JP6641366B2 - スピノサド異種発現株およびその構築方法ならびに使用 - Google Patents

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Description

本発明は生物工学の分野に属し、スピノサド異種発現に関し、より詳細には、スピノサド異種発現株およびその構築方法ならびに使用に関する。
１９９９年６月に米国の「Presidential Green Chemistry Challenge Award」を獲得した、生物学的農薬の安全性および化学的農薬の即効性の両方を有している、スピノサドはマクロライド化合物である。天然において、スピノサドはSaccharopolyspora spinosaから発酵され、その生合成は主に２つの局面：１つはポリケチドシンターゼ（ＰＫＳ）によって合成されるグリコンであり、第２は、関連するシンテターゼおよび修飾酵素によってそれぞれ行われるラムノースおよびホロサミンの付加および改変である（SU Jianya et al., Biosynthesis of Spinosad, CHINA BIOTECHNOLOGY, Vol. 23, No. 5参照）。。ラムノース合成遺伝子を除くと、Saccharopolyspora spinosaにおける関連する他のスピノサド生合成遺伝子は、約８０ｋｂのＤＮＡ断片（GenBank AY007564）にクラスタ形成されている。
Saccharopolyspora spinosaは、天然のスピノサド生成株であるが、その生産性は高くない。さらに、Saccharopolyspora spinosaの遺伝子操作は比較的に困難であり、良好な生産能を有している株の取得を困難にするほど形質転換の余地が限られている。従来技術において、Saccharopolyspora spinosaおよびSaccharopolyspora erythraeaの異種間の融合を、スピノサドの高い生成株をスクリーニングし、かつ交配させるための二親性の不活性化の方法を介して、実施している（WU Ping et al., Screening and Breeding of High Producing Strains of Spinosad by Protoplast Fusion, SCIENCE AND TECHNOLOGY OF CEREALS, OILS AND FOODS, 2012,20 (3): 46-49）。しかし、原形質融合のあとに、複雑な組換えが、２つの親ゲノムの間に生じ、当該複雑な組換えは、最終的にスクリーニングされた株の複雑な遺伝的背景および不安定な遺伝的特徴を生じ、かつさらなる遺伝的な改変に有益ではない。
本発明は、上述の組換え発現株の不確かな遺伝的背景および不安定な遺伝的特徴の問題を解決するために、スピノサド発現株の構築方法を提供すること、およびスピノサド異種発現株を入手することを目的とする。
第１の態様では、本発明は、スピノサド異種発現株の構築方法を提供する。当該方法において、Saccharopolyspora erythraeaにおけるエリスロマイシン合成性の遺伝子クラスタが、Saccharopolyspora spinosaのスピノサド合成性の遺伝子クラスタおよびラムノース合成性の遺伝子クラスタに置き換えられる。好ましくは、当該方法は、複数の相同的組換えを用いてSaccharopolyspora erythraeaにおける上記エリスロマイシン合成性の遺伝子クラスタをSaccharopolyspora spinosaの上記スピノサド合成性の遺伝子クラスタおよび上記ラムノース合成性の遺伝子クラスタに置き換える。
さらに好ましくは、当該方法は、以下のステップ：（１）Saccharopolyspora spinosaの上記スピノサド合成性の遺伝子クラスタならびにその上流および下流を網羅しており、かつ複数の隣接する核酸断片が重複している配列を保有している、複数の核酸断片を得ることと；（２）ステップ（１）において得られた上記複数の核酸断片を、Saccharopolyspora erythraeaのゲノム内に連続的に連結して、これによって、Saccharopolyspora erythraeaにおける上記エリスロマイシン合成性の遺伝子クラスタを、Saccharopolyspora spinosaの、上記スピノサド合成性の遺伝子クラスタの配列ならびにその上流配列および下流配列と置き換えて組換え株を得るために、相同的組換えの機序を用いることと；（３）Saccharopolyspora spinosaのラムノース合成性の遺伝子クラスタの、核酸断片を得ることおよびステップ（２）において得られた上記組換え株のスピノサド合成性の遺伝子クラスタの上記下流配列を、ラムノース合成性の遺伝子クラスタの上記核酸断片に置き換えて、上記スピノサド異種発現株を得るために、相同的組換えの機序を用いることとを包含している。
好ましくは、ステップ（２）において、上記複数の核酸断片はそれぞれプラスミドとして構築され、それから上記Saccharopolyspora erythraeaと相同的な交差によって相同的組換えを行う。ここで、上記複数の核酸断片の５’〜３’（５’から３’）までの配列に従って、最後の核酸断片を含んでいるプラスミドを除く他のプラスミドのそれぞれは、順に接続されている５’相同性アーム、ステップ（１）で得られた上記核酸断片、および接合に必要な耐性遺伝子カセットを含んでおり、各プラスミドの上記５’相同性アームは、Saccharopolyspora erythraeaの上記エリスロマイシン合成性の遺伝子クラスタの上流の配列と相同である。上記最後の核酸断片を含んでいるプラスミドは、耐性遺伝子カセット、５’相同性アーム、上記最後の核酸断片、および３’相同性アームを含んでおり、上記耐性遺伝子カセット、上記５’相同性アーム、上記最後の核酸断片、上記３’相同性アームは順に結合しており、上記３’相同性アームは、Saccharopolyspora erythraeaの上記エリスロマイシン合成性の遺伝子クラスタの下流の配列と相同である。さらに好ましくは、まず、上記最後の核酸断片を含んでいるプラスミドおよび最初のSaccharopolyspora erythraeaの間で相同性組換えが生じ、それから続いて、上記他の核酸断片を含んでいるプラスミドおよび先のステップで得られたSaccharopolyspora erythraeaの間で相同性組換えが生じる。好ましくは、上記最初のSaccharopolyspora erythraeaはATCC11635である。
さらに好ましくは、cosmid supercos-1がステップ（２）の最初のプラスミドとして用いられる。好ましくは、上記耐性遺伝子カセットはaac(3)IV+oriT配列を含んでいる。
さらに好ましくは、ステップ（２）におけるプラスミド構築過程は以下の通りである。まず、Saccharopolyspora erythraeaの上記エリスロマイシン合成性の遺伝子クラスタの上流および下流の核酸断片（それぞれ約３ｋｂ）を、それぞれ上記５’相同性アームおよび上記３’相同性アームとしてcosmid supercos-1に挿入して、改変cosmid eryUD-cos2を得る。それから、ステップ（１）で得られた上記核酸断片を上記cosmid eryUD-cos2の上記２つの相同性アームの間に挿入する。上記最後の核酸断片を含んでいるプラスミドでは、上記５’相同性アームの上流に耐性遺伝子カセットを導入し、他のプラスミドでは、上記３’相同性アームを置き換えることで耐性遺伝子カセットを導入する。さらに好ましくは、他のプラスミドの上記３’相同性アームを上記耐性遺伝子カセットと置き換えることは、相同的組換えによって行われる。
さらに好ましくは、上記５’相同性アームの配列は配列番号４６に示されており、上記３’相同性アームの配列は配列番号４７に示されている。
好ましくは、ステップ（３）において、上記ラムノース合成性の遺伝子クラスタは相同的組換え用のプラスミドとして構築され、上記プラスミドはそれから、ステップ（２）で得られた上記組換え株と相同的組換えし、上記プラスミドは、２つの相同性アームおよびこれら２つの相同性アームの間に位置する上記ラムノース合成性の遺伝子クラスタを含んでおり、これら２つの相同性アームは両方とも、上記スピノサド合成性の遺伝子クラスタの上記下流の配列と相同である。好ましくは、これら２つの相同性アームの配列はそれぞれ、配列番号４９および配列番号４８である。
好ましくは、ステップ（１）において、上記複数の核酸断片は、少なくとも３つの核酸断片であり、好ましくは、３、４、５、６または７つの核酸断片であり、各核酸断片は２５〜４０ｋｂのサイズであり、さらに好ましくは、上記複数の核酸断片は、４つの核酸断片であり、それらの配列は、配列番号１７〜２０にそれぞれ示されている。
好ましくは、ステップ（１）において、Saccharopolyspora spinosaのゲノムＤＮＡはSau3AIによって消化されてゲノムライブラリを構築し、上記スピノサド合成性の遺伝子クラスタ配列ならびにその上流および下流の配列を網羅している複数の核酸断片は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によってスクリーニングされる。
第２の態様では、本発明は、本発明の方法によって構築されるスピノサド異種発現株を提供する。上記発現株は、上記エリスロマイシン合成性の遺伝子クラスタがSaccharopolyspora spinosaの上記スピノサド合成性の遺伝子クラスタおよび上記ラムノース合成性の遺伝子クラスタと置き換えられたSaccharopolyspora erythraeaである。好ましくは、上記発現株は遺伝的に改変された株ES05である。
第三の態様では、本発明は、本発明のスピノサド異種発現株を、スピノサドを調製するのに用いる方法を提供する。
第四の態様では、本発明は、スピノサドを生成する方法であって、当該方法は本発明によって構築されるスピノサド異種発現株を用いる方法を提供する。
本発明では、エリスロマイシン生成株Saccharopolyspora erythraeaのエリスロマイシン生合成性の遺伝子クラスタ（３２ｋｂ、GenBank AY661566.1）をSaccharopolyspora spinosaのスピノサド生合成性の遺伝子クラスタ（８０ｋｂ、GenBank AY007564）によって置換し、ラムノース生合成性の遺伝子クラスタ（全部で４つの遺伝子。gdh+ kre、GenBank AF355468.1; gtt、 GenBank AF355467.1; epi、GenBank AF355466.1）を挿入して、Saccharopolyspora erythraeaがスピノサドを生成するようにする。得られた遺伝的に改変された株は、明確な遺伝的背景を有し、全ゲノムの配列情報は極めてはっきりしている。したがって、任意の位置の遺伝子を正確に改変でき、遺伝子操作および株育成が容易になる。Saccharopolyspora erythraea自身が改変の可能性を有しているので、得られた組換え株も改変の可能性を有しており、これはもともとのスピノサド生成株Saccharopolyspora spinosaに比べてすぐれており、得られた組換え株の発酵時間（fermentation time）は短いので、感染しにくく、スピノサドの生成により役に立ち、コストを削減し、品質を保証し、産業的な大規模生産に適している。
プラスミドpBS-eryUDの構築過程である。 プラスミドSupercos-1 (A)およびeryUD-cos2 (B)のプラスミド概観図である。 スピノサド生成株のゲノムＤＮＡの酵素消化結果であり；それぞれのレーンが、１．酵素消化なしのゲノムＤＮＡ；２．５分間の酵素消化；３．８分間の酵素消化；４．１１分間の酵素消化；５．１４分間の酵素消化；６．１７分間の酵素消化；７．２０分間の酵素消化；およびＭ、λ/Hind IIIをそれぞれ表わしている。 スピノサド生成株のゲノムＤＮＡの酵素消化結果であり、それぞれのレーンが、１．５分間の酵素消化；２．６分間の酵素消化；３．７分間の酵素消化；およびＭ、λ/Hind IIIをそれぞれ表わしている。 ９６ウェルプレートを用いてゲノムプラスミドライブラリをスクリーニングするフロー図である。 スピノサド合成性の遺伝子クラスタにおける各遺伝子位置、および各ゲノムプラスミドライブラリ位置の概略図である。 Ａ〜Ｆは、spnR、spnFおよびspnBを含んでいるプラスミドライブラリをスクリーニングするＰＣＲ電気泳動の結果である。 Ａ〜Ｆは、図７Ａ〜７Ｆにおいて得られた陽性の結果をさらにスクリーニングするＰＣＲ電気泳動の結果である。 Ａ〜Ｄは、spnDおよびspnEを含んでいるプラスミドライブラリをスクリーニングするＰＣＲ電気泳動の結果である。 Ａ〜Ｄは、図９Ａ〜９Ｄにおいて得られた陽性の結果をさらにスクリーニングするＰＣＲ電気泳動の結果である。 スピノサド合成性の遺伝子クラスタの断片改変および相同的組換え過程を示す概略図である。 プラスミド15D1-AmTの構築過程である。 プラスミドpUAmT14の概観図である。 プラスミドpAT-DgegUの概観図である。 Ａ〜Ｃは、３株の発酵のＨＰＬＣプロファイルである。 種々の断片の重複している部分のＰＣＲ検出の概略図である。
以下、具体的な実施形態を参照して発明を説明するが、本発明の内容はこれに限定されない。
本発明のスピノサド異種発現株構築方法は、以下のステップに説明され得る。
（１）元のコスミドを改変すること：すなわち、Saccharopolyspora erythraeaのエリスロマイシン合成性の遺伝子クラスタの上流および下流断片（それぞれ約３ｋｂ）をそれぞれ、cosmid supercos-1のクローニング部位BamHIの両側に挿入して、改変されたcosmid eryUD-cos2を得ること。Saccharopolyspora erythraeaの染色体におけるエリスロマイシン合成性の遺伝子クラスタは、２つの異種断片によって、クローン化されている標的断片と直接に置き換えられ得る。
（２）Saccharopolyspora spinosaのスピノサド合成性の遺伝子クラスタ断片をクローン化すること：Saccharopolyspora spinosaのゲノムＤＮＡに対する、Sau3AIを用いた部分的な酵素消化を実施して、酵素消化後の上記断片の大部分を２５〜４０ｋｂの範囲に分布させ、それから改変されたcosmid eryUD-cos2をキャリアとして選び、パッケージキットGigapack（登録商標） III XL Packaging Extractをパッケージングのために利用し、Saccharopolyspora spinosaゲノムライブラリを構築し、スピノサド合成性の遺伝子クラスタ断片を含んでいるライブラリプラスミドをＰＣＲを介してスクリーニングする。
（３）スクリーニングしたゲノムライブラリを配列決定し、そこに含まれているＤＮＡ断片の、スピノサド生合成性の遺伝子クラスタにおける相対的位置を決定する。同じ挿入方向を有する異なる断片を含んでいる４つのライブラリプラスミドを選択する。上記４つのライブラリプラスミドは、スピノサド生合成性の遺伝子クラスタを完全に網羅でき、上記遺伝子クラスタを移動させるために十分な長さだけ、互いに重複している。
（４）ライブラリプラスミドをトリミングすること：ＰＣＲターゲット法を用いて、上記相同性アームがeryUD-cos2に設計されている相同性アームと同じ長さであり、かつ接合に必要な要素を有しているように、スピノサド合成性の遺伝子クラスタ断片上の不要な相同性アーム断片をアプラマイシン耐性遺伝子カセットaac(3)IV+oriTと置き換える。ＰＣＲターゲットに供された耐性遺伝子カセットは、２つの相同性アームの外側に配置されており、ターゲット断片が相同的な二重の交差によってSaccharopolyspora erythraea染色体に移されるときに、失われ、したがって、上記耐性遺伝子カセットを次の回のトリミングおよびＤＮＡ断片移動に再利用され得る。
（５）
含まれているＤＮＡ断片の配列の接合によって、上記４つのトリミングされたライブラリプラスミドを、Saccharopolyspora erythraeaに形質転換し、二重交差の株をスクリーニングによって、遺伝子断片の移動を達成する。４段階の移動後、８０ｋｂのスピノサド合成性の遺伝子クラスタは、エリスロマイシン合成性の遺伝子クラスタがSaccharopolyspora erythraea染色体上に本来的に配置されている位置に、うまく移動させられる。スピノサド合成性の遺伝子クラスタの上流および下流の約１０ｋｂの断片が同時に移動され、これらの断片はそのあとの遺伝子操作の標的領域として用いることができ、それぞれ「操作可能領域１」「操作可能領域２」と呼ばれる。
（６）gtt、epi、gdh、 kre遺伝子を含んでいるラムノース合成性の遺伝子クラスタをクローニングしてキャリアにライゲートし、当該クラスタを上記の「操作可能領域２」に相同的二重交差法により挿入して、組換えの全過程を終え、スピノサド異種発現株を得る。
以下の方法は、詳細には以下の通りである以下の実施形態において使用される。
方法１：ＤＮＡのライゲーション反応
異なる断片およびリニアのキャリアを、３：１〜９：１のモル比、３μｌの総容積において準備した。３μｌの溶液Ｉ（Takara、商品番号Ｄ６０２０Ａ）を加え、ウォーターバスを３０分以上にわたって６℃に保った。
方法２：Escherichia coli形質転換（ＣａＣｌ２法）（Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition; Beijing Science Press, 2002:93-99）
１）Escherichia coliの単コロニーを３ｍｌのＬＢ培地に３７℃（ＢＷ２５１１３の場合は３０℃）において播き（Escherichia coliが耐性遺伝子を保有しているとき、対応する抗生物質を加える）、２２０ｒｐｍで１４〜１８時間、培養した。
２）上記混合物を、１％の播種量（必要に応じて対応する構成物質が加えられ；種々の抗生物質の終濃度は以下の通り：アンピシリン（Ａｐ）の終濃度は１００μｇ／ｍＬ、カナマイシン（Ｋｍ）およびアプラマイシン（Ａｍ）の終濃度は５０μｇ／ｍＬ、クロラムフェニコール（Ｃｍ）の終濃度は２５μｇ／ｍＬ））、３７℃（３０℃におけるBW 25113）においてＬＢ培地に移し、それから上記混合物を、ＯＤ６００が０．４〜０．６になるまで、２２０ｒｐｍにおいて培養した。
３）株を遠心分離によって回収し、滅菌した１００ｍＭのＣａＣｌ２（同容積）に懸濁し、氷上に２０分間置いた。
４）株を遠心分離によって回収し、１００ｍＭのＣａＣｌ２／１５％（Ｗ／Ｖ）グリセロール（１／１０容積）に懸濁し、１００μｌ／チューブにおいて、１．５ｍｌの遠心チューブにサブパッケージ化して、コンピテントセルを得た。
５）コンピテントセルの１つのチューブを取り、ＤＮＡ（１０μｌを超えない体積の、プラスミドまたはライゲーション生成物）を加え、静かに混合し、氷上に３０分間置いた。
６）上記混合物を、４２℃のウォーターバスに９０秒間入れたあとすぐに、氷上に１〜２分置いた。
７）９００μｌのＬＢ培地を加え、ウォーターバスを４５〜６０分間、３７℃に保った。
８）菌株液（５０μｌをプラスミド形質転換用およびライゲーション生成物形質転換用に取り、それから、遠心分離後、上澄の大部分を取り除き、株を残留溶液に懸濁した）を、対応する抗生物質を含んでいるＬＢプレート上に、スクリーニングのためにコートし、３７℃（ＢＷ２５１１３の場合は３０℃）、１４〜１８時間で培養して、形質転換体を増やした。
方法３：ＰＣＲ増幅
反応溶液を以下の比に従って調製した。２５μｌの２ｘＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＧＣバッファー溶液（Ｍｇ２+ Ｐｌｕｓ）、４μｌのｄＮＴＰ混合物（それぞれ２．５ｍＭ）、１μｌの上流プライマー（２５μＭ）、１μｌの下流プライマー（２５μＭ）、１８μｌのｄｄＨ２Ｏ、０．５μｌのテンプレートＤＮＡ、および０．５μｌのＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）ＨＳＤＮＡポリメラーゼ。
反応手順：９５℃×５分、（９８℃×１０秒、６８℃×１分／１ｋｂ標的断片長）×２５サイクル、７２℃×２分、１６℃×１分。
方法４：ＤＮＡの回収
Shanghai Huashun Biotechnology Co., Ltd.のＰＣＲ産物回収キット（商品番号Ｗ５２０２）およびゲル回収キット（商品番号Ｗ５２０３）を回収に用いた。
１）溶液からＤＮＡを回収する場合は、５倍の体積のＰＢバッファー溶液を上記溶液に加え、混合し、吸収カラムに吸収した。電気泳動ゲルから回収する場合は、３倍の重量（１００μｌは１００ｍｇに等しいとして計算）のＳ１バッファー溶液をスライスしたゲルに加え、５０℃のウォーターバスに入れて、ゲルを融かし、吸収カラムに吸収させた。
２）９０００ｒｃｆの遠心分離を３０秒行った。
３）回収チューブ内の液体を注ぎ、５００μｌのＷ１バッファー溶液を加え、遠心分離を９０００ｒｃｆで３０秒行った。
４）ステップ３）を繰り返して、回収チューブ内の液体を注いだ。
５）吸収カラムを清潔な１．５ｍｌ遠心チューブに移し、３０μｌのＴ１バッファー溶液をカラムの中心に加え、室温において５分、置いた。
６）９０００ｒｃｆの遠心分離を１分行って、回収されたＤＮＡを得た。
方法５：ＤＮＡ断片の付着端の補填および５’リン酸化
以下の反応溶液を調製した。４．２μｌの精製したＤＮＡ断片、０．５μｌのＢＫＬバッファー溶液、および０．２５μｌのＢＫＬ酵素混合物を３７℃のウォーターバスに３０分以上入れ、それから７０℃のウォーターバスに５分入れて、上記酵素混合物を不活性化した。
方法６：エンドヌクレアーゼ消化によるリニア化後におけるＤＮＡ断片の脱リン酸化
１μｌのFastAp（Fermentas、商品番号ＥＦ０６５１）をエンドヌクレアーゼ消化反応溶液に直接加え、３７℃のウォーターバスに３０分間にわたって入れた。
方法７：Escherichia coli-Saccharopolyspora erythraeaの接合方法
１）Escherichia coliＥＴ１２５６７（pUZ8002）（Gust B, Kieser T, Chater KF. REDIRECT Technology: PCR-targeting system in Streptomyces coelicolor. Norwich: John Innes Center. 2002: 13-35）のコンピテントセルを方法２に従って調製し、それから、培養の間にＫｍおよびＣｍを培地に加えた。
２）接合に用いる５μｌのプラスミドを取り、ET12567（pUZ8002）のコンピテントセルに方法２に従って形質転換させ、形質転換後、Ｋｍ、Ｃｍ、およびＡｍを含んでいるＬＢプレート上にコートした。
３）１つの形質転換体を取り、Ｋｍ、Ｃｍ、Ａｍを含んでいる３ｍｌのＬＢ液体培地、３７℃、１４〜１８時間、２２０ｒｐｍにおいて培養した。
４）上記混合物を、Ｋｍ、Ｃｍ、Ａｍを含んでいる３０ｍｌのＬＢ液体培地に、１％の播種量、３７℃、２２０ｒｐｍにおいて、ＯＤ６００が０．４〜０．６になるまで培養した。
５）遠心分離により株を回収し、ＬＢ液体培地を用いて２回にわたって洗浄し、２ｍｌのＬＢ液体培地に懸濁し、それから使用のため室温に置いた。
６）ステップ５）を行うと同時に、１０６〜１０８の細胞を含み５００μｌの２×ＹＴ培地（１．６％のトリプトン、１．０％のイースト抽出物、０．５％ＮのａＣｌ）に懸濁したSaccharopolyspora erythraea胞子溶液に、５０℃において１０分間、熱ショックを与え、それから室温において冷やした。
７）ステップ５）の菌株液５００μｌを、ステップ６）の熱的衝撃を受けた上記胞子溶液および混合し、９０００ｒｃｆ、１分間、遠心分離し、それから約８００μｌの上澄を捨て、株を残留溶液に懸濁し、ＭＳ（２％の大豆ケークパウダー、２％のマンニトール、１．５％の寒天粉末）プレート（当該プレートはその前に、無菌環境において１時間にわたって風乾し、部分的に脱水した）に塗り、３４℃において１４〜１８時間、培養した。
８）１．２５ｍｇのＡｍおよび０．５ｍｇのナリジクス酸（Ｎａｌ）を含んでいる１ｍｌの滅菌水を上記プレートに塗り、引き続き３４℃において培養した。
９）６〜７日後、形質転換体が成長した。
方法８：アルカリ溶解によるプラスミドＤＮＡの調製
１）単一のコロニーを３ｍｌ（必要なら、体積を大きくしてもよい）のＬＢ液体培地に接種し、適当な抗生物質を加え、それから３７℃において１４〜１８時間、振盪培養を行った。
２）１．５ｍｌ（低コピー数のプラスミドを調製する場合は５ｍｌ）を取って、３０秒間、１２０００ｒ／分で遠心分離した。
３）上澄を完全に吸収し、株を１００μｌの予冷した溶液Ｉ（５０ｍｍｏｌ／Ｌのグルコース、２５ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍｍｏｌ／ＬのＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）に懸濁した。
４）２００μｌの新たに調製した溶液ＩＩ（ＮａＯＨを０．２ｍｏｌ／Ｌ、ＳＤＳ１％）を加え、５回ひっくり返し（reversed for 5 times）、３分間、氷上に置いた。
５）１５０μｌのあらかじめ冷却した溶液ＩＩＩ（６０ｍｌの５ｍｏｌ／Ｌ酢酸カリウム、１１．５ｍｌの氷酢酸、２８．５ｍｌの水）を加え、アップダウンによって混ぜ、３分間、氷上に置いた。
６）５分間、１２０００ｒ／分で遠心分離し、それから上澄を別の遠心チューブに移し、等量のフェノール−クロロフォルム−イソアミルアルコール（BioFlux, 商品No.: BSA03M1）を加えて振動し混合した。
７）５分間、１２０００ｒ／分で遠心分離し、それから上澄を別の遠心チューブに慎重に移し、二倍の体積の氷冷の無水エタノールを加え、室温において２分間、置いた。
８）５分間、１２０００ｒ／分で遠心分離し、それから上澄を注ぎ、沈殿物を７０％のあらかじめ氷冷したアルコールで２度、洗浄した。
９）上記沈殿物を乾燥させ、２０〜５０μｌのＴＥ（ｐＨ８．０）に溶解させ、−２０℃において保存した。
方法９：ＰＣＲ検出
次のような反応溶液を調製する。２５μｌの２×ＧＣ Ｉ バッファー溶液（Takara、商品番号ＤＲＲ２０ＧＣＩ）、４μｌの２．５ｍＭ ｄＮＴＰ、１μｌのプライマー１（２５μＭ）、１μｌのプライマー２（２５μＭ）、１μｌ（１０−１００ｎｇ）のテンプレートＤＮＡ、３２．５μｌのＨ２Ｏ
ＰＣＲ産物が３ｋｂ未満のサイズの場合は、０．５μｌのｒＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（Takara、商品番号Ｒ００１）を加え、
ＰＣＲ産物が３ｋｂより大きいサイズの場合は、０．５μｌのＬＡ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Takara、商品番号ＤＲＲ００２Ｂ）を加えた
手順：９４℃×５分、（９５℃×３０秒、（Ｔｍ-５）℃×１５秒、７２℃×１分／ｋｂｐ）×３０サイクル、７２℃×２分、１６℃×１秒
方法１０：放線菌のトータルＤＮＡの抽出
１）放線菌の胞子または菌糸を取り、３０ｍｌのＴＳＢ培地（商品番号２１１８２５、ＢＤ、ＵＳＡ）に接種して、２８℃において４０時間、２００ｒｐｍで培養した。
２）遠心分離で株を回収し、滅菌水で２度洗い、４ｍｌのリゾチーム溶液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．０、１０．３％スクロース、４ｍｇ／ｍｌリゾチーム）に懸濁し、それから３７℃のウォーターバスに４時間にわたって入れた。
３）４００μｌの１０％ＳＤＳ溶液および１５μｌの２０ｍｇ／ｍｌプロテイナーゼＫ（Takara、商品番号Ｄ９０３３）溶液を加え、引き続き３７℃のウォーターバスに３０分間にわたって入れた。
４）上記混合物を、同体積のフェノール−クロロフォルム−イソアミルアルコール（ＢｉｏＦｌｕｘ、商品番号ＢＳＡ０３Ｍ１）で２度抽出し、２．５ｍｌの上澄を取った。
５）２５０μｌの３Ｍ ＮａＡｃ溶液（ｐＨ５．３）および３ｍｌのイソプロパノールを加え、何度かひっくり返した（reversing for several times）したあと、白色の綿状沈殿物を摘出して新たな２．５ｍｌの遠心チューブに入れ、７０％エタノールで２度、洗浄したあと、室温において１時間乾燥させた。
６）２ｍｌの２ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ溶液（ｐＨ８．０）を用いて、上記沈殿物を溶解させ、それから、２μｌの２０ｍｇ／ｍｌＲＮＡ酵素を加えた。
特に断りがない限り、本発明で用いられる特定の実験方法はすべて、本研究分野で既知の従来の方法である。例えば、
１．エンドヌクレアーゼの単回の酵素消化は、製品マニュアルに従って行われる。
２．プラスミドはアルカリ溶解によって抽出される。詳細について方法８を参照。
３．ＰＣＲ検出には通常のＴａｑＤＮＡポリメラーゼが用いられる。詳細について方法９を参照。
さらに、記載の便宜のため、以下の記載は実際には次のような内容を含んでいるものとする。
１．プラスミドを構築する際、「ライゲートしてプラスミドを得る」という記載は、以下のいくつかの局面からなる複数の操作内容を含んでいる、連続的な操作プロセスである。（１）ＤＮＡ断片のライゲーション反応（方法１を参照）。（２）上記ライゲーション反応の生成物をEscherichia coliＤＨ５αに移すこと（方法２を参照）。（３）形質転換体を摘出してプラスミドを抽出。（４）上記プラスミドをエンドヌクレアーゼで酵素消化して、上記プラスミドの消化生成物の断片サイズが想定したサイズと一致するかどうかテストすること。
２．「ＰＣＲ増幅」という記載は、特に断りがない限り、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）ＨＳ ＤＮＡポリメラーゼおよびＧＣバッファー溶液を増幅に用いる。詳細は方法３を参照。
３．「回収する」という記載は、ＰＣＲ産物回収キットを用いて溶液から回収することであり、ゲル回収キットを用いて電気泳動ゲルから回収することである。具体的な操作について方法４を参照。
特に断りがない限り、以下の実施例に使用される試薬のすべては、化学または生物学の試薬販売店または供給業者から購入され得；使用されるすべての器具も当該分野における従来の器具である。
〔実施例１：コスミドキャリアの改変〕
ステップ（１）およびステップ（２）は、エリスロマイシン生合成性の遺伝子クラスタの上流断片および下流断片（すなわち、５’相同性アームおよび３’相同性アームを含んでいる、二重乗り換えのための２つの相同性アーム）を、pBluscript KS (+)（GenBank:X52331.1）ベクターに順にクローニングし、２つの相同性アームの間にBamHI部位を導入し、上流の断片の５’末端および下流の断片の３’末端にNotI部位をそれぞれ導入し、上記NotIを用いて、上記２つの相同性アームを含んでいる断片を切断する。構築プロセスは、図１に示す通りである。
（１）Saccharopolyspora erythraea（ATCC 11635）のゲノム（ゲノムＤＮＡの抽出については方法１０を参照）を、テンプレートとして使用し、euF（配列番号１、５’末端にNotI部位を導入している）／euR（配列番号２、５’末端にBamHI部位を導入している）を、プライマーとして利用し、エリスロマイシン生合成性の遺伝子クラスタの上流にある２５１１ｂｐ断片１：eryU（配列番号４６、制限消化部位および保護的な塩基配列を含んでおり、したがってサイズは２５３１ｂｐであった）を、ＰＣＲによって増幅した。ＰＣＲ産物を回収し、NotI（Takara）を用いた１時間にわたる酵素消化に供し；それから、酵素消化された生成物を、回収し、BamHI（Takara）を用いた１時間にわたる酵素消化に供して、二重に酵素消化された生成物を得；また、pBluscript KS (+)ベクターを、NotIおよびBamHIを用いた酵素消化に供し、回収し；それから、二重消化後における上述のＰＣＲ産物とライゲートさせ、組換え組換えプラスミド1:pBS-eryUを、スクリーニングおよび試験の後に得た。
（２）それから、エリスロマイシン生成株のゲノムＤＮＡを、テンプレートとして利用し、エリスロマイシン生合成性の遺伝子クラスタの下流に基づく２６４２ｂｐ断片２:eryD（配列番号４７、制限消化部位および保護塩基配列を含んでおり、したがってサイズは２６６７ｂｐであった）を、edF（配列番号３、５’末端にPst I部位を導入している）／edR（配列番号４、３’末端にNotIおよびXhoI部位を導入している）を、プライマー対として用いたＰＣＲによって増幅した。回収後に、XhoIおよびPstI：５μｌの１０×Ｈバッファー溶液、２５μｌのＰＣＲ産物（またはプラスミド１：pBS-eryU）、１８μｌのｄｄＨ２Ｏ、１μｌのPstI（Takara、商品番号１０７３Ａ）、および１μｌのXhoI（Takara、商品番号１０９４Ａ）を用いて、ＰＣＲ産物および組換えプラスミド１：pBS-eryUを、二重の酵素消化に供した。二重酵素消化させた。混合物を、１時間にわたって３７℃のウォータバスに入れ、それから、生成物を、それぞれ回収し、ライゲートして、組換えプラスミド2: pBS-eryUDを、スクリーニングおよび同定を経て、得た。
（３）組換えプラスミド２ pBS-eryUDを、NotIを用いた制限消化に供し、２つの相同性アーム（すなわち、断片１：eryUおよび断片２：eryU）を含んでいる５１７９ｂｐ断片を、ゲルの切り取りを介して回収し、それから、NotIを用いて消化された、脱リン酸化されているたコスミドsupercos-1（Stratagene、商品番号２５１３０１、概観について図２Ａを参照）とライゲートした。最後に、コスミドEryUD-Cos2（概観について図２Ｂを参照）を、ＰＣＲおよび酵素消化検出を経て、得た。
〔実施例２：スピノサド生成株のトータルＤＮＡの抽出〕
極低温バイアルからのスピノサド生成株Saccharopolyspora spinosaの胞子溶液（NRRL 18538）を、取り、３０ｍｌのＴＳＢ培地に播き、トータルＤＮＡを、方法１０にしたがって抽出した。
〔実施例３：スピノサド生成株のゲノムライブラリの構築〕
（１）スピノサド生成株のトータルＤＮＡの部分的な酵素消化条件のための試験：
以下の反応溶液：実施例２において調製されたスピノサド生成株の１００μｌのトータルＤＮＡ；１５μｌの１０×Ｈバッファー溶液および、３５μｌのｄｄＨ２Ｏを調製した。
上記溶液を、５分間にわたって３７℃のウォーターバスに入れたあと、０．２５ｕのSau3AI（Takara Biological Engineering (Dalian) Co., Ltd., 商品番号Ｄ１０８２Ａ、酵素の保存溶液を用いて標的濃度まで希釈されている）を加えて、それから、混合物を３７℃のウォーターバスにふたたび入れた。５分後から、３分ごとに２５μｌの反応液を取りだして、５μｌの６×ローディングバッファー溶液（Takara Biological Engineering (Dalian) Co., Ltd., 商品番号Ｄ６０４）において反応を停止させた。電気泳動の結果（図３）は、反応時間が５〜８分間のとき、スピノサド生成株のトータルＤＮＡの消化断片が、相対的に３０ｋｂ付近に集められることを示している。
（２）スピノサド生成株のトータルＤＮＡの、部分的な酵素消化：
以下の反応溶液：スピノサド生成株の、１０００μｌのトータルＤＮＡ、１５０μｌの１０×Ｈバッファー溶液、および３５０μｌのｄｄＨ２Ｏを調製した。
上記溶液を３７℃のウォーターバスに５分間にわたって入れておいたあと、０．２５ｕのSau3AIを加えて、それから、混合物を３７℃のウォーターバスにふたたび入れた。反応が５分間、６分間および７分間にわたって実施されたときに、５００μｌの反応溶液を、それぞれ取り出し、等量のフェノール−クロロフォルム−イソアミルアルコールを抽出物に加え、それから、５μｌの混合物を、電気泳動試験のために取りだした。結果は、反応時間が５分および６分のときに、スピノサド生成株のトータルＤＮＡの消化された断片が、相対的に２５〜４０ｋｂ付近に集められることを示している。その結果を図４に示した。
５分の反応時間および６分の反応時間を有している２つのチューブを混ぜ合わせ、それから、１００μｌの３ｍｏｌ／ＬのＮａＡｃ溶液（ｐＨ５．３）および１．１ｍｌのイソプロパノールを加え、数回の転倒の後に白色の綿状の沈殿物を新しい２．５ｍｌの遠心管に取り出した。沈殿物を、７０％エタノールを用いて２回にわたって洗浄し、室温において３０分間にわたって乾燥させ、１００μｌの２ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ−ＨＣｌ溶液（ｐＨ８．０）に溶解させた。
（３）スピノサド生成株のトータルＤＮＡの部分的な酵素消化生成物の脱リン酸化：
以下の反応溶液：スピノサド生成株のトータルＤＮＡの、１００μｌの部分的な酵素消化生成物；１１．５μｌのFastApバッファー溶液；および３μｌのFastApを調製した。
溶液を３７℃のウォーターバスに５０分間にわたって入れておいたあと、等量のフェノール−クロロフォルム−イソアミルアルコールを加えて、抽出し；９０μｌの上澄を取り、９μｌの３ｍｏｌ／ＬのＮａＡｃ溶液（ｐＨ５．３）および２００μｌの無水エタノールを加え、上澄を遠心分離によって除去し、それから沈殿物を、７０％エタールを用いて２回にわたって洗浄し、室温において３０分間にわたって乾燥させた。上記沈殿物を、５０μｌの２ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ−ＨＣｌ溶液（ｐＨ８．０）に溶解させて、スピノサド生成株のトータルＤＮＡの脱リン酸化部分的な酵素消化生成物を得た。
（４）コスミドEryUD-Cos2の酵素消化および脱リン酸化：
以下の反応溶液：５０μｌのコスミドEryUD-Cos2；１０μｌの１０×Ｈバッファー溶液；３７μｌのｄｄＨ２Ｏ；および３μｌのXhoIを調製した。
溶液を３７℃のウォーターバスに２時間にわたって入れておき、１μｌのFastApを加え、３７℃のウォーターバスに３０分間にわたって入れておき；等量のフェノール−クロロフォルム−イソアミルアルコールを加えて抽出し；８０μｌの上澄を取り、８μｌの３ＭのＮａＡｃ溶液（ｐＨ５．３）および１８０μｌの無水エタノールを加え、それから上澄を遠心分離によって除去し、沈殿物を、７０％エタノールを用いて２回にわたって洗浄し、室温において３０分間にわたって乾燥させた。それから、上記沈殿物を、５０μｌの２ｍＭのＴＲＩＳ−ＨＣＬ溶液（ｐＨ８．０）に溶解させて、５’−脱リン酸化されているリニアのコスミドEryUD-Cos2を得た。
以下の反応溶液：５’−脱リン酸化されているリニアの、５０μｌのコスミドEryUD-Cos2；１０μｌの１０×BamH Iバッファー溶液；３７μｌのｄｄＨ２Ｏ；および３μｌのBamH Iを調製した。
溶液を３７℃のウォーターバスに２時間にわたって入れたあと、等量のフェノール−クロロフォルム−イソアミルアルコールを加えて抽出した。８０μｌの上澄を取り、８μｌの３ｍｏｌ／ＬのＮａＡｃ溶液（ｐＨ５．３）および１８０μｌの無水エタノールを加え、それから上記上澄を遠心分離によって除去し、沈殿物を、７０％エタノールを用いて２回にわたって洗浄し、室温において３０分間にわたって乾燥させた。それから、上記沈殿物を、３０μｌの２ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ溶液（ｐＨ８．０）に溶解させて、XhoIおよびBamH Iの二重に酵素消化されたコスミドEryUD-Cos2を得た。
（５）スピノサド生成株のゲノムライブラリのライゲーション：
以下の反応溶液：スピノサド生成株のトータルＤＮＡの、３μｌの脱リン酸化されている部分的な酵素消化生成物；XhoIおよびBamH Iの二重に酵素消化された、１μｌのコスミドEryUD-Cos2；３μｌの１０×Ｔ４リガーゼバッファー溶液；２１μｌのｄｄＨ２Ｏ；２μｌのＴ４リガーゼ（Takara、商品番号Ｄ２０１１Ａ）を調製した。
溶液を１６℃のウォーターバスに一晩にわたって入れておいたあとに、３μｌの３ｍｏｌ／ＬのＮａＡｃ溶液（ｐＨ５．３）および１８０μｌの無水エタノールを加え、それから上澄を遠心分離によって除去し、沈殿物を、７０％エタノールを用いて２回にわたって洗浄し、室温において３０分間にわたって乾燥させた。それから、上記沈殿物を、５μｌのｄｄＨ２Ｏに溶解させて、ライゲーション生成物を得た。
（６）スピノサド生成株のゲノムライブラリの、パッケージングおよびトランスフェクション：
パッケージングキットは、以下のステップによって扱われるGigapack（登録商標） III XLパッケージングシステム（Stratagene Inc.、商品番号２００２０１）であった。
ａ）キットのうち１パック（１つの遠心チューブ）を、取り出し、チューブにおける試薬が融けるまで手に握っていた。
ｂ）ステップ５）から得られた４μｌのライゲーション生成物を加え、穏やかに撹拌し、遠心分離器において３〜５秒間にわたって素早く遠心分離して、溶液のすべてが遠心チューブの底にある状態を確保し；
ｃ）２２℃において２時間にわたって反応させたあと、５００μｌのＳＭバッファー溶液を加え（１０００ｇごとに、以下の物質：５．８ｇのＮａＣｌ、２．０ｇのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、５０ｍｌの１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５．０ｍｌの２％（Ｗ／Ｖ）のゼラチンを含んでいる）；
ｄ）２０μｌのクロロフォルムを加え、穏やかに混合し、３〜５秒間にわたって素早く遠心分離し、４℃の冷蔵庫に使用のために保存し；
ｅ）Escherichia coli DH10Bを、グリセロールと一緒に入っている、キットにおけるチューブからピックアップして、LB培地上にストリークし、３７℃において１４〜１８時間にわたって培養して、複数の単コロニーを形成させた。
ｆ）１つの単コロニーをピックアップし、１０ｍＭのＭｇＳＯ４および０．２％（ｗ／ｖ）のマルトースを含んでいる３ｍｌのＬＢ培地に播き、３７℃において４〜６時間にわたって２２０ｒｐｍにおいて、ＯＤ６００が０．６〜０．８になるまで振盪培養に供し；
ｇ）１．５ｍｌの菌菌株液を取り、１０分間にわたって５００ｇにおいて遠心分離して菌株を回収し、沈殿物を、滅菌した１０ｍＭのＭｇＳＯ４を用いて懸濁させ、ＯＤ６００＝０．５まで希釈して、コンピテントセルを得；
ｈ）ｄ）において得られた５μｌのパッケージ生成物を取り、ＳＭバッファー溶液によって５０μｌまで希釈し、それから１μｌの混合物を取り、２００μｌのコンピテントセルに加え、３７℃において１５分間にわたって培養し；
ｉ）それから、１ｍｌのＬＢ培地を加え、一様に混ぜ、混合物を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含んでいる１０個のＬＢプレートに均一に広げ、３７℃において約１６時間にわたって培養した（各プレート上の形質転換体の数は３００〜４００であった）。
（７）スピノサド生成株のゲノムライブラリプラスミドのスクリーニング：
１００μｇ／ｍｌのＣｂを含んでいるＬＢ培地を、１５０μｌ／ウェルの９６ウェルプレート１５個にサブパッケージし、これら１５個のプレートにそれぞれ１＃から１５＃の番号を振り、上記形質転換体の１つを爪楊枝で各ウェルへ取って接種し、それから３７℃、２２０ｒｐｍで約１６時間、培養した。
上記の９６ウェルプレート中の１２ウェルのそれぞれの菌株液１０μｌを、以下の規則に基づいて混合して新たな９６ウェルプレート（それぞれ１６＃および１７＃および番号を振る）に入れた。
１６＃９６ウェルプレートの縦方向：１＃９６ウェルプレートのウェルＡ１〜Ａ１２を混合して１６＃９６ウェルプレートのウェルＡ１に入れ、ウェルＢ１〜Ｂ１２を混合して１６＃９６ウェルプレートのウェルＢ１に入れ（以下同様）、Ｈ１〜Ｈ１２を混合して１６＃９６ウェルプレートのウェルＨ１に入れた。
１６＃９６ウェルプレートの横方向：１＃９６ウェルプレートのウェルＡ１〜Ａ１２を混合して１６＃９６ウェルプレートのウェルＡ１に入れ、２＃９６ウェルプレートのウェルＡ１〜Ａ１２を混合して１６＃９６ウェルプレートのウェルＡ２に入れ（以下同様）、１２＃９６ウェルプレートのウェルＡ１〜Ａ１２を混合して１６＃９６ウェルプレートのウェルＡ１２に入れた。詳細は図５を参照。
同様にして、１７＃９６ウェルプレートの縦方向：１３＃９６ウェルプレートのウェルＡ１〜Ａ１２を混合して１７＃９６ウェルプレートのウェルＡ１に入れ、ウェルＢ１〜Ｂ１２を混合して１７＃９６ウェルプレートのウェルＢ１に入れ（以下同様）、Ｈ１〜Ｈ１２を混合して１７＃９６ウェルプレートのウェルＨ１に入れた。
１７＃９６ウェルプレートの横方向：１３＃９６ウェルプレートのウェルＡ１〜Ａ１２を混合して１７＃９６ウェルプレートのウェルＡ１（Ａ１３および数を振り直す）に入れ、１４＃９６ウェルプレートのウェルＡ１〜Ａ１２を混合して１７＃９６ウェルプレートのウェルＡ２（Ａ１４および数を振り直す）に入れ、１５＃９６ウェルプレートのウェルＡ１〜Ａ１２を混合して１７＃９６ウェルプレートのウェルＡ３（Ａ１５および数を振り直す）に入れた。
（８）スピノサド生成株特別ゲノムライブラリのＰＣＲスクリーニング：
ａ）ＰＣＲを用いて、ライブラリプラスミドが、ｓｐｎＲ、ｓｐｎＦ、およびｓｐｎＢの３つの遺伝子に含まれる部分断片（スピノサド生合成性の遺伝子クラスタの相対位置はそれぞれ、4168-5330、20151-21020、34049-34639である）を含んでいるかどうか検出した。スピノサド生合成性の遺伝子クラスタ上の上記３つの断片の相対位置を、図６に示す（つまり、スピノサド生合成性の遺伝子クラスタ上の矢印は、上記断片の位置を示す）。上記３つの遺伝子の部分断片のＰＣＲ産物のサイズはそれぞれ、１１６３ｂｐ（ｓｐｎＲ）、８７０ｂｐ（ｓｐｎＦ）、５９１ｂｐ（ｓｐｎＢ）である。上記３つの遺伝子のＰＣＲ増幅に用いたプライマー配列は、それぞれ以下の通り：
spnRプライマー：spnRF（配列番号５）およびspnRR（配列番号６）；
spnFプライマー：spnFF（配列番号７）およびspnFR（配列番号８）；ならびに
spnBプライマー：spnBF（配列番号９）およびspnBR（配列番号１０）。
以下の反応溶液：７５０μｌの２×ＧＣＩバッファー溶液、１２０μｌの２．５ｍＭ ｄＮＴＰ、１５μｌのｓｐｎＲＦ（２５μＭ）、１５μｌのｓｐｎＲＲ（２５μＭ）、１５μｌのｓｐｎＦＦ（２５μＭ）、１５μｌのｓｐｎＦＲ（２５μＭ）、１５μｌのｓｐｎＢＦ（２５μＭ）、１５μｌのｓｐｎＢＲ（２５μＭ）、５３５μｌのｄｄＨ２Ｏ、および７．５μｌのｒＴａｑ（Takara、商品番号ＤＲ００１Ａ）を調製した。
上記溶液を１０μｌ／チューブにサブパッケージし、１６＃および１７＃９６ウェルプレートの各ウェルの菌株液０．５μｌをそれぞれ加え、スピノサド生成株のトータルＤＮＡ０．２μｌをコントロールとして用いた。ＰＣＲ反応手順は以下のようにした。９５℃×１０分、（９４℃×３０秒、５５℃×３０秒、７２℃×１分１０秒）×３５サイクル、７２℃×１分、１６℃×１秒。
ＰＣＲの結果を電気泳動によって調べた。その結果を図７Ａ〜７Ｆに示した。
図７Ａ〜７Ｃの結果によれば、Ｂ９、Ｄ９、Ｅ４、Ｆ１、Ｆ４は目的のバンドを有した。すなわち、１＃９６ウェルプレートのＦ１〜Ｆ１２（１Ｆ１〜１Ｆ１２と表す）、４＃９６ウェルプレートのＥ１〜Ｅ１２（４Ｅ１〜４Ｅ１２と表す）およびＦ１〜Ｆ１２（４Ｆ１〜４Ｆ１２と表す）、９＃９６ウェルプレートのＢ１〜Ｂ１２（９Ｂ１〜９Ｂ１２と表す）およびＤ１〜Ｄ１２（９Ｄ１〜９Ｄ１２と表す）の菌株液が、対応する目的遺伝子を有した。上記の５つを第１グループと表した。図７Ｄ〜７Ｆの結果によれば、Ｈ５、Ｅ７、Ｈ９、Ａ１０、Ｄ１０、Ｇ１０、Ｈ１０は目的のバンドを有した。すなわち、５＃９６ウェルプレートのＨ１〜Ｈ１２（５Ｈ１〜５Ｈ１２と表す）、７＃９６ウェルプレートのＥ１〜Ｅ１２（７Ｅ１〜７Ｅ１２と表す）、９＃９６ウェルプレートのＨ１〜Ｈ１２（９Ｈ１〜９Ｈ１２と表す）、１０＃９６ウェルプレートのＡ１〜Ａ１２（１０Ａ１〜１０Ａ１２と表す）、Ｄ１〜Ｄ１２（１０Ｄ１〜１０Ｄ１２と表す）、Ｇ１〜Ｇ１２（１０Ｇ１〜１０Ｇ１２と表す）、Ｈ１〜Ｈ１２（１０Ｈ１〜１０Ｈ１２と表す）の菌株液が、対応する目的遺伝子を有した。以上の７つを第２グループと表した。
第１グループの６０の菌株液および第２グループの８４の菌株液に対して、上記と同じ組成を用いて、別々に個別にＰＣＲ検出を行った。それらの結果を図８Ａ〜８Ｆに示した（図８Ａ〜８Ｃは第１グループ、図８Ｄ〜８Ｆは第２グループと称した）。
第１グループの結果は、1F9、4E11、4F11、9B5、9D10は対応する目的断片をそれぞれ有していると示した。一方、第２グループの結果は、7E9、9H9、10A5、10D5、10D6、10G3は対応する目的断片をそれぞれ有していると示した。上記の菌株液を再培養してプラスミドを抽出したあと、当該プラスミドはそれぞれ上記の数で名付けられ、サンプルを配列決定に送った。シークエンシングプライマーは、ｃｏｓＦ：配列番号１１およびｃｏｓＲ：配列番号１２であった。
ｂ）ＰＣＲを用いて、ライブラリプラスミドが２つの遺伝子ｓｐｎＤおよびｓｐｎＥの部分断片を有しているか検出した（スピノサド生合成性の遺伝子クラスタ上の相対位置はそれぞれ、５０３０５−５１７２５および６９２６４−７００７６であった）。スピノサド生合成性の遺伝子クラスタ上の２つの断片の相対位置を図６に示した。上記２つの断片のＰＣＲ産物のサイズはそれぞれ、１４２１ｂｐおよび８１３ｂｐであった。用いられたプライマー配列は以下の通り：
spnDプライマー：spnDF(配列番号１３)およびspnDR(配列番号１４)；ならびに
spnEプライマー：spnEF(配列番号１５)および spnER(配列番号１６)。
以下の反応溶液：７５０μｌの２×ＧＣＩバッファー溶液、１２０μｌの２．５ｍＭ ｄＮＴＰ、１５μｌのｓｐｎＤＦ（２５μＭ）、１５μｌのｓｐｎＤＲ（２５μＭ）、１５μｌのｓｐｎＥＦ（２５μＭ）、１５μｌのｓｐｎＥＲ（２５μＭ）、および５８０μｌのｄｄＨ２Ｏ、７．５μｌのｒＴａｑを調製した。
上記溶液を１０μｌ／チューブにサブパッケージし、上記１６＃および１７＃９６ウェルプレートの各ウェルの菌株液０．５μｌをそれぞれ加え、スピノサド生成株のトータルＤＮＡ０．２μｌをコントロールとして用いた。ＰＣＲ反応手順は以下のようにした。９５℃×１０分、（９４℃×３０秒、５５℃×３０秒、７２℃×１分１０秒）×３５サイクル、７２℃×１分、１６℃×１秒。
ＰＣＲの生成物を電気泳動によって調べた。その結果を図９Ａ〜９Ｄに示した。
上記結果によれば、Ｂ８、Ｃ２、Ｄ４、Ｅ４、Ｅ１２、Ｆ４、Ａ１５、Ｄ１５は目的のバンドを有した。すなわち、８＃９６ウェルプレートのＢ１〜Ｂ１２（８Ｂ１〜８Ｂ１２と表す）、２＃９６ウェルプレートのＣ１〜Ｃ１２（２Ｃ１〜２Ｃ１２と表す）、４＃９６ウェルプレートのＤ１〜Ｄ１２（4D1〜4D1２と表す）、Ｅ１〜Ｅ１２（４Ｅ１〜４Ｅ１２と表す）、Ｆ１〜Ｆ１２（４Ｆ１〜４Ｆ１２と表す）、１２＃９６ウェルプレートのＥ１〜Ｅ１２（１２Ｅ１〜１２Ｅ１２と表す）、１５＃９６ウェルプレートのＡ１〜Ａ１２（１５Ａ１〜１５Ａ１２と表す）、Ｄ１〜Ｄ１２（15D1〜15D1２と表す）の菌株液が、対応する目的遺伝子を持つと示した。上記９６の菌株液を選んで、上記と同じ組成を用いて、別途ＰＣＲ検出をそれぞれ行った。それらの結果を図１０Ａ〜１０Ｄに示した。
上記結果によれば、2C7、4D1、4E11、4F11、8B8、12E10、15A11、15D1の菌株液は対応する目的遺伝子を有した。上記の菌株液を再培養してプラスミドを抽出したあと、当該プラスミドはそれぞれ上記の数で名付けられ、サンプルを配列決定に送った。シークエンシングプライマーは同様にｃｏｓＦおよびｃｏｓＲであった。
配列結果によれば、9D10および10G3はまったく同じ配列を有し、2C7、4D1、12E10はまったく同じ配列を有し、4E11および4F11はまったく同じ配列を有していた。2C7／4D1／12E10および9H9によって運ばれる断片は逆方向であり、残りは順方向であった。
各ライブラリプラスミドに含まれるスピノサド生合成性の遺伝子クラスタ断片の相対位置を以下の表に示した。GenBank AY007564.1によって公開された配列位置は１〜８０１６１であり、9D10、10G3、15A11、15D1すべての部分配列は、上記範囲の外に位置している。10G3（配列番号１７）および15D1（配列番号２０）の追加の配列決定結果に従って、位置１の前の配列をマイナスに設定し、位置８０１６１のあとの配列はそれに続けてカウントした。
Figure 0006641366
種々のプラスミドによって運ばれる断片の、スピノサド生合成性の遺伝子クラスタに対する位置を、図６に示した。
４つのプラスミド10G3、9B5、8B8、15D1によって運ばれる断片は、全スピノサド生合成性の遺伝子クラスタおよびその上流および下流の配列を網羅できた。上記４つのプラスミドによって運ばれる断片の配列は以下の通り：
10G3によって運ばれるＤＮＡ断片配列：配列番号１７；
9B5によって運ばれるＤＮＡ断片配列：配列番号１８；
8B8によって運ばれるＤＮＡ断片配列：配列番号１９；ならびに
15D1によって運ばれるＤＮＡ断片配列：配列番号２０。
トリミング後、ライブラリプラスミド15D1、8B8、9B5、10G3を、配列における相同的な二重の交差によって、Saccharopolyspora erythraeaのエリスロマイシン合成性の遺伝子クラスタの位置にインテグレートした。図１１は、全過程の模式図である。図１１において、「ＵＳ」は、エリスロマイシン合成性の遺伝子クラスタの上流断片eryUであり、「ＤＳ」はエリスロマイシン合成性の遺伝子クラスタの下流断片eryDである。種々のプラスミドの改変方法、および相同的組換えを行う方法については、このあとで詳細に説明する。
〔実施例４：ライブラリプラスミド15D1の改変〕
本実施例の目的は、aac(3)IV遺伝子（アプラマイシン耐性遺伝子）およびoriT（接合開始点（conjugative origin）、接合に必須の要素）を含んでいる耐性断片をライブラリプラスミド15D1のHindIII部位に挿入して、改変プラスミドを接合に用いることができるようにすることであった。本実施例は２つのステップで行われた。耐性遺伝子カセットをClaIおよびEcoRIでプラスミドpIJ773から切り離し、当該耐性遺伝子カセットを、平滑末端化後、ベクターｐＵＣ１１８（Takara、商品番号Ｄ３３２２）のHincII部位にライゲートした(配列番号６５)。切断された耐性断片はClaI付近の末端にHindIII部位を有しており、ベクターｐＵＣ１１８も１つのHindIII部位を有しているので、正確な挿入方向を有する形質転換体をスクリーニングし、耐性断片はHindIIIで切断されうる。第２のステップは、HindIIIで切断した耐性断片を、15D1のHindIII部位に挿入することである。耐性断片は、スクリーニングおよび接合のために機能するだけなので、その挿入方向はその後の実験の結果に影響しなかった。したがって、その挿入方向を決定する必要はなかった。特定の操作は以下の通りであった（図１２に示す）。
以下の反応溶液：２０μｌのpIJ773、５μｌの１０×Ｈバッファー溶液、２３μｌのｄｄＨ２Ｏ、１μｌのCla I（Takara、商品番号Ｄ１０３４Ａ）、および１μｌのEcoRI（Takara、商品番号Ｄ１０４０Ａ）を調製した。
上記溶液を３７℃のウォーターバスに１時間にわたって入れ、aac(3)IV遺伝子およびoriTを含んでいる１３８９ｂｐ断片を電気泳動で回収した。ＢＫＬキットで平滑末端化後、断片をpUC118/Hinc II、BAP（Takara、商品番号Ｄ３３２２）にライゲートして形質転換した。プラスミドを抽出するため形質転換体を選び出し、HindIIIを用いて酵素消化を行い、３５０２ｂｐ＋１４０２ｂの酵素消化結果を有する組換えプラスミドをスクリーニングした。aac(3)IV遺伝子およびoriTを含んでいる１４０２ｂｐ断片を電気泳動で回収し、HindIIIで消化された脱リン酸化プラスミド15D1にライゲートして、組換えプラスミド15D1-AmTを得た。
〔実施例５：スピノサド生合成性の遺伝子クラスタの第１断片の、Saccharopolyspora erythraeaへの転移〕
組換えプラスミド15D1-AmTを接合（方法７を参照）によってSaccharopolyspora erythraea（ATCC １１６３５）に形質転換した。形質転換体を２度、継代培養したあと、アプラマイシン感受性のコロニーをスクリーニングした。ゲノムＤＮＡを抽出し（方法１０に従ったが、ＴＳＢの量を３ｍｌに変え、他の試薬の量も同様に対応して減らした。ただし、７０％エタノールで洗浄する間の量は依然として５００μｌにした。以下同様）、プライマーspnEF（配列番号１５）／spnER（配列番号１６）およびプライマーery1F（配列番号２１）／ery1R（配列番号２２）を用いてＰＣＲ検出をそれぞれ行った。ライブラリプラスミド15D1によって運ばれるＤＮＡ断片内の配列はプライマーspnEF/spnERによって増幅され、一方、エリスロマイシン合成性の遺伝子クラスタ内の配列はプライマーery1F/ery1Rによって増幅された。したがって、spnEF/spnERは標的のバンドを増幅できたが、ery1F/ery1Rは標的のバンドを増幅できなかった。これは、エリスロマイシン合成性の遺伝子クラスタがライブラリプラスミド15D1によって運ばれるＤＮＡ断片と置き換えられており、標的の株であることを示した。遺伝子組換え株ＥＳ０１をスクリーニングによって得た。
以下の実施例６、８、１０の目的は、耐性遺伝子カセットaac(3)IV+oriT（耐性遺伝子カセットはプラスミドpIJ773、配列番号６５の14-1382部位からＰＣＲで増幅された）を用いて、対応するライブラリプラスミド上のＤＳを、運ばれたゲノム断片の３’末端の部分配列と置き換えることであった。これは主に２つのステップに分けられた。長さがそれぞれ５９ｎｔおよび５８ｎｔの順方向プライマーおよび逆方向プライマーをまず設計した。当該プライマーの５’末端の３９ｎｔはそれぞれ相同性アームとして働き、一方、３’末端の２０ｎｔ（順方向プライマー、配列番号６３）および１９ｎｔ（逆方向プライマー、配列番号６４）は耐性遺伝子カセット上のプライマー配列と一致した。耐性遺伝子カセットはpIJ773からＰＣＲによって増幅された。長さ３９ｂｐの相同性アームをＰＣＲ産物によって耐性遺伝子カセットの両端にそれぞれ導入した。これら２つの相同性アームは、ライブラリプラスミド上で置き換えられるべき断片の両端に位置していた。それから、ＰＣＲ産物が、ライブラリプラスミドを含んでいるEscherichia coli BW25113 (pIJ790)に形質転換され、標的配列が、Escherichia coliの組換え系を用いて耐性遺伝子カセットに置き換えられた。種々の実施例に用いられているプライマーおよび置き換えられた断片の関連情報について表２を参照。
Figure 0006641366
〔実施例６：ライブラリプラスミド8B8の改変〕
（１）ライブラリプラスミド8B8を、コンピテントセルBW25113 (pIJ790)に、方法２に従って形質転換した。
（２）BW25113 (pIJ790、8B8)の１つの形質転換体を選び出し、Ｃｍを含んでいる３ｍｌＬＢ培地に接種し、３０℃において１４〜１８時間の間、２２０ｒｐｍで培養した。
（３）それから、形質転換体を、Ｋｍ、Ｃｍ、Ａｐ、および３００μｌの１ＭのＬ−アラビノースを含んでいる３０ｍｌのＳＯＢ培地（滅菌済の、２．０％のトリプトン、０．５％のイースト抽出物、０．０５％のＮａＣｌ、２．５ｍｌ／Ｌの、１ＭのＫＣｌ、および４ｍｌ／Ｌの、２．５ＭのＭｇＣｌ２）に移し、ＯＤ６００が０．４から０．６になるまで３０℃、２２０ｒｐｍで培養した。
（４）４℃において遠心分離して株を回収し、１０％グリセロールを用いて２回にわたって洗浄し、それから１００μｌの１０％のグリセロールで懸濁して、エレクトロポレーション−コンピテントセルを得た。
（５）プラスミドpIJ773を鋳型として用いて、aac(3)IV+oriT耐性遺伝子カセットをＰＣＲ増幅し、相同的な交差のための長さ３９ｂｐの相同性アームを、耐性遺伝子カセットの両端に加えた。
反応系：２５μｌの５×ＰｒｉｍｅＳＴＡＲバッファー溶液（Ｍｇ２+Ｐｌｕｓ）、４μｌのｄＮＴＰ混合物（各２．５ｍＭ）、１μｌのプライマー８ＢＡ−Ｌ（配列番号２３、２５μＭ）、１μｌのプライマー８ＢＡ−Ｒ（配列番号２４、２５μＭ）、１８μｌのｄｄＨ２Ｏ、０．５μｌのプラスミドpIJ773、および０．５μｌのＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）ＨＳ ＤＮＡポリメラーゼ。
反応プログラム：９５℃×５分、（９８℃×１０秒、５０℃×１０秒、７２℃×９０秒）×１０サイクル、７２℃×２分、１６℃×１分、（９８℃×１０秒、６８℃×９０秒）×１５サイクル、７２℃×１分、１６℃×１分。
ＰＣＲ産物の電気泳動後、約１．４ｋｂの標的断片をゲル切断によって回収した。
（６）ステップ（５）で得られた耐性断片３μｌを取り、ステップ（４）で得られた５０μｌのBW25113 (pIJ790/8B8) エレクトロポレーション−コンピテントセルに加えた。当該エレクトロポレーション−コンピテントセルをすべて、２ｍｍのエレクトロポレーションカップ（BioRad）に移した。電気ショックのパラメータは、２５００Ｖ、２５μＦ、２００Ωであった。電気ショック後、１ｍｌのＳＯＣ培地（１００ｍｌのＳＯＢ培地につき、２ｍｌの１ｍｏｌ／Ｌグルコース）を速やかに加え、１．５ｍｌの遠心チューブにすべて移した。
（７）３７℃のウォーターバスに１時間にわたって入れたあと、９００μｌの上澄を遠心分離により取り除き、沈殿物を、残っている培地に懸濁させ、Ａｍを含んでいるＬＢ固体培地上に完全に広げ、３７℃において１６時間、培養した。
（８）サイズの大きな形質転換体を選び出し、Ａｍを含んでいる３ｍｌのＬＢ液に加え、３７℃において６時間、２００ｒｐｍで培養し、それからプラスミドを抽出して、プライマー8BD-L (配列番号２５)/8BD-R(配列番号２６)を用いてＰＣＲ検出を行った（ＰＣＲ反応手順における伸張時間は４分であった）プライマー８ＢＤ−Ｌおよび８ＢＤ−Ｒはそれぞれ、ライブラリプラスミド8B8上で置き換えられるべき配列の両端に位置していた。置き換えがうまく行われている場合、プラスミドのＰＣＲ産物は１９６３ｂｐの標的バンドとなる。置き換えがうまく行われていない場合、ＰＣＲ産物は３９５７ｂｐである。スクリーニング後、組換えプラスミド8B8-AmTが得られた。
〔実施例７：スピノサド生合成性の遺伝子クラスタの第２断片の、Saccharopolyspora erythraeaへの転移〕
組換えプラスミド8B8-AmTを、実施例５で得られた遺伝的に改変された株ＥＳ０１に、接合で形質転換した。形質転換体を２度、継代培養したあと、アプラマイシン感受性コロニーをスクリーニングした。トータルＤＮＡを抽出し、プライマー8BD-L（配列番号２５）／8BD-R（配列番号２６）をＰＣＲ検出に用いた。沈殿物は、実施例６のステップ（８）のそれと同じであり、標的株のＰＣＲ産物は１９６３ｂｐのバンドのみであった。遺伝的に改変された株ＥＳ０２をスクリーニングによって得た。
〔実施例８：ライブラリプラスミド9B5の改変〕
標的および方法は、実施例６のライブラリプラスミド8B8と同じであり、耐性遺伝子カセットを増幅するプライマーは9B5-L (配列番号２７)/9B5-R (配列番号２８)であった。プライマー95A-L（配列番号２９）／95A-R（配列番号３０）を用いてプラスミドＰＣＲ検出を行い、１８８１ｂｐバンドを増幅できるプラスミドをスクリーニングし、組換えプラスミド9B5-AmTを得た。
〔実施例９：スピノサド生合成性の遺伝子クラスタの第３断片の、Saccharopolyspora erythraeaへの転移〕
組換えプラスミド9B5-AmT、実施例７で得られた遺伝的に改変された株ＥＳ０２に、接合で形質転換した。形質転換体を２度、継代培養したあと、アプラマイシン感受性コロニーをスクリーニングした。トータルＤＮＡを抽出し、プライマー95A-L（配列番号２９）／95A-R （配列番号３０）をＰＣＲ検出に用いた。標的株のＰＣＲ産物は１８８１ｂｐのバンドのみであった。遺伝的に改変された株ＥＳ０３をスクリーニングによって得た。
〔実施例１０：ライブラリプラスミド10G3の改変〕
標的および方法は、実施例６のライブラリプラスミド8B8と同じであり、耐性遺伝子カセットを増幅するプライマーは10G3-L（配列番号３１）／9B5-R（配列番号２８）であった。プライマー10G-L（配列番号３２）／10G-R（配列番号３３）を用いてプラスミドＰＣＲ検出を行い、１６７６ｂｐ標的バンドを増幅できるプラスミドをスクリーニングし、組換えプラスミド10G3-AmTを得た。
〔実施例１１：スピノサド生合成性の遺伝子クラスタの第４断片の、Saccharopolyspora erythraeaへの転移〕
組換えプラスミド10G3-AmTを、実施例９で得られた遺伝的に改変された株ＥＳ０３に、接合で形質転換した。形質転換体を２度、継代培養したあと、アプラマイシン感受性コロニーをスクリーニングした。トータルＤＮＡを抽出し、プライマー10G-L／10g-RをＰＣＲ検出に用いた。標的株のＰＣＲ産物は１６７６ｂｐのバンドのみであった。遺伝的に改変された株ＥＳ０４をスクリーニングによって得た。
〔実施例１２：Saccharopolyspora spinosaのラムノース合成性の遺伝子クラスタを含んでいる組換えプラスミドの構築〕
本実施例の目的は、上流および下流の相同性アームの間に４つのラムノース合成性の遺伝子を集め、それによって、上記４つの遺伝子を、実施例１１で得られた遺伝的に改変された株ＥＳ０４の染色体に、相同的な二重の交差によって挿入することであった。遺伝的に改変された株ＥＳ０４の染色体において、８０ｋｂスピノサド生合成性の遺伝子クラスタが、これまでの実施例において、エリスロマイシン合成遺伝子の位置に挿入され、エリスロマイシン合成性の遺伝子クラスタが同時に欠損していた。しかし、Saccharopolyspora spinosaに由来する、スピノサド生合成と無関係な２つの断片も同時に導入されており、これを「複数の操作可能領域」と呼ぶ（図１１の、ＫＣＺ１およびＫＣＺ２）。本実施例では、２つの相同性アームを、「複数の操作可能領域」うちの１つにおいて選択し、上記４つの挿入された遺伝子がスピノサド生合成性の遺伝子クラスタを損なわないようにした。したがって、本実施例は以下のいくつかのステップを含んでいる。
（１）「操作可能領域２」から上流および下流の相同性アームをクローニングし、当該アームを配列のベクターpUAmT14内に挿入する。
（２）４つのラムノース合成遺伝子をそれぞれクローニングし、当該遺伝子を配列の上記２つの相同性アームの間に挿入する。
本実施例は１つのベクターおよび５つの断片（２つの相同性アーム、ここで、３つの断片に、４つのラムノース合成遺伝子が分配されていた）に関するので、XbaI部位のみが、操作を容易にするために、二番目の相同性アームおよび３つの遺伝子断片をクローニングする間のクローニングのために選択された。以下は、次の条件に基づいて設計された解決策である。
（１）２つの相同性アームおよび４つのラムノース合成遺伝子の両方にXbaI部位はなかった。ベクターpUAmT14には２つのXbaI部位があったが（図１３）、消化の第１ステップ後に、１つのXbaI部位だけが残った。
（２）エンドヌクレアーゼXbaIはメチル化に影響される酵素であった。認識部位TCTAGAのあとにある２つの塩基がTCである場合、メチル化機能を有する宿主株から抽出されたプラスミド（例えば、DH5α）は、XbaI部位によって切断できなかった。ＰＣＲ産物はメチル化されていなかったので、ＰＣＲ産物が直接消化される場合、認識部位のあとにある塩基がどのような配列であっても、酵素消化は影響されなかった。
したがって、具体的な解決策は以下のようなものであった。
（１）下流の相同性アームをまず、ベクターpUAmT14のAseI-HindIII部位にクローニングした。二重の酵素消化により、断片の挿入方向が正しいことが保障され、XbaI部位を下流の相同性アームの上流に位置させた。
（２）メチル化に影響されたXbaI部位を、ＰＣＲ増幅で得られた上流相同性アームの５’末端に導入し、一方、メチル化に影響されていないXbaI部位を３’末端に導入した。断片がXbaIによって酵素消化され、先のステップで得られたプラスミドのXbaI部位に挿入されると、DH5αから抽出されたプラスミド中の上流相同性アームおよび下流相同性アーム間のXbaI部位だけを切断することができ、他のXbaI部位は、メチル化の影響で切断できなくなった。これにより、以下のラムノース遺伝子断片がすべて、上記２つの相同性アーム間に挿入された。
（３）３つのラムノース遺伝子断片を、同じ方法でXbaI部位に挿入した。
具体的な実施プロセスは以下の通りである。
（１）下流相同性アームの挿入：
ライブラリプラスミド15D1を鋳型として、プライマー005DF（配列番号３４、５’末端にHind III部位を導入）／006DR（配列番号３５、５’末端に Ase I部位を導入）を用いてＰＣＲ増幅を行い、下流相同性アーム断片５: D PCR（配列番号４８）を得た。断片５を回収し、ベクターpUAmT1とともにAseI+HindIIIの二重の酵素消化を行った。
反応系：２０μｌの断片５（または担体pUAmT14）、５μｌの１０×Ｔａｎｇｏバッファー溶液、２３μｌのｄｄＨ２Ｏ、１μｌのAseI （Fermentas、商品No. ER0911）、１μｌのEcoRI（Fermentas、商品No. ER0501）。
３７℃のウォーターバスに１時間にわたって入れたあと、生成物をそれぞれ直接回収し、ライゲートして、組換えプラスミドpAT-Dを得た。
（２）上流相同性アームの挿入：
ライブラリプラスミド15D1を鋳型として、プライマー007UF（配列番号３６。５’末端にメチル化に影響されたXbaI部位を導入）／008UR（配列番号３７。５’末端にメチル化に影響されていないXbaI部位を導入）を用いてＰＣＲ増幅を行い、上流相同性アーム断片６: U PCR（配列番号４９）を得た。断片６に対してXbaIで酵素消化を行い、XbaIで消化した脱リン酸化プラスミドpAT-Dにライゲートし、形質転換した。形質転換体のプラスミドを抽出し、プライマー009F（配列番号４４）／010R（配列番号４５）を用いてＰＣＲ増幅を行った。フォワードプライマー009Fは上流相同性アームに位置し、リバースプライマー010Rは下流相同性アームに位置した。上流方向性アームの挿入方向が正しい場合、ＰＣＲ産物は１７０ｂｐとなる。挿入方向が誤っている場合、ＰＣＲ産物は得られない。組換えプラスミドpAT-DUはスクリーニングによって得られた。
（３）上流相同性アームおよび下流相同性アームの間への、gtt遺伝子の挿入：
Saccharopolyspora spinosaのトータルＤＮＡを鋳型として、プライマーgttF（配列番号３８。５’末端にメチル化に影響されていないXbaI部位を導入）／gttR（配列番号３９、５’末端にメチル化に影響されたXbaI部位を導入）を用いてＰＣＲ増幅を行い、gtt遺伝子を含んでいる断片７: gtt PCR（配列番号５０）を得た。断片７に対してXbaIで酵素消化を行い、XbaIで消化した脱リン酸化プラスミドpAT-DUおよびライゲートし、組換えプラスミドpAT-DgUを得た。
（４）上流相同性アームおよび下流相同性アームの間への、epi遺伝子の挿入：
Saccharopolyspora spinosaのトータルＤＮＡを鋳型として、プライマーepiF（配列番号４０、５’末端にメチル化に影響されていないXbaI部位を導入）／epiR（配列番号４１、５’末端にメチル化に影響されたXbaI部位を導入）を用いてＰＣＲ増幅を行い、epi遺伝子を含んでいる断片８：epiＰＣＲ（配列番号５１）を得た。断片８に対してXbaIで酵素消化を行い、XbaIで消化した脱リン酸化プラスミドpAT-DgUにライゲートし、組換えプラスミドpAT-DgeUを得た。
（５）上流相同性アームおよび下流相同性アームの間への、gdhおよびkre遺伝子の挿入：
Saccharopolyspora spinosaのトータルＤＮＡを鋳型として、プライマーgdhF（配列番号４２。５’末端にメチル化に影響されていないXbaI部位を導入）／gdhR（配列番号４３。５’末端にメチル化に影響されていないXbaI部位を導入）を用いてＰＣＲ増幅を行い、gdh+kre遺伝子を含んでいる断片９：gdhＰＣＲ（配列番号２）を得た。断片９に対してXbaIで酵素消化を行い、XbaIで消化した脱リン酸化プラスミドpAT-DgeUおよびライゲートし、組換えプラスミドpAT-DgegUを得た。そのプラスミドプロファイルを図１４に示した。
４つのラムノース合成遺伝子の配列および方向はラムノースの合成に影響しないので、当該遺伝子がステップ（３）〜（５）で挿入されるのを確認しさえすればよく、挿入の方向および配列は決定する必要はなかった。配列決定検出により、プラスミドpAT-DgegUは４つのラムノース合成遺伝子を含んでいる。
〔実施例１３：Saccharopolyspora spinosaのラムノース合成性の遺伝子クラスタの、Saccharopolyspora erythraeaへの転移〕
組換えプラスミドpAT-DgegUを、実施例１１で得られた遺伝的に改変された株ES０４へ接合により形質転換した。形質転換体を２度、継代培養したあと、アプラマイシン感受性コロニーをスクリーニングした。トータルＤＮＡを抽出し、プライマー009F（配列番号４４）／010R（配列番号４５）を用いてＰＣＲ検出を行った。プライマー009Fおよび010Rはそれぞれ、上流相同性アームおよび下流相同性アームに位置していた。４つのラムノース合成遺伝子が首尾よく挿入された場合は、ＰＣＲ産物は４９３１ｂｐとなる。４つのラムノース合成遺伝子が首尾よく挿入されなかった場合は、ＰＣＲ産物は１３２２ｂｐとなる。遺伝的に改変された株ES05をスクリーニングによって得た。
Figure 0006641366
遺伝的に改変された株ES05のスピノサド合成性の遺伝子クラスタの種々のライブラリプラスミド間の接合部に対する配列決定を行った。種々の接合点の相対位置を図１６に示し、結果を表３に示した。シークエンシングの結果は想定した結果と一致した。このことが示すのは、スピノサド合成性の遺伝子クラスタが遺伝的に改変された株へすでに移動しており、配列順は、Saccharopolyspora spinosa中のスピノサド合成性の遺伝子クラスタの配列順と一致した。
遺伝的に改変された細菌ES05に挿入されたスピノサド合成性の遺伝子クラスタおよびラムノース合成性の遺伝子クラスタに対する配列決定をさらに行った。結果は、想定した配列および完全に一致した。このことが示すのは、はっきりした遺伝的背景を有する遺伝的に改変された株が得られたということである。
〔実施例１４：遺伝学的に改変された株ES05の発酵〕
ES05のコロニー塊を種培地（３．０％のスターチ、２．５％の大豆のケーク粉末、０．５％のペプトン、３．０％のキストリン、１．０％のグルコース、０．４％の塩化ナトリウム、ｐＨ７．５）で、３４℃、４８時間、２００ｒｐｍで培養し、発酵培地（３．０％の大豆ケーク粉末、４．０％のコーンスターチ、３．０％のキストリン、０．２％の硫酸アンモニウム、０．６％の硫酸カルシウム、１．０％のグルコース、０．０４％のリン酸二水素カリウム、ｐＨ６．８）に、１０％の播種量において移し、３４℃において７〜８日間、２００ｒｐｍで培養した。発酵液１ｍｌを取り、４ｍｌの無水エタノールに浸し、１時間にわたって超音波処理し、それから濾過した。濾過物に対して、以下の条件でＨＰＬＣ検出を行った。Ｃ１８カラム、水溶液の移動相は、メタノール、アセトニトリル、０．０５％の酢酸アンモニウム（１８００：１８００：４００）、流速１ｍｌ／分、検出波長２５０ｎｍ。スピノサド生成株Saccharopolyspora spinosaをポジティブコントロールにし、Saccharopolyspora erythraeaをネガティブコントロールにした。結果を図１５Ａ〜１５Ｃに示した。ポジティブコントロール（図１５Ａ）および本発明で得られた遺伝的に改変された株ES05（図１５Ｂ）の両方とも、スピノサドの構成要素ＡおよびＤを生成できたのに対し、ネガティブコントロール（図１５Ｃ）はスピノサドＡおよびＤを生成できなかった。

Claims (19)

  1. スピノサド異種発現株の構築方法であって、
    Saccharopolyspora erythraea（サッカロポリスポラ エリスレア）におけるエリスロマイシン合成性の遺伝子クラスタが、Saccharopolyspora spinosa（サッカロポリスポラ
    スピノサ）のスピノサド合成性の遺伝子クラスタおよびラムノース合成性の遺伝子クラスタによって置き換えられる、方法。
  2. Saccharopolyspora erythraea（サッカロポリスポラ エリスレア）における上記エリスロマイシン合成性の遺伝子クラスタを、Saccharopolyspora spinosa（サッカロポリスポラ スピノサ）の上記スピノサド合成性の遺伝子クラスタおよびラムノース合成性の遺伝子クラスタに置き換えるために複数の相同的組換えを利用している、請求項１に記載の方法。
  3. 以下のステップ：（１）Saccharopolyspora spinosa（サッカロポリスポラ スピノサ）の上記スピノサド合成性の遺伝子クラスタの配列ならびにその上流配列および下流配列を網羅している複数の核酸断片であって、隣接する当該核酸断片が重複している配列を保有している、複数の核酸断片を得ることと；（２）ステップ（１）において得られた上記複数の核酸断片を、Saccharopolyspora erythraea（サッカロポリスポラ エリスレア）のゲノム内に連続的に連結して、これによって、Saccharopolyspora erythraea（サッカロポリスポラ エリスレア）における上記エリスロマイシン合成性の遺伝子クラスタを、Saccharopolyspora spinosa（サッカロポリスポラ スピノサ）の、上記スピノサド合成性の遺伝子クラスタの配列ならびにその上流配列および下流配列と置き換えて組換え株を得るために、相同的組換えの機序を用いることと；（３）Saccharopolyspora spinosa（サッカロポリスポラ スピノサ）のラムノース合成性の遺伝子クラスタの、核酸断片を得ることおよびステップ（２）において得られた上記組換え株のスピノサド合成性の遺伝子クラスタの上記下流配列を、ラムノース合成性の遺伝子クラスタの上記核酸断片に置き換えて、上記スピノサド異種発現株を得るために、相同的組換えの機序を用いることとを包含している、請求項１または２に記載の方法。
  4. ステップ（１）において、上記複数の核酸断片が、少なくとも３つの核酸断片である、請求項３に記載の方法。
  5. 上記複数の核酸断片が、３、４、５、６または７つの核酸断片であり、かつ当該核酸断片のそれぞれが、２５〜４０ｋｂの大きさを有している、請求項４に記載の方法。
  6. 上記複数の核酸断片が４つの核酸断片であり、かつその配列が配列番号１７〜２０にそれぞれ示されている、請求項５に記載の方法。
  7. ステップ（１）において、Saccharopolyspora spinosa（サッカロポリスポラ スピノサ）のゲノムＤＮＡが、ゲノムライブラリを構築するために、Sau3AIを用いて消化され、上記スピノサド合成性の遺伝子クラスタの配列ならびにその上流配列およびその下流配列を網羅している上記複数の核酸断片が、ＰＣＲを介してスクリーニングされる、請求項３に記載の方法。
  8. ステップ（２）において、上記複数の核酸断片がプラスミドとしてそれぞれ構築され、かつ相同的組換えが複数の当該プラスミドおよび上記Saccharopolyspora erythraea（サッカロポリスポラ エリスレア）の間に生じ、
    上記複数の核酸断片の５’から３’への配列順に関して最後の上記核酸断片を含んでいる上記プラスミドを除く他のプラスミドのすべてが、順に接続されている５’相同性アーム、ステップ（１）において得られた複数の上記核酸断片および耐性遺伝子カセットを含んでおり、
    上記プラスミドのそれぞれの上記５’相同性アームが、Saccharopolyspora erythraea（サッカロポリスポラ エリスレア）の上記エリスロマイシン合成性の遺伝子クラスタの、上記上流配列に対して相同であり；上記最後の核酸断片を含んでいる上記プラスミドが、順に接続されている耐性遺伝子カセット、５’相同性アーム、当該最後の核酸断片および３’相同性アームを含んでおり、
    上記３’相同性アームが、Saccharopolyspora erythraea（サッカロポリスポラ エリスレア）の上記エリスロマイシン合成性の遺伝子クラスタの、上記下流配列に対して相同である、請求項３から７のいずれか１項に記載の方法。
  9. コスミドsupercos-1が、ステップ（２）における初期のプラスミドとして使用され、かつ上記耐性遺伝子カセットがaac(3)IV+oriT配列を含んでいる、請求項８に記載の方法。
  10. ステップ（２）におけるプラスミドの構築処理が、以下の通りである：
    ５’相同性アームおよび３’相同性アームとしてそれぞれ機能させるために、上記Saccharopolyspora erythraea（サッカロポリスポラ エリスレア）の、上記エリスロマイシン合成性の遺伝子クラスタの上記上流核酸断片および下流核酸断片を上記コスミドsupercos-1に挿入して、改変されたコスミドeryUD-cos2を得ること；およびそれから、上記コスミドeryUD-cos2のうち上記２つの相同性アームの間に、ステップ（１）において得られた上記複数の核酸断片を挿入すること；上記最後の核酸断片を含んでいる上記プラスミドの上記５’相同性アームの上流に耐性遺伝子カセットを導入すること；
    ならびに他の複数のプラスミドのうち上記３’相同性アームを、他の複数のプラスミドにおける耐性遺伝子カセットによって置き換えること、
    請求項８に記載の方法。
  11. 他の複数のプラスミドのうち上記３’相同性アームを、上記耐性遺伝子カセットによって、置き換えることが、相同的組換えを介している、請求項１０に記載の方法。
  12. 上記５’相同性アームの配列が配列番号４６に示され、かつ３’相同性アームの配列が配列番号４７に示される、請求項８から１１のいずれか１項に記載の方法。
  13. ステップ（２）が、以下の通りである：
    相同的組換えが、上記最後の核酸断片を含んでいる上記プラスミドおよび初期のSaccharopolyspora erythraea（サッカロポリスポラ エリスレア）の間に生じ、それから相同的組換えが、他の核酸断片を含んでいる複数の上記プラスミドおよび前の段階における相同的組換えを介して得られた上記Saccharopolyspora erythraea（サッカロポリスポラ
    エリスレア）の間に、順に生じる、請求項８から１２のいずれか１項に記載の方法。
  14. 上記初期のSaccharopolyspora erythraea（サッカロポリスポラ エリスレア）がATCC11635である、請求項１３に記載の方法。
  15. ステップ（３）において、上記ラムノース合成性の遺伝子クラスタが、相同的組換えのためのプラスミドとして構築され、相同的組換えが、上記プラスミドおよびステップ（２）において得られた上記組換え株の間に生じ、上記プラスミドが、２つの相同性アームおよび当該相同性アームの間に配置されている上記ラムノース合成性の遺伝子クラスタを含んでおり、上記２つの相同性アームの両方が、上記スピノサド合成性の遺伝子クラスタの上記下流配列に対してそれぞれ相同である、請求項３から１４のいずれか１項に記載の方法。
  16. これらの２つの相同性アームの配列が、それぞれ配列番号４９および配列番号４８である、請求項１５に記載の方法。
  17. 上記エリスロマイシン合成性の遺伝子クラスタが、Saccharopolyspora spinosa（サッカロポリスポラ スピノサ）の、上記スピノサド合成性の遺伝子クラスタおよびラムノース合成性の遺伝子クラスタによって置き換えられているSaccharopolyspora erythraea（サッカロポリスポラ エリスレア）である、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法によって得られた、スピノサド異種発現株。
  18. 請求項１７に記載のスピノサド異種発現株の、スピノサドを調製することにおける、使用。
  19. スピノサドを調製する方法であって、当該方法が、請求項１７に記載のスピノサド異種発現株を使用する、方法。
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