DE69402308T2 - Neue a83543 verbindungen und verfahren zu ihrer herstellung - Google Patents

Neue a83543 verbindungen und verfahren zu ihrer herstellung

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DE69402308T2
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Description

  • Neue A83543-Verbindungen und Verfahren zu ihrer Herstellung
    • Gebiet der Erfindung
  • Die Erfindung betrifft neue Komponenten vom Fermentationsprodukt A83543.
    • Hintergrund der Erfindung
  • Zu bekämpfende Insekten entwickeln rasch Resistenz gegenüber Insektiziden, welche derzeit verfügbar sind. Die Resistenz gegenüber Insektiziden bei Arthropoden ist weit verbreitet, wobei wenigstens 400 Spezies Resistenz gegenüber einem oder mehreren Insektiziden zeigen. Die Entwicklung der Resistenz gegneüber älteren Insektiziden, wie DDT, den Carbamaten und den Organophosphaten, ist gut dokumentiert (siehe Brattsten, et al. (1986), Science, 231:1255). Die Resistenz gegenüber synthetischen Insektiziden hat sich extrem rasch entwickelt, einschließlich der Entwicklung der Resistenz gegenüber neueren Pyrethroidinsektiziden (siehe Pickett (1988), Chem. Britain, 137). Daher besteht Nachfrage nach neuen Insektiziden.
  • Das Fermentationsprodukt A83543, eine Familie von verwandten Verbindungen, erzeugt durch Saccharopolyspora spinosa, wurde in neuerer Zeit entdeckt, und es wurde gezeigt, daß es ausgezeichnete insektizide Aktivität aufweist. A83543 und seine Einzelverbindungen sind zur Kontrolle von Milben und Insekten, insbesondere Lepidoptera- und Dipteraspezies, brauchbar.
  • Unter "A83543-Verbindungen" sind Komponenten zu verstehen, welche aus einem an ein 12-gliedriges makrocyclisches Lacton anellierten 5,6,5-tricyclischen Ringsystem, einem neutralen Zucker und einem Aminozucker betehen (see Kirst et al. (1991), Tetrahedron Letters, 32:4839). Die Familie der natürlichen Komponenten von A83543 schließen eine Art ein, die in der EPO-Anmeldung NO. 0375316 angegeben ist und folgende allgemeine Formel besitzt:
  • worin R¹ = H oder eine Gruppe ist, ausgewählt aus
  • und R², R&sup4;, R³, R&sup5; und R&sup6; Wasserstoff oder Methyl sind, oder ein Säureadditionssalz hiervon, wenn R¹ von Wasserstoff verschieden ist.
  • Es wurde gezeigt, daß die Familie von Verbindungen aus A83543 Fermentationsprodukt Einzelkomponenten umfaßt: A83543A, A83543B, A83543C, A83543D, A83543E, A83543F, A83543G, A83543H und A83543J (siehe europäische Patentveröffentlichung No. 0 375 316); einzelne Komponenten A83543L, A83543M und A83543N (siehe US-Patent Nr. 5 202 242, veroffentlicht 13. April 1993); und einzelne Komponenten A83543Q, A83543R, A83543S und A83543T (siehe anhängige US- Patentanmeldung von Turner, Broughton, Huber und Mynderse mit dem Titel "New A83543 Compounds and Processes for Production Thereof" (US-Patentanmeldung, Serial NO. 07/973121), eingereicht am 6. November 1992). Die Strukturen dieser einzelnen Komponenten und hiervon abstammender Pseudoaglykone sind im folgenden gezeigt.
  • worin R¹, R², R³, R&sup4;, R&sup5; und R&sup6; für jede Komponente wie folgt sind: Strukturen von A83543 Komponenten
  • Es wurde gezeigt, daß Sinefungin, ein Antibiotikum von mikrobiellem Ursprung, spezifische S-adenosylmethionin-abhängige Methyltransferasen hemmt. Diese Verbindung ist wirksam bei der Hemmung der folgenden Methyltransferasen von Säugetieren: Norepinephrin-N-methyltransferase, Histamin-N-methyltransferase und Catechol-O-methyltransferase (siehe Fuller und Nagarajan (1978), Biochemical Pharmacology, 27:1981). Sinefungin ist ebenfalls wirksam bei der Hemmung der S-adenosyl-methionin-abhängigen O-Methyltransferase bei Avermectin bildenden Stämmen von Streptomyces avermitilis (siehe Schulman, et al. (1985), J. Antibiotics, 38:1494). In neuerer Zeit wurde berichtet, daß Sinefungin bei der Hemmung einer S-adenosylmethionin-abhängigen O-Methyltransferase (Macrocin-O-methyltransferase) in Streptomyces fradiae wirksam ist (siehe Kreuzman, et al. (1988), J. Biological Chemistry, 263:15626). Ein Verfahren zur Verwendung von Sinefungin zur Hemmung einer O-Methyltransferase in Stämmen von S.spinosa ist hier beschrieben.
    • Zusammenfassung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung richtet sich auf eine neue Art der A83543 Familie von Verbindungen, wobei diese Art Verbindungen der Formel 1 einschließt:
  • worin R&sup7; Wasserstoff oder eine Gruppe der Formel ist:
  • R&sup8;, R&sup9;, R¹&sup0;, R¹¹ und R¹² unabhängig voneinander Wasserstoff oder Methyl sind, vorausgesetzt, daß R¹¹ und R¹² nicht gleichzeitig Wasserstoff sind, oder ein Säureadditionssalz hiervon, wenn R&sup7; von Wasserstoff verschieden ist.
  • Insbesondere bezieht sich diese Erfindung auf neue Komponenten des Fermentationsproduktes A83543. Die neuen Komponenten, bezeichnet als Verbindungen der Formel 2, haben die folgende allgemeine Formel:
  • worin R¹³ eine Gruppe der Formel ist:
  • und R¹&sup4;, R¹&sup5;, R¹&sup6;, R¹&sup7; und R¹&sup8; unabhängig voneinander Wasserstoff oder Methyl sind, vorausgesetzt, daß R¹&sup7; und R¹&sup8; nicht gleichzeitig Wasserstoff sind, oder ein Säureadditionssalz hiervon, wenn R¹ von Wasserstoff verschieden ist.
  • Bevorzugt bezieht sich die vorliegende Erfindung auf neue A83543 Komponenten, Komponenten der Formel 2, bezeichnet als A83543K, A83543O, A83543P, A83543U, A83543V, A83543W und A83543Y, worin R¹³, R¹&sup4;, R¹&sup5;, R¹&sup6;, R¹&sup7; und R¹&sup8; für jede Komponente wie folgt sind:
  • Ein anderer Aspekt dieser Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel 1, welches die Kultivierung eines Stammes von S.spinosa, ausgewählt aus den Stämmen NRRL 18395 (A83543.1), NRRL 18537 (A83543.3), NRRL 18538 (A83543.4), NRRL 18539 (A83543.5), NRRL 18719 (A83543.6) und NRRL 18823 (A83543.9) oder einer die Formel 1 bildenden Mutante hiervon, in einem geeigneten Kulturmedium, das von etwa 50 µg/ml bis etwa 200 µg/ml Sinefungin enthält, unter aeroben Tauchbedingungen, bis eine gewinnbare Menge einer Verbindung der Formel 1 gebildet ist, umfaßt. Die Verbindung der Formel 1 wird aus der Fermentationsbrühe und aus dem Mycel mit polaren organischen Lösungsmitteln extrahiert. Die Verbindung kann weiter nach auf dem Fachgebiet bekannten Arbeitsweisen wie durch Säulenchromatographie, gereinigt werden.
  • Ein noch weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel 1, welches das Kultivieren von S.spinosa, Stamm NRRL 18743 (A83543.8) oder einer A83543K bildenden Mutante hiervon in einem geeigneten Kulturmedium unter aeroben Tauchfermentationsbedingungen umfaßt, bis eine gewinnbare Menge einer Verbindung der Formel 1 gebildet ist. Die Verbindung der Formel 1 kann isoliert und gereint werden, wie zuvor beschrieben.
  • Da der Stamm NRRL 18743 ein neu aufgefundener Stamm ist, liefert diese Erfindung weiterhin ein biologisch gereinigte Kultur diese Mirkoorganismus.
  • Die Verbindungen der Formel 2 sind für die Kontrolle von Milben und Insekten, insbesondere den Spezies Lepidoptera, Homoptera and Diptera brauchbar. Daher bilden insektizide und mitizide Zusammensetzungen und Verfahren zur Reduzierung der Populationen von Insekten und Milben unter verwendung dieser Verbindungen ebenfalls einen Teil dieser Erfindung.
    • Beschreibung der Zeichnungen
  • Fig. 1 zeigt das IR-Absorbtionsspektrum von A83543K in KBr.
  • Fig. 2 zeigt das kernmagnetische Protonenresonanzspektrum von A83543K in Aceton-d&sub6;.
  • Fig. 3 zeigt das UV-Spektrum von A83543K in EtOH.
  • Fig. 4 zeigt das IR-Absorptionsspektrum von A83543O in KBr.
  • Fig. 5 zeigt das kernmagnetische Protonenresonanzspektrum von A83543O in Aceton-d&sub6;.
  • Fig. 6 zeigt das UV-Spektrum von A83543O in EtOH.
  • Fig. 7 zeigt das IR-Absorptionsspektrum von A83543P in KBr.
  • Fig. 8 zeigt das kernmagnetische Protonenresonanzspektrum von A83543P in Aceton-d&sub6;.
  • Fig. 9 zeigt das UV-Spektrum von A83543P in EtOH.
  • Fig. 10 zeigt das IR-Absorptionsspektrum von A83543U in KBr.
  • Fig. 11 zeigt das kernmagnetische Protonenresonanzspektrum von A83543U in Aceton-d&sub6;.
  • Fig. 12 zeigt das UV-Spektrum von A83543U in EtOH.
  • Fig. 13 zeigt das IR-Absorptionsspektrum von A83543V in KBr.
  • Fig. 14 zeigt das kernmagnetische Protonenresonanzspektrum von A83543V in Aceton-d&sub6;.
  • Fig. 15 zeigt das UV-Spektrum von A83543V in EtOH.
  • Fig. 16 zeigt das IR-Absorptionsspektrum von A83543W in KBr.
  • Fig. 17 zeigt das kernmagnetische Protonenresonanzspektrum von A83543W in Aceton-d&sub6;.
  • Fig. 18 zeigt das UV-Spektrum von A83543V in EtOH.
  • Fig. 19 zeigt das IR-Absorptionsspekktrum von A83543Y in KBr.
  • Fig. 20 zeigt das kernmagnetische Protonenresonanzspektrum von A83543Y in Aceton-d&sub6;.
  • Fig. 21 zeigt das UV-Spektrum von A83543V in EtOH.
  • Fig. 22 zeigt die Aufzeichnung der Fettsäureanalysen der Hauptkomponente für die Stämme A83543.1, A83543.3, A83543.4, A83543.5, A83543.6, A83543.7, A83543.8 und A83543 .9,
  • worin R&sup7; Wasserstoff oder eine Gruppe der Formel ist
  • R&sup8;, R&sup9;, R¹&sup0;, R¹¹ und R¹² unabhängig voneinander Wasserstoff oder Methyl sind, vorausgesetzt, daß R¹¹ und R¹² nicht gleichzeitig Wasserstoff sind, oder ein Säure additionssalz hiervon, wenn R&sup7; von Wasserstoff verschieden ist.
  • Ein bevorzugter Aspekt der Erfindung sind die Verbindungen der Formel 1, worin R&sup8; und R¹&sup0; Methyl sind. Ein mehr bevorzugter Aspekt der Erfindung sind Verbindungen der Formel 1, worin R&sup8; und R¹&sup0; Methyl sind und R&sup7; eine Gruppe der Formel ist:
  • Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung sind neue Komponenten des Fermentationsproduktes A83543. Diese neuen A83543 Komponenten, bezeichnet als Verbindungen der Formel 2, haben die folgende chemische Struktur:
  • worin R¹³ eine Gruppe der Formel ist:
  • und R¹&sup4;, R¹&sup5;, R¹&sup6;, R¹&sup7; und R¹&sup8; unabhängig voneinander Wasserstoff oder Methyl sind, vorausgesetzt, daß R¹&sup7; und R¹&sup8; nicht gleichzeitig Wasserstoff sind; oder ein Säureadditionssalz hiervon, wenn R¹³ von Wasserstoff verschieden ist.
  • Ein stärker bevorzugter Aspekt der vorliegenden Erfindung sind Verbindungen der Formel 2, worin R¹&sup4; = CH&sub3; ist, und R¹³ eine Gruppe der Formel ist:
  • Bevorzugt betrifft diese Erfindung neue A83543 Komponenten, Verbindungen der Formel 2, bezeichnet als A83543K, A83543O, A83543P, A83543U, A83543V, A83543W und A83543Y, worin R¹³, R¹&sup4;, R¹&sup5;, R¹&sup6;, R¹&sup7; und R¹&sup5; im einzelnen für jede neue Komponente wie folgt sind:
  • Die chemischen Strukturen dieser neuen Komponenten wurden durch spektrometrische Methoden bestimmt, einschließlich Massenspektroskopie, Infrarotspektroskopie (IR), kernmagnetischer Resonanzspektroskopie (NMR) und Ultraviolettspektroskopie (UV), sowie durch Vergleich der A83543 Komponenten (siehe Kirst et al. (1991), oben). Die folgenden Abschnitte beschreiben die physikalischen und spektralen Eigenschaften der Komponenten A83543K, A83543O, A83543P, A83543U, A83543V, A83543W und A83543Y.
  • Zur Einfachheit für den Betrachter liefert das folgende Diagramm von A83543K die Stellung der Bezeichnungen für alle NMR-Spektrendaten für die unten angegebenen A83543 natürlichen Faktoren:
    • A83543K:
  • A83543K hatte folgende Charakteristika:
  • Molekulargewicht: 717
  • Empirische Formel: C&sub4;OH&sub6;&sub3;NO&sub1;&sub0;
  • UV (EtOH): 243 nm (ε=10.657)
  • MS (FAB) : (M+H) m/z 718
  • MR (KBR): siehe Figur 1.
  • Tabelle I faßt die ¹H und ¹³C NMR-Spektraldaten für A83453K (in Aceton-d&sub6;), wie in Fig. 2 gezeigt, zusammen: Tabelle I: ¹H und ¹³C NMR-Daten von A83543K in Aceton-d&sub6;
  • * Einige Zuordnungen stammen von ¹H/¹³C- Korrelationen. Tabelle I: Fortsetzung
  • * Einige Zuordnungen stammen von ¹H/¹³C- Korrelationen.
  • A835430 hat die folgenden Charakteristika:
  • Molekulargewicht: 731
  • Empirische Formel: C&sub4;&sub1;H&sub6;&sub5;NO&sub1;&sub0;
  • UV (EtOH): 243 nm (ε=9.267)
  • FD (M&spplus;) : m/z 731
  • IR (KBR): siehe Figur 3.
  • Tabelle II faßt die ¹H und ¹³C kernmagnetischen Resonanzspektraldaten (NMR) für A83454O (in Aceton-d&sub6;), wie in Fig. 4 gezeigt, zusammen. Tabelle II: ¹H und ¹³C NMR-Daten von A83543O in Aceton-d&sub6;
  • * Die Werte wurden aus einem 2D-Korrelationsspektrum einer heteronuklearen Einfachbindung entnommen. Tabelle II: Fortsetzung
  • * Die Werte wurden aus einem 2D-Korrelationsspektrum einer heteronuklearen Einfachbindung entnommen.
  • A83543P hat die folgenden Charakteristika:
  • Molekulargewicht: 703
  • Empirische Formel: C&sub3;&sub9;H&sub6;&sub1;NO&sub1;&sub0;
  • UV (EtOH) : 243 nm (ε=13.760)
  • MS (FAB) : (M+H) m/z 704
  • IR (KBr): siehe Figur 5.
  • Tabelle III faßt die ¹H und ¹³C kernmagnetischen Resonanzspektraldaten (NMR) für A83454P (in Aceton-d&sub6;), wie in Fig. 6 gezeigt, zusammen. Tabelle III: ¹H und ¹³C NMR-Daten von A83543P in Aceton-d&sub6;
  • * Die Werte wurden aus einem 2D-Korrelationsspektrum einer heteronuklearen Einfachbindung entnommen. Tabelle III: Fortsetzung
  • * Die Werte wurden aus einem 2D-Korrelationsspektrum einer heteronuklearen Einfachbindung entnommen.
    • A83543U:
  • A83543U hat die folgenden Charakteristika:
  • Molekulargewicht: 703
  • Empirische Formel: C&sub3;&sub9;H&sub6;&sub1;NO&sub1;&sub0;
  • UV (EtOH) : 242 nm (ε=17.095)
  • MS (FAB) : (M+H) m/z 704
  • IR (KBr): siehe Figur 7.
  • Tabelle IV faßt die ¹H und ¹³C kernmagnetischen Resonanzspektraldaten (NMR) für A83454U (in Aceton-d&sub6;), wie in Fig. 8 gezeigt, zusammen. Tabelle IV: ¹H und ¹³C NMR-Daten von A83543U in Aceton-d&sub6;
  • * Die Werte wurden aus dem Korrelationsspektrum 1D oder inverse 2D Einfachbindung entnommen.
  • ** Die Zuordnungen kännen umgekehrt werden. Tabelle IV: Fortsetzung
  • * Die Werte wurden aus dem Korrelationsspektrum 1D oder inverse 2D Einfachbindung entnommen.
  • ** Die Zuordnungen können umgekehrt werden.
    • A83543V:
  • A83543V hat die folgenden Charakteristika:
  • Molekulargewicht: 717
  • Empirische Formel: C&sub4;OH&sub6;&sub3;NO&sub1;&sub0;
  • UV (EtOH) : 242 nm (ε=10.140)
  • MS (FAB) : (M+H) m/z 718
  • IR (KBr): siehe Figur 9.
  • Tabelle V faßt die ¹H und ¹³C kernmagnetischen Resonanzspektraldaten (NMR) für A83454V (in Aceton-d&sub6;), wie in Fig. 10 gezeigt, zusammen. Tabelle V: ¹H und ¹³C NMR-Daten von A83543V in Aceton-d&sub6;
  • * Die Werte wurden aus 1D und 2D inversen Experimenten entnommen. Tabelle V: Fortsetzung
  • * Die Werte wurden aus 1D und 2D inversen Experimenten entnommen.
    • A83543W:
  • A83543W hat die folgenden Charakteristika:
  • Molekulargewicht: 717
  • Empirische Formel: C&sub4;OH&sub6;&sub3;NO&sub1;&sub0;
  • UV (EtOH) : 242 nm (ε=10.254)
  • MS (FAB) : (M+H) m/z 718
  • IR (KBr): siehe Figur 11.
  • Tabelle VI faßt die ¹H und ¹³C kernmagnetischen Resonanzspektraldaten (NMR) für A83543W (in Aceton-d&sub6;), wie in Fig. 12 gezeigt, zusammen. Tabelle VI: ¹H und ¹³C NMR-Daten von A83543W in Aceton-d&sub6;
  • * Die Werte wurden aus ¹H/¹³C inversen Einfachbindungs-Korrelations spektren entnommen. Tabelle VI: Fortsetzung
  • * Die Werte wurden aus ¹H/¹³C inversen Einfachbindungs-Korrelationsspektren entnommen.
    • A83543Y:
  • A83543Y hat die folgenden Charakteristika:
  • Molekulargewicht: 703
  • Empirische Formel: C&sub3;&sub9;H&sub6;&sub1;NO&sub1;&sub0;
  • UV (EtOH) : 242 nm (ε=14.042)
  • MS (FAB) : (M+H) m/z 704
  • IR (KBr): siehe Figur 11.
  • Tabelle VII faßt die ¹H und ¹³C kernmagnetischen Resonanzspektraldaten (NMR) für A83543Y (in Aceton-d&sub6;), wie in Fig. 12 gezeigt, zusammen. Tabelle VII: ¹H und ¹³C NMR-Daten von A83543W in Aceton-d&sub6;
  • * Daten erhalten aus 1D inverser heteronuklearer Korrelation, homonuklearer Entkopplung und COSY-Experimenten.
  • ** Die Zuordnungen kännen umgekehrt werden. Tabelle VII: Fortsetzung
  • * Daten erhalten aus 1D inverser heteronuklearer Korrelation, homonuklearer Entkopplung und COSY-Experimenten.
  • ** Die Zuordnungen können umgekehrt werden.
  • Die Komponenten A83543K, A83543O, A83543P, A83543U, A83543V, A83543W und A83543Y sind von den zuvor beschriebenen Verbindungen strukturell verschieden. Die vorliegenden Verbindungen weisen neutrale Zucker auf, welche früher nicht beschrieben wurden: die Komponenten A83543K, A83543O und A83543Y haben einen neutralen Zucker, identifiziert als α-2, 3-Di-O-methylrhamnose; die Komponenten A83543P und A83543W haben einen neutralen Zucker, identifiziert als 2-O-Methylrhamnose; die Komponenten A83543U und A83543V haben einen neutralen Zucker, identifiziert als 3-O-Methylrhamnose.
  • Der Aminozucker kann selektiv von den neuen A83543 Komponenten entfernt werden, um neue A83543 Pseudoaglycone, bezeichnet als Verbindungen der Formel 3, zu ergeben. Diese Verbindungen sind ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung, und sie sind Verbindungen der Formel 1, worin R¹ Wasserstoff ist.
  • Die selektive Entfernung der Aminozucker aus A83543K, A83543O, A83543P, A83543U, A83543V, A83543W und A83543Y ergibt A83543K Pseudoaglycon, A83543O Pseudoaglycon, A83543P Pseudoaglycon, A83543U Pseudoaglycon, A83543V Pseudoaglycon, A83543W Pseudoaglycon bzw. A83543Y Pseudoaglycon. Diese Verbindungen sind in der folgenden Formel gezeigt:
  • Die Verbindungen der Formel 2 werden benutzt, um die Verbindungen der Formel 3 durch Reaktion einer Verbindung der Formel 2 mit Säure zur Entfernung des Aminozuckers herzustellen. Geeignete Säuren schließen Salzsäure und Schwefelsäure ein, wobei die bevorzugte Säure für die Umwandlung Schwefelsäure ist. Die Reaktion wird bevorzugt in einem polaren organischen Lösungsmittel, einer Mischung von einem polaren organischen Lösungsmittel und Wasser, oder in Wasser durchgeführt. Geeignete organische Lösungsmittel schließen Methanol, THF, Acetonitril und Dioxan ein. Die bevorzugten Lösungsmittel für die Umwandlung sind eine Mischung von Methanol und Wasser oder Wasser. Die Reaktion kann bei einer Temperatur von etwa 25ºC bis etwa 95ºC, bevorzugt bei 80ºC, durchgeführt werden.
  • Die Pseudoaglycone sind als Ausgangsmaterialien für die Herstellung von neuen A83543 Verbindungen brauchbar, beispielsweise kann das Pseudoaglycon an der Hydroxylgruppe, wo der Aminozucker vorgelegen hat, glycosyliert werden. Diese Glycosylierung kann durch chemische Synthese oder durch mikrobielle Bioumwandlung durchgeführt werden.
  • Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist die chemische Demethylierung von bestimmten Verbindungen der Formel 1. Die Verbindungen der Formel 1 können in 3 Untergruppen unterteilt werden: 1A, 1B und 1C. Die Verbindungen der Formel 1A sind Verbindungen der Formel 1, worin R&sup7; eine Gruppe der Formel ist:
  • Die Verbindungen der Formel 1B sind Verbindungen der Formel 1, worin R&sup7; eine Gruppe der Formel ist:
  • Die Verbindungen der Formel 1C sind Verbindungen der Formel 1, worin R&sup7; eine Gruppe der Formel ist:
  • Wie hier beschrieben, können Verbindungen der Formel 1B aus den Verbindungen der Formel 1A hergestellt werden. In gleicher Weise können Verbindungen der Formel 1C aus Verbindungen der Formel 1B hergestellt werden. Diese Verbindungen können durch chemische Demethylierung der entsprechenden neuen A83543 Komponente hergestellt werden. Jede dieser Untergruppen ist ebenfalls eine Untergruppe von Verbindungen der Formel 2.
  • Die N-Demethylderivate, Verbindungen der Formel 1B, werden durch Reaktion einer Verbindung der Formel 1A mit Jod und Natriumacetat hergestellt. Die Reaktion wird in einem polaren organischen Lösungsmittel, wie Methanol, oder einer Mischung aus polarem organischem Lösungsmittel und Wasser, wie wäßrigem Methanol, durchgeführt.
  • Die Reaktion wird bei pH 9, beispielsweise unter Verwendung eines Puffers mit pH 9, gehalten. Die Reaktion wird bevorzugt bei einer Temperatur von etwa 30ºC bis etwa 70ºC für etwa 2 bis etwa 6 Stunden. durchgeführt.
  • Die Di-N-demethylderivate, Verbindungen der Formel 1C, können durch die Reaktion einer Verbindung der Formel 1B mit Natriumethoxid/Jod hergestellt werden. Die Reaktion wird bevorzugt in einem polaren organischen Lösungsmittel, wie Methanol, durchgeführt. Weiterhin wird die Reaktion bei einer Temperatur von etwa 10ºC bis etwa 15ºC, bevorzugt zwischen 0ºC bis 5ºC, durchgeführt. Die Reaktionszeiten variieren von etwa 4 Stunden bis etwa 6 Stunden.
  • Erläuternde Beispiele für Verbindungen der Formel 1B und 1C sind in den folgenden Formeln gezeigt: worin R&sup7;, R&sup8;, R&sup9;, R¹&sup0;, R¹¹ und R¹² für jede Verbindung wie folgt sind:
  • Die Verbindungen der Formel 2, welche Verbindungen der Formel 1, worin R&sup7; von Wasserstoff verschieden ist, sind, können unter Bildung verschiedener Salze, welche ebenfalls ein Teil dieser Erfindung sind, reagieren. Diese Salze sind beispielsweise bei der Trennung und Reinigung der Verbindungen der Formel 2 brauchbar. Zusätzlich können einige der Salzformen eine erhöhte Wasserlöslichkeit besitzen. Diese Salze werden unter Anwendung von üblichen Arbeitsweisen zur Salzherstellung hergestellt. Beispielsweise kann A83543K mit einer geeigneten Säure zur Bildung eines Säureadditionssalzes neutralisiert werden.
  • Die Säureadditionssalze sind besonders vorteilhaft. Repräsentative geeignete Salze schließen solche Salze ein, welche durch Standardreaktionen mit sowohl organischen als auch anorganischen Säuren gebildet werden wie beispielsweise Schwefel-, Salz-, Phosphor-, Essig-, Bernstein-, Zitronen-, Milch-, Malein-, Fumar-, Cholin-, Pamoa-, Mucin-, Glutamin-, Campher-, Glutar-, Glycol-, Phthal-, Wein-, Ameisen-, Laurin-, Stearin-, Salicyl-, Methansulfon-, Benzolsulfon-, Sorbin-, Picrin-, Benzoe-, Zimtsäure und ähnlichen Säuren.
  • Der Einfachheit halber wurden in den folgenden Erläuterungen den A83543A-bildenden Stämmen die folgenden Bezeichnungen gegeben: A83543.1, A83543.3, A83543.4 und A83543.5. Ebenfalls wurde einem neuen A83543K-bildenden Stamm die Bezeichnung A83543.8 gegeben. Die Kulturen A83543.1, A83543.3, A83543.4, A83543.5, A83543.6, A83543.7, A83543.8 und A83543.9 wurden hinterlegt und bilden einen Teil der Stock Culture Collection des Midwest Area Regional Research Center, Agricultural Research Service, United States Department for Agriculture, wovon sie der Öffentlichkeit unter den folgenden Zugangsnummern zur Verfügung stehen:
  • Die Kultur A83543.1 wurde durch chemische Mutation der Kultur A83543, die aus einer in den Virgin Islands entnommenen Bodenprobe isoliert wurde, erhalten. Mertz und Yao (1990), Int'l J. of Systematic Bacteriology, 40:34. Die Kultur 83543.4 wurde aus der Kultur A83543.1 abgeleitet. Jeder der Stämme A83543.3, A83543.4, A83543.5, A83543.6 und A83543.7 wurde von A83543.1 durch chemisch induzierte Mutagenese mit N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin abgeleitet. Die Stämme A83543.8 und A83543.9 wurden von A83453.4 durch chemisch induzierte Mutagenese mit N-Methyl-N'-nitro- N-nitrosoguanidin abgeleitet. Mit Ausnahme für Unterschiede bei der Herstellung der Komponenten A83543 scheinen diese Isolate dieselben wie die Ausgangskultur zu sein.
    • Kulturcharakteristika
  • Die Kulturen A83543.1, A83543.3, A83543.4, A83543.5, A83543.6, A83543.7, A83543.8 und A83543.9 wurden auf zwölf Agarplattenmedien gezüchtet und auf Wachstum, Umkehrfärbung, Bildung von Lufthyphen, Sporenmassenfarbe und Bildung von löslichem Pigment verglichen. Es wurden keine signifikanten Unterschiede bei irgendeinem der verwendeten Medien beobachtet. Die Kulturen wuchsen gut sowohl auf komplexen als auch auf definierten Medien. Lufthyphen wurden auf den meisten der verwendeten Medien gebildet. Die Luftsporenmassenfarbe war überwiegend weiß, und die Umkehrseite war gelb bis gelbbraun. Keine unterscheidungskräftige Pigmentierung lag vor, jedoch wurde ein lösliches braunes Pigment in einige Medien freigesetzt. Die Kulturcharakteristika von A83543.3, A83543.4, A83543.5, A83543.6, A83543.7, A83543.8 und A83543.9 waren vergleichbar der ursprünglichen taxonomischen Beschreibung von A83543.1 (siehe Mertz und Yao (1990), oben).
    • Morphologische Charakteristika
  • Wohigebildete Lufthyphen, welche in lange Ketten von als Haken und offene Schleifen angeordnete Sporen segmentiert waren, lagen auf den meisten der Medien vor. Spiralen wurden ebenfalls beobachtet, jedoch waren sie kurz und unvollständig. Die allgemeine Morphologie war rectus-flexibilis. Lufthyphen eines jeden der Stämme hatten unterscheidungskräftiges perlenähnliches Aussehen mit zahlreichen leeren Stellen in der Sporenkette. Dieses Merkmal zeigt,daß eine Sporenhülle die Sporenkette einhüllte, dies ist ein unterscheidungskräftiges Merkmal der genus Saccharopolyspora. Mit Ausnahme der Unterschiede in der Bildung der A83543 Komponenten scheinen diese Isolate den Ausgangs- bzw. Elternkulturen vergleichbar zu sein.
    • Physiologische Charakteristika
  • Fettsäureanalysen von jedem der Stämme wurden miteinander verglichen. Die Zellen wurden für 96 Stunden bei 28ºC in Trypticase-Sojabohnenbrühe (Difco Laboratories, Detroit, MI) gezüchtet. Fettsäuremethylester wurden durch Gas-Flüssigkeitschromatographie mit einem computergesteuerten Gas-Flüssigkeitschromatographiesystem Modell 5898A (Hewlett-Packard Co., Pab Alto, CA) analysiert (siehe Miller und Berger, "Bacterial Identification by Gas Chromatography of Whole cell Fatty Acids", Hewlett-Packard Application Note 228-41. Diese Ergebnisse sind in Tabelle VIII wiedergegeben). Tabelle VIII
  • ¹F, B und C zeigen Doppelbindungsstellen oder -Konfigurationen an, die unbekannt sind.
  • Analyse auf Hauptkomponenten ist ein Zweig der Multivariationsstatistik, welcher sich mit internen Beziehungen eines Satzes von Variablen beschäftigt. Bei dieser Analyse wird die größte Menge der Varianz innerhalb der ursprünglichen Daten- oder Testergebnisse als Hauptkomponenten ausgedrückt (siehe Alderson "The Application and Relevance of Nonheirarchic Methods in bacterial Taxonomy", in Computer- Assisted Bacterial Systematics 227 (1985)). Eine Aufzeichnung, welche ein Gitter oder die Variabilität zeigt, kann konstruiert werden. Beziehungen können durch Überprüfung der Varianz gefunden werden und eine mikrobielle Population kann charakterisiert werden. Eine zweidimensionale Auftragung der Hauptkomponente aus den Fettsäureanalysen der Stämme A83543.1, A83543.3, A83543.4, A83543.5, A83543.6, A83543.7, A83543.8 und A83543.9 ist in Fig. 13 gezeigt. Die Werte beziehen sich auf das Maß der Trennung zwischen den betreffenden Stämmen. Die Unterschiede zwischen den Stämmen sind taxonomisch nicht signifikant.
  • Wie im Fall von anderen Organismen sind die Charakteristika der A83543 bildenden Stämme der Variation unterworfen. So können Mutanten dieser Stämme durch auf dem Fachgebiet bekannte physikalische und chemische Methoden erhalten werden. Beispielsweise können andere Stämme durch Behandlung mit Chemikalien wie N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin erhalten werden. Natürliche und induzierte Mutanten der Stämme S.spinosa NRRL 18395, NRRL 18537, NRRL 18538, NRRL 18539, NRRL 18719, NRRL 18720, NRRL 18743 und NRRL 18823, welche die Charakteristika der Bildung von gewinnbaren Mengen einer Verbindung der Formel 1 bei der Kultivierung unter geeigneten Bedingungen beibehalten, sind bei der vorliegenden Erfindung einsetzbar.
  • Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung ist die Bildung einer Verbindung der Formel 1, erzeugt durch Kultivieren eines A83543A bildenden Stammes von S.spinosa in einem Sinefungin enthaltenden geeigneten Kulturmedium, ausgewählt aus der Gruppe, welche besteht aus NRRL 18395, NRRL 18537, NRRL 18538 und NRRL 18539 oder einer A83543A bildenden Mutante hiervon. Eine "A83543A bildende Mutante" ist ein Stamm, der von einem beliebigen der A83543A bildenden Stämme von S.spinosa, NRRL 18395, NRRL 18537, NRRL 18538, NRRL 18539 abstammt, welcher zur Bildung von gewinnbaren Mengen von A83543A in der Lage ist, und der in der Lage ist, bei der Kultivierung in einem Sinefungin enthaltenden geeigneten Kulturmedium gleichzeitig vorkommende Mengen von A83543K und A83543O zu erzeugen.
  • Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist die Erzeugung einer Verbindung der Formel 1 durch Kultivieren eines A83543H bildenden Stammes von S.spinosa, wie NRRL 18823 oder einer A83543H bildenden Mutante hiervon in einem geeigneten Sinefungin enthaltenden Kulturmedium. Eine "A83543H bildende Mutante" ist ein Stamm, der von einem beliebigen der A83543H bildenden Stämme von S.spinosa, NRRL 18823, abstammt, der zur Bildung von gewinnbaren Mengen von A83543H in der Lage ist, und der in der Lage ist, bei der Kultivierung in einem Sinefungin enthaltenden geeigneten Kulturmedium gleichzeitig auftretende Mengen von A83543U und A83543V zu erzeugen.
  • Ein noch weiterer Aspekt dieser Erfindung ist die Herstellung einer verbindung der Formel 1 durch Kultivieren eines A83543J bildenden Stammes von S.spinosa, wie NRRL 18719, oder einer A83543J bildenden Mutante hiervon, in einem geeigneten Sinefungin enthaltenden Kulturmedium. Eine "A83543J bildende Mutante" ist ein Stamm, der von einem beliebigen der A83543J bildenden Stämme von S.spinosa, NRRL 18719 oder NRRL 18720, abstammt, der zur Bildung von gewinnbaren Mengen von A83543J in der Lage ist, und der in der Lage ist, bei der Kultivierung in einem von etwa 50 mg/ml bis etwa 200 mg/ml Sinefungin enthaltenden geeigneten Kulturmedium gleichzeitig auftretende Mengen von A83543P und A83543W zu erzeugen.
  • Typischerweise wird Sinefungin zu dem Bildungsmedium nach 48-72 Stunden zugesetzt, oder für die Herstellung in großem Maßstab wird die Zugabe von Sinefungin verzögert, bis die Kultur zu wachsen beginnt, was durch die Aufnahme von Sauerstoff angezeigt wird. Bevorzugt wird Sinefungin zu dem Fermentationsmedium etwa 48 Studnen bis etwa 72 Stunden nach der Impfung zugesetzt. Sinefungin kann als Feststoff oder als Lösung zugegeben werden. Der Einfachheit halber ist, wenn Sinefungin bei einer Fermentation im großen Maßstab zugesetzt wird, die Zugabe als eine alkoholische Lösung bevorzugt. Eine solche Lösung wird durch Auflösen von Sinefungin in einem ausreichenden Volumen von Methylalkohol, dann Sterilisieren der Lösung durch Futration durch ein 0,45 µm Filter hergestellt.
  • Alternativ werden die Verbindungen der Formel 1 durch Kultivieren von S.spinosa Stamm NRRL 18743 (der die Komponenten A83543K, A83543O und A83543Y erzeugt) oder einer A83543K bildenden Mutante hiervon in einem geeigneten Kulturmedium ohne Zugabe von Sinefungin erzeugt. Eine "A83543K bildende Mutante" ist ein Stamm, der von S.spinosa NRRL 18743 abstammt und der in der Lage ist, gewinnbare Mengen von A83543K zu bilden.
  • Nach der Bildung kann die Verbindung der Formel 1 aus dem Kulturmedium unter Anwendung verschiedener Isolierungs- und Reinigungsarbeitsweisen, welche auf dem Fachgebiet wohlbekannt sind, abgetrennt werden. Aus wirtschaftlichen Gründen der Herstellung, der optimalen Ausbeute und der Einfachheit der Produktisolierung sind bestimmte Kulturmedien bevorzugt. Beispielsweise sind bevorzugte Kohlenstoffquellen bei der Fermentation im großen Maßstab Glucose und Methyloleat, obwohl Ribose, Xylose, Fructose, Galactose, Mannose, Mannit, lösliche Stärke, Kartoffeldextrin, Öle wie Sojabohnenöl und dergl. ebenfalls verwendet werden können. Bevorzugte Stickstoffquellen sind Baumwollsaatmehl, peptonisierte Milch und Maissteepliquor, obwohl Fischmehl, verdautes Sojabohnenmehl, Hefeextrakt, enzymhydrolysiertes Casein, Rinderextrakt und dergl. ebenfalls verwendet werden können. Zu den anorganischen Nährsalzen, welche in die Kulturmedien eingegeben werden können, gehören die üblichen löslichen Salze, welche zur Anlieferung von Zink, Natrium, Magnesium, Calcium, Ammonium, Chlorid, Carbonat, Sulfat, Nitrat und ähnlichen Ionen in der Lage sind. Essentielle Spurenelemente, welche für das Wachstum und die Entwicklung des Organismus erforderlich sind, sollten ebenfalls in das Kulturmedium eingegeben werden.
  • Solche Spurenelemente treten üblicherweise als Verunreinigungen in anderen Bestandteilen des Mediums in ausreichenden Mengen, um die Wachstumsanforderungen des Organismus zu erfüllen, auf.
  • Üblicherweise können, falls Schäumen ein Problem ist, kleine Mengen (d.h. 0,2 ml/l) eines Antischaummittels wie Polypropylenglykol zu den Medien zur Fermentation im großen Maßstab zugesetzt werden. Jedoch hemmen im Falle von A83543 bildenden Kulturen konventionelle Entschäumer die Bildung von A83543. Das Schäumen kann durch Eingabe von Sojabohnenöl oder PLURONIC L-101 (BASF, Parsipanny, NJ) in das Medium (1-3%) gesteuert werden. Zusätzliches Öl kann zugesetzt werden, falls sich ein Schäumen entwickelt.
  • Für die Erzeugung von wesentlichen Mengen einer Verbindung der Formel 1 ist die aerobe Tauchfermentation in gerührten Bioreaktoren bevorzugt; jedoch können kleine Mengen einer Verbindung der Formel 1 durch Kultur in Schüttelflaschen erhalten werden. Als Folge des Zeitverlustes bei der Erzeugung, welcher üblicherweise mit der Impfung von großen Bioreaktoren mit der Sporenform des Organismus verbunden ist, wird die Verwendung eines vegetativen Inoculums bevorzugt. Das vegetative Inoculum wird durch Impfen eines kleinen Volumens von Kulturmedium aus einer in flüssigem Stickstoff aufbewahrten Stammkultur hergestellt, um eine frische, aktiv wachsende Kultur des Organismus zu erhalten. Das vegetative Inoculum wird dann in einen größeren Bioreaktor überführt. Das Medium für das vegetative Inoculum kann dasselbe sein, wie es für größere Fermentationen benutzt wird, jedoch sind andere Medien ebenfalls geeignet.
  • Die Verbindung der Formel 1 wird durch die A83543 bildenden Stämme erzeugt, wenn es bei Temperaturen zwischen etwa 24ºC und etwa 33ºC wachsen gelassen wird. Optimale Temperaturen für die Produktion scheinen etwa 28-30ºC zu sein.
  • Wie dies bei aeroben Tauchkulturverfahren üblich ist, wird sterile Luft in den Behälter vom Boden aus eingeblasen, während das Medium mit konventionellen Turbinenschaufeln gerührt wird. Im allgemeinen sollten die Belüftungsrate und die Rührrate ausreichen, um den Pegel von aufgelöstem Sauerstoff bei oder oberhalb von 80% bei einem Behälterinnendruck von etwa 0,34 Atmosphären zu-halten.
  • Die Bildung der Verbindung der Formel 1 kann während der Fermentation durch Testen von Extrakten der Brühe verfolgt werden. Ein bevorzugtes Verfahren zur Verfolgung der Bildung ist die Analyse der Brühenextrakte durch Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC). Ein geeignetes System für die Analyse ist in Beispiel 1 beschrieben.
  • Im Anschluß an die Bildung in Schüttelflaschen oder in gerührten Reaktoren kann die Verbindung der Formel 1 aus dem Fermentationsmedium nach auf dem Fachgebiet angewandten Methoden gewonnen werden. Die während der Fermentation des A83543 bildenden Stammes gebildeten Verbindungen treten sowohl in den Mycelien als auch in der Brühe auf. Die Verbindungen der Formel 1 sind lipophil; wenn eine wesentliche Menge von Öl bei der Fermentation verwendet wird, ist die Extraktion der Gesamtbrühe effizienter.
  • Falls nur kleine Mengen von Öl verwendet werden, liegt der größere Anteil der Verbindung der Formel 1 in den Mycelien vor. In diesem Fall wird eine effizientere Gewinnung der Verbindung der Formel 1 durch anfängliches Filtrieren des Mediums zur Abtrennung der Brühe von der Mycelmasse (der Biomasse) erreicht.
  • Die Verbindung der Formel 1 kann aus der Biomasse mittels einer Vielzahl von Arbeitsweisen gewonnen werden. Eine geeignete Arbeitsweise schließt das Waschen der abgetrennten Biomasse mit Wasser zur Entfernung von verbliebener Brühe, das Mischen der Biomasse mit einem polaren Lösungsmittel, in welchem die Verbindung der Formel 1 löslich ist, z.B. Methanol oder Aceton, das Abtrennen und das Konzentrieren-des Lösungsmittels, die Extraktion des Konzentrates mit einem nicht-polaren Lösungsmittel und/oder seine Adsorption auf einem Umkehrphasen-Kieselerdegeladsorbens, wie einem Umkehrphasen-C&sub8;- oder -C&sub1;&sub8;-harz, oder einem hochporösen Polymeren wie HP-20 oder HP-20ss (Mitsubishi Chemical Industries Co., Ltd., Japan) ein. Das aktive Material wird von dem Adsorbens mit einem geeigneten Lösungsmittel wie beispielsweise H&sub2;O:- Acetonitril:Methanol-mischungen, welche wahlweise geringe Mengen von THF enthalten, eluiert.
  • Eine bevorzugte Arbeitsweise zur Isolierung der Verbindung der Formel 1 aus der Biomasse schließt die Zugabe eines gleichen Volumens von Aceton zu der Gesamtbrühe, das Filtrieren der Mischung in einem keramischen Filter zur Entfernung der Biomasse und die Extraktion des Filtrates mit Ethylacetat ein. Der Ethylacetatextrakt wird im Vakuum zur Entfernung des Acetons eingeengt, und die wäßrige Schicht wird von der organischen Schicht abgetrennt. Die Ethylacetatlösung wird weiter im Vakuum konzentriert, und das Konzentrat wird mit verdünnter wäßriger Säure (pH 3) extrahiert. Die Verbindung der Formel 1 kann weiter durch Chromatographie, wie hier beschrieben, gereinigt werden.
  • Eine mehr bevorzugte Arbeitsweise zur Isolierung der Verbindung der Formel 1 aus der Biomasse schließt die Zugabe eines gleichen Volumens von Aceton zu der Gesamtbrühe, das Filtrieren der Mischung in einem keramischen Filter zur Entfernung der Biomasse und das Einstellen des pH des Filtrates auf etwa pH 9 bis etwa pH 13 ein. Diese Lösung wird auf HP-20ss (Mitsubishi Chemical Industries Co., Ltd., Japan) aufgegeben, und die Säule wird mit einer Mischung von Methanol, Acetonitril und Wasser (1:1:2) gewaschen. Die Verbindung der Formel 1 wird mit einer 95:5 Mischung von Methanoll Acetonitril (1:1), welche 0,1% Ammoniumacetat (pH 8,1) enthält, eluiert. Die die Verbindungen der Formel enthaltenden Fraktionen werden kombiniert und lyophilisiert. Die Verbindung der Formel 1 kann weiter mittels Chromatographie, wie hier beschrieben, gereinigt werden.
  • Alternativ können die Kulturfeststoffe einschließlich der Medienbestandteile und des Mycels ohne Extraktion oder Abtrennung, jedoch bevorzugt nach der Entfernung von Wasser, als Quelle für die Verbindung der Formel 1 benutzt werden. Beispielsweise kann nach der Bildung der Verbindung der Formel 1 die gesamte Fermentationsbrühe durch Lyophilisieren, durch Trommeitrocknung oder durch azeotrope Destillation und Trocknen getrocknet werden. Die getrocknete Brühe kann dann mischen in eine Nahrungsvormischung oder in Formulierungen für Sprays und Pulver.
  • Insektizid- und Mitizidaktivität
  • Die Verbindungen der Formel 2 sind für die Kontrolle von Insekten und Milben brauchbar. Daher richtet sich ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung auf Verfahren zur Hemmung eines Insekts oder einer Milbe, welches den Auftrag einer das Insekt oder die Milbe hemmenden Menge einer Verbindung der Formel 2 auf den Ort der Milbe oder des Insektes umfaßt.
  • Der "Ort" des Insektes oder der Milbe bezieht sich auf die Umgebung, in welcher das Insekt oder die Milbe lebt oder wo ihre Eier vorkommen, einschließlich der es/sie umgebenden Luft, der Nahrungsmittel, welche es/sie verzehrt, oder der Objekte, welche es/sie kontaktiert. Beispielsweise können pflanzenverdauende Insekten oder Milben dadurch kontrolliert werden, daß die aktive Verbindung auf Pflanzenteile aufgebracht wird, welche die Insekten oder Milben verzehren oder bewohnen, insbesondere die Blätter.
  • Der Ausdruck "Hemmen eines Insektes oder einer Milbe" bezieht sich auf die Verringerung der Anzahl von lebenden Insekten oder Milben oder auf die Verringerung der Anzahl von lebensfähigen Insekten- oder Milbeneiern. Das Ausmaß der von einer Verbindung erreichten Verminderung hängt selbstverständlich von der Auftragungsrate der Verbindung, der speziellen eingesetzten Verbindung und der als Ziel vorgesehenen Insekten- oder Milbenspezies ab. Wenigstens eine das Insekt inaktivierende oder die Milbe inaktivierende Menge sollte verwendet werden.
  • Die Ausdrücke "Insekten inaktivierende Menge" und "Milben inaktivierende Menge" werden verwendet, um die Menge zu beschreiben, welche zur Herbeiführung einer meßbaren Verminderung in der behandelten Population der Insekten oder Miiben herbeizuführen. Im allgemeinen wird eine Menge im Bereich von etwa 1 bis etwa 1000 ppm (oder 0,01 bis 1 kg/a) an aktiver Verbindung eingesetzt.
  • Die Verbindungen der Formel 2 zeigen Aktivität gegenüber einer Anzahl von Insekten und Milben. Mehr spezifisch, zeigen die Verbindungen Aktivität gegenüber Beet-Heerwurm und Tabakknospenraupen, welches Glieder der Insektenordnung Lepidoptera sind. Andere typische Glieder dieser Ordnung sind der südliche Heerwurm, Apfelwicklermotte, Eulenfalterraupe, Kleidermotte, Maismehlmotte, Blattwickler, Maisährenraupe, Baumwollsamenraupe, Raupe des europäischen Maiszünslers, importierter Kohlraupe, Kohlspannerlarve, Nelkensamenraupe, Raupe des Sackträgers, östliche Zeltraupe, Rasenspannerraupe und Herbst-Heerwurm.
  • Die Verbindungen der Formel 2 zeigen ebenfalls Aktivität gegenüber Singzirpen, welche ein Glied der Insektenordnung Homoptera sind. Andere Glieder dieser Ordnung schließen ein Baumwollblattlaus, Pflanzenheuschrecken, Pfirsichblattfloh, Apfelsauger, Schildläuse, weiße Fliegen, Schaumzikaden wie auch eine Anzahl von anderen wirtsspezifischen Läusespezies.
  • Zusätzlich zeigen die Verbindungen der Formel 2 Aktivität gegenüber Stallfliegen, Schmeißfliegen und Moskitos, welche Glieder der Insektenordnung Diptera sind. Ein anderes typisches Glied dieser Ordnung ist die gewöhnliche Hausfliege.
  • Die Verbindungen der Formel 2 zeigen ebenfalls Aktivität gegenüber der zweifleckigen roten Spinne, welche ein Glied der Insektenordnung Acarina ist. Andere typische Glieder dieser Ordnung schließen ein Balgmilbe, Krätzenmilbe, Schafkrätzenmilbe, Hühnermilbe, Blattläuse, Federmilben und Hundefollikelmilben.
  • Die Verbindungen der Formel 2 sind brauchbar zur Verminderung der Populationen von Insekten und Milben, und sie werden bei einem Verfahren zur Hemmung einer Insekten- oder Milbenpopulation eingesetzt, welches das Auftragen einer wirksamen, die Insekten oder Milben inaktivierenden Menge einer Verbindung der Formel 2 auf einen Ort des Insektes oder der Milbe umfaßt. Bei einer bevorzugten Ausführungsform ist die Erfindung auf ein Verfahren zur Hemmung eines empfänglichen Insekts der Ordnung Lepidoptera gerichtet, welches den Auftrag einer wirksamen das Insekt inaktivierenden Menge einer Verbindung der Formel 2 gemäß der vorliegenden Erfindung auf eine Pflanze umfaßt. Eine andere bevorzugte Ausführungsform der Erfindung richtet sich auf ein Verfahren zur Hemmung von Beißfliegen der Ordnung Diptera bei Tieren, welche die orale, parenterale oder topische Zufuhr bzw. Auftrag einer effektiven den Schädling hemmenden Menge einer Verbindung der Formel 2 bei dem Tier umfaßt. Bei einer anderen bevorzugten Ausführungsform richtet sich die vorliegende Erfindung auf ein Verfahren zur Hemmung eines empfänglichen Insektes der Ordnung Homoptera, welches den Auftrag einer effektiven das Insekt inaktivierenden Menge einer Verbindung der Formel 2 auf eine Pflanze umfaßt. Eine andere bevorzugte Ausführungsform der Erfindung richtet sich auf ein Verfahren zur Hemmung von Milben der Ordnung Acarina, welches den Auftrag einer die Milben aktivierenden Menge einer Verbindung der Formel 2 auf den Ort der Milbe umfaßt.
    • Milben/ Insekten-Untersuchung
  • Die Verbindungen der Formel 2 wurden auf mitizide und insektizide Aktivität bei der folgenden Milben/Insekten- Untersuchung getestet. Jede Testverbindung wurde durch Auflösen der Verbindung in einer Aceton-Alkoholmischung (1:1), welche 23 g TOXIMUL R (Sulfonat/nichtionische Emulgatormischung) und 13 g TOXIMUL S (Sulfonat/nichtionische Emulgatormischung) pro Liter enthielt, formuliert. Diese Mischungen wurden dann mit Wasser verdünnt, um die angegebenen Konzentrationen zu erhalten.
  • Zweigefleckte rote Spinnen und Baumwolläuse wurden auf Kürbiskeimblättern angesiedelt und sich auf beiden Blattoberflächen entwickeln gelassen. Die Blätter wurden dann mit 5 ml der Testlösungen unter Verwendung eines Devilbiss-Sprühzerstäubers bei 10 psi besprüht. Beide Oberflächen der Blätter wurden bis zum Ablaufen bedeckt und dann für 1 Stunde trocknen gelassen. Nach Standardexpositionsperioden wurde die prozentuale Mortalität bestimmt. Zusätzliche Insekten wurden unter Verwendung vergleichbarer Formulierungen und Untersuchungsmethoden überprüft. Die Ergebnisse sind in Tabelle IX angegeben. Die folgenden Abkürzungen werden verwendet: Tabelle IX. Aktivität von Verbindungen der Formel 2 bei der Insekten/Milben-Untersuchung % Hemmung b
  • a Raten in ppm (falls nicht anders in Klammern angegeben)
  • b % Hemmung als Mittelwert von einzelnen wiederholten Tests
  • c Periode der Exposition
  • Verbindungen der Formel 2 wurden bei dem folgenden Versuch zur Bestimmung der LD&sub5;&sub0; gegenüber frisch geborenen Tabakknospenraupen (Heliothis virescens) untersucht. Eine Petrischale (100 mm x 20 mm) wird umgedreht und der Deckel mit einem qualitativen Filterpapier #1 ausgekleidet. Zehn frisch geborene Larven werden in jede Schale eingesetzt und eine 1 ml Testlösung wird auf die Insekten aufpipettiert. Der Boden der Petrischale wird dann auf den Deckel aufgesetzt, um die Larven einzuschließen. 1 Stunde nach der Behandlung wird ein kleines Stück von Heliothis Diät (modifizierte Aufschlämmung, Southland Products, Lake Village, AR) in jede Schale eingegeben. Die Mortalität wird bei 24 und 48 Stunden festgestellt. Die Tests wurden dreifach durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Tabelle X gezeigt. Tabelle X: Aktivität gegenüber frisch geschlüpften Tabakknospenraupen
  • a Mittelwert von zwei Tests
    • Insektizide Zusammensetzungen
  • Die Verbindungen der Formel 2 dieser Erfindung werden in Form von Zusammensetzungen, welche ebenfalls Teil dieser Erfindung sind, aufgebracht. Diese Zusammensetzungen umfassen eine Insekten oder Milben inaktivierende Menge einer Verbindung der Formel 2 in einem phytologisch annehmbaren inerten Träger. Die aktive Komponente, die Verbindung der Formel 2, kann als eine einzelne Verbindung der Formel 2, eine Mischung von zwei oder mehr Verbindungen der Formel 2 oder eine Mischung von wenigstens einer Komponente A83543K, A83543O, A83543P, A83543U, A83543V, A83543W und A83543Y oder eine Mischung von wenigstens einer Komponente A83543K, A83543O, A83543P, A83543U, A83543V, A83543W und A83543Y zusammen mit dem getrockneten Teil des Fermentationsmediums, in welcher sie gebildet wurde, vorliegen.
  • Zusammensetzungen werden nach Arbeitsweisen und Formulierungen hergestellt, welche auf dem Gebiet der Agrikulturchemie üblich sind, welche jedoch neu und wichtig als Folge der Anwesenheit von einer oder mehreren der Verbindungen dieser Erfindung sind. Die Zusammensetzungen sind entweder konzentrierte Formulierungen, welche in Wasser für den Auftrag dispergiert werden, oder Stäube oder granulatförmige Formulierungen, welche ohne weitere Behandlung aufgebracht werden.
  • Die Dispersionen, in denen die Verbindung oder das rohe getrocknete Material angewandt werden, sind am häufigsten wäßrige Suspensionen oder Emulsionen, hergestellt aus konzentrierten Formulierungen der Verbindungen oder des rohen Materials. Solche wasserlöslichen, wasser-suspendierbaren oder -emulgierbaren Formulierungen sind entweder Feststoffe (üblicherweise als benetzbare Pulver bekannt) oder Flüssigkeiten (üblicherweise als emulgierbare Konzentrate oder wäßrige Suspensionen bekannt).
  • Benetzbare Pulver, welche unter Bildung von in Wasser dispergierbaren Granulen kompaktiert werden können, umfassen eine innige Mischung der aktiven Verbindung, einen inerten Träger und grenzflächenaktive Stoffe. Die Konzentration an der aktiven Verbindung beträgt üblicherweise von etwa 1 Gew.-% bis etwa 90 Gew.-%. Der inerte Träger wird üblicherweise unter Attapulgittonen, den Montmorillonittonen, den Diatomeenerden oder den gereinigten Silikaten ausgewählt.
  • Effektive grenzflächenaktive Stoffe, welche von etwa 0,5% bis etwa 10% des benetzbaren Pulvers ausmachen, finden sich unter den sulfonierten Ligninen, den kondnesierten Naphthalinsulfonaten, den Naphthalinsulfonaten, den Alkylbenzolsulfonaten, den Alkylsulfaten und nichtionischen Tensiden wie Ethylenoxidaddukten von Alkylphenolen.
  • Emulgierbare Konzentrate der Verbindungen umfassen eine geeignete Konzentration einer Verbindung, beispielsweise von etwa 50 bis etwa 500 Gramm pro Liter an Flüssigkeit, äquivalent zu etwa 10% bis etwa 50%, aufgelöst in einem inerten Träger, der entweder ein mit Wasser mischbares Lösungsmittel oder ein Gemisch eines mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittels und von Emulgatoren ist. Brauchbare organische Lösungsmittel schließen ein: aromatische Stoffe, insbesondere die Xylole und Petroleumfraktionen, insbesondere hochsiedende naphthalinartige und olefinartige Abschnitte von Petroleum wie Schwernaphtha oder aromatisches Naphtha. Andere organische Lösungsmittel können ebenfalls verwendet werden, beispielsweise die Terpenlösungsmittel, einschließlich Kollophoniumderivaten, aliphatische Ketone wie Cyclohexanon und komplexe Alkohole wie 2-Ethoxyethanol. Geeignete Emulgatoren für emulgierfähige Konzentrate werden aus konventionellen nichtionischen Tensiden ausgewählt, wie sie zuvor erwähnt wurden.
  • Wäßrige Suspensionen umfassen Suspensionen von wasserunlöslichen Verbindungen dieser Erfindung, welche in einem wäßrigen Träger mit einer Konzentration in dem Bereich von etwa 5 Gew.-% bis etwa 50 Gew.-% dispergiert sind. Die Suspensionen werden durch feines Mahlen der Verbindung und kräftiges Einmischen hiervon in einen Träger, der aus Wasser und Tensiden besteht, welche aus denselben zuvor diskutierten Arten ausgewählt wurden, hergestellt. Inerte Inhaltsstoffe wie anorganische Salze und synthetische oder natürliche Gumme bzw. Harze können zur Erhöhung der Dichte und der Viskosität des wäßrigen Trägers zugesetzt werden. Oftmals ist es effektiver, die Verbindung zum selben Zeitpunkt durch Herstellung des wäßrigen Gemisches und seine Homogenisierung in einem Gerät wie einer Sandmühle, einer Kugelmühle oder einem Homogenisator vom Kolbentyp zu mahlen und zu mischen.
  • Die Verbindungen der Formel 2 können ebenfalls als granulatförmige Zusammensetzungen aufgebracht werden, welche besonders brauchbar für Anwendungen auf dem Erdreich sind. Granulatförmige Zusammensetzungen enthalten üblicherweise von etwa 0,5 Gew.-% bis etwa 10 Gew.-% der Verbindung der Formel 2, dispergiert in einem inerten Träger, der vollständig oder zum großen Teil aus Ton oder einer ähnlichen preiswerten Substanz besteht. Solche Zusammensetzungen werden üblicherweise durch Auflösen der Verbindung in einem geeigneten Lösungsmittel und deren Auftrag auf einen granulatförmigen Träger, der auf die geeignete Teilchengröße in dem Bereich von etwa 0,5 bis 3 mm zuvor geformt wurde, hergestellt. Solche Zusammensetzungen können ebenfalls durch Herstellung eines Teiges oder einer Paste des Trägers, Trocknen der vereinigten Mischung von aktivem Inhaltsstoff in dem Teig oder der Paste und Mahlen der getrockneten Zusammensetzung zum Erhalt der gewünschten Granulatteilchengröße formuliert werden.
  • Die Verbindungen enthaltende Stäube werden durch inniges Mischen der Verbindung in gepulverter Form mit einem geeigneten staubförmigen, für die Landwirtschaft geeigneten Träger wie Kaolinton, gemahlener Vulkanasche und dergl. hergestellt. Stäube können geeigneterweise von etwa 1% bis etwa 10% der Verbindung der Formel 2 enthalten.
  • Ebenfalls ist es praktizierbar, wenn dies aus irgendeinem Grunde gewünscht wird, die Verbindung in Form einer Lösung in einem geeigneten organischen Lösungsmittel, üblicherweise einer Mischung von Petrolöl wie den Sprühölen, welche weit verbreitet in der Landwirtschaftschemie angewandt werden, anzuwenden.
  • Insektizide und Mitizide werden üblicherweise in Form einer Dispersion des aktiven Inhaltsstoffes in einem flüssigen Träger aufgebracht. Es ist konventionell, die Auftragungsraten in Werten der Konzentration des aktiven Inhaltsstoffes in dem Träger anzugeben. Der am meisten verbreitet eingesetzte Träger ist Wasser.
  • Die Verbindungen der Formel 2 können ebenfalls in Form einer Aerosolzusammensetzung aufgebracht werden. In solchen Zusammensetzungen ist die aktive Verbindung in einem inerten Träger aufgelöst, der eine druckerzeugende Treibmischung ist. Die Aerosolzusammensetzung wird in einem Behälter abgepackt, aus welchem die Mischung durch ein Zerstäubungsventil abgegeben wird. Treibmittelmischungen umfassen entweder niedrigsiedende Halogenkohlenstoffe, welche mit organischen Lösungsmitteln gemischt sein können, oder wäßrige Suspensionen, welche mit Inertgasen oder gasförmigen Kohlenwasserstoffen unter Druck gesetzt werden.
  • Die Menge an auf den Ort von Insekten oder Milben aufzubringenden Verbindung ist nicht kritisch und kann leicht durch den Fachmann auf dem Gebiet anhand der gegebenen Beispiele festgelegt werden. Im allgemeinen ist zu erwarten, daß Konzentrationen von etwa 10 ppm bis etwa 5000 ppm der Verbindung der Formel 2 gute Kontrolle ergeben. Bei vielen Verbindungen reichen Konzentrationen von etwa 100 bis etwa 1000 ppm aus. Für Feldfrüchte wie Sojabohnen und Baumwolle beträgt eine geeignete Auftragsrate der Verbindungen etwa 0,01 bis etwa 1 kg/ha, typischerweise aufgetragen in einer 5 bis 50 gal/A der Sprayformulierung.
  • Der Ort, auf welchen eine Verbindung der Formel 2 aufgebracht wird, kann ein beliebiger von einem Insekt oder einer Milbe bewohnter Ort sein, beispielsweise Gemüsefrüchte, Frucht- und Nußbäume, Weinberge und Zierpflanzenanlagen. wegen der einzigartigen Fähigkeit von Milbeneiern, einer toxischen Einwirkung zu widerstehen, können wiederholte Auftragungen zur Kontrolle von neu geschlüpften Larven erwünscht sein, wie dies für andere bekannte Acarizide gilt.
    • Ectoparasitäre Aktivität
  • Die Verbindungen der Formel 2 sind ebenfalls aktiv gegenüber Gliedern der Insektenordnung Diptera. Die Tabellen XI und XII fassen die in vitro Studien von Verbindungen der Formel 2 gegenüber Schmeißfliegenlarven und ausgewachsene Stallfliegen bei 48 Stunden zusammen. Tabelle XI: Aktivität gegen Schmeißfliegenlarven Tabelle XII: Aktivität gegen ausgewachsene Stallfliege
    • Ectoparasitäre Methoden
  • Die ectoparasitäre Methode dieser Erfindung wird so durchgeführt, daß eine Verbindung der Formel 2 auf Wirtstiere zur Kontrolle von Insekten und Acarina-parasiten appliziert wird. Die Applikation bei dem Tier kann auf dermalem, oralem oder parenteralem Weg erfolgen.
  • Parasitäre Insekten und Acarina schließen Spezies ein, welche sowohl blutsaugend als auch fleischfressend sind und welche während ihres gesamten Lebenszyklus oder nur eines Teiles ihres Lebenszyklus parasitär sind, wie nur die Larvenstufen oder nur die Reifestufe. Repräsentative Spezies schließen die folgenden ein:
  • Roßfliege Tabanus spp.
  • Stallfliege Stomoxys calcitrans
  • schwarze Fliege Simulium spp.
  • Pferde-Sauglaus Haematopinus asini
  • Räudenmilbe Sarcoptes scabiei
  • Krätzenmilbe Psoropies equi
  • Hornfliege Haematobia irritans
  • Rinderbeißlaus Bovicola bovis
  • kurznasige Rinderlaus Haematopinus eurysternus
  • langnasige Rinderlaus Linoqnathus vituli
  • Tsetsefliege Glossina spp.
  • Rinderfollikelmilbe Demodex bovis
  • Rinderzecke Boophilus microplus and B.decoloratus
  • Golfküstenzecke Amblyomma maculatum
  • Lone-Star-Zecke Amblyomma americanum
  • Ohrzecke Otobius meqnini
  • Rocky-Mountain Holzbock Dermacentor andersoni
  • Goldfliege Cochliomyia hominivorax
  • Mörderwanze Reduvius spp.
  • Moskito Culiseta inornata
  • Braunohrzecke Rhipicephalus appendiculatus
  • afrikanische rote Zecke Rhipicephalus evertsi
  • Buntzecke Amblyomma sp.
  • Buntbeinzecke Hyalomma sp.
  • Schweinelaus Haematopinus suis
  • Sandfloh Tunqa penetrans
  • Körperlaus Haematopinus ovillus
  • Fußlaus Linoqnathus pedalis
  • Schafzecke Melophaqus ovinus
  • Schafkrätzenmilbe Psoroptes ovis
  • Greenbottle-Fliege Phaenicia sericata
  • schwarze Schmeißfliege Phormia reqina
  • sekundäre Goldfliegenlarve Cochliomyia macellaria
  • Schafschmeißfliege Phaenicia cuprina
  • Bettwanze Cimex lectularius
  • Southern Hühnerfloh Echidnophaqa qallinacea
  • Hühnerzecke Arqas persicus
  • Hühnermilbe Dermanyssus qallinae
  • Blattlaus Knemidokoptes mutans
  • Federmilbe Knemidokoptes qallinae
  • Hundefollikelmilbe Demodex canis
  • Hundefloh Ctenocephalis canis
  • amerikanischer Hundefloh Dermacentor variabilis
  • brauner Hundefloh Rhipicephalus sanguineus
  • Das Verfahren der Erfindung kann zum Schutz von wirtschaftlich genutzten Tieren und von im Haus gehaltenen Tieren von Ectoparasiten angewandt werden. Beispielsweise kann die Verbindung vorteilhafterweise bei Pferden, Rindern, Schafen, Schweinen, Ziegen, Hunden, Katzen und dergl. wie auch bei exotischen Tieren wie Kamelen, Llamas, Rotwild und anderen Spezies, welche üblicherweise als Wildtiere bezeichnet werden, angewandt werden. Die Verbindung kann ebenfalls vorteilhafterweise bei Geflügel und anderen Vögeln wie Truthähnen, Küken, Enten und dergl. eingesetzt werden.
  • Bevorzugt wird das Verfahren bei wirtschaftlich genutzten Tieren und am meisten bevorzugt bei Rindern und Schafen angewandt.
    • Ectoparasitäre Zusammensetzungen
  • Diese Erfindung betrifft auch Zusammensetzungen zur Kontrolle einer Population von Insektenectoparasiten, welche das Blut eines Wirtstieres konsumieren. Diese Zusammensetzungen können zum Schutz von wirtschaftlich gehaltenen Tieren, den Menschen begleitenden Tieren und Wildtieren vor Ectoparasiten eingesetzt werden. Die Zusammensetzungen können ebenfalls vorteilhafterweise bei Geflügel und anderen Vögeln angewandt werden.
  • Bevorzugt wird das Verfahren angewandt oder die Zusammensetzungen benutzt, um wirtschaftlich gehaltene Tiere und am meisten bevorzugt Rinder und Schafe zu schützen. Die Rate, der Zeitpunkt und die Art und Weise der effektiven Anwendung variiert in starkem Maße mit der Identität des Parasiten, dem Ausmaß des Parasitenbefalls und anderen Faktoren. Die Anwendungen können periodisch während der gesamten Lebensspanne des Wirtes oder für nur eine Spitzenzeit des parasitären Befalls erfolgen. Im allgemeinen wird ectoparasitäre Kontrolle mit topischem Auftrag von flüssigen Formulierungen erreicht, welche von etwa 0,0005 bis etwa 95% der Verbindung der Formel 2, bevorzugt bis zu 5% und am meisten bevorzugt bis zu 1% einer Verbindung der Formel 2 enthalten. Effektive Parasitenkontrolle wird bei einer Anwendungsrate von etwa 5 bis etwa 100 mg/kg erreicht.
  • Die Verbindungen der Formel 2 werden bei den Wirtstieren nach üblicher Veterinärpraxis angewandt. Üblicherweise werden die Verbindungen in ectoparasitären Zusammensetzungen formuliert, welche eine Verbindung der Formel 2 und einen physiologisch annehmbaren Träger umfassen. Beispielsweise können flüssige Zusammensetzungen lediglich auf die Tiere, bei denen ectoparasitäre Kontrolle gewünscht ist, aufgesprüht werden. Die Tiere können ebenfalls sich selbst mittels solcher Einrichtungen wie Rückenscheuergeräten, welche eine Verbindung der Formel 2 und ein Textilmaterial enthalten, behandeln, beispielsweise mit denen die Tiere sich in Kontakt bringen können. Tauchtanks können ebenfalls zum Applizieren des aktiven Mittels bei dem Wirtstier eingesetzt werden.
  • Die orale Applikation kann dadurch erreicht werden, daß die Verbindung in das Tierfutter oder das Trinkwasser eingegeben wird, oder dadurch daß Dosierungsformen wie Tabletten, Kapseln, Boluse oder Implantate gegeben werden. Perkutane Applikation wird üblicherweise durch subkutane, intrapentoneale oder intravenöse Injektion einer injizierbaren Formulierung erreicht.
  • Die Verbindungen der Formel 2 können für die orale Applikation in den üblichen Formen wie als gewaltsam einzuflößendes Mittel, Tabletten oder Kapseln formuliert werden. Solche Zusammensetzungen erfordern selbstverständlich oral annehmbare inerte Träger. Die Verbindungen können ebenfalls als eine injizierbare Lösung oder Suspension für die subkutane, dermale, intraruminale, intraperitoneale, intramuskuläre oder intravenöse Injektion formuliert werden. Bei einigen Anwendungen werden die Verbindungen geeigneterweise als eine Komponente eines standardmäßigen Tierfutters formuliert. Bei dieser Ausführungsform ist es üblich, die vorliegende Verbindung zuerst als eine Vormischung zu formulieren, in welcher die Verbindung in einem flüssigen oder teilchenförmigen festen Träger dispergiert ist. Die Vormischung kann von etwa 2 bis etwa 250 g an Verbindung der Formel 2 pro Pfund (pound) (0,45 kg) enthalten. Die Vormischung wird wiederum in das letztuche Futter durch konventionelles Mischen eingegeben.
  • Da ecotparasitärer Angriff im allgemeinen während eines wesentlichen Teiles der Lebensspanne des Wirtstieres erfolgt, wird es bevorzugt, Verbindungen der Formel 2 in einer Form zu geben, um eine fortdauernde Freisetzung während einer Zeitspanne sicherzustellen. Konventionelle Arbeitsweisen schließen die Verwendung einer Matrix ein, welche physikalisch das Auflösen hemmt, wobei die Matrix ein wachsartiger Halbfeststoff ist, wie die pflanzlichen Wachse, oder ein Polyethylenglykol mit hohem Molekulargewicht. Ein guter Weg zur Applikation der Verbindungen ist mittels eines Bolus mit Langzeitwirkung, wie denjenigen von Laby, US-Patent No. 4 251 506 und Simpson, britisches Patent No. 2 059 767. Für einen solchen Bolus würde die Verbindung in einer polymeren Matrix eingekapselt werden, wie in derjenigen von Nevin, US- Patent NO. 4 273 920. Die Langzeitfreisetzung von Verbindungen der vorliegenden Erfindung kann ebenfalls durch Verwendung eines Implantates wie aus einem silikonhaltigen Kautschuk erreicht werden.
  • Zur vollständigeren Erläuterung der Arbeitsweise dieser Erfindung werden die folgenden Beispiele gegeben:
    • Beispiel 1 A83543 Assay-Methode
  • Das folgende Verfahren zur analytischen Hochleistungs- Flüssigkeitschromatographie (HPLC) ist zur überwachung einer Fermentation für die Erzeugung von A83543K, A83543O, A83543P, A83543U, A83543V, A83543W, A83543Y und anderen A83543 Komponenten brauchbar:
  • Eine Probe der Gesamtbrühe wird mit 3 Volumina von Acetonitril verdünnt, um die Faktoren aus den Mycelien zu extrahieren. Die erhaltene Lösung wird dann durch ein 0,45 µm Polytetrafluor-(PTFE)-filter zur Entfernung von teilchenförmigem Material vor dem Injizieren in das HPLC Assaysystem filtriert. Eine Lösung von gereinigtem A83543A mit einer Konzentration von 100 mg/ml in Methanol wird als ein externer Standard für den Assay benutzt, und die Peakflächen aller A83543 Komponenten werden auf diesen Eichstandard zur Bestimmung der Konzentrationen der einzelnen Komponenten rückbezogen.
    • HPLC-System
  • Kolonnenträger: YMC-PACK 4,6 x 100-mm ID (innerer Durchmesser) Säule, 5 µm sphärisch, 120 Å (YMC Inc., Morris Plains, NJ)
  • Mobile Phase: CH&sub3;CN/MeOH/H&sub2;O (3:3:2) mit einem Gehalt von 0,05% Ammoniumacetat
  • Strömungsgeschwindigkeit: 2 ml/min
  • Detektor: UV bei 250 nm
  • Retentionszeiten: A83543A 15,52 min
  • A83543K 8,10 min
  • A83543O 11,40 min
  • A83543P 6,40 min
  • A83543U 5,22 min
  • A83543V 7,05 min
  • A83543W 8,47 min
  • A83543Y 6,12 min
    • Beispiel 2 Herstellung von A83543K und A835430 mit Kultur NRRL 18538 (A83543.4) A. Schüttelflaschen-Fermentation
  • Die Kultur S.spinosa NRRL 18538, entweder als ein lyophilisiertes Pellet oder als eine in flüssigem Stickstoff gehaltene Suspension, wurde zum Impfen eines vegetativen Mediums mit folgender Zusammensetzung benutzt: Vegetatives Medium 1
  • * NZ Amine A, Sheffield Products, Norwich, NY.
  • Schrägplatten oder Platten können durch Zugabe von 2,5% Agar zu dem vegetativen Medium hergestellt werden. Die beimpfte Schrägplatte wird bei 30ºC für etwa 10 bis etwa 14 Tage inkubiert. Die reife Schrägplattenkultur wird mit einem sterilen Werkzeug zum Lockermachen der Sporen und zur Entfernung und Macerierung der Mycelmatte gelockert. Etwa ein Viertel der so erhaltenen gelockerten Sporen und des Kulturbewuchses werden zum Impfen von 50 ml eines vegetativen Mediums als erste Stufe benutzt. Alternativ kann das Medium der ersten Stufe aus einer Ampulle aus flüssigem Stickstoff beimpft werden.
  • Wenn die Kultur in flüssigem Stickstoff gehalten wird, werden die Ampullen unter Verwendung gleicher Volumina von vegetativer Kultur (48-72 Stunden Inkubation, 30ºC) und von Suspendiermedium präpariert. Das Suspendiermedium enthält Lactose (100 g), Glycerin (200 ml) und entionisiertes Wasser (q.s. auf 1-1).
  • Eine Ampulle aus flüssigem Stickstoff wird zum Beimpfen von 50 ml vegetativem Medium in 250 ml Erlenmeyerkolben benutzt. Die Kulturen werden bei 30ºC für 48 Stunden auf einem Schüttler inkubiert, der in einem 2 Zoll (5,08 cm) Kreis mit 250 Upm umläuft.
  • Die inkubierte Kultur (5% Vol/Vol Inoculum) wird zum Beimpfen von 30 ml eines Produktionsmediums in einem 250 ml Weithals-Erlenmeyerkolben verwendet. Die Mediumzusammensetzung war wie folgt: Produktionsmedium
  • * Peptonized Milk Nutrient, Sheffield Products, Norwich, NY
  • ** Proflo, Traders Protein, Memphis, TN
  • *** Die Menge von Methyloleat betrug 30 ml
  • Das beimpfte Produktionsmedium wird in 250 ml Weithals- Erlenmeyerkolben bei 30ºC für 7 Tage auf einem Schüttler inkubiert, der in einem 2-Zoll-Kreis mit 250 Upm umläuft. Sinefungin wurde mit einer Endkonzentration von etwa 100 µg/ml zum Zeitpunkt 72 Stunden nach dem Beimpfen zugesetzt.
    • B. Fermentation in gerührtem Reaktor
  • Um ein größeres Volumen von Inoculum bereitzustellen, wurden 10 ml des inkubierten Mediums der ersten Stufe, hergestellt wie in Beispiel 2, Abschnitt A, zum Beimpfen von 400 ml eines vegetativen Mediums der zweiten Stufe, welches dieselbe Zusammensetzung wie diejenige des Mediums der ersten Stufe hatte, verwendet. Dieses vegetative Medium der zweiten Stufe wird in einem 2 l Weithals-Erlenmeyerkolben für etwa 48 Stunden bei 30ºC auf einem Schüttler inkubiert, der in einem 2-Zoll-Kreis mit 250 Upm umläuft.
  • Auf diese Weise hergestelltes inkubiertes vegetatives Medium der zweiten Stufe (2 l) wird zum Beimpfen von 115 Litern eines sterilen Produktionsmediums, hergestellt wie in Beispiel 2, Abschnitt A, beschrieben, verwendet. Sinefungin als eine filtrierte methanolische Lösung wurde zum Zeitpunkt 66 Stunden bis zu einer Endkonzentration von 100 µg/ml zugesetzt
  • Das beimpfte Produktionsmedium wurde in einem gerührten 165 l Bioreaktor für 7 Tage bei einer Temperatur von 30ºC fermentieren gelassen. Der Luftfluß und die Rührgeschwindigkeit in dem gerührten Kessel wurden mittels Computer gesteuert, um einen Pegel von aufgelöstem Sauerstoff bei etwa 80% der Luftsättigung zu erhalten.
    • Beispiel 3 Herstellung von A83543K, A83543O und A83543Y mit Kultur NRRL 18743 (A83543.8) A. Schüttelflaschen-Fermentation
  • Die Kultur S.spinosa NRRL 18743, entweder als ein lyophilisiertes Pellet oder als eine in flüssigem Stickstoff gehaltene Suspension, wurde zum Beimpfen eines vegetativen Mediums mit der folgenden Zusammensetzung benutzt: Vegetatives Medium 2
  • * Baltimore Biological Laboratories, Cockeysville, MD
  • Schrägplatten oder Platten können durch Zugabe von 2,5% Agar zu dem vegetativen Medium hergestellt werden. Die beimpfte Schrägplatte wird bei 30ºC für etwa 10 bis etwa 14 Tage inkubiert. Die reife Schrägplattenkultur wird mit einem sterilen Werkzeug zum Lockermachen der Sporen und zur Entfernung und Macerierung der Mycelmatte gelockert. Etwa ein Viertel der so erhaltenen gelockerten Sporen und des Kulturbewuchses werden zum Impfen von 50 ml eines vegetativen Mediums als erste Stufe benutzt. Alternativ kann das Medium der ersten Stufe aus einer Ampulle aus flüssigem Stickstoff beimpft werden.
  • Ausgangsinoculum aus flüssigem Stickstoff wurde durch Homogenisieren einer vegetativen Kultur, Verdünnen auf 1:1 (Volumen:Volumen) mit einem sterilen Suspendiermittel aus Glycerin:Lactose:Wasser (2:1:7) und Verteilen in sterile Reagenzgläser (1,5 ml/Reagenzglas) hergestellt. Das verdünnte Inocolum wurde dann über flüssigem Stickstoff in geeigneten Lagerbehältern aufbewahrt und als Arbeitsausgangsinoculum für die Kultivierung von Schüttelflaschenkulturen und als Impfmedium für Fermenter benutzt.
  • Eine Ampulle aus flüssigem Stickstoff wurde rasch aufgetaut, und 015 ml wurden zum Beimpfen von 50 ml von vegetativem Medium in 250 ml Weithals-Erlenmeyerkolben verwendet. Die Kulturen wurden bei 32ºC für 48 Stunden auf einem Schüttler inkubiert, der in einen 2-Zoll (5,08 cm)-Kreis bei 250 Upm umlief.
  • Die inkubierte Kultur (5% Vol/Vol Inoculum) wird zum Beimpfen von 25 ml eines Produktionsmediums verwendet, welches die folgende Zusammensetzung besitzt: Produktionsmedium
  • * Peptonized Milk Nutrient, Sheffield Products, Norwich, NY
  • ** Proflo, Traders Protein, Memphis, TN
  • Das beimpfte Produktionsmedium wird in 250 ml Weithals- Erlenmeyerkolben bei 30ºC für 7 Tage auf einem Schüttler inkubiert, welcher in einem 2-Zoll-Kreis mit 250 Upm umläuft.
    • B. Fermentation in gerührtem Reaktor
  • Um ein grtßeres Volumen von Inoculum bereitzustellen, wurden 10 ml des inkubierten Mediums der ersten Stufe, hergestellt wie in Beispiel 31 Abschnitt A, zum Beimpfen von 400 ml eines vegetativen Mediums der zweiten Stufe, welches dieselbe Zusammensetzung wie diejenige des Mediums der ersten Stufe hatte, verwendet. Dieses vegetative Medium der zweiten Stufe wird in einem 2 l Weithals-Erlenmeyerkolben für etwa 48 Stunden bei 32ºC auf einem Schüttler inkubiert, der in einem 2-Zoll-Kreis mit 250 Upm umläuft.
  • So hergestelltes inkubiertes vegetatives Medium der zweiten Stufe (2 l) wird zum Beimpfen von 115 Litern von sterilem Produktionsmedium, hergestellt wie in Beispiel 3, Abschnitt A, beschrieben, verwendet.
  • Das beimpfte Produktionsmedium wurde in einem gerührten 165 l Bioreaktor für 7 Tage bei einer Temperatur von 30ºC fermentieren gelassen. Der Luftfluß und die Rührgeschwindigkeit in dem gerührten Kessel wurden mittels Computer gesteuert, um einen Pegel von aufgelöstem Sauerstoff bei etwa 80% der Luftsättigung zu erhalten.
    • Beispiel 4
  • Isolierung von A83543P und A83543W aus NRRL 18719 (A83543.6), fermentiert in Anwesenheit von Sinefungin
  • Fermentationsbrühe (190 l, hergestellt im wesentlichen wie in Beispiel 2B beschrieben (mit der Ausnahme, daß Stamm A83543.6 eingesetzt wurde), wurde zwei Tage vor der Verarbeitung gekühlt, Aceton (190 l) wurden zu der Gesamtbrühe zugesetzt, nachdem der pH auf 3,0 mit 5N HCl eingestellt worden war. Das erhaltene Gemisch wurde durch ein keramisches Filter filtriert, um Filtrat (335 l) zu erhalten, dies wurde über das Wochenende unter Kühlung gehalten. Das Filtrat von Brühe/Aceton wurde auf pH 10 mit 5N NaOH eingestellt und erneut durch das keramische Filter filtriert, bevor es auf eine Stahikolonne (10 1; 10 cm x 122 cm), welche HP-20ss Harz (Mitsubishi Chemical Industries, ltd., Japan) enthielt, mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 1 l/Minute aufgegeben wurde. Die Kolonne wurde mit CH&sub3;CN - CH&sub3;OH - 0,1% wäßrigem NH&sub4;OAc (eingestellt auf pH 8,1 mit NH&sub4;OH) (25:25:50; 20 l) gewaschen, dann mit CH&sub3;CN - CH&sub3;OH - 0,1% wäßrigem NH&sub4;OAc (eingestellt auf pH 8,1 mit NH&sub4;OH) (95:95:10; 40 l) eluiert, wobei Fraktionen von 2 l gesammelt wurden. Die Fraktionen 3 - 9 wurden zur Trockne eingeengt, in CH&sub3;OH (100 ml) wieder aufgelöst, erneut eingeengt, dann in CH&sub3;CN (1 l) ausgefällt. Der erhaltene Niederschlag wurde durch Filtration entfernt und verworfen; das Filtrat wurde zur Trockne eingeengt. Der erhaltene Rückstand wurde in Dichlormethan (25 ml) wieder aufgelöst und auf eine Säule (7,5 cm x 50 cm) von Kieselgel (EM Qualität 62, 60 - 200 mesh), das in Acetonitril ins Gleichgewicht gesetzt war, aufgegeben. Die Säule wurde mit CH&sub3;CN (4 l), dann mit CH&sub3;CN - CH&sub3;OH (9:1; 5 l), gefolgt von CH&sub3;OH (1 l) unter Auffangen von Fraktionen von 1 l eluiert. Die Auffangmenge 1 (Fraktionen 3 - 4) enthielt die A83543 Komponenten J und L; die Auffangmenge 3 (Fraktionen 7 - 10) die Komponenten M und N. Die Auffangmenge 2 (Fraktionen 5 - 6), welche die neuen Komponenten P und W enthielt, wurde zur Trockne eingeengt. Der erhaltene Niederschlag wurde in CH&sub3;OH (10 ml) aufgelöst und auf eine präparative Umkehrphasen-HPLC-Kolonne (Ramm Dynamax-60Å 8 µm C18, 41,4 mm ID x 25 cm mit 41,4 mm x 5 cm Sicherheitsmodul), ins Gleichgewicht gesetzt mit H&sub2;O - CH&sub3;OH - CH&sub3;CN; (30:35:35, enthaltend 0,1% NH&sub4;OAc) aufgebracht. Die Kolonne wurde mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 40 ml/Minute mit einem Gradienten, gemischt aus Lösungsmittel "A" H&sub2;O - CH&sub3;OH - CH&sub3;CN (30:35:35, enthaltend 0,1% NH&sub4;OAc) und Lösungsmittel "B" H&sub2;O - CH&sub3;OH - CH&sub3;CN; (10:45:45, enthaltend 0,1% NH&sub4;OAc) eluiert. Das Pumpensystem war programmiert, um einen linearen Gradienten von 25 bis 75% B in 60 Minuten zu erzeugen. Der Fortschritt der Trennung wurde mit einem UV-Detektor mit variabler Wellenlänge, der auf 250 nm eingestellt war, überwacht. Der Hauptpeak wurde in 6 x 3 Minuten Fraktionen aufgefangen. Die Fraktionen 1 - 2, welche die neue Komponente P enthielten, wurden auf 40 ml eingeengt, dann in derselben HPLC-Säule, welche mit H&sub2;O - CH&sub3;OH - CH&sub3;CN (30:35:35) ins Gleichgewicht gesetzt war, durch Elution mit einem 60 Minuten linearen Gradienten von H&sub2;O - CH&sub3;OH - CH&sub3;CN (30:35:35) bis H&sub2;O - CH&sub3;OH - CH&sub3;CN (10:45:45) entsalzt. Der UV-Absorptionspeak (minus der ersten 2 Minuten eluiert) wurde aufgefangen und zur Trockne eingeengt. Der erhaltene Rückstand wurde in t-BuOH (10 ml) aufgelöst und zum Erhalt der reinen Komponente P (479 mg) lyophilisiert. Die vereinigten Fraktionen 3 - 4 von zuvor, welche ein Gemisch von Komponente P und W enthielten, wurden auf 20 ml eingeengt und auf eine präparative Umkehrphasen-HPLC-Säule (Ramm Dynamax-60Å 8 µm C18, 21,4 mm ID x 25 cm mit 21,4 mm x 5 cm Sicherheitsmodul), welche in H&sub2;O - CH&sub3;OH - CH&sub3;CN (30:35:35) mit einem Gehalt von 0,1% NH&sub4;OAc ins Gleichgewicht gesetzt war, aufgegeben und mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 10 ml/Minute mit einem Gradienten, gemischt aus Lösungsmittel "A" H&sub2;O - CH&sub3;OH - CH&sub3;CN; (30:35:35), enthaltend 0,1 NH&sub4;OAc) und Lösungsmittel "B" H&sub2;O - CH&sub3;OH - CH&sub3;CN; (10:45:45, enthaltend 0,1% NH&sub4;OAc) eluiert. Das Pumpensystem wurde so programmiert, daß es einen linearen Gradienten von 25 bis 75% B in 60 Minuten erzeugte. Zwei hauptsächliche UV-Absorptionspeaks (Komponente P, gefolgt von Komponente W) wurden aufgefangen. Die die Komponente W enthaltende Auffangmenge wurde auf ein kleines Volumen konzentriert, dann auf derselben HPLC-Säule, welche in H&sub2;O - CH&sub3;OH - CH&sub3;CN (30:35:35) ins Gleichgewicht gesetzt war, entsalzt. Die Komponente W wurde mit einem 60 Minuten linearen Gradienten aus H&sub2;O - CH&sub3;OH - CH&sub3;CN (30:35:35) bis H&sub2;O - CHOH - CH&sub3;CN (10:45:45) bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 10 ml/Minute, Auffangen des UV absorbierenden Peaks in 10 x 3 Minuten Fraktionen eluiert. Die vereinigten Fraktionen 2 - 7 wurden bis zum Rückstand eingeengt, in t-BuOH erneut aufgelöst und lyophilisiert, um die reine Komponente W (82 mg) zu erhalten. Der die Komponente P enthaltende UV absorbierende Peak von zuvor wurde in derselben Weise entsalzt, um weitere reine Komponente P (132 mg) zu ergeben.
    • Beispiel 5
  • Isolierung von A83543U und A83543V aus Stamm NRRL 18823 (A83543.9), fermentiert in Anwesenheit von Sinefungin
  • Fermentationsbrühe (500 ml; 30 x 250 ml Schüttelflaschen), hergestellt im wesentlichen wie in Beispiel 2A beschrieben (mit der Ausnahme, daß Stamm A83543.9 verwendet wurde), wurde mit Methanol (1,3 l) unter Rühren für 1 Stunde extrahiert, dann unter Verwendung eines Filterhilfsstoffs (3% Hyflo)filtriert, um methanolisches Filtrat (1,5 l) zu erhalten. Die Biomasse wurde mit Methanol (700 ml) erneut extrahiert und filtriert. Die zwei methanolischen Extrakte wurden kombiniert und es wurde ein gleiches Volumen Wasser zugesetzt. HP-20 Harz (75 ml) wurde zugesetzt und für 2 Stunden gerührt, danach wurde die Aufschlämmung auf eine Glaschromatographiesäule gegossen. Die abfließende Flüssigkeit (5 l) wurde verworfen, ebenso eine CH&sub3;OH - H&sub2;O (1:1) Wäsche (500 ml) der Säule. Die Säule wurde dann mit Aceton (250 ml) eluiert. Das Acetoneluat wurde mit demjenigen, welches aus einer ähnlichen Extraktion und Chromatographie der Gesamtbrühe (500 ml; 40 x 250 ml Schüttelflaschen) erhalten worden war, kombiniert und zur Trockne eingeengt. Der erhaltene Rückstand wurde in Dichlormethan (10 ml) aufgelöst und auf eine Säule (2,5 cm x 25 cm) von Kieselgel (EM Qualität 62, 60 - 200 mesh), welche mit Acetonitril ins Gleichgewicht gesetzt worden war, aufgegeben. Die Säule wurde mit Acetonitril gewaschen, dann mit einem linearen Gradienten aus Acetonitril zu Acetonitril - Methanol (4:1) unter Auffangen von 25 ml Fraktionen eluiert. Die Fraktionen 34 - 43, welche die neuen A83543 Komponenten U und V enthielten, wurden vereinigt (200 ml), und zur Trockne eingeengt. Der Rückstand wurde in Methanol (2 ml) aufgelöst und auf eine präparative Umkehrphasen-HPLC-Säule (Ramm Dynamax-60Å 8 µm C18, 21,4 mm ID x 25 cm mit 21,4 mmx 5 cm Sicherheitsmodul), welche in H&sub2;O - CH&sub3;OH - CH&sub3;CN (30:35:35) mit einem Gehalt von 0,1% NH&sub4;OAc ins Gleichgewicht gesetzt war, aufgegeben. Die Säule wurde mit einem 60 Minuten linearen Gradienten aus H&sub2;O - CH&sub3;OH - CH&sub3;CN (30:35:35) mit einem Gehalt von 0,1% NH&sub4;OAc bis H&sub2;O - CH&sub3;OH - CH&sub3;CN (10:45:45) mit einem Gehalt von 0,1% NH&sub4;OAc bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 10 ml/Minute eluiert. Die Hauptpeaks (UV überwacht bei 250 nm), welche die neuen Komponenten U und V enthielten, wurden vor den restlichen Komponenten H und Q aufgefangen. Die die Komponente U enthaltende Sammelmenge wurde auf derselben HLPC-Säule, welche in H&sub2;O - CH&sub3;OH - CH&sub3;CN (30:35:35) ins Gleichgewicht gesetzt war, durch Eluieren mit einem linearen Gradienten von H&sub2;O - CH&sub3;OH - CH&sub3;CN (30:35:35) bis H&sub2;O - CH&sub3;OH - CH&sub3;CN (10:45:45) eluiert. Die Komponente U eluierte in 2 Minuten Fraktionen (10). Die Fraktionen 2 - 8 wurden vereinigt, dann zur Trockne eingeengt. Der Rückstand wurde in t-BuOH (5 ml) aufgelöst und lyophilisiert, um die reine Komponente U (71 mg) zu erhalten. Die die Komponente V enthaltende Sammelmenge wurde nach derselben Arbeitsweise entsalzt und lyophilisiert, um die reine Komponente V (7 mg) zu ergeben.
    • Beispiel 6
  • Isolierung von A83543K und A83543O aus NRRL 18538 (A83543.4), fermentiert in Anwesenheit von Sinefungin
  • Fermentationsbrühe (210 l) wurde hergestellt, im wesentlichen wie in Beispiel 28 beschrieben. Aceton wurde zu der Gesamtbrühe zugesetzt, und der pH wurde auf 8,0 eingestellt. Das erhaltene Gemisch wurde durch ein keramisches Filter filtriert, um Filtrat (370 l) zu erhalten. Das Brühe/Acetonfiltrat wurde auf eine Stahlsäule (10 l, 10 cm x 122 cm), welche HP-20ss Harz (Mitsubishi Chemical Industries, Ltd., Japan) enthielt, mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 1 l/Minute aufgegeben, wobei die austretende Flüssigkeit in einer einzigen Auffangmenge gesammelt wurde. Die Säule wurde mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 1 l/Minute mit einem Gradienten, gemischt aus Lösungsmittel "A" (0,1% NH&sub4;OAC) und Lösungsmittel "B" (CH&sub3;OH - CH&sub3;CN; 1:1) eluiert. Das Pumpensystem wurde so programmiert, daß 50% B für 2 Minuten angeliefert wurden, gefolgt von einem linearen Gradienten von 50 - 80% B (45 Minuten)&sub1; gefolgt von einem linearen Gradienten von 80 - 90% B (33 Minuten), Auffangen von 20 x 4 l Fraktionen. Die Fraktionen 13 - 17, welche die Komponenten K und enthielten, wurden vereinigt. Die aus der Säule ausfließende Flüssigkeit (siehe oben) wurde auf pH 9,5 mit 5N NaOH eingestellt und erneut auf die HP-20ss-Säule aufgegeben. Das Pumpensystem wurde so programmiert, daß 50% B für 1 Minute, ein linearer Gradient von 50 - 75% B (30 Minuten), ein linearer Gradient von 75 - 85% B (45 Minuten, ein linearer Gradient von 85 - 88% B (15,4 Minuten) und ein linearer Gradient von 88 - 100% B (20 Minuten) bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 1 l/Minute angeliefert wurden, wobei 22 x 4 l Fraktionen aufgefangen wurden. Die Fraktionen 7 - 17 wurden zusammengegeben und mit der Auffangmenge (Fraktionen 13 - 17 aus der ersten Chromatographie mit HP-20ss (siehe oben) vereinigt. Die vereinigten Auffangmengen wurden auf 4 l eingeengt, dann weiter zur Trockne eingeengt, in CH&sub3;OH (100 ml) erneut aufgelöst, dann in CH&sub3;CN (3 l) ausgefällt. Der erhaltene Niederschlag wurde durch Futration entfernt, mit CH&sub3;CN gewaschen und verworfen; das Filtrat wurde zur Trockne eingeengt. Der erhaltene Rückstand wurde in Dichlormethan (50 ml) erneut aufgelöst und auf eine Säule (6 cm x 24 cm) von Kieselgel (EM Qualität 62, 60 - 200 mesh), das mit Acetonitril ins Gleichgewicht gesetzt war, aufgegeben. Die Säule wurde mit CH&sub3;CN (4 l), dann CH&sub3;CN - CH&sub3;OH (9:1; 10 l) unter Auffangen von 10 x 250 ml Fraktionen und anschließend 7 x 1 l Fraktionen eluiert. Die Fraktionen 6 - 15, welche die Komponenten K und 0 enthielten, wurden zur Trockne eingeengt. Der erhaltene Rückstand wurde in CH&sub3;OH (100 ml) aufgelöst und (in 20 Durchläufen) auf eine präparative Umkehrphasen-HPLC-Säule (Ramm Dynamax-60Å 8 µm C18, 41,4 mm ID x 25 cm mit 41,4 mm x 5 cm Sicherheitsmodul), welche in H&sub2;O - CH&sub3;OH - CH&sub3;CN; (50:175:175, enthaltend 0,1% NH&sub4;OAc) ins Gleichgewicht gesetzt war, aufgegeben. Die Säule wurde mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 40 ml/Minute eluiert. Der Fortschritt der Trennung wurde mit einem UV-Detektor mit variabler Wellenlänge, der auf 250 nm eingestellt war, überwacht. UV absorbierende Peaks (aus den 20 chromatographischen Durchläufen) wurden in sieben Auffangmengen gesammelt. Die zwei größten Peaks entsprachen den Komponenten K und O. Die Auffangmenge 3 (6 l) enthielt die Komponente K (98% rein). Die Auffangmenge 4 (8 l), welche die Komponenten O und K enthielt, wurde auf 200 ml konzentriert und erneut (in 4 Durchläufen) unter denselben Bedingungen chromatographiert, wobei die zwei Peaks als zwei Auffangmengen gesammelt wurden. Die Auffangmenge 1 (3 l) enthielt die Komponente K (98% rein). Die Auffangmenge 2 (5 l) enthielt die Komponente O (95%) und die Komponente K (5%). Die Auffangmenge 2 wurde auf 100 ml konzentriert und durch Chromatographie auf derselben HPLC-Säule (in 3 Durchläufen) entsalzt, wobei mit einem 60 Minuten linearen Gradienten von H&sub2;O - CH&sub3; OH - CH&sub3;CN (30:35:35) bis H&sub2;O - CH&sub3;OH - CH&sub3;CN (10:45:45) eluiert wurde. Das UV absorbierende Eluat wurde in 10 x 3 Minuten Fraktionen gesammelt. Fraktionen, welche > 98% reine Komponente O enthielten, wurden zusammengefaßt, zur Trockne eingeengt und aus t-BuOH lyophilisiert, um die Komponente O (2,5 g; > 98% rein) zu erhalten. Komponente K enthaltende Auffangmengen aus der ersten präparativen HPLC-Trennung (Auffangmenge 3, 6 l) und die erneute Reinigung von Komponente O (Auffangmenge 1, 3 l) wurden kombiniert, auf 200 ml eingeengt und in derselben Weise wie Komponente O entsalzt. Fraktionen, welche > 98% reine Komponente K enthielten, wurden zusammengegeben, zur Trockne eingeengt und aus t-BuOH lyophilisiert, um Komponente K (11,1 g; > 99% rein) zu ergeben.
    • Beispiel 7 Isolierung von A83543K, A83543O und A83543Y aus Stamm NRRL 18743 (A83543.8)
  • Fermentationsbrühe (260 l) wurde hergestellt, im wesentlichen wie in Beispiel 38 beschrieben. Aceton (260 l) wurden zu der Gesamtbrühe nach Einstellung des pH auf 3,0 mit 5N HCl zugesetzt. Das erhaltene Gemisch wurde durch ein keramisches Filter filtriert, um Filtrat (480 l) zu ergeben, das über das Wochenende gekühlt aufbewahrt wurde. Das Brühe/Acetonfiltrat wurde auf pH 12 mit 25%iger NaOH eingestellt und zweimal durch das keramische Filter erneut filtriert, bevor es auf eine Stahlsäule (10 l, 10 cm x 122 cm), welche HP-20ss Harz (Mitsubishi Chemical Industries, Ltd., Japan) enthielt, mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 0,5 l/Minute aufgegeben wurde. Die Säule wurde mit CH&sub3;CN - CH&sub3;OH - 0,15% wäßrigem NH&sub4;OAc (eingestellt auf pH 8,1 mit NH&sub4;OH) (25:25:50; 20 l) gewaschen. Die neuen Komponenten K, O und Y wurden mit CH&sub3;CN - CH&sub3;OH - 0,1%gem wäßrigem NH&sub4;OAc (eingestellt auf pH 8,1 mit NH&sub4;OH) (95:95:10; 30 l) bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 1 l/Minute eluiert. Das Eluat (30 l) wurde konzentriert, in CH&sub3;OH erneut aufgelöst, erneut zur Trockne eingeengt, erneut in CH&sub3;OH (100 ml) aufgelöst, dann in CH&sub3;CN (2 l) ausgefällt. Der erhaltene Niederschlag wurde durch Filtration entfernt, mit CH&sub3;CN gewaschen und verworfen; das vereinigte Filtrat und die Waschflüssigkeit (3 l) wurden zur Trockne eingeengt. Der erhaltene Rückstand wurde in Dichlormethan (50 ml) erneut aufgelöst und auf eine Säule (7,5 cm x 50 cm) von Kieselgel (EM Qualität 62, 60 - 200 mesh), welche in Acetonitril ins Gleichgewicht gesetzt war, aufgegeben. Die Säule wurde mit CH&sub3;CN (10 l), dann CH&sub3;OH (9:1; 20 l) gefolgt von CH&sub3;CN - CH&sub3;OH (8:2; 10 l) unter Auffangen von 1 l Fraktionen eluiert. Die Fraktionen 11 - 30 wurden zusammengegeben und zur Trockne eingeengt. Der erhaltene Rückstand wurde in CH&sub3;OH (50 ml) erneut aufgelöst und (in 10 Durchläufen) auf eine präparative Umkehrphasen-HPLC-Säule (Ramm Dynamax-60Å 8 µm C18, 41,4 mm ID x 25 cm mit 41,4 mm x 5 cm Sicherheitsmodul), welche in H&sub2;O - CH&sub3;OH - CH&sub3;CN; (50:175:175, enthaltend 0,1% NH&sub4;OAc) ins Gleichgewicht gesetzt war, aufgegeben. Die Säule wurde bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 40 ml/Minute mit einem 60 Minuten linearen Gradienten aus H&sub2;O - CH&sub3;OH - CH&sub3;CN; 50:175:175, enthaltend 0,1% NH&sub4;OAc) bis H&sub2;O - CH&sub3;OH - CH&sub3;CN; (10:45:45, enthaltend 0,1% NH&sub4;OAc) eluiert. Der Fortschritt der Trennung wurde mit einem UV-Detektor mit variabler Wellenlänge, der auf 250 nm eingestellt war, überwacht. Die ersten drei gesammelten Peaks (10 zusammengefaßte Durchläufe) entsprechen der Elution der kleineren Komponente Y (Auffangmenge 1,1 l), der Komponente K (Auffangmenge 2, 8 l) und der Komponente O (Auffangmenge 3, 4 l). Die Auffangmenge 2 wurde auf ein kleines Volumen konzentriert, dann durch erneute Chromatographie auf derselben Säule und Elution ohne Puffer entsalzt. Die austretende Flüssigkeit, welche dem UV-Absorptionspeak entsprach, wurde zur Trockne eingeengt, in t-BuOH aufgelöst und lyophilisiert, um reine Komponente K (7,3 g) zu ergeben. Die Auffangmenge 3 wurde in derselben Weise entsalzt und lyophilisiert, um reine Komponente O (1,4 g) zu erhalten. Die Auffangmenge 1 wurde durch eine ähnliche Chromatographie (Ramm Dynamax-60Å 8 µm C18 Säule, 21,4 mm ID x 25 cm mit 21,4 mm x 5 cm Sicherheitsmodul) entsalzt und in derselben Weise lyophilisiert, um reine Komponente Y (46 mg) zu ergeben.
    • Beispiel 8 A83543K Pseudoaglycon
  • Eine Probe von A83543K (100 mg) wurde in 2N Schwefelsäure (10 ml) aufgelöst. Diese Lösung wurde auf etwa 80ºC für 1,25 Stunden erhitzt, und das erhaltene Gemisch wurde auf Zimmertemperatur abkühlen gelassen. Der Niederschlag wurde durch Filtration gesammelt, mit kaltem entionisiertem Wasser gewaschen und getrocknet, um 59 mg A83543K Pseudoaglycon zu erhalten.
    • Elementaranalyse
  • MS (FD) : m/z 576 (100%)
  • IR (CHCl&sub3;) : 2936,0, 1714,9, 1659,0 cm&supmin;¹
  • UV (EtOH): λmax 243 nm
    • Beispiel 9 A83543O Pseudoaglycon
  • Eine Probe von A83543O (500 mg) wurde in entionisiertem Wasser (40 ml) suspendiert, und es wurde ein ausreichendes Volumen von 1N H&sub2;SO&sub4; zugesetzt, um vollständige Auflösung herbeizuführen (annähernd 0,25 ml). Die erhaltene Lösung wurde auf etwa 80ºC für 3 Stunden erhitzt und dann auf Zimmertemperatur abkühlen gelassen. Der Niederschlag wurde durch Filtration gesammelt, mit kaltem entionisiertem Wasser gewaschen und getrocknet. Das Filtrat wurde mit NaCl gesättigt und mit Methylenchlorid extrahiert. Die Methylenchlondextrakte wurden kombiniert, mit Salzlösung extrahiert, getrocknet (K&sub2;CO&sub3;) und zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wurde mit dem Niederschlag kombiniert, um 348 mg rohes Produkt zu erhalten.
  • Das rohe Produkt wurde durch Schnellchromatographie (Kieselgel 60, 230-400 mesh), Eluieren mit einer Mischung von Ethylacetat und Hexan (7:3) gereinigt. Die das gewünschte Produkte enthaltenden Fraktionen wurden zur Trockne eingedampft, um 146,5 mg A83543O Pseudoaglycon zu erhalten.
    • Elementaranalyse
  • MS (FD) : m/z 590 (100%), 591 (70%, M+), 592 (20% M+H) 593 (5%, M+2)
  • IR (CHCl&sub3;) : 3014,2, 2932,2, 1714,9, 1659,0 cm&supmin;¹
  • UV (EtOH) : λmax 242 nm (ε 9.185)
    • Beispiel 10 N-Demethyl-A83543K
  • A83543K (101,5 mg, 0,14 trimol) und Natriumacetattrihydrat (142,4 mg, 1,05 mmol) wurden zu einer Mischung von Methanol und einer pH 9 Pufferlösung (Fisher Scientific, Lexington, MA) zugesetzt. Die erhaltene Suspension wurde auf etwa 47ºC erhitzt und dann wurde Jod (47,7 mg, 0,19 mMol) in einer Portion zugesetzt. Nach 2-1/2 Stunden bei 47ºC wurde das Reaktionsgemisch auf Zimmertemperatur abkühlen gelassen. Nach Rühren für weitere 3 Stunden bei Zimmertemperatur wurde die Reaktionslösung zu einer 5%igen Natriumthiosulfatlösung zugesetzt. Die erhaltene farblose wäßrige Mischung wurde mit Diethylether extrahiert. Die wäßrige Schicht wurde dann mit NaCl gesättigt und mit Methylenchlorid extrahiert. Die Methylenchloridextrakte wurden mit den Diethyletherextrakten vereinigt, mit Salzlösung gewaschen und über K&sub2;CO&sub3; getrocknet. Die getrocknete Lösung wurde dann zur Trockne im Vakuum eingedampft, um 79,3 mg N-Demethyl-A83543K als weißes Glas (81% Ausbeute) zu erhalten.
  • MS (FD) : m/z 703 (100%, M+), 704 (57%, M+H), 705 (19%, M+2)
  • Elementaranalyse (C&sub3;&sub9;H&sub6;&sub1;NO&sub1;&sub0;):
  • ber. C, 66,55; H, 8,73; N, 1,99
  • gef.: C, 64,80; H, 8,67; N, 1,95
  • IR (KBr) : 3462,7, 2934,1, 1721,7, 1660,9, 1457,4 cm&supmin;¹.
    • Beispiel 11 Di-N-demethyl-A83543K
  • Eine Lösung N-Demethyl-A83543K (891 mg, 1,27 mmol) in MeOH (40 ml) wurde auf 3ºC abgekühlt. Frisch hergestellte 1M NaOME in Methanol (6,3 ml, 6,3 mmol) und Jod (1,61 g, 6,3 mmol) wurden sukzessiv zu dieser Lösung zugegeben. Die Reaktionslösung wurde auf 3ºC für 5 Stunden gehalten, dann wurde zu einer 5%igen Natriumthiosulfat/verdünnten Ammoniumhydroxidlösung zugesetzt. Das erhaltene Gemisch wurde mit Ethylacetat extrahiert. Die vereinigten Ethylacetatextrakte wurden mit Salzlösung gewaschen und über K&sub2;CO&sub3; getrocknet. Die getrocknete Lösung wurde zur Trockne im Vakuum eingedampft, um 770 mg rohes Produkt zu erhalten.
  • Die gewünschte Verbindung wurde partiell durch Schnellchromatographie (Kieselgel 60, 230-400 mesh, 2 Zoll x 8 Zoll), Eluieren mit einer Mischung von Methylenchlorid und Methanol (93:7) gereinigt. Die gewünschte Verbindung wurde weiter durch Umkehrphasen-HPLC (Waters Prep NOVA- Pak, ODS, 60Å, 40 mm x 300 mm), Eluieren mit Methanol/Acetonitril/0,25% Ammoniumacetat (40:40:20) gereinigt, wobei 463,6 mg (53% Ausbeute) an Di-N-demethyl-A83543K als farbloses Glas erhalten wurden.
  • Elementaranalyse (C&sub3;&sub8;H&sub5;&sub9;,NO&sub1;&sub0;):
  • ber. : C, 66,16; H, 8,62; N, 2,03;
  • gef. : C, 66,29; H, 8,63; N, 2,02,
  • MS (FD) : m/z 690 (100%, M+) , 689 (70%) , 691 (59%, M+H) 704 (20%)
  • UV (EtOH): λmax 244 nm (ε 10.328)
  • IR (CHCl&sub3;) : 3700, 3600, 3550-3350 (br), 3420, 2975, 1700, 1675, 1620 cm&supmin;¹

Claims (10)

1. Verbindung der Formel 1:
worin R&sup7; Wasserstoff oder eine Gruppe der Formel ist:
R&sup8;, R&sup9;, R¹&sup0;, R¹¹ und R¹² unabhängig voneinander Wasserstoff oder Methyl sind, vorausgesetzt, daß R¹¹ und R¹² nicht gleichzeitig Wasserstoff sind, oder ein Säureadditionssalz hiervon, wenn R&sup7; von Wasserstoff verschieden ist.
2. Verbindung nach Anspruch 1, worin R&sup7; eine Gruppe der Formel ist:
3. Verbindung nach Anspruch 2, worin R&sup7; eine Gruppe der Formel ist:
4. Verbindung nach Anspruch 3, worin R&sup8; Methyl ist.
5. Verbindung nach Anspruch 1, worin R&sup7; Wasserstoff ist.
6. Verbindung nach Anspruch 1, worin R&sup7;, R&sup8;, R&sup9;, R¹&sup0;, R¹¹ und R¹² für jede Komponente wie folgt sind:
7. Insektizid- oder Mitizidzusammensetzung, umfassend eine Insekten oder Mitizide inaktivierende Menge einer Verbindung nach Anspruch 2 in Kombination mit einem phytologisch annehmbaren Träger.
8. Insektizid- oder Mitizidverfahren, welches den Auftrag einer Insekten oder Mitizide inaktivierende Menge einer Verbindung nach Anspruch 2 auf den Ort eines Insekts oder einer Milbe umfaßt.
9. Ektoparasitäre Zusammensetzung, umfassend einen physiologisch annehmbaren inerten Träger und eine Verbindung nach Anspruch 2.
10. Biologisch reine Kultur von Saccharopolyspora spinosa NRRL 18743 oder eine A83543K-produzierende Mutante hiervon.
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