JP2001507923A - ストレプトマイセス・グローセスセンスｇｌａ．ｏ由来の偽オリゴ糖の生合成遺伝子の単離およびそれらの使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、アカルボースおよび相同偽オリゴ糖の生合成遺伝子を含有する組換えＤＮＡ分子；該分子のPCR増幅用オリゴヌクレオチドプライマー；該分子上に配置された遺伝子の発現によって得ることができるタンパク質；該ＤＮＡ分子を含有するベクターおよび宿主細胞；該ＤＮＡ分子によってコードされたタンパク質；該宿主細胞内で該ベクターによって発現するタンパク質；相当する宿主微生物での該同定遺伝子の浸潤および／または排除によるアカルボースの生産法；アカルボース生合成遺伝子の遺伝子クラスターを完成させる方法；ストレプトマイセス・グローセスセンスGLA.O以外の他の微生物において類似の遺伝子クラスターを単離する方法；内生アカルボース生合成遺伝子のプロモーターを変異させて、アカルボースの生産を増大させる方法；アカルボースの生産のためのストレプトマイセス・グローセスセンスGLA.Oの使用；並びにアカルボース収量に関して最適化されたストレプトマイセス・グローセスセンスGLA.Oの変異体に関する。

Description

【発明の詳細な説明】 ストレプトマイセス・グローセスセンスGLA.O由来の 偽オリゴ糖の生合成遺伝子の単離およびそれらの使用 本発明はα−アミラーゼ阻害剤、いわゆる偽オリゴ糖の生合成に関する酵素を コードする遺伝子の単離に関する。これに関連する遺伝子としては、特にストレ プトマイセス科系統ストレプトマイセス・グローセスセンス(Streptmyces glauc escens)GLA.O(DSM 40716)由来の遺伝子がある。さらに本発明は、ストレプトマ イセス・グローセスセンスGLA.Oによりアカルボースおよび相同物質を生産する ためのこれら遺伝子の使用、生産の増大および安定化を目的とする、偽オリゴ糖 （例えばアクチノプラーネス種(Actinoplanes sp)SE50/100を産生する他系統で のこれら遺伝子の異種発現、並びに、大腸菌(E．coli)、バチルス・ズブチルス( Bacillus subtilis)、およびストレプトマイセス、アクチノプラーネス、アンプ ラリエラ(Ampullariella)およびストレプトポランギウム(Streptoporangium)系 統、ストレプトマイセス・ヒグロスコピカス・リモネウス種(Streptomyces hygr oscopicus var．limoneus)、およびストレプトマイセス・グローセスセンスなど の放線菌目(Actinomycetales)、並びにバイオテクノロジー関連真菌類（例えば アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)およびペニシリウム・クリソゲナ ム(Penicillium chrysogenum)）および酵母（例えばサッカロミセス・セレビシ エ(Saccharomyces cerevisiae)などの他の微生物でのそれらの異種発現について 記載する。本発明はまた、他の微生物の相同遺伝子およびそれらの単離法に関す る。 ストレプトマイセス・グローセスセンスGLA.Oは２種の抗生物質、すなわちヒ ドロキシストレプトマイシン(Hutter(1967)Systematik der Streptomyceten (Taxonomy of the Streptomycetes)．Basel，Karger Verlag)とテトラセノマイ シン(Weber et al.(1979)Arch．Microbial．121:111-116)を産生する。ストレプ トマイセス科は構造的に多様な天然産物を合成し得ることが知られている。しか しながら、これら化合物が産生される条件は知られていないことが多い。あるい は、この物質は極めて微量でしか産生されず、検出できない。 α−アミラーゼ阻害剤であるアカルボース（acarbose）が種々のアクチノプラ ーネス系統(SE50、SE82およびSE18)から単離されている(Schmidt et al.(1977)N aturwissenschaften 64:535-536)。この活性物質はアクチノプラーネス属、アン プラリエラ属、およびストレプトポランギウム属の微生物に由来するα-アミラ ーゼ阻害剤に関するスクリーニングに付随して発見された。アカルボースとは、 アミノ糖、すなわち4,6-ジデオキシ-4-アミノ-D-グルコピラノースが結合する稀 な不飽和サイクリトール単位からなる偽四糖類である。さらにα-1,4-グリコシ ド結合したD-グルコピラノース単位がこのアミノ糖と結合することができる。か くして、アカルボースは、例えば、さらに２個のD-グルコース分子を含む。この 産生株は、長さの異なる糖側鎖を有する偽オリゴ糖生成物の混合物を合成する(S chmidt et al.(1977)Naturwisssenschaften 64:535-536)。このアカルボースサ イクリトール残基は、ストレプトマイセス・ヒグロスコピカス・リモネウス種由 来の抗生物質バリダマイシンＡ(Iwasa et al．(1979)J．Antibiot．32:595-602) の成分である化合物バリエナミンと同一である。 アカルボースはアクチノプラーネス系統を用いる発酵によって生産でき、糖尿 病用治療薬として経済的重要性を持つに至っている。アクチノプラーネスはα- アミラーゼ阻害剤生成物の混合物を合成するが、それは645.5の相対分子量を有 する化合物（２個のグルコース単位を含むアカルビオシン）に過ぎず(Truscheit (1984)VIIIth Intemational Symposium on Medicinal Chemistry，Proc．Vol.1 ．Swedish Academy of Pharmaceutical Sciences，Stockholm，Sweden)、これ はアカルボースという属名で使用されている。発酵条件は、アカルボースが確実 にその発酵の主生成物となるよう選択される。別法としては、アカルボースが主 生成物として形成される特定の選択物および系統の使用、もしくは選択的単離を 達成する精製法の使用がある(Truscheit(1984)VIIIth Intemational Symposium on Medicinal Chemistry，Proc．Vol．1．Swedish Academy of Pharmaceutical Sciences，Stockholm，Sweden)。また、生成混合物を化学的に順々に変換して、 最終的に所望の生成物であるアカルボースを得ることも可能である。 ストレプトマイセス属とは対照的に、アクチノプラーネス属は遺伝的見地から これまで鋭意検討されて来なかった。ストレプトマイセス属のために確立された 方法はアクチノプラーネス属には転用できないか、もしくは常に転用できるとは 限らない。意図してアカルボース産生を最適化する分子生物学的方法を使用する ためには、アカルボース生合成に関する遺伝子を単離・同定しなければならない 。これに関連して、その可能性はアクチノプラーネス種用の宿主／ベクター系を 計画する試みそのものを示唆するものである。しかしながら、アクチノプラーネ スに関する研究がどちらかと言えば表層的であったという事実のために、これは 極めて単調で苦心を要するものである。 本願発明は、アカルボースおよび相同偽オリゴ糖の生合成遺伝子をクローニン グことを目的とする。これら遺伝子は遺伝学的に十分に研究され来た(Crameri e t al．(1983)J．Gen．Microbial．129:519-527;Hintermarm et al．(1984)Mol． Gen．Genet．196:513-520;Motamedi and Hutchinson（1987）PNAS USA 84:4445- 4449;Geistlich et al．(1989)Mol．Microbiol．3:1061-1069)ストレプトマイセ ス科であり、また驚くべきことにアカルボースプロデューサーでもあるストレプ トマイセス・グローセスセンスGLA.Oからクローニングされる。デンプン含有培 地において、ストレプトマイセス・グローセスセンスGLA.Oは645、807および970 の分子量を有する偽オリゴ糖を産生する。 従って本発明の内容の一部分は、対応する生合成遺伝子のストレプトマイセス ・グローセスセンスGLA.Oからの単離、並びに該生合成遺伝子の遺伝子クラスタ ーを完成するための隣接したＤＮＡ領域の単離のためのそれらの使用にある。 偽オリゴ糖の生合成に関する遺伝子の単離およびこれら遺伝子の同定は、偽オ リゴ糖の生合成、並びにその調節についてのより良い理解に達するために極めて 重要である。次いでこの知見を用いて、確立された従来の分子生物学的方法によ ってアカルボース産生に関してストレプトマイセス・グローセスセンスGLA.O系 統の生産性を増大させることができる。これに加えてまた、アカルボースなどの 偽オリゴ糖の製造のさらなる増大、または単純化を達成するために、偽オリゴ糖 の生合成をコードする全遺伝子クラスター、またはこの遺伝子クラスター由来の 個々の遺伝子を、バイオテクノロジー上関連する他の微生物内で発現させること もできる。また、該生合成遺伝子の特異的修飾を用いて、専ら645の分子量を有 するアカルボースだけを産生する系統を作製することもできる。抗生物質の生合 成に関する遺伝子は常にクラスターとして存在し、極めて強固に保存されている ことが多いので(Stockmann and Piepersberg（1992）FENS Microbiol．Letters 90:185-190;Malpartida et al．(1987)Nature314:642-644)、ストレプトマイセ ス・グローセスセンスGLA.O遺伝子を、例えばアクチノプラーネス種由来のアカ ルボースをコードする遺伝子を単離するためのプローブとして用いることも可能 である。調節遺伝子、すなわち生合成における制限段階をコードする遺伝子の発 現は、結果としてストレプトマイセス・グローセスセンスGLA.O、アクチノプラ ーネス種、または相当するプロデューサー系統における生産性を高めることにな る。また、生産性の増大は、生合成に阻害的効果を有するそれらアカルボース生 合成遺伝子のスイッチオフ（ノックアウト、または突然変異誘発）によって達成 することもできる。 これまで単離されていない抗生物質生合成遺伝子をクローニングするための可 能性ある戦略の一つとして、遺伝子特異的プローブの使用がある(Stockmann and Piepersberg（1992）FEMS Microbiol．Letters 90:185-190;Malpartida et al ．(1987)Nature 314:642-644)。これらのプローブはP³²標識または他のいくつか の方法で標識されたＤＮＡ断片であってもよく、さもなくば、適切な遺伝子をそ の系統から直接増幅し、縮重PCRプライマーを用いて検討し、鋳型としての染色 体ＤＮＡを単離してもよい。 本研究では後者の方法を用いた。アカルボースなどの偽オリゴ糖は、構造要素 として4,6-デオキシグルコース結合ブロックを含有する。酵素dTDP-グルコース4 ,6-デヒドラターゼが4,6-デオキシグルコースの生合成に関与することが知られ ている(Stockmann and Piepersberg（1992）FEMS Microbiol．Letters 90:185-1 90)。デオキシ糖は天然生成物および抗生物質でしばしば見られる構成成分であ るので、この酵素が相当する抗生物質生合成遺伝子を単離する手段となる可能性 がある。これらの遺伝子は常にクラスターとして存在するので、まず１つの遺伝 子を単離すれば十分であり、次いで、隣接するＤＮＡ領域の単離および同定を続 いて行うことができる。 例えばdTDP-グルコース4,6-デヒドラターゼは、ストレプトマイセス・グロー セスセンスGLA.Oにおけるヒドロキシストレプトマイシンの生合成中の段階を触 媒する(Retzlaff et al．(1993)Industrial Microorganisms．Basic and applie d molecular genetics ASM，Washington DC，USA)。さらにdTDP-グルコース4,6- デヒドラターゼは、他の微生物、例えばストレプトマイセス・グリセウス(Strep tomyces griseus)(Pissowotzki et al．(1991)Mol．Gen．Genet．231:113-123) 、ストレプトマイセス・フラディエ(Streptomyces fradiae)(Merson-Davies and Cundcliffe（1994）Mol．Microbiol．13:349-355)、およびストレプトマイセス ・ビオラセオルバー(Streptomyces violaceoruber)(Bechthold et al．(1995)Mo l．Gen．Genet．248:610-620)から単離されている。 その結果として、既知の生合成遺伝子のアミノ酸配列からdTDP-グルコース4,6 -デヒドラターゼを増幅させるためのPCRプライマーに対する配列を推定できる。 これに関しては、これらの酵素のタンパク質配列における保存領域が選択され、 アミノ酸配列は遺伝子コードに従い核酸配列へと翻訳された。このタンパク質配 列はEMBL and Genbankデータベースから得たものである。以下の配列を用いた： ストレプトマイセス・グリセウス（griseus）；受託番号：X62567遺伝子：strE( 1993年10月30日付）；ストレプトマイセス・ビオラセオルバー（violaceoruber ）；受託番号：L37334遺伝子：graE（1995年４月10日付）；サッカロポリスポラ ・エチスラエ(Saccharopolyspora etythraea)；受託番号：L37354遺伝子：gdh（ 1994年11月９日付）。遺伝子コードの縮重の結果、多数の可能性あるプライマー 配列が得られる。ストレプトマイセス科が通常、コドンの第３位にGまたはCを含 有しているという事実(Wright and Bibb（1992）gene 113:55-65)により、合成 されるべきプライマーの数は少なくなる。次いで、これらプライマー混合物を用 いて検討すべき系統由来のＤＮＡを用いたPCR増幅を行うことができ、この増幅 は理想的にはＤＮＡ断片の増幅をもたらす。高度に保存されたタンパク質の場合 、この断片は相当遺伝子の核酸配列内のプライマー間の距離から結果的に推定で きる長さを有する。しかしながら、この性質を有する実験混合物は必ずしも増幅 物を生じなくともよい。該プライマーは極めて非特異的であると考えられるので 、非常に多数の断片を増幅し、また、染色体に、生産されたPCRプライマーに対 して相補的結合部位がなければ、PCR生成物は得られない。 ストレプトマイセス科系統ストレプトマイセス・グローセスセンスGLA.Oの研 究の結果、550bp長を発現したＤＮＡ断片(acbD)が増幅された。さらなる研究で は、ヒドロキシストレプトマイシンの生合成に関するdTDP-グルコース4,6-デヒ ドラターゼ遺伝子を含有することの他、この系統が驚くべきことにアカルボース などの偽オリゴ糖の生合成に関する第二のdTDP-グルコース4,6-デヒドラターゼ 遺伝子を含んでいることが示された。この２種の遺伝子は高度の相同性を示すが 、アミノ酸レベルでは65%の一致を示すに過ぎない。 acbDプローブ（実施例２および表２Ａ参照）を用いて、ストレプトマイセス・ グローセスセンスGLA.Oから、偽オリゴ糖の生合成に関与する種々の遺伝子(acbA 、acbB、acbC、acbD、acbEおよびacbF)をコードする6.8kbのPSt1 ＤＮＡ断片を 単離した。 acbBCD遺伝子（アミノトランスフェラーゼ、acbB、dTDP-グルコースシンター ゼ、acbC、dTDP-グルコース4,6-デヒドラターゼ、acbD、実施例６を参照）を欠 失させると、ストレプトマイセス・グローセスセンスGLA.Oの変異体が生じ、そ れはもはや産生培地ではいずれの偽オリゴ糖も産生しない。従って、偽オリゴ糖 の合成におけるacbBCD遺伝子の関与は相当する遺伝子座の欠失により変更された 。 この２種の遺伝子、すなわちdTDP-グルコースシンターゼとdTDP-グルコース4, 6-デヒドラターゼは、十分に研究された相同酵素の機能から結論付けることがで きるように、偽オリゴ糖のデオキシ糖の生合成に関与するはずである（前記参照 ）。恐らくは(acbB遺伝子によってコードされる）アミノトランスフェラーゼが 、糖残基か、もしくはサイクリトール残基かのいずれかへのアミノ基の転移に関 わっているものと考えられる。acbBのタンパク質配列を解析することにより、ア ミノ酸モチーフのいずれが結合性ピリドキサールリン酸に関与しているのかが判 明した。このモチーフは典型的なクラスIIIアミノトランスフェラーゼである(EC 2.6.1.11;EC 2.6.1.13;EC 2.6.1.18;EC 2.6.1.19;EC 2.6.1.62;EC 2.6.1.64;EC 5.4.3.8)。acbBの厳密な酵素作用は、偽オリゴ糖の生合成のさらなる研究によ って初めて解明され得る。acbEはヘリックス・ターン・ヘリックスモチーフ（例 えば、バチルス・サブチリスDegA、P37974：Swiss-Protデータベース）を有する ＤＮＡ結合タンパク質との酷似性を示す転写調節タンパク質をコードする。この ようにして、バチルス・サブチリス由来の転写アクチベータ−CcpAは、例え ばグルコースの存在下でα-アミラーゼの形成を阻害する(Henkin et al．(1991) Mol．Microbiol．5:575-584)。このグループの他の代表例としては、特定の糖結 合ブロックを認識し、代謝経路の生合成における正または負の効果を阻害するこ とが可能なタンパク質がある。偽オリゴ糖の生合成はまた、ストレプトマイセス ・グローセスセンスGLA.Oにおいても調節される。従来はデンプン含有培地での 偽オリゴ糖の合成を証明できるに過ぎなかった。この方法によりAcbEが偽オリゴ 糖合成の調節にあずかっている可能性があることが示されたが、厳密なメカニズ ムは依然として判っていない。しかしながら、今や、偽オリゴ糖の生合成速度を 増大させるために、分子生物学的方法を用いて遺伝子の特異性を修飾することが できる。さらには、いわゆるゲルシフトアッセイによって、acbEが結合するＤＮ Ａ部位を同定することができる(Miwa et al．(1994)Microbiology 140:2576-257 5)。アカルボースが生合成される速度の増大は、プロモーター、並びに偽オリゴ 糖遺伝子の転写にあずかる他の調節ＤＮＡ領域の同定およびそれに次ぐ修飾の後 に達成できる。 現在のところ、acbFの機能はまだ明確には知られていない。これに相当する遺 伝子生成物は、ストレプトコッカス．ミュータンス(Streptococcus mutans)(Msm E;Q00749:Swissprotデータベース)由来の糖結合タンパク質のような糖結合タン パク質との相同性を示し、このことによりそれが偽オリゴ糖の生合成に関与する ことが可能となる。acbA遺伝子の遺伝子生成物は公知の細菌のATP-結合タンパク 質（例えば、ストレプトマイセス・プーシトウス(Streptmyces peusitus)DrrA， P32010:SwissProtデータベース由来）と相同性を示す。該AcbAタンパク質は典型 的なATP/GTP結合モチーフ、すなわち、いわゆるＰループを有する。これらのタ ンパク質は、重要な構成要素であるいわゆるABC輸送体から構成され、これらは 生体膜での代謝物の能動輸送に関与している(Higgins（1995）Cell 82:693-696) 。従って、AcbAは偽オリゴ糖の細胞外への運搬に関わるか、もしくはマル トースのようなα-アミラーゼ阻害剤の生合成に関する糖結合ブロックの取り入 れに関与している可能性がある。 これまでに解析されてきた二次代謝物の生合成に関するストレプトマイセス科 遺伝子は総て、クラスターとして配置されている。この理由としては、本出願の アカルボース生合成遺伝子もまた、かかる遺伝子クラスターとして配置されてい ると仮定される。従って、本発明の6.8kbのPSt1 ＤＮＡ断片に隣接するＤＮＡ領 域を単離することにより、偽オリゴ糖生合成に関連した残りの遺伝子も単離する ことができる。また、既に前記したように、ストレプトマイセス・グローセスセ ンスGLA.O以外の微生物由来の相同な遺伝子クラスターも容易に単離することが できる。 従って本発明は、アカルボースの生合成に関する遺伝子と相同偽オリゴ糖とを 含有する組換えＤＮＡ分子、特に、個々の遺伝子が図３で示されたような転写方 向および順序で配列され、および／または図３で示されたような制限酵素切断部 位パターンを示す組換えＤＮＡ分子であって、好ましくは、 (a)表４のＤＮＡ配列またはその一部を含んでなる； (b)ストリンジェント条件下で(a)のＤＮＡ分子とハイブリダイズすることが可能 なＤＮＡ配列またはその一部を含んでなる；または (c)遺伝子コードの縮重のために(a)および(b)のＤＮＡ分子とは異なるが、(a)お よび(b)のＤＮＡ分子を用い相応して発現させることができるタンパク質発現を 可能にするＤＮＡ配列、またはその一部を含んでなる、組換えＤＮＡ分子に関す る。 さらに本発明は特に表４のヌクレオチド1〜720のＤＮＡ配列またはその一部を 含むことを特徴とする、acbA遺伝子を含有する組換えＤＮＡ；特に表４のヌクレ オチド720〜2006のＤＮ配列またはその一部を含むことを特徴とする、acbB遺伝 子を含有する組換えＤＮＡ分子；特に表４のヌクレオチド2268〜3332のＤＮＡ配 列またはその一部を含むことを特徴とする、acbC遺伝子を含有する組換えＤＮＡ 分子；特に表４のヌクレオチド3332〜4306のＤＮＡ配列またはその一部を含むこ とを特徴とする、acbD遺伝子を含有する組換えＤＮＡ分子；特に表４のヌクレオ チド4380〜5414のＤＮＡ配列またはその一部を含むことを特徴とする、acbE遺伝 子を含有する組換えＤＮＡ分子；および特に表４のヌクレオチド5676〜6854のＤ ＮＡ配列またはその一部を含むことを特徴とする、acbF遺伝子を含有する組換え ＤＮＡ分子に関する。 さらに本発明は、前記され、プライマーが特に表１の配列を有する、アカルボ ースおよび相同偽オリゴ糖の生合成遺伝子を含有する組換えＤＮＡ分子のPCR増 幅用オリゴヌクレオチドプライマーに関する。 さらに本発明は、２段落前とさらにその前段落に記載されるＤＮＡ分子を含む 組換えＤＮＡを含有するベクターであって、特に発現ベクターであり、しかも該 ＤＮＡ配列がプロモーター配列に作動可能に連結されており、好ましくは、大腸 菌、バチルス・ズブチリス、およびストレプトマイセス、アクチノプラーネス、 アンプラリエラおよびストレプトスポランギウム系統、ストレプトマイセス・ヒ グロスコピカス・リモネウス種、ストレプトマイセス・グローセスセンスなどの 放線菌目、およびバイオテクノロジー的に関連する真菌類（例えば、アスペルギ ルス・ニガー、ペニシリウム・クリソゲナム）並びに酵母（例えば、サッカロミ セス・セレビシエ）からなる群より選択され、ストレプトマイセス・グローセス センスGLA.Oまたはアクチノプラーネス種が特に極めて好ましい宿主微生物での 発現に適しているベクターに関する。該ＤＮＡ分子の、ベクターのプロモーター 配列への作動可能な連結は本発明の好ましい具体例の１つに過ぎないので、発現 のためにはＤＮＡ分子に関して内生的なプロモーター配列、例えば各々の場合に おける天然のプロモーター、またはアカルボース収量を最適化することを考慮し て変異された天然プロモーターを用いて達成することもできる。かかる天然プロ モーターは本発明のＤＮＡ分子の一部である。 さらに本発明は、アカルボース産生微生物における天然のアカルボース生合成 遺伝子を消失させる、または改変する方法に使用するための、本発明のＤＮＡ分 子を含有するベクターに関する。かかるベクターは好ましくは、pGM160並びに欧 州特許EP 0 334 282およびEP0 158 872に記載のベクターからなる群より選択さ れる。 さらに本発明は、前記ＤＮＡ分子またはベクターの１つで形質転換した宿主細 胞であって、特に大腸菌、バチルス・ズブチリス、およびストレプトマイセス、 アクチノプラーネス、アンプラリエラまたはストレプトスポランギウム系統、ス トレプトマイセス・ヒグロスコピカス・リモネウス種、またはストレプトマイセ ス・グローセスセンスなどの放線菌目、およびバイオテクノロジー関連真菌類（ 例えば、アスペルギルス・ニガーおよびペニシリウム・クリソゲナム）並びに酵 母（例えば、サッカロミセス・セレビシエ）からなる群より選択されることを特 徴とする宿主細胞に関し；そのためにはストレプトマイセス・グローセスセンス GLA.Oまたはアクチノプラーネス種からなる群より選択されることが特に極めて 好ましい。 さらに本発明は、アカルボースおよび相同偽オリゴ糖の生合成に関する遺伝子 を含有する、本発明の組換えＤＮＡ分子の遺伝子を発現させることによって得る ことができるタンパク質混合物であって、特に該ＤＮＡ分子が (a)表４のＤＮＡ配列またはその一部を含んでなる； (b)ストリンジェント条件下で(a)のＤＮＡ配列とハイブリダイズすることができ るＤＮＡ配列またはその一部を含んでなる；または (c)遺伝子コードの縮重のために、(a)および(b)のＤＮＡ分子とは異なるが、(a) および(b)のＤＮＡ分子を用い相応して発現させることができるタンパク質発現 を可能にするＤＮＡ配列、またはその一部を含んでなることを特徴とするタンパ ク質混合物に関する。 さらに本発明は、前段落に記載されたＤＮＡ分子によってコードされている遺 伝子を発現させることによって得ることができる単離タンパク質に関する。 以下の記載は本発明の文脈の範囲内にあると認められる個々の遺伝子すべてに 当てはまり、明らかな理由でまとめられたに過ぎない。さらに本発明は、特に表 ４のヌクレオチド1〜720、720〜2006、2268〜3332、3332〜4306、4380〜5414、 または5676〜6854のＤＮＡ配列またはその一部を含有することを特徴とする、直 前の一段落に記載される組換えＤＮＡ分子によってコードされるタンパク質に関 するものであり、acbA遺伝子、acbB遺伝子、acbC遺伝子、acbD遺伝子、acbE遺伝 子またはacbF遺伝子によってコードされ、かつ表４のアミノ酸配列またはその一 部を含んでなるタンパク質が特に極めて好ましい。 さらに本発明は、本発明の内容の一部をなすことが前記されたタンパク質を得 る方法であって、 (a)タンパク質を、特に宿主細胞が大腸菌、バチルス・ズブチリス、およびスト レプトマイセス、アクチノプラーネス、アンプラリエラまたはストレプトスポラ ンギウム系統、ストレプトマイセス・ヒグロスコピカス・リモネウス種、または ストレプトマイセス・グローセスセンスなどの放線菌目、およびバイオテクノロ ジー関連真菌類（例えば、アスペルギルス・ニガーおよびペニシリウム・クリソ ゲナム）並びに酵母（例えば、サッカロミセス・セレビシエ）からなる群より選 択され；ストレプトマイセス・グローセスセンスGLA.Oおよびアクチノプラーネ ス種からなる群より選択されることが特に極めて好ましい、適当な宿主細胞で発 現させ、次いで (b)単離することを特徴とする方法に関する。 さらに本発明は、 (a)表４のＤＮＡ配列またはその一部を含有する、ストリンジェント条件下で表 ４のＤＮＡ分子とハイブリダイズすることができるＤＮＡ配列またはその一部を 含有する、もしくは遺伝子コードの縮重のために今記載したＤＮＡ分子とは異な るが、これらのＤＮＡ分子を用い相応して発現させることができるタンパク質発 現を可能にするＤＮＡ配列またはその一部を含有する組換えＤＮＡの１以上の遺 伝子を、特に直前の段落と同様の群より選択される適切な宿主での発現に使用し 、次いで、 (b)該宿主細胞の培養上清からアカルボースを単離することを特徴とする、アカ ルボースの生産法に関する。 さらに本発明は、 (a)表４のＤＮＡ配列またはその一部を含有する、ストリンジェント条件下で表 ４のＤＮＡ分子とハイブリダイズすることができるＤＮＡ配列またはその一部を 含有する、もしくは遺伝子コードの縮重のために今記載したＤＮＡ分子とは異な るが、このＤＮＡ分子を用い相応して発現させることができるタンパク質発現を 可能にするＤＮＡ配列またはその一部を含有する組換えＤＮＡの１以上の遺伝子 を、アカルボース産生宿主細胞、特にストレプトマイセス・グローセスセンスGL A.Oおよびアクチノプラーネス種内で欠失させ、 (b)該宿主細胞からアカルボースを単離することを特徴とする、アカルボースの 生産法に関する。 この点について、１以上の遺伝子の欠失は、例えば前記ベクター（pGM160他） を用いる標準的な分子生物学的方法によって達成できる。欠失させる遺伝子は例 えば、恐らく調節機能を有すると考えられるacbE遺伝子であってもよい。もはや 相同偽オリゴ糖の混合物を得ることではなく、発酵生成物としてのみ純粋なアカ ルボースを得るという目的でも、同様に遺伝子を欠失させてもよい（前記参照） 。該遺伝子の欠失は、これを目的として記載されたベクターを用いて達成するこ とが好ましい。 さらに本発明は、前ニ段落に記載したアカルボースの生産法を互いに組み合わ せ、その結果、１以上の該遺伝子を人工的に発現させ、また１以上の該遺伝子が 欠失することを特徴とする、アカルボースの生産に関する。 さらに本発明は、アカルボースの収量を向上させるため各々の遺伝子プロモー ターに変異を誘発することにより、内生アカルボース生合成遺伝子の遺伝子発現 を改変する方法に関する。これに関連して、公知の相同組換え法を用いて、改良 すべき産生株へ突然変異を導入することができる。これら突然変異はトランジシ ョン、欠失および／または付加であってよい。「付加」とは、例えば、単一のス クレオチドまたはいくつかのヌクレオチドの、もしくは正の調節作用を有し、か つアカルボースの生合成に関する内生遺伝子の発現を増減する１以上のＤＮＡ配 列の付加を示す。逆の場合、すなわち内生アカルボース生合成遺伝子の抑制に対 して負の調節効果を有するＤＮＡ配列の付加も好ましい付加の形態である。「ト ランジション」とは、例えば、負または正の作用をする調節要素の効果を減じる 、または増幅させるヌクレオチド交換であってよい。「欠失」を用いて負または 正の作用をする調節要素を除去することができる。本法の内生遺伝子は好ましく は、ストレプトマイセス、アクチノプラーネス、アンプラリエラまたはストレプ トスポランギウム系統、ストレプトマイセス・ヒグロスコピカス・リモネウス種 、またはストレプトマイセス・グローセスセンスなどの放線菌目に存在し、特に は、それらはストレプトマイセス・グローセスセンスGLA.Oおよびアクチノプラ ーネス種に存在する。 さらに本発明は、アカルボースを得るためのストレプトマイセス・グローセス センスGLA.Oの使用に関する。 さらに本発明は、変異体がより多量のアカルボースの産生を達成することを可 能にする、「従来の経路」によりこの系統の変異体を生産するためのストレプト ミセス・グローセスセンスGLA.Oの使用に関する。この性質を有する改良された 天然生成物プロデューサーを生産する方法はかなり以前から公知であり、しばし ば従来工程の突然変異誘発と選択を使用する。 さらに本発明は、表４のアカルボースおよび相同多糖類の生合成に関する遺伝 子クラスターを完成させる方法であって、 a)表４のＤＮＡ分子から誘導されるハイブリダイゼーションプローブを生産し、 b)これらのハイブリダイゼーションプローブをストレプトマイセス・グローセス センスGLA.Oから得られたＤＮＡライブラリーのゲノムスクリーニングに使用し 、次いで c)見出されたクローンを単離・同定することを特徴とする方法に関する。 さらに本発明は、表４のアカルボースおよび相同偽オリゴ糖の生合成に関する 遺伝子クラスターを完成させる方法であって、表４の組換えＤＮＡ分子から出発 して、 a)PCRプライマーを生産し、 b)これらPCRプライマーを用い、これらのプライマーを使用したベクター系の配 列からハイブリダイズするプライマーと結合させて、ストレプトマイセス・グロ ーセスセンスGLA.O由来のゲノムＤＮＡのＤＮＡ断片を集積し、 c)集積された断片を単離・同定することを特徴とする方法に関する。 さらに本発明は、ストレプトマイセス・グローセスセンスGLA.O以外のアカル ボース産生微生物からアカルボースおよび相同偽オリゴ糖の生合成に関する遺伝 子クラスターを単離する方法であって、表４の組換えＤＮＡ分子から出発して、 a)ハイブリダイゼーションプローブを生産し、 b)これらのハイブリダイゼーションプローブを相当する微生物から得られたＤＮ ＡライブラリーのゲノムまたはｃＤＮＡのスクリーニングに使用し c)見出したクローンを単離・同定することを特徴とする方法に関する。 さらに本発明は、ストレプトマイセス・グローセスセンスGLA.O以外のアカル ボース産生微生物からアカルボースおよび相同偽オリゴ糖の生合成に関する遺伝 子クラスターを単離する方法であって、表４の組換えＤＮＡ分子から引き続き、 a)PCRプライマーを生産し、 b)これらPCRプライマーを相当する微生物由来のゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡの ＤＮＡ断片を集積するために使用し、 c)集積された断片を単離・同定し、次いで d)適したところに、従前の段落に記載した方法に使用されることを特徴とする方 法に関する。 記載の、ストレプトマイセス・グローセスセンスGLA.O以外のアカルボース産 生微生物由来のアカルボースおよび相同偽オリゴ糖の生合成に関する遺伝子クラ スターを単離する方法は、該微生物がストレプトマイセス、アクチノプラーネス 、アンプラリエラまたはストレプトスポランギウム系統、ストレプトマイセス・ ヒグロスコピカス・リモネウス種、またはストレプトマイセス・グローセスセン スなどの放線菌目からなる群より、好ましくはストレプトマイセス・グローセス センスGLA.Oおよびアクチノプラーネス種からなる群より選択されることを特徴 とする。 さらに本発明は、アカルボースを単離するためのストレプトマイセス・グロー セスセンスGLA.Oの使用に関する。 以下、実施例、表および図面により本発明を詳しく説明するが、これに限定す るものではない。 プラスミドの単離はすべて、製造業者の説明書に従い、Macherey and Nagel(D uren，Germany)単離キット(Nucleobond（商標名）)を用いて行った。分子生物学 的手法は、標準的なプロトコール(Sambrock et al．(1989)Molecular cloning:A Laboratory Manual，2nd ed．Cold Spring Harbor Laboratory，USA)に従って 、もしくはそれぞれの製造業者の説明書に従って行った。ＤＮＡおよびタンパ ク質配列は、Genetics Computer Group Software，Version 8（プログラム：Fas tA、TFastA、BlastX、モチーフ、GAPおよびCODONPREFERENCE）並びにSwissProt （公開32）EMBL（公開46）およびProsite（公開12.2）データベースを用いて調 べた。ストレプトマイセス・グローセスセンスおよびアクチノプラーネスの分子 生物学的操作（ＤＮＡ単離およびＤＮＡ形質転換）はHopwood et al:Genetic Ma nipulation of Streptomyces:A Laboratory Manual．The john Innes Foundatio n，Norwich，UK，1985およびMotamedi and Hutchinson:ストレプトマイセス・グ ローセスセンスのアントラサイクリン抗腫瘍性抗生物質、テトラセノマイシンC の生合成に関する遺伝子クラスターのクロニングおよび異種発現Proc．Natl.Aca d．Sci．USA 84:4445-4449(1987)に記載されたように行った。 一般に、ハイブリダイゼーションは、Boehriger Mannheim（Cat．No．1175033 ）からの「非放射性ＤＮＡ標識キット」を用いて行った。ＤＮＡはBoehriger Ma nnheim(Cat．No．1363514)からの「蛍光検出キット」を用いて視覚化した。本特 許出願に与えられたすべての実施例において、ハイブリダイゼーションはストリ ンジェント条件：68℃、16時間、5xSSC、0.1% N-ラウリルサルコシン、0.02% SD S、1%ブロッキング剤(Boehriger Mannheim)。SSCは0.15M NaCl/0.015Mクエン酸 ナトリウムを示す。これに関して、当業者は、例えば、他の温度と組み合わせて 他のハイブリダイゼーション溶液を用いるなどして、同様のストリンジェント条 件を達成するために他の条件を選択することもできるので、このストリンジェン シー、すなわち列挙したハイブリダイゼーション条件を達成する方法は限定され た効果を有すると考えるものではない。 実施例１：PCRプライマーのおよび配列決定、並びにS.glaucescensエス・グラー セスセンスGLA.O由来断片の増幅 PCRは、100μlの反応混合物中100pmのプライマー１、およびプライマー２の各 々の場合に用いられる標準条件下で行った。 PCR緩衝液¹ 10μl PCRプライマー 各場合2.5μl dNTPs 各場合0.2mM BSA(10mg/ml) １μl 鋳型ＤＮＡ １μg(1μl) Taqポリメラーゼ²(5ユニット/ml) 1.5μl H₂O 100μlにする ¹：Promega ²：Boehriger Marmheim サンプルに75μlの鉱油を重層し、Perkin Elmer TC1 ＤＮＡサーマルサイクラ ーを用いて増幅を行った。 プライマー： サイクル 温度 時間 1 96℃ 5 分 74℃ 5 分 30 95℃ 1.5分 74℃ 1.5分 1 74℃ 5 分 表１には種々のストレプトマイセス由来のdTDP-グルコースの増幅に使用すべ き縮重プライマーの配列を挙げている。 表１：dTDP-グルコース4,6-デヒドラターゼ増幅用プライマー配列 この表において、S=GまたはC、W=AまたはT、V=AまたはG、Y=TまたはC。 実施例２：ストレプトマイセス・グローセスセンスGLA.Oから単離されたPCR断片 のＤＮＡ配列 配列決定はSanger et al.(PNAS USA，74:5463-5476(1977))のジデオキシ鎖終 結法によって行った。反応はPharmacia Biotech(Freiburg，Germany)からのAuto Read Sequenzing Kit(商標名）を用いて製造業者の説明書に従い行った。分離 および検出にはPharmacia Biotech(Freiburg，Germany)からのALF DNA Sequence r（商標名）を用いた。 これに続くPCR断片の大腸菌ベクターpUC 18へのクローン化(Sure Clone Kit（ 商標名），Pharmacia Biotech，Freiburg)および該断片の配列決定は、該断片が dTDP-グルコース4,6-デヒドラターゼをコードしているという仮説を指示するも のであった。しかしながら、双方ともdTDP-グルコース4,6-デヒドラターゼと高 い一致を示すが同一ではない２つの異なる遺伝子が単離された。結果的に、この PCR断片はacbDとHstrEを示している。 単離されたPCR断片の配列は表２Ａおよび２Ｂに示されており、またHstrE^*とa cbD^*の推定アミノ酸配列の相同性比較は表２Ｃに示されている。２種のタンパク 質は65%の一致しか示していない。 表２Ａ：acbDのＤＮＡ配列（プライマー結合部位には下線で示されている、配列 番号：３）表２Ｂ：HstrEのＤＮＡ配列（プライマー結合部位には下線で示されている、配 列番号：４） 表２Ｃ：PCR生成物HstrE^*とacbD^*の推定アミノ酸配列の相同性比較（プログラム ：GAP）各場合で上の列は、配列番号：５ 各場合で下の列は、配列番号：６ 実施例３：ストレプトマイセス・グローセスセンスGLA.O由来の染色体ＤＮＡお よび単離し、次いで標識したPCR断片を用いたサザン解析 細胞をR2YENG培地で増殖させ、30時間後にＤＮＡ単離のために回収した。Hopw ood et al．(1985)Genetic manipulations of Streptomyces:a laboratory manu al．The John Irmes Foundation，Norwich UK)に記載されたように、染色体ＤＮ ＡをS.グローセスセンスGLA.Oから単離した。 acbD^*およびHstrE^*PCR断片からなる標識プローブを用い、PstI、BgIIIおよびB amHIで消化したS.グローセスセンスGLA.Oプロデューサー系統染色体ＤＮＡを用 いてサザンブロット解析を行った。２種のPCR断片を、製造業者の(Boehringer M annheim;Mannheim)説明書に従ってジゴキシゲニンで標識し、次いでストレプト マイセス・グローセスセンスGLA.Oプロデューサー系統染色体ＤＮＡの消化物を アガロースゲル上で分離した。該ＤＮＡを毛管転移によってナイロン膜に移し、 ハイブリダイゼーション後、続いて標識プローブと相同性のあるＤＮＡ領域を視 覚化した。 ２種の遺伝子は、ストレプトマイセス・グローセスセンスGLA.Oヒドロキシス トレプトマイシン生合成由来の遺伝子断片を有するEstrEによって標識された断 片を有する異なるＤＮＡ領域（図１および図２）を標識する。ＤＮＡ配列は公表 されていないが、HstrE^*とストレプトマイセス・グリセウスN2-3-11ストレプト マイシン生合成由来のStrE（Pissowotzki et al．(1991)Mol．Gen．Genet．231: 113-123）から推定されたタンパク質配列の高度の相同性（82％の一致）、およ びHstrE^*標識ＤＮＡ断片（図1）と公表されたストレプトマイセス・グローセス センスGLA.Oヒドロキシストレプトマイシン遺伝子クラスター(Retzlaff et al． (1993)Industrial Microorganisms．Basic and applied molecular genetics AS M，WashingtonDC，USA)の制限地図との一致はこの結論を許容するものである。a cbD^*プローブ（図２）によって標識された断片は、これまでには研究されてい ないＤＮＡ領域に属する。この領域は、ストレプトマイセス・グローセスセンス GLA.O偽オリゴ糖を生合成する酵素をコードする。 実施例４：6.8kbのPst1断片のクローニング とりわけ、acbD^*PCR断片は、6.8kbのPst1 ＤＮＡ断片を標識する（図２）。こ のＤＮＡ断片は以下のようにして単離した。ゲルの領域をかみそりの刃で切り取 り、ＤＮＡをPharmacia Biotechの単離キットを用いてゲルから単離し、制限酵 素Pst1（プラスミドpacb1）で切断したプラスミドpUC19へクローン化し、次いで この後者のプラスミドを大腸菌系統DH５αに形質転換した。これらのプレートか ら個々のクローンを継体培養し、これらのクローンを用いてプラスミドＤＮＡの 単離を行った。前記プライマー１および１（表１）を用いたPCR増幅を、これら のクローン（250）由来のＤＮＡを用いて行った。このようにして、6.8kbのPstI 断片を含む適切な大腸菌・クローンを単離した。 実施例５：単離した6.8kbのPstI ＤＮＡ断片の配列決定 ＤＮＡを種々の制限酵素で消化し、個々のＤＮＡ断片をpUC19へクローン化し た。次いで表４（配列番号７）に示されている全断片のＤＮＡ配列を決定した。 6.8kbのPstI断片のＤＮＡ配列は、対合鎖の補助的な配列決定によって部分的で はあるが確認された。種々のタンパク質をコードする数個のオープンリーディン グフレームが見出された（プログラム：CODONPREFERENCEおよびBlastX）。合計 ６個のコーディング領域が見出された。すなわち、ATP結合タンパク質と高度の 相同性を有する遺伝子acbA、アミノトランスフェラーゼacbB、dTDP-グルコース シンターゼacbC、dTDP-グルコースデヒドロゲナーゼacbD、LacIタンパク質ファ ミリーasbEと相同性を有する調節遺伝子、および糖結合タンパク質acbFとの類似 性を有するタンパク質acbFである。acbAおよびacbF遺伝子の配列は一部分だけが 決定された。データベースからの他のタンパク質との相同性、および推定される タンパク質の性質を表３にまとめた。図３は、本文中で記載した最も重要な制限 切断部位を含む断片の制限地図、および同定されたオープンリーディングフレー ムの配列を要約した形で示している。 表３：ストレプトマイセス・グローセスセンスGLA.O由来の6.8kb PstI断片につ いて同定されたオープンリーディングフレームの解析 ^★不完全なオープンリーディングフレーム；^§Swiss-Protデータベース（公開32 ） 実施例６：ストレプトマイセス・グローセスセンスGLA.O染色体由来の偽オリゴ 糖生合成遺伝子acbBCDの欠失 同定されたＤＮＡ断片をコードした偽オリゴ糖生合成遺伝子が生産されたとい う証拠は以下の通りである。3.4kbの遺伝子領域（EcoR1/SatI断片b、図３）をエ リスロマイシン耐性遺伝子(1.6kb)で置換して、6.8kbのPstI断片(pacb1)由来の フランキングＤＮＡ領域とともに温度感受性プラスミドpGM160へクローン化した 。プラスミドは以下に記載したように構築した。プラスミドpacb1由来の2.2kbの EcoR1/HindIII断片（c、図３）をpGEM7zf(Promega，Madison，WI，USA;プラスミ ドpacb2)へクローン化し、次いでpacb1由来の1kbのSstI断片(a、図３)をpUC19（ プラスミドpacb3）へにクローン化した。次いで、以下の断片を用いて連結を行 った。1.6kbのermE耐性遺伝子を単離するために、プラスミドpGM160(Muth et al ． (1989)Mol．Gen．Genet．219:341-348)をBamH/HindIIIで切断し、プラスミドpac b2をXbaI/BamHI（c、図３）で切断し、プラスミドpacb3をEcoRI/HindIII（a、図 ３）で切断し、さらにプラスミドp1J4026(Bibb et al．(1985)Gene 38:215-226) をEcoRI/Xba1で切断した。混合物中で断片を連結し、大腸菌DH5αに形質転換し 、次いでアンピシリン上で選択した。得られたプラスミド、すなわちpacb4を大 腸菌DH5αから単離し、制限消化によってその厳密性を試験し、次いでS.グロー セスセンスGLA.Oへのプロトプラスト形質転換によって形質転換した。該形質転 換体をR2YENG寒天中、27℃にて、チオストレプトンを用いて選択した。続いて該 形質転換体を39℃の非許容温度でインキュベートすると、それによる相同組換え によってプラスミドのゲノムへの組み込みが起こった（チオストレプトン（25μ g/ml）およびエリスロマイシン(50μg/ml)をでの選択）。これらの条件下では、 増殖可能なクローンだけが、該プラスミドをそのゲノムに組み込んだことになる 。相当するクリーンを単離し、胞子形成させ（培地１、下記を参照）、次いでエ リスロマイシン含有寒天（培地１）上にプレーティングした。このプレートから 個々のクローンを再び単離し、チオストレプトン含有培地とエリスロマイシン含 有寒天の双方の上に線状塗布した。エリスロマイシン耐性はあるがもはやチオス トレプトン耐性はないクローンを解析した。これらのクローンにおいて、acbBCD 遺伝子をermEで置換した。数個のクローンを検討し、さらなる研究のために、S. グローセスセンスGLA.O Δacb系統を最終的に対照系統（エリスロマイシン耐性 、チオストレプトン感受性）として選択した。 培地１ 酵母抽出物 4g/L 麦芽抽出物 10g/L グルコース 4g/L 寒天 15g/L pH 7.2 相当する系統がまだアカルボースを産生するかどうかのさらなる実験を行った 。数個のクローンを増殖させ、バイオアッセイにおいてα-アミラーゼ阻害剤の 形成に関して調べた。しかしながら、活性は認められなかった。続いて突然変異 体をサザンハイブリダイゼーションによってさらに同定した。ermE遺伝子の組み 込みが推定部位で起こった。図４は、野生型およびストレプトマイセス・グロー セスセンスGLA.O Δacb欠失突然変異体を用いて行ったサザンハイブリダイゼー ションを示している。pacb3由来のSstI断片をプローブとして用いた。染色体Ｄ ＮＡを野生型および変異体から単離し、酵素PstIおよびPstI/HindIIIで消化した 。該欠失変異体に関して得られた断片パターンは、推定された組換え事象に対応 するものである。野生型は変化していない6.8kbのPstI断片を示すが、変異体は1 .8kbで切断された断片を示す（図４のレーン１および３を比較のこと）。EermE 耐性遺伝子の組み込みはさらに、PstI断片へ分子内HindIII切断部位を導入した （図４のレーン２および４を比較のこと）。 実施例７：アカルボースによるα-アミラーゼの阻害 デンプン検出のための酵素試験(TC-Starch，Boehringer-Marmheim，Cat．No． 297748)を用いて、ストレプトマイセス・グローセスセンスGLA.Oから単離された 化合物がα-アミラーゼを阻害することを証明することが可能であった。試験原 理：デンプンはアミログルコシダーゼによりD-グルコースへと分割される。次い でグルコースはヘキソキナーゼによりグルコース-6-リン酸に変換され、後者は グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼによりD-グルコネート-6-リン酸へと変換 される。この反応は、その形成が光度計測により検出され得るNADPHを生成する 。 アカルボースはα-アミラーゼを阻害し、それによりD-グルコースの生成を妨げ 、最終的にはNADPHの生成もまた妨害する。 実施例８：S.グローセスセンスGLA.Oの増殖およびアカルボースの生成のための 培地 発酵は、120rpmのオービタルシェーカー上、27℃にて、100mlの培地２を入れ たサイドバッフル付き500ml三角フラスコ中で行った。発酵は２または３日後に 終了させた。偽オリゴ糖は、実施例９に記載したように、プレート拡散試験によ り検出した。培地３を用いた場合、α-アミラーゼ阻害剤は生成しなかった。こ のことは、偽オリゴ糖の生成がグルコースにより阻害されることを意味する。ま た、マルトース、スクロース、または複合糖源（麦芽抽出物）などの他の糖も、 S.グローセスセンスGLA.Oを用いる偽オリゴ糖の生成の際、考慮に入れられる。 培地２： ダイズ粉末 20g/L デンプン 20g/L pH 7.2 培地３： ダイズ粉末 20g/L グルコース 20g/L pH 7.2 実施例９：Mucor mieheiを用いるバイオテスト Mucor miehei系統の胞子懸濁液を寒天（培地５）に注ぎ(１０⁵胞子/lm)、次い で各場合においてこの混合物10mlをペトリ皿に注いだ。ペーパーテストディス ク（径6mm）に10μlのアカルボース［lacuna］(1mg/ml)またはS.グローセスセン ス培養液からのサンプルを載せ、試験平板培地上に置いた。次いで該平板培地を 37℃でインキュベートした。デンプン含有培地５上には阻止円が現れた。デンプ ンの代わりにグルコースを用いて生産した平板培地（培地４）を対照として用い た。この培地上には、活性化合物を載せたフィルターディスクの周囲に阻止円は 形成されなかった。 培地４および５ KH₂PO₄×3H₂O 0.5g MgSO₄×7H₂O 0.2g NaCl 0.1g 硫酸アンモニウム 5g 酵母窒素塩基 1.7g グルコース(4)またはデンプン(5) 5g 寒天 15g 実施例１０：S.グローセスセンスGLA.Oの形質転換 ストレプトマイセス・グローセスセンス系統のプロトプラストをMotamedi and Hutchinson((1987)PNAS USA 84:4445-4449)に記載されたように単離し、単離し たプラスミドＤＮＡをHopwood et al.((1985)Genetic manipulations of Strept omyces:a laboratory manual．The John Innes Foundation，Norwich UK)に説明 されているように、PEG形質転換法により細胞へ導入した。このプロトプラスト をR2YENG培地上で、30℃にて再分化させた(Motamedi and Hutchinson（1987）PN AS USA 84:4445-4449)。18時間後、寒天平板培地にチオストレプトン含有溶液を 重層し、30℃でインキュベートした（チオストレプトン最終濃度：20μg/ ml）。 実施例１１：ストレプトマイセス・グローセスセンスGLA.Oからの偽オリゴ糖の 単離、HPLC分析および質量分析 単離 濾過により、菌糸体から培養液を分離した。次いで、このようにして得られた 培養濾液をXAD16カラムに装填し、その後カラムを水で洗浄し、活性化合物を30% メタノールで溶出させた。脂溶性不純物を除去するために、溶出物を水性相まで 濃縮し、脂溶性不純物は酢酸エチルを用いて抽出した。次いで水性相を濃縮し、 バイオゲルP2カラムを用い、活性化合物をさらに5%メタノール中で精製した。個 々の画分はフラクションコレクターで分取した。この個々の画分をムコール・ミ エヘイのバイオテストにより分析した。さらなる精製のために、バイオゲルP2上 、5%メタノール中で、活性溶出物を再びクロマトグラフィにかけた。この方法で 単離された物質をHPLCおよびMSにより調べた。 HPLC カラム：Nucleosil（商標名）100C-18 溶出液：0.1%リン酸=A／アセトニトリル=B グラディエント：１５分間で0〜100%B 検出：215nm 流量：2ml/分 注入量：10-20μl HPLCを用いて、S.グローセスセンスGLA.O由来の偽オリゴ糖生産物と真のアカ ルボースを区別することは不可能であった。この溶出系においては、２種の化合 物の保持時間およびUV吸収スペクトルは双方とも同一であった。これらの条件下 にでは、偽オリゴ糖混合物は分画されなかった。 質量分析(MS) 真のアカルボースおよびストレプトマイセス・グローセスセンスGLA.Oから単 離した偽オリゴ糖の分子量および断片化パターンを、エレクトロスプレー質量分 析法により測定した。Bayer(Glucobay)から市販されているアカルボースの分析 では、質量ピーク645.5（アカルボース）が得られた。S.グローセスセンスGLA.O から得られた精製サンプルは、糖側鎖の長さが異なる：969（アカルボース+2グ ルコース単位）、807（アカルボース+1グルコース単位）、645（真のアカルボー スに相当）、種々の偽オリゴ糖の混合物を含有する。アカルボースおよびS.グロ ーセスセンスGLA.Oから単離された分子量645の化合物を断片化した場合、同一の 分子断片が形成され、すなわちそれは145（4-アミノ-4,6-デオキシグルコース） 、303(アカルビオシン）、および465（1グルコース単位を伴う303）である。 また、アクチノプラーネス種SE50も、異なる長さの糖側鎖を有するアカルボー ス分子混合物を生成する(Truscheit(1984)VIIIth International Symposium on Medicinal Chemistry，Proc．Vol 1．Swedish Academy of Pharmaceutical Scie nces，Stockholm，Sweden)。糖側鎖の長さは、発酵パラメーターおよび栄養溶液 中の基質の選択に影響され得る。 実施例１２：アクチノプラーネス種SE50/110(ATCC31044)を用いるサザンハイブ リダイゼーション アクチノプラーネス種SE50/100系統から染色体ＤＮＡを単離し、制限酵素(Pst 1およびBamH1)で消化した。次いでストレプトマイセス・グローセスセンスGLA.O 由来のdTDP-グルコース4,6-デヒドラターゼacbDのコーディング領域（断片d、図 ３）を含むプローブを用いてサザンハイブリダイゼーションを行なった。該プロ ーブをアクチノプラーネス種SE50/110由来の異なったバンド（図５、レーン１お よび２）とハイブリダイズさせた。このことは、アクチノプラーネス種SE50/100 および他の系統ライン由来の相当する断片を単離できる可能性をもたらすもので ある。これらのＤＮＡ領域が実際にアカルボースの生合成に関与しているかどう かは後の研究で証明されるべく残っている。また、PCRプライマ−１および２（ 表１）をアクチノプラーネス種由来のdTDP-グルコース4,6-デヒドラターゼを増 幅するために使用することもできる。 図面の説明： 図１：S.グローセスセンスGLA.Oを用いたサザンハイブリダイゼーション。レー ン1:Pst1、レーン２：BamH1、レーン３：Bg111。標識したPCR断片HstrE^★をプロ ーブとして用いた。ヒドロキシストレプトマイシンの生合成に関与するＤＮＡ断 片の標識。 図２：S.グローセスセンスGLA.Oを用いたサザンハイブリダイゼーション。レー ン１：Pst1、レーン２：BamH1、レーン３：Bg111。標識したPCR断片acbD^*をプロ ーブとして用いた。偽オリゴ糖の生合成に関与するＤＮＡ断片の標識。 図３：ストレプトマイセス.・グローセスセンスGLA.O由来の6.8kb Pst1断片の制 限地図。オープンリーディングフレームおよび各々転写される方向は矢印で示さ れている。断片a,b,cおよびｄは本文中により詳細に説明されているＤＮＡ領域 に同じ。図４：ストレプトマイセス・グロースセスセンス△acbを用いたサザン ハイブリダイゼーション。レーン１：Pst1、レーン２：Pst1/Hind111、およびス トレプトマイセス・グローセスセンスGLA.O、レーン３：Pst1、レーン４：Pst1/ Hindlll。標識1.0kb Sstl断片a（図3）をプローブとして用いた。 図５：アクチノプラーネス種SE50/100を用いたサザンハイブリダイゼーション。 レーン１:Pstl、レーン２：BamHlおよびストレプトマイセス・グローセスセンス GLA.O、レーン３：Pstl。標識1.0kb Smal/EcoRI断片d（dTDP-グルコース4,6-ヒ ドラターゼ、図３）をプローブとして用いた。矢印は標識ＤＮＡ断片(BamHl：2. 1および0.7kb、Pstl：〜11-12kb)を表す。 表４：ストレプトマイセス・グローセスセンスGLA.O由来の6.8kb Pstl断片のＤ ＮＡ配列（配列番号７）。同定されたオープンリーディングフレームの推定アミ ノ酸配列（配列番号８〜１３）はＤＮＡ配列の下に示されている。開始および停 止コドン、並びに可能性のあるリボゾーム結合部位は下線で示されている。 acbA：配列番号８ acbB：配列番号９ acbC：配列番号１０ acbD：配列番号１１ acbE：配列番号１２ acbF：配列番号１３ 表４（配列番号７、８、９、１０、１１、１２、１３）

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ Ｄ，ＳＺ，ＵＧ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＵ，ＡＺ ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＵ， ＣＺ，ＥＥ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＧ，Ｋ Ｐ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ， ＲＵ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，Ｕ Ａ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． アカルボースの生合成遺伝子を含んでなる、ＤＮＡ分子。 ２． アカルボースおよび相同偽オリゴ糖の生合成遺伝子を含有する、請求項 １記載のＤＮＡ分子。 ３． 遺伝子が図３に示されたように、それらの転写の方向および順序に配置 されている、請求項１または２記載のＤＮＡ分子。 ４． 図３に示されたような制限酵素切断部位パターンを示す、請求項１、２ または３記載のＤＮＡ分子。 ５． (a)表４のＤＮＡ配列またはその一部を含んでなる；または (b)ストリンジェント条件下で、(a)のＤＮＡ分子とハイブリダイズすることがで きるＤＮＡ配列またはその一部を含んでなる；または (c)遺伝子コードの縮重のために、(a)および(b)のＤＮＡ分子とは異なるが、(a) および(b)のＤＮＡ分子を用いて発現させることができるタンパク質発現を可能 にするＤＮＡ配列またはその一部を含んでなる、請求項１〜４のいずれか１項記 載のＤＮＡ分子。 ６． (a)に記載の配列として、表４のヌクレオチド1〜720のＤＮＡ配列（acb A遺伝子）またはその一部を含んでなる、請求項５記載のＤＮＡ分子。 ７． (a)に記載の配列として、表４のヌクレオチド720〜2006のＤＮＡ配列（ acbB遺伝子）またはその一部を含んでなる、請求項５記載のＤＮＡ分子。 ８． (a)に記載の配列として、表４のヌクレオチド2268〜3332のＤＮＡ配列 （acbC遺伝子）またはその一部を含んでなる、請求項５記載の組換えＤＮＡ分子 。 ９． (a)に記載の配列として、表４のヌクレオチド3332〜4306のＤＮＡ配列 （acbD遺伝子）またはその一部を含んでなる、請求項５記載の組換えＤＮＡ分子 。 １０． (a)に記載の配列として、表４のヌクレオチド4380〜5414のＤＮＡ配 列（acbE遺伝子）またはその一部を含んでなる、請求項５記載の組換えＤＮＡ分 子。 １１． (a)に記載の配列として、表４のヌクレオチド5676〜6854のＤＮＡ配 列（acbF遺伝子）またはその一部を含んでなる、請求項５記載の組換えＤＮＡ分 子。 １２． 請求項５のＤＮＡ分子のPCR増殖用オリゴヌクレオチドプライマー。 １３． 表１の配列を有する、請求項１２記載のオリゴヌクレオチドプライマ ー。 １４． 請求項１〜１１のいずれか１項記載のＤＮＡ分子を含有するベクター 。 １５． アカルボース産生微生物の天然アカルボース生合成遺伝子を欠失、ま たは改変する方法に使用する、請求項１４記載のベクター。 １６． pGM160または関連ベクターからなる群より選択される、請求項１５記 載のベクター。 １７． 発現ベクターであって、ＤＮＡ分子がプロモーター配列に作動可能に 連結されている、請求項１４記載のベクター。 １８． 大腸菌、バチルス・ズブチリス、ストレプトマイセス、アクチノプラ ーネス、アンプラリエラおよびストレプトスポランギウム系統、ストレプトマイ セス・ヒグロスコピカス・リモネウス種、ストレプトマイセス・グローセスセン ス、並びにアスペルギルス・ニガー、ペニシリウム・クリソゲナム、およびサッ カロミセス・セレビシエからなる群より選択される宿主微生物での発現に適する 、請求項１７記載のベクター。 １９． ストレプトマイセス・グローセスセンスGLA.Oまたはアクチノプラー ネス種での発現に適する、請求項１７記載のベクター。 ２０． 請求項１〜１１のいずれか１項記載のＤＮＡ分子、または請求項１４ 〜１９のいずれか１項記載のベクターで形質転換された宿主細胞。 ２１． 大腸菌、バチルス・ズブチリス、ストレプトマイセス、アクチノプラ ーネス、アンプラリエラおよびストレプトスポランギウム系統、ストレプトマイ セス・ヒグロスコピカス・リモネウス種、ストレプトマイセス・グローセスセン ス、並びにアスペルギルス・ニガー、ペニシリウム・クリソゲナム、およびサッ カロミセス・セレビシエからなる群より選択される、請求項２０記載の宿主細胞 。 ２２． ストレプトマイセス・グローセスセンスGLA.Oまたはアクチノプラー ネス種よりなる群より選択される、請求項２１記載の宿主細胞。 ２３． 請求項１〜５のいずれか１項記載の遺伝子クラスターの遺伝子を発現 させることによって得ることができるタンパク質混合物。 ２４． 請求項６〜１１のいずれか１項記載の遺伝子を発現させることにより 得ることができる単離タンパク質。 ２５． 請求項６のＤＮＡによってコードされるタンパク質（acbA遺伝子生成 物）。 ２６． 請求項７のＤＮＡによってコードされるタンパク質（acbB遺伝子生成 物）。 ２７． 請求項８のＤＮＡによってコードされるタンパク質（acbC遺伝子生成 物）。 ２８． 請求項９のＤＮＡによってコードされるタンパク質（acbD遺伝子生成 物）。 ２９． 請求項１０のＤＮＡによってコードされるタンパク質（acbE遺伝子生 成物）。 ３０． 請求項１１のＤＮＡによってコードされるタンパク質（acbF遺伝子生 成物）。 ３１． (a)適切な宿主細胞でタンパク質を発現させ、次いで (b)単離することを特徴とする、請求項２３〜３０のいずれか１項記載のタンパ ク質を得る方法。 ３２． 宿主細胞が大腸菌、バチルス・サブチリス、ストレプトマイセス、ア クチノプラーネス、アンプラリエラおよびストレプトスポランギウム系統、スト レプトマイセス・ヒグロスコピカス・リモネウス種、ストレプトマイセス・グロ ーセスセンス、並びにアスペルギルス・ニガー、ペニシリウム・サッカロミセス ・セレビシエからなる群より選択される、請求項３１記載の方法。 ３３． 宿主細胞がストレプトマイセス・グローセスセンスGLA.Oまたはアク チノプラーネス種からなる群より選択される、請求項３１記載の方法。 ３４． (a)請求項６〜１１のいずれか１項記載の遺伝子の１以上を適切な宿 主細胞での発現に使用し、次いで (b)該宿主細胞の培養上清からアカルボースを単離することを特徴とする、アカ ルボースの生産法。 ３５． 請求項２１または２２のいずれか１項の宿主細胞が選択される、請求 項３４記載のアカルボースの生産法。 ３６． (a)天然アカルボース産生宿主細胞において、請求項６〜１１のいず れか１項の遺伝子の１以上を欠失させ、次いで (b)該宿主細胞からアカルボースを単離することを特徴とするアカルボースの生 産法。 ３７． 請求項２２の宿主細胞が選択される、請求項３６記載のアカルボース の生産法。 ３８． 請求項３４〜３５のいずれか１項の方法を請求項３６〜３７のいずれ か１項の方法と組み合わせる、アカルボースの生産法。 ３９． (a)請求項５のＤＮＡ分子から誘導されるハイブリダイゼーションプ ローブを用いるハイブリダイゼーション法によって隣接するゲノムＤＮＡ領域を 単離し、次いで (b)配列決定することを特徴とする、請求項５のアカルボースの生合成遺伝子ク ラスターの完成方法。 ４０． (a)請求項５のＤＮＡ分子由来のＤＮＡ配列から誘導されるPCRプライ マーおよび使用されるベクター系の配列とのハイブリダイゼーションを可能にす る配列を有するプライマーを用いるPCR法により、隣接するゲノムＤＮＡ領域を 単離し、次いで (b)配列決定することを特徴とする、請求項５記載のアカルボースの生合成に関 する遺伝子クラスターの完成法。 ４１． ストレプトマイセス・グローセスセンスGLA.O以外のアカルボース産 生微生物由来のアカルボースおよび相同偽オリゴ糖の生合成に関する遺伝子クラ スターの単離法であって、請求項５の組換えＤＮＡ分子から引き続き、 a)ハイブリダイゼーションプローブを生産し、 b)これらハイブリダイゼーションプローブを、相当する微生物から得られたＤＮ ＡライブラリーのゲノムおよびｃＤＮＡスクリーニングに用い、次いで c)見出されたクローンを単離・同定することを特徴とする方法。 ４２． ストレプトマイセス・グローセスセンスGLA.O以外のアカルボース産 生微生物由来のアカルボースおよび相同偽オリゴ糖の生合成遺伝子クラスターの 単離法であって、請求項５の組換えＤＮＡ分子から出発して、 a)ハイブリダイゼーションプローブを生産し、 b)これらハイブリダイゼーションプローブを、相当する微生物に由来するゲノム ＤＮＡまたはｃＤＮＡのＤＮＡ断片の集積に用い、 c)集積された断片を単離・同定し、次いで d)適当なところで請求項４１の方法に使用することを特徴とする方法。 ４３． 微生物が放線菌目、ストレプトマイセス、アクチノプラーネス、アン プラリエラおよびストレプトスポランギウム系統、ストレプトマイセス・ヒグロ スコピカス・リモネウス種、並びにストレプトマイセス．グローセスセンスから なる群より選択される、請求項４１または４２記載の方法。 ４４． 微生物が特にストレプトマイセス・グローセスセンスGLA.Oまたはア クチノプラーネス種からなる群より選択される、請求項４３記載の方法。 ４５． アカルボースを得るためのストレプトマイセス・グローセスセンスGL A.Oの使用。 ４６． より大量のアカルボース産生を可能にする、この系統の突然変異体を 作製するためのストレプトマイセス・グローセスセンスGLA.Oの使用。 ４７． アカルボース収量を向上させるための内生アカルボース生合成遺伝子 の遺伝子発現の改変法であって、 a)各々の遺伝子プロモーターの１以上に突然変異を導入し、次いで b)得られた生産系統のアカルボース収量を開始系統のそれと比較することを特徴 とする方法。 ４８． 突然変異体が、 a)トランジション b)欠失および／または c)付加である、請求項４７記載の方法。