DE10021667A1 - Neue Enzyme in der Acarbose-Synthese und deren Verwendung - Google Patents

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft neue Enzyme in der Acarbose-Synthese und deren Verwendung bei der Herstellung von Acarbose, deren Vorprodukte, und bei der Biokonversion von Nebenprodukten.

Description

Die Erfindung betrifft das Gencluster für die Biosynthese von Acarbose aus Actinoplanes sp. SE 50/110 (CBS 614.71) und seiner Mutanten und Selektanten. Die Gene mit direktem Bezug zum Acarbosemetabolismus wurden mit dem Mnemonic (Funktionskürzel) "acb" bezeichnet. Andere Gene wurden mit "asp" plus Zahlencode (bezogen auf die Herkunft aus Nr. der Phagenbank) bezeichnet. Eine Genkarte als Übersicht über die im zusammenhängenden Bereich von etwa 38 kb gefundenen Gene zeigt die Fig. 1, in Tabelle 1 ist eine Auflistung der bisher identifizierten Leserahmen und ihrer Funktionen dargestellt. Die komplette DNA-Sequenz ist mit überlappenden Abschnitten auf 3 Lambda-Phagen kloniert.

Insgesamt werden 15 Gene ganz oder teilweise neu beschrieben: Das Clusterende ist auf der linken Seite noch nicht absolut gesichert, dürfte aber mit dem zweiten Amylasegen acbZ beendet sein. Auf der rechten Seite gehören die Gene ab asp3.1 wahrscheinlich nicht mehr zum Cluster, sind aber Teil des Kohlenhydrat-Metabolis­ mus. Die Funktionen der neuen Gene bestätigen und runden das bisherige Bild ab: Sie stellen eine Beziehung zwischen Biosynthese (evtl. auch Resistenzmechanismus: AcbK), intra- und extrazellulärem Umsatz und Transport (Import und Export) von Acarbose bzw. seinen Analogen, den Maltodextrinen, her. Viele Gene codieren für Proteine, die noch ganz neu sind oder nur entfernte Verwandtschaft zu anderen Proteinen haben, die in entfernt verwandten Organismen vorkommen. Vier Proteine haben deutliche Verwandtschaft zu allgemein vorkommenden "housekeeping enzymes" (in Klammern genannt), AcbC (AroB), AcbQ (MalQ), AcbR (GlgC) und AcbV (GabT), wovon mindestens drei eine deutliche Abweichung von den authen­ tischen Funktionsträgern bei einer Stammbaumanalyse aufweisen. Dies weist auf eine deutliche Veränderung in der enzymatischen Funktion hin, die ihre mögliche Ursache in einer Genduplikation mit anschließendem evolutionären Drift durch Selektion auf eine andere Funktion haben könnte. Insofern verhält sich das Gen­ cluster wie ein typisches Cluster für die Biosynthese von Sekundärstoffen. Andererseits ist der Metabolismus evtl. direkt mit dem hauptsächlichen C-Stoff­ wechsel verknüpft und insofern eine Besonderheit. Eine enzymologische Funktion konnte bisher folgenden Genloci direkt zugeordnet werden: AcbA, AcbB, AcbC, AcbD, AcbE, (AcbFGH), AcbK, AcbV. Die Funktionen weisen auf eine intra­ zelluläre Baustein-Biosynthese und Kondensation (Oxidoreduktase- oder Glycosyl­ transferase-Mechanismus), sowie auf eine Modifikation (Phosphorylierung durch AcbK) und Ausschleusung (Export durch AcbWX[Y]) hin. Auch die Hydrolyse (AcbE und AcbZ), Umsetzung (AcbD), Aufnahme (AcbFGH), und intrazelluläre Verstoffwechselung (AcbQ) von Maltodextrinen oder seinen Acarviosyl-Derivaten sind gewährleistet.

Im ersten Genomprojekt eines nahe verwandten höheren Actinomyceten, S. coelicolor A3(2) [Sanger-Institut, Welcome-Trust; kurz vor der Vollendung], wurden weder ein acb-ähnliches Gencluster noch Homologe zu den charakteristischen Genen (z. B. acbC, acbD) gefunden. Das gleiche gilt auch für die vollständigen Genomse­ quenzen der Actinomyceten Mycobacterium tuberculosis und M. leprae. z. B. haben die Proteine AroB von S. coelicolor und AcbC nur BLAST-Werte von P = 1.5e-14, Identitäten = 84/294 (28%); die AroB Proteine von M. tuberculosis und S. coelicolor haben aber BLAST-Werte von P = 1.4e-96, Identitäten = 195/344 (56%).

Die Gene acbVUSRPI und wahrscheinlich auch acbJQ sind translational gekoppelt, was auch für das mit wenigen bp Abstand nachfolgende Operon acbKMLNOC gilt. Dies stellt eine ungewöhnlich dichte Anordnung von 14 Genen dar und weist klar darauf hin, dass eine Kotranskription und damit eine funktionale Kopplung vorliegt.

Charakterisierung der neu identifizierten offenen Leserahmen aus dem Acarbosebiosynthese-Cluster von Actinoplanes sp.

Die neu gefundenen Gene werden in der Reihenfolge, in der sie im Cluster organisiert sind, charakterisiert, ausgehend von acbZ, das das linke Ende darstellt. Für die Enzyme wurden biochemische Charakterisierungen zur Verifizierung der enzymatischen Aktivitäten durchgeführt. Diese sind bei der Beschreibung des jeweiligen Leserahmens/Genprodukts dargestellt.

acbZ

Dieses Gen codiert für eine alpha-Amylase. Die abgeleitete Proteinsequenz zeigt hohe Ähnlichkeit zu anderen langkettigen Amylasen aus Actinomyceten; z. B. zu der im selben Cluster codierten Acarbose-insensitiven Amylase AcbE und zu den beiden Amylasen aus S. lividans und S. coelicolor (Genomprojekt).

acbWXY

Diese drei Gene stellen eine funktionelle Einheit dar und codieren für ein ABC- Exporter-System. Die abgeleiteten Proteinsequenzen von AcbW, AcbX und AcbY zeigen signifikante Ähnlichkeiten zu anderen Proteinen der ATP-abhängigen ABC- Transporterfamilie, am deutlichsten zu einem charakteristischen, aber ebenfalls noch hypothetischen ABC-Transporter (Exporter-Typ) aus Deinococcus radiodurans (AE001882), der ebenfalls durch drei benachbarte Gene und in entsprechender Reihenfolge codiert wird. Viele Antibiotika-Exporter gehören zur selben Unter­ familie der ABC-Transporter, vor allem in Streptomyceten. Die postulierten Start­ codons der Gene acbX und acbY überlappen mit den postulierten Stopcodons für acbW bzw. acbX. AcbW ist ein typisches ATP-Bindeprotein vom ABC-Typ (Hyde et al. 1990). Die ATP-Bindeproteine vom Typ MtrA (z. B. DrrA, OleC-Orf4), zu denen AcbW strukturell den höchsten Grad an Übereinstimmung aufweist (30% Identität), enthalten die charakteristischen, hochkonservierten ATP-Binde-Domänen. Diese bestehen aus zwei konservierten Motiven, die Walker A und B Sites genannt werden (Walker et al. 1982). Die dem MtrA-Typ zugehörigen Proteine sind charakteristisch für ABC-Transporter, die Resistenz gegen verschiedene Antibiotika vermitteln. Die Analyse der Hydrophobizitätsprofile von AcbX ergaben, daß dieses Protein 6 poten­ tielle transmembrane Helices besitzt und demnach das acbX-Gen für ein Membran­ protein eines ABC-Transporters kodieren könnte. Die postulierte Struktur des Proteins gleicht bekannten Membranproteinen bekannter ABC-Transporter wie DrrB, dem Membranprotein des Daunorubicin/Doxorubicin ABC-Exporters aus Strepto­ myces peuceticus (Guilfoile und Hutchinson 1991) und OleC-orf4, dem Membran­ protein des Oleandromycin ABC-Exporters aus Streptomyces antibioticus (Rodriguez et al. 1993). Das AcbY Protein ist ebenfalls hydrophob, hat aber keine Ähnlichkeit zu typischen ABC-Transmembrandomänen. Das AcbY Protein dürfte, analog zu dem Befund aus Deinococcus radiodurans, eine Komponente des Exporters darstellen, z. B. ein zusätzliches Membranprotein.

AcbV

AcbV ist eine Aminotransferase und nimmt in der Acarbose-Biosynthese die Funktion einer dNTP-4-Keto-6-desoxyglucose Aminotransferase wahr. In seiner Nukleotidsequenz ähnelt AcbV den Aminotransferasen der GabT-Familie (gamma- Aminobutyrat Aminotransferasen), die zu der Aminotransferase-Subfamilie III gehören. Das Protein zeigt die Ähnlichkeit mit verschiedenen Typ III-Aminotrans­ ferasen. Das AcbV Protein hat eine charakteristische Abweichung von der Ähnlich­ keit zu den authentischen GabT Enzymen der Bakterien, was auf eine veränderte Funktion hinweist.

Heterologe Expression der Aminotransferase acbV

Für das acbV Gen wurden zwei mögliche Start-Kodons gefunden. Die von diesen beiden Startstellen zu erwartenden AcbV Proteinvarianten werden im Folgenden mit der zusätzlichen Bezeichnung "K" (für kurz) bzw. "L" (für lang) versehen.

Heterologe Expression in E. coli

Mittels der PCR-Methode wurden zwei verschiedene Fragmente (1452 bp und 1506 bp) aus chromosomaler DNA von Actinoplanes amplifiziert, welche den kodierenden Bereich des acbV-Gens umfassen. Die beiden PCR Fragmente wurden NdeI und BamHI hydrolysiert und mit NdeI/BamHI hydrolysierten Vektor pET16b ligiert.

Die resultierenden Plasmide pH16AT1 und pH16AT9 kodieren für die Proteine AcbV-K (1452 bp) bzw. AcbV-L (1506 bp), jeweils mit einem Poly-His-Rest N- terminal fusioniert. Diese wurden dann in E. coli BL21 (DE3) Zellen, welche das pSUTNESLB10 Plasmid trugen, transformiert. Das Plasmid pSUTNESLB10 erlaubt die Expression der Proteine GroESEL aus S. griseus unter Kontrolle des T7-Φ10 Promotors (Pöhling 1997, Dissertation. Chem. Mikrobiologie BUGH Wuppertal). Die Plasmid-tragenden Zellen wurden in LB Medium angeimpft und bei 30°C kultiviert. Bei einer OD-540 = 0,5 wurden die Zellen mit 0,4 mM IPTG induziert und nach 4 Stunden geerntet. Mit Hilfe der Western Blot-Methode und mittels Anti His- Tag Antikörper (Qiagen, Hilden) und dem "Western Blot Kit" von Roche Diag­ nostics konnte die Expression der Fusionsproteine nachgewiesen werden.

Heterologe Expression in S. lividans

Die Plasmide pH16AT1 und pH16AT9, welche für AcbV-K (1452 bp) bzw. AcbV-L (1506 bp) jeweils mit einem fusionierten N-terminalen Poly-His-Rest kodieren, wurden XbaI/BamHI hydrolysiert und mit XbaI/BamHI hydrolysiertem Vektor pUCPU21 (U. Wehmeier, BUGH Wuppertal) ligiert. Die resultierenden Plasmide pUCAT1 (acbV-k) und pUCAT9 (acbV-l) wurden dann mit den Restriktionenzymen HindII/BamHI hydrolysiert. Die entsprechenden Fragmente, die für his-acbV-k und his-acbV-l kodieren, wurden dann in HindIII/BamHI hydrolysierten pUWL201 ligiert. Diese neu konstruierten Expressionsplasmide, die pHWAT1 (his-acbV-k) und pHWAT9 (his-acbV-l) genannt wurden, wurden in S. lividans TK23 transformiert. Die Expression der Proteine His-AcbV-K und His-AcbV-L erfolgt unter Kontrolle des permE Promotors und wurde bei 30°C in TSB Medium getestet. Nach 48 Stun­ den Wachstum wurden die Zellen geerntet. In Western Blots mit Anti His-Tag Anti­ körpern (Qiagen) konnte die Expression des Fusionsproteins His-AcbV-L nachge­ wiesen werden.

Die abgeleitete AcbV Sequenz zeigte die höchste Ähnlichkeit (30 bis 46% Identität) zu den GabT Proteinen aus S. coelicolor (SC8B7), M. tuberculosis (Q50632) und E. coli (P22256). Alle authentischen, in Bakterien und wahrscheinlich auch anderen Organismen essentiellen, GabT-Proteine und ihre Homologen aus Genomsequenzen haben eine deutlich nähere Verwandtschaft im taxonomischen Umkreis. Anderer­ seits zeigte AcbV-Asp auch gute Ähnlichkeit zu einer Aminotransferase (AF145039) SpcS1, die im Spectinomycin-Cluster aus S. spectabilis codiert wird und die ebenfalls eine andere Funktion haben sollte.

Die GabT Enzyme katalysieren die Umsetzung von Aminobutyrat zu Succinat­ semialdehyd. Daher sollte zunächst Aminobutyrat als potentieller Aminogruppen­ donor überprüft werden. Um die Funktion des AcbV-Proteins zu klären, wurden von S. lividans mit den Expressionsplasmiden pHWAT1 (his-acbV-k), pHWAT9 (his- acbV-l) oder pUWL201 (als Negativkontrolle) Proteinextrakte hergestellt und für Enzymtests eingesetzt. Es konnten mit den verwendeten Zellextrakten unter Ver­ wendung von Aminobutyrat keine GabT ähnlichen Enzymaktivitäten gemessen werden, wenn α-Ketoglutarat oder 2-epi-5-epi-Valiolon als Substrat eingesetzt wurden.

Wurden dTDP-4-Keto-6-desoxyglucose und L-Glutamat in Enzymtests eingesetzt, wurde durch AcbV ein Aminotransfer katalysiert, so daß dTDP-4-Amino-4,6- Didesoxyglucose gebildet wurde.

acbU

Das Protein AcbU enthält die für eine ATP-Bindung charakteristischen Walker- Motive und zeigt eine Ähnlichkeit (25% Identität) zu den beiden Pep2-Proteinen aus den Glycogensyntheseoperons von S. coelicolor (Celia et al. 1995; Cosmide StL11 und St6A11). Im Genom von S. coelicolor A3(A2) wurden bisher zwei potentielle Glycogensynthese-Operone identifiziert. In beiden Operonen findet man die als pep2 bezeichneten Gene, wobei die Nukleotidsequenzen dieser beiden Gene nicht iden­ tisch sind. AcbU besitzt eine Phosphorylierungsfunktion und aktiviert ein Cyclitol (wahrscheinlich ein 2-epi-5-epi-Valienon-Derivat) vor der Kondensation mit dTDP- 4-Amino-4,6-Didesoxyglucose.

acbS

Die abgeleitete Aminosäuresequenz von AcbS zeigt gute, durch ProDom-Analyse (WU-BLAST-Analyse einer Motivsammlung von identifizierten Proteindomänen) bestätigte Übereinstimmungen mit Glycogen Synthasen (Glycosyltransferasen mit ADP-Glucose als Donorsubstrat) aus zwei Pyrococcus-Arten (AJ248283 und AP0000019) und verschiedenen anderen Organismen (Bakterien und Pflanzen). Die Ähnlichkeiten zwischen AcbS und anderen Proteinen beziehen sich auch auf die an der LPS Core Biosynthese beteiligte Glucosaminyltransferasen, z. B. dem WaaK Protein, das in der E. coli F632 waa-Genregion kodiert wird und aus UDP-GlcNAc den Zuckerrest auf polymerisierende Oligomer-Vorläufer des LPS überträgt. AcbS ist eine Acarviosylsynthase und an dem Kondensationsmechanismus der Acarviose oder des fertigen Acarbosemoleküls beteiligt.

acbR

Das AcbR Protein (frühere Bezeichnung GlgC; ADP-Glucose Synthase) zeigt 34% Sequenzidentität in einer Überlappung von 364 AS mit GlgC aus Bacillus stearothermophilus. Auch zu anderen GlgC-Proteinen liegt die Identität im Bereich von 30%. Dagegen sind die ADP-Glucose Synthasen von S. coelicolor und M. tuber­ culosis 63.6% Identität viel näher miteinander verwandt. Daß alle anderen GlgC-Proteine untereinander größere Übereinstimmungen zeigen (z. B. GlgC aus S. coeli­ color noch 60% zu E. coli) deutet an, daß AcbR ein anderes Substrat erkennt. AcbR stellt eine GlgC-ähnliche NDP-Polyol-Synthase dar. Diese Reaktion ist eine Vorstufenaktivierung für die Kondensationsreaktion bei der Acarviose/Acarbose Biosynthese.

acbP

Vermutlich translational gekoppelt mit acbR wurde ein kürzerer Leserahmen identifiziert, der nach Translation in die Aminosäuresequenz eine entfernte Ähnlichkeit zu hypothetischen Proteinen vergleichbarer Größe aus S. coelicolor, M. tuber­ culosis, Synechocystis sp. und Thermotoga maritima zeigt (z. B. 28% Amino­ säureidentität in einer Überlappung von 166 AS mit TM1181 aus Thermotoga maritima). Die Funktion ist bisher unklar.

acbI

Translational gekoppelt mit acbP schließt sich der Leserahmen acbI an, der nach Translation in die Aminosäuresequenz (588 AS) jedoch keine signifikanten Identitäten zu bekannten Proteinen zeigte, lediglich entferntere Übereinstimmungen zu hypothetischen Proteinen. Daher läßt sich noch keine Funktion zuordnen.

acbJ

Für das Gen acbJ wird kein eindeutiger Genstart gefunden. Etwa 430 bp hinter dem Stopcodon von acbI liegt ein mögliches Startcodon für das Gen acbJ, es kodiert für ein 283 AS langes Protein. AcbJ weist auf der gesamten Länge des Proteins eine signifikante Übereinstimmung von 45% zu einem hypothetischen Protein von S. coeli­ color (SCD78.27C, Länge 280 AS) und ebenfalls gute Ähnlichkeit zu zwei weiteren hypothetischen Proteinen aus demselben Organismus auf. Auch zu anderen hypothetischen Proteinen liegt die Übereinstimmung über die ganze Länge des Proteins zwischen 30% und 40%. Der C-terminale Bereich des Proteins zeigt Über­ einstimmungen mit Phosphoserin-Phosphatasen. Eine Funktion in der Acarbosebio­ synthese ist bisher noch nicht bekannt.

acbQ

AcbQ ist eine Amylomaltase-ähnliche intrazelluläre Transglycosylase. Die Sequenz des abgeleiteten AcbQ Proteins zeigt eine sehr hohe Ähnlichkeit zu MalQ-ähnlichen Proteinen, besonders zu dem Protein aus M. tuberculosis und S. coelicolor. Diese Amylomaltasen sind Bestandteil des Maltosestoffwechsels. Auch hier ist jedoch eine zwar weniger deutliche Abweichung der Sequenzähnlichkeit zu den entsprechenden Proteinen der verwandten Bakterien zu beobachten, so dass eine Funktionsverän­ derung und eine Anpassung an den Acarbose-Stoffwechsel stattgefunden haben dürfte.

asp3.1, asp3.2 und asp3.3

Die abgeleiteten Aminosäuresequenzen der Proteine Asp3.1 und Asp3.2 zeigen eine gute Übereinstimmung untereinander und mit XlnA Proteinen an den C-Termini, Asp3.1 darüberhinaus in der Gesamtsequenz mit Galactocerebrosidasen aus Säugetieren. Alignments von Asp3.1 und Asp3.2 ergaben, dass es sich hierbei um Mitglieder eines seltenen Typs von Acetylxlyanesterasen (AXE) handeln könnte. Diese Proteine bestehen oft aus zwei Domänen, einer katalytischen Domäne und einer Xylan-bindenden Domäne. Beide Domänen sind normalerweise durch eine Linkersequenz miteinander verbunden. Die hier gefundene katalytische Domäne ist eng verwandt mit einer katalytischen Domäne einer Acetylxylanesterase aus dem Pilz Neocallimastix patriciarum, die bislang in anderen Acetylxylanesterasen noch nicht identifiziert worden ist. Dalrymple et al. (1998) hatten drei in diesem Pilz identifizierte AXE's aufgrund des Vorkommens von drei konservierten Blöcken mit den Motiven GDS, GXND und DXXH als erste Acetylxylanesterasen einer Gruppe von Hydrolasen zugeordnet. Auf Sequenzebene zeigen die AXE aus Actinoplanes sp., vergleichbar mit den AXE's aus N. patriciarum keine signifikante Überein­ stimmung zu anderen AXE's. Das Vorkommen der drei konservierten Amino­ säurenblöcke zeigt, das die AXE aus Actinoplanes sp. ebenfalls dieser Gruppe zuzuordnen sind.

Am N-Terminus des Proteins Asp3.2 ist, wie bei Exoenzymen zu erwarten, eine Signalsequenz lokalisiert, die mit 23 AS kürzer ist als die bei Streptomyceten ermittelte durchschnittliche Länge von 35 AS. Mit einer Nettoladung von +2 und einem negativen Rest (D) in Position zwei nach der vermuteten Spaltstelle (Konsensusmotiv A-Xxx-A) war anzunehmen, dass das Protein effektiv sekretiert wird. Mit den von Dalrymple at al. (1998) beschriebenen AXE's zeigt das Protein nur signifikante Übereinstimmung der katalytischen Domänen. Die Linkersequenz zwischen der katalytischen und der Substratbindedomäne beträgt 29 AS, die vermutete Substratbindestelle selbst zeigt eine hohe Übereinstimmung mit XlnA aus S. lividans, XlnA aus S. coelicolor und StxI aus S. thermoviolaceus (je 52% Identität in einer Überlappung von 117 AS im C-Terminus). Der C-Terminus zeigt nicht nur signifikante Ähnlichkeit zu Substratbindestellen von am Xylanabbau beteiligten Proteinen (mit XlnA aus S. lividans wie auch aus S. coelicolor und StxI von S. thermo­ violaceus 52% Aminosäureidentität in einer 117 AS Überlappung im C- terminalen Bereich, sondern auch sehr gute Übereinstimmung mit dem C-Terminus von Asp3.1 (55% Identität in einer Überlappung von 119 AS).

Asp3.2 wurde in S. lividans heterolog expremiert und die Aktivität und Substrat­ spezifität mit entsalzten Überständen getestet. Das Protein katalysiert die Freisetzung von Acetat aus p-Nitrophenylacetat, sowie die Hydrolyse von Acetat aus Xylosetetra­ acetat, wie auch aus Glucosepentaacetat, wenn auch letzteres mit wesentlich niedrigerer Umsatzrate hydrolysiert wird. Der KM-Wert liegt bei 1,5 mM mit dem artifiziellen Substrat p-Nirophenylacetat.

Um zu überprüfen, ob das Enzym Asp3.2 Xylan binden kann, wurde es in Kalium­ phosphatpuffer mit suspendiertem Xylan inkubiert. Nach der Inkubation wurde der Überstand abzentrifugiert und auf Esterase-Aktivität gegenüber p-Nitrophenylacetat hin untersucht. Zudem wurde das Pellet noch zwei mal mit Puffer gewaschen und anschließend versucht, das Enzym mit zwei Waschschritten mit einer 1 M Xylose­ lösung wieder aus dem suspendierten Xylan herauszuwaschen. Asp3.2 bindet fest an Xylan. Die Waschfraktionen zeigten nur geringe Aktivität und auch durch die 2- fache Elution mit 1 M Xylose kann die Aktivität nicht aus dem Xylan entfernt werden, 94% der eingesetzten Aktivität findet man im Pellet.

acbLMNO

Versuche zur (Über-)Expression der von den Genen acbLMNO und acbQ kodierten Proteine (-/+ His-tag Fusionen) in E. coli und S. lividans TK23 wurden unter­ nommen. z. T. konnte eine nachweisbare Expression erzielt werden.

Tabelle 1

Gene im acb-Cluster von Actinoplanes sp. und die Funktionen der Genprodukte

SEQUENZPROTOKOLL

Claims (9)

1. Nucleinsäure der Sequenzen acbZ, acbY, acbX, acbW, acbV, acbU, acbS, acbR, acbP, acbI, acbJ, acbQ, acbK, acbM, acbL, acbN, acbO, acbC, acbB, acbA, acbE, acbD, acbG, acbF, acbH, asp3.1, asp3.2 und asp3.3 und deren Homologe.

2. Genprodukte codiert durch die Sequenzen gemäß Anspruch 1.

3. Verwendung einzelner oder sämtlicher Genprodukte gemäß Anspruch 1 in der Synthese oder Biokonversion von Acarbose oder Vorstufen von Acarbose oder Acarbose-ähnlichen Substanzen mit alpha-Glucosidase-inhibitorischen Eigenschaften.

4. Vektoren enthaltend eine oder mehrere Sequenzen gemäß Anspruch 1.

5. Mikroorganismen transformiert mit einer oder mehreren der Sequenzen aus Anspruch 1.

6. Verwendung der Mikroorganismen gemäß Anspruch 5 bei der Herstellung von Acarbose oder bei der Herstellung von Vorstufen von Acarbose oder bei der Herstellung von Acarbose-ähnlichen Substanzen mit alpha-Glucosidase- inhibitorischen Eigenschaften.

7. Verwendung des kompletten Genclusters oder Teilen davon, um in Actino­ planes sp. SE 50/110 oder in anderen Organismen die Bildung von Acarbose oder Acarbose-ähnlichen Substanzen mit alpha-Glucosidase-inhibitorischen Eigenschaften hervorzurufen oder deren Bildung zu optimieren.

8. Verwendung einzelner Gene oder Kombinationen von Genen aus Anspruch 1 für die Biosynthese von alpha-Glucosidase-Inhibitoren.

9. Verwendung der Aminotransferase AcbV bei der Synthese von dTDP-D-4,6- Didesoxy-4-Aminoglucose.