FI107266B - Uusia A83543-yhdisteitä ja menetelmä niiden valmistamiseksi - Google Patents

Description

107266

Uusia A83543-yhdisteitä ja menetelmä niiden valmistamiseksi

Keksinnön kenttä 5 Tämä keksintö koskee fermentointituotteen A83543 uusia komponentteja.

Keksinnön tausta

Kohteina olevat hyönteiset ovat kehittämässä nopeasti vastustuskykyä nykyisin saatavissa oleville insekti-10 sideille. Insektisidiresistenssi on yleistä niveljalkaisilla; vähintään 400 lajilla on resistenssi yhdelle tai useammalle insektisidille. Resistenssin kehittyminen vanhemmille insektisideille, kuten DDT:lie, karbamaateille ja organofosfaateille, on hyvin dokumentoitua [katso Bratts-15 ten et ai., Science 231 (1986) 1255]. Resistenssi synteettisille insektisideille on kehittynyt äärimmäisen nopeasti, mukaan luettuna resistenssin kehittyminen uudemmille pyretroidi-insektisideille [katso Pickett, Chem. Britain (1988) 137]. Siksi tarvitaan uusia insektisidejä.

20 Fermentointituote A82543, ryhmä Saccharopolyspora spinosan tuottamia sukulaisyhdisteitä, on löydetty vähän . aikaa sitten ja sillä on osoitettu olevan erinomainen in- ··· sektisidinen aktiivisuus. A83543 ja sen yksittäiset yhdis-

MM

teet ovat käyttökelpoisia punkkien ja hyönteisten, erityi- • · 25 sesti Lepidoptera- ja Diptera-lajien, torjunnassa.

: .·. "A82543-yhdisteillä" tarkoitetaan komponentteja, • · · [V·/ jotka koostuvat trisyklisestä 5,6,5-rengasjärjestelmästä, ♦ ♦ ♦ * joka on fuusioitunut 12-jäsenisen makrosyklisen laktonin, neutraalin sokerin ja aminosokerin kanssa [katso Kirst et * 30 ai., Tetrahedron Letters 32 (1991) 4839]. Luonnon A83543- * · · -1...· komponenttien ryhmään kuuluu suku, joka esitetään EP-hake- .:. musjulkaisussa 0 375 316 ja jolla on seuraava yleinen kaa- « ♦ · · -,·2. va: • · I 1 » » • · 9 • · « · · • · • · 2 • » · 107266 2 OR5 — , ^---3 OR1 O OCH3 5 / 'OR6 J ν-ι·Λ° r o ° c^y~\\ r4ci^ *0 ^aY\_/ΠΓ H - \ a Η \ Ά R3 10 jossa R1 on H tai jokin seuraavista ryhmistä: CH3 \H3 n (CH3)NE-W\ 0 , (ch3)2n->J^o ^ (a) ^ (b) ch3 Η2Ν“^ί-^Γ 20 (c) ^ (d) CH3 » • · ja kukin ryhmistä R2, R4, R3, R5 vetyatomi tai metyyliryhmä; ...: tai sen happoadditiosuola, jos R1 on muu kuin vetyatomi.

< 1 ·.**: Fermentointituotteesta A83543 peräisin olevan yx- 25 disteryhmän on osoitettu käsittävän yksittäisiä komponentti*: teja A83543A, A83543B, A83543C, A83543D, A83543E, A83543F, A83543G, A83543H ja A83543J (katso EP-julkaisu 0 375 316); *

yksittäisiä komponentteja A83543L, A83543M ja A83543N

(katso US-patenttijulkaisu 5 202 242, julkaistu 13. huhti- • · e···, 30 kuuta 1993); ja yksittäisiä komponentteja A83543 2, *!’ A83543R, A83543S ja A83543T [katso Turnerin, Broughtonix,

Huberin ja Myndersen avoinna oleva yhdysvaltalainen rix- : nakkaishakemus, jonka otsikko on New A83543 Compounds ja *·, Processes for Production Thereof [US-patenttihakemus sar- • · * I” 35 janumero 07/073 121) ja joka on jätetty 6. marraskuuta • · « 3 107266 1992]. Näiden yksittäisten komponenttien ja niistä johdettujen pseudoaglykonien rakenteet esitetään seuraavassa.

_ o»1 OR3 ch3 O I / /X >r2 0 —01:8 3 / Γ~ 10 r4cBj 0 · “ H N .

CH3 CHl m n (CH3)HH- XO (CH3)2M-· \ ; £ δ (b) (a) ct3 20 H2„_A O ICH3>2H—~ - v°^ .··' ^ ch3 · <d (d> 25 joissa ryhmät R1, R2, R3, R4, R5 ja R6 ovat kussakin kompo- • nentissa seuraavat: • · · · • ♦ · • · · • ♦ « • · • « • 1·» « · · · · • · · · » · 107266 4 A83543-komponenttien rakenteet Komponentti R1 R2 R3 R4 r5 R6 A (a) Me H Me Me Me B (b) Me H Me Me Me 5 C (c) Me H Me Me Me D (a) Me Me Me Me Me E (a) Me H H Me Me F (a) H H Me Me Me G (d) Me H Me Me Me 10 H (a) Me H Me H Me

j (a) Me H Me Me H

L (a) Me H Me Me H

M (b) Me H Me Me H

N (b) Me Me Me Me H

15 Q (a) Me Me Me H Me r (b) Me H Me H Me S (a) Me H H H Me

T (a) Me H Me H H

PsaAl H Me H Me Me Me 20 PsaDl H Me Me Me Me Me

PsaEl H Me H H Me Me . PsaFl H H H Me Me Me i < « . . PsaHl H Me H Me H Me

PsaJl H Me H Me Me H

25 PsaLl H Me Me Me Me H

I"! PsaQl H Me Me Me H Me • · ·

PsaRl H Me H Me H Me :·’ ’ PsaSl H Me H H H Me

PsaTl H Me H Me H H

« 30 • « «

Sinefungiinin, joka on mikrobiperäinen antibiootti, on osoitettu inhiboivan määrättyjä S-adenosyylimetionii-.···. nista riippuvaisia me tyyli transfer aaseja. Tämä yhdiste inhiboi tehokkaasti seuraavia nisäkkäiden metyylitransfe-35 raaseja: norepinefriini-N-metyylitransferaasi, histamiini- 107266 5 N-metyylitransferääsi ja katekoli-O-metyylitransferääsi [katso Fuller ja Nagarajan, Biochemical Pharmacology 27 (1978) 1981]. Sinefungiini inhiboi tehokkaasti myös S-ade-nosyylimetioniinistä riippuvaista O-metyylitransferaasia 5 avermektiinia tuottavissa Streptomyces avermitilis -kannoissa [katso Schulman et ai., 3. Antibiotics 38 (1985) 1494]. Myöhemmin sinefungiinin on ilmoitettu olevan tehokas erään S-adenosyylimetioniinista riippuvaisen O-metyy-litransferaasin (makrosiini-O-metyylitransferaasin) inhi- 10 boinnissa Streptomyces fradiaessa [katso Kreuzman et ai., 3. Biological Chemistry 263 (1988) 15626]. Tässä esitetään yksi menetelmä sinefungiinin käyttämiseksi O-metyylitrans-feraasin inhibointiin S. spinosa -kannoissa.

Yhteenveto keksinnöstä 15 Tämä keksintö koskee uutta yhdisteryhmän A83543 alaryhmää, joka mainittu alaryhmä sisältää yhdisteitä, joilla on kaava 1, 20 R7” a Rll°

L· R« I

j: . -

·:· 25 r10ch2 0 H *H

:**: H ^ R9 « · · • · · ♦ ·· · • · · • · · • · · jossa R7 on vetyatomi tai ryhmä, jolla on kaava, • « 30 .* : ch3 ··· ch3 \ , (a) ' ib' ::: 35 « • · • < 107266 6 H2H-tCH3)2H- \ ^ tai λ,^-" Ο ζ c a I » 5 CH3 (c) (d) ja kukin ryhmistä R8, R9, R10, R11 ja R12 on riippumattomasti vetyatomi tai metyyliryhmä sillä edellytyksellä, etteivät 10 ryhmät R11 ja R12 ole samanaikaisesti vetyatomeja; tai niiden happoadditiosuola, kun R7 on muu kuin vetyatomi.

Tämä keksintö koskee erityisesti fermentointituot-teen A83543 uusia komponentteja. Näillä uusilla komponenteilla, joita kutsutaan kaavan 2 mukaisiksi yhdisteiksi, 15 on seuraava yleinen kaava: - ,u Rl7° γη,

' o -0H

Rl6CH2 0 — /'H

. 2 h k

Ri5 :\i (2) ·: 25 «*·· : jossa R13 on ryhmä, jolla on kaava, • · · · ch3 ca3 \ a ( ch3 ) 2H —0. --^__/ *:*♦: —-Λ > » ... 30 (b) (a) φ·« • · < < ch3 : , ::: 35 —2 tai F ä $ ch3 (C) (d) 107266 7 ja kukin ryhmistä R14, R15, R16, R17 ja R18 on riippumattomasti vetyatomi tai metyyliryhmä sillä edellytyksellä, etteivät ryhmät R17 ja R18 ole samanaikaisesti vetyatomeja; tai niiden happoadditiosuola, kun R1 on muu kuin vetyatomi.

5 Keksintö koskee edullisesti uusia A83543-komponent- teja, kaavan 2 mukaisia komponentteja, joista käytetään merkintöjä A83543K, A835430, A83543P, A83543U, A83543V, A83543W ja A83543Y ja joissa ryhmät R13, R14, R15, R16, R17 ja R18 ovat kussakin komponentissa seuraavat: 10

Komponentti R13 R14 R15 R16 R17 R18 K (a) CH3 H ch3 ch3 ch3 O (a) CH3 CH3 CH3 CH3 CH3

P (a) CH3 H CH3 CH3 H

15 U (a) CH3 H CH3 H CH3 V (a) CH3 CH3 CH3 H CH3

W (a) CH3 CH3 CH3 CH3 H

Y (a) ch3 h h ch3 ch3 20 Tämän keksinnön yhtenä toisena puolena on menetelmä kaavan 1 mukaisen yhdisteen valmistamiseksi, joka käsittää kantojen NRRL 18395 (A83543.1), NRRL 18537 (A83543.3), NRRL 18538 (A83543.4), NRRL 18539 (A83543.5), NRRL 18719 (A83543.6) ja NRRL 18823 (A83543.9) joukosta valittavan S. 25 spinosa -kannan tai sen kaavan 1 mukaista yhdistettä tuot-tavan mutanttikannan viljelemisen sopivassa kasvualustas- • · · *“.* sa, joka sisältää noin 50 - 200 pg/ml sinefungiinia, pin- • · · *·* * nanalaisissa aerobisissa olosuhteissa, kunnes syntyy tal teen otettavissa oleva määrä kaavan 1 mukaista yhdistettä.

***** 30 Kaavan 1 mukainen yhdiste uutetaan fermentointiliemestä ja • · · myseelistä polaarisilla orgaanisilla liuotteilla. Yhdiste .:. voidaan jatkopuhdistaa alalla hyvin tunnetuin menetelmin, • * · · -.···. kuten pylväskromatografiällä.

Tämän keksinnön yhtenä lisäpuolena on vielä mene-**.:.* 35 telmä kaavan 1 mukaisen yhdisteen valmistamiseksi, joka • · • » · 107266 8 käsittää S. spinosa -kannan NRRL 18743 (A83543.8) tai san A83543K:ta tuottavan mutantin viljelemisen sopivassa kasvualustassa pinnanalaisissa aerobisissa olosuhteissa, kunnes syntyy talteen otettavissa oleva määrä kaavan 1 m> 5 kaista yhdistettä. Kaavan 1 mukainen yhdiste voidaan eristää ja puhdistaa tässä kuvattavalla tavalla.

Koska kanta NRRL 18743 on uusi löydetty kanta, tämä keksintö koskee lisäksi tämän mikro-organismin biologisesti puhdistettua viljelmää.

10 Kaavan 2 mukaiset yhdisteet ovat käyttökelpoisia punkkien ja hyönteisten, erityisesti Lepidoptera-, Homop-tera- ja Diptera-lajien, torjuntaan. Siksi insektisidisot ja mitisidiset koostumukset ja menetelmät hyönteis- ja punkkipopulaatioiden pienentämiseksi käyttämällä näi"ä 15 yhdisteitä ovat myös osa tätä keksintöä.

Piirustusten kuvaus

Kuvio 1 esittää A83543K:n infrapuna-absorptiospekt-riä KBr:ssa.

Kuvio 2 esittää A83543K:n ydinmagneettista reso-20 nanssispektriä asetoni-d6: ssa.

Kuvio 3 esittää A83543K:n UV-spektriä EtOH:ssa.

. Kuvio 4 esittää Α83543θ:η infrapuna-absorptiospekt;- riä KBr:ssa.

Kuvio 5 esittää A835430:n ydinmagneettista reso- 25 nanssispektriä asetoni-d6:ssa.

Kuvio 6 esittää A835430:n UV-spektriä EtOH:ssa.

♦ * * *”.* Kuvio 7 esittää A83543P:n infrapuna-absorptiospekt- • » · *·* * riä KBr: ssa.

Kuvio 8 esittää A83543P:n ydinmagneettista resc- : 30 nanssispektriä asetoni-d6:ssa.

• · ·

Kuvio 9 esittää A83543P:n UV-spektriä EtOHjssa.

Kuvio 10 esittää A83543U:n infrapuna-absorptiospek-.··«. triä KBr:ssa.

Kuvio 11 esittää A83543U:n ydinmagneettista reso-35 nanssispektriä asetoni-d6:ssa.

• · · « · • 0 • · · 107266 9 A83543U EtOH:ssa.

Kuvio 13 esittää A83543V:n infrapuna-absorptiospek-triä KBr:ssa.

Kuvio 14 esittää A83543V:n ydinmagneettista reso-5 nanssispektriä asetoni-d6:ssa.

Kuvio 15 esittää A83543V:n UV-spektriä EtOH:ssa. Kuvio 16 esittää A83543W:n infrapuna-absorptiospek-triä KBrissa.

Kuvio 17 esittää A83543W:n ydinmagneettista reso-10 nanssispektriä asetoni-d6:ssa.

Kuvio 18 esittää A83543W:n UV-spektriä EtOH:ssa. Kuvio 19 esittää A83543Y:n infrapuna-absorptiospek-triä KBr:ssa.

Kuvio 20 esittää A83543Y:n ydinmagneettista reso-15 nanssispektriä asetoni-d6: ssa.

Kuvio 21 esittää A83543Y:n UV-spektriä EtOH:ssa. Kuvio 22 esittää kantojen A83543.1, A83543.3, A83543.4, A83543.5, A83543.6, A83543.7, A83543.8 ja A83543.9 rasvahappoanalyysien pääkomponenttidiagrammia.

20 jossa R7 on vety tai ryhmä, jolla on kaava, C&3 , <ch3}2h—(ch3)nh— ·;· 25 1 i‘;:: (a) (b) «·· · ·«· • · · • · · m3 . H2N—(ch3)2h- ·;"· 30 ^^ tai Γ ···1 ch3 *** (0 _«·· (d) :]1]: ja kukin ryhmistä R8, R9, R10, R11 ja R12 on riippumattomasti ]·, vetyatomi tai metyyliryhmä sillä edellytyksellä, etteivät • · » • · · · · « · « · 107266 10 ryhmät H11 ja R12 ole samanaikaisesti vetyatomeja; tai niiden happoadditiosuola, kun R7 on muu kuin vetyatomi.

Tämän keksinnön yhtenä edullisena puolena ovat kaavan 1 mukaiset yhdisteet, joissa R8 ja R10 ovat metyylirjh-5 miä. Tämän keksinnön yhtenä edullisempana puolena ovat kaavan 1 mukaiset yhdisteet, joissa R8 ja R10 ovat metyyli-ryhmiä ja R7 on ryhmä, jolla on kaava.

CH3 10 \ n tCH3 2M- •s Tämän keksinnön yhtenä muuna puolena ovat fermen-tointituotteen A83543 uudet komponentit. Näillä uusilla 15 A83543-komponenteilla, joita kutsutaan kaavan 2 mukaisiksi yhdisteiksi, on seuraava kemiallinen rakenne:

Ri3p· r17q rU I /H3 20 fi H _ s ^ p -oRie

RlfiCH, 0 : 2 a -\ • · r15 ..‘S 25 (2) • · • · « • ♦ ♦ ··♦ ♦ ;*j*j jossa R13 on ryhmä, jolla on kaava, CH3 CH3 \ .···. 30 ^ a (a) (b) * « · « ♦ CH3 ::i? 35 , 1CB3,3““><\ > CH3 107266 11 ja kukin ryhmistä R14, R15, R16, R17 ja R18 on riippumattomasti vetyatomi tai metyyliryhmä sillä edellytyksellä, etteivät ryhmät R17 ja R18 ole samanaikaisesti vetyatomeja; tai niiden happoadditiosuola, kun R13 on muu kuin vetyatomi.

5 Tämän keksinnön yhtenä edullisempana puolena ovat kaavan 2 mukaiset yhdisteet, joissa R14 on CH3 ja R13 on ryhmä, jolla on kaava.

CH3 10 i CH3 ) 2»- $ Tämä keksintö koskee edullisesti uusia A83543-kom-ponentteja, kaavan 2 mukaisia yhdisteitä, joista käytetään 15 merkintöjä A83543K, A835430, A83543P, A83543U, A83543V, A83543W ja A83543Y ja joissa ryhmät R13, R14, R15, R16, R17 ja R18 ovat kussakin yksittäisessä uudessa komponentissa seu-raavat: 20 Komponentti R13 R14 R15 R16 R17 R18 K (a) CH3 H ch3 ch3 ch3 O (a) CH3 ch3 ch3 ch3 ch3

P (a) CH3 H CH3 CH3 H

\‘·· u (a) ch3 h ch3 h ch3 25 v (a) ch3 ch3 ch3 h ch3 I.:’: W (a) ch3 ch3 ch3 ch3 h :T: y (a) ch3 h h ch3 ch3 Näiden uusien komponenttien kemialliset rakenteet .···. 30 on määritetty spektrometrisin menetelmin, mukaan luettuina *·* massaspektroskopia, infrapunaspektroskopia (IR), ydinmag- ...: neettinen resonanssispektroskopia (NMR) ja ultravioletti- “« « · spektroskopia (UV), ja vertaamalla A83543-komponentteihin . .·. [katso Kirst et ai. (1991), supra}. Seuraavissa kappaleis- • · » ,·*·. 35 sa kuvataan komponenttien A83543K, A835430, A83543P, « · < « « 107266 12 A83J543U, A83543V; A83543W ja A83543Y fysikaalisia ja spektriominaisuuksia.

Lukijan työn helpottamiseksi seuraavassa A83543K:n kaaviossa annetaan jäljempänä esitettävien luonnossa 5 esiintyvien A83543-tekijöiden kaikkien NMR-spektritietoj sn asemamerkinnät.

6" 10 5^

/ O

l λ v PH

3" \ \ N-( l,N0 o. /ϊ1·\ 6'

In 2« V- 15 f 16'15 / J21 s 1 ^ /° o lNv/’V/^T' 19 f B's^—.

20 23 6 H

A83543K: A83543K:l.la on seuraavat tunnusmerkilliset piii- 4 « : teet : « « *:· 25 Moolimassa: 717 ···» • ·1; Empiirinen kaava: C40H63N010 «φ· · UV (EtOH): 243 nm (e = 10 657) MS (FAB): (M+H) m/z 718 . IR (KBr): katso kuvio 1.

·»♦·· ♦ · ... 30 Taulukkoon I on koottu kuviossa 2 esitetyt ·;2 A83543K:n 1H- ja 13C-NMR-spektritiedot (asetoni-d6: ssa).

« ··« • · · · • · · • · • · « 1 1 • · · • · « » ♦ • 1 • · 2 ·1» 107266 13

Taulukko 1 A83543K:n asetoni-d6: ssa saadut *11- ja “C-NMR-spektritiedot

Asema 13C XH* 5 1 172,69 _ 2 34,57 3,07/2,46 3 48,46 2,94 4 42,41 3,50 5 129,84 5,86 10 6 130,39 5,92 7 42,18 2,16 8 37,24 1,97/1,38 9 77,09 4,35 10 38,38 2,37/1,38 15 11 47,15 0,93 12 50,49 2,85 13 148,32 7,06 14 145,78 15 203,15 20 16 48,41 3,31 17 81,23 3,53 . 18 35,18 1,50 19 22,44 1,78/1,17 i 20 31,12 1,50 4 4 4 25 21 76,86 4,65 * Γ" 22 29,15 1,48 !:i.: 23 9,56 0,81 • · · 24 16,42 1,12 1' 97,47 4,85 30 2' 78,06 3,55 O 3' 82,42 3,33 4' 72,78 3,41 ]···. 5’ 69,80 3,53 « « 6' 18,26 1,19 :.i.; 35 2' -0CH3 59,02 3,42 • · • · M » 107266 14

Taulukko I (jatkoa)

Aseina 13C 1H* 3'-OCH3 57,39 3,39 1" 104,20 4,46 5 2" 32,02 1,94/1,38 3" 18,93 1,81/1,48 4" 66,10 2,11 5" 74,17 2,56 6" 19,44 1,20 10 N(CH3)2 41,02 2,21 *Jotkut vastaavuusmerkinnät ovat peräisin korrelaatioista * A835430:lla on seuraavat tunnusmerkilliset pii:ir- 15 teet:

Moolimassa: 731 Empiirinen kaava: C41H65N010 UV (EtOH): 243 nm (G = 9267) FD (M+) m/z 731 20 IR (KBr): katso kuvio 3.

Taulukkoon II on koottu kuviossa 4 esitetyt . ' : A835430:n XH- ja 13C-ydinmagneettinen resonanssi (NMR) -spektritiedot (asetoni-d5: ssa).

• i i e l i

25 Taulukko II

: .·. A835430:n asetoni-d6:ssa saadut XH- ja “C-NMI:- • ♦ « ‘Γ..* spektritiedot • Asema 13C XH* 1 172,60 _ 30 2 34,29 3,08/2,42 ··· \..J 3 48,88 2,91 4 42,71 3,45 !*··, 5 123,26 5,55 • i 6 137,16 • * V..** 35 7 45,32 2,19 • * · * · • * • · · 107266 15

Taulukko 11 (jatkoa)

Asema 13C *Η* 8 35,52 2,02/1,45 9 76,80 4,64 5 10 38,59 2,37/1,41 11 47,92 1,03 12 49,94 2,78 13 148,46 7,03 14 145,07 10 15 203,09 16 48,39 3,30 17 80,88 3,55 18 35,00 1,50 19 22,49 1,80/1,17 15 20 30,84 1,50 21 76,50 4,34 22 29,08 1,48 23 9,54 0,80 24 16,26 1,13 20 6-CH3 20,85 1,73 1' 97,21 4,87 , i'; 2' 77,80 3,56 l . / 3' 82,23 3,33 !\ : 4' 72,54 3,41 25 5’ 69,61 3,55 6’ 18,21 1,19 • · · :::/ 2' -OCH3 58,96 3,41 * 3' -OCH3 57,31 3,39 1" 104,02 4,46 30 2" 31,85 1,94/1,39 3" 18,74 1,82/1,52 4” 65,90 2,12 ;···. 5" 73,90 3,57 6" 19,39 1,20 35 N(CH3)2 40,92 2,20 • » i • · • · • > * 107266 16 *Arvot on otettu heteronukleaarisesta yhden sidoksen kaksiulotteisesta korrelaatiospektristä.

A83543P:llä on seuraavat tunnusmerkilliset piir- 5 teet:

Moolimassa: 703 Empiirinen kaava: C39H61N010 UV (EtOH): 243 nm (e = 13 760) MS (FAB): (M+H) m/z 704 10 IR (KBr): katso kuvio 5.

Taulukkoon III on koottu kuviossa 6 esitetyt A83543P:n 1H- ja 13C-ydinmagneettinen resonanssi (NMk) -spektritiedot (asetoni-d6: ssa).

15 Taulukko III

A83543P:n asetoni-d6: ssa saadut *11- ja 13C-NM!l~ spektritiedot

Asema 13C XH* 1 172,62 _ 20 2 34,43 3,06/2,44 3 48,74 2,94 . 4 42,26 3,50 • · · .:· 5 129,70 5,86 .·. : 6 130,30 5,89 25 7 42,06 2,14 8 37,15 1,97/1,34 ::i.: 9 76,84 4,34 • · · 10 38,28 2,36/1,36 11 47,05 0,92 30 12 50,37 2,86 ··· 13 148,43 7,03 14 144,85 '.··. 15 203,09 16 48,35 3,31 :.i.: 35 17 80,96 3,55 • · • · • · · 107266 17

Taulukko 111 (jatkoa)

Asema 13C 1H1 18 35,06 1,50 19 22,44 1,78/1,16 5 20 30,91 1,55 21 76,84 4,64 22 29,11 1,47 23 9,55 0,80 24 16,29 1,11 10 1' 96,68 4,86 2' 82,07 3,33 3’ 72,41 3,63 4’ 74,27 3,30 5' 69,45 3,53 15 6' 18,17 1,19 2' -0CH3 59,12 3,41 1" 104,08 4,45 2" 31,89 1,92/1,37 3” 18,72 1,81/1,52 20 4" 65,97 2,11 5" 74,03 3,56 . 6" 19,39 1,19 t « t <:< N(CH3)2 40,95 2,20 : 1Arvot on otettu heteronukleaarisesta yhden sidok- t; 25 sen kaksiulotteisesta korrelaatiospektristä.

• · · · • · • · ·

A83543U

*·1 1 A83543U:lla on seuraavat tunnusmerkilliset piir teet: 30 Moolimassa: 703 • · ·

Empiirinen kaava: ^39^61^10 UV (EtOH): 242 nm (G = 17 095) '1.··. MS (FAB): (M+H) m/z 704 IR (KBr): katso kuvio 7.

« · · • · 1 φ « · · • 1 « 18 107266

Taulukkoon IV on koottu kuviossa 8 esitetyt A83543U:n XH- ja 13C-ydinmagneettinen resonanssi (NMR) -spektritiedot (asetoni-d6: ssa)*

5 Taulukko IV

A83543U: n asetoni--d6: ssa saadut XH- ja 13C-NMR-spektritiedot

Asema 13C XH* 1 172,68 _ 10 2 34,53 3,10/2,49 3 48,41 2,97 4 42,15 3,54 5 129,77 5,91 6 130,39 5,93 15 7 42,37 2,19 8 37,16 2,00/1,41 9 76,81** 4,38 10 38,82 2,41/1,42 11 47,13 0,97 20 12 50,46 2,91 13 148,37 7,09 . 14 144,96 · 15 203,10 : J 16 48,63 3,35 25 17 81,15 3,57 Y\'·' 18 35,15 1,57/1,51 ::i.: 19 22,45 1,82/1,21 • · · 20 31,06 1,58/1,49 21 76,85** 4,69 30 22 29,04 1,54/1,50 • · · 23 9,57 0,83 24 16,39 1,16 1? 99,92 4,80 "·; 2’ 68,34 3,97 35 3’ 82,36 3,29 • · 19 107266

Taulukko IV (jatkoa)

Asema 13C 1Η1 4’ 72,45 3,48 5' 69,42 3,62 5 6' 18,21 1,24 3'-0CH3 57,06 3,42 1" 104,16 4,49 2" 31,98 1,97/1,42 3" 18,67 1,86/1,55 10 4" 66,06 2,14 5" 74,13 3,60 6" 19,43 1,24 N(CH3)2 41,01 2,24 *Arvot on otettu yksiulotteisesta tai käänteisestä 15 kaksiulotteisesta yhden sidoksen korrelaatiospektristä.

**Vastaavuusmerkinnät voivat olla päinvastoin.

A83543V

A83543V:llä on seuraavat tunnusmerkilliset piir- 20 teet:

Moolimassa: 717

Empiirinen kaava: C4oH63N010 UV (EtOH): 242 nm (e = 10 140) MS (FAB): (M+H) m/z 718 25 IR (KBr): katso kuvio 9.

ΓΊ Taulukkoon V on koottu kuviossa 10 esitetyt • · · *”.1 A83543V:n XH- ja 13C-ydinmagneettinen resonanssi (NMR) ♦ · · *·1 1 -spektritiedot (asetoni-d6:ssa).

« • · • · · « · * ♦ 1 »»·· • « · • · 1 1 • · » • · · 107266 20

Taulukko V

A83543V: n asetoni-d6: ssa saadut *H- ja 13C-NMR-spektritiedot

Asema 13C* *H* 5 1 172,63 _ 2 34,34 3,10/2,45 3 48,88 2,88 4 42,63 3,49 5 123,20 5,57 10 6 137,25 6-CH3 20,77 1,76 7 45,23 2,21 8 35,44 2,02/1,45 9 76,22 4,36 15 10 38,63 2,40/1,41 11 44,89 1,07 12 49,92 2,80 13 148,54 7,08 14 145,10 20 15 203,11 16 48,46 3,34 . 17 80,80 3,56 18 35,12 1,54/1,50 19 22,50 1,82/1,21 25 20 30,81 1,56/1,51 ‘.’‘I 21 76,71 4,67 22 29,01 1,51 • · « 23 9,38 0,82 24 16,17 1,14 30 1' 99,88 4,67 O 2' 69,03 3,69 3’ 82,19 3,28 /··. 4’ 72,21 3,46 5’ 68,18 3,61 35 6' 18,05 1,22 107266 21

Taulukko V (jatkoa)

Asema 13C* XH* 3'-OCH3 56,98 3,41 1" 104,14 4,49 5 2" 31,91 1,95/1,41 3" 18,62 1,84/1,54 4" 65,92 2,14 5" 73,92 3,59 6" 19,31 1,22 10 N(CH3)2 40,78 2,23 *Arvot on otettu yksi- ja kaksiulotteisista kään-teiskokeista.

A83543W: 15 A83543W:llä on seuraavat tunnusmerkilliset piir teet:

Moolimassa: 717 Empiirinen kaava: C40H63NO10 UV (EtOH): 244 nm (e = 10 254) 20 MS (FAB): (M+H) m/z 718 IR (KBr): katso kuvio 11.

. Taulukkoon VI on koottu kuviossa 12 esitetyt r ( < <;· A83543W:n *11- ja 13C-ydinmagneettinen resonanssi (NMR) .1 -spektritiedot (asetoni-d6: ssa).

25

Taulukko VI

• · · *”.* A83543W:n asetoni-d6:ssa saadut 3Η- ja “c-nmr- • · · *·* spektri tiedot

Asema 13C* *H* 30 1 172,62 _ *”1: 2 34,46 3,08/2,44 3 49,00 2,90 '.···. 4 42,69 3,46 5 123,52 5,55 35 6 137,25 1072(56 22

Taulukko VI (jatkoa)

Asema 13C* XH* 6-CH3 20,93 1,76 7 45,58 2,21 5 8 35,83 2,04/1,46 9 76,67 4,35 10 38,81 2,39/1,41 11 47,27 1,04 12 50,09 2,80 10 13 146,41 7,04 14 145,15 15 203,11 16 48,45 3,32 17 81,05 3,56 15 18 35,19 1,51 19 22,62 1,81/1,19 20 31,08 1,51 21 76,94 4,66 22 29,31 1,49 20 23 9,58 0,80 24 16,26 1,11 . 1’ 96,94 4,88 2' 82,42 3,34 3' 72,56 3,64 25 4’ 74,48 3,32 j**/.. 5' 69,54 3,56 ::i/ 6' 18,27 1,20 • · · *’* * 2' -OCH3 59,13 3,43 1" 104,34 4,47 30 2" 32,13 1,96/1,40 3" 18,84 1,83/1,54 4" 66,26 2,12 5" 74,20 3,59 6" 19,56 1,21 :.i.: 35 N(CH3)2 41,15 2,22 • 0 107266 23 *Arvot on otettu käänteisistä yhden sidoksen 1H/13C-korrelaatiospektreistä.

A83543Y:llä on seuraavat tunnusmerkilliset piirteet: 5 Moolimassa: 703

Empiirinen kaava: C39H61N010 UV (EtOH): 243 nm (e = 14 042) MS (FAB): (M+H) m/z 704 IR (KBr): katso kuvio 11.

10 Taulukkoon VII on koottu kuviossa 12 esitetyt A83543Y:n ’’H- ja 13C-ydinmagneettinen resonanssi (NMR) -spektritiedot (asetoni-d6:ssa).

Taulukko VII

15 A83543Y:n asetoni-d6: ssa saadut 3H- ja 13C-NMR- spektritiedot

Asema 13C* 1H* 1 172,42 _ 2 34,86 3,07/2,42 20 3 48,80 2,96 4 42,04** 3,44 . 5 129,68 5,87 6 130,32 5,91 7 42,00** 2,16 25 8 37,08 1,98/1,38 *;***·. 9 76,86 4,35 "I/ 10 38,26 2,38/1,39 • · · 11 47,07 0,94 12 50,30 2,87 30 13 148,45 7,06 O 14 144,72 15 203,06 /··. 16 47,97 3,35 • » *·* 17 81,23 3,56 :.i.: 35 18 34,86 1,61/1,52 ··» • · • · *♦ ♦ 107266 24

Taulukko VII

Asema 13C* XH* 19 22,22 1,78/1,19 20 33,56 1,54/1,47 5 21 72,97 4,69 22 21,58 1,12 23 - 24 16,42 1,13 1' 97,24 4,85 10 2’ 77,81 3,55 3’ 82,25 3,31 4' 72,61 3,41 5' 69,64 3,55 6' 18,21 1,19 15 2T-OCH3 58,94 3,41 3’-OCH3 57,28 3,4 1" 104,16 4,47 2" 31,90 1,94/1,41 3" 18,71 1,82/1,53 20 4" 65,94 2,12 5" 74,02 3,57 6" 19,37 1,21 N(CH3)2 40,93 2,22 a < a a : *Tulokset on saatu yksiulotteisista, käänteisistä a aa 25 heteronukleaarisista korrelaatio-, homonukleaarisista kyt- 1**1 kennänpoistumis- ia COSY-kokeista.

• · · • · · *”.* **Vastaavuusmerkinnät voivat olla päinvastoin.

• · · a a a

Komponentit A83543K, A835430, A83543P, A83543U, 30 A83543V, A83543W ja A83543Y eroavat rakenteellisesti aiem- ··« min kuvatuista yhdisteistä. Näissä yhdisteissä on neutraii- « le ja sokereita, joita ei ole aiemmin kuvattu: komponeri- ♦ teissä A83543K, A835430 ja A83543Y on neutraali sokeri., ♦ · Ί* joka on identifioitu a-2,3-di-0-metyyliramnoosiksi; koni- 35 ponenteissa A83543P ja A83543W on neutraali sokeri, joka • · · • » • » a · · 107266 25 on . identifioitu 2-O-metyyliramnoosiksi; komponenteissa A83543U ja A83543V on neutraali sokeri, joka on identifioitu 3-O-metyyliramnoosiksi.

Aminosokeri voidaan poistaa selektiivisesti näistä 5 uusista A83543-komponenteista, jolloin saadaan uusia A83543-pseudoaglykoneja, joita kutsutaan kaavan 3 mukaisiksi yhdisteiksi. Nämä yhdisteet ovat tämän keksinnön yksi lisäpiirre, ja ne ovat kaavan 1 mukaisia yhdisteitä, joissa R1 on vetyatomi.

10 Aminosokerin selektiivinen poistaminen A83543K:sta, A835430:sta, A83543P:stä, A83543U:sta, A83543V:stä, A83543W:stä ja A83543Y:stä antaa tulokseksi A83543K-pseu-doaglykonin, A835430-pseudoaglykonin, A83543P-pseudoagly-konin, A83543U-pseudoaglykonin, A83543V-pseudoaglykonin, 15 A83543W-pseudoaglykonin ja vastaavasti A83543Y-pseudoagly-konin. Seuraava kaava esittää näitä yhdisteitä: oh OR21 ?H3 20 f r20cb^ o _ / 'h : H —\ 1Q (3) \ Rl·» ·: 25 : Yhdiste R19 R20 R21 R22 • ·· · A83543K-pseudoaglykoni H CH3 CH3 CH3 A835430-pseudoaglykoni CH3 CH3 CH3 CH3

A83543P-pseudoaglykoni H CH3 CH3 H

30 A83543U-pseudoaglykoni H CH3 H CH3 • · ·;·* A83543V-pseudoaglykoni CH3 CH3 H CH3

*:* A83543W-pseudoaglykoni CH3 CH3 CH3 H

A83543Y-pseudoaglykoni H H CH3 CH3 • · · • » · • ♦ ♦ • · · ««» • « • « M » 10726(5 26

Kaavan 2 mukaisia yhdisteitä käytetään kaavan 3 mukaisten yhdisteiden valmistukseen saattamalla kaavan 2 mukainen yhdiste reagoimaan hapon kanssa, jolloin aminoso-keri poistuu. Soveltuviin happoihin kuuluvat vetyklorid:.-5 ja rikkihappo, edullinen happo tähän transformaatioon on rikkihappo. Reaktio toteutetaan edullisesti polaarisessa orgaanisessa liuotteessa, polaarisen orgaanisen liuotteon ja veden seoksessa tai vedessä. Soveltuviin orgaanisien liuotteisiin kuuluvat metanoli, THF, asetonitriili ja d:.-10 oksaani. Edullisia liuotteita tähän transformaatioon ovat metanolin ja veden seos tai vesi. Reaktio voidaan toteuttaa suunnilleen lämpötilassa 25 - 95 °C, edullisesti lämpötilassa 80 °C.

Pseudoaglykonit ovat käyttökelpoisia lähtöaineina 15 uusien A83543-yhdisteiden valmistamiseksi; pseudoaglykori voidaan esimerkiksi glykosyloida sen hydroksyyliryhmin kohdalta, jossa oli läsnä aminosokeri. Tämä glykosylaatjo voidaan toteuttaa kemiallisen synteesin tai mikrobiaalisen biokonversion kautta.

20 Tämän keksinnön yhtenä muuna puolena on tiettyjen kaavan 1 mukaisten yhdisteiden kemiallinen demetylaatic. Kaavan 1 mukaiset yhdisteet voidaan ryhmitellä 3 alaryh-"ly mäksi IA, IB ja 1C. Kaavan IA mukaiset yhdisteet ovat kaa- van mukaisia yhdisteitä, joissa R7 on ryhmä, jolla on kaa- « · ··« 25 va.

»··· • · • · · • · · ch3 : (CH3)2N- 30 • · * • · ···' Kaavan IB mukaiset yhdisteet ovat kaavan mukaisia ·*· yhdisteitä, joissa R7 on ryhmä, jolla on kaava.

tt·»

Mt • » • · CH3 35 (CH3)hh— 5 107266 27

Kaavan 1C mukaiset yhdisteet ovat kaavan mukaisia yhdisteitä, joissa R7 on ryhmä, jolla on kaava.

ch3

Kuten tässä kuvataan, kaavan IB mukaisia yhdisteitä voidaan valmistaa kaavan IA mukaisista yhdisteistä. Vas-10 taavasti kaavan 1C mukaisia yhdisteitä voidaan valmistaa kaavan IB mukaisista yhdisteistä. Näitä yhdisteitä voidaan valmistaa vastaavan A83543-komponentin kemiallisella deme-tylaatiolla. Kukin näistä alaryhmistä on myös kaavan 2 mukaisten yhdisteiden alaryhmä.

15 N-demetyylijohdannaisia, kaavan IB mukaisia yhdis teitä, valmistetaan saattamalla kaavan IA mukainen yhdiste reagoimaan jodin ja natriumasetaatin kanssa. Reaktio toteutetaan polaarisessa orgaanisessa liuotteessa, kuten metanolissa, tai polaarisen orgaanisen liuotteen ja veden 20 seoksessa, kuten vesipitoisessa metanolissa. Reaktioseok-sen pH pidetään arvossa 9, esimerkiksi käyttämällä pH 9 « · *·!*' -puskuria. Reaktio toteutetaan edullisesti suunnilleen « lämpötilassa 30 - 70 °C, ja se kestää noin 2-6 tuntia.

• · V·· Di-N-demetyylijohdannaisia, kaavan 1C mukaisia yh- *;* 25 disteitä, voidaan valmistaa saattamalla kaavan IB mukainen

MM

• yhdiste reagoimaan natriummetoksidin/jodin kanssa. Reaktio • ·· · toteutetaan edullisesti polaarisessa orgaanisessa liuot-teessä, kuten metanolissa. Reaktio toteutetaan lisäksi suunnilleen lämpötilassa 10 - 15 °C, edullisesti 0-5 °C.

• · ... 30 Reaktioaika vaihtelee noin 4 tunnista noin 6 tuntiin.

• « **’ Valaisevia esimerkkejä kaavan IB ja 1C mukaisista .,*·* yhdisteistä esitetään seuraavassa kaavassa: «M « < « · « i · t a a · • · « a · · « · « · « «

IM

107256 28 r7o

7 OR11 CHI

5 ΓΓ 1. h /L4—

r!0CH2 ° H 12 \ — / ' H

H \ .

10 1 CH3 9Hl 1 Ο H2N--0 (CH3)HH-^ _? (b) $ <c> 15 jossa R7, R9, R10, R11 ja R12 ovat kussakin yhdisteessä seu-raavat:

Yhdiste R7 R9 R10 R11 R12 20 N-deme tyyli-A83543K (b) H CH3 CH3 CH3 di-N-demetyyli-A83543K (c) H CH3 CH3 CH3 v‘,: N-demetyyli-A835430 (b) CH3 CH3 CH3 CH3 di-N-demetyyli-A835430 (c) CH3 CH3 CH3 CH3

:/.1 N-demetyyli-A83543P (b) H CH3 CH3 H

*; 1 25 di-N-demetyyli-A83543P (c) H CH, CH, H

: N-demetyyli-A83543U (b) H CH3 H CH3 • «· « di-N-demetyyli-A83543U (c) H CH3 H CH3 N-deme tyyli-A83543V (b) CH3 CH3 H CH3 di-N-demetyyli-A83543V (b) CH3 CH3 H CH3

!./ 30 N-demetyyli-A83543W (b) CH3 CH3 CH3 H

·:1’ di-N-demetyyli-A83543W (c) CH3 CH3 CH3 H

f<^:· N-demetyyli-A83543Y (b) H H CH3 CH3 di-N-demetyyli-A83543Y (c) H H CH3 CH3 • · · 9 9 9 9 9 ♦ · · • » » > · • « • · 9 > 9 107266 29

Kaavan 2 mukaiset yhdisteet, jotka ovat kaavan 1 mukaisia yhdisteitä, joissa R7 on muu kuin vetyatomi, voivat reagoida erilaisiksi suoloiksi, jotka ovat myös osa tätä keksintöä. Nämä suolat ovat käyttökelpoisia esimer-5 kiksi kaavan 2 mukaisten yhdisteiden erotuksessa ja puhdistuksessa. Lisäksi joillakin suolamuodoilla saattaa olla parantunut vesiliukoisuus. Näitä suoloja valmistetaan tavanomaisin suolavalmistusmenettelyin. A83543K voidaan esimerkiksi neutraloida sopivalla hapolla, niin että muodos-10 tuu happoadditiosuola.

Happoadditiosuolat ovat erityisen käyttökelpoisia. Edustaviin esimerkkeihin soveltuvista suoloista kuuluvat suolat, joita muodostetaan tavanomaisin reaktioin sekä orgaanisten että epäorgaanisten happojen, kuten esimerkik-15 si rikki-, vetykloridi-, fosfori-, etikka-, meripihka-, sitruuna-, maito-, maleiini-, fumaari-, kooli-, pamoiini-, lima-, glutamiini-, kamferi-, glutaari-, glykoli-, ftaa-li-, viini-, muurahais-, lauriini-, steariini-, salisyy-li-, metaanisulfoni-, bentseenisulfoni-, sorbiini-, pik-20 riini-, bentsoe-, kaneli- yms. happojen, kanssa.

Seuraavan käsittelyn helpottamiseksi on A83543A:ta t tuottaville kannoille annettu seuraavat tunnukset: .:. A83543.1, A83543.3, A83543.4 ja A83543.5. Samoin on uudel- • · le A83543K:ta tuottavalle kannalle annettu tunnus « « · ' t.\ 25 A83543.8. Viljelmät A83543.1, A83543.3, A83543.4, A83543.5, A83543.6, A83543.7, A83543.8 ja A83543.9 on tai- • · « letettu osaksi the Midwest Area Regional Research • · · '·* * Centerin, Agricultural Research Service, United States

Department of Agriculture, varastoviljelmäkokoelmaa, josta ***** 30 ne ovat yleisesti saatavissa seuraavilla tulonumeroilla: • · · • « ·· · )·, NRRL-numero Kannan numero *::: 18395 A83543.1 • « ‘•I** 18537 A83543.3 35 18538 A83543.4 • * · « · • · • · · 107266 30 NRRL-numero Kannan numero 18539 A83543.5 18719 A83543.6 18720 A83543.7 5 18743 A83543.8 18823 A83543.9

Viljemä A83543.1 saatiin Neitsytsaarilta otetusta maanäytteestä eristetyn viljelmän A83543 kemiallisen mu-10 taation kautta [Mertz ja Yao, Int'l J. of Systematic Bacteriology 40 (1990) 34], Viljelmä A83543.4 johdettiin viljelmästä A83543.1. Kukin kannoista A83543.3, A83543.4, A83543.5, A83543.6 ja A83543.7 johdettiin N-metyyli-N'-nitro-N-nitrosoguanidiinilla tehdyn kemiallisesti indusoi-15 dun mutageneesin kautta. Kannat A83543.8 ja A83543.9 jon-dettiin kannasta A83543.4 N-metyyli-N'-nitro-N-nitrosoguanidiinilla tehdyn kemiallisesti indusoidun mutageneesLn kautta. A83543-komponenttien tuotannossa esiintyviä eroja lukuun ottamatta nämä eristetyt kannat näyttävät samanlai-20 silta kuin kantaviljelmä.

Viljelyominaisuudet

Viljelmiä A83543.1, A83543.3, A83543.4, A83543. 5, ... A83543.6, A83543.7, A83543.8 ja A83543.9 kasvatettiin kai- ; dellatoista agarsiirrotusalustalla ja verrattiin kasvun, 25 kääntöpuolen värin, ilmaan kohoavien hyyfien tuotannoi, **" itiömassan värin ja liukenevan pigmentin tuotannon sun- • · · teen. Millään käytetyistä alustoista ei havaittu merkitti- • · · *·’ viä eroja. Ilmaan kohoavia hyyfejä syntyi useimmilla käy tetyistä alustoista. Ilmassa olevan itiömassan väri o Li *·**· 30 pääasiallisesti valkoinen, ja kääntöpuoli oli keltainen - * · · *../ kellanruskea. Selvästi erottuvaa pigmentaatiota ei esiin- tynyt; joihinkin alustoihin vapautui kuitenkin liukenevia ruskeaa pigmenttiä. Kantojen A83543.3, A83543.4, A83543.5, "1 A83543.6, A83543.7, A83543.8 ja A83543.9 viljelyominaisuu- « « · · * 1 107266 31 det vastaavat A83543.1:n alkuperäistä taksonomista kuvausta [katso Mertz ja Yao (1990), supra).

Morfologiset ominaisuudet

Useimmilla alustoilla esiintyi hyvin muodostuneita 5 ilmaan kohoavia hyyfejä, jotka olivat segmentoituneina pitkiksi, koukuiksi ja avoimiksi silmukoiksi järjestyneiksi itiöketjuiksi. Myös spiraaleja havaittiin, mutta ne olivat lyhyitä ja epätäydellisiä. Yleinen muoto oli suora ja taipuisa. Kukin kannan ilmaan kohoavilla hyyfeillä oli 10 selvästi erottuva helmimäinen ulkonäkö, ja itiöketjussa oli useita tyhjiä tiloja. Tämä piirre osoitti, että itiö-ketjua ympäröi itiövaippa, mikä on suvulle Saccharopoly-spora tunnusmerkillinen piirre. A83543-komponenttien tuotannossa esiintyviä eroja lukuun ottamatta nämä eristetyt 15 kannat näyttävät samanlaisilta kuin kantaviljelmä.

Fysiologiset ominaisuudet

Verrattiin kunkin kannan rasvahappoanalyysejä. Soluja kasvatettiin 96 tuntia lämpötilassa 28 °C Trypticase-soijaliemessä (Difco Laboratories, Detroit, MI). Rasvahap-20 pometyyliesetrit analysoitiin kaasu-nestekromatografialla käyttämällä mallia 5898A olevaa tietokoneohjattua kaasu-, nestekromatografiajärjestelmää (Hewlett-Packard Co., Palo .:. Alto, CA) (katso Miller ja Berger, Bacterial Identifi- «14 1 ; cation by Gas Chromatography of Whole Cell Fatty Acids, * t 1 * t;1 25 Hewlett-Packard Application Note 228-41. Nämä tulokset esitetään taulukossa VIII).

• · · » · · • · · · * ♦♦ • · · • ♦ · • · • · · • · ·· · ♦ * · · · • · · · • ♦ • · · • · · • 1 · · 4»1 107266 32

Taulukko Vili

Rasvahappo *83543.1 *83543.3 *83543.4 *83543.5 *83543.6 *83543.7 *83543.8 *83543.9 15:1 ISO 15,95 22.47 16.49 17,00 19,76 17,42 16:0 ISO 28.71 22,00 25,76 27.39 13,14 24,34 5 16:1 Cls 9 1,35 — — 0,90 0,92 15:0 ISO 20H 2.67 2,02 3,87 3.95 2,44 1,78 16:0 1.20 0.69 0.63 0,60 0,47 0.36 17:1 ISO F1 5.52 8.62 7.54 5.51 7,55 8.72 17:0 Iso 13,55 20,67 16,40 13.89 21,15 19.43 10 17:0 Änteiso 8.39 3,94 4,69 5,18 3,57 5,52 17:1 B 4,14 3.97 4,65 6,68 4,47 4.61 17:1 C 2.52 2.88 4,90 5.53 3.18 3.02 17:0 4,26 1.49 3.13 3.84 2.25 1,67 16:1 20H 1,87 1.52 1.93 0,92 1,36 2.17 15 18:1 Iso F 6,55 4.16 5,82 6,00 5,75 5,74 18:1 Cis 9 0,34 1.03 0.64 0,63 0.96 0,84 *F, B ja C osoittavat kaksoissidosten asemia tai rakenteita, jotka ovat tuntemattomia.

20 Pääkomponenttianalyysi on monimuuttujastatistiikan haara, joka käsittelee muuttujajoukon sisäisiä suhteita. Tässä analyysissä ilmaistaan alkuperäisten tietojen tai testitulosten sisällä esiintyvä suurin varianssi pääkompo-25 nentteina (katso Alderson, The Application and Relevance of Nonhierarchic Methods in Bacterial Taxonomy teoksessa Computer-Assisted Bacterial Systematics 1985, s. 227 i. Voidan konstruoida käyrä, joka esittää hajontaa tai vaihtelevuutta. Suhteita voidaan arvioida tutkimalla väriäni • · · · ·’; 30 siä ja karakterisoida siten mikrobipopulaatio. Kuvio 13 • · * · esittää kaksiulotteista pääkomponenttikäyrää, joka on saii-tu kantojen A83543.1, A83543.3, A83543.4, Α83543.Ϊ, A83543.6, A83543.7, A83543.8 ja A83543.9 rasvahappoanalyy- • ♦ ... seistä. Arvot tarkoittavat erottumisasteita kyseisten kar - • · ·;·’ 35 tojen välillä. Kantojen väliset erot eivät ole taksonomi- *:* sesti merkitseviä.

« · · ·

Samoin kuin muiden organismien ollessa kyseessä \ A83543:a tuottavien kantojen ominaisuudet ovat alttiita • · · muuttumaan. Niinpä näiden kantojen mutantteja voidaan saa- • · • · 107266 33 da aikaan alalla tunnetuin fysikaalisin ja kemiallisin menetelmin. Muita kantoja voidaan saada esimerkiksi käsittelemällä kemikaaleilla, kuten N-metyyli-N'-nitro-N-nitro-soguanidiinilla. S. spinosa -kantojen NRRL 18395, NRRL 5 18537, NRRL 18538, NRRL 18539, NRRL 18719, NRRL 18720, NRRL 18743 ja NRRL 18823 luonnolliset ja indusoidut mutan-tit, joilla on jäljellä kyky tuottaa talteen otettavissa olevia määriä kaavan 1 mukaista yhdistettä sopivissa olosuhteissa viljeltyinä, ovat käyttökelpoisia tämän keksin-10 nön yhteydessä.

Tämän keksinnön yhtenä puolena on kaavan 1 mukaisen yhdisteen tuottaminen, jota tuotetaan viljelemällä sopivassa, sinefungiinia sisältävässä kasvualustassa A83543A:ta tuottavaa S. spinosa -kantaa, joka valitaan 15 kantojen NRRL 18395, NRRL 18537, NRRL 18538 ja NRRL 18539 joukosta, tai sen A83543A:ta tuottavaa mutanttia. "A83543A:ta tuottava mutantti" on mistä tahansa A83543A:ta tuottavasta S. spinosa -kannasta NRRL 18395, NRRL 18537, NRRL 18538 ja NRRL 18539 johdettu kanta, jolla on kyky 20 tuottaa talteen otettavissa olevia määriä A83543A:ta ja sopivassa, sinefungiinia sisältävässä kasvualustassa viljeltynä kyky tuottaa samanaikaisesti A83543K:ta ja A835430: ta.

Tämän keksinnön yhtenä muuna puolena on kaavan 1 25 mukaisen yhdisteen tuottaminen viljelemällä A83543H:ta 1**1 tuottavaa S. spinosa -kantaa, kuten kantaa NRRL 18823, tai • · · ·;·.,* sen A83543H:ta tuottavaa mutanttia sopivassa, sinefungii- • · · *·* * nia sisältävässä kasvualustassa. "A83543H:ta tuottava mu tantti" on mistä tahansa A83543H;ta tuottavasta S. spinosa 30 -kannasta NRRL 18823 johdettu kanta, jolla on kyky tuottaa talteen otettavissa olevia määriä A83543H:ta ja sopivassa, *:. sinefungiinia sisältävässä kasvualustassa viljeltynä kyky '[·'··, tuottaa samanaikaisesti A83543U:ta ja A83543V:tä.

Tämän keksinnön yhtenä lisäpuolena on vielä kaavan 35 1 mukaisen yhdisteen tuottaminen viljelemällä A83543J:tä • « · • · • · • » · 107256 34 tuottavaa S. spinosa -kantaa, kuten kantaa NRRL 18719, tai sen A83543J:tä tuottavaa mutanttia sopivassa, sinefungii-nia sisältävässä kasvualustassa. "A83543J:tä tuottava mu-tantti" on inistä tahansa A83543J:tä tuottavasta S. spinosa 5 -kannasta NRRL 18719 tai NRRL 18720 johdettu kanta, joi La on kyky tuottaa talteen otettavissa olevia määriä A83543J:tä ja sopivassa, noin 50 - 200 mg/ml sinefungiinia sisältävässä kasvualustassa viljeltynä kyky tuottaa samai-aikaisesti A83543P:tä ja A83543W:tä.

10 Sinefungiinia lisätään tyypillisesti tuotantoalu3- taan 48 - 72 tunnin kuluttua laajamittaisen tuotannon oL-lessa kyseessä; sinefungiinin lisäystä viivytetään, kunnas viljelmä alkaa kasvaa, mistä on osoituksena hapenotto. Sinefungiinia lisätään fermentointialustaan edullisesti 15 noin 48 - 72 tunnin kuluttua inokuloinnista. Sinefungiini voidaan lisätä kiinteänä aineena tai liuoksena. Kun sino-fungiinia lisätään suuren fermentointierään, on lisävs alkoholiliuoksena kätevyyden vuoksi edullista. Tällainen liuos valmistetaan liuottamalla sinefungiini riittävään 20 tilavuuteen metanolia ja steriloimalla liuos sitten suodattamalla 0,45 pm:n suodattimen läpi.

, r; Kaavan 1 mukaisia yhdisteitä tuotetaan vaihtoehtoi sesti viljelemällä S. spinosa -kantaa NRRL 18743 (joka ; tuottaa komponentteja A83543K, A835430 ja A83543Y) tai sen t 25 A83543K:ta tuottavaa mutanttia sopivassa kasvualustassa lisäämättä sinefungiinia. "A83543K:ta tuottava mutanttl" ”*.* on S. spinosa -kannasta NRRL 18743 johdettu kanta, jolla • · a ’·’ * on kyky tuottaa talteen otettavissa olevia määriä A83543K:ta.

***** 30 Kaavan 1 mukainen yhdiste voidaan tuottamisens a ’...· jälkeen erottaa kasvualustasta käyttämällä erilaisia eris- tys- ja puhdistusmenettelyjä, jotka ovat alalla hyvin tur-nettuja. Tuotannon taloudellisuuden, optimaalisen saanncn ” ja tuotteen eristämisen helppouden kannalta ovat tietyt :.i.: 35 kasvualustat edullisia. Laajamittaisessa fermentoinnissa • · t • · • · * · · 107266 35 ovat edullisia hiililähteitä esimerkiksi glukoosi ja me-tyylioleaatti, vaikka myös riboosia, ksyloosia, fruktoosia, galaktoosia, mannoosia, mannitolia, liukoista tärkkelystä, perunadekstriiniä, öljyjä, kuten soijaöljyä, yms. 5 voidaan käyttää. Edullisia typpilähteitä ovat puuvillan-siemenjauho, peptonisoitu maito ja maissiliemi, vaikka myös kalajauhoa, pilkottua soijajauhoa, hiivauutetta, entsyymillä hydrolysoitua kaseiinia, lihauutetta yms. voidaan käyttää. Epäorgaanisiin ravintosuoloihin, joita voidaan 10 sisällyttää kasvualustoihin, kuuluvat tavanomaiset liukoiset suolat, joilla on kyky antaa tulokseksi sinkki-, natrium-, magnesium-, kalsium-, ammonium-, kloridi-, karbonaatti-, sulfaatti-, nitraatti- yms. ioneja. Organismin kasvulle ja kehitykselle välttämättömiä hivenaineita tuli-15 si myös sisällyttää kasvualustaan. Tällaisia hivenaineita esiintyy tavallisesti alustan muissa aineosissa epäpuhtauksina riittäviä määriä organismin kasvuvaatimusten täyttämiseksi.

Jos vaahtoaminen on ongelma, voidaan alustaan ta-20 vallisesti lisätä pieniä määriä (ts. 0,2 ml/1) vaahtoami-senestoainetta, kuten polypropeeniglykolia, laajamittaisen fermentoinnin ollessa kyseessä. A83543:a tuottavien vil- t < i jelmien ollessa kyseessä tavanomaiset vaahtoamisenestoai- « « « « : neet kuitenkin estävät A83543:n tuotantoa. Vaahtoamista € « · 25 voidaan säädellä sisällyttämällä alustaan (1 - 3 %) soija- Y". öljyä tai PLURONIC L101:ä (BASF, Parsipanny, NJ). Öljyä * · · '**,* voidaan lisätä edelleen, jos kehittyy vaahtoa.

* * · *·* * Kaavan 1 mukaisen yhdisteen tuottamiseksi olennai sina määrinä on sekoituksella varusteuissa bioreaktoreissa 30 tehtävä pinnanalainen aerobinen fermentointi edullinen; • · · pieniä määriä kaavan 1 mukaista yhdistettä voidaan kuiten- kin valmistaa ravistuspulloviljelyllä. Koska suurten bio- [·”. reaktoreiden inokulointiin organismin itiömuodolla liittyy • « yleensä tuotantoviive, on edullista käyttää vegetatiivista 35 inokulaattia. Vegetatiivinen inokulaatti valmistetaan ino- • · • « « » · 107266 36 kuloimalla pieni tilavuus kasvualustaa nestetypessä säilytetystä varastoviljelmästä käsin, jolloin saadaan organismin tuore, aktiivisesti kasvava viljelmä. Vegetatiivinen inokulaatti siirretään sitten suurempaan bioreaktoriin. 5 Vegetatiivisen inokulaatin alusta voi olla sama kuin suuremmissa fermentoinneissa käytetty, mutta muutkin alustat ovat soveltuvia.

Kaavan 1 mukaista yhdistettä valmistavat A83543:a tuottavat kannat kasvatettaessa niitä suunnilleen lämpöti-10 lassa 24 - 33 °C. Optimaalinen tuotantolämpötila näyttää olevan noin 28 - 30 °C.

Kuten on tavanomaista aerobisissa pinnanalaisviljij-lyprosesseissa, astiaan puhalletaan steriiliä ilmaa pohjalta käsin sekoittaen samalla alustaa tavanomaisin tu:r-15 biinisekoittimin. Xlmastusnopeuden ja sekoitusnopeuden tulisi yleisesti ottaen olla riittäviä liuenneen hapen tason pitämiseksi vähintään arvossa 80 % astian sisäisen paineen ollessa noin 34,5 kPa (0,34 atm).

Kaavan 1 mukaisen yhdisteen tuotantoa voidaan seu-20 rata fermentoinnin aikana testaamalla lieminäytteitä. Yksi edullinen menetelmä tuotannon seuraamiseksi on liem:.-, näytteiden analysointi suurtehonestekromatografiai;.a < t < (HPLCrllä). Yhtä soveltuvaa analyysijärjestelmää kuvatacin < « I « : esimerkissä 1.

« < · 25 Ravistuspulloissa tai sekoituksella varustetuissa t reaktoreissa tapahtuneen tuotannon jälkeen kaavan 1 mukai- • · · **;.* nen yhdiste voidaan ottaa talteen fermentointialustasta « · · *** * alalla tunnetuin menetelmin. A83543:a tuottavan kannan fermentoinnin aikana syntyneitä yhdisteitä esiintyy sekä 30 myseeleissä että liemessä. Kaavan 1 mukaiset yhdisteet • ♦e ovat lipofiilisiä; kun fermentoinnissa käytetään olennai-.:. nen määrä öljyä, on koko liemen uuttaminen tehokkaampaa.

.···. Jos käytetään vain pieniä määriä öljyä, pääosa kaavan 1 mukaisesta yhdisteestä on läsnä myseeleissä. Tässä tapauk-35 sessa saadaan aikaan kaavan 1 mukaisen yhdisteen tehok- • » * « » • ♦ • * · 107266 37 kaampi talteenotto suodattamalla aluksi alusta liemen erottamiseksi myseelimassasta (biomassasta).

Kaavan 1 mukainen yhdiste voidaan ottaa talteen biomassasta monin erilaisin menetelmin. Yhdessä soveltu-5 vassa menettelyssä pestään erotettu biomassa vedellä jäljellä olevan liemen poistamiseksi, sekoitetaan biomassa sellaisen polaarisen liuotteen kanssa, johon kaavan 1 mukainen yhdiste liukenee, esimerkiksi metanolin tai asetonin kanssa, erotetaan ja konsentroidaan liuote, uutetaan 10 konsentraatti epäpolaarisella liuotteella ja/tai adsorboidaan se käänteisfaasilikageeliadsorbentille, kuten kään-teisfaasi-C8- tai -C18-hartsille, tai hyvin huokoiselle polymeerille, kuten HP-20:lle tai HP-20ss:lle (Mitsubishi Chemical Industries Co., Ltd., Japan). Aktiivinen materi-15 aali eluoidaan adsorbentilta sopivalla liuotteella, kuten esimerkiksi H20:n, asetonitriilin ja metanolin seoksilla, jotka sisältävät mahdollisesti pieniä määriä THF:a.

Yhdessä edullisessa menetelmässä kaavan 1 mukaisen yhdisteen eristämiseksi biomassasta lisätään yhtä suuri 20 tilavuus asetonia koko liemeen, suodatetaan seos keraami-suodattimella biomassan poistamiseksi ja uutetaan suodos , etyyliasetaatilla. Etyyliasetaattiuute konsentroidaan ali- I i < paineessa asetonin poistamiseksi ja erotetaan vesikerros t M f : orgaanisesta kerroksesta. Etyyliasetaattiliuos konsentroi- « « » 25 daan edelleen alipaineessa ja konsentraatti uutetaan lai- « mealla vesipitoisella hapolla (pH 3). Kaavan 1 mukainen • · · *".* yhdiste voidaan jatkopuhdistaa kromatografisesti tässä • · · *·’ * kuvatulla tavalla.

Yhdessä edullisemmassa menetelmässä kaavan 1 mukai-30 sen yhdisteen eristämiseksi biomassasta lisätään yhtä suu- • · · ri tilavuus asetonia koko liemeen, suodatetaan seos kerää-misuodattimella biomassan poistamiseksi ja säädetään suo- • · · · '/··. doksen pH suunnilleen arvoon 9-13. Tämä liuos laitetaan HP-20ss:lle (Mitsubishi Chemical Industries Co., Ltd., 35 Japan) ja pylväs huuhdotaan metanolin, asetonitriilin ja • · · • · • · • · · 38 107265 veden seoksella (.1:1:2). Kaavan 1 mukainen yhdiste eluoL-daan seoksella, joka sisältää suhteessa 95:5 metanolia ja asetonitriiliä (1:1) ja 0,1 % ammoniumasetaattia (pH 8,1). Kaavan 1 mukaisia yhdisteitä sisältävät fraktiot yhdista-5 tään ja kylmäkuivataan. Kaavan 1 mukainen yhdiste voidaan jatkopuhdistaa kromatografisesti tässä kuvatulla tavalla.

Viljelmän kiintoainekset, mukaan luettuina alustan aineosat ja myseeli, voidaan vaihtoehtoisesti käyttää kaavan 1 mukaisen yhdisteen lähteenä ilman uuttamista tai 10 erottamista mutta edullisesti veden poistamisen jälkeen. Koko fermentointiliemi voidaan kaavan 1 mukaisen yhdisteen tuottamisen jälkeen esimerkiksi kuivata lyofilisoimalla, rumpukuivauksella tai atseotrooppisella tislauksella ja kuivauksella. Kuivattu liemi voidaan käyttää sitten suo-15 raan esimerkiksi sekoittamalla se suoraan rehuesiseoksean tai suihkutteisiin ja jauheisiin käytettäviin formuloihin. Insektisidinen ja mitisidinen aktiivisuus Kaavan 2 mukaiset yhdisteet ovat käyttökelpois La hyönteisten ja punkkien torjuntaan. Siksi tämän keksinnön 20 yksi lisäpuoli koskee menetelmiä hyönteisen tai punkin torjumiseksi levittämällä hyönteisen tai punkin olinpaik-. kaan hyönteistä tai punkkia inhiboiva määrä kaavan 2 mi- 4 11 • kaista yhdistettä.

« * · · : Hyönteisen tai punkin "olinpaikka" tarkoittaa ympä- « « 25 ristöä, jossa hyönteinen tai punkki elää tai jossa on san « munia, mukaan luettuina sitä ympäröivä ilma, sen syöinä • · · ravinto tai kohteet, joiden kanssa se on kosketuksessa.

• · · *·* * Kasveja syöviä hyönteisiä tai punkkeja voidaan esimerkiksi torjua levittämällä aktiivista yhdistettä kasvinosiin, *·*’· 30 joita hyönteiset tai punkit syövät tai joilla ne oleskella- ♦ ♦♦ *...; vat, erityisesti lehdille.

.:. Termi "hyönteisen tai punkin inhibointi" tarkoittaa .«··. elävien hyönteisten tai punkkien lukumäärän pienentämisiä tai hyönteisten tai punkkien elävien munien lukumäärän 35 pienentämistä. Yhdisteellä aikaansaatava vähentymisas :e • » · • · « · 107266 39 riippuu tietenkin, levitettävästä yhdistemäärästä, kulloinkin käytettävästä yhdisteestä ja kohteena olevasta hyön-teis- tai punkkilajista. Käytettävän määrän tulisi olla vähintään hyönteisiä inaktivoiva tai punkkeja inaktivoiva.

5 Termejä "hyönteisiä inaktivoiva määrä" ja "punkkeja inaktivoiva määrä" käytetään kuvaamaa määrää, joka riittää aiheuttamaan käsitellyn hyönteis- tai punkkipopulaation mitattavissa olevan pienenemisen. Yleensä aktiivista yhdistettä käytetään noin 1-1 000 ppm (tai 0,01 - 1 kg/a). 10 Kaavan 2 mukaisilla yhdisteillä monien hyönteisten ja punkkien vastainen vaikutus. Tarkemmin määriteltynä yhdisteellä on hyönteislahkoon Lepidoptera kuuluvien "juu-rikasyökkösen" toukkien (beet armyworm, Spodoptera exiqua) ja "tupakansiImutoukan" (tobacco budworm, Heliothis vires-15 cens) vastainen vaikutus. Muita tyypillisiä tämän lahkon jäseniä ovat "etelänyöperhosen" toukka (southern armyworm, Leucania-laji?), "omenakoi" (codling moth), "kasvit juuresta katkaisevat yöperhosten toukat" (cutworms), vaate-koit (clothes moths), "maissijauhokoisa" (Indian meal 20 moth), "lehtiä rullaavat hyönteisten toukat" (leaf rollers), "maissiyöperhosen toukka" (corn ear worm), "puu-, villayöperhosen toukka" (cotton bollworm, Heliothis armi- t i « .:. gera?), "eurooppalaisen maissiyöperhosen toukka" (European

MM

/. : corn borer), "tuontikaaliperhosen toukka" (imported « ·« 25 cabbage worm), "kaalimittarin toukka" (cabbage looper), J**I# "vaaleanpunainen yöperhosen toukka" (pink bollworm), "pus- ···/ sikehrääjien toukat" (bagworms), "itäisen kehrääjäkoin • · · toukka" (Eastern tent caterpillar, Malacosoma america- num?), "verkkoja kutova nurmitoukka" (sod webworm) ja ***** 30 "syysyöperhosen toukka" (fall armyworm).

··· *...ί Kaavan 2 mukaisilla yhdisteillä on myös hyönteis- lahkoon Homoptera kuuluvien kaskaiden vastainen vaikutus. Muita tämän lahkon jäseniä ovat "puuvillakirva" (cotton • « T aphid), "taimikaskaat" (plant hoppers), päärynäkemppi 35 (pear psylla), "omenanimijä" (apple sucker), kilpikirvat « · · « « • · I*» 107266 40 (scale insects), Jauhiaiset (whiteflies) ja sylkikaskaat (spittle bugs) samoin kuin joukko muita isäntäspesifisiä kirvalajeja.

Kaavan 2 mukaiset yhdisteet vaikuttavat lisäk si 5 hyönteislahkoon Diptera kuuluvien pistokärpästen (stab Le flies), lihakärpästen (blow flies) ja sääskien (mosquL-toes) vastaisesti. Yksi muu tyypillinen tämän lahkon jäsian on tavallinen huonekärpänen (common house fly).

Kaavan 2 mukaisilla yhdisteillä on myös hyönteis-10 lahkoon Acarina kuuluvien "kaksitäpläisten kehrääjäpunkkien" (two-spotted spider mite, Tetranychys urticae) vastainen vaikutus. Muita tyypillisiä tämän lahkon jäsen:.ä ovat syyhypunkit (mange mite, scab mite), "lampaan syyhypunkki" (sheep scab mite), "kanapunkki" (chicken mite , 15 "suomujalkapunkki" (scalyleg mite), "kynijäpunkki" (dis pluming mite) ja "koiran karvapussipunkki" (dog follicle mite).

Kaavan 2 mukaiset yhdisteet ovat käyttökelpoisia hyönteis- ja punkkipopulaatioiden pienentämiseen, ja niitä 20 käytetään menetelmässä hyönteis- tai punkkipopulaaticn pienentämiseksi, jossa levitetään hyönteisen tai punkin olinpaikkaan hyönteisiä tai punkkeja inaktivoivasti vai- <41 kuttava määrä kaavan 2 mukaista yhdistettä. Yhdessä edul- 4 • ’ lisessa suoritusmuodossa tämä keksintö koskee menetelmää 4 * · * t * • / 25 lahkoon Lepidoptera kuuluvan käsittelylle herkän hyöntei- “** sen inhiboimiseksi, jossa levitetään kasville hyönteisiä • · * ··· * inaktivoivasti vaikuttava määrä tämän keksinnön mukaista • · · • · · *·* ' kaavan 2 mukaista yhdistettä. Tämän keksinnön yksi toinen edullinen suoritusmuoto koskee menetelmää lahkoon Diptera *·**· 30 kuuluvien purevien kärpästen inhiboimiseksi, jossa anne- • « · * ί taan eläimelle tuholaisia inhiboivasti vaikuttava määrä • · « ]·, kaavan 2 mukaista yhdistettä suun kautta, parenteraalises- ti tai paikallisesti. Yhdessä toisessa edullisessa suori- « · tusmuodossa tämä keksintö koskee menetelmää lahkoon Homo- ·.·/ 35 ptera kuuluvan käsittelylle herkän hyönteisen inhiboimi- • » · • · • ·

»M

107266 41 seksi, jossa levitetään kasville hyönteisiä inaktivoivasti vaikuttava määrä kaavan 2 mukaista yhdistettä. Tämän keksinnön yksi toinen edullinen suoritusmuoto koskee menetelmää lahkoon Acarina kuuluvien punkkien inhiboimiseksi, 5 jossa levitetään punkin olinpaikkaan punkkeja inaktivoiva määrä kaavan 2 mukaista yhdistettä.

Punkki- ja hyönteistutkimus

Kaavan 2 mukaisten yhdisteiden mitisidinen ja in-sektisidinen aktiivisuus testattiin seuraavalla punkki- ja 10 hyönteistutkimuksella. Kukin testattava yhdiste formuloitiin liuottamalla yhdiste asetonin ja alkoholin seokseen (1:1), joka sisälsi 23 g TOXIMUL R:ää (sulfonaatin ja io-nittoman emulgointiaineen seos) ja 13 g TOXIMUL S:ää (sulfonaatin ja ionittoman emulgointiaineen seos) litraa koh-15 den. Nämä seokset laimennettiin vedellä, niin että saatiin aikaan esitetyt pitoisuudet.

"Kaksitäpläisiä kehrääjäpunkkeja" ja "puuvillakir-voja" tuotiin kesäkurpitsojen sirkkalehdille ja niiden annettiin asettua pysyvästi lehden kummallekin pinnalle. 20 Sitten lehdet suihkutettiin 5 ml:11a tutkittavia liuoksia käyttämällä DeVilbiss-sumutinta paineella 69 kPa (10 psi). Lehtien molemmat pinnat peitettiin, kunnes neste valui i « « niiltä pois, ja niiden annettiin sitten kuivua 1 tunti.

MM

,«,: Kuolleiden hyönteisten prosentuaalinen osuus arvioitiin « · · 25 tavanomaisten altistusjaksojen jälkeen. Tutkittiin lisäksi '*** muita hyönteisiä käyttämällä samanlaisia formuloita ja • · · *** 5 arviointimenetelmiä. Tulokset esitetään taulukossa IX.

• · · ♦ · · *·* * Käytetyt lyhenteet ovat seuraavat: *·**· 30 Lyhenne Tuholainen Tieteellinen nimi * J ALH "Asterikaskas" Macrosteles fascifrons )·. (Aster leaf hopper) ’!!! BAW "Juurikasyökkönen” Spodoptera exiqua • « ‘Γ (Beet Armyworm) 35 CA "Puuvillakirva” Aphis gossypii Glover • · « • · • · • ♦ · 42 1071266 (Cotton Aphid) GECR Russakka Blattella germanica (German Cockroach) NEM "Juuriäkämämato" Meliiodyne spp.

5 (Rootknot Nematode) SCWR "Eteläinen maissinjuurimato" Diabrotlca (Southern Corn Rootworm) undeclmpunctata howarii TBW "Tupakansilmutoukka" Hellothis viresce.is (Tobacco Budworm) 10 TSSM "Kaksitäpläinen kehrääjäpunkki" Tetranychis (Two-spotted Spider Mite) utricle

Taulukko IX

Kaavan 2 mukaisten yhdisteiden aktiivisuus hyönte:.s 15 ja punkkitutkimuksessa

Prosentuaalinen inhibitio**

Tuho- Pitol- Aikac A83543K £835430 A83543P £835430 R83S43W A83543Y M-denetyrli-K lainen suusa 20 ALH 200 24 h 100 100 0 100 0 60 100 400 24 h 100 100 0 100 0 80 100 BAW 200 6 d 100 100 100 100 0 80 100 400 6 d 100 100 100 100 60 100 100 . ί ί CA 200 4-5 d000000 0 ! • l · 25 400 4-5 d 0 100 0 0 0 0 0 ’ “ 1 CECR 200 7 d 0 0 0 0 0 0 0 » · */·· 400 7 d 0 0 0 0 0 0 0 .200 21 d 0 20 20 0 20 - 20 11 **** 400 21 d 80 100 0 0 0 - 60 ; 30 nem 200 11 d o o o o o .1»’« 400 11 d 0 0 0 0 0 - 100 « · · • SCRW 200 11 d 00000 400 11 d 100 0 0 0 0 80 60 ····· TBW 200 6 d 100 100 0(50) 100(50) 0(50) 0(50) 100(50) ,.t 3 5 400 6 d 100 100 100 100 100 100 100 * · .··1 TSSM 200 4-5 d 90 100 100(50) 0 0(50) 0(50) 0(50) * 400 4-5 d 100 100 100 0 80 100 100 • · · *;;; a Pitoisuus ppmrinä (ellei suluissa anneta muuta arvoa)

f I

’·;·1 b Prosentuaalinen inhibitio yksittäisten toistokokeiden : 40 keskiarvona

«M

"‘j c Altistusaika »Il 107266 43

Kaavan 2 mukaisia yhdisteitä arvioitiin seuraavassa tutkimuksessa LD50-arvon määrittämiseksi vastakuoriutunutta "tupakansilmutoukkaa" (Hellothis virescens) vastaan. Käännetään petrimalja (100 mm x 20 mm) ylösalaisin ja kansi 5 vuorataan kvalitatiivisella suodatinpaperilla #1. Kullekin maljalle sijoitetaan vastakuoriutuneita toukkia ja hyönteisille pipetoidaan 1 ml testattavaa liuosta. Petrimaljan pohjaosa asetetaan sitten kannelle, niin että toukat jäävät sisään. Tunnin kuluttua käsittelystä kuhunkin maljaan 10 lisätään pieni pala Heliofchis-ravintoa (muunnettu liete. Southland Products, Lake Village, AR). Kuolemisaste arvioidaan 24 ja 48 tunnin kuluttua. Testit tehtiin kolmena rinnakkaismäärityksenä. Tulokset esitetään taulukossa X.

15 Taulukko X

Vastakuoriutuneiden "tupakansilmutoukkien” vastainen aktiivisuus

Yhdiste LD50 (ppm)a A83543K 3,5 20 A835430 1,4 A83543P > 64 . A83543U 22 « « « A83543W > 64 .·. : A83543Y 20 • ·« 25 N-demetyyli-K 9,8 a Kahden testin keskiarvo • · · • · · • · · · ··· • · · * Insektisidiset koostumukset Tämän keksinnön mukaisia kaavan 2 mukaisia yhdis- **'*’* 30 teitä käytetään koostumusten muodossa, jotka myös ovat osa • · · tätä keksintöä. Nämä koostumukset käsittävät hyönteisiä .:. tai punkkeja inaktivoivan määrän kaavan 2 mukaista yhdis- -.···. tettä fytologisesti hyväksyttävässä inertissä kantajassa.

*·’ Aktiivinen komponentti, kaavan 2 mukainen yhdiste, voi 35 olla läsnä yhtenä kaavan 2 mukaisena yhdisteenä, kahden • · · • · • · • ♦ « 44 107265 tai useamman kaavan 2 mukaisen yhdisteen seoksena, vähintään yhden tuotteista A83543K, A835430, A83543P, A83543LJ, A83543V, A83543W ja A83543Y seoksena tai vähintään yhdsn tuotteista A83543K, A835430, A83543P, A83543U, A83543/, 5 A83543W ja A83543Y seoksena yhdessä sen tuotantoon käytet tävän fermentointialustan kuivatun osan kanssa.

Koostumuksia valmistetaan noudattamalla menettely jä ja kaavoja, jotka ovat tavanomaisia maatalouskemikaalL-alalla mutta uudenlaisia ja tärkeitä yhden tai useammin 10 tämän keksinnön mukaisen yhdisteen läsnäolon ansiosta. Koostumukset ovat joko konsentroituja formuloita, jotka dispergoidaan veteen levitystä varten, tai pölyte- tai raeformuloita, joita levitetään ilman jatkokäsittelyä.

Dispersiot, joina yhdiste tai kuivattu raakamater:.-15 aali levitetään, ovat useimmiten vesisuspensioita tai -emulsioita, jotka on valmistettu yhdisteitä tai raakama-teriaalia sisältävistä konsentroiduista formuloista. Täk-laiset vesiliukoiset, veteen suspendoitavissa olevat tai emulgoitavissa olevat formulat ovat joko kiinteitä (tunno-20 taan yleisesti kostutettavissa olevina jauheina) tai nesteitä (tunnetaan yleisesti emulgoitavissa olevina konsen-. traatteina tai vesisuspensioina).

·· Kostutettavissa olevat jauheet, jotka voidaan tii-

Ml· .'. j vistää veteen dispergoitavissa olevien rakeiden muodostc- t · 25 miseksi, käsittävät aktiivisen yhdisteen, inertin kantajen ; [·. ja pinta-aktiivisuusaineiden läheisen seoksen. Aktiivisen • · · yhdisteen osuus on tavallisesti noin 1-90 paino-%. Ir- • · o • · e ' ertti kantaja valitaan tavallisesti attapulgiittisavien, montmorilloniittisavien, piimaiden ja puhdistettujen sili- * * 30 kaattien joukosta.

·»« ’...· Tehokkaita pinta-aktiivisuusaineita, joiden osuus on noin 0,5 - 10 % kostutettavissa olevasta jauheesta, .··♦. löydetään sulfonoitujen ligniinien, kondensoitujen nafta- *·* leenisulfonaattien, naftaleenisulfonaattien, alkyylibent- 35 seenisulfonaattien, alkyylisulfaattien ja ionittomien pin- « · 107266 45 ta-aktiivisuusaineiden, kuten alkyylifenolien eteenioksi-diadditiotuotteiden, joukosta.

Emulgoitavissa olevat yhdistekonsentraatit käsittävät yhdistettä sopivana pitoisuutena, kuten noin 50 -5 500 g litraa kohden nestettä, joka vastaa suunnilleen osu utta 10 - 50 %, liuotettuna inerttiin kantajaan, joka on joko veteen sekoittuva liuote tai veteen sekoittuvan orgaanisen liuotteen ja emulgointiaineiden seos. Käyttökelpoisiin orgaanisiin liuotteisiin kuuluvat aromaattiset 10 hiilivedyt, erityisesti ksyleenit, ja maaöljyfraktiot, erityisesti maaöljyn korkeassa lämpötilassa kiehuvat naf-teeni- ja olefiiniosat, kuten raskas tai aromaattinen teollisuusbensiini. Muitakin orgaanisia liuotteita, kuten terpeeniliuotteita, hartsijohdannaiset mukaan luettuina, 15 alifaattisia ketoneja, kuten sykloheksanonia, ja kompleksisia alkoholeja, kuten 2-etoksietanolia, voidaan käyttää. Emulgoitavissa oleviin konsentraatteihin soveltuvat emul-gointiaineet valitaan tavanomaisten ionittomien pinta-ak-tiivisuusaineiden, kuten edellä mainittujen, joukosta.

20 Vesipitoiset suspensiot ovat vesipitoiseen vehikke- liin suunnilleen pitoisuudeksi 5-50 paino-% dispergoitu-. jen tämän keksinnön mukaisten veteen liukenemattomien yh- •j· disteiden suspensioita. Suspensiot valmistetaan jauhamalla I « ( * : yhdiste hienojakoiseksi ja sekoittamalla se voimakkaasti 25 vehikkeliin, joka koostuu vedestä ja edellä käsitelyjen « Y". tyyppien joukosta valituista pinta-aktiivisuusaineista.

• · ·

Inerttejä aineosia, kuten epäorgaanisia suoloja ja syn- ♦ · · *·* * teettisiä tai luonnon kumeja, voidaan myös lisätä vesipi toisen vehikkelin tiheyden ja viskositeetin kohottamisek- ** ** 30 si. Usein on tehokkainta jauhaa ja sekoittaa yhdiste sa- • · · *...· manaikaisesti valmistamalla vesipitoinen seos ja homoge- « noimalla se laitteessa, kuten kollerimyllyssä, kuulamyl- « « « « ',·*·, lyssä tai mäntätyyppisessä homogenaattorissa.

*** Kaavan 2 mukaisia yhdisteitä voidaan käyttää myös 35 rakeisina koostumuksina, jotka ovat erityisesti käyttökel- • · · • · • · · 107266 46 poisia maahan tehtävien levitysten yhteydessä. Rakeiset koostumukset sisältävät tavallisesti noin 0,5 - 10 paine-% kaavan 2 mukaista yhdistettä dispergoituna inerttiin kantajaan, joka koostuu kokonaan tai suurelta osin savesta 5 tai vastaavasta halvasta aineksesta. Tällaisia koostumuksia valmistetaan tavallisesti liuottamalla yhdiste sopivaan liuotteeseen ja lisäämällä se rakeiseen kantajaan, joka on ennalta saatettu sopivaan hiukkaskokoon, noin 0,5-3 mm. Tällaisia koostumuksia voidaan formuloida myös 10 valmistamalla taikina tai tahna kantajasta, kuivaamalla yhdistelmäseos, joka sisältää aktiivista aineosaa taikinassa tai tahnassa, ja murskaamalla kuivattu koostumus, niin että saadaan aikaan haluttu hiukkaskoko.

Yhdistettä sisältäviä pölytteitä valmistetaan s s-15 koittamalla jauhemuodossa oleva yhdiste perusteellisesti sopivan maanviljelyskemikaalikantajan, kuten kaoliinisi-ven, vulkaanisen kiven yms., kanssa. Pölytteet voivat sisältää noin 1 - 10 % kaavan 2 mukaista yhdistettä.

On yhtä käytännöllistä levittää yhdiste sopivaan 20 orgaaniseen liuotteeseen, tavallisesti mietoon maaöljyyn, kuten maatalouskemiassa laajasti käytettyihin suihkuteöl-. : : jyihin, valmistetun liuoksen muodossa sen ollessa jostak:.n ··· syystä toivottavaa.

j Insektisidejä ja mitisidejä levitetään tavallisesti « « 25 aktiivisen aineosan nestemäiseen kantajaan valmistetun dispersion muodossa. Levitettäviä määriä kuvataan perin- • · · teisesti aktiivisen aineen pitoisuudella kantajassa. Ylel- • · · * simmin käytetty kantaja on vesi.

Kaavan 2 mukaisia yhdisteitä voidaan levittää myös * 1 30 aerosolikoostumuksen muodossa. Mainitunlaisissa koostumuk- o · · *...· sissa aktiivinen aineosa on liuotettuna inerttiin kante - .:. jaan, joka on painetta muodostava ponneaineseos. Aerosoli- « « « · ,···. koostumus pakataan säiliöön, josta seosta levitetään sumu- * · tusventtiiliin kautta. Ponneaineosaeokset käsittävät joko 35 alhaisessa lämpötilassa liehuvia halogeenihiilivetyjä, • ♦ ♦ • · • » « · 1 107266 47 jotka voidaan sekkoittaa orgaanisten liuotteiden kanssa, tai vesipitoisia suspensioita, jotka on paineistettu inerttikaasuilla tai kaasumaisilla hiilivedyillä.

Hyönteisten ja punkkien olinpaikkaan levitettävä 5 yhdistemäärä ei ole ratkaiseva, ja ammattimiehet pystyvät helposti määrittämään sen annettujen esimerkkien valossa. Yleensä ottaen suunnilleen pitoisuuksien 10-5 000 ppm kaavan 2 mukaista yhdistettä odotetaan antavan tulokseksi hyvän torjunnan. Monien yhdisteiden kohdalla suunnilleen 10 pitoisuudet 100 - 1 000 ppm ovat riittäviä. Peltokasvien, kuten soijapavun ja puuvillan, ollessa kyseessä yhdisteiden sopiva levitysmäärä on noin 0,01 - 1 kg/ha, joka levitetään tyypillisesti käyttämällä 47 - 470 1/ha (5 - 50 gal/acre) suihkuteformulaa.

15 Paikka, johon kaavan 2 mukaista yhdistettä levite tään, voi olla mikä tahansa kohta, jossa hyönteinen tai punkki oleskelee, esimerkiksi vihannesviljelmä, hedelmä-ja pähkinäpuut, viiniköynnökset ja koristekasvit. Koska punkkien munilla on ainutlaatuinen kyky kestää myrkkyvai-20 kutusta, voivat toistuvat levitykset olla toivottavia juuri kuoriutuneiden toukkien torjumiseksi samoin kuin muiden . tunnettujen akarisidien kohdalla.

« · <

Ulkoloisten vastainen aktiivisuus < < t · : Kaavan 2 mukaisilla yhdisteillä on myös hyönteis- i · · • · 25 lahkon Dlptera jäsenten vastainen vaikutus. Taulukoissa XI ja XII on yhteenveto in vitro -tutkimuksista, joissa käy-tettiin kaavan 2 mukaisia yhdisteitä lihakärpäsen toukkia « · » ja aikuisia pistokärpäsiä vastaan; tulokset on mitattu 48 tunnin kuluttua.

• · « · · • · • « · • · · • « · · « · « • » 1 4 « * · · » »» • · » • · « « M· 107266 48

Taulukko Xl

Lihakärpäsen toukkien vastainen vaikutus

Yhdiste Aktiivisuus

Pitoisuus (ppm) Kuolleiden osuus (k) 5 A83543K 2,5 40 A83543P 10,0 10 A83543W 10,0 0 A83543Y 10,0 100

10 Taulukko XII

Aikuisten pistokärpästen vastainen vaikutus

Yhdiste Aktiivisuus

Pitoisuus (ppm) Kuolleiden osuus (! fe > A83543K 2,5 90 15 A835430 5 100 A83543P 10 90 A83543W 10 40 A83543Y 10 90 20 Ulkoloisten vastaiset menetelmät Tämän keksinnön mukainen ulkoloisten vastainen menetelmä toteutetaan antamalla kaavan 2 mukaista yhdistettä isäntäeläimille hyönteis- ja Acarina-loi Sten torjumiseksi.. Anto eläimelle voi tapahtua ihon tai suun kautta tai par-25 enteraalisesti.

, Parasiittisiin hyönteisiin ja Acarina-lajeihin kuu- luu lajeja, jotka ovat verta imeviä samoin kuin lihaa syö-: viä ja jotka ovat loisia koko elämänkiertonsa ajan tili vain osan siitä, kuten vain toukka- tai vain aikuisval- Γ**.ο 30 heessa. Näiden lajien edustajiiin kuuluvat seuraavat; • · · • · · · • · · « « · • Paarma (horse fly) Tabanus spf .

Pistokärpänen (stable fly) Stomoxys calcitrar.s : Mäkärä (black fly) Simullvm spp.

• « · *...· 35 "Verta imevä hevostäi" Haematopinus aslnl .:. (horse sucking louse) I I « » .·*·. Syyhypunkki (mange mite) Sarcoptes scabei

Syyhypunkki (scab mite) Psoroptes equ± "Sarvikärpänen" (horn fly) Haematobia irritans • ♦ · • « • · « * · 107266 49 "Pureva karjatäi"· Bovicola bovis (cattle biting louse) "Lyhytkärsäinen karjatäi” Haematopinus eurysternus (shortnosed cattle louse) 5 "Pitkäkärsäinen karjatäi” Linognathus vituli (longnosed cattle louse)

Tsetsekärpänen (tsetse fly) Glossina spp.

"Karjan karvapussipunkki" Demonex bovis (cattle follicle mite) 10 "Karjapunkki" (cattle tick) Boophilus microplus ja B. decoloratus "Meksikonlahden rannikon punkki" Amblyomma maculaturn (Gulf Coast tick) "Teksasinpunkki" (Lone Star tick) Rmblyomma americanum 15 "Korvapunkki" (ear tick) Otobius meqnini "Kalliovuorten puutiainen" Dermacentor andersoni (Rocky Mountain wood tick)

Raatokärpänen (screw-worm fly) Cochliomyta hominivorax

Petolude (assassin bug) Reduvius spp.

20 Sääski (mosquito) Culiseta Inornata "Ruskea korvapunkki" Rhipicephalus appendiculatus . (brown ear tick) 1(1 "Afrikan punapunkki" Rhipicephalus evertsi mi : (African red tick)

i I I

4 · ,:, 25 "Täpläpunkki" (bont tick) Rmbiblyomma sp.

"Täpläjalkapunkki" (bont legged tick) Hyalomma sp.

• · · *“.* "Sikatäi" (hog louse) Haematopinus suis • · · **’ ’ Hietakirppu (chigoe) Tunga penetrans

Ihmistäi (body louse) Haematopinus ovillus *:**· 30 "Jalkatäi" (foot louse) Linognathus pedalis • · · *...· Lampaantäikärpänen (sheep ked) Melophagus ovinus .:. "Lampaansyyhypunkki" (sheep scab mite) Psoroptes ovis '/··. "Vihreä lihakärpänen" Phaenicia sericata (greenbottle fly) 35 "Musta lihakärpänen" (black blow fly) Phormia regina • > · • · • ♦ • · # 107266 50 "Toissijainen raatokärpänen" Cochliomyta macellaria (screw-worm fly) "Lampaanlihakärpänen" (sheep blow fly) Phaenicia cuprina Lutikka (bed bug) Cimex lectulariis 5 "Etelän kanakirppu" Echidnophaga gallinacBa (Southern chicken flea) "Lintupunkki" (fowl tick) Rrgas persicis "Kanapunkki" (chicken mite) Dermanyssus gallime "Suomujalkapunkki" (scalyleg mite) Knemiddkoptes muta is 10 "Kynijäpunkki" (depluming mite) Knemiddkoptes gallime "Koiran karvapussipunkki" Demonex can is (dog follicle mite)

Koirankirppu (dog flea) Ctenocephalis canLs "Amerikan koirapunkki" Dermacentor variabilLs 15 (American dog tick) "Ruskea koirapunkki" Rhipicephalus sanguine is (brown dog tick)

Keksinnön mukaista menetelmää voidaan käyttää hyj-20 ty- ja seuraeläinten suojaamisen ulkoloisilta. Yhdistettä voidaan antaa edullisesti esimerkiksi hevosille, nautaka::-. jalle, lampaille, sioille, vuohille, koirille, kissoille «44 yms. samoin kuin eksoottisille eläimille, kuten kamelei.L- : le, laamoille, peuroille ja muille lajeille, joita yleensä • · 25 kutsutaan villieläimiksi. Yhdistettä voidaan antaa edull.L- « sesti myös siipikarjalle ja muille linnuille, kuten kalk- • · · *11.* kunoille, kanoille, ankoille yms. Menetelmää sovelletaan ♦ · · edullisesti hyötyeläimiin ja edullisimmin nautakrjaan ja lampaisiin.

*'*’* 30 Ulkoloisten vastaiset koostumukset • · o *..,· Tämä keksintö koskee myös koostumuksia isäntäelä:.- .:. men verta kuluttavien hyönteisulkoloispopulaatioiden kon ;- • · · · .···. rolloimiseksi. Näitä koostumuksia voidaan käyttää hyöty -, ·’ seura- ja villieläinten suojelemiseen ulkoloisilta. Kooa- • » · • · · 4 4» « · • · • · « 107266 51 tumuksia voidaan edullisesti antaa myös siipikarjalle ja muille linnuille.

Menetelmää sovelletaan tai koostumuksia käytetään edullisesti hyötyeläinten ja edullisimmin nautakarjan ja 5 lampaiden suojaamiseksi. Tehokas antomäärä, annon ajoitus ja antotapa vaihtelevat laajasti loisiajin, loishyökkäyk-sen voimakkuuden ja muiden tekijöiden mukaan. Antoja voidaan tehdä ajoittain isännän koko eliniän ajan tai vain loishyökkäyksen huippukauden aikana. Yleisesti ottaen ul-10 koloisten torjunta saadaan aikaan antamalla paikallisesti nestemäisiä formuloita, jotka sisältävät noin 0,0005 -noin 95 % kaavan 2 mukaista yhdistettä, edullisesti korkeintaan 5 % ja edullisimmin korkeintaan 1 % kaavan 2 mukaista yhdistettä. Tehokas loisten torjunta saavutetaan 15 antomäärän ollessa noin 5 - 100 mg/kg.

Kaavan 2 mukaisia yhdisteitä annetaan isäntäeläi-mille käyttämällä tavanomaisia eläinlääketieteellisiä toimintatapoja. Yhdisteet formuloidaan tavallisesti ulkolois-ten vastaisiksi koostumuksiksi, jotka käsittävät kaavan 2 20 mukaista yhdistettä ja fysiologisesti hyväksyttävää kantajaa. Nestemäisiä koostumuksia voidaan esimerkiksi yksin- . kertaisesti suihkuttaa eläimille, joiden kohdalla toivo- • « · ··· taan ulkoloisten torjuntaa. Eläimet voivat myös saattaa « « · · : tekemään itsehoito sellaisten välineiden selänhankauslait- • «« • · 25 teiden avulla, jotka voivat sisältää kaavan 2 mukaista !1)·. yhdistettä ja esimerkiksi kankaan, jota vasten eläin voi • ♦ · *ΓΓ.1 kävellä kosketukseen. Myös kastoaltaita käytetään aktiivi- • · · * sen aineen antamiseen isäntäeläimelle.

Anto suun kautta voidaan toteuttaa sekoittamalla * 1 30 yhdiste eläimen rehuun tai juomaveteen tai antamalla an- * · · *...· nostusmuotoja, kuten tabletteja, kapseleita, isokokoisia .:. tabletteja tai istutteita. Ihon kautta tapahtuva anto to- • 1 « ♦ ·.···. teutetaan kätevästi injektoimalla ihonalaisesti, vatsaon- *·’ telonsisäisesti ja laskimonsisäisesti ruiskeformulaa.

» · 1 » · · · · « · « · M· 107266 52

Kaavan 2 mukaiset yhdisteet voidaan formuloida suin kautta tapahtuvaa antoa varten tavanomaisiin muotoihii, kuten lääkeliuoksiksi, tableteiksi tai kapseleiksi. TäL-laiset koostumukset vaativat tietenkin oraaliseen antoin 5 hyväksyttäviä inerttejä kantajia. Yhdisteet voidaan formuloida myös injektioliuokseksi tai -suspensioksi ihonalaista, ihonsisäistä, pötsinsisäistä, vatsaontelonsisäisti, lihaksensisäistä tai laskimonsisäistä injektointia vartei. Joissakin sovellutuksissa on kätevää formuloida yhdisteet 10 tavanomaisen eläinrehun yhdeksi komponentiksi. Tässä suoritusmuodossa keksinnön mukainen yhdiste formuloidaan ensin esiseokseksi, jossa yhdiste on dispergoituna nestemäiseen hiukkasmaiseen, kiinteään kantajaan. Esiseos voi sisältää noin 4-550 g/kg (2 - 250 g/lb) kaavan 2 mukaisia 15 yhdistettä. Esiseos puolestaan formuloidaan lopulliseksi rehuksi tavanomaisesti sekoittamalla.

Koska loishyökkäystä tapahtuu yleensä olennaisen osan aikana isäntäeläimen eliniästä, on edullista antaa kaavan 2 mukaisia yhdisteitä muodossa, jolla saadaan a:.-20 kaan pitkittynyt vapautuminen jonkin ajanjakson kuluessa.

Tavanomaisiin menettelyihin kuuluu sellaisen matriks:.n . käyttäminen, joka estää fysikaalisesti liukenemista, joi.- < i c .«· loin matriksi on vahamainen puolikiinteä aine, kuten kas- <44· : vivahat, tai suurimoolimassainen polyeteeniglykoli. Yksi 25 hyvä tapa antaa yhdisteitä on käyttää pitkitetystä vaikut:- « tavia suuria tabletteja, kuten Labyn (US-patenttijulkaisu 4 251 506) ja Simpsonin (GB-patenttijulkaisu 2 059 767) • · · • · o * mukaisia tabletteja. Tällaisen suuren tabletin ollessa kyseessä yhdiste koteloitaisiin polymeerimatriksiin, kuten ····· * * 30 Nevinin (US-patenttijulkaisu 4 273 920) mukaiseen matrik- ·»· siin. Tämän keksinnön mukaisten yhdisteiden pitkitetty vapautuminen voidaan saada aikaan myös käyttämällä istv- « « · · .···. tetta, kuten silikonipitoisesta kumista valmistettua istv- '** tetta.

* · · • · « • · · • · 107266 53

Seuraavat esimerkit annetaan tämän keksinnön toiminnan valaisemiseksi tarkemmin.

Esimerkki 1

Menetelmä A83543:n määrittämiseksi 5 Seuraava analyyttinen suurtehonestekromatografia (HPLC) -menetelmä on käyttökelpoinen fermentoinnin seuraamiseksi komponenttien A83543K, A835430, A83543P, A83543U, A83543V, A83543W ja A83543Y ja muiden A83543-komponenttien tuottamisen yhteydessä.

10 Koko liemestä otettu näyte laimennetaan kolminker taisella tilavuudella asetonitriiliä tekijöiden uuttamiseksi myseeleistä. Tuloksena oleva liuos suodatetaan sitten 0,45 pm:n polytetrafluorieteeni (PTFE) -suodattimen läpi hiukkasmaisen materiaalin poistamiseksi ennen ruis-15 kuttamista HPLC-määritysjärjestelmään. Liuosta, joka si sältää puhdistettua A83543A:ta pitoisuutena 100 mg/ml me-tanolissa, käytetään ulkoisena standardina määrityksessä ja kaikkien A83543-komponenttien muodostamien piikkien pinta-alat suhteutetaan tähän kalibrointistandardiin yk-20 sittäisten komponenttien pitoisuuksien määrittämiseksi.

HLPC-järj estelmä . Kolonnin kantaja: YMC-PACK-kolonni, sisähalkaisija ··· 4,6 x 100 mm, 5 pm pallomainen, 120 A (YMC Inc., Morris « « · · : Plains, NJ)

< M

25 Liikkuva faasi: CH3CN/MeOH/H20 (3:3:2), joka sisäl- tää 0,05 % ammoniumasetaattia.

• · · w • · * *11.* Virtausnopeus: 2 ml/min • · · ** ’ Detektointi: UV aallonpituudella 250 nm

Retentioajat: A83543A 15,52 min « 30 A83543K 8,10 min A835430 11,40 min ♦ .:. A83543P 6,40 min /*··. A83543U 5,22 min ♦ · A83543V 7,05 min 35 A83543W 8,47 min A83543Y 6,12 min 707266 54

Esimerkki .2 A83543K:n ja A835430:n valmistus käyttämällä viljelmää NRRL 18538 (A83543.4) A. Ravistuspullofermentointi 5 Käytettiin viljelmää S. spinosa NRRL 18538 jo co kylmäkuivattuna pellettinä tai nestetypessä ylläpidettylä suspensiona koostumukseltaan seuraavan vegetatiivissn alustan inokulointiin: 10 Vegetatiivinen alusta 1

Aineosa Määrä (g)

Entsyymillä hydrolysoitu kaseiini* 30

Hiivauute 3

MgS04 · 7H20 2 15 Glukoosi 10

Deionisoitu vesi täytetään 1 ljksi

pH 6,6, säädetään pH arvoon 6,5 NaOH:11a *NZ Amine A, Sheffield Products, Norwich, NY

20 Vinopintoja tai maljoja voidaan valmistaa lisäämäl- lä 2,5 % agaria vegetatiiviseen alustaan. Inokuloitua vd- . nopintaa inkuboidaan noin 10 - 14 vuorokautta lämpötilass a *;* 30 °C. Valmista vinopintaviljelmää raaputetaan steriilillä « « · * j välineellä itiöiden irrottamiseksi ja myseelimaton poiste- « « 25 miseksi ja pehmentämiseksi. Noin neljäsosa siten saaduista irrotetuista itiöistä ja kasvustosta käytetään ensimmäisen » · · *II.‘ vaiheen vegetatiivisen alustan (50 ml) inokulointiin.

• · ·

Vaihtoehtoisesti ensimmäisen vaiheen alusta voidaan inoku-loida nestetypessä pidetystä ampullista käsin.

* * 30 Kun viljelmää pidetään yllä nestetypessä, ampullit ··» valmistetaan käyttämällä yhtä suuri tilavuus vegetatiivis-ta viljelmää (48 - 72 tunnin inkubointi, 30 °C) ja suspen- ·«·* .···, dointiväliainetta. Suspendointiväliaine sisältää laktoosia • · *** (100 g), glyserolia (200 ml) ja deionisoitua vettä (täyteni.· 35 tään 1 l:ksi).

* » « • ♦ • ♦ • » · 107266 55

Nestetypessä pidetyllä ampullilla inokuloidaan 50 ml vegetatiivista alustaa 250 ml:n erlenmeyerpulloissa. Viljelmiä inkuboidaan 48 tuntia lämpötilassa 30 °C ravis-timellä, joka kiertää 5,08 cm:n (2 in) ympyrää kierrostaa-5 juudella 250 min"1.

Inkuboidulla viljelmällä (5 til-% inokulaattia) inokuloidaan 30 ml tuotantoalustaa 250 ml:n laajasuisessa erlenmeyerpullossa. Alustan koostumus oli seuraava: 10 Tuotantoalusta

Aineosa Määrä (g)

Glukoosi 80

Peptonisoitu maito* 20

Puuvillasiemenj auho** 30 15 Maissiliemi 10

CaC03 (tekninen laatu) 5

Metyylioleaatti 30***

Vesijohtovesi täytetään 1 l:ksi

*Peptonized Milk Nutrient, Sheffield Products, Norwich, NY 20 **Proflo, Traders Protein, Memphis, TN

***Metyylioleaatin määrä oli 30 ml.

( I I I I I

Inokuloitua tuotantoalustaa inkuboidaan 250 ml:n 1 « 4 · : laajasuisissa erlenmeyerpulloissa 7 vuorokautta lämpöti- 25 lassa 30 °C ravistimella, joka kiertää 5,08 cm:n (2 in) ympyrää kierros taajuudella 250 min'1. Sinefungiinia lisät-·**/ tiin suunnilleen loppupitoisuudeksi 100 pg/ml 72 tunnin i « « *·* * kuluttua inokuloinnista.

B. Fermentointi sekoituksella varustetussa reakto- ’*”* 30 rissa • · · *.,/ Suuremman inokulaattitilavuuden saavuttamiseksi inkokuloidaan 10 ml :11a inkuboitua, esimerkissä 2, osassa « *··· A kuvatulla tavalla valmistettua ensimmäisen vaiheen alus- » · • · *!* taa 400 ml toisen vaiheen vegetatiivista alustaa, jonka « ·.·.· 35 koostumus on sama kuin ensimmäisen vaiheen alustan. Tätä «* * • « • · I·· 107266 56 toisen vaiheen vegetatiivista alustaa inkuboidaan 2 l:n laajasuisessa erlenmeyerpullossa noin 48 tuntia lämpötilassa 30 °C ravistimellä, joka kiertää 5,08 cm:n (2 in) ympyrää kierrostaajuudella 250 min"1.

5 Siten valmistetulla inkuboidulla toisen vaiheen vegetatiivisella alustalla (2 1) inokuloidaan 115 1 steriiliä tuotantoalustaa, joka valmistetaan esimerkissä 2, osassa A kuvatulla tavalla. Sinefungiinia lisättiin suodatettuna metanoliliuoksena 66 tunnin kuluttua loppupito;!-10 suudeksi 100 pg/ml.

Inokuloidun tuotantoalustan annettiin fermentoitua sekoituksella varustetussa 165 l:n bioreaktorissa 7 vuorokautta lämpötilassa 30 °C. Ilman virtausta ja sekoittimon nopeutta sekoitusastiassa säädellään tietokoneella, ni:.n 15 että liuenneen hapen pitoisuus pidetään noin 80 %:na kyl.-lästysarvosta.

Esimerkki 3 A83543K:n ja A835430:n ja A83543Y:n valmistus käyt- tämällä viljelmää NRRL 18743 (A83543.8) 20 A. Ravistuspullofermentointi Käytettiin viljelmää S. spinosa NRRL 18743 joko . kylmäkuivattuna pellettinä tai nestetypessä ylläpidettynä 11« suspensiona koostumukseltaan seuraavan vegetatiivisen : alustan inokulointiin: • «· « * 25 « · · ^ « !**! Vegetatiivinen alusta 2 *".* Aineosa Määrä (g) • · · *·* * Trypticase-soijaliemi* 30

Hiivauute 3 30 MgS04 · 7H20 2

Glukoosi 5

Maltoosi 4 ♦ ...^ Deionisoitu vesi täytetään 1 l:ksi • ·

*1* Autoklavoidaan 30 min lämpötilassa 120 °C

·.·.· 35 ^Baltimore Biological Laboratories, Cockeysville, MD

• » · • · ♦ · ·»» 107266 57

Vinopintoja tai maljoja voidaan valmistaa lisäämällä 2,5 % agaria vegetatiiviseen alustaan. Inokuloitua vi-nopintaa inkuboidaan noin 10 - 14 vuorokautta lämpötilassa 30 °C. Valmista vinopintaviljelmää raaputetaan steriilillä 5 välineellä itiöiden irrottamiseksi ja myseelimaton poistamiseksi ja pehmentämiseksi. Noin neljäsosa siten saaduista irrotetuista itiöistä ja kasvustosta käytetään ensimmäisen vaiheen vegetatiivisen alusta (50 ml) inokulointiin. Vaihtoehtoisesti ensimmäisen vaiheen alusta voidaan inokuloida 10 nestetypessä pidetystä ampullista käsin.

Nestetypessä pidettävä varastoinokulaatti valmistettiin homogenoimalla vegetatiivinen viljelmä, laimentamalla se tilavuussuhteessa 1:1 steriilillä suspendointiai-neella, joka oli glyserolin, laktoosin ja veden seos (2: 15 1:7), ja siirtämällä se steriileihin putkiin (1,5 ml/put- ki). Laimennettu inokulaatti säilytettiin sitten nestetypessä sopivista varastointisäiliöissä ja käytettiin varas-toinokulaattina ravistuspulloviljelmien ja fermentoriin laitettavan inokulaatin kasvatukseen.

20 Nestetypessä ollut ampulli sulatettiin nopeasti ja käytettiin siitä 0,5 ml vegetatiivisen alusta (50 ml) ino-. kulointiin laajasuisissa 250 ml:n erlenmeyerpulloissa.

··1 Viljelmiä inkuboidaan 48 tuntia lämpötilassa 30 °C ravis-

I U I

•\! timella, joka kiertää 5,08 cm:n (2 in) ympyrää kierrostaa- 25 juudella 250 min .

« • ]·. Inkuboidulla viljelmällä (5 til-% inokulaattia) • ♦ ♦ “!.1 inokuloidaan 25 ml tuotantoalue taa, jonka koostumus on • · 1 • seuraava: 1 30 Tuotantoalusta

Aineosa Määrä (g) .:. Glukoosi 80 Φ • M» ,···, Peptonisoitu maito1 20 • · 107256 58

CaC03 (tekninen laatu) 5

Metyylioleaatti 30

Vesijohtovesi täytetään 1 l:ksi

*Peptonized Milk Nutrient, Sheffield Products, Norwich, NY 5 **Proflo, Traders Protein, Memphis, TN

Inokuloitua tuotantoalustaa inkuboidaan 250 ml:n laajasuisissa erlenmeyerpulloissa 7 vuorokautta lämpötilassa 30 °C ravistimella, joka kiertää 5,08 cm:n (2 in) 10 ympyrää kierrostaaj uudella 250 min-1.

Bo Fermentointi sekoituksella varustetussa reaktorissa

Suuremman inokulaattitilavuuden saavuttamiseksi inkokuloidaan 10 ml:11a inkuboitua, esimerkissä 3, osassa 15 A kuvatulla tavalla valmistettua ensimmäisen vaiheen alustaa 400 ml toisen vaiheen vegetatiivista alustaa, jonka koostumus on sama kuin ensimmäisen vaiheen alustan. Tä:ä toisen vaiheen vegetatiivista alustaa inkuboidaan 2 l:n laajasuisessa erlenmeyerpullossa noin 48 tuntia lämpöt1-20 lassa 30 °C ravistimella, joka kiertää 5,08 cm:n (2 in) ympyrää kierrostaaj uudella 250 min'1.

, Siten valmistetulla inkuboidulla toisen vaiheen

III

«> vegetatiivisella alustalla (2 1) inokuloidaan 115 1 ste-

I I I I

.·. : rilliä tuotantoalustaa, joka valmistetaan esimerkissä 3, i · 25 osassa A kuvatulla tavalla.

I1! Inokuloidun tuotantoalustaa annetaan fermentoitua • · · • · · *“.1 sekoituksella varustetussa 165 l:n bioreaktorissa 7 vuoro- • · ·

• I I

• kautta lämpötilassa 30 °C. Ilman virtausta ja sekoittimen nopeutta sekoitusastiassa säädellään tietokoneella, ni:.n • 1 30 että liuenneen hapen pitoisuus pidetään noin 80 %:na ky!.-

Ml ...1 lästysarvosta.

• M t ··· « · ♦ • ♦ • 1

Ml » f • tl • · · « · » · · « · • 1

IM

107266 59

Esimerkki .4 A83543P:n ja A83543W:n eristäminen sinefungiinin läsnä ollessa fermentoidusta NRRL 18719:sta (A83543.6) 5 Fermentointilientä (190 1, valmistettu olennaisesti esimerkissä 2B kuvatulla tavalla, paitsi että käytettiin kantaa Ά83543.6) pidettiin jääkaappilämpötilassa kaksi vuorokautta ennen käsittelyä. Koko liemeen lisättiin 190 1 asetonia, kun pH oli ensin säädetty arvoon 3,0 HCl-liuok-10 sella (5 ekv/1). Tuloksena oleva suodos suodatettiin ke-raamisuodattimella, jolloin saatiin suodos (335 1), jota pidettiin viikonlopun yli jääkaappilämpötilassa. Liemi-asetoni suodoksen pH säädettiin arvoon 10 NaOH-liuoksella (5 ekv/1) ja seos suodatettiin uudelleen keraamisuodat-15 timen ennen syöttämistään teräskolonnille (10 1; 10 cm x 122 cm), joka sisälsi HP-20ss-hartsia (Mitsubishi Chemical Industries, Ltd., Japani), virtausnopeudella 1 1/min. Ko-lonni huuhdottiin seoksella, joka sisälsi CH3CN:ä, CH30H:a ja NH40Ac:n 0,l-%:ista vesiliuosta (pH säädetty arvoon 8,1 20 NH40H:lla) suhteessa 25:25:50 (20 1), ja eluoitiin sitten seoksella, joka sisälsi CH3CN:ä, CH30H:a ja NH40Ac:n , 0,l-%:ista vesiliuosta (pH säädetty arvoon 8,1 NH40H:lla) suhteessa 95:95:10 (40 1) keräten 2 l:n fraktioita. Frak-tiot 3-9 konsentroitiin kuiviin, liuotettiin uudelleen 25 CH,0H:iin (100 ml), konsentroitiin uudelleen ja seostettiin

Ml J w

C

**** sitten CH3CN:iin (1 1). Tuloksena oleva sakka poistettiin • · · ••j * suodattamalla ja heitettiin pois; suodos konsentroitiin « ♦ ♦ *·* * kuiviin. Tuloksena oleva jäännös liuotettiin uudelleen dikloorimetaaniin (25 ml) ja laitettiin silikageeliä (EM-*·**· 30 laatu 62, 60 - 200 mesh) sisältävään kolonniin (7,5 cm x 50 cm), joka oli tasapainotettu asetonitriilillä. Kolonni eluoitiin CH3CN:llä (4 1), sitten CH3CN:n ja CH30H:n seok-sella (9:1; 5 1) ja sen jälkeen CH30H:lla (1 1) keräten ‘I’ 1 l:n fraktioita. Fraktioyhdistelmä 1 (fraktiot 3 - 4) s.j.i 35 sisälsi A83543-komponentteja J ja L; fraktioyhdistelmä 3 • * · • » ♦ · 107266 60 (fraktiot 7 - 10.) sisälsi A83543-komponentteja M ja SI.

Fraktioyhdistelmä 2 (fraktiot 5 - 6), joka sisälsi uusia komponentteja P ja W, konsentroitiin kuiviin. Tulokseia oleva jäännös liuotettiin CH3OH:iin (10 ml) ja syötettiin 5 preparatiiviseen käänteisfaasi-HPLC-kolonniin [Rainin

Dynamax-60Ä 8 pm C18, 41,4 mm (sisäläpimitta) x 25 an, jossa oli suojamoduuli (41,4 mm x 5 cm)], joka oli tasa- painotettu H20:n, CH30H:n ja CH3CN:n seoksella (30:35:35, sisältää 0,1 % NH4Ac: a] . Kolonni eluoitiin virtausnopeude 10 la 40 ml/min gradientilla, joka sekoitettiin liuottees:a "A" (H20, CH30H, CH3CN, 30:35:35, sisältää 0,1 % NH4Ac:a) ja liuotteesta "B" (H20, CH30H, CH3CN, 10:45:45, sisältää 0,1 % NH4Ac:a). Pumppausjärjestelmä ohjelmoitiin muodostamaan lineaarinen gradientti 25 - 75 % B:tä 60 minuutin aikana.

15 Erottumisen edistymistä seurattiin aallonpituussäädöli.ä varustetulla UV-detektorilla, joka oli säädetty arvoon 250 nm. Pääpiikki kerättiin kuudessa 3 min:n fraktiossci.

Fraktiot 1 - 2, jotka sisälsivät uutta komponenttia I', konsentroitiin tilavuuteen 40 ml, tehtiin sitten suolari- 20 poisto samalla HPLC-kolonnilla, joka oli tasapainotettu H20:n, CH30H:n ja CH3CN:n seoksella (30:35:35), eluoimalla 60 min kestävällä lineaarisella gradientilla seoksesta H2C , CH30H, CH3CN (30:35:35) seokseen H20, CH30H, CH3CN (10:45: : 45). UV:a absorboiva piikki (ensimmäisten 2 min:n aikana 25 eluoitunut osa pois luettuna) otettiin talteen ja konsent- Y". roitiin kuiviin. Tuloksena oleva jäännös liuotettiin t- ♦ · · « · · ***,* BuOH:iin (10 ml) ja kylmäkuivattiin, jolloin saatiin puh- • · · *·* dasta komponenttia P (479 mg). Edellä saadut yhdistetyt

fraktiot 3 - 4, jotka sisälsivät komponenttien P ja M

« *·'*· 30 seosta, konsentroitiin tilavuuteen 20 ml, syötettiin pre- «·· paratiiviseen käänteisfaasi-HPLC-kolonniin [Rainiu Dynamax-60Ä 8 pm C18, 21,4 mm (sisäläpimitta) x 25 cm, jossa oli suojamoduuli (21,4 mm x 5 cm)], joka oli tasapainotettu H20:n, CH30H:n ja CH3CN:n seoksella (30:35:35, .:.· 35 sisältää 0,1 % NH4Ac:a], ja eluoitiin virtausnopeudella • m m « • » · 107266 61 10 ml/min gradientilla, joka sekoitettiin liuotteesta "A" (H20, CH30H, CH3CN, 30:35:35, sisältää 0,1 % NH4Ac:a) ja liuotteesta "B" (H20, CH30H, CH3CN, 10:45:45, sisältää 0,1 % NH4Ac:a). Pumppausjärjestelmä ohjelmoitiin muodostamaan 5 lineaarinen gradientti 25 - 75 % B:tä 60 minuutin aikana. Kaksi suurinta UV:a absorboivaa piikkiä (komponentti P ja sen jälkeen komponentti W) otettiin talteen. Komponentti W:tä sisältävät fraktioyhdistelmä konsentroitiin pieneen tilavuuteen ja tehtiin sitten suolanpoisto samalla HPLC-10 kolonnilla, joka oli tasapainotettu H20:n, CH30H:n ja CH3CN:n seoksella (30:35:35). Komponentti W eluoitiin 60 min kestävällä lineaarisella gradientilla seoksesta H20, CH30H, CH3CN (30:35:35) seokseen H20, CH30H, CH3CN (10:45: 45) virtausnopeudella 10 ml/min, jolloin UV: a absorboiva 15 piikki kerääntyi 10:een 3 min:n fraktioon. Yhdistetyt

fraktiot 2-7 konsentroitiin jäännökseksi, liuotettiin t-BuOH:iin ja kylmäkuivattiin, jolloin saatiin puhdasta komponenttia W (82 mg). Edellä saadulle komponenttia P sisältävälle UV:a absorboivalle piikille tehtiin suolanpoisto 20 samalla tavalla, jolloin saatiin lisää komponenttia P

(132 mg).

. Esimerkki 5

I I I

A83543U:n ja A83543V:n eristäminen sinefungiinin : läsnä ollessa fermentoidusta NRRL 18823:sta 25 (A83543.9) ΓΊ Fermentointilientä (500 ml; 30 x 250 ml:n ravistus- • · · •*j/ pulloa, valmistettu olennaisesti esimerkissä 2A kuvatulla *·* * tavalla, paitsi että käytettiin kantaa A83543.9) uutettiin metanolilla (1,3 1) sekoittaen 1 tunnin ajan ja suodatet-30 tiin sitten käyttämällä suodatusapuainetta (3 % Hyfloa), * jolloin saatiin metanolipitoinen suodos (1,5 1). Biomassa uutettiin uudelleen metanolilla (700 ml) ja suodatettiin. Saadut kaksi metanolipitoista uuteliuosta yhdistettiin ja lisättiin yhtä suuri tilavuus vettä. Lisättiin HP-20-hart- 35 siä (75 ml) ja sekoitettiin 2 tuntia, minkä jälkeen liete • · • · 107266 62 kaadettiin lasiseen kromatografiakolonniin. Effluentti (5 1) heitettiin pois samoin kuin kolonninhuuhteluliuos (CH30H, H20; 1:1, 500 ml). Sitten kolonni eluoitiin aseta-nilla 250 ml). Asetonieluaatti yhdistettiin eluaattiin, 5 joka saatiin koko liemelle tehdystä samanlaisesta uutosta ja kromatografiästä (500 ml; 40 x 250 ml ravistuspulloa), ja konsentroitiin kuiviin. Tuloksena oleva jäännös liuotettiin dikloorimetaaniin (10 ml) ja laitettiin silikageo-liä (EM-laatu 62, 60 - 200 mesh) sisältävään kolonniin 10 (2,5 cm x 25 cm), joka oli tasapainotettu asetonitriilil- lä. Kolonni huuhdottiin asetonitriilillä ja eluoitiin sir-ten lineaarisella gradientilla asetonitriilistä asetoni-;-riilin metanolin seokseen (4:1) keräten 25 ml:n fraktioita. Fraktiot 34 - 43, jotka sisälsivät uusia A83543-kompo-15 nentteja U ja V, yhdistettiin (200 ml) ja konsentroitiin kuiviin. Jäännös liuotettiin metanoliin (2 ml) ja syötettiin preparatiiviseen käänteisfaasi-HPLC-kolonniin [Rainj n Dynamax-60Ä 8 pm C18, 21,4 mm (sisäläpimitta) x 25 cm,

jossa oli suojamoduuli (21,4 mm x 5 cm)], joka oli tase.-20 painotettu H20:n, CH30H:n ja CH3CN:n seoksella (30:35:3S , sisältää 0,1 % NH4Ac:a]. Kolonni eluoitiin 60 min kestävä!-. lä lineaarisella gradientilla seoksesta H20, CH30H, CH3CN

(30:35:35), joka sisältää 0,1 % NH4Ac:a, seokseen H2C, .·. : CH30H, CH3CN (10:45:45), joka sisältää 0,1 % NH4Ac:a, vir- 25 tausnopeudella 10 ml/min. Isoimmat piikit (UV-seurava aal-lonpituudella 250 nm), jotka sisälsivät uusia komponentte- ♦ · · *11.1 ja U ja V, saatiin talteen ennen jäännöskomponentteja H ja • · · * Q. Komponenttia U sisältäville yhdistetyille fraktioilla tehtiin suolanpoisto samalla HPLC-kolonnilla, joka oli * 1 30 tasapainotettu H20:n, CH30H:n ja CH3CN:n seoksella (30:35: * · · 35), eluoimalla lineaarisella gradientilla seoksesta H20, CH30H, CH3CN (30:35:35) seokseen H20, CH30H, CH3CN (10:45: .·1·. 45). Komponentti U eluoitiin 2 min:n fraktioina (10).

’** Fraktiot 2-8 yhdistettiin ja konsentroitiin sitten kui- 35 viin. Jäännös liuotettiin t-BuOH:iin (5 ml) ja kylmäkui - • · · « · · » 107266 63 vattiin, jolloin saatiin puhdasta komponenttia U (71 mg). Komponenttia V sisältävälle fraktioyhdistelmälle tehtiin suolanpoisto ja kylmäkuivaus noudattamalla samaa menette-lyä, jolloin saatiin puhdasta komponenttia V (7 mg).

5 Esimerkki 6 A83543K:n ja A835430:n eristäminen sinefungiinin läsnä ollessa fermentoidusta NRRL 18538:sta (A83543.4)

Fermentointiliemi (210 1) valmistettiin olennaises-10 ti esimerkissä 2B kuvatulla tavalla. Koko liemeen lisättiin asetonia ja sen pH säädettiin arvoon 8,0. Tuloksena oleva seos suodatettiin keraamisuodattimen läpi, jolloin saatiin suodos (370 1). Liemi-asetonisuodos syötettiin te-räskolonnille (10 1; 10 cm x 122 cm), joka sisälsi HP- 15 20ss-hartsia (Mitsubishi Chemical Industries, Ltd., Japani), virtausnopeudella 1 1/min ja otettiin effluentti talteen yhtenä eränä. Kolonni eluoitiin virtausnopeudella 1 1/min gradientilla, joka sekoitettiin liuotteesta "A" (0,1 % NH4Ac:a) ja liuotteesta "B" (CH30H ja CH3CN, 1:1). 20 Pumppausjärjestelmä ohjelmoitiin syöttämään 50 % liuotetta B 2 min:n ajan, sen jälkeen lineaarinen gradientti 50 -;·; 80 % B:tä (45 min) ja sen jälkeen lineaarinen gradientti 80 - 90 % B:tä (33 min); 4 l:n fraktioita kerättiin 20. Fraktiot 13 - 17, jotka sisälsivät komponentteja K ja 0, ‘25 yhdistettiin. Kolonnista tulleen effluentin (katso edellä) **** pH säädettiin arvoon 9,5 NaOH-liuoksella (5 ekv/1) ja eff- • · · ·”/ luentti syötettiin uudelleen HP-20ss-kolonniin. Pumppaus- • · · *·* * järjestelmä ohjelmoitiin syöttämään 50 % liuotetta B 1 min:n ajan, lineaarinen gradientti 50 - 75 % B:tä 30 (30 min), lineaarinen gradientti 75 - 85 % B:tä (45 min), • « · *###J lineaarinen gradientti 85 - 88 % B:tä (15,4 min) ja line- \·, aarinen gradientti 88 - 100 % B:tä (20 min) virtausnopeu- "I! della 1 1/min; 4 l:n fraktioita kerättiin 22. Fraktiot 7 - ‘1* 17 yhdistettiin toisiinsa ja edellä saatuun yhdistelmään 35 (fraktiot 13 - 17 ensimmäisestä HP-20ss-kromatografiästä, • · » « » * · « · · 107266 64 katso edellä). Nämä yhdistetyt fraktioyhdistelmät konsentroitiin tilavuuteen 4 1 ja sitten edelleen kuiviin, liuotettiin uudelleen CH3OH:iin (100 ml) ja saostettiin sitton CH3CN:iin (3 1). Tuloksena oleva sakka poistettiin suodat-5 tamalla ja heitettiin pois; suodos konsentroitiin kuiviin. Tuloksena oleva jäännös liuotettiin uudelleen dikloorime-taaniin (50 ml) ja laitettiin silikageeliä (EM-laatu 62, 60 - 200 mesh) sisältävään kolonniin (6 cm x 24 cm), joka oli tasapainotettu asetoni triilillä. Kolonni eluoiti:.n 10 CH3CN:llä (4 1) ja sitten CH3CN:n ja CH30H:n seoksella (9:1.; 10 1) ottaen talteen 10 kpl 250 ml:n fraktioita ja sen jälkeen 7 kpl 1 l:n fraktioita. Komponentteja K ja 0 sisältävät fraktiot 6-15 konsentroitiin kuiviin. Tuloksena oleva jäännös liuotettiin CH30H:iin (100 ml) ja syötettiin 15 (20 ajoa) preparatiiviseen käänteisfaasi-HPLC-kolonnii.n [Rainin Dynamax-60Ä. 8 pm C18, 41,4 mm (sisäläpimitta) x 25 cm, jossa oli suojamoduuli (41,4 mm x 5 cm)], joka oli tasapainotettu H20:n, CH30H:n ja CH3CN:n seoksella (50:17S: 175, sisältää 0,1 % NH4Ac:a]. Kolonni eluoitiin virtausnc-20 peudella 40 ml/min. Erottumisen edistymistä seurattiin aallonpituussäädöllä varustetulla UV-detektorilla, joka ·/: oli säädetty arvoon 250 nm. UV:a absorboivat piikit (20 kromatografia-a josta) kerättiin 7 f raktioyhdistelmäksi.

: Kaksi suurinta piikkiä vastasivat komponentteja K ja 0.

25 Fraktioyhdistelmä 3(61) sisälsi komponenttia K (puhtaus- Y”. aste 98 %). Komponentteja 0 ja K sisältävä fraktioyhdis- • · *”.* telmä 4 (8 1) konsentroitiin tilavuuteen 200 ml ja käsi- • · · *·* * teltiin uudelleen kromatografisesti (4 ajoa) samoissa olo suhteissa ottaen talteen kyseiset kaksi piikkiä kahtena ’·**· 30 fraktioyhdistelmänä. Fraktioyhdistelmä 1 (3 1) sisälsi • · · komponenttia K (puhtausaste 98 %). Fraktioyhdistelmä 2 (5 1) sisälsi komponenttia 0 (95 %) ja komponenttia li [*··. (5 %). Fraktioyhdistelmä 2 konsentroitiin tilavuuteen 100 ml ja sille tehtiin suolanpoisto kromatografisesti *.!.·’ 35 samalla HPLC-kolonnilla (3 ajoa) tekemällä eluoint:.

• · · • t • · • * · 107266 65 60 min:n pituisella lineaarisella gradientilla seoksesta H20, CH30H, CH3CN (30:35:35) seokseen H20, CH30H, CH3CN (10:45:45). UV:a absorboiva eluaatti otettiin talteen kymmenenä 3 min:n fraktiona. Fraktiot, jotka sisälsivät kom-5 ponenttia O jonka puhtausaste oli > 98 %, yhdistettiin, konsentroitiin kuiviin ja kylmäkuivattiin t-Bu0H:sta, jolloin saatiin komponenttia O (2,5 g, puhtausaste > 98 %). Komponenttia K sisältävät fraktioyhdistelmät, jotka saatiin ensimmäisestä preparatiivisesta HPLC-erotuksesta (yh-10 distelmä 3, 6 1) ja komponentin O uudelleenpuhdistuksesta (yhdistelmä 1, 3 1), yhdistettiin, konsentroitiin tilavuuteen 200 ml ja tehtiin suolanpoisto samalla tavalla kuin komponentille O. Fraktiot, jotka sisälsivät komponenttia K jonka puhtausaste oli >98 %, yhdistettiin, konsentroitiin 15 kuiviin ja kylmäkuivattiin t-BuOH:sta, jolloin saatiin komponenttia K (11,1 g, puhtausaste > 99 %).

Esimerkki 7 A83543K:n, A835430:n ja A83543Y:n eristäminen kannasta NRRL 18743 (A83543.8) 20 Fermentointiliemi (260 1) valmistettiin olennaises ti esimerkissä 3B kuvatulla tavalla. Koko liemeen lisät-. tiin asetonia (260 1), kun sen pH oli ensin säädetty ar- «<· voon 3,0 HCl-liuoksella (5 ekv/1). Tuloksena oleva seos : suodatettiin ker aarni suodattimen läpi, jolloin saatiin suo- 25 dos (480 1), joka pidettiin viikonlopun yli jääkaappiläm- i

Potilassa. Liemi-asetonisuodoksen pH säädettiin arvoon 12 • * · ***.* käyttämällä 25-%:ista NaOH-liuosta ja seos suodatettiin • · · **’ * uudelleen kahdesti keraamisuodattimella ennen syöttämis- tään teräskolonnille (10 1; 10 cm x 122 cm), joka sisälsi # 30 HP-20ss-hartsia (Mitsubishi Chemical Industries, Ltd., • · · *...: Japani), virtausnopeudella 0,5 1/min. Kolonni huuhdottiin .:. seoksella, joka sisälsi CH3CN:ä, CH3OH:a ja NH40Ac:n '.···. 0,l-%:ista vesiliuosta (pH säädetty arvoon 8,1 NH40H:lla) suhteessa 25:25:50 (20 1). Uudet komponentit K, O ja Y \:V 35 eluoitiin seoksella, joka sisälsi CH3CN:ä, CH30H:a ja » I · • · 107266 66 NH4OAc:n 0,l-%:ista vesiliuosta (pH säädetty arvoon 8rl NH4OH:lla) suhteessa 95:95:10 (30 1) virtausnopeudella 1 1/min. Eluaatti (30 1) konsentroitiin, liuotettiin uudelleen CH3OH:iin, konsentroitiin uudelleen kuiviin, liuo-5 tettiin uudelleen CH30H:iin (100 ml) ja seostettiin sitten CH3CN:iin (2 1). Tuloksena oleva saostuma poistettiin suodattamalla, pestiin CH3CN:llä ja heitettiin pois; yhdistetyt suodos ja pesuliuos (3 1) konsentroitiin kuiviin. Tuloksena oleva jäännös liuotettiin uudelleen dikloorimetaa-10 niin (50 ml) ja laitettiin silikageeliä (EM-laatu 62, 60 -200 mesh) sisältävään kolonniin (7,5 cm x 50 cm), joka oi.i tasapainotettu asetoni triilillä. Kolonni eluoiti;.n CH3CN:llä (10 1), sitten CH3CN:n ja CH30H:n seoksella (9:1; 20 1) ja sitten CH3CN:n ja CH30H:n seoksella (8:2; 10 1) 15 ottaen talteen 1 l:n fraktioita. Fraktiot 11 - 30 yhdistettiin ja konsentroitiin kuiviin. Tuloksena oleva jäännös liuotettiin CH30H:ixn (50 ml) ja syötettiin (10 ajoa) prc-paratiiviseen käänteisfaasi-HPLC-kolonniin [Rainin

Dynamax-60Ä 8 pm C18, 41,4 mm (sisäläpimitta) x 25 en, 20 jossa oli suojamoduuli (41,4 mm x 5 cm)], joka oli tasapainotettu Hz0:n, CH30H:n ja CH3CN:n seoksella (50:175:175, . sisältää 0,1 % NH4Ac:a]. Kolonni eluoitiin virtausnopeudel- 4 11 .:· la 40 ml/min 60 min kestävällä lineaarisella gradientilla ( « « 4 : seoksesta H20, CH30H, CH3CN (50:175:175), joka sisältää 25 0,1 % NH4Ac:a, seokseen H20, CH30H, CH3CN (10:45:45), joka 4 sisältää 0,1 % NH4Ac:a. Erottumisen edistymistä seurattiin • · · *”.* aallonpituussäädöllä varustetulla UV-detektorilla, joka II· oli säädetty arvoon 250 nm. Talteen saadut kolme ensimmäistä piikkiä (10 ajoa yhdistettyinä) vastasivat pienenä * ** 30 pitoisuutena esiintyvän komponentin Y (fraktioyhdistelmä • · · 1, 1 1), komponentin K (fraktioyhdistelmä 2, 8 1) ja kom-.:. ponentin 0 (fraktioyhdistelmä 3, 4 1) eluoitumista. Frak- ,···. tioyhdistelmä 2 konsentroitiin pieneen tilavuuteen ja teh tiin sille sitten suolanpoisto käsittelemällä se uudelleen :.i.; 35 kromatografisesti samalla kolonnilla tehden eluointi ilman • · · • ·

Mt 107266 67 puskuria. UV-absorptiopiikkiä vastaava effluentti konsentroitiin kuiviin, liuotettiin t-BuOH:iin ja kylmäkuivat-tiin, jolloin saatiin puhdasta komponenttia K (7,3 g). Fraktioyhdistelmälle 3 tehtiin suolanpoisto ja kylmäkui-5 vaus samalla tavalla, jolloin saatiin puhdasta komponenttia O (1,4 g). Fraktioyhdistelmälle 1 tehtiin suolanpoisto samanlaisella kromatografiakäsittelyllä [Rainin Dynamax-60Ä 8 pm C18, 21,4 mm (sisäläpimitta) x 25 cm, jossa oli suojamoduuli (21,4 mm x 5 cm)] ja samanlainen kylmäkuiva-10 us, jolloin saatiin puhdasta komponenttia Y (46 mg).

Esimerkki 8 A83543K-pseudoaglykoni A83543K-näyte (100 mg) liuotettiin rikkihappoon (10 ml, 2 ekv/1). Tätä liuosta pidettiin 1,25 tuntia suun-15 nilleen lämpötilassa 80 °C ja tuloksena oleva seoksen annettiin jäähtyä huoneenlämpötilaan. Sakka otettiin talteen suodattamalla, pestiin kylmällä deionisoidulla vedellä ja kuivattiin, jolloin saatiin 59 mg A83543K-pseudoaglykonia.

Alkuaineanalyysi 20 MS (FD): m/z 576 (100 %) IR (CHC13): 2936,0; 1714,9; 1659,0 cm"1 , UV (EtOH): lambda^1 243 nm < < «

Esimerkki 9 • 1·« : A835430-pseudoaglykoni • · · 25 A835430-näyte (500 mg) suspendoitiin deionisoituun veteen (40 ml) ja lisättiin riittävä tilavuus H2S04-liuosta • · · *".1 (1 ekv/1) täydellisen liukenemisen aikaansaamiseksi (noin • · · *·1 0,25 ml). Tuloksena olevaa liuosta pidettiin 3 tuntia suunnilleen lämpötilassa 80 °C ja annettiin sen sitten **** 30 jäähtyä huoneenlämpötilaan. Sakka otettiin talteen suodat- *,,,· tamalla, pestiin kylmällä deionisoidulla vedellä ja kui- vattiin. Suodos kyllästettiin NaClilla ja uutettiin di-kloorimetaanilla. Dikloorimetaaniuuteliuokset yhdistet-tiin, uutettiin kylläisellä NaCl-liuoksella, kuivattiin * • · · 1 1 t « « · · · • · « · • · · 107266 68 (K2C03) ja haihdutettiin kuiviin. Jäännös yhdistettiin saostuman kanssa, jolloin saatiin 348 mg raakatuotetta.

Raakatuote puhdistettiin flash-kromatografisesti (Silica gel 60, 230 - 400 mesh) eluoimalla etyyliasetaain 5 ja heksaanin seoksella (7:3). Haluttua yhdistettä sisältävät fraktiot haihdutettiin kuiviin, jolloin saatiin 146.5 mg A835430-pseudoaglykonia.

Alkuaineanalyysi MS (FD): m/z 590 (100 %), 591 (70 %, M+), 5 Ϊ2 10 (20 %, M + H), 593 (5 %, M + 2) IR (CHC13): 3014,2; 2932,2; 1714,9; 1659,0 cm-1 UV (EtOH): lambdanax 242 nm (€ 9185)

Esimerkki 10 N-demetyyli-A83543K

15 Lisättiin A83543K:ta (101,5 mg, 0,14 mmol) ja nat- riumasetaattitrihydraattia (142,4 mg, 1,05 mmol) metanolin ja puskuriliuoksen pH 9 (Fisher Scientific, Lexington, MA) seokseen. Tuloksena oleva suspensio kuumennettiin suunnil leen lämpötilaan 47 °C ja lisättiin sitten jodia (47,7 mc;, 20 0,19 mmol) yhtenä annoksena. Kun reaktioseosta oli pidetty 2.5 tuntia lämpötilassa 47 °C, sen annettiin jäähtyä huc-neenlämpötilaan. Kun reaktioliuosta oli sekoitettu vielä 3 « « « tuntia huoneenlämpötilassa, se lisättiin 5-%:iseen natri-V’· umtiosulfaattiliuokseen. Tuloksena oleva väritön vesipi- * ,‘ 25 toinen seos uutettiin dietyylieetterillä. Vesikerros kyl-« · · •••| lästettiin sitten NaCl:lla ja uutettiin dikloorimetaanil- • » « :·Σ : la. Dikloorimetaaniuutteet yhdistettiin dietyylieetteri- «·» *.: 1 uutteisiin, pestiin kylläisellä NaCl-liuoksella ja kuivat tiin K2C03:lla. Kuivattu liuos haihdutettiin sitten kuiviin *ϊ2: 30 alipaineessa, jolloin saatiin 79,3 mg N-demetyyli **"1; A83543K:ta valkeana lasimaisena aineena (saanto 81 %).

·«« MS (FD): m/z 703 (100 %, M+), 704 (57 %, M + H)[, *::: 705 (19%, m + 2) « · ’·♦·1 Alkuaineanalyysi yhdisteelle (C39H61NO10): ::: 35 Teoreettinen: C, 66,55; H, 8,73; N, 1,99 ··· w w · r · w · 2 • · 107266 69

Mitattu: C, 64,80; H, 8,67; N, 1,95 IR (KBr): 3462,7; 2934,1; 1721,7; 1660,9; 1457,4 cm-1

Esimerkki 11

5 Di-N-demetyyli-A83543K

N-demetyyli-A83543K:n (891 mg, 1,27 mmol) MeOH:ssa (40 ml) jäähdytettiin lämpötilaan 3 °C. Juuri valmistettu liuos, joka sisälsi 1 mol/1 NaOMe:a metanolissa (6,3 ml,

6.3 mmol), ja jodia (1,61 g, 6,3 mmol) lisättiin peräkkäin 10 tähän liuokseen. Reaktioliuos pidettiin lämpötilassa 3 ®C

5 tuntia ja lisättiin sitten 5 % natriumtiosulfaattia sisältävään laimeaan ammoniumhydroksidiliuokseen. Tuloksena oleva seos uutettiin etyyliasetaatilla. Yhdistetyt etyyli-asetaattiuutteet pestiin kylläisellä NaCl-liuoksella ja 15 kuivattiin K2C03:lla. Kuivattu liuos haihdutettiin kuiviin alipaineessa, jolloin saatiin 770 mg raakatuotetta.

Haluttu yhdiste puhdistettiin osittain flash-kroma-tografisesti [Silica gel 60, 230 - 400 mesh, 5,1 cm x 20.3 cm (2 in x 2 in)] eluoimalla dikloorimetaanin ja me-20 tanolin seoksella (93:7). Haluttu yhdiste jatkopuhdistet- tiin käänteisfaasi-HPLC:llä (Waters Prep NOVA-Pak, ODS, . 60 A, 40 mm χ 300 mm) eluoimalla metanolin, asetonitriilin «Il ja 0,25-%:isen ammoniumasetaattiliuoksen seoksella (40: « « « · .·. : 40:20), jolloin saatiin 463,6 mg (saanto 53 %) di-N-deme- « ·« 25 tyyli-A83543K:ta värittömänä lasimaisena aineena.

«

Alkuaineanalyysi yhdisteelle (C40H59NO10): *”.* Teoreettinen: C, 66,16; H, 8,62; N, 2,03 • · ·

Mitattu: C, 66,29; H, 8,63; N, 2,02 MS (FD): m/z 690 (100 %, M+), 689 (70 %), 691 30 (59 %, M + H), 704 (20 %) UV (EtOH): lambda^, 244 nm (€ 10 328) IR (CHCl,): 3700, 3600, 3550 - 3350 (leveä), 3420, V*·. 2975, 1700, 1675, 1620 cm-1 • · • · « • « · ♦ * · ·»· » · · « m « · • · ·

Claims (13)

1072(56 70

1. A83543-yhdiste, tunnettu siitä, että sillä on kaava (1), 5 «Ή , RUO >. *· I Λ a> r10cH2 0 H v \ — / ' fl

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen yhdiste, ♦ · 7 ... 30 tunnettu siitä, että R on ryhmä, jolla on kaava *...: CH3 •ί: <CH3,2N^St^s <CH3,NE“\b^ i « i 35 <\H3 tai tnn v „ ···· (CH3) ^ (c) (<J) CH3 107266 71

2 H \ „ R9 7 15 jossa R on vetyatomi tai ryhmä, jolla on kaava, CH3 (a) ** (b) 20 •::i: (o (d) 1:83 « « · « « < • · * . , , . , 8 9 10 11 . 12 25 ja kukin ryhmistä R,R,R,R ja R on riippumattomas- : ti vetyatomi tai metyyliryhmä sillä edellytyksellä, ettei- *** * 11 12 ♦*j*j vät ryhmät R ja R ole samanaikaisesti vetyatomeja; tai *«* 7 sen happoadditiosuola, kun R on muu kuin vetyatomi.

3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen yhdiste, 7 tunnettu siitä, että R on ryhmä, jolla on kaava CB3 5 <CE3l2W—

4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen yhdiste, 8 tunnettu siitä, että R on metyyliryhmä.

5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen yhdiste, 7 tunnettu siitä, että R on vetyatomi.

6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen yhdiste, 7 8 9 10 11 tunnettu silta, että ryhmät R,R,R,R,R ja 12 R ovat kussakin komponentissa seuraavat: 15 Komponentti R7 R8 r9 r10 r11 r12 K (a) CH3 H ch3 ch3 ch3 O (a) ch3 ch3 ch3 ch3 ch3 20 p (a) CH3 H CH3 CH3 H u (a) ch3 h ch3 h ch3 "1. v (a) ch3 ch3 ch3 h ch3 Τ’. w (a) CH3 CH3 CH3 CH3 H ** / Y (a) ch3 h h ch3 ch3 25 MM • · • · · • · · IM ·

7. Insektisidi- tai mitisidikoostumus, t u n - • · · t u siitä, että se käsittää hyönteisiä tai punkkeja inak- . tivoivan määrän patenttivaatimuksen 2 mukaista yhdistettä ... 30 yhdessä fytologisesti hyväksyttävän kantajan kanssa. - · · ···’ 8. Insektisidinen tai mitisidinen menetelmä, *:1 tunnettu siitä, että levitetään hyönteisen tai . · · · · punkin olinpaikkaan hyönteisiä tai punkkeja inaktivoiva • » · ’. määrä patenttivaatimuksen 2 mukaista yhdistettä. • · « • · · • · · · · * · * · 107266 72

9. Ulkoloisten vastainen koostumus, tunnettu siitä, että se käsittää fytologisesti hyväksyttävää kantajaa ja kaavan 2 mukaista yhdistettä.

10. Patenttivaatimuksen 2 mukaisten yhdisteiden 5 käyttö valmistettaessa isäntäeläimen verta kuluttavien hyönteisulkoloisten populaation kontrolloimiseksi tarkoitettua valmistetta.

11. Saccharopolyspora spinosa NRRL 18743:n tai sen A83543K:ta tuottavan mutantin biologisesti puhdas viljel- 10 mä. « I I I I * III·

4 I « · » I · · • « « I « · M·· • · • · · • · « ♦ ·· « «·· * · · • · · «•••I • O • · · • · « • * «· ·«· • • t 4 · < I « t « f · « i · • • · ♦ • · · I I I · « I I · f 107266 73