DE60225366T2

DE60225366T2 - Expressionskontrollsequenz

Info

Publication number: DE60225366T2
Application number: DE60225366T
Authority: DE
Inventors: Sergei Vladimirovich Mashko; Danila Vadimovich Zimenkov
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 2001-02-22
Filing date: 2002-01-30
Publication date: 2009-03-12
Anticipated expiration: 2022-01-31
Also published as: CN1236064C; BR0200509A; JP2002320495A; JP4352650B2; CN1375556A; US20030049736A1; EP1234883B1; RU2225442C2; DE60225366D1; US7989611B2; EP1234883A1; US20050266525A1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft die mikrobiologische Industrie, insbesondere die Entwicklung eines neuen Ansatzes zur regulierten Genexpression in Bakterienzellen.
Das Induzieren der Expression von geklonten Genen durch die Zugabe der relativ einfachen und günstigen chemischen Verbindungen ist eine sehr attraktive Idee für viele biotechnologische Verfahren, welche rekombinante Bakterien, insbesondere E. coli, verwenden.
Offensichtlich sind natürliche L-Aminosäuren potenziell sehr gute Kandidaten, um als solche Induktoren eingesetzt zu werden. Soweit jedoch die Erfinder wissen, sind die regulatorischen Bereiche der Tryptophanasegene die einzigen natürlichen Systeme, die durch die Zugabe von Tryptophan zu dem Kulturmedium induziert werden [Landick R., Turnbough C. L., Vanofsky C. "Transcription attenuation"/ In: "Escherichia coli and Salmonella. Cellular and molecular biology" (Zweite Ausgabe, F. C. Neidhardt – Herausgeber), (1996), S. 1263–1286]. Im Gegensatz dazu gibt es mehrere Systeme, welche eine Verringerung der kontrollierten Genexpression bei Überschuss von Aminosäuren in Zellen bereitstellen (das System des trp-Operonrepressor-Operators [Platt, T. "Regulation of gene expression in the tryptophan operon of Escherichia coli"/ In: "The Operon" (insbesondere Miller, J. H., Reznikoff, W. S. – Herausgeber), Cold Spring Harbor Laboratory (1978), S. 263–302.], die Attenuation der Aminosäure-Operontranskription [Landick R., Turnbough C. L., Yanofsky C. "Transcription attenuation"/ In: "Escherichia coli and Salmonella. Cellular and molecular biology" (Zweite Ausgabe, F. C. Neidhardt – Herausgeber), (1996), S. 1263–1286]).
Der molekulare Mechanismus der Transkriptionsattenuation in Aminosäure-Operons basiert auf der Möglichkeit der Bildung alternativer mRNA-Sekundärstrukturen in der sogenannten "Attenuator"-Region in Abhängigkeit von der Translation des "Leader"-Peptids, dessen Gen stromaufwärts des ersten Strukturgens des Operons lokalisiert ist. Der kodierende Teil des Leader-Peptidgens weist eine Häufung der Kodons für die Sinnaminosäure auf (die Kodons der Aminosäuren, deren Biosynthese durch die korrespondierenden Proteinprodukte durchgeführt wird: für das trp-Operon sind dies Trp-Kodons, für das his-Operon – His-Kodons, für das thr-Operon – Thr- und Ile-Kodons, etc).
Die Details dieser gut untersuchten Regulation der Transkription sind in 1 unter Verwendung der Attenuatorregionen der trp- und his-Operons von E. coli als Beispiele angegeben. Aus 1 geht hervor, dass alternative mRNA-Sekundärstrukturen im Fall der Transkription der korrespondierenden DNA-Fragmente gebildet werden können: die Haarnadelstrukturen t1:t2 und t3:t4, oder deren Alternative – t2:t3 kann analog für den trp-Leader gebildet werden, h1:h2, h3:h4 und h5:h6, oder h2:h3 und h4:h5 können für den his-Leader gebildet werden. Die Haarnadelstrukturen t3:t4 und h5:h6 sind typische rho-unabhängige Transkriptionsterminatoren, so dass ihre Bildung während der Transkription zu einer Terminierung in den Attenuatorregionen des korrespondierenden Operons führt, wodurch die Expression der Strukturgene des Operons verhindert wird.
Soweit die Bildung der mRNA-Sekundärstruktur mit der mRNA-Synthese gekoppelt ist, werden die Haarnadelstrukturen t1:t2 und danach t3:t4 stufenweise gebildet (die Alternative, nämlich die Haarnadelstruktur t2:t3, kann nicht gebildet werden, weil t1:t2 vorher gebildet worden ist) im Fall des trp-Attenuators, wenn das Leader-Peptid nicht translatiert worden ist. In analoger Weise verhindert die schnellere Bildung der Haarnadelstrukturen h1:h2, h3:h4 und dann h5:h6 die Bildung deren Alternative, nämlich h2:h3 und h4:h5 im Fall der Synthese der his-Attenuator mRNA ohne Translation des korrespondierenden Leader-Peptids. Wie vorstehend erwähnt wurde, führt die Bildung der Haarnadelstrukturen t3:t4 sowie h5:h6 zur Terminierung in den korrespondierenden Attenuatorregionen. Diese Situation konnte während der Transkription in vitro der korrespondierenden DNAs durch reine RNA-Polymerase ohne Translationsfaktoren in dem Reaktionsgemisch oder in vivo im Fall eines allgemeinen Aminosäuremangels realisiert werden.
Die viel kompliziertere Situation konnte in vivo im Fall der Translation des Leader-Peptids auftreten, wenn die Sinnaminosäure im Überschuss vorhanden ist (genauer gesagt, wenn die korrespondierende beladene tRNA im Überschuss vorhanden ist), oder unter Mangelbedingungen in der bakteriellen Zelle. Es wurde gezeigt, dass RNA-Polymerase, welche die Transkription von Attenuator mRNA initiiert, an der Pausenstelle in der Region unmittelbar stromabwärts der Haarnadelstruktur 1:2 anhält (wahrscheinlich ist die Bildung der Haarnadelstruktur wesentlich, sie ist jedoch nicht die eigentliche Bedingung für das Pausieren) [Chan, C. L., Wang, D., Landick, R. "Multiple interactions stabilize a single paused transcription intermediate in which hairpin to 3' end spacing distinguishes pause and termination pathway"/ J. Mol. Biol. 268 (1997) 54–68]. Das Ribosom, das den N-terminalen Teil des Leader-Peptids translatiert, setzt die RNA-Polymerase frei, und danach wird die Elongation der Transkription fortgesetzt, so dass die alternative Haarnadelstruktur der mRNA, nämlich 2:3, gebildet werden kann. Die folgenden Ereignisse hängen von der intrazellulären Konzentration der beladenen tRNA(s) der Sinnaminosäure ab, weil die korrespondierenden Kodons des Leader-Peptidgens zu diesem Zeitpunkt durch das Ribosom translatiert werden müssen.
Im Fall des Sinnaminosäuremangels hält das Ribosom an den Sinnkodons an und kann die Haarnadelstruktur 2:3 nicht zerstören, während RNA-Polymerase das stromabwärtige Fragment der mRNA synthetisiert, das im Prinzip die Terminator-Haarnadelstruktur formen könnte (t3:t4 – für den trp-Attenuator und h5:h6 – für his), sie faltet jedoch nicht aufgrund des Vorhandenseins der alternativen Haarnadelstruktur (t2:t3 – für trp und Struktur h2:h3, h4:h5 – für his), und danach kommt es zu einer Verlängerung der Transkription und Synthese der mRNA der Operon-Strukturgene.
Im Fall eines Überschusses der Sinnaminosäure kommt es zur Translation des Leader-Peptids mit hoher Effizienz, so dass das Ribosom, das anfänglich die Haarnadelstruktur 1:2 aufbricht, auch die Haarnadelstruktur 2:3 aufbricht und am Stoppkodon des Leader-Peptids anhält. Das Letztgenannte führt schließlich zur Bildung der Terminator-Haarnadelstruktur und zur Beendigung der Transkription in der Attenuatorregion.
ZUSAMMENFASSENDE DARSTELLUNG DER ERFINDUNG
Ein Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Erzeugung eines neuen prokaryotischen künstlichen Regulationssystems, das eine Erhöhung der kontrollierten Genexpression als Ergebnis einer Erhöhung der intrazellulären Konzentration der Sinnaminosäure bereitstellen kann.
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben erfolgreich ein neues künstliches Regulationssystem in Abhängigkeit von der intrazellulären Aminosäurekonzentration erzeugt, indem der natürliche Regulationsmechanismus, der auf der Bildung der alternativen Sekundärstrukturen von mRNA in Abhängigkeit von der Effizienz der Leader-Peptid-Translation gründet, ausgenutzt wird. Dieses neue System stellt im Gegensatz zu den natürlichen Attenuatoren von Aminosäure-Operons kein Verringern sondern ein Erhöhen der kontrollierten Genexpression im Fall eines Überschusses der intrazellulären Sinnaminosäurekonzentration bereit. Gleichzeitig wird das Expressi onsniveau von Genen unter der Kontrolle der neuen Expressionskontrollsequenz im Zustand des Sinnaminosäuremangels verringert. Die gut bekannte Regulation der Transkription, die Attenuation der Aminosäure-Operontranskription, ist als Vorlage für das neue System eingesetzt worden, das neue System stellt jedoch im Gegensatz zur Vorlage keine Verringerung sondern eine Erhöhung des Niveaus der kontrollierten Genexpression im Fall eines Überschusses der Sinnaminosäure bereit.
Die vorliegende Erfindung stellt die Expressionskontrollsequenz sowie das Expressionskontrollverfahren und das Produktionsverfahren unter Einsatz der Expressionskontrollsequenz wie nachstehend beschrieben bereit:

(1) Eine Expressionskontrollsequenz, welche die Expression eines Zielgens stromabwärts der Expressionskontrollsequenz in Abhängigkeit der intrazellulären Konzentration einer Aminosäure kontrolliert, wobei in einem Bacterium, das ein DNA-Konstrukt enthält, welches die Expressionskontrollsequenz, einen Promotor stromaufwärts der Expressionskontrollsequenz und das Zielgen stromabwärts der Expressionskontrollsequenz aufweist, die Häufigkeit der Termination der Transkription, die von dem Promotor aus startet, in der Expressionskontrollsequenz durch die Erhöhung der intrazellulären Konzentration einer Aminosäure verringert wird, wodurch die Expression des Zielgens erhöht wird; wobei die Expressionskontrollsequenz einen Bereich umfasst, der für ein die Aminosäure enthaltendes Leader-Peptid kodiert, und einen ρ-abhängigen Terminator enthält, wobei, wenn die Translation des Leader-Peptids an dem Kodon der Aminosäure im Verlauf der Translation bei Unterversorgung mit dieser Aminosäure stoppt, eine Basenpaarungsstruktur des ρ-unabhängigen Terminators in einem Transkript der Expressionskontrollsequenz gebildet wird, wobei die Häufigkeit der Termination der Transkription in der Expressionskontrollsequenz erhöht wird; wobei die Expressionskon trollsequenz fünf Segmente an1 bis an5 in dieser Reihenfolge von der stromaufwärtigen Seite aufweist, wobei die Segmente an1 und an2 und eine für das Leader-Peptid kodierende Region von einer Sequenz eines Attenuators eines Tryptophan-Operons von Escherichia coli abgeleitet sind, die Segmente an4 und an5 von einer Sequenz eines Attenuators eines Histidin-Operons von Escherichia coli abgeleitet sind und das Segment an3 von einer Kombination der Sequenzen der Attenuatoren des Tryptophan-Operons und des Histidin-Operons abgeleitet ist; wobei das erste Segment mit dem Kodon der Aminosäure in dem Leader-Peptid überlappt; und wobei die Sequenz jedes Segments oder eines Teils davon und die Sequenz des benachbarten Segments oder eines Teils davon eine umgekehrte Wiederholungssequenz darstellen.
(2) Die Expressionskontrollsequenz nach (1), wobei das Leader-Peptid modifiziert worden ist, so dass es nicht weniger als 2 Tryptophanreste enthält.
(3) Die Expressionskontrollsequenz nach (1), welches die in 2 gezeigte künstliche TrpHis-anti-Attenuator-Sequenz umfasst.
(4) Verfahren zum Kontrollieren einer Expression eines Zielgens, welches die folgenden Stufen umfasst: Kultivieren eines Bacteriums, das ein DNA-Konstrukt enthält, welches die Expressionskontrollsequenz nach einem der Punkte (1) bis (3), einen Promotor stromaufwärts der Expressionskontrollsequenz und das Zielgen stromabwärts der Expressionskontrollsequenz umfasst, in einem Kulturmedium und das Verändern der intrazellulären Konzentration einer Aminosäure, von der die Expressionskontrolle durch die Expressionskontrollsequenz abhängt, um die Expression des Zielgens zu kontrollieren.
(5) Verfahren zum Herstellen einer Zielsubstanz, welches die Stufen umfasst, bei denen ein Bacterium, das die Substanz herstellen kann, kultiviert wird, wobei die Substanz hergestellt wird und die Substanz gewonnen wird, wobei das Bacterium ein DNA-Konstrukt trägt, welches die Expressionskontrollsequenz nach einem der Punkte (1) bis (3), einen Promotor stromaufwärts der Expressionskontrollsequenz und ein Zielgen umfasst, das mit der Produktion der Zielsubstanz in Beziehung steht und stromabwärts der Expressionskontrollsequenz verbunden ist, und die intrazelluläre Konzentration einer Aminosäure, von der die Expressionskontrolle durch die Expressionskontrollsequenz abhängt, verändert wird, um die Expression des Zielgens zu kontrollieren.
(6) Verfahren nach (5), wobei die intrazelluläre Konzentration der Aminosäure durch die Synthese oder den Abbau der Aminosäure durch das Bacterium verändert wird. Erfindungsgemäß wird eine Expressionskontrollsequenz bereitgestellt, die eine Erhöhung der kontrollierten Genexpression durch Erhöhen der intrazellulären Konzentration der Sinnaminosäure ermöglicht. Gemäß dem erfindungsgemäßen Expressionskontrollverfahren kann die Expression des Zielgens durch Erhöhen der intrazellulären Konzentration der Sinnaminosäure erhöht werden. Durch das erfindungsgemäße Produktionsverfahren kann die hergestellte Menge der Zielsubstanz durch Erhöhen der intrazellulären Konzentration der Sinnaminosäure erhöht werden, so dass die Zielsubstanz effizient produziert werden kann. und an2 und eine für das Leader-Peptid kodierende Region von einer Sequenz eines Attenuators eines Tryptophan-Operons von Escherichia coli abgeleitet sind, die Segmente an4 und an5 von einer Sequenz eines Attenuators eines Histidin-Operons von Escherichia coli abgeleitet sind und das Segment an3 von einer Kombination der Sequenzen der Attenuatoren des Tryptophan-Operons und des Histidin-Operons abgeleitet ist.
(10) Die Expressionskontrollsequenz nach (9), wobei das Leader-Peptid modifiziert worden ist, so dass es nicht weniger als 2 Tryptophanreste enthält.
(11) Verfahren zum Kontrollieren einer Expression eines Zielgens, welches die folgenden Stufen umfasst: Kultivieren eines Bacteriums, das ein DNA-Konstrukt enthält, welches die Expressionskontrollsequenz nach einem der Punkte (1) bis (10), einen Promotor stromaufwärts der Expressionskontrollsequenz und das Zielgen stromabwärts der Expressionskontrollsequenz umfasst, in einem Kulturmedium und das Verändern der intrazellulären Konzentration einer Aminosäure, von der die Expressionskontrolle durch die Expressionskontrollsequenz abhängt, um die Expression des Zielgens zu kontrollieren.
(12) Verfahren zum Herstellen einer Zielsubstanz, welches die Stufen umfasst, bei denen ein Bacterium, das die Substanz herstellen kann, kultiviert wird, wobei die Substanz hergestellt wird und die Substanz gewonnen wird,

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 zeigt das Erklärungsschema der Strukturen und Eigenschaften der natürlichen Attenuatoren und der Expressionskontrollsequenz (künstlicher anti-Attenuator) der vorliegenden Erfindung.
2 zeigt eingehende Strukturen der natürlichen Attenuatoren und des künstlichen anti-Attenuators. A und B stellen die vorgeschlagene "stromabwärtige" Grenze der mRNA-Teile dar, die durch das Anhalten des Ribosoms bei "Sinn"-Kodons (A) und das Terminieren bei Stoppkodon (B) des "Leader"-Peptids geschützt sind. C stellt die Pausenstelle der DNA-Transkription durch E. coli RNA-Polymerase dar.
3 zeigt das allgemeine Konstruktionsschema des künstlichen anti-Attenuators. Die durchkreuzten Kreise stel len Nucleotide dar, die im Vergleich zur natürlichen Sequenz verändert sind. BI: BamHI, Bg: BglII, NI: NdeI, XI; XbaI, XI*; XbaI(dam^–).
4 zeigt das Konstruktionsschema des Plasmids in Beispiel 1.
5 zeigt die Struktur des P_tac-Promotors aus dem Plasmid pDR540. Die Sequenzen der "stromaufwärtigen" (III) und "stromabwärtigen" (IV) Primer für die PCR sind schraffiert.
6 zeigt die Struktur des chemisch synthetisierten an3:an4(an4:an5)-Fragments und die Art und Weise, wie das Fragment in den Klonierungsvektor eingefügt wurde.
7 zeigt die Struktur der natürlichen Attenuatorregion des trp-Operons von E. coli. Das Leader-Peptid ist in großen kursiven Buchstaben angegeben.
8 zeigt die Struktur der intermediären Konstruktion, einschließlich der Fusion zwischen RBS des Bacteriophagen T7 Gen10 und der Leader-Region des trp-Operons. Das Leader-Peptid ist in großen kursiven Buchstaben angegeben.
EINGEHENDE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
<1> Expressionskontrollsequenz
Die erfindungsgemäße Expressionskontrollsequenz ist eine Expressionskontrollsequenz, welche die Expression eines Zielgens, das stromabwärts der Expressionskontrollsequenz angehängt ist, in Abhängigkeit von der intrazellulären Konzentration einer Aminosäure (Sinnaminosäure) kontrolliert, wobei in einem Bacterium, das ein DNA-Konstrukt enthält, welches die Expressionskontrollsequenz, einen Promotor strom aufwärts der Expressionskontrollsequenz und das Zielgen stromabwärts der Expressionskontrollsequenz aufweist, die Häufigkeit der Termination der Transkription, die von dem Promotor aus startet, in der Expressionskontrollsequenz durch die Erhöhung der intrazellulären Konzentration einer Aminosäure verringert wird, wodurch die Expression des Zielgens erhöht wird; wobei die Expressionskontrollsequenz einen Bereich umfasst, der für ein die Aminosäure enthaltendes Leader-Peptid kodiert, und einen ρ-abhängigen Terminator enthält, wobei, wenn die Translation des Leader-Peptids an dem Kodon der Aminosäure im Verlauf der Translation bei Unterversorgung mit dieser Aminosäure stoppt, eine Basenpaarungsstruktur des ρ-unabhängigen Terminators in einem Transkript der Expressionskontrollsequenz gebildet wird, wobei die Häufigkeit der Termination der Transkription in der Expressionskontrollsequenz erhöht wird; wobei die Expressionskontrollsequenz fünf Segmente an1 bis an5 in dieser Reihenfolge von der stromaufwärtigen Seite aufweist, wobei die Segmente an1 und an2 und eine für das Leader-Peptid kodierende Region von einer Sequenz eines Attenuators eines Tryptophan-Operons von Escherichia coli abgeleitet sind, die Segmente an4 und an5 von einer Sequenz eines Attenuators eines Histidin-Operons von Escherichia coli abgeleitet sind und das Segment an3 von einer Kombination der Sequenzen der Attenuatoren des Tryptophan-Operons und des Histidin-Operons abgeleitet ist; wobei das erste Segment mit dem Kodon der Aminosäure in dem Leader-Peptid überlappt; und wobei die Sequenz jedes Segments oder eines Teils davon und die Sequenz des benachbarten Segments oder eines Teils davon eine umgekehrte Wiederholungssequenz darstellen.
Die Sinnaminosäure ist nicht eingeschränkt, mit der Maßgabe, dass ihre Aminoacyl-tRNA synthetisiert werden kann und die synthetisierte Aminoacyl-tRNA für die Translation eines Proteins in einem Bacterium, für das die Expressionskontrollsequenz der vorliegenden Erfindung eingesetzt wird, eingesetzt werden kann. Vorzugsweise ist die Sinnaminosäure Tryp tophan, Histidin, Phenylalanin, Threonin, Leucin, Isoleucin oder Valin.
Beispiele des Zielgens umfassen das Chloramphenicolacetyltransferasegen (cat), Aminosäure-Operons, Gene, deren Proteinprodukte an der Biosynthese von Aminosäuren, Nucleosiden und Nucleotiden beteiligt sind, und Gene, die für fremde Proteinprodukte kodieren.
Beispiele des Promotors umfassen P_tac und beliebige andere regulierte und konstitutive prokaryotische Promotoren.
Beispiele des Bacteriums, welches das DNA-Konstrukt enthält, umfassen Bakterien der Gattungen Escherichia, Salmonella und Serratia.
Die Konstruktion der Expressionskontrollsequenz und des DNA-Konstrukts und die Präparation des Bacteriums, welches das DNA-Konstrukt enthält, kann gemäß standardisierten gentechnologischen Techniken durchgeführt werden (vgl. beispielsweise Molecular Cloning, 2^nd Edition, Cold Spring Harbor Press (1989), offengelegte japanische Patentanmeldung Nr. 2-207791 und dergleichen).
Die Verringerung der Häufigkeit der Termination in der Expressionskontrollsequenz der Transkription, die von dem Promotor aus startet, durch Erhöhen der intrazellulären Konzentration einer Aminosäure, wobei die Expression des Zielgens erhöht wird, kann ebenfalls durch standardisierte gentechnologische Verfahren bestimmt werden. Im Hinblick auf die intrazelluläre Konzentration der Sinnaminosäure wird, wenn eine Beziehung zwischen der intrazellulären und der extrazellulären Konzentration in dem Bacterium bekannt ist, die intrazelluläre Konzentration nicht notwendigerweise direkt gemessen, sondern auf der Grundlage der extrazellulären Konzentration, beispielsweise der Konzentration in dem Medium, abgeschätzt. Die Häufigkeit der Termination der Transkripti on, die von dem Promotor aus startet, in der Expressionskontrollsequenz wird nicht notwendigerweise direkt gemessen, es reicht vielmehr aus, die Erhöhung der Zielgenexpression zu bestimmen. Die Erhöhung der Zielgenexpression kann dadurch bestimmt werden, dass die Menge des Genprodukts des Zielgens oder die Aktivität des Genprodukts gemessen wird, wenn das Genprodukt die Aktivität hat.
Eine Ausführungsform, bei der die Häufigkeit der Termination der Transkription, die von dem Promotor aus startet, in der Expressionskontrollsequenz durch Erhöhung der intrazellulären Konzentration einer Aminosäure gesenkt wird, wodurch die Expression des Zielgens erhöht wird, wird beispielhaft anhand einer Ausführungsform gezeigt, bei der die von dem Promotor aus startende Transkription in der Expressionskontrollsequenz terminiert wird, wenn die intrazelluläre Konzentration der Sinnaminosäure nicht höher als ein bestimmter Wert ist, und die Transkription wird verlängert, wenn die intrazelluläre Konzentration der Sinnaminosäure höher als ein bestimmter Wert ist, wodurch die Expression des Zielgens stattfindet.
Die erfindungsgemäße Expressionskontrollsequenz umfasst eine Region, die für ein Leader-Peptid kodiert, umfassend die Sinnaminosäure und einen rho-unabhängigen Terminator, wobei, wenn die Translation des Leader-Peptid am Kodon der Sinnaminosäure (Sinnkodon) im Verlauf der Translation bei Mangel der Sinnaminosäure stoppt, eine Basenpaarungsstruktur des rho-unabhängigen Terminators in einem Transkript der Expressionskontrollsequenz gebildet wird, wodurch die Häufigkeit der Termination der Transkription in der Expressionskontrollsequenz erhöht wird.
Die Länge des Leader-Peptids ist üblicherweise 14 bis 32 Reste. Das Leader-Peptid enthält üblicherweise 14 bis 57%, vorzugsweise 30 bis 45% Sinnaminosäurereste, bezogen auf die gesamten Aminosäurereste. Mit Zunahme des Anteils der Sinn aminosäure wird die Kontrolle durch die intrazelluläre Konzentration der Sinnaminosäure strikter.
Der rho-unabhängige Terminator hat eine Sequenz, die eine Basenpaarungsstruktur (Haarnadelstruktur) bilden kann und terminiert die Transkription, wenn die Basenpaarungsstruktur gebildet wird. Der rho-unabhängige Terminator ist vorzugsweise einer, der in einem Bacterium der Gattung Escherichia, Salmonella oder Serratia funktioniert.
Die Mittel, mit denen die Bildung der Basenpaarungsstruktur des rho-unabhängigen Terminators in dem Transcript der Expressionskontrollsequenz erlaubt wird, wenn die Translation des Leader-Peptids an den Sinnkodons im Laufe der Translation stoppt, sind beispielsweise das die Expressionskontrollsequenz so konstruiert wird, dass sie eine ungerade Anzahl von nicht weniger als 3 Segmenten aufweist, wobei jedes der Segmente eine Basenpaarungsstruktur zusammen mit dem benachbarten Segment bilden kann, und wobei in dem Transcript der Expressionskontrollsequenz, wenn ein anderes Segment oder andere Segmente als die terminalen Segmente jeweils eine Basenpaarungsstruktur mit einem seiner zwei benachbarten Segmente bildet bzw. bilden, das Segment oder die Segmente jeweils eine Basenpaarungsstruktur mit den anderen der zwei benachbarten Segmente bildet bzw. bilden; ein erstes Segment an einem stromaufwärtigen Ende überlappt mit der Region, die mit dem Ribosom wechselwirkt, welches das Leader-Peptid translatiert; ein zweites Segment, das dem ersten Segment benachbart ist, bildet eine Basenpaarungsstruktur mit einem dritten Segment, das dem zweiten Segment benachbart ist, im Laufe der Translation des Leader-Peptids; und eine Basenpaarungsstruktur, die gebildet wird aus dem stromabwärtigen Endsegment und dessen benachbarten Segment ist die Basenpaarungsstruktur des rho-unabhängigen Terminators.
In dieser Ausführungsform ist es erforderlich, dass die Bildung der Basenpaarungsstruktur zwischen dem ersten Segment und dem zweiten Segment durch Stoppen des Ribosoms an dem Kodon der Sinnaminosäure blockiert wird. Wegen der Masse des Ribosoms bedeckt das Ribosom eine Region von etwa 17 Basenpaaren stromaufwärts des Kodons der Sinnaminosäure, wo das Ribosom stoppt, bis etwa 13 Basenpaare stromabwärts des Kodons der Sinnaminosäure. Der Bereich, der mit dem Ribosom wechselwirkt, bedeutet einen solchen Bereich, der durch das Ribosom bedeckt wird. Wenn das erste Segment mit dem Bereich überlappt, der mit dem Ribosom wechselwirkt, welches das Leader-Peptid translatiert, wird vorhergesagt, dass die Bildung der Basenpaarungsstruktur zwischen dem ersten Segment und dem zweiten Segment durch Stoppen des Ribosoms am Kodon der Sinnaminosäure ausreichend blockiert wird. Wenn beispielsweise das Kodon der Sinnaminosäure unmittelbar dem Terminationskodon des Leader-Peptids vorhanden ist und der Abstand des Kodons der Sinnaminosäure zum Startpunkt des ersten Segments weniger als etwa 13 Basenpaare ist, kann die Bildung der Basenpaarungsstruktur zischen dem ersten Segment und dem zweiten Segment blockiert werden.
Das erste Segment überlappt mit dem Kodon der Sinnaminosäure in dem Leader-Peptid.
In dieser Ausführungsform werden, wenn das erste Segment aufgrund eines Mangels der Sinnaminosäure durch das Ribosom blockiert wird, die Basenpaarungsstrukturen zwischen dem zweiten und dem dritten, dem vierten und dem fünften ... gebildet, und die endständige Basenpaarungsstruktur funktioniert als Terminator der Transkription. Wenn andererseits die Sinnaminosäure in ausreichendem Maße bereitgestellt wird und das Ribosom sich entlang der mRNA bis zu einem Stoppkodon in einer ausreichenden Geschwindigkeit bewegt, um dem Fortschreiten der Transkription zu folgen, was zu einer Blockierung durch das Ribosom bis zu dem zweiten Segment führt, werden die Basenpaarungsstrukturen zwischen dem dritten und dem vierten, ... gebildet, um die Bildung eines Terminators zu verhindern.
In der erfindungsgemäßen Expressionskontrollsequenz ist es bevorzugt, dass eine Pausenstelle für die RNA-Polymerase in der Region vorhanden ist, die für den C-terminalen Bereich des Leader-Peptids kodiert, oder stromabwärts des für das Leader-Peptid kodierenden Bereichs, stärker bevorzugt in einem Bereich von dem zweiten Segment bis zu dem dritten Segment. Wenn keine Pausenstelle vorhanden ist, kann die Expression des Zielgens nicht ausreichend kontrolliert werden, wenn die mit der Transkription zusammenhängende Translation in nicht ausreichendem Maße auftritt.
Die Anzahl der Segment ist 5.
Die Nucleotidsequenz jedes Segments kann eine sein, die eine Basenpaarungsstruktur mit dem benachbarten Segment bilden kann. Die Sequenz jedes Segments oder ein Teil davon und die Sequenz des benachbarten Segments oder ein Teil davon stellt eine umgekehrte Wiederholungssequenz dar. Die umgekehrte Wiederholungssequenz muss nicht kontinuierlich sein. Anders ausgedrückt kann sie einen Teil enthalten, der innerhalb der Sequenz keine Basenpaarung bildet. In dem anderen Segment als den terminalen Segmenten ist es ausreichend, dass zumindest eine teilweise Überlappung zwischen einem Teil, der mit einem der benachbarten Segmente die umgekehrte Wiederholungssequenz ausmacht, und einem Teil vorliegt, der mit einem anderen der benachbarten Segmente die umgekehrte Wiederholungssequenz ausmacht.
Die Expressionskontrollsequenz ist eine, die fünf Segmente an1 bis an5 in einer Reihenfolge von der stromaufwärtigen Seite umfasst, wobei die Segmente an1 und an2 und die für das Leader-Peptid kodierende Region von einer Sequenz eines Attenuators eines Tryptophan-Operons von Escherichia coli abgeleitet sind, die Segmente an4 und an5 von einer Sequenz eines Attenuators eines Histidin-Operons von Escherichia coli abgeleitet sind, und das Segment an3 von einer Kombination der Sequenzen der Attenuatoren des Tryptophan-Operons und des Histidin-Operons abgeleitet ist.
Der hier verwendete Ausdruck "abgeleitet von" bedeutet, dass die Sequenz dieselbe oder eine ähnliche wie die natürliche Sequenz ist. Die Mittel zum Bereitstellen der Sequenz sind nicht eingeschränkt. Die Sequenz kann aus einem biologischen Material isoliert oder chemisch synthetisiert werden. Die ähnliche Sequenz kann eine Sequenz sein, die Subsitution, Deletion oder Insertion eines oder mehrerer Nucleotide in der natürlichen Sequenz aufweist und eine Basenpaarungsstruktur bilden kann, die zu derjenigen äquivalent ist, die in der natürlichen Sequenz gebildet wird.
In dem bevorzugten Beispiel der Expressionskontrollsequenz ist das Leader-Peptid vorzugsweise eines, das modifiziert worden ist, um nicht weniger als zwei Tryptophanreste aufzuweisen. Diese Tryptophanreste sind vorzugsweise kontinuierlich.
Die vorliegende Erfindung wird unter Bezugnahme auf das bevorzugte Beispiel der Expressionskontrollsequenz beschrieben. Die Expressionskontrollsequenz wird im Folgenden der Einfachheit halber als künstlicher anti-Attenuator bezeichnet.
Die biologischen Eigenschaften des künstlichen anti-Attenuators sind in 1 schematisch angegeben. 1 zeigt, dass im Fall des Mangels der Sinnaminosäure und des Anhaltens des Ribosoms an den entsprechenden Kodons des Leader-Peptids die nicht aufgelöste Haarnadelstruktur an2:an3 des anti-Attenuators die Bildung der Haarnadelstruktur an4:an5 fördert, welche der Teil des typischen rho-unabhängigen Transkriptionsterminators ist. Die effiziente Translation des Leader-Peptids im Fall eines Überschusses der Sinnaminosäure führt andererseits zur Auflösung der Haarnadelstruktur an2:an3 des künstlichen anti-Attenuators und zur nachfolgenden Bildung der alternativen Haarnadelstruktur an3:an4, welche die Termination vor der Transkription der weiter weg liegenden (stromabwärtigen) Gene verhindert, weil die Terminator-Haarnadelstruktur an4:an5 nicht gebildet werden konnte.
Die Konstruktion des künstlichen anti-Attenuators wurde auf der Grundlage von zwei gut bekannten natürlichen Attenuatoren der trp- und his-Operons von E. coli konstruiert. Er setzt das Gen für das natürliche Leader-Peptid des trp-Operons (trpL) mit zwei kontrollierenden Trp-Kodons in seinem strukturellen Teil als Leader-Peptid des künstlichen anti-Attenuators ein. Andererseits kommt es zur Bildung einer alternativen mRNA-Sekundärstruktur in dem 3'-nicht translatierten Bereich des künstlichen anti-Attenuators wie in dem korrespondierenden Bereich des natürlichen his-Attenuators.
Die Nucleotid-Sequenzen der kodierenden Teile und der 3'-nicht-translatierten Bereiche der zwei natürlichen Attenuatoren (trp und his), die als Grundlage eingesetzt wurden, sowie die Sequenz des korrespondierenden Bereichs des künstlichen anti-Attenuators sind in 2 angegeben. 2 zeigt, dass die Strukturen bis zu "+85" (die Zahl ergibt sich, indem A von ATG des kodierenden Teils des Leader-Peptids als "+1" angenommen wird) von dem natürlichen trp-Attenuator und von dem künstlichen anti-Attenuator übereinstimmen. Deshalb konnte man davon ausgehen, dass das Verfahren der Transkriptionselongation mit pausierender RNA-Polymerase in der Position "+66–+67", die Auflösung der Haarnadelstruktur an1:an2 durch das Leader-Peptid translatierende Ribosom im Fall des Trp-Mangels, sowie die zusätzliche Auflösung der Haarnadelstruktur an2:an3 im Fall eines Trp-Überschusses in der Zelle in der regulatorischen Region des künstlichen anti-Attenuators auf gleiche Weise wie im Fall des natürlichen trp-Attenuators stattfindet. Andererseits unterscheidet sich der weiter entfernte Teil des anti-Attenuators deutlich von den korrespondierenden Bereichen des his-Attenuators, der als der zweite Vorläufer eingesetzt worden ist.
Die minimalen Änderungen wurden in dem Bereich ausgeführt, der die Terminator-Haarnadelschleife an4:an5 bilden kann. Wie in dem natürlichen his-Attenuator wird trotzdem die mögliche Bildung der alternativen Haarnadelstruktur an3:an4 in dem künstlichen anti-Attenuator bereitgestellt (die Sekundärstruktur dieser Region ist homolog zu h4:h5 des natürlichen his-Attenuators), deren Bildung durch die Termination der Transkription in dem künstlichen anti-Attenuator verhindern kann. Im Vergleich zu dem natürlichen his-Attenuator gibt es in dem anti-Attenuator kein DNA-Fragment, das die Bildung der Haarnadelstruktur h3:h4 und als Folge eine Änderung der biologischen Eigenschaften ermöglicht. Die Bildung des rho-unabhängigen Transkriptionsterminators findet im Fall eines Sinnaminosäuremangels und nicht im Fall einer erhöhten intrazellulären Konzentration statt.
Die Ergebnisse der Untersuchungen der Eigenschaften des künstlichen anti-Attenuators sind nachstehend beschrieben.
Der künstliche anti-Attenuator wurde unter Einsatz standardisierter gentechnischer Verfahren synthetisiert (einschließlich der Amplifikation des natürlichen Fragments des trp-Attenuators durch PCR, die chemische Synthese der Oligonucleotide und dergleichen), was in 3 gezeigt wird. Zwei unterschiedliche Typen der künstlichen anti-Attenuatoren sind erhalten worden. Die natürliche Ribosomenbindungsstelle (RBS) von trpL ist eingesetzt worden, um die Translationsinitiation des Leader-Peptids in dem künstlichen anti-Attenuator des ersten Typs bereitzustellen – anti-Attenuator-I. Es wurde eine effizientere RBS des Phagen T7 Gen10 in die 5'-Region des Leader-Peptidgens in die zweite eingesetzt – anti-Attenuator-II. Die beiden künstlichen anti-Attenuatoren sind in das Vektorplasmid stromabwärts des hocheffizienten Promotors P_tac und stromaufwärts des strukturellen Teils des Cat-Gens mit dem eigenen RBS kloniert worden. Das Cat-Gen, das für Chloramphenicolacetyltransferase (CAT) kodiert, ist als Reporter eingesetzt worden, und das Maß ihrer Expression gibt Hinweise auf die Effizienz der Funktion der erzeugten regulatorischen Elemente in Abhängigkeit von der intrazellulären Konzentration der Sinnaminosäure Trp.
Überdies sind mehrere rekombinante Kontrollplasmide auf der Grundlage desselben Vektors konstruiert worden. Das erste Plasmid trägt den natürlichen Attenuator des trp-Operons, nämlich trpL. Das zweite trägt den potenziellen Transkriptionsterminator, nämlich das 3'-terminale DNA-Fragment der anti-Attenuatoren, welches die Bildung der Terminator-Haarnadelstruktur an4:an5 ermöglicht. Das dritte Plasmid trägt das längere 3'-terminale DNA-Fragment der anti-Attenuatoren, welche die Bildung der Terminator-Haarnadelstruktur an4:an5 nicht ermöglichen kann, weil die potenzielle alternative Haarnadelstruktur an3:an4 während der mRNA-Synthese zuerst gebildet werden muss.

Aus der Literatur ist bekannt, dass das natürliche trpL des trp-Operons von E. coli (im Gegensatz zu den Attenuatoren anderer Aminosäure-Operons) ein eher schwacher Attenuator ist: "Die Anwesenheit oder Abwesenheit von Trp in dem Wachstumsmedium beeinflusst normalerweise das Überlesen des trp-Attenuators nicht; eine 10-fache Änderung des Überlesens tritt nur auf bei einem extremen Trp-Mangel in einem mutierten Bacterium oder übergangsweise bei der Übertragung von Bakterien von einem Trp-enthaltenden in ein Trp-freies Medium" [Landick R., Turnbough C. L., Yanofsky C. "Transcription attenuation"/ In: "Escherichia coli and Salmonella. Cellular and molecular biology" (Second Edition, F. C. Neidhardt – Herausgeber), (1996), S. 1263–1286]. Das Letztgenannte könnte möglicherweise der Anwesenheit von ausschließlich Tandem-Codons der Sinnaminosäure im Strukturteil des korrespondierenden Leader-Peptids geschuldet sein. Da die kodierenden Teile der Leader-Peptide der künstlichen anti-Attenuatoren und das natürliche trpL identisch sind, muss das spezielle Modellsystem eingesetzt werden, um die regulatorischen Eigenschaften des neuen Systems zu testen. Die Bestimmung der enzymatischen Aktivität der Reporter-CAT wurde bereitgestellt in den trp^–Zellen, welche die rekombinanten Plasmide von Interesse enthalten und unter Bedingungen des Trp-Mangels und, falls erforderlich, anschließende Zugabe von Trp in das Kulturmedium wachsen. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt. Tabelle 1

Bestimmung der CAT-Aktivität in den Stämmen, welche die rekombinanten Plasmide mit den untersuchten regulatorischen Elementen enthalten
Plasmidname	Vermutete Eigenschaften	CAT-Aktivität unter folgenden Bedingungen von Trp:
Plasmidname	Vermutete Eigenschaften	Mangel	Überschuss
PML-P_tac-an4:an5-cat	"Terminator"	3 ± 1	3 ± 1
PML-P_tac-an3:an4(an4:an5)-cat	"anti-Terminator"	60 ± 6	58 ± 6
PML-P_tac-trpL-cat	Natürliche trpL	17 ± 3	9 ± 3
PML-P_tac-anti_att-I-cat	"anti-Attenuator-I"	22 ± 3	30 ± 3
pML-P_tac-anti_att-II-cat	"anti-Attenuator-II"	18 ± 3	51 ± 5

Tabelle 1 zeigt, dass das Maß der CAT-Aktivität nicht von der Zugabe von Trp zu den Zellen, welche die Plasmide ohne den kodierenden Teil von trpL enthalten, abhängt. Überdies konnte der theoretische Unterschied in dem erzielten Maß der CAT-Aktivitäten in Abhängigkeit von der Bildung der alternativen mRNA-Sekundärstruktur auf der Grundlage der erhaltenen Ergebnisse für die Kontrollplasmide beurteilt werden, welche die "Terminator"- und "anti-Terminator"-Haarnadelstrukturen kodieren. Es konnte eine 20-fache Verstärkung der Transkription im Fall der Bildung der "anti-Terminator"-Struktur im Vergleich zu der rho-unabhängigen Transkriptionstermination in dem 3'-Teil der künstlichen anti-Attenuatoren erzielt werden.
Wie vermutet wurde, war das bestimmte Maß der CAT-Aktivität höher im Fall des Plasmids mit dem natürlichen trp-Attenuator. Das erhöhte Maß wurde im Fall des Trp-Mangels erzielt, und die Aktivität war höher als nach der Zugabe von Trp zu den wachsenden Plasmid-tragenden Bakterien. Das genau erzielte Maß der CAT-Aktivität (17 Einheiten) konnte mit dem Maximalwert (60 Einheiten) nicht verglichen werden. Das liegt daran, dass zunächst der Trp-Mangel im Fall des Bakterienwachstums nicht die maximale Effizienz der trpL-Durchlesetranskription garantiert. Zum Zweiten unterscheiden sich die nicht-translatierte Region des Cat-Gens, das unmittelbar stromaufwärts seines eigenen RES lokalisiert ist, im Fall des Ausnutzens des natürlichen trpL und die anderen Konstruktionen erheblich, so dass die Effizienz der CAT-Translationsinitiation ebenfalls verschieden sein konnte.
Das Hauptergebnis wurde für die Plasmide erzielt, welche die künstlichen anti-Attenuatoren tragen. Tabelle 1 zeigt, dass das erhöhte Maß der CAT-Aktivität nach der Zugabe von Trp zu den wachsenden Bakterien bei beiden Plasmid-tragenden Bakterienstämmen beobachtet werden konnte. Das Ausnutzen der hocheffizienten RBS des Phagen T7 Gen10 für die Translationsinitiation des Leader-Peptids führt zudem zum Erzielen eines Maßes an CAT-Anhäufung, die nahe dem theoretischen Maximum liegt (51 Einheiten im Vergleich zu 60 Einheiten). Das Letztgenannte kann durch die Tatsache erklärt werden, dass es im Fall der Transkription des künstlichen anti-Attenuators von dem eher starken Promotor P_tac aus (der stärker ist als der natürliche Promotor des trp-Operons) notwendig ist, die RES des Leader-Peptids zu verbessern, um die vollständige Transkriptionstranslationskopplung zu erreichen, die für das Erzielen des molekularen Mechanismus der Bildung der alternativen mRNA-Sekundärstruktur essentiell ist (typisch für die na türliche Attenuationstranskription in prokaryotischen Aminosäure-Operons).
Die folgenden Schlussfolgerungen konnten auf der Grundlage der erhaltenen Ergebnisse gezogen werden:

1. Das Verfahren der Bildung der alternativen mRNA-Sekundärstruktur kann tatsächlich für die Regulation der Transkription ausgenutzt werden. Aufgrund der Ausnutzung der künstlichen "his-ähnlichen" Endsequenzen konnten bis zu 20-fache Unterschiede in dem Expressionsniveau erzielt werden.
2. Die erhaltenen künstlichen "anti-Attenuator"-Systeme waren funktionell aktiv:
2.1. Die Anwesenheit des kodierenden Teils des nativen trp-Leader-Peptids konnte die Faltung der mRNA-Sekundärstruktur in Abhängigkeit von der intrazellulären Trp-Konzentration stimulieren.
2.2. Die beste "Aktivator"-Wirkung bei Trp-Überschuss konnte im Fall des Einsatzes des P_tac-Promotors für die Transkription in Kombination mit der optimierten Translationsinitiation des Leader-Peptids gefunden werden (Verwendung der RBS des Phagen T7 S10 anstelle der nativen RBS von trpL).
3. Es kann davon ausgegangen werden, dass das entwickelte System als Grundlage der Herstellung eines tatsächlich induzierbaren regulatorischen Elements eingesetzt werden kann. Es konnte durch die Zugabe eines Trp-Überschusses in das Kulturmedium nach Erhöhen der Menge der Sinnaminosäure-Codons für Trp im Strukturteil des Leader-Peptids der anti-Attenuatorregion induziert werden.

<2> Verfahren zum Kontrollieren der Zielgenexpression
Das erfindungsgemäße Expressionskontrollverfahren ist ein Verfahren zum Kontrollieren der Expression eines Zielgens, welches die folgenden Stufen umfasst:
Kultivieren eines Bacteriums, das ein DNA-Konstrukt enthält, welches die Expressionskontrollsequenz der vorliegenden Erfindung, einen Promotor stromaufwärts der Expressionskontrollsequenz und das Zielgen stromabwärts der Expressionskontrollsequenz umfasst, in einem Kulturmedium und das Verändern der intrazellulären Konzentration einer Aminosäure, von der die Expressionskontrolle durch die Expressionskontrollsequenz abhängt, um die Expression des Zielgens zu kontrollieren.
Das DNA-Konstrukt und das Bacterium, welches das DNA-Konstrukt enthält, können im Hinblick auf die Expressionskontrollsequenz wie vorstehend beschrieben sein.
Die Kulturbedingungen sind nicht eingeschränkt, mit der Maßgabe, dass das Bacterium überleben kann. Die Bedingungen werden in Abhängigkeit von dem Bacterium in geeigneter Weise ausgewählt.
Das Verfahren, bei dem die intrazelluläre Konzentration der Sinnaminosäure geändert wird, ist beispielsweise ein Verfahren, bei dem die Konzentration der Sinnaminosäure in dem Medium, in dem das Bacterium kultiviert wird, geändert wird, ein Verfahren, bei dem die Menge der Synthese oder der Abbau der Sinnaminosäure in den Zellen geändert wird. Die Änderung der Zielgenexpression kann durch Messen einer Menge des Genprodukts des Zielgens oder der Aktivität des Genprodukts, wenn das Genprodukt diese Aktivität hat, bestimmt werden.
<3> Verfahren zur Produktion der Zielsubstanz
Das erfindungsgemäße Produktionsverfahren ist ein Verfahren zum Herstellen einer Zielsubstanz, welches die Stufen umfasst, bei denen ein Bacterium, das die Substanz produzieren kann, kultiviert wird, um die Substanz herzustellen, und die Substanz dann gewonnen wird,
wobei das Bacterium ein DNA-Konstrukt enthält, welches die erfindungsgemäße Expressionskontrollsequenz, einen Promotor stromaufwärts der Expressionssequenz und ein Zielgen enthält, das zur Produktion der Zielsubstanz in Beziehung steht und stromabwärts der Expressionskontrollsequenz angehängt ist, und die intrazelluläre Konzentration einer Aminosäure (Sinnaminosäure), von der die Expressionskontrolle durch die Expressionskontrollsequenz abhängt, wird verändert, um die Expression des Zielgens zu kontrollieren.
Beispiele der Zielsubstanz umfassen CAT und andere prokaryotische Enzyme, fremde Proteinprodukte, Aminosäuren, Nucleotide und Nucleoside, Vitamine und andere biologisch aktive Substanzen.
Beispiele des Bacteriums, welches die Zielsubstanz produzieren kann, umfassen Bakterien der Gattung Escherichia, Salmonella und Serratia.
Die Kulturbedingungen sind nicht eingeschränkt, mit der Maßgabe, dass das Bacterium, welches die Zielsubstanz produzieren kann, die Zielsubstanz herstellen kann. Die Bedingungen werden in geeigneter Weise in Abhängigkeit von dem Bacterium ausgewählt.
Die Kultivierung wird üblicherweise unter aeroben Bedingungen während 10 bis 50 Stunden durchgeführt. Die Kultivierungstemperatur wird üblicherweise bei 28 bis 37°C kontrolliert, und der pH-Wert wird üblicherweise während der Kultivierung bei 6,6 bis 7,4 kontrolliert. Anorganische oder organische, saure oder basische Substanzen sowie Ammoniakgas oder dergleichen können für die pH-Einstellung verwendet werden.
Das Medium kann ein übliches Medium sein, das eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle, organische Ionen und gegebenenfalls andere organische Komponenten enthält.
Es ist möglich, als Kohlenstoffquelle Zucker, wie Glucose, Lactose, Galactose, Fructose, Saccharose oder Stärkehydrolysat, Alkohole, wie Glycerin oder Sorbitol, oder organische Säuren, wie Fumarsäure, Citronensäure oder Bernsteinsäure, einzusetzen.
Es ist möglich, als Stickstoffquelle anorganische Ammoniumsalze, wie Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid oder Ammoniumphosphat, organischen Stickstoff, wie Sojabohnenhydrolysat, Ammoniakgas oder wässeriges Ammoniak einzusetzen.
Es ist wünschenswert, dass zugelassen wird, dass erforderliche Substanzen, wie Vitamin B1 oder Hefeextrakt, in geeigneten Mengen als organische Spurennährstoffe enthalten sind. Bei Bedarf werden andere als die vorstehend genannten Verbindungen, nämlich Kaliumphosphat, Magnesiumsulfat, Eisenionen, Manganionen und dergleichen, in kleinen Mengen zugegeben.
Die Gewinnung der Zielsubstanz aus einer Kultur, beispielsweise aus Zellen und einem Kulturmedium, kann üblicherweise durchgeführt werden, indem ein Ionenaustauscherharzverfahren, ein Ausfällungsverfahren und andere bekannte Verfahren kombiniert werden.
Das DNA-Konstrukt kann im Hinblick auf die Expressionskontrollsequenz wie vorstehend beschrieben sein, mit der Maßgabe, dass ein Gen, das in Zusammenhang mit der Produktion der Zielsubstanz steht, als Zielgen eingesetzt wird. Beispiele des Zielgens, die in Zusammenhang mit der Produktion der Zielsubstanz stehen, umfassen Biosynthesegene für die Zielsubstanz, Gene für die Produktion von Energie und verwandten Substanzen, wie Intermediate, die für die Biosynthese der Zielsubstanz eingesetzt werden, regulatorische Gene dafür und dergleichen. Spezifische Beispiele umfassen L-Tryptophanbiosynthesegene, L-Serinbiosynthesegene (insbesondere für die L-Tryptophanbiosynthese), pntAB-Gene und Gene von H⁺-ATPase.
Insbesondere wenn L-Tryptophan als Sinnaminosäure eingesetzt wird und ein L-Serinbiosynthesegen als Zielgen stromabwärts der erfindungsgemäßen Expressionskontrollsequenz in einem L-Tryptophan produzierenden Bacterium angehängt ist, wird die Expression des L-Serinbiosynthesegens erhöht, wenn die intrazelluläre Menge des angehäuften L-Tryptophans steigt. Der Zeitpunkt, wenn die intrazelluläre Menge des angehäuften L-Tryptophans steigt, ist auch der Zeitpunkt, an dem L-Serin, das eine der Substanzen für die L-Tryptophanbiosynthese ist, abnimmt. Deshalb kann die Expression des L-Serinbiosynthesegens nur erhöht werden, wenn L-Serin abnimmt. Andererseits kann das L-Serinbiosynthesegen in dem L-Tryptophan produzierenden Bacterium nicht immer hoch exprimiert werden, weil eine hohe Konzentration von L-Serin für das Wachstum der Zellen schädlich ist. Es wird dementsprechend gewürdigt, dass die erfindungsgemäße Expressionskontrollsequenz sehr nützlich ist, wenn sie vorgesehen ist, die Expression des L-Serinbiosynthesegens in dem L-Tryptophan produzierenden Bacterium zu erhöhen.
Das Bacterium, welches die Zielsubstanz produzieren kann und das DNA-Konstrukt enthält, kann dadurch erhalten werden, dass zugelassen wird, dass ein Bacterium, das die Zielsubstanz produzieren kann, das DNA-Konstrukt enthält oder die Fähigkeit zur Produktion der Zielsubstanz auf ein Bacterium, das das DNA-Konstrukt enthält, übertragen wird. Das Zulassen, dass das Bacterium das DNA-Konstrukt enthält, kann gemäß standardisierten gentechnologischen Verfahren durchgeführt werden. Die Übertragung der Fähigkeit zur Produktion der Zielsubstanz kann gemäß bekannten Verfahren durchgeführt werden. Wenn beispielsweise die Zielsubstanz CAT ist, kann ein Verfahren zum Einführen einer für Chloramphenicolacetyltransferase kodierenden DNA eingesetzt werden.
Das Verfahren, bei dem die intrazelluläre Konzentration der Sinnaminosäure verändert wird, ist beispielsweise ein Verfahren, bei dem die Konzentration der Sinnaminosäure in dem Medium, worin das Bacterium kultiviert wird, verändert wird, ein Verfahren, bei dem die Menge der Synthese oder des Abbaus der Sinnaminosäure in Zellen verändert wird. Das Verfahren, bei dem die Menge der Synthese oder des Abbaus der Sinnaminosäure in Zellen verändert wird, ist bevorzugt, weil die Produktion der Zielsubstanz mit der Produktion eines Intermediats und dergleichen für die Zielsubstanzproduktion gekoppelt sein kann. Die Änderung der Zielgenexpression kann dadurch bestimmt werden, dass die Menge des Genprodukts des Zielgens oder die Aktivität des Genprodukts gemessen wird, wenn das Genprodukt diese Aktivität hat.
BEISPIELE
Beispiel 1: Konstruktion der rekombinanten Plasmide, welche den natürlichen Attenuator und die künstlichen anti-Attenuatoren und deren Fragmente enthalten.
1. Konstruktion des Vektorplasmids pML-P_tac-ter_thrL-cat
Der Plasmidvektor pML-P_tac-ter_thrL-cat, welcher ein Co-1E1-ähnliches Replicon, ein Ap^R-Gen als selektiven Marker, den tac-Promoter (P_tac)(Russel D. R., Bennett G., Gene 20 (1982) 231), den synthetischen rho-unabhängigen Transkriptionsterminator des Leader-Peptids des thr-Operons (ter_thrL) von E. coli und den strukturellen Teil des Cat-Gens stromabwärts von P_tac enthält, wurde auf die folgende Weise konstruiert. Das Gen Cat, das von P_tac aus transkribiert wird, ist als Reporter in den weiteren Experimenten eingesetzt worden.
1.1. Konstruktion des pML-pp-Vektors
Zwei Plasmide wurden als Vorläufer für die Konstruktion des pML-pp-Vektors eingesetzt. Das erste war das von uns bereits früher beschriebene Plasmid pML24 (Trukhan et al., Biotechnologiya (auf Russisch) 4, Nr. 3 (1988) 325–334). Das zweite Plasmid war der käuflich erwerbbare (MBI "Fermentas", Litauen) Vektor pUC57 (GenBank/EMBL Hinterlegungsnummer Y14837). Das Schema der Konstruktion des pML-pp-Vektors auf der Grundlage standardisierter Genkonstruktionsverfahren (Sambrook et al., "Molecular cloning. Laboratory manual". (1989), zweite Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press) ist in 4 gezeigt.
1.2. Einführung des chemisch synthetisierten ter_thrL in dem Plasmid pML-pp-Vektor
Der synthetische rho-unabhängige Transkriptionsterminator des thr-Operon-Leader-Peptids von E. coli wurde durch das Verknüpfen von zwei chemisch synthetisierten Oligonucleotiden der folgenden Strukturen konstruiert:
und
Das doppelsträngige DNA-Fragment mit den einzelsträngigen "kohäsiven" Enden, die typischerweise nach der Behandlung mit XbaI und BamHI erhalten werden, wurde nach dem Verknüpfen der synthetischen Oligonucleotide konstruiert.
Dieses Fragment wurde durch T4-Polynucleotidekinase gemäß Standardverfahren phosphoryliert und in den Plasmid-pML-pp-Vektor, der mit XbaI und BamHI geschnitten worden war, kloniert. Die Übereinstimmung zwischen der gewünschten und der erhaltenen Plasmidstruktur wurde anhand von Restriktionsanalyse und DNA-Sequenzierung des eingeführten Fragments gezeigt.
1.3. Molekulares Klonen von P_tac
Die DNA-Amplifikation durch PCR wurde für das molekulare Klonen des Hybridpromotors (P_tac) durchgeführt. Zwei Oligonucleotide wurden zu diesem Zweck chemisch synthetisiert:
und
und das käuflich erwerbbare Plasmid pDR540 (Pharmacia, Schweden), welches den P_tac-Promotor trägt, wurde als Matrize für die PCR eingesetzt.
Diese Oligonucleotide trugen die Sequenzen stromaufwärts (III) und stromabwärts (IV) des Promotors, wie in 5 gezeigt. Sie trugen außerdem die Sequenzen, die von mehreren Restriktionsendonucleasen (KpnI und XbaI) erkannt werden (vergleiche 5), um das folgende molekulare Klonen zu erleichtern. Das amplifizierte DNA-Fragment wurde mit KpnI und XbaI behandelt und in den vorher erhaltenen (vergleiche Punkt 1.2.) Plasmidvektor, der mit denselben Restriktasen geschnitten worden war, molekular kloniert. Das ausgewählte rekombinante Plasmid wurde pML-P_tac→ter_thrL→cat genannt und als ein Vektor in den weiteren Experimenten eingesetzt.
2. Konstruktion der Plasmide mit den natürlichen und künstlichen Transkriptionsregulationselementen
Das vorstehend beschriebene Plasmid pML-P_tac→ter_thrL→cat wurde als Vektor für die Bildung aller interessierenden Plasmide eingesetzt. Überdies wurde der folgende Satz Oligonucleotide chemisch synthetisiert:
Diese Oligonucleotide wurden als Primer für die DNA-Amplifikation durch PCR wie nachstehend beschrieben eingesetzt. Der andere Satz Oligonucleotide:
wurde direkt in dem Verfahren der Rekonstruktion des 3'-terminalen Teils des neuen künstlichen Attenuators eingesetzt (vergleiche nachstehend).
2.1. Konstruktion des Plasmids pML-P_tac-an3:an4(an4:an5)-cat
Das Plasmid wurde auf der Grundlage von pML-P_tac→ter_thrL→cat durch Insertion des doppelsträngigen DNA-Fragments, das von den chemisch synthetisierten Oligonucleotiden gebildet wurde (olig6, olig7, olig8 und olig9) anstelle von ter_thrL zwischen dem Promotor P_tac und dem strukturellen Teil des Cat-Gens konstruiert (vergleiche 6). Zu diesem Zweck wurden anfänglich 650 ng olig7 und 650 ng olig9 durch T4-Polynucleotidkinase ("MBI Fermentas", Litauen) gemäß dem vorgeschlagenen Protokoll phosphoryliert. Zwei Gemische, die-430 ng oligo plus 650 ng phosphoryliertes olig9 und 430 ng olig8 plus 650 ng phosphoryliertes olig7 in 30 μl des "Y+/Tango"-Puffers ("MBI Fermentas", Litauen) enthielten, wurden 5 Minuten bei unter 100°C erwärmt und dann 5 Minuten bei 75°C verbunden. Nach dem Zusammenmischen wurden sie 5 Minuten bei unter 60°C erwärmt und dann 10 Minuten bei 20°C verbunden. Danach wurden 5 Einheiten T4-DNA-Ligase ("MBI Fermentas", Litauen) und 0,5 μl 100 mM ATP zugegeben, und es wurde 4 Stunden bei 22°C und über Nacht bei 4°C inkubiert. Das Gemisch wurde 10 Minuten bei 68°C erwärmt und dann einer Gelelektrophorese unterworfen. Die gut zu erkennende DNA-Bande wurde unter Einsatz der Low-Melting-Point-Agarosetechnik isoliert. Das erhaltene doppelsträngige DNA-Fragment (108 bp Länge) wurde mit XbaI ("MBI Fermentas", Litauen) wie vom Hersteller vorgeschlagen behandelt. 360 ng dieses Fragments wurden an 50 ng des Vektors pML-P_tac→ter_thrL→cat ligiert, der aus dem Stamm E. coli (dam^–) hergestellt und mit XbaI geschnitten worden war. In allen Fällen, in denen das Vektorplasmid pML-P_tac→ter_thrL→cat und die rekombinanten Plasmide, die auf dessen Basis erhalten wurden, durch die Restriktase XbaI geschnitten werden muss, muss die Plasmid-DNA von dem Stamm E. coli (dam^–) bereitgestellt werden, weil die XbaI-Restriktionsstelle in diesen Plasmiden mit der GATC-Sequenz überlappt, so daß die Plasmid-DNA, die aus dem Stamm E. coli (dam⁺) gereinigt worden war, durch XbaI nicht geschnitten werden konnte. Die Ligation wurde mit 3 u T4-DNA-Ligase bei 4°C über Nacht durchgeführt. Das erhaltene Gemisch wurde mit BamHI ("MBI Fermentas", Litauen) gemäß Standardprotokoll behandelt. In der letzten Stufe wurde dieses DNA-Gemisch auf ein Volumen von 60 μl mit T4-DNA-Ligasepuffer verdünnt und über Nacht bei 4°C mit 5 Einheiten T4-DNA-Ligase behandelt. Das erhaltene Gemisch wurde in den Stamm HB101 überführt, und Kolonien wurden auf die gewünschte Konstruktion gescreent. Auf diese Weise wurde das Plasmid pML-P_tac-an3:an4(an4:an.5)-cat erhalten, und seine Struktur wurde durch Restriktionsanalyse und DNA-Sequenzierung gemäß dem standardisierten Sanger-Verfahren bestätigt. Wir nehmen an, dass das erhaltene Plasmid, das die transkribierte DNA-Fragment enthält, die Bildung einer anti-Terminator-Haarnadelstruktur an3:an4 ermöglicht (die Terminator- Haarnadelstruktur an4:an7 konnte nicht gebildet werden, weil an3:an4 vorher synthetisiert wird).
2.2. Konstruktion des Plasmids pML-Ptac-an4:an5-cat
Das vorstehend beschriebene Plasmid pML-Ptac-an3:an4(an4:ans)-cat wurde als Vorläufer für die Konstruktion der nächsten rekombinanten DNA eingesetzt. Sie wurde als Matrize für die DNA-Amplifikation durch PCR des Fragments eingesetzt, das die letzte Haarnadelstruktur an4:an5 der neuen Regulationsregion kodiert. Für diese PCR wurden die Oligonucleotide olig5 und cat3' als Primer eingesetzt (vergleiche 6). Das erste Oligonucleotid entspricht dem Anfang des Teils des vorher klonierten Fragments, das die Haarnadelstruktur an4:an5 kodiert, es hat jedoch zusätzlich die Nucleotide, die von XbaI erkannt werden, in der Nähe des 5'-Endes (vergleiche 6). Das zweite Oligonucleotid, cat3', entspricht dem Fragment des kodierenden Teils des Cat-Gens (Position +219–+245, wenn das A des ATG-Initiations-Codons von CAT als "+1" gezählt wird) (vergleiche 6). Das doppelsträngige DNA-Fragment, das durch PCR erhalten wurde, wurde mit XbaI behandelt, mit dem Vektorplasmid pML-P_tac→ter_thrL→cat, das durch dieselbe Restriktase geschnitten worden war, ligiert, und dann wurde mit BamHI behandelt und das Produkt durch T4-DNA-Ligase wieder zum Ring geschlossen. Somit wurde das interessierende Plasmid, pML-Ptac-an4:an5-cat, erhalten.
2.3. Konstruktion des Plasmids pML-Ptac-trpL-cat
Für die Konstruktion des Plasmids, welches das natürliche Gen des trp-Operon-Leader-Peptids (trpL-Gen) von E. coli unter der Transkriptionskontrolle des P_tac-Promotors trägt, wurde die chromosomale DNA des Stammes E. coli MG1655, dessen gesamte Genomsequenz bestimmt worden war, als Matrize für die PCR eingesetzt. Die Oligonucleotide olig1 und olig4, die den 5'- und 3'-terminalen Teilen des trpL-Gens entsprechen (vergleiche 7), wurden als Primer für die DNA-Amplifikation eingesetzt. Aus 7 geht hervor, dass diese Primer zusätzlich die flankierenden Erkennungsstellen XbaI und BamHI (entsprechend in olig1 und olig4) enthalten, um die folgende Manipulation zu erleichtern. Das doppelsträngige DNA-Fragment mit einer Länge von 175 bp wurde durch XbaI und BamHI behandelt und danach in das Vektorplasmid pML-P_tac→ter_thrL→cat, das mit denselben Restriktasen geschnitten worden war, kloniert. Das erhaltene Plasmid, das das natürliche trpL-Gen anstelle von ter_thrL in dem Vektorplasmid enthält, wurde als pML-P_tac-trpL-cat bezeichnet.
2.4. Konstruktion des Plasmids pML-P_tac-anti_att-I-cat
Das vorstehend beschriebene Plasmid pML-P_tac-trpL-cat wurde als Matrize in der PCR für die Erzeugung der folgenden rekombinanten DNA eingesetzt. In diesem Verfahren wurde das vorstehend beschriebene Oligonucleotid olig1, sowie olig3 als Primer eingesetzt. olig3 entspricht dem zentralen Teil des natürlichen trpL-Gens und trägt zusätzlich die BglII-Erkennungsstelle an seinem 5'-Terminus (vergleiche 7). Nach der DNA-Amplifikation durch PCR wurde das erhaltene doppelsträngige Fragment mit einer Länge von 133 bp mit XbaI behandelt, mit dem Plasmid pML-P_tac-an3:an4(an4:an5)-cat, das mit derselben Restriktase geschnitten worden war, ligiert, und dann wurde das Produkt mit BglII hydrolysiert und mit T4-DNA-Ligase ein Ringschluss durchgeführt. Das erhaltene Plasmid, welches den künstlichen anti-Attenuator zwischen dem P_tac-Promotor und dem strukturellen Teil des Cat-Gens trägt, wurde als pML-P_tac-anti_att-I-cat bezeichnet.
2.5. Konstruktion des Plasmids pML-P_tac-anti_att-II-cat
Die Konstruktion des rekombinanten Plasmids, welches den künstlichen anti-Attenuator mit der hocheffizienten Ribosomenbindungsstelle (RBS) des Phagen T7 Gen10 stromaufwärts des kodierenden Teils des natürlichen Leader-Peptids des trp-Operons von E. coli enthält, wurde auf die folgende Weise bereitgestellt. Zuerst wurde das doppelsträngige DNA-Fragment durch PCR unter Einsatz von olig2 (vergleiche 7) und olig3 als Primer und der DNA des Plasmids pML-P_tac-trpL-cat als Matrize erhalten. Auf diese Weise wurde die Restriktionsschnittstelle für NdeI stromaufwärts des ATG-Initiations-Codons des Leader-Peptids rekonstruiert (die Nucleotide des ATG-Codons sind Teil der von NdeI erkannten Sequenz CATATG). Das erhaltene DNA-Fragment, das mit NdeI geschnitten worden war, wurde mit dem käuflich erwerbbaren Plasmidvektor pET-22b(+)("Novagen", USA), der mit NdeI geschnitten worden war, ligiert. Das Plasmid pET-22b(+) trägt RBS von T7 Gen10 zwischen den Restriktionsschnittstellen XbaI und NdeI. Das Produkt dieser Ligation wurde als Matrize für die PCR in der nächsten Stufe der Konstruktion eingesetzt. Das neue Oligonucleotid cr5' (vergleiche 8) sowie das vorher eingesetzte olig3 wurden als Primer für diese PCR verwendet. Das erhaltene doppelsträngige DNA-Fragment mit einer Länge von 210 bp wurde mit XbaI und BglII behandelt und in das Plasmid pML-P_tac-an3:an4(an4:an5)-cat gemäß dem für die Konstruktion von pML-P_tac-anti_att-I-cat eingesetzten Protokoll kloniert. Auf diese Weise wurde das neue Plasmid, das als pML-P_tac-anti_att-II-cat bezeichnet wurde und den künstlichen anti-Attenuator mit der RBS des Phagen T7 Gen10 in der 5'-nicht-translatierten Region des trp-Leader-Peptidgens trägt, erhalten. Die Strukturen aller Plasmide, welche die künstlichen Transkriptionsregulationselemente tragen, wurden durch die Restriktionsanalyse und durch Sequenzierung gemäß dem Standardverfahren nach Sanger untersucht.
Beispiel 2: Nachweis der akkumulierten Menge des Cat-Proteins in Stämmen, welche die rekombinanten Plasmide mit dem natürlichen trpL, den künstlichen anti-Attenuatoren und deren Fragmente enthalten.
Die vorstehend beschriebenen Plasmide (vergleiche Beispiel 1): pML-P_tac-an4:an5-cat, pML-P_tac-an3:an4(an4:an5)-cat, pML-P_tac-trpL-cat, pML-P_tac-anti_att-I-cat, pML-P_tac-anti_att-II-cat wurden in die Stämme E. coli TG1 (supE, hsd, thi, Δ(lac-proAB), F'[traD36, proAB⁺, lacI^Q, lacZΔM15]) und E. coli B7248 (trpB^–.Tn10, Str^R) gemäß Standardprotokollen unter Selektion der Plasmidträgerzellen auf dem Medium mit Ampicillin (100 μg/ml) eingeführt (Sambrook et al., "Molecular cloning. Laboratory manual". (1989), Zweite Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press). Die erhaltenen Zellkulturen wurden in den Röhrchen mit dem Flüssigmedium bei 37°C unter guter Belüftung gezüchtet. Als Kultivierungsmedium wurde L-Brühe mit zugesetztem Ampicillin für die von TG1 abgeleiteten Plasmidträgerstämme und das M9-Minimalmedium mit Ampicillin (100 μg/ml), Thiamin (5 μg/ml) und Tryptophan (10 μg/ml) für die Stämme eingesetzt, die auf der Grundlage von E. coli B7248 konstruiert wurden. Die von B7248 abgeleiteten Übernachtkulturen wurden 50-fach mit demselben Kulturmedium verdünnt, und die Kultivierung wurde 2–4 Stunden fortgesetzt, bis die optische Dichte bei 600 nm 1 war (OD600 = 1). Jedes der Kulturmedien wurde in zwei Teile geteilt, und Tryptophan (200 μg/ml) wurde zu einer der zwei Portionen gegeben. Die Kultivierung wurde 1 Stunde fortgesetzt, dann wurden Zellen durch Zentrifugation gewonnen, mit physiologischer Lösung gewaschen und in 1/10 des Anfangsvolumens von Kaliumphosphatpuffer resuspendiert. Dann wurden Zellen mit Ultraschall behandelt, die Zelltrümmer wurden durch Zentrifugation bei 4°C gewonnen. Die Proteinkonzentration in den Überständen wurde mit Bio-Rad Coumassie R250-Reagens nach dem vom Hersteller beschriebenen Protokoll gemessen. Die Chloramphenicolacetyltransferaseaktivität wurde nach dem herkömmlichen Verfahren gemessen (Schottel JL, Sninsky JJ, Cohen SN "Effects of alterations in the translation control region an bacterial gene expression: use of cat gene constructs transcribed from the lac promoter as a model system." Gene, 28 (1984) 177–193). In diesen Experimenten wurde 5,5'-Dithio-bis(2-nitrobenzoesäure) – das Ellman's-Reagens ("Sigma") – als spezifisches Reagens eingesetzt. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 1 des Haupttextes gezeigt.
Eine SDS-PAGE (0,1% SDS–12,5% PRAG-Elektrophorese) wurde zum Sichtbarmachen der angehäuften CAT in den von E. coli TG1 abgeleiteten Plasmid-tragenden Stämmen durchgeführt. Jeder Stamm wurde wie vorstehend beschrieben gezüchtet. Jede Kultur wurde in zwei Teile aufgetrennt. Die Kulturen wurden mit IPTG (bis zu 0,4 mM der Endkonzentration) supplementiert und 2 Stunden kultiviert. Dann wurden die Zellen geerntet, in SDS-Probenbeladungspuffer (60 mM Tris-HCl pH 6,8/2,3% SDS/10% Glycerin/5% β-Mercaptoethanol) resuspendiert und 15 Minuten gekocht. 10–20 μl der erhaltenen Suspension wurden als Probe auf PRAG aufgetragen und eine Elektrophoration wurde gemäß dem von Laemmli beschriebenen Verfahren durchgeführt (Laemmli V. K.// "Cleavage of structural Proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4". Nature 227 (1970) 680–685). Das Gel wurde mit Coomassie-blue eingefärbt, um die aufgetrennten Proteine nachzuweisen. Die entsprechenden Muster der erhaltenen Gele sind in 3 gezeigt. Sequenzliste

Claims

Expressionskontrollsequenz, welche die Expression eines Zielgens stromabwärts der Expressionskontrollsequenz in Abhängigkeit der intrazellulären Konzentration einer Aminosäure kontrolliert, wobei in einem Bacterium, das ein DNA-Konstrukt enthält, welches die Expressionskontrollsequenz, einen Promotor stromaufwärts der Expressionskontrollsequenz und das Zielgen stromabwärts der Expressionskontrollsequenz aufweist, die Häufigkeit der Termination der Transkription, die von dem Promotor aus startet, in der Expressionskontrollsequenz durch die Erhöhung der intrazellulären Konzentration einer Aminosäure verringert wird, wodurch die Expression des Zielgens erhöht wird; wobei die Expressionskontrollsequenz einen Bereich umfaßt, der für ein die Aminosäure enthaltendes Leader-Peptid kodiert, und einen ρ-abhägigen Terminator enthält, wobei, wenn die Translation des Leader-Peptids an dem Kodon der Aminosäure im Verlauf der Translation bei Unterversorgung mit dieser Aminosäure stoppt, eine Basenpaarungsstruktur des ρ-unabhängigen Terminators in einem Transkript der Expressionskontrollsequenz gebildet wird, wobei die Häufigkeit der Termination der Transkription in der Expressionskontrollsequenz erhöht wird; wobei die Expressionskontrollsequenz fünf Segmente an1 bis an5 in dieser Reihenfolge von der stromaufwärtigen Seite aufweist, wobei die Segmente an1 und an2 und eine für das Leader-Peptid kodierende Region von einer Sequenz eines Attenuators eines Tryptophan-Operons von Escherichia coli abgeleitet sind, die Segmente an4 und an5 von einer Sequenz eines Attenuators eines Histidin-Operons von Escherichia coli abgeleitet sind und das Segment an3 von einer Kombination der Sequenzen der Attenuatoren des Tryptophan-Operons und des Histidin-Operons abgeleitet ist; wobei das erste Segment mit dem Kodon der Aminosäure in dem Leader-Peptid überlappt; und wobei die Sequenz jedes Segments oder eines Teils davon und die Sequenz des benachbarten Segments oder eines Teils davon eine umgekehrte Wiederholungssequenz darstellen.
Expressionskontrollsequenz nach Anspruch 1, wobei das Leader-Peptid modifiziert worden ist, so daß es nicht weniger als 2 Tryptophanreste enthält.
Expressionskontrollsequenz nach Anspruch 1, welches die in 2 gezeigte künstliche TrpHis-anti-Attenuator-Sequenz umfaßt.
Verfahren zum Kontrollieren einer Expression eines Zielgens, welches die folgenden Stufen umfaßt: Kultivieren eines Bakteriums, das ein DNA-Konstrukt enthält, welches die Expressionskontrollsequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 3, einen Promotor stromaufwärts der Expressionskontrollsequenz und das Zielgen stromabwärts der Expressionskontrollsequenz umfaßt, in einem Kulturmedium und das Verändern der intrazellulären Konzentration einer Aminosäure, von der die Expressionskontrolle durch die Expressionskontrollsequenz abhängt, um die Expression des Zielgens zu kontrollieren.
Verfahren zum Herstellen einer Zielsubstanz, welches die Stufen umfaßt, bei denen ein Bakterium, das die Substanz herstellen kann, kultiviert wird, wobei die Substanz hergestellt wird und die Substanz gewonnen wird, wobei das Bakterium ein DNA-Konstrukt trägt, welches die Expressionskontrollsequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 3, einen Promotor stromaufwärts der Expressionskontrollsequenz und ein Zielgen umfaßt, das mit der Produktion der Zielsubstanz in Beziehung steht und stromabwärts der Expressionskontrollsequenz verbunden ist, und die intrazelluläre Konzentration einer Aminosäure, von der die Expressionskontrolle durch die Expressionskontrollsequenz abhängt, verändert wird, um die Expression des Zielgens zu kontrollieren.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei die intrazelluläre Konzentration der Aminosäure durch die Synthese oder den Abbau der Aminosäure durch das Bakterium verändert wird.