ES2563485T3 - Construcciones de ADN recombinante y procedimientos para modular la expresión de un gen diana - Google Patents

Construcciones de ADN recombinante y procedimientos para modular la expresión de un gen diana Download PDF

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Abstract

Un procedimiento para aumentar la expresión de un gen diana en una célula vegetal, que comprende expresar en dicha célula vegetal una construcción de ADN recombinante que comprende ADN que se expresa en una célula vegetal transgénica y se somete a procesamiento en un ARN que comprende ARN monocatenario que se une al transcrito de al menos un gen diana en dicha célula vegetal transgénica para formar un segmento hibridado de ARN al menos parcialmente bicatenario que confiere a dicho transcrito resistencia a la escisión por una ribonucleasa RNasa III dentro o en las proximidades del segmento hibridado, en el que dicha unión es en un sitio de reconocimiento de miARN en dicho transcrito, sucediendo dicha escisión de dicho transcrito en dicho sitio de reconocimiento de miARN, y formándose dicho segmento hibridado al menos parcialmente en dicho sitio de reconocimiento de miARN, en el que dicha unión de dicho ARN monocatenario a dicho transcrito inhibe la supresión de dicho al menos un gen diana por un miARN maduro.

Description

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miARN". Una realización preferida es un procedimiento para expresar una construcción de ADN recombinante que incluye ADN que se somete a procesamiento en un ARN incluyendo ARN monocatenario que se une al transcrito de al menos un gen diana para formar un segmento hibridado de al menos ARN parcialmente bicatenario que confiere al transcrito resistencia a la escisión por una ribonucleasa RNasa III en o en las proximidades del segmento hibridado, en el que la unión del ARN monocatenario al transcrito (y la formación resultante del segmento hibridado) inhibe la supresión del al menos un gen diana mediada por ARN bicatenario, en el que la escisión por una ribonucleasa RNasa III está mediada por la unión de un miARN maduro, la unión es en un sitio de reconocimiento de miARN (que se reconoce por el miARN maduro) en el transcrito, la escisión del transcrito sucede en el sitio de reconocimiento de miARN, y formándose el segmento hibridado al menos parcialmente en el sitio de reconocimiento de miARN. En esta realización, la construcción de ADN recombinante produce un ARN bloqueador de la escisión de miARN que se une a (o en la proximidad de) un sitio de reconocimiento de miARN en un transcrito de gen diana, formando un segmento hibridado que es en sí resistente a la escisión por ribonucleasa RNasa III (o que previene la escisión por ribonucleasa RNasa III del transcrito en la proximidad del segmento hibridado), evitando de este modo que el miARN que normalmente reconoce al sitio de reconocimiento de miARN se una al sitio de reconocimiento de miARN y mediando la escisión por ribonucleasa RNasa III del transcrito de gen diana. En realizaciones particularmente preferidas, el segmento hibridado incluye: (a) al menos un desemparejamiento entre el ARN monocatenario y el sitio de reconocimiento de miARN en posiciones del sitio de reconocimiento de miARN correspondientes a las posiciones 9, 10, u 11 (en dirección de 3' a 5') del miARN maduro, o (b) al menos una inserción en una posición en el ARN monocatenario en posiciones del sitio de reconocimiento de miARN correspondientes a las posiciones 10 u 11 (en dirección de 3' a 5') del miARN maduro. En algunas realizaciones preferidas, el ARN monocatenario que se une al transcrito de al menos un gen diana tiene una secuencia de nucleótidos para permitir que se forme un segmento hibridado de manera estable entre esta y el transcrito del gen diana, pero que inhibe la unión de una proteína Argonauta o similar a Argonauta al segmento hibridado, tal como se describe por Mi y col. (2008) Cell, 133:1-12; por ejemplo, el ARN monocatenario tiene una secuencia de nucleótidos que incluye una A, G, o C (pero no un U) en una posición correspondiente al extremo 5' del miARN maduro que se une de manera nativa al sitio de reconocimiento. Lo más preferentemente, la unión de un bloqueador de la escisión de miARN a un transcrito de gen diana da como resultado la inhibición de la supresión mediada por miARN de el al menos un gen diana, de este modo aumentando la expresión del gen diana (en relación a la expresión en ausencia del bloqueador de la escisión de miARN).
Otro aspecto de la presente invención incluye procedimientos para hacer uso de un "bloqueador de la escisión modificado en 5'". Una realización preferida incluye una construcción de ADN recombinante que incluye ADN que se somete a procesamiento en un ARN incluyendo ARN monocatenario que se une al transcrito de al menos un gen diana para formar un segmento hibridado de al menos ARN parcialmente bicatenario que confiere al transcrito resistencia a la escisión por una ribonucleasa RNasa III en o en las proximidades del segmento hibridado, en el que la unión del ARN monocatenario al transcrito (y la formación resultante del segmento hibridado) inhibe la supresión del al menos un gen diana mediada por ARN bicatenario, en el que la escisión por una ribonucleasa RNasa III está mediada por la unión de un miARN maduro, la unión es en un sitio de reconocimiento de miARN (que se reconoce por el miARN maduro) en el transcrito, la escisión del transcrito sucede en el sitio de reconocimiento de miARN, y formándose el segmento hibridado al menos parcialmente en el sitio de reconocimiento de miARN, y el segmento hibridado incluye una A, G, o C (pero no un U) en una posición correspondiente al extremo 5' del miARN maduro que se une de manera nativa al sitio de reconocimiento, pero no incluye desemparejamientos entre el ARN monocatenario y el sitio de reconocimiento de miARN en posiciones del sitio de reconocimiento de miARN correspondientes a las posiciones 9, 10, u 11 (en dirección de 3' a 5') del miARN maduro, o inserciones en una posición en el ARN monocatenario en posiciones del sitio de reconocimiento de miARN correspondientes a las posiciones 10 u 11 (en dirección de 3' a 5') del miARN maduro. La unión de dicho bloqueador de la escisión modificado en 5' al transcrito de gen diana da como resultado la inhibición de la supresión mediada por miARN de el al menos un gen diana, de este modo aumentando la expresión del gen diana (en relación a la expresión en ausencia del bloqueador de la escisión).
Un experto habitual en la materia reconoce fácilmente que diversos aspectos de los procedimientos de la presente invención incluyen construcciones de ADN recombinante análogas que se procesan para proporcionar ARN, incluyendo ARN monocatenario que sirve como un "bloqueador de la escisión de ARNpi", un "bloqueador de la escisión de ARNpi que actúa en trans", un "bloqueador de la escisión de ARN pequeño en fase", un "bloqueador de la escisión de ARNpi de transcrito antisentido natural", o un "bloqueador de la escisión de miARN de transcrito antisentido natural" (o, en términos generales, un "bloqueador de la escisión de ARN pequeño"), según si la escisión por ribonucleasa RNasa III que está inhibida está mediada por, respectivamente, un ARNpi, un ARNpi que actúa en trans, un ARN pequeño en fase, un ARNpi de transcrito antisentido natural, o un ARNpi de transcrito antisentido natural (o, en términos generales, cualquier ARN pequeño asociado con un complejo de silenciamiento, tal como RISC o una proteína Argonauta o similar a Argonauta). En estos casos, la formación del segmento hibridado resistente a la escisión por ribonucleasa RNasa III previene generalmente que el ARN pequeño respectivo se una al transcrito de gen diana y media la escisión por ribonucleasa RNasa III del transcrito. Lo más preferentemente, la unión de dicho bloqueante de la escisión de ARN pequeño al transcrito de gen diana da como resultado la inhibición de la supresión del al menos un gen diana mediada por ARN bicatenario, aumentando de este modo la expresión del gen diana (en relación a la expresión en ausencia del bloqueador de la escisión de ARN pequeño). Un experto habitual en la materia es capaz de idear una secuencia de nucleótidos para dicho ARN, incluyendo ARN
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la formación del segmento hibridado) inhibe la supresión del al menos un gen diana mediada por ARN bicatenario, aumentando de este modo la expresión del gen diana, en relación a la expresión en ausencia de expresión de la construcción.
Se cree que los microARN (miARN) regulan generalmente la expresión génica postranscripcionalmente en plantas dirigiendo la escisión específica de secuencia de ARN mensajeros ("ARNm"). Un aspecto de la presente invención es un procedimiento para controlar la velocidad de supresión postraduccional de un gen de planta que se transcribe en un ARNm que contiene un sitio de reconocimiento de miARN que normalmente se reconoce y se une por un miARN específico en complejo con Argonauta (Ago), seguido de la escisión del segmento hibridado de miARN/ARNm por una ribonucleasa RNasa III, tal como una ribonucleasa similar a Dicer. Este procedimiento emplea una construcción de "bloqueador de la escisión" para expresar transgénicamente en la planta un ARN que incluye ARN monocatenario que se une al transcrito de ARNm del gen diana para formar un segmento hibridado de ARN al menos parcialmente bicatenario que confiere al transcrito resistencia a la escisión por una ribonucleasa RNasa III en o en las proximidades del segmento hibridado, en el que la unión del ARN monocatenario al transcrito (y la formación resultante del segmento hibridado) inhibe la supresión del al menos un gen diana mediada por ARN bicatenario. El ARN "bloqueador de la escisión" compite generalmente con miARN maduros endógenos, por la unión con un ARNm que normalmente está regulado por ese miARN; el bloqueador de la escisión protege al ARNm de la escisión por el complejo miARN-Ago uniéndose al sitio diana de miARN en el ARNm para formar un segmento hibridado no escindible. Por lo tanto, un bloqueador de la escisión protege al sitio de escisión del ARNm (sitio de reconocimiento de miARN) de ser escindido por miARN y previene la regulación negativa de ese gen diana particular. Preferentemente, un bloqueador de la escisión aumenta la expresión del gen diana (en relación a su expresión en ausencia del bloqueador de la escisión). Este procedimiento permite la regulación de la expresión génica de un modo específico y es una alternativa útil a la regulación positiva del nivel de transcrito de un gen o de su proteína codificada mediante la sobreexpresión del gen.
Un aspecto de la presente invención es un procedimiento para proporcionar un bloqueador de la escisión mediante la generación del ARN monocatenario bloqueador de la escisión en la planta a partir de una "construcción bloqueadora de la escisión" basada en una secuencia similar a precursor de miARN recombinante. Una secuencia similar a precursor de miARN se crea colocando la secuencia bloqueadora de la escisión en el armazón de un transcrito primario de miARN, a la vez que se mantiene la estructura secundaria predicha en el pliegue del transcrito de tal forma que el transcrito resultante se procesa mediante ribonucleasas similares a Dicer en ARN monocatenario, que después es capaz de asociarse con el sitio de reconocimiento de miARN en el ARNm diana y de prevenir que se escinda el ARNm por un miARN maduro. La secuencia bloqueadora de la escisión se selecciona de tal modo que, tras la hibridación del bloqueador de la escisión al ARNm diana, se forma un segmento hibridado que incluye: (a) al menos un desemparejamiento entre el ARN monocatenario y el sitio de reconocimiento de miARN en posiciones del sitio de reconocimiento de miARN correspondientes a las posiciones 9, 10, u 11 del miARN maduro, o (b) al menos una inserción en una posición en el ARN monocatenario en posiciones del sitio de reconocimiento de miARN correspondientes a las posiciones 10-11 del miARN maduro. En realizaciones especialmente preferidas, el ARN monocatenario que se une al transcrito de al menos un gen diana tiene una secuencia de nucleótidos para permitir que se forme un segmento hibridado de manera estable entre esta y el transcrito del gen diana, pero que inhibe la unión de una proteína Argonauta o similar a Argonauta al segmento hibridado, tal como se describe por Mi y col. (2008) Cell, doi:10.1016/j.cell.2008.02.034; por ejemplo, el ARN monocatenario tiene una secuencia de nucleótidos que incluye una A, G, o C (pero no un U) en una posición correspondiente al extremo 5' del miARN maduro que se une de manera nativa al sitio de reconocimiento. Para los bloqueadores de la escisión expresados en plantas transgénicas, en muchas realizaciones hay también preferentemente un desemparejamiento entre el ARN monocatenario y el sitio de reconocimiento de miARN en la posición del sitio de reconocimiento de miARN correspondiente a las posiciones 1 del miARN maduro para prevenir que el efecto supresor sea transitorio.
Un procedimiento alternativo para generar un bloqueador de la escisión in vivo o en una planta es expresar ARN monocatenario corto a partir de un promotor fuerte, tales como los promotores Pol II o Pol III. Este ARN monocatenario incluye preferentemente una secuencia que es complementaria con el ARNm solo en el sitio de reconocimiento de miARN. Debido a que la producción de un bloqueador de la escisión usando este procedimiento no requiere de la asociación del ARN con una proteína Argonauta o Ago, no son necesarios desemparejamientos en las posiciones 10 y 11.
Genes diana
La construcción de ADN recombinante para su uso en la presente invención puede diseñarse para que module la expresión de cualquier gen o genes diana. El gen diana puede ser secuencia traducible (codificante), o puede ser secuencia no codificante (tal como secuencia reguladora no codificante), o a ambos, y puede incluir al menos un gen seleccionado entre el grupo que consiste en un gen diana eucariota, un gen diana no eucariota, una secuencia de ADN precursora de miARN, y un promotor de microARN. El gen diana puede ser nativo (endógeno) para la célula (por ejemplo, una célula vegetal o animal) en la que se transcribe la construcción de ADN recombinante, o puede ser nativo para una plaga o patógeno (o un simbionte de la plaga o patógeno) de la planta o animal en el que se transcribe la construcción de ADN recombinante. El gen diana puede ser un gen exógeno, tal como un transgén en una planta. Un gen diana puede ser un gen diana usado como diana para la supresión, con o sin la expresión
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fúngicos esenciales en la Base de datos de Genes Esenciales ("DEG", disponible en línea en tubic.tju.edu.cn/deg/). Los genes esenciales incluyen aquellos que influencian otros genes, donde el efecto general es la muerte de la plaga de invertebrado o la pérdida de la capacidad de la plaga de invertebrado para reproducirse de manera satisfactoria. En un ejemplo, la supresión del gen de caja homeostática de Drosophila, Caudal, da lugar en última instancia a la mortalidad del hospedador causada por el desequilibrio de la población bacteriana intestinal comensalista del insecto (Ryu y col. (2008) Science, 319:777-782) y por lo tanto, Caudal, así como los genes peptídicos antimicrobianos controlados directamente por Caudal se consideran ambos genes esenciales.
Las plagas de invertebrados incluyen, pero sin limitación, plagas de nematodos, plagas de moluscos (babosas y caracoles), plagas de anélidos, y plagas de insectos. Los fitopatógenos de interés incluyen hongos, oomicetos, bacterias (por ejemplo, las bacterias que causan el manchado de las hojas, fuego bacteriano, agalla de la corona, y la marchitez bacteriana), micoplasmas, y virus (por ejemplo, los virus que causan mosaicos, bandeo de venas, moteado, manchado, o crecimiento anormal). Véase también G. N. Agrios, "Plant Pathology" (Cuarta edición), Academic Press, San Diego, 1997, pág. 635, para descripciones de hongos, bacterias, micoplasmas (incluyendo micoplasmas y espiroplasmas), virus, nematodos, plantas superiores parasíticas, y protozoos flagelados, todos los cuales son plagas o patógenos de plantas de interés. Véase también la compilación actualizada de plagas y patógenos de plantas y las enfermedades causadas por estos en "Common Names of Plant Diseases" de la American Phytopathological Society, disponible en línea en www.apsnet.org/on-line/common/top.asp.
Los ejemplos de patógenos de planta fúngicos de interés particular incluyen, por ejemplo, los hongos que provocan el moho pulverulento, herrumbre, mancha y tizón foliar, podredumbre húmeda, podredumbre de raíces, podredumbre de la corona, podredumbre de la cápsula del algodón, cancro del tallo, cancro de la varilla, marchitez vascular, tizón, o moho, incluyendo, pero sin limitación, Fusarium spp., Phakospora spp., Rhizoctonia spp., Aspergillus spp., Gibberella spp., Pyricularia spp., y Alternaria spp., y las numerosas especies fúngicas proporcionadas en las tablas 4 y 5 de la Patente de Estados Unidos 6.194.636. Los ejemplos de patógenos de plantas incluyen patógenos clasificados anteriormente como hongos, pero clasificados más recientemente como oomicetos. Los ejemplos específicos de patógenos de plantas oomicetos de interés particular incluyen miembros del género Pythium (por ejemplo, Pythium aphanidermatum) y Phytophthora (por ejemplo, Phytophthora infestans, Phytophthora sojae,) y organismos que provocan el mildiu (por ejemplo, Peronospora farinosa).
Los ejemplos de plagas de invertebrados incluyen nematodos de quistes Heterodera spp. especialmente el nematodo del quiste de la soja Heterodera glycines, nematodos del nudo de la raíz Meloidogyne spp., gusanos de la raíz del maíz (Diabrotica spp.), Lygus spp., pulgones e insectos chupadores de savia similares, tales como la filoxera (Daktulosphaira vitifoliae), perforadores del maíz, gusanos cortadores, gusanos soldado, saltahojas, escarabajos japoneses, saltamontes, y otras plagas de coleópteros, dípteros, y lepidópteros.
Los ejemplos específicos de genes diana adecuados también incluyen genes implicados en la síntesis de aminoácidos o de ácidos grasos, su almacenamiento, o catabolismo, genes implicados en rutas de biosíntesis de múltiples etapas, donde puede ser interesante regular el nivel de uno o más intermedios; y genes que codifican proteínas de control del ciclo celular. Los genes diana pueden incluir genes que codifican proteínas no deseadas (por ejemplo, alérgenos o toxinas) o las enzimas para la biosíntesis de compuestos no deseados (por ejemplo, componentes de sabor u olor no deseados).
La construcción de ADN recombinante puede diseñarse para modular de manera más específica la expresión del gen diana, por ejemplo, diseñando la construcción de ADN recombinante para que incluye ADN que se someta a procesamiento en ARN incluyendo ARN monocatenario que se une al transcrito del gen diana, en el que el ARN monocatenario incluye una secuencia de nucleótidos sustancialmente no identica (o no complementaria) a una secuencia de gen no diana (y por lo tanto es menos probable que se una a un transcrito de gen no diana). En un ejemplo, la construcción de ADN recombinante se diseña para que suprima un gen diana que es un gen endógeno para una sola especie (por ejemplo, el gusano de la raíz del maíz occidental, Diabrotica virgifera virgifera LeConte) pero para no suprimir un gen no diana, tales como genes de especies relacionadas, incluso estrechamente relacionadas (por ejemplo, el gusano de la raíz del maíz del norte, Diabrotica barberi Smith y Lawrence, o el gusano de la raíz del maíz del sur, Diabrotica undecimpunectata). En otras realizaciones, la construcción de ADN recombinante se diseña para modular la expresión de una secuencia de gen diana común a múltiples especies en las que se va a silenciar el gen. Por ejemplo, puede seleccionarse una construcción de ADN recombinante para modular un gen diana del gusano de la raíz del maíz para que sea específico para todos los miembros del género Diabrotica. En un ejemplo adicional de esta realización, dicha construcción de ADN recombinante dirigida a Diabrotica puede seleccionarse de tal forma que no se dirija a cualquier secuencia génica de especies de insectos beneficiosas.
Promotores
En general, la construcción de ADN recombinante para su uso en la presente invención incluye un promotor, funcional en la célula en la que se pretende transcribir la construcción, y unido operativamente al ADN que se somete a procesamiento en un ARN incluyendo ARN monocatenario que se une al transcrito de al menos un gen diana. En varias realizaciones, el promotor se selecciona entre el grupo que consiste en un promotor constitutivo, un promotor específico espacialmente, un promotor específico temporalmente, un promotor específico del desarrollo, y
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un promotor inducible.
Los promotores no constitutivos adecuados para su uso con las construcciones de ADN recombinante para su uso en la invención incluyen promotores específicos espacialmente, promotores específicos temporalmente, y promotores inducibles. Los promotores específicos espacialmente pueden incluir promotores específicos de orgánulo, célula, tejido u órgano (por ejemplo, un promotor específico de plástido, específico de raíz, específico de polen o específico de semilla para suprimir la expresión del primer ARN diana en plástidos, raíces, polen, o semillas, respectivamente). En muchos casos, es especialmente útil un promotor específico de semilla, específico de embrión, específico de aleurona o específico de endospermo. Los promotores específicos temporalmente pueden incluir promotores que tiendan a promover la expresión durante determinadas etapas del desarrollo en el ciclo de crecimiento de una planta, o durante diferentes tiempos del día o la noche, o en diferentes estaciones del año. Los promotores inducibles incluyen promotores inducidos por agentes químicos o por condiciones ambientales tales como, pero sin limitación, estrés biótico o abiótico (por ejemplo, déficit de agua o sequía, calor, frío, altos o bajos niveles de nutrientes o sales, altos o bajos niveles de luz, o infección por una plaga o patógeno). Son particularmente interesantes los promotores de microARN, especialmente aquellos que tengan un patrón específico temporalmente, específico espacialmente, o de expresión inducible; los ejemplos de promotores de miARN, así como de los procedimientos para identificar promotores de miARN que tengan patrones de expresión específicos, se proporcionan en las Publicaciones de Patente de Estados Unidos 2006/0200878, 2007/0199095, y 2007/0300329. Un promotor específico de expresión también puede incluir promotores que se expresan generalmente de manera constitutiva pero con diferentes grados o "fuerzas" de expresión, incluyendo promotores considerados comúnmente como "promotores fuertes" o como "promotores débiles".
Los promotores de particular interés incluyen los siguientes ejemplos: un promotor de opalina sintasa aislado de ADN-T de Agrobacterium; un promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor; elementos promotores potenciados o elementos promotores quiméricos, tales como un promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor (CaMV) potenciado unido a un elemento potenciador (un intrón de la proteína 70 de choque térmico de Zea mays); promotores específicos de raíz, tales como aquellos desvelados en las Patentes de Estados Unidos 5.837.848;
6.437.217 y 6.426.446; un promotor de oleosina L3 de maíz, desvelado en la Patente de Estados Unidos 6.433.252; un promotor para un gen nuclear de una planta que codifica una aldolasa localizada en plástido desvelado en la Publicación de Solicitud de Patente de Estados Unidos 2004/0216189; promotores inducibles por frío desvelados en la Patente de Estados Unidos 6.084.089; promotores inducibles por sal desvelados en la Patente de Estados Unidos número 6.140.078; promotores inducibles por luz desvelados en la Patente de Estados Unidos 6.294.714; promotores inducibles por patógenos desvelados en la Patente de Estados Unidos 6.252.138; y promotores inducibles por déficit de agua desvelados en la Publicación de Solicitud de patente de Estados Unidos 2004/0123347 A1.
Los promotores específicos de vasculatura o de floema de plantas de interés incluyen un promotor rolC o rolA de Agrobacterium rhizogenes, un promotor de un gen 5 de ADN-T de Agrobacterium tumefaciens, el promotor génico RSs1 de sacarosa sintasa de arroz, un promotor de badnavirus del moteado amarillo de Commelina, un promotor del virus del decaimiento foliar del coco, un promotor de virus baciliforme del tungro del arroz, el promotor de un gen GS3A de glutamina sintasa del guisante, uno de los promotores invCD111 e invCD141 de los genes de invertasa de la patata, un promotor aislado de Arabidopsis que se haya demostrado que tenga expresión específica en floema por Kertbundit y col. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 88:5212-5216, una región promotora VAHOX1, un promotor génico de invertasa de la pared celular del guisante, un promotor génico de invertasa ácida de la zanahoria, un promotor del gen Sultrl 3 de transportador de sulfato, un promotor de un gen de sacarosa sintasa de una planta, y un promotor de un gen de transportador de sacarosa de una planta.
Los promotores adecuados para su uso con una construcción de ADN recombinante para su uso en la presente invención incluyen promotores de polimerasa II ("pol II") y promotores de polimerasa III ("pol III"). La ARN polimerasa II transcribe ARN estructurales o catalíticos que normalmente son más cortos de 400 nucleótidos de longitud, y reconoce una sola serie de restos de T como señal de terminación; se ha usado para transcribir dúplex de ARNpi (véase, por ejemplo, Lu y col. (2004) Nucleic Acids Res., 32:e171). Por lo tanto se prefieren los promotores de Pol II en determinadas realizaciones donde se va a producir un transcrito de ARN corto a partir de una construcción de ADN recombinante para su uso en la presente invención. En una realización, la construcción de ADN recombinante incluye un promotor de pol II para expresar un transcrito de ARN flanqueado por secuencias de ribozima autoescindibles (por ejemplo, ribozimas cabeza de martillo autoescindibles), que da como resultado un ARN procesado, incluyendo ARN monocatenario que se une al transcrito de al menos un gen diana, con extremos 5' y 3' definidos, libres de secuencias flanqueante que puedan interferir de manera potencial. Una estrategia alternativa emplea promotores de pol III para generar transcritos con extremos 5' y 3' relativamente definidos, es decir, para transcribir un ARN con secuencias flanqueantes 5' y 3' mínimas. En algunas realizaciones, Se prefieren promotores de pol III (por ejemplo, los promotores U6 o H1) para añadir un sitio de transcripción corto rico en AT que da como resultado salientes de 2 pares de bases (UU) en el ARN transcrito; esto es útil, por ejemplo, para la expresión de construcciones de tipo ARNpi. Se ha comunicado el uso de promotores de pol III para dirigir la expresión de construcciones de ARNpi; véase van de Wetering y col. (2003) EMBO Rep., 4: 609-615, y Tuschl (2002) Nature Biotechnol., 20: 446-448.
El elemento promotor puede incluir secuencias de ácido nucleico que no son promotores, elementos promotores u
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homólogos de los mismos de origen natural pero que pueden regular la expresión de un gen. Los ejemplos de dichas secuencias reguladoras "independientes de un gen" incluyen secuencias de ARN de origen natural o diseñadas artificialmente que incluyen una región o aptámero de unión a ligando (véase "Aptámeros", más adelante) y una región reguladora (que puede actuar en cis). Véase, por ejemplo, Isaacs y col. (2004) Nat. Biotechnol., 22:841847, Bayer y Smolke (2005) Nature Biotechnol., 23:337-343, Mandal y Breaker (2004) Nature Rev. Mol. Cell Biol., 5:451-463, Davidson y Ellington (2005) Trends Biotechnol., 23:109-112, Winkler y col. (2002) Nature, 419:952-956, Sudarsan y col. (2003) RNA, 9:644-647, y Mandal y Breaker (2004) Nature Struct. Mol. Biol., 11:29-35. Dichos "riborreguladores" pueden seleccionarse o diseñarse respecto de su especificidad espacial o temporal, por ejemplo, para regular la traducción del ADN que se somete a procesamiento en un ARN, incluyendo ARN monocatenario que se une al transcrito de al menos un gen diana solo en presencia (o ausencia) de una concentración dada del ligando adecuado. Un ejemplo es un riborregulador que responde a un ligando endógeno (por ejemplo, ácido jasmónico o ácido salicílico) producido por la planta cuando se somete a estrés (por ejemplo, estrés abiótico, tal como estrés hídrico, temperatura, o de nutrientes, o estrés biótico, tal como el ataque por plagas o patógenos); cuando se somete a estrés, el nivel de ligando endógeno aumenta hasta un nivel suficiente para que el biorregulador comience la transcripción del ADN que se somete a procesamiento en un ARN incluyendo ARN monocatenario que se une al transcrito de al menos un gen diana.
Aptámeros
En algunas realizaciones, la construcción de ADN recombinante para su uso en la presente invención incluye ADN que se procesa en un aptámero de ARN, es decir, un ARN que se une a un ligando mediante un mecanismo de unión que no está basado principalmente en el emparejamiento de bases de Watson-Crick (al contrario, por ejemplo, del emparejamiento de bases que sucede entre hebras de ácido nucleico complementarias, antiparalelas para formar una estructura de ácido nucleico bicatenaria). Véase, por ejemplo, Ellington y Szostak (1990) Nature, 346:818-822. Pueden encontrarse ejemplos de aptámeros, por ejemplo, en la Base de datos de Aptámeros pública, disponible en línea en aptamer.icmb.utexas.edu (Lee y col. (2004) Nucleic Acids Res., 32(1):D95-100). Los aptámeros útiles en la invención pueden, sin embargo, ser monovalentes (uniéndose a un solo ligando) o multivalentes (uniéndose a más de un ligando individual, por ejemplo, que se unen a una unidad de dos o más ligandos diferentes).
Los ligandos útiles en la invención incluyen cualquier molécula (o parte de una molécula) que pueda reconocerse y unirse por una estructura secundaria de ácido nucleico mediante un mecanismo no basado principalmente en el emparejamiento de bases de Watson-Crick. De este modo, el reconocimiento y unión de ligando y aptámero es análogo al de un antígeno y un anticuerpo, o al de efector y receptor biológico. Los ligandos pueden incluir moléculas individuales (o partes de una molécula), o una combinación de dos o más moléculas (o partes de una molécula), y pueden incluir uno o más complejos macromoleculares (por ejemplo, polímeros, bicapas lipídicas, liposomas, membranas celulares u otras estructuras celulares, o superficies celulares). Los ejemplos de ligandos específicos incluyen vitaminas, tales como la coenzima B12 y el pirofosfato de tiamina, mononucleótido de flavina, guanina, adenosina, S-adenosilmetionina, S-adenosilhomocisteína, coenzima A, lisina, tirosina, dopamina, glucosamina-6-fosfato, cafeína, teofilina, antibióticos, tales como cloranfenicol y neomicina, herbicidas tales como glifosato y dicamba, proteínas, incluyendo proteínas de la envuelta de virus o fagos y proteínas de la superficie epidérmica o tracto digestivo de invertebrados, y ARN que incluyen ARN viral, ATN transferente (ARNt), ARN ribosomal (ARNr), y ARN polimerasas, tales como ARN polimerasa dependiente de ARN (RdRP). Una clase de aptámeros de ARN útiles en la invención son los "termointerruptores" que no se unen a un ligando pero que responden termalmente, es decir, la conformación del aptámero se determina por la temperatura; véase, por ejemplo, Caja 3 en Mandal y Breaker (2004) Nature Rev. Mol. Cell Biol., 5:451-463.
Unidades de transcripción de transgén
En algunas realizaciones, la construcción de ADN recombinante para su uso en la presente invención incluye una unidad de transcripción de transgén. Una unidad de transcripción de transgén incluye secuencia de ADN que codifica un gen de interés, por ejemplo, una proteína natural o una proteína heteróloga. Un gen de interés puede ser cualquier secuencia codificante o no codificante de cualquier especie (incluyendo, pero sin limitación, no eucariotas, tales como bacterias y virus; hongos, protistas, plantas, invertebrados, y vertebrados). Los genes de interés incluyen aquellos genes también descritos anteriormente como genes diana, con el encabezado "Genes diana". La unidad de transcripción del transgén puede incluir además una secuencia 5' o 3' o ambas, según se requiera para la transcripción del transgén.
Intrones
En algunas realizaciones, la construcción de ARN recombinante para su uso en la presente invención incluye ADN que codifica un intrón que puede cortarse y empalmarse. Por "intrón" se entiende generalmente un segmento de ADN (o el ARN transcrito a partir de dicho segmento) que se localiza entre exones (segmentos codificantes de proteína del ADN o del ARN transcrito correspondiente), en el que, durante la maduración del ARN mensajero, el intrón se "corta" o elimina enzimáticamente de la hebra de ARN mediante un proceso de escisión/ligadura que sucede en el núcleo de eucariotas. El término "intrón" también se aplica a secuencias de ADN no codificantes que se transcriben a segmentos de ARN que pueden cortarse de un transcrito de ARN en maduración, pero no son intrones
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Una planta transgénica no natural incluye plantas en cualquier estado de desarrollo, e incluye una planta regenerada no natural preparada a partir de las células vegetales transgénicas no naturales desveladas en el presente documento, o una planta descendiente no natural (que puede ser una planta descendiente pura o híbrida) de la planta regenerada, o semilla de dicha planta transgénica no natural. También se proporciona una semilla transgénica no natural que tiene en su genoma una construcción de ADN recombinante tal como se ha descrito anteriormente. Las células vegetales transgénicas no naturales, plantas transgénicas, y semillas transgénicas tal como se han descrito anteriormente se producen mediante procedimientos bien conocidos en la técnica, tal como se describe más adelante en el encabezado "Producción y uso de células vegetales transgénicas y plantas transgénicas".
La célula vegetal transgénica no natural puede incluir una célula vegetal aislada (por ejemplo, células vegetales individuales o células cultivadas en o sobre un medio de cultivo artificial), o puede incluir una célula vegetal en tejido no diferenciado (por ejemplo, callo o cualquier agregación de células vegetales). La célula vegetal transgénica no natural puede incluir una célula vegetal en al menos un tejido diferenciado seleccionado entre el grupo que consiste en hoja (por ejemplo, peciolo y lámina), raíz, tallo (por ejemplo, tubérculo, rizoma, estolón, bulbo, y cormo) tallo (por ejemplo, xilema, floema), madera, semilla, fruto, y flor (por ejemplo, estambre, filamento, antera, polen, microespora, carpelo, pistilo, ovario, óvulos). La célula vegetal transgénica no natural o la planta transgénica no natural descrita anteriormente puede transformarse de manera estable, por ejemplo, plantas transgénicas fértiles y su semilla transgénica no natural que también contiene la construcción recombinante descrita anteriormente.
En algunas realizaciones de la presente invención, los procedimientos usan una planta no natural que es una planta transgénica no natural. En dichas realizaciones, todas las células (con la posible excepción de células haploides) y tejidos de la planta no natural contienen la construcción de ADN recombinante descrita anteriormente. En otras realizaciones, la planta no natural es parcialmente transgénica, e incluye tejido natural no transgénico (por ejemplo, tejido transgénico no natural injertado en tejido no transgénico natural). En una realización, la planta no natural incluye un vástago no transgénico y un rizoma transgénico no natural que incluye a la célula vegetal transgénica, en la que el vástago no transgénico y el rizoma transgénico se injertan juntos. Dichas realizaciones son particularmente útiles en los casos donde la planta sea una que se cultive comúnmente de manera vegetativa en forma de un vástago injertado en un rizoma (en el que el vástago y el rizoma pueden ser de la misma especie o variedad o de diferentes especies o variedades); los ejemplos incluyen uvas, manzanas, peras, membrillos, aguacates, cítricos, frutas con hueso, kiwi, rosas, y otras plantas de importancia agrícola u ornamental. Las realizaciones reivindicadas específicamente incluyen realizaciones en las que (a) la planta transgénica parcialmente no natural incluye un vástago de uva no transgénico natural y un rizoma de uva transgénico no natural; y (b) la planta parcialmente transgénica no natural incluye un vástago de árbol frutal transgénico no natural (por ejemplo, peral) y un rizoma de árbol frutal transgénico no natural (por ejemplo, membrillo).
Producción y uso de células vegetales transgénicas y de plantas transgénicas
En los casos donde se usa una construcción de ADN recombinante para producir una célula vegetal, planta o semilla transgénica no natural, la transformación puede incluir cualquiera de los procedimientos y composiciones bien conocidos y demostrados. Los procedimientos adecuados para la transformación de plantas incluyen virtualmente cualquier procedimiento mediante el cual pueda introducirse ADN en una célula. Un procedimiento para la transformación de plantas es el bombardeo con microproyectiles, por ejemplo, tal como se ilustra en las patentes de Estados Unidos 5.015.580 (soja), 5.538.880 (maíz), 5.550.318 (maíz), 5.550.318 (soja), 6.153.812 (trigo), 6.160.208 (maíz), 6.288.312 (arroz), 6.365.807 (arroz), y 6.399.861 (maíz), y 6.403.865 (maíz) para permitir la producción de plantas transgénicas.
Otro procedimiento adecuado de transformación de plantas es la transformación mediada por Agrobacterium mediante Agrobacterium que contiene un sistema de plásmido Ti binario, en el que el Agrobacterium porta un primer plásmido Ti y un segundo plásmido quimérico que contiene al menos un borde de ADN-T de un plásmido Ti de tipo silvestre, un promotor funcional en la célula vegetal transformada y unido operativamente a una construcción de supresión génica descrita anteriormente. Véase, por ejemplo, el sistema binario descrito en la Patente de Estados Unidos 5.159.135. Véase también De Framond (1983) Biotechnology, 1:262-269; y Hoekema y col., (1983) Nature,
303:179. En dicho sistema binario, el plásmido menor, que contiene el borde o bordes de ADN-T, puede construirse y manipularse de manera conveniente en un hospedador alternativo adecuado, tal como E. coli, y después transferirse a Agrobacterium.
Los procedimientos detallados para la transformación de plantas mediada por Agrobacterium, especialmente de plantas de cultivo, incluyen los procedimientos desvelados en las Patentes de Estados Unidos 5.004.863, 5.159.135, y 5.518.908 (algodón); 5.416.011, 5.569.834, 5.824.877 y 6.384.301 (soja); 5.591.616 y 5.981.840 (maíz); 5.463.174 (brasicáceas, incluyendo colza), 7.026.528 (trigo), y 6.329.571 (arroz), y en las Publicaciones de Solicitud de Patente de Estados Unidos 2004/0244075 (maíz) y 2001/0042257 A1 (remolacha azucarera) para permitir la producción de plantas transgénicas. Se han comunicado procedimientos similares para muchas especies vegetales, tanto dicotiledóneas como monocotiledóneas, incluyendo, entre otras, cacahuete (Cheng y col. (1996) Plant Cell Rep., 15: 653); espárrago (Bytebier y col. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 84:5345); cebada (Wan y Lemaux (1994) Plant Physiol., 104:37); arroz (Toriyama y col. (1988) Bio/Technology, 6:10; Zhang y col. (1988) Plant Cell Rep., 7:379; trigo (Vasil y col. (1992) Bio/Technology, 10:667; Becker y col. (1994) Plant J., 5:299), alfalfa (Masoud y col. (1996)
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Transgen. Res., 5:313); y tomate (Sun y col. (2006) Plant Cell Physiol., 47:426-431). Véase también una descripción de vectores, procedimientos de transformación, y de producción de plantas de Arabidopsis thaliana transformadas donde se expresan factores de transcripción de manera constitutiva por un promotor CaMV35S, en la Publicación de Solicitud de Patente de Estados Unidos 2003/0167537 A1. Se conocen bien en la técnica diversos procedimientos de transformación de otras especies de plantas, véase, por ejemplo, la referencia enciclopédica, "Compendium of Transgenic Crop Plants", editado por Chittaranjan Kole y Timothy C. Hall, Blackwell Publishing Ltd., 2008; ISBN 9781-405-16924-0 (disponible electrónicamente en mrw.interscience.wiley.com/emrw/9781405181099/hpt/toc), que describe procedimientos de transformación para cereales y hierbas de forraje (arroz, maíz, trigo, cebada, avena, sorgo, mijo perla, mijo africano, hierbas de forraje de estación fría, y pasto bahía), cultivos de semillas oleaginosas (soja, brasicáceas de semilla oleosa, girasol, cacahuete, lino, sésamo, y cártamo), granos y forrajes leguminosos (alubia común, caupí, guisante, haba, lenteja, frijol tépari, frijol asiático, guandul, arveja, garbanzo, lupino, alfalfa, y trébol), frutos y nueces templados (manzana, pera, melocotón, ciruela, cultivos de bayas, cerezas, uvas, aceituna, almendra, y nogal), frutos y nueves tropicales y subtropicales (cítricos, pomelo, banana y plátano, piña, papaya, mango, aguacate, kiwi, granadilla, y caqui), cultivos vegetales (tomate, berenjena, pimientos, brasicáceas vegetales, rábano, zanahoria, cucurbitáceas, alliums, espárrago, y vegetales de hoja), cultivos de azúcar, tubérculos y fibra (caña de azúcar, remolacha azucarera, estevia, patata, batata, mandioca, y algodón), cultivos de plantación, ornamentales, y hierbas de césped (tabaco, café, cacao, té, árbol del caucho, plantas medicinales, ornamentales, y hierbas de césped), y especies de árboles forestales. Un experto habitual en la materia tiene diversas metodologías de transformación para la producción de plantas transgénicas estables.
Los procedimientos de transformación para proporcionar células vegetales transgénicas y plantas transgénicas que contengan ADN recombinante integrado de manera estable se ponen en práctica preferentemente en cultivo tisular en medio y en un ambiente controlado. "Medio" se refiere a las numerosas mezclas de nutrientes que se usan para cultivar células in vitro, es decir, fuera del organismo vivo intacto. Las células diana receptoras incluyen, pero sin limitación, células meristemáticas, callos, embriones inmaduros o partes de embriones, y gametocitos, tales como microesporas, polen, esperma, y ovocitos. Cualquier célula a partir de la cual pueda regenerarse una planta fértil se contempla como una célula receptora útil. Pueden iniciarse callos a partir de diversas fuentes de tejido, incluyendo, pero sin limitación, embriones inmaduros o partes de embriones, meristemos apicales de plantas, microesporas, y similares. Aquellas células que son capaces de proliferar en forma de callo pueden servir como células receptoras para la transformación genética. Los procedimientos y materiales de transformación prácticos para producir plantas transgénicas (por ejemplo, diversos medios y células diana receptoras, transformación de embriones inmaduros, y la posterior regeneración de plantas transgénicas fértiles) se desvelan, por ejemplo, en las Patentes de Estados Unidos
6.194.636 y 6.232.526 y en la Publicación de Solicitud de Patente de Estados Unidos 2004/0216189.
En la práctica de transformación general, se introduce ADN solo en un pequeño porcentaje de células diana en un solo experimento de transformación. Generalmente se usan genes marcadores para proporcionar un sistema eficaz para la identificación de aquellas células que se transforman de manera estable mediante la recepción e integración de una construcción de ADN transgénica en sus genomas. Los genes marcadores preferidos proporcionan marcadores de selección que confieren resistencia a un agente de selección, tal como un antibiótico o herbicida. Cualquiera de los antibióticos o herbicidas a los que puede ser resistente una planta pueden ser agentes de selección útiles. Las células potencialmente transformadas se exponen al agente de selección. En la población de células supervivientes se encontrarán aquellas células en donde, en general, se integra el gen que confiere resistencia y se expresa a niveles suficientes para permitir la supervivencia celular. Las células pueden ensayarse adicionalmente para confirmar la integración estable del ADN recombinante. Los genes marcadores de selección usados comúnmente incluyen aquellos que confieren resistencia a los antibióticos, tales como kanamicina o paromomicina (nptll), higromicina B (aph IV) y gentamicina (aac3 y aacC4) o resistencia a herbicidas, tales como glufosinato (bar o pat) y glifosato (EPSPS). Los ejemplos de genes marcadores de selección y de agentes de selección útiles se ilustran en las Patentes de Estados Unidos 5.550.318, 5.633.435, 5.780.708, y 6.118.047. Los marcadores de exploración o indicadores, tales como marcadores que proporcionan una capacidad para identificar visualmente transformantes, también pueden emplearse. Los ejemplos de marcadores de exploración útiles incluyen, por ejemplo, un gen que expresa una proteína que produce un color detectable actuando sobre un sustrato cromogénico (por ejemplo, beta glucuronidasa (GUS) (uidA) o luciferasa (luc)) o que es detectable por sí mismo, tal como la proteína fluorescente verde (GFP) (gfp) o una molécula inmunogénica. Los expertos en la materia reconocerán que hay disponibles para su uso otros marcadores o indicadores útiles.
La detección o medición de la transcripción de la construcción de ADN recombinante en la célula vegetal transgénica puede lograrse mediante cualquier procedimiento adecuado, incluyendo procedimientos de detección de proteínas (por ejemplo, transferencias de Western, ELISA, y otros procedimientos inmunoquímicos), mediciones de la actividad enzimática, o procedimientos de detección de ácidos nucleicos (por ejemplo, transferencias de Southern, transferencias de Northern, PCR, RT-PCR, hibridación fluorescente in situ).
Otros procedimientos adecuados para detectar o medir la transcripción de la construcción de ADN recombinante en la célula vegetal transgénica incluye la medición de cualquier otro rasgo que sea una indicación directa o aproximada del nivel de expresión del gen diana en la célula vegetal transgénica en la que se transcribe la construcción de ADN recombinante, en relación al nivel de expresión en una en la que no se transcribe el ADN recombinante, por ejemplo, rasgos morfológicos evidentes o microscópicos, velocidades de crecimiento, rendimiento, velocidades reproductivas o de reclutamiento, resistencia a plagas o patógenos, o resistencia al estrés
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biótico o abiótico (por ejemplo, estrés por déficit de agua, estrés salino, estrés de nutrientes, estrés por calor o frío). Dichos procedimientos pueden usar mediciones directas de un rasgo fenotípico o ensayos aproximados (por ejemplo, en plantas, estos ensayos incluyen ensayos con partes de plantas, tales como ensayos de hojas o raíces para determinar la tolerancia al estrés abiótico). Dichos procedimientos incluyen mediciones directas de resistencia a una plaga o patógeno invertebrado (por ejemplo, daño a tejidos vegetales) o ensayos aproximados (por ejemplo, ensayos de rendimiento de plantas, o bioensayos, tales como el bioensayo de larvas del gusano de la raíz del maíz occidental (Diabrotica virgifera virgifera LeConte) descrito en la Publicación de Solicitud de Patente Internacional WO2005/11006 A2 y en la Publicación de Solicitud de Patente de Estados Unidos US 2006/0021087 A1 o el bioensayo del nematodo del quiste de la soja descrito por Steeves y col. (2006) Funct. Plant Biol., 33:991-999, en el que se miden los quistes por planta, quistes por gramo de raíz, huevos por planta, huevos por gramo de raíz y huevos por quiste.
Las construcciones de ADN recombinante descritas anteriormente pueden agruparse con otros ADN recombinantes para conferir rasgos adicionales (por ejemplo, en el caso de plantas transformadas, rasgos que incluyan resistencia a herbicidas, resistencia a plagas, tolerancia a la germinación en frío, tolerancia al déficit de agua, y similares) por ejemplo, expresando o suprimiendo otros genes. Las construcciones para la disminución y aumento coordinado de la expresión génica se desvelan en la Publicación de Solicitud de Patente de Estados Unidos 2004/0126845 A1.
Pueden cosecharse y usarse semillas de plantas transgénicas fértiles para cultivar generaciones descendientes, incluyendo generaciones híbridas, de plantas transgénicas, tal como se ha descrito anteriormente que incluyen la construcción de ADN recombinante en su genoma. Por lo tanto, además de la transformación directa de una planta con una construcción de ADN recombinante, las plantas transgénicas pueden prepararse cruzando una primera planta que tenga el ADN recombinante con una segunda planta que carezca de la construcción. Por ejemplo, el ADN recombinante puede introducirse en una línea de plantas que sea susceptible de transformación para producir una planta transgénica, que puede cruzarse con una segunda línea de plantas para introducir por introgresión el ADN recombinante en la descendencia resultante. Una planta transgénica puede cruzarse con una línea de planta que tenga otro ADN recombinante que confiera uno o más rasgos adicionales (tales como, pero sin limitación, resistencia a herbicida, resistencia a plagas o enfermedades, resistencia al estrés ambiental, contenido de nutrientes modificado, y mejora del rendimiento) para producir plantas descendientes que tienen ADN recombinante que confiere tanto el comportamiento de expresión de la secuencia diana deseada como los rasgos adicionales.
En dicho cruzamiento para combinar rasgos, la planta transgénica que dona el rasgo adicional puede ser una línea macho (polinizador) y la planta transgénica que porta los rasgos básicos puede ser la línea hembra. La descendencia de este cruce se segrega de tal forma que algunas de las plantas portarán el ADN para ambos rasgos progenitores y algunas portarán el ADN para un rasgo progenitor; dichas plantas pueden identificarse mediante marcadores asociados con ADN recombinante progenitor. Las plantas descendientes que portan ADN para ambos rasgos progenitores pueden retrocruzarse en la línea progenitora hembra múltiples veces, por ejemplo, usualmente 6 a 8 generaciones, para producir una planta descendiente homocigótica con sustancialmente el mismo genotipo que la línea progenitora transgénica original así como el ADN recombinante de la otra línea progenitora transgénica.
Otro aspecto más de la invención es un procedimiento que usa una planta transgénica cultivada a partir de la semilla transgénica. La presente invención contempla el uso de plantas transgénicas cultivadas directamente a partir de semillas transgénicas que contienen el ADN recombinante así como generaciones descendientes de plantas, incluyendo líneas de plantas puras o híbridas, producidas mediante el cruzamiento de una planta transgénica cultivada directamente a partir de semillas transgénicas en una segunda planta no cultivada a partir de la misma semilla transgénica. El cruzamiento puede incluir, por ejemplo, las siguientes etapas:
(a)
semillas de plantas de la primera planta progenitora (por ejemplo, no transgénica o una transgénica) y una segunda planta progenitora que es transgénica;
(b)
cultivar las semillas de la primera y la segunda planta progenitora en plantas que portan flores;
(c)
polinizar una flor del primer progenitor con polen del segundo progenitor; y
(d)
cosechar semillas producidas en la planta progenitora que porta la flor fertilizada.
A menudo es deseable introducir mediante introgresión ADN recombinante en variedades de élite, por ejemplo, mediante retrocruzamiento, para transferir un rasgo específico deseable de una fuente a una planta pura u otra que carezca de ese rasgo. Esto puede lograrse, por ejemplo, cruzando en primer lugar un endógamo superior ("A") (progenitor recurrente) con un individuo de puro donante ("B") (progenitor no recurrente), que porta el gen o los genes adecuados para el rasgo en cuestión, por ejemplo, una construcción preparada tal como se ha descrito anteriormente. La descendencia de este cruce se selecciona en primer lugar en la descendencia resultante respecto del rasgo deseado que se va a transferir a partir del progenitor "B" no recurrente, y después se vuelve a emparejar la descendencia seleccionada con el progenitor recurrente "A". Después de cinco o más generaciones de retrocruzamientos con selección respecto del rasgo deseado, la descendencia puede ser esencialmente hemicigótica para locus que controlan la característica que se está transfiriendo, pero son como el progenitor superior para la mayoría o prácticamente todos los demás genes. La última generación de retrocruzamiento podría autoemparejarse para proporcionar descendencia que son de raza pura para el gen o los genes que se estén transfiriendo, es decir, uno o más eventos de transformación.
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Mediante una serie de manipulaciones de cruzamientos, puede moverse una construcción de ADN seleccionada desde una línea a una línea completamente diferente sin la necesidad de manipulación recombinante adicional. Por lo tanto se pueden producir plantas puras que son raza pura para una o más construcciones de ADN. Mediante el cruzamiento de diferentes plantas puras, se puede producir un gran número de híbridos diferentes con diferentes combinaciones de construcciones de ADN. De este modo, pueden producirse plantas que tengan las propiedades agrícolas deseables asociadas frecuentemente con los híbridos ("vigor del híbrido"), así como las características deseables conferidas por una o más construcciones de ADN.
En determinadas células vegetales transgénicas y plantas transgénicas, puede ser deseable expresar de manera concurrente un gen de interés mientras que a la vez se modula la expresión de un gen diana. Por lo tanto, en algunas realizaciones, la planta transgénica contiene ADN recombinante que incluye además un elemento de expresión génica para expresar al menos un gen de interés, y se efectúa la transcripción de la construcción de ADN recombinante tal como se ha descrito anteriormente con transcripción concurrente del elemento de expresión génica.
Las construcciones de ADN recombinante tal como se han descrito anteriormente pueden transcribirse en cualquier célula o tejido vegetal o en una planta completa en cualquier estado de desarrollo. Las plantas transgénicas pueden proceder de cualquier planta monocotiledónea o dicotiledónea, tales como, pero sin limitación, plantas de interés comercial o agrícola, tales como plantas de cultivo (especialmente plantas de cultivo usadas para alimentación humana o animal), árboles productores de madera o de pulpa, plantas vegetales, plantas de fruto, y plantas ornamentales. Los ejemplos de plantas de interés incluyen plantas de cultivo de grano (tales como trigo, avena, cebada, maíz, centeno, tritical, arroz, mijo, sorgo, quinoa, amaranto, y alforfón); las plantas de cultivo de forraje (tales como las hierbas de forraje y las dicotiledóneas de forraje, incluyendo alfalfa, arveja, trébol, y similares); plantas de cultivo de semillas oleaginosas (tales como algodón, cártamo, girasol, soja, canola, colza, lino, cacahuete, y palma de aceite); nueces de árbol (tales como nuez, anacardo, avellana, pacana, almendra, y similares); caña de azúcar, coco, palmera datilera, aceituna, remolacha azucarera, té, y café; árboles productores de madera o de pulpa; plantas de cultivos vegetales, tales como legumbres (por ejemplo, alubias, guisantes, lentejas, alfalfa, cacahuete), lechuga, espárrago, alcachofa, apio, zanahoria, rábano, las brasicáceas (por ejemplo, repollo, col rizada, mostaza, y otras brasicáceas foliares, brécol, coliflor, coles de Bruselas, nabo, colinabo), cucurbitáceas comestibles (por ejemplo, pepino, melón, calabaza de verano, calabaza de invierno), alliums comestibles (por ejemplo, cebolla, ajo, puerro, chalota, cebollino), miembros comestibles de las solanáceas (por ejemplo, tomate, berenjena, patata, pimientos, alquequenjes), y miembros comestibles de las quenopodiáceas (por ejemplo, remolacha, acelga, espinaca, quinoa, amaranto); plantas de cultivos frutales, tales como manzana, pera, frutos cítricos (por ejemplo, naranja, lima, limón, pomelo, y otros), frutas con hueso (por ejemplo, albaricoque, melocotón, ciruela, nectarina), banana, piña, uva, kiwi, papaya, aguacate, y bayas; plantas cultivadas para biomasa o biocombustibles (por ejemplo, hierbas Miscanthus, pasto varilla, jatropa, palma de aceite, microalgas eucariotas, tales como Botryococcus braunii, Chlorella spp., y Dunaliella spp., y macroalgas eucariotas, tales como Gracilaria spp., y Sargassum spp.); y plantas ornamentales, tales como plantas de flor ornamentales, árboles y arbustos ornamentales, tréboles ornamentales, y hierbas ornamentales.
Los procedimientos de la invención también usan productos de consumo producidos a partir de una célula vegetal, planta o semilla transgénica no natural, incluyendo, pero sin limitación, hojas cosechadas, raíces, brotes, tubérculos, tallos, frutos, semillas, u otras partes de una planta, alimentos, aceites, extractos, productos de fermentación o digestión, granos o semillas trituradas o completas de una planta, o cualquier producto alimentario o no alimentario, incluyendo dichos productos de consumo producidos por una célula vegetal, planta o semilla transgénica. La detección de una o más secuencias de ácido nucleico de las construcciones de ADN recombinantes tal como se han descrito anteriormente en uno o más productos de consumo contemplados en el presente documento es una prueba de facto de que el consumible o el producto de consumo es o procede de una célula vegetal, planta o semilla transgénica no natural.
En varias realizaciones, la planta transgénica no natural que tiene en su genoma una construcción de ADN recombinante descrita anteriormente tiene al menos un rasgo alterado adicional, en relación a una planta que carece de la construcción de ADN recombinante, seleccionado entre el grupo de rasgos que consiste en:
(a)
tolerancia al estrés abiótico mejorada;
(b)
tolerancia al estrés biótico mejorada;
(c)
composición de metabolitos primarios modificada;
(d)
composición de metabolitos secundarios modificada;
(e)
composición de oligoelementos, carotenoides o vitaminas modificada;
(f)
rendimiento mejorado;
(g)
capacidad mejorada para usar nitrógeno, fosfato u otros nutrientes;
(h)
características agronómicas modificadas;
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características de crecimiento o reproductivas modificadas; y
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calidad de la cosecha, almacenamiento o procesamiento mejoradas.
En algunas realizaciones, la planta transgénica no natural está caracterizada por: tolerancia mejorada al estrés abiótico (por ejemplo, tolerancia al déficit de agua o sequía, calor, frío, niveles de nutrientes o de sal no óptimos,
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niveles de luz no óptimos) o de estrés biótico (por ejemplo, superpoblación, alelopatía, o heridas); por una composición de metabolito primario modificada (por ejemplo, de ácido grasos, aceites, aminoácidos, proteínas, azúcares o hidratos de carbono); una composición de metabolitos secundarios modificada (por ejemplo, de alcaloides, terpenoides, policétidos, péptidos no ribosomales y metabolitos secundarios de origen biosintético mixto); una composición de oligoelementos (por ejemplo, hierro, cinc), carotenoides (por ejemplo, beta-caroteno, licopeno, luteína, zeaxantina u otros carotenoides y xantofilinas) o vitaminas (por ejemplo, tocoferoles) modificada; rendimiento mejorado (por ejemplo, rendimiento mejorado en condiciones no estresantes o rendimiento mejorado en condiciones de estrés biótico o abiótico); capacidad mejorada para usar nitrógeno, fosfato u otros nutrientes; características agronómicas modificadas (por ejemplo, maduración retardada; senescencia retardada; madurez temprana o tardía; tolerancia a la sombra mejorada; resistencia mejorada al acame de la raíz o tallo; resistencia mejorada al "quebrado en verde" de los tallos; respuesta modificada al fotoperiodo); características de crecimiento o reproductivas modificadas (por ejemplo, enanismo intencionado; esterilidad masculina intencional, útil, por ejemplo, en procedimientos de hibridación mejorados; velocidad de crecimiento vegetativo mejorada; germinación mejorada; fertilidad del macho o de la hembra mejorada); calidad de la cosecha, almacenamiento o procesamiento mejoradas (por ejemplo, resistencia mejorada a plagas durante el almacenamiento, resistencia mejorada a la rotura, mejor aspecto para los consumidores); o cualquier combinación de estos rasgos.
En otra realización, la semilla transgénica no natural, o la semilla producida por la planta transgénica no natural, tiene una composición de metabolito primario modificada (por ejemplo, de ácido grasos, aceites, aminoácidos, proteínas, azúcares o hidratos de carbono), una composición de metabolitos secundarios modificada, una composición de oligoelementos, carotenoides o vitaminas modificada, una calidad de la cosecha, almacenamiento o procesamiento mejoradas, o una combinación de estas. En otra realización, puede ser deseable cambiar los niveles de componentes nativos de la planta o semilla transgénica de una planta transgénica, por ejemplo, para disminuir niveles de una proteína o glucoproteína alergénica o de un metabolito tóxico.
En general, se lleva a cabo la exploración de una población de plantas transgénicas regeneradas cada una a partir de una célula vegetal transgénica para identificar células vegetales transgénicas que se desarrollan en plantas transgénicas que tienen el rasgo deseado. Las plantas transgénicas se ensayan para detectar un rasgo mejorado, por ejemplo, eficacia mejorada del uso de agua, tolerancia al frío mejorada, rendimiento aumentado, eficacia mejorada del uso de nitrógeno, proteínas de la semilla mejoradas, y aceite de semilla mejorada. Los procedimientos de exploración incluyen la exploración directa respecto del rasgo en un ensayo en invernadero o en el campo o la exploración respecto de un rasgo sustituto. Dichos análisis se dirigen a la detección de cambios en la composición química, biomasa, propiedades fisiológicas, o morfología de la planta. Los cambios en las composiciones químicas, tales como la composición nutricional del grano se detectan mediante análisis de la composición y contenido de proteína, aminoácidos libres, aceite, ácidos grasos libres, almidón, tocoferoles, u otros nutrientes de la semilla. Los cambios en las características de crecimiento o biomasa se detectan midiendo la altura de la planta, el diámetro del tallo, la longitud entre nódulos, los pesos en seco de la raíz y brotes, y (para las plantas productoras de grano, tales como maíz, arroz, o trigo) longitud y diámetro de la mazorca o de la cabeza de semillas. Los cambios en las propiedades fisiológicas se identifican evaluando las respuestas a condiciones de estrés, por ejemplo, ensayos en condiciones de estrés impuestas, tales como déficit de agua, deficiencia de nitrógeno o de fosfato, condiciones de crecimiento frías o calientes, ataque por patógenos o insectos, deficiencia de luz, o densidad de plantas aumentada. Otras propiedades de selección incluyen días hasta la dispersión de polen, días hasta la serificación en el maíz, velocidad de extensión foliar, contenido de clorofila, temperatura de la hoja, posición erguida, vigor de la plántula, la longitud entre nódulos, altura de la planta, número de hojas, área de las hojas, macollaje, raíces de anclaje, permanencia del verdor, acame del tallo, acame de la raíz, salud de la planta, fertilidad, quebrado en verde, y resistencia a plagas. Además, pueden evaluarse las características fenotípicas de la semilla cosechada; por ejemplo, en el maíz puede incluir el número granos por fila en la mazorca, el número de filas de granos en la mazorca, el aborto de granos, peso del grano, tamaño del grano, densidad del grano y calidad física del grano. Lo siguiente ilustra ejemplos de ensayos de exploración útiles para identificar rasgos deseados en plantas de maíz. Estos pueden adaptarse fácilmente para explorar otras plantas, tales como colza, algodón, y soja ya sea como híbridos o como líneas puras.
Las plantas de maíz transgénicas que tienen eficacia en el uso del nitrógeno se identifican explorando en campos en los que se aplican fertilizantes con tres niveles de nitrógeno, por ejemplo, bajo nivel (0 kg/hectárea), nivel medio (89 kg/hectárea) y alto nivel (201,7 kg/hectárea). Las plantas con una eficacia del uso del nitrógeno potenciada proporcionan mayor rendimiento en comparación con plantas de control.
Las plantas de maíz transgénicas que tienen rendimiento mejorado se identifican explorando las plantas transgénicas en diversas ubicaciones con plantas cultivadas en condiciones óptimas de control de la producción y un control máximo de las hierbas y plagas. Un objetivo útil para rendimiento mejorado es un aumento del 5% al 10% en el rendimiento en comparación con el rendimiento producido por plantas cultivadas a partir de semilla para una planta de control. Pueden aplicarse procedimientos de selección en múltiples y diversas localizaciones geográficas y a lo largo de una o más temporadas de siembra para distinguir estadísticamente la mejora del rendimiento de los efectos ambientales naturales.
Las plantas de maíz transgénicas que tienen una eficacia del uso del agua mejorada se identifican explorando plantas en un ensayo donde se contiene el agua durante un periodo para inducir estrés seguido de riego para revivir
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las plantas. Por ejemplo, un procedimiento de selección útil imprime 3 ciclos de sequía/riego en plantas durante un periodo total de 15 días después de un periodo de crecimiento sin estrés de 11 días. Cada ciclo consiste en 5 días, sin aplicación de agua durante los primeros cuatro días y finalizando con agua en el 5º día del ciclo. Los fenotipos principales analizados mediante el procedimiento de selección son los cambios en la velocidad de crecimiento de la planta determinados por la altura y la biomasa durante un tratamiento de sequía vegetativa.
Las plantas de maíz transgénicas que tienen tolerancia al frío mejorada se identifican explorando plantas en un ensayo de germinación en frío y/o un ensayo en campo de tolerancia al frío. En un ensayo de germinación en frío, se colocan bandejas de semillas transgénicas y de control en una cámara de crecimiento oscura a 9,7 grados Celsius durante 24 días. Se identifica que las semillas que tienen mayores velocidades de crecimiento en comparación con el control tienen tolerancia al frío mejorada. En un ensayo de campo de tolerancia al frío, se identifican plantas con tolerancia al frío mejorada sembrando en una fecha más temprana a la siembra primaveral convencional para la localización del campo. Por ejemplo, las semillas se siembran en el suelo aproximadamente dos semanas antes de que los granjeros locales comiencen a plantar maíz, de tal forma que se ejerce un estrés por frío significativo en el cultivo. Como control, las semillas también se siembran en condiciones de siembra óptimas locales de tal forma que la cosecha tiene poca o ninguna exposición a condiciones frías. En cada ubicación, se plantan semillas en condiciones tanto frías como normales, preferentemente con múltiples repeticiones por tratamiento.
La descripción anterior y los ejemplos presentados en la presente divulgación describen los procedimientos de la presente invención, que emplean: (I) una construcción de ADN recombinante que comprende ADN que se somete a procesamiento en un ARN que comprende ARN monocatenario que se une al transcrito de al menos un gen diana para formar un segmento hibridado de al menos ARN parcialmente bicatenario que confiere a dicho transcrito resistencia a la escisión por una ribonucleasa RNasa III en o en las proximidades de dicho segmento hibridado; (II) una construcción de ADN recombinante que comprende ADN que se somete a procesamiento en un ARN que comprende ARN monocatenario que se une al transcrito de al menos un gen diana para formar un segmento hibridado de al menos ARN parcialmente bicatenario que confiere a dicho transcrito resistencia a la escisión por una ribonucleasa RNasa III en o en las proximidades de dicho segmento hibridado, en el que dicho procesamiento de ADN en un ARN que comprende ARN monocatenario comprende la transcripción de dicho ADN en un intermedio de ARN que comprende uno o más segmentos de ARN bicatenario; (III) una construcción de ADN recombinante que comprende ADN que se somete a procesamiento en un ARN que comprende ARN monocatenario que se une al transcrito de al menos un gen diana para formar un segmento hibridado de al menos ARN parcialmente bicatenario que confiere a dicho transcrito resistencia a la escisión por una ribonucleasa RNasa III en o en las proximidades de dicho segmento hibridado, en el que la longitud de dicho ARN monocatenario comprende entre aproximadamente 10 a aproximadamente 100 nucleótidos; (IV) una construcción de ADN recombinante que comprende ADN que se somete a procesamiento en un ARN que comprende ARN monocatenario que se une al transcrito de al menos un gen diana para formar un segmento hibridado de al menos ARN parcialmente bicatenario que confiere a dicho transcrito resistencia a la escisión por una ribonucleasa RNasa III en o en las proximidades de dicho segmento hibridado, que comprende además al menos un elemento seleccionado entre el grupo que consiste en: (A) un promotor funcional en una célula eucariota; (B) un promotor de Pol III unido operativamente a dicho ADN que se somete a procesamiento en un ARN que comprende ARN monocatenario; (C) ADN que se procesa en un aptámero de ARN; (D) una unidad de transcripción de transgén; (E) ADN que codifica un intrón que puede cortarse y empalmarse; (F) ADN que codifica una ribozima autoescindible; (G) ADN que codifica un sitio de reconocimiento de recombinasa de sitio específico; (H) ADN que codifica un elemento de supresión génica; e (I) ADN que codifica un elemento regulador de la transcripción; (V) una construcción de ADN recombinante que comprende ADN que se somete a procesamiento en un ARN que comprende ARN monocatenario que se une al transcrito de al menos un gen diana para formar un segmento hibridado de al menos ARN parcialmente bicatenario que confiere a dicho transcrito resistencia a la escisión por una ribonucleasa RNasa III en o en las proximidades de dicho segmento hibridado, en el que dicho al menos un gen diana comprende: (A) secuencia codificante, secuencia no codificante, o secuencia tanto codificante como no codificante; o (B) un solo gen diana, o múltiples genes diana; o (C) uno o más del grupo que consiste en: (1) un gen endógeno de un eucariota, (2) un transgén de una planta transgénica, (3) un gen endógeno de una plaga o patógeno de una planta, y (4) un gen endógeno de un simbionte asociado con una plaga o patógeno de una planta; (VI) una construcción de ADN recombinante que comprende ADN que se somete a procesamiento en un ARN que comprende ARN monocatenario que se une al transcrito de al menos un gen diana para formar un segmento hibridado de al menos ARN parcialmente bicatenario que confiere a dicho transcrito resistencia a la escisión por una ribonucleasa RNasa III en o en las proximidades de dicho segmento hibridado, en el que dicha unión de dicho ARN monocatenario a dicho transcrito: (A) inhibe la supresión mediada por ARN bicatenario de dicho al menos un gen diana; o (B) inhibe la traducción de dicho transcrito; (VII) una construcción de ADN recombinante que comprende ADN que se somete a procesamiento en un ARN que comprende ARN monocatenario que se une al transcrito de al menos un gen diana para formar un segmento hibridado de al menos ARN parcialmente bicatenario que confiere a dicho transcrito resistencia a la escisión por una ribonucleasa RNasa III en o en las proximidades de dicho segmento hibridado, en el que dicha unión de dicho ARN monocatenario a dicho transcrito: (A) inhibe la supresión mediada por ARN bicatenario de dicho al menos un gen diana; o (B) inhibe la traducción de dicho transcrito; y en el que: (1) dicha unión de dicho ARN monocatenario a dicho transcrito inhibe la supresión mediada por ARN bicatenario de dicho al menos un gen diana y la longitud de dicho segmento hibridado comprende entre aproximadamente 10 a aproximadamente 100 pares de bases; (2) dicha unión de dicho ARN monocatenario a dicho transcrito inhibe la traducción de dicho transcrito y la longitud de dicho segmento hibridado
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miARN identificada en las tablas 2 o 3; (B) ADN que codifica un bloqueador de la escisión modificado en 5' para evitar o disminuir la escisión mediada por ARN pequeño del transcrito de al menos una diana de miARN identificada en las tablas 2 o 3; (C) ADN que codifica un inhibidor traduccional para evitar o disminuir la escisión mediada por ARN pequeño del transcrito de al menos una diana de miARN identificada en las tablas 2 o 3; (D) ADN que codifica un señuelo para evitar o disminuir la escisión mediada por ARN pequeño del transcrito de al menos una diana de miARN identificada en las tablas 2 o 3; (E) ADN que codifica un transgén que no responde a miARN que tiene una secuencia de nucleótidos procedente de la secuencia de nucleótidos nativa de al menos una diana de miARN identificada en las tablas 2 o 3, en el que un sitio de reconocimiento de miARN en dicha secuencia de nucleótidos nativa se elimina o modifica de otro modo para evitar la escisión mediada por miARN; (F) ADN que codifica un precursor de miARN que se procesa en un miARN para suprimir la expresión de al menos una diana de miARN identificada en las tablas 2 o 3; (G) ADN que codifica ARN bicatenario que se procesa en ARNpi para suprimir la expresión de al menos una diana de miARN identificada en las tablas 2 o 3; y (H) ADN que codifica un ARNpi-ta que se procesa en ARNpi para suprimir la expresión de al menos una diana de miARN identificada en las tablas 2 o 3; y en el que dicha al menos una diana de miARN identificada en las tablas 2 o 3 es al menos una seleccionada entre el grupo que consiste en una diana de miR156, una diana de miR160, una diana de miR164, una diana de miR166, una diana de miR167, una diana de miR169, una diana de miR171, una diana de miR172, una diana de miR319, una diana de miR395, una diana de miR396, una diana de miR398, una diana de miR399, una diana de miR408, una diana de miR444, una diana de miR528, una diana de miR167g, una diana de miR169g, COP1 (fotomorofogénesis I constitutivo), GA2ox (oxidasa del ácido 2 giberélico), GA20ox (oxidasa del ácido 20 giberélico), HB2 (caja homeostática 2), HB2-4 (caja homeostática 2 y caja homeostásica 4), HB4 (caja homeostática 4), LG1 (liguleless l), SPX (SYG1, dominio PHO81 y XPR1; PFAM entrada PF03105 en www.sanger.ac.uk), VIM1a (variante en metilación 1a), DHS1 (desoxihipusina sintasa), DHS2 (desoxihipusina sintasa), DHS3 (desoxihipusina sintasa), DHS4 (desoxihipusina sintasa), DHS5 (desoxihipusina sintasa), DHS6 (desoxihipusina sintasa), DHS7 (desoxihipusina sintasa), DHS8 (desoxihipusina sintasa), CRF (dedo ANULAR de maíz; RNF169), G1543a (ortólogo de maíz de la caja homeostática 17 de Arabidopsis thaliana), G1543b (ortólogo de maíz de la caja homeostática 17 de Arabidopsis thaliana), GS3 (tamaño del grano 3), y GW2 (peso del grano 2); (XXII) una construcción de ADN recombinante que puede transcribirse en una célula vegetal, que comprende un promotor que es funcional en dicha célula vegetal y que está unido operativamente a al menos un polinucleótido seleccionado entre: (A) ADN que codifica un bloqueador de la escisión para evitar o disminuir la escisión mediada por ARN pequeño del transcrito de al menos una diana de miARN identificada en las tablas 2 o 3; (B) ADN que codifica un bloqueador de la escisión modificado en 5' para evitar o disminuir la escisión mediada por ARN pequeño del transcrito de al menos una diana de miARN identificada en las tablas 2 o 3; (C) ADN que codifica un inhibidor traduccional para evitar o disminuir la escisión mediada por ARN pequeño del transcrito de al menos una diana de miARN identificada en las tablas 2 o 3;
(D) ADN que codifica un señuelo para evitar o disminuir la escisión mediada por ARN pequeño del transcrito de al menos una diana de miARN identificada en las tablas 2 o 3; (E) ADN que codifica un transgén que no responde a miARN que tiene una secuencia de nucleótidos procedente de la secuencia de nucleótidos nativa de al menos una diana de miARN identificada en las tablas 2 o 3, en el que un sitio de reconocimiento de miARN en dicha secuencia de nucleótidos nativa se elimina o modifica de otro modo para evitar la escisión mediada por miARN; (F) ADN que codifica un precursor de miARN que se procesa en un miARN para suprimir la expresión de al menos una diana de miARN identificada en las tablas 2 o 3; (G) ADN que codifica ARN bicatenario que se procesa en ARNpi para suprimir la expresión de al menos una diana de miARN identificada en las tablas 2 o 3; y (H) ADN que codifica un ARNpi-ta que se procesa en ARNpi para suprimir la expresión de al menos una diana de miARN identificada en las tablas 2 o 3; y en el que dicha al menos una diana de miARN identificada en las tablas 2 o 3 es al menos una seleccionada entre el grupo que consiste en una diana de miR156, una diana de miR160, una diana de miR164, una diana de miR166, una diana de miR167, una diana de miR169, una diana de miR171, una diana de miR172, una diana de miR319, una diana de miR395, una diana de miR396, una diana de miR398, una diana de miR399, una diana de miR408, una diana de miR444, una diana de miR528, una diana de miR167g, una diana de miR169g, COP1 (fotomorofogénesis I constitutivo), GA2ox (oxidasa del ácido 2 giberélico), GA20ox (oxidasa del ácido 20 giberélico), HB2 (caja homeostática 2), HB2-4 (caja homeostática 2 y caja homeostásica 4), HB4 (caja homeostática 4), LG1 (liguleless l), SPX (SYG1, dominio PHO81 y XPR1; PFAM entrada PF03105 en www.sanger.ac.uk), VIM1a (variante en metilación 1a), DHS1 (desoxihipusina sintasa), DHS2 (desoxihipusina sintasa), DHS3 (desoxihipusina sintasa), DHS4 (desoxihipusina sintasa), DHS5 (desoxihipusina sintasa), DHS6 (desoxihipusina sintasa), DHS7 (desoxihipusina sintasa), DHS8 (desoxihipusina sintasa), CRF (dedo ANULAR de maíz; RNF169), G1543a (ortólogo de maíz de la caja homeostática 17 de Arabidopsis thaliana), G1543b (ortólogo de maíz de la caja homeostática 17 de Arabidopsis thaliana), GS3 (tamaño del grano 3), y GW2 (peso del grano 2); y en el que dicho al menos un polinucleótido es al menos uno seleccionado entre el grupo que consiste en ADN que codifica una secuencia de nucleótidos seleccionada entre las SEC ID Nº: 1120, 1121, 1122, 1248, 1257, 1313, 1314, 1364, 1387,1478, 1489, 1490,1491, 1492,1493, 1585, 1597, 1598, 1599, 1713, 1752, 1753, 1801, 1802,1820, 1927,1929, 1931, 1971, 2006, 2007, 2008, 2010, 2012, 2014, 2016, 2018, 2022, 2023, 2025, 2027, 2029, 2031,2033, 2035, 2037, 2039, 2041,2043, 2045, 2047, 2049, 2051,2053, 2055, 2056, 2057, 2059, 2060, 2061, y 2063; y (XXIII) una construcción de ADN recombinante que puede transcribirse en una célula vegetal, que comprende un promotor que es funcional en dicha célula vegetal y que está unido operativamente a al menos un polinucleótido seleccionado entre: (A) ADN que codifica un bloqueador de la escisión para evitar o disminuir la escisión mediada por ARN pequeño del transcrito de al menos una diana de miARN identificada en las tablas 2 o 3; (B) ADN que codifica un bloqueador de la escisión modificado en 5' para evitar o disminuir la escisión mediada por ARN pequeño del transcrito de al menos una diana de miARN identificada en las tablas 2 o 3; (C) ADN que codifica un inhibidor traduccional para evitar o disminuir la
escisión mediada por ARN pequeño del transcrito de al menos una diana de miARN identificada en las tablas 2 o 3;
(D) ADN que codifica un señuelo para evitar o disminuir la escisión mediada por ARN pequeño del transcrito de al menos una diana de miARN identificada en las tablas 2 o 3; (E) ADN que codifica un transgén que no responde a miARN que tiene una secuencia de nucleótidos procedente de la secuencia de nucleótidos nativa de al menos una 5 diana de miARN identificada en las tablas 2 o 3, en el que un sitio de reconocimiento de miARN en dicha secuencia de nucleótidos nativa se elimina o modifica de otro modo para evitar la escisión mediada por miARN; (F) ADN que codifica un precursor de miARN que se procesa en un miARN para suprimir la expresión de al menos una diana de miARN identificada en las tablas 2 o 3; (G) ADN que codifica ARN bicatenario que se procesa en ARNpi para suprimir la expresión de al menos una diana de miARN identificada en las tablas 2 o 3; y (H) ADN que codifica un
10 ARNpi-ta que se procesa en ARNpi para suprimir la expresión de al menos una diana de miARN identificada en las tablas 2 o 3; y en el que dicha construcción de ADN recombinante se integra de manera estable en un plástido o un cromosoma de dicha célula vegetal.
Ejemplos
Ejemplo 1
15 El presente ejemplo ilustra la elaboración y uso de una construcción de ADN recombinante "bloqueadora de la escisión" que incluye ADN que se somete a procesamiento en un ARN incluyendo ARN monocatenario que se une al transcrito de al menos un gen diana para formar un segmento hibridado de al menos ARN parcialmente bicatenario que confiere al transcrito resistencia a la escisión por una ribonucleasa RNasa III en o en las proximidades del segmento hibridado, en el que la unión del ARN monocatenario al transcrito (y la formación
20 resultante del segmento hibridado) inhibe la supresión de un gen diana mediada por ARN bicatenario. Más específicamente, el presente ejemplo describe construcciones para producir un miARN artificial o diseñado por ingeniería genética o un bloqueador de la escisión en una planta y el uso del bloqueador de la escisión para inhibir la supresión mediada por miARN de un gen GL1 de Arabidopsis en células vegetales transformadas.
Gen diana: El gen GLABROUS1 (GL1) de Arabidopsis es necesario para la síntesis del tricoma; los mutantes de 25 GL1 carecen de tricomas foliares. GL1 está codificado por la secuencia de ADN
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incluye un sitio de reconocimiento, que tiene la secuencia CTCCACCGTCATTGTTCATCA (SEC ID Nº: 2) y que también está indicada por el texto subrayado en las posiciones de nucleótido 404 a 424 de SEC ID Nº: 1.
MicroARN: Como un armazón o secuencia inicial para diseñar un miARN artificial se seleccionó ADN procedente de 30 un precursor "miRMON1" de soja que tiene la secuencia
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Bloqueador de la escisión: Se diseñó ADN que codifica un precursor de bloqueador de la escisión ("miRGL1-CB") derivado de la SEC ID Nº: 3 para transcribirlo en un precursor de miARN de tipo "bloqueador de la escisión" que se procesa en un ARN que incluye ARN monocatenario que se une al transcrito del gen diana GL1 para formar un segmento hibridado de ARN al menos parcialmente bicatenario que confiere al transcrito de GL1 resistencia a la escisión por una ribonucleasa RNasa III dentro o en las proximidades del segmento hibridado, en el que la unión del ARN monocatenario al transcrito (y la formación resultante del segmento hibridado) inhibe la supresión del al menos un gen diana mediada por ARN bicatenario, en el que la supresión está mediada por miRGL1. El precursor de miRGL1-CB tenía la secuencia
imagen15
donde los nucleótidos del bloqueador de la escisión maduro ("miRGL1-CB") se indican mediante texto subrayado en las posiciones de nucleótido 104 a 124 de SEC ID Nº: 7 y los nucleótidos de la hebra opuesta correspondiente miARN* ("miRGL1-CB*") se indica mediante texto en cursiva en las posiciones de nucleótido 151 a 171 de SEC ID Nº: 7. Los nucleótidos en las posiciones 113 y 114 de la SEC ID Nº: 7 se indican en texto subrayado en negrita y corresponden a las posiciones 10 y 11 (en dirección de 3' a 5') del miRGL1-CB1 maduro; estos dos nucleótidos se seleccionaron para que estuviesen desemparejados de manera intencional con los nucleótidos del sitio de reconocimiento de miARN (SEC ID Nº: 2) de GL1 (SEC ID Nº: 1) para prevenir la escisión por una ribonucleasa RNasa III. Se predijo que el ARN precursor de miRGL1-CB tiene la estructura plegada representada en la figura 1C y se procesa en la planta en el miRGL1-CB maduro, que tiene la secuencia (en dirección de 5' a 3') TGATGAACATAGACGGTGGAG (SEC ID Nº: 8, como alternativa escrita en dirección de 3' a 5' como GAGGTGGCAGATACAAGTAGT). La figura 1E ilustra un alineamiento del sitio de reconocimiento de miARN de GL1 (SEC ID Nº: 2), el miRGL1 maduro en dirección de 3’ a 5’ (SEC ID Nº: 6), y el miRGL1-CB maduro en dirección de 3’ a 5’ (SEC ID Nº: 8).
Sensor de miRGL1: Se diseñó ADN que codifica un "sensor de miRGL1" que tiene la secuencia TccaqctqctcatttqqtctcaTGATCACTGCGGCCGCAATACAqccataqatcacttqatqtcaCGAccacccattcatcagatttctctctgcaagcg (SEC ID Nº: 9) para incluir un sitio de reconocimiento de miRGL1 artificial que tiene la secuencia GACCACCGTCATTGTTCATCA (SEC ID Nº: 10), que también está indicada por texto subrayado en las posiciones de nucleótido 67 y 87 de SEC ID Nº: 9. Los nucleótidos en las posiciones 67 y 68 de la SEC ID Nº: 9 (o los nucleótidos en las posiciones 1 y 2 de la SEC ID Nº: 10) se indican en texto subrayado en negrita y corresponden a las posiciones 1 y 2 (en dirección de 3' a 5') del miRGL1 maduro; estos dos nucleótidos se seleccionaron para que estuviesen desemparejados de manera intencional con los dos últimos nucleótidos en el extremo 3' del miRGL1 maduro (SEC ID Nº: 6) para evitar la transitividad.
Se construyeron tres plásmidos para la transformación mediada por Agrobacterium:
(1)
"35S/miRGL1/Term" -este plásmido incluyó una construcción que contenía, en dirección de 5' a 3', (a) un promotor 35S que dirigía la expresión de (b) un precursor de miRGL1 (SEC ID Nº: 5), y (c) un terminador nos;
(2)
"35S/GFP/miRGL1-sensor/Term" -este plásmido incluyó una construcción que contenía, en dirección de 5' a 3', (a) un promotor 35S unido operativamente a (b) una secuencia codificante de proteína fluorescente verde (GFP), (c) una secuencia de sensor de miRGL1 (SEC ID Nº: 9), y (d) un terminador nos;
(3)
"35S/miRGL1-CB" -este plásmido incluyó una construcción que contenía, en dirección de 5' a 3', (a) un promotor 35S que dirigía la expresión de (b) un precursor de miRGL1-CB (SEC ID Nº: 7).
Un aspecto de la presente invención se demostró usando protocolos descritos en Koscianska y col. (2005) Plant Mol. Biol., 59:647-661). Se transformaron transitoriamente plantas de Nicotiana benthamiana usando Agrobacterium con diversas combinaciones de estos plásmidos y, en caso necesario, Agrobacterium de "carga" (plásmido nulo) para asegurar la infiltración de cantidades iguales de Agrobacterium.
Las plantas de Nicotiana benthamiana transformadas con el plásmido (2) mostraron fluorescencia de GFP (verde) cuando se visualizaron con luz UV. En las plantas transformadas con los plásmidos (1) y (2), la fluorescencia de GFP se suprimió con fluorescencia solo de clorofila (roja) observada con luz UV, indicando que el microARN de miRGL1 suprimió la expresión de GFP. En las plantas transformadas con los plásmidos (1), (2) y (3), se restauró la fluorescencia de GFP, lo que indica que el bloqueador de la escisión miRGL1-CB inhibió la supresión mediada por ARN bicatenario (es decir, mediada por mRGL1) del gen diana GFP protegiendo el sitio de reconocimiento de miRGL1 de la escisión por el miRGL1 maduro, dando como resultado expresión aumentada (fluorescencia) del gen diana GFP en relación a su expresión en ausencia del bloqueador de la escisión.
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imagen17
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Tabla 1: diccionario de palabras clave de dianas de miARN
miR156
Proteína de unión a promotor de Squamosa, Unión a promotor de Squamosa, Unión a promotor de Squamosa, similar a SBP, SPL, SPL2, SPL15, SPL9, SPL13, SPL4, SPL10, SPL6, SPL11, proteína que contiene dominio SBP, dominio SBP, dominio SBP, arquitectura de gluma de teosinte, tga1
miR157
Proteína de unión a promotor de Squamosa, Unión a promotor de Squamosa, Unión a promotor de Squamosa, similar a SBP, SPL, SPL2, SPL15, SPL9, SPL13, SPL4, SPL10, SPL6, SPL11, proteína que contiene dominio SBP, dominio SBP, dominio SBP, arquitectura de gluma de teosinte, tga1
miR158
Repetición de pentatricopéptido, pentatricopéptido (PPR), PPR, repetición de PPR, pentatricopéptido
miR159
MYB, AtMYB65, AtMYB101, AtMYB104, GAMyB, proteína de dominio myb, dominio myb, proteína myb, DUO1, MYB120, MYB97, MYB65, MYB33, dominio de unión a ADN similar a myb, similar a myb, unión a ADN similar a myb
miR160
Factor de respuesta a auxina, ARF, ARF10, ARF16, ARF17, proteína que contiene dominio de unión a ADN B3, dominio B3, dominio de unión a ADN B3, contiene dominio B3
miR161
Repetición de pentatricopéptido, pentatricopéptido (PPR), PPR, repetición de PPR, EMB2654, EMBRYO DEFECTIVE 2654, pentatricopéptido
miR162
similar a Dicer 1, similar a Dicer1, similar a Dicer 1, DCL, DCL1, CAF, SUS1, SIN1, ASU1, EMB76, EMB60, Dicer
miR163
metiltransferasa dependiente de S-adenosilmetionina, SAMT, S-adenosil-L-metionina:carboxil metiltransferasa, metiltransferasa
miR164
Cotiledón en forma de taza, Cotiledón en forma de taza, CUC, NAM, NAC, CUC2, CUC1, similar a NAM, NAC1, Sin meristemo apical, ATAF, ANAC079/ANAC080, ANAC100, ANAC092, proteína de dominio NAC, dominio NAC, proteína que contiene dominio NAC, contiene dominio NAC
miR165
Phavoluta, Phabulosa, Revoluta, Corona, PHB, PFV, CNA, HD-ZIPIII, HD-ZIP, HD ZIP, REV, PHV, AtHB8, AtHB15, ICU4, ATHB-15, INCURVATA 4, IFL, IFL1, proteína HD-ZIP de clase III de HD-Zip, clase III de HZ-ZIP, proteína HD-Zip, proteína HD-ZIP de clase III, HD-ZIP de clase III, homeodominio/cremallera de leucina, hoja enrollada (rld1), hoja enrollada 1 hoja enrolada, rld1, gen HB1, HB1, HD-ZIP III
miR166
Phavoluta, Phabulosa, Revoluta, Corona, PHB, PFV, CNA, HD-ZIPIII, HD-ZIP, HD ZIP, REV, PHV, AtHB8, AtHB15, ICU4, ATHB-15, INCURVATA 4, IFL, IFL1, proteína HD-ZIP de clase III de HD-Zip, clase III de HZ-ZIP, proteína HD-Zip, proteína HD-ZIP de clase III, HD-ZIP de clase III, homeodominio/cremallera de leucina, hoja enrollada1 (rld1), hoja enrollada 1 hoja enrolada, rld1, gen HB1, HB 1, HD-ZIP III
miR167
Factor de respuesta a auxina, ARF, ARF6, ARF8
miR168
Argonauta, AGO, AGO1, PINHEAD, ZWILLE, ZLL, AGO2, AGO3, AGO4, AGO5, AGO6, AGO7, AGO8, AGO9, AGO10, PNH/ZLL
miR169
factor Y de transcripción nuclear, HAP2, CCAAT, unión a CCAAT, NFYa, HAP2b, similar a HAP2b, similar a HAP2ab, similar a HAP2c, HAP2c, HAP2a, similar a HAP2a
miR170
Similar a Scarecrow, Scarecrow, SCL, regulador génico de SCARECROW, gen SCARECROW, factores de transcripción de Scarecrow/GRAS, GRAS, Scarecrow/GRAS, proteína de ruta de señalización de nodulación 2, ruta de señalización de nodulación 2, Ruta de Señalización de Nodulación 2, NSP2, ruta de señalización de nodulación, Ruta de Señalización de Nodulación, NSP1
miR171
Similar a Scarecrow, Scarecrow, SCL, regulador génico de SCARECROW, gen SCARECROW, factores de transcripción de Scarecrow/GRAS, GRAS, Scarecrow/GRAS, proteína de ruta de señalización de nodulación 2, ruta de señalización de nodulación 2, Ruta de Señalización de Nodulación 2, NSP2, ruta de señalización de nodulación, Ruta de Señalización de Nodulación, NSP1
miR172
Apetala, AP2, TOE1, TOE2, TOE3, SMZ, SNZ, Diana de EAT, TOE, Schnarchzapfen SCHLAFMUTZE, Glossy15, Glossy-15, Glossy 15, proteína que contiene dominio AP2, proteína de dominio AP2, dominio AP2, proteína homeótica floral Apetala APETALA2, proteína homeótica floral Apetala, proteína Apetala, APETALA2
miR173
TAS
(continuación)
miR319
Teosinte ramificado, Cicloidea, PCF, TCP, TCP2, TCP3, TCP4, TCP10, TCP24, factor de transcripción de familia TCP, familia TCP, proteína de dominio TCP, proteína de dominio TCP, detención embrionaria de efecto materno, Ciclina, CyCA, CyCB, CyCC, CyCD, CyCH, CyCT, CyCU
miR390
TAS3, TAS, Ser/Thr/Tyr proteín cinasa, Ser/Thr/Tyr
miR393
Respuesta de inhibidor de transporte, TIR, TIRI, Caja F, Caja F, proteína de la familia de caja F, proteína de la familia de caja F, familia de caja F, familia de caja F, IPS1, GRH1, GRR1-LIKE, ubiquitina proteína ligasa, ubiquitina proteína ligasa, proteína de la familia hélice-bucle-hélice (nHLH) básica, bHLH, hélice-bucle-hélice básico, proteína que contiene dominio de caja F, proteína de dominio de caja F, dominio de caja F
miR394
Caja F, Caja F, proteína de la familia de caja F, proteína de la familia de caja F, familia de caja F, familia de caja F, proteína que contiene dominio de caja F, proteína de dominio de caja F, dominio de caja F
miR395
APS, AST, ATP-sulfurilasa, transportador de sulfato, transportador de sulfato, AST68, APS 1, APS3, APS4, ATP sulfurilasa, sulfato adenililtransferasa, Transportador de sulfato
miR396
Factor de regulación del crecimiento, GRL, GRF, GROWTH-REGULATING FACTOR, GROWTH REGULATING FACTOR, AtGRF3, AtGRF4, AtGRF8, AtGRF7, AtGRF1 AtGRF2, AtGRF
miR397
Laccasa, LAC, PCL, plantacianina, plastacianina, proteína de unión a cobre azul, IRX12, unión a ion de cobre
miR398
Superóxido dismutasa de cobre, superóxido dismutasa 2, CSD, CSD2, COPPER/ZINC SUPEROXIDE DISMUTASE, COPPER ZINC SUPEROXIDE DISMUTASE, COPPER-ZINC SUPEROXIDE DISMUTASE, citocromo c oxidasa, citocromoc oxidasa, citocromo-c oxidasa
miR399
Enzima de conjugación a ubiquitina E2, PH02, ubiquitina proteína ligasa, ubiquitina proteína ligasa, UBC24, enzima de conjugación a ubiquitina, conjugación a ubiquitina
miR400
Repetición de pentatricopéptido, pentatricopéptido (PPR), PPR, EMB2745, EMBRYO DEFECTIVE 2745, pentatricopéptido
miR402
DML3, DEMETER-LIKE PROTEIN 3, DEMETER-LIKE PROTEIN, DEMETER LIKE PROTEIN
miR403
AGO, Argonauta, AGO2
miR408
Laccasa, LAC, LAC3, PCL, plantacianina, plastacianina, proteína de unión a cobre azul, unión a cobre azul, ARPN, unión a ion de cobre, proteína de cobre azul
miR444
caja de MADS, caja de MADS, MADS
miR447
relacionado con 2-fosfoglicerato cinasa, 2-fosfoglicerato cinasa, fosfoglicerato cinasa
miR472
RFL1, RPS5, RPS5-LIKE 1, unión a ATP, RPS5, RESISTANT TO P. SYRINGAE 5, proteína de resistencia a enfermedad (clase CC-NBS-LRR), proteína de resistencia a enfermedad, CC-NBS-LRR, proteína de resistencia a enfermedad NBS-LRR, proteína de resistencia a enfermedad de tipo NBS-LRR,
miR473
proteína que contiene dominio GRAS, AtGAI, AtLAS, AtPAT1, AtRGA, AtRGL1, AtRGL2, AtRGL3, AtSCL1, AtSCL11, AtSCL13, AtSCL14, AtSCL15, AtSCL16, AtSCL18, AtSCL21, AtSCL22, AtSCL23, AtSCL26, AtSCL27, AtSCL28, AtSCL29, AtSCL3, AtSCL30, AtSCL31, AtSCL32, AtSCL33, AtSCL4, AtSCL5, AtSCL6, AtSCL7, AtSCL8, AtSCL9, AtSCR, AtSHR, REPRESSOR, RGA2, RGA-LIKE 1, RGL, RGL1, SGR7, VHS4, VHS5
miR474
Repetición de pentatricopéptido,pentatricopéptido (PPR), PPR,repetición de PPR,EMB2654,EMBRYO DEFECTIVE 2654,pentatricopéptido
miR475
Repetición de pentatricopéptido, pentatricopéptido (PPR), PPR, repetición de PPR, EMB2654, EMBRYO DEFECTIVE 2654, pentatricopéptido
miR476
Repetición de pentatricopéptido, pentatricopéptido (PPR), PPR, repetición de PPR, EMB2654, EMBRYO DEFECTIVE 2654, pentatricopéptido
miR477
Factor de transcripción de hélice-bucle-hélice básico (bHLH), unión a factor de transcripción/ion zinc similar a CONSTANS, proteína que contiene dominio GRAS, bHLH, GRAS, similar a CONSTANS, CONSTANS
(continuación)
miR478
proteína similar a transportador aniónico orgánico, transportador aniónico orgánico
miR480
Proteína de transporte de oligopéptidos dependiente de protones, Transporte de oligopéptidos dependiente de protones, Transporte de oligopéptidos dependiente de protones
miR482
Proteína supuesta de resistencia a enfermedad, proteína de resistencia a enfermedad, resistencia a enfermedad
miR529
Factor de respuesta a etileno/factor de transcripción de dominio AP2, erf/ap2, Factor de respuesta a etileno/AP2
miR534
Proteínas de repetición de anquirina, Proteínas de repetición de anquirina, Proteína de repetición de anquirina, Repetición de anquirina, Repetición de anquirina
miR536
Caja F, Caja F, proteína de la familia de caja F, proteína de la familia de caja F, familia de caja F, familia de caja F, proteína de caja F
miR538
caja de MADS, MADS
miR771
Proteína de la familia de factor de iniciación de la traducción eucariota 2, proteína de la familia elF2, eIF-2, eIF2
miR773
DMT02, DMT2, MET02, MET2, ADN metiltransferasa 2, ADN (citosina-5-)-metiltransferasa
miR774
familia de caja F, Caja F, Caja F, proteína que contiene dominio de caja F, proteína de dominio de caja F, dominio de caja F
miR775
proteína de la familia de galactosiltransferasa, familia de galactosiltransferasa, galactosiltransferasa
miR776
IRE, INCOMPLETE ROOT HAIR ELONGATION
miR777
relacionado con proteína que interactúa con COP1, proteína que interactúa con COP1, interactúa con COP1, interactúa con COP1
miR778
dominio SET, SET, SUVH6, SUVH5, homólogo de SU(VAR)3-9
miR779
proteína cinasa transmembrana de repetición rica en leucina, repetición rica en leucina, repetición rica en leucina, proteína cinasa transmembrana, transmembrana
miR780
CHX18, ATCHX18, intercambiador de cationes/hidrógeno 18, antiportador monovalente de catión:protones, antiportador de protones
miR781
InterPro:IPR003169, proteína que contiene dominio BAF60b de complejo SWIB, dominio BAF60b de complejo SWIB, SWIB, BAF60b, proteína que contiene dominio plus-3, dominio plus-3, plus-3, proteína que contiene dominio GYF, dominio GYF
miR809
gen de proteína resistente a enfermedad Mlo, similar a Mlo, Mlo
miR818
gen de proteína de dominio ENT, dominio ENT, dominio ENT
miR820
ADN citosina metiltransferasa, citosina metiltransferasa
miR823
CMT3, CHROMOMETHYLASE 3, CHROMOMETHYLASE
miR824
caja de MADS, MADS, AGL16, AGAMOUS-LIKE, AGAMOUS
miR827
SPX, NLA, SYG1/Pho81/XPR1, dedo de cinc, dedo de cinc, dedo RING tipo C3HC4, C3HC4
miR828
MYB, proteína de dominio myb, proteína myb, AtMYB113, MYB113, proteína similar a MYB, similar a myb, unión a ADN similar a myb
miR842
JR/MBP, proteína familia de lectina de jacalina, familia de lectina de jacalina, lectina de jacalina, jacalina, lectina
miR844
proteína de la familia de proteína cinasa, familia de proteína cinasa, proteína cinasa
miR846
JR/MBP, InterPro:IPR001229, proteína inducible por jasmonato, proteína familia de lectina de jacalina, familia de lectina de jacalina, lectina de jacalina, jacalina, lectina
miR856
Transportador de cinc, Transportador de cinc, ACHX18, ATCHX18| ATCHX18, intercambiador de cationes/hidrógeno 18, intercambiador de cationes/hidrógeno, antiportador monovalente de catión:protones, antiportador de protones, antiportador
miR857
LAC, LAC7, lacasa 7, unión a ion de cobre, unión a ion de cobre
(continuación)
miR858
MYB, proteína de dominio myb, proteína myb, MYB12, AtMYB12, AtMYB83, MYB83, proteína similar a MYB, similar a myb, unión a ADN similar a myb
miR859
Caja F, Caja F, proteína de la familia de caja F, proteína de la familia de caja F, familia de caja F, familia de caja F, proteína de caja F, InterPro:IPR006527, proteína de la familia de UDP-3-O-acil Nacetilglucosamina desacetilasa, familia de UDP-3-O-acil N-acetilglucosamina desacetilasa, UDP-3O-acil N-acetilglucosamina desacetilasa, UDP-3-O-acil N-acetilglucosamina, proteína que contiene dominio de caja F, proteína de dominio de caja F, dominio de caja F
miR902
Factor de transcripción de hélice-bucle-hélice básico (bHLH), bHLH
miR904
AGO, Argonauta
miR1029
Factor de respuesta a etileno/factor de transcripción de dominio AP2, Factor de respuesta a etileno, Factor de respuesta a etileno, erf/AP2
miR1219c
Factores de respuesta a auxina, Factor de respuesta a auxina, arf
Tabla 2: Dianas de miARN validadas computacionalmente
miARN
Función génica SEC ID Nº: ID del gen Especie de origen*
miR156/157
SPL 15 PHE0014564 Arabidopsis thaliana
miR156/157
SPL 16 PHE0014996 A. thaliana
miR156/157
Proteína de unión a promotor de Squamosa 17 PHE0004508 A. thaliana
miR156/157
Proteína de unión a promotor de Squamosa 18 PHE0004925 A. thaliana
miR160
ARF 19 PHE0003525 A. thaliana
miR164
ANAC092 20 PHE0013733 A. thaliana
miR164
proteína de dominio NAC 21 PHE0001074 A. thaliana
miR165/166
Revoluta 22 PHE0008129 A. thaliana
miR165/166
Revoluta 23 PHE0010493 A. thaliana
miR165/166
Revoluta 24 PHE0012654 A. thaliana
miR165/166
Revoluta 25 PHE0007271 A. thaliana
miR165/166
Revoluta 26 PHE0007467 A. thaliana
miR165/166
Revoluta 27 PHE0007720 A. thaliana
miR165/166
Revoluta 28 PHE0010355 A. thaliana
miR165/166
Revoluta 29 PHE0010473 A. thaliana
miR165/166
Revoluta 30 PHE0010494 A. thaliana
miR165/166
Revoluta 31 PHE0010495 A. thaliana
miR165/166
Revoluta 32 PHE0010537 A. thaliana
miR166
Revoluta 33 PHE0010496 A. thaliana
miR166
Revoluta 34 PHE0010497 A. thaliana
miR166
Revoluta 35 PHE0010500 A. thaliana
(continuación)
miARN
Función génica SEC ID Nº: ID del gen Especie de origen*
miR167
ARF 36 PHE0003428 A. thaliana
miR172
AP2 37 PHE0003881 A. thaliana
miR172
dominio AP2 38 PHE0006606 A. thaliana
miR393
Caja F 39 PHE0007151 A. thaliana
miR393
Caja F 40 PHE0007164 A. thaliana
miR393
Caja F 41 PHE0007167 A. thaliana
miR393
Respuesta de inhibidor de transporte 42 PHE0004988 A. thaliana
miR396
GRL 43 PHE0004617 A. thaliana
miR778
dominio SET 44 PHE0006443 A. thaliana
miR779
proteína cinasa transmembrana de repetición rica en leucina 45 PHE0002993 A. thaliana
miR858
MYB 46 PHE0001073 A. thaliana
miR858
MYB 47 PHE0001093 A. thaliana
miR858
MYB 48 PHE0002073 A. thaliana
miR858
MYB 49 PHE0010073 A. thaliana
miR858
MyB 50 PHE0011722 A. thaliana
miR858
MyB 51 PHE0015935 A. thaliana
miR859
Caja F 52 PHE0003311 A. thaliana
miR859
Caja F 53 PHE0006468 A. thaliana
miR902
bHLH 54 PHE0000658 A. thaliana
miR902
bHLH 55 PHE0006524 A. thaliana
miR156
Proteína de unión a promotor de Squamosa 56 MRT3708_37334C.1 Colza (Brassica napus o Brassica rapa)
miR156/157
Proteína de unión a promotor de Squamosa 57 MRT3708_10628C.4 Colza
miR156/157
Proteína de unión a promotor de Squamosa 58 MRT3708_22559C.1 Colza
miR156/157
Proteína de unión a promotor de Squamosa 59 MRT3708_30289C.3 Colza
miR156/157
Proteína de unión a promotor de Squamosa 60 MRT3708_39670C.2 Colza
miR156/157
Proteína de unión a promotor de Squamosa 61 MRT3708_53675C.1 Colza
(continuación)
miARN
Función génica SEC ID Nº: ID del gen Especie de origen*
miR156/157
Proteína de unión a promotor de Squamosa 62 MRT3708_58630C.1 Colza
miR159
MYB 63 MRT3708_33278C.1 Colza
miR159
MYB 64 MRT3708_33279C.1 Colza
miR163
metiltransferasa 65 MRT3708_16440C.1 Colza
miR163
metiltransferasa 66 MRT3708_28174C.1 Colza
miR163
metiltransferasa 67 MRT3708_52155C.2 Colza
miR164
NAM 68 MRT3708_39966C.1 Colza
miR164
Sin meristemo apical 69 MRT3708_51022C.1 Colza
miR164
Sin meristemo apical 70 MRT3708_7877C.4 Colza
miR165/166
proteína HD-ZIP de clase III 71 MRT3708_45624C.1 Colza
miR165/166
proteína HD-Zip 72 MRT3708_5493C.1 Colza
miR167
Factor de respuesta a auxina 73 MRT3708_37499C.2 Colza
miR167
Factor de respuesta a auxina 74 MRT3708_50323C.1 Colza
miR169
unión a CCAAT 75 MRT3708_45516C.2 Colza
miR169
unión a CCAAT 76 MRT3708_46224C.1 Colza
miR169
unión a CCAAT 77 MRT3708_56325C.1 Colza
miR169
factor Y de transcripción nuclear 78 MRT3708_42756C.1 Colza
miR170/171
regulador génico de SCARECROW 79 MRT3708_34048C.2 Colza
miR172
AP2 80 MRT3708_39387C.1 Colza
miR172
dominio AP2 81 MRT3708_36942C.2 Colza
miR393
Respuesta de inhibidor de transporte 82 MRT3708_31301C.1 Colza
miR393
Respuesta de inhibidor de transporte 83 MRT3708_52518C.1 Colza
miR393
Respuesta de inhibidor de transporte 84 MRT3708_55951C.1 Colza
miR394
Caja F 85 MRT3708_61891C.1 Colza
miR395
ATP sulfurilasa 86 MRT3708_35187C.3 Colza
miR395
sulfato adenililtransferasa 87 MRT3708_36129C.1 Colza
miR395
sulfato adenililtransferasa 88 MRT3708_55043C.1 Colza
(continuación)
miARN
Función génica SEC ID Nº: ID del gen Especie de origen*
miR396
factor de regulación del crecimiento 89 MRT3708_29578C.1 Colza
miR396
factor de regulación del crecimiento 90 MRT3708_51563C.1 Colza
miR398
citocromo c oxidasa 91 MRT3708_47361C.2 Colza
miR400
PPR 92 MRT3708_57455C.1 Colza
miR408
proteína de cobre azul 93 MRT3708_29149C.3 Colza
miR472
unión a ATP 94 MRT3708_45273C.1 Colza
miR472
unión a ATP 95 MRT3708_55890C.1 Colza
miR472
unión a ATP 96 MRT3708_55902C.2 Colza
miR824
caja de MADS 97 MRT3708_59018C.1 Colza
miR827
dedo de cinc 98 MRT3708_29390C.1 Colza
miR828
unión a ADN similar a myb 99 MRT3708_31708C.1 Colza
miR856
antiportador 100 MRT3708_61144C.1 Colza
miR857
LAC 101 MRT3708_24461C.1 Colza
miR858
MYB 102 MRT3708_31372C.1 Colza
miR858
unión a ADN similar a myb 103 MRT3708_16589C.4 Colza
miR858
unión a ADN similar a myb 104 MRT3708_29291C.3 Colza
miR858
unión a ADN similar a myb 105 MRT3708_54665C.1 Colza
miR858
unión a ADN similar a myb 106 MRT3708_61897C.1 Colza
miR859
dominio de caja F 107 MRT3708_51653C.1 Colza
miR167
Factor de respuesta a auxina 108 NMT3711_1592C.1 Mostaza silvestre (Brassica rapa o Brassica campestris)
miR168
Argonauta 109 MRT3711_4500C.2 Mostaza silvestre
miR169
factor Y de transcripción nuclear 110 MRT3711_4547C.1 Mostaza silvestre
miR172
AP2 111 MRT3711_6838C.1 Mostaza silvestre
miR319
PCF 112 MRT3711_7220C.1 Mostaza silvestre
miR393
Respuesta de inhibidor de transporte 113 MRT3711_1771C.1 Mostaza silvestre
miR395
sulfato adenililtransferasa 114 MRT3711_3394C.1 Mostaza silvestre
miR395
sulfato adenililtransferasa 115 MRT3711_4165C.1 Mostaza silvestre
miR395
sulfato adenililtransferasa 116 MRT3711_4313C.1 Mostaza silvestre
miR472
unión a ATP 117 MRT3711_7972C.1 Mostaza silvestre
(continuación)
miARN
Función génica SEC ID Nº: ID del gen Especie de origen*
miR827
dedo de cinc 118 MRT3711_10064C.1 Mostaza silvestre
miR858
unión a ADN similar a myb 119 MRT3711_7980C.1 Mostaza silvestre
miR156/157
dominio SBP 120 MRT3847_197471C.3 Glycine max
miR156/157
dominio SBP 121 MRT3847_202791C.3 G. max
miR156/157
dominio SBP 122 MRT3847_28990C.5 G. max
miR156/157
dominio SBP 123 MRT3847_39715C.7 G. max
miR156/157
Proteína de unión a promotor de Squamosa 124 MRT3847_207934C.2 G. max
miR156/157
Proteína de unión a promotor de Squamosa 125 MRT3847_257545C.4 G. max
miR156/157
Proteína de unión a promotor de Squamosa 126 MRT3847_217782C.3 G. max
miR156/157
Proteína de unión a promotor de Squamosa 127 MRT3847_235081C.4 G. max
miR156/157
Proteína de unión a promotor de Squamosa 128 MRT3847_235082C.6 G. max
miR156/157
Proteína de unión a promotor de Squamosa 129 MRT3847_289291C.3 G. max
miR156/157
Proteína de unión a promotor de Squamosa 130 MRT3847_335568C.1 G. max
miR156/157
Proteína de unión a promotor de Squamosa 131 MRT3847_350831C.1 G. max
miR156/157
Proteína de unión a promotor de Squamosa 132 MRT3847_14683C.5 G. max
miR156/157
Proteína de unión a promotor de Squamosa 133 MRT3847_237444C.4 G. max
miR156/157
Proteína de unión a promotor de Squamosa 134 MRT3847_329752C.1 G. max
miR156/157
Proteína de unión a promotor de Squamosa 135 MRT3847_334134C.1 G. max
miR156/157
arquitectura de gluma de teosinte 136 MRT3847_338602C.1 G. max
miR159
dominio de unión a ADN similar a myb 137 MRT3847_345009C.1 G. max
miR159
dominio de unión a ADN similar a myb 138 MRT3847_346338C.1 G. max
miR160
ARF 139 PHE0003526 G. max
miR160
Factor de respuesta a auxina 140 MRT3847_139013C.5 G. max
(continuación)
miARN
Función génica SEC ID Nº: ID del gen Especie de origen*
miR160
Factor de respuesta a auxina 141 MRT3847_197785C.3 G. max
miR160
Factor de respuesta a auxina 142 MRT3847_239685C.2 G. max
miR160
Factor de respuesta a auxina 143 MRT3847_269589C.4 G. max
miR160
Factor de respuesta a auxina 144 MRT3847_28328C.3 G. max
miR160
Factor de respuesta a auxina 145 MRT3847_289982C.2 G. max
miR160
Factor de respuesta a auxina 146 MRT3847_37862C.4 G. max
miR160
Factor de respuesta a auxina 147 MRT3847_41982C.5 G. max
miR160
Factor de respuesta a auxina 148 MRT3847_52071C.7 G. max
miR161
pentatricopéptido 149 MRT3847_4014C.4 G. max
miR161
PPR 150 MRT3847_20482C.2 G. max
miR161
PPR 151 MRT3847_227121C.4 G. max
miR164
proteína de dominio NAC 152 MRT3847_46332C.2 G. max
miR164
proteína de dominio NAC 153 MRT3847_46333C.6 G. max
miR164
NAC1 154 PHE0001363 G. max
miR164
NAM 155 MRT3847_244824C.2 G. max
miR164
Sin meristemo apical 156 MRT3847_259513C.2 G. max
miR164
Sin meristemo apical 157 MRT3847_270117C.3 G. max
miR164
Sin meristemo apical 158 MRT3847_48464C.4 G. max
miR164
Sin meristemo apical 159 MRT3847_48465C.6 G. max
miR165/166
proteína HD-ZIP de clase III 160 MRT3847_209034C.4 G. max
miR165/166
proteína HD-ZIP de clase III 161 MRT3847_233286C.5 G. max
miR165/166
proteína HD-ZIP de clase III 162 MRT3847_248020C.5 G. max
miR165/166
proteína HD-ZIP de clase III 163 MRT3847_288367C.4 G. max
miR165/166
proteína HD-ZIP de clase III 164 MRT3847_296736C.1 G. max
miR165/166
proteína HD-ZIP de clase III 165 MRT3847_326691C.1 G. max
miR165/166
proteína HD-ZIP de clase III 166 MRT3847_345104C.1 G. max
miR165/166
proteína HD-ZIP de clase III 167 MRT3847_348410C.1 G. max
miR166
Caja homeostática 168 PHE0003454 G. max
(continuación)
miARN
Función génica SEC ID Nº: ID del gen Especie de origen*
miR167
ARF 169 PHE0003655 G. max
miR167
Factor de respuesta a auxina 170 MRT3847_195447C.5 G. max
miR167
Factor de respuesta a auxina 171 MRT3847_263906C.5 G. max
miR167
Factor de respuesta a auxina 172 MRT3847_305421C.4 G. max
miR167
Factor de respuesta a auxina 173 MRT3847_340154C.1 G. max
miR167
Factor de respuesta a auxina 174 MRT3847_41926C.6 G. max
miR167
Factor de respuesta a auxina 175 MRT3847_55334C.5 G. max
miR169
unión a CCAAT 176 MRT3847_251095C.3 G. max
miR169
unión a CCAAT 177 MRT3847_259875C.4 G. max
miR169
unión a CCAAT 178 MRT3847_293871C.3 G. max
miR169
unión a CCAAT 179 MRT3847_305217C.3 G. max
miR169
unión a CCAAT 180 MRT3847_347487C.1 G. max
miR169
unión a CCAAT 181 MRT3847_40604C.6 G. max
miR169
unión a CCAAT 182 MRT3847_53466C.6 G. max
miR169
unión a CCAAT 183 MRT3847_53467C.5 G. max
miR169
unión a CCAAT 184 MRT3847_54675C.6 G. max
miR169
NFYa 185 PHE0011547 G. max
miR169
factor Y de transcripción nuclear 186 MRT3847_25786C.5 G. max
miR169
factor Y de transcripción nuclear 187 MRT3847_289667C.3 G. max
miR169
factor Y de transcripción nuclear 188 MRT3847_312701C.1 G. max
miR169
factor Y de transcripción nuclear 189 MRT3847_335193C.1 G. max
miR169
factor Y de transcripción nuclear 190 MRT3847_51286C.6 G. max
miR169
factor Y de transcripción nuclear 191 MRT3847_54010C.4 G. max
miR170/171
Similar a Scarecrow 192 MRT3847_41579C.4 G. max
miR171
GRAS 193 MRT3847_267119C.3 G. max
(continuación)
miARN
Función génica SEC ID Nº: ID del gen Especie de origen*
miR171
GRAS 194 MRT3847_270988C.3 G. max
miR171
GRAS 195 MRT3847_275596C.2 G. max
miR171
GRAS 196 MRT3847_294457C.2 G. max
miR171
GRAS 197 MRT3847_344862C.1 G. max
miR172
dominio AP2 198 PHE0000638 G. max
miR172
dominio AP2 199 MRT3847_202930C.3 G. max
miR172
dominio AP2 200 MRT3847_21933C.5 G. max
miR172
dominio AP2 201 MRT3847_235857C.3 G. max
miR172
dominio AP2 202 MRT3847_257655C.4 G. max
miR172
dominio AP2 203 MRT3847_289890C.3 G. max
miR172
dominio AP2 204 MRT3847_289891C.3 G. max
miR172
dominio AP2 205 MRT3847_295726C.1 G. max
miR172
dominio AP2 206 MRT3847_326790C.1 G. max
miR172
dominio AP2 207 MRT3847_329301C.1 G. max
miR172
dominio AP2 208 MRT3847_43925C.7 G. max
miR172
dominio AP2 209 MRT3847_46007C.5 G. max
miR172
dominio AP2 210 MRT3847_51633C.3 G. max
miR172
dominio AP2 211 MRT3847_59804C.6 G. max
miR172
APETALA2 212 MRT3847_196945C.3 G. max
miR319
Ciclina 213 MRT3847_238163C.3 G. max
miR319
PCF 214 MRT3847_262919C.1 G. max
miR319
factor de transcripción de familia TCP 215 MRT3847_230131C.1 G. max
miR319
factor de transcripción de familia TCP 216 MRT3847_304168C.2 G. max
miR319
factor de transcripción de familia TCP 217 MRT3847_336868C.1 G. max
miR319
factor de transcripción de familia TCP 218 MRT3847_343365C.1 G. max
miR319
factor de transcripción de familia TCP 219 MRT3847_38312C.5 G. max
miR319
factor de transcripción de familia TCP 220 MRT3847_103008C.6 G. max
miR319
factor de transcripción de familia TCP 221 MRT3847_12165C.5 G. max
(continuación)
miARN
Función génica SEC ID Nº: ID del gen Especie de origen*
miR319
factor de transcripción de familia TCP 222 MRT3847_247420C.4 G. max
miR319
factor de transcripción de familia TCP 223 MRT3847_294519C.4 G. max
miR319
factor de transcripción de familia TCP 224 MRT3847_334277C.1 G. max
miR390
TAS 225 MRT3847_133706C.5 G. max
miR390
TAS 226 MRT3847_298568C.2 G. max
miR390
TAS 227 MRT3847_60306C.8 G. max
miR393
TIRI 228 MRT3847_238705C.4 G. max
miR393
TIR1 229 MRT3847_27973C.7 G. max
miR393
TIR1 230 MRT3847_313402C.3 G. max
miR393
Respuesta de inhibidor de transporte 231 MRT3847_329954C.2 G. max
miR393
Respuesta de inhibidor de transporte 232 MRT3847_335477C.1 G. max
miR393
Respuesta de inhibidor de transporte 233 MRT3847_44371C.6 G. max
miR394
dominio de caja F 234 MRT3847_249313C.3 G. max
miR394
dominio de caja F 235 MRT3847_260044C.4 G. max
miR395
AST 236 MRT3847_118061C.7 G. max
miR395
AST 237 MRT3847_120571C.4 G. max
miR395
AST 238 MRT3847_161863C.4 G. max
miR395
AST 239 MRT3847_233832C.4 G. max
miR395
AST 240 MRT3847_294717C.3 G. max
miR395
AST 241 MRT3847_303988C.3 G. max
miR395
AST 242 MRT3847_336528C.1 G. max
miR395
AST 243 MRT3847_55707C.5 G. max
miR395
ATP sulfurilasa 244 MRT3847_14792C.7 G. max
miR395
sulfato adenililtransferasa 245 MRT3847_331787C.1 G. max
miR395
transportador de sulfato 246 MRT3847_10451C.5 G. max
miR395
transportador de sulfato 247 MRT3847_245035C.3 G. max
miR396
GRF 248 PHE0001215 G. max
miR396
factor de regulación del crecimiento 249 MRT3847_183050C.6 G. max
(continuación)
miARN
Función génica SEC ID Nº: ID del gen Especie de origen*
miR396
factor de regulación del crecimiento 250 MRT3847_200704C.5 G. max
miR396
factor de regulación del crecimiento 251 MRT3847_21877C.7 G. max
miR396
factor de regulación del crecimiento 252 MRT3847_275465C.2 G. max
miR396
factor de regulación del crecimiento 253 MRT3847_285089C.5 G. max
miR396
factor de regulación del crecimiento 254 MRT3847_307974C.3 G. max
miR396
factor de regulación del crecimiento 255 MRT3847_34351C.6 G. max
miR396
factor de regulación del crecimiento 256 MRT3847_39577C.5 G. max
miR397
Laccasa 257 MRT3847_148737C.1 G. max
miR397
Laccasa 258 MRT3847_196074C.1 G. max
miR397
Laccasa 259 MRT3847_240006C.2 G. max
miR397
Laccasa 260 MRT3847_256982C.1 G. max
miR397
Laccasa 261 MRT3847_25859C.5 G. max
miR397
Laccasa 262 MRT3847_29767C.4 G. max
miR397
Laccasa 263 MRT3847_297900C.1 G. max
miR397
Laccasa 264 MRT3847_309594C.2 G. max
miR397
Laccasa 265 MRT3847_33656C.5 G. max
miR397
Laccasa 266 MRT3847_347553C.1 G. max
miR397
Laccasa 267 MRT3847_36695C.5 G. max
miR397
Laccasa 268 MRT3847_49069C.6 G. max
miR397
Laccasa 269 MRT3847_7864C.1 G. max
miR397
Laccasa 270 MRT3847_99867C.5 G. max
miR398
DISMUTASA DE COBRE/SUPERÓXIDO DE CINC 271 MRT3847_235546C.3 G. max
miR400
pentatricopéptido 272 MRT3847_12750C.4 G. max
miR400
pentatricopéptido 273 MRT3847_17367C.3 G. max
miR400
PPR 274 MRT3847_10096C.3 G. max
miR400
PPR 275 MRT3847_139832C.5 G. max
miR400
PPR 276 MRT3847_141759C.5 G. max
(continuación)
miARN
Función génica SEC ID Nº: ID del gen Especie de origen*
miR400
PPR 277 MRT3847_218904C.2 G. max
miR400
PPR 278 MRT3847_267668C.2 G. max
miR400
PPR 279 MRT3847_57083C.4 G. max
miR408
proteína de cobre azul 280 PHE0000330 G. max
miR408
proteína de cobre azul 281 MRT3847_273288C.3 G. max
miR408
proteína de cobre azul 282 MRT3847_329905C.2 G. max
miR408
proteína de cobre azul 283 MRT3847_336704C.1 G. max
miR408
proteína de cobre azul 284 MRT3847_343250C.1 G. max
miR408
proteína de cobre azul 285 MRT3847_346770C.1 G. max
miR408
proteína de cobre azul 286 MRT3847_349900C.1 G. max
miR408
proteína de cobre azul 287 MRT3847_350132C.1 G. max
miR408
proteína de cobre azul 288 MRT3847_60064C.6 G. max
miR408
proteína de cobre azul 289 MRT3847_66506C.8 G. max
miR408
Laccasa 290 MRT3847_296270C.2 G. max
miR408
Laccasa 291 MRT3847_31127C.7 G. max
miR444
caja de MADS 292 PHE0002647 G. max
miR444
caja de MADS 293 PHE0002648 G. max
miR444
caja de MADS 294 PHE0015540 G. max
miR444
caja de MADS 295 MRT3847_247970C.2 G. max
miR444
caja de MADS 296 MRT3847_259952C.3 G. max
miR472
unión a ATP 297 MRT3847_324977C.1 G. max
miR472
unión a ATP 298 MRT3847_335756C.1 G. max
miR472
proteína de resistencia a enfermedad 299 MRT3847_348618C.1 G. max
miR472
proteína de resistencia a enfermedad de tipo NBS-LRR, 300 MRT3847_292513C.3 G. max
miR472
proteína de resistencia a enfermedad de tipo NBS-LRR, 301 MRT3847_34971C.6 G. max
miR472/482
proteína de resistencia a enfermedad 302 MRT3847_159134C.1 G. max
miR472/482
proteína de resistencia a enfermedad 303 MRT3847_208382C.4 G. max
miR472/482
proteína de resistencia a enfermedad 304 MRT3847_229943C.2 G. max
(continuación)
miARN
Función génica SEC ID Nº: ID del gen Especie de origen*
miR472/482
proteína de resistencia a enfermedad 305 MRT3847_262606C.4 G. max
miR472/482
proteína de resistencia a enfermedad de tipo NBS-LRR, 306 MRT3847_223192C.5 G. max
miR472/482
proteína de resistencia a enfermedad de tipo NBS-LRR, 307 MRT3847_264890C.3 G. max
miR475
Repetición de pentatricopéptido 308 MRT3847_204627C.1 G. max
miR475
Repetición de pentatricopéptido 309 MRT3847_234253C.2 G. max
miR475
Repetición de pentatricopéptido 310 MRT3847_289449C.2 G. max
miR475
Repetición de pentatricopéptido 311 MRT3847_342062C.1 G. max
miR475
PPR 312 MRT3847_137370C.4 G. max
miR475
PPR 313 MRT3847_196480C.3 G. max
miR475
PPR 314 MRT3847_241148C.2 G. max
miR475
PPR 315 MRT3847_30662C.4 G. max
miR475
PPR 316 MRT3847_44502C.5 G. max
miR475
repetición de PPR 317 MRT3847_235882C.3 G. max
miR477
bHLH 318 MRT3847_117808C.5 G. max
miR477
bHLH 319 MRT3847_330789C.2 G. max
miR477
GRAS 320 MRT3847_161254C.2 G. max
miR477
GRAS 321 MRT3847_250541C.3 G. max
miR482
proteína de resistencia a enfermedad 322 MRT3847_216742C.1 G. max
miR482
proteína de resistencia a enfermedad 323 MRT3847_221164C.1 G. max
miR482
proteína de resistencia a enfermedad 324 MRT3847_28447C.6 G. max
miR482
proteína de resistencia a enfermedad 325 MRT3847_302802C.3 G. max
miR482
proteína de resistencia a enfermedad 326 MRT3847_146432C.5 G. max
miR482
proteína de resistencia a enfermedad 327 MRT3847_184524C.6 G. max
(continuación)
miARN
Función génica SEC ID Nº: ID del gen Especie de origen*
miR482
proteína de resistencia a enfermedad 328 MRT3847_268743C.4 G. max
miR482
proteína de resistencia a enfermedad 329 MRT3847_272693C.2 G. max
miR482
proteína de resistencia a enfermedad 330 MRT3847_297146C.2 G. max
miR482
proteína de resistencia a enfermedad 331 MRT3847_314629C.2 G. max
miR482
proteína de resistencia a enfermedad 332 MRT3847_335514C.1 G. max
miR482
proteína de resistencia a enfermedad 333 MRT3847_335735C.1 G. max
miR482
proteína de resistencia a enfermedad 334 MRT3847_337518C.1 G. max
miR482
proteína de resistencia a enfermedad 335 MRT3847_340947C.1 G. max
miR482
proteína de resistencia a enfermedad 336 MRT3847_352235C.1 G. max
miR482
proteína de resistencia a enfermedad 337 MRT3847_63055C.5 G. max
miR482
proteína de resistencia a enfermedad 338 MRT3847_66636C.5 G. max
miR482
Proteína supuesta de resistencia a enfermedad 339 MRT3847_184595C.4 G. max
miR824
caja de MADS 340 PHE0001395 G. max
miR824
caja de MADS 341 PHE0003427 G. max
miR824
caja de MADS 342 PHE0013854 G. max
miR824
caja de MADS 343 MRT3847_14550C.4 G. max
miR824
caja de MADS 344 MRT3847_39202C.7 G. max
miR828
MyB 345 PHE0001477 G. max
miR828
MYB 346 MRT3847_346366C.1 G. max
miR828
unión a ADN similar a myb 347 MRT3847_215219C.3 G. max
miR828
unión a ADN similar a myb 348 MRT3847_215220C.2 G. max
miR828/858
unión a ADN similar a myb 349 MRT3847_22767C.2 G. max
miR857
LAC 350 MRT3847_13225C.3 G. max
miR858
MyB 351 PHE0000380 G. max
miR858
MYB 352 PHE0001408 G. max
(continuación)
miARN
Función génica SEC ID Nº: ID del gen Especie de origen*
miR858
MyB 353 PHE0004448 G. max
miR858
MyB 354 PHE0012029 G. max
miR858
MyB 355 PHE0015929 G. max
miR858
MYB 356 MRT3847_212141C.3 G. max
miR858
MYB 357 MRT3847_347736C.1 G. max
miR858
MYB 358 MRT3847_38379C.5 G. max
miR858
MYB 359 MRT3847_40737C.7 G. max
miR858
MYB 360 MRT3847_41334C.3 G. max
miR858
MYB12 361 MRT3847_51246C.6 G. max
miR858
unión a ADN similar a myb 362 MRT3847_131164C.6 G. max
miR858
unión a ADN similar a myb 363 MRT3847_137726C.5 G. max
miR858
unión a ADN similar a myb 364 MRT3847_228792C.3 G. max
miR858
unión a ADN similar a myb 365 MRT3847_255360C.1 G. max
miR858
unión a ADN similar a myb 366 MRT3847_255362C.6 G. max
miR858
unión a ADN similar a myb 367 MRT3847_260391C.1 G. max
miR858
unión a ADN similar a myb 368 MRT3847_261508C.2 G. max
miR858
unión a ADN similar a myb 369 MRT3847_270136C.3 G. max
miR858
unión a ADN similar a myb 370 MRT3847_290332C.2 G. max
miR858
unión a ADN similar a myb 371 MRT3847_294239C.3 G. max
miR858
unión a ADN similar a myb 372 MRT3847_322770C.2 G. max
miR858
unión a ADN similar a myb 373 MRT3847_32417C.5 G. max
miR858
unión a ADN similar a myb 374 MRT3847_332192C.1 G. max
miR858
unión a ADN similar a myb 375 MRT3847_335664C.1 G. max
miR858
unión a ADN similar a myb 376 MRT3847_34082C.5 G. max
miR858
unión a ADN similar a myb 377 MRT3847_39825C.5 G. max
miR858
unión a ADN similar a myb 378 MRT3847_40203C.4 G. max
miR858
unión a ADN similar a myb -379 MRT3847_41332C.5 G. max
miR858
unión a ADN similar a myb 380 MRT3847_42168C.6 G. max
miR858
unión a ADN similar a myb 381 MRT3847_51247C.3 G. max
miR858
unión a ADN similar a myb 382 MRT3847_52127C.4 G. max
miR858
unión a ADN similar a myb 383 MRT3847_54395C.5 G. max
miR858
unión a ADN similar a myb 384 MRT3847_55676C.6 G. max
(continuación)
miARN
Función génica SEC ID Nº: ID del gen Especie de origen*
miR156
dominio SBP 385 MRT3635_30868C.2 Gossypium hirsutum
miR156/157
dominio SBP 386 MRT3635_36657C.2 G. hirsutum
miR156/157
dominio SBP 387 MRT3635_65765C.1 G. hirsutum
miR156/157
Proteína de unión a promotor de Squamosa 388 MRT3635_15791C.2 G. hirsutum
miR156/157
Proteína de unión a promotor de Squamosa 389 MRT3635_48230C.2 G. hirsutum
miR156/157
Proteína de unión a promotor de Squamosa 390 MRT3635_69088C.1 G. hirsutum
miR156/157
Proteína de unión a promotor de Squamosa 391 MRT3635_69159C.1 G. hirsutum
miR156/157
Proteína de unión a promotor de Squamosa 392 MRT3635_30369C.2 G. hirsutum
miR156/157
Proteína de unión a promotor de Squamosa 393 MRT3635_56290C.1 G. hirsutum
miR156/157
arquitectura de gluma de teosinte 394 MRT3635_15393C.1 G. hirsutum
miR159
MYB65 395 MRT3635_249C.2 G. hirsutum
miR159
unión a ADN similar a myb 396 MRT3635_54684C.2 G. hirsutum
miR160
Factor de respuesta a auxina 397 MRT3635_36222C.2 G. hirsutum
miR162
CAF 398 MRT3635_16630C.2 G. hirsutum
miR164
proteína de dominio NAC 399 MRT3635_24172C.2 G. hirsutum
miR164
Sin meristemo apical 400 MRT3635_48601C.2 G. hirsutum
miR164
Sin meristemo apical 401 MRT3635_64345C.1 G. hirsutum
miR165/166
proteína HD-ZIP de clase III 402 MRT3635_4809C.2 G. hirsutum
miR165/166
proteína HD-ZIP de clase III 403 MRT3635_50942C.2 G. hirsutum
miR165/166
proteína HD-ZIP de clase III 404 MRT3635_72188C.1 G. hirsutum
miR166
proteína HD-ZIP de clase III 405 MRT3635_12880C.2 G. hirsutum
miR167
Factor de respuesta a auxina 406 MRT3635_13510C.2 G. hirsutum
miR167
Factor de respuesta a auxina 407 MRT3635_14893C.2 G. hirsutum
miR167
Factor de respuesta a auxina 408 MRT3635_24556C.2 G. hirsutum
miR167
Factor de respuesta a auxina 409 MRT3635_59443C.1 G. hirsutum
(continuación)
miARN
Función génica SEC ID Nº: ID del gen Especie de origen*
miR168
AGO1 410 MRT3635_43628C.2 G. hirsutum
miR168
Argonauta 411 MRT3635_68755C.1 G. hirsutum
miR169
unión a CCAAT 412 MRT3635_18720C.2 G. hirsutum
miR169
unión a CCAAT 413 MRT3635_60547C.1 G. hirsutum
miR169
unión a CCAAT 414 MRT3635_63602C.1 G. hirsutum
miR169
unión a CCAAT 415 MRT3635_751C.2 G. hirsutum
miR169
factor Y de transcripción nuclear 416 MRT3635_57584C.1 G. hirsutum
miR169
factor Y de transcripción nuclear 417 MRT3635_63203C.1 G. hirsutum
miR169
factor Y de transcripción nuclear 418 MRT3635_67492C.1 G. hirsutum
miR171
GRAS 419 MRT3635_41132C.2 G. hirsutum
miR172
AP2 420 MRT3635_50596C.2 G. hirsutum
miR172
dominio AP2 421 MRT3635_21738C.2 G. hirsutum
miR172
dominio AP2 422 MRT3635_5937C.2 G. hirsutum
miR172
dominio AP2 423 MRT3635_64989C.1 G. hirsutum
miR172
dominio AP2 424 MRT3635_8244C.2 G. hirsutum
miR319
TCP 425 MRT3635_31917C.2 G. hirsutum
miR319
factor de transcripción de familia TCP 426 MRT3635_40862C.2 G. hirsutum
miR319
factor de transcripción de familia TCP 427 MRT3635_55735C.1 G. hirsutum
miR393
TIR1 428 MRT3635_18850C.2 G. hirsutum
miR393
TIR1 429 MRT3635_35639C.2 G. hirsutum
miR393
TIR1 430 MRT3635_68504C.1 G. hirsutum
miR393
Respuesta de inhibidor de transporte 431 MRT3635_18188C.2 G. hirsutum
miR393
Respuesta de inhibidor de transporte 432 MRT3635_49076C.2 G. hirsutum
miR395
AST 433 MRT3635_73824C.1 G. hirsutum
miR395
sulfato adenililtransferasa 434 MRT3635_15903C.2 G. hirsutum
miR395
sulfato adenililtransferasa 435 MRT3635_48567C.2 G. hirsutum
miR395
transportador de sulfato 436 MRT3635_64866C.1 G. hirsutum
miR396
factor de regulación del crecimiento 437 MRT3635_10089C.2 G. hirsutum
(continuación)
miARN
Función génica SEC ID Nº: ID del gen Especie de origen*
miR396
factor de regulación del crecimiento 438 MRT3635_18322C.2 G. hirsutum
miR396
factor de regulación del crecimiento 439 MRT3635_43733C.2 G. hirsutum
miR396
factor de regulación del crecimiento 440 MRT3635_44225C.2 G. hirsutum
miR396
factor de regulación del crecimiento 441 MRT3635_67643C.1 G. hirsutum
miR396
factor de regulación del crecimiento 442 MRT3635_71085C.1 G. hirsutum
miR396
factor de regulación del crecimiento 443 MRT3635_7854C.2 G. hirsutum
miR397
Laccasa 444 MRT3635_2612C.2 G. hirsutum
miR397
Laccasa 445 MRT3635_59330C.1 G. hirsutum
miR397
Laccasa 446 MRT3635_62379C.1 G. hirsutum
miR400
PPR 447 MRT3635_14024C.2 G. hirsutum
miR400
PPR 448 MRT3635_24425C.2 G. hirsutum
miR400
PPR 449 MRT3635_62540C.1 G. hirsutum
miR400
PPR 450 MRT3635_71976C.1 G. hirsutum
miR408
proteína de cobre azul 451 MRT3635_25321C.2 G. hirsutum
miR408
proteína de cobre azul 452 MRT3635_36078C.2 G. hirsutum
miR408
proteína de cobre azul 453 MRT3635_36080C.2 G. hirsutum
miR408
proteína de cobre azul 454 MRT3635_54561C.2 G. hirsutum
miR408
proteína de cobre azul 455 MRT3635_54936C.2 G. hirsutum
miR444
caja de MADS 456 MRT3635_52393C.1 G. hirsutum
miR472
unión a ATP 457 MRT3635_16581C.2 G. hirsutum
miR472/482
proteína de resistencia a enfermedad de tipo NBS-LRR, 458 MRT3635_77272C.1 G. hirsutum
miR475
pentatricopéptido 459 MRT3635_73944C.1 G. hirsutum
miR475
Repetición de pentatricopéptido 460 MRT3635_35992C.1 G. hirsutum
miR475
Repetición de pentatricopéptido 461 MRT3635_51055C.1 G. hirsutum
miR475
PPR 462 MRT3635_36232C.2 G. hirsutum
miR475
PPR 463 MRT3635_65837C.1 G. hirsutum
miR475
PPR 464 MRT3635_6832C.2 G. hirsutum
(continuación)
miARN
Función génica SEC ID Nº: ID del gen Especie de origen*
miR827
SPX 465 MRT3635_71336C.1 G. hirsutum
miR827
dedo de cinc 466 MRT3635_61225C.1 G. hirsutum
miR828
MYB 467 MRT3635_63902C.1 G. hirsutum
miR828
unión a ADN similar a myb 468 MRT3635_11678C.2 G. hirsutum
miR828
unión a ADN similar a myb 469 MRT3635_23974C.2 G. hirsutum
miR828
unión a ADN similar a myb 470 MRT3635_37632C.1 G. hirsutum
miR828
unión a ADN similar a myb 471 MRT3635_46849C.2 G. hirsutum
miR828
unión a ADN similar a myb 472 MRT3635_75185C.1 G. hirsutum
miR828/858
MYB 473 MRT3635_12320C.2 G. hirsutum
miR828/858
unión a ADN similar a myb 474 MRT3635_25669C.1 G. hirsutum
miR858
MYB 475 MRT3635_11888C.1 G. hirsutum
miR858
MYB 476 MRT3635_17735C.1 G. hirsutum
miR858
MYB 477 MRT3635_3345C.1 G. hirsutum
miR858
MYB 478 MRT3635_46789C.1 G. hirsutum
miR858
unión a ADN similar a myb 479 MRT3635_48257C.1 G. hirsutum
miR858
unión a ADN similar a myb 480 MRT3635_53024C.2 G. hirsutum
miR858
unión a ADN similar a myb 481 MRT3635_55977C.1 G. hirsutum
miR858
unión a ADN similar a myb 482 MRT3635_57077C.1 G. hirsutum
miR858
unión a ADN similar a myb 483 MRT3635_66730C.1 G. hirsutum
miR858
unión a ADN similar a myb 484 MRT3635_67640C.1 G. hirsutum
miR858
unión a ADN similar a myb 485 MRT3635_69682C.1 G. hirsutum
miR858
unión a ADN similar a myb 486 MRT3635_74072C.1 G. hirsutum
miR156
dominio SBP 487 MRT4513_33353C.1 Hordeum vulgare
miR156/157
dominio SBP 488 MRT4513_19757C.1 H. vulgare
miR156/157
dominio SBP, miR157 489 MRT4513_52153C.1 H. vulgare
miR156/157
dominio SBP, miR157 490 MRT4513_41849C.1 H. vulgare
miR156/157
Proteína de unión a promotor de Squamosa 491 MRT4513_4449C. 1 H. vulgare
miR159
dominio de unión a ADN similar a myb 492 MRT4513_1572C.3 H. vulgare
miR159
dominio de unión a ADN similar a myb 493 MRT4513_55409C.1 H. vulgare
miR160
Factor de respuesta a auxina 494 MRT4513_43004C.1 H. vulgare
(continuación)
miARN
Función génica SEC ID Nº: ID del gen Especie de origen*
miR160
Factor de respuesta a auxina 495 MRT4513_48930C.1 H. vulgare
miR160
Factor de respuesta a auxina 496 MRT4513_51165C.1 H. vulgare
miR160
Factor de respuesta a auxina 497 MRT4513_9322C.2 H. vulgare
miR164
proteína de dominio NAC 498 MRT4513_51143C.2 H. vulgare
miR164
proteína de dominio NAC 499 MRT4513_7890C.1 H. vulgare
miR164
Sin meristemo apical 500 MRT4513_26199C.1 H. vulgare
miR167
Factor de respuesta a auxina 501 MRT4513_29483C.2 H. vulgare
miR167
Factor de respuesta a auxina 502 MRT4513_29827C.2 H. vulgare
miR167
Factor de respuesta a auxina 503 MRT4513_31779C.1 H. vulgare
miR167
Factor de respuesta a auxina 504 MRT4513_47791C.1 H. vulgare
miR168
Argonauta 505 MRT4513_31835C.1 H. vulgare
miR168
Argonauta 506 MRT4513_43289C.1 H. vulgare
miR168
PINHEAD 507 MRT4513_28709C.1 H. vulgare
miR169
unión a CCAAT 508 MRT4513_27452C.1 H. vulgare
miR169
unión a CCAAT 509 MRT4513_38912C.1 H. vulgare
miR169
unión a CCAAT 510 MRT4513_51394C.1 H. vulgare
miR170/171
SCL 511 MRT4513_44124C.1 H. vulgare
miR172
AP2 512 MRT4513_6417C.1 H. vulgare
miR172
dominio AP2 513 MRT4513_42015C.1 H. vulgare
miR319
PCF 514 MRT4513_31590C.1 H. vulgare
miR319
PCF 515 MRT4513_52459C.1 H. vulgare
miR393
Respuesta de inhibidor de transporte 516 MRT4513_12741C.1 H. vulgare
miR393
Respuesta de inhibidor de transporte 517 MRT4513_38675C.1 H. vulgare
miR394
Caja F 518 MRT4513_23211C.1 H. vulgare
miR396
factor de regulación del crecimiento 519 MRT4513_20166C.2 H. vulgare
miR396
factor de regulación del crecimiento 520 MRT4513_26009C.2 H. vulgare
(continuación)
miARN
Función génica SEC ID Nº: ID del gen Especie de origen*
miR396
factor de regulación del crecimiento 521 MRT4513_33203C.1 H. vulgare
miR396
factor de regulación del crecimiento 522 MRT4513_4600C.1 H. vulgare
miR396
factor de regulación del crecimiento 523 MRT4513_50332C.1 H. vulgare
miR397
Laccasa 524 MRT4513_35926C.1 H. vulgare
miR397
Laccasa 525 MRT4513_40609C.1 H. vulgare
miR398
dismutasa de cobre/superóxido de cinc 526 MRT4513_43414C.2 H. vulgare
miR398
dismutasa de cobre/superóxido de cinc 527 MRT4513_8559C.2 H. vulgare
miR408
proteína de cobre azul 528 MRT4513_31098C.2 H. vulgare
miR472
proteína de resistencia a enfermedad NBS-LRR 529 MRT4513_5784C.1 H. vulgare
miR475
pentatricopéptido 530 MRT4513_47541C.1 H. vulgare
miR475
PPR 531 MRT4513_7525C.2 H. vulgare
miR482
resistencia a enfermedad 532 MRT4513_11673C.1 H. vulgare
miR858
unión a ADN similar a myb 533 MRT4513_11055C.1 H. vulgare
miR858
unión a ADN similar a myb 534 MRT4513_42246C.1 H. vulgare
miR858
unión a ADN similar a myb 535 MRT4513_4767C.1 H. vulgare
miR858
unión a ADN similar a myb 536 MRT4513_5642C.1 H. vulgare
miR156/157
dominio SBP 537 MRT3880_19943C.1 Medicago sativa
miR156/157
dominio SBP 538 MRT3880_34839C.1 M. sativa
miR156/157
dominio SBP 539 MRT3880_54023C.1 M. sativa
miR156/157
Proteína de unión a promotor de Squamosa 540 MRT3880_59834C.1 M. sativa
miR156/157
Proteína de unión a promotor de Squamosa 541 MRT3880_62151C.1 M. sativa
miR159
dominio de unión a ADN similar a myb 542 MRT3880_51095C.1 M. sativa
miR160
Factor de respuesta a auxina 543 MRT3880_22965C.1 M. sativa
miR160
Factor de respuesta a auxina 544 MRT3880_28718C.1 M. sativa
miR160
Factor de respuesta a auxina 545 MRT3880_38543C.1 M. sativa
(continuación)
miARN
Función génica SEC ID Nº: ID del gen Especie de origen*
miR160
Factor de respuesta a auxina 546 MRT3880_44036C.1 M. sativa
miR161
PPR 547 MRT3880_11000C.1 M. sativa
miR161/475
Repetición de pentatricopéptido 548 MRT3880_37878C.1 M. sativa
miR162
Dicer 549 MRT3880_26893C.1 M. sativa
miR164
proteína de dominio NAC 550 MRT3880_18003C.2 M. sativa
miR164
Sin meristemo apical 551 MRT3880_44619C.1 M. sativa
miR165/166
proteína HD-ZIP de clase III 552 MRT3880_37546C.1 M. sativa
miR165/166
proteína HD-ZIP de clase III 553 MRT3880_39764C.1 M. sativa
miR167
Factor de respuesta a auxina 554 MRT3880_12926C.1 M. sativa
miR167
Factor de respuesta a auxina 555 MRT3880_17672C.1 M. sativa
miR167
Factor de respuesta a auxina 556 MRT3880_25270C.1 M. sativa
miR167
Factor de respuesta a auxina 557 MRT3880_30476C.1 M. sativa
miR167
Factor de respuesta a auxina 558 MRT3880_36150C.1 M. sativa
miR167
Factor de respuesta a auxina 559 MRT3880_470C.1 M. sativa
miR169
factor Y de transcripción nuclear 560 MRT3880_16272C.2 M. sativa
miR169
factor Y de transcripción nuclear 561 MRT3880_21811C.2 M. sativa
miR169
factor Y de transcripción nuclear 562 MRT3880_59679C.1 M. sativa
miR170/171
GRAS 563 MRT3880_12452C.1 M. sativa
miR170/171
GRAS 564 MRT3880_29125C.1 M. sativa
miR170/171
GRAS 565 MRT3880_31130C.1 M. sativa
miR170/171
GRAS 566 MRT3880_40896C.1 M. sativa
miR170/171
GRAS 567 MRT3880_63440C.1 M. sativa
miR172
dominio AP2 568 MRT3880_36568C.1 M. sativa
miR172
dominio AP2 569 MRT3880_39959C.1 M. sativa
miR172
dominio AP2 570 MRT3880_55789C.1 M. sativa
miR319
TCP 571 MRT3880_2628C.1 M. sativa
(continuación)
miARN
Función génica SEC ID Nº: ID del gen Especie de origen*
miR319
factor de transcripción de familia TCP 572 MRT3880_44480C.1 M. sativa
miR393
Respuesta de inhibidor de transporte 573 MRT3880_18564C.2 M. sativa
miR393
Respuesta de inhibidor de transporte 574 MRT3880_38847C.1 M. sativa
miR393
Respuesta de inhibidor de transporte 575 MRT3880_67369C.1 M. sativa
miR396
factor de regulación del crecimiento 576 MRT3880_18861C.1 M. sativa
miR396
factor de regulación del crecimiento 577 MRT3880_22460C.1 M. sativa
miR396
factor de regulación del crecimiento 578 MRT3880_41297C.1 M. sativa
miR397
Laccasa 579 MRT3880_43121C.1 M. sativa
miR397
Laccasa 580 MRT3880_56114C.2 M. sativa
miR400
pentatricopéptido 581 MRT3880_53970C.1 M. sativa
miR400
PPR 582 MRT3880_14263C.1 M. sativa
miR400
PPR 583 MRT3880_65540C.1 M. sativa
miR400/475
Repetición de pentatricopéptido 584 MRT3880_27459C.1 M. sativa
miR400/475
Repetición de pentatricopéptido 585 MRT3880_49876C.1 M. sativa
miR400/475
PPR 586 MRT3880_44329C.1 M. sativa
miR408
proteína de cobre azul 587 MRT3880_46744C.2 M. sativa
miR408
proteína de cobre azul 588 MRT3880_53025C.1 M. sativa
miR408
proteína de cobre azul 589 MRT3880_5838C.1 M. sativa
miR472
unión a ATP 590 MRT3880_29560C.1 M. sativa
miR472
unión a ATP 591 MRT3880_30961C.1 M. sativa
miR472
unión a ATP 592 MRT3880_48315C.1 M. sativa
miR472
unión a ATP 593 MRT3880_53199C.1 M. sativa
miR472
unión a ATP 594 MRT3880_54030C.2 M. sativa
miR472
unión a ATP 595 MRT3880_57442C.1 M. sativa
miR472
proteína de resistencia a enfermedad 596 MRT3880_10080C.1 M. sativa
miR472
proteína de resistencia a enfermedad 597 MRT3880_12559C.2 M. sativa
(continuación)
miARN
Función génica SEC ID Nº: ID del gen Especie de origen*
miR472
proteína de resistencia a enfermedad 598 MRT3880_17698C.1 M. sativa
miR472
proteína de resistencia a enfermedad 599 MRT3880_21650C.1 M. sativa
miR472
proteína de resistencia a enfermedad 600 MRT3880_22933C.1 M. sativa
miR472
proteína de resistencia a enfermedad 601 MRT3880_26007C.1 M. sativa
miR472
proteína de resistencia a enfermedad 602 MRT3880_28379C.1 M. sativa
miR472
proteína de resistencia a enfermedad 603 MRT3880_3002C.1 M. sativa
miR472
proteína de resistencia a enfermedad 604 MRT3880_38354C.1 M. sativa
miR472
proteína de resistencia a enfermedad 605 MRT3880_41496C.1 M. sativa
miR472
proteína de resistencia a enfermedad 606 MRT3880_51100C.1 M. sativa
miR472
proteína de resistencia a enfermedad 607 MRT3880_5498C.1 M. sativa
miR472
proteína de resistencia a enfermedad 608 MRT3880_59891C.1 M. sativa
miR472
proteína de resistencia a enfermedad de tipo NBS-LRR, 609 MRT3880_45204C.1 M. sativa
miR472
proteína de resistencia a enfermedad de tipo NBS-LRR, 610 MRT3880_52654C.1 M. sativa
miR472
proteína de resistencia a enfermedad de tipo NBS-LRR, 611 MRT3880_66600C.1 M. sativa
miR472
proteína de resistencia a enfermedad de tipo NBS-LRR, 612 MRT3880_7642C.1 M. sativa
miR472/482
proteína de resistencia a enfermedad 613 MRT3880_19707C.1 M. sativa
miR472/482
proteína de resistencia a enfermedad 614 MRT3880_19814C.1 M. sativa
miR472/482
proteína de resistencia a enfermedad 615 MRT3880_26877C.1 M. sativa
miR472/482
proteína de resistencia a enfermedad 616 MRT3880_2935C.1 M. sativa
(continuación)
miARN
Función génica SEC ID Nº: ID del gen Especie de origen*
miR472/482
proteína de resistencia a enfermedad 617 MRT3880_36417C.1 M. sativa
miR472/482
proteína de resistencia a enfermedad 618 MRT3880_44875C.1 M. sativa
miR472/482
proteína de resistencia a enfermedad 619 MRT3880_5004C.1 M. sativa
miR472/482
proteína de resistencia a enfermedad 620 MRT3880_52723C.1 M. sativa
miR472/482
proteína de resistencia a enfermedad 621 MRT3880_57846C.1 M. sativa
miR472/482
proteína de resistencia a enfermedad 622 MRT3880_63259C.1 M. sativa
miR472/482
proteína de resistencia a enfermedad 623 MRT3880_6363C.1 M. sativa
miR472/482
proteína de resistencia a enfermedad 624 MRT3880_65083C.1 M. sativa
miR472/482, miR779
proteína de resistencia a enfermedad, repetición rica en leucina 625 MRT3880_55187C.1 M. sativa
miR475
Repetición de pentatricopéptido 626 MRT3880_13183C.1 M. sativa
miR475
Repetición de pentatricopéptido 627 MRT3880_42014C.1 M. sativa
miR475
Repetición de pentatricopéptido 628 MRT3880_46171C.1 M. sativa
miR475
PPR 629 MRT3880_12164C.1 M. sativa
miR475
PPR 630 MRT3880_12471C.1 M. sativa
miR475
PPR 631 MRT3880_16503C.1 M. sativa
miR475
PPR 632 MRT3880_22609C.1 M. sativa
miR475
PPR 633 MRT3880_35917C.1 M. sativa
miR475
PPR 634 MRT3880_39210C.1 M. sativa
miR475
PPR 635 MRT3880_55838C.1 M. sativa
miR475
PPR 636 MRT3880_56789C.1 M. sativa
miR475
PPR 637 MRT3880_65802C.1 M. sativa
miR475
PPR 638 MRT3880_870C.1 M. sativa
miR475
PPR 639 MRT3880_9632C.1 M. sativa
miR476
Repetición de pentatricopéptido 640 MRT3880_13782C.1 M. sativa
(continuación)
miARN
Función génica SEC ID Nº: ID del gen Especie de origen*
miR477
GRAS 641 MRT3880_1038C.1 M. sativa
miR477
GRAS 642 MRT3880_14765C.1 M. sativa
miR477
GRAS 643 MRT3880_28393C.1 M. sativa
miR477
GRAS 644 MRT3880_31231C.1 M. sativa
miR477
GRAS 645 MRT3880_42028C.1 M. sativa
miR477
GRAS 646 MRT3880_51782C.1 M. sativa
miR482
proteína de resistencia a enfermedad 647 MRT3880_12508C.1 M. sativa
miR482
proteína de resistencia a enfermedad 648 MRT3880_16156C.1 M. sativa
miR482
proteína de resistencia a enfermedad 649 MRT3880_22305C.1 M. sativa
miR482
proteína de resistencia a enfermedad 650 MRT3880_30579C.1 M. sativa
miR482
proteína de resistencia a enfermedad 651 MRT3880_38019C.1 M. sativa
miR482
proteína de resistencia a enfermedad 652 MRT3880_4159C.1 M. sativa
miR482
proteína de resistencia a enfermedad 653 MRT3880_49695C.1 M. sativa
miR482
proteína de resistencia a enfermedad 654 MRT3880_54965C.1 M. sativa
miR482
proteína de resistencia a enfermedad 655 MRT3880_56400C.1 M. sativa
miR482
proteína de resistencia a enfermedad 656 MRT3880_56673C.1 M. sativa
miR482
proteína de resistencia a enfermedad 657 MRT3880_58830C.1 M. sativa
miR482
proteína de resistencia a enfermedad 658 MRT3880_58849C.1 M. sativa
miR482
proteína de resistencia a enfermedad 659 MRT3880_59857C.1 M. sativa
miR482
proteína de resistencia a enfermedad 660 MRT3880_60136C.1 M. sativa
miR482
proteína de resistencia a enfermedad 661 MRT3880_65552C.2 M. sativa
miR482
proteína de resistencia a enfermedad 662 MRT3880_8722C.1 M. sativa
miR482
proteína de resistencia a enfermedad 663 MRT3880_9618C.1 M. sativa
(continuación)
miARN
Función génica SEC ID Nº: ID del gen Especie de origen*
miR828
unión a ADN similar a myb 664 MRT3880_19611C.1 M. sativa
miR858
unión a ADN similar a myb 665 MRT3880_10365C.1 M. sativa
miR858
unión a ADN similar a myb 666 MRT3880_12267C.1 M. sativa
miR858
unión a ADN similar a myb 667 MRT3880_19438C.1 M. sativa
miR858
unión a ADN similar a myb 668 MRT3880_23642C.1 M. sativa
miR858
unión a ADN similar a myb 669 MRT3880_33147C.1 M. sativa
miR858
unión a ADN similar a myb 670 MRT3880_34889C.1 M. sativa
miR858
unión a ADN similar a myb 671 MRT3880_39946C.1 M. sativa
miR858
unión a ADN similar a myb 672 MRT3880_55009C.1 M. sativa
miR858
unión a ADN similar a myb 673 MRT3880_56414C.1 M. sativa
miR858
unión a ADN similar a myb 674 MRT3880_62538C.1 M. sativa
miR858
unión a ADN similar a myb 675 MRT3880_801C.1 M. sativa
miR858
unión a ADN similar a myb 676 MRT3880_8393C.1 M. sativa
miR859
proteína de caja F 677 MRT3880_46176C.1 M. sativa
miR859
proteína de caja F 678 MRT3880_47002C.1 M. sativa
miRMON13
PPR 679 MRT3880_52640C.1 M. sativa
miRMON13
PPR 680 MRT3880_60915C.1 M. sativa
miR156
dominio SBP 681 MRT4530_118092C.3 Oryza sativa
miR156
dominio SBP 682 MRT4530_135991C.4 O. sativa
miR156
dominio SBP 683 MRT4530_257640C.1 O. sativa
miR156
dominio SBP 684 MRT4530_142142C.4 O. sativa
miR156
Proteína de unión a promotor de Squamosa 685 MRT4530_195506C.2 O. sativa
miR156
Proteína de unión a promotor de Squamosa 686 MRT4530_220364C.2 O. sativa
miR156
Proteína de unión a promotor de Squamosa 687 MRT4530_236277C.1 O. sativa
miR156
Proteína de unión a promotor de Squamosa 688 MRT4530_53217C.5 O. sativa
miR156
Proteína de unión a promotor de Squamosa 689 MRT4530_6964C.4 O. sativa
miR159
MYB 690 MRT4530_103606C.2 O. sativa
miR159
similar a myb 691 MRT4530_82994C.2 O. sativa
miR159
dominio de unión a ADN similar a myb 692 MRT4530_103605C.3 O. sativa
(continuación)
miARN
Función génica SEC ID Nº: ID del gen Especie de origen*
miR159
dominio de unión a ADN similar a myb 693 MRT4530_156102C.3 O. sativa
miR159
dominio de unión a ADN similar a myb 694 MRT4530_181046C.3 O. sativa
miR159
dominio de unión a ADN similar a myb 695 MRT4530_42135C.5 O. sativa
miR160
ARF 696 PHE0003527 O. sativa
miR160
ARF 697 PHE0003528 O. sativa
miR160
Factor de respuesta a auxina 698 MRT4530_228913C.1 O. sativa
miR160
Factor de respuesta a auxina 699 MRT4530_69952C.4 O. sativa
miR160
Factor de respuesta a auxina 700 MRT4530_71017C.4 O. sativa
miR160
Factor de respuesta a auxina 701 MRT4530_75962C.5 O. sativa
miR162
CAF 702 MRT4530_212066C.2 O. sativa
miR164
NAC 703 MRT4530_224181C.2 O. sativa
miR164
proteína de dominio NAC 704 MRT4530_178256C.3 O. sativa
miR164
proteína de dominio NAC 705 MRT4530_221769C.1 O. sativa
miR164
NAC1 706 MRT4530_141528C.5 O. sativa
miR164
Sin meristemo apical 707 MRT4530_147737C.4 O. sativa
miR164
Sin meristemo apical 708 MRT4530_157393C.3 O. sativa
miR166
HD-ZIP 709 MRT4530_253068C.2 O. sativa
miR167
ARF 710 PHE0003657 O. sativa
miR167
Factor de respuesta a auxina 711 MRT4530_86291C.3 O. sativa
miR168
Argonauta 712 MRT4530_147864C.3 O. sativa
miR169
unión a CCAAT 713 MRT4530_156068C.3 O. sativa
miR169
unión a CCAAT 714 MRT4530_52650C.3 O. sativa
miR169
unión a CCAAT 715 MRT4530_98042C.6 O. sativa
miR171
GRAS 716 MRT4530_157676C.3 O. sativa
miR171
GRAS 717 MRT4530_159257C.2 O. sativa
miR171
GRAS 718 MRT4530_177712C.1 O. sativa
miR171
GRAS 719 MRT4530_64038C.2 O. sativa
miR171
Similar a Scarecrow 720 MRT4530_146050C.4 O. sativa
(continuación) (continuación) (continuación) (continuación) (continuación) (continuación) (continuación) (continuación) (continuación) (continuación) (continuación) (continuación) (continuación) (continuación) (continuación)
miARN
Función génica SEC ID Nº: ID del gen Especie de origen*
miR171
SCL 721 MRT4530_111185C.3 O. sativa
miR171
SCL 722 MRT4530_12928C.2 O. sativa
miR171
SCL 723 MRT4530_88963C.6 O. sativa
miR172
AP2 724 PHE0003882 O. sativa
miR172
dominio AP2 725 MRT4530_160275C.3 O. sativa
miR172
dominio AP2 726 MRT4530_56773C.3 O. sativa
miR319
factor de transcripción de familia TCP 727 MRT4530_154891C.2 O. sativa
miR319
factor de transcripción de familia TCP 728 MRT4530_9431C.5 O. sativa
miR319
TCP3 729 MRT4530_151800C.2 O. sativa
miR393
Respuesta de inhibidor de transporte 730 MRT4530_241313C.2 O. sativa
miR395
ATP sulfurilasa 731 MRT4530_16384C.4 O. sativa
miR395
transportador de sulfato 732 MRT4530_33633C.6 O. sativa
miR396
factor de regulación del crecimiento 733 PHE0000026 O. sativa
miR396
factor de regulación del crecimiento 734 MRT4530_140789C.3 O. sativa
miR396
factor de regulación del crecimiento 735 MRT4530_145151C.4 O. sativa
miR396
factor de regulación del crecimiento 736 MRT4530_147352C.3 O. sativa
miR396
factor de regulación del crecimiento 737 MRT4530_180707C.1 O. sativa
miR396
factor de regulación del crecimiento 738 MRT4530_221461C.1 O. sativa
miR396
factor de regulación del crecimiento 739 MRT4530_63308C.3 O. sativa
miR396
factor de regulación del crecimiento 740 MRT4530_73195C.3 O. sativa
miR396
factor de regulación del crecimiento 741 MRT4530_83576C.4 O. sativa
miR397
Laccasa 742 MRT4530_148379C.4 O. sativa
miR397
Laccasa 743 MRT4530_181828C.1 O. sativa
miR397
Laccasa 744 MRT4530_237569C.1 O. sativa
miR397
Laccasa 745 MRT4530_60143C.3 O. sativa
miARN
Función génica SEC ID Nº: ID del gen Especie de origen*
miR408
proteína de cobre azul 746 MRT4530_137979C.3 O. sativa
miR408
proteína de cobre azul 747 MRT4530_260849C.1 O. sativa
miR408
proteína de cobre azul 748 MRT4530_40477C.6 O. sativa
miR408
Laccasa 749 MRT4530_160612C.2 O. sativa
miR408
Laccasa 750 MRT4530_169405C.1 O. sativa
miR444
MADS 751 MRT4530_27947C.3 O. sativa
miR444
MADS 752 MRT4530_78475C.3 O. sativa
miR444
caja de MADS 753 PHE0001381 O. sativa
miR444
caja de MADS 754 PHE0015548 O. sativa
3miR444
caja de MADS 755 PHE0015549 O. sativa
miR444
caja de MADS 756 PHE0003829 O. sativa
miR444
caja de MADS 757 MRT4530_196636C.3 O. sativa
miR809
Mlo 758 MRT4530_59197C.5 O. sativa
miR538
caja de MADS 759 PHE0014613 Physcomitrella patens
miR156/157
dominio SBP 760 MRT4558_6587C.1 Sorghum bicolor
miR156/157
dominio SBP 761 MRT4558_12680C.1 S. bicolor
miR156/157
Proteína de unión a promotor de Squamosa 762 MRT4558_8644C.2 S. bicolor
miR 159
GAMYB 763 MRT4558_37619C.1 S. bicolor
miR160
Factor de respuesta a auxina 764 MRT4558_27799C.1 S. bicolor
miR164
proteína de dominio NAC 765 MRT4558_43436C.1 S. bicolor
miR164
proteína de dominio NAC 766 MRT4558_4564C.2 S. bicolor
miR164
NAC1 767 MRT4558_43081C.1 S. bicolor
miR164
Sin meristemo apical 768 MRT4558_41467C.1 S. bicolor
miR165/166
proteína HD-ZIP de clase III 769 MRT4558_27560C.1 S. bicolor
miR167
Factor de respuesta a auxina 770 MRT4558_10718C.3 S. bicolor
miR167
Factor de respuesta a auxina 771 MRT4558_1659C.2 S. bicolor
miR167
Factor de respuesta a auxina 772 MRT4558_37108C.1 S. bicolor
miR169
unión a CCAAT 773 MRT4558_11671C.2 S. bicolor
miR169
unión a CCAAT 774 MRT4558_13240C.2 S. bicolor
miARN
Función génica SEC ID Nº: ID del gen Especie de origen*
miR169
unión a CCAAT 775 MRT4558_19368C.2 S. bicolor
miR169
unión a CCAAT 776 MRT4558_8287C.2 S. bicolor
miR170/171
SCL 777 MRT4558_7655C.1 S. bicolor
miR172
dominio AP2 778 MRT4558_25704C.2 S. bicolor
miR393
Respuesta de inhibidor de transporte 779 MRT4558_1226C.2 S. bicolor
miR393
Respuesta de inhibidor de transporte 780 MRT4558_20000C.2 S. bicolor
miR394
dominio de caja F 781 MRT4558_11973C.2 S. bicolor
miR395
sulfato adenililtransferasa 782 MRT4558_11861C.1 S. bicolor
miR395
Transportador de sulfato 783 MRT4558_24400C2 S. bicolor
miR396
factor de regulación del crecimiento 784 MRT4558_13321C.2 S. bicolor
miR400
Repetición de pentatricopéptido 785 MRT4558_43831C.1 S. bicolor
miR408
proteína de cobre azul 786 MRT4558_16166C.2 S. bicolor
miR408
proteína de cobre azul 787 MRT4558_8981C.2 S. bicolor
miR408
Laccasa 788 MRT4558_40844C.1 S. bicolor
miR444
caja de MADS 789 MRT4558_11440C.2 S. bicolor
miR472
unión a ATP 790 MRT4558_33723C.1 S. bicolor
miR475
PPR 791 MRT4558_5261C.2 S. bicolor
miR536
proteína de caja F 792 MRT4558_34710C.1 S. bicolor
miR858
unión a ADN similar a myb 793 MRT4558_5881C.2 S. bicolor
miR858
unión a ADN similar a myb 794 MRT4558_642C.1 S. bicolor
miR 159
proteína myb 795 MRT4565_281735C.1 Triticum aestivum
miR169
CCAAT 796 MRT4565_240119C.2 T. aestivum
miR169
CCAAT 797 MRT4565_270644C.2 T. aestivum
miR172
AP2 798 MRT4565_247090C.1 T. aestivum
miR394
Caja F 799 MRT4565_259298C.2 T. aestivum
miR444
caja de MADS 800 PHE0002649 T. aestivum
miR444
caja de MADS 801 MRT4565_247066C.1 T. aestivum
miR444
caja de MADS 802 MRT4565_258649C.1 T. aestivum
miR529
AP2 803 MRT4565_278632C.2 T. aestivum
miR858
MYB 804 MRT4565_223049C.1 T. aestivum
miARN
Función génica SEC ID Nº: ID del gen Especie de origen*
miR165/166
REV 805 PHE0012638 No identificada
miR824
caja de MADS 806 PHE0015528 No identificada
miR824
caja de MADS 807 PHE0015545 No identificada
miR1029
erf 808 MRT4577_148956C.8 Zea mays
miR1029
erf 809 MRT4577_267494C.5 Z. mays
miR1029
erf 810 MRT4577_389477C.2 Z. mays
miR1029
erf 811 MRT4577_48700C.7 Z. mays
miR1029
erf 812 MRT4577_565542C.1 Z. mays
miR1029
erf 813 MRT4577_600239C.1 Z. mays
miR156
Unión a promotor de Squamosa 814 MRT4577_396357C.4 Z. mays
miR156/157
dominio SBP 815 MRT4577_122478C.6 Z. mays
miR156/157
dominio SBP 816 MRT4577_270892C.4 Z. mays
miR156/157
dominio SBP 817 MRT4577_334372C.5 Z. mays
miR156/157
dominio SBP 818 MRT4577_532824C.3 Z. mays
miR156/157
dominio SBP 819 MRT4577_535297C.2 Z. mays
miR156/157
dominio SBP 820 MRT4577_537670C.2 Z. mays
miR156/157
dominio SBP 821 MRT4577_565057C.1 Z. mays
miR156/157
dominio SBP 822 MRT4577_568647C.1 Z. mays
miR156/157
dominio SBP 823 MRT4577_571545C.1 Z. mays
miR156/157
dominio SBP 824 MRT4577_644419C.1 Z. mays
miR156/157
dominio SBP 825 MRT4577_23629C.7 Z. mays
miR156/157
dominio SBP 826 MRT4577_295538C.7 Z. mays
miR156/157
dominio SBP 827 MRT4577_31704C.9 Z. mays
miR156/157
Unión a promotor de Squamosa 828 MRT4577_427964C.4 Z. mays
miR156/157
Unión a promotor de Squamosa 829 MRT4577_461098C.3 Z. mays
miR156/157
Proteína de unión a promotor de Squamosa 830 MRT4577_137984C.6 Z. mays
miR156/157
Proteína de unión a promotor de Squamosa 831 MRT4577_188360C.6 Z. mays
miR156/157
Proteína de unión a promotor de Squamosa 832 MRT4577_205098C.7 Z. mays
miARN
Función génica SEC ID Nº: ID del gen Especie de origen*
miR156/157
Proteína de unión a promotor de Squamosa 833 MRT4577_26483C.7 Z. mays
miR156/157
Proteína de unión a promotor de Squamosa 834 MRT4577_341149C.6 Z. mays
miR156/157
Proteína de unión a promotor de Squamosa 835 MRT4577_383301C.4 Z. mays
miR156/157
Proteína de unión a promotor de Squamosa 836 MRT4577_42534C.9 Z. mays
miR156/157
Proteína de unión a promotor de Squamosa 837 MRT4577_564644C.1 Z. mays
miR156/157
Proteína de unión a promotor de Squamosa 838 MRT4577_619443C.1 Z. mays
miR156/157
Unión a promotor de Squamosa 839 MRT4577_333683C.4 Z. mays
miR156/157
Unión a promotor de Squamosa 840 MRT4577_38044C.8 Z. mays
miR156/157
arquitectura de gluma de teosinte 841 MRT4577_181019C.5 Z. mays
miR156/157
arquitectura de gluma de teosinte 842 MRT4577_78773C.8 Z. mays
miR159
GAMYB 843 MRT4577_481577C.2 Z. mays
miR159
MYB 844 MRT4577_210747C.5 Z. mays
miR159
MYB 845 MRT4577_542744C.2 Z. mays
miR159
similar a myb 846 MRT4577_298452C.5 Z. mays
miR159
unión a ADN similar a myb 847 MRT4577_565447C.1 Z. mays
miR159
unión a ADN similar a myb 848 MRT4577_565456C.1 Z. mays
miR159
dominio de unión a ADN similar a myb 849 MRT4577_30813C.8 Z. mays
miR159
dominio de unión a ADN similar a myb 850 MRT4577_390477C.4 Z. mays
miR159
dominio de unión a ADN similar a myb 851 MRT4577_391124C.5 Z. mays
miR159
dominio de unión a ADN similar a myb 852 MRT4577_416957C.3 Z. mays
miR159
dominio de unión a ADN similar a myb 853 MRT4577_545477C.2 Z. mays
miR159
dominio de unión a ADN similar a myb 854 MRT4577_582653C.1 Z. mays
miR159
dominio de unión a ADN similar a myb 855 MRT4577_598088C.1 Z. mays
miARN
Función génica SEC ID Nº: ID del gen Especie de origen*
miR159
dominio de unión a ADN similar a myb 856 MRT4577_605039C.1 Z. mays
miR159
dominio de unión a ADN similar a myb 857 MRT4577_613992C.1 Z. mays
miR159
dominio de unión a ADN similar a myb 858 MRT4577_622542C.1 Z. mays
miR159
dominio de unión a ADN similar a myb 859 MRT4577_709777C.1 Z. mays
miR159
dominio de unión a ADN similar a myb 860 MRT4577_77765C.6 Z. mays
miR160
Factor de respuesta a auxina 861 MRT4577_256734C.4 Z. mays
miR160
Factor de respuesta a auxina 862 MRT4577_258637C.3 Z. mays
miR160
Factor de respuesta a auxina 863 MRT4577_385317C.4 Z. mays
miR160
Factor de respuesta a auxina 864 MRT4577_400043C.5 Z. mays
miR160
Factor de respuesta a auxina 865 MRT4577_41620C.7 Z. mays
miR160
Factor de respuesta a auxina 866 MRT4577_429671C.4 Z. mays
miR160
Factor de respuesta a auxina 867 MRT4577_430512C.4 Z. mays
miR160
Factor de respuesta a auxina 868 MRT4577_448022C.1 Z. mays
miR160
Factor de respuesta a auxina 869 MRT4577_503622C.2 Z. mays
miR160
Factor de respuesta a auxina 870 MRT4577_569655C.1 Z. mays
miR160
Factor de respuesta a auxina 871 MRT4577_605037C.1 Z. mays
miR161
PPR 872 MRT4577_219343C.5 Z. mays
miR161
PPR 873 MRT4577_338127C.1 Z. mays
miR161
PPR 874 MRT4577_381918C.5 Z. mays
miR161
PPR 875 MRT4577_549370C.2 Z. mays
miR161
PPR 876 MRT4577_653452C.1 Z. mays
miR162
Dicer 877 MRT4577_226226C.4 Z. mays
miR 162
Dicer 878 MRT4577_50615C.6 Z. mays
miARN
Función génica SEC ID Nº: ID del gen Especie de origen*
miR162
Dicer 879 MRT4577_592675C.1 Z. mays
miR164
proteína de dominio NAC 880 MRT4577_686098C.1 Z. mays
miR164
proteína de dominio NAC 881 MRT4577_98755C.5 Z. mays
miR164
NAC1 882 PHE0003788 Z. mays
miR164
Sin meristemo apical 883 MRT4577_105083C.9 Z. mays
miR164
Sin meristemo apical 884 MRT4577_16045C.7 Z. mays
miR164
Sin meristemo apical 885 MRT4577_256695C.4 Z. mays
miR164
Sin meristemo apical 886 MRT4577_29326C.8 Z. mays
miR164
Sin meristemo apical 887 MRT4577_317955C.5 Z. mays
miR164
Sin meristemo apical 888 MRT4577_370828C.5 Z. mays
miR164
Sin meristemo apical 889 MRT4577_394716C.4 Z. mays
miR164
Sin meristemo apical 890 MRT4577_586054C.1 Z. mays
miR164
Sin meristemo apical 891 MRT4577_625707C.1 Z. mays
miR164
Sin meristemo apical 892 MRT4577_629408C.1 Z. mays
miR164
Sin meristemo apical 893 MRT4577_705865C.1 Z. mays
miR164
Sin meristemo apical 894 MRT4577_9951C.8 Z. mays
miR165/166
proteína HD-ZIP de clase III 895 MRT4577_197925C.4 Z. mays
miR165/166
proteína HD-ZIP de clase III 896 MRT4577_200605C.3 Z. mays
miR165/166
proteína HD-ZIP de clase III 897 MRT4577_320718C.6 Z. mays
miR165/166
proteína HD-ZIP de clase III 898 MRT4577_43102C.9 Z. mays
miR165/166
proteína HD-ZIP de clase III 899 MRT4577_535928C.2 Z. mays
miR165/166
proteína HD-ZIP de clase III 900 MRT4577_568616C.1 Z. mays
miR165/166
proteína HD-ZIP de clase III 901 MRT4577_613062C.1 Z. mays
miR165/166
proteína HD-ZIP de clase III 902 MRT4577_659410C.1 Z. mays
miR165/166
proteína HD-ZIP de clase III 903 MRT4577_673351C.1 Z. mays
miR165/166
HD-ZIP 904 PHE0008043 Z. mays
miR165/166
Rev 905 PHE0007773 Z. mays
miR165/166
Rev 906 PHE0012657 Z. mays
miR165/166
hoja enrollada 907 MRT4577_229497C.6 Z. mays
miR165/166
hoja enrollada 908 MRT4577_312384C.3 Z. mays
miR165/166
hoja enrollada 909 MRT4577_342259C.4 Z. mays
miR165/166
hoja enrollada 910 MRT4577_442838C.4 Z. mays
miARN
Función génica SEC ID Nº: ID del gen Especie de origen*
miR165/166
hoja enrollada 911 MRT4577_535676C.2 Z. mays
miR165/166
hoja enrollada 912 MRT4577_566770C.1 Z. mays
miR165/166
hoja enrollada 913 MRT4577_586718C.1 Z. mays
miR167
ARF 914 PHE0003656 Z. mays
miR167
Factor de respuesta a auxina 915 MRT4577_267543C.4 Z. mays
miR167
Factor de respuesta a auxina 916 MRT4577_267545C.6 Z. mays
miR167
Factor de respuesta a auxina 917 MRT4577_306050C.5 Z. mays
miR167
Factor de respuesta a auxina 918 MRT4577_310720C.4 Z. mays
miR167
Factor de respuesta a auxina 919 MRT4577_339989C.4 Z. mays
miR167
Factor de respuesta a auxina 920 MRT4577_35746C.4 Z. mays
miR167
Factor de respuesta a auxina 921 MRT4577_360403C.2 Z. mays
miR167
Factor de respuesta a auxina 922 MRT4577_377896C.4 Z. mays
miR167
Factor de respuesta a auxina 923 MRT4577_45522C.9 Z. mays
miR167
Factor de respuesta a auxina 924 MRT4577_509023C.3 Z. mays
miR167
Factor de respuesta a auxina 925 MRT4577_521851C.2 Z. mays
miR167
Factor de respuesta a auxina 926 MRT4577_536912C.2 Z. mays
miR167
Factor de respuesta a auxina 927 MRT4577_569979C.1 Z. mays
miR167
Factor de respuesta a auxina 928 MRT4577_650810C.1 Z. mays
miR167
Factor de respuesta a auxina 929 MRT4577_676039C.1 Z. mays
miR167
Factor de respuesta a auxina 930 MRT4577_680014C.1 Z. mays
miR167
Factor de respuesta a auxina 931 MRT4577_681088C.1 Z. mays
miR167
Factor de respuesta a auxina 932 MRT4577_681995C.1 Z. mays
miARN
Función génica SEC ID Nº: ID del gen Especie de origen*
miR167
Factor de respuesta a auxina 933 MRT4577_683953C.1 Z. mays
miR167
Factor de respuesta a auxina 934 MRT4577_684325C.1 Z. mays
miR167
Factor de respuesta a auxina 935 MRT4577_8821C.7 Z. mays
miR168
Argonauta 936 MRT4577_247045C.8 Z. mays
miR168
Argonauta 937 MRT4577_29086C.7 Z. mays
miR168
Argonauta 938 MRT4577_418712C.5 Z. mays
miR168
Argonauta 939 MRT4577_57570C.9 Z. mays
miR168
Argonauta 940 MRT4577_577443C.1 Z. mays
miR169
unión a CCAAT 941 MRT4577_40749C.8 Z. mays
miR169
unión a CCAAT 942 MRT4577_428392C.4 Z. mays
miR169
unión a CCAAT 943 MRT4577_434247C.4 Z. mays
miR169
unión a CCAAT 944 MRT4577_536961C.2 Z. mays
miR169
unión a CCAAT 945 MRT4577_536962C.2 Z. mays
miR169
unión a CCAAT 946 MRT4577_540147C.2 Z. mays
miR169
unión a CCAAT 947 MRT4577_556372C.2 Z. mays
miR169
unión a CCAAT 948 MRT4577_570254C.1 Z. mays
miR169
unión a CCAAT 949 MRT4577_668660C.1 Z. mays
miR169
unión a CCAAT 950 MRT4577_693949C.1 Z. mays
miR169
unión a CCAAT 951 MRT4577_701125C.1 Z. mays
miR170/171
SCL 952 PHE0006551 Z. mays
miR170/171
SCL 953 MRT4577_140896C.6 Z. mays
miR170/171
SCL 954 MRT4577_234039C.6 Z. mays
miR170/171
SCL 955 MRT4577_269667C.5 Z. mays
miR170/171
SCL 956 MRT4577_520619C.2 Z. mays
miR170/171
SCL 957 MRT4577_617401C.1 Z. mays
miR170/171
SCL 958 MRT4577_75777C.8 Z. mays
miR171
GRAS 959 MRT4577_26778C.8 Z. mays
miR171
GRAS 960 MRT4577_30852C.6. Z. mays
miR171
GRAS 961 MRT4577_683754C.1 Z. mays
miR171
GRAS 962 MRT4577_687943C.1 Z. mays
miARN
Función génica SEC ID Nº: ID del gen Especie de origen*
miR171
Scarecrow 963 MRT4577_569322C.1 Z. mays
miR172
AP2 964 PHE0006602 Z. mays
miR172
dominio AP2 965 MRT4577_12523C.7 Z. mays
miR172
dominio AP2 966 MRT4577_27478C.9 Z. mays
miR172
dominio AP2 967 MRT4577_304712C.4 Z. mays
miR172
dominio AP2 968 MRT4577_307553C.7 Z. mays
miR172
dominio AP2 969 MRT4577_431122C.3 Z. mays
miR172
dominio AP2 970 MRT4577_455774C.3 Z. mays
miR172
dominio AP2 971 MRT4577_468762C.3 Z. mays
miR172
dominio AP2 972 MRT4577_548310C.2 Z. mays
miR172
dominio AP2 973 MRT4577_556612C.2 Z. mays
miR172
dominio AP2 974 MRT4577_597136C.1 Z. mays
miR172
dominio AP2 975 MRT4577_669210C.1 Z. mays
miR172
dominio AP2 976 MRT4577_676464C.1 Z. mays
miR172
dominio AP2 977 MRT4577_708079C.1 Z. mays
miR172
APETALA2 978 MRT4577_49517C.8 Z. mays
miR172
APETALA2 979 MRT4577_700043C.1 Z. mays
miR172
Glossy15 980 PHE0000011 Z. mays
miR319
Ciclina 981 PHE0001434 Z. mays
miR319
PCF 982 MRT4577_427906C.4 Z. mays
miR319
PCF 983 MRT4577_480991C.1 Z. mays
miR319
PCF 984 MRT4577_568064C.1 Z. mays
miR319
PCF 985 MRT4577_590917C.1 Z. mays
miR319
PCF 986 MRT4577_679533C.1 Z. mays
miR319
PCF 987 MRT4577_680167C.1 Z. mays
miR319
factor de transcripción de familia TCP 988 MRT4577_147719C.7 Z. mays
miR319
factor de transcripción de familia TCP 989 MRT4577_221733C.7 Z. mays
miR319
factor de transcripción de familia TCP 990 MRT4577_275063C.6 Z. mays
miR319
factor de transcripción de familia TCP 991 MRT4577_30525C.6 Z. mays
miARN
Función génica SEC ID Nº: ID del gen Especie de origen*
miR319
factor de transcripción de familia TCP 992 MRT4577_340633C.4 Z. mays
miR319
factor de transcripción de familia TCP 993 MRT4577_557860C.2 Z. mays
miR319
factor de transcripción de familia TCP 994 MRT4577_558102C.2 Z. mays
miR319
factor de transcripción de familia TCP 995 MRT4577_568063C.1 Z. mays
miR319
factor de transcripción de familia TCP 996 MRT4577_571095C.1 Z. mays
miR319
factor de transcripción de familia TCP 997 MRT4577_590269C.1 Z. mays
miR319
factor de transcripción de familia TCP 998 MRT4577_686625C.1 Z. mays
miR390
TAS 999 MRT4577_306288C.5 Z. mays
miR390
TAS 1000 MRT4577_325578C.3 Z. mays
miR390
TAS 1001 MRT4577_687438C.1 Z. mays
miR390
TAS 1002 MRT4577_72903C.4 Z. mays
miR393
Caja F 1003 PHE0000546 Z. mays
miR393
Caja F 1004 PHE0000912 Z. mays
miR393
Respuesta de inhibidor de transporte 1005 MRT4577_39097C.9 Z. mays
miR393
Respuesta de inhibidor de transporte 1006 MRT4577_546333C.2 Z. mays
miR393
Respuesta de inhibidor de transporte 1007 MRT4577_560980C.2 Z. mays
miR393
Respuesta de inhibidor de transporte 1008 MRT4577_656737C.1 Z. mays
miR393
Respuesta de inhibidor de transporte 1009 MRT4577_688815C.1 Z. mays
miR394
dominio de caja F 1010 MRT4577_56429C.8 Z. mays
miR394
dominio de caja F 1011 MRT4577_613832C.1 Z. mays
miR395
AST 1012 MRT4577_293072C.7 Z. mays
miR395
AST 1013 MRT4577_57393C.8 Z. mays
miR395
AST 1014 MRT4577_594643C.1 Z. mays
miR395
AST 1015 MRT4577_655078C.1 Z. mays
miR395
AST 1016 MRT4577_681126C.1 Z. mays
miARN
Función génica SEC ID Nº: ID del gen Especie de origen*
miR395
ATP sulfurilasa 1017 MRT4577_118322C.5 Z. mays
miR395
ATP sulfurilasa 1018 MRT4577_453989C.4 Z. mays
miR395
sulfato adenililtransferasa 1019 MRT4577_386324C.4 Z. mays
miR395
sulfato adenililtransferasa 1020 MRT4577_57434C.9 Z. mays
miR395
sulfato adenililtransferasa 1021 MRT4577_694623C.1 Z. mays
miR395
sulfato adenililtransferasa 1022 MRT4577_709359C.1 Z. mays
miR395
transportador de sulfato 1023 MRT4577_644561C.1 Z. mays
miR396
factor de regulación del crecimiento 1024 PHE0000025 Z. mays
miR396
factor de regulación del crecimiento 1025 PHE0000289 Z. mays
miR396
factor de regulación del crecimiento 1026 PHE0001216 Z. mays
miR396
factor de regulación del crecimiento 1027 MRT4577_215581C.4 Z. mays
miR396
factor de regulación del crecimiento 1028 MRT4577_215583C.5 Z. mays
miR396
factor de regulación del crecimiento 1029 MRT4577_232004C.7 Z. mays
miR396
factor de regulación del crecimiento 1030 MRT4577_24924C.7 Z. mays
miR396
factor de regulación del crecimiento 1031 MRT4577_266456C.6 Z. mays
miR396
factor de regulación del crecimiento 1032 MRT4577_278593C.3 Z. mays
miR396
factor de regulación del crecimiento 1033 MRT4577_29961C.8 Z. mays
miR396
factor de regulación del crecimiento 1034 MRT4577_356670C.6 Z. mays
miR396
factor de regulación del crecimiento 1035 MRT4577_359461C.1 Z. mays
miR396
factor de regulación del crecimiento 1036 MRT4577_372672C.5 Z. mays
miR396
factor de regulación del crecimiento 1037 MRT4577_410501C.4 Z. mays
miR396
factor de regulación del crecimiento 1038 MRT4577_432229C.3 Z. mays
miR396
factor de regulación del crecimiento 1039 MRT4577_534804C.2 Z. mays
miARN
Función génica SEC ID Nº: ID del gen Especie de origen*
miR396
factor de regulación del crecimiento 1040 MRT4577_551090C.1 Z. mays
miR396
factor de regulación del crecimiento 1041 MRT4577_563407C.1 Z. mays
miR396
factor de regulación del crecimiento 1042 MRT4577_569284C.1 Z. mays
miR396
factor de regulación del crecimiento 1043 MRT4577_597418C.1 Z. mays
miR396
factor de regulación del crecimiento 1044 MRT4577_618948C.1 Z. mays
miR396
factor de regulación del crecimiento 1045 MRT4577_635741C.1 Z. mays
miR397
Laccasa 1046 MRT4577_233334C.7 Z. mays
miR397
Laccasa 1047 MRT4577_26704C.2 Z. mays
miR397
Laccasa 1048 MRT4577_293572C.3 Z. mays
miR397
Laccasa 1049 MRT4577_602028C.1 Z. mays
miR398
citocromo c oxidasa 1050 MRT4577_434356C.4 Z. mays
miR398
citocromo c oxidasa 1051 MRT4577_547404C.2 Z. mays
miR399
Ciclina 1052 PHE0002694 Z. mays
miR400
PPR 1053 MRT4577_480700C.2 Z. mays
miR400
PPR 1054 MRT4577_593504C.1 Z. mays
miR408
proteína de cobre azul 1055 MRT4577_325458C.1 Z. mays
miR408
proteína de cobre azul 1056 MRT4577_37590C.9 Z. mays
miR408
proteína de cobre azul 1057 MRT4577_47069C.8 Z. mays
miR408
proteína de cobre azul 1058 MRT4577_528699C.2 Z. mays
miR408
proteína de cobre azul 1059 MRT4577_550892C.1 Z. mays
miR408
Laccasa 1060 PHE0003380 Z. mays
miR408
Laccasa 1061 MRT4577_245033C.8 Z. mays
miR408
Laccasa 1062 MRT4577_380413C.6 Z. mays
miR408
Laccasa 1063 MRT4577_388860C.4 Z. mays
miR408
Laccasa 1064 MRT4577_461451C.3 Z. mays
miR408
Laccasa 1065 MRT4577_625157C.1 Z. mays
miR408
Laccasa 1066 MRT4577_629379C.1 Z. mays
miR408
plantacianina 1067 PHE0000329 Z. mays
miR444
MADS 1068 PHE0013719 Z. mays
miARN
Función génica SEC ID Nº: ID del gen Especie de origen*
miR444
caja de MADS 1069 PHE0002650 Z. mays
miR444
caja de MADS 1070 MRT4577_321664C.4 Z. mays
miR444
caja de MADS 1071 MRT4577_204116C.4 Z. mays
miR444
caja de MADS 1072 MRT4577_537511C.2 Z. mays
miR444
caja de MADS 1073 MRT4577_553467C.1 Z. mays
miR444
caja de MADS 1074 MRT4577_613242C.1 Z. mays
miR444
caja de MADS 1075 MRT4577_695496C.1 Z. mays
miR472
unión a ATP 1076 MRT4577_110498C.5 Z. mays
miR472
unión a ATP 1077 MRT4577_251486C.3 Z. mays
miR472
proteína de resistencia a enfermedad de tipo NBS-LRR, 1078 MRT4577_320221C.4 Z. mays
miR475
PPR 1079 MRT4577_110120C.3 Z. mays
miR475
PPR 1080 MRT4577_205728C.3 Z. mays
miR475
PPR 1081 MRT4577_664698C.1 Z. mays
miR477
GRAS 1082 MRT4577_278714C.7 Z. mays
miR477
GRAS 1083 MRT4577_401721C.2 Z. mays
miR477
GRAS 1084 MRT4577_463199C.2 Z. mays
miR477
GRAS 1085 MRT4577_526548C.1 Z. mays
miR477
GRAS 1086 MRT4577_569010C.1 Z. mays
miR482
resistencia a enfermedad 1087 MRT4577_204880C.4 Z. mays
miR482
resistencia a enfermedad 1088 MRT4577_285745C.3 Z. mays
miR482
resistencia a enfermedad 1089 MRT4577_537326C.2 Z. mays
miR482
resistencia a enfermedad 1090 MRT4577_642390C.1 Z. mays
miR482
resistencia a enfermedad 1091 MRT4577_647253C.1 Z. mays
miR482
resistencia a enfermedad 1092 MRT4577_700169C.1 Z. mays
miR776
IRE 1093 MRT4577_475418C.2 Z. mays
miR776
IRE 1094 MRT4577_569446C.1 Z. mays
miR776
IRE 1095 MRT4577_668929C.1 Z. mays
miR827
SYG1/Pho81/XPR1 1096 MRT4577_565044C.1 Z. mays
miR844
proteína cinasa 1097 MRT4577_34878C.9 Z. mays
miR844
proteína cinasa 1098 MRT4577_469768C.2 Z. mays
miR857
LAC 1099 MRT4577_447458C.4 Z. mays
miARN
Función génica SEC ID Nº: ID del gen Especie de origen*
miR858
MYB 1100 MRT4577_230084C.4 Z. mays
miR858
MYB 1101 MRT4577_28298C.7 Z. mays
miR858
MYB 1102 MRT4577_365133C.3 Z. mays
miR858
MYB 1103 MRT4577_691552C.1 Z. mays
miR858
similar a myb 1104 MRT4577_237723C.3 Z. mays
miR858
unión a ADN similar a myb 1105 MRT4577_204899C.4 Z. mays
miR858
unión a ADN similar a myb 1106 MRT4577_229676C.2 Z. mays
miR858
unión a ADN similar a myb 1107 MRT4577_303539C.6 Z. mays
miR858
unión a ADN similar a myb 1108 MRT4577_330816C.1 Z. mays
miR858
unión a ADN similar a myb 1109 MRT4577_340919C.6 Z. mays
miR858
unión a ADN similar a myb 1110 MRT4577_549954C.1 Z. mays
miR858
unión a ADN similar a myb 1111 MRT4577_585620C.1 Z. mays
miR858
unión a ADN similar a myb 1112 MRT4577_665482C.1 Z. mays
miR858
unión a ADN similar a myb 1113 MRT4577_704749C.1 Z. mays
miR904
AGO 1114 MRT4577_374929C.6 Z. mays
Ejemplo 4
Este ejemplo proporciona realizaciones adicionales de genes diana identificados como "dianas de miARN validadas"
(es decir, que contienen un sitio de reconocimiento de miARN validado) y usos representativos de sitios de
reconocimiento de miARN validados, por ejemplo, para el diseño de secuencias artificiales útiles en la producción de
5 construcciones de ADN recombinante, incluyendo, pero sin limitación, transgenes con un sitio de reconocimiento de
miARN exógeno añadido, transgenes con un sitio de reconocimiento de miARN nativo modificado o eliminado,
señuelos, bloqueadores de la escisión, o inhibidores traduccionales tal como se enseñan y reivindican por los
presentes solicitantes. Las construcciones de ADN recombinantes de la presente invención son útiles para modular
la expresión de dichos genes diana y para producir células vegetales, tejidos vegetales y plantas transgénicas no 10 naturales (especialmente plantas de cultivo transgénicas no naturales) que tienen rendimiento mejorado u otros
rasgos deseables.
La tabla 3 proporciona una lista de miARN y dianas de miARN que contienen sitios de reconocimiento de miARN
que se identificaron en diversas plantas usando técnicas similares a aquellas descritas en el ejemplo 2. Las dianas
de miARN se identificaron por el nombre del gen, dominio de proteína, función, localización, o simplemente como un 15 gen que tiene un sitio de reconocimiento de miARN; esta información es suficiente para diseñar secuencias
artificiales, incluyendo transgenes que no responden a miARN, bloqueadores de la escisión, bloqueadores de la
escisión modificados en 5', inhibidores traduccionales, y señuelos de miARN. La tabla 3 proporciona además una
lista de precursores de miARN (diseñados para procesarse en un miARN maduro nativo), así como secuencias
artificiales que incluyen precursores de miARN diseñados para procesarse en un miARN maduro sintético, señuelos 20 de miARN, transgenes que no responden a miARN, y bloqueadores de la escisión de miARN, todos los cuales son
especialmente útiles para producir construcciones de ADN recombinante de la presente invención. Un experto
habitual en la materia, informado por las enseñanzas de la presente solicitud y provisto de la secuencia de
nucleótidos de un miARN o un sitio de reconocimiento de miARN en un gen diana, será fácilmente capaz de idear
dichas secuencias artificiales. Dicho experto habitual en la materia reconocería además que el conocimiento del gen 25 diana no es en sí necesario, solo la secuencia de la secuencia de miARN maduro o de un precursor de miARN que
se procese en el miARN maduro (o, como alternativa, el conocimiento de la secuencia del sitio de reconocimiento de
miARN) en combinación con las enseñanzas de la presente solicitud, para idear un bloqueador de la escisión (o de
un bloqueador de la escisión modificado en 5') para inhibir los efectos de silenciamiento génico de un miARN dado.
La tabla 3 también proporciona ejemplos de construcciones de ADN recombinantes que, cuando se expresan de 30 manera transgénica en una planta de cultivo (preferentemente, pero sin limitación, maíz, soja, canola, algodón, alfalfa, caña de azúcar, remolacha azucarera, sorgo, y arroz), da como resultado un rendimiento aumentado en dicha planta de cultivo, cuando se compara con la planta de cultivo en la que la construcción no se expresa. Las técnicas para producir plantas transgénicas se describen en el encabezado "Producción y uso de células vegetales transgénicas y plantas transgénicas". El "rendimiento aumentado" puede ser rendimiento intrínseco aumentado; en otras realizaciones, el rendimiento aumentado es rendimiento aumentado en unas condiciones de cultivo concretas, tales como condiciones de estrés abiótico o biótico (por ejemplo, estrés por calor o frío, estrés de sequía, o estrés de nutrientes), cuando se compara con un cultivo que carece de la expresión de la construcción de ADN recombinante de la presente invención.
Con la información anterior acerca de dianas de miARN, un experto habitual en la materia es capaz de producir y usar diversas realizaciones adicionales de aspectos de la presente invención, incluyendo una construcción de ADN recombinante que puede transcribirse en una célula vegetal, incluyendo un promotor que es funcional en la célula vegetal y que está unido operativamente a al menos un polinucleótido seleccionado entre: (a) ADN que codifica un bloqueador de la escisión para evitar o disminuir la escisión mediada por ARN pequeño del transcrito de al menos una diana de miARN identificada en las tablas 2 o 3; (b) ADN que codifica un bloqueador de la escisión modificado en 5' para evitar o disminuir la escisión mediada por ARN pequeño del transcrito de al menos una diana de miARN identificada en las tablas 2 o 3; (c) ADN que codifica un inhibidor traduccional para evitar o disminuir la escisión mediada por ARN pequeño del transcrito de al menos una diana de miARN identificada en las tablas 2 o 3; (d) ADN que codifica un señuelo para evitar o disminuir la escisión mediada por ARN pequeño del transcrito de al menos una diana de miARN identificada en las tablas 2 o 3; (e) ADN que codifica un transgén que no responde a miARN que tiene una secuencia de nucleótidos procedente de la secuencia de nucleótidos nativa de al menos una diana de miARN identificada en las tablas 2 o 3, en el que un sitio de reconocimiento de miARN en la secuencia de nucleótidos nativa se elimina o modifica de otro modo para evitar la escisión mediada por miARN; (f) ADN que codifica un precursor de miARN que se procesa en un miARN para suprimir la expresión de al menos una diana de miARN identificada en las tablas 2 o 3; (g) ADN que codifica ARN bicatenario que se procesa en ARNpi para suprimir la expresión de al menos una diana de miARN identificada en las tablas 2 o 3; y (h) ADN que codifica un ARNpi-ta que se procesa en ARNpi para suprimir la expresión de al menos una diana de miARN identificada en las tablas 2 o 3. Se reivindican específicamente realizaciones en las que la construcción de ADN recombinante se integra de manera estable en un plástido o un cromosoma de la célula vegetal. También se reivindican específicamente procedimientos para mejorar el rendimiento en una planta, en los que la construcción de ADN recombinante se expresa de manera transgénica en una planta de cultivo (preferentemente, pero sin limitación, maíz, soja, canola, algodón, alfalfa, caña de azúcar, remolacha azucarera, sorgo, y arroz), dando como resultado un rendimiento aumentado en dicha planta de cultivo, cuando se compara con la planta de cultivo en la que la construcción no se expresa.
Las realizaciones dentro del ámbito de la presente invención incluyen una construcción de ADN recombinante que puede transcribirse en una célula vegetal, incluyendo un promotor que es funcional en la célula vegetal y que está unido operativamente a al menos un polinucleótido seleccionado entre: (a) un ADN que codifica un bloqueador de la escisión para evitar o disminuir la escisión mediada por ARN pequeño del transcrito de al menos una diana de miARN; (b) ADN que codifica un bloqueador de la escisión modificado en 5' para prevenir o disminuir la escisión mediada por ARN pequeño del transcrito de al menos una diana de miARN; (c) ADN que codifica un inhibidor traduccional para prevenir o disminuir la escisión mediada por ARN pequeño del transcrito de al menos una diana de miARN; (d) ADN que codifica un señuelo para prevenir o disminuir la escisión mediada por ARN pequeño del transcrito de al menos una diana de miARN; (e) ADN que codifica un transgén que no responde a miARN que tiene una secuencia de nucleótidos procedente de la secuencia de nucleótidos nativa de al menos una diana de miARN, en el que un sitio de reconocimiento de miARN en la secuencia de nucleótidos nativa se elimina o modifica de otro modo para evitar la escisión mediada por miARN; (f) ADN que codifica un precursor de miARN que se procesa en un miARN para suprimir la expresión de al menos una diana de miARN; (g) ADN que codifica ARN bicatenario que se procesa en ARNpi para suprimir la expresión de al menos una diana de miARN; y (h) ADN que codifica un ARNpi-ta que se procesa en ARNpi para suprimir la expresión de al menos una diana de miARN, en el que al menos una diana de miARN es al menos una seleccionada entre el grupo que consiste en una diana de miR156, una diana de miR160, una diana de miR164, una diana de miR166, una diana de miR167, una diana de miR169, una diana de miR171, una diana de miR172, una diana de miR319, una diana de miR395, una diana de miR396, una diana de miR398, una diana de miR399, una diana de miR408, una diana de miR444, una diana de miR528, una diana de miR167g, una diana de miR169g, COP1 (fotomorofogénesis I constitutivo), GA2ox (oxidasa del ácido 2 giberélico), GA20ox (oxidasa del ácido 20 giberélico), HB2 (caja homeostática 2), HB2-4 (caja homeostática 2 y caja homeostásica 4), HB4 (caja homeostática 4), LG1 (liguleless l), SPX (SYG1, dominio PHO81 y XPR1; PFAM entrada PF03105 en www.sanger.ac.uk), VIM1a (variante en metilación 1a), DHS1 (desoxihipusina sintasa), DHS2 (desoxihipusina sintasa), DHS3 (desoxihipusina sintasa), DHS4 (desoxihipusina sintasa), DHS5 (desoxihipusina sintasa), DHS6 (desoxihipusina sintasa), DHS7 (desoxihipusina sintasa), DHS8 (desoxihipusina sintasa), CRF (dedo ANULAR de maíz; RNF169), G1543a (ortólogo de maíz de la caja homeostática 17 de Arabidopsis thaliana), G1543b (ortólogo de maíz de la caja homeostática 17 de Arabidopsis thaliana), GS3 (tamaño del grano 3), y GW2 (peso del grano 2). Las realizaciones particulares que se reivindican específicamente por la presente invención incluyen una construcción de ADN recombinante que puede transcribirse en una célula vegetal, incluyendo un promotor que es funcional en la célula vegetal y que está unido operativamente a al menos un polinucleótido seleccionado entre el grupo que consiste en ADN que codifica una secuencia de nucleótido seleccionada entre las
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miARN específicas identificadas por su nombre en este párrafo), o un transcrito que suprime la expresión de al menos una diana de miARN identificada en las tablas 2 o 3 (incluyendo las dianas de miARN específicas identificadas por su nombre en este párrafo), o un transcrito que codifica al menos una diana de miARN identificada en las tablas 2 o 3, o codifica una secuencia de ADN seleccionada entre las SEC ID Nº: 15 -2064.
Vectores de transformación y protocolos
Las siguientes secciones describen ejemplos de un vector base para preparar vectores de transformación que incluyen construcciones de ADN de la presente invención para la transformación de una planta de cultivo específica. Las construcciones de ADN recombinante pueden transcribirse en una célula vegetal e incluyen un promotor que es funcional en la célula vegetal y unido operativamente a al menos un polinucleótido, que codifica un transcrito que previene o reduce la escisión mediada por ARN pequeño del transcrito de al menos una diana de miARN identificada en las tablas 2 o 3 (que incluyen las dianas de miARN específicas identificadas por su nombre en este párrafo), o un transcrito que suprime la expresión de al menos una diana de miARN identificada en las tablas 2 o 3 (incluyendo las dianas de miARN específicas identificadas por su nombre en este párrafo), o un transcrito que codifica al menos una diana de miARN identificada en las tablas 2 o 3, o codifica una secuencia de ADN seleccionada entre las SEC ID Nº: 15 -2064. También se proporcionan ejemplos detallados de protocolos de transformación específicos de cultivos para usar estos vectores que incluyen construcciones de ADN recombinante de la presente invención para generar una célula vegetal transgénica no natural, tejido vegetal transgénico no natural, o planta transgénica no natural. Las técnicas de transformación adicionales son conocidas para un experto habitual en la materia, tal como se reflejan en el "Compendium of Transgenic Crop Plants", editado por Chittaranjan Kole y Timothy C. Hall, Blackwell Publishing Ltd., 2008; ISBN 978-1-405-16924-0 (disponible electrónicamente en mrw.interscience.wiley.com/emrw/9781405181099/hpt/toc). Dichos procedimientos de transformación son útiles para producir una célula vegetal transgénica no natural que tiene un núcleo transformado. Las plantas, semillas y pólenes transgénicos no naturales se producen posteriormente a partir de dicha célula vegetal transgénica no natural que tiene un núcleo transformado, y se exploran respecto de un rasgo mejorado (por ejemplo, rendimiento aumentado, eficacia mejorada del uso de agua, tolerancia al frío mejorada, eficacia mejorada del uso de nitrógeno o fosfato, proteínas de la semilla mejoradas, o aceite de semilla mejorado, o cualquier rasgo tales como aquellos desvelados en el encabezado "Producción y uso de células vegetales transgénicas y plantas transgénicas").
Transformación de maíz
Se usó un vector base pMON93039 (SEC ID Nº: 2065), ilustrado en la tabla 4 y en la figura 2 para preparar construcciones de ADN recombinantes para la transformación de células de maíz mediada por Agrobacterium. Se construyó un vector de transformación para expresar cada una de las construcciones de ADN de la presente invención insertando un polinucleótido de la presente invención en el vector base pMON93039 (SEC ID Nº: 2065) en el casete de expresión del gen de interés en un sitio de inserción, es decir, entre el elemento de intrón (coordenadas 1287-1766) y el elemento de poliadenilación (coordenadas 1838-2780). Por ejemplo, se prepara un vector de transformación para la expresión de un bloqueador de la escisión de miR399 insertando el ADN de la SEC ID Nº: 1802 (véase la tabla 3) en el casete de expresión del gen de interés en un sitio de inserción entre el elemento de intrón (coordenadas 1287-1766) y el elemento de poliadenilación (coordenadas 1838-2780) de pMON93039 (SEC IDNº: 2065).
Para la transformación de células embrionarias de maíz mediada por Agrobacterium, se cultivan plantas de maíz de una línea transformable en el invernadero y se cosechan las mazorcas cuando los embriones tienen de 1,5 a 2,0 mm de longitud. Las mazorcas se esterilizan superficialmente rociando o empapando las mazorcas en etanol al 80%, seguido de secado al aire. Los embriones inmaduros se aíslan a partir de los granos individuales de las mazorcas esterilizadas. Antes de la inoculación de las células de maíz, se cultivan durante toda una noche a temperatura ambiente los cultivos de Agrobacterium que contienen cada uno un vector de transformación para expresar cada una de las construcciones de ADN recombinante de la presente invención. Las células embrionarias de maíz inmaduras se inoculan con Agrobacterium después de la escisión, se incuban a temperatura ambiente con Agrobacterium durante 5 a 20 minutos, y después se cultivan conjuntamente con Agrobacterium durante 1 a 3 días a 23 grados Celsius en la oscuridad. Los embriones cultivados conjuntamente se transfieren a un medio de selección y se cultivan durante aproximadamente dos semanas para permitir que se desarrolle el callo embriogénico. El callo embriogénico se transfiere a un medio de cultivo que contiene 100 mg/ml de paromomicina y se subcultivan a intervalos de aproximadamente dos semanas. Se recuperan múltiples eventos de células vegetales transformadas tras 6 a 8 semanas después de iniciar la selección.
Las plantas de maíz transgénicas se regeneran a partir de callos de células vegetales transgénicas para cada uno de los múltiples sucesos de transformación resultantes de la transformación y selección. Los callos de células vegetales transgénicas de cada suceso se colocan en un medio para iniciar el desarrollo de tallos y raíces en plántulas que se transfieren a suelo de siembra para el crecimiento inicial en una cámara de cultivo a 26 grados Celsius, seguido de crecimiento en un banco de nebulización antes de trasplantarlos a macetas donde las plantas se cultivan hasta la madurez. Las plantas regeneradas se autofertilizan. Se recoge la simiente de primera generación ("R1"). La semilla o las plantas cultivadas a partir de la semilla se usa para seleccionar semillas, plántulas, plantas transgénicas de segunda generación ("R2") descendientes, o híbridos, por ejemplo, seleccionando plantas transgénicas que muestran un rasgo potenciado en comparación con una planta de control (una planta que carece
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Tabla 4
Función
Nombre Anotación Coordenadas de SEC ID Nº: 2065
Transferencia de ADN-T de Agrobacterium
borde de B-AGRtu.derecho Secuencia de borde derecho de Agro, esencial para la transferencia de ADN-T. 11364-11720
Casete de expresión de gen de interés
E-Os.Act1 Región promotora cadena arriba del gen de actina 1 de arroz 19-775
E-CaMV.35S.2xA1-B3
Dominio duplicado A1-B3 35S sin caja de TATA 788-1120
P-Os.Act1
Región promotora del gen de actina 1 de arroz 1125-1204
L-Ta.Lhcbl
Líder 5' no traducido de la proteína principal de unión a clorofila a/b 1210-1270
I-Os.Act1
Secuencias del primer intrón y UTR flanqueante del gen de actina 1 de arroz 1287-1766
T-St.Pis4
Región 3' no traducida del gen inhibidor II de proteinasa de la patata que funciona para dirigir la poliadenilación del ARNm 1838-2780
Casete de expresión de marcador de selección en plantas
P-Os.Act1 Promotor del gen de actina 1 de arroz 2830-3670
L-Os.Act1
Primer exón gel gen de actina 1 de arroz 3671-3750
I-Os.Act1
Secuencias del primer intrón y UTR flanqueante del gen de actina 1 de arroz 3751-4228
TS-At.ShkG-CTP2
Región de péptido transitoria de EPSPS de Arabidopsis 4238-4465
CR-AGRtu.aroA-CP4.nat
Región codificante para el gen aroA nativo de la cepa bacteriana CP4. 4466-5833
T-AGRtu.nos
Una región 3' no traducida del gen de nopalina sintasa de plásmido Ti de Agrobacterium tumefaciens que funciona para dirigir la poliadenilación del ARNm. 5849-6101
Transferencia de ADN-T de Agrobacterium
Borde B-AGRtu.izquierdo Secuencia de borde izquierdo de Agro, esencial para la transferencia de ADN-T. 6168-6609
Mantenimiento en E. coli
OR-Ec.oriV-RK2 El origen de replicación vegetativa del plásmido RK2. 6696-7092
CR-Ec.rop
Región codificante para el represor del cebador del plásmido ColE1. La expresión de este producto génico interfiere con la unión del cebador en el origen de replicación, manteniendo un bajo número de copias del plásmido. 8601-8792
OR-Ec.ori-ColE1
El origen de replicación mínimo del plásmido ColE1 de E. coli. 9220-9808
P-Ec.aadA-SPC/STR
Promotor para adenililtransferasa Tn7 (AAD(3")) 10339-10380
CR-Ec.aadA-SPC/STR
Región codificante para Tn7 adenililtransferasa (AAD(3")) que confiere resistencia a espectinomicina y estreptomicina. 10381-11169
T-Ec.aadA-SPC/STR
3’ UTR del gen Tn7 adenililtransferasa (AAD(3")) de E. coli. 11170-11227
5
10
15
20
25
30
35
40
Tabla 5: dianas de miARN
una diana de miR156, una diana de miR160, una diana de miR164, una diana de miR166, una diana de miR167, una diana de miR169, una diana de miR171, una diana de miR172, una diana de miR319, una diana de miR395, una diana de miR396, una diana de miR398, una diana de miR399, una diana de miR408, una diana de miR444, una diana de miR528, una diana de miR167g, una diana de miR169g, COP1 (fotomorofogénesis 1 constitutivo), GA2ox (oxidasa del ácido 2 giberélico), GA20ox (oxidasa del ácido 20 giberélico), HB2 (caja homeostática 2), HB24 (caja homeostática 2 y caja homeostásica 4), HB4 (caja homeostática 4), LG1 (liguleless 1), SPX (SYG1, dominio PHO81 y XPR1; PFAM entrada PF03105 en www.sanger.ac.uk), VIM1a (variante en metilación 1a), DHS1 (desoxihipusina sintasa), DHS2 (desoxihipusina sintasa), DHS3 (desoxihipusina sintasa), DHS4 (desoxihipusina sintasa), DHS5 (desoxihipusina sintasa), DHS6 (desoxihipusina sintasa), DHS7 (desoxihipusina sintasa), DHS8 (desoxihipusina sintasa), CRF (dedo ANULAR de maíz; RNF169), G1543a (ortólogo de maíz de la caja homeostática 17 de Arabidopsis thaliana), G1543b (ortólogo de maíz de la caja homeostática 17 de Arabidopsis thaliana), GS3 (tamaño del grano 3), y GW2 (peso del grano 2)
Tabla 6: Polinucleótidos expresados por construcciones de la presente invención
SEC ID Nº: 1120, 1121, 1122, 1248, 1257, 1313, 1314, 1364, 1387, 1478, 1489, 1490, 1491, 1492, 1493, 1585, 1597, 1598, 1599, 1713, 1752, 1753, 1801, 1802, 1820, 1927, 1929, 1931, 1971,2006, 2007, 2008, 2010, 2012, 2014, 2016, 2018, 2022, 2023, 2025, 2027, 2029, 2031, 2033, 2035, 2037, 2039, 2041, 2043, 2045, 2047, 2049, 2051, 2053, 2055, 2056, 2057, 2059, 2060, 2061, y 2063.
Transformación de soja
Se usó un vector base pMON82053 (SEC ID Nº: 2066), ilustrado en la tabla 7 y en la figura 3 para preparar construcciones de ADN recombinantes de la presente invención para la transformación en células o tejido de soja mediada por Agrobacterium. Para construir un vector de transformación para expresar cualquiera de las construcciones de ADN recombinante de la presente invención, se insertan nucleótidos que codifican el al menos un polinucleótido en el vector base pMON82053 (SEC ID Nº: 2066) en el casete de expresión del gen de interés en un sitio de inserción, es decir, entre el elemento promotor (coordenadas 1-613) y el elemento de poliadenilación (coordenadas 688-1002). Por ejemplo, se prepara un vector de transformación para la expresión de un bloqueador de la escisión de miR399 insertando el ADN de la SEC ID Nº: 1802 (véase la tabla 3) en el casete de expresión del gen de interés en un sitio de inserción entre el elemento promotor (coordenadas 1-613) y el elemento de poliadenilación (coordenadas 688-1002) de pMON82053 (SEC ID Nº: 2066).
Para la transformación mediada por Agrobacterium, se embeben semillas de soja durante toda la noche y se escindieron y colocaron los explantes de meristemo en un vaso para heridas. Los cultivos de células de Agrobacterium inducidos que contenían cada uno un vector de transformación para expresar cada una de las construcciones de ADN recombinante de la presente invención se mezclan con explantes preparados. Los explantes inoculados se hieren usando sonicación, se colocan en co-cultivo durante 2-5 días, y se transfieren a medio de selección durante 6-8 semanas para permitir la selección y crecimiento de brotes transgénicos. Los brotes resistentes se cosechan aproximadamente a las 6-8 semanas y se colocan en medio de brotado selectivo durante 23 semanas. Los brotes que producen raíces se transfieren al invernadero y se siembran en suelo.
El procedimiento anterior se repite para producir múltiples eventos de células vegetales de soja transgénicas que se transforman con construcciones de ADN recombinante separadas de la presente invención, es decir, una construcción que puede transcribirse en una célula vegetal de soja, que incluye un promotor que es funcional en la célula vegetal de soja y que está unido operativamente a cada polinucleótido seleccionado entre: (a) ADN que codifica un bloqueador de la escisión para prevenir o reducir la escisión mediada por ARN pequeño del transcrito de cada diana de miARN identificada en las tablas 2 y 3; (b) ADN que codifica un bloqueador de la escisión modificado en 5' para prevenir o reducir la escisión mediada por ARN pequeño del transcrito de cada diana de miARN identificada en las tablas 2 y 3; (c) ADN que codifica un inhibidor traduccional para prevenir o reducir la escisión mediada por ARN pequeño del transcrito de cada diana de miARN identificada en las tablas 2 y 3; (d) ADN que codifica un señuelo para prevenir o reducir la escisión mediada por ARN pequeño del transcrito de cada diana de miARN identificada en las tablas 2 y 3; (e) ADN que codifica un transgén que no responde a miARN que tiene una secuencia de nucleótidos procedente de la secuencia de nucleótidos nativa de cada diana de miARN identificada en las tablas 2 y 3, en el que un sitio de reconocimiento de miARN en la secuencia de nucleótidos nativa se elimina o modifica de otro modo para evitar la escisión mediada por miARN; (f) ADN que codifica un precursor de miARN que se procesa en un miARN para suprimir la expresión de cada diana de miARN identificada en las tablas 2 y 3; (g) ADN que codifica ARN bicatenario que se procesa en ARNpi para suprimir la expresión de cada diana de miARN identificada en las tablas 2 y 3; y (h) ADN que codifica un ARNpi-ta que se procesa en ARNpi para suprimir la expresión de cada diana de miARN identificada en las tablas 2 y 3.
El procedimiento anterior se repite para producir múltiples eventos de células vegetales de soja transgénicas que se transforman con cada una de las siguientes construcciones de ADN recombinante de la presente invención, es decir, una construcción que puede transcribirse en una célula vegetal de soja, que incluye un promotor que es funcional en
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Los procedimientos para la transformación del algodón se conocen en la técnica, véase, por ejemplo, las técnicas descritas en las Publicaciones de Solicitud de Patente de Estados Unidos 2004/0087030A1, 2008/0256667A1, 2008/0280361 A1, y 2009/0138985A1. En un ejemplo de un protocolo de transformación de algodón, se esterilizan superficialmente semillas de genotipos de algodón transformables (por ejemplo, si néctar, DP393, OOSO4, 07W610F, STN474, Delta Pearl, DP5415, SureGrow501, o SureGrow747), se enjuagan, y se hidratan en medio CSM (que contiene carbenicilina, cefotaxima, BRAVO, y Captan 50) durante 14 a 42 horas en la oscuridad. Los explantes meristemáticos se procesan a partir de semillas tal como se describe en la Publicación de Solicitud de Patente de Estados Unidos 2008/0256667A1. Los cultivos de células de Agrobacterium que contenían cada uno un vector de transformación para expresar cada una de las construcciones de ADN recombinante de la presente invención se usan para inocular los explantes usando sonicación. El inóculo se retira y los explantes inoculados se transfieren a medio INO y se incuban durante 2 a 5 días usando un fotoperiodo de 16 horas de luz. Después del cultivo conjunto, los explantes se transfieren a medio de selección semisólido (medio Lloyd & McCown Para plantas leñosas modificado suplementado con 200 mg/l de cefotaxima, 200 mg/l de carbenicilina y 100-200 mg/l de estreptomicina) con o sin reguladores del crecimiento de plantas y otros aditivos para promover la formación y crecimiento de múltiples brotes. Los explantes se cultivan en un fotoperiodo de 16 horas de luz. Después de 4 a 6 semanas en el medio de selección se transfieren aquellos explantes que han desarrollado brotes verdes a tapones y se colocan en medio líquido que contiene 0,25mg/l de IBA para el crecimiento de brotes y enraizamiento en cúpulas de plástico durante 3 a 4 semanas. Los tejidos se ensayan respecto de la caracterización molecular mediante uno o más procedimientos de ensayo molecular (por ejemplo, PCR, o transferencias de Southern).
El procedimiento anterior se repite para producir múltiples eventos de células vegetales de algodón transgénicas que se transforman con construcciones de ADN recombinante separadas de la presente invención, es decir, una construcción que puede transcribirse en una célula vegetal de algodón, que incluye un promotor que es funcional en la célula vegetal de algodón y que está unido operativamente a cada polinucleótido seleccionado entre: (a) ADN que codifica un bloqueador de la escisión para prevenir o reducir la escisión mediada por ARN pequeño del transcrito de cada diana de miARN identificada en las tablas 2 y 3; (b) ADN que codifica un bloqueador de la escisión modificado en 5' para prevenir o reducir la escisión mediada por ARN pequeño del transcrito de cada diana de miARN identificada en las tablas 2 y 3; (c) ADN que codifica un inhibidor traduccional para prevenir o reducir la escisión mediada por ARN pequeño del transcrito de cada diana de miARN identificada en las tablas 2 y 3; (d) ADN que codifica un señuelo para prevenir o reducir la escisión mediada por ARN pequeño del transcrito de cada diana de miARN identificada en las tablas 2 y 3; (e) ADN que codifica un transgén que no responde a miARN que tiene una secuencia de nucleótidos procedente de la secuencia de nucleótidos nativa de cada diana de miARN identificada en las tablas 2 y 3, en el que un sitio de reconocimiento de miARN en la secuencia de nucleótidos nativa se elimina o modifica de otro modo para evitar la escisión mediada por miARN; (f) ADN que codifica un precursor de miARN que se procesa en un miARN para suprimir la expresión de cada diana de miARN identificada en las tablas 2 y 3; (g) ADN que codifica ARN bicatenario que se procesa en ARNpi para suprimir la expresión de cada diana de miARN identificada en las tablas 2 y 3; y (h) ADN que codifica un ARNpi-ta que se procesa en ARNpi para suprimir la expresión de cada diana de miARN identificada en las tablas 2 y 3.
El procedimiento anterior se repite para producir múltiples eventos de células vegetales de algodón transgénicas que se transforman con cada una de las siguientes construcciones de ADN recombinante de la presente invención, es decir, una construcción que puede transcribirse en una célula vegetal de algodón, que incluye un promotor que es funcional en la célula vegetal de algodón y que está unido operativamente a un polinucleótido seleccionado entre: (a) un ADN que codifica un bloqueador de la escisión para evitar o disminuir la escisión mediada por ARN pequeño del transcrito de la diana de miARN; (b) ADN que codifica un bloqueador de la escisión modificado en 5' para prevenir o disminuir la escisión mediada por ARN pequeño del transcrito de la diana de miARN; (c) ADN que codifica un inhibidor traduccional para prevenir o reducir la escisión mediada por ARN pequeño del transcrito de la diana de miARN; (d) ADN que codifica un señuelo para prevenir o reducir la escisión mediada por ARN pequeño del transcrito de la diana de miARN; (e) ADN que codifica un transgén que no responde a miARN que tiene una secuencia de nucleótidos procedente de la secuencia de nucleótidos nativa de la diana de miARN, en el que un sitio de reconocimiento de miARN en la secuencia de nucleótidos nativa se elimina o modifica de otro modo para evitar la escisión mediada por miARN; (f) ADN que codifica un precursor de miARN que se procesa en un miARN para suprimir la expresión de la diana de miARN; (g) ADN que codifica ARN bicatenario que se procesa en ARNpi para suprimir la expresión de la diana de miARN; y (h) ADN que codifica un ARNpi-ta que se procesa en ARNpi para suprimir la expresión de la diana de miARN, en el que se elaboran construcciones separadas para cada una de las dianas de miARN enumeradas en la tabla 5.
El procedimiento anterior se repite para producir múltiples eventos de células vegetales de algodón transgénicas que se transforman con cada una de las siguientes construcciones de ADN recombinante de la presente invención, es decir, una construcción que puede transcribirse en una célula vegetal de algodón, que incluye un promotor que es funcional en la célula vegetal de algodón y que está unido operativamente a cada polinucleótido proporcionado en la tabla 6, en el que se producen construcciones separadas para cada polinucleótido.
El procedimiento anterior se repite para producir múltiples eventos de células vegetales de algodón transgénicas que se transforman con cada una de las siguientes construcciones de ADN recombinante de la presente invención, es decir, una construcción que puede transcribirse en una célula vegetal de algodón, que incluye un promotor que es funcional en la célula vegetal y está unido operativamente a un polinucleótido seleccionado entre ADN que codifica cada diana de miARN identificada en las tablas 2 y 3.
El procedimiento anterior se repite para producir múltiples eventos de células vegetales de algodón transgénicas que se transforman con cada una de las siguientes construcciones de ADN recombinante de la presente invención, es decir, una construcción que puede transcribirse en una célula vegetal de algodón, que incluye un promotor que es
5 funcional en la célula vegetal y que está unido operativamente a cada polinucleótido de las SEC ID Nº: 15 -2064.
Las plantas de algodón transgénicas regeneradas, o las plantas de algodón transgénicas descendientes o semillas de algodón, producidas a partir de las plantas de algodón transgénicas regeneradas, se exploran respecto de un rasgo mejorado (por ejemplo, rendimiento aumentado), en comparación con una planta o semilla de control (una planta o semilla que carezca de expresión de la construcción de ADN recombinante). A partir de cada grupo de
10 múltiples sucesos de plantas de algodón transgénicas con una construcción recombinante específica de la presente invención, el suceso que produce el rasgo más potenciado (por ejemplo, mayor potenciamiento del rendimiento) se identifica y se selecciona la semilla de algodón transgénica descendiente para desarrollo comercial.
Tabla 7
Función
Nombre Anotación Coordenadas de SEC ID Nº: 2066
Transferencia de ADN-T de Agrobacterium
Borde B-AGRtu.izquierdo Secuencia de borde izquierdo de Agro, esencial para la transferencia de ADN-T. 6144-6585
Casete de expresión de marcador de selección en plantas
P-At.Act7 Promotor del gen de actina 7 de Arabidopsis 6624-7861
L-At.Act7
5’UTR del gen Act7 de Arabidopsis
I-At.Act7
Intrón del gen actina 7 de Arabidopsis
TS-At.ShkG-CTP2
Región de péptido transitoria de EPSPS de Arabidopsis 7864-8091
CR-AGRtu.aroA-CP4.nno At
Región codificante de CP4 sintética con uso de codones preferido para dicotiledóneas. 8092-9459
T-AGRtu.nos
Una región 3' no traducida del gen de nopalina sintasa de plásmido Ti de Agrobacterium tumefaciens que funciona para dirigir la poliadenilación del ARNm. 9466-9718
Casete de expresión de gen de interés
P-CaMV.35S-enh Promotor para ARN 35S de CaMV que contiene un duplicado de la región -90 a -350. 1-613
T-Gb.E6-3b
Región 3' no traducida del gen E6 de la proteína de fibra del algodón de la isla. 688-1002
Transferencia de ADN-T de Agrobacterium
borde de BAGRtu.derecho Secuencia de borde derecho de Agro, esencial para la transferencia de ADN-T. 1033-1389
Mantenimiento en E. coli
OR-Ec.oriV-RK2 El origen de replicación vegetativa del plásmido RK2. 5661-6057
CR-Ec.rop
Región codificante para el represor del cebador del plásmido ColEI. La expresión de este producto génico interfiere con la unión del cebador en el origen de replicación, manteniendo un bajo número de copias del plásmido. 3961-4152
OR-Ec.ori-ColEl
El origen de replicación mínimo del plásmido ColEI de E. coli. 2945-3533
P-Ec.aadA-SPC/STR
Promotor para adenililtransferasa Tn7 (AAD(3")) 2373-2414
CR-Ec.aadA-SPC/STR
Región codificante para Tn7 adenililtransferasa (AAD(3")) que confiere resistencia a espectinomicina y estreptomicina. 1584-2372
T-Ec.aadA-SPC/STR
3’ UTR del gen Tn7 adenililtransferasa (AAD(3")) de E. coli. 1526-1583
15 Tabla 8
Función
Nombre Anotación Coordenadas de SEC ID Nº: 2067
Transferencia de ADN-T de Agrobacterium
borde de BAGRtu.derecho Secuencia de borde derecho de Agro, esencial para la transferencia de ADN-T. 1-357
(continuación)
Función
Nombre Anotación Coordenadas de SEC ID Nº: 2067
Casete de expresión de gen de interés
Exp-CaMV.35Senh+Ph.DnaK Versión mejorada del promotor de ARN 35S de CaMV más la región 5' no traducida de hsp70 de petunia 388-1091
T-Ps.RbcS2-E9
La región 3' no traducida del gen RbcS2 de guisante que funciona para dirigir la poliadenilación del ARNm. 1165 -1797
Expresión de marcador de selección en plantas casete
Exp-CaMV.35S Promotor y región 5' no traducida del ARN 35S de CaMV 1828-2151
CR-Ec.nptII-Tn5
Región codificante para el gen neomicina fosfotransferasa del transposón Tn5 que confiere resistencia a la neomicina y kanamicina. 2185-2979
T-AGRtu.nos
Una región 3' no traducida del gen de nopalina sintasa de plásmido Ti de Agrobacterium tumefaciens que funciona para dirigir la poliadenilación del ARNm. 3011-3263
Transferencia de ADN-T de Agrobacterium
Borde B-AGRtu.izquierdo Secuencia de borde izquierdo de Agro, esencial para la transferencia de ADN-T. 3309-3750
Mantenimiento en E. coli
OR-Ec.oriV-RK2 El origen de replicación vegetativa del plásmido RK2. 3837-4233
CR-Ec.rop
Región codificante para el represor del cebador del plásmido ColE1. La expresión de este producto génico interfiere con la unión del cebador en el origen de replicación, manteniendo un bajo número de copias del plásmido. 5742-5933
OR-Ec.ori-ColE1
El origen de replicación mínimo del plásmido ColE1 de E. coli. 6361-6949
P-Ec.aadA-SPC/STR
Promotor para adenililtransferasa Tn7 (AAD(3")) 7480-7521
CR-Ec.aadA-SPC/STR
Región codificante para Tn7 adenililtransferasa (AAD(3")) que confiere resistencia a espectinomicina y estreptomicina. 7522-8310
T-Ec.aadA-SPC/STR
3’ UTR del gen Tn7 adenililtransferasa (AAD(3")) de E. coli. 8311-8368
Transformación de caña de azúcar
Las técnicas de transformación de caña de azúcar se conocen en la técnica; véase, por ejemplo, los procedimientos descritos para la caña de azúcar de Brumbley y col. en "Sugarcane" (disponible electrónicamente en 5 mrw.interscience.wiley.com/em-rw/9781405181099/hpt/article/k0701/current/pdf), publicado en: "Compendium of Transgenic Crop Plants", editado por Chittaranjan Kole y Timothy C. Hall, Blackwell Publishing Ltd., 2008; ISBN 9781-405-16924-0 (disponible electrónicamente en mrw.interscience.wiley.com/emrw/9781405181099/hpt/toc), y en las Publicaciones de Solicitud de Patente Internacionales PCT WO2007/003023 (caña de azúcar) y WO2008/049183 (caña de azúcar). En un ejemplo de transformación de caña de azúcar (véase el ejemplo 3 de la Publicación de 10 Solicitud de Patente Internacional PCT WO2007/003023A2), se establecen cultivos de callo de caña de azúcar embrionarios a partir de meristemo y hojas primordiales de caña de azúcar (híbrido de Saccharum spp.). Se bombardean conjuntamente callos de ocho semanas con una mezcla equimolar de casetes de expresión UBI-1::Bar::NOSpolyA and UBI-1::Oas::NOSpolyA o UBI-1::Bar::NOSpolyA y UBI-1::CPs::NOSpolyA (10 pg DNAI3/mg partícula) mediante bombardeo de partículas tal como se ha descrito anteriormente (Sanford (1990) Plant Physiol., 15 79:206-209). Después del bombardeo, los callos se transfieren a medio MS que contiene 1 mg/l de PPT y 1 mg/l de BAP para promover la regeneración de brotes e inhibir el desarrollo de tejido no transgénico. Dos semanas después, los callos se transfieren a medio MS que contiene 1 mg/l de PPT y 1 mg/l de Affi para la elongación de los brotes y para inducir la formación de raíces. Después de dos semanas, las plántulas se colocan en cajas magenta para su aclimatación y 2 semanas después, los brotes (10-15 cm) con raíces bien desarrolladas se transfieren a suelo de
20 siembra y se colocan en el invernadero.
El procedimiento anterior se repite para producir múltiples eventos de células vegetales de caña de azúcar transgénicas que se transforman con construcciones de ADN recombinante separadas de la presente invención, es decir, una construcción que puede transcribirse en una célula vegetal de caña de azúcar, que incluye un promotor que es funcional en la célula vegetal de caña de azúcar y que está unido operativamente a cada polinucleótido 25 seleccionado entre: (a) ADN que codifica un bloqueador de la escisión para prevenir o reducir la escisión mediada por ARN pequeño del transcrito de cada diana de miARN identificada en las tablas 2 y 3; (b) ADN que codifica un bloqueador de la escisión modificado en 5' para prevenir o reducir la escisión mediada por ARN pequeño del
transcrito de cada diana de miARN identificada en las tablas 2 y 3; (c) ADN que codifica un inhibidor traduccional para prevenir o reducir la escisión mediada por ARN pequeño del transcrito de cada diana de miARN identificada en las tablas 2 y 3; (d) ADN que codifica un señuelo para prevenir o reducir la escisión mediada por ARN pequeño del transcrito de cada diana de miARN identificada en las tablas 2 y 3; (e) ADN que codifica un transgén que no responde a miARN que tiene una secuencia de nucleótidos procedente de la secuencia de nucleótidos nativa de cada diana de miARN identificada en las tablas 2 y 3, en el que un sitio de reconocimiento de miARN en la secuencia de nucleótidos nativa se elimina o modifica de otro modo para evitar la escisión mediada por miARN; (f) ADN que codifica un precursor de miARN que se procesa en un miARN para suprimir la expresión de cada diana de miARN identificada en las tablas 2 y 3; (g) ADN que codifica ARN bicatenario que se procesa en ARNpi para suprimir la expresión de cada diana de miARN identificada en las tablas 2 y 3; y (h) ADN que codifica un ARNpi-ta que se procesa en ARNpi para suprimir la expresión de cada diana de miARN identificada en las tablas 2 y 3.
El procedimiento anterior se repite para producir múltiples eventos de células vegetales de caña de azúcar transgénicas que se transforman con cada una de las siguientes construcciones de ADN recombinante de la presente invención, es decir, una construcción que puede transcribirse en una célula vegetal de caña de azúcar, que incluye un promotor que es funcional en la célula vegetal de caña de azúcar y que está unido operativamente a un polinucleótido seleccionado entre: (a) un ADN que codifica un bloqueador de la escisión para evitar o disminuir la escisión mediada por ARN pequeño del transcrito de la diana de miARN; (b) ADN que codifica un bloqueador de la escisión modificado en 5' para prevenir o disminuir la escisión mediada por ARN pequeño del transcrito de la diana de miARN; (c) ADN que codifica un inhibidor traduccional para prevenir o reducir la escisión mediada por ARN pequeño del transcrito de la diana de miARN; (d) ADN que codifica un señuelo para prevenir o reducir la escisión mediada por ARN pequeño del transcrito de la diana de miARN; (e) ADN que codifica un transgén que no responde a miARN que tiene una secuencia de nucleótidos procedente de la secuencia de nucleótidos nativa de la diana de miARN, en el que un sitio de reconocimiento de miARN en la secuencia de nucleótidos nativa se elimina o modifica de otro modo para evitar la escisión mediada por miARN; (f) ADN que codifica un precursor de miARN que se procesa en un miARN para suprimir la expresión de la diana de miARN; (g) ADN que codifica ARN bicatenario que se procesa en ARNpi para suprimir la expresión de la diana de miARN; y (h) ADN que codifica un ARNpi-ta que se procesa en ARNpi para suprimir la expresión de la diana de miARN, en el que se elaboran construcciones separadas para cada una de las dianas de miARN enumeradas en la tabla 5.
El procedimiento anterior se repite para producir múltiples eventos de células vegetales de caña de azúcar transgénicas que se transforman con cada una de las siguientes construcciones de ADN recombinante de la presente invención, es decir, una construcción que puede transcribirse en una célula vegetal de caña de azúcar, que incluye un promotor que es funcional en la célula vegetal de caña de azúcar y que está unido operativamente a cada polinucleótido proporcionado en la tabla 6, en el que se producen construcciones separadas para cada polinucleótido.
El procedimiento anterior se repite para producir múltiples eventos de células vegetales de caña de azúcar transgénicas que se transforman con cada una de las siguientes construcciones de ADN recombinante de la presente invención, es decir, una construcción que puede transcribirse en una célula vegetal de caña de azúcar, que incluye un promotor que es funcional en la célula vegetal y está unido operativamente a un polinucleótido seleccionado entre ADN que codifica cada diana de miARN identificada en las tablas 2 y 3.
El procedimiento anterior se repite para producir múltiples eventos de células vegetales de caña de azúcar transgénicas que se transforman con cada una de las siguientes construcciones de ADN recombinante de la presente invención, es decir, una construcción que puede transcribirse en una célula vegetal de caña de azúcar, que incluye un promotor que es funcional en la célula vegetal y que está unido operativamente a cada polinucleótido de las SEC ID Nº: 15 -2064.
Las plantas de caña de azúcar transgénicas regeneradas, o las plantas de caña de azúcar transgénicas descendientes o semillas de caña de azúcar, producidas a partir de las plantas de caña de azúcar transgénicas regeneradas, se exploran respecto de un rasgo mejorado (por ejemplo, rendimiento aumentado), en comparación con una planta o semilla de control (una planta o semilla que carezca de expresión de la construcción de ADN recombinante). A partir de cada grupo de múltiples sucesos de plantas de caña de azúcar transgénicas con una construcción recombinante específica de la presente invención, el suceso que produce el rasgo más potenciado (por ejemplo, mayor potenciamiento del rendimiento) se identifica y se selecciona la semilla de caña de azúcar transgénica descendiente para desarrollo comercial.
Un señuelo de miARN compite con el gen diana endógeno por la unión a ese miARN particular y por lo tanto reduce el efecto del miARN en la red o redes bioquímicas que implican al miARN. Los señuelos incluyen secuencias señuelo de miARN endógenas (nativas), señuelos creados mediante manipulación de una secuencia endógena (por ejemplo, mediante mutagénesis química u otros o recombinación de sitio dirigido), y secuencias señuelo de miARN sintéticas. Puede diseñarse una construcción de ADN recombinante para expresar múltiples señuelos de miARN. Las ventajas de una estrategia de señuelo de miARN incluyen el hecho de que no se expresa proteína, y debido a que los miARN a menudo pertenecen a múltiples familias de genes (en las que cada gen de miARN produce un transcrito primario de miARN único) un solo señuelo de miARN es útil para unirse a un miARN maduro que procede de más de un gen o transcrito primario de miARN.
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