JP4258575B2 - 新規ａ８３５４３化合物及びそれらの製造法 - Google Patents
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Description
発明の分野
本発明は発酵生成物Ａ８３５４３の新規成分に関する。
発明の背景
標的昆虫は現在利用できる殺虫剤に対する耐性を急速に発現しつつある。節足動物における殺虫剤に対する耐性は広範囲であり、少なくとも４００の種が１つ又はそれ以上の殺虫剤に対する耐性を示す。ＤＤＴ、カルバメート類及び有機リン酸塩類などの比較的古い殺虫剤に対する耐性の発現は十分に文献により証明されている（Ｂｒａｔｔｓｔｅｎ，ｅｔ ａｌ．（１９８６），Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３１：１２５５を参照）。比較的新しいピレスロイド殺虫剤に対する耐性の発現を含む合成殺虫剤に対する耐性は非常に急速に発現した（Ｐｉｃｋｅｔｔ（１９８８），Ｃｈｅｍ．Ｂｒｉｔａｉｎ，１３７を参照）。従って新規な殺虫剤が求められている。
サッカロポリスポラ・スピノサ（Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ ｓｐｉｎｏｓａ）により製造される関連化合物の一群である発酵生成物Ａ８３５４３は近年発見され、優れた殺虫活性を示すことが示された。Ａ８３５４３及びその個々の化合物はダニ及び昆虫、特に鱗翅類（Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ）及び双翅類（Ｄｉｐｔｅｒａ）の抑制に有用である。
“Ａ８３５４３化合物”は１２−員大環状ラクトン、中性糖及びアミノ糖に縮合した５，６，５−三環系から成る成分を意味する（Ｋｉｒｓｔ ｅｔ ａｌ．（１９９１），Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ，３２：４８３９を参照）。Ａ８３５４３の天然成分の群はＥＰＯ出願番号０３７５３１６に記載され、以下の一般式：
［式中、
Ｒ1はＨ又は
から選ばれる基であり、
Ｒ2、Ｒ4、Ｒ3、Ｒ5及びＲ6は水素又はメチルである］
を有する種類、あるいはＲ1が水素以外である場合のそれらの酸付加塩を含む。
Ａ８３５４３発酵産物からの化合物の群は、各成分Ａ８３５４３Ａ、Ａ８３５４３Ｂ、Ａ８３５４３Ｃ、Ａ８３５４３Ｄ、Ａ８３５４３Ｅ、Ａ８３５４３Ｆ、Ａ８３５４３Ｇ Ａ８３５４３Ｈ及びＡ８３５４３Ｊ（ヨーロッパ特許公開番号０ ３７５ ３１６を参照）；各成分Ａ８３５４３Ｌ、Ａ８３５４３Ｍ及びＡ８３５４３Ｎ（１９９３年４月１３日発行の米国特許番号５，２０２，２４２を参照）；ならびに各成分Ａ８３５４３Ｑ、Ａ８３５４３Ｒ、Ａ８３５４３Ｓ及びＡ８３５４３Ｔ（１９９２年１１月６日出願の“Ｎｅｗ Ａ８３５４３ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｔｈｅｒｅｏｆ”という標題のＴｕｒｎｅｒ，Ｂｒｏｕｇｔｏｎ，Ｈｕｂｅｒ ａｎｄ Ｍｙｎｄｅｒｓｅの同時係属米国特許出願（米国特許出願番号０７／９７３，１２１）を参照）を含むことが示された。これらの各成分及びそれらから誘導されるシュードアグリコンの構造を下記に示す。
式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5及びＲ6は各成分に関して以下の通りである：
微生物起源の抗生物質であるシネフンジン（Ｓｉｎｅｆｕｎｇｉｎ）は特異的Ｓ−アデノシルメチオニン−依存性メチルトランスフェラーゼを阻害することが示された。この化合物は以下の哺乳類メチルトランスフェラーゼの阻害に有効である：ノルエピネフリン Ｎ−メチルトランスフェラーゼ、ヒスタミン Ｎ−メチルトランスフェラーゼ及びカテコール Ｏ−メチルトランスフェラーゼ（Ｆｕｌｌｅｒ ａｎｄ Ｎａｇａｒａｊａｎ（１９７８），Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，２７：１９８１を参照）。シネフンジンはストレプトミセス・アベルミチリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｖｅｒｍｉｔｔｉｌｉｓ）のアベルメクチン−製造株におけるＳ−アデノシル−メチオニン−依存性Ｏ−メチルトランスフェラーゼの阻害にも有効である（Ｓｃｈｕｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．（１９８５），Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ，３８：１４９４を参照）。さらに近年、シネフンジンはストレプトミセス・フラジアエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｆｒａｄｉａｅ）におけるＳ−アデノシルメチオニン−依存性Ｏ−メチルトランスフェラーゼ（マクロシン Ｏ−メチルトランスフェラーゼ）の阻害に有効であることが報告された（Ｋｒｅｕｚｍａｎ，ｅｔ ａｌ．（１９８８），Ｊ．Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２６３：１５６２６を参照）。Ｓ．スピノサの株においてＯ−メチルトランスフェラーゼを阻害するためのシネフンジンの利用法を本明細書において開示する。
発明の概要
本発明はＡ８３５４３化合物群の新規な種類を目的とし、該種類は式１
［式中、Ｒ7は水素又は式
の基であり、
Ｒ8、Ｒ9、Ｒ10、Ｒ11及びＲ12は独立して水素又はメチルであり、
但しＲ11及びＲ12は同時に水素であることはない］
の化合物又はＲ7が水素以外である場合のそれらの酸付加塩を含む。
特に本発明は発酵生成物Ａ８３５４３の新規な成分に関する。式２化合物と命名される新規な成分は以下の一般式：
［式中、
Ｒ13は式
の基であり、
Ｒ14、Ｒ15、Ｒ16、Ｒ17及びＲ18は独立して水素又はメチルであり、
但し、Ｒ17及びＲ18は同時に水素であることはない］
を有し、あるいはＲ1が水素以外の場合のそれらの酸付加塩である。
好ましくは本発明はＡ８３５４３Ｋ、Ａ８３５４３Ｏ、Ａ８３５４３Ｐ、Ａ８３５４３Ｕ、Ａ８３５４３Ｖ、Ａ８３５４３Ｗ及びＡ８３５４３Ｙと称される式２成分である新規なＡ８３５４３成分に関し、各成分に関するＲ13、Ｒ14、Ｒ15、Ｒ16、Ｒ17及びＲ18は以下の通りである：
本発明の別の側面は、株ＮＲＲＬ １８３９５（Ａ８３５４３．１）、ＮＲＲＬ １８５４３（Ａ８３５４３．３）、ＮＲＲＬ １８５３８（Ａ８３５４３．４）、ＮＲＲＬ １８５３９（Ａ８３５４３．５）、ＮＲＲＬ １８７１９（Ａ８３５４３．６）及びＮＲＲＬ １８８２３（Ａ８３５４３．９）から選ばれるＳ．スピノサの株、あるいはそれらの式１−生産性突然変異株を、約５０μｇ／ｍｌ〜約２００μｇ／ｍｌのシネフンジンを含む適した培地において、深部好気的条件下で、回収可能な量の式１の化合物が生産されるまで培養することを含む式１の化合物の製造法である。式１化合物は発酵ブロスから、及び菌糸体から極性有機溶媒を用いて抽出される。化合物はカラムクロマトグラフィーなどの当該技術分野において周知の方法によりさらに精製することができる。
本発明のさらに別の側面は、Ｓ．スピノサ株ＮＲＲＬ １８７４３（Ａ８３５４３．８）又はそれらのＡ８３５４３Ｋ−生産性突然変異株を適した培地中で、深部好気的発酵条件下において回収可能な量の式１の化合物が生産されるまで培養することを含む式１の化合物の製造法である。式１の化合物は本明細書に記載の通りに単離し、精製することができる。
株ＮＲＲＬ １８７４３は新規に発見された株なので、本発明はさらにこの微生物の生物学的に精製された培養物も提供する。
式２の化合物はダニ及び昆虫、特に鱗翅類、同翅類及び双翅類の抑制に有用である。従って殺虫及び殺ダニ性組成物、ならびにこれらの化合物を用いた昆虫及びダニの個体群を減少させる方法も本発明の一部である。
図面の説明
図１はＫＢｒ中におけるＡ８３５４３Ｋの赤外吸収スペクトルを示す。
図２はアセトン−ｄ6中におけるＡ８３５４３Ｋのプロトン核磁気共鳴スペクトルを示す。
図３はＥｔＯＨ中におけるＡ８３５４３ＫのＵＶスペクトルを示す。
図４はＫＢｒ中におけるＡ８３５４３Ｏの赤外吸収スペクトルを示す。
図５はアセトン−ｄ6中におけるＡ８３５４３Ｏのプロトン核磁気共鳴スペクトルを示す。
図６はＥｔＯＨ中におけるＡ８３５４３ＯのＵＶスペクトルを示す。
図７はＫＢｒ中におけるＡ８３５４３Ｐの赤外吸収スペクトルを示す。
図８はアセトン−ｄ6中におけるＡ８３５４３Ｐのプロトン核磁気共鳴スペクトルを示す。
図９はＥｔＯＨ中におけるＡ８３５４３ＰのＵＶスペクトルを示す。
図１０はＫＢｒ中におけるＡ８３５４３Ｕの赤外吸収スペクトルを示す。
図１１はアセトン−ｄ6中におけるＡ８３５４３Ｕのプロトン核磁気共鳴スペクトルを示す。
図１２はＥｔＯＨ中におけるＡ８３５４３ＵのＵＶスペクトルを示す。
図１３はＫＢｒ中におけるＡ８３５４３Ｖの赤外吸収スペクトルを示す。
図１４はアセトン−ｄ6中におけるＡ８３５４３Ｖのプロトン核磁気共鳴スペクトルを示す。
図１５はＥｔＯＨ中におけるＡ８３５４３ＶのＵＶスペクトルを示す。
図１６はＫＢｒ中におけるＡ８３５４３Ｗの赤外吸収スペクトルを示す。
図１７はアセトン−ｄ6中におけるＡ８３５４３Ｗのプロトン核磁気共鳴スペクトルを示す。
図１８はＥｔＯＨ中におけるＡ８３５４３ＶのＵＶスペクトルを示す。
図１９はＫＢｒ中におけるＡ８３５４３Ｙの赤外吸収スペクトルを示す。
図２０はアセトン−ｄ6中におけるＡ８３５４３Ｙのプロトン核磁気共鳴スペクトルを示す。
図２１はＥｔＯＨ中におけるＡ８３５４３ＶのＵＶスペクトルを示す。
図２２は株ａ８３５４３．１、Ａ８３５４３．３、Ａ８３５４３．４、Ａ８３５４３．５、Ａ８３５４３．６、Ａ８３５４３．７、Ａ８３５４３．８及びＡ８３５４３．９に関する脂肪酸分析の主成分プロットを示す。
ここで、Ｒ7は水素又は式
の基であり、
Ｒ8、Ｒ9、Ｒ10、Ｒ11及びＲ12は独立して水素又はメチルであり、但しＲ11及びＲ12は同時に水素であることはなく、あるいはＲ7が水素以外の場合のそれらの酸付加塩となる。
本発明の好ましい側面はＲ8及びＲ10がメチルである式１化合物である。本発明のより好ましい側面はＲ8及びＲ10がメチルであり、Ｒ7が式
の基である式１化合物である。
本発明の別の側面は発酵生成物Ａ８３５４３の新規な成分である。式２化合物と命名されるこれらの新規なＡ８３５４３成分は以下の化学構造：
［式中、Ｒ13は式
の基であり、
Ｒ14、Ｒ15、Ｒ16、Ｒ17及びＲ18は独立して水素又はメチルであり、但しＲ17及びＲ18は同時に水素であることはない］
を有するか、あるいはＲ13が水素以外の場合のそれらの酸付加塩である。
本発明のより好ましい側面はＲ14がＣＨ3であり、Ｒ13が式
の基である式２化合物である。
好ましくは本発明はＡ８３５４３Ｋ、Ａ８３５４３Ｏ、Ａ８３５４３Ｐ、Ａ８３５４３Ｕ、Ａ８３５４３Ｖ、Ａ８３５４３Ｗ及びＡ８３５４３Ｙと称される式２化合物である新規なＡ８３５４３成分に関し、ここで各新規成分に関するＲ13、Ｒ14、Ｒ15、Ｒ16、Ｒ17及びＲ18はそれぞれ以下の通りである：
これらの新規成分の化学構造は、質量分析、赤外分光学（ＩＲ）、核磁気共鳴分光学（ＮＭＲ）及び紫外分光学（ＵＶ）を含む分光測定により、ならびにＡ８３５４３成分に対する比較により決定した（Ｋｉｒｓｔ ｅｔ ａｌ．（１９９１），同上を参照）。次章は成分Ａ８３５４３Ｋ、Ａ８３５４３Ｏ、Ａ８３５４３Ｐ、Ａ８３５４３Ｕ、Ａ８３５４３Ｖ、Ａ８３５４３Ｗ及びＡ８３５４３Ｙの物理的及びスペクトル的性質を記載する。
読者の便利のために、Ａ８３５４３Ｋの以下の図は下記に示すＡ８３５４３天然因子（ｎａｔｕｒａｌ ｆａｃｔｏｒｓ）に関するすべてのＮＭＲスペクトルデータの位置指定を与える：
Ａ８３５４３Ｋ：
Ａ８３５４３Ｋは以下の特性を有する：
分子量：７１７
実験式：Ｃ40Ｈ63ＮＯ10
ＵＶ（ＥｔＯＨ）：２４３ｎｍ（ε＝１０，６５７）
ＭＳ（ＦＡＢ）：（Ｍ＋Ｈ）ｍ／ｚ ７１８
ＩＲ（ＫＢＲ）：図１を参照。
表Ｉは図２に示されるＡ８３５４３Ｋに関する1Ｈ及び13Ｃ ＮＭＲスペクトルデータ（アセトン−ｄ6中）をまとめたものである。
Ａ８３５４３Ｏは以下の特性を有する：
分子量：７３１
実験式：Ｃ41Ｈ65ＮＯ10
ＵＶ（ＥｔＯＨ）：２４３ｎｍ（ε＝９，２６７）
ＭＳ（ＦＡＢ）：（Ｍ＋）ｍ／ｚ ７３１
ＩＲ（ＫＢＲ）：図３を参照。
表ＩＩは図４に示されるＡ８３５４３Ｏに関する1Ｈ及び13Ｃ核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクトルデータ（アセトン−ｄ6中）をまとめたものである。
Ａ８３５４３Ｐは以下の特性を有する：
分子量：７０３
実験式：Ｃ39Ｈ61ＮＯ10
ＵＶ（ＥｔＯＨ）：２４３ｎｍ（ε＝１３，７６０）
ＭＳ（ＦＡＢ）：（Ｍ＋Ｈ）ｍ／ｚ ７０４
ＩＲ（ＫＢＲ）：図５を参照。
表ＩＩＩは図６に示されるＡ８３５４３Ｐに関する1Ｈ及び13Ｃ核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクトルデータ（アセトン−ｄ6中）をまとめたものである。
Ａ８３５４３Ｕ：
Ａ８３５４３Ｕは以下の特性を有する：
分子量：７０３
実験式：Ｃ39Ｈ61ＮＯ10
ＵＶ（ＥｔＯＨ）：２４２ｎｍ（ε＝１７，０９５）
ＭＳ（ＦＡＢ）：（Ｍ＋Ｈ）ｍ／ｚ ７０４
ＩＲ（ＫＢＲ）：図７を参照。
表ＩＶは図８に示されるＡ８３５４３Ｕに関する1Ｈ及び13Ｃ核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクトルデータ（アセトン−ｄ6中）をまとめたものである。
Ａ８３５４３Ｖ：
Ａ８３５４３Ｖは以下の特性を有する：
分子量：７１７
実験式：Ｃ40Ｈ63ＮＯ10
ＵＶ（ＥｔＯＨ）：２４２ｎｍ（ε＝１０，１４０）
ＭＳ（ＦＡＢ）：（Ｍ＋Ｈ）ｍ／ｚ ７１８
ＩＲ（ＫＢＲ）：図９を参照。
表Ｖは図１０に示されるＡ８３５４３Ｖに関する1Ｈ及び13Ｃ核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクトルデータ（アセトン−ｄ6中）をまとめたものである。
Ａ８３５４３Ｗ：
Ａ８３５４３Ｗは以下の特性を有する：
分子量：７１７
実験式：Ｃ40Ｈ63ＮＯ10
ＵＶ（ＥｔＯＨ）：２４４ｎｍ（ε＝１０，２５４）
ＭＳ（ＦＡＢ）：（Ｍ＋Ｈ）ｍ／ｚ ７１８
ＩＲ（ＫＢＲ）：図１１を参照。
表ＶＩは図１２に示されるＡ８３５４３Ｗに関する1Ｈ及び13Ｃ核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクトルデータ（アセトン−ｄ6中）をまとめたものである。
Ａ８３５４３Ｙは以下の特性を有する：
分子量：７０３
実験式：Ｃ39Ｈ61ＮＯ10
ＵＶ（ＥｔＯＨ）：２４３ｎｍ（ε＝１４，０４２）
ＭＳ（ＦＡＢ）：（Ｍ＋Ｈ）ｍ／ｚ ７０４
ＩＲ（ＫＢＲ）：図１１を参照。
表ＶＩＩは図１２に示されるＡ８３５４３Ｙに関する1Ｈ及び13Ｃ核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクトルデータ（アセトン−ｄ6中）をまとめたものである。
化合物Ａ８３５４３Ｋ、Ａ８３５４３Ｏ、Ａ８３５４３Ｐ、Ａ８３５４３Ｕ、Ａ８３５４３Ｖ、Ａ８３５４３Ｗ及びＡ８３５４３Ｙは以前に記載された化合物と構造的に異なる。本発明の化合物は以前に記載されていない中性糖を有し：成分Ａ８３５４３Ｋ、Ａ８３５４３Ｏ及びＡ８３５４３Ｙはａ−２、３−ジ−Ｏ−メチルラムノースと同定される中性糖を有し；成分Ａ８３５４３Ｐ及びＡ８３５４３Ｗは２−Ｏ−メチルラムノースと同定される中性糖を有し；成分Ａ８３５４３Ｕ及びＡ８３５４３Ｖは３−Ｏ−メチルラムノースと同定される中性糖を有する。
アミノ糖は新規Ａ８３５４３成分から選択的に除去され、式３成分と命名される新規Ａ８３５４３プソイドアグリコンを与えることができる。これらの化合物は本発明の別の側面であり、Ｒ1が水素である式１の化合物である。
Ａ８３５４３Ｋ、Ａ８３５４３Ｏ、Ａ８３５４３Ｐ、Ａ８３５４３Ｕ、Ａ８３５４３Ｖ、Ａ８３５４３Ｗ及びＡ８３５４３Ｙからのアミノ糖の選択的除去は、それぞれＡ８３５４３Ｋプソイドアグリコン、Ａ８３５４３Ｏプソイドアグリコン、Ａ８３５４３Ｐプソイドアグリコン、Ａ８３５４３Ｕプソイドアグリコン、Ａ８３５４３Ｖプソイドアグリコン、Ａ８３５４３Ｗプソイドアグリコン及びＡ８３５４３Ｙプソイドアグリコンを与える。これらの化合物は次式：
により示される。
式２化合物は、式２化合物を酸と反応させてアミノ糖を除去することによる式３化合物の製造に用いられる。適した酸には塩酸及び硫酸が含まれ、変換に好ましい酸は硫酸である。反応は極性有機溶媒、極性有機溶媒と水の混合物、あるいは水中で行われるのが好ましい。適した有機溶媒にはメタノール、ＴＨＦ、アセトニトリル及びジオキサンが含まれる。変換に好ましい溶媒はメタノールと水の混合物、あるいは水である。反応は約２５℃〜約９５℃の温度、好ましくは８０℃において行うことができる。
プソイドアグリコンは新規Ａ８３５４３化合物の製造のための出発材料として有用であり、例えばプソイドアグリコンをアミノ糖が存在したヒドロキシル基においてグリコシル化することができる。このグリコシル化は化学合成により、又は微生物による生物変換（ｂｉｏｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ）により行うことができる。
本発明の別の側面はある種の式１化合物の化学的脱メチル化である。式１化合物は３つの小群、１Ａ、１Ｂ及び１Ｃに分類することができる。式１Ａ化合物はＲ7が式：
の基である式１化合物である。
式１Ｂ化合物はＲ7が式：
の基である式１化合物である。
式１Ｃ化合物はＲ7が式：
の基である式１化合物である。
本明細書に記載の通り、式１Ｂ化合物は式１Ａ化合物から製造することができる。同様に式１Ｃ化合物は式１Ｂ化合物から製造することができる。これらの化合物は対応する新規Ａ８３５４３成分の化学的脱メチル化により製造することができる。これらの小群のそれぞれは式２化合物の小組でもある。
Ｎ−脱メチル化誘導体である式１Ｂ化合物は式１Ａ化合物とヨウ素及び酢酸ナトリウムとの反応により製造される。反応はメタノールなどの極性有機溶媒又はメタノール水溶液などの極性有機溶媒と水の混合物中で行われる。反応は、例えばｐＨ９緩衝液を用いることによりｐＨ９に保たれる。反応は約３０℃〜約７０℃の温度において約２〜約６時間行うのが好ましい。
ジ−Ｎ−脱メチル化誘導体である式１Ｃ化合物は式１Ｂ化合物とナトリウムメトキシド／ヨウ素との反応により製造することができる。反応はメタノールなどの極性有機溶媒中で行われる。さらに反応は約１０〜約１５℃、好ましくは約０℃〜５℃の温度で行われる。反応時間は約４時間〜約６時間まで変化する。
式１Ｂ及び１Ｃ化合物の例を次式に示す：
ここで各化合物に関するＲ7、Ｒ9、Ｒ10、Ｒ11及びＲ12は以下の通りである：
Ｒ7が水素以外である場合の式１化合物である式２化合物は反応して種々の塩を形成することができ、その塩も本発明の一部である。これらの塩は例えば式２化合物の分離及び精製において有用である。さらに塩の形態のいくつかは水溶性が向上し得る。これらの塩は塩の製造のための標準的方法を用いて製造される。例えばＡ８３５４３Ｋを適した酸で中和し、酸付加塩を形成することができる。
酸付加塩は特に有用である。代表的な適した塩には、有機及び無機酸の両方、例えば硫酸、塩酸、リン酸、酢酸、コハク酸、クエン酸、乳酸、マレイン酸、フマル酸、コール酸、パモ酸、粘液酸、グルタミン酸、樟脳酸、グルタル酸、グリコール酸、フタル酸、酒石酸、蟻酸、ラウリン酸、ステアリン酸、サリチル酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ソルビン酸、ピクリン酸、安息香酸、ケイ皮酸などの酸との標準的反応により形成される塩が含まれる。
続く議論を簡単にするために、Ａ８３５４３Ａ−製造株に以下の名称を与えた：Ａ８３５４３．１、Ａ８３５４３．３、Ａ８３５４３．４及びＡ８３５４３．５。又、新規Ａ８３５４３Ｋ−製造株にＡ８３５４３．８の名称を与えた。培養物Ａ８３５４３．１、Ａ８３５４３．３、Ａ８３５４３．４、Ａ８３５４３．５、Ａ８３５４３．６、Ａ８３５４３．７、Ａ８３５４３．８及びＡ８３５４３．９をＭｉｄｗｅｓｔ Ａｒｅａ Ｒｅｇｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ，Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ，に寄託し、原料培養物コレクション（ｓｔｏｃｋ ｃｕｌｔｕｒｅ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）の一部とし、それらはそこから以下の登録番号で公に入手することができる：
ＮＲＲＬ番号 株番号
１８３９５ Ａ８３５４３．１
１８５３７ Ａ８３５４３．３
１８５３８ Ａ８３５４３．４
１８５３９ Ａ８３５４３．５
１８７１９ Ａ８３５４３．６
１８７２０ Ａ８３５４３．７
１８７４３ Ａ８３５４３．８
１８８２３ Ａ８３５４３．９
培養物Ａ８３５４３．１はバージン島（Ｖｉｒｇｉｎ Ｉｓｌａｎｄ）で集められた土壌試料から単離された培養物Ａ８３５４３の化学的突然変異により得た。Ｍｅｒｔｚ ａｎｄ Ｙａｏ（１９９０），Ｉｎｔ’ｌ Ｊ． ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，４０：３４。培養物８３５４３．４は培養物Ａ８３５４３．１から誘導された。株Ａ８３５４３．３、Ａ８３５４３．４、Ａ８３５４３．５、Ａ８３５４３．６及びＡ８３５４３．７のそれぞれはＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジンを用いた化学的誘導突然変異誘発によりＡ８３５４３．１から誘導された。株Ａ８３５４３．８及びＡ８３５４３．９はＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジンを用いた化学的誘導突然変異誘発によりＡ８３５４３．４から誘導された。Ａ８３５４３成分の製造における差を除いて、これらの単離物は親培養物と同一であると思われる。なお、株Ａ８３５４３．８は、ブダペスト条約のもとで１９９０年１２月１９日にＮＲＲＬに国際寄託されている。
培養特性（Ｃｕｌｔｕｒａｌ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ）
培養物Ａ８３５４３．１、Ａ８３５４３．３、Ａ８３５４３．４、Ａ８３５４３．５、Ａ８３５４３．６、Ａ８３５４３．７、Ａ８３５４３．８及びＡ８３５４３．９を１２種の寒天平板培養培地上で生育し、成長、裏の色（ｒｅｖｅｒｓｅ ｃｏｌｏｒ）、気生菌糸製造、胞子塊（ｓｐｏｒｅ ｍａｓｓ）の色、及び可溶性色素製造に関して比較した。用いたいずれの培地においても有意な差は観察されなかった。培養物は複合培地及び規定培地の両方において十分に生育した。気生菌糸は、用いたほとんどの培地において製造された。気生胞子塊の色は主に白であり、裏側は黄色から黄褐色であった。明白な着色は存在しなかったが、可溶性の褐色の色素がいくつかの培地中に放出された。Ａ８３５４３．３、Ａ８３５４３．４、Ａ８３５４３．５、Ａ８３５４３．６、Ａ８３５４３．７、Ａ８３５４３．８及びＡ８３５４３．９の培養特性はＡ８３５４３．１の最初の分類学的説明と類似である（Ｍｅｒｔｚ ａｎｄ Ｙａｏ（１９９０），同上を参照）。
形態学的特性
分裂して（ｓｅｇｍｅｎｔｅｄ）鍵と環（ｈｏｏｋｓ ａｎｄ ｏｐｅｎ ｌｏｏｐｓ）のように配置された胞子の長鎖となった、十分に形成された気生菌糸はほとんどの培地に存在した。らせんも観察されたが、それらは短く、不完全であった。一般的形態はレクタス−フレキシビリス（ｒｅｃｔｕｓ−ｆｌｅｘｉｂｉｌｉｓ）であった。各株のそれぞれの気生菌糸は胞子鎖に多くの空の空間を有する明確なビーズ−様外観を有した。この特徴は胞子の鞘（ｓｐｏｒｅ ｓｈｅａｔｈ）が胞子鎖を包んでいることを示しており、それはサッカロポリスポラ属の明確な特徴である。Ａ８３５４３成分の製造における差を除いてこれらの単離物は親培養物と類似であると思われる。
生理学的特性
それぞれの株からの脂肪酸分析を比較した。細胞をトリプチカーゼしょうゆブロス（ｔｒｙｐｔｉｃａｓｅ ｓｏｙ ｂｒｏｔｈ）（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ）中で２８℃において９６時間生育した。脂肪酸メチルエステルを、５８９８Ａ型コンピューター制御気液クロマトグラフィー系（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ Ｃｏ．，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）を用いた気液クロマトグラフィーにより分析した（Ｍｉｌｌｅｒ ａｎｄ Ｂｅｒｇｅｒ，“Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｂｙ Ｇａｓ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｏｆ Ｗｈｏｌｅ Ｃｅｌｌ Ｆａｔｔｙ Ａｃｉｄｓ，”Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏｔｅ ２２８−４１を参照）。これらの結果を表ＶＩＩＩに示す。
主成分分析は、１組の変数の内部相関性を扱う多変数統計学の一部門である。この分析において、最初のデータ又は試験結果内の最大量の変動が主成分として表される（Ｃｏｍｐｕｔｅｒ−Ａｓｓｉｓｔｅｄ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃｓ ２２７（１９８５）におけるＡｌｄｅｒｓｏｎ，“Ｔｈｅ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｒｅｌｅｖａｎｃｅ ｏｆ Ｎｏｎｈｅｉｒａｒｃｈｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｔａｘｏｎｏｍｙ”を参照）。散乱又は変動を示すプロットを作図することができる。変動を調べることにより相関性を評価し、微生物個体群を特性化することができる。株Ａ８３５４３．１、Ａ８３５４３．３、Ａ８３５４３．４、Ａ８３５４３．５、Ａ８３５４３．６、Ａ８３５４３．７、Ａ８３５４３．８及びＡ８３５４３．９の脂肪酸分析からの２次元主成分プロットを図１３に示す。値は含まれる株間の分離の程度に関連する。株間の差は分類学的に重要ではない。
他の生物の場合と同様に、Ａ８３５４３−生産株の特性は変異を受ける。かくしてこれらの株の突然変異株を当該技術分野において既知の物理的及び化学的方法により得ることができる。例えばＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジンなどの化学品を用いた処理により他の株を得ることができる。適した条件で培養した場合に回収可能な量の式１化合物を生産する特性を保持しているＳ．スピノサ ＮＲＲＬ １８３９５、ＮＲＲＬ １８５３７、ＮＲＲＬ １８５３８、ＮＲＲＬ １８５３９、ＮＲＲＬ １８７１９、ＮＲＲＬ １８７２０、ＮＲＲＬ １８７４３及びＮＲＲＬ １８８２３の自然及び誘発突然変異株を本発明において適用できる。
本発明の１つの側面は、ＮＲＲＬ １８３９５、ＮＲＬＬ １８５３７、ＮＲＲＬ １８５３８及びＮＲＲＬ １９５３９又はそれらのＡ８３５４３Ａ−製造突然変異株から成る群より選ばれるＳ．スピノサのＡ８３５４３Ａ−製造株をシネフンジンを含む適した培地中で培養することにより製造される式１の化合物の製造である。“Ａ８３５４３Ａ−製造突然変異株”は、Ｓ．スピノサのＡ８３５４３Ａ−製造株、ＮＲＲＬ １８３９５、ＮＲＲＬ １８５３７、ＮＲＲＬ １８５３８、ＮＲＲＬ １８５３９のいずれか１つから誘導され、回収可能な量のＡ８３５４３Ａを製造することができ、シネフンジンを含む適した培地中で培養された場合に付随量のＡ８３５４３Ｋ及びＡ８３５４３Ｏを製造することができる株である。
本発明の別の側面は、ＮＲＲＬ １８８２３又はそれらのＡ８３５４３Ｈ−製造突然変異株などのＳ．スピノサのＡ８３５４３Ｈ−製造株をシネフンジンを含む適した培地中で培養することによる式１の化合物の製造である。“Ａ８３５４３Ｈ−製造突然変異株”は、Ｓ．スピノサのＡ８３５４３Ｈ−製造株、ＮＲＲＬ １８８２３のいずれか１つから誘導され、回収可能な量のＡ８３５４３Ｈを製造することができ、シネフンジンを含む適した培地中で培養されると付随量のＡ８３５４３Ｕ及びＡ８３５４３Ｖを製造することができる株である。
本発明のさらに別の側面は、ＮＲＲＬ １８７１９又はそれらのＡ８３５４３Ｊ−製造突然変異株などのＳ．スピノサのＡ８３５４３Ｊ−製造株をシネフンジンを含む適した培地中で培養することによる式１の化合物の製造である。“Ａ８３５４３Ｊ−製造突然変異株”は、Ｓ．スピノサのＡ８３５４３Ｊ−製造株、ＮＲＲＬ １８７１９又はＮＲＲＬ １８７２０のいずれか１つから誘導され、回収可能な量のＡ８３５４３Ｊを製造することができ、約５０ｍｇ／ＭＬ〜約２００ｍｇ／ＭＬのシネフンジンを含む適した培地中で培養されると付随量のＡ８３５４３Ｐ及びＡ８３５４３Ｗを製造することができる株である。
典型的にシネフンジンは４８〜７２時間後に製造培地に加えられるか、あるいは大規模製造の場合シネフンジンの添加は培養物の成長の開始が酸素の吸収により示されるまで延期される。シネフンジンは接種の約４８時間〜約７２時間後に発酵培地に加えるのが好ましい。シネフンジンは個体として、又は溶液として加えることができる。便宜的に、シネフンジンが大規模発酵に加えられる場合、アルコール性溶液としての添加が好ましい。そのような溶液はシネフンジンを十分な体積のメチルアルコールに溶解し、次いで０．４５μフィルターを通して濾過することにより溶液を滅菌することにより調製される。
別の場合、式１化合物はＳ．スピノサ株 ＮＲＲＬ １８７４３（成分Ａ８３５４３Ｋ、Ａ８３５４３Ｏ及びＡ８３５４３Ｙを製造する）又はそれらのＡ８３５４３Ｋ−製造突然変異株をシネフンジンを添加しない適した培地中で培養することにより製造される。“Ａ８３５４３Ｋ−製造突然変異株”はＳ．スピノサ ＮＲＲＬ １８７４３から誘導され、回収可能な量のＡ８３５４３Ｋを製造することができる株である。
製造後、式１化合物は当該技術分野において十分に理解される種々の単離及び精製法を用いて培地から分離することができる。製造における経済性、最適収量及び生成物単離の容易さのために、ある種の培地が好ましい。例えば大規模発酵における好ましい炭素源はグルコース及びオレイン酸メチルであるが、リボース、キシロース、フルクトース、ガラクトース、マンノース、マンニトール、可溶性澱粉、ポテトデキストリン、油類、例えば大豆油なども用いることができる。好ましい窒素源は綿実粉、ペプトン化乳（ｐｅｐｔｏｎｉｚｅｄ ｍｉｌｋ）及びとうもろこし浸漬液（ｃｏｒｎ ｓｔｅｅｐ ｌｉｑｕｏｒ）であるが、魚粉、消化大豆粉、酵母抽出物、酵素−加水分解カゼイン、ビーフ抽出物なども用いることができる。培地中に挿入することができる栄養無機塩の中には、亜鉛、ナトリウム、マグネシウム、カルシウム、アンモニウム、塩化物、炭酸、硫酸、硝酸などのイオンを与えることができる通常の可溶性塩がある。生物の成長及び発育に必要な必須微量元素も培地に含まれなければならない。そのような微量元素は通常、培地の他の置換物中に不純物として、生物の成長条件を満たすのに十分な量で存在する。
通常、発泡が問題である場合、少量（すなわち０．２ｍＬ／Ｌ）のポリプロピレングリコールなどの消泡剤を大規模発酵培地に加えることができる。しかしＡ８３５４３−製造培養物の場合、従来の脱泡剤はＡ８３５４３製造を阻害する。発泡は培地中に大豆油又はＰＬＵＲＯＮＩＣ Ｌ−１０１（ＢＡＳＦ，Ｐａｒｓｉｐａｎｎｙ，ＮＪ）を含むことにより（１〜３％）抑制することができる。発泡が現れたら追加の油を加えることができる。
実質的量の式１化合物の製造のために、撹拌されたバイオリアクターにおける深部好気的発酵が好ましいが、震盪フラスコ培養によって少量の式１化合物を得ることができる。通常大バイオリアクターへの胞子の形態の生物の接種に伴う製造における遅れの故に、栄養接種材料（ｖｅｇｅｔａｔｉｖｅ ｉｎｏｃｕｌｕｍ）を用いるのが好ましい。栄養接種材料は、液体窒素中に保存された原料培養物からの小体積の培地を接種して生物の新しい、活発に成長している培養物を得ることにより調製される。次いで栄養接種材料を大バイオリアクターに移す。栄養接種材料の培地は、より大きな発酵に用いられるものと同一であることができるが、他の培地も適している。
式１化合物は約２４℃〜約３３℃の温度で生育した場合にＡ８３５４３−製造株から製造される。製造のための最適温度は約２８〜３０℃であると思われる。
深部好気的培養法で通常行われる通り、培地を従来のタービン撹拌機を用いて撹拌しながら底から無菌の空気を容器中に吹き込む。一般にエアレーション速度及び撹拌速度は、約０．３４気圧の内部容器圧力で溶解酸素の量を８０％か又はそれ以上に保持するのに十分でなければならない。
式１化合物の製造はブロスからの抽出物を調べることにより発酵の間、追跡することができる。製造の追跡のための好ましい方法は、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によるブロス抽出物の分析である。分析のために適した系は実施例１に記載されている。
震盪フラスコ又は撹拌反応器における製造に続いて、式１化合物を当該技術分野で用いられる方法により発酵培地から回収することができる。Ａ８３５４３−製造株の発酵の間に製造された化合物は、菌糸体及びブロスの両方に存在する。式１化合物は親油性であり、発酵に実質的量の油が用いられる場合、全ブロス抽出がより有効である。少量の油しか用いられない場合、式１化合物の大部分は菌糸体に存在する。その場合、式１化合物のより有効な回収は、最初に培地を濾過してブロスを菌糸体の塊（バイオマス）から分離することにより成される。
式１化合物は多様な方法によりバイオマスから回収することができる。適した方法は、分離されたバイオマスを水で洗浄した残留ブロスを除去し、バイオマスを式１化合物が可溶性の極性溶媒、例えばメタノール又はアセトンと混合し、分離して溶媒を濃縮し、濃縮物を非極性溶媒で抽出し、及び／又はそれを逆相シリカゲル吸着剤、例えば逆相Ｃ8又はＣ18樹脂、又はＨＰ−２０もしくはＨＰ−２０ｓｓ（Ｍｉｔｓｕｂｉｓｈｉ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．，Ｊａｐａｎ）などの非常に多孔質なポリマー上に吸着させる方法を含む。活性材料は、例えば場合により少量のＴＨＦを含むＨ2Ｏ：アセトニトリル：メタノール混合物などの適した溶媒を用いて吸着剤から溶離させる。
バイオマスからの式１化合物の単離のための好ましい方法は、全ブロスに等量のアセトンを加え、セラミックフィルターにおいて混合物を濾過してバイオマスを除去し、濾液を酢酸エチルで抽出する方法を含む。酢酸エチル抽出物を真空中で濃縮してアセトンを除去し、水層を有機層から分離する。酢酸エチル溶液をさらに真空中で濃縮し、濃縮液を希酸水溶液（ｐＨ３）で抽出する。式１化合物は本明細書に記載の通り、クロマトグラフィーによりさらに精製することができる。
バイオマスからの式１化合物の単離のためのより好ましい方法は、全ブロスに等体積のアセトンを加え、セラミックフィルターにおいて混合物を濾過してバイオマスを除去し、濾液のｐＨを約ｐＨ９〜約ｐＨ１３に調節する方法を含む。この溶液をＨＰ−２０ｓｓ（Ｍｉｔｓｕｂｉｓｈｉ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．，Ｊａｐａｎ）に適用し、カラムをメタノール、アセトニトル及び水（１：１：２）の混合物で洗浄する。式１化合物を０．１％の酢酸アンモニウム（ｐＨ８．１）を含むメタノール／アセトニトリル（１：１）の９５：５混合物を用いて溶離させる。式１化合物を含む画分を合わせ、凍結乾燥する。式１化合物は本明細書に記載の通り、クロマトグラフィーによりさらに精製することができる。
別の場合、培地成分及び菌糸体を含む培養物固体を抽出又は分離をせずに式１化合物の供給源として用いることができるが、水の除去の後が好ましい。例えば式１化合物の製造後、全発酵ブロスを凍結乾燥により、ドラム−乾燥により、又は共沸蒸留及び乾燥により乾燥することができる。次いで乾燥されたブロスを、例えばそれを飼料予備混合物中、又はスプレー及び粉末のための調剤中に直接混合することにより、直接用いることができる。
殺虫及び殺ダニ活性
式２化合物は昆虫及びダニの抑制に有用である。従って本発明の別の側面は、ダニ又は昆虫の場所（ｌｏｃｕｓ）に昆虫−又はダニ−阻害量の式２化合物を適用することを含む昆虫又はダニの阻害の方法を目的としている。
昆虫又はダニの“場所”は、昆虫又はダニが生存している、あるいはその卵が存在する環境を言い、それを取り巻く空気、それが食する食物、あるいはそれが接触する対象を含む。例えば植物−摂取昆虫又はダニは、昆虫又はダニが食する、又は棲息する植物部分、特に葉に活性化合物を適用することにより抑制することができる。
“昆虫又はダニの阻害”という用語は、生存昆虫又はダニの数の減少、あるいは生育し得る昆虫又はダニの卵の数の減少を言う。化合物により成される減少の程度は、もちろん化合物の適用比、用いられる特定の化合物、及び標的昆虫又はダニの種に依存する。少なくとも昆虫−不活性化又はダニ−不活性化量を用いなければならない。
“昆虫−不活性化量”及び“ダニ−不活性化量”という用語は、処理された昆虫又はダニの個体群における測定可能な減少を引き起こすのに十分な量を言うために用いられる。一般に約１〜約１，０００ｐｐｍ（又は０．０１〜１ｋｇ／ａ）の範囲の量の活性化合物が用いられる。
式２化合物は複数の昆虫及びダニに対して活性を示す。さらに特定的には、化合物は鱗翅類の昆虫のメンバーであるビート・アーミーワーム及びタバコ・バズワームに対して活性を示す。この目の他の典型的メンバーはサザン・アーミーワーム、コズリング・モス、カットワーム、クローズ・モス、インディアン・ミール・モス、リーフ・ローラー、コーン・イア・ワーム、コットン・ボールワーム、ヨーロピアン・コーン・ボーラー、インポーテッド・キャベツ・ワーム、キャベツ・ルーパー、ピンク・ボールワーム、バッグワーム、イースタン・テント・キャタピラー、ソド・ウェブワーム及びフォール・アーミーワームである。
式２化合物はリーフ・ホッパーに対しても活性を示し、それは同翅類の昆虫のメンバーである。この目の他のメンバーにはコットン・アフィド、プラント・ホッパー、ピア・プシラ、アップル・サッカー、スケール・インセクト、ホワイトフライ、及びスピットル・バグ、ならびに複数の他の宿主特異的アフィド種が含まれる。
さらに式２化合物はステープル・フライ、ブローフライ及び蚊に活性を示し、それらは双翅類の昆虫のメンバーである。この目の他の典型的メンバーはコモン・ハウス・フライである。
式２化合物は２点クモダニ（ｔｗｏ−ｓｐｏｔｔｅｄ ｓｐｉｄｅｒ ｍｉｔｅｓ）に対して活性を示し、これはダニ類の昆虫のメンバーである。この目の他の典型的メンバーにはメインジ・ダニ、スカブ・ダニ、シーブ・スカブ・ダニ、チキン・ダニ、スケーリーレッグ・ダニ、デプルミング・ダニ及びドッグ・フォリクル・ダニが含まれる。
式２化合物は昆虫及びダニの個体群を減少させるために有用であり、昆虫又はダニの個体群の阻害の方法で用いられ、その方法は昆虫又はダニの場所に昆虫−又はダニ−不活性化有効量の式２化合物を適用することを含む。１つの好ましい実施態様の場合、本発明は鱗翅類の感受性昆虫の阻害の方法を目的としており、その方法は本発明に従って昆虫−不活性化有効量の式２化合物を植物に適用することを含む。本発明の他の好ましい実施態様は、動物中の双翅類のバイティング・フライの阻害の方法を目的としており、その方法は有害生物−阻害有効量の式２化合物を経口的に、非経口的に、又は局所的に動物に投与することを含む。他の好ましい実施態様の場合、本発明は同翅類の感受性昆虫の阻害の方法を目的としており、それは昆虫−不活性化有効量の式２化合物を植物に適用することを含む。本発明の他の好ましい実施態様は、ダニ（Ａｃａｒｉｎａ）類のダニの阻害の方法を目的としており、それはダニ−不活性化量の式２化合物をダニの場所に適用することを含む。
ダニ／昆虫スクリーン
式２化合物を以下のダニ／昆虫スクリーンにおいて、殺ダニ及び殺虫活性に関して調べた。各試験化合物は、１リットル当たり２３ｇのＴＯＸＩＭＵＬ Ｒ（スルホネート／非イオン性乳化剤ブレンド）及び１３ｇのＴＯＸＩＭＵＬ Ｓ（スルホネート／非イオン性乳化剤ブレンド）を含むアセトン−アルコール（１：１）混合物に化合物を溶解することにより調製した。これらの混合物を次いで水で希釈し、示されている濃度を得た。
二点クモダニ及びコットン・アフィドをかぼちゃ（ｓｑｕａｓｈ）の子葉上に導入し、葉の両面に落ち着かせた。次いで、葉にＤｅＶｉｌｂｉｓｓ噴霧器を１０ｐｓｉで用いて５ｍｌの試験溶液を噴霧した。葉の両面を流れ落ちるまで覆い、次いで１時間乾燥させた。標準的暴露時間の後、パーセント死亡率を評価した。追加の昆虫を類似の調剤及び評価法を用いて評価した。結果を表ＩＸに報告する。以下の略字を用いる：
略字 有害生物 科学名
ＡＬＨ アスター・リーフホッパー マクロステレス・ファシフロンス（Ｍａｃｒｏｓｔｅｌｅｓ ｆａｓｃｉｆｒｏｎｓ）
ＢＡＷ ビート・アーミーワーム スポドプテラ・エクシグア（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｅｘｉｇｕａ）
ＣＡ コットン・アフィド アフィス・ゴシピイ・グロベル（Ａｐｈｉｓ ｇｏｓｓｙｐｉｉ Ｇｌｏｖｅｒ）
ＧＥＣＲ ジャーマン・コックローチ ブラテラ・ゲルマニカ（Ｂｌａｔｔｅｌｌａ ｇｅｒｍａｎｉｃａ）
ＮＥＭ ルートノット・ネマトード メリイオジン種（Ｍｅｌｉｉｏｄｙｎｅ ｓｐｐ．）
ＳＣＲＷ サザン・コーン・ルートワーム （ディアブロチカ・ウンデシンプンクタタ・ホワルジ（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ ｕｎｄｅｃｉｍｐｕｎｃｔａｔａ ｈｏｗａｒｄｉ）
ＴＢＷ タバコ・バズワーム ヘリオチス・ビレセンス（Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ ｖｉｒａｓｃｅｎｓ）
ＴＳＳＭ 二点クモダニ テトラニクス・ウルチカエ（Ｔｅｔｒａｎｙｃｈｕｓ ｕｒｔｉｃａｅ）
式２化合物を以下のアッセイにおいて評価し、新生タバコ・バズワーム（ヘリオチス・ビレセンス）に対するＬＤ50を決定した。ペトリ皿（１００ｍｍｘ２０ｍｍ）を裏返し、蓋を＃１定性濾紙で裏打ちする。新生幼虫を各皿に置き、１ｍｌの試験溶液を昆虫に上にピペットで注ぐ。次いでペトリ皿の底を蓋の上に置き、幼虫を囲う。処理の１時間後、ヘリオチスの常食の小片（修正スラリ（ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｓｌｕｒｒｙ），Ｓｏｕｔｈｌａｎｄ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｌａｋｅ Ｖｉｌｌａｇｅ，ＡＲ）を各皿に加える。２４及び４８時間に死亡率を評価する。試験は三重に行った。結果を表Ｘに示す。
殺虫性組成物
本発明の式２化合物を、やはり本発明の一部である組成物の形態で適用する。これらの組成物は昆虫−又はダニ−不活性化量の式２化合物を、植物学的に許容し得る不活性担体中に含む。活性成分である式２化合物は単独の式２化合物として、２種又はそれ以上の式２化合物の混合物として、少なくとも１種のＡ８３５４３Ｋ、Ａ８３５４３Ｏ、Ａ８３５４３Ｐ、Ａ８３５４３Ｕ、Ａ８３５４３Ｖ、Ａ８３５４３Ｗ及びＡ８３５４３Ｙの混合物として、あるいはそれが製造された発酵培地の乾燥部分と一緒の少なくとも１種のＡ８３５４３Ｋ、Ａ８３５４３Ｏ、Ａ８３５４３Ｐ、Ａ８３５４３Ｕ、Ａ８３５４３Ｖ、Ａ８３５４３Ｗ及びＡ８３５４３Ｙの混合物として存在することができる。
組成物は農業化学的分野において慣習的な方法及び処方に従って製造されるが、それは１種又はそれ以上の本発明の化合物が存在する故に新規であり、重要である。組成物は、適用の場合に水に分散される濃厚調剤、あるいはさらに処理を受けずに適用される粉剤又は顆粒剤であることができる。
化合物又は粗乾燥材料が適用される分散液は、化合物又は粗材料の濃厚調剤から調製される水性懸濁液又は乳液である場合が最も多い。そのような水溶性、水−懸濁性又は乳化性調剤は固体（通常水和剤として既知）又は液体（通常濃厚乳剤又は水性懸濁液として既知）のいずれかである。
圧縮して水分散性顆粒とすることができる水和剤は、活性化合物、不活性担体及び界面活性剤の均質な混合物を含む。活性化合物の濃度は通常約１重量％〜約９０重量％である。不活性担体は通常アタパルジャイトクレー、モントモリロナイトクレー、ケイ藻土又は精製シリカから選ばれる。
水和剤の約０．５％〜約１０％を構成する有効な界面活性剤は、スルホン化リグニン、縮合ナフタレン−スルホネート、ナフタレン−スルホネート、アルキルベンゼンスルホネート、アルキルサルフェート及び非イオン性界面活性剤、例えばアルキルフェノールのエチレンオキシド付加物から見いだされる。
化合物の濃厚乳剤は、水−混和性溶媒又は水−非混和性有機溶媒と乳化剤の混合物である不活性担体中に溶解された従来の濃度、例えば約１０％〜約５０％に等しい液体１リットル当たり約５０〜約５００グラムの濃度の化合物を含む。有用な有機溶媒には芳香族化合物、特にキシレン類、及び石油留分、特に石油の高沸点ナフタレン性及びオレフィン性部分、例えば重質又は芳香族ナフサが含まれる。他の有機溶媒、例えばロジン誘導体を含むテルペン性溶媒、シクロヘキサノンなどの脂肪族ケトン類、及び２−エトキシエタノールなどの複合アルコール類（ｃｏｍｐｌｅｘ ａｌｃｏｈｏｌｓ）も用いることができる。濃厚乳液に適した乳化剤は上記で挙げたような従来の非イオン性界面活性剤から選ばれる。
水性懸濁液は、水性ビヒクル中に約５重量％〜約５０重量％の範囲の濃度で分散された本発明の水−不溶性化合物の懸濁液を含む。懸濁液は化合物を微粉砕し、水及び上記で議論されたと同じ種類から選ばれる界面活性剤を含むビヒクル中にそれを激しく混合することにより調製される。無機塩及び合成又は天然ゴムなどの不活性成分を加え、水性ビヒクルの密度及び粘度を増加させることもできる。水性混合物を調製し、それをサンドミル、ボールミル又はピストン型ホモジナイザーなどの装置で均質化することにより、化合物を同時に粉砕及び混合するのが多くの場合に最も有効である。
式２化合物は顆粒組成物としても適用することができ、それは土壌への適用の場合に特に有用である。顆粒組成物は通常、完全に、又は大部分がクレー又は類似の安価な物質から成る不活性担体中に分散された約０．５重量％〜約１０重量％の式２化合物を含む。そのような組成物は通常、適した溶媒中に化合物を溶解し、約０．５〜３ｍｍの範囲の適した粒径に予備形成された顆粒担体にそれを適用することにより調製される。そのような組成物は担体のドウ又はペーストを作り、ドウ又はペースト中に活性成分を合わせた混合物を乾燥し、乾燥された組成物を粉砕して所望の顆粒粒径を得ることによっても調製することができる。
化合物を含む粉剤は、粉末の形態の化合物を適した微粉農業用担体、例えばカオリンクレー、粉砕火山岩などと均質に混合することにより調製される。粉剤は約１％〜約１０％の式２化合物を含むのが適している。
いずれかの理由で望ましい場合、適した有機溶媒、通常は無刺激石油、例えば農業化学で広く用いられるスプレーオイル中の溶液の形態で化合物を適用するのが同様に実用的である。
殺虫剤及び殺ダニ剤は通常液体担体中の活性成分の分散液の形態で適用される。適用比を担体中の活性成分の濃度として言うのが簡便である。最も広く用いられる担体は水である。
式２化合物はエアゾール組成物の形態で適用することもできる。そのような組成物の場合、活性化合物は圧力−発生プロペラント混合物である不活性担体中に溶解される。エアゾール組成物は容器に詰められ、そこから混合物が噴霧バルブを介して分散される。プロペラント混合物は、有機溶媒と混合することができる低沸点ハロカーボン類、あるいは不活性気体又は気体炭化水素類で加圧された水性懸濁液を含む。
昆虫及びダニの場所に適用されるべき化合物の量は重要ではなく、与えられている実施例を見て当該技術分野における熟練者が容易に決定することができる。一般に約１０ｐｐｍ〜約５，０００ｐｐｍの濃度の式２化合物が優れた抑制を与えると予想される。多くの化合物の場合、約１００〜約１，０００ｐｐｍの濃度が十分である。大豆及び綿などの畑作物の場合、化合物に関する適した適用比は約０．０１〜約１ｋｇ／ｈａであり、典型的に５〜５０ガロン／Ａのスプレー調剤として適用される。
式２化合物が適用される場所は昆虫又はダニが棲息するいずれの場所であることもでき、例えば野菜作物、果実及びナッツの木、ぶどうの木及び装飾用植物であることができる。ダニの卵の有毒作用に耐える独特の能力の故に、新しく発生した幼虫の抑制のためには繰り返し適用が望ましく、これは他の既知の殺ダニ剤の場合も真実である。
殺外部寄生虫活性
式２化合物は双翅類の昆虫のメンバーに対しても活性である。表ＸＩ及びＸＩＩは、ブローフライ幼虫及びステーブルフライ成虫に対する式２化合物の４８時間における試験管内研究をまとめたものである。
殺外部寄生虫法
本発明の殺外部寄生虫法は、式２化合物を宿主動物に投与して昆虫及びダニ寄生虫を抑制することにより行われる。動物への投与は経皮的、経口的又は非経口的経路によることができる。
寄生昆虫及びダニには吸血性及び食肉性の種、及びその生活環のすべて又はその生活環の一部の間のみ、例えば幼虫のみ又は成虫段階のみに寄生性である種が含まれる。代表的種には以下が含まれる：
本発明の方法は経済動物（ｅｃｏｎｏｍｉｃ ａｎｉｍａｌｓ）及び随伴動物（ｃｏｍｐａｎｉｏｎ ａｎｉｍａｌｓ）を外部寄生虫から保護するために用いることができる。例えば化合物を馬、牛、羊、豚、山羊、犬、猫など、ならびにらくだ、ラマ、鹿などの外来の動物及び通常野生動物と呼ばれる他の種に投与して有益である。化合物は家禽及び他の鳥類、例えば七面鳥、鶏、あひるなどに投与しても有益である。方法は経済動物に投与するのが好ましく、牛及び羊に投与するのが最も好ましい。
殺外部寄生虫性組成物
本発明は宿主動物の血液を吸う昆虫外部寄生虫の個体群の抑制のための組成物にも関する。これらの組成物は経済動物、随伴動物及び野生動物を外部寄生虫から保護するために用いることができる。組成物は家禽及び他の鳥類に投与しても有益である。
経済動物の保護のために方法を適用し、あるいは組成物を用いるのが好ましく、牛及び羊に用いるのが最も好ましい。有効適用の比率、時期及び方法は、寄生虫の正体、寄生虫攻撃の程度及び他の因子と共に広く変化する。適用は宿主の全寿命をかけて周期的に、又は寄生虫攻撃のピーク季節のみに行うことができる。一般に約０．０００５〜約９５％の式２化合物、好ましくは最高５％、及び最も好ましくは最高１％の式２化合物を含む液体調剤の局所的適用により外部寄生虫抑制が得られる。有効な寄生虫抑制は、約５〜約１００ｍｇ／ｋｇの適用比で達成される。
式２化合物は従来の獣医学的慣習により宿主動物に適用される。通常化合物は、式２化合物及び生理学的に許容し得る担体を含む殺外部寄生虫性組成物に調製される。例えば液体組成物は、殺外部寄生虫的抑制が望まれている動物に単に噴霧することができる。動物は、式２化合物と動物がそれを背に接触しながら歩くことができる例えば布を含むことができるバックラバーのような装置により、自ら処置することもできる。浸漬タンクも宿主動物に活性薬剤を投与するために用いることができる。
化合物を動物の飼料又は飲料水に混合することにより、あるいは錠剤、カプセル、大型丸薬又は体内埋植などの投薬形態を投与することにより経口的投与を行うことができる。経皮的投与は、注射可能な調剤の皮下、腹腔内及び静脈内注射により簡単に行われる。
式２化合物は経口的投与のために飲薬、錠剤又はカプセルなどの通常の形態に調製することができる。そのような組成物はもちろん経口的に許容し得る不活性担体を必要とする。化合物は、皮下的、皮膚的、管内、腹腔内、筋肉内又は静脈内注射のための注射可能な溶液又は懸濁液として調製することもできる。いくつかの適用の場合、化合物は標準的動物飼料の１成分として調製するのが便利である。この実施態様の場合、本発明の化合物を最初に、液体又は粒子状固体担体中に化合物が分散されている予備混合物として調製するのが通常である。予備混合物は、混合物１ポンド当たり約２〜約２５０ｇの式２化合物を含むことができる。予備混合物自身は従来の混合により最終的飼料中に調製される。
一般に外部寄生虫攻撃は宿主動物の寿命の実質的割合の間に起こるので、一定の期間をかけた持効性を与える形態で式２化合物を投与するのが好ましい。従来の方法は溶解を物理的に阻害するマトリックスの使用を含み、ここでマトリックスはワックス状の半−固体、例えば植物ワックス類、あるいは高分子量ポリエチレングリコールである。化合物を投与する優れた方法は、Ｌａｂｙ，米国特許第４，２５１，５０６号及びＳｉｍｐｓｏｎ，英国特許第２，０５９，７６７号のものなどの、持続−作用大型丸薬を用いる方法である。そのような大型丸薬の場合、化合物はＮｅｖｉｎ，米国特許第４，２７３，９２０号のものなどのポリマーマトリックス中に封入されている。本発明の化合物の持効性はシリコン−含有ゴムから作られるような体内埋植の使用によっても達成される。
本発明の実施をより十分に説明するために、以下の実施例を提供する：
実施例１
Ａ８３５４３アッセイ法
Ａ８３５４３Ｋ、Ａ８３５４３Ｏ、Ａ８３５４３Ｐ、Ａ８３５４３Ｕ、Ａ８３５４３Ｖ、Ａ８３５４３Ｗ、Ａ８３５４３Ｙ及び他のＡ８３５４３成分の製造のための発酵を監視するために以下の分析的高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）が有用である：
全ブロスの試料を３体積のアセトニトリルで希釈し、菌糸体からの因子を抽出する。次いで得られる溶液を０．４５ミクロンのポリテトラフルオリン（ＰＴＦＥ）フィルターを通して濾過し、ＨＰＬＣアッセイ系に注入する前に粒子状物質を除去する。メタノール中１ｍｌ当たり１００ｍｇの濃度の精製Ａ８３５４３Ａの溶液をアッセイのための外部標準として用い、すべてのＡ８３５４３成分のピーク面積をこのキャリブレーション標準に逆相関させ、各成分の濃度を決定する。
ＨＰＬＣ系：
カラム担体：ＹＭＣ−ＰＡＣＫ ４．６ｘ１００−ｍｍ ＩＤカラム、５μ球状、１２０Å（ＹＭＣ Ｉｎｃ．，Ｍｏｒｒｉｓ Ｐｌａｉｎｓ，ＮＪ）
可動相：０．０５％の酢酸アンモニウムを含むＣＨ3ＣＮ／ＭｅＯＨ／Ｈ2Ｏ（３：３：２）
流量：２ｍｌ／分
検出：２５０ｎｍにおけるＵＶ
実施例２
培養物ＮＲＲＬ １８５３８（Ａ８３５４３．４）を用いたＡ８３５４３Ｋ及びＡ８３５４３Ｏの製造
Ａ．震盪フラスコ発酵
凍結乾燥ペレットとして、又は液体窒素中に保持された懸濁液としての培養物Ｓ．スピノサ ＮＲＲＬ １８５３８を用い、以下の組成を有する栄養培地に接種した：
栄養培地に２．５％の寒天を加えることにより斜面又は平板を調製することができる。接種された斜面を３０℃で約１０〜約１４日間インキュベートする。成熟斜面培養物を無菌の道具を用いてこすり落とし、胞子を解放し、菌糸体マット（ｍａｔ）を取り出し、ふやかす。かくして得られる解放された胞子及び成長培養物の約４分の１を用いて５０ｍｌの第１期栄養培地に接種する。代わりに液体窒素アンプルから第１期培地に接種することができる。
培養物が液体窒素中に保持されている場合、アンプルは、同体積の栄養培地（４８〜７２時間インキュベーション、３０℃）及び懸濁培地を用いて調製することができる。懸濁培地はラクトース（１００ｇ）、グリセロール（２００ｍｌ）及び脱イオン水（１−Ｌとなる量）を含む。
液体窒素アンプルを用い、２５０−ｍｌの三角フラスコ中の５０ｍｌの栄養培地に接種する。培養物を、２５０ｒｐｍで２インチ（５．０８ｃｍ）の円の軌道を描く震盪器上で３０℃において４８時間インキュベートする。
インキュベートされた培養物（５％ｖ／ｖ接種材料）を用い、２５０−ｍｌの広口三角フラスコ中の３０ｍｌの製造培地に接種する。培地の組成は以下の通りであった：
接種された製造培地を２５０−ｍｌの広口三角フラスコ中で３０℃において７日間、２５０ｒｐｍで２インチの円の軌道を描く震盪器上でインキュベートする。接種の７２時間後に、シネフンジンを約１００μｇ／ｍｌの最終濃度で加えた。
Ｂ．撹拌リアクター発酵
大体積の接種材料を与えるために、実施例２、Ａ章で記載の通りに調製された１０ｍｌのインキュベートされた第１期培地を用い、第１期培地の組成と同じ組成を有する４００ｍｌの第２期栄養培地に接種する。この第２期栄養培地を２−Ｌの広口三角フラスコ中で３０℃において約４８時間、２５０ｒｐｍにおいて２インチの円の軌道を描く震盪器上でインキュベートする。
かくして調製され、インキュベートされた第２期栄養培地（２−Ｌ）を用い、実施例２、Ａ章に記載の通りに調製された１１５リットルの無菌製造培地に接種する。シネフンジンを、濾過されたメタノール性溶液として、６６時間において１００μｇ／ｍｌの最終濃度まで加えた。
接種された製造培地を１６５−Ｌの撹拌バイオリアクター中で、３０℃の温度において７日間発酵させた。撹拌容器における空気流及び撹拌機の速度はコンピューター制御され、溶解酸素の量は空気飽和の約８０％に保持される。
実施例３
培養物ＮＲＲＬ １８７４３（Ａ８３５４３．８）を用いたＡ８３５４３Ｋ、Ａ８３５４３Ｏ及びＡ８３５４３Ｙの製造
Ａ．震盪フラスコ発酵
凍結乾燥ペレットとして、又は液体窒素中に保持された懸濁液としての培養物Ｓ．スピノサ ＮＲＲＬ １８７４３を用い、以下の組成を有する栄養培地に接種した：
栄養培地に２．５％の寒天を加えることにより斜面又は平板を調製することができる。接種された斜面を３０℃で約１０〜約１４日間インキュベートする。成熟斜面培養物を無菌の道具を用いてこすり落とし、胞子を解放し、菌糸体マットを取り出し、ふやかす。かくして得られる解放された胞子及び成長培養物の約４分の１を用いて５０ｍｌの第１期栄養培地に接種する。代わりに液体窒素アンプルから第１期培地に接種することができる。
液体窒素貯蔵接種材料は、栄養培養物を均質化し、グリセロール：ラクトース：水（２：１：７）の無菌の懸濁剤を用いて１：１に希釈し（体積：体積）、それを無菌の管に分配する（１．５ｍｌ／管）ことにより調製した。希釈された接種材料は、次いで適した保存容器中で液体窒素の上で保存し、震盪フラスコ培養物の培養のための発酵原料接種材料（ｗｏｒｋｉｎｇ ｓｔｏｃｋ ｉｎｏｃｕｌｕｍ）として、及び発酵器播種接種材料として用いた。
液体窒素アンプルを急速解凍し、０．５ｍｌを用いて２５０−ｍｌの広口三角フラスコ中の５０ｍｌの栄養培地に接種した。培養物を、２５０ｒｐｍで２インチ（５．０８ｃｍ）の円の軌道を描く震盪器上で３２℃において４８時間インキュベートする。
インキュベートされた培養物（５％ｖ／ｖ接種材料）を用い、以下の組成を有する２５ｍｌの製造培地に接種する：
接種された製造培地を２５０−ｍｌの広口三角フラスコ中で３０℃において７日間、２５０ｒｐｍで２インチの円の軌道を描く震盪器上でインキュベートする。
Ｂ．撹拌リアクター発酵
大体積の接種材料を与えるために、実施例３、Ａ章で記載の通りに調製された１０ｍｌのインキュベートされた第１期培地を用い、第１期培地の組成と同じ組成を有する４００ｍｌの第２期栄養培地に接種する。この第２期栄養培地を２−Ｌの広口三角フラスコ中で３２℃において約４８時間、２５０ｒｐｍにおいて２インチの円の軌道を描く震盪器上でインキュベートする。
かくして調製され、インキュベートされた第２期栄養培地（２−Ｌ）を用い、実施例３、Ａ章に記載の通りに調製された１１５リットルの無菌製造培地に接種する。
接種された製造培地を１６５−Ｌの撹拌バイオリアクター中で、３０℃の温度において７日間発酵させた。撹拌容器における空気流及び撹拌機の速度はコンピューター制御され、溶解酸素の量は空気飽和の約８０％か又はそれ以上に保持される。
実施例４
シネフンジンの存在下で発酵されたＮＲＲＬ １８７１９（Ａ８３５４３．６）からのＡ８３５４３Ｐ及びＡ８３５４３Ｗの単離
発酵ブロス（１９０−Ｌ、実質的に実施例２Ｂに記載の通りに調製（株Ａ８３５４３．６を用いることを除いて））を処理の前に２日間冷却した。５ＮのＨＣｌを用いてｐＨを３．０に調節した後、全ブロスにアセトン（１９０−Ｌ）を加えた。得られた混合物をセラミックフィルターを通して濾過し、濾液（３３５−Ｌ）を得、それを冷却下に週末をかけて保持した。ブロス／アセトン濾液を５ＮのＮａＯＨを用いてｐＨ１０に調節し、セラミックフィルターを通して再濾過してからＨＰ−２０ｓｓ樹脂（Ｍｉｔｓｕｂｉｓｈｉ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｌｔｄ．，Ｊａｐａｎ）を含むスチールカラム（１０−Ｌ；１０ｃｍｘ１２２ｃｍ）上に１−Ｌ／分の流量で負荷した。カラムをＣＨ3ＣＮ−ＣＨ3ＯＨ−０．１％ＮＨ4ＯＡｃ水溶液（ＮＨ4ＯＨを用いてｐＨ８．１に調節）（２５：２５：５０：２０−Ｌ）を用いて洗浄し、次いでＣＨ3ＣＮ−ＣＨ3ＯＨ−０．１％ＮＨ4ＯＡｃ水溶液（ＮＨ4ＯＨを用いてｐＨ８．１に調節）（９５：９５：１０：４０−Ｌ）を用いて溶離させ、２−Ｌの画分を集めた。画分３〜９を濃縮乾固し、ＣＨ3ＯＨ（１００ｍｌ）中に再溶解し、再濃縮し、次いでＣＨ3ＣＮ（１−Ｌ）中に沈澱させた。得られた沈澱を濾過により除去し、捨て、濾液を濃縮乾固した。得られた残留物をジクロロメタン（２５ｍｌ）に再溶解し、アセトニトリル中で平衡化したシリカゲル（ＥＭ等級６２、６０〜２００メッシュ）のカラム（７．５ｃｍｘ５０ｃｍ）に適用した。カラムをＣＨ3ＣＮ（４−Ｌ）、次いでＣＨ3ＣＮ−ＣＨ3ＯＨ（９：１、５−Ｌ）、続いてＣＨ3ＯＨ（１−Ｌ）を用いて溶離させ、１−Ｌの画分を集めた。プール１（画分３〜４）はＡ８３５４３成分Ｊ及びＬを含み；プール３（画分７〜１０）は成分Ｍ及びＮを含んだ。新規成分Ｐ及びＷを含むプール２（画分５〜６）を濃縮乾固した。得られた残留物をＣＨ3ＯＨ（１０ｍｌ）に溶解し、Ｈ2Ｏ−ＣＨ3ＯＨ−ＣＨ3ＣＮ（３０：３５：３５，０．１％のＮＨ4ＯＡｃを含む）で平衡化した分取逆相ＨＰＬＣカラム（Ｒａｉｎｉｎ Ｄｙｎａｍａｘ−６０Å ８μｍ Ｃ１８，４１．４ｍｍ内径ｘ２５ｃｍ，４１．１ｍｍｘ５ｃｍのガードモジュールを有する）に適用した。カラムを、溶媒“Ａ”Ｈ2Ｏ−ＣＨ3ＯＨ−ＣＨ3ＣＮ（３０：３５：３５，０．１％のＮＨ4ＯＡｃを含む）から溶媒“Ｂ”Ｈ2Ｏ−ＣＨ3ＯＨ−ＣＨ3ＣＮ（１０：４５：４５，０．１％のＮＨ4ＯＡｃを含む）を混合した勾配を用いて４０ｍｌ／分の流量で溶離した。ポンピング系は６０分間で２５から７５％Ｂへの直線状勾配を与えるようにプログラムした。分離の進行は、２５０ｎｍに戻される可変波長ＵＶ検出器を用いて監視した。主ピークを６ｘ３分の画分として集めた。新規成分Ｐを含む画分１〜２を４０ｍｌに濃縮し、次いでＨ2Ｏ−ＣＨ3ＯＨ−ＣＨ3ＣＮ（３０：３５：３５）中で平衡化した同じＨＰＬＣカラム上で、Ｈ2Ｏ−ＣＨ3ＯＨ−ＣＨ3ＣＮ（３０：３５：３５）からＨ2Ｏ−ＣＨ3ＯＨ−ＣＨ3ＣＮ（１０：４５：４５）への６０分の直線状勾配を用いて溶離することにより脱塩した。ＵＶ吸収ピーク（溶離の最初の２分間を除く）を集め、濃縮乾固した。得られた残留物をｔ−ＢｕＯＨ（１０ｍｌ）に溶解し、凍結乾燥して純粋な成分Ｐ（４７９ｍｇ）を得た。プールされた、成分Ｐ及びＷの混合物を含む上記からの画分３〜４を２０ｍｌに濃縮し、０．１％のＮＨ4ＯＡｃを含むＨ2Ｏ−ＣＨ3ＯＨ−ＣＨ3ＣＮ（３０：３５：３５）で平衡化した分取逆相ＨＰＬＣカラム（Ｒａｉｎｉｎ Ｄｙｎａｍａｘ−６０Å ８μｍ Ｃ１８，４１．４ｍｍ内径ｘ２５ｃｍ，４１．１ｍｍｘ５ｃｍのガードモジュールを有する）に適用し、溶媒“Ａ”Ｈ2Ｏ−ＣＨ3ＯＨ−ＣＨ3ＣＮ（３０：３５：３５，０．１％のＮＨ4ＯＡｃを含む）から溶媒“Ｂ”Ｈ2Ｏ−ＣＨ3ＯＨ−ＣＨ3ＣＮ（１０：４５：４５，０．１％のＮＨ4ＯＡｃを含む）を混合した勾配を用いて１０ｍｌ／分の流量で溶離した。ポンピング系は６０分間で２５から７５％Ｂへの直線状勾配を与えるようにプログラムした。２つのＵＶ吸収主ピーク（成分Ｐ、続いて成分Ｗ）を集めた。成分Ｗ含有ピークを小体積に濃縮し、次いでＨ2Ｏ−ＣＨ3ＯＨ−ＣＨ3ＣＮ（３０：３５：３５）で平衡化した同じＨＰＬＣカラム上で脱塩した。成分Ｗは、Ｈ2Ｏ−ＣＨ3ＯＨ−ＣＨ3ＣＮ（３０：３５：３５）からＨ2Ｏ−ＣＨ3ＯＨ−ＣＨ3ＣＮ（１０：４５：４５）への６０分間の直線状勾配を用い、１０ｍｌ／分の流量で溶離させ、ＵＶ吸収ピークを１０ｘ３分の画分に集めた。プールされた画分２〜７を濃縮して残留物とし、それをｔ−ＢｕＯＨに溶解し、凍結乾燥して純粋な成分Ｗ（８２ｍｇ）を得た。上記からの成分Ｐ−含有ＵＶ吸収ピークを同様の方法で脱塩し、追加の純粋な成分Ｐ（１３２ｍｇ）を得た。
実施例５
シネフンジンの存在下で発酵させた株ＮＲＲＬ １８８２３（Ａ８３５４３．９）からのＡ８３５４３Ｕ及びＡ８３５４３Ｖの単離
実質的に実施例２Ａに記載の通りに調製した（株Ａ８３５４３．９を用いる以外）発酵ブロス（５００ｍｌ；３０ｘ２５０ｍｌ震盪フラスコ）を１時間撹拌しながらメタノール（１．３−Ｌ）で抽出し、次いで濾過助剤（３％Ｈｙｆｌｏ）を用いて濾過し、メタノール性濾液（１．５−Ｌ）を得た。バイオマスをメタノール（７００ｍｌ）で再抽出し、濾過した。２つのメタノール性抽出物を合わせ、等体積の水を加えた。ＨＰ−２０樹脂（７５ｍｌ）を加え、２時間撹拌し、その後スラリをガラスのクロマトグラフィーカラム中に注いだ。流出液（５−Ｌ）を捨て、カラムのＣＨ3ＯＨ−Ｈ2Ｏ（１：１）洗浄液（５００ｍｌ）も捨てた。次いでカラムをアセトン（２５０ｍｌ）で溶離した。アセトン溶離液を、全ブロスの類似の抽出及びクロマトグラフィーから得た溶離液（５００ｍｌ；４０ｘ２５０ｍｌ震盪フラスコ）と合わせ、濃縮乾固した。得られた残留物をジクロロメタン（１０ｍｌ）に溶解し、アセトニトリル中で平衡化したシリカゲル（ＥＭ等級６２，６０〜２００メッシュ）のカラム（２．５ｃｍｘ２５ｃｍ）に適用した。カラムをアセトニトリルで洗浄し、次いでアセトニトリルからアセトニトリル−メタノール（４：１）への直線状勾配を用いて溶離させ、２５ｍｌの画分を集めた。新規Ａ８３５４３成分Ｕ及びＶを含む画分３４〜４３をプールし（２００ｍｌ）、濃縮乾固した。残留物をメタノール（２ｍｌ）に溶解し、０．１％のＮＨ4ＯＡｃを含むＨ2Ｏ−ＣＨ3ＯＨ−ＣＨ3ＣＮ（３０：３５：３５）で平衡化した分取逆相ＨＰＬＣカラム（Ｒａｉｎｉｎ Ｄｙｎａｍａｘ−６０Å ８μｍ Ｃ１８，４１．４ｍｍ内径ｘ２５ｃｍ，４１．１ｍｍｘ５ｃｍのガードモジュールを有する）に適用した。カラムは０．１％のＮＨ4ＯＡｃを含むＨ2Ｏ−ＣＨ3ＯＨ−ＣＨ3ＣＮ（３０：３５：３５）から０．１％のＮＨ4ＯＡｃを含むＨ2Ｏ−ＣＨ3ＯＨ−ＣＨ3ＣＮ（１０：４５：４５）への６０分の直線状勾配を用いて１０ｍｌ／分の流量で溶離させた。残留成分Ｈ及びＱの前に新規成分Ｕ及びＶを含む主ピーク（２５０ｎｍにおいてＵＶ監視）を集めた。成分Ｕを含むプールをＨ2Ｏ−ＣＨ3ＯＨ−ＣＨ3ＣＮ（３０：３５：３５）で平衡化した同じＨＰＬＣカラム上で、Ｈ2Ｏ−ＣＨ3ＯＨ−ＣＨ3ＣＮ（３０：３５：３５）からＨ2Ｏ−ＣＨ3ＯＨ−ＣＨ3ＣＮ（１０：４５：４５）への直線状勾配を用いて溶離させることにより脱塩した。成分Ｕは２分の画分（１０）として溶離させた。画分２〜８をプールし、次いで濃縮乾固した。残留物をｔ−ＢｕＯＨ（５ｍｌ）に溶解し、凍結乾燥し、純粋な成分Ｕ（７１ｍｇ）を得た。成分Ｖ−含有プールは同じ方法により脱塩及び凍結乾燥し、純粋な成分Ｖ（７ｍｇ）を得た。
実施例６
シネフンジンの存在下で発酵させたＮＲＲＬ １８５３８（Ａ８３５４３．４）からのＡ８３５４３Ｋ及びＡ８３５４３Ｏの単離
発酵ブロス（２１０−Ｌ）を実質的に実施例２Ｂに記載の通りに調製した。全ブロスにアセトンを加え、ｐＨを８．０に調節した。得られた混合物をセラミックフィルターを通して濾過し、濾液（３７０−Ｌ）を得た。ブロス／アセトン濾液をＨＰ−２０ｓｓ樹脂（Ｍｉｔｓｕｂｉｓｈｉ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ．Ｌｔｄ．，Ｊａｐａｎ）を含むスチールカラム（１０−Ｌ，１０ｃｍｘ１２２ｘｍ）上に１−Ｌ／分の流量で負荷し、流出液を１つのプールとして集めた。カラムを溶媒“Ａ”（０．１％ＮＨ4ＯＡｃ）から溶媒“Ｂ”（ＣＨ3ＯＨ−ＣＨ3ＣＮ；１：１）を混合した勾配を用いて１−Ｌ／分の流量で溶離した。ポンピング系は５０％Ｂを２分間配達し、その後５０−８０％Ｂの直線状勾配（４５分間）、８０−９０％Ｂの直線状勾配（３３分間）が続くようにプログラムし、２０ｘ４Ｌの画分を集めた。成分Ｋ及びＯを含む画分１３〜１７をプールした。カラムの流出液（上記参照）を５ＮのＮａＯＨを用いてｐＨ９．５に調節し、ＨＰ−２０ｓｓカラムに再度適用した。ポンピング系は、５０％Ｂを１分間、５０−７５％Ｂの直線状勾配（３０分間）、７５〜８５％Ｂの直線状勾配（４５分間）、８５−８８％Ｂの直線状勾配（１５．４分間）及び８８−１００％Ｂの直線状勾配（２０分間）を１−Ｌ／分の流量で配達するようにプログラムし、２２ｘ４Ｌの画分を集めた。画分７〜１７をプールし、プール（最初のＨＰ−２０ｓｓクロマトグラフィーからの画分１３〜１７（上記参照））と合わせた。合わせたプールを４−Ｌに濃縮し、次いでさらに濃縮乾固し、ＣＨ3ＯＨ（１００ｍｌ）に再溶解し、次いでＣＨ3ＣＮ（３−Ｌ）中に沈澱させた。得られた沈澱を濾過により除去し、ＣＨ3ＣＮで洗浄し、捨て：濾液を濃縮乾固した。得られた残留物をジクロロメタン（５０ｍｌ）に再溶解し、アセトニトリル中で平衡化したシリカゲル（ＥＭ等級６２，６０〜２００メッシュ）のカラム（６ｃｍｘ２４ｃｍ）に適用した。カラムをＣＨ3ＣＮ（４−Ｌ）、次いでＣＨ3ＣＮ−ＣＨ3ＯＨ（９：１；１０−Ｌ）を用いて溶離し、１０ｘ２５０ｍｌ画分、続いて７ｘｌＬ画分を採取した。成分Ｋ及びＯを含む画分６〜１５を濃縮乾固した。得られた残留物をＣＨ3ＯＨ（１００ｍｌ）に溶解し、Ｈ2Ｏ−ＣＨ3ＯＨ−ＣＨ3ＣＮ；（５０：１７５：１７５，０．１％ＮＨ4ＯＡｃを含む）中で平衡化した分取逆相ＨＰＬＣカラム（Ｒａｉｎｉｎ Ｄｙｎａｍａｘ−６０Å ８μｍ Ｃ１８，４１．４ｍｍ内径ｘ２５ｃｍ，４１．４ｍｍｘ５ｃｍのガードモジュールを有する）に適用した（２０回で）。カラムは４０ｍｌ／分の流量で溶離した。分離の進行を２５０ｎｍに戻る可変波長ＵＶ検出器を用いて監視した。ＵＶ吸収ピーク（２０回のクロマトグラフィーから）を７プールに集めた。２つの最大ピークは成分Ｋ及びＯに対応した。プール３（６−Ｌ）は成分Ｋ（純度９８％）を含んだ。成分Ｏ及びＫを含むプール４（８−Ｌ）を２００ｍｌに濃縮し、同一条件下で再度クロマトグラフィーにかけ（４回）、２つのピークを２つのプールとして集めた。プール１（３−Ｌ）は成分Ｋ（純度９８％）を含んだ。プール２（５−Ｌ）は成分Ｏ（９５％）及び成分Ｋ（５％）を含んだ。プール２を１００ｍｌに濃縮し、同じＨＰＬＣカラム上のクロマトグラフィー（３回）により、Ｈ2Ｏ−ＣＨ3ＯＨ−ＣＨ3ＣＮ（３０：３５：３５）からＨ2Ｏ−ＣＨ3ＯＨ−ＣＨ3ＣＮ（１０：４５：４５）への６０分間の直線状勾配を用いて溶離して脱塩した。ＵＶ吸収溶離液を１０ｘ３分の画分として集めた。純度＞９８％の成分Ｏを含む画分をプールし、濃縮乾固し、ｔ−ＢｕＯＨから凍結乾燥して成分Ｏ（２．５ｇ；純度＞９８％）を得た。最初の分取ＨＰＬＣ分離（プール３、６−Ｌ）及び成分Ｏの再精製（プール１、３−Ｌ）からの成分Ｋ含有プールを合わせ、２００ｍｌに濃縮し、成分Ｏと同じ方法で脱塩した。純度＞９８％の成分Ｋを含む画分をプールし、濃縮乾固し、ｔ−ＢｕＯＨから凍結乾燥し、成分Ｋ（１１．１ｇ；純度＞９９％）を得た。
実施例７
株ＮＲＲＬ １８７４３（Ａ８３５４３．８）からのＡ８３５４３Ｋ、Ａ８３５４３Ｏ及びＡ８３５４３Ｙの単離
発酵ブロス（２６０−Ｌ）を実質的に実施例２Ｂに記載の通りに調製した。５ＮのＨＣｌを用いてｐＨを３．０に調節した後、全ブロスにアセトン（２６０−Ｌ）を加えた。得られた混合物をセラミックフィルターを通して濾過し、濾液（４８０−Ｌ）を得、それを週末をかけて冷却下に保った。ブロス／アセトン濾液を２５％のＮａＯＨを用いてｐＨ１２に調節し、セラミックフィルターを通して２回濾過した後、ＨＰ−２０ｓｓ樹脂（Ｍｉｔｓｕｂｉｓｈｉ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ．Ｌｔｄ．，Ｊａｐａｎ）を含むスチールカラム（１０−Ｌ，１０ｃｍｘ１２２ｘｍ）上に０．５−Ｌ／分の流量で負荷した。カラムをＣＨ3ＣＮ−ＣＨ3ＯＨ−０．１％ＮＨ4ＯＡｃ水溶液（ＮＨ4ＯＨを用いてｐＨ８．１に調節）（２５：２５：５０；２０−Ｌ）で洗浄した。新規成分Ｋ、Ｏ及びＹをＣＨ3ＣＮ−ＣＨ3ＯＨ−０．１％ＮＨ4ＯＡｃ水溶液（ＮＨ4ＯＨを用いてｐＨ８．１に調節）（９５：９５：１０；３０−Ｌ）を用い、１−Ｌ／分の流量で溶離させた。溶離液（３０−Ｌ）を濃縮し、ＣＨ3ＯＨに再溶解し、再度濃縮乾固し、ＣＨ3ＯＨ（１００ｍｌ）に再溶解し、次いでＣＨ3ＣＮ（２−Ｌ）中に沈澱させた。得られた沈澱を濾過により除去し、ＣＨ3ＣＮで洗浄し、捨て：合わせた濾液及び洗浄液（３−Ｌ）を濃縮乾固した。得られた残留物をジクロロメタン（５０ｍｌ）に再溶解し、アセトニトリル中で平衡化したシリカゲル（ＥＭ等級６２，６０〜２００メッシュ）のカラム（７．５ｃｍｘ５０ｃｍ）に適用した。カラムをＣＨ3ＣＮ（１０−Ｌ）、次いでＣＨ3ＣＮ−ＣＨ3ＯＨ（９：１；２０−Ｌ）、続いてＣＨ3ＣＮ−ＣＨ3ＯＨ（８：２；１０−Ｌ）を用いて溶離し、１−Ｌの画分を集めた。画分１１〜３０をプールし、濃縮乾固した。得られた残留物をＣＨ3ＯＨ（５０ｍｌ）に溶解し、Ｈ2Ｏ−ＣＨ3ＯＨ−ＣＨ3ＣＮ；（５０：１７５：１７５，０．１％ＮＨ4ＯＡｃを含む）中で平衡化した分取逆相ＨＰＬＣカラム（Ｒａｉｎｉｎ Ｄｙｎａｍａｘ−６０Å ８μｍ Ｃ１８，４１．４ｍｍ内径ｘ２５ｃｍ，４１．４ｍｍｘ５ｃｍのガードモジュールを有する）に適用した（１０回で）。カラムは４０ｍｌ／分の流量で、Ｈ2Ｏ−ＣＨ3ＯＨ−ＣＨ3ＣＮ；（５０：１７５：１７５，０．１％のＮＨ4ＯＡｃを含む）からＨ2Ｏ−ＣＨ3ＯＨ−ＣＨ3ＣＮ；（１０：４５：４５，０．１％のＮＨ4ＯＡｃを含む）への６０分間の直線状勾配を用いて溶離した。分離の進行を２５０ｎｍに戻る可変波長ＵＶ検出器を用いて監視した。集められた最初の３つのピーク（プールされた１０回分）は少量成分Ｙ（プール１、１−Ｌ）、成分Ｋ（プール２、８−Ｌ）及び成分Ｏ（プール３、４−Ｌ）に対応した。プール２を小体積に濃縮し、次いで同じカラム上で再度クロマトグラフィーにかけ、緩衝液を用いずに溶離することにより脱塩した。ＵＶ吸収ピークに対応する流出液を濃縮乾固し、ｔ−ＢｕＯＨに溶解し、凍結乾燥して純粋な成分Ｋ（７．３ｇ）を得た。プール３を同様の方法で脱塩及び凍結乾燥し、純粋な成分Ｏ（１．４ｇ）を得た。プール１を類似のクロマトグラフィー（Ｒａｉｎｉｎ Ｄｙｎａｍａｘ−６０Å ８μｍ Ｃ１８，４１．４ｍｍ内径ｘ２５ｃｍ，４１．４ｍｍｘ５ｃｍのガードモジュールを有する）により脱塩し、同様の方法で凍結乾燥し、純粋な成分Ｙ（４６ｍｇ）を得た。
実施例８
Ａ８３５４３Ｋプソイドアグリコン
Ａ８３５４３Ｋの試料（１００ｍｇ）を２Ｎの硫酸（１０ｍｌ）に溶解した。この溶液を約８０℃において１．２５時間加熱し、得られた混合物を室温に冷却した。沈澱を濾過により集め、冷脱イオン水で洗浄し、乾燥して５９ｍｇのＡ８３５４３Ｋプソイドアグリコンを得た。
元素分析
ＭＳ（ＦＤ）：ｍ／ｚ ５７６（１００％）
ＩＲ（ＣＨＣｌ3）：２９３６．０、１７１４．９、１６５９．０ｃｍ-1
ＵＶ（ＥｔＯＨ）：λmax ２４３ｎｍ
実施例９
Ａ８３５４３Ｏプソイドアグリコン
Ａ８３５４３Ｏの試料（５００ｍｇ）を脱イオン水（４０ｍｌ）に懸濁し、完全に溶解させるのに十分な体積の１ＮのＨ2ＳＯ4を加えた（約０．２５ｍｌ）。得られた溶液を約８０℃に３時間加熱し、次いで室温に冷却した。沈澱を濾過により集め、冷脱イオン水で洗浄し、乾燥した。濾液をＮａＣｌで飽和させ、メチレンクロリドで抽出した。メチレンクロリド抽出液を合わせ、ブラインで抽出し、乾燥し（Ｋ2ＣＯ3）、蒸発乾固した。残留物を沈澱と合わせ、３４８ｍｇの粗生成物を得た。
粗生成物をフラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル６０、２３０〜４００メッシュ）により、酢酸エチル及びヘキサンの混合物（７：３）を用いて溶離して精製した。所望の化合物を含む画分を蒸発乾固して１４６．５ｍｇのＡ８３５４３Ｏプソイドアグリコンを得た。
元素分析
ＭＳ（ＦＤ）：ｍ／ｚ ５９０（１００％）、５９１（７０％、Ｍ＋）、５９２（２０％、Ｍ＋Ｈ）、５９３（５％、Ｍ＋２）
ＩＲ（ＣＨＣｌ3）：３０１４．２、２９３２．２、１７１４．９、１６５９．０ｃｍ-1
ＵＶ（ＥｔＯＨ）：λmax ２４２ｎｍ（ε ９．１８５）
実施例１０
Ｎ−デメチル−Ａ８３５４３Ｋ
Ａ８３５４３Ｋ（１０１．５ｍｇ、０．１４ミリモル）及び酢酸ナトリウム三水和物（１４２．４ｍｇ、１．０５ミリモル）をメタノール及びｐＨ９緩衝液（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）の混合物に加えた。得られた懸濁液を約４７℃に加熱し、次いでヨウ素（４７．７ｍｇ、０．１９ミリモル）を一度に加えた。４７℃において２時間半後、反応物を室温に冷却した。室温でさらに３時間撹拌した後、反応溶液を５％のチオ硫酸ナトリウム溶液に加えた。得られた無色の水性混合物をジエチルエーテルで抽出した。次いで水相をＮａＣｌで飽和させ、メチレンクロリドで抽出した。メチレンクロリド抽出物をジエチルエーテル抽出物と合わせ、ブラインで洗浄し、Ｋ2ＣＯ3上で乾燥した。乾燥溶液を次いで真空中で蒸発乾固し、７９．３ｍｇのＮ−デメチル−Ａ８３５４３Ｋを白色のガラスとして得た（収率８１％）。
ＭＳ（ＦＤ）：ｍ／ｚ ７０３（１００％、Ｍ＋）、７０４（５７％、Ｍ＋Ｈ）、７０５（１９％、Ｍ＋２）
元素分析（Ｃ39Ｈ61ＮＯ10）計算値：Ｃ，６６．５５；Ｈ，８．７３；Ｎ，１．９９；測定値：Ｃ，６４．８０；Ｈ，８．６７；Ｎ，１．９５
ＩＲ（ＫＢｒ）：３４６２．７、２９３４．１、１７２１．７、１６６０．９、１４５７．４ｃｍ-1
実施例１１
ジ−Ｎ−デメチル−Ａ８３５４３Ｋ
ＭｅＯＨ（４０ｍｌ）中のＮ−デメチル−Ａ８３５４３Ｋ（８９１ｍｇ、１．２７ミリモル）の溶液を３℃に冷却した。新しく調製したメタノール中の１ＭのＮａＯＭｅ（６．３ｍｌ、６．３ミリモル）及びヨウ素（１．６１ｇ、６．３ミリモル）をこの溶液に連続的に加えた。反応溶液を３℃に５時間保ち、次いで５％チオ硫酸ナトリウム／希水酸化アンモニウム溶液に加えた。得られた混合物を酢酸エチルで抽出した。合わせた酢酸エチル抽出物をブラインで洗浄し、Ｋ2ＣＯ3上で乾燥した。乾燥溶液を真空中で蒸発乾固し、７７０ｍｇの粗生成物を得た。
所望の化合物をフラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル６０、２３０〜４００メッシュ、２インチｘ８インチ）により、メチレンクロリド及びメタノールの混合物（９３：７）を用いて溶離して部分的に精製した。所望の化合物を逆相ＨＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ Ｐｒｅｐ ＮＯＶＡ−Ｐａｋ，ＯＤＳ，６０Å，４０ｍｍｘ３００ｍｍ）により、メタノール／アセトニトリル／０．２５％酢酸アンモニウム（４０：４０：２０）を用いて溶離してさらに精製し、４６３．６ｍｇ（収率５３％）のジ−Ｎ−デメチル−Ａ８３５４３Ｋを無色のガラスとして得た。
元素分析（Ｃ38Ｈ59ＮＯ10）計算値：Ｃ，６６．１６；Ｈ，８．６２：Ｎ，２．０３；測定値：Ｃ，６６．２９；Ｈ，８．６３；Ｎ，２．０２
ＭＤ（ＦＤ）：ｍ／ｚ ６９０（１００％、Ｍ＋）、６８９（７０％）、６９１（５９％、Ｍ＋Ｈ）、７０４（２０％）
ＵＶ（ＥｔＯＨ）：λmax ２４４ｎｍ（ε １０，３２８）
ＩＲ（ＣＨＣｌ3）：３７００、３６００、３５５０〜３３５０（ｂｒ）、３４２０、２９７５、１７００、１６７５、１６２０ｃｍ-1
本発明は発酵生成物Ａ８３５４３の新規成分に関する。
発明の背景
標的昆虫は現在利用できる殺虫剤に対する耐性を急速に発現しつつある。節足動物における殺虫剤に対する耐性は広範囲であり、少なくとも４００の種が１つ又はそれ以上の殺虫剤に対する耐性を示す。ＤＤＴ、カルバメート類及び有機リン酸塩類などの比較的古い殺虫剤に対する耐性の発現は十分に文献により証明されている（Ｂｒａｔｔｓｔｅｎ，ｅｔ ａｌ．（１９８６），Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３１：１２５５を参照）。比較的新しいピレスロイド殺虫剤に対する耐性の発現を含む合成殺虫剤に対する耐性は非常に急速に発現した（Ｐｉｃｋｅｔｔ（１９８８），Ｃｈｅｍ．Ｂｒｉｔａｉｎ，１３７を参照）。従って新規な殺虫剤が求められている。
サッカロポリスポラ・スピノサ（Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ ｓｐｉｎｏｓａ）により製造される関連化合物の一群である発酵生成物Ａ８３５４３は近年発見され、優れた殺虫活性を示すことが示された。Ａ８３５４３及びその個々の化合物はダニ及び昆虫、特に鱗翅類（Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ）及び双翅類（Ｄｉｐｔｅｒａ）の抑制に有用である。
“Ａ８３５４３化合物”は１２−員大環状ラクトン、中性糖及びアミノ糖に縮合した５，６，５−三環系から成る成分を意味する（Ｋｉｒｓｔ ｅｔ ａｌ．（１９９１），Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ，３２：４８３９を参照）。Ａ８３５４３の天然成分の群はＥＰＯ出願番号０３７５３１６に記載され、以下の一般式：
Ｒ1はＨ又は
Ｒ2、Ｒ4、Ｒ3、Ｒ5及びＲ6は水素又はメチルである］
を有する種類、あるいはＲ1が水素以外である場合のそれらの酸付加塩を含む。
Ａ８３５４３発酵産物からの化合物の群は、各成分Ａ８３５４３Ａ、Ａ８３５４３Ｂ、Ａ８３５４３Ｃ、Ａ８３５４３Ｄ、Ａ８３５４３Ｅ、Ａ８３５４３Ｆ、Ａ８３５４３Ｇ Ａ８３５４３Ｈ及びＡ８３５４３Ｊ（ヨーロッパ特許公開番号０ ３７５ ３１６を参照）；各成分Ａ８３５４３Ｌ、Ａ８３５４３Ｍ及びＡ８３５４３Ｎ（１９９３年４月１３日発行の米国特許番号５，２０２，２４２を参照）；ならびに各成分Ａ８３５４３Ｑ、Ａ８３５４３Ｒ、Ａ８３５４３Ｓ及びＡ８３５４３Ｔ（１９９２年１１月６日出願の“Ｎｅｗ Ａ８３５４３ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｔｈｅｒｅｏｆ”という標題のＴｕｒｎｅｒ，Ｂｒｏｕｇｔｏｎ，Ｈｕｂｅｒ ａｎｄ Ｍｙｎｄｅｒｓｅの同時係属米国特許出願（米国特許出願番号０７／９７３，１２１）を参照）を含むことが示された。これらの各成分及びそれらから誘導されるシュードアグリコンの構造を下記に示す。
発明の概要
本発明はＡ８３５４３化合物群の新規な種類を目的とし、該種類は式１
Ｒ8、Ｒ9、Ｒ10、Ｒ11及びＲ12は独立して水素又はメチルであり、
但しＲ11及びＲ12は同時に水素であることはない］
の化合物又はＲ7が水素以外である場合のそれらの酸付加塩を含む。
特に本発明は発酵生成物Ａ８３５４３の新規な成分に関する。式２化合物と命名される新規な成分は以下の一般式：
Ｒ13は式
Ｒ14、Ｒ15、Ｒ16、Ｒ17及びＲ18は独立して水素又はメチルであり、
但し、Ｒ17及びＲ18は同時に水素であることはない］
を有し、あるいはＲ1が水素以外の場合のそれらの酸付加塩である。
好ましくは本発明はＡ８３５４３Ｋ、Ａ８３５４３Ｏ、Ａ８３５４３Ｐ、Ａ８３５４３Ｕ、Ａ８３５４３Ｖ、Ａ８３５４３Ｗ及びＡ８３５４３Ｙと称される式２成分である新規なＡ８３５４３成分に関し、各成分に関するＲ13、Ｒ14、Ｒ15、Ｒ16、Ｒ17及びＲ18は以下の通りである：
本発明のさらに別の側面は、Ｓ．スピノサ株ＮＲＲＬ １８７４３（Ａ８３５４３．８）又はそれらのＡ８３５４３Ｋ−生産性突然変異株を適した培地中で、深部好気的発酵条件下において回収可能な量の式１の化合物が生産されるまで培養することを含む式１の化合物の製造法である。式１の化合物は本明細書に記載の通りに単離し、精製することができる。
株ＮＲＲＬ １８７４３は新規に発見された株なので、本発明はさらにこの微生物の生物学的に精製された培養物も提供する。
式２の化合物はダニ及び昆虫、特に鱗翅類、同翅類及び双翅類の抑制に有用である。従って殺虫及び殺ダニ性組成物、ならびにこれらの化合物を用いた昆虫及びダニの個体群を減少させる方法も本発明の一部である。
図面の説明
図１はＫＢｒ中におけるＡ８３５４３Ｋの赤外吸収スペクトルを示す。
図２はアセトン−ｄ6中におけるＡ８３５４３Ｋのプロトン核磁気共鳴スペクトルを示す。
図３はＥｔＯＨ中におけるＡ８３５４３ＫのＵＶスペクトルを示す。
図４はＫＢｒ中におけるＡ８３５４３Ｏの赤外吸収スペクトルを示す。
図５はアセトン−ｄ6中におけるＡ８３５４３Ｏのプロトン核磁気共鳴スペクトルを示す。
図６はＥｔＯＨ中におけるＡ８３５４３ＯのＵＶスペクトルを示す。
図７はＫＢｒ中におけるＡ８３５４３Ｐの赤外吸収スペクトルを示す。
図８はアセトン−ｄ6中におけるＡ８３５４３Ｐのプロトン核磁気共鳴スペクトルを示す。
図９はＥｔＯＨ中におけるＡ８３５４３ＰのＵＶスペクトルを示す。
図１０はＫＢｒ中におけるＡ８３５４３Ｕの赤外吸収スペクトルを示す。
図１１はアセトン−ｄ6中におけるＡ８３５４３Ｕのプロトン核磁気共鳴スペクトルを示す。
図１２はＥｔＯＨ中におけるＡ８３５４３ＵのＵＶスペクトルを示す。
図１３はＫＢｒ中におけるＡ８３５４３Ｖの赤外吸収スペクトルを示す。
図１４はアセトン−ｄ6中におけるＡ８３５４３Ｖのプロトン核磁気共鳴スペクトルを示す。
図１５はＥｔＯＨ中におけるＡ８３５４３ＶのＵＶスペクトルを示す。
図１６はＫＢｒ中におけるＡ８３５４３Ｗの赤外吸収スペクトルを示す。
図１７はアセトン−ｄ6中におけるＡ８３５４３Ｗのプロトン核磁気共鳴スペクトルを示す。
図１８はＥｔＯＨ中におけるＡ８３５４３ＶのＵＶスペクトルを示す。
図１９はＫＢｒ中におけるＡ８３５４３Ｙの赤外吸収スペクトルを示す。
図２０はアセトン−ｄ6中におけるＡ８３５４３Ｙのプロトン核磁気共鳴スペクトルを示す。
図２１はＥｔＯＨ中におけるＡ８３５４３ＶのＵＶスペクトルを示す。
図２２は株ａ８３５４３．１、Ａ８３５４３．３、Ａ８３５４３．４、Ａ８３５４３．５、Ａ８３５４３．６、Ａ８３５４３．７、Ａ８３５４３．８及びＡ８３５４３．９に関する脂肪酸分析の主成分プロットを示す。
ここで、Ｒ7は水素又は式
Ｒ8、Ｒ9、Ｒ10、Ｒ11及びＲ12は独立して水素又はメチルであり、但しＲ11及びＲ12は同時に水素であることはなく、あるいはＲ7が水素以外の場合のそれらの酸付加塩となる。
本発明の好ましい側面はＲ8及びＲ10がメチルである式１化合物である。本発明のより好ましい側面はＲ8及びＲ10がメチルであり、Ｒ7が式
本発明の別の側面は発酵生成物Ａ８３５４３の新規な成分である。式２化合物と命名されるこれらの新規なＡ８３５４３成分は以下の化学構造：
Ｒ14、Ｒ15、Ｒ16、Ｒ17及びＲ18は独立して水素又はメチルであり、但しＲ17及びＲ18は同時に水素であることはない］
を有するか、あるいはＲ13が水素以外の場合のそれらの酸付加塩である。
本発明のより好ましい側面はＲ14がＣＨ3であり、Ｒ13が式
好ましくは本発明はＡ８３５４３Ｋ、Ａ８３５４３Ｏ、Ａ８３５４３Ｐ、Ａ８３５４３Ｕ、Ａ８３５４３Ｖ、Ａ８３５４３Ｗ及びＡ８３５４３Ｙと称される式２化合物である新規なＡ８３５４３成分に関し、ここで各新規成分に関するＲ13、Ｒ14、Ｒ15、Ｒ16、Ｒ17及びＲ18はそれぞれ以下の通りである：
読者の便利のために、Ａ８３５４３Ｋの以下の図は下記に示すＡ８３５４３天然因子（ｎａｔｕｒａｌ ｆａｃｔｏｒｓ）に関するすべてのＮＭＲスペクトルデータの位置指定を与える：
Ａ８３５４３Ｋは以下の特性を有する：
分子量：７１７
実験式：Ｃ40Ｈ63ＮＯ10
ＵＶ（ＥｔＯＨ）：２４３ｎｍ（ε＝１０，６５７）
ＭＳ（ＦＡＢ）：（Ｍ＋Ｈ）ｍ／ｚ ７１８
ＩＲ（ＫＢＲ）：図１を参照。
表Ｉは図２に示されるＡ８３５４３Ｋに関する1Ｈ及び13Ｃ ＮＭＲスペクトルデータ（アセトン−ｄ6中）をまとめたものである。
分子量：７３１
実験式：Ｃ41Ｈ65ＮＯ10
ＵＶ（ＥｔＯＨ）：２４３ｎｍ（ε＝９，２６７）
ＭＳ（ＦＡＢ）：（Ｍ＋）ｍ／ｚ ７３１
ＩＲ（ＫＢＲ）：図３を参照。
表ＩＩは図４に示されるＡ８３５４３Ｏに関する1Ｈ及び13Ｃ核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクトルデータ（アセトン−ｄ6中）をまとめたものである。
分子量：７０３
実験式：Ｃ39Ｈ61ＮＯ10
ＵＶ（ＥｔＯＨ）：２４３ｎｍ（ε＝１３，７６０）
ＭＳ（ＦＡＢ）：（Ｍ＋Ｈ）ｍ／ｚ ７０４
ＩＲ（ＫＢＲ）：図５を参照。
表ＩＩＩは図６に示されるＡ８３５４３Ｐに関する1Ｈ及び13Ｃ核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクトルデータ（アセトン−ｄ6中）をまとめたものである。
Ａ８３５４３Ｕは以下の特性を有する：
分子量：７０３
実験式：Ｃ39Ｈ61ＮＯ10
ＵＶ（ＥｔＯＨ）：２４２ｎｍ（ε＝１７，０９５）
ＭＳ（ＦＡＢ）：（Ｍ＋Ｈ）ｍ／ｚ ７０４
ＩＲ（ＫＢＲ）：図７を参照。
表ＩＶは図８に示されるＡ８３５４３Ｕに関する1Ｈ及び13Ｃ核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクトルデータ（アセトン−ｄ6中）をまとめたものである。
Ａ８３５４３Ｖは以下の特性を有する：
分子量：７１７
実験式：Ｃ40Ｈ63ＮＯ10
ＵＶ（ＥｔＯＨ）：２４２ｎｍ（ε＝１０，１４０）
ＭＳ（ＦＡＢ）：（Ｍ＋Ｈ）ｍ／ｚ ７１８
ＩＲ（ＫＢＲ）：図９を参照。
表Ｖは図１０に示されるＡ８３５４３Ｖに関する1Ｈ及び13Ｃ核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクトルデータ（アセトン−ｄ6中）をまとめたものである。
Ａ８３５４３Ｗは以下の特性を有する：
分子量：７１７
実験式：Ｃ40Ｈ63ＮＯ10
ＵＶ（ＥｔＯＨ）：２４４ｎｍ（ε＝１０，２５４）
ＭＳ（ＦＡＢ）：（Ｍ＋Ｈ）ｍ／ｚ ７１８
ＩＲ（ＫＢＲ）：図１１を参照。
表ＶＩは図１２に示されるＡ８３５４３Ｗに関する1Ｈ及び13Ｃ核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクトルデータ（アセトン−ｄ6中）をまとめたものである。
分子量：７０３
実験式：Ｃ39Ｈ61ＮＯ10
ＵＶ（ＥｔＯＨ）：２４３ｎｍ（ε＝１４，０４２）
ＭＳ（ＦＡＢ）：（Ｍ＋Ｈ）ｍ／ｚ ７０４
ＩＲ（ＫＢＲ）：図１１を参照。
表ＶＩＩは図１２に示されるＡ８３５４３Ｙに関する1Ｈ及び13Ｃ核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクトルデータ（アセトン−ｄ6中）をまとめたものである。
アミノ糖は新規Ａ８３５４３成分から選択的に除去され、式３成分と命名される新規Ａ８３５４３プソイドアグリコンを与えることができる。これらの化合物は本発明の別の側面であり、Ｒ1が水素である式１の化合物である。
Ａ８３５４３Ｋ、Ａ８３５４３Ｏ、Ａ８３５４３Ｐ、Ａ８３５４３Ｕ、Ａ８３５４３Ｖ、Ａ８３５４３Ｗ及びＡ８３５４３Ｙからのアミノ糖の選択的除去は、それぞれＡ８３５４３Ｋプソイドアグリコン、Ａ８３５４３Ｏプソイドアグリコン、Ａ８３５４３Ｐプソイドアグリコン、Ａ８３５４３Ｕプソイドアグリコン、Ａ８３５４３Ｖプソイドアグリコン、Ａ８３５４３Ｗプソイドアグリコン及びＡ８３５４３Ｙプソイドアグリコンを与える。これらの化合物は次式：
プソイドアグリコンは新規Ａ８３５４３化合物の製造のための出発材料として有用であり、例えばプソイドアグリコンをアミノ糖が存在したヒドロキシル基においてグリコシル化することができる。このグリコシル化は化学合成により、又は微生物による生物変換（ｂｉｏｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ）により行うことができる。
本発明の別の側面はある種の式１化合物の化学的脱メチル化である。式１化合物は３つの小群、１Ａ、１Ｂ及び１Ｃに分類することができる。式１Ａ化合物はＲ7が式：
式１Ｂ化合物はＲ7が式：
式１Ｃ化合物はＲ7が式：
本明細書に記載の通り、式１Ｂ化合物は式１Ａ化合物から製造することができる。同様に式１Ｃ化合物は式１Ｂ化合物から製造することができる。これらの化合物は対応する新規Ａ８３５４３成分の化学的脱メチル化により製造することができる。これらの小群のそれぞれは式２化合物の小組でもある。
Ｎ−脱メチル化誘導体である式１Ｂ化合物は式１Ａ化合物とヨウ素及び酢酸ナトリウムとの反応により製造される。反応はメタノールなどの極性有機溶媒又はメタノール水溶液などの極性有機溶媒と水の混合物中で行われる。反応は、例えばｐＨ９緩衝液を用いることによりｐＨ９に保たれる。反応は約３０℃〜約７０℃の温度において約２〜約６時間行うのが好ましい。
ジ−Ｎ−脱メチル化誘導体である式１Ｃ化合物は式１Ｂ化合物とナトリウムメトキシド／ヨウ素との反応により製造することができる。反応はメタノールなどの極性有機溶媒中で行われる。さらに反応は約１０〜約１５℃、好ましくは約０℃〜５℃の温度で行われる。反応時間は約４時間〜約６時間まで変化する。
式１Ｂ及び１Ｃ化合物の例を次式に示す：
酸付加塩は特に有用である。代表的な適した塩には、有機及び無機酸の両方、例えば硫酸、塩酸、リン酸、酢酸、コハク酸、クエン酸、乳酸、マレイン酸、フマル酸、コール酸、パモ酸、粘液酸、グルタミン酸、樟脳酸、グルタル酸、グリコール酸、フタル酸、酒石酸、蟻酸、ラウリン酸、ステアリン酸、サリチル酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ソルビン酸、ピクリン酸、安息香酸、ケイ皮酸などの酸との標準的反応により形成される塩が含まれる。
続く議論を簡単にするために、Ａ８３５４３Ａ−製造株に以下の名称を与えた：Ａ８３５４３．１、Ａ８３５４３．３、Ａ８３５４３．４及びＡ８３５４３．５。又、新規Ａ８３５４３Ｋ−製造株にＡ８３５４３．８の名称を与えた。培養物Ａ８３５４３．１、Ａ８３５４３．３、Ａ８３５４３．４、Ａ８３５４３．５、Ａ８３５４３．６、Ａ８３５４３．７、Ａ８３５４３．８及びＡ８３５４３．９をＭｉｄｗｅｓｔ Ａｒｅａ Ｒｅｇｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ，Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ，に寄託し、原料培養物コレクション（ｓｔｏｃｋ ｃｕｌｔｕｒｅ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）の一部とし、それらはそこから以下の登録番号で公に入手することができる：
ＮＲＲＬ番号 株番号
１８３９５ Ａ８３５４３．１
１８５３７ Ａ８３５４３．３
１８５３８ Ａ８３５４３．４
１８５３９ Ａ８３５４３．５
１８７１９ Ａ８３５４３．６
１８７２０ Ａ８３５４３．７
１８７４３ Ａ８３５４３．８
１８８２３ Ａ８３５４３．９
培養物Ａ８３５４３．１はバージン島（Ｖｉｒｇｉｎ Ｉｓｌａｎｄ）で集められた土壌試料から単離された培養物Ａ８３５４３の化学的突然変異により得た。Ｍｅｒｔｚ ａｎｄ Ｙａｏ（１９９０），Ｉｎｔ’ｌ Ｊ． ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，４０：３４。培養物８３５４３．４は培養物Ａ８３５４３．１から誘導された。株Ａ８３５４３．３、Ａ８３５４３．４、Ａ８３５４３．５、Ａ８３５４３．６及びＡ８３５４３．７のそれぞれはＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジンを用いた化学的誘導突然変異誘発によりＡ８３５４３．１から誘導された。株Ａ８３５４３．８及びＡ８３５４３．９はＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジンを用いた化学的誘導突然変異誘発によりＡ８３５４３．４から誘導された。Ａ８３５４３成分の製造における差を除いて、これらの単離物は親培養物と同一であると思われる。なお、株Ａ８３５４３．８は、ブダペスト条約のもとで１９９０年１２月１９日にＮＲＲＬに国際寄託されている。
培養特性（Ｃｕｌｔｕｒａｌ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ）
培養物Ａ８３５４３．１、Ａ８３５４３．３、Ａ８３５４３．４、Ａ８３５４３．５、Ａ８３５４３．６、Ａ８３５４３．７、Ａ８３５４３．８及びＡ８３５４３．９を１２種の寒天平板培養培地上で生育し、成長、裏の色（ｒｅｖｅｒｓｅ ｃｏｌｏｒ）、気生菌糸製造、胞子塊（ｓｐｏｒｅ ｍａｓｓ）の色、及び可溶性色素製造に関して比較した。用いたいずれの培地においても有意な差は観察されなかった。培養物は複合培地及び規定培地の両方において十分に生育した。気生菌糸は、用いたほとんどの培地において製造された。気生胞子塊の色は主に白であり、裏側は黄色から黄褐色であった。明白な着色は存在しなかったが、可溶性の褐色の色素がいくつかの培地中に放出された。Ａ８３５４３．３、Ａ８３５４３．４、Ａ８３５４３．５、Ａ８３５４３．６、Ａ８３５４３．７、Ａ８３５４３．８及びＡ８３５４３．９の培養特性はＡ８３５４３．１の最初の分類学的説明と類似である（Ｍｅｒｔｚ ａｎｄ Ｙａｏ（１９９０），同上を参照）。
形態学的特性
分裂して（ｓｅｇｍｅｎｔｅｄ）鍵と環（ｈｏｏｋｓ ａｎｄ ｏｐｅｎ ｌｏｏｐｓ）のように配置された胞子の長鎖となった、十分に形成された気生菌糸はほとんどの培地に存在した。らせんも観察されたが、それらは短く、不完全であった。一般的形態はレクタス−フレキシビリス（ｒｅｃｔｕｓ−ｆｌｅｘｉｂｉｌｉｓ）であった。各株のそれぞれの気生菌糸は胞子鎖に多くの空の空間を有する明確なビーズ−様外観を有した。この特徴は胞子の鞘（ｓｐｏｒｅ ｓｈｅａｔｈ）が胞子鎖を包んでいることを示しており、それはサッカロポリスポラ属の明確な特徴である。Ａ８３５４３成分の製造における差を除いてこれらの単離物は親培養物と類似であると思われる。
生理学的特性
それぞれの株からの脂肪酸分析を比較した。細胞をトリプチカーゼしょうゆブロス（ｔｒｙｐｔｉｃａｓｅ ｓｏｙ ｂｒｏｔｈ）（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ）中で２８℃において９６時間生育した。脂肪酸メチルエステルを、５８９８Ａ型コンピューター制御気液クロマトグラフィー系（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ Ｃｏ．，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）を用いた気液クロマトグラフィーにより分析した（Ｍｉｌｌｅｒ ａｎｄ Ｂｅｒｇｅｒ，“Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｂｙ Ｇａｓ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｏｆ Ｗｈｏｌｅ Ｃｅｌｌ Ｆａｔｔｙ Ａｃｉｄｓ，”Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏｔｅ ２２８−４１を参照）。これらの結果を表ＶＩＩＩに示す。
他の生物の場合と同様に、Ａ８３５４３−生産株の特性は変異を受ける。かくしてこれらの株の突然変異株を当該技術分野において既知の物理的及び化学的方法により得ることができる。例えばＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジンなどの化学品を用いた処理により他の株を得ることができる。適した条件で培養した場合に回収可能な量の式１化合物を生産する特性を保持しているＳ．スピノサ ＮＲＲＬ １８３９５、ＮＲＲＬ １８５３７、ＮＲＲＬ １８５３８、ＮＲＲＬ １８５３９、ＮＲＲＬ １８７１９、ＮＲＲＬ １８７２０、ＮＲＲＬ １８７４３及びＮＲＲＬ １８８２３の自然及び誘発突然変異株を本発明において適用できる。
本発明の１つの側面は、ＮＲＲＬ １８３９５、ＮＲＬＬ １８５３７、ＮＲＲＬ １８５３８及びＮＲＲＬ １９５３９又はそれらのＡ８３５４３Ａ−製造突然変異株から成る群より選ばれるＳ．スピノサのＡ８３５４３Ａ−製造株をシネフンジンを含む適した培地中で培養することにより製造される式１の化合物の製造である。“Ａ８３５４３Ａ−製造突然変異株”は、Ｓ．スピノサのＡ８３５４３Ａ−製造株、ＮＲＲＬ １８３９５、ＮＲＲＬ １８５３７、ＮＲＲＬ １８５３８、ＮＲＲＬ １８５３９のいずれか１つから誘導され、回収可能な量のＡ８３５４３Ａを製造することができ、シネフンジンを含む適した培地中で培養された場合に付随量のＡ８３５４３Ｋ及びＡ８３５４３Ｏを製造することができる株である。
本発明の別の側面は、ＮＲＲＬ １８８２３又はそれらのＡ８３５４３Ｈ−製造突然変異株などのＳ．スピノサのＡ８３５４３Ｈ−製造株をシネフンジンを含む適した培地中で培養することによる式１の化合物の製造である。“Ａ８３５４３Ｈ−製造突然変異株”は、Ｓ．スピノサのＡ８３５４３Ｈ−製造株、ＮＲＲＬ １８８２３のいずれか１つから誘導され、回収可能な量のＡ８３５４３Ｈを製造することができ、シネフンジンを含む適した培地中で培養されると付随量のＡ８３５４３Ｕ及びＡ８３５４３Ｖを製造することができる株である。
本発明のさらに別の側面は、ＮＲＲＬ １８７１９又はそれらのＡ８３５４３Ｊ−製造突然変異株などのＳ．スピノサのＡ８３５４３Ｊ−製造株をシネフンジンを含む適した培地中で培養することによる式１の化合物の製造である。“Ａ８３５４３Ｊ−製造突然変異株”は、Ｓ．スピノサのＡ８３５４３Ｊ−製造株、ＮＲＲＬ １８７１９又はＮＲＲＬ １８７２０のいずれか１つから誘導され、回収可能な量のＡ８３５４３Ｊを製造することができ、約５０ｍｇ／ＭＬ〜約２００ｍｇ／ＭＬのシネフンジンを含む適した培地中で培養されると付随量のＡ８３５４３Ｐ及びＡ８３５４３Ｗを製造することができる株である。
典型的にシネフンジンは４８〜７２時間後に製造培地に加えられるか、あるいは大規模製造の場合シネフンジンの添加は培養物の成長の開始が酸素の吸収により示されるまで延期される。シネフンジンは接種の約４８時間〜約７２時間後に発酵培地に加えるのが好ましい。シネフンジンは個体として、又は溶液として加えることができる。便宜的に、シネフンジンが大規模発酵に加えられる場合、アルコール性溶液としての添加が好ましい。そのような溶液はシネフンジンを十分な体積のメチルアルコールに溶解し、次いで０．４５μフィルターを通して濾過することにより溶液を滅菌することにより調製される。
別の場合、式１化合物はＳ．スピノサ株 ＮＲＲＬ １８７４３（成分Ａ８３５４３Ｋ、Ａ８３５４３Ｏ及びＡ８３５４３Ｙを製造する）又はそれらのＡ８３５４３Ｋ−製造突然変異株をシネフンジンを添加しない適した培地中で培養することにより製造される。“Ａ８３５４３Ｋ−製造突然変異株”はＳ．スピノサ ＮＲＲＬ １８７４３から誘導され、回収可能な量のＡ８３５４３Ｋを製造することができる株である。
製造後、式１化合物は当該技術分野において十分に理解される種々の単離及び精製法を用いて培地から分離することができる。製造における経済性、最適収量及び生成物単離の容易さのために、ある種の培地が好ましい。例えば大規模発酵における好ましい炭素源はグルコース及びオレイン酸メチルであるが、リボース、キシロース、フルクトース、ガラクトース、マンノース、マンニトール、可溶性澱粉、ポテトデキストリン、油類、例えば大豆油なども用いることができる。好ましい窒素源は綿実粉、ペプトン化乳（ｐｅｐｔｏｎｉｚｅｄ ｍｉｌｋ）及びとうもろこし浸漬液（ｃｏｒｎ ｓｔｅｅｐ ｌｉｑｕｏｒ）であるが、魚粉、消化大豆粉、酵母抽出物、酵素−加水分解カゼイン、ビーフ抽出物なども用いることができる。培地中に挿入することができる栄養無機塩の中には、亜鉛、ナトリウム、マグネシウム、カルシウム、アンモニウム、塩化物、炭酸、硫酸、硝酸などのイオンを与えることができる通常の可溶性塩がある。生物の成長及び発育に必要な必須微量元素も培地に含まれなければならない。そのような微量元素は通常、培地の他の置換物中に不純物として、生物の成長条件を満たすのに十分な量で存在する。
通常、発泡が問題である場合、少量（すなわち０．２ｍＬ／Ｌ）のポリプロピレングリコールなどの消泡剤を大規模発酵培地に加えることができる。しかしＡ８３５４３−製造培養物の場合、従来の脱泡剤はＡ８３５４３製造を阻害する。発泡は培地中に大豆油又はＰＬＵＲＯＮＩＣ Ｌ−１０１（ＢＡＳＦ，Ｐａｒｓｉｐａｎｎｙ，ＮＪ）を含むことにより（１〜３％）抑制することができる。発泡が現れたら追加の油を加えることができる。
実質的量の式１化合物の製造のために、撹拌されたバイオリアクターにおける深部好気的発酵が好ましいが、震盪フラスコ培養によって少量の式１化合物を得ることができる。通常大バイオリアクターへの胞子の形態の生物の接種に伴う製造における遅れの故に、栄養接種材料（ｖｅｇｅｔａｔｉｖｅ ｉｎｏｃｕｌｕｍ）を用いるのが好ましい。栄養接種材料は、液体窒素中に保存された原料培養物からの小体積の培地を接種して生物の新しい、活発に成長している培養物を得ることにより調製される。次いで栄養接種材料を大バイオリアクターに移す。栄養接種材料の培地は、より大きな発酵に用いられるものと同一であることができるが、他の培地も適している。
式１化合物は約２４℃〜約３３℃の温度で生育した場合にＡ８３５４３−製造株から製造される。製造のための最適温度は約２８〜３０℃であると思われる。
深部好気的培養法で通常行われる通り、培地を従来のタービン撹拌機を用いて撹拌しながら底から無菌の空気を容器中に吹き込む。一般にエアレーション速度及び撹拌速度は、約０．３４気圧の内部容器圧力で溶解酸素の量を８０％か又はそれ以上に保持するのに十分でなければならない。
式１化合物の製造はブロスからの抽出物を調べることにより発酵の間、追跡することができる。製造の追跡のための好ましい方法は、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によるブロス抽出物の分析である。分析のために適した系は実施例１に記載されている。
震盪フラスコ又は撹拌反応器における製造に続いて、式１化合物を当該技術分野で用いられる方法により発酵培地から回収することができる。Ａ８３５４３−製造株の発酵の間に製造された化合物は、菌糸体及びブロスの両方に存在する。式１化合物は親油性であり、発酵に実質的量の油が用いられる場合、全ブロス抽出がより有効である。少量の油しか用いられない場合、式１化合物の大部分は菌糸体に存在する。その場合、式１化合物のより有効な回収は、最初に培地を濾過してブロスを菌糸体の塊（バイオマス）から分離することにより成される。
式１化合物は多様な方法によりバイオマスから回収することができる。適した方法は、分離されたバイオマスを水で洗浄した残留ブロスを除去し、バイオマスを式１化合物が可溶性の極性溶媒、例えばメタノール又はアセトンと混合し、分離して溶媒を濃縮し、濃縮物を非極性溶媒で抽出し、及び／又はそれを逆相シリカゲル吸着剤、例えば逆相Ｃ8又はＣ18樹脂、又はＨＰ−２０もしくはＨＰ−２０ｓｓ（Ｍｉｔｓｕｂｉｓｈｉ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．，Ｊａｐａｎ）などの非常に多孔質なポリマー上に吸着させる方法を含む。活性材料は、例えば場合により少量のＴＨＦを含むＨ2Ｏ：アセトニトリル：メタノール混合物などの適した溶媒を用いて吸着剤から溶離させる。
バイオマスからの式１化合物の単離のための好ましい方法は、全ブロスに等量のアセトンを加え、セラミックフィルターにおいて混合物を濾過してバイオマスを除去し、濾液を酢酸エチルで抽出する方法を含む。酢酸エチル抽出物を真空中で濃縮してアセトンを除去し、水層を有機層から分離する。酢酸エチル溶液をさらに真空中で濃縮し、濃縮液を希酸水溶液（ｐＨ３）で抽出する。式１化合物は本明細書に記載の通り、クロマトグラフィーによりさらに精製することができる。
バイオマスからの式１化合物の単離のためのより好ましい方法は、全ブロスに等体積のアセトンを加え、セラミックフィルターにおいて混合物を濾過してバイオマスを除去し、濾液のｐＨを約ｐＨ９〜約ｐＨ１３に調節する方法を含む。この溶液をＨＰ−２０ｓｓ（Ｍｉｔｓｕｂｉｓｈｉ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．，Ｊａｐａｎ）に適用し、カラムをメタノール、アセトニトル及び水（１：１：２）の混合物で洗浄する。式１化合物を０．１％の酢酸アンモニウム（ｐＨ８．１）を含むメタノール／アセトニトリル（１：１）の９５：５混合物を用いて溶離させる。式１化合物を含む画分を合わせ、凍結乾燥する。式１化合物は本明細書に記載の通り、クロマトグラフィーによりさらに精製することができる。
別の場合、培地成分及び菌糸体を含む培養物固体を抽出又は分離をせずに式１化合物の供給源として用いることができるが、水の除去の後が好ましい。例えば式１化合物の製造後、全発酵ブロスを凍結乾燥により、ドラム−乾燥により、又は共沸蒸留及び乾燥により乾燥することができる。次いで乾燥されたブロスを、例えばそれを飼料予備混合物中、又はスプレー及び粉末のための調剤中に直接混合することにより、直接用いることができる。
殺虫及び殺ダニ活性
式２化合物は昆虫及びダニの抑制に有用である。従って本発明の別の側面は、ダニ又は昆虫の場所（ｌｏｃｕｓ）に昆虫−又はダニ−阻害量の式２化合物を適用することを含む昆虫又はダニの阻害の方法を目的としている。
昆虫又はダニの“場所”は、昆虫又はダニが生存している、あるいはその卵が存在する環境を言い、それを取り巻く空気、それが食する食物、あるいはそれが接触する対象を含む。例えば植物−摂取昆虫又はダニは、昆虫又はダニが食する、又は棲息する植物部分、特に葉に活性化合物を適用することにより抑制することができる。
“昆虫又はダニの阻害”という用語は、生存昆虫又はダニの数の減少、あるいは生育し得る昆虫又はダニの卵の数の減少を言う。化合物により成される減少の程度は、もちろん化合物の適用比、用いられる特定の化合物、及び標的昆虫又はダニの種に依存する。少なくとも昆虫−不活性化又はダニ−不活性化量を用いなければならない。
“昆虫−不活性化量”及び“ダニ−不活性化量”という用語は、処理された昆虫又はダニの個体群における測定可能な減少を引き起こすのに十分な量を言うために用いられる。一般に約１〜約１，０００ｐｐｍ（又は０．０１〜１ｋｇ／ａ）の範囲の量の活性化合物が用いられる。
式２化合物は複数の昆虫及びダニに対して活性を示す。さらに特定的には、化合物は鱗翅類の昆虫のメンバーであるビート・アーミーワーム及びタバコ・バズワームに対して活性を示す。この目の他の典型的メンバーはサザン・アーミーワーム、コズリング・モス、カットワーム、クローズ・モス、インディアン・ミール・モス、リーフ・ローラー、コーン・イア・ワーム、コットン・ボールワーム、ヨーロピアン・コーン・ボーラー、インポーテッド・キャベツ・ワーム、キャベツ・ルーパー、ピンク・ボールワーム、バッグワーム、イースタン・テント・キャタピラー、ソド・ウェブワーム及びフォール・アーミーワームである。
式２化合物はリーフ・ホッパーに対しても活性を示し、それは同翅類の昆虫のメンバーである。この目の他のメンバーにはコットン・アフィド、プラント・ホッパー、ピア・プシラ、アップル・サッカー、スケール・インセクト、ホワイトフライ、及びスピットル・バグ、ならびに複数の他の宿主特異的アフィド種が含まれる。
さらに式２化合物はステープル・フライ、ブローフライ及び蚊に活性を示し、それらは双翅類の昆虫のメンバーである。この目の他の典型的メンバーはコモン・ハウス・フライである。
式２化合物は２点クモダニ（ｔｗｏ−ｓｐｏｔｔｅｄ ｓｐｉｄｅｒ ｍｉｔｅｓ）に対して活性を示し、これはダニ類の昆虫のメンバーである。この目の他の典型的メンバーにはメインジ・ダニ、スカブ・ダニ、シーブ・スカブ・ダニ、チキン・ダニ、スケーリーレッグ・ダニ、デプルミング・ダニ及びドッグ・フォリクル・ダニが含まれる。
式２化合物は昆虫及びダニの個体群を減少させるために有用であり、昆虫又はダニの個体群の阻害の方法で用いられ、その方法は昆虫又はダニの場所に昆虫−又はダニ−不活性化有効量の式２化合物を適用することを含む。１つの好ましい実施態様の場合、本発明は鱗翅類の感受性昆虫の阻害の方法を目的としており、その方法は本発明に従って昆虫−不活性化有効量の式２化合物を植物に適用することを含む。本発明の他の好ましい実施態様は、動物中の双翅類のバイティング・フライの阻害の方法を目的としており、その方法は有害生物−阻害有効量の式２化合物を経口的に、非経口的に、又は局所的に動物に投与することを含む。他の好ましい実施態様の場合、本発明は同翅類の感受性昆虫の阻害の方法を目的としており、それは昆虫−不活性化有効量の式２化合物を植物に適用することを含む。本発明の他の好ましい実施態様は、ダニ（Ａｃａｒｉｎａ）類のダニの阻害の方法を目的としており、それはダニ−不活性化量の式２化合物をダニの場所に適用することを含む。
ダニ／昆虫スクリーン
式２化合物を以下のダニ／昆虫スクリーンにおいて、殺ダニ及び殺虫活性に関して調べた。各試験化合物は、１リットル当たり２３ｇのＴＯＸＩＭＵＬ Ｒ（スルホネート／非イオン性乳化剤ブレンド）及び１３ｇのＴＯＸＩＭＵＬ Ｓ（スルホネート／非イオン性乳化剤ブレンド）を含むアセトン−アルコール（１：１）混合物に化合物を溶解することにより調製した。これらの混合物を次いで水で希釈し、示されている濃度を得た。
二点クモダニ及びコットン・アフィドをかぼちゃ（ｓｑｕａｓｈ）の子葉上に導入し、葉の両面に落ち着かせた。次いで、葉にＤｅＶｉｌｂｉｓｓ噴霧器を１０ｐｓｉで用いて５ｍｌの試験溶液を噴霧した。葉の両面を流れ落ちるまで覆い、次いで１時間乾燥させた。標準的暴露時間の後、パーセント死亡率を評価した。追加の昆虫を類似の調剤及び評価法を用いて評価した。結果を表ＩＸに報告する。以下の略字を用いる：
略字 有害生物 科学名
ＡＬＨ アスター・リーフホッパー マクロステレス・ファシフロンス（Ｍａｃｒｏｓｔｅｌｅｓ ｆａｓｃｉｆｒｏｎｓ）
ＢＡＷ ビート・アーミーワーム スポドプテラ・エクシグア（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｅｘｉｇｕａ）
ＣＡ コットン・アフィド アフィス・ゴシピイ・グロベル（Ａｐｈｉｓ ｇｏｓｓｙｐｉｉ Ｇｌｏｖｅｒ）
ＧＥＣＲ ジャーマン・コックローチ ブラテラ・ゲルマニカ（Ｂｌａｔｔｅｌｌａ ｇｅｒｍａｎｉｃａ）
ＮＥＭ ルートノット・ネマトード メリイオジン種（Ｍｅｌｉｉｏｄｙｎｅ ｓｐｐ．）
ＳＣＲＷ サザン・コーン・ルートワーム （ディアブロチカ・ウンデシンプンクタタ・ホワルジ（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ ｕｎｄｅｃｉｍｐｕｎｃｔａｔａ ｈｏｗａｒｄｉ）
ＴＢＷ タバコ・バズワーム ヘリオチス・ビレセンス（Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ ｖｉｒａｓｃｅｎｓ）
ＴＳＳＭ 二点クモダニ テトラニクス・ウルチカエ（Ｔｅｔｒａｎｙｃｈｕｓ ｕｒｔｉｃａｅ）
本発明の式２化合物を、やはり本発明の一部である組成物の形態で適用する。これらの組成物は昆虫−又はダニ−不活性化量の式２化合物を、植物学的に許容し得る不活性担体中に含む。活性成分である式２化合物は単独の式２化合物として、２種又はそれ以上の式２化合物の混合物として、少なくとも１種のＡ８３５４３Ｋ、Ａ８３５４３Ｏ、Ａ８３５４３Ｐ、Ａ８３５４３Ｕ、Ａ８３５４３Ｖ、Ａ８３５４３Ｗ及びＡ８３５４３Ｙの混合物として、あるいはそれが製造された発酵培地の乾燥部分と一緒の少なくとも１種のＡ８３５４３Ｋ、Ａ８３５４３Ｏ、Ａ８３５４３Ｐ、Ａ８３５４３Ｕ、Ａ８３５４３Ｖ、Ａ８３５４３Ｗ及びＡ８３５４３Ｙの混合物として存在することができる。
組成物は農業化学的分野において慣習的な方法及び処方に従って製造されるが、それは１種又はそれ以上の本発明の化合物が存在する故に新規であり、重要である。組成物は、適用の場合に水に分散される濃厚調剤、あるいはさらに処理を受けずに適用される粉剤又は顆粒剤であることができる。
化合物又は粗乾燥材料が適用される分散液は、化合物又は粗材料の濃厚調剤から調製される水性懸濁液又は乳液である場合が最も多い。そのような水溶性、水−懸濁性又は乳化性調剤は固体（通常水和剤として既知）又は液体（通常濃厚乳剤又は水性懸濁液として既知）のいずれかである。
圧縮して水分散性顆粒とすることができる水和剤は、活性化合物、不活性担体及び界面活性剤の均質な混合物を含む。活性化合物の濃度は通常約１重量％〜約９０重量％である。不活性担体は通常アタパルジャイトクレー、モントモリロナイトクレー、ケイ藻土又は精製シリカから選ばれる。
水和剤の約０．５％〜約１０％を構成する有効な界面活性剤は、スルホン化リグニン、縮合ナフタレン−スルホネート、ナフタレン−スルホネート、アルキルベンゼンスルホネート、アルキルサルフェート及び非イオン性界面活性剤、例えばアルキルフェノールのエチレンオキシド付加物から見いだされる。
化合物の濃厚乳剤は、水−混和性溶媒又は水−非混和性有機溶媒と乳化剤の混合物である不活性担体中に溶解された従来の濃度、例えば約１０％〜約５０％に等しい液体１リットル当たり約５０〜約５００グラムの濃度の化合物を含む。有用な有機溶媒には芳香族化合物、特にキシレン類、及び石油留分、特に石油の高沸点ナフタレン性及びオレフィン性部分、例えば重質又は芳香族ナフサが含まれる。他の有機溶媒、例えばロジン誘導体を含むテルペン性溶媒、シクロヘキサノンなどの脂肪族ケトン類、及び２−エトキシエタノールなどの複合アルコール類（ｃｏｍｐｌｅｘ ａｌｃｏｈｏｌｓ）も用いることができる。濃厚乳液に適した乳化剤は上記で挙げたような従来の非イオン性界面活性剤から選ばれる。
水性懸濁液は、水性ビヒクル中に約５重量％〜約５０重量％の範囲の濃度で分散された本発明の水−不溶性化合物の懸濁液を含む。懸濁液は化合物を微粉砕し、水及び上記で議論されたと同じ種類から選ばれる界面活性剤を含むビヒクル中にそれを激しく混合することにより調製される。無機塩及び合成又は天然ゴムなどの不活性成分を加え、水性ビヒクルの密度及び粘度を増加させることもできる。水性混合物を調製し、それをサンドミル、ボールミル又はピストン型ホモジナイザーなどの装置で均質化することにより、化合物を同時に粉砕及び混合するのが多くの場合に最も有効である。
式２化合物は顆粒組成物としても適用することができ、それは土壌への適用の場合に特に有用である。顆粒組成物は通常、完全に、又は大部分がクレー又は類似の安価な物質から成る不活性担体中に分散された約０．５重量％〜約１０重量％の式２化合物を含む。そのような組成物は通常、適した溶媒中に化合物を溶解し、約０．５〜３ｍｍの範囲の適した粒径に予備形成された顆粒担体にそれを適用することにより調製される。そのような組成物は担体のドウ又はペーストを作り、ドウ又はペースト中に活性成分を合わせた混合物を乾燥し、乾燥された組成物を粉砕して所望の顆粒粒径を得ることによっても調製することができる。
化合物を含む粉剤は、粉末の形態の化合物を適した微粉農業用担体、例えばカオリンクレー、粉砕火山岩などと均質に混合することにより調製される。粉剤は約１％〜約１０％の式２化合物を含むのが適している。
いずれかの理由で望ましい場合、適した有機溶媒、通常は無刺激石油、例えば農業化学で広く用いられるスプレーオイル中の溶液の形態で化合物を適用するのが同様に実用的である。
殺虫剤及び殺ダニ剤は通常液体担体中の活性成分の分散液の形態で適用される。適用比を担体中の活性成分の濃度として言うのが簡便である。最も広く用いられる担体は水である。
式２化合物はエアゾール組成物の形態で適用することもできる。そのような組成物の場合、活性化合物は圧力−発生プロペラント混合物である不活性担体中に溶解される。エアゾール組成物は容器に詰められ、そこから混合物が噴霧バルブを介して分散される。プロペラント混合物は、有機溶媒と混合することができる低沸点ハロカーボン類、あるいは不活性気体又は気体炭化水素類で加圧された水性懸濁液を含む。
昆虫及びダニの場所に適用されるべき化合物の量は重要ではなく、与えられている実施例を見て当該技術分野における熟練者が容易に決定することができる。一般に約１０ｐｐｍ〜約５，０００ｐｐｍの濃度の式２化合物が優れた抑制を与えると予想される。多くの化合物の場合、約１００〜約１，０００ｐｐｍの濃度が十分である。大豆及び綿などの畑作物の場合、化合物に関する適した適用比は約０．０１〜約１ｋｇ／ｈａであり、典型的に５〜５０ガロン／Ａのスプレー調剤として適用される。
式２化合物が適用される場所は昆虫又はダニが棲息するいずれの場所であることもでき、例えば野菜作物、果実及びナッツの木、ぶどうの木及び装飾用植物であることができる。ダニの卵の有毒作用に耐える独特の能力の故に、新しく発生した幼虫の抑制のためには繰り返し適用が望ましく、これは他の既知の殺ダニ剤の場合も真実である。
殺外部寄生虫活性
式２化合物は双翅類の昆虫のメンバーに対しても活性である。表ＸＩ及びＸＩＩは、ブローフライ幼虫及びステーブルフライ成虫に対する式２化合物の４８時間における試験管内研究をまとめたものである。
本発明の殺外部寄生虫法は、式２化合物を宿主動物に投与して昆虫及びダニ寄生虫を抑制することにより行われる。動物への投与は経皮的、経口的又は非経口的経路によることができる。
寄生昆虫及びダニには吸血性及び食肉性の種、及びその生活環のすべて又はその生活環の一部の間のみ、例えば幼虫のみ又は成虫段階のみに寄生性である種が含まれる。代表的種には以下が含まれる：
殺外部寄生虫性組成物
本発明は宿主動物の血液を吸う昆虫外部寄生虫の個体群の抑制のための組成物にも関する。これらの組成物は経済動物、随伴動物及び野生動物を外部寄生虫から保護するために用いることができる。組成物は家禽及び他の鳥類に投与しても有益である。
経済動物の保護のために方法を適用し、あるいは組成物を用いるのが好ましく、牛及び羊に用いるのが最も好ましい。有効適用の比率、時期及び方法は、寄生虫の正体、寄生虫攻撃の程度及び他の因子と共に広く変化する。適用は宿主の全寿命をかけて周期的に、又は寄生虫攻撃のピーク季節のみに行うことができる。一般に約０．０００５〜約９５％の式２化合物、好ましくは最高５％、及び最も好ましくは最高１％の式２化合物を含む液体調剤の局所的適用により外部寄生虫抑制が得られる。有効な寄生虫抑制は、約５〜約１００ｍｇ／ｋｇの適用比で達成される。
式２化合物は従来の獣医学的慣習により宿主動物に適用される。通常化合物は、式２化合物及び生理学的に許容し得る担体を含む殺外部寄生虫性組成物に調製される。例えば液体組成物は、殺外部寄生虫的抑制が望まれている動物に単に噴霧することができる。動物は、式２化合物と動物がそれを背に接触しながら歩くことができる例えば布を含むことができるバックラバーのような装置により、自ら処置することもできる。浸漬タンクも宿主動物に活性薬剤を投与するために用いることができる。
化合物を動物の飼料又は飲料水に混合することにより、あるいは錠剤、カプセル、大型丸薬又は体内埋植などの投薬形態を投与することにより経口的投与を行うことができる。経皮的投与は、注射可能な調剤の皮下、腹腔内及び静脈内注射により簡単に行われる。
式２化合物は経口的投与のために飲薬、錠剤又はカプセルなどの通常の形態に調製することができる。そのような組成物はもちろん経口的に許容し得る不活性担体を必要とする。化合物は、皮下的、皮膚的、管内、腹腔内、筋肉内又は静脈内注射のための注射可能な溶液又は懸濁液として調製することもできる。いくつかの適用の場合、化合物は標準的動物飼料の１成分として調製するのが便利である。この実施態様の場合、本発明の化合物を最初に、液体又は粒子状固体担体中に化合物が分散されている予備混合物として調製するのが通常である。予備混合物は、混合物１ポンド当たり約２〜約２５０ｇの式２化合物を含むことができる。予備混合物自身は従来の混合により最終的飼料中に調製される。
一般に外部寄生虫攻撃は宿主動物の寿命の実質的割合の間に起こるので、一定の期間をかけた持効性を与える形態で式２化合物を投与するのが好ましい。従来の方法は溶解を物理的に阻害するマトリックスの使用を含み、ここでマトリックスはワックス状の半−固体、例えば植物ワックス類、あるいは高分子量ポリエチレングリコールである。化合物を投与する優れた方法は、Ｌａｂｙ，米国特許第４，２５１，５０６号及びＳｉｍｐｓｏｎ，英国特許第２，０５９，７６７号のものなどの、持続−作用大型丸薬を用いる方法である。そのような大型丸薬の場合、化合物はＮｅｖｉｎ，米国特許第４，２７３，９２０号のものなどのポリマーマトリックス中に封入されている。本発明の化合物の持効性はシリコン−含有ゴムから作られるような体内埋植の使用によっても達成される。
本発明の実施をより十分に説明するために、以下の実施例を提供する：
実施例１
Ａ８３５４３アッセイ法
Ａ８３５４３Ｋ、Ａ８３５４３Ｏ、Ａ８３５４３Ｐ、Ａ８３５４３Ｕ、Ａ８３５４３Ｖ、Ａ８３５４３Ｗ、Ａ８３５４３Ｙ及び他のＡ８３５４３成分の製造のための発酵を監視するために以下の分析的高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）が有用である：
全ブロスの試料を３体積のアセトニトリルで希釈し、菌糸体からの因子を抽出する。次いで得られる溶液を０．４５ミクロンのポリテトラフルオリン（ＰＴＦＥ）フィルターを通して濾過し、ＨＰＬＣアッセイ系に注入する前に粒子状物質を除去する。メタノール中１ｍｌ当たり１００ｍｇの濃度の精製Ａ８３５４３Ａの溶液をアッセイのための外部標準として用い、すべてのＡ８３５４３成分のピーク面積をこのキャリブレーション標準に逆相関させ、各成分の濃度を決定する。
ＨＰＬＣ系：
カラム担体：ＹＭＣ−ＰＡＣＫ ４．６ｘ１００−ｍｍ ＩＤカラム、５μ球状、１２０Å（ＹＭＣ Ｉｎｃ．，Ｍｏｒｒｉｓ Ｐｌａｉｎｓ，ＮＪ）
可動相：０．０５％の酢酸アンモニウムを含むＣＨ3ＣＮ／ＭｅＯＨ／Ｈ2Ｏ（３：３：２）
流量：２ｍｌ／分
検出：２５０ｎｍにおけるＵＶ
培養物ＮＲＲＬ １８５３８（Ａ８３５４３．４）を用いたＡ８３５４３Ｋ及びＡ８３５４３Ｏの製造
Ａ．震盪フラスコ発酵
凍結乾燥ペレットとして、又は液体窒素中に保持された懸濁液としての培養物Ｓ．スピノサ ＮＲＲＬ １８５３８を用い、以下の組成を有する栄養培地に接種した：
培養物が液体窒素中に保持されている場合、アンプルは、同体積の栄養培地（４８〜７２時間インキュベーション、３０℃）及び懸濁培地を用いて調製することができる。懸濁培地はラクトース（１００ｇ）、グリセロール（２００ｍｌ）及び脱イオン水（１−Ｌとなる量）を含む。
液体窒素アンプルを用い、２５０−ｍｌの三角フラスコ中の５０ｍｌの栄養培地に接種する。培養物を、２５０ｒｐｍで２インチ（５．０８ｃｍ）の円の軌道を描く震盪器上で３０℃において４８時間インキュベートする。
インキュベートされた培養物（５％ｖ／ｖ接種材料）を用い、２５０−ｍｌの広口三角フラスコ中の３０ｍｌの製造培地に接種する。培地の組成は以下の通りであった：
Ｂ．撹拌リアクター発酵
大体積の接種材料を与えるために、実施例２、Ａ章で記載の通りに調製された１０ｍｌのインキュベートされた第１期培地を用い、第１期培地の組成と同じ組成を有する４００ｍｌの第２期栄養培地に接種する。この第２期栄養培地を２−Ｌの広口三角フラスコ中で３０℃において約４８時間、２５０ｒｐｍにおいて２インチの円の軌道を描く震盪器上でインキュベートする。
かくして調製され、インキュベートされた第２期栄養培地（２−Ｌ）を用い、実施例２、Ａ章に記載の通りに調製された１１５リットルの無菌製造培地に接種する。シネフンジンを、濾過されたメタノール性溶液として、６６時間において１００μｇ／ｍｌの最終濃度まで加えた。
接種された製造培地を１６５−Ｌの撹拌バイオリアクター中で、３０℃の温度において７日間発酵させた。撹拌容器における空気流及び撹拌機の速度はコンピューター制御され、溶解酸素の量は空気飽和の約８０％に保持される。
実施例３
培養物ＮＲＲＬ １８７４３（Ａ８３５４３．８）を用いたＡ８３５４３Ｋ、Ａ８３５４３Ｏ及びＡ８３５４３Ｙの製造
Ａ．震盪フラスコ発酵
凍結乾燥ペレットとして、又は液体窒素中に保持された懸濁液としての培養物Ｓ．スピノサ ＮＲＲＬ １８７４３を用い、以下の組成を有する栄養培地に接種した：
液体窒素貯蔵接種材料は、栄養培養物を均質化し、グリセロール：ラクトース：水（２：１：７）の無菌の懸濁剤を用いて１：１に希釈し（体積：体積）、それを無菌の管に分配する（１．５ｍｌ／管）ことにより調製した。希釈された接種材料は、次いで適した保存容器中で液体窒素の上で保存し、震盪フラスコ培養物の培養のための発酵原料接種材料（ｗｏｒｋｉｎｇ ｓｔｏｃｋ ｉｎｏｃｕｌｕｍ）として、及び発酵器播種接種材料として用いた。
液体窒素アンプルを急速解凍し、０．５ｍｌを用いて２５０−ｍｌの広口三角フラスコ中の５０ｍｌの栄養培地に接種した。培養物を、２５０ｒｐｍで２インチ（５．０８ｃｍ）の円の軌道を描く震盪器上で３２℃において４８時間インキュベートする。
インキュベートされた培養物（５％ｖ／ｖ接種材料）を用い、以下の組成を有する２５ｍｌの製造培地に接種する：
Ｂ．撹拌リアクター発酵
大体積の接種材料を与えるために、実施例３、Ａ章で記載の通りに調製された１０ｍｌのインキュベートされた第１期培地を用い、第１期培地の組成と同じ組成を有する４００ｍｌの第２期栄養培地に接種する。この第２期栄養培地を２−Ｌの広口三角フラスコ中で３２℃において約４８時間、２５０ｒｐｍにおいて２インチの円の軌道を描く震盪器上でインキュベートする。
かくして調製され、インキュベートされた第２期栄養培地（２−Ｌ）を用い、実施例３、Ａ章に記載の通りに調製された１１５リットルの無菌製造培地に接種する。
接種された製造培地を１６５−Ｌの撹拌バイオリアクター中で、３０℃の温度において７日間発酵させた。撹拌容器における空気流及び撹拌機の速度はコンピューター制御され、溶解酸素の量は空気飽和の約８０％か又はそれ以上に保持される。
実施例４
シネフンジンの存在下で発酵されたＮＲＲＬ １８７１９（Ａ８３５４３．６）からのＡ８３５４３Ｐ及びＡ８３５４３Ｗの単離
発酵ブロス（１９０−Ｌ、実質的に実施例２Ｂに記載の通りに調製（株Ａ８３５４３．６を用いることを除いて））を処理の前に２日間冷却した。５ＮのＨＣｌを用いてｐＨを３．０に調節した後、全ブロスにアセトン（１９０−Ｌ）を加えた。得られた混合物をセラミックフィルターを通して濾過し、濾液（３３５−Ｌ）を得、それを冷却下に週末をかけて保持した。ブロス／アセトン濾液を５ＮのＮａＯＨを用いてｐＨ１０に調節し、セラミックフィルターを通して再濾過してからＨＰ−２０ｓｓ樹脂（Ｍｉｔｓｕｂｉｓｈｉ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｌｔｄ．，Ｊａｐａｎ）を含むスチールカラム（１０−Ｌ；１０ｃｍｘ１２２ｃｍ）上に１−Ｌ／分の流量で負荷した。カラムをＣＨ3ＣＮ−ＣＨ3ＯＨ−０．１％ＮＨ4ＯＡｃ水溶液（ＮＨ4ＯＨを用いてｐＨ８．１に調節）（２５：２５：５０：２０−Ｌ）を用いて洗浄し、次いでＣＨ3ＣＮ−ＣＨ3ＯＨ−０．１％ＮＨ4ＯＡｃ水溶液（ＮＨ4ＯＨを用いてｐＨ８．１に調節）（９５：９５：１０：４０−Ｌ）を用いて溶離させ、２−Ｌの画分を集めた。画分３〜９を濃縮乾固し、ＣＨ3ＯＨ（１００ｍｌ）中に再溶解し、再濃縮し、次いでＣＨ3ＣＮ（１−Ｌ）中に沈澱させた。得られた沈澱を濾過により除去し、捨て、濾液を濃縮乾固した。得られた残留物をジクロロメタン（２５ｍｌ）に再溶解し、アセトニトリル中で平衡化したシリカゲル（ＥＭ等級６２、６０〜２００メッシュ）のカラム（７．５ｃｍｘ５０ｃｍ）に適用した。カラムをＣＨ3ＣＮ（４−Ｌ）、次いでＣＨ3ＣＮ−ＣＨ3ＯＨ（９：１、５−Ｌ）、続いてＣＨ3ＯＨ（１−Ｌ）を用いて溶離させ、１−Ｌの画分を集めた。プール１（画分３〜４）はＡ８３５４３成分Ｊ及びＬを含み；プール３（画分７〜１０）は成分Ｍ及びＮを含んだ。新規成分Ｐ及びＷを含むプール２（画分５〜６）を濃縮乾固した。得られた残留物をＣＨ3ＯＨ（１０ｍｌ）に溶解し、Ｈ2Ｏ−ＣＨ3ＯＨ−ＣＨ3ＣＮ（３０：３５：３５，０．１％のＮＨ4ＯＡｃを含む）で平衡化した分取逆相ＨＰＬＣカラム（Ｒａｉｎｉｎ Ｄｙｎａｍａｘ−６０Å ８μｍ Ｃ１８，４１．４ｍｍ内径ｘ２５ｃｍ，４１．１ｍｍｘ５ｃｍのガードモジュールを有する）に適用した。カラムを、溶媒“Ａ”Ｈ2Ｏ−ＣＨ3ＯＨ−ＣＨ3ＣＮ（３０：３５：３５，０．１％のＮＨ4ＯＡｃを含む）から溶媒“Ｂ”Ｈ2Ｏ−ＣＨ3ＯＨ−ＣＨ3ＣＮ（１０：４５：４５，０．１％のＮＨ4ＯＡｃを含む）を混合した勾配を用いて４０ｍｌ／分の流量で溶離した。ポンピング系は６０分間で２５から７５％Ｂへの直線状勾配を与えるようにプログラムした。分離の進行は、２５０ｎｍに戻される可変波長ＵＶ検出器を用いて監視した。主ピークを６ｘ３分の画分として集めた。新規成分Ｐを含む画分１〜２を４０ｍｌに濃縮し、次いでＨ2Ｏ−ＣＨ3ＯＨ−ＣＨ3ＣＮ（３０：３５：３５）中で平衡化した同じＨＰＬＣカラム上で、Ｈ2Ｏ−ＣＨ3ＯＨ−ＣＨ3ＣＮ（３０：３５：３５）からＨ2Ｏ−ＣＨ3ＯＨ−ＣＨ3ＣＮ（１０：４５：４５）への６０分の直線状勾配を用いて溶離することにより脱塩した。ＵＶ吸収ピーク（溶離の最初の２分間を除く）を集め、濃縮乾固した。得られた残留物をｔ−ＢｕＯＨ（１０ｍｌ）に溶解し、凍結乾燥して純粋な成分Ｐ（４７９ｍｇ）を得た。プールされた、成分Ｐ及びＷの混合物を含む上記からの画分３〜４を２０ｍｌに濃縮し、０．１％のＮＨ4ＯＡｃを含むＨ2Ｏ−ＣＨ3ＯＨ−ＣＨ3ＣＮ（３０：３５：３５）で平衡化した分取逆相ＨＰＬＣカラム（Ｒａｉｎｉｎ Ｄｙｎａｍａｘ−６０Å ８μｍ Ｃ１８，４１．４ｍｍ内径ｘ２５ｃｍ，４１．１ｍｍｘ５ｃｍのガードモジュールを有する）に適用し、溶媒“Ａ”Ｈ2Ｏ−ＣＨ3ＯＨ−ＣＨ3ＣＮ（３０：３５：３５，０．１％のＮＨ4ＯＡｃを含む）から溶媒“Ｂ”Ｈ2Ｏ−ＣＨ3ＯＨ−ＣＨ3ＣＮ（１０：４５：４５，０．１％のＮＨ4ＯＡｃを含む）を混合した勾配を用いて１０ｍｌ／分の流量で溶離した。ポンピング系は６０分間で２５から７５％Ｂへの直線状勾配を与えるようにプログラムした。２つのＵＶ吸収主ピーク（成分Ｐ、続いて成分Ｗ）を集めた。成分Ｗ含有ピークを小体積に濃縮し、次いでＨ2Ｏ−ＣＨ3ＯＨ−ＣＨ3ＣＮ（３０：３５：３５）で平衡化した同じＨＰＬＣカラム上で脱塩した。成分Ｗは、Ｈ2Ｏ−ＣＨ3ＯＨ−ＣＨ3ＣＮ（３０：３５：３５）からＨ2Ｏ−ＣＨ3ＯＨ−ＣＨ3ＣＮ（１０：４５：４５）への６０分間の直線状勾配を用い、１０ｍｌ／分の流量で溶離させ、ＵＶ吸収ピークを１０ｘ３分の画分に集めた。プールされた画分２〜７を濃縮して残留物とし、それをｔ−ＢｕＯＨに溶解し、凍結乾燥して純粋な成分Ｗ（８２ｍｇ）を得た。上記からの成分Ｐ−含有ＵＶ吸収ピークを同様の方法で脱塩し、追加の純粋な成分Ｐ（１３２ｍｇ）を得た。
実施例５
シネフンジンの存在下で発酵させた株ＮＲＲＬ １８８２３（Ａ８３５４３．９）からのＡ８３５４３Ｕ及びＡ８３５４３Ｖの単離
実質的に実施例２Ａに記載の通りに調製した（株Ａ８３５４３．９を用いる以外）発酵ブロス（５００ｍｌ；３０ｘ２５０ｍｌ震盪フラスコ）を１時間撹拌しながらメタノール（１．３−Ｌ）で抽出し、次いで濾過助剤（３％Ｈｙｆｌｏ）を用いて濾過し、メタノール性濾液（１．５−Ｌ）を得た。バイオマスをメタノール（７００ｍｌ）で再抽出し、濾過した。２つのメタノール性抽出物を合わせ、等体積の水を加えた。ＨＰ−２０樹脂（７５ｍｌ）を加え、２時間撹拌し、その後スラリをガラスのクロマトグラフィーカラム中に注いだ。流出液（５−Ｌ）を捨て、カラムのＣＨ3ＯＨ−Ｈ2Ｏ（１：１）洗浄液（５００ｍｌ）も捨てた。次いでカラムをアセトン（２５０ｍｌ）で溶離した。アセトン溶離液を、全ブロスの類似の抽出及びクロマトグラフィーから得た溶離液（５００ｍｌ；４０ｘ２５０ｍｌ震盪フラスコ）と合わせ、濃縮乾固した。得られた残留物をジクロロメタン（１０ｍｌ）に溶解し、アセトニトリル中で平衡化したシリカゲル（ＥＭ等級６２，６０〜２００メッシュ）のカラム（２．５ｃｍｘ２５ｃｍ）に適用した。カラムをアセトニトリルで洗浄し、次いでアセトニトリルからアセトニトリル−メタノール（４：１）への直線状勾配を用いて溶離させ、２５ｍｌの画分を集めた。新規Ａ８３５４３成分Ｕ及びＶを含む画分３４〜４３をプールし（２００ｍｌ）、濃縮乾固した。残留物をメタノール（２ｍｌ）に溶解し、０．１％のＮＨ4ＯＡｃを含むＨ2Ｏ−ＣＨ3ＯＨ−ＣＨ3ＣＮ（３０：３５：３５）で平衡化した分取逆相ＨＰＬＣカラム（Ｒａｉｎｉｎ Ｄｙｎａｍａｘ−６０Å ８μｍ Ｃ１８，４１．４ｍｍ内径ｘ２５ｃｍ，４１．１ｍｍｘ５ｃｍのガードモジュールを有する）に適用した。カラムは０．１％のＮＨ4ＯＡｃを含むＨ2Ｏ−ＣＨ3ＯＨ−ＣＨ3ＣＮ（３０：３５：３５）から０．１％のＮＨ4ＯＡｃを含むＨ2Ｏ−ＣＨ3ＯＨ−ＣＨ3ＣＮ（１０：４５：４５）への６０分の直線状勾配を用いて１０ｍｌ／分の流量で溶離させた。残留成分Ｈ及びＱの前に新規成分Ｕ及びＶを含む主ピーク（２５０ｎｍにおいてＵＶ監視）を集めた。成分Ｕを含むプールをＨ2Ｏ−ＣＨ3ＯＨ−ＣＨ3ＣＮ（３０：３５：３５）で平衡化した同じＨＰＬＣカラム上で、Ｈ2Ｏ−ＣＨ3ＯＨ−ＣＨ3ＣＮ（３０：３５：３５）からＨ2Ｏ−ＣＨ3ＯＨ−ＣＨ3ＣＮ（１０：４５：４５）への直線状勾配を用いて溶離させることにより脱塩した。成分Ｕは２分の画分（１０）として溶離させた。画分２〜８をプールし、次いで濃縮乾固した。残留物をｔ−ＢｕＯＨ（５ｍｌ）に溶解し、凍結乾燥し、純粋な成分Ｕ（７１ｍｇ）を得た。成分Ｖ−含有プールは同じ方法により脱塩及び凍結乾燥し、純粋な成分Ｖ（７ｍｇ）を得た。
実施例６
シネフンジンの存在下で発酵させたＮＲＲＬ １８５３８（Ａ８３５４３．４）からのＡ８３５４３Ｋ及びＡ８３５４３Ｏの単離
発酵ブロス（２１０−Ｌ）を実質的に実施例２Ｂに記載の通りに調製した。全ブロスにアセトンを加え、ｐＨを８．０に調節した。得られた混合物をセラミックフィルターを通して濾過し、濾液（３７０−Ｌ）を得た。ブロス／アセトン濾液をＨＰ−２０ｓｓ樹脂（Ｍｉｔｓｕｂｉｓｈｉ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ．Ｌｔｄ．，Ｊａｐａｎ）を含むスチールカラム（１０−Ｌ，１０ｃｍｘ１２２ｘｍ）上に１−Ｌ／分の流量で負荷し、流出液を１つのプールとして集めた。カラムを溶媒“Ａ”（０．１％ＮＨ4ＯＡｃ）から溶媒“Ｂ”（ＣＨ3ＯＨ−ＣＨ3ＣＮ；１：１）を混合した勾配を用いて１−Ｌ／分の流量で溶離した。ポンピング系は５０％Ｂを２分間配達し、その後５０−８０％Ｂの直線状勾配（４５分間）、８０−９０％Ｂの直線状勾配（３３分間）が続くようにプログラムし、２０ｘ４Ｌの画分を集めた。成分Ｋ及びＯを含む画分１３〜１７をプールした。カラムの流出液（上記参照）を５ＮのＮａＯＨを用いてｐＨ９．５に調節し、ＨＰ−２０ｓｓカラムに再度適用した。ポンピング系は、５０％Ｂを１分間、５０−７５％Ｂの直線状勾配（３０分間）、７５〜８５％Ｂの直線状勾配（４５分間）、８５−８８％Ｂの直線状勾配（１５．４分間）及び８８−１００％Ｂの直線状勾配（２０分間）を１−Ｌ／分の流量で配達するようにプログラムし、２２ｘ４Ｌの画分を集めた。画分７〜１７をプールし、プール（最初のＨＰ−２０ｓｓクロマトグラフィーからの画分１３〜１７（上記参照））と合わせた。合わせたプールを４−Ｌに濃縮し、次いでさらに濃縮乾固し、ＣＨ3ＯＨ（１００ｍｌ）に再溶解し、次いでＣＨ3ＣＮ（３−Ｌ）中に沈澱させた。得られた沈澱を濾過により除去し、ＣＨ3ＣＮで洗浄し、捨て：濾液を濃縮乾固した。得られた残留物をジクロロメタン（５０ｍｌ）に再溶解し、アセトニトリル中で平衡化したシリカゲル（ＥＭ等級６２，６０〜２００メッシュ）のカラム（６ｃｍｘ２４ｃｍ）に適用した。カラムをＣＨ3ＣＮ（４−Ｌ）、次いでＣＨ3ＣＮ−ＣＨ3ＯＨ（９：１；１０−Ｌ）を用いて溶離し、１０ｘ２５０ｍｌ画分、続いて７ｘｌＬ画分を採取した。成分Ｋ及びＯを含む画分６〜１５を濃縮乾固した。得られた残留物をＣＨ3ＯＨ（１００ｍｌ）に溶解し、Ｈ2Ｏ−ＣＨ3ＯＨ−ＣＨ3ＣＮ；（５０：１７５：１７５，０．１％ＮＨ4ＯＡｃを含む）中で平衡化した分取逆相ＨＰＬＣカラム（Ｒａｉｎｉｎ Ｄｙｎａｍａｘ−６０Å ８μｍ Ｃ１８，４１．４ｍｍ内径ｘ２５ｃｍ，４１．４ｍｍｘ５ｃｍのガードモジュールを有する）に適用した（２０回で）。カラムは４０ｍｌ／分の流量で溶離した。分離の進行を２５０ｎｍに戻る可変波長ＵＶ検出器を用いて監視した。ＵＶ吸収ピーク（２０回のクロマトグラフィーから）を７プールに集めた。２つの最大ピークは成分Ｋ及びＯに対応した。プール３（６−Ｌ）は成分Ｋ（純度９８％）を含んだ。成分Ｏ及びＫを含むプール４（８−Ｌ）を２００ｍｌに濃縮し、同一条件下で再度クロマトグラフィーにかけ（４回）、２つのピークを２つのプールとして集めた。プール１（３−Ｌ）は成分Ｋ（純度９８％）を含んだ。プール２（５−Ｌ）は成分Ｏ（９５％）及び成分Ｋ（５％）を含んだ。プール２を１００ｍｌに濃縮し、同じＨＰＬＣカラム上のクロマトグラフィー（３回）により、Ｈ2Ｏ−ＣＨ3ＯＨ−ＣＨ3ＣＮ（３０：３５：３５）からＨ2Ｏ−ＣＨ3ＯＨ−ＣＨ3ＣＮ（１０：４５：４５）への６０分間の直線状勾配を用いて溶離して脱塩した。ＵＶ吸収溶離液を１０ｘ３分の画分として集めた。純度＞９８％の成分Ｏを含む画分をプールし、濃縮乾固し、ｔ−ＢｕＯＨから凍結乾燥して成分Ｏ（２．５ｇ；純度＞９８％）を得た。最初の分取ＨＰＬＣ分離（プール３、６−Ｌ）及び成分Ｏの再精製（プール１、３−Ｌ）からの成分Ｋ含有プールを合わせ、２００ｍｌに濃縮し、成分Ｏと同じ方法で脱塩した。純度＞９８％の成分Ｋを含む画分をプールし、濃縮乾固し、ｔ−ＢｕＯＨから凍結乾燥し、成分Ｋ（１１．１ｇ；純度＞９９％）を得た。
実施例７
株ＮＲＲＬ １８７４３（Ａ８３５４３．８）からのＡ８３５４３Ｋ、Ａ８３５４３Ｏ及びＡ８３５４３Ｙの単離
発酵ブロス（２６０−Ｌ）を実質的に実施例２Ｂに記載の通りに調製した。５ＮのＨＣｌを用いてｐＨを３．０に調節した後、全ブロスにアセトン（２６０−Ｌ）を加えた。得られた混合物をセラミックフィルターを通して濾過し、濾液（４８０−Ｌ）を得、それを週末をかけて冷却下に保った。ブロス／アセトン濾液を２５％のＮａＯＨを用いてｐＨ１２に調節し、セラミックフィルターを通して２回濾過した後、ＨＰ−２０ｓｓ樹脂（Ｍｉｔｓｕｂｉｓｈｉ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ．Ｌｔｄ．，Ｊａｐａｎ）を含むスチールカラム（１０−Ｌ，１０ｃｍｘ１２２ｘｍ）上に０．５−Ｌ／分の流量で負荷した。カラムをＣＨ3ＣＮ−ＣＨ3ＯＨ−０．１％ＮＨ4ＯＡｃ水溶液（ＮＨ4ＯＨを用いてｐＨ８．１に調節）（２５：２５：５０；２０−Ｌ）で洗浄した。新規成分Ｋ、Ｏ及びＹをＣＨ3ＣＮ−ＣＨ3ＯＨ−０．１％ＮＨ4ＯＡｃ水溶液（ＮＨ4ＯＨを用いてｐＨ８．１に調節）（９５：９５：１０；３０−Ｌ）を用い、１−Ｌ／分の流量で溶離させた。溶離液（３０−Ｌ）を濃縮し、ＣＨ3ＯＨに再溶解し、再度濃縮乾固し、ＣＨ3ＯＨ（１００ｍｌ）に再溶解し、次いでＣＨ3ＣＮ（２−Ｌ）中に沈澱させた。得られた沈澱を濾過により除去し、ＣＨ3ＣＮで洗浄し、捨て：合わせた濾液及び洗浄液（３−Ｌ）を濃縮乾固した。得られた残留物をジクロロメタン（５０ｍｌ）に再溶解し、アセトニトリル中で平衡化したシリカゲル（ＥＭ等級６２，６０〜２００メッシュ）のカラム（７．５ｃｍｘ５０ｃｍ）に適用した。カラムをＣＨ3ＣＮ（１０−Ｌ）、次いでＣＨ3ＣＮ−ＣＨ3ＯＨ（９：１；２０−Ｌ）、続いてＣＨ3ＣＮ−ＣＨ3ＯＨ（８：２；１０−Ｌ）を用いて溶離し、１−Ｌの画分を集めた。画分１１〜３０をプールし、濃縮乾固した。得られた残留物をＣＨ3ＯＨ（５０ｍｌ）に溶解し、Ｈ2Ｏ−ＣＨ3ＯＨ−ＣＨ3ＣＮ；（５０：１７５：１７５，０．１％ＮＨ4ＯＡｃを含む）中で平衡化した分取逆相ＨＰＬＣカラム（Ｒａｉｎｉｎ Ｄｙｎａｍａｘ−６０Å ８μｍ Ｃ１８，４１．４ｍｍ内径ｘ２５ｃｍ，４１．４ｍｍｘ５ｃｍのガードモジュールを有する）に適用した（１０回で）。カラムは４０ｍｌ／分の流量で、Ｈ2Ｏ−ＣＨ3ＯＨ−ＣＨ3ＣＮ；（５０：１７５：１７５，０．１％のＮＨ4ＯＡｃを含む）からＨ2Ｏ−ＣＨ3ＯＨ−ＣＨ3ＣＮ；（１０：４５：４５，０．１％のＮＨ4ＯＡｃを含む）への６０分間の直線状勾配を用いて溶離した。分離の進行を２５０ｎｍに戻る可変波長ＵＶ検出器を用いて監視した。集められた最初の３つのピーク（プールされた１０回分）は少量成分Ｙ（プール１、１−Ｌ）、成分Ｋ（プール２、８−Ｌ）及び成分Ｏ（プール３、４−Ｌ）に対応した。プール２を小体積に濃縮し、次いで同じカラム上で再度クロマトグラフィーにかけ、緩衝液を用いずに溶離することにより脱塩した。ＵＶ吸収ピークに対応する流出液を濃縮乾固し、ｔ−ＢｕＯＨに溶解し、凍結乾燥して純粋な成分Ｋ（７．３ｇ）を得た。プール３を同様の方法で脱塩及び凍結乾燥し、純粋な成分Ｏ（１．４ｇ）を得た。プール１を類似のクロマトグラフィー（Ｒａｉｎｉｎ Ｄｙｎａｍａｘ−６０Å ８μｍ Ｃ１８，４１．４ｍｍ内径ｘ２５ｃｍ，４１．４ｍｍｘ５ｃｍのガードモジュールを有する）により脱塩し、同様の方法で凍結乾燥し、純粋な成分Ｙ（４６ｍｇ）を得た。
実施例８
Ａ８３５４３Ｋプソイドアグリコン
Ａ８３５４３Ｋの試料（１００ｍｇ）を２Ｎの硫酸（１０ｍｌ）に溶解した。この溶液を約８０℃において１．２５時間加熱し、得られた混合物を室温に冷却した。沈澱を濾過により集め、冷脱イオン水で洗浄し、乾燥して５９ｍｇのＡ８３５４３Ｋプソイドアグリコンを得た。
元素分析
ＭＳ（ＦＤ）：ｍ／ｚ ５７６（１００％）
ＩＲ（ＣＨＣｌ3）：２９３６．０、１７１４．９、１６５９．０ｃｍ-1
ＵＶ（ＥｔＯＨ）：λmax ２４３ｎｍ
実施例９
Ａ８３５４３Ｏプソイドアグリコン
Ａ８３５４３Ｏの試料（５００ｍｇ）を脱イオン水（４０ｍｌ）に懸濁し、完全に溶解させるのに十分な体積の１ＮのＨ2ＳＯ4を加えた（約０．２５ｍｌ）。得られた溶液を約８０℃に３時間加熱し、次いで室温に冷却した。沈澱を濾過により集め、冷脱イオン水で洗浄し、乾燥した。濾液をＮａＣｌで飽和させ、メチレンクロリドで抽出した。メチレンクロリド抽出液を合わせ、ブラインで抽出し、乾燥し（Ｋ2ＣＯ3）、蒸発乾固した。残留物を沈澱と合わせ、３４８ｍｇの粗生成物を得た。
粗生成物をフラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル６０、２３０〜４００メッシュ）により、酢酸エチル及びヘキサンの混合物（７：３）を用いて溶離して精製した。所望の化合物を含む画分を蒸発乾固して１４６．５ｍｇのＡ８３５４３Ｏプソイドアグリコンを得た。
元素分析
ＭＳ（ＦＤ）：ｍ／ｚ ５９０（１００％）、５９１（７０％、Ｍ＋）、５９２（２０％、Ｍ＋Ｈ）、５９３（５％、Ｍ＋２）
ＩＲ（ＣＨＣｌ3）：３０１４．２、２９３２．２、１７１４．９、１６５９．０ｃｍ-1
ＵＶ（ＥｔＯＨ）：λmax ２４２ｎｍ（ε ９．１８５）
実施例１０
Ｎ−デメチル−Ａ８３５４３Ｋ
Ａ８３５４３Ｋ（１０１．５ｍｇ、０．１４ミリモル）及び酢酸ナトリウム三水和物（１４２．４ｍｇ、１．０５ミリモル）をメタノール及びｐＨ９緩衝液（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）の混合物に加えた。得られた懸濁液を約４７℃に加熱し、次いでヨウ素（４７．７ｍｇ、０．１９ミリモル）を一度に加えた。４７℃において２時間半後、反応物を室温に冷却した。室温でさらに３時間撹拌した後、反応溶液を５％のチオ硫酸ナトリウム溶液に加えた。得られた無色の水性混合物をジエチルエーテルで抽出した。次いで水相をＮａＣｌで飽和させ、メチレンクロリドで抽出した。メチレンクロリド抽出物をジエチルエーテル抽出物と合わせ、ブラインで洗浄し、Ｋ2ＣＯ3上で乾燥した。乾燥溶液を次いで真空中で蒸発乾固し、７９．３ｍｇのＮ−デメチル−Ａ８３５４３Ｋを白色のガラスとして得た（収率８１％）。
ＭＳ（ＦＤ）：ｍ／ｚ ７０３（１００％、Ｍ＋）、７０４（５７％、Ｍ＋Ｈ）、７０５（１９％、Ｍ＋２）
元素分析（Ｃ39Ｈ61ＮＯ10）計算値：Ｃ，６６．５５；Ｈ，８．７３；Ｎ，１．９９；測定値：Ｃ，６４．８０；Ｈ，８．６７；Ｎ，１．９５
ＩＲ（ＫＢｒ）：３４６２．７、２９３４．１、１７２１．７、１６６０．９、１４５７．４ｃｍ-1
実施例１１
ジ−Ｎ−デメチル−Ａ８３５４３Ｋ
ＭｅＯＨ（４０ｍｌ）中のＮ−デメチル−Ａ８３５４３Ｋ（８９１ｍｇ、１．２７ミリモル）の溶液を３℃に冷却した。新しく調製したメタノール中の１ＭのＮａＯＭｅ（６．３ｍｌ、６．３ミリモル）及びヨウ素（１．６１ｇ、６．３ミリモル）をこの溶液に連続的に加えた。反応溶液を３℃に５時間保ち、次いで５％チオ硫酸ナトリウム／希水酸化アンモニウム溶液に加えた。得られた混合物を酢酸エチルで抽出した。合わせた酢酸エチル抽出物をブラインで洗浄し、Ｋ2ＣＯ3上で乾燥した。乾燥溶液を真空中で蒸発乾固し、７７０ｍｇの粗生成物を得た。
所望の化合物をフラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル６０、２３０〜４００メッシュ、２インチｘ８インチ）により、メチレンクロリド及びメタノールの混合物（９３：７）を用いて溶離して部分的に精製した。所望の化合物を逆相ＨＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ Ｐｒｅｐ ＮＯＶＡ−Ｐａｋ，ＯＤＳ，６０Å，４０ｍｍｘ３００ｍｍ）により、メタノール／アセトニトリル／０．２５％酢酸アンモニウム（４０：４０：２０）を用いて溶離してさらに精製し、４６３．６ｍｇ（収率５３％）のジ−Ｎ−デメチル−Ａ８３５４３Ｋを無色のガラスとして得た。
元素分析（Ｃ38Ｈ59ＮＯ10）計算値：Ｃ，６６．１６；Ｈ，８．６２：Ｎ，２．０３；測定値：Ｃ，６６．２９；Ｈ，８．６３；Ｎ，２．０２
ＭＤ（ＦＤ）：ｍ／ｚ ６９０（１００％、Ｍ＋）、６８９（７０％）、６９１（５９％、Ｍ＋Ｈ）、７０４（２０％）
ＵＶ（ＥｔＯＨ）：λmax ２４４ｎｍ（ε １０，３２８）
ＩＲ（ＣＨＣｌ3）：３７００、３６００、３５５０〜３３５０（ｂｒ）、３４２０、２９７５、１７００、１６７５、１６２０ｃｍ-1
Claims (11)
- 式１
Ｒ7は水素又は式
Ｒ8、Ｒ9、Ｒ10、Ｒ11及びＲ12は独立して水素又はメチルであり、但しＲ11とＲ12は同時に水素であることはない］
の化合物、あるいはＲ7が水素以外の場合のそれらの酸付加塩。 - Ｒ7が式
- Ｒ7が式
- Ｒ8がメチルである請求項３に記載の化合物。
- Ｒ7が水素である請求項１に記載の化合物。
- 各成分に関してＲ7、Ｒ8、Ｒ9、Ｒ10、Ｒ11及びＲ12が以下のとおりである請求項１に記載の化合物。
- 昆虫−又はダニ−不活性化量の請求項２に記載の化合物を植物学的に許容し得る担体と組み合わせて含んでなる殺虫又は殺ダニ組成物。
- 昆虫又はダニの生息場所に昆虫−又はダニ−不活性化量の請求項２項に記載の化合物を適用することを含んでなる殺虫又は殺ダニ法。
- 生理学的に許容し得る不活性担体及び請求項２に記載の化合物を含んでなる殺外部寄生虫組成物。
- ヒト以外の宿主動物に請求項２に記載の化合物を投与することを含んでなる、ヒト以外の宿主動物の血液を吸う昆虫外部寄生虫の個体群の抑制法。
- サッカロポリスポラ スピノサ（Saccharopolyspora spinosa）ＮＲＲＬ １８７４３の生物学的に純粋な培養物。
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