DE19708127A1

DE19708127A1 - Acarbose acb-Cluster: Isolierung von weiteren Genen der Acarbose Biosynthese und des Acarbose-Stoffwechsels aus Actinoplanes sp. SE 50/110 sowie deren Verwendung

Info

Publication number: DE19708127A1
Application number: DE19708127A
Authority: DE
Inventors: Anneliese Dr Crueger; Heiner Dr Apeler; Werner Dr Schroeder; Hermann Prof Dr Pape; Klaus Dr Goeke; Wolfgang Prof Dr Piepersberg; Juergen Dr Distler; Marta Diaz-Guardamino Urib Paz; Martin Jarling; Ansgar Stratmann
Original assignee: Bayer AG
Current assignee: Bayer AG
Priority date: 1997-02-28
Filing date: 1997-02-28
Publication date: 1998-09-03
Also published as: CZ9903054A3; HUP0000889A2; ZA981659B; CN1249001A; AU6296898A; EP0968294A1; IL131433A0; CA2282735A1; NO994164L; BR9807640A; NO994164D0; PL335369A1; KR20000075777A; WO1998038313A1; BG103672A

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Isolierung von weiteren Genen der Biosynthese und des Stoffwechsels von Acarbose aus Actinomyceten, vorwiegend aus Actinoplanes sp. SE 50/110 und seinen Mutanten, die mit den bereits bekannten Biosynthesegenen in einem gemeinsamen Gencluster vergesellschaftet sind, die Nut zung dieser Gene für die Herstellung von Acarbose und Acarbose-Homologen mit Actinoplanes sp. und anderen Produzenten von Acarbose-verwandten Naturstoffen (Pseudooligosaccharide), die Nutzung dieser Gene für die Verfahrensoptimierung durch Methoden des biochemisch-molekularbiologischen "Engineering" sowie die heterologe Expression dieser Gene in anderen Mikroorganismen.

Gegenstand älterer Patentanmeldungen (z. B. DE 20 64 092, DE 22 09 834) ist die Erkenntnis, daß eine Reihe von Actinomyceten, vor allem die Actinoplanaceen, oligosaccharidartige Inhibitoren von Glycosidhydrolasen vorzugsweise kohlenhydrat spaltender Enzyme des Verdauungstraktes bilden. Als potentester Inhibitor dieser Gruppe ist die Verbindung O-4,6-Dideoxy-4-[[1S-(1S, 4R, 5S, 6S)-4,5,6-trihydroxy- 3-(hydroxymethyl)-2-cyclohexen-1-yl]-amino]-α-D-glucopyranosyl-(1 → 4)-O-α-D- glucopyranosyl-(1 → 4)-D-glucopyranose als Acarbose beschrieben [DE 23 47 782].

Acarbose ist ein potenter α-Glucosidase-Inhibitor, der als orales Antidiabetikum unter dem Markennamen Glucobay® für die Therapie des Diabetes mellitus eingesetzt wird. Die Bildung des Sekundärmetaboliten Acarbose erfolgt durch Actinoplanes sp. SE 50 (CBS-Nr. 791.96) und durch eine natürliche Variante dieses Stammes, SE 50/ 110 (CBS 793.96) [DE 22 09 834], sowie durch deren Selektanten und Mutanten. In den genannten Patentanmeldungen, z. B. in den Beispielen 1 bis 4 der genannten deutschen Patentanmeldung P 22 09 834, wird die Gewinnung eines derartigen α-Glucosidase- Inhibitors beschrieben.

Mittels molekularbiologischer Methoden lassen sich bestimmte Gene direkt aus einem nicht charakterisierten Genom isolieren, wobei Gensonden - z. B. ³²P-markierte DNA-Fragmente - eingesetzt werden, die spezifisch an die gesuchte DNA-Sequenz binden.

Weiterhin ist bei Actinomyceten - vor allem Streptomyceten - bekannt, daß bei den bisher untersuchten Sekundärmetabolit-Produzenten die Biosynthesegene auf dem Chromosom, seltener auf einem Plasmid, in einem Cluster nebeneinander angeordnet sind [Hershberger, C.L., et al. (1989)]. Damit lassen sich durch die Verwendung von Gensonden benachbarte, bisher unbekannte Biosynthesegene isolieren, deren Bedeutung für die gewünschte Biosynthese dann aufgeklärt werden kann. Ebenso können mit Hilfe der Gensonden die entsprechenden Biosynthesegene in anderen Mikroorganismen nachgewiesen werden.

Aus der Struktur der Acarbose war zu vermuten, daß der Deoxyglucose-Teil des Acarbose-Moleküls entsprechend der Biosynthese von 6-Deoxyzuckerresten verschie dener Antibiotika gebildet wird (z. B. Aminoglykoside, wie Streptomycin, Kasugamy cin; Makrolide, wie Erythromycin, Tylosin; Polyene, wie Amphotericin A, B, Ny statin; Anthrazycline, wie Daunorubicin; Glykopeptide, wie Vancomycin). Daher wurde eine Gensonde von hoch-konservierten Proteinbereichen bekannter dTDP- Glucose-Dehydratase-Enzymen abgeleitet.

Die Anwendung der geschilderten Techniken führte bei Actinoplanes sp. SE 50/110 zunächst zur Isolierung und Sequenzierung eines 2,2 kb BamHI-DNA-Fragments mit der vollständigen DNA-Sequenz von acbB (codierend für dTDP-Glucose Dehydra tase) sowie den DNA-Teilsequenzen von acbA (codierend für dTDP-Glucose Syn thase) und acbC (codierend für eine Cyclase) [EP A 0 730 029/DE 195 07 214]. Als weitere Enzyme, die an der Acarbose-Biosynthese beteiligt sind, wurde die Acarviosyl Transferase aus Actinoplanes sp. SE 50/110 und -Mutanten beschrieben (codiert von acbD) [DE 196 25 269.5] sowie die Acarbose 7-Phosphotransferase (codiert von acbK) [Goeke, K., et al. (1996); Drepper, A., et al. (1996)]. Für die Acarviosyl Transferase wurde die Fähigkeit beschrieben, bei Acarviosin-haltigen Pseudooligosacchariden den jeweiligen Zuckerrest gegen andere Zucker auszutauschen. Acarbose 7-Phosphatase (Acarbose Kinase) könnte an der Herstellung einer Transportform der Acarbose aus der Zelle beteiligt sein. Außerdem wird die Acarbose 7-Phosphatase als Teil eines Selbstschutzmechanismus gesehen:
Acarbose hemmt stark die cytoplasmatische α-Glucosidase des Produktionsstammes, die durch Acarbose 7-Phosphatase phorphorylierte Verbindung dagegen nicht, so daß der zelleigene Substratmetabolismus nicht gestört wird. Solche Schutzmechanismen sind für viele Produzenten von Aminocyclitol-Antibiotika beschrieben worden.

In der vorliegenden Patentanmeldung wird das Cluster der Biosynthesegene sowie anderer Gene des Stoffwechsels der Acarbose aus Actinoplanes sp. SE 50/110 in einem Abschnitt von 18 kb beschrieben (s. Fig. 1-3). Die Isolierung weiterer Gene des Acarbose-Stoffwechsels erbrachte überraschenderweise, daß die schon bekannten Biosynthesegene, acbABC [EP A 0 730 029/DE 195 07 214], mit Genen der Acarbo semodifikation (Acarviosyltransfer, Phosphorylierung, Gene acbD, acbK), des extra zellulären bzw. des cytoplasmatischen Maltodextrin- und Glucose-Stoffwechsels (En zyme der Familien der α-Amylasen und 4-α-Glucanotransferasen bzw. Amylo maltasen) und des Bindeprotein-abhängigen Zuckertransports (Maltodextrin- oder Disaccharid-Aufnahme in das Cytoplasma) in einem gemeinsamen Gencluster ver gesellschaftet sind. Dieser Befund ist für die biotechnische Produktion der Acarbose in Hinblick auf die gezielte Optimierung des Verfahrens von erheblicher Bedeutung. Denn hiermit ist als ein neuer, die in früheren Patenten aufgezeigten Möglichkeiten erweiternder Gesichtspunkt die Verfügbarkeit wichtiger Teile des gesamten Acar bose-Stoffwechsels für die Methoden des biochemisch-molekularbiologischen "Engineerings" gegeben. So können jetzt auch das für die Synthese der Acarbose offensichtlich wichtige Bereitstellen von α-1,4-Glucan-Vorstufen über Stärke-/Malto dextrin-Abbau, die Aufnahme/Abgabe sowie der cytoplasmatische Umbau von Oligosacchariden bis zur Maltosestufe, die Vielfalt des Produktspektrums sowie die möglicherweise für die Acarbose-Ausschleusung und/oder Freisetzung außerhalb der Zelle wichtigen Modifikationen (z. B. Acarbose-Phosphorylierung) beeinflußt werden.

Ein Gegenstand der Erfindung ist damit die Isolierung von weiteren Biosynthesegenen aus Actinoplanes sp. SE 50/110 und ihre Verwendung zur Isolierung der angren zenden DNA-Bereiche zur weiteren Aufklärung des Acarbose-Genclusters.

Die Aufklärung des Acarbose-Genclusters mit Isolierung und Charakterisierung der Acarbose-Biosynthesegene ist essentiell für eine gezielte Verbesserung des Produk tionsprozesses z. B. durch

- Steigerung der Acarbose-Syntheseleistung in Actinoplanes durch Genamplifikation von "Bottleneck" -Enzymen, Verwendung effektiverer Pro motoren, Ausschaltung von Regulationsereignissen.
- Verbesserte Bereitstellung von Vorstufen vor allem aus dem Zuckerstoff wechsel mit Optimierung der Transportmechanismen, wie Substrattransport in die Zelle und Ausschleusen von Acarbose oder modifizierten Verbindungen.
- Eingrenzung des Produktspektrums in Actinoplanes auf das gewünschte Hauptprodukt Acarbose durch Ausschalten unerwünschter Biosynthesewege zu Nebenkomponenten oder durch Ausschalten unerwünschter enzymatischer Abbaureaktionen.
- Expression in heterologen Wirtsstämmen zur Produktionssteigerung durch eine verbesserte Raum- Zeit-Ausbeute, zur Vereinfachung des Aufarbeitungsverfahrens, zur gezielten Einschränkung des Produktspektrums.
- Verwendung einzelner oder mehrerer Acarbose-Biosynthesegene für die in vitro-Synthese von Acarbose oder Verbindungen dieser Stoffklasse, ausge hend von synthetisch oder mikrobiell hergestellten Vorstufen.

Die Erfindung offenbart daher:
Ein rekombinantes DNA-Molekül, das Gene für die Biosynthese von Acarbose und Acarbose-Homologen enthält, die im Gencluster gemäß Abb. 2 angeordnet sind.

Ein rekombinantes DNA-Molekül mit einem Restriktionsenzymschnittstellenmuster gemäß Abb. 1.

Die vollständige DNA-Sequenz des 18 kb Fragments mit den in Tab. 1 aufgeführten Genen gemäß Abb. 3 sowie die daraus resultierenden Aminosäure-Sequenzen.

Tab. 1: Eigenschaften der acb-Gene und der Acb-Genprodukte

Dabei codieren die Gene acbA und acbB mit hoher Wahrscheinlichkeit Enzyme der Acarbose-Biosynthese, da sie hohe Sequenzidentität von AcbA bzw. AcbB zu bekannten bakteriellen dTDP-Glucose Synthasen bzw. dTDP-Glucose 4,6- Dehydratasen aufweisen. Die Ähnlichkeit der Proteinsequenzen zum jeweils nächsten bekannten Vertreter der beiden Enzymfamilien (vgl. Fig. 3) liegt weit über derjenigen anderer beliebiger Paare funktionsidentischer Proteine aus beiden Gruppen. Erstaun lich dabei ist, daß AcbA seine nächsten Verwandten unter Streptomyceten-Proteinen hat, während AcbB näher verwandt ist mit verschiedenen RfbB-Proteinen Gram negativer Bakterien. Dieses Phänomen wird aber auch von anderen entsprechenden Streptomyceten-Proteinen, z. B. TylA1 und TylA2 aus dem Tylosin-Produzenten Streptomyces fradiae [Merson-Davies u. Cundliffe (1994)], gezeigt, die ebenfalls von benachbarten Genen in einem gemeinsamen Gencluster codiert werden.

Das Gen acbC codiert ein wahrscheinliches Enzym der Acarbose-Biosynthese, da das Enzym AcbC mit AroB-Proteinen, Dehydrochinasäure-Synthasen, verwandt ist und nach Überexpression in Streptomyces lividans eine Enzymaktivität zeigt, die - wie zu erwarten - Heptulosephosphate (z. B. Sedoheptulase-7-phosphat) zu Produkten um setzt, die ähnliche Eigenschaften wie Valienon und Valiolon aufweisen (mögliche Vorstufen der Acarbose-Biosynthese), jedoch nicht identisch mit diesen Verbindungen sind.

Die Gene acbK (Acarbose-7-Kinase), acbL (Ketozucker oder Zuckeralkohol Oxido reductase) und acbM (unbekannte Funktion) sowie das möglicherweise vorhandenen acbN-Gen (direkte Verbindung mit den Leserahmen acbL und acbC ist durch überlappende Start-/Stopcodons angedeutet) codieren wahrscheinlich Enzyme der Acarbose-Biosynthese, da sie alle zusammen mit acbC und evtl. auch acbQ ein wahrscheinliches Operon (Transkriptionseinheit) bilden und translationell gekoppelt abgelesen werden. Auch die Funktion einer spezifischen, cytoplasmatisch lokalisierten Acarbose-Kinase (AcbK) und einer möglichen Dehydrogenase (AcbL) sprechen für eine direkte Beteiligung am innerzellulären Acarbose-Stoffwechsel; die Zucker-Dehy drogenase AcbL könnte dabei an der Vorstufensynthese des C-7 Cyclitols oder der 6- Desoxyhexose, bzw. deren Kondensation beteiligt sein.

Die beiden Gene acbD (Acarviosyl Transferase) [DE 196 25 269.5; Goeke, K., et al. (1996); Drepper, A., et al. (1996)] und acbE (α-Amylase), die einander gegenüber mit einer gemeinsamen Promotor-Region im Cluster von Actinoplanes sp SE 50/110 liegen, und die beide für Enzyme der Amylase-Familie codieren, deuten darauf hin, daß eine enge Verflechtung der Regulation des Stärkeabbaus und der Produktion der Acarbose besteht. Dies wird durch den Befund bestätigt, daß beide Enzyme in Actinoplanes sp. unter der Wachstums-Kontrolle des Stärke-Katabolismus die am stärksten exprimierten extrazellulären Proteine im Kulturüberstand von Actinoplanes sp. sind. Dies gilt für die acbE-Expression vom eigenen Promotor sogar auch in Streptomyces lividans (s. Beispiele).

Die Gene acbHFG codieren ein wahrscheinlich extrazelluläres Zucker-Bindeprotein, AcbH, und zwei typische Membrankomponenten, AcbF und AcbG, eines bakteriellen Zuckertransporters vom Typ ABC-Importer. Sie sind wahrscheinlich am Stoffwechsel der Acarbose durch Aufnahme von Oligo-Maltodextrinen beteiligt oder rezyklieren Acarbose als Transportvehikel kurzer Oligo-α-1,4-Glucane (höhere Homologe der Acarbose) durch Aufnahme in die Zelle. An einem solchen Vorgang könnte auch das Amylomaltase-ähnliche Genprodukt (AcbQ) des acbQ-Gens beteiligt sein.

Weiterhin offenbart die Erfindung:
Ein Verfahren zur Isolierung von Acarbose-Biosynthesegenen aus Actinomyceten, vor allem aus Actinoplanes, dadurch gekennzeichnet, daß Gensonden verwendet werden, die sich von einem 2,2 kb BamHI-Fragment ableiten. Das 2,2 kb BamHI-Fragment, das mittels einer Gensonde von hochkonservierten Proteinbereichen bekannter dTDP- Glucose-Dehydratase-Enzyme abgeleitet wurde, ist in der Patentanmeldung [EP A 0 730 029/DE 195 07 214] beschrieben.

Ein Verfahren zur Isolierung von Biosynthesegenen von Acarbose-verwandten Naturstoffen in Actinomyceten (z. B. für Validamycin, Oligostatine (Trestatin), Adiposine).

Verfahren zur Steigerung der Acarbose-Syntheseleistung in Actinoplanes durch

- erhöhte Gendosis für geschwindigkeitsbestimmende Biosyntheseenzyme,
- effektivere Promotoren für geschwindigkeitsbestimmende Biosynthese enzyme,
- Ausschaltung von unerwünschten Regulationsschritten.

Ein Verfahren zur Steigerung der Acarbose-Syntheseleistung in Actinoplanes durch Protein Engineering bei den die Acarbose-Synthese limitierenden Biosyntheseschritten oder zur Vermeidung von Abbauprodukten, die durch unerwünschte Rückreaktionen von Biosyntheseenzymen entstehen.

Ein Verfahren zur Eingrenzung des Produktspektrums in Actinoplanes auf das ge wünschte Hauptprodukt durch Ausschalten unerwünschter Biosynthesewege zu Nebenkomponenten oder durch Ausschalten unerwünschter enzymatischer Abbau reaktionen, wie z. B. durch eine Inaktivierung des acbD-Gens.

Ein Verfahren zur Veränderung von Transport-Mechanismen im Hinblick auf einen verbesserten Transport von Substraten in die Zelle oder ein effektiveres Ausschleusen von Acarbose aus der Zelle.

Ein Verfahren zur Expression in heterologen Wirtsstämmen (z. B. Pseudo oligosaccharid-bildenden Streptomyceten sowie in anderen Streptomyceten wie Streptomyces lividans, in schnell wachsenden Bakterien wie E. coli oder in Hefen und Pilzen),

- zur Erzielung einer Produktionssteigerung durch eine verbesserte Raum-Zeit-Ausbeute,
- zur Vereinfachung des Aufarbeitungsverfahrens,
- zur gezielten Einschränkung des Produktspektrums.

Ein Verfahren zur Verwendung der Acarbose-Biosynthesegene für die in vitro- Synthese von Acarbose oder Verbindungen dieser Stoffklasse, ausgehend von synthetisch oder mikrobiell hergestellten Vorstufen.

Die Erfindung wird im folgenden detailliert beschrieben. Ferner wird die Erfindung durch den Inhalt der Ansprüche bestimmt.

Alle gentechnologischen Methoden wurden, wenn nicht anders angegeben, wie in Sambrook et al. (1989) durchgeführt.

Für das Screening wurden drei verschiedene Gensonden verwendet. Sie wurden aus den Plasmiden pAS2, pAS5/7.3 und pAS6/3 isoliert. Das Plasmid pAS2 wurde aus E.coli DH5α mit Hilfe der "Boiling-Method" oder durch alkalische Lyse präpariert und mittels der Restriktionsendonuklease BamHI hydrolysiert. Das resultierende 2,2 kb BamHI Fragment wurde isoliert und durch sogenannte "Nick-translation" mit ³²P- markierten Desoxynukleotiden markiert. Dieses radioaktiv markierte Fragment wurde als Gensonde für die Isolierung von Acarbose-Biosynthese-Genen eingesetzt und wird im folgenden als acb-Sonde-II bezeichnet. Die zweite Gensonde wurde aus dem Plasmid pAS5/7.3 isoliert. Das SphI-SstI Fragment wurde isoliert und wie oben beschrieben radioaktiv markiert. Im folgenden wird diese Gensonde als acb-Sonde-III bezeichnet. Die dritte Gensonde wurde aus dem Plasmid pAS6/3 isoliert. Das BamHI Fragment wurde isoliert und wie oben beschrieben radioaktiv markiert. Diese Sonde bekam die Bezeichnung acb-Sonde-IV.

Acarbosebiosynthese-Gene wurden auf zwei Arten wie folgt isoliert.

1) Chromosomale DNA von Actinoplanes sp. wurde mit den Restrikrions enzymen Ssfl, Bgl/I und Pstl hydrolysiert, Gel-chromatographisch getrennt und durch "Southern"-Hybridisierung mit der acb-Sonde-II (SstI und Bgl/I- Hydrolyse) bzw. acb-Sonde-III (PstI-Hydrolyse) nach einer homologen DNA- Sequenz untersucht. Das mit der Gensonde hybridisierende SstI-Fragment hat eine Größe von 10,5 kb und das Bg/ll-Fragment von 10 kb. Das 10,5 kb Sstl- Fragment und das 10 kp Bg/II-Fragment wurden aus dem Gel eluiert, in den Vektor pUC18 bzw. pBluescript II ligiert und in E.coli DH5α kloniert. Die resultierenden Plasmide bekamen die Bezeichnung pAS5 (Sstl-Fragment) und pAS6 (Bgl/I-Fragment). Ein mit dem Sstl-Fragment überlappendes 2,8 kb PstI- Fragment, das mit der Gensonde acb-Sonde-III hybridisierte, wurde in den Vektor pUC18 kloniert und mit pMJ1 bezeichnet.
2) Eine GEM12-Phagen-Genbank genomischer DNA von Actinoplanes sp. wurde mit den Sonden acb-Sonde-III und acb-Sonde-IV mittels Plaquehybri disierung gescreent. Insgesamt wurden mit der acb-Sonde III 15 Phagen isoliert, mit der acb-Sonde IV zwei Phagen, die insgesamt ca. 38.5 kb koli neare Actinoplanes sp. DNA mit Acarbose Biosynthese-Genen enthalten. Die Phagen, die näher charakterisiert wurden, tragen die Bezeichnung 10/ 3 und 5/4. Aus dem Phagen 10/3 wurde das Plasmid pMJ1 durch eine Hydrolyse mit dem Restriktionsenzym PstI und Klonierung eines 2,8 kb PstI-DNA- Fragments in das Plasmid pUC18 gewonnen. Aus dem Phagen 5/4 wurde durch Hydrolyse mit den Restriktionsenzymen BamHI und Bg/II und folgender Klonierung in pUC18 (BamHI hydrolysiert) das Plasmid pMJ9 (0.9 kb Fragment) erhalten.

Für die Bestimmung der DNA-Sequenz des 10,7 kb SstI-Fragments (pAS5) von Actinoplanes sp. wurden folgende rekombinante Plasmide, ausgehend von dem Vektor pUC18, konstruiert und die Sequenz der inserierten DNA analysiert:
pAS5 10,5 kb SstI Fragment aus chromosomaler DNA von Actinoplanes
pAS2 2,2 kb BamHI Fragment aus chromosomaler DNA von Actinoplanes (siehe Patentanmeldung DE 195 07 214)
pAS5/15 3,8 kb HindIII/SstI Fragment aus pAS5 (siehe Patentanmeldung DE 196 25 269.5)
pAS5/15.1 =2,6 kb HindIII/PstI Fragment aus pAS5
pAS5/15.2 =0,75 kb SalI Fragment aus pAS5/15.1
pAS5/15.3 =0,5 kb SalIl Fragment aus pAS5/15.1
pAS5/15.4 =0,4 kb SalIl Fragment aus pAS5/15.1
pAS5/15.5 =0,35 kb SalI Fragment aus pAS5/15. 1
pAS5/15.6 =1.25 kb PvuII Fragment aus pAS5/15.1
pAS5/15.7 =0,7 kb PvuII/HindIII Fragment aus pAS5/1 5.1
pAS5/15.9 =0,1 kb PvuII Fragment aus pAS5/15. 1
pAS5/15.11 =1,1 kb KpnI/NcoI Fragment aus pAS5/15
pAS5/15.12 =0,9 kb KpnI/NcoI Fragment aus pAS5/15
Mit der PCR-Methode wurden drei DNA-Bereiche amplifiziert und die entsprechenden Fragmente kloniert und sequenziert:

pAS5/17 =0,46 kb PCR Fragment
pAS5/18 =0,26 kb PCR Fragment
pAS5/19 =0,27 kb PCR Fragment
pAS5/6 5,4 kb PstI Fraqment aus dem Plasmid pAS5 Klone, die durch die Enzyme Exonuclease III und Nuklease S1 ausgehend von dem Plasmid pAS5/6 nach Hydrolyse mit Xhol und SstI erstellt wurden:

pAS5/6.3-15 = 5,1 kb Insert-DNA
pAS5/6.12-4 = 4,7 kb Insert-DNA
pAS5/6.3- 18 = 4,3 kb Insert-DNA
pAS5/6.6-3 = 4,2 kb Insert-DNA
pAS5/6.9-2 = 3,8 kb Insert-DNA
pAS5/6.9-6 = 3,8 kb Insert-DNA
pAS5/6.12-6 = 3,2 kb Insert-DNA
pAS5/6.3-6 = 3,0 kb Insert-DNA
pAS15/6.15-1 = 2,8 kb Insert-DNA
pAS5/6.3-16 = 2,3 kb Insert-DNA
pAS5/6.9-1 = 1,8 kb Insert-DNA
pAS5/6.9-3 = 1,2 kb Insert-DNA
pAS5/6.6-1 = 0,9 kb Insert-DNA
pAS5/6.12-3 = 0,47 kb Insert-DNA
pAS5/6. 12-2 = 0,17 kb Insert-DNA

pAS5/3 1,4 kb BamHI Fragment aus dem Plasmid pAS5
pAS5/3. 1 = 0.35 kb SphI/FspI Fragment aus pAS5/3
pAS5/3.2 = 0.85 kb SphI/BamHI Fragment aus pAS5/3
pAS5/3.3 = 0.55 kb SphI/BamHI Fragment aus pAS5/3

pAS5/4 1,2 kb BamHI Fragment aus dem Phagen Pacb2
pAS5/5 0,48 kb SstI/BamHI Fragment aus dem Plasmid pAS5
pAS5/7 1,2 kb PstI/SstI Fragment aus dem Plasmid pAS5
pAS5/7.1 0,64 kb PvuII/AccI Fragment aus dem Plasmid
pAS5/7
pAS5/7.2 0,54 kb PstI/SphI Fragment aus dem Plasmid
pAS5/7
pAS5/7.3 0,67 kb SphI/SstI Fragment aus dem Plasmid
pAS5/7

pAS5/11 0,68 kb Bg/I/HindIII Fragment aus dem Plasmid pAS5
pAS5/12 0,63 kb Bg/II/PstI Fragment aus dem Plasmid pAS5
pAS5/13 4,8 kb BamHI/SstI Fragment aus dem Plasmid pAS5
pAS5/15 3,8 kb HindIII/SstI Fragment aus dem Plasmid pAS5
pAS5/16 0,5 kb Bam/HI Fragment aus dem Plasmid pAS5
Für die Bestimmung der DNA-Sequenz konstruierte Plasmide, die DNA-Fragmente mit Acarbose-Biosynthese-Genen von Actinoplanes sp. aus dem Plasmid pAS6 enthalten. Die im Plasmid pAS6 klonierte DNA hat ein 6,2 kb Acarbosebiosynthese- Gene enthaltenes Bg/II/SstI-Fragment mit dem Plasmid pAS5 gemeinsam. Für die Sequenzierung des 5,9 kb Bg/II/SstI-Fragments, welches sich an das Plasmid pAS5 anschließt (Fig. 1), wurden folgende Subklone konstruiert.

pMJ 6/6 5,9 kb Bg/II/SstI Fragment aus dem Plasmid pAS6
pMJ 6/4.2 0,5 kb BamHI/PstI Fragment aus dem Plasmid pMJ 6/6
pMJ 6/4.1 0,36 kb BamHI/PstI Fragment aus dem Plasmid pMJ 6/ 6
pMJ6/6.2.2 05 kb SaII Religand
pMJ 6/6.2.3 2,5 kb SaII Fragment
pMJ 6/6.2.4 1,2 kb SaII Fragment
pMJ 6/6.2.5 1,0 kb SaII Fragment
pMJ 6/6.2.6 0,5 kb SaII Fragment
pMJ 6/6.2.7 0,14 kb SaII Fragment
pMJ 6/6.2.8 0,13 kb SaII Fragment
pMJ6/8. 1 0,9 kb ClaI/BamHI Fragment
pMJ6/10 1,5 kb PstI/SaII Fragment

pAS6/3 2,8 kb BamHI Fragment aus dem Plasmid pAS6
pAS 6/3.1 1,1 kb HincII Fragment aus dem Plasmid pAS 6/3
pAS6/3.2 1,2 kb SaII Fragment aus dem Plasmid pAS 6/3
pAS6/3.3 1,45 kb PstI Fragment aus dem Plasmid pAS 6/3

Für die Bestimmung der DNA-Sequenz des 2,8 kb PstI-Fragment (pMJ1) von Actinoplanes sp. wurden folgende Plasmide konstruiert und die Sequenz der Insert- DNA analysiert.

pMJ 1/1 0,6 kb SphI/PstI Fragment aus dem Plasmid pMJ1, Religand nach SphI Hydrolyse
pMJ1/2 1,2 kb SaII/PstI Fragment aus dem Plasmid pMJ1, Religand nach SaIGI Hydrolyse
pMJ1/3 1,4 kb SstI/PstI Fragment aus dem Plasmid pMJ1, Religand nach SstI Hydrolyse
pMJ1/4.1 0,9 kb SalI/Smal Subklon aus dem Plasmid pMJ1

Für die DNA-Sequenzierung wurde die Methode von Sanger et al. (1977) oder ein davon abgeleitetes Verfahren angewandt. Es wurde mit dem Autoread Sequencing Kit (Pharmacia, Freiburg, Deutschland) in Verbindung mit dem Automated Laser Fluoreszens (ALF) DNA-Sequenzierungsgerät (Pharmacia, Freiburg, Deutschland) gearbeitet. Geeignete Fluoreszein-markierte pUC reverse sequencing und sequencing Primer wurden käuflich erworben (Pharmacia, Freiburg, Deutschland). Die Sequenz des ca. 18,0 kb Bg/II - PstI Fragmentes ist in Abb. 3 dargestellt. Tab. 1 gibt eine Übersicht über die Eigenschaften der acb-Gene und der von ihnen codierten Produkte.

Tab. 2. Sequenzen der Primer für die PCR und die Sequenzreaktion. Primer für die PCR:

Primer für die Amplifizierung des acbC-Gens:

Primer für die Sequenzreaktion:

Die N-terminale Sequenzanalyse des AcbE-Proteins wurde mit dem Gasphasenproteinsequenzer 473A der Firma Applied Biosystems (Forster City, CA., USA) durchgeführt. Das Standard-Proteinsequenzierungsprogramm Fastblott wurde verwendet. Der Proteinsequenzer, die verschiedenen Programme, die Abbauzyklen sowie das PTH-Identifikationssystem sind im Handbuch des Sequenzers beschrieben (User's manual protein sequenzing system model 473A (1989); Applied Biosystems Forster City, CA 94404, USA).

Der Nachweis der PTH-Aminosäuren wurde on-line mit einer RP-18-Säule (220 mm×2 mm, 5µ-material) von Applied Biosystems durchgeführt. Die PTH-Aminosäuren wurden mittels eines 50 pMol Standard identifiziert und quantifiziert. Die Daten wurden mit dem Sequenzerdatensystem 610A von Applied Biosystems verarbeitet.

Alle eingesetzten Chemikalien für den Proteinsequenzer waren von Applied Biosystems.

Beispiele 1. Anzucht der E. coli Stämme, Präparation der Plasmid-DNA und Isolierung von DNA-Fragmenten

E.coli DH5α wurde in LB-Medium bei 37°C bebrütet. Plasmidtragende Bakterien wurden unter Selektionsdruck (Ampicillin, 100 µg/ml) gehalten. Die Kultivierung erfolgte auf einem Rundschüttler bei 270 rpm. Als Übernachtkultur (ÜK) wurden Ansätze bezeichnet, die wenigstens 16 h bebrütet wurden.

Für die Präparation von Plasmid-DNA wurden die Zellen aus 1,5 ml einer unter Selektionsdruck bebrüteten ÜK eingesetzt. Die Isolierung der Plasmide erfolgte nach der Methode der alkalischen SDS-Lyse [Birnboim, H.C., u. J. Doly (1979)].

Zur gezielten Hydrolyse von Vektor-DNA wurden ausschließlich Restriktions endonukleasen nach Vorschrift des Herstellers (Gibco BRL, Eggenstein, Deutschland) eingesetzt. Zur Restriktion von 10 µg Plasmid-DNA wurden 5 U der jeweiligen Restriktionsendonuklease eingesetzt und 2 h bei 37°C inkubiert. Um eine vollständige Hydrolyse zu gewährleisten, wurde die gleiche Menge Restriktionsendonuklease ein zweites Mal zugegeben und erneut mindestens 1 h inkubiert.

Die gespaltene DNA wurde, je nach Größe der DNA-Fragmente, auf 0,5-1,2%igen horizontalen Agarosegelen elektrophoretisch getrennt. Zur Elution wurde das Gelstück, welches das DNA-Fragment enthielt, mit einem sterilen Skalpell ausge schnitten und gewogen. Die Elution der DNA-Fragmente aus der Agarose erfolgte nach Vorschrift mit dem JETsorb-Kit (Genomed, Bad Oeynhausen, Deutschland).

2. Anzucht von Actinoplanes sp. SE50/110, Präparation, Spaltung der chromosomalen DNA und gelelektrophoretische Trennung

Actinoplanes sp. SE50/110 wurde bei 30°C in TSB-Medium auf einem Rundschüttler für 3 d bebrütet. Die Vorkultur (5 ml) erfolgte bei 240 rpm in Kulturröhrchen, die Hauptkultur (50 ml) in 500 ml Schikanekolben bei 100 rpm. Die Zellen wurden nach der Kultivierung durch Zentrifugation sedimentiert und zweimal in TE-Puffer gewaschen.

Die Präparation der Gesamt-DNA erfolgte mit 1,5-2 mg Zellen (Frischgewicht) nach der Methode der Phenol/Chloroform-Extraktion [Hopwood, D.A., et. al. (1985)].

Die Hydrolyse von 20 µg chromosomaler DNA wurde mit 10 U des entsprechenden Restriktionsenzyms (Gibco BRL, Eggenstein, Deutschland) für 2 h bei 37°C in dem zugehörigen Puffer durchgeführt. Um eine vollständige Hydrolyse zu gewährleisten, wurde die gleiche Menge Restriktionsendonuklease ein zweites Mal zugegeben und erneut für mindestens 1 h inkubiert.

Die gespaltene DNA wurde auf 0,6%igen horizontalen Agarosegelen elektropho retisch getrennt.

Die Elution von DNA-Fragmenten erfolgte wiederum mit dem JETsorb-Kit (s. Beispiel 1).

3. Herstellung der acb-Gensonde-II, acb-Gensonde-III und acb-Gensonde-IV

Die nach Beispiel 1 präparierten Fragmente aus pAS2 (s. DE 195 07 214), pAS5/7.3 und pAS6/3 wurden mit dem "Nick Translation System" des Herstellers Gibco BRL, Eggenstein, Deutschland nach dessen Angaben radioaktiv markiert. Hierbei wurden 0,5-1,0 ug DNA-Fragment eingesetzt. Es wurde [α ³²P]dCTP verwendet (3000 Ci/mM; Amersham Buchler, Braunschweig). Anschließend wurde der Ansatz 10 Minuten gekocht (Denaturierung) und sofort zu der Hybridisierungslösung gegeben (s. Beispiel 4).

4. DNA-Transfer auf Membranen, DNA-Hybridisierung (Southern- Hybridisierung und Autoradiographie)

Die Übertragung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen auf Membranen erfolgte nach der Methode des "Southern-Transfer" [Southern, E.M. ( 1975)]. Die nach Beispiel 2 erhaltenen Agarosegele wurden 20 Minuten in 0,25 M HCI geschwenkt. Die Gele wurden auf 3 Lagen saugfähiges Whatman-Papier 3MM (Whatmann, Maidstone, GB) gelegt und eine Hybond^TM-N+Membran (Amersham Buchler, Braunschweig) luftblasenfrei aufgelegt. Darauf wurden mehrere Schichten saugfähiges Papier gelegt. Auf den Filterstapel wurde ein ca. 1 kg schweres Gewicht gestellt. Der DNA-Transfer erfolgte durch Durchsaugen von 0,4 M NaOH. Nach mindestens 12 h Transferzeit wurden die Nylonfilter mit 2xSSC für 5 Minuten gespült und an der Luft getrocknet.

Die Nylon-Filter wurden dann mindestens 2 h bei 68°C in 50-100 ml Prähybridisierungslösung im Wasserbad geschüttelt. Dabei wurde die Lösung mindestens zweimal gewechselt. Die Hybridisierung fand im Hybridisierschrank für mindestens 12 h statt. Es wurden 15 ml Hybridisierungslösung, welche die acbSonde II enthielt (s. Beispiel 3), eingesetzt.

Die Nylon-Filter wurden anschließend für jeweils 15 Minuten mit 6x Postwash und 1x Postwash gewaschen. Die Nylon-Filter wurden dann im noch feuchten Zustand mit Frischhaltefolie abgedeckt. Die Autoradiographie erfolgte mit Hyperfilm-MP (Amersham Buchler, Braunschweig) in einer lichtdichten Kassette mit Verstärkerfolien bei -80°C für mindestens 16 h.

5. Isolierung und Klonierung der Bg/II-, PstI- und SstI-Fragmente aus der Gesamt-DNA von Acfinoplanes sp.

Chromosomale DNA aus Actinoplanes sp. wurde mit Bg/II, PstI und SstI vollständig hydrolysiert, durch Agarose-Gelelektrophorese getrennt und die SstI-Fragmente der Länge 9,0-12 kb, Bg/II-Fragmente der Länge 11-13 kb und PstI Fragmente der Länge 2,5-3,5 kb aus der Agarose eluiert (s. Beispiel 1). Die eluierten SstI-Fragmente und PstI-Fragmente wurden mit Vektorplasmid pUC18, präpariert aus E.coli DH5α, hydrolysiert mit SstI bzw. PstI ligiert. Die Vektorplasmide wurden zuvor mit alkalischer Phosphatase (Boehringer, Mannheim) nach Vorschrift des Herstellers behandelt. Die Ligation fand in einem Volumen von 20 µl statt, wobei das Verhältnis von Fragment zu Vektor 3 : 1 betrug mit 0,01-0,1 µg DNA im Ansatz. Es wurde 1 U der T4-DNA-Ligase mit dem entsprechendem Puffer (Gibco BRL, Eggenstein, Deutschland) eingesetzt. Die eluierten Bg/II-Fragmente wurden in das BamHI- hydrolisierte Vektorplasmid pBluescript II ligiert. Die Ligation wurde wie bei den SstI- und PstI-Fragmenten durchgeführt.

Transformationskompetente Zellen von E.coli DH5α wurden mit vollständigen Ligationsansätzen transformiert [nach: Hanahan, D. (1983)]. Ampicillin-resistente Transformanden wurden auf LB-Amp Selektivplatten (100 µg/ml) übertragen.

6. Identifizierung von Klonen, welche das 10,7 kb SstI-Fragment, 12 kb Bg/II- Fragment, 2,8 kb PstI-Fragment und das 0,9 kb Bg/II/BamHI Fragment aus dem Acarbose-Biosynthesecluster enthalten

Ampicillin-resistente Transformanden wurden auf das Vorhandensein des 10,7 kb Sstl- Fragments und 12 kb Bg/II-Fragments, das mit der acb-Sonde-II hybridisiert, untersucht. Jeweils zehn dieser Klone wurden auf einer Selektivplatte ausgestrichen, über Nacht bebrütet und mit 3 ml LB-Medium von der Platte gewaschen. Es wurde dann aus 20 solcher Zehner-Pools die Plasmid-DNA isoliert [nach: Birnboim, H.C., u. J. Doly (1979 )]. Um die klonierten SstI-Fragmente aus dem Polylinker zu entfernen, wurden die 20 verschiedenen Plasmidpräparationen mit den Restriktionsendo nukleasen EcoRI und HindIII, bzw. SstI und HindIII hydrolysiert. Die Restriktions ansätze wurden dann auf einem 0,6% Agarosegel elektrophoretisch getrennt und die DNA mittels Southern-Transfer aus dem Agarosegel auf einen Nylon-Filter übertagen (s. Beispiel 4). Die Hybridisierung erfolgte wiederum mit der acb-Sonde-II (s. Beispiel 4). Je einer der Pools reagierte positiv mit der acb-Sonde-II und wurde in die zehn Einzelklone geteilt. Deren Plasmide wurden ebenfalls isoliert und der oben beschrie benen Prozedur unterworfen. Die hybridisierenden Plasmide wurden mit pAS5 bzw. pAS6 bezeichnet. Sie enthalten ein 10,7 kb SstI-Fragment (pAS5) bzw. ein 12 kb Bg/II-Fragment (pAS6).

Der rekombinierte Phage 10/3 wurde mit PstI hydrolysiert, die DNA auf einem horizontalen Agarosegel und das 2,8 kb PstI Fragment aus der Matrix eluiert (s. Beispiel 1) und in den Vektor pUC18 ligiert. Das rekombinante Plasmid bekam die Bezeichnung pMJ1 und wurde in E. coli DH5α transformiert.

Der rekombinante Phage 5/4 wurde mit BamHI/Bg/II hydrolysiert, die DNA auf einem horizontalen Agarosegel getrennt und das 0,9 kb BamFII/Bg/II Fragment aus der Matrix eluiert (siehe Beispiel 1) und in den Vektor pUC18 ligiert. Das rekom binante Plasmid bekam die Bezeichnung pMJ9 und wurde in E. coli DH5α transfor miert.

7. Herstellung der GEMI2-Genbank und Isolierung von rekombinanten Phagen, die Acarbose-Biosynthese-Gene enthalten und Präparation der Pagen-DNA

Chromosomale DNA aus Actinoplanes sp. wurde mit Sau3AI partiell hydrolysiert. Hierfür wurde 50 µg chromosomale Actinoplanes-DNA mit 0,015 U Sau3AI für 30 min bei 37°C inkubiert. Die Enzymreaktion wurde durch Extraktion mit Phenol, Chloroform und Ethanolpräzipitation [nach: Sambrook et al. (1989)] gestoppt. Die weitere Behandlung der DNA-Fragmente und die Ligation mit Phagenvektor GEM12 erfolgte nach Angabe des Herstellers (Promega, Heidelberg). Die in vitro Verpackung des Ligationansatzes wurden mit dem "DNA packaging kit" von Boehringer (Mannheim) durchgeführt. Die Phagen wurden in E. coli LE392, nach der bei Sambrook et al. (1989) beschriebenen Methode vermehrt. Die Phagen mit Acarbose biosynthese-Genen wurden durch Plaquehybridisierung (nach Sambrook et al. 1989) mit den Gensonden-acbIII und -acbIV identifiziert. Die Phagen-DNA, die Acarbose biosynthese-Gene enthielt, wurde aus Phagen, die auf E. coli LE392 vermehrt wur den, nach Sambrook et al. (1989) präpariert.

8. Polymerase-Ketten-Reaktion

Die PCR dient der in vitro Vermehrung ausgesuchter DNA Bereiche [Mullis, K.B., u. F.A. Falloona (1987)]. Es wurde für alle Reaktionen die Taq-DNA-Polymerase nach Angaben des Herstellers (Gibco BRL, Eggenstein) in 25 Reaktionszyklen eingesetzt. Die Ansätze enthielten zur Unterdrückung möglicher Sekundärstrukturen bei GC- reicher DNA 5% Formamid. Das Volumen betrug 100 µl wobei 50 pmol je Primer und 200 µM dNTP's eingesetzt wurden. Nach einer einleitenden fünfminütigen Denaturierung der DNA bei 95°C wurden 2,5 U der temperaturstabilen DNA- Polymerase in einem "hot-start" den Ansätzen zugefügt. Die Primerverlängerung erfolgte bei 72°C und die Denaturierung der DNA am Anfang jedes Zyklus erfolgte bei 95°C für 1 Min. Die Reaktionen wurden in einem Biometra Thermocycler (Göttingen) durchgeführt.

Tab. 3: Protokolle für die PCR, um DNA-Fragmente aus dem Acarbose-Cluster zu amplifizieren

Die Bezeichnung der rekombinanten Plasmide, die die entsprechenden Fragmente enthalten, sind aufgeführt

9. Subklonierung des Plasmids pAS5

Ausgehend von dem Plasmid pAS5 wurden mehrere Subklone erstellt, um die Sequenz der Doppelstrang-DNA aufzuklären.

pAS5/6 Das Plasmid pAS5 wurde mit den Restriktionsenzymen PstI hydrolysiert, Gel elektrophoretisch (0,7%igen Agarosegel) aufgetrennt, das 5,4 kb Pstl-Fragment aus dem Gel eluiert und in pUC 18 (hydrolysiert mit PstI) in E. coli DH5α kloniert.

pAS5/3: pAS5/4: pAS5/13; pAS5/16. Das Plasmid pAS5 wurde mit dem Restriktionsenzym BamHI hydrolysiert und Gel-elektrophoretisch aufgetrennt. Die Fragmente hatten die folgende Größe:
1,4 kb BamHI Fragment
1,2 kb BamHI Fragment
2,3 kb BamHI Fragment
0,5 kb BamHI Fragment
0,45 kb BamHI Fragment
7,5 kb BamHI Fragment (=4,8 kb BamHI /SstI Fragment aus Actinoplanes DNA ligiert mit pUC18)

Die für die Subklonierung vorgesehenen Fragmente mit der Größe von 1,4 kb und 0,5 kb wurden aus dem Gel eluiert (s. Beispiel 1). Für die Klonierung wurde der Vektor pUC18 mittels des Restriktionsenzyms BamHI wie unter Beispiel 1 beschrieben präpariert. Die Ligationen wurden wie unter Beispiel 5 beschrieben durchgeführt. Das 0,5 kb Fragment wurde in den präparierten pUC 18 ligiert, und es entstand der Subklon pAS5/16. Der Subklon pAS5/3 entstand nach der Ligation des 1,4 kb Fragments mit dem präparierten pUC18. Der Subklon pAS5/4 entstand nach der Ligation des 1,2 kb Fragments mit dem Vektor pUC18. Der Subklon pAS5/13 entstand durch Religation des 7,5 kb BamHI Fragments.

nAS5/5: pAS5/7: pAS5/11: pAS5/12. Das Plasmid pAS5 wurde mit den Restriktionsenzymen BamHI u. SstI, PstI u. SstI, Bg/II u. Pstl sowie Bg/II u. HindIII hydrolysiert. Die Restriktionsansätze wurden in einem 1,2%igen Agarosegel getrennt. Die entsprechenden Fragmente wurden aus dem Agarosegel eluiert und in pUCl8 (hydrolysiert mit BamHI u. SstI, PstI u. SstI, BamHI u. PstI oder BamHI u. HindIII) in E.coli DH5α kloniert. Der Subklon pAS5/5 enthält das 0,48 kb Sstl/BamHI Fragment, der Subklon pAS5/12 das 0,65 kb Bg/II/ PstI Fragment und der Subklon pAS5/11 das 0,68 kb Bg/II/HindIII Fragment.

pAS5/15.11; pAS5/15.12. Das Plasmid pAS5/15 wurde mit den Restriktions endonukleasen NcoI und KpnI hydrolysiert. Die dadurch entstandenen 0,9 kb NcoI/KpnI u. 1,1 kb NcoI/KpnI Fragmente wurden aus einem 1,2%igen Agarosegel eluiert (s. Beispiel 1) und in den Vektor pUCBM21 (Boehringer, Mannheim) (hydrolysiert mit NcoI/KpnI) in E.coli DH5α kloniert, und es entstanden die Subklone pAS5/15. 12 (0,9 kb Fragment) und pAS5/15. 11(1,1 kb Fragment).

10. Subklonierung der Plasmide pAS6 und pMJ 6/6

pMJ6/6: Das Plasmid pAS6 wurde mit der Restriktionsendonuklease SstI hydrolysiert (unter Ausnutzung der Restrikrionsschnittstelle des Vektors) und ein 5,9 kb SstI Fragment aus dem Agarose-Gel eluiert und mit dem Plasmid pUC18 ligiert. E. coli DH5α wurde mit dem rekombinanten Plasmid transformiert.

pMJ6/4.1 und pMJ6/4.2 Das Plasmid pMJ6/6 wurde mit den Restriktions endonucleasen BamHI und PstI hydrolysiert, und ein 0,36 kb BamHI/PstI-, sowie ein 0,5 BamHI/PstI-Fragment wurden aus dem Agarose-Gel eluiert und mit dem Plasmid pUC18 ligiert. E. coli DH5α wurde mit den rekombinanten Plasmiden transformiert.

pMJ 6/6.2.2. pMJ 6/6.2.3. pMJ 6/6.2.4 pMJ 6/6.2.5 pMJ 6/6.2.6 pMJ 6/6.2.7, pMJ 6/6.2.8: das Plasmid pMJ6/6 wurde mit der Restriktionsendonuclease SaII hydrolysiert und ein 2,5 kb- Fragment, ein 1,2 kb Fragment, ein 1,0 kb- Fragment, ein 0,5 kb- Fragment, ein 0,14 kb-Fragment und ein 0,13 kb- Fragment wurden aus dem Agarose-Gel eluiert und mit dem Plasmid pUC18 ligiert. E. coli DH5α wurde mit den rekombinanten Plasmiden transformiert. Das Plasmid pMJ6/6.2.2 wurde durch Hdrolyse und folgende Religation erhalten.

pMJ6/8.1: das Plasmid pMJ6/6 wurde mit den Restriktionsenzymen ClaI und BamHI hydrolysiert und ein 0,9 kb Fragment aus einem Agarosegel eluiert und mit dem Plasmid pBluescript II KS ligiert. E. coli DH5α wurde mit den rekombinanten Plasmiden transformiert.

pMJ6/10: Das Plasmid pMJ6/6 wurde mit den Restriktionsenzymen PstI und SaII hydrolysiert und ein 1,5 kb Fragment aus einem Agarosegel eluiert und mit dem Plasmid pUC18 ligiert. E. coli DH5α wurde mit den rekombinanten Plasmiden transformiert.

pAS6/3 Das Plasmid pAS6 wurde mit der Restriktionsendonuclease BamHI hydrolysiert und ein 2,8 kb BamHI Fragment aus dem Agarose-Gel eluiert, mit dem Plasmid pUC 18 ligiert und inE. coli DH5α transformiert.

pAS 6/3.1: Das Plasmid pAS6/3 wurde mit der Restriktionsendonuclease HincII hydrolysiert und ein 1,1 kb Fragment in pUC18, hydrolysiert mit HincII, ligiert und in E. coli DH5α kloniert.

pAS6/3.2 Das Plasmid pAS6/3 wurde mit der Restriktionsendonuclease SaII hydrolysiert, ein 1,2 kb Fragment in pUC18, hydrolysiert mit SaII, ligiert und in E. coli DH5α Moniert.

pAS6/3.3 Das Plasmid pAS6 wurde mit der Restriktionsendonuclease PstI hydrolysiert, ein 1,45 kb Fragment aus dem Gel eluiert und mit pUC18 ligiert. E. colj DH5α wurde mit dem rekombinanten Plasmid transformiert.

11. Subklonierung des Plasmids pMJ1

pMJ1/1 Das Plasmid pMJ1 wurde mit der Restriktionsendonuklease Sphl hydrolysiert und ein 3,3 kb Sphl-Fragment (0,6 kb SphI/Pstl Fragment ligiert mit pUCl8) aus dem Agarosegel eluiert. Dieses Fragment wurde religiert und in E. coli DH5α kloniert.

pMJ 1/2 Das Plasmid pMJ1 wurde mit der Restriktionsendonuklease Sall hydrolysiert und ein 3,9 kb SaII -Fragment (1,2 kb SaII/PstI Fragment ligiert mit pUC18) aus dem Agarosegel eluiert. Dieses Fragment wurde religiert und in E. coli DH5α kloniert.

pMJ 1/3: Das Plasmid pMJ1 wurde mit der Restriktionsendonuklease SaII hydrolysiert und ein 4,1 kb SstI/PstI (1,4 kb SstI/PstI Fragment ligiert mit pUC18) aus dem Agarosegel eluiert. Dieses Fragment wurde religiert und in E. coli DH5α kloniert.

pMJ 1/4. 1 Das Plasmid pMJ1 wurde mit der Restriktionsendonuklease Sall hydroly siert und ein 0,9 kb SaII/Sinal Fragment aus dem Agarose-Gel eluiert und mit dem Plasmid pUC18 ligiert. Das rekombinante Plasmid wurde in E. coli DH5α transformiert.

12. Herstellung von Subklonen aus pAS5/6

Die Herstellung der pAS5/6-Subklone erfolgte mit dem "double-stranded Nested Deletion Kit" (Pharmacia, Freiburg, Deutschland). 10 µg pAS5/6 DNA wurde wie in Beispiel 1 beschrieben präpariert und mit je 10 U Xhol und SstI hydrolysiert. Die anschließende Inkubation mit Exonuklease III erfolgte nach Herstellerangaben für insgesamt 20 min. In Abständen von 5 min wurden dem Reaktionsansatz Teilmengen entnommen, die einer DNA-Menge von ca. 2,5 µg DNA entsprachen. Die Behand lung mit S1-Nuklease zur Herstellung nicht-überlappender DNA-Enden erfolgte für 30 min bei 20°C nach Herstellerangaben. Diese DNA-Moleküle wurden mit T4- Liaase religiert und in E. coli DH5α kloniert.

13. DNA-Sequenzierung von Acarbose-Biosynthese-Genen aus Actinoplanes sp.

Es wurden die unter Beispiel 8 bis 11 beschriebenen Plasmide sequenziert. In die Sequenzierungsreaktion wurden 6-8 µg Plasmid-DNA aus einer Präparation (s. Bei spiel 1) eingesetzt. Die Sequenzierreaktion wurde mit dem Auto-Read-Sequenzing- Kit (Pharmacia, Freiburg, Deutschland) durchgeführt. Hierbei kam das Standard protokoll zur Sequenzierung von dsDNA zur Anwendung. Um die Auswertung der Nukleotidsequenz mit dem A.L.F (automatisierter Laser Fluoreszens-(DNA)- Sequenzierer) zu ermöglichen, wurden als Startermoleküle für die Sequenzreaktion die Fluorescin-markierten universellen und reversen Sequenzier-Primer verwendet (s. Tab. 2). Zur Herstellung des Gels wurden 8 ml Hydro Link Long Ranger (Serva, Heidelberg), 33,6 g Harnstoff, 8 ml 10x TBE-Puffer, ad 80 ml mit H₂Overmischt, sterilfiltriert und 1 Minute entgast. Die Polymerisation wurde durch Zugabe von 350 µl 10% (w/v) Ammoniumpersulfat und 40 µl N,N,N',N', Tetramethylethylendiamin eingeleitet. Die Lösung wurde in eine Gelform (50×50×0,05 cm) gegossen. Die Elektrophorese erfolgte bei 38 W und einer konstanten Temperatur von 45°C. Als Laufpuffer diente 1x TBE-Puffer. Die Verarbeitung der gemessenen Fluoreszenz zu einer DNA-Sequenz erfolgte über einen angeschlossenen Computer (Compaq 386/20e), der auch zur Steuerung der Elektrophoreseeinheit diente (Programm A.L.F. Manager 2.5; Pharmacia, Freiburg).

14. Transformation von S. lividans

Die Protoplastierung und Transformation von S. lividans TK23 und 1326 erfolgte nach der Methode von Babcock und Kendrick (1988), wobei die Zellen in TSB-PEG 8000 angezogen wurden.

15. Überexpression von AcbC 15.1 Überexpression von AcbC in E. coli

Die DNA-Sequenz des acbC-Gens zeigt zwei mögliche Translation-Startpunkte für AcbC. Obwohl Startpunkt 1 aufgrund einer signifikanteren Ribosomen-bindestelle den wahrscheinlichen Start von AcbC darstellt, wurden beide möglichen AcbC-Proteine überexprimiert. Dazu wurden die Plasmide pET11a und pET16b (Novagen, Heidelberg) für eine Expression in E. coli genutzt. Um einen optimalen Translationsstart für die Expression zu gewährleisten, sollte das ATG Start-Codon, mit passendem Abstand zu einer E. coli ähnlichen RBS, der pET-Vektoren genutzt werden. Dazu ist es notwendig, eine NdeI-Erkennungssequenz am Start-Codon von acbC zu konstruieren. Es wurden die Oligonucleotide AS7 (Sequenzposition 6091 ) und AS8 (Sequenzposition 6112) für die Synthese einer NdeI-Erkennungsstelle an den beiden möglichen Start-Codons eingesetzt. Das Oligonucleotid AS9 bindet 66 bp stromabwärts von einer BamHI Erkennungssequenz an der Sequenzposition 6361 an die DNA. Mit der PCR-Methode (s. Beispiel 8) wurden zwei DNA-Fragmente ampli fiziert, die für eine Expression der beiden möglichen AcbC Proteine genutzt wurden. Die Anlagerung der Primer erfolgte für 40 Sek. bei 45°C, und die Primerverlän gerung fand in 30 Sek. statt. Die beiden amplifizierten DNA-Fragmente wurden mit den Restriktionsendonucleasen NdeI und BamHI hydrolysiert und in die Vektoren pET11a und pET16b entsprechend ligiert. Aus dem rekombinanten Plasmid pAS2 [EP A 0 730 029/DE 195 07 214] wurde das 2,2 kb BamHI-Fragment isoliert und über die BamHI-Erkennungsstelle mit den klonierten PCR-Fragmenten fusioniert. Nachdem die Orientierung des 2,2 kb BamHI-Fragments überprüft wurde, lag das vollständige acbC Gen in den Expressionsvektoren vor. Die Expressionsvektoren bekamen die Bezeichnung pAS8/1-pAS8/4 (Fig. 4). Zusätzlich befindet sich der vollständige acbB Leserahmen (in entgegengesetzter Orientierung) und der Anfang des acbA Gens auf der klonierten DNA in den Expressionsvektoren. In IPTG- induzierten E. coli BL21pLys-Kulturen konnte jeweils ein zusätzlich exprimiertes Protein identifiziert werden. Die Größe der überexprimierten AcbC Proteine ist in Tab. 4 dargestellt. Jedoch wurden alle Proteine in Form unlöslicher "inclusion bodies" gebildet.

Tab. 4: Die Struktur der AcbC-Expressionsvektoren für die Expression in E. coli

15.2 Überexpression von AcbC in S. lividans 1326

Das AcbC Protein wurde in S. lividans 1326 mittels des Plasmidvektors pIJ6021 [Takano, e., et al. (1995)] exprimiert. Es wurde mittels der PCR-Methode [Southern, E.M. (1975)] ein Fragment aus chromosomaler DNA amplifiziert, das ausschließlich den kodierenden Bereichen des acbC-Gens umfaßt. Für die PCR wurden die Oligonucleotide AS-C1 und AS-C2 eingesetzt, wobei mit Hilfe des Primers AS-C1 (Sequenzposition 6089) eine NdeI Erkennungssequenz am Start-Codon 2 des acbC- Gens konstruiert wurde. Das Oligonucleotid AS-C2 bindet an Sequenzposition 7356 und wurde genutzt, um eine EcoRI-Erkennungssequenz zu konstruieren. Die Anlagerung der Primer erfolgte in 20 Sek. bei 50°C, und die Primer wurden in 40 Sek. verlängert. Das so erhaltene acbC DNA-Fragment wurde zuerst in den Vektor pUC18 "blunt-end" kloniert und die Richtigkeit der DNA-Sequenz nach der PCR überprüft. Dieses rekombinante Plasmid mit dem klonierten acbC-Gen bekam die Bezeichnung pAS8/5.1. Das Plasmid pAS8/5.1 wurde mit den Restriktionsendo nucleasen NdeI und EcoRI hydrolysiert, die DNA auf einem Agarosegel getrennt und aus der Matrix eluiert. Das so präparierte acbC-Fragment wurde in den Vektor pIJ6021 ligiert. Das rekombinante Expressionsplasmid bekam die Bezeichnung pAS8/7.2 (Fig. 5). Protoplasten von S. lividans 1326 wurden mit dem Plasmid pAS8/7.2 transformiert. Mit dem so erhaltenen Klon konnte das AcbC Protein in Thiostrepton induzierten Kulturen in löslicher Form überexprimiert werden (Fig. 6).

16. Überexpression von AcbE in S. lividans TK23

Das acbE-Gen konnte aus dem Plasmid pAS5/6.9-6 mittels einer Hydrolyse mit den Restriktionsendonucleasen EcoRI und HindII gewonnen werden. Nach Trennung der DNA auf einem Agarose-Gel und Elution des 3,8 kb EcoRI/HindII Fragments aus der Matrix wurde dieses acbE Fragment entsprechend in den Vektor pUWL219 ligiert [J. Wehmeier, U.F. (1995)]. Für eine spätere Expression von AcbE in S. lividans sollte in diesen Vektoren eine mögliche Promotor-Sequenz auf dem 200 bp großen "upstream"-Bereich genutzt werden (s. Tab. 5). Das rekombinante Plasmid bekam die Bezeichnung pAS11 (Fig. 7).

Tab. 5: Der intercistronische Bereich zwischen den Genen acbE und acbD. Inverted repeat (IR) und direct repeat (DR) Sequenzen, die an einer Regulation beteiligt sein könnten, sind unterstrichen.

Protoplasten von S. lividans TK23 wurden mit dem Plasmid pAS11 transformiert. In den Überständen aus MD 50-Kulturen war sowohl in den S. lividans TK23/pAS11 als auch in den Actinoplanes sp. Ansätzen ein extrazelluläres Protein mit der Größe von 110 kDa zu erkennen (Fig. 8). Diese Größe entspricht dem Molekulargewicht des von acbE abgeleiteten Proteins. Die Identität dieser Proteine wurde durch entsprechende Enzymtests (s. Beispiel 19.2) und die Sequenzierung der N-terminalen Aminosäuren (s. Beispiel 18) nachgewiesen. In dem Überstand aus der Kontroll-Kultur S. lividans TK23/pUWL219 in MD 50-Medium konnte kein entsprechendes Protein nachgewiesen werden. Daher ist es wahrscheinlich, daß die mögliche Promotorsequenz (Tab. 5) "upstream" vom acbE-Gen für die Expression von AcbE in den S. lividans/pAS11 Kulturen in MD 50-Medium verantwortlich ist.

17. Gelelektrophoretische Darstellung von Proteinen

Die denaturierende Trennung von Proteinen in SDS-Polyacrylamidgelen und deren Färbung mit dem Coomassie-Farbstoff erfolgte nach der Methode von Lugtenberg (1975). Je nach Ansatz wurden 8%ige oder 11%ige Gele verwendet.

Gelzusammensetzung (11%iges Gel)

Die Elektrophorese erfolgte entweder mit der SERVA Blue-Vertical 100 /C Apparatur (Gelform, 80×100×0,75 mm) oder mit der Renner-Twin-Vertical-Apparatur (Gelform, 180×170×1 mm).

Die Bestimmung der Proteinkonzentration der zu analysierenden Proben erfolgte mit dem Protein-Assay (BioRad, München), wobei mit BSA eine Eichgerade erstellt wurde. Als Standard für die Molekulargewichte der getrennten Proteine dienten der "VIIL Dalton-Marker" (14,2 kDa-66 kDa) und der "High Molecular Weight Standard" (29 kDA-210 kDa) von Sigma (Deisenhofen).

18. Bestimmung der N-terminalen Aminosäuresequenz

Es wurde die N-terminale Aminosäuresequenz des AcbE Proteins vergleichend aus Actinoplanes sp. und dem Klon S. lividans TK23/pAS11 bestimmt. Dazu wurden 50 ml Kulturen in MD 50-Medium für drei Tage bebrütet. Die Zellen wurden durch Zentrifugieren entfernt und die Kulturüberstände für 12 h gegen Puffer (5 mM Tris/HCl pH 7.5; 1 mM CaCl₂) bei 4°C dialysiert. Anschließend wurden die Über stände in 48 h gefriergetrocknet und in 1,5 ml Probenpuffer aufgenommen. Die so präparierten Kulturüberstände wurden in einer SDS-PAGE mit der Renner-Twin- Vertical-Apparatur (Gelform, 180×170×3 mm) getrennt. Um eine möglichst gute Trennung des AcbE Proteins von anderen extracellulären Proteinen zu gewährleisten, wurde ein Gradientengel (5% → 10%) eingesetzt. Der Transfer der Proteine aus dem SDS-Polyacrylamidgel auf eine Polyvinylfluorid (PVDF) Membran (Amersham Buchler, Braunschweig) erfolgte in einem halbtrockenen elektrophoretischen Verfah ren mit einer Fast-Blott B33-Apparatur (Biometra, Göttingen) nach Vorschrift der Hersteller. Der Transfer erfolgte für 45 Min. mit 250 mA. Als Transferpuffer diente 1 : 2 verdünnter Laufpuffer (s. Puffer und Lösungen) in 30 Min. gefärbt und mit Entfärbelösung (s. Puffer u. Lösungen) entfärbt. Zur Bestimmung der N-terminalen Aminosäuresequenz wurde das Blottstück vor der Sequenzierung zweimal mit je 100 µl 50%igem Methanol gewaschen, um überschüssige Salze zu entfernen. Nach dem Trocknen wurde die Sequenzanalyse mittels Blottcartridge sowie eines mit Polybren vorbehandelten Filters durchgeführt. Für die Sequenzanalyse wurde der Fastblottzyklus verwendet. Das Ergebnis ist in Tab. 6 dargestellt.

Tab. 6: Die Ergebnisse der Sequenzierung der N-terminalen Aminosäurese quenz des AcbE Proteins aus Actinoplanes sp. und dem Klon S. livi dans TK23/pAS 11

19. Bestimmung von Enzym-Aktivitäten 19.1. Bestimmung der Valiolon-Synthase Aktivität

Für die Überexpression von AcbC wurden 10 ml YEME-Medium (50 µg/ml Km) mit einer Sporensuspension von S. lividans 1326/pAS8.7.2 beimpft. Nach ein- bis zwei tägiger Kultivierung befanden sich die Kulturen in der frühen logarithmischen Wachstumsphase. Zu diesem Zeitpunkt wurden die Kulturen mit 7,5 µg/ml Thio strepton induziert. Die Kulturen wurden 20 h nach der Induktion geerntet. Die sedimentierten Zellen wurden in 1,5 ml kaltem Aufschlußpuffer (s. Puffer und Lösungen) aufgenommen und schonend mit Ultraschall aufgeschlossen. Durch eine 30 minütige Zentrifugation bei 15.000 g und 4°C wurden die Zelltrümmer entfernt. Durch eine Dialyse (12 h) gegen 2,5 Liter Aufschlußpuffer bei 4°C wurde der für den Enzymtest nötige AcbC-Extrakt hergestellt. Dieser Extrakt konnte bei -20°C gelagert werden, ohne merklich an Aktivität zu verlieren. Der Proteingehalt des Extraktes wurde mit dem Protein-Assay (BioRad, München) bestimmt und 15 µg in einer SDS- PAGE analysiert (Fig. 6). Der Enzymtest wurde in einem 20 mM P-Puffer (pH 7,5) bei RT für 2 h durchgeführt. Es wurden 20 µg Gesamt-Protein aus dem AcbC-Extrakt und 8 mM Sedoheptulose-7-Phosphat in dem Enzymtest eingesetzt. Zusätzlich erhielt der Reaktionsansatz 2 mM NaF, um unspezifische Phosphatasen in dem Extrakt zu hemmen. Das Reaktionsvolumen betrug 100 µl. Die Auswertung erfolgte über eine DC auf Kieselgelfolien mit Butanol/Ethanol/H₂O (9 : 7 : 4) als Laufmittel, wobei 25 µl aus einem Reaktionsansatz analysiert wurden. Durch Besprühen der DC-Folien mit Cer-Reagenz (s. Puffer und Lösungen) und anschließender 15 minütiger Inkubation bei 90°C im Trockenschrank konnten die organischen Verbindungen sichtbar gemacht werden. Als Referenzsubstanz diente ein Gemisch aus Valienon und Valiolon (Prof. H.G. Floss, Seattle).

Durch das in S. lividans exprimierte AcbC Protein konnte Sedoheptulose-7-Phosphat spezifisch umgesetzt werden (Fig. 9). Allerdings zeigte das Reaktionsprodukt ein geringfügig anderes Laufverhalten in der DC als der Valienon-/Valiolon-Standard. Eine Verminderung der Wanderungsstrecke des Reaktionsproduktes auf der Kieselgel-Folie durch den Reaktionspuffer konnte ausgeschlossen werden (Fig. 9, Spur 5).

19.2. Bestimmung der α-Amylase Aktivität

Die Kulturen von S. lividans TK23/pAS11 wurden in TSB-Medium und MD 50- Medium in Gegenwart von 25 µg/ml Thiostrepton angezüchtet. Nach 3-4 tägiger Inkubation wurden die Kulturen geerntet. Durch Zentrifugation (3500 g) bei 4°C für 10 Min. wurden die Zellen entfernt. Die Überstände wurden für 12 h bei 4°C gegen Puffer (25 mM Tris/HCl pH 7,5; 1 mM CaCl₂) dialysiert. Aus den so präparierten Überständen wurden 500 µl im Vakuum getrocknet, in Probenpuffer (s. Puffer und Lösungen) aufgenommen; die Proteine in den Überständen wurden auf einer SDS- PAGE (Fig. 8) getrennt. Als Referenz dienten Überstände aus Actinoplanes sp. Kulturen, die unter identischen Bedingungen gewachsen waren. Die α-Amylase Aktivität wurde durch Messung der Trübungsabnahme einer 1% Stärkesuspension bestimmt. Für eine Messung wurden 100 µl dialysierter Kulturüberstand mit 900 µl Stärkesuspension gemischt und die Abnahme der Extinktion bei 300 nm zeitabhängig aufgezeichnet [Virolle, M.J., et al. (1990)]. Zum Vergleich wurden entsprechende Untersuchungen mit einer α-Amylase aus Bacillus sp. (Sigma, Deisenhofen) durchgeführt. Die Ergebnisse sind in (Fig. 10) dargestellt. Die AcbE Aktivität in Actinoplanes sp. MD 50-Kulturen und in den S. lividans TK23/pAS11 MD 50- Kulturen ließen sich durch 1 mM Acarbose im Test nicht hemmen. Dahingegen ließ sich die Hintergrund-Aktivität in S. lividans TK23/pUWL219 MD50-Kulturen durch 0,1 mM Acarbose im Test hemmen. Die Bacillus sp. α-Amylase wurde ebenfalls durch 0,1 mM Acarbose inhibiert (Fig. 10).

Puffer und Lösungen: Medien für die Bakterienanzucht

LB-Medium:
Trypton	10 g
NaCl	10 g
Hefeextrakt	5 g
H₂O	ad 1000 ml

Es wurde mit 4 M NaOH ein pH-Wert von 7,5 eingestellt.

MD 50-Medium
Lösung I@	Stärkehydrolysat MD 50	70 g
(NH₄)₂SO₄	5 g
Hefeextrakt	2 g
ad 400 ml mit H₂O@	Lösung II@	K₂HPO₄	1 g
KH₂PO₄	1 g
Tri-Natriumcitrat	5 g
ab 400 ml mit H₂O@	pH-Einstellung auf 7.0 mit 1M NaOH@	Lösung III@	MgCl₂.6 H₂O	1 g
FeCl₃.6 H₂O	0,25 g
CaCl₂.2 H₂O	2 g
ad 200 ml mit H₂O

Die Lösungen werden nach dem Mischen sterilfiltriert.

TSB-Medium:
Tryptone-Soya Broth (Oxoid)	30 g
H₂O	ad 1000 ml

TSB-PEG 8000:
Tryptone Soya Broth (Oxoid)	30 g/l
PEG 8000	50 g/l
nach dem Autoklavieren:@	Glycin (20%)	25 ml
MgCl₂ (2,5 M)	2 ml

YEME [Hopwood, D.A., et al. (1985)]
Hefeextrakt	3 g/l
Pepton	5 g/l
Malzextrakt	3 g/l
Glukose	10 g/l
Saccharose	340 g/l
nach dem Autoklavieren:@	MgCl₂ (2,5 M)	2 ml

Standardpräparation von Plasmid-DNA [modifiziert nach: Birnboim u. Doly (1979)]

Mix I	50 mM Glukose
50 mM Tris-HCl (pH 8,0)@	10 mM EDTA (pH 8,0)@	5 mg/ml Lysozym@	Mix II	200 mM NaOH
1% (w/v) SDS (Natriumdodecylsulfat)@	Mix III	3 M Kaliumacetat
1,8 M Formiat

TE-Puffer (pH 8,0)

Tris-Hcl	10 mM
Na₂-EDTA	1 mM

DNA-DNA-Hybridisierung

20x SSC
3 M NaCl
0,3 M Na-Citrat

Prähybridisierungslösung:

6x SSC
0,01 M Natriumphosphatpuffer pH 6,8
1 mM EDTA
0,5% SDS
0,1% Magermilchpulver

Hybridisierungslösung:

In 15 ml Prähybridisierungslösung wird die acb-Sonde nach der Markierungsreaktion gegeben.
6x Postwash
0.5% SDS

DNA-Sequenzierung:

TBE-Puffer (pH 8,0)
1M Tris-Base
0,83 M Borsäure
10 mM EDTA

Denaturierende Polyacrylamid-Gelelektrophorese von Proteinen

Probenpuffer 5x
Glycerin	25 ml
SDS	5 g
BPB	2,5 mg
2-Mercaptoethanol	12,5 ml
ad 50 ml 0,625 M Tris/HCl (pH 6,8)

Elektrodenpuffer
Tris/HCl (pH 8,3)	25 mM
Glycin	190 mM
SDS (w/v)	0,1%
pH-Einstellung vor SDS-Zugabe

Lösung A
Acrylamid	44 g
N,N-Methylen-Bisacrylamid	0,8 g
ad 100 ml H₂O

Lösung B
Acrylamid	30 g
N,N-Methylen-Bisacrylamid	0,8 g
ad 100 ml H₂O

Färbelösung
SERVA-Blau	0,15%
R-250 (w/v)@	Methanol (v/v)	50%
Essigsäure (v/v)	10%

Entfärbelösung
Methanol (v/v)	25%
Essigsäure (v/v)	10%

Aufschlußpuffer AcbC

K₂HPO₄/KH₂PO₄ (pH 7,5)	20 mM
NAD	0,2 mM
DTT	0,5 mM

Phosphatpuffer α-Amylase-Test

K₂HPO₄/KH₂PO₄ (pH 6,8)	50 mM
KCl	50 mM

Cer-Reagenz

Molybdatophosphorsäure	1,25 g
Cer-4-sulfat	0,5 g
H₂SO₄	3 ml
ad 50 ml mit H₂O

Literatur

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Birnboim, H.C., Doly, J. (1979) A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA Nucleic Acids Res.: 7, 1513-1523
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Goeke, K., Drepper, A., Pape, H. (1996) Formation of acarbose phosphate by a cell-free extract from the acarbose producer Actinoplanes sp. J. Antibiot., 49, 661-663
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Hopwood, D.A., et .al. (1985) Genetic manipulation of Streptomyces; A laboratory manual; The John Innes Foundation, Norwich, England
Lugtenberg, B., et al. (1975) Electrophoretic resolution of the "major" outer membrane protein of Escherichia coli into four bands. FEBS Lett. 58, 254-258.
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Mol. Microbiol., 13, 349-355.
Mullis, K.B., Falloona, F.A. (1987) Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase catalyzed chain reaction. Methods Enzymol., 155, 335-350.
Sambrook, J., et al. (1989) Molecular cloning; a laboratory manual, 2nd ed. Cold Spring Harbour Laboratory Press, N.Y., USA.
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Virolle, M.J., Morris, V.J., Bibb, M.J. (1990) A simple and reliable turbidimetric and kinetic assay for alpha-amylase that is really applied to culture supernatants and cell extracts. J. Industrial Microbiol., 5, 295-302.
Wehmeier, U.F. (1995) New multifunctional Escherichia coli-Streptomyces shuttle vectors allowing blue-white screening on XGal plates. Gene, 165, 149-150.

Legenden

Fig. 1 Restriktionskarte des sequenzierten ca. 18 kb Abschnittes aus dem Genom von Actinoplanes sp. SE50/110 (vgl. Fig. 2). Der schwarze Balken gibt den im ursprünglichen Patent beanspruchten Bereich an, der die Gene acbCBA (Reihenfolge wie angegeben von links nach rechts) z. T. überlappt.

Fig. 2 Genkarte des Acarbose Biosynthese-Clusters.

Fig. 3 DNA Sequenzen aus dem Acarbose Biosynthese-Cluster.

Fig. 4 Die rekombinanten Plasmide, die - ausgehend von den Plasmiden pET11a und pET16b - für die Expression von AcbC in E. Coli konstruiert wurden.

Fig. 5 Das rekombinante Plasmid pAS8/7.2, welches - ausgehend von dem Plasmid pIJ6021 - für die Expression von AcbC in S. lividans 1326 konstruiert wurde.

Fig. 6 Gelelektrophoretische Trennung von Zellysaten (s. Beispiel 15.2). Die Expression von AcbC (42 kDa) in der S. lividans 1326/pAS8/7 Kultur ist in der Spur 3 dargestellt.

Fig. 7 Das rekombinante Plasmid pAS11, welches - ausgehend von dem Plasmid pUWL219 - für die Expression von AcBE in S. lividans TK 23 konstruiert wurde.

Fig. 8 Gelelektrophoretische Trennung von Proteinen aus Kulturüberständen (s. Beispiel 16). Die Expression von AcbE (110 kDa) ist in Spur 2, Spur 5 und Spur 6 zu erkennen.

Fig. 9 Nachweis der AcbC-Enzymaktivität durch Dünnschicht- Chromatographie auf Kieselgelfolien (s. Beispiel 19.1).

1) Extrakt aus Actinoplanes sp.
2) Extrakt aus S lividans 1326/pJ6021
3) Extrakt aus S. lividans 1326/pAS8/7.2 (Kultur v. 12.12.96)
4) Extrakt aus S. lividans 1326/pAS8/7.2 (gekocht)
5) Extrakt aus S. lividans 1326/pAS8/7.2 (Valienon statt Sedo heptulose-7-Pho sp hat als Substrat)
6) Valiolon/Valienon Standard
7) Sedoheptulose
8) Sedoheptulose-7-Phosphat
9) Extrakt aus S. lividans 1326/pAS8/7.2 (Kultur vom 8.1.97)

Fig. 10 Bestimmung der α-Amylase Aktivität in Kulturüberständen. Die Anzucht der Bakterien erfolgt in MD-50 Medium. Mit gekochten Kulturüberständen konnte keine Aktivität gemessen werden. Die Testdauer betrug 6 min. Zum Vergleich wurde in den Ansätzen 9-11 jeweils 2,8 mU gekaufte α-Amylase eingesetzt.

Claims

1. Acarbose Biosynthese Gen Cluster enthaltend DNA aus der Fig. 3.

2. Acarbose Gene enthaltend DNA aus der Fig. 3.