MX2012013099A - Cepas spnk. - Google Patents

Abstract

La presente invención incluye genes biosintéticos de spinosyn, microorganismos que producen spinosyn transformados con los genes biosintéticos, métodos para utilizar los genes biosintéticos para incrementar la producción de macrólidos e insecticidas de spinosyn y métodos que utilizan los genes o fragmentos de los mismos para cambiar los productos producidos mediante microorganismos que producen spinosyn. Además, la presente invención incluye métodos y composiciones para convertir la cepa que produce spinosyn A y D, a una cepa que produce un precursor de spinetoram, spinosyn J y L.

Description

CEPAS SPNK Referencia Cruzada con Solicitud Relacionada La presente solicitud de patente reclama el beneficio de la Solicitud de Patente Provisional Norteamericana No. 61/333,540, presentada el 11 de mayo de 2010, la cual está incorporada en su totalidad a la presente invención como referencia.

Campo de la Invención La presente invención aplica al campo técnico de genética molecular, para interrumpir la expresión de genes. Más específicamente, se ha descubierto que una mutación en el gen spnK, convierte una cepa que produce espinosad en una cepa que produce un precursor de espinetoram.

Antecedentes de la Invención Tal como se describe en la Patente Norteamericana No. 5,362,634, el producto de fermentación A83543 es una familia de compuestos relacionados producidos mediante Saccharopolyspora spinosa. Los miembros conocidos de esta familia, han sido referidos como factores o componentes, y a cada uno se le ha proporcionado una designación de letra de identificación. Estos compuestos en lo sucesivo son referidos como espinosina A, B, etc. Los compuestos de espinosina son útiles para el control de arácnidos, nemátodos e insectos, en particular, especies Lepidoptera y Díptera, y son ambientalmente amigables y tienen un perfil toxicológico muy atrayente.

Los compuestos de espinosina producidos naturalmente, consisten en un sistema de anillo 5,6,5-tricíclico, fusionado a una lactona macrocíclica de 12 miembros, un azúcar neutral (ramnosa) y un azúcar amino (forosamina) (ver la Publicación de Kirst y asociados (1991). Si no está presente el azúcar de amino, los compuestos han sido referidos como la ppseudoglicona de A, D, etc., y si no está presente el azúcar neutral, entonces los compuestos han sido referidos como la ppseudoglicona inversa de A, D, etc. Una nomenclatura más preferida es para referirse a las pseudogliconas como A 17-Psa, espinosina D 17-Psa, etc., y a las pseudogliconas inversas como espinosina A 9-Psa, espinosina D 9-Psa, etc.

Los compuestos de espinosina producidos naturalmente pueden ser producidos mediante fermentación a partir de los cultivos NRRL 18395, 18537, 18538, 18539, 18719, 18720, 18743 y 18823. Estos cultivos han sido depositados y hechos parte de la recolección de cultivo de reserva del Centro de Investigación Regional del Área Norte del Medio Oeste, Servicio de Investigación Agrícola, Departamento de Agricultura de los Estados Unidos (Midwest Area Northern Regional Research Center, Agricultural Research Service, United States Department of Agriculture), 1815 North University Street, Peoría, 111., 61604.

La Patente Norteamericana No. 5,362,634 y la Solicitud de Patente Europea correspondiente No. 375316 A1, se refieren a espinosinas A, B, C, D, E, F, G, H y J. Se dice que estos compuestos eran producidos cultivando una cepa de microorganismo novedoso Saccharopolyspora spinosa, seleccionado de NRRL 18395, NRRL 18537, NRRL 18538, y NRRL 18539.

WO 93/09126 se refiere a las espinosinas, L, M, N, Q, R, S y T. También se describen en dicha Publicación Internacional dos cepas que producen: NRRL 18719 y NRRL 18720, y una cepa que produce las espinosinas Q, R, S y T: NRRL 18823.

La Publicación Internacional WO 94/20518 y la Patente Norteamericana No. 5,6704,486 se refieren a las espinosinas K, O, P, U, V, W y Y, y derivados de las mismas. También se describe la cepa que produce espinosina K, NRRL 18743.

Surge un desafío en la producción de compuestos de espinosina, a partir del hecho de que se requiere un volumen de fermentación muy grande para producir una cantidad muy pequeña de espinosinas. Es altamente deseado incrementar la eficiencia de la producción de espinosina, y de esta forma incrementar la disponibilidad de las espinosinas, reduciendo al mismo tiempo su costo.

Puede ser conveniente proporcionar genes biosintéticos clonados, que proporcionan un método para producir nuevos derivados de las espinosinas, que pueden tener un diferente espectro de actividad insecticida. Son recomendables nuevos derivados, debido a que aunque las espinosinas conocidas inhiben un amplio espectro de insectos, no controlan todas las pestes. Se pueden proporcionar diferentes patrones de control, mediante intermediarios biosintéticos de las espinosinas, o mediante sus derivados producidos in vivo, o mediante derivados que resultan de su modificación química in vitro.

Puede también ser conveniente proporcionar intermediarios novedosos sintetizados a través de cepas mutantes de S. spinosa, en donde las partes de ciertos genes que codifican enzimas para la biosíntesis de espinosina, han sido reemplazadas con partes del mismo gen, que han sido mutadas específicamente in vitro, o con partes correspondientes de genes de otros organismos.

Breve Descripción de la Invención La presente invención proporciona procesos para convertir una cepa que produce espinosad, tal como espinosina A y D, a una cepa que produce un precursor de espinetoram, tal como espinosina J y L. Dicho proceso puede incluir la producción de una modificación en el gen spnK para eliminar la actividad de 3'-0-metiltransferasa . La modificación se puede elaborar a través de eliminaciones en cuadro, mutaciones, sustituciones, eliminaciones, inserciones, y similares. Las eliminaciones en cuadro que pueden ser a través del gen, incluyen eliminaciones del extremo 5', el extremo 3', o una región de codificación spnK. Una de dichas eliminaciones en cuadro, puede incluir la SEC. ID. NO. 9. Las mutaciones de punta pueden incluir, pero no se limitan a, mutaciones en las ubicaciones de los pares base 528, 589, 602, 668, 721, 794, 862, 895, 908, 937 y 1131. Estas mutaciones pueden conducir a cambios en la traducción del gen spnK. Dichos cambios pueden ser cambios, sustituciones de aminoácido, o la creación de codones de detención. Dichas modificaciones dan como resultado la producción del compuesto de espinosina de espinosina J y L, en comparación con espinosina A y D.

Los métodos particulares de la presente invención, incluyen la conversión de una cepa que produce espinosad, a una cepa que produce un precursor de espinetoram, deshabilitando un gen spnK, manteniendo al mismo tiempo la producción de J y L. La deshabilitación o interrupción de la actividad de la proteína spnK normalmente, puede ocurrir mediante eliminaciones en cuadro, mutaciones, sustituciones, eliminaciones, inserciones, y similares. También se puede originar mediante manipulaciones al promotor o a las secuencias del sitio de enlace de ribosoma.

La presente invención proporciona además una célula huésped genéticamente modificada que produce un precursor de espinetoram. El huésped genéticamente modificado, puede ser producido modificando el gen spnK para eliminar la actividad de 3'-0-metiltransferasa. La modificación puede ser a través de las eliminaciones en cuadro, mutaciones, sustituciones, eliminaciones, inserciones y similares. Las eliminaciones en cuadro pueden incluir eliminaciones del extremo 5', extremo 3' o de la región de codificación spnK.

La presente invención también proporciona procesos para convertir las cepas que producen espinosad en cepas que producen el precursor de espinetoram, modificando el gen spnK para eliminar la actividad de 3'-0-metiltransferasa. Este proceso puede incluir eliminaciones en cuadro, mutaciones de punta, eliminaciones e inserciones. Dichas eliminaciones en cuadro pueden incluir eliminaciones en cuadro de un extremo 5', eliminaciones en cuadro de un extremo 3', y eliminaciones en cuadro de una región de codificación spnK. Las eliminaciones pueden incluir eliminaciones de base de nucleótido simple o múltiples que interrumpen el cuadro de lectura normal del gen spnK. Las inserciones pueden incluir inserciones base de nucleótidos simples o múltiples, que interrumpen el cuadro de lectura normal del gen spnK. Las mutaciones de punta pueden ocurrir en las ubicaciones del par base 528, 589, 602, 668, 721, 794, 862, 895, 908, 937 y 1131. Estas mutaciones de punta pueden dar como resultado sustituciones de aminoácido en el sitio activo o el sitio de enlace de substrato del gen spnK.

La presente invención también incluye células huésped genéticamente modificadas que producen un precursor de espinetoram, en donde la célula huésped genéticamente modificada es una célula huésped procariótica que no produce normalmente una cantidad significativa de un precursor de espinetoram, produciendo una modificación en el ge spnK, para eliminar la actividad 3'-0-metiltransferasa. Otras modalidades incluyen métodos para convertir una cepa que produce espinosad en una cepa que produce un precursor de espinetoram, deshabilitando un gen spnK, manteniendo al mismo tiempo la producción de espinosina J y L. Dichos métodos pueden incluir eliminaciones en cuadro, mutaciones de punta, sustituciones, eliminaciones, inserciones, y similares. Dichas eliminaciones en cuadro pueden incluir eliminaciones en cuadro de un extremo 5', eliminaciones en cuadro de un extremo 3' y eliminaciones en cuadro de una región de codificación spnK. Las eliminaciones pueden incluir eliminaciones de base de nucleótido simple o múltiples que interrumpen el cuadro de lectura normal del gen spnK. Las inserciones pueden incluir inserciones base de nucleótido simple o múltiples, que interrumpen el cuadro de lectura normal del gen spnK. Las inserciones pueden incluir inserciones base de nucleótido simple o múltiples, que interrumpen el cuadro de lectura normal del gen spnK. Las mutaciones de punta pueden ocurrir en las ubicaciones de par base 528, 589, 602, 668, 721, 794, 862, 895, 908, 937 y 1131. Estas mutaciones de punta pueden dar como resultado sustituciones de aminoácido en el sitio activo o el sitio de enlace de substrato del gen spnK. Pueden ocurrir otros métodos para deshabilitar el spnK, manipulando un sitio de enlace de ribosoma, o manipulando un promotor de un gen spnK.

Breve Descripción de las Figuras La figura 1, ilustra la ubicación de las mutaciones de punta spnK. Las mutaciones son señaladas dentro de la secuencia tipo natural de spnK (SEC ID NO: 17).

La figura 2 ilustra un mapa físico de spnJ, spnK, spnL y spnM. Los productos PCR que fueron producidos son indicados mediante las líneas que se encuentran debajo del mapa cromosoma.

La figura 3, demuestra la integración de la construcción de eliminación en cuadro spnK, dentro de la región spnLM como una recombinación homóloga de cruce simple de acuerdo con una modalidad de la presente invención. (El asterisco indica una secuencia de codificación incompleta de spnJ y spnM).

La figura 4, ilustra mutantes de cruce dobles que dan como resultado una eliminación del gen spnK de acuerdo con una modalidad de la presente invención. El tamaño y secuencia de ADN del fragmento PCR, indica la eliminación en cuadro del gen spnK.

La figura 5, es un diagrama del cartucho de inserción que contiene un cartucho de gen de resistencia a apramicina en cuadro (aac(3)IV) dentro de spnK, de acuerdo con una modalidad de la presente invención.

La figura 6, ilustra el sitio de enlace de ribosoma (etiquetado como Shine-Dalgarno), el cual se localiza en la corriente ascendente de la secuencia de codificación spnK de acuerdo con una modalidad de la presente invención (SEC ID NO: 16). Esta secuencia está señalada en la figura.

Descripción Detallada de la Invención Existen muchos usos para el ADN de Saccharopolyspora spinosa clonado. Los genes clonados se pueden utilizar para mejorar los rendimientos de espinosinas y producir nuevas espinosinas. Los rendimientos mejorados se pueden obtener integrando en el genoma de una cepa particular, una copia por duplicado del gen para cualquier enzima que tenga un rango limitante en esta cepa. En casos en donde la trayectoria biosintética se bloquea en una cepa mutante particular debido a la carencia de una enzima requerida, se puede restaurar la producción de las espinosinas deseadas, integrando una copia del gen requerido. Cuando se interrumpe una trayectoria biosintética, se puede crear una diferente cepa precursora. Más específicamente, la interrupción del gen spnK puede dar como resultado la producción de espinosina J y L, en comparación con la producción de espinosina A y D.

Se pueden producir nuevas espinosinas utilizando fragmentos del ADN clonado para interrumpir los pasos en la biosíntesis de espinosinas. Dicha interrupción puede conducir a la acumulación de precursores o productos de "derivación" (los derivados de precursores procesados en forma natural). Los fragmentos útiles para llevar a cabo las interrupciones, son los internos en un gen con bases omitidas tanto de los del extremos 5' como 3' del gen, así como a lo largo del gen. Los eventos de recombinación homologa, que utilizan dichos fragmentos dan como resultado dos copias parciales del gen: una en la que está faltando las bases omitidas del extremo 5', y una en la que están faltando las bases omitidas del extremo 3'. El número de bases omitidas en cada extremo del fragmento, deben ser lo suficientemente grandes para que ninguna de las copias parciales del gen, retengan la actividad.

Se utilizan las siguientes definiciones en la presente invención, y deben ser referidas para la interpretación de las reivindicaciones y la especificación. A menos que se observe de otra manera, todas las Patentes Norteamericanas y las Solicitudes de Patente Norteamericana aquí referenciadas, están incorporadas en su totalidad a la presente invención como referencia .

Tal como se utiliza en la presente invención, los artículos indefinidos "un, uno, una", y "unos, unas" que preceden un elemento o componente de la presente invención, están proyectados para ser no restrictivos con respecto al número de casos (es decir surgimientos) del elemento o componente. Por consiguiente, "un, uno" o "unos, unas" se debe leer para incluir uno o al menos uno, en la forma singular de la palabra del elemento o componente y también incluye el plural a menos que el número obviamente signifique un singular.

Tal como se utiliza en la presente invención, los términos "que comprende" y "que incluye" significan la presencia de figuras, enteros, pasos o componentes estándar, tal como son referidos en las reivindicaciones, pero que excluyen la presencia o adición de una o más de otras características, enteros, pasos, componentes o grupos de los mismos. Esto significa una composición, una mezcla, un proceso, un método, un artículo o un aparato que "comprende" o "incluye" una lista de elementos que no está limitada únicamente a los elementos, sino que puede incluir otros no descritos en forma expresa o inherentes al mismo. Tal como se utiliza en la presente invención, el término "o" se refiere a un "o" inclusivo" y uno exclusivo. Por ejemplo, se satisface una condición A o B a través de cualesquiera de los siguientes casos: A es verdadera (o está presente) y B es falsa (o no está presente), A es falsa (o no está presente) y B es verdadera (o está presente), y tanto A como B son verdaderas (o están presentes).

Tal como se utiliza en la presente invención, el término "aproximadamente" se refiere a modificar la cantidad de un ingrediente reactivo de la presente invención, o se refiere a una variación en la cantidad numérica que puede ocurrir, por ejemplo, a través de los procedimientos típicos de manejo de líquidos y medición utilizados para elaborar concentrados o utilizar soluciones en el mundo real; a través del error inadvertido en estos procedimientos; a través de diferencias en la fabricación, fuente o pureza de los ingredientes empleados para elaborar las composiciones o llevar a cabo los métodos; y similares. El término "aproximadamente" también comprende cantidades que difieren debido a las condiciones de equilibrio diferentes de una composición, que resultan de una mezcla inicial particular. Si están o no modificadas por el término "aproximadamente, las reivindicaciones incluyen equivalentes a las cantidades.

Tal como se utiliza en la presente invención, el término "invención" o "presente invención", es un término no limitante, y pretende comprender todas las posibles variaciones tal como se describen en la especificación y en las reivindicaciones.

Tal como se utiliza en la presente invención, los términos "polipéptido" y "péptido" serán utilizados en forma intercambiable para referirse a un polímero de dos o más aminoácidos unidos juntos a través de un enlace de péptido. En un aspecto, este término también incluye modificaciones post expresión del polipéptido, por ejemplo, glucosilaciones, acetilaciones, fosforilaciones y similares. Incluidos dentro de la definición, están por ejemplo los péptidos que contienen uno o más análogos de un aminoácido o aminoácidos etiquetados y peptidomiméticos. Los péptidos pueden comprender a m i n o á c i d o s - L .

Tal como se utiliza en la presente invención, los términos "péptido de interés", "??G, "producto de gen", "producto de gen objetivo" y "producto de gen de región de codificación objetivo", se refieren al producto de péptido/proteína heterologo deseado codificado por el gen extraño expresado en forma recombinante. El péptido de interés puede incluir cualquier producto de péptido/proteína, que incluye pero no se limita a proteínas, proteínas de fusión, enzimas, péptidos, polipéptidos y oligopéptidos. El péptido de interés fluctúa en tamaño de 2 a 398 aminoácidos de longitud.

Tal como se utiliza en la presente invención, el término "construcción genética" se refiere a una serie de ácidos nucleicos contiguos para modular el genotipo y fenotipo de un organismo. Los ejemplos sin limitación de construcciones genéticas incluyen pero no se limitan a una molécula de ácido nucleico, y un cuadro de lectura abierta, un gen, un cartucho de expresión, un vector, un plásmido y similares.

Tal como se utiliza en la presente invención, el término "gen endógeno" se refiere a un gen nativo en su ubicación natural en el genoma de un organismo.

Tal como se utiliza en la presente invención, un "gen extraño" se refiere a un gen que normalmente no se encuentra en el organismo huésped, sino que es introducido en el organismo huésped a través de transferencia genética. Los genes extraños pueden comprender genes nativos insertados en un organismo no nativo o genes quiméricos.

Tal como se utiliza en la presente invención, el término "heterólogo" , con respecto a una secuencia dentro de un organismo/genoma en particular, indica que la secuencia se origina de una especie extraña, o si es de la misma especie, es modificado especialmente de su forma nativa en composición y/o locus genómico, mediante intervención humana deliberada. Por lo tanto, por ejemplo, la expresión de gen heterólogo se refiere al proceso de expresar un gen de un organismo/genoma, colocándolo en el genoma de un diferente organismo/genoma.

Tal como se utiliza en la presente invención, el término "recombinante" se refiere a una combinación artificial de otros dos segmentos separados de la secuencia, por ejemplo, mediante síntesis química o mediante manipulación de segmentos aislados de ácidos nucleicos, mediante técnicas de ingeniería genética. El término "recombinante" también incluye referencia a una célula o vector, que ha sido modificado mediante la introducción de un ácido nucleico heterólogo o una célula derivada de una célula modificada, pero que no comprende la alteración de la célula o vector mediante eventos que ocurren naturalmente (por ejemplo, mutación espontánea, transformación natural, transducción natural, transposición natural), tal como la que ocurre sin la intervención humana deliberada.

El término "construido genéticamente" o "alterado genéticamente" significa la alteración científica de la estructura del material genético en un organismo vivo. Implica la producción y uso de ADN recombinante. Más en particular, se utiliza para delinear el organismo modificado o genéticamente construido a partir del organismo que ocurre naturalmente. La construcción genética se puede llevar a cabo a través de un número de técnicas conocidas en el arte, tal como por ejemplo, reemplazo de gen, amplificación genética, interrupción de gen, transfección, transformación utilizando plásmidos, virus u otros vectores. Un organismo genéticamente modificado, por ejemplo, un microorganismo genéticamente modificado, también con frecuencia es referido como un organismo recombinante, por ejemplo, microorganismo recombinante.

Tal como se utiliza en la presente invención, el término "interrumpido" o "interrupción", es cuando hace referencia a un gen que ha sido manipulado o modificado a través de ingeniería genética o a través de causas generales que cambian la actividad de un gen. Dicha actividad de gen puede ser incrementada o disminuida. Además, dicha interrupción puede abolir la función de la proteína. Para facilitar dicha disminución, el número de copias del gen puede ser disminuido, tal como por ejemplo mediante subexpresión o interrupción de un gen. Se dice que un gen será "subexpresado" si se reduce el nivel de transcripción del gen, en comparación con el gen tipo natural.

Esto puede ser medido, por ejemplo mediante análisis de manchado Northern, que identifica la cantidad de mARN como una indicación de la expresión genética. Tal como se utiliza en la presente invención, un gen es subexpresado si la cantidad de mARN generada es disminuida en al menos el 1%, 2%, 5% 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 200% o incluso más del 500%, en comparación con la cantidad de mARN generada a partir de un gen tipo natural. Como alternativa, se puede utilizar un promotor débil para dirigir la expresión del polinucleótido. En otra modalidad, el promotor, la región reguladora y/o la corriente ascendente del sitio de enlace de ribosoma del gen, se pueden alterar para lograr la expresión reducida. La expresión también puede ser reducida disminuyendo la vida media relativa del ARN mensajero. En otra modalidad, la actividad del propio polipéptido, puede ser disminuida empleando una o más mutaciones en la secuencia de aminoácido de polipéptido, lo cual disminuye la actividad. Por ejemplo, al alterar la afinidad del polipéptido para su substrato correspondiente, puede dar como resultado actividad reducida. De igual manera, la vida media relativa del polipéptido, puede ser disminuida. En otro escenario, en la que hay expresión de gen reducida o actividad reducida, la reducción se puede lograr alterando la composición del medio de cultivo celular y/o los métodos utilizados para cultivo. El término "expresión reducida" o "actividad reducida" tal como se utiliza en la presente invención, significa una disminución de al menos el 5%, 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 200% o incluso más del 500%, en comparación con una proteína, polinucleótido, gen tipo natural; o la actividad y/o la concentración de la proteína presente antes de que se reduzcan los polinucleótido o polipéptidos. La actividad de la proteína SpnK también se puede reducir contactando la proteína con un inhibidor específico o general de su actividad. Los términos "actividad reducida", "actividad disminuida o abolida" se utiliza de manera intercambiable en la presente invención.

La expresión "secuencias de control" se refiere colectivamente a secuencias promotoras, sitios de enlace de ribosoma, secuencias de terminación de transcripción, dominios reguladores de corriente ascendente, aumentadores y similares, que proporcionan colectivamente la transcripción y traducción de una secuencia de codificación en una célula huésped. No todas estas secuencias de control siempre necesitan estar presentes en un vector recombinante, siempre que el gen deseado tenga la capacidad de ser transcrito o traducido.

El término "recombinación" se refiere a la reclasificación de secciones de secuencias de ADN o ARN entre dos moléculas de ADN o ARN. La "recombinación homologa" ocurre entre dos moléculas ADN que hibridan en virtud de las secuencias de nucleótido homologas o complementarias presentes en cada molécula de ADN.

Los términos "condiciones estrictas" o "hibridación bajo condiciones estrictas" se refiere a condiciones bajo las cuales una sonda hibridará preferentemente a su subsecuencia objetivo, y en un menor grado a, o para nada a otras secuencias. La "hibridación estricta" y "condiciones de lavado de hibridación estricta" dentro del contexto de los experimentos de hibridación de ácido nucleico, tal como hibridaciones Southern y Northern, dependen de la secuencia, y son diferentes bajo diferentes parámetros ambientales. Se puede encontrar una guía extensa para la hibridación de ácidos nucleicos en la publicación de Tijssen (1993) Técnicas de Laboratorio de Bioquímica y Biología Molecular -- Hibridación con sondas de ácido nucleico parte I, capítulo 2, revisión de principios de hibridación y estrategia de ensayos de sonda de ácido nucleico, Elsevier, Nueva York. Generalmente, las condiciones de lavado e hibridación altamente estrictas son seleccionadas para estar a una temperatura de aproximadamente 5°C menos que el punto de fusión térmico (Tm) de la secuencia específica, con una fuerza iónica y pH definidos. La Tm es la temperatura (de acuerdo con la resistencia iónica y pH definido) en la cual el 50% de la secuencia objetivo híbrida a una sonda que corresponde perfectamente. Se seleccionan condiciones muy estrictas para ser ¡guales a Tm para una sonda particular.

Un ejemplo de condiciones de hibridación estricta para hibridación de ácidos nucleicos complementarios que tienen más de 100 residuos complementarios en un filtro en un manchado Southern o Northern blot, es formamida al 50%, con 1 mg de heparina a una temperatura de 42°C, llevándose a cabo la hibridación durante la noche. Un ejemplo de condiciones de lavado altamente estricto es 0.15 NaCI a una temperatura de 72°C durante aproximadamente 15 minutos. Un ejemplo de condiciones de lavado estrictos es un lavado 0.2xSSC a una temperatura de 65°C durante 15 minutos (ver la Publicación de Sambrook y asociados (1989) Clonación Molecular - Manual de Laboratorio (2o edición) Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Press, NY, para una descripción del amortiguador SSC). Con frecuencia, un lavado de alta rigurosidad está precedido por un lavado de baja rigurosidad para eliminar la señal de la sonda de fondo. Un lavado de rigurosidad media de ejemplo para un dúplex, por ejemplo, de más de 100 nucleótidos, es 1xSSC, a una temperatura de 45°C durante 15 minutos. Un ejemplo de un lavado de baja rigurosidad para un dúplex, por ejemplo, de más de 100 nucleótidos, es 4-6xSSC a una temperatura de 40°C durante 15 minutos. En general, una proporción de señal a ruido de 2x (o mayor) a la observada para una sonda no relacionada en el ensayo de hibridación particular, indica la detección de una hibridación específica. Los ácidos nucleicos que no hibridan entre sí bajo condiciones rigurosas, aún son substancialmente idénticos si los polipéptidos que codifican, son sustancialmente idénticos. Esto ocurre, por ejemplo, cuando una copia de un ácido nucleico es creada utilizando una degeneración de codón máxima permitida por el código genético.

La presente invención también se refiere a un polinucleótido aislado hibridizable bajo condiciones estrictas, preferentemente bajo condiciones altamente estrictas, para un polinucleótido como el de la presente invención.

Tal como se utiliza en la presente invención, el término "hibridar" pretende describir condiciones para hibridación y lavado bajo las cuales las secuencias de nucleótido de al menos aproximadamente 50%, al menos aproximadamente 60%, al menos aproximadamente 70%, más preferentemente al menos aproximadamente 80%, incluso más preferentemente al menos aproximadamente 85% a 90%, lo más preferentemente al menos aproximadamente 95% de homología entre sí, normalmente permanecen hibridadas entre sí.

En una modalidad, el ácido nucleico de la presente invención es al menos el 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o más homólogo a una secuencia de ácido nucleico mostrada en su aplicación o complemento de la misma.

Otro ejemplo no limitante de las condiciones de hibridación estrictas, es hibridación en cloruro de sodio/citrato de sodio 6x (SSC) a una temperatura de aproximadamente 45°C, seguido por uno o más lavados en 1xSSC, 0.1% SDS a una temperatura de 50°C, preferentemente a una temperatura de 55°C, más preferentemente a una temperatura de 60°C, e incluso más preferentemente a una temperatura de 65°C.

Las condiciones altamente estrictas pueden incluir incubaciones a una temperatura de 42°C durante un período de varios días, tal como 2 a 4 días, utilizando una sonda de ADN etiquetada, tal como una sonda de ADN etiquetada con digoxigenina (DIG), seguido de uno o más lavados en 2xSSC, 0.1% SDS a temperatura ambiente y uno o más lavados en 0.5xSSC, 0.1% SDS o O.lxSSC, 0.1% SDS a una temperatura de 65 a 68°C. En particular, las condiciones altamente estrictas incluyen, por ejemplo, 2 horas a 4 días de incubación a una temperatura de 42°C utilizando una sonda de ADN etiquetada-DIG (preparada utilizando por ejemplo un sistema de etiquetado DIG; Roche Diagnostics GmbH, 68298 Mannheim, Alemania) en una solución tal como una solución DigEasyHyb (Roche Diagnostics GmbH) con o sin 100 pg/ml de ADN de esperma de salmón, o una solución que comprende el 50% de formamida, 5xSSC (150 mM NaCI, 15 mM de citrato trisódico), 0.02% de sulfato dodecilo de sodio, 0.1% de N-lauroilsarcosina, y 2% de un reactivo de bloqueo (Roche Diagnostics GmbH), seguido del lavado de los filtros dos veces durante de 5 a 15 minutos en 2xSSC y SDS de 0.1% a temperatura ambiente, y posteriormente lavando dos veces durante 15 a 30 minutos en 0.5xSSC y 0.1% SDS o O.lxSSC y 0.1% SDS a una temperatura de 65 a 68°C.

En algunas modalidades, una molécula de ácido nucleico aislado de la presente invención que híbrida bajo condiciones altamente estrictas para una secuencia de nucleótido de la presente invención, puede corresponder a una molécula de ácido nucleico que ocurre naturalmente. Tal como se utiliza en la presente invención, una molécula de ácido nucleico que "ocurre naturalmente" se refiere a una molécula de ARN o ADN que tiene una secuencia de nucleótido que ocurre en la naturaleza (por ejemplo, codifica una proteína natural).

Un experto en la técnica conocerá que condiciones aplican a las condiciones de hibridación estrictas y altamente estrictas. La guía adicional con respecto a dichas condiciones, está fácilmente disponible en la técnica, por ejemplo en la Publicación de Sambrook y asociados, 1989, Clonación Molecular, Manual de Laboratorio, Cold Spring Harbor Press, N.Y.; y Ausubel y asociados (eds.), 1995, Protocolos Actuales en Biología Molecular (John Wiley & Sons, N.Y.).

Un fragmento clonado de genes que contienen ADN para enzimas biosintéticas de espinosina, puede permitir la duplicación de genes que codifican las enzimas que limitan el rango en la producción de espinosinas. Esto se puede utilizar para incrementar el rendimiento en cualquier circunstancia cuando una de las actividades codificadas limitó la síntesis de la espinosina deseada. Se logró un incremento en rendimiento de este tipo, en fermentaciones de Streptomyces fradiae, duplicando el gen que codifica una metiltransferasa que limita el rango, que convierte macrocina a tilosina (Baltz y asociados, 1997).

Se pueden sintetizar intermediarios específicos (o sus derivados naturales) mediante cepas mutantes de S. spinosa en donde ciertos genes que codifican las enzimas para la biosíntesis de espinosina, han sido interrumpidos. Dichas cepas se pueden generar integrando, mediante recombinación homóloga, un plásmido mutagénico que contiene un fragmento interno del gen objetivo. Al momento de la integración de plásmido, se forman dos copias incompletas del gen biosintético, eliminando de esta forma la función enzimática que codifica. El substrato para esta enzima, o algún derivado natural del mismo, debe acumularse al momento de la fermentación de la cepa mutante. Dicha estrategia se utilizó para generar una cepa de Saccharopolyspora erythraea que produce derivados de 6-desoxieritromicina novedosos (Weber & McAlpine, 1992).

Dichas cepas pueden ser generadas, intercambiando la región objetivo, mediante recombinación homóloga de cruce doble, con un plásmido mutagénico que contiene el nuevo fragmento entre secuencias no mutadas que flanquean la región objetivo. El gen híbrido puede producir proteína con funciones alteradas, ya sea careciendo de una actividad o llevando a cabo una transformación enzimática novedosa. Un nuevo derivado puede acumularse al momento de la fermentación de la cepa mutante. Dicha estrategia fue utilizada para generar una cepa de Saccharopolyspora erythraea que produce un derivado de anhidro eritromicina novedoso (Donadío y asociados, 1993).

Se clonaron genes biosintéticos de espinosina y ORFs relacionados, y se determinó la secuencia de ADN de cada uno. Los genes clonados y los ORFs son designados en lo sucesivo como spnA, spnB, spnC, spnD, spnE, spnF, spnG, spnH, spnl, spnJ, spnK, spnL, spnM, spnN, spnO, spnP, spnQ, spnR, spnS, ORFL15, ORFL16, ORFR1 , ORFR2, S. spinosa gtt, S. spinosa gdh, S. spinosa epi y S. spinosa kre.

Saccharapolyspora spinosa produce una mezcla de nueve compuestos relacionados en forma cercana llamados colectivamente "espinosinas". Dentro de la mezcla, la espinosina A y D, conocida como espinsoad, son los componentes mayores y tienen la más alta actividad contra objetivos de insecto clave. Espinosina J y L, dos de los componentes menores dentro de la mezcla de espinosina, son los precursores de espinetoram, el insecticida de espinosina de segunda generación. Las modalidades de la presente invención se refiere a la conversión directa de una cepa que produce espinosad a una cepa que produce un precursor de espinetoram mediante manipulación de spnK que codifica 3'-0-metil transferasa.

El espinosad es un insecticida producido por Dow AgroSciences (Indianapolis, Ind.) que está comprendido principalmente de aproximadamente el 85% de espinosina A y aproximadamente el 15% de espinosina D. Espinosina A y D son productos naturales producidos mediante la fermentación de Saccharopolyspora spinosa, tal como se describe en la Patente Norteamericana No. 5,362,634. Espinosad es un ingrediente activo de diversas formulaciones insecticidas disponibles comercialmente en Dow AgroSciences, incluyendo los productos de control de insectos de TRACER™, SUCCESS™, SPINTOR™ y CONSERVE™. Por ejemplo, el producto TRACER está comprendido de aproximadamente 44% hasta aproximadamente 48% de espinosad (p/v), o aproximadamente 4 libras de espinosad por galón. Los compuestos de espinosina en formulaciones granulares y líquidas tienen utilidad establecida para el control de arácnidos, nemátodos e insectos, en particular las especies Lepidoptera, Thysanoptera y Díptera. Espinosina A y D también son referidas en la presente invención como Espinosina A/D.

Espinetoram es una mezcla de espinosina J 5,6-dihidro-3'-etoxi (componente mayor) y espinosina L 3'-etoxi, producida por Dow AgroSciences. La mezcla puede ser preparada etoxilando una mezcla de espinosina J y espinosina L, seguido de hidrogenación. El enlace doble 5,6 de espinosina J y su 3'-etoxi es hidrogenado en forma mucho más fácil que el de L y su derivado 3'-etoxi, debido a la hidranza estérica a través de grupo metilo en C-5 en espinosina L y su derivado 3'-etoxi. Ver la Patente Norteamericana No. 6,001,981. Espinosina J y L también son referidas en la presente invención como Espinosina J/L.

Recientemente se demostró que spnK codifica 3'-0-metiltransferasa. Ver la Publicación de Kim y asociados, JACS, 132(9): 2901-3 (2010). Los solicitantes han encontrado que spnK puede eliminarse de la agrupación del gen biosintético de espinosina a través de una recombinación homóloga de cruce doble en cuadro, sin tener un efecto polar en la transcripción de los genes de corriente descendente spnL y spnM. Esto permite que se construya una cepa que produce espinosad para producir una cepa que produce el precursor de espinetoram. Esto también indica que la cepa de eliminación spnK había perdido la actividad de 3'-0-metiltransferasa.

Las modalidades de la presente invención pueden incluir manipulaciones en el gen spnK, que dan como resultado una eliminación en cuadro del gen spnK, eliminando uno o múltiples codones en una cepa que produce espinosad. Una eliminación en cuadro del gen spnK puede incluir cualquier truncación de cualquier parte del gen spnK. Las eliminaciones en cuadro de acuerdo con la presente invención, incluyen eliminaciones que eliminan un segmento de la secuencia que codifica proteína, reteniendo aún el cuadro de lectura adecuado después de la eliminación. Algunas modalidades de la presente invención pueden incluir eliminaciones que son "eliminaciones limpias" es decir, no contienen secuencias de ADN exógenas insertadas en el gen. Una eliminación en cuadro del gen spnK puede incluir la eliminación de cualesquiera de los aminoácidos 1 a 397. Puede incluir la eliminación del codón de inicio. Puede incluir además la eliminación del dominio conservado o cualquier región de inicio de transcripción.

Se utiliza la notación convencional en la presente invención para describir secuencias de polinucleótido: el extremo izquierdo de una secuencia de polinucleótido de hebra simple es el extremo 5'; la dirección de la izquierda de una secuencia de polinucleótido de hebra doble es referida como la dirección 5'. La dirección de la adición de nucleótidos 5' a 3' de las transcripciones de ARN nacientes es referida como la dirección de transcripción. La hebra de ADN que tiene la misma secuencia que un mARN es referida como la "hebra de codificación"; las secuencias en la hebra de ADN que tienen la misma secuencia que una mARN transcrita a partir de dicho ADN, y que se localizan en el extremo 5' a 5' de la transcripción de ARN, son referidas como "secuencias de corriente ascendente"; las secuencias de la hebra de ADN que tiene la misma secuencia que el ARN y que son el extremo 3' al 3' de la transcripción de ARN de codificación, son referidas como "secuencias de corriente descendente".

Las modalidades de la presente invención pueden incluir manipulaciones en el gen spnK, que dan como resultado una eliminación en cuadro del extremo 5' del gen spnK, eliminando uno o más codones múltiples en una cepa que produce espinosad. Estos codones pueden incluir el primero, segundo y tercer caso de un codón ATG.

Las modalidades adicionales de la presente invención pueden incluir manipulaciones en el gen spnK, que dan como resultado una eliminación en cuadro del extremo 3' del gen snpK, eliminando uno o más codones en una cepa que produce espinosad .

Otras modalidades de la presente invención pueden incluir manipulaciones en el gen spnK en una eliminación en cuadro de la región que codifica spnK, ya sea un codón simple o codones múltiples, dejando al mismo tiempo tanto el extremo 5' como el extremo 3' del gen intacto.

Las modalidades adicionales de la presente invención pueden incluir manipulaciones en el gen spnK que incluyen mutaciones de punta simples o múltiples que dan como resultado una terminación de transcripción prematura o una sustitución(s) de aminoácido en sitios múltiples, incluyendo pero sin limitarse al sitio activo y/o el sitio de enlace de substrato. Dichas mutaciones de punta simple o múltiples pueden ocurrir dentro de motivo de enlace-SAM, dando como resultado que exista una terminación temprana en el sitio activo o sitio de unión de enlace de substrato. Dichas mutaciones de punta simples o múltiples también pueden estar en un lugar que afecte la estructura SpnK general, o afecte el doblez adecuado, lo cual podría abolir la función SpnK. Dichas mutaciones de punta simples o múltiples, pueden crearse a través de la detección de polimorfismos funcionales o mediante mutagénesis.

El "polimorfismo funciona tal como se utiliza en la presente invención, se refiere a un cambio en la secuencia de par base de un gen que produce un cambio cualitativo o cuantitativo en la actividad de la proteína codificada por dicho gen (por ejemplo, un cambio en especificidad de actividad; un cambio en el nivel de actividad). El término "polimorfismo funcional" incluye mutaciones, eliminaciones e inserciones.

En general, se puede llevar a cabo el paso para detectar el polimorfismo de interés, recolectando una muestra biológica que contiene ADN de la fuente, y posteriormente determinando la presencia o ausencia del ADN que contiene el polimorfismo de interés, en la muestra biológica.

La determinación de la presencia o ausencia de ADN que codifica una mutación particular, se puede llevar a cabo con una sonda de oligonucleótido etiquetada con un grupo detectable adecuado, y/o por medio de una reacción de amplificación tal como reacción de cadena de polimerasa o reacción de cadena de ligasa (el producto del cual posteriormente se puede detectar la reacción de amplificación con una sonda de oligonucleótido etiquetada o un número de otras técnicas). Además, el grupo de detección puede incluir el paso de detectar si el sujeto es heterocigoso u homocigoso para la mutación particular. Se conocen diversos formatos de ensayo de sonda de oligonucleótido diferentes, que pueden ser empleados para llevar a cabo la presente invención. Ver por ejemplo, la Patente Norteamericana No. 4,302,204 de Wahl y asociados; la Patente Norteamericana No. 4,358,535 de Falkow y asociados; la Patente Norteamericana No. 4,563,419 de Ranki y asociados; y la Patente Norteamericana No. 4,994,373 de Stavrianopoulos y asociados La amplificación de una secuencia de ácido nucleico seleccionada, u objetivo se puede llevar a cabo a través de cualquier medio adecuado. Ver de manera genera la Publicación de Kwoh y asociados, Am. Biotechnol. Lab. 8, 14-25 (1990). Los ejemplos de técnicas de amplificación adecuada incluyen, pero no se limitan a reacción de cadena de polimerasa, reacción de cadena de ligasa, amplificación de desplazamiento de hebra (ver de manera general las Publicaciones de G. Walker y asociados, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89, 392-396 (1992); G. Walker y asociados, Nucleic Acids Res. 20, 1691-1696 (1992)), amplificación a base de transcripción (ver la Publicación de D. Kwoh y asociados, Proc. Nati. Acad Sci. USA 86, 1173-1177 (1989)), réplica de secuencia autosostenida (o "3SR") (ver la Publicación de J. Guatelli y asociados, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 87, 1874-1878 (1990)), la amplificación a base de secuencia ?ß (ver la Publicación de P. Lizardi y asociados, BioTechnology 6, 1197-1202 (1988)), la amplificación a base de secuencias de ácido nucleico (o "NASBA") (ver la Publicación de R. Lewis, Genetic Engineering News 12 (9), 1 (1992)), la reacción de cadena de reparación (o "RCR") (ver R. Lewis, supra), y la amplificación de ADN de boomerang (o "BDA") (ver R. Lewis, supra). La reacción de cadena de polimerasa es generalmente la más preferida.

Se puede llevar a cabo la reacción de cadena de polimerasa (PCR) de acuerdo con técnicas conocidas. Ver por ejemplo, las Patentes Norteamericanas Nos. 4,683,195; 4,683,202; 4,800,159; y 4,965,188. En general, PCR implica, primero, tratar una muestra de ácido nucleico (por ejemplo, en la presencia de una polimerasa de ADN estable al calor) con un cebador de oligonucleótido para cada hebra de la secuencia específica que será detectada bajo condiciones de hibridación, de modo que el producto de extensión de cada cebador sea sintetizado, el cual es complementario a cada hebra de ácido nucleico, con cebadores suficientemente complementarios para cada hebra de la secuencia específica para hibridar, de modo que el producto de extensión sintetizada de cada cebador, cuando se separa de su complemento, pueda servir como una plantilla para síntesis del producto de extensión del otro cebador, y posteriormente tratar la muestra bajo condiciones de desnaturalización para separar los productos de extensión de cebador de sus plantillas, si la secuencia o secuencias que serán detectadas están presentes. Estos pasos se repiten en forma cíclica hasta que se obtiene el grado de amplificación deseado. La detección de la secuencia amplificada se puede llevar a cabo agregando al producto de reacción, una sonda de oligonucleótido con la capacidad de hibridar para el producto de reacción (por ejemplo, una sonda de oligonucleótido de la presente invención), llevando la sonda una etiqueta detectable, y posteriormente detectando la etiqueta de acuerdo con técnicas conocidas, o mediante visualización directa en un gel. Dichas sondas pueden tener de 5 a 500 nucleótidos de longitud, preferentemente 5 a 250, más preferentemente 5 a 100 ó 5 a 50 ácidos nucleicos. Cuando las condiciones PC permiten la amplificación de todos los tipos alélicos, los tipos pueden ser distinguidos mediante hibridación con una sonda específica alélica, mediante digestión de endonucleasa de restricción, mediante electroforesis en los geles de gradiente de desnaturalización u otras técnicas.

La reacción de cadena de ligasa (LCR) también se lleva a cabo de acuerdo con técnicas conocidas. Ver la publicación de R. Weiss, Science 254, 1292 (1991). En general, la reacción se lleva a cabo con dos pares de sondas de oligonucleótido; un par enlaza a una hebra de la secuencia que será detectada; el otro par enlaza a la otra hebra de la secuencia que será detectada. Cada par traslapa completamente junto con la hebra a la cual corresponde. La reacción se lleva a cabo primero, desnaturalizando (por ejemplo, separando) las hebras de la secuencia que será detectada, posteriormente haciendo reaccionar las hebras con los dos pares de las sondas de oligonucleótido en la presencia de una ligasa estable al calor, de modo que cada par de sondas de oligonucleótido se ligue junto, separando posteriormente el producto de reacción, y posteriormente repitiendo en forma cíclica el proceso hasta que la secuencia haya sido amplificada hasta el grado deseado. Posteriormente se puede llevar a cabo la detección en una forma similar a la descrita anteriormente con respecto a PCR.

Las técnicas de amplificación de ADN, tal como las anteriores, pueden implicar el uso de una sonda, un par de sondas, o dos pares de sondas que enlazan específicamente al ADN que contiene el polimorfismo funcional, pero no enlazan a ADN que no contiene el polimorfismo funcional. Como alternativa, la sonda o par de sondas pueden enlazar a ADN, ya que ambas contienen y no contienen el polimorfismo funcional, pero producen o amplifican un producto (por ejemplo, un producto de elongación) en el cual se puede confirmar una diferencia detectable (por ejemplo, un producto más corto, en donde el polimorfismo funcional es una mutación de eliminación). Dichas sondas pueden generarse de acuerdo con técnicas estándar de las secuencias de ADN conocidas en, o asociadas con un gen enlazado a spnK, o de secuencias que se pueden generar de dichos genes de acuerdo con técnicas estándar.

Se podrá apreciar que los pasos de detección aquí descritos pueden llevarse a cabo directa o indirectamente. Otros medios para determinar indirectamente el tipo alélico, incluyen medir los marcadores polimórficos que están enlazados al polimorfismo funcional particular, tal como ha sido demostrado para las VNTR (repeticiones tándem de número variable).

La biología molecular comprende una amplia variedad de técnicas para el análisis de secuencias de proteína y ácido nucleico. Muchas de estas técnicas y procedimientos forman las bases de los ensayos y pruebas de diagnóstico clínico. Estas técnicas incluyen análisis de hibridación de ácido nucleico, análisis de enzima de restricción, análisis de secuencia genética y la separación y purificación de ácidos nucleicos y proteínas (ver por ejemplo, la Publicación de J. Sambrook, E. F. Fritsch, y T. Maniatis, Clonación Molecular: Manual de Laboratorio, 2o Edición, Cold spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989).

La mayoría de estas técnicas implican llevar a cabo numerosas operaciones (por ejemplo, pipeteado, centrifugación y electroforesis) en un gran número de muestras. Con frecuencia son complejas y tardadas, y generalmente requieren un alto grado de precisión. Muchas técnicas están limitadas en su aplicación por la carencia de sensibilidad, especificidad o capacidad de reproducción.

El análisis de hibridación de ácido nucleico generalmente implica la detección de un número muy pequeño de ácidos nucleicos objetivo específicos (ADN o ARN) con un exceso de ADN de sonda, entre una cantidad relativamente grande de ácidos nucleicos no objetivo complejos. Es útil una reducción en la complejidad del ácido nucleico en una muestra, para la detección de bajos números de copias (por ejemplo 10,000 a 100,000) de objetivos de ácido nucleico. Se logra la reducción de complejidad de ADN hasta cierto grado mediante la amplificación de las secuencias de ácido nucleico objetivo (ver por ejemplo la Publicación de M. A. Innis y asociados, Protocolos PCR: Guía para Métodos y Aplicaciones, Academic Press, 1990, Spargo y asociados, 1996, Sondas Moleculares y Celulares, con respecto a la amplificación SDA). Esto se debe a que la amplificación de los ácidos nucleicos objetivo, dan como resultado un gran número de secuencias de ácido nucleico objetivo relativas a las secuencias no objetivo, para mejorar de esta manera el paso de hibridación objetivo subsecuente.

El paso de hibridación implica poner la muestra de ADN preparada en contacto con una sonda reportera específica en un conjunto de condiciones óptimas para que ocurra la hibridación entre la secuencia de ADN objetivo y la sonda. La hibridación se puede llevar a cabo en cualquier número de formatos. Por ejemplo, se ha llevado a cabo el análisis de hibridación de ácido nucleico de muestra múltiple en una variedad de formatos de soporte sólido y filtro (ver la Publicación de Beltz y asociados, Métodos en Enzimología, Vol. 100, Part y asociados, Eds., Academic Press, Nueva York, Capítulo 19, páginas 266-308, 1985). Un formato, llamado hibridación de "manchado de punto" implica la unión no covalente de los ADN objetivo a un filtro, seguido de la hibridación subsecuente a una sonda(s) etiquetada con radioisótopo. La hibridación de "Manchado de Punto" ganó un amplio uso con respecto a las dos décadas pasadas, tiempo durante el cual se desarrollaron muchas versiones (ver la Publicación de Anderson y Young, en Hibridación de Ácido Nucleico-Método Práctico, Hames y Higgins, Eds., IRL Press, Washington, D.C. Capítulo 4, pp. 73-111, 1985). Por ejemplo, el método de manchado de punto ha sido desarrollado para múltiples análisis de mutaciones genómicas (EPA 0228075 para Nanibhushan y asociados) y para la detección de clones de traslape y la construcción de mapas genómicos (Patente Norteamericana No. 5,219,726 de Evans).

Las técnicas adicionales para llevar a cabo análisis de hibridación de ácido nucleico de muestra múltiple, incluyen dispositivos de matriz o múltiplex microformateados (por ejemplo, chips de ADN) (ver la Publicación de M. Barinaga, 253 Science, pp. 1489, 1991; W. Bains, 10 Bio/Technology, pp. 757-758, 1992). Estos métodos normalmente unen las secuencias de ADN específico a áreas muy pequeñas de un soporte sólido, tal como microdepósitos de un chip de ADN. Estos formatos de hibridación son versiones a microescala de los sistemas de hibridación de "manchado de punto" y "emparedado convencionales".

La hibridación microformateada puede ser utilizada para llevar a cabo la "secuenciación mediante hibridación" (SBH) (ver la Publicación de M. Barinaga, 253 Science, pp. 1489, 1991; W. Bains, 10 Bio/Technology, pp. 757-758, 1992). SBH hace uso de todos los posibles oligómeros de n-nucleótido (n-mers) para identificar n-mers en una muestra de ADN desconocida, los cuales sustancialmente son alineados mediante análisis de algoritmo para producir la secuencia de ADN (Ver, Drmanac Patente Norteamericana No. 5,202,231).

Existen dos formatos para llevar a cabo SBH. El primer formato implica crear una formación de todos los posibles n-mers en un soporte, la cual posteriormente es hibridada con la secuencia objetivo. El segundo formato implica unir la secuencia objetivo a un soporte, el cual es sondeado en secuencias con todos los posibles n-mers. Southern, (Solicitud de Patente del Reino Unido GB 8810400, 1988; E. M. Southern y asociados, 13 Genomics 1008, 1992), propuso el uso del primer formato para analizar o secuenciar el ADN. Southern identificó una mutación de punta simple conocida utilizando ADN genómico amplificado mediante PCR. Southern también describió un método para sintetizar una formación de oligonucleótidos en un soporte sólido para SBH. Drmanac y asociados, (260 Science 1649-1652, 1993), utilizó un segundo formato para secuenciar diversas secuencias de ADN cortas (116 pb). Los ADNs objetivo fueron unidos a soportes de membrana (formato de "manchado de punto"). Cada filtro fue hibridado en secuencias con 272 oligonucleótidos 10 mer y 1 mer etiquetados. Se utilizaron amplios rangos de condiciones estrictas para lograr la hibridación específica para cada sonda n-mer. Los tiempos de lavado variaron de 5 minutos a toda la noche, utilizando temperaturas de 0°C a 16°C. La mayor parte de las sondas requirieron 3 horas de lavado a una temperatura de 16°C. Los filtros tuvieron que ser expuestos de 2 a 18 horas, con el objeto de detectar las señales de hibridación.

Generalmente, están disponibles una variedad de métodos para detección y análisis de los eventos de hibridación. Dependiendo del grupo reportero (fluoróforo, enzima, radioisótopo, etc.) utilizado para etiquetar la sonda de ADN, se llevó a cabo la detección y análisis en forma fluorimétrica, calorimétrica o mediante autorradiografía. Al observar y medir la radiación emitida, tal como radiación fluorescente o emisión de partículas, se puede obtener información con respecto a los eventos de hibridación. Incluso cuando los métodos de detección tienen una sensibilidad intrínseca muy alta, es difícil la detección de los eventos de hibridación debido a la presencia de fondo de los materiales no enlazados en forma específica. Por lo tanto, la detección de los eventos de hibridoma depende de como se puede llevar a cabo la hibridación específica y sensible. Con respecto al análisis genético, se han desarrollado varios métodos que han intentado incrementar la especificidad y sensibilidad.

Una forma de análisis genético, es el análisis centrado en la elucidación de polimorfismos de ácido nucleico simple o ("SNPs"). Los factores que favorecen el uso de SNPs, son su alta abundancia en el genoma humano (comparado especialmente con repeticiones tándem cortas, (STRs)), su frecuencia ubicación dentro de las regiones de codificación o reguladoras de los genes (que pueden afectar la estructura de proteína o los niveles de expresión) y su estabilidad cuando se pasan de una generación de la siguiente (Landegren y asociados, Genome Research, Vol. 8, pp. 769-776, 1998).

Se define un SNP como una posición en el genoma que existen dos variantes, y la variante más común ocurre en menos del 99% del tiempo. Con el objeto de utilizar SNPs como marcadores genéticos amplios, es crucial tener la capacidad de genotipearlos en forma fácil, rápida, precisa y efectiva en costo. Actualmente están disponibles numerosas técnicas para tipificar SNPs (para una revisión ver la Publicación de Landegren y asociados, Genome Research, Vol. 8, pp. 769-776, (1998), las cuales todas requieren amplificación objetivo. Incluyen secuenciación directa (Carothers y asociados, BioTechniques, Vol. 7, pp. 494-499, 1989), polimorfismo de conformación de hebra simple (Orita y asociados, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, Vol. 86, pp. 2766-2770, 1989), amplificación especifica de alelo (Newton y asociados, Nucleic Acids Research, Vol. 17, pp. 2503-2516, (1989), digestión por restricción (Day and Humphries, Analytical Biochemistry , Vol. 222, pp. 389-395, 1994), y ensayos de hibridación. En su forma más básica, los ensayos de hibridación funcionan diferenciando reporteros de oligongcleótido cortos contra objetivos acoplados y no acoplados. Se han desarrollado muchas adaptaciones al protocolo básico. Éstas incluyen reacción de cadena de ligadura (Wu y Wallace, Gene, Vol. 76, pp. 245-254, 1989) y minisecuenciación (Syvanen y asociados, Genomics, Vol. 8, pp. 684-692, 1990). Otras mejorías incluyen el uso de la actividad de 5'-nucleasa de polimerasa de ADN Taq (Holland y asociados, Proc. Nati. Acad. Scic USA, Vol. 88, pp. 7276-7280, 1991), faros moleculares (Tyagi y Kramer, Nature Biotechnology , Vol. 14, pp. 303-308, 1996), curvas de desnaturalización térmica (Howell y asociados, Nature Biotechnology, Vol. 17, pp. 87-88, 1999) y "chips" de ADN (Wang y asociados, Science, Vol. 280, pp. 1077-1082, 1998).

Un fenómeno adicional que puede ser utilizado para distinguir las SNPs, son las energías de interacción de ácido nucleico o energías de adhesión base derivadas de la hibridación de sondas específicas de objetivo múltiple a un objetivo simple (ver por ejemplo la Publicación de R. Ornstein y asociados, "Función Potencial Optimizada para el Cálculo de Energías de interacción de ácido nucleico" Biopolymers, Vol.17, 2341-2360 (1978); J. Norberg y L. Nilsson, Biophysical Journal, Vol. 74, pp. 394-402, (1998); y J. Pieters y asociados, Nucleic Acids Research, Vol. 17, no. 12, pp. 4551-4565 (1989)). Este fenómeno de adhesión base se utiliza en un formato único en la presente invención, para proporcionar diferenciales Tm altamente sensibles, que permiten la detección directa de SNPs en una muestra de ácido nucleico.

Se han utilizado métodos adicionales para distinguir secuencias de ácido nucleico en organismos relacionados o para ADN de secuencia. Por ejemplo, la Patente Norteamericana No. 5,030,557 de Hogan y asociados describe que la estructura secundaria y terciaria de un ácido nucleico objetivo de hebra simple puede verse afectado por el enlace de oligonucleótidos "auxiliares" además de oligonucleótidos de "sonda" que originan una Tm más alta exhibida entre la sonda y el ácido nucleico objetivo. Sin embargo dicha aplicación estuvo limitada en su método al uso de energías de hibridación únicamente para alterar la estructura secundaria y terciaria de las hebras de ARN de autoendurecimiento, lo cual si se deja sin alterar, puede tender a evitar que la sonda hibride para el objetivo.

Con respecto a la secuenciación de ADN, por ejemplo K.

Khrapko y asociados, Federación de Cartas de la Sociedad Bioquímica Europea (Federation of European Biochemical Societies Letters), Volumen 256, no. 1,2, pp. 118-122 (1989), describió que la hibridación de adhesión continua da como resultado una estabilización dúplex. Además, J. Kieleczawa y asociados, Ciencia, Vol. 258, pp. 1787-1791 (1992), describe el uso de cadenas contiguas de hexámeros para imprimar la síntesis de ADN, en donde las cadenas contiguas parecen estabilizar la imprimación. De igual manera L. Kotler y asociados, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, Vol. 90, pp. 4241-4245, (1993), describe especificidad de secuencia en la imprimación de las reacciones de secuenciación de ADN a través del uso de módulos de oligonucleótido de hexámero y pentámero. Además, S. Parinov y asociados, Nucleic Acids Research, Vol. 24, no. 15, pp. 2998-3004, (1996), describe el uso de oligómeros de adhesión base para secuenciación de ADN en asociación con microchips de secuenciación de ADN pasiva. Además, G. Yershov y asociados, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, Vol. 93, pp. 4913-4918 (1996), describe la aplicación de energías de adhesión base en SBH en un microchip pasivo. En el ejemplo de Yershov, se anclaron sondas de ADN 10-mer a la superficie del microchip y se hibridaron para secuencias objetivo junto con sondas cortas adicionales, cuya combinación parece estabilizar el enlace de las sondas. En dicho formato, los segmentos cortos de la secuencia de ácido nucleico pueden ser elucidados para secuenciación de ADN. Yershov observó además que en su sistema, el efecto desestabilizantes de los desacoplamientos, fue incrementado utilizando sondas más cortas (por ejemplo, 5-mers). El uso de dichas sondas cortas en secuenciación de ADN, proporcionó la capacidad de diferenciar la presencia de desacoplamientos a lo largo de la secuencia que está siendo sondeada, en lugar de sólo un desacoplamiento simple en una ubicación específica del complejo de hibridación de sonda/objetivo. El uso de sondas más largas (por ejemplo 8-mer, 10-mer, y 13-mer oligos) fue menos funcional para dichos propósitos.

Un ejemplo adicional de metodologías que han utilizado adhesión base en el análisis de ácidos nucleicos, incluyen la Patente Norteamericana No. 5,770,365 de Lañe y asociados, en donde se describe un método para capturar objetivos de ácido nucleico que utilizan una sonda de captura unimolecular que tiene un lazo de hebra simple y una región de hebra doble, que actúa junto con un objetivo de enlace para estabilizar la formación dúplex mediante energías de adhesión.

La secuencia de nucleótidos puede ser modificada convencionalmente por mutagénesis dirigida al sitio de acuerdo con métodos convencionales. Como alternativa, la secuencia de nucleótidos puede ser preparada mediante síntesis química, incluyendo pero sin limitarse al uso de un sintetizador de oligonucleótido, en donde los oligonucleótidos están diseñados con base en la secuencia de aminoácido del polipéptido deseado, y seleccionando preferentemente los codones que son favorecidos en la célula huésped, en los cuales se producirá el polipéptido recombinante.

También se pueden producir espinosinas novedosas mediante mutagénesis de los genes clonados, y la sustitución de los genes mutados para sus contrapartes no mutadas en un organismo que produce espinosina. La mutagénesis puede implicar por ejemplo: 1) eliminación o desactivación de un dominio KR, DH o ER, de modo que se bloqueen una o más de estas funciones y la cepa produzca una espinosina que tenga un núcleo de lactona con un enlace doble, un grupo hidroxilo, o un grupo ceto que no esté presente en el núcleo del reemplazo de espinosina A (ver la Publicación de Donadío y asociados, 1993); 2) de un dominio AT, de modo que se incorpore un ácido carboxílico diferente en el núcleo de lactona (ver la Publicación de Rúan y asociados, 1997); 3) la adición de un dominio KR, DH o ER a un módulo PKS existente de modo que la cepa produzca una espinosina que tenga un núcleo de lactona con un enlace saturado, un grupo hidroxilo, o un enlace doble que no esté presente en el núcleo de espinosina A; o 4) la adición o sustracción de un módulo PKS completo, de modo que el núcleo de lactona cíclico tenga un mayor o menor número de átomos de carbono. Se puede crear un PKS híbrido reemplazando el dominio de carga de PKS de espinosina con una carga de PKS heteróloga. Ver por ejemplo la Patente Norteamericana No: 7,626,010. Se ha observado en forma adicional que las espinosinas mediante modificación de los azúcares que son adheridos al esqueleto de lactona de espinosina, pueden incluir modificaciones de la porción de ramnosa y/o forosamina o la adhesión de diferentes azúcares desoxi. El grupo Salas en España, demostró que se pueden producir compuestos de policétido novedosos, sustituyendo la molécula de azúcar existente con diferentes moléculas de azúcar. Rodríguez y asociados J. Mol. Microbiol Biotechnol. 2000 Jul;2(3):271 -6. Los ejemplos que se encuentran en la presente solicitud, ayudan a ilustrar el uso de mutagénesis para producir una espinosina con funcionalidad modificada.

El ADN de la región de agrupación del gen de spinosyn se puede utilizar como una sonda de hibridación para identificar secuencias homólogas. Por lo tanto, el ADN aquí clonado, puede utilizarse para localizar plásmidos adicionales de las bibliotecas del gen Saccharopolyspora spinosa, que traslapan la región aquí descrita, pero también contienen el ADN no clonado previamente de regiones adyacentes en el genoma de Saccharopolyspora spinosa. Además, el ADN aquí clonado se puede utilizar para identificar secuencias no idénticas pero similares en otros organismos. Las sondas de hibridación normalmente tienen al menos aproximadamente 20 bases de largo y están etiquetadas para permitir la detección.

Se pueden utilizar varios tipos de mutagénesis en la presente invención para una variedad de propósitos. Éstos incluyen, pero no se limitan a, mutagénesis de punta aleatoria, dirigida al sitio, recombinación homóloga, revoltura de ADN u otros métodos de mutagénesis de recurso, construcción quimérica, mutagénesis utilizando plantillas que contienen uracilo, mutagénesis dirigida a oligon ucleótido, mutagénesis de ADN modificada por fosforotioato, mutagénesis utilizando ADN dúplex con brecha o similar, o cualquier combinación de las mismas. Los métodos adecuados adicionales incluyen mutagénesis de reparación de desacoplamiento de punta, utilizando cepas huésped con deficiencia de reparación, restricción-selección y restricción-purificación, mutagénesis de eliminación, mutagénesis mediante síntesis de gel total, reparación de rompimiento de hebra doble, y similares. La mutagénesis, incluyendo pero sin limitarse a, construcciones quiméricas, también están incluidas en la presente invención. En una modalidad, la mutagénesis puede ser guiada a través de información conocida de la molécula que ocurre naturalmente o de la molécula que ocurre naturalmente alterada o mutada, incluyendo pero sin limitarse a, secuencia, comparaciones de secuencia, propiedades físicas, estructura de cristal o similares.

Los textos y ejemplos aquí encontrados describen estos procedimientos. Se encuentra información adicional en las siguientes publicaciones y referencias mencionadas en: Ling y asociados, Métodos para mutagénesis de ADN: revisión, Anal Biochem. 254(2): 157-178 (1997); Mutagénesis aleatoria dirigida a oligon ucleótidos utilizando el método de fosforotioato, Methods Mol. Biol. 57: 369-374 (1996); Smith, Mutagénesis in vitro, Ann. Rev. Genet. 19: 423-462(1985); Botstein & Shortle, Estrategias y aplicaciones de mutagénesis in vitro, Science 229: 1193-1201(1985); Cárter, Mutagénesis dirigida al sitio, Biochem. J. 237: 1-7 (1986); Kunkel, Eficiencia de mutagénesis dirigida a oligonucleótido en la publicación de Nucleic Acids & Molecular Biology (Eckstein, F. y Lilley, D. M. J. eds., Springer Verlag, Berlín) (1987); Kunkel, Mutagénesis específica del sitio rápida y eficiente sin selección fenotípica, Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 82: 488-492 (1985); Kunkel y asociados, Mutagénesis específica del sitio rápida y eficiente sin selección fenotípica, Methods in Enzymol. 154, 367-382 (1987); Bass y asociados, Represores Trp mutantes con nuevas especificidades de enlace de ADN, Science 242: 240-245 (1988); Methods in Enzymol. 100: 468-500 (1983); Methods in Enzymol. 154: 329-350 (1987); Zoller & Smith, Mutagénesis dirigida a oligonucleótido utilizando vectores derivados de M13: procedimiento general y eficiente para la producción de mutaciones de punta en cualquier fragmento de ADN, Nucleic Acids Res. 10: 6487-6500 (1982); Zoller & Smith, M utagénesis dirigida por oligonucleótido de fragmentos de ADN clonados en vectores M13, Methods in Enzymol. 100: 468-500 (1983); Zoller & Smith, M utagénesis dirigida por oligonucleótido: un método simple que utiliza dos cebadores de oligonucleótido y una plantilla de ADN de hebra simple, Methods in Enzymol. 154: 329-350 (1987); Taylor y asociados, El uso de ADN modificado por fosforotioato en reacciones de enzima de restricción para preparar ADN mellado, Nucí. Acids Res. 13: 8749-8764 (1985); Taylor y asociados, Generación rápida de mutaciones dirigidas por oligonucleótido en alta frecuencia utilizando ADN modificado con fosforotioato, Nucí. Acids Res. 13: 8765-8787 (1985); Nakamaye & Eckstein, Inhibición de disociación de endonucleasa de restricción Nci I mediante grupos de fosforotioato y su aplicación a mutagénesis dirigida por oligonucleótido, Nucí. Acids Res. 14: 9679-9698 (1986); Sayers y asociados, Exonucleasas Y-T en mutagénesis dirigida por oligonucleótido a base de fosforotioato, Nucí. Acids Res. 16: 791-802 (1988); Sayers y asociados, Disociación específica de hebra de ADN que contiene fosforotioato mediante reacción con endonucleasas de restricción en la presencia de bromuro de etidio, (1988) Nucí. Acids Res. 16: 803-814; Kramer y asociados, Método de ADN dúplex con brecha para construcción de mutación dirigida por oligonucleótido, Nucí. Acids Res. 12: 9441-9456 (1984); Kramer & Fritz, Construcción dirigida por oligonucleótido de mutaciones mediante ADN dúplex con brecha, Methods in Enzymol. 154: 350-367 (1987); Kramer y asociados, Reacciones enzimáticas in vitro mejoradas en el método de ADN dúplex con brecha para construcción de mutaciones dirigidas por oligonucleótido, Nucí. Acids Res. 16: 7207 (1988); Fritz y asociados, Construcción de mutaciones dirigidas por oligonucleótido: procedimiento de ADN dúplex con brecha sin reacciones enzimáticas in vitro, Nucí. Acids Res. 16: 6987-6999 (1988); Kramer y asociados, Reparación de Desacoplamiento de Punta, Cell 38: 879-887 (1984); Cárter y asociados, Mutagénesis dirigida al sitio por oligonucleótido mejorada utilizando vectores M13, Nucí. Acids Res. 13: 4431-4443 (1985); Cárter, Mutagénesis dirigida por oligonucleótido mejorada utilizando vectores M13, Methods in Enzymol. 154: 382-403 (1987); Eghtedarzadeh & Henikoff, Uso de oligonucleótidos para generar eliminaciones grandes, Nucí. Acids Res. 14: 5115 (1986); Wells y asociados, Importancia de formación de enlace de hidrógeno para estabilizar el estado de transición de subtilisina, Phil. Trans. R. Soc. Lond. A 317: 415-423 (1986); Nambiar y asociados, Síntesis total y clonación de un gen que codifica para la proteína de ribonucleasa S, Science 223: 1299-1301 (1984); Sakamar y Khorana, Síntesis de expresión total de un gen para una subunidad de proteína de enlace de nucleótido (transducina) de guanina de cemento externo de varilla de bovino, Nucí. Acids Res. 14: 6361-6372 (1988); Wells y asociados, M utagénesis de cartucho: método eficiente para generación de mutaciones múltiples en sitios definidos, Gene 34: 315-323 (1985); Grundstrom y asociados, utagénesis dirigida por oligonucleótido mediante síntesis de gen de "escopeta" de microescala, Nucí. Acids Res. 13: 3305-3316 (1985); Mandecki, Preparación de rompimiento de hebra doble dirigida por oligonucleótido en plásmidos de Escherichia coli: método para mutagénesis específica del sitio, Proc. Nati. Acad. Sci. EUA, 83: 7177-7181 (1986); Arnold, Construcción de proteína para ambientes no usuales, Current Opinión in Biotechnology 4: 450-455 (1993); Sieber, y asociados, Nature Biotechnology, 19: 456-460 (2001). W. P. C. Stemmer, Nature 370, 389-91 (1994); y, I. A. Lorimer, I. Pastan, Nucleic Acids Res. 23, 3067-8 (1995). Algunos detalles adicionales de muchos de los métodos anteriores se pueden encontrar en la publicación de Métodos en Enzimología, Volumen 154, que también describe controles útiles para resolver problemas con diversos métodos de mutagénesis.

Los términos "homología" o "porcentaje de identidad" se utilizan de manera intercambiable en la presente invención. Para el propósito de la presente invención, aquí se define que con el objeto de determinar el porcentaje de identidad de dos secuencias de aminoácido o dos secuencias de ácido nucleico, las secuencias se alinean para propósitos de comparación óptima (por ejemplo, se pueden introducir brechas en la secuencia de una primera secuencia de aminoácido o ácido nucleico para alineación óptima con una segunda secuencia de aminoácido o ácido nucleico). Los residuos de aminoácido o nucleótidos en las posiciones de aminoácido o posiciones de nucleótido, posteriormente son comparados. Cuando una posición en la primera secuencia es ocupada por el mismo residuo de aminoácido o nucleótido de la posición correspondiente en la segunda secuencia, entonces las moléculas son idénticas en dicha posición. El porcentaje de identidad entre las dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias (es decir, % de identidad = número de posiciones idénticas/número total de posiciones (es decir, posiciones de traslape x 100). Preferentemente, las dos secuencias tienen la misma longitud.

Los expertos en la técnica estarán atentos del hecho de que están disponibles varios diferentes programas de computadora para determinar la homología entre dos secuencias. Por ejemplo, se puede lograr una comparación de secuencias y la determinación del porcentaje de identidad entre dos secuencias, utilizando un algoritmo matemático. En una modalidad preferida, el porcentaje de identidad entre las dos secuencias de aminoácido se determina utilizando el algoritmo de Needleman y Wunsch (J. Mol. Biol. (48): 444-453 (1970)), el cual ha sido incorporado en el programa GAP en el paquete de software GCG (disponible en la Internet en el sitio web de accelrys, más específicamente en http://www.accelrys.com), utilizando ya sea una matriz Blossom 62 o una matriz PAM250, y un peso de brecha de 16, 14, 12, 10, 8, 6 ó 4 y un peso de longitud de 1, 2, 3, 4, 5 ó 6. Los expertos en la técnica apreciarán que todos estos diferentes parámetros producirán resultados ligeramente diferentes, pero que el porcentaje de identidad general de las dos secuencias no se altera significativamente cuando se utilizan algoritmos diferentes.

Aún en otra modalidad, el porcentaje de identidad entre dos secuencias de nucleótidos se determina utilizando el programa GAP en el paquete de software GCG (disponible en la Internet en el sitio web accelrys, más específicamente en http://www.accelrys.com), utilizando una matriz N WSgapdna.CMP y un peso de brecha de 40, 50, 60, 70 u 80 y un peso de longitud de 1, 2, 3, 4, 5 ó 6. En otra modalidad, el porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácido o nucleótido se determina utilizando el algoritmo de E. Meyers y W. Miller (CABIOS, 4: 11-17 (1989), el cual ha sido incorporado en el programa ALIGN (versión 2.0) (disponible en la Internet en el sitio web vega, más específicamente ALIGN - IGH Montpellier, o más específicamente en http://vega.igh.cnrs.fr/bin/align-guess.cgi) utilizando una tabla de residuos de peso PAM120, una penalidad de longitud de brecha de 12 y una penalidad de brecha de 4.

Las secuencias de ácido nucleico y proteína de la presente invención, pueden ser utilizadas en forma adicional como una "secuencia de consulta", para llevar a cabo una búsqueda contra bases de datos públicas, por ejemplo, para identificar otros miembros de la familia o secuencias relacionadas. Dichas búsquedas se pueden llevar a cabo utilizando los programas BLASTN y BLASTX (versión 2.0) o Altschul, y asociados. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-10. Se pueden llevar a cabo búsquedas de nucleótido BLAST con el programa BLASTN, calificación = 100, longitud de palabra =12 para obtener secuencias de nucleótido homólogas a las moléculas de ácido nucleico de la presente invención. Se pueden llevar a cabo búsquedas de proteína BLAST con el programa BLASTX, calificación = 50, longitud de palabra = 3 para obtener secuencias de aminoácido homólogas para las moléculas de proteína de la presente invención. Para obtener alineaciones con brecha para propósitos de comparación, se puede utilizar Gapped BLAST tal como se describe en la publicación de Altschul y asociados, (1997) Nucleic Acids Res. 25 (17): 3389-3402. Cuando se utilizan los programas BLAST y Gapped BLAST, se pueden utilizar los parámetros por omisión de los programas respectivos (por ejemplo, BLASTX y BLASTN). (Disponible en la Internet en el sitio web ncbi, más específicamente en http://www.ncbi.nlm.nih.gov).

Otras modalidades de la presente invención pueden incluir manipulaciones en el gen spnK que pueden incluir una eliminación(s) de base de nucleótido simple o múltiple que pueden interrumpir el cuadro de lectura normal de spnK. Dichas eliminaciones pueden incluir en cualquier parte de 1 a 1194 nucleótidos. Dicha eliminación afecta el cuadro de lectura normal de Sank, que da como resultado la producción de una cepa que produce un precursor de spinetoram.

Otra modalidad de la presente invención, puede incluir manipulaciones en el gen Sank, que puede incluir una inserción(s) de nucleótido simple o múltiple dentro de la región de codificación Sank, que interrumpe el cuadro de lectura normal de spnK. Dicha inserción afecta el cuadro de lectura normal de spnK, dando como resultado la producción de una cepa que produce el precursor spinetoram.

Las modalidades adicionales de la presente invención, pueden incluir manipulaciones en el gen spnK que incluyen el uso de tecnología antisentido o sentido para abolir o interferir en forma significativa con la producción de la proteína spnK. Los expertos en la técnica conocen como lograr un efecto antisentido o de co-supresión. Por ejemplo, el método de inhibición por co-supresión ha sido descrito en la publicación de Jorgensen (Trends Biotechnol. 8 (1990), 340-344), Niebel y asociados, (Curr. Top. Microbiol. Immunol. 197 (1995), 91-103), F I a ve 11 y asociados. (Curr. Top. Microbiol. Immunol. 197 (1995), 43-46), Palaqui y Vaucheret (Plant. Mol. Biol. 29 (1995), 149-159), Vaucheret y asociados, (Mol. Gen. Genet. 248 (1995), 311-317), de Borne y asociados. (Mol. Gen. Genet. 243 (1994), 613-621).

Por consiguiente, la presente invención proporciona además métodos de silenciación de gen, mediante la expresión en un organismo, tal como S. spinosa, un ácido nucleico que tiene una repetición invertida 5' ó 3' para una secuencia de dirección de sentido o antisentido, en donde la secuencia de dirección de sentido o antisentido tiene una identidad de secuencia substancial para el gen objetivo que será suprimido, pero la repetición invertida no está relacionada mediante la secuencia con el gen objetivo. En otra modalidad, la repetición invertida heteróloga está flanqueada por una secuencia de dirección 5' y 3'.

La construcción de silenciación de gen puede expresarse en el organismo de elección, por ejemplo, una célula bacteriana, una célula fúngica, una célula eucariótica, por ejemplo, una célula de planta o una célula de mamífero.

Los vectores de expresión adecuados para utilizarse en la presente invención, incluyen vectores procarióticos y eucarióticos (por ejemplo, plásmido, fagémido o bacteriófago), incluyen vectores de mamífero y vectores de planta. Los vectores procarióticos adecuados incluyen plásmidos tales como, pero sin limitarse a, los comúnmente utilizados para manipulación de ADN en Actinomyces, (por ejemplo pSET152, pOJ260, pl J 101 , pJV1, pSG5, pHJL302, pSAM2, pKC1250. Dichos plásmidos se describen en la publicación de Kieser y asociados. ("Genéticas Prácticas de Streptomyces"), 2000). Otros vectores adecuados pueden incluir plásmidos tales como los que tienen la capacidad en réplica en E. coli (por ejemplo, pBR322, ColE1, pSC101, PACYC 184, itVX, pRSET, pBAD (Invitrogen, Carlsbad, Calif.) y similares). Dichos plásmidos se describen en la publicación de Sambrook (cf. "Clonación Molecular: Un Manual de Laboratorio"), segunda edición, editada por Sambrook, Fritsch, & Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory, (1989)) y muchos vectores están comercialmente disponibles. Los plásmidos Bacillus incluyen pC194, pC221, pT127, y similares, y se describen en la publicación de Gryczan ("En: La Biología Molecular de Bacilli"), Academic Press, NY (1982), páginas 307-329). Los plásmidos de Streptomyces adecuados incluyen p l i 01 (Kendall y asociados, J. Bacteriol. 169: 4177-4183, 1987), y los bacteriófagos de Streptomyces incluyen pero no se limitan a ?031 (Chater y asociados, "En: Sexto Simposio Internacional en Biología de Actinomicetales", Akademiai Kaido, Budapest, Hungría (1986), páginas 45-54). Los plásmidos de pseudomonas son revisados en la publicación de John y asociados. (Rev. Infect. Dis. 8: 693-704, 1986), e Izaki (Jpn. J. Bacteriol. 33: 729-742, 1978).

La supresión de expresión de los genes particulares, es una herramienta importante tanto para investigación como para el desarrollo de organismos genéticamente construidos más adaptados para un propósito particular. La silenciación de gen se puede lograr mediante la introducción de un transgén que corresponde al gen de interés en la orientación antisentido relativa a su promotor (por ejemplo, ver las publicaciones de Sheehy y asociados, Proc. Nat'l Acad. Sci. EUA 85: 8805 8808 (1988); Smith y asociados, Nature 334: 724 726 (1988)), o en la orientación de sentido relativa a su promotor (Napoli y asociados, Plant Cell 2: 279 289 (1990); van der Krol y asociados, Plant Cell 2: 291 299 (1990); la Patente Norteamericana No. 5,034,323; la Patente Norteamericana No. 5,231,020; y la Patente Norteamericana No. 5,283,184), ambas de las cuales conducen a una expresión reducida del trangén, así como del gen endógeno.

Se ha reportado la silenciación del gen post-transcripción, para ser acompañada por la acumulación de pequeños fragmentos (de 20 a 25 nucleótidos) de ARN antisentido, que pueden sintetizarse a partir de una plantilla de ARN, y representan los determinantes de especificidad y mobilidad del proceso (Hamilton & Baulcombe, Science 286: 950 952 (1999)). Queda claro que en un rango de organismos, la introducción de dsARN (ARN de hebra doble) es un componente importante que conduce a silenciación de gen (Fire y asociados, Nature 391: 806 811 (1998); Tímmons & Fire, Nature 395: 854 (1998); W099/32619; Kennerdell & Carthew, Cell 95: 1017 1026 (1998); Ngo y asociados, Proc. Nati Acad. Sci. EUA 95: 14687 14692 (1998); Waterhouse y asociados, Proc. Nat'l Acad. Sci. EUA 95: 13959 13964 (1998); WO99/53050; Cogoni & Macino, Nature 399: 166-169 (1999); Lohmann y asociados, Dev. Biol. 214: 211-214 (1999); Sanchez-Alvarado & Newmark, Proc. Nat'l Acad. Sci. EUA 96: 5049-5054 (1999)). En bacterias, el gen suprimido no necesita ser un gen de bacteria endógena, ya que tanto los transgénes reporteros como los genes de virus, se someten a silenciación de gen post-transcripción mediante los transgenes introducidos (English y asociados, Plant Cell 8: 179-188 (1996); Waterhouse y asociados, supra). Sin embargo, en todos los casos anteriores, se puede preferir cierta similitud de secuencia entre el transgén introducido y el gen que es suprimido.

En los ejemplos anteriores, la introducción de un transgén de sentido consiste en 5'-UTR ("región no traducida"), región de codificación y 3'-UTR de un gen de oxidasa ACC bajo el control del promotor CaMV 35S que da como resultado una actividad reducida de la enzima de oxidasa ACC en el 15% de una población de plantas de tomate (Hamilton y asociados, Plant J. 15: 737-746 (1998); WO98/53083). Sin embargo, si se incluyeron en la construcción repeticiones invertidas y de sentido de parte de la 5'-UTR de esta oxidasa ACC, se observó la supresión en el 96% de las plantas (Hamilton y asociados, supra). Además, la supresión de otro gen de oxidasa ACC relacionado en la secuencia para la región de codificación del transgén, pero no para la 5'-UTR del transgén, fue suprimida, mostrando que el ARN de hebra doble de cualquier parte de la transcripción, dirige toda la transcripción de ARN para degradación. Además, se ha descubierto la alta frecuencia y alto nivel de silenciación del gen post-transcripción, mediante la introducción ya se de construcciones que contienen repeticiones invertidas de las regiones de codificación del virus o genes reporteros, o mediante el cruce de plantas juntas que expresan las transcripciones sentido y antisentido de la región de codificación del gen objetivo (Waterhouse y asociados, Proc. Nat'l Acad. Sci. EUA 95: 13959-13964 (1998)). Se obtuvieron resultados similares mediante la expresión de los transgénes sentido y antisentido bajo el control de diferentes promotores en la misma planta (Chuang & Meyerowitz, Proc. Nat'l Acad. Sci. EUA 97: 4985-4990 (2000)).

Otras modalidades de la presente invención, pueden incluir manipulaciones en el gen spnK que incluyen silenciación de gen. La frase "silenciación de gen" se refiere a un proceso mediante el cual se hace lenta o se atenúa la expresión de un producto de gen específico. La silenciación de gen puede tener lugar a través de una variedad de trayectorias. A menos que se especifique de otra manera, tal como se utiliza en la presente invención, la silenciación de gen se refiere a disminuciones en la expresión del producto de gen, que resultan de la interferencia de ARN (ARNi), una trayectoria definida aunque parcialmente caracterizada mediante la cual el ARN inhibidor pequeño (siARN) actúa junto con proteínas huésped (por ejemplo, el complejo de silenciación inducido por ARN, RISC) para degradar el ARN mensajero (mARN) en una forma dependiente de la secuencia. El nivel de silenciación de gen se puede medir a través de una variedad de medios, incluyendo, pero sin limitarse a, medida de niveles de transcripción mediante Análisis de Manchado Northern, técnicas B-ADN, construcciones reporteras sensibles a transcripción, perfil de expresión (por ejemplo, chips de ADN), y tecnologías relacionadas. Como alternativa, el nivel de silenciación se puede medir evaluando el nivel de la proteína codificada por un gen específico. Esto se puede lograr llevando a cabo un número de estudios que incluyen Análisis Western, midiendo los niveles de expresión de una proteína reportera que tiene, por ejemplo, propiedades fluorescentes (por ejemplo, GFP) o actividad enzimática (por ejemplo, fosfatasas alcalinas), u otros diversos procedimientos.

Las modalidades adicionales incluyen una substitución(s) de aminoácido simple o múltiple en el sitio activo en el sitio de enlace de substrato del gen Sank, que deshabilitan al gen Sank, y dan como resultado la producción de J/L. En general, los expertos en la técnica apreciarán que se pueden realizar eliminaciones o substituciones menores en las secuencias de aminoácido de los péptidos de la presente invención, sin afectar indebidamente de manera adversa la actividad de las mismas. Por lo tanto, las proteínas y péptidos que contienen dichas eliminaciones o substituciones, son un aspecto adicional de la presente invención. En péptidos que contienen substituciones o reemplazos de aminoácidos, se pueden reemplazar uno o más aminoácidos de una secuencia de péptido a través de uno o más aminoácidos, en donde el reemplazo no afecta la función de dicha secuencia. Dichos cambios pueden ser guiados a través de similitudes conocidas entre los aminoácidos en características físicas, tal co o densidad de carga, hidrofobicidad/hidrofilicidad, tamaño y configuración, de modo que los aminoácidos sean substituidos con otros aminoácidos que tienen esencialmente las mismas propiedades funcionales. Por ejemplo: Ala se puede reemplazar con Val o Ser; Val se puede reemplazar con Ala, Leu, Met, o lie, preferentemente Ala o Leu; Leu se puede reemplazar con Ala, Val o Me, preferentemente Val o lie; Gly se puede reemplazar con Pro o Cys, preferentemente Pro; Pro se puede reemplazar con Gly, Cys, Ser, o Met, preferentemente Gly, Cys, o Ser; Cys se puede reemplazar con Gly, Pro, Ser, o Met, preferentemente Pro o Met; Met se puede reemplazar con Pro o Cys, preferentemente Cys; His se puede reemplazar con Phe o Gin, preferentemente Phe; Phe se puede reemplazar con His, Tyr, o Trp, preferentemente His o Tyr; Tyr se puede reemplazar con His, Phe o Trp, preferentemente Phe o Trp; Trp se puede reemplazar con Phe o Tyr, preferentemente Tyr; Asn se puede reemplazar con Gin o Ser, preferentemente Gin; KGIn se puede reemplazar con His, Lys, Glu, Asn, o Ser, preferentemente Asn o Ser; Ser se puede reemplazar con Gin, Thr, Pro, Cys o Ala; Thr se puede reemplazar con Gin o Ser, preferentemente Ser; Lys se puede reemplazar con Gin o Arg; Arg se puede reemplazar con Lys, Asp o Glu, preferentemente Lys o Asp; Asp se puede reemplazar con Lys, Arg, o Glu, preferentemente Arg o Glu; y Glu se puede reemplazar con Arg o Asp, preferentemente Asp. Una vez elaborados, los cambios se pueden clasificar en forma rutinaria para determinar sus efectos en la función.

Otras modalidades de la presente invención pueden incluir manipulaciones en el gen spnK que incluyen la manipulación de los sitios de enlace de ribosoma (RBS). El sitio de enlace de ribosoma (etiquetado como Shine-Dalgarno), que se localiza en la corriente ascendente de la secuencia de codificación Sank, se puede manipular de modo que el gen spnK sea interrumpido, dando como resultado la producción de una cepa que produce un precursor spinetoram.

Las modalidades adicionales de la presente invención pueden incluir la inhibición enzimática que afecta múltiples trayectorias de señalización del gen Sank, que pueden dar como resultado la producción de una cepa que produce spinetoram. Los métodos para detectar la actividad enzimática asociada con el objetivo, pueden incluir el uso de ensayos enlazados por enzimas.

Otra modalidad de la presente invención incluye la interrupción de la secuencia promotora que codifica para el gen spnK. Dicha interrupción puede ser a través de cualquier tipo de manipulación que incluye pero no se limita a, truncaciones, eliminaciones, mutaciones de punta, e inserciones. Dichas manipulaciones pueden estar dentro o fuera de cuadro. Dichas manipulaciones dan como resultado la producción de una cepa que produce spinetoram.

La presente invención se explica con mayor detalle en los siguientes ejemplos no limitantes.

Ejemplo 1: Generación de Mutaciones de Punta dentro de spnK Se generaron mutaciones de punta dentro del gen spnK mediante mutagénesis aleatoria de una cepa que produce Saccharopolyspora spinosa A y D (Kieser y asociados, 2000). Las cepas mutantes que producen spinosyn J y L, en lugar de spinosyn A y D, fueron caracterizadas en forma adicional mediante amplificación PCR del gen spnK seguido de secuenciación de ADN. El gen spnK fue amplificado mediante PCR con spnKF (SEQ ID No: 1; GGGAATTCCATATGTCCACAACGCACGAG ATCG A) y spnKR (SEQ ID No: 2; GCCGCTCGAGCTCGTCCTCCGCGCTGTTCACGTCS) utilizando el Sistema PCR FailSafe (Epicentre Biotechnologies; adison, Wl). El producto PCR resultante fue purificado utilizando el Equipo de Purificación de ADN de limpieza PCR MoBio Ultraclean (MoBio Laboratories; Solana Beach, CA) y se clonó en el vector de clonación TA utilizando ligasa de ADN T4 (Invitrogen Life Technologies; Carlsbad, CA). Las colonias bacterianas que contienen en forma putativa el producto PCR, fueron aisladas y confirmadas mediante digestión de enzima de restricción. La secuenciación de ADN de los clones de plásmido positivos, se llevó a cabo tal como se describe en el protocolo del fabricante, utilizando el Equipo CEQ™ DTCS-Quick Start (Beckman-Coulter; Palo Alto, CA). Las reacciones fueron purificadas utilizando los Cartuchos Performa DTR Gel Filtration Cartridges (Edge BioSystems; Gaithersburg, MD), tal como lo describen los protocolos del fabricante. Se analizaron las reacciones de secuencia en un Sistema de Análisis de ADN Beckman-Coulter CEQ™ 2000 XL, y se llevó a cabo la caracterización de nucleótido utilizando SEQUENCHER™ (Gene Codes Corporation; Ann Arbor, MI). Los resultados de la secuenciación confirmaron la ubicación de las mutaciones de punta dentro de la secuencia de gen spnK. Las mutaciones de punta resultantes se describen en la Tabla 1, y están sombreadas en la figura 1.

La fermentación de las cepas mutantes spnK de Saccharopolyspora spinosa, pueden llevarse a cabo bajo condiciones descritas por Burns y asociados, (WO 2003070908). El análisis del caldo de fermentación para la presencia de los factores de spinosyn, se puede llevar a cabo bajo condiciones descritas por Baltz y asociados, (Patente Norteamericana No. 6,143,526). Para confirmar la presencia de los factores de spinosyn en el sobrenadante, los extractos del caldo de fermentación fueron secados en un SpeedVac durante la noche, seguido de la división del residuo entre agua y éter. La capa de éter fue secada mediante evaporación bajo una corriente N2. Posteriormente, la muestra fue disuelta en acetona-d6 y transferida a un tubo de RMN para la adquisición RMN de protón ID. Los perfiles RMN fueron comparados con los de los estándares de spinosyn. Los resultados de RMN indicaron la presencia de un exceso de J/L con respecto a A/D. La fermentación de las cepas que contienen la mutación de punta produjeron una mezcla de spinosyn que contiene spinosyn J y L, en comparación con Saccharopolyspora spinosa de control, que produjo una mezcla de spinosyn que contiene spinosyn A y D.

Tabla 1: Lista de mutaciones de punta, su ubicación dentro de spnK y los compuestos de spinosyn producidos por estas cepas durante la fermentación.

Producción de Cepa# Mutación Resultante Ubicación de Mutación Compuesto Spinosyn 1. TGG (W)? codón de detención TGA Par base 528 Spinosyn JyL 2. CGC (R)? TGC (C) Par base 589 Spinosyn JyL 3. GGT (G)? GAT (D) Par base 602 Spinosyn JyL 4. GGC (G)? GAC (D) Par base 668 Spinosyn JyL 5. CTC (L) -> TTC (F) Par base 721 Spinosyn JyL 6. GAC (D)? GGC (G) Par bae 794 Spinosyn JyL 7. CGG (R)? TGG (W) Par base 862 Spinosyn JyL 8. GAT (D)? AAT (N) Par base 895 Spinosyn JyL 9. ACC (T)? ATC (I) Par base 908 Spinosyn JyL 10. CAG (Q)? codón de detención TAG Par base 937 Spinosyn JyL 11. TGG (W)? codón de detención TGA Par base 1131 Spinosyn JyL Control Control Tipo Natural No Aplicable Spinosyn AyD Ejemplo 2: Generación de Mutación de Eliminación spnK Construcción del vector de eliminación en cuadro de spnK Se amplificó mediante PCR un fragmento de ADN de 1,595 pb, utilizando ADN genómico de una cepa que produce spinosyn A y D (Hopwood y asociados, 1985). Este fragmento abarcó el codón de inicio de spnK y contuvo la región de codificación spnJ sin el extremo 5' de spnJ (figura 2). La reacción PCR fue completada utilizando el quipo PCR FailSafe (Epicentre Biotechnologies; Madison, Wl) y el Cebador de Avance #1 (SEQ ID No: 3; CGGTGCCCGAATTCCATG ACCCG) y el Cebador Inverso #1 (SEQ ID No: 4; GTGCGTTCTAG ACATATGAGCTCCTC ATGGCTG) .

Se completó una segunda reacción de PCR que produjo un fragmento de ADN de 1,951 bp; este fragmento contuvo el extremo 3' de spnK, un spnL intacto y el extremo 5' de spnM (figura 2). La reacción PCR se completó utilizando el equipo PCR FailSafe y el Cebador de Avance #2 (SEQ ID No: 5; GTGCCATCTAGACTGGACGACATATTGCACCTG) y el Cebador Inverso #2 (SEQ ID No: 6; GAATGCGAAGCT TACGATCTCGTCGTCCGTG). Los productos PCR fueron purificados utilizando el Equipo de Purificación QIAquick PCR (Qiagen; Valencia, CA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

El fragmento PCR de 1,595 bp fue digerido con EcoRI y Xbal. Se digirió el fragmento PCR de 1,951 bp con Xbal y Hindlll. Al término de la digestión de enzimas de restricción, los fragmentos fueron purificados utilizando el Equipo de Purificación QIAquick PCR. Los fragmentos digeridos fueron ligados a los sitios de restricción EcoRI y Hindlll correspondientes del plásmido pOJ260, utilizando el Equipo de Ligadura de ADN FastLink (Epicentre; Madison, Wl) y se transformaron en células competentes E. coli TOP 10 (Invitrogen; Carlsbad, CA). Las colonias fueron seleccionadas y clasificadas para el producto de ligadura deseado mediante análisis de digestión de enzimas de restricción y de secuencia de ADN. Los clones positivos fueron identificados, y se utilizó un clon seleccionado para la eliminación en cuadro subsecuente de spnK en Saccharopolyspora spinosa. La secuencia resultante del fragmento de gen spnK eliminado sin el plásmido pOJ260 se presenta en la Tabla 2.

Tabla 2: Alineación de secuencia de nucleótidos del gen spnK eliminado. 1 40 spnK (SEQ ID N0:17) (1) lllllCACAACGCACGAGATCGAAACCGTGGAACGCATCA eliminación spnK (SEQ ID NO: 9) (1) lililí 41 80 spnK (SEQ ID NO:17) (41) rCCTCGCCGCCGGATCCAGTGCGGCGAGCCTGGCCGACCT eliminación spnK (SEQ ID NO:9) (7) 81 120 spnK (SEQ ID NO:17) (81) GACCACCGAACTCGGACTCGCCAGGATCGCACCCGTGCTG eliminación spnK (SEQ ID NO: 9) (7) 121 160 spnK (SEQ ID NO:17) (121) ATCGACGAGATCCTCTTCCGCGCGGAACCGGCCCCCGACA eliminación spnK (SEQ ID NO:9) (7) 161 200 spnK (SEQ ID NO: 17) (161) TCGAACGGACCGAGGTCGCGGTCCAGATCACCCACCGAGG eliminación spnK (SEQ ID NO: 9) (7) 201 240 spnK (SEQ ID N0:17) (201) CGAGACCGTTGACTTCGTCCTGACGCTACAGTCCGGTGAG eliminación spnK (SEQ ID NO: 9) (7) 241 280 spnK (SEQ ID NO:17) (241) CTGATCAAGGCCGAGCAACGACCGGTCGGAGACGTCCCGC eliminación spnK (SEQ ID NO: 9) (7) 281 320 spnK (SEQ ID NO: 17) (281) TGCGGATCGGTTACGAGCTCACCGATCTCATCGCCGAGTT eliminación spnK (SEQ ID NO: 9) (7) 321 360 spnK (SEQ ID NO:17) (321) GTTCGGCCCAGGAGCTCCCAGGGCCGTCGGCGCCCGGAGC eliminación spnK (SEQ ID NO: 9) (7) 361 400 spnK (SEQ ID NO:17) (361) ACCAACTTCCTCCGAACCACCACATCCGGTTCGATACCCG eliminación spnK (SEQ ID NO: 9) (7) 401 440 spnK (SEQ ID NO: 17) (401) GTCCGTCGGAACTGTCCGATGGCTTCCAGGCCATCTCCGC eliminación spnK (SEQ ID NO: 9) (7) 441 480 spnK (SEQ ID NO:17) (441) AGTGGTCGCCGGCTGCGGGCACCGACGTCCCGACCrCAAC eliminación spnK (SEQ ID NO: ) (7) 481 520 spnK (SEQ ID NO: 17) (481) TTGCTCGCCTCCCACTACCGCACGGACAAGTGGGGCGGCC eliminación spnK (SEQ ID NO: 9) (7) 521 560 spnK (SEQ ID NO:17) (521) TGCACTGGTTCACCCCGCTATACGAGCGACACCTCGGCGA eliminación spnK (SEQ ID NO: 9) (7) 561 600 spnK (SEQ ID NO: 17) (561) GTTCCGTGATCGCCCGGTGCGCATCCTGGAGATCGGTGTC eliminación spnK (SEQ ID NO: 9) (7) 601 640 spnK (SEQ ID NO: 17) (601) GGTGGCTACAACTTCGACGGTGGCGGCGGCGAATCCCTGA eliminación spnK (SEQ ID NO: 9) (7) 641 680 spnK (SEQ ID NO: 17) (641) AGATGTGGAAGCGCTACTTCCACCGCGGCCTCGTGTTCGG eliminación spnK (SEQ ID NO: 9) (7) 681 720 spnK (SEQ ID NO:17) (681) GATGGACGTTTTCGACAAGTCCTTCCTCGACCAGCAGAGG eliminación spnK (SEQ ID NO: 9) (7) 721 760 spnK (SEQ ID NO:17) (721) CTCTGCACCGTCCGCGCCGACCAGAGCAAGCCCGAGGAGC eliminación spnK (SEQ ID NO:9) (7) 761 800 spnK (SEQ ID NO:17) (761) TGGCCGCCGTTGACGACAAGTACGGACCGTTCGACATCAT eliminación spnK (SEQ ID NO: 9) (7) 801 840 spnK (SEQ ID NO: 17) (801) CATCGACGATGGCAGCCACATCAACGGACACGTGCGCACA eliminación spnK (SEQ ID NO:9) (7) 841 880 spnK (SEQ ID NO:17) (841) TCCCTGGAAACGCTGTTCCCCCGGTTGCGCAGCGGTGGCG eliminación spnK (SEQ ID NO:9) (7) 881 920 spnK (SEQ ID NO: 17) (881) TATACGTGATCGAGGATCTGTGGACGACCTATGCTCCCGG eliminación spnK (SEQ ID NO: 9) (7) 921 960 spnK (SEQ ID NO:17) (921) ATTCGGCGGGCAGGCGCAGTGCCCGGCCGCACCCGGCACC eliminación spnK (SEQ ID NO:9) (7) 961 1000 spnK (SEQ ID NO:17) (961) ACGGTCAGCCTGCTCAAGAACCTGTTGGAAGGCGTTCAGC eliminación spnK (SEQ ID NO: 9) (7) 1001 1040 spnK (SEQ ID NO:17) (1001) ACGAGGAGCAGCCGCATGCGGGCTCGTACGAGCCGAGCTA eliminación spnK (SEQ ID NO:9) (7) 1041 1080 spnK (SEQ ID NO:17) (1041) CCTGGAACGCAATITGGTCGGCCTCCACACCTACCACAAC eliminación spnK (SEQ ID NO: 9) (7) spnK (SEQ ID NO: 17) (1081) eliminación spnK (SEQ ID NO: ) (7) spnK (SEQ ID NO:17) (1121) eliminación spnK (SEQ ID NO:9) (7) spnK (SEQ ID NO: 17) (1161) eliminación spnK (SEQ ID NO: 9) (27) Por consiguiente, una eliminación spnK puede incluir la secuencia: ATGTCTAGACTGGACGACATATTGCACCTGGCCG ACGTGA ACAGCGCGGAGGAC GAGTGA (SEQ ID No: 9).

Conjugación de vector de eliminación spnK en Saccharopolvspora spinosa Se transformó la construcción de eliminación en cuadro spnK en la cepa donadora de conjugación E. coli ET12567/pUZ8002. Se identificó una cepa transformada en forma positive y se utilizó para inocular un frasco de medio de Caldo Luria (que contiene antibióticos adecuados) durante la noche crecido a una temperatura de 37°C con agitación en 225 rpm. Se llevó a cabo la confirmación de la identidad de plásmido, aislando el ADN de plásmido y completando una digestión de enzima de restricción de la cepa donadora £. coli. Al momento de la confirmación de que fue correcta la fidelidad de este clon, el cultivo restante fue almacenado en 20% de glicerol a una temperatura de -80°C para uso adicional.

La conjugación de células E. coli que llevan la construcción de eliminación en cuadro spnK con Saccharopolyspora spinosa, se llevó a cabo de acuerdo con el método descrito en la publicación de Matsushima y asociados, (1994). Los transconjugados putativos resistentes a apramicina, debido a la presencia del marcador de gen de resistencia a apramicina en el esqueleto de vector de la construcción de eliminación en cuadro Sank, fueron seleccionados.

Confirmación de transconjugados v Amplificación de la región spnK para determinar el sitio de integración Se creció un transconjugado primario simple en el medio R6, y se transfirió en placas de agar de Infusión de Corazón Cerebro (BHI) suplementado con 50 pg/mL de apramicina y 25 pg/mL de ácido nalidíxico, para confirmar el fenotipo de resistencia. Se inocularon las Mycelia de los transconjugados a partir de la placa BHI en un medio de Caldo de Soya Tríptico (TSB) suplementado con 50 pg/mL de apramicina. El cultivo fue incubado a una temperatura de 29°C con agitación en 250 rpm durante 72 horas. Se recolectaron las Mycelia después de 72 horas de incubación y se aisló el ADN genómico utilizando el Equipo de Aislamiento de ADN Genómico de Edge BioSystem's de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Edge Biosystems; Gaithersburgh, MD). Se llevó a cabo PCR utilizando el ADN genómico aislado del transconjugado como plantilla con los cebadores de Validación spnK Del 1 de Avance (SEQ ID No: 7; GTTCACGGTGATTCCGGTGACTCG) y Validación del SpnK Del 1 Inversa (SEQ ID No: 8; ACCTGCACTGCTTCCTGGAGCTTC). Además, el ADN genómico aislado de la cepa de control de origen Saccharopolyspora spinosa y el ADN plásmido de la construcción de eliminación en cuadro de spnK, se utilizaron como plantillas para una reacción PCR de control. Se secuenciaron los resultados de amplificación PCR. Los datos de secuenciación indicaron que la construcción de eliminación en cuadro de spnK se integró en la región spnLM mediante recombinación homóloga de cruce simple (figura 3). La integración en la región spnLM generó, dentro del cromosoma, una copia intacta de spnJ, spnK, spnL, y una spnM truncada en la corriente ascendente del esqueleto del vector pOJ260, y una spnJ truncada, y una spnL y spnM intactas, en la corriente descendente del esqueleto de vector.

Aislamiento del mutante de eliminación en cuadro de spnK de cruce doble El mutante de cruce simple resistente a apramicina, fue inoculado en placas de agar BHI en la ausencia de apramicina e incubado a una temperatura de 29°C durante 14 días. Las esporas fueron recolectadas de las placas de acuerdo con la publicación de Hopwood y asociados, (1985) y almacenadas en 20% de glicerol a una temperatura de -80°C. Las esporas se inocularon en diez placas de agar BHI nuevas sin apramicina, y las placas fueron incubadas a una temperatura de 29°C durante 14 días. Este paso se repitió tres veces. La preparación de esporas se diluyó en 10"6 utilizando 20% de glicerol y las esporas diluidas fueron revestidas en diez placas agar BHI. Las placas se incubaron a una temperatura de 29°C durante 10 días para un desarrollo de colonia simple. Se parcharon las colonias individuales en placas de agar BHI nuevas con y sin apramicina. Todas las placas se incubaron a una temperatura de 29°C durante 10 días para el desarrollo micelial. Las colonias que no crecieron en las placas de agar BHI que contienen 50 pg/mL de apramicina, fueron identificadas como candidatos de mutantes de cruce doble y se seleccionaron para validación utilizando PCR.

Identificación y validación de mutantes de cruce doble Se confirmaron los mutantes de cruce doble mediante PCR. Se designaron los cebadores de Validación SpnK Del 1 de Avance (SEQ ID No: 7) y Validación SpnK Del 1 Inversa (SEQ ID No: 8), para enlazar dentro de los genes spnL y spnJ que se utilizaron para amplificación PCR utilizando el Sistema PCR FailSafe. Se determinaron los tamaños de los productos PCR mediante electroforesis de gel de agarosa. Los mutantes de cruce doble que dieron como resultado la eliminación del gen spnK, fueron identificados (figura 4) y seleccionados con base en el tamaño del producto PCR. El tamaño y secuencia de ADN del fragmento PCR, indica la eliminación en cuadro del gen spnK.

Producción de spinosyn de mutantes de cruce doble mediante fermentación de frasco de agitación La fermentación del mutante de cruce doble se puede llevar a cabo bajo condiciones descritas por Burns y asociados, (WO 2003070908). El análisis del caldo de fermentación con respecto a la presencia de factores de spinosyn, se puede llevar a cabo bajo condiciones descritas por Baltz y asociados, (Patente Norteamericana No. 6,143,526). Para confirmar la presencia de factores de spinosyn en el sobrenadante, se secaron los extractos del caldo de fermentación en un SpeedVac durante la noche, seguido de la división del residuo entre agua y éter. La capa de éter se secó mediante evaporación bajo una corriente N2. Posteriormente, la muestra fue disuelta en acetona-d6 y transferida a un tubo RMN para adquisición RMN de ID de protón. Los perfiles RMN fueron comparados con los de los estándares de spinosyn. La fermentación del mutante de cruce doble produce spinosyn J y L. Los resultados RMN indicaron la presencia de un exceso de J/L con respecto a A/D.

Ejemplo 3: Generación de Mutación de Inserción spnK Se generaron mutantes Saccharopolyspora spinosa mediante mutación de inserción dentro del gen spnK. Se construyó (figura 5) un fragmento de ADN que contiene un cartucho de gen de resistencia a apramicina en cuadro (aac(3)IV) dentro del gen spnK, y las secuencias de flanqueo del gen spnJ y spnL de la corriente ascendente y corriente descendente no interrumpida. Se clonó el fragmento de gen aac(3)IV en un plásmido y se transformó en una cepa donadora de conjugación E. coli ET12567/pUZ8002. Se identificó una cepa transformada en forma positiva y se utilizó para inocular un frasco de medio de Caldo Luria (que contiene antibióticos adecuados) para un crecimiento durante la noche a una temperatura de 37°C con agitación en 225 rpm. Se llevó a cabo la confirmación de la identidad del plásmido aislando el ADN de plásmido, y completando una digestión de enzima de restricción. Al momento de la confirmación de que es correcto el plásmido que contiene el cartucho de inserción de apramicina, se almacenó el cultivo restante en 20% de glicerol a una temperatura de -80°C.

La conjugación de las células donadoras de E. coli con Saccharopolyspora spinosa se lleva a cabo de acuerdo con el método descrito en la publicación de Matsushima y asociados, (1994). La transferencia del cartucho de gen de apramicina de £. coli y la integración subsecuente de este plásmido en el genoma de Saccharopolyspora spinosa, se selecciona utilizando la resistencia a apramicina.

Se creció un transconjugado primario simple en un medio R6 y se transfirió en placas de agar de Infusión de Corazón Cerebro (BHI) suplementadas con 50 pg/mL de apramicina y 25 pg/mL de ácido nalidíxico para confirmar el fenotipo de resistencia. La Mycelia de los transconjugados se inoculó de la placa BHI en un medio de Caldo de Soya Tríptico (TSB) suplementado con 50 pg/mL de apramicina. El cultivo se incubó a una temperatura de 29°C con agitación en 250 rpm durante 72 horas. Las Mycelia se recolectaron después de 72 horas de incubación y se aisló el ADN genómico utilizando el Equipo de Aislamiento de ADN Genómico de Edge BioSystem's, de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Edge Biosystems; Gaithersburgh, MD). Se llevó a cabo PCR utilizando un ADN genómico aislado del transconjugado como una plantilla. El producto PCR deseado se clonó en un plásmido utilizando la Tecnología de Clonación TOPO® (Invitrogen; Carlsbad CA). Se aislaron las colonias bacterianas que contienen en forma putativa el producto PCR, se clonaron dentro del vector TOPO®, y se confirmaron mediante digestión de enzima de restricción. Se llevó a cabo la secuenciación de ADN de los clones de plásmido positivo. Los resultados de secuenciación indican que el cartucho de inserción de apramicina está integrado dentro del gen spnK de Saccharopolyspora spinosa a través de una recombinación homóloga de cruce doble. La inserción resultante mediante recombinación homóloga, interrumpe la transcripción de spnK, aboliendo de esta forma la función del gen spnK.

La fermentación de las cepas mutantes spnK de Saccharopolyspora spinosa, se puede llevar a cabo bajo condiciones descritas por Burns y asociados, (WO 2003070908). El análisis del caldo de fermentación para la presencia de factores de spinosyn, se puede llevar a cabo bajo condiciones descritas por Baltz y asociados, (Patente Norteamericana No. 6,143,526). Para confirmar la presencia de factores de spinosyn en el sobrenadante, se secaron los extractos del caldo de fermentación en un SpeedVac durante la noche, seguido de la división del residuo entre agua y éter. La capa de éter se secó mediante evaporación bajo corriente N2- Posteriormente, la plantilla se disolvió en acetona-d6 y se transfirió a un tubo de RMN para adquisición RMN de ID de protón. Los perfiles RMN se compararon con los de los estándares de spinosyn. Los resultados de RMN indicaron la presencia de un exceso de J/L con respecto a A/D. La fermentación de las cepas que contienen la mutación de inserción produce una mezcla de spinosyn que contiene spinosyn J y L, en comparación con Saccharopolyspora spinosa de control que produce una mezcla de spinosyn que contiene spinosyn A y D.

Ejemplo 4: Interrupción de la Secuencia Shine-Dalgarno spnK La secuencia Shine-Dalgarno localizada en la corriente ascendente de spnK (figura 6), es interrumpida dando como resultado de esta forma una traducción reducida del mARN spnK. Se produjo una cepa mutante de Saccharopolyspora spinosa que contiene una secuencia Shine-Dalgarno spnK eliminada, utilizando un protocolo similar al descrito en el Ejemplo 2. Se amplificaron mediante PCR dos fragmentos de al menos 1,500 pb localizados en la corriente ascendente y corriente descendente de la secuencia Shine-Dalgarno spnK. Estos fragmentos no contienen la siguiente secuencia 5'-AGGAGCTC-3'. Los dos fragmentos se ligaron juntos dentro de un plásmido tal como pOJ260 que puede ser utilizado para conjugación con Saccharopolyspora spinosa.

El plásmido deseado es transformado en una cepa donadora de conjugación E. coli ET12567/pUZ8002. Se confirmó una cepa transformada en forma positiva mediante digestión de enzima de restricción. Al momento de la confirmación de que la cepa E. coli que contiene el plásmido es correcta, se llevó a cabo la conjugación de las células E. coli con Saccharopolyspora spinosa, de acuerdo con el método descrito en la publicación de Matsushima y asociados, (1994). La transferencia del plásmido de las células donadoras E. coli y la integración subsecuente del plásmido en el genoma de Saccharopolyspora spinosa, se selecciona para utilizar la resistencia a un antibiótico.

La integración del plásmido dentro del cromosoma de Saccharopolyspora spinosa, está caracterizada en forma molecular mediante amplificación PCR de la región de ADN genómico específica. En síntesis, el ADN genómico se aisla y la inserción que contiene la secuencia Shlne-Dalgarno spnK es amplificada mediante PCR, clonada y secuenciada. Los datos de secuenciación indican que la construcción de eliminación Shine-Dalgarno spnK se integra en la región spnJK mediante la recombinación homóloga de cruce simple.

Se obtuvieron mutantes de cruce doble que contienen la secuencia Shine-Dalgarno spnK interrumpida, utilizando el protocolo descrito en el Ejemplo 2. Las colonias que no tienen la capacidad de crecer en placas de agar BHI que contienen antibióticos que son seleccionados por el marcador presente en el esqueleto del vector, se identificaron como candidatos de mutantes de cruce doble y se seleccionan para validación utilizando PCR. Se utilizaron los cebadores designados para enlazar dentro del gen spnK y spnJ. El producto PCR resultante subclonado en un plásmido utilizando la Tecnología de Clonación TOPO® (Invitrogen; Carlsbad CA). Las colonias bacterianas que contienen el producto PCR, clonadas dentro del vector TOPO® son aisladas y confirmadas mediante digestión de enzima de restricción. Se llevó a cabo la secuenciación de ADN de los clones de plásmido positivos. Los resultados de secuenciación indican que la secuencia de nucleótido Shine-Dalgarno spnK es interrumpida del genoma de Saccharopolyspora spinosa. La fermentación de las cepas mutantes de Shine-Dalgarno spnK de Saccharopolyspora spinosa, se puede llevar a cabo bajo condiciones descritas por Burns y asociados, (WO 2003070908). El análisis del caldo de fermentación para la presencia de factores de spinosyn, se puede llevar a cabo bajo condiciones descritas por Baltz y asociados, (Patente Norteamericana No. 6,143,526). Para confirmar la presencia de factores de spinosyn en el sobrenadante, se secaron los extractos del caldo de fermentación en un SpeedVac durante la noche, seguido de la división del residuo entre agua y éter. La capa de éter se secó mediante evaporación bajo corriente N2. Posteriormente, la muestra se disuelve en acetona-d6 y se transfiere a un tubo de RMN para adquisición RMN de ID de protón. Los resultados de RMN indicaron la presencia de un exceso de J/L con respecto a A/D. Los perfiles RMN se compararon con los de los estándares de spinosyn. La fermentación de las cepas que contienen la mutación de la secuencia de Shine-Dalgarno spnK produce una mezcla de spinosyn que contiene spinosyn J y L, tal como se compara con Saccharopolyspora spinosa de control que produce una mezcla de spinosyn que contiene spinosyn A y D.

Ejemplo 5: Reducción de la Expresión de 3'-Q-Metiltransferasa mediante Des-Regulación de ARN Antisentido de spnK Se designó un plásmido para producir asARN (ARN antisentido) complementario para la secuencia de codificación spnK. La des-regulación resultante de la expresión del gen spnK, da como resultado una reducción de la actividad spnK.

La secuencia de codificación spnK es amplificada mediante PCR, y se clona en un plásmido tal como pOJ260 para integración en el cromosoma de Saccharopolyspora spinosa. Como alternativa, la secuencia de codificación spnK puede ser clonada en un plásmido que se mantiene en forma estable y se replica dentro del citosol de Saccharopolyspora spinosa. El plásmido resultante se construye para producir el asARN spnK expresando la hebra antisentido de spnK utilizando un promotor bacteriano constitutivo fuerte. Este plásmido de asARN spnK se trasforma en la cepa donadora de conjugación E. coli ET12567/pUZ8002. Se confirmó una cepa transformada en forma positiva mediante digestión de enzima de restricción. Al momento de la confirmación de que es correcta la cepa E. coli que contiene el plásmido, se llevó a cabo la conjugación del plásmido a partir de células donadoras E. coli con Saccharopolyspora spinosa, de acuerdo con el método descrito por Matsushima y asociados, (1994). La transferencia del plásmido asARN spnK de E. coli en Saccharopolyspora spinosa, se selecciona para utilizar la resistencia para un antibiótico; la resistencia de la cual se codifica en el plásmido asARN spnK. El ADN genómico es aislado de los transconjugados y se utiliza como plantilla para amplificación PCR para confirmar la existencia del plásmido.

La fermentación de las cepas de Saccharopolyspora spinosa que contienen el plásmido asARN spnK se puede llevar a cabo bajo condiciones descritas por Burns y asociados, (WO 2003070908). El análisis del caldo de fermentación con respecto a la presencia de factores de spinosyn factores se puede llevar a cabo bajo condiciones descritas por Baltz y asociados (Patente Norteamericana No. 6,143,526). Para confirmar la presencia de factores de spinosyn en el sobrenadante, se secaron los extractos del caldo de fermentación en un SpeedVac durante la noche, seguido de la división del residuo entre agua y éter. La capa de éter se secó mediante evaporación bajo corriente N2. Posteriormente, la muestra se disuelve en acetona-d6 y se transfiere a un tubo de RMN para adquisición RMN de ID de protón. Los resultados de RMN indicaron la presencia de un exceso de J/L con respecto a A/D. Los perfiles RMN se compararon con los de los estándares de spinosyn. La fermentación de las cepas que contienen el plásmido sarna spnK produce una mezcla de spinosyn que contiene spinosyn J y L, en comparación con Saccharopolyspora spinosa de control, que produce una mezcla de spinosyn que contiene spinosyn A y D.

Ejemplo 6: Generación de Mutaciones de Eliminación spnK Adicionales Ejemplo 6.1 Construcción del vector de eliminación de extremo 5' spnK Se amplificó mediante PCR el ADN genómico de una cepa que produce spinosyn A y D (Hopwood y asociados, 1985) para producir dos fragmentos de ADN. El primer fragmento amplificado tiene aproximadamente 1,500 pb de longitud, y se localiza directamente en la corriente ascendente del codón de inicio ATG. El segundo fragmento amplificado tiene aproximadamente 1,500 pb de longitud, y se localiza directamente en la corriente descendente del par base 61 spnK. Las amplificaciones PCR se completaron utilizando métodos conocidos para los expertos en la técnica. Los cebadores de oligonucleótido son sintetizados para incorporar secuencias de enlace de enzima de restricción. Los productos PCR resultantes son digeridos con enzimas de restricción que disocian las secuencias de enlace incorporadas por los cebadores. Los fragmentos son ligados juntos y posteriormente ligados en los sitios de restricción correspondientes del plásmido pOJ260. El producto de ligadura resultante se clona en células competentes E. coli. Las colonias son seleccionadas y clasificadas para el producto de ligadura deseado mediante digestión de enzimas de restricción y análisis de secuencia de ADN. Se identificaron clones positivos y se utilizó un clon seleccionado para eliminación de extremo 5' subsecuente de spnK en Saccharopolyspora spinosa. La secuencia resultante del fragmento de gen spnK eliminado dentro del plásmido pOJ260, está presente en la Tabla 3. Por consiguiente, una eliminación del codón de inicio spnK puede incluir la secuencia: (SEQ ID No: 10).

Tabla 3: Alineación de secuencia de nucleótido del extremo 5' eliminado de Sank eliminación de extremo 5' spnK (SEQ ID NO 10) (1) seq ascendente y spnK (SEQ ID NO 14) (1) eliminación de extremo 5' spnK (SEQ ID NO 10) (14) seq ascendente y spnK (SEQ ID NO 14) (31) eliminación de extremo 5' spnK (SEQ ID NO 10) (14) seq ascendente y spnK (SEQ ID NO 14) (61) eliminación de extremo 5' spnK (SEQ ID NO 10) (31) VCGAC Í^C C GA TCSCC seq ascendente y spnK (SEQ ID NO 14) (91) ÜÍÉI CGAAC'íCGGACTC-XC ACOAT 121 ' 150 eliminación de extremo 5' spnK (SEQ ID NO 10) (61) CGC.V lGT GCTSATCGACSAGSTC seq ascendente y spnK (SEQ ID NO 14) (121) CGCA< &íi 151 180 eliminación de extremo 5' spnK (SEQ ID NO 10) (91) seq ascendente y spnK (SEQ ID NO 14) (151) eliminación de extremo 5' spnK (SEQ ID NO 10) (121) seq ascendente y spnK (SEQ ID NO 14) (181) eliminación de extremo 5' spnK (SEQ ID NO 10) (151) seq ascendente y spnK (SEQ ID NO 14) (211) eliminación de extremo 5' spnK (SEQ ID NO 10) (181) XGAGCtGAXCSáéGGC (Si seq ascendente y spnK (SEQ ID NO 14) (241) lili: .CCGC / . ,K-"-^ r G¾GCA 271 3C0 eliminación de extremo 5' spnK (SEQ ID NO 10) (211) .VTGAC ";C'3GT CGGAGACGTCCéGGTG § seq ascendente y spnK (SEQ ID NO 14) (271) AGGAC X3GT GGGAGACGICCC GTG GGGAT 301 330 eliminación de extremo 5' spnK (SEQ ID NO 10) (241) CGSr \;\CGA GCTC CCGATC CAIC C CGA seq ascendente y spnK (SEQ ID NO 14) (301) £Gl^ \¾CGA CTCACCGATGTCAIC m 331 360 eliminación de extremo 5' spnK (SEQ ID NO 10) (271) CC: AGC¾GC~i7CCAGG GOCGÍ seq ascendente y spnK (SEQ ID NO 14) (331) GIXG' ¾GGAGGAGCTCGC GG eliminación de extremo 5' spnK (SEQ ID NO 10) (301) seq ascendente y spnK (SEQ ID NO 14) (361) eliminación de extremo 5' spnK (SEQ ID NO 10) (331) CACCí GGIE GGÁÍACCCGG'í CCGTG seq ascendente y spnK (SEQ ID NO 14) (391) CACO CGGT?CGATA¿GG½¾.; CCGTC 421 450 eliminación de extremo 5' spnK (SEQ ID NO 10) (351) GG&..V :TG'ÍVe; ÁTG CTTCc GGcc ATCT seq ascendente y spnK (SEQ ID NO: 14) (421) GGAAC :IGXC CGAT¾GCITCC GGCe:tiltil 451 480 eliminación de extremo 5' spnK ( SEQ ID NO: 10) (391) seq ascendente y spnK ( SEQ ID NO: 14) (451) eliminación de extremo 5' spnK (SEQ ID NO 10) (421) seq ascendente y spnK (SEQ ID NO 14) (481) eliminación de extremo 5' spnK (SEQ ID NO: 10) (451) seq ascendente y spnK (SEQ ID NO: 14) (511) eliminación de extremo 5' spnK (SEQ ID NO 10) (481) seq ascendente y spnK (SEQ ID NO 14) (541) eliminación de extremo 5' spnK (SEQ ID NO 10) (511) seq ascendente y spnK (SEQ ID NO 14) (571) eliminación de extremo 5' spnK ( SEQ ID NO 10) (541) seq ascendente y spnK ( SEQ ID NO 14) (601) eliminación de extremo 5' spnK (SEQ ID NO 10) (571) G\^X S>GG CGGCGAÁXCGCTGAÁGi •.XGTG- seq ascendente y spnK (SEQ ID NO 14) (631) CGGXGGCGG C$GG¾¾AXGGCrG¾AGi iíí l 661 690 eliminación de extremo 5' spnK ( SEQ ID NO 10) (601) GAAGCGGTA G~TCCACGGGOGCCXG< seq ascendente y spnK ( SEQ ID NO 14) (661) (:~TCCAG(:< GG CCXG< jXGTt eliminación de extremo 5' spnK (SEQ ID NO 10) (631) seq ascendente y spnK (SEQ ID NO 14) (691) eliminación de extremo 5' spnK (SEQ ID NO 10) (661) CG&CCAOCA GAGGOI'JTGCACOGTCC iasG¾ seq ascendente y spnK (SEQ ID NO 14) (721) CGACGASCA GAGCGXC1GCAGCGXCC GGGC 751 780 eliminación de extremo 5' spnK ( SEQ ID NO 10) (691) CGÁ¿CA AGCA''.('5CCCGAGGA :CTG( seq ascendente y spnK ( SEQ ID NO 14) (751) CGA7CAGAG G&AGC cc¾¾tósa«i(¾ 781 810 eliminación de extremo 5' spnK (SEQ ID NO 10) (721) CCTTG--!:CGA seq ascendente y spnK (SEQ ID NO 14) (781) CfiTTGACG<> OAAG X GGG GGGXTG' 811 840 eliminación de extremo 5' spnK (SEQ ID NO 10) (751) CATKAXOQA CGAXGGCAGGGAGATC. seq ascendente y spnK (SEQ ID NO 14) (811) P¾TCAt; GAC AT G AGC <:&TC. ¾ACGG 841 870 eliminación de extremo 5' spnK (SEQ ID NO 10) (781) ACACGtGCG CACA CCCXGGAAAGG< .rerr seq ascendente y spnK ( SEQ ID NO 14) (841) ¾||lll¾ GAC TC:CCXGGZ>,?\AGGÍ 871 900 eliminación de extremo 5' spnK ( SEQ ID NO 10) (811) ccoí GGrr G O C¾ GOGGTOGC T Í (». G T seq ascendente y spnK (SEQ ID NO 14) (871) G GOCGGTT GCGCAGGGGTGGCGf A :ACGX 901 930 eliminación de extremo 5' spnK (SEQ ID NO 10) (841) ¾XCGÁG¾¾T ;TGXGGAC:GAGCT¾T' seq ascendente y spnK (SEQ ID NO 14) (901) TC'TGXGSAC ACCTAT TGTCC 931 eliminación de extremo 5' spnK (SEQ ID NO 10) (871) C GC AGGG GCAG T GC< JCGGC seq ascendente y spnK ( SEQ ID NO 14) (931) CGGATTÍGGOGGGCAGGCGCAG/ÍGG< :cooc 961 990 eliminación de extremo 5' spnK (SEQ ID NO 10) (901) C;GK<¾ '-.CGG CA^CAC GT AG -S- * seq ascendente y spnK (SEQ ID NO 14) (961) CGCACéCGG C:A¾¾éGGTGAGCGfé< eliminación de extremo 5' spnK (SEQ ID NO 10) (931) seq ascendente y spnK (SEQ ID NO 14) (991) eliminación de extremo 5' spnK ( SEQ ID NO 10) (961) seq ascendente y spnK ( SEQ ID NO 14) (1021) eliminación de extremo 5' spnK (SEQ ID NO 10) (991) seq ascendente y spnK (SEQ ID NO 14) (1051) CXAC 7GGAACGCAATXXSÍST GGC;CTCCA 1081 1110 eliminación de extremo 5' spnK (SEQ ID NO 10) (1021) CACCTrt CACAACA C ÍCSTTCCTC seq ascendente y spnK (SEQ ID NO 14) (1081) eliminación de extremo 5' spnK (SEQ ID NO:10) (1051) seq ascendente y spnK (SEQ ID NO 14) (1111) eliminación de extremo 5' spnK (SEQ ID NO 10) (1081) seq ascendente y spnK (SEQ ID NO 14) (1141) eliminación de extremo 5' spnK (SEQ ID NO 10) (1111) G<:AGCÍGG(GGACGIGAA¾ GCGC( seq ascendente y spnK ( SEQ ID NO 14) (1171) íGASGA 1201 eliminación de extremo 5' spnK (SEQ ID NO 10) (1141) C .GX <\ seq ascendente y spnK (SEQ ID NO 14) (1201) ¾?,GTG<\ Conjugación de vector de eliminación spnK en Saccharopolyspora spinosa La conjugación de las células E. coli que llevan la construcción de eliminación de extremo 5' spnK con Saccharopolyspora spinosa, se llevó a cabo de acuerdo con el método descrito en Matsushima y asociados, (1994) y ejemplificado en el Ejemplo 2. Se seleccionaron los transconjugados putativos resistentes a apramicina, debido a la presencia del marcador del gen de resistencia a apramicina en el esqueleto del vector de la construcción de eliminación de extremo 5' de spnK.

Confirmación de transcon(upados y Amplificación de la región spnK para determinar el sitio de integración Se transfirió un transconjugado primario simple crecido en un medio R6 en placas de agar de Infusión de Corazón Cerebro (BHI) suplementadas con 50 pg/mL de apramicina y 25 pg/mL de ácido nalidíxico, para confirmar el fenotipo de resistencia. Se inocularon las Mycelia de los transconjugados a partir de la placa BHI en un medio de Caldo de Soya Tríptico (TSB) suplementado con 50 pg/mL de apramicina. El cultivo se incubó a una temperatura de 29°C con agitación en 250 rpm durante 72 horas. Las Mycelia se recolectaron después de 72 horas de incubación y se aisló el ADN genómico. El PCR se llevó a cabo utilizando el ADN genómico aislado del transconjugado como plantilla con los cebadores designados para detectar el mutante de cruce simple. Los resultados del producto de amplificación PCR son secuenciados. Los datos de secuenciación indican que la construcción de eliminación del extremo 5' spnK se integra en la región spnJK mediante recombinación homóloga de cruce simple.

Aislamiento de mutante de eliminación de extremo 5' spnK de cruce doble Se inoculó un mutante de cruce doble resistente a apramicina en placas agar BHI, en la ausencia de apramicina y se incubó a una temperatura de 29°C durante 14 días. Las esporas fueron recolectadas de las placas de acuerdo con la publicación de Hopwood y asociados (1985) y almacenadas en 20% de glicerol a una temperatura de -80°C. Las esporas se inocularon en placas agar BHI nuevas sin apramicina y las placas se incubaron a una temperatura de 29°C durante 14 días. Este paso se repitió varias veces. La preparación de esporas se diluyó utilizando 20% de glicerol, y las esporas diluidas se revistieron el placas de agar BHI. Las placas se incubaron a una temperatura de 29°C durante 10 días para el desarrollo de colonia simple. Las colonias individuales se parcharon en placas de agar BHI nuevas con y sin apramicina. Todas las placas se incubaron a una temperatura de 29°C durante 10 días para el desarrollo micelial. Las colonias que no crecen en placas de agar BHI que contienen 50 pg/mL de apramicina, fueron identificadas como candidatos de mutantes de cruce doble y se seleccionan para validación utilizando PCR. Identificación v validación de mutantes de cruce doble Se confirmaron mediante PCR los mutantes de cruce doble. Los cebadores que son designados para enlazar dentro de los genes spnJ y spnK se utilizan para amplificación PCR. Los tamaños de los productos PCR son determinados mediante electroforesis de gel de agarosa. Los mutantes de cruce doble que dan como resultado la eliminación del extremo 5' del gen spnK, se identifican y seleccionan con base en el tamaño del producto PCR. El tamaño y la secuencia de ADN del fragmento PCR, indica la eliminación del codón de inicio ATG y el extremo 5' del gen spnK.

Producción de spinosyn mediante fermentación de frasco de agitación La fermentación del mutante de cruce doble se puede llevar a cabo bajo condiciones descritas por Burns y asociados, (WO 2003070908). El análisis del caldo de fermentación con respecto a la presencia de factores spinosyn se puede llevar a cabo bajo condiciones descritas por Baltz y asociados, (Patente Norteamericana No. 6,143,526). La fermentación del mutante de cruce doble produce spinosyn J y L.

Ejemplo 6.2 Construcción del vector de eliminación en cuadro de spnK Se amplificaron mediante PCR dos fragmentos de ADN utilizando ADN genómico de una cepa que produce spinosyn A y D (Hopwood y asociados, 1985). El primer fragmento amplificado tiene aproximadamente 1,500 pb de longitud, y se localiza directamente en la corriente ascendente del primer dominio de metiltransferasa dependiente de S-adenosilmetionina putativo. El segundo fragmento amplificado tiene aproximadamente 1,500 pb de longitud, y se localiza directamente en la corriente descendente del primer dominio de metiltransferasa dependiente de S-adenosilmetionina putativo. Las amplificaciones PCR se completan utilizando métodos conocidos para los expertos en la técnica. Los cebadores de oligonucleótido son sintetizados para incorporar las secuencias de enlace de enzima de restricción. Los productos PCR resultantes son digeridos con enzimas de restricción que disocian las secuencias de enlace incorporadas por los cebadores. Los fragmentos son ligados juntos y posteriormente ligados en los sitios de restricción correspondientes del plásmido pOJ260. El producto de ligadura resultante se clona en células competentes E. coli. Las colonias se seleccionan y clasifican para el producto de ligadura deseado mediante digestión de enzima de restricción y análisis de secuencia de ADN. Los clones positivos son identificados y se utiliza un clon seleccionado para la eliminación en cuadro subsecuente del primer dominio de metiltransferasa dependiente de S-adenosilmetionina putativo de spnK dentro de Saccharopolyspora spinosa. La secuencia resultante del fragmento de gen spnK eliminado dentro del plásmido pOJ260, se presenta en la Tabla 4. Por consiguiente, una eliminación spnK puede incluir la secuencia: SEQ ID No: 11.

Tabla 4: Alineación de secuencia de nucleótido del primer dominio de metiltransferasa dependiente de S-adenosilmetionina putativo de spnK (se subrayan los dominios de metiltransferasa dependiente de S-adenosilmetionina putativos). spnK (SEQ ID NO 17) (31) T l eÓiXC C CG CGGA; i GlSi eliminación SA #1 spnK (SEQ ID NO. 11) (31) CGCC- GA* 61 90 spnK (SEQ ID NO 17) (61) .GCCrOGCCGA V :iCCC¾A. eliminación SA #1 spnK (SEQ ID NO 11) (61) >~" "- "· > C TGGCOG.Á CCTGACC. \CCGAA 91 120 spnK (SEQ ID NO 17) (91) llillilllí GCÁC C" :;IGCXG eliminación SAM#1 spnK (SEQ ID NO 11) (91) , ..,. C GCA GAT CGCAOCCi 121 150 spnK (SEQ ID NO 17) (121) <AGATC TCTT lililí eliminación SA #1 spnK (SEQ ID NO 11) (121) AXCGACC t§lll t¾ CCf3C CGí 151 180 spnK (SEQ ID NO 17) (151) Í&CATCGA&CC JÜH eliminación SA #1 spnK (SEQ ID NO 11) (151) c ccc c ÍAC.MCGAACC GA cie tTCGCC 181 210 spnK (SEQ ID NO 17) (181) %CGGTX eliminación SA #1 spnK (SEQ ID NO 11) (181) llll i .TCACGCiVJvG AGGC AG, ¾ CGXX 211 240 spnK (SEQ ID NO 17) (211) .i .n.' ^ ACAGTCC ÍCXGAO eliminación SAM#1 spnK (SEQ ID NO 11) (211) > \. rrccTGA Ci AGA'^TCC "3GTÍ3 -! 241 270 spnK (SEQ ID NO 17) (241) íYJGA CG'j ?¿yGA eliminación SAM#1 spnK (SEQ ID NO 11) (241) vACGCOGAGCA A ACCG JX GGA 271 300 spnK (SEQ ID NO 17) (271) CGGTXAO eliminación SA #1 spnK (SEQ ID NO 11) (271) GACGXCÍ : XGGGGAT CGGXXAG S&GCTC 301 330 spnK (SEQ ID NO 17) (301) ÁCCGAX' :IC,¾TCGC';GA GI'TGXÍC eliminación SA #1 spnK (SEQ ID NO 11) (301) i ii lGi G','TGT7C 331 360 spnK (SEQ ID NO: 17) (331) II¾ GG]X¾G . -> GGGG ^T^ GCC-GC < GGAGG eliminación SAM#1 spnK (SEQ ID NO: 11) (331) ¾GGGCG5TCGGCGG <" ¾¾&<«: 361 390 spnK (SEQ ID NO: 17) (361) rrcccAz-.ccA CAc A-CGCX eliminación SA #1 spnK (SEQ ID NO: 11) (361) 391 420 spnK (SEQ ID NO: ?) (391) ~CG A"Í eliminación SAM#1 spnK (SEQ ID NO: 11) (391) «STCC TC SAÁCTGn 421 450 spnK (SEQ ID NO: 17) (421) •XCGCC eliminación SAM#1 spnK (SEQ ID NO11) (421) GOCTTC At» *OGA C¾ GCA^X% SC G; 451 480 spnK (SEQ ID NO. 17) (451) GGGTGCSO '¾GG(ÍACGTCGGG¾¾|C eliminación SAM#1 spnK (SEQ ID NO: U) (451) ;.ACCGftCGiGCX;CAC>. 481 510 spnK (SEQ ID NO 17) (481) fCCCAGTA" GCACGG C¾¾« eliminación SAM#1 spnK (SEQ ID NO 11) (481) rcccÁCTAOcGcÁGGC ¾|¾¾ spnK eliminación SAM#1 spnK spnK eliminación SAM#1 "spnK spnK (SEQ ID O 17) (571) CGCCCGGTGCGCATCCTGGAGATCGGTGTC eliminación SAM#1 spnK (SEQ ID NO 11) (561) 601 630 spnK (SEQ ID NO 17) (601) GGTGC-CTACAACTTCGACGGTGGCC lililí eliminación SAM#1 spnK (SEQ ID NO 11) (561) T^ii"^ .í GGGC' 631 " " 660 spnK (SEQ ID NO 17) (631) G¾A:TCCCTG 'A ATGT ÍVGCGC" eliminación SAM#1 spnK (SEQ ID O 11) (571) EA f!$ 661 690 spnK (SEQ ID NO 17) (661) !!! fiSSG XCCXGTICGGCATGi JA T eliminación SA #1 spnK (SEQ ID NO 11) (601) G¾*G &GGC GXGGXGttCGGGAtGí spnK (SEQ ID O 17) (691) eliminación "S>A #1" spnK (SEQ ID NO 11) (631) spnK (SEQ ID NO 17) (721) ^ GGCGGG í- CA . Í GAAG eliminación SAM#1 spnK (SEQ ID O 11) (661) G~GGGCGCCGACCAG. \C¡CAAG 751 780 spnK (SEQ ID NO 17) (751) 2¾GGGG¾CCGTXGAC' ÍKGS I eliminación SAM#1 spnK (SEQ ID NO 11) (691) TGGC G .GTTGAC>. 781 810 spnK (SEQ ID NO 17) (781) XXCGACATCATCATCt ¿ACGAX eliminación SAM#1 spnK (SEQ ID NO 11) (721) I S& G X¾ ¾ACATCAICñÍGl ¾¾l 811 840 spnK (SEQ ID NO 17) (811) ATCíy-^ GACACG GC eliminación SÁM#1 "spnK (SEQ ID O 11) (751) GGCAGCCAC 841 870 spnK (SEQ ID NO 17) (841) «CGCXGTTCGCCCGG' ¦|| GG; eliminación SA #1 spnK (SEQ ID O 11) (781) f¾§pXGG¾ AGGGXGTTCcc íoGS' :¿GCGG 871 900 spnK (SEQ ID O 17) (871) G;¿¾rACGTG TCGAG( A CXG: eliminación SA #1 spnK (SEQ ID O 11) (811) AGOGGTGGC :?X; T a.CGTGATCGAG( ÍAXCTG 901 930 spnK (SEQ ID NO 17) (901) TG3ACGACCx>i.T crccc{:»GAtxc( ¾¾ G eliminación SAM#1 spnK (SEQ ID NO 11) (841) XATSCXCCCGGAXXet 931 960 spnK (SEQ ID NO 17) (931) T:GC:CCGGC GCACC 3 CAOC eliminación SAM#1 spnK (SEQ ID NO: H) (871) ¾GC¾~CCG¾C»CC spnK (SEQ ID NO. 17) (961) eliminación SAM#1 spnK (SEQ ID NO. 11) (901) spnK (SEQ ID NO 17) (991) G-OGT .táG GG^G iSCaGCCG AXSCG eliminación SAM#1 spnK (SEQ ID NO 11) (931) liitf .CAGGAGGAGG: ^GGAGCCGGATGCG 1021 1050 SpnK (SEQ ID NO 17) (1021) eliminación SA #1 spnK (SEQ ID NO 11) (961) spnK (SEQ ID NO 17) (1051) eliminación SAM#1 spnK (SEQ ID NO 11) (991) spnK (SEQ ID NO 17) (1081) eliminación SA #1 spnK (SEQ ID NO 11) (1021) spnK (SEQ ID NO 17) (1111) GAA3G "GGCGTT CrGt ; T TGGG TGG. í¾ eliminación SAM#1 spnK (SEQ ID NO 11) (1051) GAAGGv GGGG:I ::G irGGGXGCC¾GG 1141 1170 spnK (SEQ ID NO 17) (1141) ß¾ íGk¾'¾CATAT' eliminación SAM#1 spnK (SEQ ID NO 11) (1081) ¾GTGT( rGCAGGTGGGGGAG; 1171 1194 spnK (SEQ ID NO 17) (1171) -.G \ I#|¾ SG G& ¾C3AGT'Jft eliminación SAM#1 spnK (SEQ ID NO 11) (1111) G'iGAA' .GCv?C¾C vO'> Conjugación de vector de eliminación spnK en Saccharopolyspora spinosa La conjugación de las células E. coli que llevan la construcción de eliminación en cuadro de spnK con Saccharopolyspora spinosa, se lleva a cabo de acuerdo con el método descrito en Matsushima y asociados, (1994) y ejemplificado en el Ejemplo 2. Se seleccionaron transconjugados putativos resistentes a apramicina, debido a la presencia del marcador de gen de resistencia a apramicina en el esqueleto de vector de la construcción de eliminación en cuadro de spnK.

Confirmación de transconiugados y Amplificación de la región spnK para determinar el sitio de integración Se transfirió un transconjugado primario simple crecido en un medio R6 en placas de agar de Infusión de Corazón Cerebro (BHI) suplementado con 50 pg/mL de apramicina y 25 pg/mL de ácido nalidíxico para confirmar el fenotipo de resistencia. Las Mycelia de los transconjugados son inoculadas a partir de la placa BHI en un medio de Caldo de Soya Tríptico (TSB) suplementado con 50 pg/mL de apramicina. El cultivo se incubó a una temperatura de 29°C con agitación en 250 rpm durante 72 horas. Se recolectaron las Mycelia después de 72 horas de incubación y se aisló el ADN genómico. El PCR se llevó a cabo utilizando el ADN genómico aislado del transconjugado como plantilla con cebadores designados para detectar el mutante de cruce simple. Se secuenciaron los resultados de la amplificación PCR. Los datos de secuenciación indican que la construcción de eliminación en cuadro de spnK se integra en la región spnK mediante recombinación homóloga de cruce simple. Aislamiento de mutante de eliminación en cuadro de spnK de cruce doble Se inoculó un mutante de cruce simple resistente a apramicina en placas agar BHI en la ausencia de apramicina y se incubó a una temperatura de 29°C durante 14 días. Las esporas son recolectadas de las placas de acuerdo con la publicación de Hopwood y asociados, (1985) y almacenadas en 20% de glicerol a una temperatura de -80°C. Las esporas son inoculadas en placas de agar BHI nuevas sin apramicina, y las placas son incubadas a una temperatura de 29°C durante 14 días. Este paso se repitió varias veces. Se diluyó la preparación de esporas utilizando 20% de glicerol, y las esporas diluidas son revestidas en placas de agar BHI. Las placas son incubadas a una temperatura de 29°C durante 10 días para el desarrollo de colonia simple. Las colonias individuales son parchadas en placas de agar BHI nuevas con y sin apramicina. Todas las placas son incubadas a una temperatura de 29°C durante 10 días para el desarrollo micelial. Las colonias que no crecieron en placas de agar BHI que contienen 50 Mg/mL de apramicina, fueron identificadas como candidatos de mutantes de cruce doble y se seleccionan para validación utilizando PCR.

Identificación y validación de mutantes de cruce doble Los mutantes de cruce doble son confirmados mediante PCR. Los cebadores que son designados para enlazar dentro del gen spnK son utilizados para amplificación PCR. Los tamaños de los productos PCR son determinados mediante electroforesis de gel de agarosa. Los mutantes de cruce doble que dan como resultado una eliminación del dominio de metiltransferasa dependiente de S-adenosilmetionina putativo dentro del gen spnK, son identificados y seleccionados con base en el tamaño del producto PCR. El tamaño y la secuencia de ADN del fragmento PCR, indican la eliminación del primer dominio de metiltransferasa dependiente de S- adenosilmetionina putativo dentro del gen spnK.

Producción de spinosyn mediante fermentación de frasco de agitación Se puede llevar a cabo la fermentación del mutante de cruce doble bajo las condiciones descritas por Burns y asociados, (WO 2003070908). Se puede llevar a cabo el análisis del caldo de fermentación con respecto a la presencia de factores de spinosyn, bajo las condiciones descritas por Baltz y asociados, (Patente Norteamericana No. 6,143,526). La fermentación del mutante de cruce doble produce spinosyn J y L.

Ejemplo 6.3 Construcción del vector de eliminación en cuadro de spnK Se amplificaron mediante PCR dos fragmentos de ADN utilizando ADN genómico de una cepa que produce spinosyn A y D (Hopwood y asociados, 1985). El primer fragmento amplificado tiene aproximadamente 1,500 pb de longitud, y se localiza directamente en la corriente ascendente del segundo dominio de metiltransferasa dependiente de S-adenosilmetionina putativo. El segundo fragmento amplificado tiene aproximadamente 1,500 pb de longitud, y se localiza directamente en la corriente descendente del segundo dominio de metiltransferasa dependiente de S-adenosilmetionina putativo. Las amplificaciones PCR se completan utilizando métodos conocidos para los expertos en la técnica. Los cebadores de oligonucleótido son sintetizados para incorporar las secuencias de enlace de enzima de restricción. Los productos PCR resultantes son digeridos con enzimas de restricción que disocian las secuencias de enlace incorporadas por los cebadores. Los fragmentos son ligados juntos y posteriormente ligados en los sitios de restricción correspondientes del plásmido pOJ260. El producto de ligadura resultante es clonado en células competentes E. col. Las colonias son seleccionadas y clasificadas para el producto de ligadura deseado mediante la digestión de enzimas de restricción y análisis de secuencia ADN. Se identificaron los clones positivos y se utilizó un clon seleccionado para la subsecuente eliminación en cuadro del segundo dominio de metiltransferasa dependiente de S-adenosilmetionina putativo de spnK dentro de Saccharopolyspora spinosa. La secuencia resultante del fragmento de gen spnK eliminado dentro del plásmido pOJ260, se presenta en la Tabla 5. Por consiguiente, una eliminación de spnK puede incluir la secuencia: SEQ ID No: 12.

Tabla 5: Alineación de secuencia de nucleótido del segundo dominio de metiltransferasa dependiente de S-adenosilmetionina putativo eliminado de spnK (los dominios de metiltransferasa dependiente de S-adenosilmetionina putativos están subrayados). 30 spnK (SEQ ID NO: :17) (1) AlG CC&rÁACGC& SA GAXCGAAACCGXG eliminación SAM#2 spnK (SEQ ID NO: 12) (1) fercG?.?js. c-axc spnK (SEQ ID NO: :17) (31) eliminación SAM#2 spnK (SEQ ID NO: :12) (31) spnK (SEQ ID NO: :17) (61) eliminación SA #2 spnK (SEQ ID NO: :12) (61) spnK (SEQ ID NO: :17) (91) eliminación SAM#2 spnK (SEQ ID NO; ;12) (91) spnK (SEQ ID NO: :17) (121) eliminación SAM#2 spnK (SEQ ID NO: : 12) (121) spnK (SEQ ID NO: :17) (151) G&CqCrAG OñC eliminación SAM#2 spnK (SEQ ID NO: :12) (151) GACÜGAGCT GC 181 210 spnK ( SEQ ID NO: 17) (181) 5AT. ~?\Ct:CACCGAGG<A¾\: ;' spnK SAM#2 delete (SEQ ID NO.12) (181) GTCCAÍ ~ACCC?¾: GAG CGAGí' cesrx ' spnK (SEQ ID NO 17) (211) spnK SAM#2 delete ( SEQ ID NO 12) (211) spnK (SEQ ID O 17) (241) CTGATf ..AA gfí¾¾¾GCAACGS¿CGG reata spnK SAM#2 delete (SEQ ID NO 12) (241) ¾Á @ (¾ « PA^CG¾¾ G GSSA 271 ' 330 spnK ( SEQ ID NO 17) (271) 30???¾¾ t???????G ii spnK SAM#2 delete (SEQ ID NO 12) (271) :C TGCGG XC GG T AÓ il 301 " 330 spnK (SEQ ID O 17) (301) G rcT ¦;?vrc COG¾GrT xrc>; spnK SAM#2 delete (SEQ ID NO 12) (301) GCCCA 331 360 spnK (SEQ ID NO 17) (331) GGAGC CA.--.GGCCGTC;5GG<"-CCC CrGAGC spnK SAM#2 delete (SEQ ID O 12) (331) ^ . ¦ CA-GGGCCGT<;GGCGCC;C 361 " 390 spnK ( SEQ ID NO 17) (361) :xx íj XCCGAAC A CACAl ccxx eliminación SAM#2 spnK (SEQ ID NO 12) (361) jrr ^C: eCGAACC CCAC i CCGGX 391 420 spnK (SEQ ID NO 17) (391) TC AX. ¾X ÍGGXGCGTCGGAAC ~ GCGAI eliminación SAM#2 spnK (SEQ ID NO 12) (391) TCGAX. VCG XGTOÍX! CGGAACIGT IÍ A 421 450 spnK (SEQ ID NO 17) (421) eliminación SAM#2 spnK (SEQ ID NO 12) (421) spnK (SEQ ID O 17) (451) eliminación SAM#2 spnK (SEQ ID O 12) (451) spnK (SEQ ID O 17) (481) ¾GG 1 lg|lA¾¾¾¾l¾G| ?\CAAG eliminación SAM#2 spnK ( SEQ ID NO 12) (481) TIGCTCGC TCX;CA¿T¾CCaCACGG«CAAG 511 540 spnK (SEQ ID NO 17) (511) XGGOG- CCXGC?;CTGGrTCACCC GC A eliminación SAM#2 spnK (SEQ ID NO 12) (511) v 3C< X dCTGCAC GG 'ÍCACCC CGCTA 541 570 spnK (SEQ ID NO 17) (541) TACwAí G: . |í¾&í¾ G :3¾«t; eliminación SA #2 spnK (SEQ ID NO 12) (541) Ác¾;crcG(x\GAGT:;c . ¿á|G¾¾- 5 1 600 spnK (SEQ ID NO 17) (571) CGCCCGÜX f|CGCATCCTG AGATCr: eliminación SAM#2 spnK (SEQ ID O 12) (571) C¾CC;CA sG ^GCAT^nT -cíAGATrr GT tG spnK (SEQ ID NO 17) (601) eliminación SAM#2 spnK (SEQ ID NO 12) (601) spnK (SEQ ID NO 17) (631) eliminación SAM#2 spnK (SEQ ID O 12) (631) spnK (SEQ ID NO 17) (661) eorCGXGXXCGGGAXGC. A?l«li eliminación SAM#2 spnK (SEQ ID NO 12) (661) lié C it T^TXCO ArSf 691 720 spnK ( SEQ ID NO 17) (691) T¿GGA< .A s r ci r ::CT GACOAGC eliminación SAM#2 spnK (SEQ ID NO 12) (691) ' . G\ :ÁA 5 CCTX CTCa¾GCAGCAGAGG 721 750 spnK (SEQ ID O 17) (721) .c GGTCGQGGCCSACCAG? eliminación SA #2 spnK (SEQ ID NO 12) (721) : ~- ¾o; C rGC-CG CGAGOiiG? iGCAAG 751 "' 780 spnK (SEQ ID NO 17) (751) ISIÜ A GC?dGCCGCX:'GTTGÁC( ¾1AI§ eliminación SA #2 spnK (SEQ ID O 12) (751) CC Ai JA ¾OTG CCGCOGITGAC¿ A AAG 78 "' 810 spnK (SEQ ID NO: 17) (781) TACGGACCGTTCGACATCATCATCGACGAT eliminación SA #2 spnK (SEQ ID NO: 12) (781) 811 840 spnK (SEQ ID NO: 17) (811) GGCAGCCACATCAACGGACACGTGCGCACA eliminación SA #2 spnK (SEQ ID NO: 12) (781) 841 870 spnK (SEQ ID NO: 17) (841) TCCCTGGAAACGCTGTTCCCCCGGTTGCGC eliminación SA #2 spnK (SEQ ID NO: 12) (781) spnK eliminación SAM#2 spnK spnK eliminación SAM#2 spnK spnK eliminación SAM#2 spnK spnK eliminación SAM#2 spnK spnK eliminación SAM#2 spnK spnK eliminación SAM#2 spnK spnK (SEQ ID NO 17) (1051) ?? . : G TCGWC ICCACAC¾'T¾GC Illil eliminación SAM#2 spnK (SEQ ID NO 12) (941) A\:r: GGTCGGC TCCACACCI¾GClililí 1081 ' 1110 spnK (SEQ ID NO 17) (1081) . " l G¾CC? GAG A CG p A *.CGCC eliminación SAM#2 spnK (SEQ ID NO 12) (971) ' G???G -GC ^A'.^ CGT' » .CGCC 1111 11 0 spnK (SEQ ID NO 17) (1111) C-^lCGTTCCt TTGGG-r^ C&ACG eliminación SAM#2 spnK (SEQ ID NO 12) (1001) ·'»; CGG G7 C IGC i-'XCGGTGC AACG 1141 1170 spnK (SEQ ID NO 17) (1141) f- AC ATÍ T?vTTG A <7 "GG eliminación SA #2 spnK (SEQ ID NO 12) (1031) .·\ . 1171 1194 ' spnK (SEQ ID NO 17) (1171) V. < C'ÁGCG GGAGGÁC AO7 CiA eliminación SA #2 spnK (SEQ ID NO 12) (1061) CAOCGCGGAQGACGAG íCA Conjugación del vector de eliminación spnK en Saccharopolyspora spinosa La conjugación de las células E. coli que llevan la construcción de eliminación en cuadro de spnK con Saccharopolyspora spinosa, se lleva a cabo de acuerdo con el método descrito en la publicación de Matsushima y asociados, (1994) y ejemplificado en el Ejemplo 2. Se seleccionan los transconjugados putativos resistentes a apramicina, debido a la presencia del marcador de gen de resistencia a apramicina en el esqueleto de vector de la construcción de eliminación en cuadro de spnK.

Confirmación de transconjugados y Amplificación de la región spnK para determinar el sitio de integración Se transfirió un transconjugado primario simple crecido en un medio R6 en placas de agar de Infusión de Cerebro Corazón (BHI) suplementado con 50 pg/mL de apramicina y 25 pg/mL de ácido nalidixico para confirmar el fenotipo de resistencia. Se inocularon las Mycelia de los transconjugados a partir de la placa BHI en un medio de Caldo de Soya Tríptico (TSB) suplementado con 50 pg/mL de apramicina. El cultivo se incubó a una temperatura de 29°C con agitación en 250 rpm durante 72 horas. Se recolectaron las Mycelia después de 72 horas de incubación y se aisló el ADN genómico. El PCR se llevó a cabo utilizando el ADN genómico aislado del transconjugado como una plantilla con cebadores designados para detectar el mutante de cruce simple. Se secuenciaron los resultados de amplificación PCR. Los datos de secuenciación indican que la construcción de eliminación en cuadro de spnK se integra en la región spnK mediante recombinación homóloga de cruce simple.

Aislamiento del mutante de eliminación en cuadro spnK de cruce doble Se inoculó un mutante de cruce simple resistente a apramicina en placas de agar BHI en la ausencia de apramicina y se incubó a una temperatura de 29°C durante 14 días. Las esporas son recolectadas de las placas de acuerdo con la publicación de Hopwood y asociados, (1985) y almacenadas en 20% de glicerol a una temperatura de -80°C. Las esporas son inoculadas en placas de agar BHI nuevas sin apramicina, y las placas son incubadas a una temperatura de 29°C durante 14 días. Este paso se repitió varias veces. La preparación de esporas se diluyó utilizando 20% de glicerol y las esporas diluidas se revistieron en placas de agar BHI. Las placas se incubaron a una temperatura de 29°C durante 10 días para el desarrollo de colonia simple. Las colonias individuales se parcharon en placas de agar BHI nuevas con y sin apramicina. Todas las placas se incubaron a una temperatura de 29°C durante 10 días para el desarrollo micelial. Las colonias que no crecen en placas de agar BHI que contienen 50 Mg/mL de apramicina fueron identificadas como candidatos de mutantes de cruce doble y se seleccionan para validación utilizando PCR.

Identificación v validación de mutantes de cruce doble Se confirmaron los mutantes de cruce doble mediante PCR. Los cebadores que son designados para enlazar dentro del gen spnK, son utilizados para amplificación PCR. Los tamaños de los productos PCR son determinados mediante electroforesis de gel de agarosa. Los mutantes de cruce doble los cuales dan como resultado una eliminación del segundo dominio de metiltransferasa dependiente de S-adenosilmetionina putativo dentro del gen spnK, son identificados y seleccionados con base en el tamaño del producto PCR. El tamaño y la secuencia de ADN del fragmento PCR, indica la eliminación del segundo dominio de metiltransferasa dependiente de S-adenosilmetionina putativo dentro del gen spnK.

Producción de spinosyn mediante fermentación de frasco de agitación Se puede llevar a cabo la fermentación del mutante de cruce doble bajo las condiciones descritas por Burns y asociados, (WO 2003070908). El análisis del caldo de fermentación con respecto a la presencia de los factores de spinosyn se puede llevar a cabo bajo las condiciones descritas por Baltz y asociados, (Patente Norteamericana No. 6,143,526). La fermentación del mutante de cruce doble produce spinosyn J y L.

Eiemplo 6.4 Construcción del vector de eliminación de extremo 3' de spnK Dos fragmentos de ADN son amplificados mediante PCR utilizando el ADN genómico de una cepa que produce spinosyn A y D (Hopwood y asociados, 1985). El primer fragmento amplificado tiene aproximadamente 1,500 pb de longitud, y se localiza directamente en la corriente ascendente del par base 1141 de spnK. El segundo fragmento amplificado tiene aproximadamente 1,500 pb de longitud, y se localiza directamente en la corriente descendente del codón de terminación spnK e incluye una porción de spnL. Las amplificaciones PCR se completan utilizando métodos conocidos para los expertos en la técnica. Los cebadores de oligonucleótido son sintetizados para incorporar las secuencias de enlace de enzima de restricción. Los productos PCR resultantes son digeridos con enzimas de restricción que disocian las secuencias de enlace incorporadas por los cebadores. Los fragmentos son ligados juntos y posteriormente ligados en sitios de restricción correspondiente del plásmido pOJ260. El producto de ligadura resultante es clonado en células competentes E. coli. Las colonias son seleccionadas y clasificadas para el producto de ligadura deseado mediante digestión de enzima de restricción y análisis de secuencia de ADN. Se identifican clones positivos y se utiliza un clon seleccionado para eliminación subsecuente del extremo 3' de spnK dentro de Saccharopolyspora spinosa. La secuencia resultante del fragmento de gen spnK eliminado dentro del plásmido pOJ260, se presenta en la Tabla 6. Por consiguiente, una eliminación spnK puede incluir la secuencia: SEQ ID No: 13.

Tabla 6: Alineación de secuencia de nucleótido del extremo 3' eliminado del gen Sank eliminación de extremo 3' spnK (SEQ ID NO: 13) seq descendente y spnK (SEQ ID NO: 15) eliminación de extremo 3' spnK (SEQ ID NO: 13) seq descendente y spnK (SEQ ID NO: 15) eliminación de extremo 3' spnK (SEQ ID NO: :13) seq descendente y spnK (SEQ ID NO: :15) eliminación de extremo 3' spnK (SEQ ID NO: :13) seq descendente y spnK (SEQ ID NO: :15) eliminación de extremo 3' spnK (SEQ ID NO: 13) (101) seq descendente y spnK (SEQ ID NO: 15) (101) eliminación de extremo 3' spnK (SEQ ID NO: 13) (126) seq descendente y spnK (SEQ ID NO: 15) (126) eliminación de extremo 3' spnK (SEQ ID NO: 13) (151) seq descendente y spnK (SEQ ID NO: 15) (151) eliminación de extremo 3' spnK (SEQ ID NO: 13) (176) seq descendente y spnK (SEQ ID NO: 15) (?6) eliminación de extremo 3' spnK (SEQ ID NO: 13) (201) seq descendente y spnK (SEQ ID NO: 15) (201) eliminación de extremo 3' spnK (SEQ ID NO: 13) (226) CXÁ^ASTCGGGXGÁGCXGA XC¾G seq descendente y spnK (SEQ ID NO: 15) (226) CXACAGTCCGGXGAGCT'GA XGÁAG-G 251 275 eliminación de extremo 3' spnK (SEQ ID NO: 13) (251) GCG>:GCAACGACCGGXCGG ^G¾C;GX seq descendente y spnK (SEQ ID NO: 15) (251) CCf3?GCAAG;1i-¾C.CGG'rCCIO -ÍGACGX 276 300 eliminación de extremo 3' spnK (SEQ ID NO 13) (276) C¾ GGTG(;Sí3¾TCGG'X ftC GAGCXC seq descendente y spnK (SEQ ID NO 15) (276) ¿GCGe GcaGarcGGx AG l AOC G 301 325 eliminación de extremo 3' spnK (SEQ ID NO 13) (301) :¾CC¾¾TCTCMCGCCG¾GT TGTTC seq descendente y spnK ( SEQ ID NO 15) (301) Gr:jc.raA- T ?·,·;?G-¾3? ~ 5TTCG 326 350 eliminación de extremo 3' spnK (SEQ ID NO 13) (326) O'JTCGG seq descendente y spnK (SEQ ID NO 15) (326) GCCCAGGAGCTCCC'AGVGGC 351 375 eliminación de extremo 3' spnK (SEQ ID NO 13) (351) OGCGCGGAGOAC CAAOTTC GTCG A seq descendente y spnK (SEQ ID NO 15) (351) {; ctcGGA ;;;¾ cA<<::'fV: G B¾ 376 400 eliminación de extremo 3' spnK (SEQ ID NO 13) (376) ÍYCC A' C AC A í GC GGT T "G>> •JACGCG seq descendente y spnK (SEQ I NO 15) (376) ¾GLAG0 C?rrCC3STT;;GA¾eí¾CG 401 425 eliminación de extremo 3' spnK (SEQ ID NO 13) (401) G¾CGÍ CGG&AG T3TCGGA seq descendente y spnK (SEQ ID NO 15) (401) GXGC G'X'CG Ci&AC T t G A XGG ? X 426 450 eliminación de extremo 3' spnK (SEQ ID NO 13) (426) CrAf»GGCArrTrCGCA3T)3 r;~CGCG seq descendente y spnK (SEQ ID NO 15) (426) G ^GCGA^%GQG¾M3¥G 451 75 eliminación de extremo 3' spnK (SEQ ID NO 13) (451) •3GGIGGGGGC&CC¿¾C3TG GcGÁcc seq descendente y spnK (SEQ ID NO 15) (451) GG XGGGGGCAGCGACGTG G¾¾2 500 eliminación de extremo 3' spnK (SEQ ID NO: 13) (476) TC^¾ACTTk; cGcr~icc:cA CTAC G seq descendente y spnK (SEQ ID NO: 15) (476) TGAACTTGGTOG OTCCCA 501 525 eliminación de extremo 3' spnK (SEQ ID NO 13) (501) CACOGAGAAGTCOGGCGQC C?íGGAC seq descendente y spnK (SEQ ID NO 15) (501) GKCOGKGAÁGTOGGGCG 526 550 eliminación de extremo 3' spnK (SEQ ID NO 13) (526) X¾ ¾ IGÁCCCCGCXÁXA G AGOGAG seq descendente y spnK (SEQ ID NO 15) (526) ¾GG¾ÍG¾GCCGGCXATaCG AGCGAG 551 575 eliminación de extremo 3' spnK (SEQ ID NO 13) (551) ACCÍT GPC JVG THC A TGGCCG seq descendente y spnK ( SEQ ID NO 15) (551) ACO G? GGC GAG X TGCG TGS XGG¿¿¿ 576 600 eliminación de extremo 3' spnK ( SEQ ID NO 13) (576) GU ¾0: GA¿ \C ;AGATG ¾¾¾??? seq descendente y spnK (SEQ ID NO 15) (576) G ^X^O C i*CC ;O GAX;.C OG'JGXC 601 625 eliminación de extremo 3' spnK ( SEQ ID NO: 13) (601) seq descendente y spnK (SEQ ID NO: 15) (601) eliminación de extremo 3' spnK (SEQ ID NO: 13) (626) seq descendente y spnK (SEQ ID NO: 15) (626) eliminación de extremo 3' spnK (SEQ ID NO 13) (651) seq descendente y spnK (SEQ ID NO 15) (651) eliminación de extremo 3' spnK (SEQ ID NO: 13) (676) seq descendente y spnK (SEQ ID NO 15) (676) eliminación de extremo 3' spnK ( SEQ ID NO 13) (701) ¾n cc:xcr¾c ñGí ;AGA « GT seq descendente y spnK (SEQ ID NO 15) (701) ¾¾A |||| 726 750 eliminación de extremo 3' spnK (SEQ ID NO 13) (726) seq descendente y spnK (SEQ ID NO 15) (726) Cl¾:< GTCCGCGé i:¾ ¾CCA ¿GC'L¾G 751 775 eliminación de extremo 3' spnK (SEQ ID NO 13) (751) CCC ftvGAGCTOaSji ;GCGGXTG¾.G¾ seq descendente y spnK (SEQ ID NO 15) (751) GGC AGGAGCTGGCÍ 776 800 eliminación de extremo 3' spnK (SEQ ID NO 13) (776) AC&AGXAG3SACCG seq descendente y spnK (SEQ ID NO 15) (776) AC¾GTA<:GGAC;CG' s ol 825 eliminación de extremo 3' spnK (SEQ ID NO 13) (801) ¾CACATOA¾C seq descendente y spnK (SEQ ID NO 15) (801) CAXGGKÓG?.TGGCA ¾Í¾ ¾¾¾Í 826 850 eliminación de extremo 3' spnK (SEQ ID NO 13) (826) M^CGt CGC i \TG ;G¾SÍ seq descendente y spnK (SEQ ID NO 15) (826) GGACACCXGGGOAC Vf.CCC.T.GC:Aí>A 851 875 eliminación de extremo 3' spnK (SEQ ID NO 13) (851) |¾|Glí¾G£ ¾S seq descendente y spnK (SEQ ID NO 15) (851) OGCTGTTCC CCGGrXGqG¾ GG G 876 900 eliminación de extremo 3' spnK (SEQ ID NO 13) (876) ¿GGCGXATACGTGArcGA¾G¾i:c ¾ seq descendente y spnK (SEQ ID NO 15) (876) ¾ÍGG£SmmCGT &rCOAGGA'V TG 901 925 eliminación de extremo 3' spnK (SEQ ID NO 13) (901) XGGlV' ACC AT C ¾ GGS¾GG seq descendente y spnK (SEQ ID NO 15) (901) XGGÁOGACCXAXGC rCGC; GATTCG 926 950 eliminación de extremo 3' spnK (SEQ ID NO 13) (926) C^GCGCACGGCOAG J.GCCCGOCGGC seq descendente y spnK (SEQ ID NO 15) (926) Qd¾GGÁG¾GGCÁ i'GGC GGGGGC 951 ' 975 eliminación de extremo 3' spnK (SEQ ID NO 13) (951) ACC cr Cí: xrc?:>: ;t (¾c seq descendente y spnK (SEQ ID NO 15) (951) ACCCGGGACC'ACGGXCAGCCTGCX 976 1000 eliminación de extremo 3' spnK (SEQ ID NO 13) (976) ¿J.GAACGTGTTGGA ¾G Í;GÍSf seq descendente y spnK (SEQ ID NO 15) (976) AAGÁASCIGIXGGAAGGGGrTCAGG eliminación de extremo 3' spnK (SEQ ID NO 13) (1001) seq descendente y spnK ( SEQ ID NO 15) (1001) eliminación de extremo 3' spnK (SEQ ID NO 13) (1026) seq descendente y spnK (SEQ ID NO 15) (1026) eliminación de extremo 3' spnK (SEQ ID NO 13) (1051) seq descendente y spnK (SEQ ID NO 15) (1051) eliminación de extremo 3' spnK (SEQ ID NO 13) (1076) seq descendente y spnK (SEQ ID NO 15) (1076) eliminación de extremo 3' spnK (SEQ ID NO 13) (1082) seq descendente y spnK (SEQ ID NO: 15) (1101) eliminación de extremo 3' spnK (SEQ ID NO: 13) (1082) seq descendente y spnK (SEQ ID NO: 15) (1126) eliminación de extremo 3' spnK (SEQ ID NO: 13) (1082) seq descendente y spnK (SEQ ID NO::15) (1151) eliminación de extremo 3' spnK (SEQ ID NO: :13) (1082) seq descendente y spnK (SEQ ID NO::15) (1176) eliminación de extremo 3' spnK (SEQ ID NO: :13) (1087) seq descendente y spnK (SEQ ID NO::15) (1201) eliminación de extremo 3' spnK (SEQ ID NO: 13) (1112) seq descendente y spnK (SEQ ID NO: 15) (1226) Conjugación del vector de eliminación spnK en Saccharopolyspora spinosa La conjugación de las células E. coli que llevan la construcción de eliminación del extremo 3' spnK con Saccharopolyspora spinosa, se lleva a cabo de acuerdo con el método descrito en la publicación de Matsushima y asociados, (1994) y ejemplificado en el Ejemplo 2. Se seleccionan los transconjugados putativos resistentes a apramicina, debido a la presencia del marcador del gen de resistencia de apramicina en el esqueleto de vector de la construcción de eliminación del extremo 3' de spnK.

Confirmación de transconjugados y Amplificación de la región spnK para determinar el sito de integración Se transfirió un transconjugado primario simple crecido en un medio R6 en placas de agar de Infusión de Corazón Cerebro (BHI) suplementado con 50 pg/mL de apramicina y 25 pg/mL de ácido nalidíxico para confirmar el fenotipo de resistencia. Se inocularon las Mycelia de los transconjugados a partir de la placa BHI en un medio de Caldo de Soya Tríptico (TSB) suplementado con 50 g/mL de apramicina. El cultivo se incubó a una temperatura de 29°C con agitación en 250 rpm durante 72 horas. Se recolectaron las Mycelia después de 72 horas de incubación y se aisló el ADN genómico. El PCR se llevó a cabo utilizando el ADN genómico aislado del transconjugado como una plantilla con cebadores designados para detectar el muíante de cruce simple. Se secuenciaron los resultados de amplificación PCR. Los datos de secuenciación indican que la construcción de eliminación del extremo 3' spnK se integra en la región spnKL mediante recombinación homologa de cruce simple.

Aislamiento de muíante de eliminación de extremo 3' spnK de cruce doble Se inoculó un muíante de cruce simple resistente a apramicina en placas de agar BHI en la ausencia de apramicina y se incubaron a una temperatura de 29°C durante 14 días. Se recolectaron las esporas de las placas de acuerdo con la publicación de Hopwood y asociados, (1985) y se almacenaron en 20% de glicerol a una temperatura de -80°C. Las esporas se inocularon en placas de agar BHI nuevas sin apramicina y las placas se incubaron a una temperatura de 29°C durante 14 días. Este paso se repitió varias veces. La preparación de esporas se diluyó utilizando 20% de glicerol y las esporas diluidas se revistieron sobre placas de agar BHI. Las placas se incubaron a una temperatura de 29°C durante 10 días para el desarrollo de colonia simple. Las colonias individuales se parcharon sobre placas de agar BHI nuevas con y sin apramicina. Todas las placas se incubaron a una temperatura de 29°C durante 10 días para el desarrollo micelial. Las colonias que no crecen en placas de agar BHI que contienen 50 Mg/mL de apramicina, fueron identificadas como candidatos de mutantes de cruce doble y se seleccionan para validación utilizando PCR.

Identificación y validación de mutantes de cruce doble Se confirmaron mutantes de cruce doble mediante PCR. Los cebadores que son designados para enlazar dentro de los genes spnK y spnL se utilizaron para amplificación PCR. Los tamaños de los productos PCR son determinados mediante electroforesis de gel de agarosa. Los mutantes de cruce doble que dan como resultado una eliminación del extremo 3' del gen spnK, son identificados y seleccionados con base en el tamaño del producto PCR. El tamaño y la secuencia de ADN del fragmento PCR indican la eliminación del extremo 3' del gen spnK.

Producción de SDinosvn mediante fermentación de frasco de agitación La fermentación del mutante de cruce doble se puede llevar a cabo bajo las condiciones descritas por Burns y asociados, (WO 2003070908). El análisis del caldo de fermentación con respecto a la presencia de factores de spinosyn se puede llevar a cabo bajo las condiciones descritas por Baltz y asociados, (Patente Norteamericana No. 6,143,526). La fermentación del mutante de cruce doble produce spinosyn J y L.

Todas las patentes y publicaciones referenciadas están incorporadas en su totalidad a la presente invención como referencia. Lo anterior es ilustrativo de la presente invención, y no será construido como una limitante de la misma. La presente invención se define a través de las siguientes reivindicaciones, con los equivalentes de las reivindicaciones incluidos en las mismas.

Claims (20)

REIVINDICACIONES

1. Un proceso para convertir una cepa que produce spinosad, en una cepa que produce spinetoram, en donde el proceso comprende producir una modificación en el gen spnK para eliminar la actividad de 3'-0-metiltransferasa.

2. El proceso tal como se describe en la reivindicación 1, caracterizado porque la modificación se selecciona del grupo que consiste en una eliminación en cuadro, una mutación de punta, una eliminación y una inserción.

3. El proceso tal como se describe en la reivindicación 2, caracterizado porque la eliminación en cuadro se selecciona del grupo que consiste en una eliminación en cuadro de un extremo 5', una eliminación en cuadro de un extremo 3', y una eliminación en cuadro de una región de codificación spnK.

4. El proceso tal como se describe en la reivindicación 2, caracterizado porque la eliminación es una eliminación de base de nucleótido simple o múltiple que interrumpe el cuadro de lectura normal del gen spnK.

5. El proceso tal como se describe en la reivindicación 2, caracterizado porque la inserción es una inserción de base de nucleótido simple o múltiple que interrumpe el cuadro de lectura normal del gen spnK.

6. El proceso tal como se describe en la reivindicación 2, caracterizado porque la mutación de punta da como resultando una substitución de un aminoácido en el sitio activo o sitio de unión de substrato del gen spnK.

7. El proceso tal como se describe en la reivindicación 2, caracterizado porque la mutación de punta ocurre en la ubicación de par base seleccionado del grupo que consiste en la ubicación 528, 589, 602, 668, 721, 794, 862, 895, 908, 937 y 1131.

8. El proceso tal como se describe en la reivindicación 2, caracterizado porque la mutación de punta resulta de la mutagénesis química.

9. El proceso tal como se describe en la reivindicación 1, caracterizado porque el gen spnK es deshabilitado a través del uso de tecnología antisentido.

10. El proceso tal como se describe en la reivindicación 1, caracterizado porque la modificación ocurre dentro de la región de codificación spnK.

11. Una célula huésped genéticamente modificada que produce un precursor de spinetoram, en donde la célula huésped genéticamente modificada es una célula huésped procariótica, que no produce normalmente una cantidad significativa del precursor de spinetoram, que comprende producir una modificación en el gen spnK para eliminar la actividad de 3'-0-metiltransferasa.

12. Un método para convertir una cepa que produce spinosad a una cepa que produce un precursor de spinetoram, en donde el método comprende deshabilitar un gen spnK manteniendo al mismo tiempo la producción de spinosyn J y L.

13. El método tal como se describe en la reivindicación 12, caracterizado porque la deshabilitación del gen spnK se selecciona del grupo que consiste en una eliminación en cuadro, una mutación de punta, una eliminación-inserción.

14. El método tal como se describe en la reivindicación 12, caracterizado porque la deshabilitación del gen spnK es originada por manipulación de un sitio de unión de ribosoma.

15. El método tal como se describe en la reivindicación 14, caracterizado porque el sitio de unión de ribosoma es una secuencia spnK Shine-Dalgarno.

16. El método tal como se describe en la reivindicación 12, caracterizado porque la deshabilitación del gen spnK es originada por la manipulación de un promotor de un gen spnK.

17. El método tal como se describe en la reivindicación 16, caracterizado porque el promotor se co-transcribe con un promotor spnJ.

18. El método tal como se describe en la reivindicación 13, caracterizado porque la eliminación en cuadro se selecciona del grupo que consiste en una eliminación en cuadro de un extremo 5', una eliminación en cuadro de un extremo 3' y una eliminación en cuadro de una región de codificación spnK.

19. El método tal como se describe en la reivindicación 13, caracterizado porque la eliminación es una eliminación de base de nucleótido simple o múltiple que interrumpe el cuadro de lectura normal del gen spnK.

20. El método tal como se describe en la reivindicación 13, caracterizado porque la mutación de punta da como resultado una substitución de aminoácido en el sitio activo o el sitio de unión de substrato del gen spnK.