ES2230565T3 - Una secuencia de control de la expresion para una expresion general y eficaz de genes en plantas. - Google Patents
Una secuencia de control de la expresion para una expresion general y eficaz de genes en plantas.Info
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Abstract
SE DESCUBRE UNA SECUENCIA DE CONTROL DE EXPRESION QUE ES INTERMEDIARIA EN CUANTO A ESPECIFICIDAD POR TEJIDO ENTRE CONSTITUTIVA Y ESPECIFICA DE TEJIDO. ESTE PROMOTOR ES ESPECIFICO EN LA EXPRESION DE GENES EN LA MAYORIA DE TEJIDOS DE MAIZ, Y PUEDE UTILIZARSE PARA LA EXPRESION EFECTIVA DE GENES DE PROTEINAS DESEADOS EN PLANTAS.
Description
Una secuencia de control de la expresión para una
expresión general y eficaz de genes en plantas.
La invención se refiere a sistemas recombinantes
para crear plantas transgénicas que produzcan proteínas beneficiosas
para las plantas o que tengan interés por otro motivo. Más
particularmente, la invención se refiere a la expresión bajo el
control de secuencias de control de maíz que son generales de
tejido.
La transformación de plantas para proporcionar
características deseadas se practica desde hace tiempo. Son de
particular interés las plantas transgénicas resistentes a insectos
que tienen esta característica debido a su capacidad de producir
proteínas insecticidas, tales como la que produce B.
thuringiensis. De esta manera, se han desarrollado sistemas
recombinantes para la transformación de plantas que implican una
diversidad de promotores, tanto constitutivos (o sin especificidad
de tejido) como los que son activos sólo en ciertos tejidos.
Notablemente, el promotor 35S de CaMV (Odell, J. T. et al.
Nature (1985) 313:810-812); y el
promotor de la nopalina sintasa de Agrobacterium (Depicker,
A. Et al. , J Mol Appl Genet (1982)
1:561-573; An, G. Plant Physiol (1988)
88:547-552) se encuentran entre los mejor
conocidos, así como el promotor de la ubiquitina del maíz descrito
por Christensen, A.H. et al. Plant Mol Bio. (1992)
18:675-689. Adicionalmente, también son
conocidos promotores que tienen preferencia por tejidos verdes,
tales como la PEP carboxilasa (Hudspeth, R.L. y Grula, J.W. Plant
Mol Biol (1989) 12:579-589) y promotores
específicos de polen (Guerrero, F. D. et al. Mol Gen
Genet (1990) 224:161-168, Twell, D.
et al. Genes & Development (1991)
5:496-507, Albani, D. et al. The
Plant J (1992) 2:331-342).
En la creación de plantas transgénicas es
deseable que sean capaces de aprovechar la disponibilidad de más de
un solo promotor si se va a producir más de una sola proteína en la
planta modificada. El uso de secuencias reguladoras comunes que
dirigen la expresión de múltiples genes puede dar como resultado una
recombinación homóloga entre los diversos sistemas de expresión, la
formación de bucles en horquilla causada por la proximidad de dos
copias de la misma secuencia orientadas de forma opuesta, la
competición entre los diversos sistemas de expresión por unirse a
factores reguladores con especificidad de promotor y la inapropiada
fuerza del nivel de expresión con respecto a cada una de las
proteínas deseadas. Por todas estas razones, sería deseable tener un
repertorio de secuencias reguladoras operables en plantas con un
intervalo de fuerza y un intervalo de especificidades de tejido.
La presente invención proporciona un miembro
adicional de este repertorio - - la secuencia de control de
la transcripción/traducción supuestamente asociada con los genes de
la proteína DnaJ o de la proteína relacionada con DnaJ en el maíz,
denominada en este documento secuencia promotor/líder de ZmDJ1.
De esta manera, el promotor de la presente
invención está asociado con una secuencia codificante que muestra
homología con las secuencias publicadas de los genes de la proteína
DnaJ o de una proteína relacionada con DnaJ en bacterias (Bardwell,
J.C.A. et al. J Biol Chem (1986)
261:1782-1785; Anzola, J. et al.
Infection and Immunity (1992)
60:4965-4968; Narberhaus, F. et al.
J Bacteriol (1992) 174:3290-3299; van
Asseldonk, M. et al. J Bacteriol (1993)
175:1637-1644); de levaduras (Caplan, A.J.
et al. J Cell Biol (1991)
114:609-621; y Atencio, D.P. et al.
Mol Cellul Biol (1992) 12:283-291); y
las obtenidas de plantas (Bessoule, J.-J. FEBS Lett (1993)
323:51-54; Bessoule, J.-J. et al.
Plant Physiol Biochem (1994)
32:723-727; Preisig-Müler,
R. et al. Arch Biochem Biophys (1993)
305:30-37; y Zhu, J.-K. et al. The
Plant Cell (1993) 5:341-349). Por lo
visto, la función de estas proteínas en bacterias es ayudar al
plegamiento de proteínas mediado por chaperonas así como
proporcionar viabilidad celular a altas temperaturas; también están
implicadas en la replicación del ADN, en la traducción y en la
translocación de péptidos a través de las membranas intracelulares.
De esta manera, DnaJ parece importante en las funciones celulares
básicas y sería de esperar que tuviera eficacia en un amplio
intervalo de tejidos; por tanto, el promotor de ZmDJ1 tendrá un
perfil característico de especificidad tisular.
La invención proporciona un miembro adicional del
repertorio de secuencias de control que pueden usarse para la
expresión de genes extraños en plantas transgénicas. La
especificidad tisular de este promotor parece encontrarse entre los
promotores estrictamente constitutivos de CaMV y de la nopalina y
el promotor de polen con una alta especificidad de tejido.
Adicionalmente, basándose en las observaciones no publicadas de los
presentes solicitantes y de otros autores, el promotor de CaMV no
se expresa uniformemente en todos los tejidos de algunas plantas,
incluyendo el maíz, y se expresa poco en algunos tejidos.
En un aspecto, la invención se refiere a una
molécula de DNA aislada y purificada o recombinante que contiene una
secuencia de nucleótidos que representa la secuencia de control de
ZmDJ1 de la invención, mostrada desde la posición -812 a la -1 en la
Figura 1, y las subsecuencias relacionadas con la transcripción y la
traducción de la misma. Esta secuencia de control o, genéricamente,
el promotor, incluye las dos secuencias que controlan la
transcripción y una secuencia adicional que corresponde a cualquier
ARNm líder cadena arriba del codón de inicio de la traducción ATG
(AUG) mostrado en la figura 2.
Por consiguiente, la invención proporciona una
molécula de ADN purificada y aislada que contiene: la secuencia de
nucleótidos de la secuencia de control mostrada desde la posición
-812 a la -1 de la Figura 1; o un fragmento de dicha secuencia que
conserva la actividad de inicio de la transcripción.
Preferiblemente, dicha secuencia retiene la función de la secuencia
líder además de la actividad de inicio de la transcripción.
En otros aspectos, la invención se refiere a
vectores que contienen estas secuencias de control, típicamente
unidas a una secuencia codificante para la expresión de la secuencia
codificante en células vegetales o en plantas transgénicas. Por
consiguiente, la invención proporciona un vector recombinante que
contiene la secuencia de nucleótidos mostrada desde la posición -812
a la -1 en la figura 1 o un fragmento de dicha secuencia que
conserva la actividad de inicio de la transcripción.
La invención también proporciona un vector en el
que dicha secuencia está unida operativamente a la secuencia
codificante para una proteína deseada heteróloga para dicha
secuencia.
En otro aspecto más, la invención se refiere a
células vegetales, partes de plantas y plantas que contienen la
secuencia de nucleótidos mostrada desde la posición -812 a la 11 en
la Figura 1 o un fragmento de dicha secuencia que conserva la
actividad de inicio de la transcripción, unida operativamente a la
secuencia codificante de una proteína deseada heteróloga para dicha
secuencia. La secuencia codificante puede ser para una proteína
heteróloga para la célula, una parte o una planta en la que la
expresión está bajo el control de las secuencias de control de
ZmDJ1.
En otros aspectos adicionales, la invención se
refiere a métodos para transformar células vegetales, partes de
plantas o plantas para proporcionar una propiedad deseada. Tales
métodos comprenden modificar la célula, la parte o la planta para
que contenga la secuencia de la invención. En particular, se
proporciona un método para proteger a las plantas contra insectos u
hongos, comprendiendo dicho método proporcionar a dichas plantas una
secuencia de nucleótidos de la invención, como se ha descrito
anteriormente, unida operativamente a la secuencia codificante de
una proteína deseada heteróloga para dicha secuencia de nucleótidos,
donde dichas proteínas deseadas son proteínas insecticidas o
proteínas antifúngicas; y cultivar las plantas en condiciones para
la expresión de dicha secuencia codificante.
En otros aspectos adicionales, la invención se
refiere a construcciones antisentido y de formación de
triple-hélice útiles para controlar los niveles de
expresión.
De esta manera, se proporciona un DNA purificado
y aislado que comprende el complemento de la secuencia de
nucleótidos mostrada desde la posición -812 a la -1 de la Figura
1.
También se proporciona una composición de
moléculas de DNA de una sola cadena capaz de inhibir la actividad de
inicio de la transcripción y, opcionalmente, también la función de
la secuencia líder, de las secuencias de nucleótidos mostradas desde
la posición -812 a la -1 de la Figura 1, cuya composición consta de
moléculas de DNA que contienen una secuencia de nucleótidos capaz de
formar una triple hélice con el ácido nucleico de doble cadena con
una secuencia de nucleótidos desde la posición -812 hasta la -1 de
la Figura 1 y su complemento o con una porción de la misma.
Además, se proporciona un método para regular la
expresión de un gen bajo el control de la secuencia de control de
ZmDJ1 en células vegetales, partes de plantas o plantas,
comprendiendo dicho método modificar la célula, la parte o la planta
que contiene dicho gen bajo el control de dicha secuencia de control
de ZmDJ1 para que lleve el DNA de la invención o el RNA de la misma
secuencia de nucleótidos. En particular, la invención proporciona un
método para regular la expresión de un gen bajo el control de la
secuencia de control de ZmDJ1 en células vegetales, partes de
plantas o plantas, comprendiendo dicho método modificar una célula
vegetal, una parte de una planta o una planta que contiene dicho gen
bajo el control de dicha secuencia de control de ZmDJ1 para que
lleve una construcción antisentido que contenga la secuencia de
nucleótidos complementaria mostrada desde la posición -812 a la -1
de la Figura 1, o una porción suficiente de la misma para hibridar
con la secuencia de la Figura 1 en condiciones fisiológicas.
La invención también proporciona un método para
regular la expresión de un gen bajo el control de la secuencia de
control de ZmDJ1 en células vegetales, partes de plantas o plantas,
comprendiendo dicho método modificar la célula vegetal, la parte de
la planta o la planta que contiene dicho gen bajo el control de
dicha secuencia de control de ZmDJ1 para que contenga un ADN de
formación de triple hélice como se ha descrito anteriormente.
La invención también proporciona una célula
vegetal, una parte de una planta o una planta que contiene una
construcción antisentido que comprende el complementario de la
secuencia de nucleótidos mostrada desde la posición -812 a la -1 de
la Figura 1, o una porción suficiente de la misma para hibridar con
la secuencia de la Figura 1 en condiciones fisiológicas.
La invención también proporciona una célula
vegetal, una parte de una planta o una planta que contiene un ADN de
formación de triple hélice como se ha descrito anteriormente.
La Figura 1 muestra la secuencia de nucleótidos
de la secuencia de control de la invención.
La Figura 2 muestra la secuencia de nucleótidos
de un clon genómico de maíz que contiene la secuencia de control de
la invención y una región codificante cadena abajo.
La Figura 3 es un diagrama de pPH15897.
La Figura 4 es un diagrama de pPH15898.
La Tabla 1 resume los datos que muestran la
recuperación de sucesos transgénicos, los datos de bioensayos de
insectos y las puntuaciones de los ensayos ELISA en plantas,
demostrando la capacidad del promotor esbozado en la invención de
dirigir la expresión de un gen capaz de conferir resistencia al
barrenador del maíz europeo en las plantas de maíz.
La invención proporciona un promotor adicional y
una secuencia líder con un único perfil de especificidad tisular y
una fuerza transcripcional característica que es útil para
modificar plantas o sus células o partes para permitir que
produzcan proteínas extrañas. La secuencia de control tiene la
secuencia de nucleótidos mostrada desde la posición -812 a la -1 en
la Figura 1. La posición -1 de la Figura 1 está inmediatamente
cadena arriba del codón de inicio de la traducción ATG mostrado en
la Figura 2. De esta manera, la secuencia de control, a veces
denominada "promotor" en este documento, incluye tanto el
promotor de la transcripción como las secuencias intermedias
relevantes en la traducción, incluyendo aquellas que corresponden al
ARNm que no se traduce anterior al punto de inicio. Este grupo de
secuencias de control de la expresión es constitutivo en el sentido
de que es capaz de llevar a cabo la expresión de secuencias
codificantes unidas operativamente en una diversidad de tejidos
vegetales incluyendo el limbo de la hoja, el verticilo de la hoja,
el collar de la hoja, la corteza del tallo, la médula del tallo,
nudos del tallo, las raíces y las semillas, de una planta de once
semanas. Es particularmente útil en una realización preferida para
el control de Ostrinia nubilalis o el barrenador del maíz
europeo (ECB) en el maíz. En un trabajo previo se ha utilizado el
gen cryIA(b) de Bacillus thuringiensis bajo el
control del promotor 35S de CaMV así como este gen bajo el control
del promotor de la PEP carboxilasa de maíz y el promotor de polen
como se ha descrito por Koziel, M. G. et al.
Bio/Technol (1993) 11:194-200.
La recuperación de la secuencia de control de
ZmDJ1 se describe con detalle a continuación en este documento. Por
supuesto, como se proporciona la secuencia de nucleótidos completa,
no es necesario repetir este proceso de aislamiento; la secuencia de
nucleótidos puede simplemente construirse de novo usando un
equipo comercial estándar para la síntesis en fase sólida o por
cualquier otro método oportuno. Los métodos convencionales para
sintetizar moléculas de ácidos nucleicos de esta longitud se conocen
bien en la técnica actualmente.
El promotor de ZmDJ1 de la invención, como otros
promotores, tiene características inherentes que determinan los
niveles de transcripción que resultarán de su unión operativa a una
secuencia génica deseada. La operabilidad y fuerza del promotor se
controlan por factores de transcripción que son característicos de
entornos celulares particulares - - y, por extrapolación, para
factores característicos de tejidos particulares - - y pueden
variar también con el estado de desarrollo del tejido. Los factores
que influyen en la eficacia de la traducción asociada a las
características de la secuencia líder también serán variables. Por
lo tanto, aunque las plantas, que contienen células y tejidos
diferenciados, podrían modificarse sistémicamente insertando
sistemas de expresión bajo el control del promotor de ZmDJ1, la
eficacia de la transcripción y la traducción de la secuencia de
control se determinará por la célula o el tejido en el que se
encuentre y por el estado de desarrollo de la célula o tejido.
Además, como se conoce la secuencia de
nucleótidos del promotor y como se pueden adquirir fácilmente
técnicas para variar la secuencia de nucleótidos, se pueden
realizar modificaciones secundarias en la secuencia para alterar el
perfil de expresión dependiendo de la localización del tejido y el
estado de desarrollo. Según se desarrolla la bibliografía, se van
conociendo secuencias cortas que influyen en la especificidad
tisular, y pueden realizarse modificaciones de acuerdo con estas
secuencias.
La región de la secuencia de control se ha
definido como la secuencia entre las posiciones -812 y -1 cadena
arriba del sitio de traducción, como se describe adicionalmente más
adelante. Sin embargo, es posible que no sea necesaria la secuencia
entera para promover la expresión de los genes unidos operativamente
de manera eficaz. Está claro, por ejemplo, que esta secuencia de
nucleótidos contiene tanto un promotor de la transcripción como una
porción correspondiente a una secuencia "líder" cadena arriba
transcrita en el ARNm intermedio inmediatamente cadena arriba del
codón de inicio de la traducción. De esta manera, el promotor de la
transcripción podría usarse para realizar la expresión
independientemente del líder homólogo, de manera similar, la
secuencia líder podría usarse en combinación con un promotor
heterólogo. Por consiguiente, también pueden usarse fragmentos de la
secuencia de control que conserven la actividad de inicio de la
transcripción y opcionalmente también la función de la secuencia
líder y están incluidos en la definición de secuencia control de
ZmDJ1. Además, es posible que sólo se requieran porciones del
promotor de la transcripción. La eficacia de tales fragmentos se
puede someter a ensayo fácilmente usando sistemas de expresión con
marcadores como los conocidos en la técnica.
Puede construirse un vector donde una secuencia
de nucleótidos codificante deseada está bajo el control del promotor
de ZmDJ1 por métodos conocidos en la técnica. La descripción de este
documento proporciona una forma del promotor con sitios de
restricción en cualquier extremo; estos sitios de restricción pueden
usarse directamente o, como alternativa, se pueden hacer
modificaciones para emplear otros sitios de restricción. Usando
técnicas estándar de escisión de genes, el promotor de ZmDJ1 puede
unirse a una distancia apropiada del sitio de inicio de la
traducción del gen que codifica cualquier proteína deseada. El gen
incluirá no sólo la región codificante, sino también las regiones
no traducidas cadena arriba y cadena abajo indígenas para la
secuencia codificante o heteróloga o parcialmente heteróloga para la
misma. Tales variaciones son bien conocidas por los especialistas
en la técnica. De esta manera, el vector recombinante contendrá
sitios de inicio de la transcripción y la traducción, así como
secuencias de terminación de la transcripción y la traducción, como
parte o además de las secuencias codificantes de la proteína deseada
y el promotor de ZmDJ1. Tales secuencias de terminación incluyen,
pero sin limitación, la secuencia 3' de la octopina sintasa de
Agrobacterium (Gielen et al. EMBO J (1984)
3 : 835-846), la secuencia 3' de la nopalina
sintasa (Depicker et al. Mol and Appl Genet (1982)
1 : 561-573) o la secuencia 3' del inhibidor
II de la proteinasa de la patata (PinII) (An et al. Plant
Cell (1989) 1 : 115-122). Típicamente se
incluyen sitios únicos para enzimas de restricción en los extremos
5' y 3' de los sistemas de expresión para permitir una fácil
inserción en un vector preexistente.
Las proteínas idóneas cuya producción podría
desearse en las plantas incluyen proteínas insecticidas, proteínas
antifúngicas, enzimas, proteínas nutricionales, y proteínas cuya
producción se desea per se tales como eritropoyetina,
insulina humana, citoquinas, interferones, hormonas del crecimiento,
gonadotropinas, inmunoglobulinas y otras proteínas de interés
farmacéutico. Son particularmente útiles la familia de los genes cry
de B. thuringiensis, incluyendo, pero sin limitación
cryIA(b), y cryIIa y otros.
Preferiblemente, la secuencia de control de ZmDJ1
se coloca aproximadamente a la misma distancia del sitio de inicio
de la traducción que la que existe desde el sitio de inicio de la
traducción en su entorno natural. Como se conoce en la técnica, sin
embargo, pueden tener cabida algunas variaciones en esta distancia
sin perder la función del promotor.
Entonces se puede obtener un vector recombinante
que es apropiado para la transformación de plantas superiores. El
vector también puede contener típicamente un gen marcador
seleccionable por el que se puedan identificar las células vegetales
transformadas en el cultivo. Habitualmente, el gen marcador
codificará resistencia a un antibiótico. Estos marcadores incluyen
los de resistencia a G418, higromicina, bleomicina, kanamicina,
neomicina y gentamicina. Tras la transformación de las células
vegetales, aquellas células que tengan el vector se identificarán
por su capacidad de crecer en un medio que contenga el antibiótico
en particular. Como alternativa, el vector con el sistema de
expresión, y los vectores con los marcadores génicos seleccionables
de plantas se podrían introducir en plásmidos separados, seguido de
la identificación de las células vegetales que contienen ambos
grupos de secuencias.
Generalmente también se incluyen secuencias de
replicación de origen bacteriano o viral para permitir que el vector
se clone en un hospedador bacteriano o fágico, preferiblemente se
incluye una amplia serie de hospedadores con origen de replicación
procariótico. También debe incluirse un marcador seleccionable para
bacterias para permitir la selección de células bacterianas que
lleven la construcción deseada. Los marcadores seleccionables
procarióticos adecuados también incluyen resistencia a antibióticos
tales como ampicilina, kanamicina y tetraciclina.
En el vector también pueden estar presentes otras
secuencias de ADN codificantes de funciones adicionales, como se
sabe en la técnica. Por ejemplo, en el caso de transformaciones de
Agrobacterium, también se incluirán secuencias de
ADN-T para la transferencia posterior a los
cromosomas de la planta.
Las secuencias de la invención se pueden
introducir en las plantas de maneras variadas conocidas en la
técnica.
Todos los tipos de plantas son sujetos apropiados
para la transformación "directa"; en general, solo las
dicotiledóneas pueden transformarse usando infección mediada por
Agrobacterium, aunque se han hecho recientes progresos en la
transformación de monocotiledóneas usando este método.
En un tipo de transformación directa, se
microinyecta el vector directamente en las células vegetales usando
micropipetas para transferir mecánicamente el DNA recombinante
(Crossway Mol Gen Genetics (1985) 202 :
179-185). En otro tipo, el material genético se
transfiere a la célula vegetal usando polietilenglicol (Krens,
et al. Nature (1982) 296 :
72-74), o se usa penetración balística de alta
velocidad por medio de partículas pequeñas con el ácido nucleico
bien en la matriz de pequeñas perlas o partículas, o bien en la
superficie (Klein, et al. Nature (1987) 327 :
70-73). En otro método más, se fusionan
protoplastos con otras entidades que contienen el DNA que se desea
introducir. Estas entidades son minicélulas, células, lisosomas u
otros cuerpos con superficie lipídica que se pueda fundir (Fraley,
et al. Proc Natl Acad Sci USA (1982) 79 :
1859-1863).
El DNA también puede introducirse al interior de
las células vegetales por electroporación (Fromm et al.
Proc Natl Acad Sci USA (1985) 82 : 5824). En esta
técnica, se electroporan protoplastos vegetales en presencia de
plásmidos que contienen el sistema de expresión. Los impulsos
eléctricos de alta fuerza de campo permeabilizan reversiblemente
las biomembranas permitiendo la introducción de los plásmidos. Los
protoplastos vegetales electroporados rehacen la pared celular, se
dividen y se regeneran.
Para la transformación mediada por infección
bacteriana, una célula vegetal se infecta con Agrobacterium
tumefaciens o A. rhizogenes previamente transformados con
el DNA a introducir. Agrobacterium es un género
representativo de la familia gram-negativa
Rhizobiaceae. Sus especies son responsables de la agalla del cuello
(A. tumefaciens) y la enfermedad de raíces peludas (A.
rhizogenes). En los tumores de agallas de cuello y en las
raíces peludas se induce a las células vegetales para que produzcan
derivados de aminoácidos conocidos como opinas, que sólo se
catabolizan por las bacterias. Los genes bacterianos responsables de
la expresión de opinas son una fuente conveniente de elementos de
control para sistemas de expresión quiméricos. Además, se pueden
usar ensayos de la presencia de opinas para identificar los tejidos
transformados.
Pueden introducirse secuencias genéticas
heterólogas en células vegetales apropiadas por medio del plásmido
Ti de A. tumefaciens o el plásmido Ri de A.
rhizogenes. El plásmido Ti o Ri se transmite a las células
vegetales tras la infección por Agrobacterium y se integra
establemente en el genoma vegetal (Schell, J. Science (1987)
237 : 1176-1183). Los plásmidos Ti y Ri
contienen dos regiones esenciales para la producción de células
transformadas. Una de éstas, llamada DNA transferido
(ADN-T), se transfiere a los núcleos vegetales e
induce la formación de tumores o de raíces. La otra, calificada
como región de virulencia (vir), es esencial para la
transferencia del ADN-T, pero no se transfiere por
sí misma. El ADN-T se transferirá al interior de la
célula vegetal aunque la región vir esté en un plásmido
diferente (Hoekema et al. Nature (1983) 303 :
179-189). La región de DNA transferida puede
incrementar de tamaño por la inserción del DNA heterólogo sin
afectar a su capacidad para ser transferida. De esta manera, un
plásmido Ti o Ri modificado en el que se han delecionado los genes
inductores de tumores, puede usarse como vector para la
transferencia de las construcciones génicas de esta invención en una
célula vegetal apropiada.
La construcción de plásmidos Ti o Ri
recombinantes en general sigue métodos que típicamente se usan con
los vectores bacterianos más habituales, tales como pBR322.
Adicionalmente, se puede hacer uso de elementos génicos accesorios
que a veces se encuentran en plásmidos nativos y otras veces se
construyen a partir de secuencias extrañas. Éstos pueden incluir,
pero sin limitación, "vectores lanzadera", (Ruvkum and Ausubel
Nature (1981) 298 : 85-88),
promotores (Lawton et al. Plant Mol Biol (1987)
9 : 315-324) y genes estructurales para
resistencia a antibióticos como factor de selección (Fraley et
al. Proc Natl Acad Sci (1983) 80 :
4803-4807).
Hay dos clases de sistemas vectoriales de
plásmidos Ti y Ri recombinantes que se usan actualmente. En una
clase, llamada "cointegrado", el vector lanzadera que contiene
el gen de interés se inserta por recombinación genética en el
plásmido Ti no oncogénico que contiene tanto los elementos de
actuación cis como los elementos de actuación trans
que se requieren para la transformación de plantas, tales como, por
ejemplo, en el vector lanzadera pMLJ1 de DeBlock et al.
EMBO J (1984) 3 : 1681-1689 y el
plásmido Ti no oncogénico pGV3850 descrito por Zambryski et
al. EMBO J (1983) 2 : 2143-2150.
En la segunda clase o sistema "binario", el gen de interés se
inserta en un vector lanzadera que contiene los elementos de
actuación cis requeridos para la transformación de plantas.
Las otras funciones necesarias se proporcionan en trans por
el plásmido Ti no oncogénico como se ejemplifica por el vector
lanzadera pBIN19 descrito por Bevan, Nucleic Acids Research
(1984) 12 : 8711-8721 y el plásmido Ti no
oncogénico PAL4404 descrito por Hoekma, et al. Nature
(1983) 303 : 179-180. Algunos de estos
vectores están disponibles comercialmente.
Hay dos maneras habituales de transformación de
células vegetales con Agrobacterium: cocultivo de
Agrobacterium con protoplastos aislados cultivados, o
transformación de células o tejidos intactos con
Agrobacterium. La primera manera requiere un sistema de
cultivo establecido que permita el cultivo de protoplastos y la
regeneración vegetal posterior a partir de los protoplastos
cultivados. El segundo método requiere (a) que tejidos vegetales
intactos, tales como cotiledones, puedan transformarse por
Agrobacterium y (b) que las células o tejidos transformados
puedan inducirse para regenerar plantas enteras.
La mayoría de las especies dicotiledóneas pueden
transformarse por Agrobacterium, ya que todas las especies
que son hospedadores naturales de Agrobacterium son
transformables in vitro. Las plantas monocotiledóneas, y en
particular los cereales, no son hospedadores naturales de
Agrobacterium. Hasta hace poco, ha resultado insatisfactorio
intentar transformarlas usando Agrobacterium
(Hooykas-Van Slogteren et al. Nature
(1984) 311 : 763-764). Sin embargo, ahora
están aumentando los indicios de que ciertas monocotiledóneas
pueden transformarse por Agrobacterium. Usando nuevas
estrategias experimentales, ahora pueden transformarse especies de
cereales tales como el centeno (de la Pena et al.
Nature (1987) 325 : 274-276), el maíz
(Rhodes et al. Science (1988) 240 :
204-207), y el arroz (Shimamoto et al.
Nature (1989) 338 : 274-276).
La identificación de células o plantas
transformadas se consigue generalmente incluyendo un marcador
seleccionable en el vector de transformación u obteniendo evidencias
de una infección bacteriana adecuada.
Tras la inserción de las secuencias de la
invención, las plantas pueden regenerarse por métodos estándar.
La regeneración de las plantas a partir de
protoplastos cultivados se describe en Evans et al.
Handbook of Plant Cell Cutures, vol.1: (MacMillan Publishing
Co. Nueva York, 1983); y Vasil I.R. (ed.) Cell Culture and
Somatic Cell Genetics of Plants, Acad. Press, Orlando, Vol.I,
1984, y Vol. II, 1986). Se sabe que prácticamente todas las plantas
pueden regenerarse a partir de células o tejidos cultivados,
incluyendo pero sin limitación el maíz, girasol, sorgo,
Brassica sp., Arabidopsis, tabaco, tomate, trigo,
centeno, así como todas las especies principales de caña de azúcar,
remolacha azucarera, algodón, árboles frutales, y legumbres.
El medio para la regeneración varía de unas
especies de plantas a otras, pero generalmente se proporciona
primero una suspensión de protoplastos transformados o una placa de
petri que contenga explantes transformados. Se forma tejido de callo
y se puede inducir la formación de brotes a partir de los callos y
posteriormente la formación de raíces. Como alternativa, en el
tejido calloso puede inducirse la formación del embrión somático.
Estos embriones somáticos germinan igual que los embriones naturales
para formar plantas. El medio de cultivo contendrá generalmente
varios aminoácidos y hormonas vegetales, tales como auxina y
citoquinas. Es también ventajoso añadir ácido glutámico y prolina al
medio, especialmente para especies tales como el maíz y la alfalfa.
La regeneración eficaz dependerá del medio, del genotipo, y de la
historia del cultivo. Si se controlan estas tres variables, entonces
la regeneración normalmente es reproducible y repetible.
Se ha demostrado que un gran número de plantas
son capaces de regenerarse a partir de células individuales
transformadas para obtener plantas enteras transgénicas. Después de
que el sistema de expresión está incorporado establemente en las
plantas transgénicas regeneradas, se puede transferir a otras
plantas mediante cruces sexuales. Se puede usar cualquiera de varias
técnicas estándar de reproducción, dependiendo de la especie que se
vaya a cruzar. Las plantas se desarrollan y recogen usando
procedimientos convencionales.
La disponibilidad de la secuencia de control de
ZmDJ1 permite diseñar materiales recombinantes que pueden usarse
para controlar la expresión de genes que se unen operativamente a la
secuencia promotora de la transcripción. Por ejemplo, el complemento
para la secuencia génica o una porción de la misma o un sistema de
expresión capaz de generar el complemento in situ
proporciona construcciones antisentido que pueden inhibir la
expresión. Si un sistema de expresión para el complemento se coloca
bajo el control de un promotor inducible, se proporciona un segundo
medio de control de la expresión. En la patente de Estados Unidos
Nº 5.107.065 se describe, en general, el uso de construcciones
antisentido para el control de la expresión en plantas.
Además del medio antisentido para controlar la
expresión, para el control de la expresión también se pueden usar
moléculas que se asocian con el surco mayor del DNA de doble cadena
para formar triples hélices. Pueden diseñarse oligonucleótidos
específicos de secuencia de acuerdo con las reglas conocidas para
proporcionar esta asociación específica a secuencias diana. Se
describen reglas de secuenciación apropiadas en Moser, H.E., et
al. Science (1987) 238 : 645-650;
Cooney, M. et al. Science (1988) 241 :
456-459.
De acuerdo con todo esto, la invención incluye
construcciones antisentido y oligonucleótidos que pueden formar
triples hélices con respecto a la secuencia de control de la
invención.
Los siguientes ejemplos pretenden ilustrar pero
no limitar la invención.
Se construyeron bibliotecas de ADNc en el vector
lambda GEM-4 a partir de ARNm aislado de raíces de 1
semana de edad, tallos de 1 y 8 semanas de edad, y tejidos de hoja
dañados de Zea mays L. (cv. B73) por medio de técnicas estándar de
aislamiento y preparación. Se cultivaron en placas aproximadamente
10^{6} placas de cada biblioteca y se sometieron a evaluación
diferencial usando poli(A)^{+}ARNm marcado de los
otros tejidos; se identificaron algunas placas que hibridaban
fuertemente en todas las bibliotecas usando todas las sondas de ARN
tisular. Se seleccionó una de las placas, denominada F3.7, que
tenía estas características.
Se confirmó la capacidad del clon F3.7 de
hibridar con el ARNm de una diversidad de tejidos. El análisis de
Northern demostró que estaba presente ARN hibridante en el limbo de
la hoja, el verticilo de la hoja, el collar de la hoja, la corteza
del tallo, la médula del tallo, nudos del tallo y las raíces de una
planta de once semanas de edad, así como en granos de maíz 4, 14 y
27 días después de la polinización. Aunque hubo alguna variabilidad
en la intensidad de las bandas, todos los tejidos de expresión,
después de lavados muy rigurosos, mostraron un transcrito de
aproximadamente 1,5 kb.
El clon de ADNc de F3.7 se secuenció por completo
en las dos direcciones por el método de terminación de cadena
didesoxi de Sanger y la secuencia resultante se comparó con
secuencias de la base de datos GenEMBL usando las rutinas de
búsqueda FASTA y TFASTA del paquete de análisis de secuencia GCG de
la Universidad de Wisconsin. Había una similitud de secuencia entre
el DNA aislado y el gen DnaJ o los genes de proteínas relacionados
con DnaJ de bacterias, levaduras, mamíferos y tres secuencias
vegetales publicadas recientemente.
Entonces, el ADNc de F3.7 se usó como sonda para
obtener el clon genómico correspondiente como se indica a
continuación. Se aislaron un fragmento de 320 pb EcoRI/ScaI y un
fragmento de 480 pb XhoI/XbaI que correspondían respectivamente a
los extremos 5' y 3' y se marcaron con
digoxigenina-11-dUTP por el método
de cebador aleatorio de acuerdo con la guía de usuarios del sistema
Genius^{TM} (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN). Se
recuperaron dos clones positivos de aproximadamente 1x10^{6}
placas de una biblioteca genómica de maíz construida en lambda DASH
(Stratagene, La Jolla, CA).
Se estudió uno de los dos clones hibridantes para
obtener un mapa de restricción parcial; se subclonaron tres
fragmentos de un producto de digestión de SacI/XhoI en pGEM7Zf(+)
(Promega, Madison, WI) y se secuenciaron por completo.
La información de la secuencia en combinación con
la alineación de la secuencia con otros clones de ADNc de DnaJ o
relacionados con DnaJ publicados se usó para determinar el supuesto
codón de inicio de la traducción. Basándose en esta información, se
construyeron cebadores oligonucleotídicos para amplificar 812 pares
de bases de la región 5' directamente cadena arriba del supuesto
codón de inicio de la traducción. El oligonucleótido DO2444
(5'-GGGTTTGAGCTCAAGCCGCAACAACAAAT) corresponde al
extremo 5' del supuesto promotor e incluye el sitio SacI nativo de
maíz. El oligonucleótido DO2445
(5'-GGGTTAGATCTAGACTTGCCTTTGCCTCCGGCGGT) corresponde
a la cadena antisentido del extremo 3' del supuesto promotor y
contiene secuencias introducidas de los sitios de restricción XbaI
y Bg1II. Usando estos cebadores, se amplificó la porción del
promotor del clon genó-
mico.
mico.
La secuencia de DNA de 3748 nucleótidos del clon
genómico recuperado se muestra en la figura 2. La región 5' no
traducida de 812 nucleótidos que contiene el promotor se muestra en
la figura 1.
Debe tenerse en cuenta que la región promotora no
contiene secuencias tipo TATAA o CCAAT y también es muy rica en GC
-- 78% GC en los primeros 100 nucleótidos cadena arriba, que es
característico de otros promotores sin TATAA descritos.
Una muestra del promotor amplificado por PCR se
digirió con SacI y XbaI y se clonó en los sitios correspondientes en
la secuencia de multiclonación de pBlueScript SK+ (Stratagene, La
Jolla, CA) para producir el vector pPHI5896. Una segunda muestra del
promotor se digirió con SacI y BglII combinadas con un fragmento de
2188 pb BamHI/EcoRI que contenía el gen uidA (GUS) fusionado a la
región de terminación 3' del inhibidor de la proteinasa de patata
(PinII), y estos fragmentos se clonaron juntos en pBlueScript SK+
digerido con SacI/EcoRI para obtener pPHI5897, dibujado en la figura
3. Una tercera muestra del promotor se digirió con SacI/BglII y se
combinó con (1) un fragmento BglII/StuI que contenía el equivalente
sintético del gen cryIIA de BT precedido de un equivalente
sintético de una secuencia de dirección de la zeína del maíz de 15
kD; (2) un fragmento HpaI/EcoRI que contenía el terminador 3' PinII,
y (3) un pBlueScript SK+ cortado con SacI/EcoRI. La combinación de
estos cuatro elementos generó pPHI5898, dibujado en la figura 4. De
esta manera, pPHI5897 contiene un sistema de expresión para el
marcador GUS y pPHI5898 contiene un sistema de expresión para cryIIA
de BT.
Cultivos en suspensión de la variedad Negra Dulce
Mejicana (BMS) del maíz, así como los cultivos de callos HiII de
maíz regenerables, se transformaron con pPHI5897 o una región de
inserción de pPHI5898 que carecía de las secuencias del vector
BlueScript. Se cobombardeó un vector que contenía el gen marcador
seleccionable para proporcionar una selección de células
transformadas. Este vector contiene el marcador seleccionable PAT
detrás del promotor 35S de CaMV. En experimentos paralelos, se
transformaron en células vegetales vectores o insertos que contenían
los genes uidA o cryIIA bajo el control del promotor 35S de CaMV, o
el gen cryIIA bajo el control del promotor de la ubiquitina del
maíz.
Tras el bombardeo, los callos de BMS resultantes
se transfirieron a un medio no selectivo y se incubaron en la
oscuridad durante dos días, luego se resuspendieron y se pusieron en
placas en un medio de selección que contenía 25 mg/l de BASTA
(Hoescht, Alemania).
Los cultivos de Hi-II después del
bombardeo resultantes se incubaron a 27ºC en la oscuridad durante
seis días seguido de la transferencia a un medio de selección que
contenía 3 mg/l de bialophos (Meiji Seika, Japón). Aproximadamente
seis semanas después, las supuestas colonias transformadas se
transfirieron a un medio de regeneración y tras varias semanas, los
embriones en desarrollo o las estructuras escutelares se
transfirieron y cultivaron separadamente en presencia de luz. De
esta manera, se recuperaron plántulas de maíz transgénico.
Tanto los sistemas de expresión que contenían la
secuencia de control de la invención como los sistemas de control de
la expresión que contenían 35S de CaMV mostraron una fuerte
expresión de GUS en los cultivos de callos 24 horas después de
añadir la solución sustrato donde los callos transgénicos o los
tejidos vegetales Hi-II se muestrearon e incubaron
durante 24 horas en tinte de McCabe. La expresión de GUS se hizo
detectable a las cuatro horas. El nivel de expresión del promotor
de la invención parecía ser aproximadamente un 50% del conseguido
por el promotor 35S de CaMV. Además, en tejidos vegetales cultivados
hasta la maduración (4-8 días después de la
polinización), se evaluó la expresión de GUS tanto histoquímicamente
como por determinación semicuantitativa de la proteína GUS en los
tejidos. Se detectaron cantidades significantes de GUS en la mayoría
de los tejidos examinados incluyendo hojas lacias, hojas de la parte
media de la planta, parte superior e inferior del tallo, raíz,
granos y mazorca, expresándose también en algunos casos en tejido
de antera o en polen. Esta expresión se observó en varios casos de
transformación independientes, con alguna variación relativa entre
casos.
De una forma similar, se usan plántulas
transformadas con pPHI5898 así como los casos positivos para callos
de BMS o las plantas procedentes de casos positivos para
Hi-II en bioensayos de alimentación. Se permite que
las larvas se alimenten ad libitum en los tejidos
transgénicos o tejidos equivalentes sin cryIIA. Se evalúan la
pérdida de peso de los insectos y su mortalidad y se demuestra que
la proteína BT se produce bajo el control del promotor de la
invención. La expresión de la proteína de BT en tejidos vegetales
transgénicos se confirmó por análisis de Western de extractos de
proteínas. La cantidad de proteína de BT también se evaluó usando
ensayos ELISA.
La Tabla 1 proporciona una comparación de las
puntuaciones obtenidas en los bioensayos con insectos y el ensayo
ELISA para construcciones en las que el promotor de ZmDJ1 o el
promotor de la ubiquitina de maíz dirige la expresión del gen
cryIIa, como se describe en el texto. Los datos incluyen el
número total de casos que a) se confirmaron por la presencia del
gen cryIIa mediante ELISA o PCR, y b) la eficacia frente a
ECB después de la infestación y análisis de bioensayo, así como las
puntuaciones reales del ELISA para los casos que se infestaron con
larvas de ECB.
| \begin{minipage}[t]{150mm} * Un control susceptible A63 tuvo una puntuación media de ECB de 2,0, mientras que un control resistente EB90-DA tuvo una puntuación media de ECB de 8,5. \end{minipage} |
| ** No se disponía de datos ELISA para 2 de los 25 casos ZmDJ1::cryIIa infestados. |
Claims (18)
1. Una molécula de ADN aislada y purificada que
comprende: la secuencia de nucleótidos de la secuencia de control
mostrada desde la posición -812 a la - 1 de la Figura 1; o un
fragmento de dicha secuencia que conserva la actividad de inicio de
la transcripción.
2. Una molécula de ADN de la reivindicación 1 que
comprende un fragmento de la secuencia de nucleótidos de la
secuencia de control mostrada desde la posición -812 a la -1 de la
Figura 1; cuyo fragmento conserva la función de la secuencia líder
además de la actividad de inicio de la transcripción.
3. La molécula de ADN de la reivindicación 1 que
comprende la secuencia de nucleótidos de la secuencia de control
mostrada desde la posición -812 a la -1 de la Figura 1.
4. Una composición de moléculas de ADN que consta
de moléculas de ADN como se define en las reivindicaciones 1, 2 o
3.
5. Un vector recombinante que comprende la
secuencia de nucleótidos de la molécula de las reivindicaciones 1, 2
o 3.
6. El vector de la reivindicación 5, en el que
dicha secuencia de las reivindicaciones 1, 2 o 3 está unida
operativamente a la secuencia codificante para una proteína deseada
heteróloga para dicha secuencia de nucleótidos.
7. El vector de la reivindicación 6, donde dicha
proteína deseada es una proteína insecticida o una proteína
antifúngica.
8. Una planta, parte de una plante o célula
vegetal que comprende una secuencia de nucleótidos de las
reivindicaciones 1, 2 o 3 unida operativamente a la secuencia
codificante de una proteína deseada heteróloga para dicha secuencia
de nucleótidos.
9. Una planta, parte de una planta o célula
vegetal de la reivindicación 8, donde dicha proteína deseada es una
proteína insecticida o una proteína antifúngica.
10. Un método para proteger a las plantas contra
insectos u hongos, que comprende modificar dichas plantas para que
contengan una secuencia de nucleótidos de las reivindicaciones 1, 2
o 3 unida operativamente a la secuencia codificante de una proteína
deseada heteróloga para dicha secuencia de nucleótidos, donde dicha
proteína deseada es una proteína insecticida o una proteína
antifúngica; y cultivar las plantas en condiciones de expresión de
dicha secuencia codificante.
11. Un ADN purificado y aislado que comprende el
complementario de la secuencia de nucleótidos mostrada desde la
posición -812 a la -1 de la Figura 1.
12. Una composición de moléculas de ADN de una
sola cadena capaz de inhibir la actividad de inicio de la
transcripción de las secuencias de nucleótidos mostradas desde la
posición -812 a la -1 de la Figura 1, constando dicha composición
de moléculas de ADN que contienen una secuencia de nucleótidos capaz
de formar una triple hélice con el ácido nucleico de doble cadena
con una secuencia de nucleótidos en las posiciones -812 hasta la -1
de la Figura 1 y su complementario o con una porción de los
mismos.
13. Una composición de la reivindicación 12 que
también es capaz de inhibir la función de la secuencia líder de
dicha secuencia de nucleótidos mostrada desde la posición -812 a la
-1 de la Figura 1.
14. Un método para regular la expresión de un gen
bajo el control de la secuencia de control de ZmDJ1 en células
vegetales, partes de plantas o plantas, que comprende modificar una
célula vegetal, una parte de una planta o una planta que contiene
dicho gen bajo el control de dicha secuencia de control de ZmDJ1
para que contenga una construcción antisentido que comprende el
complementario de la secuencia de nucleótidos mostrada desde la
posición -812 a la -1 de la Figura 1, o una porción suficiente de la
misma para hibridar con la secuencia de la Figura 1 en condiciones
fisiológicas e inhibir la actividad de inicio de la transcripción
de dicha secuencia mostrada desde la posición -812 a la -1 de la
Figura 1; o el RNA de la misma secuencia de nucleótidos.
15. El método de la reivindicación 14, donde
dicho ARN se proporciona modificando dicha célula vegetal, parte de
la planta o planta para que contenga una secuencia de nucleótidos
que codifica dicho ARN.
16. Un método para regular la expresión de un gen
bajo el control de la secuencia de control de ZmDJ1 en células
vegetales, partes de plantas o plantas, que comprende modificar una
célula vegetal, parte de una planta o una planta que contiene dicho
gen bajo el control de dicha secuencia de control de ZmDJ1 para que
contenga el ADN de la reivindicación 12.
17. Una célula vegetal, parte de una planta o
planta que comprende una construcción antisentido que comprende el
complementario de la secuencia de nucleótidos mostrada desde la
posición -812 a la -1 de la Figura 1, o una porción suficiente de
ella para hibridar con la secuencia de la Figura 1 en condiciones
fisiológicas e inhibir la actividad de inicio de la transcripción de
dicha secuencia mostrada desde la posición -812 a la -1 de la
Figura 1.
18. Una célula vegetal, parte de una planta o
planta que comprende el ADN de la reivindicación 12.
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