CN103740631B - 能提高多杀菌素产量的基因工程菌及构建方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了能提高多杀菌素产量的基因工程菌及构建方法及应用，能提高多杀菌素产量的基因工程菌的构建方法，步骤为：①将spnk表达盒插入大肠杆菌-刺糖多孢菌穿梭质粒pOJ260，构建重组质粒pLU101；②将重组质粒pLU101导入刺糖多孢菌（Saccharopolyspora spinosa）ATCC49460中，重组质粒通过同源重组整合至基因组，得到能提高多杀菌素产量的基因工程菌，命名为LU101；本发明的方法构建的基因工程菌，能使多杀菌素的产量提高。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种高产多杀菌素的基因工程菌及其构建方法。
背景技术
多杀菌素是由放线菌刺糖多孢菌(Saccharopolysporaspinosa)发酵产生的21碳的大环内酯类化合物，包含两个脱氧糖：3-O-甲基化鼠李糖和福乐糖胺。多杀菌素A和D是在刺糖多胞菌发酵液中两个主要组分。多杀菌素已显示出广谱的杀虫活性，是环境友好且对哺乳动物无药害的生物高效杀虫剂。多杀菌素类绿色杀虫剂因其低风险，无特定靶向物种，环境影响小，对人畜毒性低等特点被授予1999年的总统绿色化学品挑战奖。
多杀菌素合成途径由27个基因编码。五个基因（SpnA，spnB，spnC，spnD和spnE）编码I型聚酮合成酶（PKS）；四个基因（spnF，spnJ，spnL，spnM）转换聚酮合成酶的产物；spnG，spnH，spnI和spnK与鼠李糖的附着和甲基化有关；spnP，spnO，spnN，spnQ，spnR和spnS涉及福乐糖胺的合成；四个基因（ORF-L15，ORF-L16，ORF-R1，ORF-R2）不参与多杀菌素的合成；另外四个与鼠李糖合成有关的基因（gtt，gdh，epi和kre）在基因组的其他区域而不是基因簇中。Madduri等（Madduri K,et al.Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology,2001a,27:399-402）研究发现，刺糖多胞菌在整个发酵期都会积累缺少福乐糖胺的中间体pseudoaglycones（PSA）。通过过表达带有原始启动子的鼠李糖合成基因，可以明显提高多杀菌素的产量[Madduri K,et al.Journal of bacteriology,2001b,183:5632-5638]。Pan等（PanHX,et al.Biotechnology letters,2011,33:733-739）也通过过表达PermE*启动子控制下的鼠李糖合成基因，使多杀菌素产量提高了3.8倍。Kim等（Kim HJ,White-Phillip JA,OgasawaraY,et al.Journal of the American Chemical Society,2010,132(9):2901-2903）发现，降低spnH的细胞浓度或者提高spnK的细胞浓度可以增加PSA的产量。但是上述研究忽视了多杀菌素合成途径的不平衡的问题。这种不平衡表现为：（1）spnP，spnO，spnN，spnQ，spnR和spnS这六个基因在多杀菌素生物合成途径中的表达不足；（2）刺糖多胞菌积累非多杀菌素类化合物是因为spnK表达量少，使合成多杀菌素的前体通过其它途径被消耗掉了。因此，通过构建理性的菌株改进策略，调整不平衡的多杀菌素合成途径，从而提高多杀菌素的产量是亟待解决的问题。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术中的不足，提供一种能提高多杀菌素产量的基因工程菌的构建方法。
本发明的第二个目的是提供一种能提高多杀菌素产量的基因工程菌。
本发明的第三个目的是提供第二种能提高多杀菌素产量的基因工程菌的构建方法。
本发明的第四个目的是提供第二种能提高多杀菌素产量的基因工程菌。
本发明的第五个目的是提供第三种能提高多杀菌素产量的基因工程菌的构建方法。
本发明的第六个目的是提供第三种能提高多杀菌素产量的基因工程菌。
本发明的第七个目的是提供第一种能提高多杀菌素产量的基因工程菌的用途。
本发明的第八个目的是提供第二种能提高多杀菌素产量的基因工程菌的用途。
本发明的第九个目的是提供第三种能提高多杀菌素产量的基因工程菌的用途。
本发明的技术方案概述如下：
一种能提高多杀菌素产量的基因工程菌的构建方法，包括如下步骤：
①将spnK表达盒插入大肠杆菌-刺糖多孢菌穿梭质粒pOJ260，构建重组质粒pLU101；
②将重组质粒pLU101导入刺糖多孢菌（Saccharopolyspora spinosa）ATCC49460中，重组质粒通过同源重组整合至基因组，得到能提高多杀菌素产量的基因工程菌，命名为LU101；
所述spnK表达盒由ermE*启动子、spnK编码基因和spnK终止子组成；
所述ermE*启动子的序列是SEQ ID NO.23所示；spnK编码基因的序列是SEQ ID NO.13所示。
上述构建方法构建的能提高多杀菌素产量的基因工程菌LU101。
第二种能提高多杀菌素产量的基因工程菌的构建方法，包括如下步骤：
①将spnK表达盒插入大肠杆菌-刺糖多孢菌穿梭质粒pOJ260，构建重组质粒pLU101；
②将spnN表达盒、spnO表达盒、spnP表达盒、spnQ表达盒、spnR表达盒和spnS表达盒，通过粘性末端酶切连接方法插入重组质粒pLU101，构建重组质粒pLU102；
③将所述重组质粒pLU102导入刺糖多孢菌（Saccharopolyspora spinosa）ATCC49460中，重组质粒通过同源重组整合至基因组，得到能提高多杀菌素产量的基因工程菌，命名为LU102；
所述spnK表达盒由ermE*启动子、spnK编码基因和spnK终止子组成；
所述spnN表达盒由spnN启动子、spnN编码基因、spnN终止子组成；
所述spnO表达盒由spnO启动子、spnO编码基因、spnO终止子组成；
所述spnP表达盒由spnP启动子、spnP编码基因、spnP终止子组成；
所述spnQ表达盒由spnQ启动子、spnQ编码基因、spnQ终止子组成；
所述spnR表达盒由spnR启动子、spnR编码基因、spnR终止子组成；
所述spnS表达盒由spnS启动子、spnS编码基因、spnS终止子组成。
所述ermE*启动子的序列是SEQ ID NO.23所示；
所述spnK编码基因的序列是SEQ ID NO.13所示；
所述spnN编码基因的序列是SEQ ID NO.14所示；
所述spnO编码基因的序列是SEQ ID NO.15所示；
所述spnP编码基因的序列是SEQ ID NO.16所示；
所述spnQ编码基因的序列是SEQ ID NO.17所示；
所述spnR编码基因的序列是SEQ ID NO.18所示；
所述spnS编码基因的序列是SEQ ID NO.19所示。
第二种构建方法构建的能提高多杀菌素产量的基因工程菌LU102。
第三种能提高多杀菌素产量的基因工程菌的构建方法，包括如下步骤：
①将spnK表达盒插入大肠杆菌-刺糖多孢菌穿梭质粒pOJ260，构建重组质粒pLU101；
②将spnN表达盒、spnO表达盒、spnP表达盒、spnQ表达盒、spnR表达盒和spnS表达盒、通过粘性末端酶切连接方法插入重组质粒pLU101，构建重组质粒pLU102；
③将gtt表达盒、gdh表达盒和kre表达盒插入重组质粒pLU102，构建重组质粒pLU104；
④将所述重组质粒pLU104导入刺糖多孢菌（Saccharopolyspora spinosa）ATCC49460中，重组质粒通过同源重组整合至基因组，得到能提高多杀菌素产量的基因工程菌，命名为LU104；
所述spnK表达盒由ermE*启动子、spnK编码基因和spnK终止子组成；
所述spnN表达盒由spnN启动子、spnN编码基因、spnN终止子组成；
所述spnO表达盒由spnO启动子、spnO编码基因、spnO终止子组成；
所述spnP表达盒由spnP启动子、spnP编码基因、spnP终止子组成；
所述spnQ表达盒由spnQ启动子、spnQ编码基因、spnQ终止子组成；
所述spnR表达盒由spnR启动子、spnR编码基因、spnR终止子组成；
所述spnS表达盒由spnS启动子、spnS编码基因、spnS终止子组成；
所述gtt表达盒由ermE*启动子、gtt编码基因和gtt终止子组成；
所述gdh表达盒由ermE*启动子、gdh编码基因和gdh终止子组成；
所述kre表达盒由ermE*启动子、kre编码基因和kre终止子组成。
所述ermE*启动子的序列是SEQ ID NO.23所示；
所述spnK编码基因的序列是SEQ ID NO.13所示；
所述spnN编码基因的序列是SEQ ID NO.14所示；
所述spnO编码基因的序列是SEQ ID NO.15所示；
所述spnP编码基因的序列是SEQ ID NO.16所示；
所述spnQ编码基因的序列是SEQ ID NO.17所示；
所述spnR编码基因的序列是SEQ ID NO.18所示；
所述spnS编码基因的序列是SEQ ID NO.19所示；
所述gtt编码基因的序列是SEQ ID NO.20所示；
所述gdh编码基因的序列是SEQ ID NO.21所示；
所述kre编码基因的序列是SEQ ID NO.22所示。
第三种构建方法构建的能提高多杀菌素产量的基因工程菌LU104。
能提高多杀菌素产量的基因工程菌LU101在发酵生产多杀菌素中的应用。
能提高多杀菌素产量的基因工程菌LU102在发酵生产多杀菌素中的应用。
能提高多杀菌素产量的基因工程菌LU104在发酵生产多杀菌素中的应用。
本发明的优点：
1、实验证明，本发明通过理性的刺糖多孢菌改造策略，为了使带有鼠李糖糖苷配基的大环（R-AGL）更多的朝着拟甙元（PSA）合成的方向进行，基因spnK在刺糖多孢菌中被过表达，提高了刺糖多孢菌中spnK的活性，得到能提高多杀菌素产量的基因工程菌LU101，其多杀菌素产量达到87mg/L，且PSA产量达到97mg/L，野生菌种刺糖多孢菌（Saccharopolyspora spinosa）ATCC49460PSA产量为29mg/L，PSA与野生菌种相比产量提高了3.3倍。
2、为了解决福乐糖胺合成量不够的问题，参与福乐糖胺合成的六个基因（spnP，spnO，spnN，spnQ，spnR和spnS）和spnK被共同表达，进一步提高了初始工程菌的spnP，spnO，spnN，spnQ，spnR，spnS的活性，得到能提高多杀菌素产量的基因工程菌LU102，在这株基因工程菌中多杀菌素的产量达到214mg/L，比野生菌种（82mg/L）高2.6倍，而PSA的产量则降低到13mg/L，使得积累的PSA转化成了多杀菌素。
3、为进一步提高多杀菌素的产量，在基因工程菌LU102的基础上又提高gtt，gdh和kre基因的活性，在过表达了gtt，gdh，kre，spnP，spnO，spnN，spnQ，spnR，spnS和spnK基因后，得到能提高多杀菌素产量的基因工程菌LU104，通过发酵验证，基因工程菌LU104的多杀菌素的产量达到了405mg/L，多杀菌素的发酵单位较野生菌株提高了5倍。
附图说明
图1为重组质粒构建过程图。
图2是重组质粒pLU101的质粒图谱。
图3是重组质粒pLU102的质粒图谱。
图4是重组质粒pLU104的质粒图谱。
图5是多杀菌素野生菌株与多杀菌素基因工程菌发酵结果。
图6是重组质粒pLU101验证电泳图。
图7是重组质粒pLU102验证电泳图。
图8是重组质粒pLU104验证电泳图。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、基因元件克隆和含有对应基因原件的质粒构建
将包含ermE*启动子（SEQ ID NO.23）的pIB139质粒用HindIII和XbaI酶切消化，所用酶为Fermentas Fast Taq限制性内切酶，酶切体系如下：目的DNA片段30ng，加入2μL10×buffer，限制性内切酶HindIII和XbaI各1μL(内切酶最后加入)，补充蒸馏水至20μL。将酶切体系置于37℃30min，得到0.3kb的包含ermE*启动子的HindIII/XbaI片段。将该HindIII/XbaI片段插入质粒pOJ260，得到pOJ261质粒。
用引物对spnK-F-Ndel（SEQ ID NO.1）和spnK-R-Xbal（SEQ ID NO.2）从刺糖多胞菌（Saccharopolyspora spinosa）ATCC49460（以下简称刺糖多胞菌ATCC49460）染色体中获取spnK基因序列并扩增，再用Ndel和Xbal酶切消化spnK的PCR产物。随后将处理过的片段插入到同样被Ndel和Xbal酶切消化的pOJ261质粒中，得到重组pLU101质粒，质粒验证见图6。
本发明所用pcr酶为北京全式金生物技术有限公司的pfu聚合酶，PCR扩增体系如下：依照下述在冰上配制PCR反应体系，先加水，最后加pfu聚合酶；
在PCR仪上设置扩增程序。扩增条件为98℃预变性2分钟(1个循环);98℃变性10秒、退火10秒、72℃延伸1分钟(32个循环);72℃延伸8分钟(1个循环)。
本发明中涉及到的寡核苷酸引物列于表1。
表1引物序列
| 引物 | 序列 | 序列5′→3′ |
| spnK-F-Ndel | SEQ ID NO.1 | CCGCCTTCCATATGTCCACAACGCAC |
| spnK-R-Xbal | SEQ ID NO.2 | CGTCTAGAGCGGAAATGCCTGTGTG |
| SN-F-XbaI | SEQ ID NO.3 | TATCTAGACGCTTCGTCGACCTGGTTGGCAC |
| SN-R-Xbal | SEQ ID NO.4 | TATCTAGACCCCACGCTCGTCTACCACAG |
| gtt-F-Ndel | SEQ ID NO.5 | CGGTATCCATATGAAGGGGATCGT |
| gtt-R-Xbal | SEQ ID NO.6 | CTTCTAGACGGTCCGCGATTTCAATG |
| gdh-kre-F-Ndel | SEQ ID NO.7 | CTGAGGGCCATATGCGGATTCTGGT |
| gdh-kre-R-Xbal | SEQ ID NO.8 | GTTCTAGACCCAGACGCGGAAAAG |
| gdh-gtt-F-MauBl | SEQ ID NO.9 | CTAATAACGCGCGCGGCGATTAAGTTGGGTAACG |
| gdh-gtt-R-MauBl | SEQ ID NO.10 | AATATATCGCGCGCGCAATGGAAATCGGAC |
| Con-F | SEQ ID NO.11 | CCGTGATTTTGTAGCCCTGG |
| Con-R | SEQ ID NO.12 | GGCCTACTTCACCTATCCTGC |
| gtt-F-Xbal | SEQ ID NO.24 | ATTCTAGAGGTACCAGCCCGACCCGAGCA |
| gtt-R-MauBl | SEQ ID NO.25 | AATATATCGCGCGCGCAATGGAAATCGGAC |
6个与福乐糖胺合成相关的基因：
用引物对SN-F-XbaI（SEQ ID NO.3）和SN-R-XbaI（SEQ ID NO.4）从刺糖多胞菌ATCC49460染色体中获取并扩增出：spnN，spnO，spnP，spnQ，spnR和spnS基因序列，PCR产物用XbaI酶切消化。随后将spnP，spnO，spnN，spnQ，spnR和spnS序列的酶切产物插入同样被XbaI酶切消化的质粒pLU101，得到重组质粒pLU102，质粒验证见图7。
以同样的方法，gtt和gdh-kre基因分别用引物对gtt-F-Ndel（SEQ ID NO.5），gtt-R-Xbal（SEQ ID NO.6）和gdh-kre-F-Ndel（SEQ ID NO.7），gdh-kre-R-Xbal（SEQ ID NO.8）从刺糖多胞菌ATCC49460染色体中获取并扩增，gtt基因的PCR产物用Ndel和Xbal酶切消化，将处理过的PCR片段插入到同样被Ndel和Xbal酶切消化的pOJ261质粒中，得到pOJ263质粒。
同样，gdh-kre的PCR产物酶切消化后插入pOJ261质粒中，得到pOJ262质粒。然后，用引物对gtt-F-Xbal（SEQ ID NO.24）和gtt-R-MauBl（SEQ ID NO.25），将ermE*启动子调控的gtt序列从pLU263质粒中扩增，并以Xbal和MauBl酶切消化，插入pOJ262得到质粒pLU103。
最后，pLU103质粒中的ermE*启动子调控的gtt和gdh-kre序列用引物对gdh-gtt-F-MauBI（SEQ ID NO.9）和gdh-gtt-R-ManBl（SEQ ID NO.10）扩增，PCR产物用MauBl酶切消化，插入到pLU102质粒中得到质粒pLU104，质粒验证见图8。
质粒pLU101、质粒pLU102质粒pLU104的构建过程及质粒见图1，2，3，4。
实施例2、能提高多杀菌素产量的基因工程菌LU101、LU102和LU104的构建：
所有构建的质粒均通过结合转移从大肠杆菌S17-1导入刺糖多胞菌，并同源重组整合到染色体中,步骤如下：
用质粒pLU101转化感受态大肠杆菌S17-1，将得到的大肠杆菌在安普霉素抗性(安普霉素100μg/mL)的LB平板上进行筛选。挑转化子至4mL LB(安普霉素100μg/ml)中37℃振荡培养12小时。
从斜面挑取适量刺糖多孢菌ATCC49460于30℃下培养在TSB液体培养基中72h左右，1%接种量转接于50mLTSB培养42h左右使菌液达到对数生长后期，离心倒去上清，菌体用LB液体洗涤2次（4000rpm，10min,4℃)，最后重悬于20mL LB，待用。
将已转化的大肠杆菌S17-1菌株2%接种于50mL LB的250mL三角瓶，37℃振荡培养2小时左右，使菌液OD值在0.4-0.6之间，将菌液移入离心管，离心（4000rpm，10min,4℃)，倒去上清，菌体洗涤2次（4000rpm，10min，4℃)，最后重悬于2mL LB中，供体-受体(E.coli-S.spinosa)按50μL(109/mL)：50μL(108孢子/mL)混合加入无菌的离心管。将混合菌液涂R6平板，用涂棒充分混匀菌液，29℃恒温箱培养32h，取出平板，涂50μl/mL安普霉素，并加入25ug/mL的萘啶酮酸，抑制结合转移的过程中大肠杆菌的生长，再于30℃恒温箱培养，培养约一周后出现重组接合子，用引物对Con-F（SEQ ID NO.11）和Con-R（SEQ ID NO.12）通过PCR扩增验证正确的为能提高多杀菌素产量的基因工程菌LU101。
R6平板培养基成分（g/L)：蔗糖200.0，糊精10.0，酪蛋白氨基酸1.0，MgSO4·7H2O0.05，谷氨酸钠盐11.0,K2SO40.1，CaCl2·2H207.0，3-(N-吗啉代)丙磺酸钠盐（MOPS）(0.1mol/L,Ph=7.2)100.0，微量元素（ml)1.0ml，琼脂20.0，余量是水。
微量元素组成（mg/L):ZnCl240,FeCl3·6H2O200，CuCl2·2H2O10，MnCl2·4H2O10，Na2B4O4·10H2O10，（NH4)6Mo7O24·4H2O10，余量是水。
用质粒pLU102替代质粒pLU101，其它操作同本实施例，得到能提高多杀菌素产量的基因工程菌LU102。
用质粒pLU104替代质粒pLU101，其它操作同本实施例，得到能提高多杀菌素产量的基因工程菌LU104。
所述spnK表达盒由ermE*启动子、spnK编码基因和spnK终止子组成；
所述spnN表达盒由spnN启动子、spnN编码基因、spnN终止子组成；
所述spnO表达盒由spnO启动子、spnO编码基因、spnO终止子组成；
所述spnP表达盒由spnP启动子、spnP编码基因、spnP终止子组成；
所述spnQ表达盒由spnQ启动子、spnQ编码基因、spnQ终止子组成；
所述spnR表达盒由spnR启动子、spnR编码基因、spnR终止子组成；
所述spnS表达盒由spnS启动子、spnS编码基因、spnS终止子组成；
所述gtt表达盒由ermE*启动子、gtt编码基因和gtt终止子组成；
所述gdh表达盒由ermE*启动子、gdh编码基因和gdh终止子组成；
所述kre表达盒由ermE*启动子、kre编码基因和kre终止子组成。
所述ermE*启动子的序列是SEQ ID NO.23所示；
所述spnK编码基因的序列是SEQ ID NO.13所示；
所述spnN编码基因的序列是SEQ ID NO.14所示；
所述spnO编码基因的序列是SEQ ID NO.15所示；
所述spnP编码基因的序列是SEQ ID NO.16所示；
所述spnQ编码基因的序列是SEQ ID NO.17所示；
所述spnR编码基因的序列是SEQ ID NO.18所示；
所述spnS编码基因的序列是SEQ ID NO.19所示；
所述gtt编码基因的序列是SEQ ID NO.20所示；
所述gdh编码基因的序列是SEQ ID NO.21所示；
所述kre编码基因的序列是SEQ ID NO.22所示。
实施例3、能提高多杀菌素产量的基因工程菌的发酵验证
菌株培养基：
斜面培养基（g/L）：酪蛋白胨2.5，葡萄糖5，牛肉膏3，琼脂20，硫酸镁2，余量为水，灭菌前pH=7.5。
种子培养基（g/L）：葡萄糖10，N-Z-Amine A（酸水解酪蛋白）30，酵母膏1.0，牛肉膏1.0，MgSO42.0，余量为水，灭菌前pH=7.3。
发酵培养基（g/L）：葡萄糖68，牛奶蛋白胨25，棉籽蛋白22，玉米浆14.5，油酸甲酯40，碳酸钙5，余量为水，灭菌前pH=7.5。
摇瓶发酵培养：将培养好能提高多杀菌素产量的基因工程菌LU101、LU102、LU104及野生菌刺糖多胞菌ATCC49460的新鲜平板，用适量无菌生理盐水将成熟的孢子洗下，分别转移至装有5颗玻璃珠的四个三角瓶中震荡20min使孢子分散。用纱布无菌过滤后，吸取适量单孢子悬液移至装有30mL/250mL种子培养基的三角瓶中，使其中的孢子浓度约为107-108个/mL，200r/min，30℃条件下摇瓶培养3d。
将种子培养液按照5%的接种量接入发酵摇瓶中，发酵摇瓶装液量为30mL/250mL的三角瓶，在30℃、220rpm摇床中培养9d。
发酵液样品的提取：刺糖多孢菌发酵的过程中合成的多杀菌素大部分存在于发酵液中，还有少量存在于菌丝体中，所以本实验中采取提取全发酵液的方法。
取1.0mL发酵液，加入3.0mL甲醇，4℃避光提取24h，超声处理20min，10000r/min离心10min，取上清液经0.22μm微孔滤膜过滤后进行HPLC检测。
多杀菌素的HPLC检测：
色谱条件如下：色谱仪:依利特P230Ⅱ系列高效液相色谱仪；色谱柱:Apollo C185μ250mm*4.6mm；流动相:甲醇：乙腈：水=40:55:5，其中含有0.05%的乙酸铵；流速:1.0mL/min；紫外检测波长：246nm；柱温:30℃。
利用多杀菌素的产品“菜喜”（25g/L悬浮剂）来制备标准品(2400mg/L)：用移液枪准确量取500μL的菜喜，置于100mL的容量瓶中，用甲醇多次洗刷枪头内壁并用甲醇定容，超声波处理20min，避光静置24h，高速离心后溶液用0.22μm的有机滤膜过滤，上清液放入棕色瓶中4℃保存待用。
能提高多杀菌素产量的基因工程菌LU101，其多杀菌素产量达到87mg/L，且PSA产量达到97mg/L，PSA量与野生菌种(29mg/L)相比提高了3.3倍。
能提高多杀菌素产量的基因工程菌LU102，其多杀菌素的产量达到214mg/L，比野生菌种（82mg/L）高2.6倍，如图5所示。
能提高多杀菌素产量的基因工程菌LU104，其多杀菌素产量可达到405mg/L，是原始菌株的5倍。
Claims (3)
1.一种能提高多杀菌素产量的基因工程菌的构建方法，其特征是包括如下步骤：
①将spnK表达盒插入大肠杆菌-刺糖多孢菌穿梭质粒pOJ260，构建重组质粒pLU101；
②将spnN表达盒、spnO表达盒、spnP表达盒、spnQ表达盒、spnR表达盒和spnS表达盒、通过粘性末端酶切连接方法插入重组质粒pLU101，构建重组质粒pLU102；
③将gtt表达盒、gdh表达盒和kre表达盒插入重组质粒pLU102，构建重组质粒pLU104；
④将所述重组质粒pLU104导入刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)ATCC 49460中，含有重组质粒pLU104的大肠杆菌与刺糖多孢菌的比例为：50μL浓度109/mL:50μL浓度108孢子/mL，重组质粒通过同源重组整合至基因组，得到能提高多杀菌素产量的基因工程菌，命名为LU104；
所述spnK表达盒由ermE*启动子、spnK编码基因和spnK终止子组成；
所述spnN表达盒由spnN启动子、spnN编码基因、spnN终止子组成；
所述spnO表达盒由spnO启动子、spnO编码基因、spnO终止子组成；
所述spnP表达盒由spnP启动子、spnP编码基因、spnP终止子组成；
所述spnQ表达盒由spnQ启动子、spnQ编码基因、spnQ终止子组成；
所述spnR表达盒由spnR启动子、spnR编码基因、spnR终止子组成；
所述spnS表达盒由spnS启动子、spnS编码基因、spnS终止子组成；
所述gtt表达盒由ermE*启动子、gtt编码基因和gtt终止子组成；
所述gdh表达盒由ermE*启动子、gdh编码基因和gdh终止子组成；
所述kre表达盒由ermE*启动子、kre编码基因和kre终止子组成 ；
所述ermE*启动子的序列是SEQ ID NO.23所示；
所述spnK编码基因的序列是SEQ ID NO.13所示；
所述spnN编码基因的序列是SEQ ID NO.14所示；
所述spnO编码基因的序列是SEQ ID NO.15所示；
所述spnP编码基因的序列是SEQ ID NO.16所示；
所述spnQ编码基因的序列是SEQ ID NO.17所示；
所述spnR编码基因的序列是SEQ ID NO.18所示；
所述spnS编码基因的序列是SEQ ID NO.19所示；
所述gtt编码基因的序列是SEQ ID NO.20所示；
所述gdh编码基因的序列是SEQ ID NO.21所示；
所述kre编码基因的序列是SEQ ID NO.22所示。
2.权利要求1所述的构建方法构建的能提高多杀菌素产量的基因工程菌LU104。
3.权利要求2所述能提高多杀菌素产量的基因工程菌LU104在发酵生产多杀菌素中的应用。
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