EP0968294A1 - Acarbose acb-cluster aus $i(actinoplanes) sp. se 50/110 - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft Biosynthesegene aus dem Acarbose-Gencluster aus Actinoplanes sp. SE 50/110, deren Isolierung aus Actinoplanes sp. oder aus Produzenten von Pseudooligosacchariden, Verfahren zur Isolierung dieser Biosynthesegene, die von den genannten Genen kodierten Proteine, die Expression der Proteine in heterologen Wirtsstämmen sowie die Verwendung der Acarbose-Biosynthesegene zur Verfahrensoptimierung.

Description

ACARBOSE ACB-CLUSTER AUS ACTINOPLANES SP. SE 50/110

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Isolierung von weiteren Genen der

Biosynthese und des Stoffwechsels von Acarbose aus Actinomyceten, vorwiegend aus Actinoplanes sp SE 50/1 10 und seinen Mutanten, die mit den bereits bekannten Bio- synthesegenen in einem gemeinsamen Gencluster vergesellschaftet sind, die Nutzung dieser Gene für die Herstellung von Acarbose und Acarbose-Homologen mit Actino- planes sp und anderen Produzenten von Acarbose-verwandten Naturstoffen

(Pseudoohgosaccharide), die Nutzung dieser Gene für die Verfahrensoptimierung durch Methoden des biochemisch-molekularbiologischen "Engineering" sowie die heterologe Expression dieser Gene in anderen Mikroorganismen

Gegenstand alterer Patentanmeldungen (z B DE 20 64 092, DE 22 09 834) ist die

Erkenntnis, daß eine Reihe von Actinomyceten, vor allem die Actinoplanaceen, ohgo- sacchaπdartige Inhibitoren von Glycosidhydrolasen vorzugsweise kohlenhydratspal- tender Enzyme des Verdauungstraktes bilden Als potentester Inhibitor dieser Gruppe ist die Verbindung O-4,6-Dιdeoxy-4-[[lS-(l S, 4R, 5S, 6S)-4,5,6-tπhydroxy-l- (hydroxymethyl)-2-cyclohexen-l-yl]-arruno]-α-D-glucopyranosyl-(l -» 4)-O-α-D- glucopyranosyl-(l→ 4)-D-glucopyranose als Acarbose beschrieben [DE 23 47 782]

Acarbose ist ein potenter α-Glucosidase-Inhibitor, der als orales Antidiabetikum unter dem Markennamen Glucobay^® für die Therapie des Diabetes melhtus eingesetzt wird Die Bildung des Sekundarmetabohten Acarbose erfolgt durch Actinoplanes sp SE 50

(CBS-Nr 791 96) und durch eine natürliche Variante dieses Stammes, SE 50/1 10 (CBS 793 96) [DE 22 09 834], sowie durch deren Selektanten und Mutanten In den genannten Patentanmeldungen, z B in den Beispielen 1 bis 4 der genannten deutschen Patentanmeldung P 22 09 834, wird die Gewinnung eines derartigen α-Glucosidase - Inhibitors beschrieben Mittels molekularbiologischer Methoden lassen sich bestimmte Gene direkt aus einem nicht charakterisierten Genom isolieren, wobei Gensonden - z B ³²P-markιerte DNA- Fragmente - eingesetzt werden, die spezifisch an die gesuchte DNA-Sequenz binden

Weiterhin ist bei Actinomyceten - vor allem Streptomyceten - bekannt, daß bei den bisher untersuchten Sekundarmetabolit-Produzenten die Biosynthesegene auf dem Chromosom, seltener auf einem Plasmid, in einem Cluster nebeneinander angeordnet sind [Hershberger, C L , et al (1989)] Damit lassen sich durch die Verwendung von Gensonden benachbarte, bisher unbekannte Biosynthesegene isolieren, deren Bedeu- tung für die gewünschte Biosynthese dann aufgeklart werden kann Ebenso können mit Hilfe der Gensonden die entsprechenden Biosynthesegene in anderen Mikroorganismen nachgewiesen werden

Aus der Struktur der Acarbose war zu vermuten, daß der Desoxyglucose-Teil des Acarbose-Molekuls entsprechend der Biosynthese von 6-Desoxyzuckerresten verschiedener Antibiotika gebildet wird (z B Aminoglykoside, wie Streptomycin, Kasugamycin, Makrolide, wie Erythromycin, Tylosin, Polyene, wie Amphoteπcin A, B, Nystatin, Anthrazychne, wie Daunorubicin, Glykopeptide, wie Vancomycin) Daher wurde eine Gensonde und heterolog einsetzbare PCR-Pπmerpaare von hoch-kon- servierten Proteinbereichen bekannter dTDP-Glucose-Dehydratase-Enzymen abgeleitet

Die Anwendung der geschilderten Techniken führte bei Actinoplanes sp SE 50/1 10 zunächst zur Isolierung und Sequenzierung eines 2,2 kb ZJα/wHI-DNA-Fragments mit der vollständigen DNA-Sequenz von acbB (codierend für dTDP-Glucose Dehydra- tase) sowie den DNA-Teilsequenzen von acbA (codierend für dTDP-Glucose Syn- thase) und acbC (codierend für eine Cyclase) [EP A 0 730 029 / DE 19507214] Als weitere Enzyme, die an der Acarbose-Biosynthese beteiligt sind, wurde die Acarviosyl Transferase aus Actinoplanes sp SE 50/110 und -Mutanten beschrieben (codiert von acbD) [DE 196 25 269 5] sowie die Acarbose 7-Phosphotransferase (codiert von acbK) [Goeke, K , et al (1996), Drepper, A , et al (1996)] Für die Acarviosyl Transferase wurde die Fähigkeit beschrieben, bei Acarviosin-haltigen Pseudooligosacchariden den jeweiligen Zuckerrest gegen andere Zucker auszutauschen Acarbose 7-Phosphotransferase (Acarbose Kinase) konnte an der Herstellung einer Transportform der Acarbose aus der Zelle beteiligt sein Außerdem wird die Acarbose 7-Phos- photransferase als Teil eines Selbstschutzmechanismus gesehen

Acarbose hemmt stark die cytoplasmatische α-Glucosidase des Produktionsstammes, die durch Acarbose 7-Phosphotransferase phorphorylierte Verbindung dagegen nicht, so daß der zelleigene Substratmetabolismus nicht gestört wird Solche Schutzmechanismen sind für viele Produzenten von Aminocychtol-Antibiotika beschrieben worden

In der vorliegenden Patentanmeldung wird das Cluster der Biosynthesegene sowie anderer Gene des Stoffwechsels der Acarbose aus Actinoplanes sp SE 50/1 10 in einem Abschnitt von 18 kb beschrieben (s Fig 1 - 3) Die Isolierung weiterer Gene des Acarbose-Stoffwechsels erbrachte überraschenderweise, daß die schon bekannten Biosynthesegene, acbABC [EP A 0 730 029 / DE 19507214], mit Genen der Acarbo- semodifikation (Acarviosyltransfer, Phosphorylierung, Gene acbD, acbK), des extrazellularen bzw des cytoplasmatischen Maltodextπn- und Glucose-Stoffwechsels (Enzyme der Familien der α-Amylasen und 4-α-Glucanotransferasen bzw Amylomalta- sen) und des Bindeprotein-abhangigen Zuckertransports (Maltodextπn- oder Disacchaπd-Aufnahme in das Cytoplasma) in einem gemeinsamen Gencluster verge- sellschaftet sind Dieser Befund ist für die biotechnische Produktion der Acarbose in

Hinblick auf die gezielte Optimierung des Verfahrens von erheblicher Bedeutung Denn hiermit ist als ein neuer, die in früheren Patenten aufgezeigten Möglichkeiten erweiternder Gesichtspunkt die Verfügbarkeit wichtiger Teile des gesamten Acarbose-Stoffwechsels für die Methoden des biochemisch-molekularbiologischen "Engineerings" gegeben So können jetzt auch das für die Synthese der Acarbose offensichtlich wichtige Bereitstellen von α-l,4-Glucan- Vorstufen über Starke-/Malto- dextπn-Abbau, die Aufnahme / Abgabe sowie der cytoplasmatische Umbau von Oli- gosacchaπden bis zur Maltosestufe, die Vielfalt des Produktspektrums sowie die möglicherweise für die Acarbose-Ausschleusung und/oder Freisetzung außerhalb der Zelle wichtigen Modifikationen (z B Acarbose-Phosphoryherung) beeinflußt werden Ein Gegenstand der Erfindung ist damit die Isolierung von weiteren Biosynthesegenen aus Actinoplanes sp SE 50/1 10 und ihre Verwendung zur Isolierung der angrenzenden DNA-Bereiche zur weiteren Aufklarung des Acarbose-Genclusters

Die Aufklarung des Acarbose-Genclusters mit Isolierung und Charakterisierung der

Acarbose-Biosynthesegene ist essentiell für eine gezielte Verbesserung des Produktionsprozesses z B durch

Steigerung der Acarbose-Syntheseleistung in Actinoplanes durch Genamplifikation von "Bottleneck"-Enzymen, Verwendung effektiverer Promotoren, Ausschaltung oder Verstärkung von Regulationsereignissen

Verbesserte Bereitstellung von Vorstufen vor allem aus dem Zuckerstoffwechsel mit Optimierung der Transportmechanismen, wie Substrattransport in die Zelle und Ausschleusen von Acarbose oder modifizierten Verbindungen

Eingrenzung des Produktspektrums in Actinoplanes auf das gewünschte Hauptprodukt Acarbose durch Ausschalten unerwünschter Biosynthesewege zu Nebenkomponenten oder durch Ausschalten unerwünschter enzymatischer Abbaureaktionen

Expression in heterologen Wirtsstammen zur Produktionssteigerung durch eine verbesserte Raum- Zeit- Ausbeute, zur Vereinfachung des Aufarbeitungsverfahrens, zur gezielten Einschränkung des Produktspektrums

Verwendung einzelner oder mehrerer Acarbose-Biosynthesegene für die m v/tro-Synthese von Acarbose oder Verbindungen dieser Stoffklasse, ausgehend von synthetisch oder mikrobiell hergestellten Vorstufen Die Erfindung offenbart daher:

Ein rekombinantes DNA-Molekül, das Gene für die Biosynthese von Acarbose und Acarbose-Hσmologen enthält, die im Gencluster gemäß Abbildung 2 angeordnet sind.

Ein rekombinantes DNA-Molekül mit einem Restriktionsenzymschnittstellenmuster gemäß Abbildung 1.

Die vollständige DNA-Sequenz des 18 kb Fragments mit den in Tab. 1 aufgeführten Genen gemäß Abb. 3 sowie die daraus resultierenden Aminosäure-Sequenzen.

Tab 1 Eigenschaften der ct⁾-Gene und der Acb-Genprodukte

die Positionsnummern beziehen sich auf die Basenpaare im Bglll-Sstl-Frag- ment in Fig. 3. In Klammern gesetzt sind Sequenz-Informationen, die entweder noch unvollständig sind oder auf unsichere Leserahmen hindeuten, die Accession No. der Datenbankeintrage sind in Klammern angegeben, AS = Aminosäuren,

Dabei codieren die Gene acbA und acbB mit hoher Wahrscheinlichleit Enzyme der Acarbose-Biosynthese, da sie hohe Sequenzidentitat von AcbA bzw AcbB zu be- kannten bakteriellen dTDP-Glucose Synthasen bzw dTDP-Glucose 4,6-Dehydratasen aufweisen Die Ähnlichkeit der Proteinsequenzen zum jeweils nächsten bekannten Vertreter der beiden Enzymfamihen (vgl Fig 3) liegt weit über derjenigen anderer beliebiger Paare fünktionsidentischer Proteine aus beiden Gruppen Erstaunlich dabei ist, daß AcbA seine nächsten Verwandten unter Streptomyceten-Proteinen hat, wahrend AcbB naher verwandt ist mit verschiedenen RfbB-Proteinen Gram-negativer Bakterien Dieses Phänomen wird aber auch von anderen entsprechenden Streptomv- ceten-Proteinen, z B TylAl und TylA2 aus dem Tylosin-Produzenten Streptomyces fradiae [Merson-Davies u Cundliffe (1994)], gezeigt, die ebenfalls von benachbarten Genen in einem gemeinsamen Gencluster codiert werden

Das Gen acbC codiert ein wahrscheinliches Enzym der Acarbose-Biosynthese, da das Enzym AcbC mit AroB-Proteinen, Dehydrochinasaure-Synthasen, verwandt ist und nach Uberexpression in Streptomyces lividans eine Enzymaktivitat zeigt, die - wie zu erwarten - Heptulosephosphate (z B Sedoheptulose-7-phosphat) zu Produkten umsetzt, die ahnliche Eigenschaften wie Va enon und Va olon autweisen (mögliche Vorstufen der Acarbose-Biosynthese), jedoch nicht identisch mit diesen Verbindungen

Die Gene acbK (Acarbose-7-Kιnase), acbL (Ketozucker oder Zuckeralkohol Oxidoreductase) und acbM (unbekannte Funktion) sowie das acbN-Gen (direkte Verbindung mit den Leserahmen acbL und acbC ist durch überlappende Start-/Stopcodons angedeutet) codieren wahrscheinlich Enzyme der Acarbose-Biosynthese, da sie alle zusammen mit acbC und evtl auch acbQ ein wahrscheinliches Operon (Transkriptionseinheit) bilden und wahrscheinlich translationell gekoppelt abgelesen werden Auch die Funktion einer spezifischen, cytoplasmatisch lokalisierten Acarbose- Kinase (AcbK) und einer möglichen Dehydrogenase (AcbL) sprechen für eine direkte Beteiligung am innerzellularen Acarbose-Stoffwechsel, die Zucker-Dehvdrogenase AcbL konnte dabei an der Vorstufensynthese des C-7 Cyc tols oder der 6- Desoxyhexose, bzw deren Kondensation beteiligt sein Die beiden Gene acbD (Acarviosyl Transferase) [DE 196 25 269 5, Goeke, K , et al (1996), Drepper, A , et al (1996)] und acbE (α-Amylase), die einander gegenüber mit einer gemeinsamen Promotor-Region im Cluster von Actinoplanes sp SE 50/1 10 liegen, und die beide für Enzyme der Amylase-Famihe codieren, deuten darauf hin, daß eine enge Verflechtung der Regulation des Starkeabbaus und der Produktion der

Acarbose besteht Dies wird durch den Befund bestätigt, daß beide Enzyme in Actinoplanes sp bei Wachstum auf Starke als C-Quelle die am stärksten expπmierten extrazellularen Proteine im Kulturuberstand von Actinoplanes sp sind Dies gilt für die αcZ>E-Expressιon unter Kontrolle des eigenen Promotors sogar auch in Streptomy- ces lividans (s Beispiele)

Die Gene acbHFG codieren ein wahrscheinlich extrazellulares Zucker-Bindeprotein, AcbH, und zwei typische Membrankomponenten, AcbF und AcbG, eines bakteriellen Zuckertransporters vom Typ ABC-Importer Sie sind wahrscheinlich am Stoffwechsel der Acarbose durch Aufnahme von Oligo-Maltodextπnen beteiligt oder rezykhsieren

Acarbose als Transportvehikel kurzer Ohgo-α- 1 ,4-Glucane (höhere Homologe der Acarbose) durch Aufnahme in die Zelle An einem solchen Vorgang konnte auch das Amylomaltase-ahn che Genprodukt (AcbQ) des acbO-Gens beteiligt sein

Weiterhin offenbart die Erfindung

Ein Verfahren zur Isolierung von Acarbose-Biosynthesegenen aus Actinomyceten, vor allem aus Actinoplanes, dadurch gekennzeichnet, daß Gensonden verwendet werden, die sich von einem 2,2 kb ßα/wHI-Fragment ableiten Das 2,2 kb Ba Hl -Fragment, das mittels einer Gensonde, die durch PCR-Pπmer gewonnen wurde, von hochkonservierten Proteinbereichen bekannter dTDP-Glucose-Dehydratase-Enzyme abgeleitet wurde, ist in der Patentanmeldung [EP A 0 730 029 / DE 19507214] beschrieben

Ein Verfahren zur Isolierung von Biosynthesegenen von Acarbose-verwandten Na- turstoffen in Actinomyceten (z B für Vahdamycin, Ohgostatine (Trestatin), Adipo- Verfahren zur Steigerung der Acarbose-Syntheseleistung in Actinoplanes durch erhöhte Gendosis für geschwindigkeitsbestimmende B io syntheseenzyme, effektivere Promotoren für geschwindigkeitsbestimmende Biosynthese- enzyme,

Ausschaltung von unerwünschten Regulationsschritten

Ein Verfahren zur Steigerung der Acarbose-Syntheseleistung in Actinoplanes durch Protein Engineering bei den die Acarbose-Synthese limitierenden Biosyntheseschritten oder zur Vermeidung von Abbauprodukten, die durch unerwünschte Ruckreaktionen von Biosyntheseenzymen entstehen.

Ein Verfahren zur Eingrenzung des Produktspektrums in Actinoplanes auf das gewünschte Hauptprodukt durch Ausschalten unerwünschter Biosynthesewege zu Ne- benkomponenten oder durch Ausschalten unerwünschter enzymatischer Abbaureaktionen, wie z B durch eine Inaktivierung des acbD-Gens

Ein Verfahren zur Veränderung von Transport-Mechanismen im Hinblick auf einen verbesserten Transport von Substraten in die Zelle oder ein effektiveres Ausschleusen von Acarbose aus der Zelle.

Ein Verfahren zur Expression in heterologen Wirtsstammen (z B Pseudo-oligosac- charid-bildenden Streptomyceten sowie in anderen Streptomyceten wie Streptomyces lividans, in schnell wachsenden Bakterien wie E. coli oder in Hefen und Pilzen),

zur Erzielung einer Produktionssteigerung durch eine verbesserte Raum- Zeit-Ausbeute, zur Vereinfachung des Aufarbeitungsverfahrens, zur gezielten Einschränkung des Produktspektrums

Ein Verfahren zur Verwendung der Acarbose-Biosynthesegene für die in vitro-Syn- these von Acarbose oder Verbindungen dieser Stoffklasse, ausgehend von synthetisch oder mikrobiell hergestellten Vorstufen

Die Erfindung wird im folgenden detailliert beschrieben Ferner wird die Erfindung durch den Inhalt der Ansprüche bestimmt

Alle gentechnologischen Methoden wurden, wenn nicht anders angegeben, wie in Sambrook et al (1989) durchgeführt

Für das Screening wurden drei verschiedene Gensonden verwendet Sie wurden aus den Plasmiden pAS2, pAS5/7 3 und pAS6/3 isoliert Das Plasmid pAS2 wurde aus E coli DH5α mit Hilfe der "Boiling-Method" oder durch alkalische Lyse präpariert und mittels der Restπktionsendonuklease BamHl hydrolysiert Das resultierende 2,2 kb Ba Hl Fragment wurde isoliert und durch sogenannte "Nick-translation" mit ^j2P- markierten Desoxynukleotiden markiert Dieses radioaktiv markierte Fragment wurde als Gensonde für die Isolierung von Acarbose-Biosynthese-Genen eingesetzt und wird im folgenden als acb-Sonde-II bezeichnet Die zweite Gensonde wurde aus dem Plasmid p AS 5/7 3 isoliert Das Sphl-Sstl Fragment wurde isoliert und wie oben be- schrieben radioaktiv markiert Im folgenden wird diese Gensonde als acb-Sonde-III bezeichnet Die dritte Gensonde wurde aus dem Plasmid pAS6/3 isoliert Das BamHl Fragment wurde isoliert und wie oben beschrieben radioaktiv markiert Diese Sonde bekam die Bezeichnung acb-Sonde-IV

Acarbosebiosynthese-Gene wurden auf zwei Arten wie folgt isoliert 1 ) Chromosomale DNA von Actinoplanes sp wurde mit den Restriktionsenzymen Ssf, Bglll und Pstl hydrolysiert, Gel-chromatographisch getrennt und durch "Southern" -Hybridisierung mit der acb-Sonde-II (Sstl und BgHl- Hydrolyse) bzw. acb-Sonde-III (P -Hydrolyse) nach einer homologen DNA- Sequenz untersucht. Das mit der Gensonde hybridisierende S tl-Fragment hat eine Große von ca.10,7 kb und das 5g//I-Fragment von ca 10 2 kb Das 10,7 kb Ätl-Fragment und das 12 kb .Sg ZI-Fragment wurden aus dem Gel eluiert, in den Vektor pUC18 bzw. pBluescript II KS ligiert und in E.co/i DH5α klo- niert Die resultierenden Plasmide bekamen die Bezeichnung pAS5 (Sstl- Fragment) und pAS6 (5g /I-Fragment) Ein mit dem Ätl-Fragment überlappendes 2,8 kb Rs ll-Fragment, das mit der Gensonde acb-Sonde-III hybridisierte, wurde in den Vektor pUC18 kloniert und mit pMJl bezeichnet

2) Eine GEM 12-Phagen-Genbank genomischer DNA von Actinoplanes sp wurde mit den Sonden acb-Sonde-III und acb-Sonde-IV mittels Plaquehybri- disierung gescreent. Insgesamt wurden mit der acb-Sonde-III 15 Phagen isoliert, mit der acb-Sonde-IV zwei Phagen, die insgesamt ca 38 5 kb kolineare Actinoplanes sp. DNA mit Acarbose Biosynthese-Genen enthalten Die Phagen, die naher charakterisiert wurden, tragen die Bezeichnung 10/3 und 5/4 Aus dem Phagen 10/3 wurde das Plasmid pM l durch eine Hydrolyse mit dem

Restriktionsenzym Pstl und Klonierung eines 2,8 kb .s/l-DNA-Fragments in das Plasmid pUC18 gewonnen. Aus dem Phagen 5/4 wurde durch Hydrolyse mit dem Restriktionsenzym Sstl und folgender Klonierung in pUC 18 (S tlhydrolysiert) das Plasmid pMI9 (N 6,3 kb Fragment) erhalten

Für die Bestimmung der DNA-Sequenz des 10,7 kb S -Fragments (pAS5) von Actinoplanes sp wurden folgende rekombinante Plasmide, ausgehend von dem Vektor pUC18, konstruiert und die Sequenz der inserierten DNA analysiert pAS5 10,7 kb Sstl Fragment aus chromosomaler DNA von

Actinoplanes pAS2 2,2 kb BamHl Fragment aus chromosomaler DNA von

Actinoplanes (siehe Patentanmeldung DE 195 07214) p AS5/ 15 3 , 8 kb Hindlll/Sstl Fragment aus pAS5

(siehe Patentanmeldung DE 196 25 269 5) pAS5/l 5 1 =2,6 kb HindlϊllPstl Fragment aus pAS5 pAS5/l 5 2 =0,75 kb Sall Fragment aus pAS5/l 5 1 p AS 5/15 3 =0,5 kb Sall Fragment aus p AS 5/15 1 pAS5/l 5 4 =0,4 kb Sall Fragment aus ρAS5/l 5 1 pAS5/15 5 =0,35 kb Sall Fragment aus pAS5/15 1 p AS 5/ 15 6 =1 25 kb Pvull Fragment aus p AS 5/ 15 1 pAS5/l 5 7 =0,7 kb PvwII/Hindlll Fragment aus pAS5/l 5 1 pAS5/l 5 9 =0,1 kb Pvull Fragment aus pAS5/l 5 1 p AS5/15 1 1 = 1 , 1 kb KpnVNcol Fragment aus pAS5/ 15 pAS5/l 5 12 =0,9 kb KpnVNcol Fragment aus pAS5/l 5

Mit der PCR-Methode wurden drei DNA-Bereiche amplifiziert und die entsprechenden Fragmente kloniert und sequenziert

pAS5/l 7 =0,46 kb PCR Fragment pAS5/18 =0,26 kb PCR Fragment pAS5/19 =0,27 kb PCR Fragment

pAS5/6 5,4 kb Pstl Fraqment aus dem Plasmid pAS5

Klone, die durch die Enzyme Exonuclease III und Nuklease S 1 ausgehend von dem Plasmid pAS5/6 nach Hydrolyse mit Xhol und Sstl erstellt wurden p AS 5/6 3 - 15 = 5 , 1 kb Insert-DN A p AS 5/6 12-4 = 4,7 kb Insert-DNA pAS5/6 3- 1 8 = 4,3 kb Insert-DNA pAS5/6 6-3 = 4,2 kb Insert-DNA p AS 5/6 9-2 = 3,8 kb Insert-DNA pAS5/6 9-6 = 3,8 kb Insert-DNA pAS5/6 12-6 = 3,2 kb Insert-DNA p AS 5/6 3-6 = 3,0 kb Insert-DNA pAS5/6 15-1 = 2,8 kb Insert-DNA pAS5/6 3-16 = 2,3 kb Insert-DNA pAS5/6 9-l = 1,8 kb Insert-DNA pAS5/6 9-3 = 1,2 kb Insert-DNA pAS5/6 6-l = 0,9 kb Insert-DNA pAS5/6 12-3 = 0,47 kb Insert-DNA pAS5/6 12-2 = 0, 17 kb Insert-DNA

pAS5/3 1,4 kb BamHl Fragment aus dem Plasmid pAS5 pAS5/3 1 = 0 35 kb SphllFspl Fragment aus pAS5/3 pAS5/3 2 = 0 85 kb SphllBamHl Fragment aus pAS5/3 p AS 5/3 3 = 0 55 kb SphllBamHl Fragment aus p AS 5/3

pAS5/4 1,2 kb BamHl Fragment aus dem Plasmid pAS5 p AS 5/5 0,48 kb Sstl/Ba Hl Fragment aus dem Plasmid pAS5 pAS5/7 1,2 kb PstllSstl Fragment aus dem Plasmid pAS5 pAS5/7 1 0,64 kb Pv-.II/_4ccI Fragment aus dem Plasmid pAS5/7 pAS5/7 2 0,54 kb PstllSphl Fragment aus dem Plasmid pAS5/7 ρAS5/7 3 0,67 kb SphllSstl Fragment aus dem Plasmid ρAS5/7 p AS 5/11 0,68 kb BgWHinάlll Fragment aus dem Plasmid pAS5 pAS5/12 0,63 kb BglLLTstl Fragment aus dem Plasmid pAS5 pAS5/13 4,8 kb BamHl Sstl Fragment aus dem Plasmid pAS5 pAS5/16 0,5 kb BamHl Fragment aus dem Plasmid pAS5

Für die Bestimmung der DNA-Sequenz konstruierte Plasmide, die DNA-Fragmente mit Acarbose-Biosynthese-Genen von Actinoplanes sp aus dem Plasmid pAS6 (vgl Beispiel 6) enthalten Die im Plasmid pAS6 klonierte DNA hat ein 6,2 kb Acarbose- biosynthese-Gene enthaltenes ßg/II/Sstl-Fragment mit dem Plasmid pAS5 gemeinsam Für die Sequenzierung des 5,9 kb -5 /II/SstI-Fragments, welches sich an das Plasmid pAS5 anschließt (Fig. 1), wurden folgende rekombinante Plasmide in dem Vektor pUC 18 konstruiert.

pMI6/6 5,9 \ώ Bglll/ Sstl Fragment aus dem Plasmid pAS6 pMI6/4.2 0,5 kb BamHVPstl Fragment aus dem Plasmid pMI6/6 pM 6/4.1 0,36 kb Ba Hl/Pstl Fragment aus dem Plasmid pMI6/6 pMI6/6.2.2 0,5 kb Sall Religand pMJ6/6.2.3 3 , 3 kb Sall Fragment pMI6/6.2.4 1 , 2 kb Sall Fragment pMI6/6.2.5 1 ,0 kb Sall Fragment pMI6/6.2.6 0,7 kb &/I Fragment pMI6/6.2.7 0, 14 kb Sall Fragment pMI6/6.2.8 0, 13 kb Sall Fragment pMI6/8.1 1 , 1 kb ClaV BamHl Fragment pMI6/l 0 1 ,5 kb Pstl/ Sall Fragment

pAS6/3 2,8 kb BamHl Fragment aus dem Plasmid pAS6 pAS6/3.1 1 , 1 kb Hincll Fragment aus dem Plasmid pAS6/ pAS6/3.2 1 ,2 kb Sall Fragment aus dem Plasmid pAS6/3 pAS6/3.3 1,45 kb Pstl Fragment aus dem Plasmid pAS6/3

Für die Bestimmung der DNA-Sequenz des 2,8 kb Pstl-Fragment (pMJ l ) von Actinoplanes sp. wurden folgende Plasmide konstruiert und die Sequenz der Insert- DNA analysiert.

pMJl/1 0,6 kb SphlPstl Fragment aus dem Plasmid pMJl,

Religand nach Sphl Hydrolyse pMJ 1/2 1 ,2 kb Satl'Pstl Fragment aus dem Plasmid pMJ 1 ,

Religand nach Sa Hydrolyse pMJl/3 1 ,4 kb SstlPstl Fragment aus dem Plasmid pMJ 1.

Religand nach Sstl Hydrolyse pMI 1/4.1 0, 9 kb Sall Smal Fragment aus dem Plasmid pMI 1 Für die DNA- Sequenzierung wurde die Methode von Sanger et al. (1977) oder ein davon abgeleitetes Verfahren angewandt. Es wurde mit dem Autoread Sequencing Kit (Pharmacia, Freiburg, Deutschland) in Verbindung mit dem Automated Laser Fluo- reszens (ALF) DNA-Sequenzierungsgerät (Pharmacia, Freiburg, Deutschland) gearbeitet. Geeignete Fluoreszein-markierte pUC reverse sequencing und sequencing Primer wurden käuflich erworben (Pharmacia, Freiburg, Deutschland). Die Sequenz des ca. 18,0 kb Bglll - Pstl Fragmentes ist in Abb. 3 dargestellt. Tab. 1 gibt eine Übersicht über die Eigenschaften der αct Gene und der von ihnen codierten Produkte.

Tab. 2. Sequenzen der Primer für die PCR und die Sequenzreaktion.

Primer für die PCR:

Plasmid pAS5/l 7: Primerbezeichnung Sequenz acbD/El 5' GGCGGCGATTCGGCCTGCGCGG 3¹ acbD/E2 5' GCGGCGATGGCATGCCTGGCG 3'

Plasmid pAS5/l 8: Primerbezeichnung Sequenz acbD3 5' ACCAGGCCGAGGACGGCGCCC 3¹ acbD4 5' AGCGGCATGTGCTTGACGGCG 3'

Plasmid pAS5/19: Primerbezeichnung Sequenz acbD5 5' ACCGGCTCGAACGGGCTGGCACC 3' acbD6 5' CCCTCGACGGTGACGGTGGCG 3' Primer für die Amplifizierung des acbC-Gens:

Die Sequenzbereiche, mit denen Erkennungsstellen für die Restriktionsendonukleasen Ndel bzw. EcoRI konstruiert wurden, sind unterstrichen. Primerbezeichnung Sequenz

AS7 5^'GGAAGCTCATATGAGTGGTGTCG3

AS8 5 CGAGACGGTACATATGCACGCGGATG3'

AS9' 5CCGTCTCGCCCACCCGCATCACC3'

AS-C1' 5^%AGGGAAGCTCATATGAGTGGTGTCGAG3' AS-C2 5'GGTATCGCGCCAAGAATTCCTGGTGGACTG3

Primer für die Sequenzreaktion: Primerbezeichnung Sequenz universal primer 5¹ GTAAAACGACGGCCAGT 3' reverse primer 5' GAAACAGCTATGACCATG 3'

Die N-terminale Sequenzanalyse des AcbΕ-Proteins wurde mit dem Gasphasenpro- teinsequenzer 473 A der Firma Applied Biosystems (Forster City, CA., USA) durchgeführt. Das Standard-Proteinsequenzierungsprogramm Fastblott wurde verwendet. Der Proteinsequenzer, die verschiedenen Programme, die Abbauzyklen sowie das

PTH-Identifikationssystem sind im Handbuch des Sequenzers beschrieben (User's manual protein sequenzing System model 473 A (1989); Applied Biosystems Forster City, CA 94404, USA).

Der Nachweis der PTH- Aminosäuren wurde on-line mit eienr RP-18-Säule (220 mm x 2 mm, 5μ-material) von Applied Biosystems durchgeführt. Die PTH- Aminosäuren wurden mittels eines 50 pMol Standard identifiziert und quantifiziert. Die Daten wurden mit dem Sequenzerdatensystem 610A von Applied Biosystems verarbeitet.

Alle eingesetzten Chemikalien für den Proteinsequenzer waren von Applied Biosystems. Beispiele:

1. Anzucht der E. coli Stämme, Präparation der Plasmid-DNA und Isolierung von DNA-Fragmenten

E coli DH5α wurde in LB-Medium bei 37°C bebrütet Plasmidtragende Bakterien wurden unter Selektionsdruck (Ampicillin, 100 μg/ml) gehalten Die Kultivierung erfolgte auf einem Rundschuttier bei 270 rpm Als Ubernachtkultur (UK) wurden Ansätze bezeichnet, die wenigstens 16 h bebrütet wurden

Für die Praparation von Plasmid-DNA wurden die Zellen aus 1,5 ml einer unter Selektionsdruck bebruteten UK eingesetzt Die Isolierung der Plasmide erfolgte nach der Methode der alkalischen SDS-Lyse [Birnboim, H C , u J Doly (1979)]

Zur gezielten Hydrolyse von Vektor-DNA wurden ausschließlich Restriktionsendonukleasen nach Vorschrift des Herstellers (Gibco BRL, Eggenstein, Deutschland) eingesetzt Zur Restriktion von 10 μg Plasmid-DNA wurden 5 U der jeweiligen Re- stπktionsendonuklease eingesetzt und 2 h bei 37°C inkubiert Um eine vollständige Hydrolyse zu gewährleisten, wurde die gleiche Menge Restπktionsendonuklease ein zweites Mal zugegeben und erneut mindestens 1 h inkubiert

Die gespaltene DNA wurde, je nach Große der DNA-Fragmente, auf 0,5 -1,2 %ιgen horizontalen Agarosegelen elektrophoretisch getrennt Zur Elution wurde das Gelstuck, welches das DNA-Fragment enthielt, mit einem sterilen Skalpell ausgeschnitten und gewogen Die Elution der DNA-Fragmente aus der Agarose erfolgte nach Vorschrift mit dem ETsorb-Kit (Genomed, Bad Oeynhausen, Deutschland) 2. Anzucht von Actinoplanes sp. SE50/110, Präparation, Spaltung der chromosomalen DNA und gelelektrophoretische Trennung

Actinoplanes sp SE50/1 10 wurde bei 30°C in TSB-Medium auf einem Rundschuttier für 3 d bebrütet Die Vorkultur (5 ml) erfolgte bei 240 rpm in Kulturrohrchen, die

Hauptkultur (50 ml) in 500 ml Schikanekolben bei 100 rpm Die Zellen wurden nach der Kultivierung durch Zentπfugation sedimentiert und zweimal in TE-Puffer gewaschen

Die Praparation der Gesamt-DNA erfolgte mit 1,5 - 2 mg Zellen (Frischgewicht) nach der Methode der Phenol/Chloroform-Extraktion [Hopwood, D A , et al (1985)]

Die Hydrolyse von 20 μg chromosomaler DNA wurde mit 10 U des entsprechenden Restriktionsenzyms (Gibco BRL, Eggenstein, Deutschland) für 2 h bei 37°C in dem zugehörigen Puffer durchgeführt Um eine vollständige Hydrolyse zu gewahrleisten, wurde die gleiche Menge Restπktionsendonuklease ein zweites Mal zugegeben und erneut für mindestens 1 h inkubiert

Die gespaltene DNA wurde auf 0,6%ιgen horizontalen Agarosegelen elektrophore- tisch getrennt

Die Elution von DNA-Fragmenten erfolgte wiederum mit dem JETsorb-Kit (s Beispiel 1)

3. Herstellung der acb-Gensonde-II, acb-Gensonde-III und acb-Gensonde-IV

Die nach Beispiel 1 präparierten Fragmente aus pAS2 (s DE 195 07214), pAS5/7 3 und pAS6/3 wurden mit dem "Nick Translation System" des Herstellers Gibco BRL, Eggenstein, Deutschland nach dessen Angaben radioaktiv markiert Hierbei wurden 0,5 - 1,0 μg DNA-Fragment eingesetzt Es wurde [α ²P]dCTP verwendet (3000

Ci/mM, Amersham Buchler, Braunschweig) Anschließend wurde der Ansatz 10 Mi- nuten gekocht (Denaturierung) und sofort zu der Hybridisierungslosung gegeben (s Beispiel 4)

4. DNA-Transfer auf Membranen, DNA-Hybridisierung (Southern- Hybridisierung und Autoradiographie)

Die Übertragung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen auf Membranen erfolgte nach der Methode des "Southern-Transfer" [ Southern, E M (1975)] Die nach Beispiel 2 erhaltenen Agarosegele wurden 20 Minuten in 0,25 M HC1 geschwenkt Die Gele wurden auf 3 Lagen saugfahiges Whatman-Papier 3MM (Whatmann, Maidstone,

GB) gelegt und eine Hybond™-N+Membran (Amersham Buchler, Braunschweig) luftblasenfrei aufgelegt Darauf wurden mehrere Schichten saugfahiges Papier gelegt Auf den Filterstapel wurde ein ca 1 kg schweres Gewicht gestellt Der DNA-Transfer erfolgte durch Durchsaugen von 0,4 M NaOH Nach mindestens 12 h Transferzeit wurden die Nylonfilter mit 2xSSC für 5 Minuten gespult und an der Luft getrocknet

Die Nylon-Filter wurden dann mindetens 2 h bei 68°C in 50-100 ml Prahybπdisie- rungslosung im Wasserbad geschüttelt Dabei wurde die Losung mindestens zweimal gewechselt Die Hybridisierung fand im Hybridisierschrank für mindestens 12 h statt Es wurden 15 ml Hybridisierungslosung, welche die acb-Sonde-II enthielt (s Beispiel

3), eingesetzt.

Die Nylon-Filter wurden anschließend für jeweils 15 Minuten mit 6x Postwash und l x Postwash gewaschen Die Nylon-Filter wurden dann im noch feuchten Zustand mit Frischhaltefolie abgedeckt Die Autoradiographie erfolgte mit Hyperfilm-MP

(Amersham Buchler, Braunschweig) in einer lichtdichten Kassette mit Verstarkerfo- hen bei -80°C für mindestens 16 h 5. Isolierung und Klonierung der Bglll-, Pstl- und Sstl-Fragmente aus der Gesamt-DNA von Actinoplanes sp.

Chromosomale DNA aus Actinoplanes sp wurde mit Bglll, Pstl und Sstl vollständig hydrolysiert, durch Agarose-Gelelektrophorese getrennt und die Sstl-Fragmente der

Lange 9,0 -12 kb, _5g- II-Fragmente der Lange 1 1 - 13 kb und Pstl Fragmente der Lange 2,5-3,5 kb aus der Agarose eluiert (s Beispiel 1) Die eluierten Sstl-Fragmente und Pstl-Fragmente wurden mit Vektorplasmid pUC18, präpariert aus E. coli DH5α, hydrolysiert mit Sstl bzw Pstl ligiert. Die Vektorplasmide wurden zuvor mit alkali- scher Phosphatase (Boehringer, Mannheim) nach Vorschrift des Herstellers behandelt

Die Ligation fand in einem Volumen von 20 μl statt, wobei das Verhältnis von Fragment zu Vektor 3 1 betrug mit 0,01 -0, 1 μg DNA im Ansatz Es wurde 1 U der T4- DNA-Ligase mit dem entsprechendem Puffer (Gibco BRL, Eggenstein, Deutschland) eingesetzt Die eluierten _9g/Η-Fragmente wurden in das Z- mHI-hydrolisierte Vektor- plasmid pBluescript II KS ligiert Die Ligation wurde wie bei den Sstl- und Pstl-

Fragmenten durchgeführt

Transformationskompetente Zellen von E.coh DH5α wurden mit vollständigen Liga- tionsansatzen transformiert [nach Hanahan, D (1983)] Ampicil n-resistente Trans- formanden wurden auf LB-Amp Selektivplatten (100 μg/ml) übertragen

6. Identifizierung von Klonen, welche das 10,7 kb Sstl-Fragment, 12 kb ßg/π-Fragment, 2,8 kb Psrt-Fragment und das 6,3 kb Sstl Fragment aus dem Acarbose-Biosynthesecluster enthalten

Ampicillin-resistente Transformanden wurden auf das Vorhandensein des 10,7 kb Sstl- Fragments und 12 kb P /II-Fragments, das mit der acb-Sonde-II hybridisiert, untersucht eweils zehn dieser Klone wurden auf einer Selektivplatte ausgestrichen, über Nacht bebrütet und mit 3 ml LB-Medium von der Platte gewaschen Es wurde dann aus 20 solcher Zehner-Pools die Plasmid-DNA isoliert [nach Birnboim, H C , u J

Doly (1979)] Um die klonierten Sstl-Fragmente aus dem Polylinker zu entfernen, wurden die 20 verschiedenen Plasmidpraparationen mit den Restriktionsendonukle- asen EcoRI und Hinάlll , bzw Sstl und Hwdlll hydrolysiert Die Restriktionsansatze wurden dann auf einem 0,6% Agarosegel elektrophoretisch getrennt und die DNA mittels Southern-Transfer aus dem Agarosegel auf einen Nylon-Filter übertragen (s Beispiel 4) Die Hybπdisierung erfolgte wiederum mit der acb-Sonde-II (s Beispiel 4) e einer der Pools reagierte positiv mit der acb-Sonde-II und wurde in die zehn Einzelklone geteilt Deren Plasmide wurden ebenfalls isoliert und der oben beschriebenen Prozedur unterworfen Die hybridisierenden Plasmide wurden mit pAS5 bzw pAS6 bezeichnet Sie enthalten ein 10,7 kb Ss/I-Fragment (pAS5) bzw ein 12 kb /II-Fragment (pAS6)

Der rekombinierte Phage 10/3 wurde mit Pstl hydrolysiert, die DNA auf einem horizontalen Agarosegel und das 2,8 kb Pvtl Fragment aus der Matrix eluiert (s Beispiel 1 ) und in den Vektor pUC18 ligiert Das rekombinante Plasmid bekam die Bezeichnung pMH und wurde ιn £ coli DH5α transformiert

Der rekombinante Phage 5/4 wurde mit Sstl hydrolysiert, die DNA auf einem horizontalen Agarosegel getrennt und das 6,3 kb Sstl Fragment aus der Matrix eluiert (siehe Beispiel 1) und in den Vektor pUC18 ligiert Das rekombinante Plasmid bekam die Bezeichnung pMJ9 und wurde in E coli DH5α transformiert

7. Herstellung der GEM12-Genbank und Isolierung von rekombinanten Phagen, die Acarbose-Biosynthese-Gene enthalten und Präparation der Phagen-DNA.

Chromosomale DNA aus Actinoplanes sp wurde mit Stπ.3AI partiell hydrolysiert

Hierfür wurde 50 μg chromosomale Acfinoplanes-DNA mit 0,015 U „S ./3AI für 30 mm bei 37°C inkubiert Die Enzvmreaktion wurde durch Extraktion mit Phenol Chloroform und Ethanolprazipitation [nach Sambrook et al (1989)] gestoppt Die weitere Behandlung der DNA-Fragmente und die Ligation mit Phagenvektor GEM12 erfolgte nach Angabe des Herstellers (Promega Heidelberg) Die in vitro Verpackung des Ligationansatzes wurde mit dem „DNA packaging kit" von Boehπnger (Mannheim) durchgeführt Die Phagen wurden in E coli LE392, nach der bei Sam- brook et al. (1989) beschriebenen Methode vermehrt Die Phagen mit Acarbosebio- synthese-Genen wurden durch Plaquehybridisierung (nach Sambrook et al 1989) mit den Gensonden-acb-HI und -acb-IV identifiziert Die Phagen-DNA, die Acarbose- biosynthese-Gene enthielt, wurde aus Phagen, die auf E. coli LE392 vermehrt wurden, nach Sambrook et al. (1989) präpariert

8. Polymerase-Ketten-Reaktion

Die PCR dient der in vitro Vermehrung ausgesuchter DNA Bereiche [Mullis, K.B , u F A Falloona (1987)]. Es wurde für alle Reaktionen die Taq-DNA-Polymerase nach Angaben des Herstellers (Gibco BRL, Eggenstein) in 25 Reaktionszyklen eingesetzt Die Ansätze enthielten zur Unterdrückung möglicher Sekundarstrukturen bei GC- reicher DNA 5 % Formamid Das Volumen betrug 100 μl wobei 50 pmol je Pπmer und 200 μM dNTP^'s eingesetzt wurden Nach einer einleitenden fünfminutigen Denaturierung der DNA bei 95 °C wurden 2,5 U der temperaturstabilen DNA-Polymerase in einem "hot-start" den Ansätzen zugefügt Die Primerverlängerung erfolgte bei 72 °C und die Denaturierung der DNA am Anfang jedes Zyklus erfolgte bei 95 °C für 1 Min Die Reaktionen wurden in einem Biometra Thermocycler (Gottingen) durchgeführt

Tab 3 Protokolle für die PCPv, um DNA-Fragmente aus dem Acarbose-Cluster zu amplifizieren

Die Bezeichnung der rekombinanten Plasmide, die die entsprechenden Fragmente enthalten, sind aufgeführt

9. Subklonierung des Plasmids pAS5

Ausgehend von dem Plasmid pAS5 wurden mehrere Subklone erstellt, um die Sequenz der Doppelstrang-DNA aufzuklaren

pAS5/6 Das Plasmid pAS5 wurde mit dem Restriktionsenzym Pstl hydrolysiert, Gel- elektrophoretisch (0,7%igen Agarosegel ) aufgetrennt, das 5,4 kb Pstl-Fragment aus dem Gel eluiert und in pUC 18 (hydrolysiert mit Pstl) in E. coli DH5α kloniert

pAS5/3. pAS5/4. pAS5/13. pAS5/16 Das Plasmid pAS5 wurde mit dem Restriktionsenzym BamHl hydrolysiert und Gel-elektrophoretisch aufgetrennt Die Fragmente hatten die folgende Große

1.4 kb BamHl Fragment 1,2 kb BamHl Fragment 2,3 kb BamHl Fragment

0,5 kb BamHl Fragment 0,45 kb BamHl Fragment

7.5 kb BamHl Fragment (= 4,8 kb BamHl Sstl Fragment aus Actinoplanes DNA ligiert mit pUC 18)

Die für die Subklonierung vorgesehenen Fragmente mit der Große von 1,4 kb und 0,5 kb wurden aus dem Gel eluiert (s Beispiel 1) Für die Klonierung wurde der Vektor pUC 18 mittels des Restriktionsenzyms BamHl wie unter Beispiel 1 beschrieben präpariert Die Ligationen wurden wie unter Beispiel 5 beschrieben durchgeführt Das 0,5 kb Fragment wurde in den präparierten pUC 18 ligiert, und es entstand der Subklon pAS5/16 Der Subklon pAS5/3 entstand nach der Ligation des 1 ,4 kb Fragments mit dem präparierten pUC 18 Der Subklon pAS5/4 entstand nach der Ligation des 1 ,2 kb Fragments mit dem Vektor pUC18 Der Subklon pAS5/13 entstand durch Rehgation des 7,5 kb BamHl Fragments

PAS5/5. PAS5/7, pAS5/U. PAS5/12 Das Plasmid pAS5 wurde mit den Restriktionsenzymen BamHl u Sstl, Pstl u. Sstl, Bglll u Pstl sowie Bglll u Hindill hydro- lysiert Die Restπktionsansatze wurden in einem l,2%ιgen Agarosegel getrennt Die entsprechenden Fragmente wurden aus dem Agarosegel eluiert und in pUC 18 (hvdrolysiert mit BamHl u Sstl, Pstl u Sstl, BamHl u Pstl oder BamHl u Hmάlll) in E coli DH5α klomert Der Subklon pAS5/5 enthalt das 0,48 kb Sstl BamHl Frag- ment, der Subklon pAS5/12 das 0,63 kb BglW Pstl Fragment und der Subklon pAS5/l 1 das 0,68 kb BgllllHinάlll Fraqment

pAS5/15 1 1. pAS5/15 12 Das Plasmid p AS 5/ 15 wurde mit den Restriktionsendonukleasen Ncol und Kpnl hydrolysiert Die dadurch entstandenen 0,9 kb Ncol Kpnl u 1, 1 kb Ncol/Kpnl Fragmente wurden aus einem l,2%ιgen Agarosegel eluiert (s

Beispiel 1 ) und in den Vektor pUCBM21 (Boehπnger, Mannheim) (hydrolysiert mit Ncol Kpnl) in E coli DH5α klomert, und es entstanden die Subklone pAS5/15 12 (0,9 kb Fragment) und pAS5/15 1 1 (1, 1 kb Fragment)

10. Subklonierung der Plasmide pAS6, pMJ 6/6 und des Phagen 5/4

pMJ6/6 Das Plasmid pAS6 wurde mit der Restπktionsendonuklease Sstl hvdrolysiert (unter Ausnutzung der Restπktionsschnittstelle des Vektors) und ein 5,9 kb Sstl Fragment aus dem Agarose-Gel eluiert und mit dem Plasmid pUC 18 ligiert L coli DH5α wurde mit dem rekombinanten Plasmid transformiert

pMI6/4 1 und pMJ6/4 2 Das Plasmid pMI6/6 wurde mit den Restπktions-endo- nucleasen BamHl und Pstl hydrolysiert, und ein 0,36 kb BamHl Pstl- sowie ein 0,5 kb ßαwHI/Pstl-Fragment wurden aus dem Agarose-Gel eluiert und mit dem Plasmid pUC18 ligiert E coli DH5α wurde mit den rekombinanten Plasmiden transformiert

pMI6/6 2 2. pMI6/6 2 3. pMI6/6 2 4, pMJ6/6 2 5, pMJ6/6 2 6 pMJ6/6 2 7, pMI6/6 2 8 das Plasmid pMI6/6 wurde mit der Restπktionsendonuclease Sall hydro- lysiert und ein 3,3 kb- Fragment, ein 1,2 kb Fragment, ein 1,0 kb- Fragment ein 0 7 kb-Fragment, ein 0, 14 kb-Fragment und ein 0, 13 kb- Fragment wurden aus dem Agarose- Gel eluiert und mit dem Plasmid pUC18 ligiert E coli DH5α wurde mit den rekombinanten Plasmiden transformiert Das Plasmid pMJ6/6 2 2 wurde durch Hydrolyse und folgende Re gation erhalten

pMI6/8 1 das Plasmid pMI6/6 wurde mit den Restriktionsenzymen C/al und BamHl hydrolysiert und ein 1, 1 kb Fragment aus einem Agarosegel eluiert und mit dem

Plasmid pBluescπpt II KS ligiert E coli DH5α wurde mit dem rekombinanten Plasmid transformiert

pMI6/10 Das Plasmid pMI6/6 wurde mit den Restriktionsenzymen Pstl und Sall hydrolysiert und ein 1,5 kb Fragment aus einem Agarosegel eluiert und mit dem

Plasmid pUC18 ligiert E coli DH5α wurde mit dem rekombinanten Plasmid transformiert

pAS6/3 Das Plasmid pAS6 wurde mit der Restπktionsendonuclease BamHl hvdroly- siert und ein 2,8 kb BamHl Fragment aus dem Agarose-Gel eluiert, mit dem Plasmid pUC 18 ligiert und in E coli DH5α transformiert

pAS6/3 1 Das Plasmid pAS6/3 wurde mit der Restπktionsendonuclease Hi cll hvdrolysiert und ein 1, 1 kb Fragment in pUC18, hydrolysiert mit Hincll, ligiert und in L coli DH5α klomert

pAS6/3 2 Das Plasmid pAS6/3 wurde mit der Restπktionsendonuclease Sall hvdrolv- siert, ein 1,2 kb Fragment in pUC18, hydrolysiert mit Sall, ligiert und in L coli DH5α klomert

pAS6/3 3 Das Plasmid pAS6 wurde mit der Restπktionsendonuclease Pstl hydrolv- siert, ein 1,45 kb Fragment aus dem Gel eluiert und mit pUC18 ligiert L coli DH5α wurde mit dem rekombinanten Plasmid transformiert 11. Subklonierung des Plasmids pMJl

pMJl/1 Das Plasmid pMJl wurde mit der Restπktionsendonuklease Sphl hydrolysiert und ein 3,3 kb S M-Fragment (0,6 kb Sphl/Pstl Fragment ligiert mιtpUC 18) aus dem Agarosegel eluiert Dieses Fragment wurde re giert und in E coli DH5α klomert

pM l/2 Das Plasmid pMJl wurde mit der Restπktionsendonuklease Sall hydrolysiert und ein 3,9 kb Sall -Fragment (1,2 kb Sall/Pstl Fragment ligiert mit pUC18) aus dem Agarosegel eluiert Dieses Fragment wurde rehgiert und in E coli DH5α klomert

pMJl/3 Das Plasmid pM l wurde mit der Restπktionsendonuklease Sall hydrolysiert und ein 4, 1 kb Sstl/Pstl-Fragment (1,4 kb SstllPstl Fragment ligiert mit pUC 18) aus dem Agarosegel eluiert Dieses Fragment wurde rehgiert und in E coli DH5α klomert

pMJl/4 1 Das Plasmid pMJl wurde mit der Restπktionsendonuklease Sall hvdrolysiert und ein 0,9 kb SaWSmal Fragment aus dem Agarose-Gel eluiert und mit dem Plasmid pUC 18 ligiert Das rekombinante Plasmid wurde in E coli DH5α transformiert

12. Herstellung von Subklonen aus pAS5/6

Die Herstellung der pAS5/6-Subklone erfolgte mit dem „double-stranded Nested Deletion Kit" (Pharmacia, Freiburg, Deutschland) 10 μg pAS5/6 DNA wurde wie in Beispiel 1 beschrieben präpariert und mit je 10 U Xhol und Ss/I hydrolysiert Die anschließende Inkubation mit Exonuklease III erfolgte nach Herstellerangaben für insgesamt 20 min In Abstanden von 5 min wurden dem Reaktionsansatz Teilmengen entnommen, die einer DNA-Menge von ca 2,5 μg DNA entsprachen Die Behandlung mit S l -Nuklease zur Herstellung icht-uberlappender DNA-Enden erfolgte für 30 min bei 20 °C nach Herstellerangaben Diese DNA-Molekule wurden mit T4-Lιgase rehgiert und in E coli DH5α klomert 13. DNA-Sequenzierung von Acarbose-Biosynthese-Genen aus Actinoplanes sp.

Es wurden die unter Beispiel 8 bis 1 1 beschriebenen Plasmide sequenziert In die Se- quenzierungsreaktion wurden 6 - 8 μg Plasmid-DNA aus einer Praparation (s Beispiel 1 ) eingesetzt Die Sequenzierreaktion wurde mit dem Auto-Read-Sequenzing- Kit (Pharmacia, Freiburg, Deutschland) durchgeführt Hierbei kam das Standardprotokoll zur Sequenzierung von dsDNA zur Anwendung Um die Auswertung der Nukleotidsequenz mit dem A L F (automatisierter Laser Fluoreszens-(DNA)-Se- quenzierer) zu ermöglichen, wurden als Startermolekule für die Sequenzreaktion die

Fluorescein-markierten universellen und reversen Sequenzier-Pπmer verwendet (s Tab 2) Zur Herstellung des Gels wurden 8 ml Hydro Link Long Ranger (Serva Heidelberg), 33,6 g Harnstoff, 8 ml lOx TBE-Puffer, ad 80 ml mit H₂0 vermischt, steπlfiltπert und 1 Minute entgast Die Polymerisation wurde durch Zugabe von 350 μl 10% (w/v) Ammoniump er sulfat und 40 μl N,N,N',N', Tetramethylethylendiamin eingeleitet Die Losung wurde in eine Gelform (50x50x0,05 cm) gegossen Die Elektrophorese erfolgte bei 38 W und einer konstanten Temperatur von 45°C Als Laufpuffer diente lx TBE-Puffer Die Verarbeitung der gemessenen Fluoreszenz zu einer DNA-Sequenz erfolgte über einen angeschlossenen Computer (Compaq 386/20e), der auch zur Steuerung der Elektrophoreseeinheit diente (Programm A. L F Manager 2 5

Pharmacia, Freiburg)

14. Transformation von S. lividans

Die Protoplastierung und Transformation von S lividans TK23 und 1326 erfolgte nach der Methode von Babcock und Kendπck ( 1988), wobei die Zellen in TSB-PEG 8000 angezogen wurden 15. Überexpression von AcbC

15.1 Überexpression von AcbC in E. coli

Die DNA-Sequenz des acbC-Gens zeigt zwei mögliche Translation-Startpunkte für

AcbC Obwohl Startpunkt 1 aufgrund einer signifikanteren Ribosomenbindestelle den wahrscheinlichen Start von AcbC darstellt, wurden beide möglichen AcbC-Proteine uberexpπmiert Dazu wurden die Plasmide pETl la und pET16b (Novagen, Heidelberg) für eine Expression in E coli genutzt Um einen optimalen Translaüonsstart für die Expression zu gewährleisten, sollte das ATG Start-Codon, mit passendem Abstand zu einer E coli ahnlichen RBS, der pET- Vektoren genutzt werden Dazu ist es notwendig, eine ΛWel-Erkennungssequenz am Start-Codon von acbC zu konstruieren Es wurden die O gonucleotide AS7 (Sequenzposition 6617) und AS8 (Sequenzposition 6638) für die Synthese einer ΛWel-Erkennungsstelle an den beiden möglichen Start-Codons eingesetzt Das O gonucleotid AS9 bindet 66 bp stromabwärts von einer BamHl Erkennungssequenz an der Sequenzposition 6877 an die DNA Mit der PCR-Methode (s Beispiel 8) wurden zwei DNA-Fragmente amplifiziert, die für eine Expression der beiden möglichen AcbC Proteine genutzt wurden Die Anlagerung der Pπmer erfolgte für 40 Sek bei 45 °C, und die Pπmerverlan- gerung fand in 30 Sek statt Die beiden amp fizierten DNA-Fragmente wurden mit den Restπktionsendonucleasen Ndel und BamHl hydrolysiert und in die Vektoren pETl la und pET16b entsprechend ligiert Aus dem rekombinanten Plasmid pAS2 [EP A 0 730 029 / DE 19507214] wurde das 2,2 kb ÄαwHI-Fragment isoliert und über die _5_7mHI-Erkennungsstelle mit den Monierten PCR-Fragmenten fusioniert Nachdem die Orientierung des 2,2 kb PαmHI-Fragments überprüft wurde, lag das vollständige acbC Gen in den Expressionsvektoren vor Die Expressionsvektoren bekamen die Bezeichnung pAS8/l - pAS8/4 (Fig 4) Zusätzlich befindet sich der vollständige acbB Leserahmen (in entgegengesetzter Orientierung) und der Anfang des acbA Gens auf der Monierten DNA in den Expressionsvektoren In IPTG-indu- zierten E coli BL21pLys-Kulturen konnte jeweils ein zusätzlich expπmiertes Protein identifiziert werden Die Große der uberexpπmierten AcbC Proteine ist in Tab 4 dargestellt edoch wurden alle Proteine in Form unlöslicher "inclusion bodies" gebildet Tab 4 Die Struktur der AcbC-Expressionsvektoren für die Expression in E coli

15.2 Überexpression von AcbC in S. lividans 1326

Das AcbC Protein wurde in S lividans 1326 mittels des Plasmidvektors pIJ6021 [Takano, e , et al (1995)] expπmiert Es wurde mittels der PCR-Methode [Mulhs u Falloona, (1987)] ein Fragment aus chromosomaler DNA amplifiziert, das ausschließlich den kodierenden Bereich des acbC-Gens umfaßt Für die PCR wurden die OHgonucleotide AS-Cl und AS-C2 eingesetzt, wobei mit Hilfe des Pπmers AS-C l (Sequenzposition 6089) eine Ndel Erkennungssequenz am Start-Codon 2 des acbC- Gens konstruiert wurde Das O gonucleotid AS-C2 bindet an Sequenzposition 7882 und wurde genutzt, um eine EcoRI-Erkennungssequenz zu konstruieren Die Anlagerung der Pπmer erfolgte in 20 Sek bei 50 °C, und die Pπmer wurden in 40 Sek ver- langert Das so erhaltene acbC DNA-Fragment wurde zuerst in den Vektor pUC18 "blunt-end" klomert und die Richtigkeit der DNA-Sequenz nach der PCR überprüft Dieses rekombinante Plasmid mit dem klonierten acbC-Gen bekam die Bezeichnung pAS8/5 1 Das Plasmid pAS8/5 1 wurde mit den Restπktionsendonucleasen Ndel und EcoRl hydrolysiert, die DNA auf einem Agarosegel getrennt und aus der Matrix elu- lert Das so präparierte «cAC-Fragment wurde in den Vektor pIJ6021 ligiert Das rekombinante Expressionsplasmid bekam die Bezeichnung pAS8/7 2 (Fig 5) Protoplasten von S lividans 1326 wurden mit dem Plasmid pAS8/7 2 transformiert Mit dem so erhaltenen Klon konnte das AcbC Protein in Thiostrepton induzierten Kulturen in loslicher Form uberexpπmiert werden (Fig 6) 16. Überexpression von AcbE in S. lividans TK23

Das acbE-Gen konnte aus dem Plasmid pAS5/6.9-6 mittels einer Hydrolyse mit den Restriktionsendonucleasen EcoRI und Hmdlll gewonnen werden. Nach Trennung der DNA auf einem Agarose-Gel und Elution des 3,8 kb EcoRI/HwdIII Fragments aus der Matrix wurde dieses acbE Fragment entsprechend in den Vektor pUWL219 ligiert [J. Wehmeier, U.F.. (1995)]. Für eine spätere Expression von AcbE in S. lividans sollte in diesen Vektoren eine mögliche Promotor-Sequenz auf dem 200 bp großen "upstream"-Bereich genutzt werden (s. Tab. 5). Das rekombinante Plasmid bekam die Bezeichnung pASl l (Fig. 7).

Tab. 5: Der intercistronische Bereich zwischen den Genen acbE und acbD.

Inverted repeat (IR) und direct repeat (DR) Sequenzen, die an einer Regulation beteiligt sein könnten, sind unterstrichen.

<- CGT GGA CCC TCT CTC GCG ATC GCT GGG ACG CTA GCC CGG CGG GAG ACG TGC CCG CAA GAΛ AcbE GCA CCT GGG AGA GAG CGC TAG CGACCC TGC GAT CGG GCC GCC CTC TGC ACG GGC GTT CTT

IR 1 CTT GCT GTTITAGCAAGAAGTTTC AGAACC GGG ACG GCA CGC TGT AGC CCAGAT CΛT AGA

GAA CGACAAAAT GCT TCT TCA AAG TCT TGG CCC TGC CGT GCG ACA TCG GGT CTA GTΛ TCT

Hind III IR 2

TAC TTAAAG CTC TGC GCA AGC TTA GGG TTG AAG TGG CGG TGA TGC ATC CAT CAC TGT ATG ATG AAT TTC GAG ACG CGT TCG AAT CCC AAC TTC ACC GCC ACT ACG TAG GTA GTG ACA TAC

IR 3 DR1

CGC ATC TGA ATG ACG TCT TCT GCA AGTTCT TGC AGC GGT CTC CGG GCC CTG CCC TTC CTC GCG TAG ACT TAC TGC AGA AGACGT TCAAGA ACG TCG CCA GAG GCC CGG GAG GGG AAG GAG

GTC ATC CCT TCACAAGGAGAA GCT C AcbD CAG TAG GGA AGT GTT CCT CTT CGAG →

Protoplasten von S. lividans TK23 wurden mit dem Plasmid pASl 1 transformiert. In den Überständen aus MD 50-Kulturen war sowohl in den S. lividans TK23/pASl 1 als auch in den Actinoplanes sp. Ansätzen ein extrazelluläres Protein mit der Größe von

110 kDa zu erkennen (Fig. 8). Diese Größe entspricht dem Molekulargewicht des von acbE abgeleiteten Proteins. Die Identität dieser Proteine wurde durch entsprechende Enzymtests (s Beispiel 19 2) und die Sequenzierung der N-termmalen Aminosäuren (s Beispiel 18) nachgewiesen In dem Überstand aus der Kontroll-Kultur S. lividans TK23/pUWL219 in MD 50-Medium konnte kein entsprechendes Protein nachgewiesen werden Daher ist es wahrscheinlich, daß die mögliche Promotorsequenz (Tab 5) "upstream" vom acbE-Gen für die Expression von AcbE in den S. lividans/pAS 1 1

Kulturen in MD 50-Medium verantwortlich ist

17. Gelelektrophoretische Darstellung von Proteinen

Die denaturierende Trennung von Proteinen in SDS-Polyacrylamidgelen und deren

Färbung mit dem Coomassie-Farbstoff erfolgte nach der Methode von Lugtenberg (1975) Je nach Ansatz wurden 8 %ige oder 11 %ige Gele verwendet Gelzusammensetzung ( 11 %iges Gel)

Trenngel Sammelgel

Losung A* 8,0 ml

Losung B* 0,64 ml

APS (2 mg/ml) 0,8 ml 0, 15 ml

10 % (w/w) SDS 0,64 ml 0,064 ml

0,75 M Tris/HCl pH 8,8 16 ml

0,25 M Tris/HCl pH 6,8 3,2 ml

A dest 6,56 ml

TEMED 25 μl 10 μl

siehe Puffer und Losungen

Die Elektrophorese erfolgte entweder mit der SERVA Blue- Vertical 100/C Apparatur (Gelform, 80 x 100 x 0,75 mm) oder mit der Renner-Twin-Vertical- Apparatur (Gelform, 180 x 170 x 1 mm)

Die Bestimmung der Proteinkonzentration der zu analysierenden Proben erfolgte mit dem Protein- Assay (BioRad, München), wobei mit BSA eine Eichgerade erstellt wurde Als Standard für die Molekulargewichte der getrennten Proteine dienten der "VILL Dalton-Marker" (14,2 kDa - 66 kDa) und der "High Molecular Weight Standard" (29 kDA - 210 kDa) von Sigma (Deisenhofen)

18. Bestimmung der N-terminalen Aminosäuresequenz

Es wurde die N-terminale Aminosauresequenz des AcbE Proteins vergleichend aus Actinoplanes sp und dem Klon S. lividans TK23/pASl 1 bestimmt Dazu wurden 50 ml Kulturen in MD 50-Medium für drei Tage bebrütet Die Zellen wurden durch Zentrifügieren entfernt und die Kulturuberstande für 12 h gegen Puffer (5 mM

Tris/HCl pH 7 5, 1 mM CaCl₂) bei 4 °C dialysiert Anschließend wurden die Überstände in 48 h gefriergetrocknet und in 1,5 ml Probenpuffer aufgenommen Die so präparierten Kulturuberstande wurden in einer SDS-PAGE mit der Renner- Twin- Vertical- Apparatur (Gelform, 180 x 170 x 3 mm) getrennt Um eine möglichst gute Trennung des AcbE Proteins von anderen extracellularen Proteinen zu gewahrleisten, wurde ein Gradientengel (5 % — » 10 %) eingesetzt. Der Transfer der Proteine aus dem SDS-Polyacrylamidgel auf eine Polyvinylfluorid (PVDF) Membran (Amersham Buchler, Braunschweig) erfolgte in einem halbtrockenen elektrophoretischen Verfahren mit einer Fast-Blott B33-Apparatur (Biometra, Gottingen) nach Vorschrift der Hersteller Der Transfer erfolgte für 45 Min mit 250 mA Als Transferpuffer diente

1 2 verdünnter Laufpuffer (s Puffer und Losungen) Die Membranen wurden 30 Min gefärbt und mit Entfarbelosung (s Puffer u Losungen) entfärbt Zur Bestimmung der N-terminalen Aminosauresequenz wurde das Blottstuck vor der Sequenzierung zweimal mit je 100 μl 50 %igem Methanol gewaschen, um überschüssige Salze zu entfernen Nach dem Trocknen wurde die Sequenzanalyse mittels Blottcartridge sowie eines mit Polybren vorbehandelten Filters durchgeführt Für die Sequenzanalyse wurde der Fastblottzyklus verwendet Das Ergebnis ist in Tab 6 dargestellt Tab 6 Die Ergebnisse der Sequenzierung der N-terminalen Aminosauresequenz des AcbE Proteins aus Actinoplanes sp und dem Klon S. //v/- -ώtts TK23/pASl l

19. Bestimmung von Enzym-Aktivitäten

19.1. Bestimmung der Valiolon-Synthase Aktivität

Für die Uberexpression von AcbC wurden 10 ml YEME-Medium (50 μg/ml Km) mit einer Sporensuspension von S. lividans 1326/pAS8 7 2 beimpft Nach ein- bis zweitägiger Kultivierung befanden sich die Kulturen in der frühen logarithmischen Wachstumsphase Zu diesem Zeitpunkt wurden die Kulturen mit 7,5 μg/ml Thiostrepton induziert Die Kulturen wurden 20 h nach der Induktion geerntet Die sedi- mentierten Zellen wurden in 1,5 ml kaltem Aufschlußpuffer (s Puffer und Losungen) aufgenommen und schonend mit Ultraschall aufgeschlossen Durch eine 30 minutige Zentrifügation bei 15 000 g und 4 °C wurden die Zelltrummer entfernt Durch eine Dialyse (12 h) gegen 2,5 Liter Aufschlußpuffer bei 4 °C wurde der für den Enzymtest notige AcbC-Extrakt hergestellt Dieser Extrakt konnte für zwei Monate bei -20 °C gelagert werden, ohne merklich an Aktivität zu verlieren Der Proteingehalt des Extraktes wurde mit dem Protein- Assay (BioRad, München) bestimmt und 15 μg in einer SDS-PAGE analysiert (Fig 6) Der Enzymtest wurde in einem 20 mM P-Puffer (pH 7,5) mit 40 μM CoCl₂ bei RT für 2 h durchgeführt Es wurden 20 μg Gesamt- Protein aus dem AcbC-Extrakt und 8 mM Sedoheptulose-7-Phosphat in dem Enzym- test eingesetzt Zusatzlich enthielt der Reaktionsansatz 2 mM NaF, um unspezifische

Phosphatasen in dem Extrakt zu hemmen Das Reaktionsvolumen betrug 100 μl Die Auswertung erfolgte über eine DC auf Kieselgelfolien mit Butanol/Ethanol H₂O (9 7 4) als Laufmittel, wobei 25 μl aus einem Reaktionsansatz analysiert wurden Durch Besprühen der DC-Folien mit Cer-Reagenz (s Puffer und Losungen) und an- schließender 15 minütiger Inkubation bei 90 °C im Trockenschrank konnten die organischen Verbindungen sichtbar gemacht werden Als Referenzsubstanz diente ein Gemisch aus Valienon und Valiolon (Prof. H G Floss, Seattle)

Durch das in S. lividans exprimierte AcbC Protein konnte Sedoheptulose-7-Phosphat spezifisch umgesetzt werden (Fig. 9) Allerdings zeigte das Reaktionsprodukt ein geringfügig anderes Laufverhalten in der DC als der Valienon-Naliolon-Standard Eine Verminderung der Wanderungsstrecke des Reaktionsproduktes auf der Kieselgel-Folie durch den Reaktionspuffer konnte ausgeschlossen werden (Fig 9, Spur 5)

19.2. Bestimmung der α-Amylase Aktivität

Die Kulturen von S lividans TK23/pAS l 1 wurden in TSB-Medium und MD 50-Me- dium in Gegenwart von 25 μg/ml Thiostrepton angezuchtet. Nach 3-4 tagiger Inku- bation wurden die Kulturen geerntet Durch Zentrifügation (3500 g) bei 4 °C für 10

Min wurden die Zellen entfernt Die Überstände wurden für 12 h bei 4 °C gegen Puffer (25 mM Tris HCl pH 7,5, 1 mM CaCl ) dialysiert Aus den so präparierten Überstanden wurden 500 μl im Vakuum getrocknet, in Probenpuffer (s Puffer und Losungen) aufgenommen, die Proteine in den Überstanden wurden auf einer SDS- PAGE (Fig 8) getrennt. Als Referenz dienten Überstände aus Actinoplanes sp Kulturen, die unter identischen Bedingungen gewachsen waren Die α-Amylase Aktivität wurde durch Messung der Trubungsabnahme einer 1 % Starkesuspension bestimmt Für eine Messung wurden 100 μl dialysierter Kulturuberstand mit 900 μl Starkesuspension gemischt und die Abnahme der Extinktion bei 300 nm zeitabhängig aufge- zeichnet [Virolle, M.J , et al. (1990)] Zum Vergleich wurden entsprechende Untersuchungen mit einer α-Amylase aus Bacillus sp (Sigma, Deisenhofen) durchgeführt Die Ergebnisse sind in (Fig. 10) dargestellt. Die AcbE Aktivität in Actinoplanes sp MD 50-Kulturen und in den S. lividans TK23/pASl l MD 50-Kulturen ließen sich durch 1 mM Acarbose im Test nicht hemmen Dahingegen ließ sich die Hintergrund- Aktivität in S. lividans TK23/pUWL219 MD50-Kulturen durch 0, 1 mM Acarbose im

Test hemmen Die Bacillus sp α-Amylase wurde ebenfalls durch 0, 1 mM Acarbose inhibiert (Fig 10) Puffer und Lösungen:

Medien für die Bakterienanzucht

LB-Medium:

Trypton 10 g

NaCI 10 g

Hefeextrakt 5 g

H₂O ad 1000 ml Es wurde mit 4 M NaOH ein pH-Wert von 7,5 eingestellt

MD 50-Medium

Lösung I

Stärkehydrolysat MD 50 70 g

Hefeextrakt 2 g ad 400 ml mit H₂O

Lösung II

K₂HPO₄ i g

KH₂PO₄ l g

Tri-Natriumcitrat 5 g ab 400 ml mit H₂O pH-Einstellung auf 7.0 mit IM NaOH

Lösung III

MgCl₂6H₂O l g

FeCl₃6H₂O 0,25 g

CaCl₂2H₂O 2 g ad 200 ml mit H₂O

Die Lösungen werden nach dem Mischen sterilfiltriert

TSB-Medium:

Tryptone-Soya Broth (Oxoid) 30 g

H₂O ad 1000 ml TSB-PEG 8000 [s Babcock et al (1988)]

Tryptone Soya Broth (Oxoid) 30 gΛ

PEG 8000 50g/l nach dem Autoklavieren

Glycin (20 %) 25 ml

MgCl₂ (2,5 M) 2 ml

YEME [Hopwood, DA, , etal (1985)]

Hefeextrakt 3g/l

Pepton 5g/l

Malzextrakt 3g/l

Glukose 10g/l

Saccharose 340 g/1 nach dem Autoklavieren

MgCl₂ (2,5 M) 2 ml

Standardpraparation von Plasmid-DNA [modifiziert nach Birnboimu Doly(1979)]

Mixl 50 mM Glukose

50 mM Tπs-HCl (pH 8,0)

10mMEDTA(pH8,0)

5 mg/ml Lysozym

1 % (w/v) SDS (Natπumdodecylsulfat)

Mix III 3 M Ka umacetat

1,8 MFormiat

TE-Puffer (pH 8.0)

Tπs-HCl 10 mM

Na₂-EDTA 1 mM

DNA-DNA-Hvbπdisierung

20x SSC

3 M NaCl 0,3 M Na-Citrat

Prähybridisierungslösung: 6x SSC 0,01 M Natriumphosphatpuffer pH 6,8

1 mM EDTA 0,5 % SDS 0,1 % Magermilchpulver

Hybridisierungslosung:

In 15 ml Prähybridisierugslösung wird die acb-Sonde nach der Markierungsreaktion gegeben.

6x Postwash

6x SSC 0.5% SDS

DNA- Sequenzierung:

TBE-Puffer (pH 8,0)

IM Tris-Base 0,83 M Borsäure 10 mM EDTA

Denaturierende Polvacrylamid-Gelelektrophorese von Proteinen Probenpuffer 5 x

Glycerin 25 ml

SDS 5 g

BPB 2,5 mg

2-Mercaptoethanol 12,5 ml ad 50 ml 0,625 M Tris/HCl (pH 6,8)

trodenputter

Tris/HCl (pH 8,3) 25 mM

Glycin 190 mM SDS(w/v) 0,1% pH-Einstellung vor SDS -Zugabe

Lösung A

Acrylamid 44 g

N,N-Methylen-

Bisacrylamid 0,8 g ad 100mlH₂O

Lösung B

Acrylamid 30 g

N,N-Methylen-

Bisacrylamid 0,8 g adl00mlH₂O

Färbelösung

SERVA-Blau 0,15'

R-250 (w/v)

Methanol (v/v) 50%

Essigsäure (v/v) 10%

Entfärbelösung

Methanol (v/v) 25%

Essigsäure (v/v) 10%

Aufschlußpuffer AcbC

K₂HPO₄/KH₂Pθ4(pH7,5) 20 mM

NAD 0,2 mM

DTT 0,5 mM

Phosphatpuffer α-Amylase-Test

K₂HPθ₄/KH₂PO₄ (pH 6,8) 50 mM KC1 50 mM

Cer-Reagenz

Molybdatophosphorsäure 1,25 g Cer-4-sulfat 0,5 g

H₂SO₄ 3 ml ad 50 ml mit H₂O

Literatur:

Babcock, M , Kendπck, K E (1988)

Cloning of DNA involved in sporulation of Streptomyces griseus J Bacteπol 170, 2802-2808

Birnboim, H C , Doly, J (1979)

A rapid alka ne extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA

Nucleic Acids Res 7, 1513-1523 Drepper, A , Pape, H (1996)

Acarbose 7-phosphotransferase from Actinoplanes sp puπfication, proper- ties, and possible physiological fünction J Antibiot , 49, 664-669 Goeke, K , Drepper, A , Pape, H (1996) Formation of acarbose phosphate by a cell-free extract from the acarbose pro- ducer Actinoplanes sp J Antibiot , 49, 661-663 Hanahan, D (1983)

Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids J Mol Biol 166, 557-580

Hershberger, C L , et a (1989)

Genetics of Molecular Biology of Industπal Microorganisms Amer Soc Microbiol , S 35-39, S 58, S 61-67, S 147-155 Hopwood, D A , et al (1985) Genetic manipulation of Streptomyces,

A laboratory manual, The John Innes Foundation, Norwich, England Lugtenberg, B , et al (1975)

Electrophoretic resolution of the "major" outer membrane protein of Eschen- chia coli into four bands FEBS Lett 58, 254-258

Merson-Davies, L A , Cundliffe, E (1994)

Analysis of five tylosin biosynthetic genes from the tyllBA region of the Streptomyces fradiae genome Mol. Microbiol., 13, 349-355. Mullis, K.B., Falloona, F.A. (1987)

Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase catalyzed chain reaction.

Methods Enzymol., 155, 335-350. Sambrook, J., et al. (1989)

Molecular cloning; a laboratory manual, 2nd ed.

Cold Spring Harbour Laboratory Press, N.Y., USA. Sanger F.; Nicklan S.; Coulson AR. (1977)

DNA sequencing with chain determinating inhibitors Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 74, 5463-5467

Southern E.M., (1975) Detection of specific sequences among DNA Fragments sepa- rated by gel electrophoresis

J.Mol.Biol., 98. 503-521. Takano, E., et al. (1995) Construction of thiostrepton-inducible, high-copy-number expression vectors for use in Streptomyces spp.

Gene, 166, 133-137. Virolle, M.J., Morris, V.J., Bibb, M.J. (1990)

A simple and reliable turbidimetric and kinetic assay for alpha-amylase that is really applied to eulture supernatants and cell extracts

J. Industrial Microbiol., 5, 295-302 Wehmeier, U.F. (1995)

New multifunctional Escherichia coli-Streptomyces Shuttle vectors allowing blue-white screening on XGal plates. Gene, 165, 149-150.

Legenden

Fig 1 Restriktionskarte des sequenzierten ca 18 kb Abschnittes aus dem

Genom von Actinoplanes sp SE50/110 (vgl Fig 2) Der schwarze Balken gibt den im ursprunglichen Patent beanspruchten Bereich an, der die Gene acbCBA (Reihenfolge wie angegeben von links nach rechts) z T überlappt

Fig 2 Genkarte des Acarbose Biosynthese-Clusters

Fig 3 DNA Sequenzen aus dem Acarbose Biosynthese-Cluster

Fig 4 Die rekombinanten Plasmide, die - ausgehend von den Plasmiden pETl la und pETlόb - für die Expression von AcbC in E coli konstru- lert wurden

Fig 5 Das rekombinante Plasmid pAS8/7 2, welches - ausgehend von dem

Plasmid pIJ6021 - für die Expression von AcbC in S lividans 1326 konstruiert wurde

Fig 6 Gelelektrophoretische Trennung von Zellysaten (s Beispiel 15 2) Die

Expression von AcbC (42 kDa) in der mit Thiostrepton induzierten S lividans 1326/pAS8/7 Kultur ist in der Spur 3 dargestellt

Fig 7 Das rekombinante Plasmid pASl l, welches - ausgehend von dem

Plasmid pUWL219 - für die Expression von AcBE in S lividans rK 23 konstruiert wurde

Fig 8 Gelelektrophoretische Trennung von Proteinen aus Kulturuberstanden (s Beispiel 16) Die Expression von AcbE (1 10 kDa) ist in Spur 2,

Spur 5 und Spur 6 zu erkennen Nachweis der AcbC-Enzymaktivitat durch Dunnschicht-Chromatogra- phie auf Kieselgelfolien (s Beispiel 19 1)

1 ) Extrakt aus Actinoplanes sp

2) Extrakt aus S. lividans 1326/pJ6021 3) Extrakt aus S. lividans 1326/pAS8/7 2 (Extrakt 2 Monate bei

-20°C gelagert)

4) Extrakt aus S. lividans 1326/pAS8/7 2 (gekocht)

5) Extrakt aus S. lividans 1326/pAS8/7 2 (Valienon statt Sedo- heptulose-7-Phosphat als Substrat) 6) Valiolon / Valienon Standard

7) Sedoheptulose

8) Sedoheptulose-7-Phosphat

9) Extrakt aus S. lividans 1326/pAS8/7 2 (Extrakt frisch präpariert)

Bestimmung der α-Amylase Aktivität in Kulturuberstanden Die Anzucht der Bakterien erfolgt in MD-50 Medium Mit gekochten Kulturuberstanden konnte keine Aktivität gemessen werden Die Testdauer betrug 6 min. Zum Vergleich wurde in den Ansätzen 9-1 1 je- weils 2,8 mU gekaufte α-Amylase eingesetzt

Claims

Patentansprüche

1. Acarbose Biosynthese Gen Cluster enthaltend DNA aus der Fig. 3.

2. Acarbose Gene enthaltend DNA aus der Fig.

3.