JPH099966A - セファロスポリンｃ生合成に係わる遺伝子を含むｄｎａ断片 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 アクレモニウム・クリソゲナム由来であり、
セファロスポリンＣ生合成に係わる遺伝子を単離し、ア
クレモニウム・クリソゲナムの改良にこれを利用する事
を目的とする。 【構成】 アクレモニウム・クリソゲナム由来であり、
セファロスポリンＣ生合成に係わる遺伝子を含むＤＮＡ
断片であり、少なくとも配列表に示されるアミノ酸配列
をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、アクレモニウム・クリ
ソゲナム由来であり、セファロスポリンＣ生合成に係わ
る遺伝子を含むＤＮＡ断片に関する。

【０００２】

【従来の技術】臨床上重要なセファロスポリン系抗生物
質の出発原料であるセファロスポリンＣは、糸状菌であ
るアクレモニウム・クリソゲナムを用いた発酵法により
製造されている。従来、該菌のセファロスポリンＣ生産
能力を向上させるために用いられてきた技術は、突然変
異生成、それに続く高生産株のランダムスクリーニング
であった。

【０００３】しかし、近年、該菌を宿主とする形質転換
系の開発〔例えば、Queener ら、Microbiology 1985. A
merican Society for Microbiology, (1985) 468-472〕
及びセファロスポリンＣ生合成酵素遺伝子のクローニン
グが相次いで行われ、優良菌株の育種に遺伝子工学的ア
プローチを施す道が開けてきた〔例えば、Skatrudら、B
IO/TECHNOLOGY (1989)7. 477 〕。

【０００４】セファロスポリンＣは、アクレモニウム・
クリソゲナムにおいて、３種のアミノ酸を出発原料とし
て、５種類の酵素による６ステップの反応を経て生合成
される事が知られている〔例えば、Martinら、Trends i
n Biotechnology (1985) 3:39-44 参照〕。現在まで
に、これら生合成酵素に係わる遺伝子の殆どがアクレモ
ニウム・クリソゲナムよりクローニングされ〔例えば、
Samonら、Nature (1985)318,191、Samsonら、BIO/TECHN
OLOGY (1987) 5,1207、Gutierres ら、Journalof Bacte
riology (1991) 173,2354-2365、EP0450758 〕、分子育
種に応用されつつある。

【０００５】一方アクレモニウム・クリソゲナムには、
セファロスポリンＣ生合成に間接的に関与する遺伝子
（例えばセファロスポリンＣ生合成遺伝子群の発現制御
に係わるタンパク質、あるいは、合成中間体の膜透過に
係わるタンパクをコードする遺伝子）が複数存在する事
が予想され、上記生合成酵素遺伝子と同様にこれらの遺
伝子もセファロスポリンＣ生産菌の分子育種に有益な手
段を提供すると考えられる。しかし乍ら、これら遺伝子
の解析は殆ど行われていない。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、アクレモニ
ウム・クリソゲナム由来であり、セファロスポリンＣ生
合成に関与する遺伝子を単離し、アクレモニウム・クリ
ソゲナムの改良に、これを利用する事を目的とする。

【０００７】

【課題を解決するための手段】抗生物質の生合成に関与
する遺伝子群は、一般にクラスターを形成しているとい
う知見〔例えば、Martinら、Annu. Rev. Microbiol.(19
89) 43,173-206〕に基づいて、既知のセファロスポリン
Ｃ生合成酵素遺伝子近傍の領域を解析する事により、本
発明者らは、セファロスポリンＣ生合成に関与する２種
の遺伝子をイソペニシリンＮ合成酵素（ＩＰＮＳ）遺伝
子の近傍（該遺伝子の直下流に位置する方をγ、更にそ
の下流に位置する遺伝子をαと命名した。）に同定し、
出願した（特開平６−３８７６３号公報）。

【０００８】本発明者らは、同上の解析を更に進めた結
果、図１、２に示す制限酵素地図を有するＤＮＡ断片上
に、セファロスポリンＣ生合成に係わる新たな遺伝子が
少なくとも１個ずつ存在している事を見いだし本発明を
完成するに至った。即ち本発明は、アクレモニウム・ク
リソゲナム由来であり、セファロスポリンＣ生合成に関
与する遺伝子を含むＤＮＡ断片であり、この遺伝子が配
列表の配列番号１のアミノ酸配列１〜４８２位をコード
する塩基配列であり、またこの塩基配列が配列表の配列
番号１の塩基１２７〜１５７２位の配列であり、または
この遺伝子が配列表の配列番号２の塩基５３５〜２５５
４位の配列である。また本発明は、アクレモニウム・ク
リソゲナム由来であり、セファロスポリンＣ生合成に関
与する遺伝子を含むＤＮＡ断片であり、この遺伝子が配
列表の配列番号３のアミノ酸配列１〜５６１位をコード
する塩基配列であり、この塩基配列が配列表の配列番号
３の塩基３３〜１７１５位の配列であり、またはこの遺
伝子が配列表の配列番号４の塩基４９７〜２２４０位の
配列であるＤＮＡ断片である。

【０００９】また、本発明のＤＮＡ断片として、配列表
の配列番号１のアミノ酸配列１〜４８２位をコードする
塩基配列や配列表の配列番号２の塩基５３５〜２５５４
位の配列として図１に示される当該配列を含むＤＮＡ断
片、配列表の配列番号３のアミノ酸配列１〜５６１位を
コードする塩基配列や配列表の配列番号４の塩基４９７
〜２２４０位の配列として図２に示される当該配列を含
むＤＮＡ断片が挙げられる。

【００１０】また、本研究の過程で、本発明ＤＮＡ断片
の一部をプローブとして使用する事により配列表（配列
番号１、２並びに３、４）に示すアミノ酸配列を有する
タンパク質をコードするｃＤＮＡが得られた。それぞれ
の塩基配列を配列表（配列番号１並びに３）に示した。
これらｃＤＮＡ化合物もアクレモニウム・クリソゲナム
内で機能するプロモ−タ−断片（例えば、特開平４ー５
８８９１号公報）と連結させる事により、本発明ＤＮＡ
断片と同様、アクレモニウム・クリソゲナムの改良に利
用できると考えられる。従って図１、図２に示す制限酵
素地図により規定されるＤＮＡ断片から転写されるＲＮ
Ａ（セファロスポリンＣ生合成に関与するタンパクをコ
ードするｍ−ＲＮＡ）に由来するｃＤＮＡ化合物群も本
発明に包含される。

【００１１】本発明に係るＤＮＡ断片は大略下記の工程
によって造成する事ができる。 (1) アクレモニウム・クリソゲナムから染色体ＤＮＡを
抽出し、適当な制限酵素（例えば、ＭｂｏＩ等）で部分
分解する。 (2)(1)で得られたＤＮＡ断片を適当なベクターに組み込
み、アクレモニウム・クリソゲナムの染色体ＤＮＡライ
ブラリーを構築する。 (3)(2)で得られたライブラリーの中から、合成ＤＮＡプ
ローブを用いたハイブリダイゼーションによりイソペニ
シリンＮ合成酵素遺伝子、αーアミノアジピルシステイ
ニルバリン合成酵素（ＡＣＶＳ）遺伝子あるいはα、γ
遺伝子等の少なくとも一部を含むクローンを単離する。 (4) 該クローンより組換えＤＮＡを抽出し、制限酵素解
析、サザンハイブリダイゼーション等を行ってα遺伝子
もしくはＡＣＶＳ遺伝子の存在位置を確認した後その近
傍の領域を適当なプラスミドベクター（例えばｐＵＣ１
８）にサブクローニングする。 (5)(4)でサブクローン化されたＤＮＡ断片上で、ＲＮＡ
に転写される領域（機能的遺伝子）を同定する。 (6) 相同組換え現象を利用した遺伝子破壊法により、
(5) で同定した領域内に変異を有するアクレモニウム・
クリソゲナム株を取得する。 (7) 上記(6) で得た変異株のセファロスポリンＣ生産能
を調べ、親株のそれと比較する事により、本遺伝子がセ
ファロスポリンＣ生合成に関与している事を確認する。

【００１２】上記の工程中でＤＮＡ、組換え体宿主とし
ての大腸菌等の取扱いに必要な一般的な操作は、当業者
間で通常行われているものであり、例えば Maniatis ら
の実験操作書 ( T.Maniatis et al., Molecular Clonin
g A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laborato
ry 1982, 1989 ) に従えば容易に実施できる。使用する
酵素、試薬類もすべて市販の製品を用いることができ、
特に断わらない限り、製品で指定されている使用条件に
従えば、完全にそれらの目的を達成することができる。

【００１３】上記(1) において、ＤＮＡ抽出源として
は、アクレモニウム・クリソゲナムＡＴＣＣ１１５５
０、アクレモニウム・クリソゲナムＩＳ−５等の菌株が
使用できる。なお、アクレモニウム・クリソゲナムＩＳ
−５株は、平成２年２月５日付けで通商産業省工業技術
院微生物工業技術研究所に微工研菌寄第１１２３２号と
して寄託され、微工研条寄第３１５３号（ＦＥＲＭ Ｂ
Ｐ−３１５３）として維持されている。

【００１４】また、該菌からの全ＤＮＡ抽出は、例え
ば、Johnstone ら〔Johnstone et al., EMBO Journal(1
985)4 1307-1311 〕の方法、もしくは、Minuthら〔Minu
th etal., Current Genetics(1982)5: 227-231 〕の方
法に準じて行うことができる。上記(2) におけるベクタ
ーとしては、例えば、ＥＭＢＬ３、ＥＭＢＬ４（STRATA
GENE社）等のラムダファージベクターもしくは、ｐＨＣ
７９（Bethesda Research Laboratories＜ＢＲＬ＞
社）、ｐＢＳＦＰＫＭ６（特開平６−３８７６３号公
報）等のコスミドベクターを使用する事ができる。

【００１５】上記(3) で使用するプローブは、例えば、
既に明かとなっている アクレモニウム・クリソゲナム
由来のＩＰＮＳ、α、γ、ＡＣＶＳ遺伝子等の配列に基
づいて設計し、市販の合成機を用いて容易に合成するこ
とができる。上記(5) における転写領域は、例えば、
(4) で得たプラスミドから適当な制限酵素断片を調製
し、該断片を放射能あるいはジゴキシゲニン、ビオチン
等の非放射性化合物でラベルしたものをプローブとし
て、アクレモニウム・クリソゲナムから抽出したＲＮＡ
とのノーザンハイブリダイゼーションを行う事によって
おおまかに推定する事ができる。あるいは、アクレモニ
ウム・クリソゲナムに由来するラベル化ｃＤＮＡをプロ
ーブとして、(4) で得たプラスミドの制限酵素分解物と
のサザンハイブリダイゼーションを行う事によっても推
定できる。また、該制限酵素断片をプローブとしてアク
レモニウム・クリソゲナム由来のｃＤＮＡクローンを単
離し、その構造を決定する事によって、更に細かく転写
領域並びにタンパク質コード領域等を限定する事も可能
である。

【００１６】尚アクレモニウム・クリソゲナムからのＲ
ＮＡの抽出は、例えば、ＥＰ−０４５０７５８号公開明
細書記載の方法に準じて行う事ができる。また、ｃＤＮ
Ａライブラリーの構築、ノーザンハイブリダイゼーショ
ン等の操作も、例えば、上記マニアティスらの実験操作
書に準じて行うことができる。上記(6) における遺伝子
破壊は、例えばHoskins らの方法〔Jo Ann Hoskinsら、
Curr Genet(1990)18:523-530〕あるいはMatsuda らの方
法〔Matsuda ら、Biochem.Biophys.Res.Commun.(1992)1
86:40-46〕等の方法に準じて行う事ができる。

【００１７】尚、遺伝子破壊用プラスミドを構築する際
必要となる選択マーカー遺伝子としては、例えば特開平
４ー５８８９１号公報に記載されている、アクレモニウ
ム・クリソゲナム内で作用するプロモーターに連結され
たハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ遺伝
子、あるいは、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ
遺伝子等を使用する事ができる。また、破壊用プラスミ
ドによるアクレモニウム・クリソゲナムの形質転換も公
知の方法に準じて行う事ができる〔例えば、Queener
ら、Microbiology 1985. American Societyfor Microbi
ology(1985) 468-472〕。上記(7)におけるセファロスポ
リンＣ濃度は、例えば、Martinezらが記載した方法〔En
zyme Microb. Technol.(1985)7,389-393〕に準じて測定
する事ができる。

【００１８】

【実施例】以下、実施例により本発明を詳述するが、本
発明は、該実施例によって限定されるものではない。
尚、実施例に記載の略称ないし略号は、以下の通りのも
のである。 マニアティスの実験書：(T.Maniatis et al.,Molecular
Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor L
aboratory 1982,1989 ) Ｎ−３シード培地：コーンスティープリカー４０ｇ／ビ
ート２０ｇ／酢酸アンモニウム２ｇ／スイトース４０ｇ
を水１リットルに溶解したもの。

【００１９】メイン培地：ビート３０ｇ／脱脂大豆４０
ｇ／コーンスティープリカー１０ｇ／酢酸アンモニウム
５ｇ／硫酸アンモニウム７ｇ／硫酸カルシウム８ｇ／炭
酸カルシウム１５ｇ／スイトース６０ｇ／メチルオレイ
ト４１．５を水１リットルに含むもの。 ＣＭ培地：ショ糖２０ｇ／リン酸二水素カリウム０．５
ｇ／リン酸水素二カリウム０．５ｇ／塩化カリウム０．
５ｇ／硫酸マグネシウム（７水塩）０．５ｇ／硫酸鉄
（ＩＩ）（７水塩）０．０１ｇ／硝酸ナトリウム３ｇ／
イーストエキストラクト４ｇ／ペプトン１０ｇを水１リ
ットルに溶解したもの。

【００２０】ＣＭ固形培地：１．５％の寒天を含有する
ＣＭ培地。 ＧＡＧ培地：グリセロール４０ｇ／アスパラギン４ｇ／
塩化カルシウム０．１ｇ／塩化ナトリウム０．１ｇ／微
量金属溶液〔硫酸マグネシウム（７水塩）４ｇ／硫酸鉄
（ＩＩ）（７水塩）０．４ｇ／硫酸マンガン（４水塩）
０．１６ｇ／硫酸亜鉛（７水塩）０．４ｇ／無水硫酸銅
０．０４ｇを水１リットルに溶解したもの〕２５ミリリ
ットル／０．１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７．０）３０
ミリリットルを水１リットルに含有する培地。

【００２１】Ｐ−バッファー：０．６Ｍ塩化カリウム／
０．０１Ｍ塩化マグネシウム／０．０２５Ｍ塩化カルシ
ウム ＰＥＧ溶液：２５％ポリエチレングリコール（〜４００
０）／０．０１Ｍトリス（ｐＨ８．０）／０．０５Ｍ塩
化カルシウム／０．６Ｍ塩化カリウム。 ６ＸＳＳＣ：０．９Ｍ塩化ナトリウム／９０ｍＭクエン
酸ナトリウム。

【００２２】

【実施例１】 α遺伝子の下流領域のサブクローニングと制限酵素地図
の作製 α遺伝子の下流、少なくとも１０Ｋｂ以上に渡る領域を
カバーする事が明かとなっているコスミドクローンＣｏ
ｓ１をＳｍａＩで切断したのち、アガロースゲル電気泳
動を行い、サザンの方法により、ゲルからナイロンフィ
ルターにＤＮＡを転写した。該フィルターとジゴキシゲ
ニン標識デオキシウリジン３リン酸（ＤＩＧーｄＵＴ
Ｐ）で標識したｐＩＰＤ２の約４００ｂｐのＳａｃＩー
ＥｃｏＲＩ断片（図１のＳａｃＩ−ＥｃｏＲＩ間に
相当）とのハイブリダイゼーションを行ったところ約
６．５ＫｂのＳｍａＩ断片がハイブリダイズした。そこ
で該断片をｐＵＣ１８のＳｍａＩ部位にサブクローニン
グし、プラスミドｐＩＰＤ３を得た。

【００２３】そして、このプラスミドを制限酵素解析に
供し、該ＳｍａＩ断片の部分制限酵素地図を作製した。
次ぎにＣｏｓ１をＳａｃＩで切断し、上記と同様にフィ
ルターに転写した。ついで該フィルターとＤＩＧ−ｄＵ
ＴＰでラベルしたｐＩＰＤ３の約１．７ＫｂのＳａｃＩ
−ＳｍａＩ断片（図１のＳａｃＩ−ＳｍａＩ間に相
当）とのサザンハイブリダイゼーションを行ったところ
約５．２ＫｂのＳａｃＩ断片がハイブリダイズした。そ
こでこの断片をｐＵＣ１１８のＳａｃＩ部位にサブクロ
ーニングしプラスミドｐＩＰＤ４を得た。

【００２４】次いでこのプラスミドを用いて該断片の制
限酵素地図を作製し、上記ｐＩＰＤ３上のＳｍａＩ断片
並びにｐＩＰＤ２上のＥｃｏＲＩ断片の地図とオーバー
ラップさせる事により図１に示すとうり、α遺伝子の下
流約１２Ｋｂに及ぶ領域の部分制限酵素地図を完成させ
た。尚、上記ハイブリダイゼーションは、５０％ホルム
アミド、５ＸＳＳＣ、０．０２％ＳＤＳ、２％ブロッキ
ング剤（Blocking Reagent:Boehringer ）、０．１％Ｎ
−ラウロイルザルコシン及び終濃度１０ｎｇ／ｍｌで各
ＤＩＧ−ｄＵＴＰラベル化プローブ（１００℃で５分間
の熱変性処理後に添加した。）を含有する溶液を用い
て、４２℃で１６時間行った。次いで、フィルターを
０．１％のＳＤＳを含む２ＸＳＳＣ溶液中、室温で１０
分間ずつ２回洗浄し、更に０．１％のＳＤＳを含む０．
１ＸＳＳＣ溶液中６８℃で１５分間ずつ２回洗浄した。
次いで、アルカリフォスファターゼ標識された抗ジゴキ
シゲニン抗体及び発光基質ＡＭＰＰＤを利用した検出キ
ット（DIG Luminescent Detection Kit:Boehringer）を
使用し、その添付プロトコールに従って、ハイブリダイ
ゼーションの有無を検出した。また、本実施例で使用し
たＣｏｓ１及びｐＩＰＤ２は、イソペニシリンＮ合成酵
素遺伝子の下流約２０Ｋｂ、約３Ｋｂの領域をそれぞれ
含有するクローンであり、その造成法は特開平６−３８
７６３号公報に記載されている。尚、図１の地図の上段
には、上記３種のサブクローンプラスミドｐＩＰＤ２、
ｐＩＰＤ３、ｐＩＰＤ４中に含まれるインサートの領域
を示した。

【００２５】

【実施例２】 転写領域の同定 上記ｐＩＰＤ２、３、４から３種の制限酵素断片を調製
し、それをプローブとしてアクレモニウム・クリソゲナ
ムＲＮＡとのノーザンハイブリダイゼーションを行っ
た。その結果、上記α遺伝子の下流約１２Ｋｂに及ぶＤ
ＮＡ断片上から、少なくとも３種の未同定ＲＮＡが転写
されている事、即ち該断片上に３種の遺伝子が存在して
いる事が明かとなった。以下、実験の詳細を記述する。 ａ．アクレモニウム・クリソゲナムのポリＡ⁺ ＲＮＡ抽
出；ＣＭ固形培地上３０℃、３日間生育させたアクレモ
ニウム・クリソゲナムＩＳ−５の菌糸体をＮ３シード培
地５０ミリリットルに接種し、２５℃で３日間培養し
た。得られた培養液１ミリリットルをメイン培地３０ミ
リリットルを含む５００ミリリットルのフラスコに移植
し、２５℃で３日間培養した。該菌液１０ミリリットル
から吸引濾過により集めた菌糸体を液体窒素中で凍結さ
せ、乳鉢と乳棒を用いてすりつぶした。

【００２６】かくして得られた菌破砕粉末から TOTAL R
NA ISOLATION KIT（インビトロジェン社）を用いて、そ
の添付プロトコールに従って全ＲＮＡ８００μg を抽出
した。次いでこの全ＲＮＡからマニアティスの実験書に
従って、オリゴ（ｄＴ）セルロースクロマトグラフィー
操作を行う事によりポリＡ⁺ ＲＮＡ２７μｇを得た。 ｂ．プローブの調製；上記ｐＩＰＤ２の約２．６Ｋｂの
ＥｃｏＲＶ−ＳａｃＩ断片（図１のＥｃｏＲＶ−Ｓａ
ｃＩ間に相当）、ｐＩＰＤ３の約４．３ＫｂのＳａｃ
Ｉ断片（図１のＳａｃＩ−ＳａｃＩ間に相当）並び
にｐＩＰＤ４の約２．１ＫｂのＳａｃＩ−ＢｇｌＩＩ断
片（図１のＳａｃＩ−ＢｇｌＩＩ間に相当）を調製
後、ＤＩＧーｄＵＴＰでラベルして、それぞれプローブ
Ａ、Ｂ、Ｃと称しハイブリダイゼーションに供した。 ｃ．ノーザンハイブリダイゼーション；上記ａ．で得た
ポリＡ⁺ ＲＮＡ２μｇをマニアティスの実験書に記載さ
れた方法に従ってグリオキザールにより変性し、１．１
％アガロースゲル中で電気泳動したのち、アマーシャム
社の添付プロトコールに従ってナイロンフィルター（ハ
イボンド−Ｎ＋、アマーシャム社）にアルカリ転写し
た。

【００２７】かくして得たフィルターをｂ．で調製した
３種のプローブとそれぞれハイブリダイゼーションさせ
た。ハイブリダイゼーションは、５０％ホルムアミド、
５ＸＳＳＣ、７％ＳＤＳ、２％ブロッキング剤（Blocki
ng Reagent:Boehringer ）、５０ｍＭリン酸バッファー
（ｐＨ７．０）、０．１％Ｎーラウロイルザルコシン及
び終濃度１０ｎｇ/ｍｌで各ＤＩＧ−ｄＵＴＰラベル化
プローブ（１００℃で５分間の熱変性処理後に添加し
た。）を含有する溶液を用いて、５０℃で１６時間行っ
た。フィルターの洗浄並びにハイブリダイゼーションシ
グナルの検出は実施例１と同様に行った。

【００２８】その結果、プローブＡでは約１．８Ｋｂ、
プローブＢでは約２．５Ｋｂ、そしてプローブＣでは約
１Ｋｂのハイブダイゼーションバンドが検出された。以
上の結果、アクレモニウム・クリソゲナムのα遺伝子か
ら下流約１２ＫｂまでのＤＮＡ断片上には、少なくとも
３種の遺伝子が存在している事が明かとなった。以後、
α遺伝子のすぐ下流に位置し、約１．８Ｋｂの転写産物
を与える遺伝子をβ遺伝子と称する。

【００２９】

【実施例３】 β遺伝子の構造解析 ａ．β−ｃＤＮＡのクローニングとその構造解析；上記
ポリＡ⁺ ＲＮＡ４μｇから野島らが記載した方法（〔遺
伝子ライブラリーの作製法〕野島博 編集、1994年、羊
土社）に従って、上記ポリＡ⁺ ＲＮＡ４μｇから、５’
側にＥｃｏＲＩ、３’側にＸｈｏＩの粘着末端を有する
２本鎖ｃＤＮＡを合成した。次いで、該ｃＤＮＡをＥｃ
ｏＲＩとＸｈｏＩで切断され、アルカリホスファターゼ
（CIAP）処理を施されたλＺＡＰＩＩベクター（Uni-ZA
P ^TM XR Cloning Kit: STRATAGENE社）と連結させた
後、GIGAPACK II Gold（STRATAGENE社）を使用してλフ
ァージ粒子内へのパッケイジングを行った。かくして得
られた組換えファージの一部を大腸菌ＳＵＲＥ株（STRA
TAGENE社）に感染させＬ−ブロス寒天培地上（プレート
5枚）に約１００００個のプラークを形成させた。

【００３０】次いで該プラークをハイボンドＮ（アマー
シャム社）に、アマーシャム社の添付プロトコールに従
って転写し、ＤＮＡを固定した。かくして得たフィルタ
ーを実施例２ｂ．で得たブローブＡとハイブリダイゼー
ションさせた。ハイブリダイゼーション及びフィルター
の洗浄は、実施例１と同様に行った。その結果２個のハ
イブリダイゼーション陽性プラークが見いだされた。そ
こで、ExAssist^TMInterference-Resistant Helper Phag
e（STRATAGENE社）のシステムを使用し、その添付プロ
トコールに従って、これら２種の陽性ファージ中に含ま
れる組換えλＤＮＡを組換えプラスミドＤＮＡに変換
し、回収した。

【００３１】かくして得られた２種のプラスミドをＸｈ
ｏＩで切断し、アガロースゲル電気泳動により解析した
ところ、ｐＣＢＥＴ１と名付けた一方のプラスミドはノ
ーザン法により検出されたβ−ｍＲＮＡのそれとほぼ同
じサイズのｃＤＮＡインサートを保持している事が明か
となった。そこでｐＣＢＥＴ１が有するｃＤＮＡインサ
ートの全塩基配列を、サンガーらの方法〔Proc.Nat.Aca
d.Sci.USA 74 5463(1977) 〕に基づき、アプライドバイ
オシステムズ（Applied Biosystems）社製の 373 DNA S
equencerを用いて決定した。

【００３２】かくして決定された１８４２ｂｐのＤＮＡ
塩基配列を配列表（配列番号１）に示す。本ＤＮＡ配列
には、１２７番目に始まるＡＴＧから１５７２番で終わ
るＣＴＧまで、４８２個のアミノ酸をコードしうるオー
プンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が存在していた。
該ＯＲＦから翻訳したアミノ酸配列を配列表（配列番号
１）の塩基配列の下段に示した。尚、コンピュータ検索
の結果、本アミノ酸配列はCandida maltosa由来のcyclo
heximide耐性タンパク、Candida albicans由来のbenomy
l/methotrexate耐性タンパク等のトランポーターファミ
リーのものとと比較的高い相同性を示した。 ｂ．β遺伝子の構造解析；上記ａ．で明かとなったβ−
ｃＤＮＡ断片の塩基配列と実施例１で得たα遺伝子下流
域の地図とを照合したところβ遺伝子は、図１の制限酵
素地図の下段に示した約３Ｋｂの領域内に含有されてい
ると推定された。そこでこの領域の全塩基配列をａ．と
同様の実験手技を用いて決定した。尚決定した塩基配列
は配列表（配列番号２）に示した。予想どうりこの配列
中には上記cDNA配列から予想されたＯＲＦが完全に含ま
れていた。またこのＯＲＦはそれぞれ５６ｂｐ、６１ｂ
ｐ、５７ｂｐから成る３個のイントロンにより分断され
ている事が明かとなった。

【００３３】

【実施例４】 β遺伝子の破壊 ａ．破壊用プラスミドの構築；先ずβ遺伝子全体を含有
するプラスミドｐＩＰＤ２のＳｔｕＩ部位（この制限酵
素認識部位はβ遺伝子コード領域内に位置し、ｐＩＰＤ
２に一箇所だけ存在する。）にＳｐｅＩリンカー（宝酒
造販）を挿入する事により、ｐＩＰＤＳ２を得た。一方
ｐＡＣＴＨＹ８３をＳｐｅＩ、ＸｂａＩで切断し、３．
２ＫｂのハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ
発現単位断片を分離精製した。

【００３４】次いで、該断片とＳｐｅＩで切断し、アル
カリフォスファターゼ処理を施した上記ｐＩＰＤＳ２を
Ｔ４リガーゼで連結する事によりβ遺伝子を破壊するた
めのプラスミドｐＤＢＥＴ１を得た。尚、本実施例で使
用したｐＡＣＴＨＹ８３は、ハイグロマイシンＢ耐性を
選択マーカーとするアクレモニウム・クリソゲナム形質
転換用ベクターであり、その造成法は特開平４−５８８
９１号公報に記載されている。 ｂ．ｐＤＢＥＴ１によるアクレモニウム・クリソゲナム
の形質転換；ｐＤＢＥＴ１をＸｂａＩで線上化した後、
アクレモニウム・クリソゲナムＩＳ−５株由来のプロト
プラストに導入し、ハイグロマイシンＢに耐性となった
形質転換体を取得した。以下にその詳細を説明する。

【００３５】ＣＭ固形培地上で３０℃５日間生育させた
アクレモニウム・クリソゲナムＩＳ−５の菌糸体をＣＭ
培地５０ミリリットルに接種し、回転式振とう機（２５
０ｒ．ｐ．ｍ）上、３０℃で３日間培養した。更に該菌
液１ミリリットルを５０ミリリットルのＧＡＧ培地に接
種して、３０℃で２０時間培養した。得られた培養液５
０ミリリットルを３５００ｒ．ｐ．ｍで１０分間遠心
し、菌糸体を沈澱させた後、０．９％のＮａＣｌ溶液で
洗浄し、０．０１Ｍジチオスレイト−ルを含んだマクイ
ルベイン緩衝液（０．１Ｍクエン酸、０．２Ｍリン酸ナ
トリウム、ｐＨ７．３）２０ミリリットルに懸濁し、３
０℃で１時間、おだやかに振とうした。

【００３６】次いで菌糸体を３２００ｒ．ｐ．ｍ、１０
分間の遠心で沈澱させ、Ｐ−バッファ−で洗浄した後、
ノボザイム（Ｎｏｖｏ社）を１０ｍｇ／ミリリットルの
濃度で含有するＰ−バッファー１０ミリリットルに懸濁
し、３０℃で１時間おだやかに振とうした。該反応液を
８００ｒ．ｐ．ｍで３０秒間遠心して得た上清を、濾紙
（ＴＯＹＯ ＦＩＬＴＥＲ ＰＡＰＥＲ ５Ａ）を用い
て濾過する事により、菌糸体とプロトプラストを分離し
た。次いで該濾液を３０００ｒ．ｐ．ｍで５分間遠心
し、プロトプラストを沈澱させた後、Ｐ−バッファ−で
１回洗浄し、プロトプラストが３×１０⁸ 個／ミリリッ
トルの濃度となるようにＰ−バッファ−に懸濁した。

【００３７】かくして得られたプロトプラスト懸濁液
０，１ミリリットルに、ＸｂａＩ切断により線上化した
ｐＤＢＥＴ１１０μg を含む溶液１０μリットルを加え
た後、０，０５ミリリットルのＰＥＧ溶液を加え、かる
く混合した。該混合液を氷上に２５分間静置した後、同
上のＰＥＧ溶液を１ミリリットル加えて、室温で更に３
０分間静置した。かくして得られた形質転換プロトプラ
スト懸濁液を０．２ミリリットルずつプロトプラスト再
生培地〔文献（イソガイら: Agric.Biol.Chem.１９８
７、５１、２３２１−２３２９）に記載されているＢＲ
Ｍ培地〕を２５ミリリットル含有するプレ−ト上に広げ
１５℃で２０時間培養した。

【００３８】次いで、該プレ−トに４．５ｍｇのハイグ
ロマイシンＢを含み、５０℃に保温した同上のＢＲＭ培
地５ミリリットルを重層した後、２８℃で１４日間培養
した。その結果、ハイグロマイシンＢに耐性となった形
質転換体（以下、ＨＹＢ形質転換体と略す。）が４０株
出現した。 ｃ．破壊株の選択；上記４０株のＨＹＢ形質転換体より
リーダー、ブローダの方法〔U.Raeder & P.Broda, Lett
ers in Applied Microbiology (1985) 1,17-20〕に従っ
て染色体ＤＮＡを抽出し、該ＤＮＡを鋳型とし、２種の
プライマー（配列表配列番号５及び配列番号６に示すプ
ライマー）を用いてＰＣＲを行う事により、β遺伝子破
壊株をスクリーニングした。

【００３９】ＰＣＲは、１０倍濃度の反応緩衝液（10X
Ex Taq Buffer:宝酒造）５μｌ、２、５ｍＭｄＮＴＰ混
合液（TaKaRa Ex Taq に添付）４μｌ、プライマーＢＥ
ＴＦ−１、ＢＥＴＡＰ−１各々２μｌ（各々濃度は０．
１μｇ／ｍｌの溶液）、TaKaRa Ex Taq ０、５μｌ、各
染色体ＤＮＡ２μｌ（０．０５μｇ−０．１μｇ相当
量）、滅菌脱イオン水３４、５μｌからなる反応系を調
製し、９４℃で一分間、６５℃で２分間、７２℃で３分
間のインキュベーションをパーキン・エルマー・シータ
ス・ＤＮＡ・サーマル・サイクラー（Perkin・Elmer ・
Cetus ・DNA ・Thermal ・Cycler）を使用して３５サイ
クル行った。得られた反応液をアガロースゲル電気泳動
により解析したところ上記４０株中１株（ＤＢＥＴ−１
と命名）に目的の遺伝子破壊が起こっている事が明かと
なった。即ち、ＤＢＥＴ−１株に由来するＤＮＡを鋳型
とした場合は親株で観察される約１．２Ｋｂサイズの増
幅産物が消失し、破壊構造から予想される約４．３Ｋｂ
のサイズの増幅産物のみが検出された。 ｄ．破壊株の培養；上記ｃ．で得たＤＢＥＴ−１並びに
その親株ＩＳ−５株をＮ３シード培地５０ミリリットル
に接種し、２５℃で３日間振とう培養した（２２０ｒ．
ｐ．ｍ）。得られた培養液各１ミリリットルをメイン培
地３０ミリリットルを含む５００ミリリットルのフラス
コに移植し、２５℃で４日間振とう培養した。

【００４０】かくして得られた培養液を遠心分離して得
た上清を１０倍希釈した後、高速液体クロマトグラフィ
ーに供し、セファロスポリンＣの検出を行った。高速液
体クロマトグラフィーのカラムは、ＺＯＲＢＡＸ−ＢＰ
ＮＨ２カラム（デュポン社製）を用い、移動相としては
４％酢酸、４％メタノール、８％アセトニトリルからな
る溶液を用いて、流速は２ミリリットル／分、検出波長
は２４５ｎｍで行った。その結果、ＤＢＥＴ−１のセフ
ァロスポリンＣ生産能はＩＳ−５株のそれに比べ著しく
低下している事が明かとなった。

【００４１】

【実施例５】ＡＣＶＳ遺伝子の下流領域のサブクローニ
ングと制限酵素地図の作製；アクレモニウム・クリソゲ
ナム由来のＩＰＮＳ遺伝子全体を含むコスミドクローン
の中から上記実施例１記載のｐＩＰＤ２の約４００ｂｐ
のＳａｃＩ−ＥｃｏＲＩ断片（図１のＳａｃＩ−Ｅｃ
ｏＲＩ間に相当）にハイブリダイズしないクローンを
選択し、その１つをＣｏｓ８と名付けた。Ｃｏｓ８をＨ
ｉｎｄＩＩＩもしくはＥｃｏＲＩで切断し、アガロース
ゲル電気泳動で解析した結果、本コスミドクローンは約
３０Ｋｂの挿入断片を保持している事が明かとなった。

【００４２】また、既に明かとなっているＡＣＶＳ、Ｉ
ＰＮＳ遺伝子の位置関係、サイズ等に関する知見を考慮
する事により、Ｃｏｓ８はＡＣＶＳ遺伝子の下流、少な
くと１０Ｋｂに渡る領域をカバーすると判断された。そ
こでＣｏｓ８を出発材料として、ＡＣＶＳ下流領域のサ
ブクローニングを以下のように実施した。Ｃｏｓ８をＨ
ｉｎｄＩＩＩで切断したのちアガロースゲル電気泳動を
行い、ＡＣＶＳのＣ末端コード域を含むと思われる約
４．５Ｋｂの断片を分離精製した。

【００４３】次いで、該断片をｐＵＣ１８のＨｉｎｄＩ
ＩＩ部位に挿入する事により、ｐＤＡＣＶＨを取得し
た。そして、このプラスミドを制限酵素解析に供し、該
断片の部分制限酵素地図を作製した。また、この断片の
塩基配列を一部（図２のＨｉｎｄＩＩＩからＥｃｏＲ
Ｉへ向かう配列）を決定した。かくして得られた部分
制限酵素地図並びに部分塩基配列はGutierres ら〔Jour
nal of Bacteriology(1991),173,2354-2365 〕により報
告されているものと一致しており、該断片中にＡＣＶＳ
のＣ末端コード域並びにＡＣＶＳ遺伝子の下流約２．５
Ｋｂの領域が含まれている事が明かとなった。

【００４４】次ぎに、Ｃｏｓ８をＥｃｏＲＩで切断した
のち、アガロースゲル電気泳動を行い、サザンの方法に
より、ゲルからナイロンフィルターにＤＮＡを転写し
た。該フィルターとＤＩＧ−ＵＴＰで標識したｐＤＡＣ
ＶＨの約５００ｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩ断片
（図２のＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩ間に相当）と
のハイブリダイゼーションを行ったところ約４ＫｂのＥ
ｃｏＲＩ断片がハイブリダイズした。そこで該断片をｐ
ＵＣ１８のＥｃｏＲＩ部位にサブクローニングし、プラ
スミドｐＤＡＣＶＥを得た。そして、このプラスミドを
用いて該断片の部分制限酵素地図を作製し、上記ｐＤＡ
ＣＶＨ上のＨｉｎｄＩＩＩ断片の地図とオーバーラップ
させる事により図２に示すとうり、ＡＣＶＳ遺伝子の下
流約６Ｋｂに及ぶ領域の部分制限酵素地図を完成させ
た。

【００４５】尚、本実施例で使用したＩＰＮＳ遺伝子全
体を含むコスミドクローンの調製法は特開平６ー３８７
６３号公報に記載されている。また、上記ハイブリダイ
ゼーション、フィルターの洗浄並びにハイブリダイゼー
ションシグナルの検出等の操作は実施例１と同様に行っ
た。

【００４６】

【実施例６】 転写領域の同定 上記ｐＤＡＣＶＨの約９００ｂｐのＥｃｏＲＩ−Ｂａｍ
ＨＩ断片（図２のＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ間に相
当）、ｐＤＡＣＶＥの約７００ｂｐのＢａｍＨＩ−Ｈｉ
ｎｄＩＩＩ断片（図２のＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ
間に相当）をそれぞれプローブとしてアクレモニウム
・クリソゲナムＲＮＡとのノーザンハイブリダイゼーシ
ョンを行った。その結果、前者をプローブとした場合に
は、約１．４Ｋｂ、後者を用いた場合には約１．８Ｋｂ
のハイブリダイゼーションバンドが検出された。即ち、
上記ＡＣＶＳ遺伝子の下流約６Ｋｂに及ぶＤＮＡ断片上
から、少なくとも２種の未同定ＲＮＡが転写されている
事、即ち該断片上に２種の機能的遺伝子が存在している
事が明かとなった。以後、約１．８Ｋｂの転写産物を与
える遺伝子をη遺伝子と称する。尚、ＲＮＡ抽出、プロ
ーブ調製、ノーザンハイブリ等の操作はすべて実施例２
に記載した方法に準じて行った。

【００４７】

【実施例７】 η遺伝子の構造解析 ａ．η−ｃＤＮＡのクローニングとその構造解析；ｃＤ
ＮＡ合成システム（ベーリンガー社）を使用し、その添
付プロトコールに従って上記実施例２ａ．で得たポリＡ
⁺ ＲＮＡ４μｇから一本鎖ＤＮＡ、次いで２本鎖ｃＤＮ
Ａを合成した。次ぎに該ｃＤＮＡの末端にＥｃｏＲＩア
ダプター（宝酒造）をＴ４リガーゼの作用により付着さ
せた後、クロマスピン４００カラム（CHROMA SPIN400 c
olumn:クローンテック社）を通して、遊離アダプター及
び５００ｂｐ以下の短いcDNA断片の除去を行った。かく
して得たＥｃｏＲＩ末端を有するｃＤＮＡ断片をλＺｉ
ｐＬｏｘのＥｃｏＲＩアーム（ＢＲＬ社）と連結させた
後、ＧＩＧＡＰＡＣＫＩＩＧｏｌｄ（STRATAGENE社）を
使用してλファージ粒子内へのパッケイジングを行っ
た。

【００４８】かくして得られた組換えファージの一部を
大腸菌ＳＵＲＥ株（STRATAGENE社）に感染させＬ−ブロ
ス寒天培地上（プレート５枚）に約２００００個のプラ
ークを形成させた。次いで該プラークをハイボンド−Ｎ
（アマーシャム社）に、アマーシャム社の添付プロトコ
ールに従って転写し、ＤＮＡを固定した。かくして得た
フィルターを実施例６で得たブローブ（ＤＩＧ−ＵＴＰ
でラベルしたｐＤＡＣＶＥの約７００ｂｐのＢａｍＨＩ
−ＨｉｎｄＩＩＩ断片）ハイブリダイゼーションさせ
た。ハイブリダイゼーション、フィルターの洗浄、シグ
ナル検出等の操作は、実施例１と同様に行った。その結
果６個のハイブリダイゼーション陽性プラークが見いだ
された。

【００４９】そこで、これら陽性プラークの純化を行っ
た後、各々のプラーク中に含まれるファージを大腸菌Ｄ
Ｈ１０Ｂ（ＺＩＰ）株（ＢＲＬ社）に感染させ、組換え
λＤＮＡから組換えプラスミドＤＮＡへの変換、回収を
行った。かくして得られた６種のプラスミドをＥｃｏＲ
Ｉで切断し、アガロースゲル電気泳動により解析したと
ころ、ｐＣＥＴＡ１と名付けたプラスミドがノーザン法
により検出されたηーｍＲＮＡのそれとほぼ同サイズの
ｃＤＮＡインサートを保持している事が明かとなった。

【００５０】そこでｐＣＥＴＡ１が有するｃＤＮＡイン
サートの全塩基配列を、上記実施例３と同様の方法によ
り決定した。かくして決定された１８３５ｂｐのＤＮＡ
塩基配列を配列表（配列番号３）に示す。本ＤＮＡ配列
には、３３番目に始まるＡＴＧから１７１５番で終わる
ＣＣＴまで、５６１個のアミノ酸をコードしうるオープ
ンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が存在していた。該
ＯＲＦから翻訳したアミノ酸配列を配列表（配列番号
３）の塩基配列の下段に示した。尚、興味ある事に本ア
ミノ酸配列は上記βタンパクのそれとと比較的高い相同
性を示す事が明かとなった。 ｂ．η遺伝子の構造解析；上記ａ．で明かとなったη−
ｃＤＮＡ断片の塩基配列と実施例６で得たＡＣＶＳ遺伝
子下流域の地図とを照合したところη遺伝子は、図２中
の制限酵素地図の下段に示した約４Ｋｂの領域内に含有
されていると推定された。そこでこの領域の全塩基配列
をａ．と同様の実験手技を用いて決定した。尚決定した
塩基配列は配列表（配列番号４）に示した。予想どうり
この配列中には上記ｃＤＮＡ配列から予想されたＯＲＦ
が完全に含まれていた。またこのＯＲＦは６１ｂｐから
成る１個のイントロンにより分断されている事が明かと
なった。

【００５１】

【実施例８】 η遺伝子の破壊 ａ．破壊用プラスミドの構築；先ずη遺伝子全体を含有
するプラスミドｐＤＡＣＶＥをＡｐａＩとＸｈｏＩ（η
タンパクコード領域内に各々１カ所ずつ存在する。）で
切断した後、ＤＮＡブランティングキット（宝酒造販）
を使用して末端の平滑化を行い、大断片を分離精製し
た。次いで本断片にＳｐｅＩリンカー（宝酒造販）を装
着する事によって、ｐＡＣＶＥＳＰを得た。一方ｐＡＣ
ＴＨＹ８３をＳｐｅＩ、ＸｂａＩで切断し、３．２Ｋｂ
のハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ発現単
位断片を分離精製した。

【００５２】次いで、該断片とＳｐｅＩで切断し、アル
カリフォスファターゼ処理を施した上記ｐＡＣＶＥＳＰ
をＴ４リガーゼで連結する事によりη遺伝子を破壊する
ためのプラスミドｐＤＥＴＡ１を得た。 ｂ．ｐＤＥＴＡ１によるアクレモニウム・クリソゲナム
の形質転換；ｐＤＥＴＡ１をＸｂａＩで線上化した後、
上記実施例４ｂ．と同様の方法によりアクレモニウム・
クリソゲナムＩＳ−５株由来のプロトプラストに導入
し、ハイグロマイシンＢに耐性となった形質転換体を取
得した。 ｃ．破壊株の選択；上記操作により取得した１１株のＨ
ＹＢ形質転換体より実施例４ｃ．と同様の方法に従って
染色体ＤＮＡを抽出し、該ＤＮＡを鋳型とし、２種のプ
ライマー（配列表配列番号７及び配列番号８に示すプラ
イマー）を用いてＰＣＲを行う事により、η遺伝子破壊
株をスクリーニングした。ＰＣＲは、１０倍濃度の反応
緩衝液（10X Ex Taq Buffer:宝酒造）５μｌ、２．５ｍ
ＭｄＮＴＰ混合液（TaKaRa Ex Taqに添付）４μｌ、プ
ライマーＥＴＡＦ１、ＥＴＡＲ１各々２μｌ（各々濃度
は０．１μｇ／ｍｌの溶液）、TaKaRa Ex Taq ０．５μ
ｌ、各染色体ＤＮＡ２μｌ（０．０５μｇ−０．１μｇ
相当量）、滅菌脱イオン水３４．５μｌからなる反応系
を調整し、９４℃で一分間、６０℃で２分間、７２℃で
３分間のインキュベーションをパーキン・エルマー・シ
ータス・ＤＮＡ・サーマル・サイクラー（Perkin・Elme
r ・Cetus ・DNA ・Thermal ・Cycler）を使用して３５
サイクル行った。得られた反応液をアガロースゲル電気
泳動により解析したところ上記１１株中３株（ＤＥＴＡ
−１、−２、−３と命名）に目的の遺伝子破壊が起こっ
ている事が明かとなった。即ち、これら３株に由来する
ＤＮＡを鋳型とした場合は親株で観察される約２．２Ｋ
ｂサイズの増幅産物が消失し、破壊構造から予想される
約５．３Ｋｂのサイズの増幅産物のみが検出された。 ｄ．破壊株の培養；上記ｃ．で得たＤＥＴＡ−１株及び
その親株であるＩＳ−５株を各々Ｎ３シード培地５０ミ
リリットルに接種し、２５℃で３日間振とう培養した
（２２０ｒ．ｐ．ｍ）。

【００５３】得られた培養液１ミリリットルをメイン培
地３０ミリリットルを含む５００ミリリットルのフラス
コに移植し、２５℃で４日間振とう培養した。かくして
得られた培養液中に含まれるセファロスポリンＣの量を
実施例４ｄ．と同様の方法により測定した。その結果、
ＤＥＴＡ−１株はＩＳ−５株より１０％程度高いセファ
ロスポリンＣ生産能を有している事が明かとなった。

【００５４】上述の実施例において制限酵素消化により
生ずるＤＮＡ断片の分離は、すべて１％アガロースゲル
電気泳動により行い、アガロースゲルからのＤＮＡ断片
の単離精製は、ジーンクリーン（ GENE CLEAN,フナコシ
社販）を用いて、その添付プロトコールに従って行っ
た。また特に断わらない限り、ＤＮＡ断片のＤＩＧ−ｄ
ＵＴＰによる標識は、ノンラジオシステムＤＮＡ標識シ
ステム（ DNA labelingkit:Boehringer）を用いて、そ
れに付属するプロトコールに従って行った。また、ＤＮ
Ａ断片の結合反応、該反応により生ずるプラスミドを用
いた大腸菌の形質転換、得られた形質転換体からのプラ
スミドの調製及びその解析等の基本操作は、すべてマニ
アテスの実験書に記載された方法に準じて行った。

【００５５】

【発明の効果】実施例に開示したとうり、本発明のＤＮ
Ａ断片上にはアクレモニウム・クリソゲナムにおけるセ
ファロスポリンＣ生合成に係わる新規遺伝子が少なくと
も２個存在している。従って該断片あるいは、該遺伝子
に対応するｃＤＮＡ化合物を使用する事により、セファ
ロスポリンＣ発酵能が向上したアクレモニウム・クリソ
ゲナム株の創製が期待できる。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、β遺伝子を含むＤＮＡ断片の部分制限
酵素地図を示す。重複する制限酵素認識部位に関して
は、便宜上図中左から右に通し番号を賦した。

【図２】図２は、η遺伝子を含むＤＮＡ断片の制限酵素
地図を示す。重複する制限酵素認識部位に関しては、便
宜上図中左から右に通し番号を賦した。尚、図中Ｅｃｏ
ＲＩからＨｉｎｄＩＩＩまでの間に存在する複数の
ＸｈｏＩ部位に関しては、その位置を決定していないの
で記載していない。

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：１８４０ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA 起源 生物名：アクレモニウム・クリソゲナム（Acremonium c
hrysogenum） 株名：ＩＳ−５ 配列の特徴 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：１２７．．１５７５ 特徴を決定した方法：Ｐ 配列 GTCCCGATCT GTTCACCATC CCCGAATCCA TCCCATGTAC ATACGTCAGA CTTTTGTTTG 60 TAGACATCAC TCTCTGCCCT CCGCCCCTTC GTCTCCAGGC CCAATGACTC CGACAACACG 120 AACAGG ATG GTC AAG GCA GAA GAG GAC AGC GCT GCT TTG GAG GCG GCG 168 Met Val Lys Ala Glu Glu Asp Ser Ala Ala Leu Glu Ala Ala 1 5 10 ATA GAC AAT GGC CGT CGC CAT ATC GTC GAC TTC GAT GGG CCG ACA GAC 216 Ile Asp Asn Gly Arg Arg His Ile Val Asp Phe Asp Gly Pro Thr Asp 15 20 25 30 CCC GAC AAT GCC GTC AAT TGG CCC GCA GCG AGG AAG TGG CTC AAT GTC 264 Pro Asp Asn Ala Val Asn Trp Pro Ala Ala Arg Lys Trp Leu Asn Val 35 40 45 TTC GTC CTA GCA GCC ATG ACA TTC ATC GCC GCC CTG GGC TCG TCC ATC 312 Phe Val Leu Ala Ala Met Thr Phe Ile Ala Ala Leu Gly Ser Ser Ile 50 55 60 GCC GCC CCA GGC GTC AAC CAG GCC ATC GTC GAC TTT GAC AGC ACC AGC 360 Ala Ala Pro Gly Val Asn Gln Ala Ile Val Asp Phe Asp Ser Thr Ser 65 70 75 AGC ATC CTC AGC TCT CTC ATC GTC AGT GTG TAC AAT GTC GGC CTG GCC 408 Ser Ile Leu Ser Ser Leu Ile Val Ser Val Tyr Asn Val Gly Leu Ala 80 85 90 ATC GGC CCC TTG ATC GTG GCG CCC TTG TCC GAG ATG TAC GGC CGC CTC 456 Ile Gly Pro Leu Ile Val Ala Pro Leu Ser Glu Met Tyr Gly Arg Leu 95 100 105 110 ATC CCC TAC CAT GTC ACC AAC GTC CTC TTC GTC CTC TTC ACC ATC GGG 504 Ile Pro Tyr His Val Thr Asn Val Leu Phe Val Leu Phe Thr Ile Gly 115 120 125 TGC GCC CTC AGT CCC AAC CTC CCC GCC CTT GTC ATC TTC CGT ATG CTG 552 Cys Ala Leu Ser Pro Asn Leu Pro Ala Leu Val Ile Phe Arg Met Leu 130 135 140 GCC GGC ATG GAG GCT TCT GCC GTG ATG ACC ATT GGC GGT GCC ACC GTC 600 Ala Gly Met Glu Ala Ser Ala Val Met Thr Ile Gly Gly Ala Thr Val 145 150 155 GCC GAT CTT TTT ATC CAG GAG GAG CGC GGT CGG GCC ATG GCC ATT TGG 648 Ala Asp Leu Phe Ile Gln Glu Glu Arg Gly Arg Ala Met Ala Ile Trp 160 165 170 ACG TTT GGC CCG TTG ATG GGT CCT GCT GTT GGT CCC GCT GTG GGA GGG 696 Thr Phe Gly Pro Leu Met Gly Pro Ala Val Gly Pro Ala Val Gly Gly 175 180 185 190 TAT CTT GCC GAG GCC AAG GGT TGG CGG TGG GTG TTT TGG GTG GTC GCC 744 Tyr Leu Ala Glu Ala Lys Gly Trp Arg Trp Val Phe Trp Val Val Ala 195 200 205 ATC GGG GGG GGC TTC ATA ACA GGC ATG TTC TTC CTC ATA GCC CGT GAG 792 Ile Gly Gly Gly Phe Ile Thr Gly Met Phe Phe Leu Ile Ala Arg Glu 210 215 220 ACC TAT CCT CCG GTT CTC CTA CAG CGC AAG GTG AAC CGC CTA CGA CAA 840 Thr Tyr Pro Pro Val Leu Leu Gln Arg Lys Val Asn Arg Leu Arg Gln 225 230 235 GAA ACC GGC AAT CCC CTC CTT ACC TCA GCA CTA GCG GAC ACC TCG AGT 888 Glu Thr Gly Asn Pro Leu Leu Thr Ser Ala Leu Ala Asp Thr Ser Ser 240 245 250 CGA CGC GCT CGG ATT TCC CGG TCT GTC CGC CGG CCC CTC GTC CTC CTC 936 Arg Arg Ala Arg Ile Ser Arg Ser Val Arg Arg Pro Leu Val Leu Leu 255 260 265 270 TTC CGC TCA CCC ATC GTC TTC CTC TTC TCC GTC TTC ATC GCC GTC GTC 984 Phe Arg Ser Pro Ile Val Phe Leu Phe Ser Val Phe Ile Ala Val Val 275 280 285 TTC TCA TAC CAG TTC CTG CTC TTT GTC ACT ATC CCC AGT GTC TTT GGC 1032 Phe Ser Tyr Gln Phe Leu Leu Phe Val Thr Ile Pro Ser Val Phe Gly 290 295 300 GAG ATC TAC GAC TTC TCG CTT GGT CAA ATA GGC CTC TCC TAT CTG GGT 1080 Glu Ile Tyr Asp Phe Ser Leu Gly Gln Ile Gly Leu Ser Tyr Leu Gly 305 310 315 ATT GCG GCG GGC CTG CTG CTG GGG AAT GCC ATA TTC GGC CAA GCC TCT 1128 Ile Ala Ala Gly Leu Leu Leu Gly Asn Ala Ile Phe Gly Gln Ala Ser 320 325 330 GAC CGG ATT CTG TCC AAA AAG TCT GGC GGG ATG GAG TTG AAG CCG GAG 1176 Asp Arg Ile Leu Ser Lys Lys Ser Gly Gly Met Glu Leu Lys Pro Glu 335 340 345 350 TTT CGT CTT CCT CTG ATG ATC CCC GGG GCT TTT TGC ATC CCC ATG TGT 1224 Phe Arg Leu Pro Leu Met Ile Pro Gly Ala Phe Cys Ile Pro Met Cys 355 360 365 TTC TTC ATC TAC GGC TGG GCG ACC TAC TAC AAG CTC CAC TGG ATG ATG 1272 Phe Phe Ile Tyr Gly Trp Ala Thr Tyr Tyr Lys Leu His Trp Met Met 370 375 380 CCC ATC TGT GCG ACG TCG CTC CTC GGC ATT GGC CTC AAC CTG TCA CTC 1320 Pro Ile Cys Ala Thr Ser Leu Leu Gly Ile Gly Leu Asn Leu Ser Leu 385 390 395 ATG ACC ATA CAG GTC TAC CTT GTA GAC ACC TAC ACA CTG TAC TCA GCC 1368 Met Thr Ile Gln Val Tyr Leu Val Asp Thr Tyr Thr Leu Tyr Ser Ala 400 405 410 TCG GCA TTG GCC GCC GCC ACC ATC CTC CGC TCT CTG TTC GGT GCC TTT 1416 Ser Ala Leu Ala Ala Ala Thr Ile Leu Arg Ser Leu Phe Gly Ala Phe 415 420 425 430 CTC CCC CTA GCC GGG CCG CCT CTA TAC GAC GCC CTA GGT CTC GGC TGG 1464 Leu Pro Leu Ala Gly Pro Pro Leu Tyr Asp Ala Leu Gly Leu Gly Trp 435 440 445 GGA AAT TCG ACT CTT GGA TTC ATT GCC GTG GCC CTC ATA CCT GTG CCT 1512 Gly Asn Ser Thr Leu Gly Phe Ile Ala Val Ala Leu Ile Pro Val Pro 450 455 460 TTC CTA TTC ATC CGC TAT GGA GAG GCG ATT AGG ACG AAT CCC CGT TTT 1560 Phe Leu Phe Ile Arg Tyr Gly Glu Ala Ile Arg Thr Asn Pro Arg Phe 465 470 475 CAG CCA GCG CTG TGAACCCCGC CCCTACTGGG TATCCCCATC CATGTTGTCT 1612 Gln Pro Ala Leu 480 CCATGAGGTT TTTGGCTTCG CTTTTATTAT TTCTGTTTCA CGCATTTGAC GAGCTCATGT 1672 GATATTACCA TAGACCATAG AGGAATGAAC AGGAAGCATT TGACCGTTGG TGGGAGCAAG 1732 GTCGCCGTGC ACATGCCAAA GTGTGCAAGA AAATAAGTTG TATCCAAACA CTATCATAAT 1792 GCACGAAAAA TAAATACAGA GAGTCTTATG TAAAAAAAAA AAAAAAAA 1840

【配列表】

配列番号：２ 配列の長さ：３１６９ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源 生物名：アクレモニウム クリソゲナム（Acremonium c
hrysogenum） 株名：ＩＳ−５ 配列の特徴 特徴を表す記号：intron 存在位置：1102..1157, 1615..1675, 2246..2302 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 ACGCGTGAAC GATTGTAACA TAGAAAACAA ATGTGGCTTG CAAAACACAT GTAATTCCGC 60 ATAAAGCCTG AAGAGCGTAA ACACAACATA GAGGGCAGAT TCGGCCGAAC TCAACCGGCT 120 ATGACTCCGT AACGCGCGGA ACAACCACTC AGATATCACC AAGTGCGCCC ACAAAAGGAC 180 CGCACTTTGC TCCTTTGAGA CTCGTACAGG CGGCTGGACG GCCTTGAGAT GCCGATCAAT 240 ACCTTCCTTG GTGGGTGTAC ATGCTGTGCG CCAAGGCATA TGCGGTAATA ATCCGTAACC 300 TGCATACGGA CGTACATGTG CATCACTATA GAGGAGGGTC TATGCAGCAG GGTTTCCATT 360 AATGTTCGAG AATCGAACCA AGTACATGTA CACCGTACGA GAGGCGAATG ACAGGGTGTA 420 TCTGTAGAGT ATACTGGCAC TTTACTCGGT GTACCCATAC GTGGTTCCGC GATTCTGGGT 480 AGGGTCGTAT GTTAGCCGCG TGTTATACTC GCTTATACCA CAGTTGTCTA CATACCAGTC 540 TGTAAGAAAC ACGAAACGAT TTTGGGGAAA TAGAAACAGG GGTCACCGGG GGCCCACGGG 600 ATTACAAGTT CGCCTCGCCC AGACCGAGCC CCAATCAAAT ACATGTACGT CCGTATAGGT 660 GCGTCCCTAT ACGTACGTCT TTCAGGTAGC ACCGGCGGAC CACAGATCCT ATTTTTGGAA 720 CCACATTGGC TTTCGTTACA CTCTGCATTC CTCAACTGTG TCTCGCCAAG GAACAGACAG 780 TCTTCCAGAC CCATTCCAAG GTCCCGTCGT CCCGATCTGT TCACCATCCC CGAATCCATC 840 CCATGTACAT ACGTCAGACT TTTGTTTGTA GACATCACTC TCTGCCCTCC GCCCCTTCGT 900 CTCCAGGCCC AATGACTCCG ACAACACGAA CAGG ATG GTC AAG GCA GAA GAG GAC 955 Met Val Lys Ala Glu Glu Asp 1 5 AGC GCT GCT TTG GAG GCG GCG ATA GAC AAT GGC CGT CGC CAT ATC GTC 1003 Ser Ala Ala Leu Glu Ala Ala Ile Asp Asn Gly Arg Arg His Ile Val 10 15 20 GAC TTC GAT GGG CCG ACA GAC CCC GAC AAT GCC GTC AAT TGG CCC GCA 1051 Asp Phe Asp Gly Pro Thr Asp Pro Asp Asn Ala Val Asn Trp Pro Ala 25 30 35 GCG AGG AAG TGG CTC AAT GTC TTC GTC CTA GCA GCC ATG ACA TTC ATC 1099 Ala Arg Lys Trp Leu Asn Val Phe Val Leu Ala Ala Met Thr Phe Ile 40 45 50 55 GC GTGAGTCCCC TTGGTCTGAT TCCCCGACGG CCGAATACTG ACACCCGCGC CCACAG 1157 Al C GCC CTG GGC TCG TCC ATC GCC GCC CCA GGC GTC AAC CAG GCC ATC 1203 a Ala Leu Gly Ser Ser Ile Ala Ala Pro Gly Val Asn Gln Ala Ile 60 65 70 GTC GAC TTT GAC AGC ACC AGC AGC ATC CTC AGC TCT CTC ATC GTC AGT 1251 Val Asp Phe Asp Ser Thr Ser Ser Ile Leu Ser Ser Leu Ile Val Ser 75 80 85 GTG TAC AAT GTC GGC CTG GCC ATC GGC CCC TTG ATC GTG GCG CCC TTG 1299 Val Tyr Asn Val Gly Leu Ala Ile Gly Pro Leu Ile Val Ala Pro Leu 90 95 100 TCC GAG ATG TAC GGC CGC CTC ATC CCC TAC CAT GTC ACC AAC GTC CTC 1347 Ser Glu Met Tyr Gly Arg Leu Ile Pro Tyr His Val Thr Asn Val Leu 105 110 115 TTC GTC CTC TTC ACC ATC GGG TGC GCC CTC AGT CCC AAC CTC CCC GCC 1395 Phe Val Leu Phe Thr Ile Gly Cys Ala Leu Ser Pro Asn Leu Pro Ala 120 125 130 135 CTT GTC ATC TTC CGT ATG CTG GCC GGC ATG GAG GCT TCT GCC GTG ATG 1443 Leu Val Ile Phe Arg Met Leu Ala Gly Met Glu Ala Ser Ala Val Met 140 145 150 ACC ATT GGC GGT GCC ACC GTC GCC GAT CTT TTT ATC CAG GAG GAG CGC 1491 Thr Ile Gly Gly Ala Thr Val Ala Asp Leu Phe Ile Gln Glu Glu Arg 155 160 165 GGT CGG GCC ATG GCC ATT TGG ACG TTT GGC CCG TTG ATG GGT CCT GCT 1539 Gly Arg Ala Met Ala Ile Trp Thr Phe Gly Pro Leu Met Gly Pro Ala 170 175 180 GTT GGT CCC GCT GTG GGA GGG TAT CTT GCC GAG GCC AAG GGT TGG CGG 1587 Val Gly Pro Ala Val Gly Gly Tyr Leu Ala Glu Ala Lys Gly Trp Arg 185 190 195 TGG GTG TTT TGG GTG GTC GCC ATC GGG GTACGTAGTT GTGTCCATTG 1634 Trp Val Phe Trp Val Val Ala Ile Gly 200 205 TGAGATCGTT CTCCCAGAGG TTTCAGCTGA CCGATGTCTA G GGG GGC TTC ATA 1687 Gly Gly Phe Ile 210 ACA GGC ATG TTC TTC CTC ATA GCC CGT GAG ACC TAT CCT CCG GTT CTC 1735 Thr Gly Met Phe Phe Leu Ile Ala Arg Glu Thr Tyr Pro Pro Val Leu 215 220 225 CTA CAG CGC AAG GTG AAC CGC CTA CGA CAA GAA ACC GGC AAT CCC CTC 1783 Leu Gln Arg Lys Val Asn Arg Leu Arg Gln Glu Thr Gly Asn Pro Leu 230 235 240 CTT ACC TCA GCA CTA GCG GAC ACC TCG AGT CGA CGC GCT CGG ATT TCC 1831 Leu Thr Ser Ala Leu Ala Asp Thr Ser Ser Arg Arg Ala Arg Ile Ser 245 250 255 260 CGG TCT GTC CGC CGG CCC CTC GTC CTC CTC TTC CGC TCA CCC ATC GTC 1879 Arg Ser Val Arg Arg Pro Leu Val Leu Leu Phe Arg Ser Pro Ile Val 265 270 275 TTC CTC TTC TCC GTC TTC ATC GCC GTC GTC TTC TCA TAC CAG TTC CTG 1927 Phe Leu Phe Ser Val Phe Ile Ala Val Val Phe Ser Tyr Gln Phe Leu 280 285 290 CTC TTT GTC ACT ATC CCC AGT GTC TTT GGC GAG ATC TAC GAC TTC TCG 1975 Leu Phe Val Thr Ile Pro Ser Val Phe Gly Glu Ile Tyr Asp Phe Ser 295 300 305 CTT GGT CAA ATA GGC CTC TCC TAT CTG GGT ATT GCG GCG GGC CTG CTG 2023 Leu Gly Gln Ile Gly Leu Ser Tyr Leu Gly Ile Ala Ala Gly Leu Leu 310 315 320 CTG GGG AAT GCC ATA TTC GGC CAA GCC TCT GAC CGG ATT CTG TCC AAA 2071 Leu Gly Asn Ala Ile Phe Gly Gln Ala Ser Asp Arg Ile Leu Ser Lys 325 330 335 340 AAG TCT GGC GGG ATG GAG TTG AAG CCG GAG TTT CGT CTT CCT CTG ATG 2119 Lys Ser Gly Gly Met Glu Leu Lys Pro Glu Phe Arg Leu Pro Leu Met 345 350 355 ATC CCC GGG GCT TTT TGC ATC CCC ATG TGT TTC TTC ATC TAC GGC TGG 2167 Ile Pro Gly Ala Phe Cys Ile Pro Met Cys Phe Phe Ile Tyr Gly Trp 360 365 370 GCG ACC TAC TAC AAG CTC CAC TGG ATG ATG CCC ATC TGT GCG ACG TCG 2215 Ala Thr Tyr Tyr Lys Leu His Trp Met Met Pro Ile Cys Ala Thr Ser 375 380 385 CTC CTC GGC ATT GGC CTC AAC CTG TCA CTC GTAAGTCTTC TTCCTGCCAC 2265 Leu Leu Gly Ile Gly Leu Asn Leu Ser Leu 390 495 TGGGATTCTT GAAACACCGT CTCACTCGCT ATCGCAG ATG ACC ATA CAG GTC TAC 2320 Met Thr Ile Gln Val Tyr 400 CTT GTA GAC ACC TAC ACA CTG TAC TCA GCC TCG GCA TTG GCC GCC GCC 2368 Leu Val Asp Thr Tyr Thr Leu Tyr Ser Ala Ser Ala Leu Ala Ala Ala 405 410 415 420 ACC ATC CTC CGC TCT CTG TTC GGT GCC TTT CTC CCC CTA GCC GGG CCG 2416 Thr Ile Leu Arg Ser Leu Phe Gly Ala Phe Leu Pro Leu Ala Gly Pro 425 430 435 CCT CTA TAC GAC GCC CTA GGT CTC GGC TGG GGA AAT TCG ACT CTT GGA 2464 Pro Leu Tyr Asp Ala Leu Gly Leu Gly Trp Gly Asn Ser Thr Leu Gly 440 445 450 TTC ATT GCC GTG GCC CTC ATA CCT GTG CCT TTC CTA TTC ATC CGC TAT 2512 Phe Ile Ala Val Ala Leu Ile Pro Val Pro Phe Leu Phe Ile Arg Tyr 455 460 465 GGA GAG GCG ATT AGG ACG AAT CCC CGT TTT CAG CCA GCG CTG 2554 Gly Glu Ala Ile Arg Thr Asn Pro Arg Phe Gln Pro Ala Leu 470 475 480 TGAACCCCGC CCCTACTGGG TATCCCCATC CATGTTGTCT CCATGAGGTT TTTGGCTTCG 2614 CTTTTATTAT TTCTGTTTCA CGCATTTGAC GAGCTCATGT GATATTACCA TAGACCATAG 2674 AGGAATGAAC AGGAAGCATT TGACCGTTGG TGGGAGCAAG GTCGCCGTGC ACATGCCAAA 2734 GTGTGCAAGA AAATAAGTTG TATCCAAACA CTATCATAAT GCACGAAAAA TAAATACAGA 2794 GAGTCTTATG TATCAGGGGA TTTCACGTTA TATTATATCA TGAGCGTCAC TATCCTTCTA 2854 TTGTCATCCT TCGTTCCTGT TCGAATCTTC AAGACGCATC TTGGAGCGGG CTGTCGCGGG 2914 TTACCCTGTG TCCCAACTCC CAAGTAACGG TGAATATGGC TTGTGAGGCC ACGGTACTCA 2974 AACATTGCTA GCTGCGTAGC CGAAATTTGC TAGTTGGAAT TCACGATCAC TATTTATATC 3034 GGCAATTACA AGGCAAAAGC ATTAGTAGGC CATTTCGTGT GTTAATATTG TGGTCTTCCC 3094 CACCAACAGG AAGAACACAA AGACGCCGGA CTTCCCCAAC AGCTTACGGA TTGAACCACC 3154 GTAGGGGGGT TTATT 3169

【配列表】

配列番号：３ 配列の長さ：１８４５ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA 起源 生物名：アクレモニウム クリソゲナム（Acremonium c
hrysogenum） 株名：ＩＳ−５ 配列の特徴 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：３３．．１７１８ 特徴を決定した方法：Ｐ 配列 CTTCCATTCA ACAGTCAATT CAATGGTCAG CT ATG GCG AAC AAT TCT GGA ACA 53 Met Ala Asn Asn Ser Gly Thr 1 5 ACA ACA GTG CAA CTG GAC GAT GTG CTC GAG AGA TCG TCC ACA TTG AAC 101 Thr Thr Val Gln Leu Asp Asp Val Leu Glu Arg Ser Ser Thr Leu Asn 10 15 20 ACC CTC AAC AAC ATC GAC ACC GTC CAA CAT CAT GAA CCC CGT ACC TCC 149 Thr Leu Asn Asn Ile Asp Thr Val Gln His His Glu Pro Arg Thr Ser 25 30 35 TTC GCC AAC AAC CGG CAA CAA GCC CCA GCG GGG GGC TCC TCA CAG TCC 197 Phe Ala Asn Asn Arg Gln Gln Ala Pro Ala Gly Gly Ser Ser Gln Ser 40 45 50 55 GAC GCG ACC GTG GGC CCC CGG CAC AAG CTC GTC ACC TTC GCT CCC GAT 245 Asp Ala Thr Val Gly Pro Arg His Lys Leu Val Thr Phe Ala Pro Asp 60 65 70 GAC CCG GAG AAC CCC AAG AAT TGG TCC AAA GCA TAC AAG TGG TAC TGC 293 Asp Pro Glu Asn Pro Lys Asn Trp Ser Lys Ala Tyr Lys Trp Tyr Cys 75 80 85 ACC CTA GTT GTT TCG TTG ACG TGC TTC GTC GTG GCG TTC GCC TCG TCC 341 Thr Leu Val Val Ser Leu Thr Cys Phe Val Val Ala Phe Ala Ser Ser 90 95 100 GTC ATC AGC GCG GAT ATA GAT GGC GTG ATG GAA GAG TTC AAC GTG AGC 389 Val Ile Ser Ala Asp Ile Asp Gly Val Met Glu Glu Phe Asn Val Ser 105 110 115 GAG ACG GCG GCC CTC GTG AGC ATC TCG GTG TTT GTT GTC GGA TTC GGT 437 Glu Thr Ala Ala Leu Val Ser Ile Ser Val Phe Val Val Gly Phe Gly 120 125 130 135 GTC GGA CCC ATG GTT TTT GCG CCC TTG TCC GAG GTG TAT GGG CGC AGG 485 Val Gly Pro Met Val Phe Ala Pro Leu Ser Glu Val Tyr Gly Arg Arg 140 145 150 ATC ATC TAT GGA TCT AAG CTG CTT TTT GCC GTC ATC TTC GTC ATC CCC 533 Ile Ile Tyr Gly Ser Lys Leu Leu Phe Ala Val Ile Phe Val Ile Pro 155 160 165 TGC GCC GTG TCC AAG AAT CTC GGA ACG CTA CTC GCT TGC CGC GCC ATT 581 Cys Ala Val Ser Lys Asn Leu Gly Thr Leu Leu Ala Cys Arg Ala Ile 170 175 180 GAC GGT ATC GCC TTC TCC GCG CCG ATG ACT CTG GTC GGC GGC ACC CTT 629 Asp Gly Ile Ala Phe Ser Ala Pro Met Thr Leu Val Gly Gly Thr Leu 185 190 195 GCC GAT ATG TGG AAG AAT GAA GAG CGT GGC GTC CCA ATG GCG GCG TTT 677 Ala Asp Met Trp Lys Asn Glu Glu Arg Gly Val Pro Met Ala Ala Phe 200 205 210 215 TCC GCG GCA CCA TTT GCC GGG CCA GCC ATC GGT CCC CTC GTG GGC GGC 725 Ser Ala Ala Pro Phe Ala Gly Pro Ala Ile Gly Pro Leu Val Gly Gly 220 225 230 TAC CTC TCC GAC GCG GCC GGC TGG CGC TGG CTC TAC TGG ATC CAG CTC 773 Tyr Leu Ser Asp Ala Ala Gly Trp Arg Trp Leu Tyr Trp Ile Gln Leu 235 240 245 ATC CTT TCG GGT ATC ATC TGG ATC CTC ATC ACC TTC ACC GTC CCC GAG 821 Ile Leu Ser Gly Ile Ile Trp Ile Leu Ile Thr Phe Thr Val Pro Glu 250 255 260 ACA TAC GCA CCC ACA ATC CTC GCC AAG CGC GCC CGC AAG CTC CGC AAG 869 Thr Tyr Ala Pro Thr Ile Leu Ala Lys Arg Ala Arg Lys Leu Arg Lys 265 270 275 TCC ACC GGC GAC CCG AAC CAC GTC ACC GAG CAG GAG CTA GAC CCT CGA 917 Ser Thr Gly Asp Pro Asn His Val Thr Glu Gln Glu Leu Asp Pro Arg 280 285 290 295 Pro Ile Ser Glu Gln Leu Arg Val Phe Leu Thr Arg Pro Phe Gln Leu 300 305 310 CTC TTC GGC GAG CTC ATC GTC TTA CTT ATA TCG CTG TAC ATG AGT GTC 1013 Leu Phe Gly Glu Leu Ile Val Leu Leu Ile Ser Leu Tyr Met Ser Val 315 320 325 CTG TAC GGC CTG TTG TAC ATG TTC TTC ATC GCC TAC CCC ATC GTC TAC 1061 Leu Tyr Gly Leu Leu Tyr Met Phe Phe Ile Ala Tyr Pro Ile Val Tyr 330 335 340 AAG GGA GGC AAA GGC TAC TCG TCC GGC AAG ACG GGA CTC ATG TTC ATC 1109 Lys Gly Gly Lys Gly Tyr Ser Ser Gly Lys Thr Gly Leu Met Phe Ile 345 350 355 CCC GTG GCC GTG GGT GTC GTG CTC TCG GCG TGC TGC TCG CCT TTT GTC 1157 Pro Val Ala Val Gly Val Val Leu Ser Ala Cys Cys Ser Pro Phe Val 360 365 370 375 AAC ACC CAC TAC ATC TCA TTG GCA CAC TTC CAC GGC GGC AAG CCG CCG 1205 Asn Thr His Tyr Ile Ser Leu Ala His Phe His Gly Gly Lys Pro Pro 380 385 390 GCC GAG GTG CGC CTC ATC CCC ATG ATG TTG TCG TGC TGG CTC ATC CCC 1253 Ala Glu Val Arg Leu Ile Pro Met Met Leu Ser Cys Trp Leu Ile Pro 395 400 405 ATC GGA CTC TTC ATC TTC GCG TGG ACG TCA TAC CCG TGG CTG TCG TGG 1301 Ile Gly Leu Phe Ile Phe Ala Trp Thr Ser Tyr Pro Trp Leu Ser Trp 410 415 420 GCT GGT CCC GCC ATG GGT GGC TTC CCC GTC GGC TTC GGC TTC ATC TTC 1349 Ala Gly Pro Ala Met Gly Gly Phe Pro Val Gly Phe Gly Phe Ile Phe 425 430 435 CTC TAC AAT TCG GCC AAC AAC TAC CTC GTC GAT TCG TAC CAG CAC CAG 1397 Leu Tyr Asn Ser Ala Asn Asn Tyr Leu Val Asp Ser Tyr Gln His Gln 440 445 450 455 GCG GCC TCG GCC CTC GCG GCC AAG ACC TTC ATC CGA AGC TTC TGG GGT 1445 Ala Ala Ser Ala Leu Ala Ala Lys Thr Phe Ile Arg Ser Phe Trp Gly 460 465 470 GCA GGT GTG GTG CTC TTT ACT AAA CAG ATG TAC TCC CGC CTG GGC GAC 1493 Ala Gly Val Val Leu Phe Thr Lys Gln Met Tyr Ser Arg Leu Gly Asp 475 480 485 CAG TGG GCC TCG TCG CTT ATT GCC TTC CTC GCT CTC GCG TGT TGC GCC 1541 Gln Trp Ala Ser Ser Leu Ile Ala Phe Leu Ala Leu Ala Cys Cys Ala 490 495 500 ATC CCT TTC CTT TTC TGG AAG TAC GGT GCC CGC ATC CGT GCT CGG AGC 1589 Ile Pro Phe Leu Phe Trp Lys Tyr Gly Ala Arg Ile Arg Ala Arg Ser 505 510 515 AAG TAC GCC TAC GCT GGC GAC GAG ACG CCA GCG GAT GTC GAG AAG GCC 1637 Lys Tyr Ala Tyr Ala Gly Asp Glu Thr Pro Ala Asp Val Glu Lys Ala 520 525 530 535 AAG CAG AGG CCG GCG GAG GCG GGC GTC CTC GCC GAC GCC GAC GAC CTC 1685 Lys Gln Arg Pro Ala Glu Ala Gly Val Leu Ala Asp Ala Asp Asp Leu 540 545 550 AGG AGG GCT ATC AGC TAC GTG AGC AAC CCT TAAGCGGTTG TACAACGGGT 1735 Arg Arg Ala Ile Ser Tyr Val Ser Asn Pro 555 560 GTTTTCGTAC GCCTTATATA CTAGAGCGGG AGATATCCTT CCGTCCATTT CGTTTTGTGT 1795 TTTATTGATA CTTAGCTTTC CCCAAAAAAA AAAAAAAAAA 1835

【配列表】

配列番号：４ 配列の長さ：３９６９ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源 生物名：アクレモニウム クリソゲナム（Acremonium c
hrysogenum） 株名：ＩＳ−５ 配列の特徴 特徴を表す記号：intron 存在位置：９５８．．１０１８ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 AAGCTTTGTT TTGATCTGCA TGTTGCGGAG ATGGTGAGGA CCCATGGTCA TCTACATACC 60 CAGCTGAGAG TGATCACAAT AAACGGCCCC GGAGATTTCT CGCAATTCCA GCGGAGACTG 120 CCCCCACGGG TGAACAAGAA AAAGGAATAC CACCGCGAAC TTGGCTCTCG TTCCATCTTT 180 ACTACCGACT GGACCCATAA TTAAAAAGTG GGTCTCCCGC TCCGGCCCCG GCCCCACCGA 240 GGGGCGAAGT ACAGTACGCA TCCGCCGCAT TCTGACTGGT GATGGTGGCC CGAGGATGGA 300 GAGCTAAATC GGTTATGACG GCATTTGTGC AATAAACTTG GGAGTTGATG ATCGGCCGCC 360 GTACCAAGAA TTTGCCGTGT ACTACCTGCT CTCTATAAAT AAGACAAGCT CCCCTCCGCC 420 TCATGATGTT TGTGTGTGTG TGTGAGCGTG AGGTGTGGTT CCTACTTCCA TTCAACAGTC 480 AATTCAATGG TCAGCT ATG GCG AAC AAT TCT GGA ACA ACA ACA GTG CAA CTG 532 Met Ala Asn Asn Ser Gly Thr Thr Thr Val Gln Leu 1 5 10 GAC GAT GTG CTC GAG AGA TCG TCC ACA TTG AAC ACC CTC AAC AAC ATC 580 Asp Asp Val Leu Glu Arg Ser Ser Thr Leu Asn Thr Leu Asn Asn Ile 15 20 25 GAC ACC GTC CAA CAT CAT GAA CCC CGT ACC TCC TTC GCC AAC AAC CGG 628 Asp Thr Val Gln His His Glu Pro Arg Thr Ser Phe Ala Asn Asn Arg 30 35 40 CAA CAA GCC CCA GCG GGG GGC TCC TCA CAG TCC GAC GCG ACC GTG GGC 676 Gln Gln Ala Pro Ala Gly Gly Ser Ser Gln Ser Asp Ala Thr Val Gly 45 50 55 60 CCC CGG CAC AAG CTC GTC ACC TTC GCT CCC GAT GAC CCG GAG AAC CCC 724 Pro Arg His Lys Leu Val Thr Phe Ala Pro Asp Asp Pro Glu Asn Pro 65 70 75 AAG AAT TGG TCC AAA GCA TAC AAG TGG TAC TGC ACC CTA GTT GTT TCG 772 Lys Asn Trp Ser Lys Ala Tyr Lys Trp Tyr Cys Thr Leu Val Val Ser 80 85 90 TTG ACG TGC TTC GTC GTG GCG TTC GCC TCG TCC GTC ATC AGC GCG GAT 820 Leu Thr Cys Phe Val Val Ala Phe Ala Ser Ser Val Ile Ser Ala Asp 95 100 105 ATA GAT GGC GTG ATG GAA GAG TTC AAC GTG AGC GAG ACG GCG GCC CTC 868 Ile Asp Gly Val Met Glu Glu Phe Asn Val Ser Glu Thr Ala Ala Leu 110 115 120 GTG AGC ATC TCG GTG TTT GTT GTC GGA TTC GGT GTC GGA CCC ATG GTT 916 Val Ser Ile Ser Val Phe Val Val Gly Phe Gly Val Gly Pro Met Val 125 130 135 140 TTT GCG CCC TTG TCC GAG GTG TAT GGG CGC AGG ATC ATC TA GTATGTCTCT 967 Phe Ala Pro Leu Ser Glu Val Tyr Gly Arg Arg Ile Ile Ty 145 150 TCCCTTTCCT CAACTCTAAC TCGGGAGGTC TGTGTGGCTG ACCTGTTCTA G T GGA 1022 r Gly 155 TCT AAG CTG CTT TTT GCC GTC ATC TTC GTC ATC CCC TGC GCC GTG TCC 1070 Ser Lys Leu Leu Phe Ala Val Ile Phe Val Ile Pro Cys Ala Val Ser 160 165 170 AAG AAT CTC GGA ACG CTA CTC GCT TGC CGC GCC ATT GAC GGT ATC GCC 1118 Lys Asn Leu Gly Thr Leu Leu Ala Cys Arg Ala Ile Asp Gly Ile Ala 175 180 185 TTC TCC GCG CCG ATG ACT CTG GTC GGC GGC ACC CTT GCC GAT ATG TGG 1166 Phe Ser Ala Pro Met Thr Leu Val Gly Gly Thr Leu Ala Asp Met Trp 190 195 200 AAG AAT GAA GAG CGT GGC GTC CCA ATG GCG GCG TTT TCC GCG GCA CCA 1214 Lys Asn Glu Glu Arg Gly Val Pro Met Ala Ala Phe Ser Ala Ala Pro 205 210 215 TTT GCC GGG CCA GCC ATC GGT CCC CTC GTG GGC GGC TAC CTC TCC GAC 1262 Phe Ala Gly Pro Ala Ile Gly Pro Leu Val Gly Gly Tyr Leu Ser Asp 220 225 230 235 GCG GCC GGC TGG CGC TGG CTC TAC TGG ATC CAG CTC ATC CTT TCG GGT 1310 Ala Ala Gly Trp Arg Trp Leu Tyr Trp Ile Gln Leu Ile Leu Ser Gly 240 245 250 ATC ATC TGG ATC CTC ATC ACC TTC ACC GTC CCC GAG ACA TAC GCA CCC 1358 Ile Ile Trp Ile Leu Ile Thr Phe Thr Val Pro Glu Thr Tyr Ala Pro 255 260 265 ACA ATC CTC GCC AAG CGC GCC CGC AAG CTC CGC AAG TCC ACC GGC GAC 1406 Thr Ile Leu Ala Lys Arg Ala Arg Lys Leu Arg Lys Ser Thr Gly Asp 270 275 280 CCG AAC CAC GTC ACC GAG CAG GAG CTA GAC CCT CGA CCC ATC AGT GAG 1454 Pro Asn His Val Thr Glu Gln Glu Leu Asp Pro Arg Pro Ile Ser Glu 285 290 295 CAG CTG CGC GTC TTT CTC ACG CGG CCC TTC CAG CTG CTC TTC GGC GAG 1502 Gln Leu Arg Val Phe Leu Thr Arg Pro Phe Gln Leu Leu Phe Gly Glu 300 305 310 315 CTC ATC GTC TTA CTT ATA TCG CTG TAC ATG AGT GTC CTG TAC GGC CTG 1550 Leu Ile Val Leu Leu Ile Ser Leu Tyr Met Ser Val Leu Tyr Gly Leu 320 325 330 TTG TAC ATG TTC TTC ATC GCC TAC CCC ATC GTC TAC AAG GGA GGC AAA 1598 Leu Tyr Met Phe Phe Ile Ala Tyr Pro Ile Val Tyr Lys Gly Gly Lys 335 340 345 Gly Tyr Ser Ser Gly Lys Thr Gly Leu Met Phe Ile Pro Val Ala Val 350 355 360 GGT GTC GTG CTC TCG GCG TGC TGC TCG CCT TTT GTC AAC ACC CAC TAC 1694 Gly Val Val Leu Ser Ala Cys Cys Ser Pro Phe Val Asn Thr His Tyr 365 370 375 ATC TCA TTG GCA CAC TTC CAC GGC GGC AAG CCG CCG GCC GAG GTG CGC 1742 Ile Ser Leu Ala His Phe His Gly Gly Lys Pro Pro Ala Glu Val Arg 380 385 390 395 CTC ATC CCC ATG ATG TTG TCG TGC TGG CTC ATC CCC ATC GGA CTC TTC 1790 Leu Ile Pro Met Met Leu Ser Cys Trp Leu Ile Pro Ile Gly Leu Phe 400 405 410 ATC TTC GCG TGG ACG TCA TAC CCG TGG CTG TCG TGG GCT GGT CCC GCC 1838 Ile Phe Ala Trp Thr Ser Tyr Pro Trp Leu Ser Trp Ala Gly Pro Ala 415 420 425 ATG GGT GGC TTC CCC GTC GGC TTC GGC TTC ATC TTC CTC TAC AAT TCG 1886 Met Gly Gly Phe Pro Val Gly Phe Gly Phe Ile Phe Leu Tyr Asn Ser 430 435 440 GCC AAC AAC TAC CTC GTC GAT TCG TAC CAG CAC CAG GCG GCC TCG GCC 1934 Ala Asn Asn Tyr Leu Val Asp Ser Tyr Gln His Gln Ala Ala Ser Ala 445 450 455 CTC GCG GCC AAG ACC TTC ATC CGA AGC TTC TGG GGT GCA GGT GTG GTG 1982 Leu Ala Ala Lys Thr Phe Ile Arg Ser Phe Trp Gly Ala Gly Val Val 460 465 470 475 CTC TTT ACT AAA CAG ATG TAC TCC CGC CTG GGC GAC CAG TGG GCC TCG 2030 Leu Phe Thr Lys Gln Met Tyr Ser Arg Leu Gly Asp Gln Trp Ala Ser 480 485 490 TCG CTT ATT GCC TTC CTC GCT CTC GCG TGT TGC GCC ATC CCT TTC CTT 2078 Ser Leu Ile Ala Phe Leu Ala Leu Ala Cys Cys Ala Ile Pro Phe Leu 495 500 505 TTC TGG AAG TAC GGT GCC CGC ATC CGT GCT CGG AGC AAG TAC GCC TAC 2126 Phe Trp Lys Tyr Gly Ala Arg Ile Arg Ala Arg Ser Lys Tyr Ala Tyr 510 515 520 GCT GGC GAC GAG ACG CCA GCG GAT GTC GAG AAG GCC AAG CAG AGG CCG 2174 Ala Gly Asp Glu Thr Pro Ala Asp Val Glu Lys Ala Lys Gln Arg Pro 525 530 535 GCG GAG GCG GGC GTC CTC GCC GAC GCC GAC GAC CTC AGG AGG GCT ATC 2222 Ala Glu Ala Gly Val Leu Ala Asp Ala Asp Asp Leu Arg Arg Ala Ile 540 545 550 555 AGC TAC GTG AGC AAC CCT TAAGCGGTTG TACAACGGGT GTTTTCGTAC 2270 Ser Tyr Val Ser Asn Pro 560 GCCTTATATA CTAGAGCGGG AGATATCCTT CCGTCCATTT CGTTTTGTGT TTTATTGATA 2330 CTTAGCTTTC CCCAGTTTCG TCTCAATATG CGCTGTGTGT GTGCGTGTGT GTGTTTGTGT 2390 GTGGCGTTAG CAGGACTCAC CATTTAACCA GCATCAAAAG TTTCAGATGA CCGTACATAG 2450 ACAGAGATAC CAGAATATAG AATTCAATCA TCCACATCAA TTTAAACATT GCGCACCGGG 2510 TCAGGGACCT TGGACCTCAA TTCGGGCTCC TTGGTCAGCG AGTTCTTGCA TGTTCCCTCC 2570 TTGATGAACT CCTCCAGGTT ACGCAGCGTG CACTGTGCAA TCTCCTCGAG CGCCTCTTCG 2630 GTGAAGAAGG CCTGGTGTCC CGTGACGATG ACGTTGGGGA ATGTCATGAG GCGCATGAGG 2690 ACATCGTCGT GGATAATCTC ACCGGAGTGG TCGTCGTAGA ACAGTGAGCC TTCGGCCTCG 2750 TACACGTCGA GGGCTACGCC GCCAATGTGC TTTGTTTTGA GGGCCTTGAT GACTGCACGG 2810 GTGTCCACAA GGCCACCGCG GGACGTGTTG ATGAGGAGGA CACCCTTTTT CATCTTGGCG 2870 ATTGTGTCGC CGTTGATGAT GTGCCGCGTG TTGTCCATGA GGGGACAGTG GAGGCTGACA 2930 ATATCCGACT CGGACAGCAA CGTGTCCAGG TCCTTGTACT CGCCGTACTC CTCAAACGCA 2990 GGCGAGGGAA ATGGGTCGCT AGCAAGGACG CGGCACCCGA AGCCCTTCAT GATCCTCGCC 3050 GTGGCCAAGC CGATCTTGCC CACGCCCACT AGCCCGACCG TCTTGCCGTG CAGTGTCTTA 3110 CCCAGGAGGC CGTGGAGGGC AAAGTTGCCC TCGCGCACGC GGTTGTAGGC GCGGTGGGTG 3170 TTGCGGTTGA GTGTCTGGAT CAGGGCTACC GCGAACTCGG CGACGGCCTC TGGCGAGTAC 3230 GACGGCACGT TGGCGACCAT GATGCCGTGT CGGGCGGCGG CGGCGAGGTC GACGTGATTG 3290 AAGCCGGCGC AGCGGAGGAG GATGGCCTTG ACACCCTGCC TGGCGAGGGT CTCGATGACG 3350 TGAGCGGAGA GGGAGTCATT TACGAAGGCG CAGACGGCAT CGGCGTCCCT AACCGTGGAG 3410 ACGGTGTCCT CATTGAGGGG GATGTCGTGG TAGGTTATCG TGACGGGTGA CGGCGGATCC 3470 CTGGCGGCGT GGGCGAGGCC AAAGGACTTT TTATCGTACG GTTTGGCGCT GAAGAAGGAG 3530 AGTCTCATAG TGAGTGACTA ATAGCTACTA GTAGGTGTTT CGGATGGAGA CGAGCCAGAT 3590 GACTTTTGTT GATGACGACG ATGGAAAAGA GACGAGGGAA GATGAGTGTC GTACGATCTG 3650 AAGGAGGAGG AAATAAGATA GGAAGGTGGG CGGGGGTGGT GATGACGACT CTTGACGAGT 3710 GAATATGCTT GGGCGCTCCT GCCACATTCC CCAACTTTTC GAGTTGCCAT GCACCCAAGG 3770 CATTTATGAA TAATACCCTT CGGTTGCCTG CATTTGTATT AGTATTTTAT GCTAGTAATT 3830 GGGCGCACCA ATATCGTGGC CCTGCACGCA TATCTCTCGG TCTGGAACCC CCCCTCTCTA 3890 TGCGAGCCTA ATGCCCGCAA TGCCCGCATG CCTTGTTTCA AGGTTCACTA TCCCCTGCCA 3950 AGATTGACGC CTGGGATCC 3969

【配列表】

配列番号：５ 配列の長さ：２５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 GTGTCTTTGGCGAGATCTACGACTT 25

【配列表】 配列番号：６ 配列の長さ：２４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ配列 CCTACGGTGGTTCAATCCGTAAGC 24

【配列表】

配列番号：７ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 AACTTGGGAGTTGATGATCGG 21

【配列表】

配列番号：８ 配列の長さ：２２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ACATGCAAGAACTCGCTGACCA 22

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 アクレモニウム・クリソゲナム由来であ
   り、セファロスポリンＣ生合成に関与する遺伝子を含む
   ＤＮＡ断片。
2. 【請求項２】 遺伝子が、配列表の配列番号１のアミノ
   酸配列１〜４８２位をコードする塩基配列である請求項
   １記載のＤＮＡ断片。
3. 【請求項３】 塩基配列が、配列表の配列番号１の塩基
   １２７〜１５７２位の配列である請求項２記載のＤＮＡ
   断片。
4. 【請求項４】 遺伝子が、配列表の配列番号２の塩基５
   ３５〜２５５４位の配列である請求項１記載のＤＮＡ断
   片。
5. 【請求項５】 遺伝子が、配列表の配列番号３のアミノ
   酸配列１〜５６１位をコードする塩基配列である請求項
   １記載のＤＮＡ断片。
6. 【請求項６】 塩基配列が、配列表の配列番号３の塩基
   ３３〜１７１５位の配列である請求項５記載のＤＮＡ断
   片。
7. 【請求項７】 遺伝子が、配列表の配列番号４の塩基４
   ９７〜２２４０位の配列である請求項１記載のＤＮＡ断
   片。