JP4258575B2 - 新規a83543化合物及びそれらの製造法 - Google Patents

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Description

発明の分野
本発明は発酵生成物A83543の新規成分に関する。
発明の背景
標的昆虫は現在利用できる殺虫剤に対する耐性を急速に発現しつつある。節足動物における殺虫剤に対する耐性は広範囲であり、少なくとも400の種が1つ又はそれ以上の殺虫剤に対する耐性を示す。DDT、カルバメート類及び有機リン酸塩類などの比較的古い殺虫剤に対する耐性の発現は十分に文献により証明されている(Brattsten,et al.(1986),Science,231:1255を参照)。比較的新しいピレスロイド殺虫剤に対する耐性の発現を含む合成殺虫剤に対する耐性は非常に急速に発現した(Pickett(1988),Chem.Britain,137を参照)。従って新規な殺虫剤が求められている。
サッカロポリスポラ・スピノサ(Saccharopolyspora spinosa)により製造される関連化合物の一群である発酵生成物A83543は近年発見され、優れた殺虫活性を示すことが示された。A83543及びその個々の化合物はダニ及び昆虫、特に鱗翅類(Lepidoptera)及び双翅類(Diptera)の抑制に有用である。
“A83543化合物”は12−員大環状ラクトン、中性糖及びアミノ糖に縮合した5,6,5−三環系から成る成分を意味する(Kirst et al.(1991),Tetrahedron Letters,32:4839を参照)。A83543の天然成分の群はEPO出願番号0375316に記載され、以下の一般式:
Figure 0004258575
[式中、
1はH又は
Figure 0004258575
から選ばれる基であり、
2、R4、R3、R5及びR6は水素又はメチルである]
を有する種類、あるいはR1が水素以外である場合のそれらの酸付加塩を含む。
A83543発酵産物からの化合物の群は、各成分A83543A、A83543B、A83543C、A83543D、A83543E、A83543F、A83543G A83543H及びA83543J(ヨーロッパ特許公開番号0 375 316を参照);各成分A83543L、A83543M及びA83543N(1993年4月13日発行の米国特許番号5,202,242を参照);ならびに各成分A83543Q、A83543R、A83543S及びA83543T(1992年11月6日出願の“New A83543 Compounds and Processes for Production Thereof”という標題のTurner,Brougton,Huber and Mynderseの同時係属米国特許出願(米国特許出願番号07/973,121)を参照)を含むことが示された。これらの各成分及びそれらから誘導されるシュードアグリコンの構造を下記に示す。
Figure 0004258575
式中、R1、R2、R3、R4、R5及びR6は各成分に関して以下の通りである:
Figure 0004258575
微生物起源の抗生物質であるシネフンジン(Sinefungin)は特異的S−アデノシルメチオニン−依存性メチルトランスフェラーゼを阻害することが示された。この化合物は以下の哺乳類メチルトランスフェラーゼの阻害に有効である:ノルエピネフリン N−メチルトランスフェラーゼ、ヒスタミン N−メチルトランスフェラーゼ及びカテコール O−メチルトランスフェラーゼ(Fuller and Nagarajan(1978),Biochemical Pharmacology,27:1981を参照)。シネフンジンはストレプトミセス・アベルミチリス(Streptomyces avermittilis)のアベルメクチン−製造株におけるS−アデノシル−メチオニン−依存性O−メチルトランスフェラーゼの阻害にも有効である(Schulman et al.(1985),J.Antibiotics,38:1494を参照)。さらに近年、シネフンジンはストレプトミセス・フラジアエ(Streptomyces fradiae)におけるS−アデノシルメチオニン−依存性O−メチルトランスフェラーゼ(マクロシン O−メチルトランスフェラーゼ)の阻害に有効であることが報告された(Kreuzman,et al.(1988),J.Biological Chemistry,263:15626を参照)。S.スピノサの株においてO−メチルトランスフェラーゼを阻害するためのシネフンジンの利用法を本明細書において開示する。
発明の概要
本発明はA83543化合物群の新規な種類を目的とし、該種類は式1
Figure 0004258575
[式中、R7は水素又は式
Figure 0004258575
の基であり、
8、R9、R10、R11及びR12は独立して水素又はメチルであり、
但しR11及びR12は同時に水素であることはない]
の化合物又はR7が水素以外である場合のそれらの酸付加塩を含む。
特に本発明は発酵生成物A83543の新規な成分に関する。式2化合物と命名される新規な成分は以下の一般式:
Figure 0004258575
[式中、
13は式
Figure 0004258575
の基であり、
14、R15、R16、R17及びR18は独立して水素又はメチルであり、
但し、R17及びR18は同時に水素であることはない]
を有し、あるいはR1が水素以外の場合のそれらの酸付加塩である。
好ましくは本発明はA83543K、A83543O、A83543P、A83543U、A83543V、A83543W及びA83543Yと称される式2成分である新規なA83543成分に関し、各成分に関するR13、R14、R15、R16、R17及びR18は以下の通りである:
Figure 0004258575
本発明の別の側面は、株NRRL 18395(A83543.1)、NRRL 18543(A83543.3)、NRRL 18538(A83543.4)、NRRL 18539(A83543.5)、NRRL 18719(A83543.6)及びNRRL 18823(A83543.9)から選ばれるS.スピノサの株、あるいはそれらの式1−生産性突然変異株を、約50μg/ml〜約200μg/mlのシネフンジンを含む適した培地において、深部好気的条件下で、回収可能な量の式1の化合物が生産されるまで培養することを含む式1の化合物の製造法である。式1化合物は発酵ブロスから、及び菌糸体から極性有機溶媒を用いて抽出される。化合物はカラムクロマトグラフィーなどの当該技術分野において周知の方法によりさらに精製することができる。
本発明のさらに別の側面は、S.スピノサ株NRRL 18743(A83543.8)又はそれらのA83543K−生産性突然変異株を適した培地中で、深部好気的発酵条件下において回収可能な量の式1の化合物が生産されるまで培養することを含む式1の化合物の製造法である。式1の化合物は本明細書に記載の通りに単離し、精製することができる。
株NRRL 18743は新規に発見された株なので、本発明はさらにこの微生物の生物学的に精製された培養物も提供する。
式2の化合物はダニ及び昆虫、特に鱗翅類、同翅類及び双翅類の抑制に有用である。従って殺虫及び殺ダニ性組成物、ならびにこれらの化合物を用いた昆虫及びダニの個体群を減少させる方法も本発明の一部である。
図面の説明
図1はKBr中におけるA83543Kの赤外吸収スペクトルを示す。
図2はアセトン−d6中におけるA83543Kのプロトン核磁気共鳴スペクトルを示す。
図3はEtOH中におけるA83543KのUVスペクトルを示す。
図4はKBr中におけるA83543Oの赤外吸収スペクトルを示す。
図5はアセトン−d6中におけるA83543Oのプロトン核磁気共鳴スペクトルを示す。
図6はEtOH中におけるA83543OのUVスペクトルを示す。
図7はKBr中におけるA83543Pの赤外吸収スペクトルを示す。
図8はアセトン−d6中におけるA83543Pのプロトン核磁気共鳴スペクトルを示す。
図9はEtOH中におけるA83543PのUVスペクトルを示す。
図10はKBr中におけるA83543Uの赤外吸収スペクトルを示す。
図11はアセトン−d6中におけるA83543Uのプロトン核磁気共鳴スペクトルを示す。
図12はEtOH中におけるA83543UのUVスペクトルを示す。
図13はKBr中におけるA83543Vの赤外吸収スペクトルを示す。
図14はアセトン−d6中におけるA83543Vのプロトン核磁気共鳴スペクトルを示す。
図15はEtOH中におけるA83543VのUVスペクトルを示す。
図16はKBr中におけるA83543Wの赤外吸収スペクトルを示す。
図17はアセトン−d6中におけるA83543Wのプロトン核磁気共鳴スペクトルを示す。
図18はEtOH中におけるA83543VのUVスペクトルを示す。
図19はKBr中におけるA83543Yの赤外吸収スペクトルを示す。
図20はアセトン−d6中におけるA83543Yのプロトン核磁気共鳴スペクトルを示す。
図21はEtOH中におけるA83543VのUVスペクトルを示す。
図22は株a83543.1、A83543.3、A83543.4、A83543.5、A83543.6、A83543.7、A83543.8及びA83543.9に関する脂肪酸分析の主成分プロットを示す。
ここで、R7は水素又は式
Figure 0004258575
の基であり、
8、R9、R10、R11及びR12は独立して水素又はメチルであり、但しR11及びR12は同時に水素であることはなく、あるいはR7が水素以外の場合のそれらの酸付加塩となる。
本発明の好ましい側面はR8及びR10がメチルである式1化合物である。本発明のより好ましい側面はR8及びR10がメチルであり、R7が式
Figure 0004258575
の基である式1化合物である。
本発明の別の側面は発酵生成物A83543の新規な成分である。式2化合物と命名されるこれらの新規なA83543成分は以下の化学構造:
Figure 0004258575
[式中、R13は式
Figure 0004258575
の基であり、
14、R15、R16、R17及びR18は独立して水素又はメチルであり、但しR17及びR18は同時に水素であることはない]
を有するか、あるいはR13が水素以外の場合のそれらの酸付加塩である。
本発明のより好ましい側面はR14がCH3であり、R13が式
Figure 0004258575
の基である式2化合物である。
好ましくは本発明はA83543K、A83543O、A83543P、A83543U、A83543V、A83543W及びA83543Yと称される式2化合物である新規なA83543成分に関し、ここで各新規成分に関するR13、R14、R15、R16、R17及びR18はそれぞれ以下の通りである:
Figure 0004258575
これらの新規成分の化学構造は、質量分析、赤外分光学(IR)、核磁気共鳴分光学(NMR)及び紫外分光学(UV)を含む分光測定により、ならびにA83543成分に対する比較により決定した(Kirst et al.(1991),同上を参照)。次章は成分A83543K、A83543O、A83543P、A83543U、A83543V、A83543W及びA83543Yの物理的及びスペクトル的性質を記載する。
読者の便利のために、A83543Kの以下の図は下記に示すA83543天然因子(natural factors)に関するすべてのNMRスペクトルデータの位置指定を与える:
Figure 0004258575
A83543K:
A83543Kは以下の特性を有する:
分子量:717
実験式:C4063NO10
UV(EtOH):243nm(ε=10,657)
MS(FAB):(M+H)m/z 718
IR(KBR):図1を参照。
表Iは図2に示されるA83543Kに関する1H及び13C NMRスペクトルデータ(アセトン−d6中)をまとめたものである。
Figure 0004258575
Figure 0004258575
Figure 0004258575
A83543Oは以下の特性を有する:
分子量:731
実験式:C4165NO10
UV(EtOH):243nm(ε=9,267)
MS(FAB):(M+)m/z 731
IR(KBR):図3を参照。
表IIは図4に示されるA83543Oに関する1H及び13C核磁気共鳴(NMR)スペクトルデータ(アセトン−d6中)をまとめたものである。
Figure 0004258575
Figure 0004258575
A83543Pは以下の特性を有する:
分子量:703
実験式:C3961NO10
UV(EtOH):243nm(ε=13,760)
MS(FAB):(M+H)m/z 704
IR(KBR):図5を参照。
表IIIは図6に示されるA83543Pに関する1H及び13C核磁気共鳴(NMR)スペクトルデータ(アセトン−d6中)をまとめたものである。
Figure 0004258575
Figure 0004258575
A83543U
A83543Uは以下の特性を有する:
分子量:703
実験式:C3961NO10
UV(EtOH):242nm(ε=17,095)
MS(FAB):(M+H)m/z 704
IR(KBR):図7を参照。
表IVは図8に示されるA83543Uに関する1H及び13C核磁気共鳴(NMR)スペクトルデータ(アセトン−d6中)をまとめたものである。
Figure 0004258575
Figure 0004258575
A83543V
A83543Vは以下の特性を有する:
分子量:717
実験式:C4063NO10
UV(EtOH):242nm(ε=10,140)
MS(FAB):(M+H)m/z 718
IR(KBR):図9を参照。
表Vは図10に示されるA83543Vに関する1H及び13C核磁気共鳴(NMR)スペクトルデータ(アセトン−d6中)をまとめたものである。
Figure 0004258575
Figure 0004258575
Figure 0004258575
A83543W
A83543Wは以下の特性を有する:
分子量:717
実験式:C4063NO10
UV(EtOH):244nm(ε=10,254)
MS(FAB):(M+H)m/z 718
IR(KBR):図11を参照。
表VIは図12に示されるA83543Wに関する1H及び13C核磁気共鳴(NMR)スペクトルデータ(アセトン−d6中)をまとめたものである。
Figure 0004258575
Figure 0004258575
Figure 0004258575
A83543Yは以下の特性を有する:
分子量:703
実験式:C3961NO10
UV(EtOH):243nm(ε=14,042)
MS(FAB):(M+H)m/z 704
IR(KBR):図11を参照。
表VIIは図12に示されるA83543Yに関する1H及び13C核磁気共鳴(NMR)スペクトルデータ(アセトン−d6中)をまとめたものである。
Figure 0004258575
Figure 0004258575
化合物A83543K、A83543O、A83543P、A83543U、A83543V、A83543W及びA83543Yは以前に記載された化合物と構造的に異なる。本発明の化合物は以前に記載されていない中性糖を有し:成分A83543K、A83543O及びA83543Yはa−2、3−ジ−O−メチルラムノースと同定される中性糖を有し;成分A83543P及びA83543Wは2−O−メチルラムノースと同定される中性糖を有し;成分A83543U及びA83543Vは3−O−メチルラムノースと同定される中性糖を有する。
アミノ糖は新規A83543成分から選択的に除去され、式3成分と命名される新規A83543プソイドアグリコンを与えることができる。これらの化合物は本発明の別の側面であり、R1が水素である式1の化合物である。
A83543K、A83543O、A83543P、A83543U、A83543V、A83543W及びA83543Yからのアミノ糖の選択的除去は、それぞれA83543Kプソイドアグリコン、A83543Oプソイドアグリコン、A83543Pプソイドアグリコン、A83543Uプソイドアグリコン、A83543Vプソイドアグリコン、A83543Wプソイドアグリコン及びA83543Yプソイドアグリコンを与える。これらの化合物は次式:
Figure 0004258575
により示される。
Figure 0004258575
式2化合物は、式2化合物を酸と反応させてアミノ糖を除去することによる式3化合物の製造に用いられる。適した酸には塩酸及び硫酸が含まれ、変換に好ましい酸は硫酸である。反応は極性有機溶媒、極性有機溶媒と水の混合物、あるいは水中で行われるのが好ましい。適した有機溶媒にはメタノール、THF、アセトニトリル及びジオキサンが含まれる。変換に好ましい溶媒はメタノールと水の混合物、あるいは水である。反応は約25℃〜約95℃の温度、好ましくは80℃において行うことができる。
プソイドアグリコンは新規A83543化合物の製造のための出発材料として有用であり、例えばプソイドアグリコンをアミノ糖が存在したヒドロキシル基においてグリコシル化することができる。このグリコシル化は化学合成により、又は微生物による生物変換(bioconversion)により行うことができる。
本発明の別の側面はある種の式1化合物の化学的脱メチル化である。式1化合物は3つの小群、1A、1B及び1Cに分類することができる。式1A化合物はR7が式:
Figure 0004258575
の基である式1化合物である。
式1B化合物はR7が式:
Figure 0004258575
の基である式1化合物である。
式1C化合物はR7が式:
Figure 0004258575
の基である式1化合物である。
本明細書に記載の通り、式1B化合物は式1A化合物から製造することができる。同様に式1C化合物は式1B化合物から製造することができる。これらの化合物は対応する新規A83543成分の化学的脱メチル化により製造することができる。これらの小群のそれぞれは式2化合物の小組でもある。
N−脱メチル化誘導体である式1B化合物は式1A化合物とヨウ素及び酢酸ナトリウムとの反応により製造される。反応はメタノールなどの極性有機溶媒又はメタノール水溶液などの極性有機溶媒と水の混合物中で行われる。反応は、例えばpH9緩衝液を用いることによりpH9に保たれる。反応は約30℃〜約70℃の温度において約2〜約6時間行うのが好ましい。
ジ−N−脱メチル化誘導体である式1C化合物は式1B化合物とナトリウムメトキシド/ヨウ素との反応により製造することができる。反応はメタノールなどの極性有機溶媒中で行われる。さらに反応は約10〜約15℃、好ましくは約0℃〜5℃の温度で行われる。反応時間は約4時間〜約6時間まで変化する。
式1B及び1C化合物の例を次式に示す:
Figure 0004258575
ここで各化合物に関するR7、R9、R10、R11及びR12は以下の通りである:
Figure 0004258575
7が水素以外である場合の式1化合物である式2化合物は反応して種々の塩を形成することができ、その塩も本発明の一部である。これらの塩は例えば式2化合物の分離及び精製において有用である。さらに塩の形態のいくつかは水溶性が向上し得る。これらの塩は塩の製造のための標準的方法を用いて製造される。例えばA83543Kを適した酸で中和し、酸付加塩を形成することができる。
酸付加塩は特に有用である。代表的な適した塩には、有機及び無機酸の両方、例えば硫酸、塩酸、リン酸、酢酸、コハク酸、クエン酸、乳酸、マレイン酸、フマル酸、コール酸、パモ酸、粘液酸、グルタミン酸、樟脳酸、グルタル酸、グリコール酸、フタル酸、酒石酸、蟻酸、ラウリン酸、ステアリン酸、サリチル酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ソルビン酸、ピクリン酸、安息香酸、ケイ皮酸などの酸との標準的反応により形成される塩が含まれる。
続く議論を簡単にするために、A83543A−製造株に以下の名称を与えた:A83543.1、A83543.3、A83543.4及びA83543.5。又、新規A83543K−製造株にA83543.8の名称を与えた。培養物A83543.1、A83543.3、A83543.4、A83543.5、A83543.6、A83543.7、A83543.8及びA83543.9をMidwest Area Regional Research Center,Agricultural Research Service,United States Department of Agriculture,に寄託し、原料培養物コレクション(stock culture collection)の一部とし、それらはそこから以下の登録番号で公に入手することができる:
NRRL番号 株番号
18395 A83543.1
18537 A83543.3
18538 A83543.4
18539 A83543.5
18719 A83543.6
18720 A83543.7
18743 A83543.8
18823 A83543.9
培養物A83543.1はバージン島(Virgin Island)で集められた土壌試料から単離された培養物A83543の化学的突然変異により得た。Mertz and Yao(1990),Int’l J. of Systematic Bacteriology,40:34。培養物83543.4は培養物A83543.1から誘導された。株A83543.3、A83543.4、A83543.5、A83543.6及びA83543.7のそれぞれはN−メチル−N’−ニトロ−N−ニトロソグアニジンを用いた化学的誘導突然変異誘発によりA83543.1から誘導された。株A83543.8及びA83543.9はN−メチル−N’−ニトロ−N−ニトロソグアニジンを用いた化学的誘導突然変異誘発によりA83543.4から誘導された。A83543成分の製造における差を除いて、これらの単離物は親培養物と同一であると思われる。なお、株A83543.8は、ブダペスト条約のもとで1990年12月19日にNRRLに国際寄託されている。
培養特性(Cultural Characteristics)
培養物A83543.1、A83543.3、A83543.4、A83543.5、A83543.6、A83543.7、A83543.8及びA83543.9を12種の寒天平板培養培地上で生育し、成長、裏の色(reverse color)、気生菌糸製造、胞子塊(spore mass)の色、及び可溶性色素製造に関して比較した。用いたいずれの培地においても有意な差は観察されなかった。培養物は複合培地及び規定培地の両方において十分に生育した。気生菌糸は、用いたほとんどの培地において製造された。気生胞子塊の色は主に白であり、裏側は黄色から黄褐色であった。明白な着色は存在しなかったが、可溶性の褐色の色素がいくつかの培地中に放出された。A83543.3、A83543.4、A83543.5、A83543.6、A83543.7、A83543.8及びA83543.9の培養特性はA83543.1の最初の分類学的説明と類似である(Mertz and Yao(1990),同上を参照)。
形態学的特性
分裂して(segmented)鍵と環(hooks and open loops)のように配置された胞子の長鎖となった、十分に形成された気生菌糸はほとんどの培地に存在した。らせんも観察されたが、それらは短く、不完全であった。一般的形態はレクタス−フレキシビリス(rectus−flexibilis)であった。各株のそれぞれの気生菌糸は胞子鎖に多くの空の空間を有する明確なビーズ−様外観を有した。この特徴は胞子の鞘(spore sheath)が胞子鎖を包んでいることを示しており、それはサッカロポリスポラ属の明確な特徴である。A83543成分の製造における差を除いてこれらの単離物は親培養物と類似であると思われる。
生理学的特性
それぞれの株からの脂肪酸分析を比較した。細胞をトリプチカーゼしょうゆブロス(trypticase soy broth)(Difco Laboratories,Detroit,MI)中で28℃において96時間生育した。脂肪酸メチルエステルを、5898A型コンピューター制御気液クロマトグラフィー系(Hewlett−Packard Co.,Palo Alto,CA)を用いた気液クロマトグラフィーにより分析した(Miller and Berger,“Bacterial Identification by Gas Chromatography of Whole Cell Fatty Acids,”Hewlett−Packard Application Note 228−41を参照)。これらの結果を表VIIIに示す。
Figure 0004258575
主成分分析は、1組の変数の内部相関性を扱う多変数統計学の一部門である。この分析において、最初のデータ又は試験結果内の最大量の変動が主成分として表される(Computer−Assisted Bacterial Systematics 227(1985)におけるAlderson,“The Application and Relevance of Nonheirarchic Methods in Bacterial Taxonomy”を参照)。散乱又は変動を示すプロットを作図することができる。変動を調べることにより相関性を評価し、微生物個体群を特性化することができる。株A83543.1、A83543.3、A83543.4、A83543.5、A83543.6、A83543.7、A83543.8及びA83543.9の脂肪酸分析からの2次元主成分プロットを図13に示す。値は含まれる株間の分離の程度に関連する。株間の差は分類学的に重要ではない。
他の生物の場合と同様に、A83543−生産株の特性は変異を受ける。かくしてこれらの株の突然変異株を当該技術分野において既知の物理的及び化学的方法により得ることができる。例えばN−メチル−N’−ニトロ−N−ニトロソグアニジンなどの化学品を用いた処理により他の株を得ることができる。適した条件で培養した場合に回収可能な量の式1化合物を生産する特性を保持しているS.スピノサ NRRL 18395、NRRL 18537、NRRL 18538、NRRL 18539、NRRL 18719、NRRL 18720、NRRL 18743及びNRRL 18823の自然及び誘発突然変異株を本発明において適用できる。
本発明の1つの側面は、NRRL 18395、NRLL 18537、NRRL 18538及びNRRL 19539又はそれらのA83543A−製造突然変異株から成る群より選ばれるS.スピノサのA83543A−製造株をシネフンジンを含む適した培地中で培養することにより製造される式1の化合物の製造である。“A83543A−製造突然変異株”は、S.スピノサのA83543A−製造株、NRRL 18395、NRRL 18537、NRRL 18538、NRRL 18539のいずれか1つから誘導され、回収可能な量のA83543Aを製造することができ、シネフンジンを含む適した培地中で培養された場合に付随量のA83543K及びA83543Oを製造することができる株である。
本発明の別の側面は、NRRL 18823又はそれらのA83543H−製造突然変異株などのS.スピノサのA83543H−製造株をシネフンジンを含む適した培地中で培養することによる式1の化合物の製造である。“A83543H−製造突然変異株”は、S.スピノサのA83543H−製造株、NRRL 18823のいずれか1つから誘導され、回収可能な量のA83543Hを製造することができ、シネフンジンを含む適した培地中で培養されると付随量のA83543U及びA83543Vを製造することができる株である。
本発明のさらに別の側面は、NRRL 18719又はそれらのA83543J−製造突然変異株などのS.スピノサのA83543J−製造株をシネフンジンを含む適した培地中で培養することによる式1の化合物の製造である。“A83543J−製造突然変異株”は、S.スピノサのA83543J−製造株、NRRL 18719又はNRRL 18720のいずれか1つから誘導され、回収可能な量のA83543Jを製造することができ、約50mg/ML〜約200mg/MLのシネフンジンを含む適した培地中で培養されると付随量のA83543P及びA83543Wを製造することができる株である。
典型的にシネフンジンは48〜72時間後に製造培地に加えられるか、あるいは大規模製造の場合シネフンジンの添加は培養物の成長の開始が酸素の吸収により示されるまで延期される。シネフンジンは接種の約48時間〜約72時間後に発酵培地に加えるのが好ましい。シネフンジンは個体として、又は溶液として加えることができる。便宜的に、シネフンジンが大規模発酵に加えられる場合、アルコール性溶液としての添加が好ましい。そのような溶液はシネフンジンを十分な体積のメチルアルコールに溶解し、次いで0.45μフィルターを通して濾過することにより溶液を滅菌することにより調製される。
別の場合、式1化合物はS.スピノサ株 NRRL 18743(成分A83543K、A83543O及びA83543Yを製造する)又はそれらのA83543K−製造突然変異株をシネフンジンを添加しない適した培地中で培養することにより製造される。“A83543K−製造突然変異株”はS.スピノサ NRRL 18743から誘導され、回収可能な量のA83543Kを製造することができる株である。
製造後、式1化合物は当該技術分野において十分に理解される種々の単離及び精製法を用いて培地から分離することができる。製造における経済性、最適収量及び生成物単離の容易さのために、ある種の培地が好ましい。例えば大規模発酵における好ましい炭素源はグルコース及びオレイン酸メチルであるが、リボース、キシロース、フルクトース、ガラクトース、マンノース、マンニトール、可溶性澱粉、ポテトデキストリン、油類、例えば大豆油なども用いることができる。好ましい窒素源は綿実粉、ペプトン化乳(peptonized milk)及びとうもろこし浸漬液(corn steep liquor)であるが、魚粉、消化大豆粉、酵母抽出物、酵素−加水分解カゼイン、ビーフ抽出物なども用いることができる。培地中に挿入することができる栄養無機塩の中には、亜鉛、ナトリウム、マグネシウム、カルシウム、アンモニウム、塩化物、炭酸、硫酸、硝酸などのイオンを与えることができる通常の可溶性塩がある。生物の成長及び発育に必要な必須微量元素も培地に含まれなければならない。そのような微量元素は通常、培地の他の置換物中に不純物として、生物の成長条件を満たすのに十分な量で存在する。
通常、発泡が問題である場合、少量(すなわち0.2mL/L)のポリプロピレングリコールなどの消泡剤を大規模発酵培地に加えることができる。しかしA83543−製造培養物の場合、従来の脱泡剤はA83543製造を阻害する。発泡は培地中に大豆油又はPLURONIC L−101(BASF,Parsipanny,NJ)を含むことにより(1〜3%)抑制することができる。発泡が現れたら追加の油を加えることができる。
実質的量の式1化合物の製造のために、撹拌されたバイオリアクターにおける深部好気的発酵が好ましいが、震盪フラスコ培養によって少量の式1化合物を得ることができる。通常大バイオリアクターへの胞子の形態の生物の接種に伴う製造における遅れの故に、栄養接種材料(vegetative inoculum)を用いるのが好ましい。栄養接種材料は、液体窒素中に保存された原料培養物からの小体積の培地を接種して生物の新しい、活発に成長している培養物を得ることにより調製される。次いで栄養接種材料を大バイオリアクターに移す。栄養接種材料の培地は、より大きな発酵に用いられるものと同一であることができるが、他の培地も適している。
式1化合物は約24℃〜約33℃の温度で生育した場合にA83543−製造株から製造される。製造のための最適温度は約28〜30℃であると思われる。
深部好気的培養法で通常行われる通り、培地を従来のタービン撹拌機を用いて撹拌しながら底から無菌の空気を容器中に吹き込む。一般にエアレーション速度及び撹拌速度は、約0.34気圧の内部容器圧力で溶解酸素の量を80%か又はそれ以上に保持するのに十分でなければならない。
式1化合物の製造はブロスからの抽出物を調べることにより発酵の間、追跡することができる。製造の追跡のための好ましい方法は、高性能液体クロマトグラフィー(HPLC)によるブロス抽出物の分析である。分析のために適した系は実施例1に記載されている。
震盪フラスコ又は撹拌反応器における製造に続いて、式1化合物を当該技術分野で用いられる方法により発酵培地から回収することができる。A83543−製造株の発酵の間に製造された化合物は、菌糸体及びブロスの両方に存在する。式1化合物は親油性であり、発酵に実質的量の油が用いられる場合、全ブロス抽出がより有効である。少量の油しか用いられない場合、式1化合物の大部分は菌糸体に存在する。その場合、式1化合物のより有効な回収は、最初に培地を濾過してブロスを菌糸体の塊(バイオマス)から分離することにより成される。
式1化合物は多様な方法によりバイオマスから回収することができる。適した方法は、分離されたバイオマスを水で洗浄した残留ブロスを除去し、バイオマスを式1化合物が可溶性の極性溶媒、例えばメタノール又はアセトンと混合し、分離して溶媒を濃縮し、濃縮物を非極性溶媒で抽出し、及び/又はそれを逆相シリカゲル吸着剤、例えば逆相C8又はC18樹脂、又はHP−20もしくはHP−20ss(Mitsubishi Chemical Industries Co.,Ltd.,Japan)などの非常に多孔質なポリマー上に吸着させる方法を含む。活性材料は、例えば場合により少量のTHFを含むH2O:アセトニトリル:メタノール混合物などの適した溶媒を用いて吸着剤から溶離させる。
バイオマスからの式1化合物の単離のための好ましい方法は、全ブロスに等量のアセトンを加え、セラミックフィルターにおいて混合物を濾過してバイオマスを除去し、濾液を酢酸エチルで抽出する方法を含む。酢酸エチル抽出物を真空中で濃縮してアセトンを除去し、水層を有機層から分離する。酢酸エチル溶液をさらに真空中で濃縮し、濃縮液を希酸水溶液(pH3)で抽出する。式1化合物は本明細書に記載の通り、クロマトグラフィーによりさらに精製することができる。
バイオマスからの式1化合物の単離のためのより好ましい方法は、全ブロスに等体積のアセトンを加え、セラミックフィルターにおいて混合物を濾過してバイオマスを除去し、濾液のpHを約pH9〜約pH13に調節する方法を含む。この溶液をHP−20ss(Mitsubishi Chemical Industries Co.,Ltd.,Japan)に適用し、カラムをメタノール、アセトニトル及び水(1:1:2)の混合物で洗浄する。式1化合物を0.1%の酢酸アンモニウム(pH8.1)を含むメタノール/アセトニトリル(1:1)の95:5混合物を用いて溶離させる。式1化合物を含む画分を合わせ、凍結乾燥する。式1化合物は本明細書に記載の通り、クロマトグラフィーによりさらに精製することができる。
別の場合、培地成分及び菌糸体を含む培養物固体を抽出又は分離をせずに式1化合物の供給源として用いることができるが、水の除去の後が好ましい。例えば式1化合物の製造後、全発酵ブロスを凍結乾燥により、ドラム−乾燥により、又は共沸蒸留及び乾燥により乾燥することができる。次いで乾燥されたブロスを、例えばそれを飼料予備混合物中、又はスプレー及び粉末のための調剤中に直接混合することにより、直接用いることができる。
殺虫及び殺ダニ活性
式2化合物は昆虫及びダニの抑制に有用である。従って本発明の別の側面は、ダニ又は昆虫の場所(locus)に昆虫−又はダニ−阻害量の式2化合物を適用することを含む昆虫又はダニの阻害の方法を目的としている。
昆虫又はダニの“場所”は、昆虫又はダニが生存している、あるいはその卵が存在する環境を言い、それを取り巻く空気、それが食する食物、あるいはそれが接触する対象を含む。例えば植物−摂取昆虫又はダニは、昆虫又はダニが食する、又は棲息する植物部分、特に葉に活性化合物を適用することにより抑制することができる。
“昆虫又はダニの阻害”という用語は、生存昆虫又はダニの数の減少、あるいは生育し得る昆虫又はダニの卵の数の減少を言う。化合物により成される減少の程度は、もちろん化合物の適用比、用いられる特定の化合物、及び標的昆虫又はダニの種に依存する。少なくとも昆虫−不活性化又はダニ−不活性化量を用いなければならない。
“昆虫−不活性化量”及び“ダニ−不活性化量”という用語は、処理された昆虫又はダニの個体群における測定可能な減少を引き起こすのに十分な量を言うために用いられる。一般に約1〜約1,000ppm(又は0.01〜1kg/a)の範囲の量の活性化合物が用いられる。
式2化合物は複数の昆虫及びダニに対して活性を示す。さらに特定的には、化合物は鱗翅類の昆虫のメンバーであるビート・アーミーワーム及びタバコ・バズワームに対して活性を示す。この目の他の典型的メンバーはサザン・アーミーワーム、コズリング・モス、カットワーム、クローズ・モス、インディアン・ミール・モス、リーフ・ローラー、コーン・イア・ワーム、コットン・ボールワーム、ヨーロピアン・コーン・ボーラー、インポーテッド・キャベツ・ワーム、キャベツ・ルーパー、ピンク・ボールワーム、バッグワーム、イースタン・テント・キャタピラー、ソド・ウェブワーム及びフォール・アーミーワームである。
式2化合物はリーフ・ホッパーに対しても活性を示し、それは同翅類の昆虫のメンバーである。この目の他のメンバーにはコットン・アフィド、プラント・ホッパー、ピア・プシラ、アップル・サッカー、スケール・インセクト、ホワイトフライ、及びスピットル・バグ、ならびに複数の他の宿主特異的アフィド種が含まれる。
さらに式2化合物はステープル・フライ、ブローフライ及び蚊に活性を示し、それらは双翅類の昆虫のメンバーである。この目の他の典型的メンバーはコモン・ハウス・フライである。
式2化合物は2点クモダニ(two−spotted spider mites)に対して活性を示し、これはダニ類の昆虫のメンバーである。この目の他の典型的メンバーにはメインジ・ダニ、スカブ・ダニ、シーブ・スカブ・ダニ、チキン・ダニ、スケーリーレッグ・ダニ、デプルミング・ダニ及びドッグ・フォリクル・ダニが含まれる。
式2化合物は昆虫及びダニの個体群を減少させるために有用であり、昆虫又はダニの個体群の阻害の方法で用いられ、その方法は昆虫又はダニの場所に昆虫−又はダニ−不活性化有効量の式2化合物を適用することを含む。1つの好ましい実施態様の場合、本発明は鱗翅類の感受性昆虫の阻害の方法を目的としており、その方法は本発明に従って昆虫−不活性化有効量の式2化合物を植物に適用することを含む。本発明の他の好ましい実施態様は、動物中の双翅類のバイティング・フライの阻害の方法を目的としており、その方法は有害生物−阻害有効量の式2化合物を経口的に、非経口的に、又は局所的に動物に投与することを含む。他の好ましい実施態様の場合、本発明は同翅類の感受性昆虫の阻害の方法を目的としており、それは昆虫−不活性化有効量の式2化合物を植物に適用することを含む。本発明の他の好ましい実施態様は、ダニ(Acarina)類のダニの阻害の方法を目的としており、それはダニ−不活性化量の式2化合物をダニの場所に適用することを含む。
ダニ/昆虫スクリーン
式2化合物を以下のダニ/昆虫スクリーンにおいて、殺ダニ及び殺虫活性に関して調べた。各試験化合物は、1リットル当たり23gのTOXIMUL R(スルホネート/非イオン性乳化剤ブレンド)及び13gのTOXIMUL S(スルホネート/非イオン性乳化剤ブレンド)を含むアセトン−アルコール(1:1)混合物に化合物を溶解することにより調製した。これらの混合物を次いで水で希釈し、示されている濃度を得た。
二点クモダニ及びコットン・アフィドをかぼちゃ(squash)の子葉上に導入し、葉の両面に落ち着かせた。次いで、葉にDeVilbiss噴霧器を10psiで用いて5mlの試験溶液を噴霧した。葉の両面を流れ落ちるまで覆い、次いで1時間乾燥させた。標準的暴露時間の後、パーセント死亡率を評価した。追加の昆虫を類似の調剤及び評価法を用いて評価した。結果を表IXに報告する。以下の略字を用いる:
略字 有害生物 科学名
ALH アスター・リーフホッパー マクロステレス・ファシフロンス(Macrosteles fascifrons)
BAW ビート・アーミーワーム スポドプテラ・エクシグア(Spodoptera exigua)
CA コットン・アフィド アフィス・ゴシピイ・グロベル(Aphis gossypii Glover)
GECR ジャーマン・コックローチ ブラテラ・ゲルマニカ(Blattella germanica)
NEM ルートノット・ネマトード メリイオジン種(Meliiodyne spp.)
SCRW サザン・コーン・ルートワーム (ディアブロチカ・ウンデシンプンクタタ・ホワルジ(Diabrotica undecimpunctata howardi)
TBW タバコ・バズワーム ヘリオチス・ビレセンス(Heliothis virascens)
TSSM 二点クモダニ テトラニクス・ウルチカエ(Tetranychus urticae)
Figure 0004258575
式2化合物を以下のアッセイにおいて評価し、新生タバコ・バズワーム(ヘリオチス・ビレセンス)に対するLD50を決定した。ペトリ皿(100mmx20mm)を裏返し、蓋を#1定性濾紙で裏打ちする。新生幼虫を各皿に置き、1mlの試験溶液を昆虫に上にピペットで注ぐ。次いでペトリ皿の底を蓋の上に置き、幼虫を囲う。処理の1時間後、ヘリオチスの常食の小片(修正スラリ(modified slurry),Southland Products,Lake Village,AR)を各皿に加える。24及び48時間に死亡率を評価する。試験は三重に行った。結果を表Xに示す。
Figure 0004258575
殺虫性組成物
本発明の式2化合物を、やはり本発明の一部である組成物の形態で適用する。これらの組成物は昆虫−又はダニ−不活性化量の式2化合物を、植物学的に許容し得る不活性担体中に含む。活性成分である式2化合物は単独の式2化合物として、2種又はそれ以上の式2化合物の混合物として、少なくとも1種のA83543K、A83543O、A83543P、A83543U、A83543V、A83543W及びA83543Yの混合物として、あるいはそれが製造された発酵培地の乾燥部分と一緒の少なくとも1種のA83543K、A83543O、A83543P、A83543U、A83543V、A83543W及びA83543Yの混合物として存在することができる。
組成物は農業化学的分野において慣習的な方法及び処方に従って製造されるが、それは1種又はそれ以上の本発明の化合物が存在する故に新規であり、重要である。組成物は、適用の場合に水に分散される濃厚調剤、あるいはさらに処理を受けずに適用される粉剤又は顆粒剤であることができる。
化合物又は粗乾燥材料が適用される分散液は、化合物又は粗材料の濃厚調剤から調製される水性懸濁液又は乳液である場合が最も多い。そのような水溶性、水−懸濁性又は乳化性調剤は固体(通常水和剤として既知)又は液体(通常濃厚乳剤又は水性懸濁液として既知)のいずれかである。
圧縮して水分散性顆粒とすることができる水和剤は、活性化合物、不活性担体及び界面活性剤の均質な混合物を含む。活性化合物の濃度は通常約1重量%〜約90重量%である。不活性担体は通常アタパルジャイトクレー、モントモリロナイトクレー、ケイ藻土又は精製シリカから選ばれる。
水和剤の約0.5%〜約10%を構成する有効な界面活性剤は、スルホン化リグニン、縮合ナフタレン−スルホネート、ナフタレン−スルホネート、アルキルベンゼンスルホネート、アルキルサルフェート及び非イオン性界面活性剤、例えばアルキルフェノールのエチレンオキシド付加物から見いだされる。
化合物の濃厚乳剤は、水−混和性溶媒又は水−非混和性有機溶媒と乳化剤の混合物である不活性担体中に溶解された従来の濃度、例えば約10%〜約50%に等しい液体1リットル当たり約50〜約500グラムの濃度の化合物を含む。有用な有機溶媒には芳香族化合物、特にキシレン類、及び石油留分、特に石油の高沸点ナフタレン性及びオレフィン性部分、例えば重質又は芳香族ナフサが含まれる。他の有機溶媒、例えばロジン誘導体を含むテルペン性溶媒、シクロヘキサノンなどの脂肪族ケトン類、及び2−エトキシエタノールなどの複合アルコール類(complex alcohols)も用いることができる。濃厚乳液に適した乳化剤は上記で挙げたような従来の非イオン性界面活性剤から選ばれる。
水性懸濁液は、水性ビヒクル中に約5重量%〜約50重量%の範囲の濃度で分散された本発明の水−不溶性化合物の懸濁液を含む。懸濁液は化合物を微粉砕し、水及び上記で議論されたと同じ種類から選ばれる界面活性剤を含むビヒクル中にそれを激しく混合することにより調製される。無機塩及び合成又は天然ゴムなどの不活性成分を加え、水性ビヒクルの密度及び粘度を増加させることもできる。水性混合物を調製し、それをサンドミル、ボールミル又はピストン型ホモジナイザーなどの装置で均質化することにより、化合物を同時に粉砕及び混合するのが多くの場合に最も有効である。
式2化合物は顆粒組成物としても適用することができ、それは土壌への適用の場合に特に有用である。顆粒組成物は通常、完全に、又は大部分がクレー又は類似の安価な物質から成る不活性担体中に分散された約0.5重量%〜約10重量%の式2化合物を含む。そのような組成物は通常、適した溶媒中に化合物を溶解し、約0.5〜3mmの範囲の適した粒径に予備形成された顆粒担体にそれを適用することにより調製される。そのような組成物は担体のドウ又はペーストを作り、ドウ又はペースト中に活性成分を合わせた混合物を乾燥し、乾燥された組成物を粉砕して所望の顆粒粒径を得ることによっても調製することができる。
化合物を含む粉剤は、粉末の形態の化合物を適した微粉農業用担体、例えばカオリンクレー、粉砕火山岩などと均質に混合することにより調製される。粉剤は約1%〜約10%の式2化合物を含むのが適している。
いずれかの理由で望ましい場合、適した有機溶媒、通常は無刺激石油、例えば農業化学で広く用いられるスプレーオイル中の溶液の形態で化合物を適用するのが同様に実用的である。
殺虫剤及び殺ダニ剤は通常液体担体中の活性成分の分散液の形態で適用される。適用比を担体中の活性成分の濃度として言うのが簡便である。最も広く用いられる担体は水である。
式2化合物はエアゾール組成物の形態で適用することもできる。そのような組成物の場合、活性化合物は圧力−発生プロペラント混合物である不活性担体中に溶解される。エアゾール組成物は容器に詰められ、そこから混合物が噴霧バルブを介して分散される。プロペラント混合物は、有機溶媒と混合することができる低沸点ハロカーボン類、あるいは不活性気体又は気体炭化水素類で加圧された水性懸濁液を含む。
昆虫及びダニの場所に適用されるべき化合物の量は重要ではなく、与えられている実施例を見て当該技術分野における熟練者が容易に決定することができる。一般に約10ppm〜約5,000ppmの濃度の式2化合物が優れた抑制を与えると予想される。多くの化合物の場合、約100〜約1,000ppmの濃度が十分である。大豆及び綿などの畑作物の場合、化合物に関する適した適用比は約0.01〜約1kg/haであり、典型的に5〜50ガロン/Aのスプレー調剤として適用される。
式2化合物が適用される場所は昆虫又はダニが棲息するいずれの場所であることもでき、例えば野菜作物、果実及びナッツの木、ぶどうの木及び装飾用植物であることができる。ダニの卵の有毒作用に耐える独特の能力の故に、新しく発生した幼虫の抑制のためには繰り返し適用が望ましく、これは他の既知の殺ダニ剤の場合も真実である。
殺外部寄生虫活性
式2化合物は双翅類の昆虫のメンバーに対しても活性である。表XI及びXIIは、ブローフライ幼虫及びステーブルフライ成虫に対する式2化合物の48時間における試験管内研究をまとめたものである。
Figure 0004258575
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殺外部寄生虫法
本発明の殺外部寄生虫法は、式2化合物を宿主動物に投与して昆虫及びダニ寄生虫を抑制することにより行われる。動物への投与は経皮的、経口的又は非経口的経路によることができる。
寄生昆虫及びダニには吸血性及び食肉性の種、及びその生活環のすべて又はその生活環の一部の間のみ、例えば幼虫のみ又は成虫段階のみに寄生性である種が含まれる。代表的種には以下が含まれる:
Figure 0004258575
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本発明の方法は経済動物(economic animals)及び随伴動物(companion animals)を外部寄生虫から保護するために用いることができる。例えば化合物を馬、牛、羊、豚、山羊、犬、猫など、ならびにらくだ、ラマ、鹿などの外来の動物及び通常野生動物と呼ばれる他の種に投与して有益である。化合物は家禽及び他の鳥類、例えば七面鳥、鶏、あひるなどに投与しても有益である。方法は経済動物に投与するのが好ましく、牛及び羊に投与するのが最も好ましい。
殺外部寄生虫性組成物
本発明は宿主動物の血液を吸う昆虫外部寄生虫の個体群の抑制のための組成物にも関する。これらの組成物は経済動物、随伴動物及び野生動物を外部寄生虫から保護するために用いることができる。組成物は家禽及び他の鳥類に投与しても有益である。
経済動物の保護のために方法を適用し、あるいは組成物を用いるのが好ましく、牛及び羊に用いるのが最も好ましい。有効適用の比率、時期及び方法は、寄生虫の正体、寄生虫攻撃の程度及び他の因子と共に広く変化する。適用は宿主の全寿命をかけて周期的に、又は寄生虫攻撃のピーク季節のみに行うことができる。一般に約0.0005〜約95%の式2化合物、好ましくは最高5%、及び最も好ましくは最高1%の式2化合物を含む液体調剤の局所的適用により外部寄生虫抑制が得られる。有効な寄生虫抑制は、約5〜約100mg/kgの適用比で達成される。
式2化合物は従来の獣医学的慣習により宿主動物に適用される。通常化合物は、式2化合物及び生理学的に許容し得る担体を含む殺外部寄生虫性組成物に調製される。例えば液体組成物は、殺外部寄生虫的抑制が望まれている動物に単に噴霧することができる。動物は、式2化合物と動物がそれを背に接触しながら歩くことができる例えば布を含むことができるバックラバーのような装置により、自ら処置することもできる。浸漬タンクも宿主動物に活性薬剤を投与するために用いることができる。
化合物を動物の飼料又は飲料水に混合することにより、あるいは錠剤、カプセル、大型丸薬又は体内埋植などの投薬形態を投与することにより経口的投与を行うことができる。経皮的投与は、注射可能な調剤の皮下、腹腔内及び静脈内注射により簡単に行われる。
式2化合物は経口的投与のために飲薬、錠剤又はカプセルなどの通常の形態に調製することができる。そのような組成物はもちろん経口的に許容し得る不活性担体を必要とする。化合物は、皮下的、皮膚的、管内、腹腔内、筋肉内又は静脈内注射のための注射可能な溶液又は懸濁液として調製することもできる。いくつかの適用の場合、化合物は標準的動物飼料の1成分として調製するのが便利である。この実施態様の場合、本発明の化合物を最初に、液体又は粒子状固体担体中に化合物が分散されている予備混合物として調製するのが通常である。予備混合物は、混合物1ポンド当たり約2〜約250gの式2化合物を含むことができる。予備混合物自身は従来の混合により最終的飼料中に調製される。
一般に外部寄生虫攻撃は宿主動物の寿命の実質的割合の間に起こるので、一定の期間をかけた持効性を与える形態で式2化合物を投与するのが好ましい。従来の方法は溶解を物理的に阻害するマトリックスの使用を含み、ここでマトリックスはワックス状の半−固体、例えば植物ワックス類、あるいは高分子量ポリエチレングリコールである。化合物を投与する優れた方法は、Laby,米国特許第4,251,506号及びSimpson,英国特許第2,059,767号のものなどの、持続−作用大型丸薬を用いる方法である。そのような大型丸薬の場合、化合物はNevin,米国特許第4,273,920号のものなどのポリマーマトリックス中に封入されている。本発明の化合物の持効性はシリコン−含有ゴムから作られるような体内埋植の使用によっても達成される。
本発明の実施をより十分に説明するために、以下の実施例を提供する:
実施例1
A83543アッセイ法
A83543K、A83543O、A83543P、A83543U、A83543V、A83543W、A83543Y及び他のA83543成分の製造のための発酵を監視するために以下の分析的高性能液体クロマトグラフィー(HPLC)が有用である:
全ブロスの試料を3体積のアセトニトリルで希釈し、菌糸体からの因子を抽出する。次いで得られる溶液を0.45ミクロンのポリテトラフルオリン(PTFE)フィルターを通して濾過し、HPLCアッセイ系に注入する前に粒子状物質を除去する。メタノール中1ml当たり100mgの濃度の精製A83543Aの溶液をアッセイのための外部標準として用い、すべてのA83543成分のピーク面積をこのキャリブレーション標準に逆相関させ、各成分の濃度を決定する。
HPLC系
カラム担体:YMC−PACK 4.6x100−mm IDカラム、5μ球状、120Å(YMC Inc.,Morris Plains,NJ)
可動相:0.05%の酢酸アンモニウムを含むCH3CN/MeOH/H2O(3:3:2)
流量:2ml/分
検出:250nmにおけるUV
Figure 0004258575
実施例2
培養物NRRL 18538(A83543.4)を用いたA83543K及びA83543Oの製造
A.震盪フラスコ発酵
凍結乾燥ペレットとして、又は液体窒素中に保持された懸濁液としての培養物S.スピノサ NRRL 18538を用い、以下の組成を有する栄養培地に接種した:
Figure 0004258575
栄養培地に2.5%の寒天を加えることにより斜面又は平板を調製することができる。接種された斜面を30℃で約10〜約14日間インキュベートする。成熟斜面培養物を無菌の道具を用いてこすり落とし、胞子を解放し、菌糸体マット(mat)を取り出し、ふやかす。かくして得られる解放された胞子及び成長培養物の約4分の1を用いて50mlの第1期栄養培地に接種する。代わりに液体窒素アンプルから第1期培地に接種することができる。
培養物が液体窒素中に保持されている場合、アンプルは、同体積の栄養培地(48〜72時間インキュベーション、30℃)及び懸濁培地を用いて調製することができる。懸濁培地はラクトース(100g)、グリセロール(200ml)及び脱イオン水(1−Lとなる量)を含む。
液体窒素アンプルを用い、250−mlの三角フラスコ中の50mlの栄養培地に接種する。培養物を、250rpmで2インチ(5.08cm)の円の軌道を描く震盪器上で30℃において48時間インキュベートする。
インキュベートされた培養物(5%v/v接種材料)を用い、250−mlの広口三角フラスコ中の30mlの製造培地に接種する。培地の組成は以下の通りであった:
Figure 0004258575
接種された製造培地を250−mlの広口三角フラスコ中で30℃において7日間、250rpmで2インチの円の軌道を描く震盪器上でインキュベートする。接種の72時間後に、シネフンジンを約100μg/mlの最終濃度で加えた。
B.撹拌リアクター発酵
大体積の接種材料を与えるために、実施例2、A章で記載の通りに調製された10mlのインキュベートされた第1期培地を用い、第1期培地の組成と同じ組成を有する400mlの第2期栄養培地に接種する。この第2期栄養培地を2−Lの広口三角フラスコ中で30℃において約48時間、250rpmにおいて2インチの円の軌道を描く震盪器上でインキュベートする。
かくして調製され、インキュベートされた第2期栄養培地(2−L)を用い、実施例2、A章に記載の通りに調製された115リットルの無菌製造培地に接種する。シネフンジンを、濾過されたメタノール性溶液として、66時間において100μg/mlの最終濃度まで加えた。
接種された製造培地を165−Lの撹拌バイオリアクター中で、30℃の温度において7日間発酵させた。撹拌容器における空気流及び撹拌機の速度はコンピューター制御され、溶解酸素の量は空気飽和の約80%に保持される。
実施例3
培養物NRRL 18743(A83543.8)を用いたA83543K、A83543O及びA83543Yの製造
A.震盪フラスコ発酵
凍結乾燥ペレットとして、又は液体窒素中に保持された懸濁液としての培養物S.スピノサ NRRL 18743を用い、以下の組成を有する栄養培地に接種した:
Figure 0004258575
栄養培地に2.5%の寒天を加えることにより斜面又は平板を調製することができる。接種された斜面を30℃で約10〜約14日間インキュベートする。成熟斜面培養物を無菌の道具を用いてこすり落とし、胞子を解放し、菌糸体マットを取り出し、ふやかす。かくして得られる解放された胞子及び成長培養物の約4分の1を用いて50mlの第1期栄養培地に接種する。代わりに液体窒素アンプルから第1期培地に接種することができる。
液体窒素貯蔵接種材料は、栄養培養物を均質化し、グリセロール:ラクトース:水(2:1:7)の無菌の懸濁剤を用いて1:1に希釈し(体積:体積)、それを無菌の管に分配する(1.5ml/管)ことにより調製した。希釈された接種材料は、次いで適した保存容器中で液体窒素の上で保存し、震盪フラスコ培養物の培養のための発酵原料接種材料(working stock inoculum)として、及び発酵器播種接種材料として用いた。
液体窒素アンプルを急速解凍し、0.5mlを用いて250−mlの広口三角フラスコ中の50mlの栄養培地に接種した。培養物を、250rpmで2インチ(5.08cm)の円の軌道を描く震盪器上で32℃において48時間インキュベートする。
インキュベートされた培養物(5%v/v接種材料)を用い、以下の組成を有する25mlの製造培地に接種する:
Figure 0004258575
接種された製造培地を250−mlの広口三角フラスコ中で30℃において7日間、250rpmで2インチの円の軌道を描く震盪器上でインキュベートする。
B.撹拌リアクター発酵
大体積の接種材料を与えるために、実施例3、A章で記載の通りに調製された10mlのインキュベートされた第1期培地を用い、第1期培地の組成と同じ組成を有する400mlの第2期栄養培地に接種する。この第2期栄養培地を2−Lの広口三角フラスコ中で32℃において約48時間、250rpmにおいて2インチの円の軌道を描く震盪器上でインキュベートする。
かくして調製され、インキュベートされた第2期栄養培地(2−L)を用い、実施例3、A章に記載の通りに調製された115リットルの無菌製造培地に接種する。
接種された製造培地を165−Lの撹拌バイオリアクター中で、30℃の温度において7日間発酵させた。撹拌容器における空気流及び撹拌機の速度はコンピューター制御され、溶解酸素の量は空気飽和の約80%か又はそれ以上に保持される。
実施例4
シネフンジンの存在下で発酵されたNRRL 18719(A83543.6)からのA83543P及びA83543Wの単離
発酵ブロス(190−L、実質的に実施例2Bに記載の通りに調製(株A83543.6を用いることを除いて))を処理の前に2日間冷却した。5NのHClを用いてpHを3.0に調節した後、全ブロスにアセトン(190−L)を加えた。得られた混合物をセラミックフィルターを通して濾過し、濾液(335−L)を得、それを冷却下に週末をかけて保持した。ブロス/アセトン濾液を5NのNaOHを用いてpH10に調節し、セラミックフィルターを通して再濾過してからHP−20ss樹脂(Mitsubishi Chemical Industries,Ltd.,Japan)を含むスチールカラム(10−L;10cmx122cm)上に1−L/分の流量で負荷した。カラムをCH3CN−CH3OH−0.1%NH4OAc水溶液(NH4OHを用いてpH8.1に調節)(25:25:50:20−L)を用いて洗浄し、次いでCH3CN−CH3OH−0.1%NH4OAc水溶液(NH4OHを用いてpH8.1に調節)(95:95:10:40−L)を用いて溶離させ、2−Lの画分を集めた。画分3〜9を濃縮乾固し、CH3OH(100ml)中に再溶解し、再濃縮し、次いでCH3CN(1−L)中に沈澱させた。得られた沈澱を濾過により除去し、捨て、濾液を濃縮乾固した。得られた残留物をジクロロメタン(25ml)に再溶解し、アセトニトリル中で平衡化したシリカゲル(EM等級62、60〜200メッシュ)のカラム(7.5cmx50cm)に適用した。カラムをCH3CN(4−L)、次いでCH3CN−CH3OH(9:1、5−L)、続いてCH3OH(1−L)を用いて溶離させ、1−Lの画分を集めた。プール1(画分3〜4)はA83543成分J及びLを含み;プール3(画分7〜10)は成分M及びNを含んだ。新規成分P及びWを含むプール2(画分5〜6)を濃縮乾固した。得られた残留物をCH3OH(10ml)に溶解し、H2O−CH3OH−CH3CN(30:35:35,0.1%のNH4OAcを含む)で平衡化した分取逆相HPLCカラム(Rainin Dynamax−60Å 8μm C18,41.4mm内径x25cm,41.1mmx5cmのガードモジュールを有する)に適用した。カラムを、溶媒“A”H2O−CH3OH−CH3CN(30:35:35,0.1%のNH4OAcを含む)から溶媒“B”H2O−CH3OH−CH3CN(10:45:45,0.1%のNH4OAcを含む)を混合した勾配を用いて40ml/分の流量で溶離した。ポンピング系は60分間で25から75%Bへの直線状勾配を与えるようにプログラムした。分離の進行は、250nmに戻される可変波長UV検出器を用いて監視した。主ピークを6x3分の画分として集めた。新規成分Pを含む画分1〜2を40mlに濃縮し、次いでH2O−CH3OH−CH3CN(30:35:35)中で平衡化した同じHPLCカラム上で、H2O−CH3OH−CH3CN(30:35:35)からH2O−CH3OH−CH3CN(10:45:45)への60分の直線状勾配を用いて溶離することにより脱塩した。UV吸収ピーク(溶離の最初の2分間を除く)を集め、濃縮乾固した。得られた残留物をt−BuOH(10ml)に溶解し、凍結乾燥して純粋な成分P(479mg)を得た。プールされた、成分P及びWの混合物を含む上記からの画分3〜4を20mlに濃縮し、0.1%のNH4OAcを含むH2O−CH3OH−CH3CN(30:35:35)で平衡化した分取逆相HPLCカラム(Rainin Dynamax−60Å 8μm C18,41.4mm内径x25cm,41.1mmx5cmのガードモジュールを有する)に適用し、溶媒“A”H2O−CH3OH−CH3CN(30:35:35,0.1%のNH4OAcを含む)から溶媒“B”H2O−CH3OH−CH3CN(10:45:45,0.1%のNH4OAcを含む)を混合した勾配を用いて10ml/分の流量で溶離した。ポンピング系は60分間で25から75%Bへの直線状勾配を与えるようにプログラムした。2つのUV吸収主ピーク(成分P、続いて成分W)を集めた。成分W含有ピークを小体積に濃縮し、次いでH2O−CH3OH−CH3CN(30:35:35)で平衡化した同じHPLCカラム上で脱塩した。成分Wは、H2O−CH3OH−CH3CN(30:35:35)からH2O−CH3OH−CH3CN(10:45:45)への60分間の直線状勾配を用い、10ml/分の流量で溶離させ、UV吸収ピークを10x3分の画分に集めた。プールされた画分2〜7を濃縮して残留物とし、それをt−BuOHに溶解し、凍結乾燥して純粋な成分W(82mg)を得た。上記からの成分P−含有UV吸収ピークを同様の方法で脱塩し、追加の純粋な成分P(132mg)を得た。
実施例5
シネフンジンの存在下で発酵させた株NRRL 18823(A83543.9)からのA83543U及びA83543Vの単離
実質的に実施例2Aに記載の通りに調製した(株A83543.9を用いる以外)発酵ブロス(500ml;30x250ml震盪フラスコ)を1時間撹拌しながらメタノール(1.3−L)で抽出し、次いで濾過助剤(3%Hyflo)を用いて濾過し、メタノール性濾液(1.5−L)を得た。バイオマスをメタノール(700ml)で再抽出し、濾過した。2つのメタノール性抽出物を合わせ、等体積の水を加えた。HP−20樹脂(75ml)を加え、2時間撹拌し、その後スラリをガラスのクロマトグラフィーカラム中に注いだ。流出液(5−L)を捨て、カラムのCH3OH−H2O(1:1)洗浄液(500ml)も捨てた。次いでカラムをアセトン(250ml)で溶離した。アセトン溶離液を、全ブロスの類似の抽出及びクロマトグラフィーから得た溶離液(500ml;40x250ml震盪フラスコ)と合わせ、濃縮乾固した。得られた残留物をジクロロメタン(10ml)に溶解し、アセトニトリル中で平衡化したシリカゲル(EM等級62,60〜200メッシュ)のカラム(2.5cmx25cm)に適用した。カラムをアセトニトリルで洗浄し、次いでアセトニトリルからアセトニトリル−メタノール(4:1)への直線状勾配を用いて溶離させ、25mlの画分を集めた。新規A83543成分U及びVを含む画分34〜43をプールし(200ml)、濃縮乾固した。残留物をメタノール(2ml)に溶解し、0.1%のNH4OAcを含むH2O−CH3OH−CH3CN(30:35:35)で平衡化した分取逆相HPLCカラム(Rainin Dynamax−60Å 8μm C18,41.4mm内径x25cm,41.1mmx5cmのガードモジュールを有する)に適用した。カラムは0.1%のNH4OAcを含むH2O−CH3OH−CH3CN(30:35:35)から0.1%のNH4OAcを含むH2O−CH3OH−CH3CN(10:45:45)への60分の直線状勾配を用いて10ml/分の流量で溶離させた。残留成分H及びQの前に新規成分U及びVを含む主ピーク(250nmにおいてUV監視)を集めた。成分Uを含むプールをH2O−CH3OH−CH3CN(30:35:35)で平衡化した同じHPLCカラム上で、H2O−CH3OH−CH3CN(30:35:35)からH2O−CH3OH−CH3CN(10:45:45)への直線状勾配を用いて溶離させることにより脱塩した。成分Uは2分の画分(10)として溶離させた。画分2〜8をプールし、次いで濃縮乾固した。残留物をt−BuOH(5ml)に溶解し、凍結乾燥し、純粋な成分U(71mg)を得た。成分V−含有プールは同じ方法により脱塩及び凍結乾燥し、純粋な成分V(7mg)を得た。
実施例6
シネフンジンの存在下で発酵させたNRRL 18538(A83543.4)からのA83543K及びA83543Oの単離
発酵ブロス(210−L)を実質的に実施例2Bに記載の通りに調製した。全ブロスにアセトンを加え、pHを8.0に調節した。得られた混合物をセラミックフィルターを通して濾過し、濾液(370−L)を得た。ブロス/アセトン濾液をHP−20ss樹脂(Mitsubishi Chemical Industries.Ltd.,Japan)を含むスチールカラム(10−L,10cmx122xm)上に1−L/分の流量で負荷し、流出液を1つのプールとして集めた。カラムを溶媒“A”(0.1%NH4OAc)から溶媒“B”(CH3OH−CH3CN;1:1)を混合した勾配を用いて1−L/分の流量で溶離した。ポンピング系は50%Bを2分間配達し、その後50−80%Bの直線状勾配(45分間)、80−90%Bの直線状勾配(33分間)が続くようにプログラムし、20x4Lの画分を集めた。成分K及びOを含む画分13〜17をプールした。カラムの流出液(上記参照)を5NのNaOHを用いてpH9.5に調節し、HP−20ssカラムに再度適用した。ポンピング系は、50%Bを1分間、50−75%Bの直線状勾配(30分間)、75〜85%Bの直線状勾配(45分間)、85−88%Bの直線状勾配(15.4分間)及び88−100%Bの直線状勾配(20分間)を1−L/分の流量で配達するようにプログラムし、22x4Lの画分を集めた。画分7〜17をプールし、プール(最初のHP−20ssクロマトグラフィーからの画分13〜17(上記参照))と合わせた。合わせたプールを4−Lに濃縮し、次いでさらに濃縮乾固し、CH3OH(100ml)に再溶解し、次いでCH3CN(3−L)中に沈澱させた。得られた沈澱を濾過により除去し、CH3CNで洗浄し、捨て:濾液を濃縮乾固した。得られた残留物をジクロロメタン(50ml)に再溶解し、アセトニトリル中で平衡化したシリカゲル(EM等級62,60〜200メッシュ)のカラム(6cmx24cm)に適用した。カラムをCH3CN(4−L)、次いでCH3CN−CH3OH(9:1;10−L)を用いて溶離し、10x250ml画分、続いて7xlL画分を採取した。成分K及びOを含む画分6〜15を濃縮乾固した。得られた残留物をCH3OH(100ml)に溶解し、H2O−CH3OH−CH3CN;(50:175:175,0.1%NH4OAcを含む)中で平衡化した分取逆相HPLCカラム(Rainin Dynamax−60Å 8μm C18,41.4mm内径x25cm,41.4mmx5cmのガードモジュールを有する)に適用した(20回で)。カラムは40ml/分の流量で溶離した。分離の進行を250nmに戻る可変波長UV検出器を用いて監視した。UV吸収ピーク(20回のクロマトグラフィーから)を7プールに集めた。2つの最大ピークは成分K及びOに対応した。プール3(6−L)は成分K(純度98%)を含んだ。成分O及びKを含むプール4(8−L)を200mlに濃縮し、同一条件下で再度クロマトグラフィーにかけ(4回)、2つのピークを2つのプールとして集めた。プール1(3−L)は成分K(純度98%)を含んだ。プール2(5−L)は成分O(95%)及び成分K(5%)を含んだ。プール2を100mlに濃縮し、同じHPLCカラム上のクロマトグラフィー(3回)により、H2O−CH3OH−CH3CN(30:35:35)からH2O−CH3OH−CH3CN(10:45:45)への60分間の直線状勾配を用いて溶離して脱塩した。UV吸収溶離液を10x3分の画分として集めた。純度>98%の成分Oを含む画分をプールし、濃縮乾固し、t−BuOHから凍結乾燥して成分O(2.5g;純度>98%)を得た。最初の分取HPLC分離(プール3、6−L)及び成分Oの再精製(プール1、3−L)からの成分K含有プールを合わせ、200mlに濃縮し、成分Oと同じ方法で脱塩した。純度>98%の成分Kを含む画分をプールし、濃縮乾固し、t−BuOHから凍結乾燥し、成分K(11.1g;純度>99%)を得た。
実施例7
株NRRL 18743(A83543.8)からのA83543K、A83543O及びA83543Yの単離
発酵ブロス(260−L)を実質的に実施例2Bに記載の通りに調製した。5NのHClを用いてpHを3.0に調節した後、全ブロスにアセトン(260−L)を加えた。得られた混合物をセラミックフィルターを通して濾過し、濾液(480−L)を得、それを週末をかけて冷却下に保った。ブロス/アセトン濾液を25%のNaOHを用いてpH12に調節し、セラミックフィルターを通して2回濾過した後、HP−20ss樹脂(Mitsubishi Chemical Industries.Ltd.,Japan)を含むスチールカラム(10−L,10cmx122xm)上に0.5−L/分の流量で負荷した。カラムをCH3CN−CH3OH−0.1%NH4OAc水溶液(NH4OHを用いてpH8.1に調節)(25:25:50;20−L)で洗浄した。新規成分K、O及びYをCH3CN−CH3OH−0.1%NH4OAc水溶液(NH4OHを用いてpH8.1に調節)(95:95:10;30−L)を用い、1−L/分の流量で溶離させた。溶離液(30−L)を濃縮し、CH3OHに再溶解し、再度濃縮乾固し、CH3OH(100ml)に再溶解し、次いでCH3CN(2−L)中に沈澱させた。得られた沈澱を濾過により除去し、CH3CNで洗浄し、捨て:合わせた濾液及び洗浄液(3−L)を濃縮乾固した。得られた残留物をジクロロメタン(50ml)に再溶解し、アセトニトリル中で平衡化したシリカゲル(EM等級62,60〜200メッシュ)のカラム(7.5cmx50cm)に適用した。カラムをCH3CN(10−L)、次いでCH3CN−CH3OH(9:1;20−L)、続いてCH3CN−CH3OH(8:2;10−L)を用いて溶離し、1−Lの画分を集めた。画分11〜30をプールし、濃縮乾固した。得られた残留物をCH3OH(50ml)に溶解し、H2O−CH3OH−CH3CN;(50:175:175,0.1%NH4OAcを含む)中で平衡化した分取逆相HPLCカラム(Rainin Dynamax−60Å 8μm C18,41.4mm内径x25cm,41.4mmx5cmのガードモジュールを有する)に適用した(10回で)。カラムは40ml/分の流量で、H2O−CH3OH−CH3CN;(50:175:175,0.1%のNH4OAcを含む)からH2O−CH3OH−CH3CN;(10:45:45,0.1%のNH4OAcを含む)への60分間の直線状勾配を用いて溶離した。分離の進行を250nmに戻る可変波長UV検出器を用いて監視した。集められた最初の3つのピーク(プールされた10回分)は少量成分Y(プール1、1−L)、成分K(プール2、8−L)及び成分O(プール3、4−L)に対応した。プール2を小体積に濃縮し、次いで同じカラム上で再度クロマトグラフィーにかけ、緩衝液を用いずに溶離することにより脱塩した。UV吸収ピークに対応する流出液を濃縮乾固し、t−BuOHに溶解し、凍結乾燥して純粋な成分K(7.3g)を得た。プール3を同様の方法で脱塩及び凍結乾燥し、純粋な成分O(1.4g)を得た。プール1を類似のクロマトグラフィー(Rainin Dynamax−60Å 8μm C18,41.4mm内径x25cm,41.4mmx5cmのガードモジュールを有する)により脱塩し、同様の方法で凍結乾燥し、純粋な成分Y(46mg)を得た。
実施例8
A83543Kプソイドアグリコン
A83543Kの試料(100mg)を2Nの硫酸(10ml)に溶解した。この溶液を約80℃において1.25時間加熱し、得られた混合物を室温に冷却した。沈澱を濾過により集め、冷脱イオン水で洗浄し、乾燥して59mgのA83543Kプソイドアグリコンを得た。
元素分析
MS(FD):m/z 576(100%)
IR(CHCl3):2936.0、1714.9、1659.0cm-1
UV(EtOH):λmax 243nm
実施例9
A83543Oプソイドアグリコン
A83543Oの試料(500mg)を脱イオン水(40ml)に懸濁し、完全に溶解させるのに十分な体積の1NのH2SO4を加えた(約0.25ml)。得られた溶液を約80℃に3時間加熱し、次いで室温に冷却した。沈澱を濾過により集め、冷脱イオン水で洗浄し、乾燥した。濾液をNaClで飽和させ、メチレンクロリドで抽出した。メチレンクロリド抽出液を合わせ、ブラインで抽出し、乾燥し(K2CO3)、蒸発乾固した。残留物を沈澱と合わせ、348mgの粗生成物を得た。
粗生成物をフラッシュクロマトグラフィー(シリカゲル60、230〜400メッシュ)により、酢酸エチル及びヘキサンの混合物(7:3)を用いて溶離して精製した。所望の化合物を含む画分を蒸発乾固して146.5mgのA83543Oプソイドアグリコンを得た。
元素分析
MS(FD):m/z 590(100%)、591(70%、M+)、592(20%、M+H)、593(5%、M+2)
IR(CHCl3):3014.2、2932.2、1714.9、1659.0cm-1
UV(EtOH):λmax 242nm(ε 9.185)
実施例10
N−デメチル−A83543K
A83543K(101.5mg、0.14ミリモル)及び酢酸ナトリウム三水和物(142.4mg、1.05ミリモル)をメタノール及びpH9緩衝液(Fisher Scientific,Lexington,MA)の混合物に加えた。得られた懸濁液を約47℃に加熱し、次いでヨウ素(47.7mg、0.19ミリモル)を一度に加えた。47℃において2時間半後、反応物を室温に冷却した。室温でさらに3時間撹拌した後、反応溶液を5%のチオ硫酸ナトリウム溶液に加えた。得られた無色の水性混合物をジエチルエーテルで抽出した。次いで水相をNaClで飽和させ、メチレンクロリドで抽出した。メチレンクロリド抽出物をジエチルエーテル抽出物と合わせ、ブラインで洗浄し、K2CO3上で乾燥した。乾燥溶液を次いで真空中で蒸発乾固し、79.3mgのN−デメチル−A83543Kを白色のガラスとして得た(収率81%)。
MS(FD):m/z 703(100%、M+)、704(57%、M+H)、705(19%、M+2)
元素分析(C3961NO10)計算値:C,66.55;H,8.73;N,1.99;測定値:C,64.80;H,8.67;N,1.95
IR(KBr):3462.7、2934.1、1721.7、1660.9、1457.4cm-1
実施例11
ジ−N−デメチル−A83543K
MeOH(40ml)中のN−デメチル−A83543K(891mg、1.27ミリモル)の溶液を3℃に冷却した。新しく調製したメタノール中の1MのNaOMe(6.3ml、6.3ミリモル)及びヨウ素(1.61g、6.3ミリモル)をこの溶液に連続的に加えた。反応溶液を3℃に5時間保ち、次いで5%チオ硫酸ナトリウム/希水酸化アンモニウム溶液に加えた。得られた混合物を酢酸エチルで抽出した。合わせた酢酸エチル抽出物をブラインで洗浄し、K2CO3上で乾燥した。乾燥溶液を真空中で蒸発乾固し、770mgの粗生成物を得た。
所望の化合物をフラッシュクロマトグラフィー(シリカゲル60、230〜400メッシュ、2インチx8インチ)により、メチレンクロリド及びメタノールの混合物(93:7)を用いて溶離して部分的に精製した。所望の化合物を逆相HPLC(Waters Prep NOVA−Pak,ODS,60Å,40mmx300mm)により、メタノール/アセトニトリル/0.25%酢酸アンモニウム(40:40:20)を用いて溶離してさらに精製し、463.6mg(収率53%)のジ−N−デメチル−A83543Kを無色のガラスとして得た。
元素分析(C3859NO10)計算値:C,66.16;H,8.62:N,2.03;測定値:C,66.29;H,8.63;N,2.02
MD(FD):m/z 690(100%、M+)、689(70%)、691(59%、M+H)、704(20%)
UV(EtOH):λmax 244nm(ε 10,328)
IR(CHCl3):3700、3600、3550〜3350(br)、3420、2975、1700、1675、1620cm-1

Claims (11)

  1. 式1
    Figure 0004258575
    [式中、
    7は水素又は式
    Figure 0004258575
    の基であり、
    8、R9、R10、R11及びR12は独立して水素又はメチルであり、但しR11とR12は同時に水素であることはない]
    の化合物、あるいはR7が水素以外の場合のそれらの酸付加塩。
  2. 7が式
    Figure 0004258575
    の基である請求項1に記載の化合物。
  3. 7が式
    Figure 0004258575
    の基である請求項2に記載の化合物。
  4. 8がメチルである請求項3に記載の化合物。
  5. 7が水素である請求項1に記載の化合物。
  6. 各成分に関してR7、R8、R9、R10、R11及びR12が以下のとおりである請求項1に記載の化合物。
    Figure 0004258575
  7. 昆虫−又はダニ−不活性化量の請求項2に記載の化合物を植物学的に許容し得る担体と組み合わせて含んでなる殺虫又は殺ダニ組成物。
  8. 昆虫又はダニの生息場所に昆虫−又はダニ−不活性化量の請求項2項に記載の化合物を適用することを含んでなる殺虫又は殺ダニ法。
  9. 生理学的に許容し得る不活性担体及び請求項2に記載の化合物を含んでなる殺外部寄生虫組成物。
  10. ヒト以外の宿主動物に請求項2に記載の化合物を投与することを含んでなる、ヒト以外の宿主動物の血液を吸う昆虫外部寄生虫の個体群の抑制法。
  11. サッカロポリスポラ スピノサ(Saccharopolyspora spinosa)NRRL 18743の生物学的に純粋な培養物。
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