KR101793753B1 - 커플링방지 단백질 ２(ｕｃｐ２)에 대한 천연 안티센스 전사체의 저해에 의한 ｕｃｐ２ 관련 질환의 치료 - Google Patents

커플링방지 단백질 ２(ｕｃｐ２)에 대한 천연 안티센스 전사체의 저해에 의한 ｕｃｐ２ 관련 질환의 치료 Download PDF

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Abstract

본 발명은 특히, 커플링 방지 단백질 2(UCP2)의 천연 안티센스 폴리뉴클레오타이드를 표적화함으로써, 커플링 방지 단백질 2(UCP2)의 발현 및/또는 기능을 조절하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드에 관한 것이다. 본 발명은 또한 이러한 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 확인 및 이의 UCP2 발현과 연관된 질병과 질환을 치료하는 용도에 관한 것이다.

Description

커플링방지 단백질 ２(ＵＣＰ２)에 대한 천연 안티센스 전사체의 저해에 의한 ＵＣＰ２ 관련 질환의 치료{TREATMENT OF UNCOUPLING PROTEIN 2 (UCP2) RELATED DISEASES BY INHIBITION OF NATURAL ANTISENSE TRANSCRIPT TO UCP2}
본 출원은 그 전체로서 본 발명의 참조문헌에 기초하여, 2009년 12월 23일자로 출원된 미국 임시특허출원 번호 61/289538의 우선성을 주장한다.
본 발명의 구체적인 예는 UCP2 및 이와 관련된 분자의 발현 및/또는 기능을 조절하는 올리고뉴클레오타이드를 포함한다.
DNA-RNA 및 RNA-RNA 하이브리드화는 DNA 복제, 전사 및 번역을 위시한 많은 관점의 핵산 기능에 중요하다. 하이브리드화는 또한 특정 핵산을 검출하거나 이의 발현을 변경하는 다양한 기술에 중추적인 역할을 한다. 안티센스 뉴클레오타이드들은, 예를 들어, 표적 RNA와 하이브리드화됨으로써 유전자 발현을 혼란시켜 RNA 스플라이싱, 전사, 번역 및 복제를 방해한다. 안티센스 DNA의 추가적인 특징은 DNA-RNA 하이브리드물이 대부분 유형의 세포에 존재하는 리보뉴클레아제 H 활성에 의해 절단되는 기질로서 사용되는 것이다. 안티센스 분자들은, 올리고데옥시뉴클레오타이드 (Oligodeoxynucleotides:ODNs)에 대한 경우와 같이, 세포로 전달될 수 있거나, 내재적인 유전자로부터 RNA 분자로서 발현될 수 있다. 미국식약청(FDA)은 최근 안티센스 약물, VITRAVENE™(거대세포바이러스 망막염(cytomegalovirus retinitis)의 치료제)을 허가하였고 이는 안티센스물이 치료적 유용성을 가지고 있다는 것을 반영한다.
본 요약은 본 발명의 본질과 실체를 간단하게 적시하고자 본 발명의 요약을 보이기 위해 제공된다. 이는 청구범위의 범위와 의미를 해석하거나 제한하는 것으로 사용되어서는 안된다는 것으로 이해되면서 제시된 것이다.
일 구체예에서, 본 발명은 천연 안티센스 전사체의 임의의 부위에 표적화된 안티센스 올리고뉴클레오타이드(들)을 이용하여 천연 안티센스 전사체의 활동을 저해하는 방법으로서, 상응하는 센스 유전자의 상향 조절을 결과하는 방법을 제공한다. 또한, 천연 안티센스 전사체의 저해는 siRNA, 리보자임류 및 소분자들에 의해서 이루어질 수 있는 것에 관한 것으로, 이들은 본 발명의 범위에 속한다.
일 구체예는 생체 내 또는 시험관 내 환자의 세포 또는 조직에서 UCP2 폴리뉴클레오타이드의 기능 및/또는 발현을 조절하는 방법으로서, 상기 세포 또는 조직을 5 내지 30 개 뉴클레오타이드 길이의 안티센스 올리고뉴클레오타이드와 접촉시키는 것을 포함하는 방법이며, 상기 올리고뉴클레오타이드는 서열번호 2의 뉴클레오타이드 1 내지 243 또는 서열 번호 3의 뉴클레오타이드 1 내지 802 내에 있는 5 내지 30 개 연속 뉴클레오타이드들을 포함하는 폴리뉴클레오타이드의 역상보체에 적어도 50% 서열 상동성을 가지는 것을 특징으로 하며, 이럼으로써, 생체 내 또는 시험관 내 환자 세포 또는 조직에서 UCP2 폴리뉴클레오타이드의 기능 및/또는 발현을 조절한다.
일 구체예에서, 상기 올리고뉴클레오타이드는 UCP2 폴리뉴클레오타이드들, 예를 들어, 서열 번호 2와 3에 설정된 뉴클레오타이드들 및 이의 임의의 변이체, 대립유전자, 상동체, 변이체, 유도체, 단편 및 상보서열의 천연 안티센스 서열을 표적화한다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드들의 예는 서열 번호 4 내지 14에 설정되어 있다.
다른 구체예는 생체 내 또는 시험관 내 환자 세포 또는 조직에서 UCP2 폴리뉴클레오타이드의 기능 및/또는 발현을 조절하는 방법을 제공하는 것으로서, 상기 방법은 상기 세포나 조직을 5 내지 30 개 뉴클레오타이드 길이의 안티센스 올리고뉴클레오타이드와 접촉시키는 것을 포함하며, 상기 올리고뉴클레오타이드는 UCP2 폴리뉴클레오타이드의 안티센스물의 역 상보체에 적어도 50% 서열 상동성을 가지는 것을 특징으로 하며, 이로써, 생체 내 또는 시험관 내 환자 세포나 조직에서 UCP2 폴리뉴클레오타이드의 기능 및/또는 발현을 조절한다.
다른 구체예는 생체 내 또는 시험관 내 환자 세포 또는 조직에서 UCP2 폴리뉴클레오타이드의 기능 및/또는 발현을 조절하는 방법을 제공하는 것으로서, 상기 방법은 상기 세포 또는 조직을 5 내지 30 개 뉴클레오타이드 길이의 안티센스 올리고뉴클레오타이드와 접촉하는 것을 포함하고, 상기 올리고뉴클레오타이드는 UCP2 안티센스 폴리뉴클레오타이드에 대한 안티센스 올리고뉴클레오타이드에 적어도 50% 서열 상동성을 가지는 것을 특징으로 하며, 이로써 생체 내 또는 시험관 내 환자 세포 또는 조직에서 UCP2 폴리뉴클레오타이드의 기능 및/또는 발현을 조절한다.
일 구체예에서, 조성물은 센스 및/또는 안티센스 UCP2 폴리뉴클레오타이드들과 결합하는 하나 이상의 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 포함한다.
일 구체예에서, 상기 올리고뉴클레오타이드들은 하나 이상의 개질된 또는 치환된 뉴클레오타이드들을 포함한다.
일 구체예에서, 상기 올리고뉴클레오타이드들은 하나 이상의 개질된 결합을 포함한다.
다른 구체예에서, 상기 개질된 뉴클레오타이드들은 포스포로티오에이트, 메틸포스포네이트, 펩타이드 핵산류, 2'-O-메틸, 플루오로- 또는 카본, 메틸렌 또는 다른 잠금 핵산(locked nucleic acid:LNA)분자를 포함하는 개질된 염기를 포함한다. 바람직하게는, 상기 개질된 뉴클레오타이드들은 α-L-LNA를 위시한 잠금 핵산 분자이다.
일 구체예에서, 상기 올리고뉴클레오타이드들은 피하, 근육 내, 정맥 내 또는 복강 내 투여된다.
일 구체예에서, 상기 올리고뉴클레오타이드들은 약학 조성물로 투여된다. 치료 섭생법은 상기 안티센스 화합물을 환자에 적어도 한번 투여하는 것을 포함한다; 그러나 이러한 치료는 시간에 걸쳐 다중 투여량을 포함하는 것으로 변경될 수 있다. 상기 치료는 하나 이상의 다른 요법과 조합될 수 있다.
일 구체예에서, 상기 올리고뉴클레오타이드들은 리포좀에 캡슐화되거난 담체 분자(예컨대, 콜레스테롤, TAT 펩타이드)에 부착될 수 있다
다른 관점들은 하기 설명된다.
도 1은 HEPG2 세포를 리포펙타민(Lipofectamine)2000을 사용하여 도입된 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오타이드로 처리한 후, 대조군과 비교하여, UCP2 mRNA에서의 배수 변화 + 표준 편차를 나타내는 실시간 PCR 결과의 도면이다. 실시간 PCR 결과, HEPG2 세포에서의 UCP2 mRNA 수준은 UCP2 안티센스에 대해 설계된 올리고들 중 하나로 처리한 지 48 시간 후에 유의하게 증가 된다는 것으로 나타난다. CUR-1132, CUR-1129, CUR-1130, CUR-1131, CUR-1133, CUR-1136, CUR-1138, CUR-1137, CUR-1135, 및 CUR-1134로 표시되는 막대는 서열번호 4 내지 14로 처리된 샘플과 각각 상응한다.
서열 목록 설명 - 서열번호 1: 호모 사피엔스 커플링방지 단백질 2(미토콘드리아성, 양성자 전달체)(UCP2), 미토콘드리아 단백질을 암호화하는 핵 유전자, mRNA(NCBI 수탁 번호: NM_003355); 서열번호 2: 천연 UCP2 안티센스 서열 Hs.627373; 서열번호 3: 천연 UCP2 안티센스 서열 sorglawbu.aApr07 ucp2; 서열번호 4 내지 14: 안티센스 올리고뉴클레오타이드. *는 포스포티오에이트 결합을 표시한다.
본 발명의 몇 가지 관점은 실시 적용 예를 참조하여 하기에 설명된다. 수많은 특정 상세내용, 연관성 및 방법들은 본 발명의 완전한 이해를 위해 설정된 것임을 염두 하여야 한다. 그러나, 해당 분야의 통상적인 기술자는 본 발명이 상기 하나 이상의 특정 상세내용 없이 또는 다른 방법을 사용하여 실행될 수 있다는 것을 쉽게 인식할 수 있을 것이다. 본 발명은, 특정 행위들이 다른 행위나 사건들과 상이한 순서로 및/또는 동시에 일어날 수 있는 것과 같이, 행위나 사건의 순서에 제한되지 않는다. 더욱이, 설명된 모든 행위나 사건들이 본 발명에 따른 방법을 이행하는 데 요구되는 것은 아니다.
본 발명에서 개시된 모든 유전자, 유전자명, 및 유전자 산물은 본 발명에서 개시된 조성물과 방법들이 적용될 수 있는 임의의 종으로부터의 동족체에 상응하는 것으로 의도된다. 따라서, 용어들은, 인간과 마우스로부터 나온 유전자와 유전자 산물을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 특정 종으로부터 나온 유전자 또는 유전자 산물이 개시될 때, 이러한 개시내용은 예증하기 위해 의도된 것으로, 그것이 나타나는 맥락이 명백하게 지시하지 않는 한, 제한물로서 해석되어서는 안된다는 것으로 이해된다. 따라서, 예를 들어, 본 발명에서 개시된, 특정 구체예에서 포유동물 핵산 및 아미노산 서열에 관련된 유전자들은 다른 포유동물, 어류. 양서류, 파충류 및 조류를 포함하나 이에 한정되지 않는 다른 동물에서 나온 상동성 및/또는 이종상동성 유전자 및 유전자 산물을 포함하는 것으로 의도된 것이다. 특정 구체예에서, 유전자 또는 핵산 서열은 인간의 것이다.
정의
본 발명에서 사용된 용어는 특정 구체예만을 설명하기 위한 것이나, 본 발명을 제한하고자 함은 아니다. 본 발명에서 사용하는 단수 형태의 용어는 그 맥락에서 명백히 별다르게 지적하지 않는 한, 복수 형태 또한 포함한다. 더욱이, 용어"위시한", "위시하다", "가지는" "가지다", "지닌" 또는 이의 변형형태의 용어들은, 그러한 용어들이 상세한 설명 및/또는 청구범위에서 사용되는 정도까지, 용어 "포함하는"과 유사한 방식으로 사용되는 것으로 의도된 것이다.
용어 "약" 또는 "대략"은 당해분야의 통상의 기술자에 의해 결정되는 바와 같이 특정 값의 수용할 만한 오차 범위내에 있는 것을 의미하며, 이는 부분적으로, 그 수치가 어떻게 측정되거나 또는 결정되는 지, 예컨대, 측정 시스템의 한계에 달려있다. 예를 들어, "약"은 당해 분야의 실시당 1 또는 1 이상의 표준 편차 내를 의미할 수 있다. 대안적으로, "약"은 주어진 값의 20%까지, 바람직하게는 10%까지, 더욱 바람직하게는 5%까지, 및 더더욱 바람직하게는 1%까지의 범위를 의미할 수 있다. 또한, 생물학적 시스템이나 과정과 특히 관련하여, 상기 용어는 주어진 값의 배율 범위 내, 바람직하게는 5-배 내, 및 더욱 바람직하게는 2-배 내를 의미할 수 있다. 특정 값이 적용 예와 청구범위에 사용되는 경우, 별다른 언급이 없으며, 그런 특정 값에 대한 허용할 수 있는 오차 범위 내를 의미하는 용어 "약"이 있는 것으로 가정되어야 한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "mRNA"는 표적화된 유전자의 현재 공지된 mRNA 전사체(들) 및 설명될 수 있는 임의의 추가 전사체들을 의미한다.
용어"안티센스 올리고뉴클레오타이드들" 또는 "안티센스 화합물"은 다른 RNA 또는 DNA (표적 RNA, DNA)에 결합하는 RNA 또는 DNA 분자를 의미한다. 예를 들어, 그것이 RNA 올리고뉴클레오타이드이라면, RNA-RNA 상호작용에 의해 다른 RNA 표적에 결합하며 표적 RNA의 활성을 변경시킨다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 특정 폴리뉴클레오타이드의 발현 및/또는 기능을 상향 또는 하향 조절할 수 있다. 상기 정의는 치료, 진단 또는 다른 관점에서부터 유용한 임의의 외부 RNA 또는 DNA 분자를 포함하는 것으로 의미한다. 그러한 분자들은, 예를 들어, 안티센스 RNA 또는 DNA 분자들, 간섭 RNA(interference RNA:RNAi), 마이크로 RNA, 디코이(decoy) RNA 분자들, siRNA, 효소성 RNA, 치료성 편집(therapeutic editing) RNA 및 효현제(agonist)와 길항제 RNA, 안티센스 올리고머성 화합물, 안티센스 올리고뉴클레오타이드들, 외부 가이드 서열(External Guide Sequence: EGS) 올리고뉴클레오타이드들, 차등 스플라이서, 프라이머, 프로브 및 상기 표적 핵산의 적어도 일부분에 하이브리드화 하는 다른 올리고머성 화합물을 포함한다. 그러한 것으로서, 이러한 화합물들은 단쇄, 이중 쇄, 부분적으로 단쇄 또는 환형 올리고머성 화합물의 형태로 도입될 수 있다.
본 발명의 맥락에서, 용어 "올리고뉴클레오타이드"는 리보핵산(RNA) 또는 데옥시리보핵산(DNA) 또는 이의 의태체의 올리고머 또는 폴리머를 지칭한다. 용어 "올리고뉴클레오타이드"는 또한 데옥시리보뉴클레오시드, 리보뉴클레오시드, 이의 치환 및 알파-아노머성 형태, 펩타이드 핵산(peptide nucleic acid: PNA), 잠금 핵산(locked nucleic acid : LNA), 포스포로티오에이트, 메틸포스포네이트, 등을 위시한 천연 및/또는 개질 단량체나 연결체의 선형 또는 환형 올리고머를 포함한다. 올리고뉴클레오타이드들은 왓슨-크릭 유형의 염기쌍, 호외그스틴(Hoogsteen) 또는 역 호외그스틴 유형의 염기쌍과 같은 단량체 대 단량체 상호작용의 규척적 패턴 방식으로 표적 폴리뉴클레오타이드에 특이적으로 결합할 수 있다.
상기 올리고뉴클레오타이드는 "키메릭", 즉 상이한 부위로 구성될 수 있다. 이러한 맥락에서, "키메릭" 화합물은, 예를 들어, DNA 부위(들), RNA 부위(들), PNA 부위(들) 등과 같은 두 개 이상의 화학적 부위를 포함하는 올리고뉴클레오타이드들이다. 각 화학적 부위는 적어도 하나의 단량체 유닛, 즉 올리고뉴클레오타이드 화합물의 경우 뉴클레오타이드로 구성된다. 이러한 올리고뉴클레오타이드들은 일반적으로 하나 이상의 소정의 특징을 나타내기 위해 올리고뉴클레오타이드가 개질된 적어도 하나의 부위를 포함한다. 상기 올리고뉴클레오타이드의 소정의 특징은, 예를 들어, 뉴클레아제에 대한 향상된 저항, 증가된 세포 흡입 및/또는 표적 핵산에 대한 증가된 결합 친화도를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 상기 올리고뉴클레오타이드의 다른 부위는 따라서 다른 특성을 가질 수 있다. 본 발명의 키메릭 올리고뉴클레오타이드들은, 전술한 바와 같이, 두 개 이상의 올리고뉴클레오타이드, 개질된 올리고뉴클레오타이드, 올리고뉴클레오시드 및/또는 올리고뉴클레오타이드 유사체의 혼합된 구조체로서 형성될 수 있다.
상기 올리고뉴클레오타이드는 단량체가 천연 DNA에서와 같이 연속적으로 연결될 때 또는 스페이스를 통해 연결될 때, "등록처"에서 연결될 수 있는 부위로 구성될 수 있다. 상기 스페이서는 상기 부위 간의 공유결합성 "다리"를 구성하며 바람직한 경우에 약 100 개 탄소 원자를 넘지 않는 길이로 의도된다. 상기 스페이서는, 상이한 기능성, 예를 들어, 양 또는 음전하를 가지는 기능성을 보유하고, 특정 핵산 결합 특성(인터칼레이터, 그루브 바인더, 톡신, 플루오로포 등)을 보유하며, 친유성이면서 예를 들어, 알파-나선을 유도하는 알라닌 함유 펩타이드와 같은 특수한 이차 구조를 유도할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "UCP2" 및 "커플링 방지 단백질 2"는 모든 동족 구성원, 변이체, 대립유전자, 단편물, 동종체, 코딩 및 비코딩 서열, 센스 및 안티센스 폴리뉴클레오타이드 본쇄 등을 포함한다.
본 명세서에서 사용된 바, 용어 커플링방지 단백질 2, UCP2, BMIQ4, 미토콘드리아성 커플링방지 단백질 2, SLC25A8, UCP 2, UCPH, 커플링방지 단백질 2(미토콘드리아성 양성자 전달체)는 동일한 것으로 간주 되며 상호 교환적으로 사용된다.
본 명세서에서 사용된 바, 용어 "-에 특이적인 올리고뉴클레오타이드" 또는 "-을 표적화하는 올리고뉴클레오타이드"는 (i) 표적화된 유전자의 일부분과 안정한 복합체를 형성할 수 있는, 또는 (ii) 표적화된 유전자의 mRNA 전사체의 일부분과 안정한 듀플렉스를 형성할 수 있는 서열을 가지는 올리고뉴클레오타이드을 지칭한다. 상기 복합체 및 듀플렉스의 안정성은 이론적 계산 및/또는 시험관 내 시험에 의해서 결정될 수 있다. 하이브리드화 복합체 및 듀플렉스의 안정성을 결정하는 시험의 예는 후술하는 실시예에 설명된다.
본 명세서에서 사용된 바, 용어 "표적 핵산"은 DNA, 그러한 DNA로부터 전사된 RNA(프리-mRNA 및 mRNA를 포함하는), 그러한 RNA로부터 유도된 cDNA, 코딩, 비코딩 서열, 센스 또는 안티센스 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 올리고머성 화합물과 그의 표적 핵산과의 특이적 하이브리드화는 상기 핵산이 정상적인 기능을 간섭한다. 표적 핵산의 기능을, 이것과 특이적으로 하이브리드화하는 화합물에 의해 조절하는 것을 일반적으로 "안티센스"라고 칭한다. 간섭될 DNA의 기능은, 예를 들어, 복제 및 전사를 포함한다. 간섭될 RNA의 기능은, 예를 들어, RNA를 단백질 번역 장소로 이동하는 것, RNA로부터 단백질의 번역, RNA를 스플라이싱하여 하나 이상의 mRNA 종을 생성하는 것, 및 RNA가 연루되거나 용이하게 될 수 있는 촉매 활성과 같은 모든 기능을 포함한다. 표적 핵산 기능의 그러한 간섭의 전체 효과는 코딩된 생성물 또는 올리고뉴클레오타이드들의 발현 조절이다.
RNA 간섭 "RNAi"은 "표적" 핵산 서열과 서열 특이적 상동성을 가지는 이중쇄 RNA(dsRNA) 분자에 의해 매개된다. 본 발명의 특정 구체예에서, 상기 매개체는 5 내지 25개 뉴클레오타이드 "소 간섭" RNA 듀플렉스(siRNA)이다. siRNA들은 다이서로 알려진 RNase 효소에 의한 dsRNA의 공정으로부터 유도된다. siRNA 듀플렉스 생성물은 RISC(RNA Induced Silencing Complex)로 지칭되는 다중-단백질 siRNA 복합체에 사용된다. 임의의 특정 이론에 얽매이지 않고, RISC는 이 후 표적 핵산(적절하게는 mRNA)로 인도되는 것으로 믿어지며, 여기서 siRNA 듀플렉스는 서열 특이적 방식으로 상호작용하여 촉매적 방식으로 절단하게 한다. 본 발명에 따라 사용될 수 있는 소분자 간섭 RNA들은 당해 분야의 공지되고 및 통상의 기술자에 익숙한 방식에 따라 합성되고 사용될 수 있다. 본 발명의 방법에 사용되는 소분자 간섭 RNA는 적절하게는 약 1 내지 약 50 개 뉴클레오타이드 (nt)를 포함한다. 비제한적 구체예의 예에서, siRNA는 약 5 내지 약 40개 nt, 약 5 내지 약 30개 nt, 약 10 내지 약 30개 nt, 약 15 내지 약 25개 nt, 또는 약 20-25개 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.
적절한 올리고뉴클레오타이드들의 선택은 핵산 서열을 자동적으로 배열하고 동일성 또는 상동성의 부위를 지시하는 컴퓨터 프로그램을 사용함으로써 이행될 수 있다. 그러한 프로그램을 사용하여, 예를 들어, GenBank와 같은 데이터베이스를 검색함으로써 또는 PCR 산물을 서열분석함으로써 얻어진 핵산 서열들을 비교할 수 있다. 일정 종으로부터 얻은 핵산 서열을 비교하면, 종 간의 적절한 정도의 동일성을 보이는 핵산 서열을 선택할 수 있다. 서열화 되지 않은 유전자의 경우, 서던 블랏을 수행하여 표적 종과 다른 종의 유전자 간에 동일성 정도를 결정한다. 당해 분야에서 공지된 바와 같이, 서던 블랏을 다양한 엄중성 (stringency)에서 수행함으로써, 동일성의 적절한 척도를 얻는 것이 가능하다. 이러한 방식은 조절될 개체의 표적 핵산 서열과 고도의 상보성을 그리고 다른 종의 상응하는 핵산 서열에는 낮은 정도의 상보성을 나타내는 올리고뉴클레오타이드들을 선택할 수 있게 한다. 당해 분야의 기술자는 본 발명에 사용하기에 적절한 유전자 부위를 선택하는 데 상당한 여유가 있다는 것을 인식할 것이다.
"효소성 RNA"는 효소 활성을 가지는 RNA 분자를 의미한다(Cech, (1988) J. American. Med. Assoc. 260, 3030-3035). 효소성 핵산(리보자임)은 일단 표적 RNA에 결합함으로써 작용한다. 그러한 결합은 표적 RNA를 절단하는 작용을 하는 분자의 효소성 부위에 근접되게 확보되어 있는 효소성 핵산의 표적 결합 부위를 통해 일어난다. 따라서, 상기 효소성 핵산은 먼저 염기쌍을 통해 표적 RNA를 인식한 후 결합하며, 일단 정확한 부위에 결합되면, 표적 RNA를 효소적으로 절단하도록 작용한다.
"디코이 RNA"는 리간드에 대한 천연 결합 도메인을 모사한 RNA 분자를 의미한다. 따라서, 디코이 RNA는 특이적 리간드의 결합에 대하여 천연 결합 표적과 경쟁한다. 예를 들어, HIV 전사촉진반응(trans-activation response:TAR) RNA를 과발현시키면, "디코이"로서 작용할 수 있고 효율적으로 HIV tat 단백질과 결합하고, 이럼으로써 HIV RNA에서 암호화된 TAR 서열에 결합하는 것을 방지하게 한다는 것이 밝혀졌다. 이것은 특정 예인 것이다. 해당 분야의 기술자는 이것은 단지 하나의 예일 뿐이고, 다른 구체예는 해당 분야에 일반적으로 공지된 기술을 사용하여 용이하게 수행될 수 있음을 인식하게 될 것이다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "단량체"는 일반적으로 포스포디에스테르 결합 또는 이의 유사체에 의해 연결되어 예를 들어, 약 3-4 내지 약 수백 단량체 단위물의 크기 범위의 올리고뉴클레오타이드를 형성하는 단량체를 지칭한다. 포스포다이에스테르 연결체의 유사체는, 후술하는 바와 같이, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 메틸포스포네이트, 포스포셀레노에이트, 포스포아미데이트 등을 포함한다.
용어 "뉴클레오타이드"는 천연 발생적 뉴클레오타이드는 물론 비천연 발생적 뉴클레오타이드를 포함한다. "비천연적 발생"으로 예전에 간주된 다양한 뉴클레오타이드들이 자연에서 연속적으로 발견되어 있는 것은 해당 분야의 숙련자에게 명백하다. 따라서, "뉴클레오타이드"는 공지된 퓨린 및 피리미딘 헤테로사이클-함유 분자뿐 아니라, 이의 헤테로시클릭 유사체 및 호변이성질체를 포함한다. 다른 유형의 뉴클레오타이드들의 예증적 실례는 아데닌, 구아닌, 티민, 시토신, 유라실, 퓨린, 크산틴, 디아미노퓨닌, 8-옥소-N6-메틸아데닌, 7-데아자크산틴, 7-데아자구아닌, N4,N4-에탄오시토신, N6,N6-에탄오-2,6-디아미노퓨린, 5-메틸시토신, 5-(C3-C6)-알키닐시토신, 5-플루오로유라실, 5-브로모유라실, 슈도이소시토신, 2-하이드록시-5-메틸-4-트리아졸로피리딘, 이소시토신, 이소구아닌, 이소신을 함유하는 분자 및 Benner 등의, 미국 특허 제5,432,272호에 설명된 "비천연 발생" 뉴클레오타이드이다. 용어 "뉴클레오타이드"는 이러한 예의 모든 및 전체는 물론 이의 유사체와 호변이성질체를 망라하도록 의도된 것이다. 특히 관심이 있는 뉴클레오타이드들은 아데닌, 구아닌, 티민, 시토신, 및 유라실을 포함하는 것으로, 이들은 인간에게 치료 및 진단 적용과 관련하여 천연적으로 발생하는 뉴클레오타이드들로 간주되고 있다. 뉴클레오타이드들은, 예를 들어, Kornberg and Baker, DNA Replication, 2nd Ed. (Freeman, San Francisco, 1992)에서 설명된 바와 같이, 천연 2'-데옥시 및 2'-하이드록시 당은 물론 이들의 유사체를 포함한다.
뉴클레오타이드와 관련한 "유사체"는 개질된 염기 분체 및/또는 개질된 당 분체를 가지는 합성 뉴클레오타이드들을 포함한다(참고, Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York, 1980; Freier & Altmann, (1997) Nucl. Acid. Res., 25(22), 4429- 4443, Toulme, J.J., (2001) Nature Biotechnology 19:17-18; Manoharan M., (1999) Biochemica et Biophysica Acta 1489:117-139; Freier S. M., (1997) Nucleic Acid Research, 25:4429-4443, Uhlman, E., (2000) Drug Discovery & Development, 3: 203-213, Herdewin P., (2000) Antisense & Nucleic Acid Drug Dev., 10:297-310); 2'-O, 3`-C-연결 [3.2.0] 바이사이클로아라비노뉴클레오시드류. 그러한 유사체들은 결합 특성, 예를 들면, 듀플렉스 또는 트리플렉스 안정성, 특이성들을 향상시키도록 고안된 합성 뉴클레오타이드를 포함한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "하이브리드화"는 올리고머성 화합물의 실질적으로 상보적인 본쇄들의 짝짓기를 의미한다. 짝짓기의 한 기작은 수소 결합이고, 올리고머성 화합물의 본쇄들의 상보적 뉴클레오시드나 뉴클레오타이드 염기들 (뉴클레오타이드들) 간의 왓슨-크릭, 호외그스틴 또는 역 호외그스틴 수소 결합일 수 있는 수소 결합을 포함한다. 예를 들면, 아데닌과 티아민은 상보적인 뉴클리오타이드로써 수소결합을 통해 짝지워진다. 이처럼 하이브리드화는 다양한 상황들에서 이루어질 수 있다.
안티센스 화합물은 화합물의 표적 핵산과 결합이 상기 표적 핵산의 정상적 기능을 방해하여 기능 및/또는 활성의 변화를 야기하고, 특이적 결합이 요청되는 조건 하, 예를 들어, 생체 내 분석이나 치료적 처치의 경우에서 생리적 조건 및 시험관 내 시험의 경우 시험이 실행되는 조건 하에서, 상기 안티센스 화합물이 비-표적 핵산 서열에 비특이적 결합을 회피할 충분한 정도의 상보성이 있을 때 "특이적으로 하이브리드화"될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 어구 "엄격한 하이브리드화 조건" 또는 "엄격한 조건"은 본 발명의 화합물이 이의 표적 서열과 하이브리드화되지만, 최소한의 수의 다른 서열과 하이브리드화되는 조건을 지칭한다. 엄격한 조건은 서열 의존적이고 상이한 환경에서 상이하게 될 것이며, 본 발명의 맥락에서는, 올리고머성 화합물이 표적 서열과 하이브리드화 되는 "엄격한 조건"은 올리고머 화합물의 특성과 조성, 및 이들이 시험 되는 시험법에 의해 결정된다. 일반적으로, 엄격한 하이브리드화 조건은 Na++ 또는 K++와 같은 무기 양이온을 가진 낮은 염 농도(<0.15M)(예 낮은 이온 강도), 20℃ 내지 25℃ 이상의 온도, 올리고머성 화합물:표적 서열 듀플렉스의 Tm 이하, 및 포름아미드, 디메틸포름아미드, 디메틸 설폭사이드, 또는 디터전트 소듐 도데실 설페이트(Sodium dodecyl sulfate:SDS)와 같은 변성제의 존재를 포함한다. 예를 들어, 하이브리드화율은 각 1% 포름아미드에 대하여 1.1% 감소한다. 고 엄격 하이브리드화 조건의 예는 60° C에서 30분간의 0.1X 염화 나트륨-소듐 사이트레이트 완충액(Sodium chloride-sodium citrate buffer : SSC)/0.1%(w/v) SDS이다.
"상보적"은, 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 하나 또는 두 개 올리고머 본쇄 상에서 두 개 뉴클레오타이드 사이의 정확한 짝짓기 능력을 지칭한다. 예를 들어, 안티센스의 특정 위치의 뉴클레오 염기가 DNA, RNA, 또는 올리고뉴클레오타이드 분자인 표적 핵산의 특정 위치의 뉴클레오 염기와 수소 결합을 할 수 있다면, 올리고뉴클레오타이드 및 표적 핵산 간의 수소 결합 위치는 상보적 위치라고 간주된다. 올리고머성 화합물 및 추가의 DNA, RNA, 또는 올리고뉴클레오타이드 분자는 각 분자에서의 충분한 수의 상보적 위치가 서로 수소 결합할 수 있는 뉴클레오타이드에 의해 점유될 때, 서로 상보적이다. 따라서, "특이적으로 하이브리드화" 및 "상보적"은 충분한 수의 뉴클레오타이드에 걸쳐 충분한 정도의 정밀한 짝짓기 또는 상보성을 지칭하는, 따라서 안정하고 특이적 결합이 올리고머성 화합물과 표적 핵산 사이에 일어나게 되는 것으로 사용되는 용어이다.
올리고머성 화합물의 서열은 특이적으로 하이브리드화될 수 있는 이의 표적 핵산의 것과 100% 상보적일 필요가 없다는 것은 해당분야에서 이해되는 것이다. 더구나, 올리고뉴클레오타이드는 하나 이상의 분체와 하이브리드화되어, 개재 또는 인접 분체가 그 하이브리드화에 포함되지 않는다(예컨대, 루프 구조, 오류짝, 또는 헤어핀 구조). 본 발명의 올리고머성 화합물은 이것이 표적화되는 표적 핵산 서열 내에서의 표적 부위와 적어도 약 70%, 또는 적어도 약 75%, 또는 적어도 약 80%, 또는 적어도 약 85%, 또는 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 99% 서열 상보성을 포함한다. 예를 들어, 안티센스 화합물에서 그 화합물의 20 개 뉴클레오타이드들 중 18개가 표적 부위에 상보적이고 따라서 특이적으로 하이브리드화할 수 있는 안티센스 화합물은 90 퍼센트 상보성을 나타낸다. 이 예에서, 나머지 비상보성 뉴클레오타이드들은 모여있거나 상보성 뉴클레오타이드들 중간에 섞여있을 수 있고 서로 또는 상보적 인접하거나 뉴클레오타이드들에 인접되어 있을 필요는 없다. 그러한 것으로서, 표적 핵산과 완전한 상버성인 두 개의 부위 측면에 위치한 4 개의 비상보적 뉴클레오타이드를 가지는 18 개 뉴클레오타이드들인 안티센스 화합물은 표적 핵산과 전체 77.8% 상보성을 가지며 따라서 본 발명의 범위에 포함된다. 표적 핵산의 부위와의 안티센스 화합물의 퍼센트 상보성은 당해 분야에 공지된 BLAST 프로그램(basic local alignment search tools) 및 PowerBLAST 프로그램을 사용하여 일반적으로 결정될 수 있다. 퍼센트 상동성, 서열 일치성 또는 상보성은 예를 들어, Smith 및 Waterman의 알고리즘(Adv. Appl. Math., (1981) 2, 482-489)을 이용하는 디폴트 세팅값을 사용하는 Gap 프로그램(Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 Unix 용, Genetics Computer Group, University Research Park, Madison Wis.)을 사용함으로써 결정될 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "열적 용융점(Thermal Melting Point:Tm)"은 정의된 이온 강도, pH 및 핵산 농도하에서, 표적 서열에 상보적인 올리고뉴클레오타이드들의 50%가 표적 서열과 평형적으로 하이브리드화되는 온도를 지칭한다. 일반적으로, 엄격한 조건은 염 농도가 pH 7.0 내지 8.3에서 적어도 약 0.01 내지 1.0 M Na 농도이고 온도가 짧은 올리고뉴클레오타이드 (예컨대, 10 내지 50 뉴클레오타이드들)에 대하여 적어도 약 30ºC인 그러한 조건이다. 엄격한 조건은 또한 포름아마이드와 같은 탈안정화제제의 첨가로 달성될 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "조절"은 유전자의 발현 증가 (자극) 또는 감소 (저해)를 의미한다.
폴리뉴클레오타이드 서열의 맥락에서 사용될 때, 용어 "변이체"는 야생형 유전자와 관련된 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 이러한 정의는 예를 들어, "대립형질성", "스플라이스", "종" 또는 "다형성" 변이체를 포함한다. 스플라이스 변이체는 참조 분자와 상당한 일치성을 가질 수 있지만, 일반적으로 mRNA 프로세싱 동안 엑손의 차등 스플라이싱 때문에 몇 개의 폴리뉴클레오타이드를 가진다. 상응하는 폴리펩타이드는 추가의 기능적 도메인을 가지거나 없을 수 있다. 종 변이체는 종에 따라 변화하는 폴리뉴클레오타이드 서열이다. 본 발명에서 특히 유용한 것은 야생형 유전자 산물의 변이체이다. 변이체는 핵산 서열에서 적어도 하나의 돌연변이에서 기인될 수 있고 그 구조나 기능이 변경되거나 되지 않을 수 있는 바뀐 mRNA 또는 폴리펩타이드를 결과할 수 있다. 임의의 주어진 천연 또는 재조합 유전자는 아무런 대립형질 형태, 하나 또는 여러 개 대립형질 형태를 가질 수 있다. 변이체를 야기하는 공통적인 돌연변이성 변화는 일반적으로, 뉴클레오타이드의 자연적인, 삭제, 첨가 또는 치환에 기인한다. 이러한 유형의 각 변화는 주어진 서열에서, 단독으로, 다른 것과 조합적으로 한번 이상으로 일어날 수 있다.
결과된 폴리펩타이드는 일반적으로 서로에 대하여 상당한 아미노산 일치성을 가지게 될 것이다. 다형성 변이체는 주어진 종의 개별체들간에 특정 유전자의 폴리뉴클레오타이드 서열에서의 변이이다. 다형성 변이체는 또한 "단일 뉴클레오타이드 다형성"(single nucleotide polymorphism:SNP) 또는 폴리뉴클레오타이드 서열이 하나의 염기에서 변화된 단일 염기 돌연변이를 포함할 수 있다. SNP의 존재는, 예를 들어, 감수성 대 저항성인, 질병 상태의 성향을 가지는 특정 인구분포를 표시할 수 있다.
유도체 폴리뉴클레오타이드들은 화학 변형, 예를 들어, 알킬, 아실 또는 아미노기에 의한 수소 치환 처리된 핵산을 포함한다. 유도체, 즉 유도체 올리고뉴클레오타이드는 변형된 당 분체 또는 중간 당 연결체와 같은 비천연 발생 부분을 포함할 수 있다. 이러한 것들의 예로 포스포로티오에이트 및 당해분야에 공지된 다른 활 함유 종이 있다. 유도체 핵산들은 또한, 방사능뉴클레오타이드, 효소, 형광제, 화학발광제, 발색제, 기질, 조효소, 저해체, 자기입자등을 위시한 표지체를 포함할 수 있다.
"유도체" 폴리펩타이드 또는 펩타이드는 글리코실화, PEG화, 포스포릴화, 황화, 환원/알칼화, 아실화, 화학 커플링 또는 순한 포르말린 처리에 의해 변형된 것이다. 유도체는 또한 방사능 동위원소, 형광체 미 효소 표지체를 포함하나 이에 한정되지 않는 검출가능한 표지체, 직접적으로 또는 간접적으로 포함하도록 변형될 수 있다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, 용어 "동물" 또는 "환자"는, 예를 들어, 인간, 양, 엘크, 사슴, 뮬 사슴, 밍크, 포유동물, 원숭이, 말, 소, 돼지, 염소, 개, 고양이, 래트, 생쥐, 새, 닭, 파충류, 어류, 곤충 및 거미류를 포함한다.
"포유동물"은 일반적으로 의료 보호하에 있는 온혈동물을 망라한다(예컨대, 인간 및 길들인 동물). 고양이과, 개과, 말과, 소과 및 영장류는 물론 인간을 예를 들 수 있다.
"치료하는 것" 또는 "치료"는 포유 동물에서 질병 상태의 치료를 망라하며 (a) 특히 그러한 포유동물이 상기 질병상태에 처해지기 쉽지만 그것을 가진 것으로 진단되지 않았을 때 포유동물에서 질병 상태가 발생하는 것을 예방하는 것; (b) 상기 질병상태를 저해하는 것, 예컨대, 발전되는 것을 정지시키는 것; 및/또는 (c) 질병 상태를 완화시키는 것, 예 바람직한 종말점에 다다를 때까지 질병 상태의 경감을 야기하는 것을 포함한다. 치료하는 것은 또한 질병의 증상의 개선을 포함하며 (예컨대, 고통 또는 불편의 감소), 여기서 그러한 증상은 질병에 직접적으로 영향을 줄 수도 주지 않을 수도 있다(예컨대, 원인, 전이, 발현 등).
본 발명에서 사용된 바와 같이, "암"은 포유동물에서 발견되는 모든 유형의 암 또는 신생물 또는 악성 종양을 지칭하는 것으로: 백혈병, 림프종, 흑색종, 암종 및 육종을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 암은 암의 악성 세포를 포함하는 "종양" 또는 조직으로서 그 자신을 증명하는 것이다. 종양의 예는: 섬유육종, 점액육종, 지방육종, 연골육종, 골원성 육종, 척색종, 혈관육종, 내피종, 림프관육종, 림프관내피육종, 활막종, 중피종, 유윙종양, 평활근육종 횡문근육종, 결장암종, 췌장암, 유방암, 난소암, 전립선 암, 편평세포암종, 기저세포암종, 선암종, 땀샘암종, 피지샘암종, 유두상 암종, 유두상 선암종, 낭선암종, 수질암종, 기관지원성암종, 신세포 암종, 간종양, 담관암종, 융모막암종, 정상피종, 태생기암종, 빌름스종양, 자궁경부암, 고환종양, 폐암종, 소세포폐암, 방광암종, 상피암종, 신경교종, 성상세포종, 수모세포종, 두개인두종, 상의세포종, 송과체종, 혈관모세포종, 청신경종, 핍지교종, 뇌수막종, 흑색종, 신경모세포종, 및 망막모세포종과 같은, 그러나 이에 한정되지 않는 육종 미 암종을 포함한다. 본 발명에 따른 개시된 조성물로 치료될 수 있는 다른 암은, 예를 들어, 호지킨씨병, 비호지킨림프종, 다발성골수종, 신경모세포종, 유방암, 난소암, 폐암, 횡문근육종, 원발성 혈소판증가증, 원발성 마크로글로블린혈증, 소세포폐종양, 원발성 뇌종양, 위암, 결장암, 악성 췌장인슐린종, 악성 유암종(carcinoid), 방광암, 위암, 전암성 피부 병변, 고환암, 림프종, 갑상선암, 신경모세포종, 식도암, 비뇨생식관암, 악성 고칼슘혈증, 자궁경부암, 자궁내막암, 부신피질암 및 전립선암을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
"신경 질병 또는 질환"은 신경계 및/또는 시각계의 임의의 질병 또는 질환을 지칭한다. "신경 질병 또는 질환"은 중추신경계(뇌, 뇌줄기 및 소뇌), 말초신경계(두개골 신경) 및 자율 신경계(이의 부분이 중추 및 말초 신경계 둘 다에 위치)를 포함하는 질환이나 질병을 포함한다. 신경 질병의 예는 두통, 혼미혼수(stupor and coma), 치매, 발작, 수면장애, 외상성 상해, 감염, 신생물, 신경안과, 운동장애, 탈수초성 질환, 척추 질환, 및 말초 신경, 근육 및 신경근육 접합부의 질환을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 중독 및 정신 질환은 조울증 및 정신분열증을 포함하나 이에 한정되지 않으며, 이들 또한 신경 질환의 정의에 포함된다. 본 발명에 따른 조성물 및 방법을 사용하여 치료될 수 있는 몇 가지 신경 질환, 증상, 징후 및 증후군들의 목록은 하기와 같다: 후천적발작성실어증; 급성 산재성 뇌척수염; 부신백질 이영양증; 노인 황반변성; 뇌량 무형성증(agenesis of the corpus callosum); 실인증; 에이카르디 증후군; 알렉산더병; 알퍼스병; 교대성 편마비; 혈관성치매; 근위축성 측삭경화증; 무뇌증; 안젤만 증후군; 혈관종증; 무산소증; 실어증; 실행증; 거미막 낭종; 거미막염; 아놀드-키아리 증후군; 동정맥기형; 아스퍼거 증후군; 모세혈관확장성 운동실조증; 주의력결핍 과잉행동장애; 자폐증; 자율신경 실조증; 요통; 바텐병; 베체트병; 벨 마비; 양성 본태성 눈꺼풀연축; 양성 국소; 근위축증; 양성 두개내 고혈압; 빈스뱅거병; 안검경련증; 블로흐 슐츠베르거(Bloch Sulzberger) 증후군; 상완신경총 손상; 뇌농양; 뇌손상; 뇌종양(다형성 교모세포종 포함); 척추종양; 브라운-세카르 증후군; 카나반병; 수근관 증후군; 작열통; 중추성 통증 증후군;중심성교탈수초증; 뇌 질환(cephalic disorder); 뇌동맥류; 뇌동맥 경화증; 뇌위축증; 뇌거인증; 뇌성마비; 샤리코-마리-투스병; 항암제 투여로 인한 말초신경증/신경병증성통증(chemotherapy-induced neuropathy and neuropathic pain); 키아리 증후군; 무도증; 만성 염증성 탈수초성 다발성 신경병증; 만성 통증; 만성 국부성 통증 증후군; 코핀-로우리 증후군; 혼수상태, 지속성 식물인간 상태를 포함하는; 선천성얼굴 양측마비; 기저피질 퇴하; 두개 동맥염; 두개골 유합증; 크로이츠펠트-야콥병; 누적 외상성 장애; 쿠싱 증후군; 거세포 봉입체증; 거대세포바이러스 감염증; 안구간대경련-근간대경련 증후군(dancing eyes-dancing feet syndrome); 댄디와커 증후군; 다우손 병; 드 모르지에 증후군(De Morsier's syndrome); 데저린-클룸키 마비(Dejerine-Klumke palsy); 치매; 피부근염; 당뇨병성 말초신경병증; 미만성 경화증; 자율신경장애; 난필증; 난독증; 긴장이상; 조기 영아 간질성뇌병증; 공터기안 증후군; 뇌염; 뇌탈출증; 스터지-웨버증후군(encephalotrigeminal angiomatosis); 간질; 에르브 마비; 본태성 진증; 파브리병; 파 증후군(Fahr's syndrome); 실신; 가족성 경련성 마비; 열성 경련(febrile seizures); 피셔증후군; 프리히드라이히 실조증; 전측두엽 치매 및 다른 "타우 단백질 질환(tauopathies)"; 고셰병; 게르스트만 증후군; 거대 세포동맥염; 거대세포 봉입병; 글로보이드 세포백질이영양증; 길랭-바레 증후군; HTLV-1-연관 척수병증; 할러포르텐-스파츠병; 두부외상; 두통; 반측안면경련; 유전성 연축성 대마비(hereditary spastic paraplegia); 유전성 다발신경염성 실조증; 이성대상포진; 대상포진; 히라야마 증후군; HIV-연관 치매 및 신경병증(또한, AIDS의 신경 징후); 완전 전뇌증; 헌팅톤 병 및 다른 폴리글루타민 반복 질병(polyglutamine repeat diseases); 수두 무뇌증; 수두증; 고코르티솔혈증; 저산소증; 면역매개성 뇌척수염; (포함체 근육염; 색소실조증; 영아 피탄산 저장병; 영아 레프섬병; 영아 연축; 염증성 근육병; 뇌내낭종; 두개내 압항진증; 주버트 증후군; 킴스-사이레 증후군(Keams-Sayre syndrome); 케네디 병 킨스번 증후군(Kennedy disease Kinsboume syndrome); 클리펠 파일 증후군; 크라베병; 쿠겔베르크-웰란더 병(Kugelberg-Welander disease); 쿠루; 라포라병; 램버트-이튼 근무력증후군; 랜도-크레프너 증후군; 발렌버그증후군과 외측 연수(발렌버그) 증후군(lateral medullary (Wallenberg) syndrome); 학습장애; 라이병; 레녹스-가스토 증후군; 레쉬-니한 증후군; 백질 이영양증; 루이 바디성 치매; 뇌회결손(Lissencephaly); 감금증후군; 루게릭병(예컨대, 운동신경 질환 또는 근위축성 측상 경화증); 요추 추간판 질환; 라임병-신경 후유증; 마차도-조셉병; 대뇌수증; 거대뇌수증; 멜커슨-로젠탈 증후군; 메니에르병; 뇌수막염; 멘케스병; 이염백질 이영양증; 소두증; 편두통; 밀러 피셔 증후군; 미세 뇌일혈; 사립체(mitochondrial) 근병증; 뫼비우스 증후군; 단지양 근위축증; 운동신경 질환; 모야모야병; 점액다당류증; 다발성 경색치매; 다초점성 운동신경병증; 다발성경화증 및 다른 탈수초성 질환; 체위성 저혈압을 가진 다계통 위축증; 근이영양증; 중증 근무력증; 수초탈락성 미만성 경화증; 영아의 간대성 근경련뇌증; 근육간대경련; 근이영양증; 선천성 근무력증; 기면증; 신경섬유종증; 신경마미성 악성 증후군; AIDS의 신경학적 징후; 루푸스의 신경학적 후유증; 신경근긴장증; 신경 세로이드 지방갈색소증; 신경세포 이주장애; 니만-피크병; 오설리반-맥레오드 증후군; 후두신경통; 초자연적 척추 이형성 속발(occult spinal dysraphism sequence); 오타하라 증후군; 올리브교소뇌 위축증; 안구간대경련 근간대경련; 시신경염; 기립성 저혈압; 운동과다증후군; 지각이상; 기저신경질환 또는 장애(파킨슨병, 헌팅톤병, 알츠하이머병, 근위축성측삭경화증(ALS), 치매, 다발성경화증 및 다른 신경세포사와 관련된 질환과 질병); 선천 이상근육긴장증; 부종양질환; 발작성공격; 패리 롬버그 증후군; 펠리쩨우스-메르쯔바하병; 주기적 마비; 말초신경병증; 통증 신경병증 및 신경질환성 통증; 지속적 식물인간 상태; 전반적 발달장애; 광반사 재채기; 피탄산 저장병; 피크병; 신경압박; 뇌하수체종양; 다발성근염; 공뇌증; 폴리 후 증후군(post-polio syndrome); 대상포진 후 신경통(post-herpetic neuralgia); 감염 후 뇌척수염; 체위성 저혈압; 프레이더-윌리 증후군(Prader- Willi syndrome); 원발성측삭경화증; 프리온 질환; 진행성 반안면 위측증; 진행성 다병소성백질뇌증; 진행성 경화성 폴리오디스트로피(progressive sclerosing poliodystrophy); 진행성 핵상마비; 가성뇌종양; 람세이-헌트 증후군 유형 I과 II(Ramsay-Hunt syndrome types I and 11); 라스무센 뇌염; 반사성 교감신경이영양 증후군; 레프섬병; 반복동작질환; 반복성 피로장애; 하지불안 증후군; 리트로바이더스-연관 척수병증; 레트 증후군(Rett syndrome); 레이 증후군(Reye's syndrome); 무도병; 샌드호프병; 쉴더병; 뇌갈림증; 시신경 형성장애; 흔들린 아이 증후군(shaken baby syndrome); 대상포진(shingles); 샤이-드레거 증후군; 쇼그랜 증후군; 수면무호흡; 소토 증후군(Soto's syndrome); 경직; 이분 척추증; 척추손상; 척추종양; 척추성 근위축; 전신근 강직증후군; 뇌졸중; 스터지-베버 증후군(Sturge-Weber syndrome); 아급성 경화성 범뇌염; 피질화 동맥경화성 뇌병증; 시드넘 무도병; 실신; 척수공동증; 지연성 운동장애; 타이-샥스병; 측두 동맥염; 견인척수손상; 톰슨병(Thomsen disease); 흉곽출구증후군; 유통성 티크(Tic Douloureux); 토트마비; 투어렛 증후군; 일과성 뇌허혈증; 전염성 해면체성 뇌병증; 횡단성 척추염; 외상성 뇌손상; 수전증호; 제3차 신경통; 열대경련성 의사부전마비; 결절성 경화증; 혈관성 치매(다발성 경색 치매); 측두동맥염을 포함하는 혈관염; 폰 히펠-린다우병; 왈렌버그 증후군(Wallenberg's syndrome); 베르니크-호프만 병(Werdnig-Hoffman disease); 웨스트 증후군; 편타성; 윌리암 증후군; 윌돈 병(Wildon's disease); 및 젤웨거 증후군.
심혈관 질병이나 질환은 허혈을 야기할 수 있거나 또는 심장의 재관류에 의해 야기되는 것들을 포함한다. 이의 예는, 죽상동맥경화증, 관상동맥질환, 육아종 심근염, 만성 심근염(비육아종), 원발성 비후성 심근증, 말초동맥질환(Peripheral artery disease:PAD), 말초혈관질환, 정맥 혈전증, 폐색전증, 협심증, 심근경색증, 심정지에 의한 심혈관 조직 손상, 심장 우회술에 의한 심혈관 조직 손상, 심장성 쇼크, 및 당해분야의 통상의 기술자에 알려진 또는 심장이나 맥관 구조의 기능장애나 이에 대한 조직 손상, 특히, 하지만 이에 제한되지 않는, GH 활성화에 관련된 조직 손상을 포함하는 관련 조건을 포함하나 이에 한정되지 않는다. CVS 질병은, 죽상동맥경화증, 육아종 심근염, 심근경색, 심장판막증에 부차적인 심근 섬유증, 무경색 심근 섬유증, 원발성 비후성 심근병증, 및 만성 심근염(비육아종)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
"염증"은 전신적 염증성 상태 및 단핵구, 백혈구 및/또는 호중구의 이동과 견인과 국소적으로 연관된 상태를 지칭한다. 염증의 예는, 병원성 유기체(그람-양성 세균, 그람-음성 세균, 바이러스, 진균, 및 원생동물과 유충 같은 기생충을 포함하는)에 의한 감염, 이식 거부 (신장, 간, 심장, 폐 또는 각막과 같은 고형 기관의 거부는 물론 이식편 대 숙주 병(graft-versus-host disease:GVHD)을 포함한 골수 이식의 거부를 포함하는), 또는 국소화된 만성 또는 급성 자가면역 또는 알레르기 반응에서 기인한 염증을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 자가면역 질환은 급성 사구체신염; 류마티스 또는 반응성 관절염; 만성 사구체신염; 글론병, 궤양성 결장염 및 궤사성 전장염과 같은 염증성 장질환; 과립구 수혈 관련 증후군; 접촉성 피부염, 아토피 피부염, 건선과 같은 염증성 피부병; 전신성 홍반성 낭창(systemic lupus erythematosus:SLE), 자가면역 갑상선염, 다발성 경화증, 및 당뇨병의 특정 형태, 또는 자신의 면역계에 의한 공격이 병원성 조직 파괴를 결과하는 임의의 자가면역 상태를 포함한다. 알레르기성 반응은 알레르기성 천식, 만성 기관지염, 급성 및 지연된 과민증을 포함한다. 전신성 염증 질환 상태는 외상, 화상, 허혈성 사건 후 (예컨대, 심근 경색과 뇌졸중을 위시한, 심자, 뇌, 장 또는 말초 맥관구조물에서의 혈전성 사건)의 재관류, 패혈증, ARDS 또는 다발성 장기 부전 증후군과 관련된 염증을 포함한다. 염증성 세포은 또한 죽상동맥경화성 플라크에서 사용된다. 염증은 비호지킨 림프종, 베게너 육아종, 하시모토 갑상선염, 간세포성 암종, 흉선 위축증, 만성 췌장염, 류마티스 관절염, 반응성 위림프종, 골관절염, 궤양성 결장염, 유두상 암종, 크론병, 궤양성 결장염, 급성 담낭염, 만성 담낭염, 간경변, 만성 타액선염, 복막염, 급성 췌장염, 만성 췌장염, 만성 위염, 자궁선근종, 자궁내막증, 급성 자궁경부염, 만성 자궁경부염, 위림프종, 다발성 경화증, 특발성 혈소판감소성 자반에 부차적인 비대, 원발성 IgA 신장병, 전신성 홍반성 낭창, 건선, 폐기종, 만성 신우신염 및 만성 방과염을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
폴리뉴클레오타이드 및 올리고뉴클레오타이드 조성물 및 분자
표적: 일 구체예에서, 표적은 커플링방지 단백질(UCP2)과 관련된 센스 및/또는 안티센스 비암호화 및/또는 암호화 서열을 포함하지만 제한되지 않는, UCP2의 핵산 서열을 포함한다.
인체는 UCP1 유전자를 가지고 있다. 하지만, 이것은 갈색지방에서만 활성적이고, 출생 직후 사라진다. UCP2는 제2의 커플링 방지 단백질로서 큰 성체 포유동물에 더욱 광범위하게 발현되어 있다. 커플링 방지 단백질 2(UCP2)은 염색체 11q13 상에 위치하고, 마우스에서의 상동 부위는 "터비(tubby)" 돌연변이와 밀접하게 연계되어 있는 데, 이는 성인형 비만, 인슐린 내성, 망막 퇴화, 및 감각신경 청각 손실을 야기한다. 또한, 이들의 염색체성 매핑는 하나는 유사유전자 계열이고 인간 인슐린 의존성 당뇨병 위치-4인, 적어도 세 마리의 독립적 마우스 모델로부터 비만에 대한 정량적 특징적 위치가 일치한다는 것이 보고되었다. UCP2는 뇌에서 근육과 지방 세포에 이르는 다양한 범위의 조직에서 발현된다. 일반적으로 에너지 이용의 조절에서, 및 특별하게는 당뇨와 비만에서의 역할이 일치하기 때문에, UCP2 유전자는 지방 흡입에 반응하여 상향조절되며 고인슐린혈증 및 비만에 관계된 인간과 마우스 게놈의 부위에 매핑된다. UCP3 유전자는 또한 골격근 및 갈색 지방 조직에 선호적으로 발현되는 것이 특징적으로 발견된다.
일 구체예에서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드들을 사용하여 UCP2 족 구성원과 연계된 질병이나 질환을 예방하거나 치료한다. 상기 안티센스 화합물을 사용하여 얻은 줄기세포로부터 재생된 세포/조직으로 치료될 수 있는 커플링 방지 단백질 2(UCP2) 매개 질병 및 질환의 예는: UCP2의 비정상적 기능 및/또는 발현과 연계된 질병 또는 질환, 암, 어팝토시스, 체중 질병이나 질환 (예컨대, 비만, 과소체중 질환 등.), 악액질, 비정상적 수준의 음식 섭취, 신경성 식욕부진증, 신경성 과식증, 당뇨병 (예컨대, 유형 2 당뇨병; 비인슐린 의존성 당뇨병), 고인슐린혈증, 글루코즈 항상성과 연관된 질병이나 질환, 글루코즈 불내성, 유형 II 당뇨병, 비만, 증후군 X, 면역학적 기능장애, 체온 기능장애, 심혈관 질병이나 질환, 죽상동맥경화증, 만성 염증성 질환, 염증, 신장 질병 또는 질환, 열발생 관련 질환, 어팝토시스, 악액질, 면역학적 질병이나 질환, 신경퇴행성 질환이나 질병, 산화성 스트레스, 손상된 마이토콘드리아 기능과 연관된 질병이나 질환, 뇌졸중, 노화 관련질환, 노화, 노쇠, 지방 대사, 체질량, 및 체온조절에서의 결함 관련 질병이나 질환을 포함한다.
일 구체예에서, 하나 이상의 안티센스 올리고뉴클레오타이드에 의한 UCP2의 조절이 경기력 향상 및 보디빌딩을 위해 필요한 환자에 제공된다.
일 구체예에서, 하나 이상의 안티센스 올리고뉴클레오타이드에 의한 UCP2의 조절이 정상 대조군에 비하여 비정상적인 UCP2 발현, 기능 및 활성과 연관이 있는 임의의 질병 또는 질환을 예방 또는 치료하기 위해, 필요한 환자에게 제공된다.
일 구체예에서, 상기 올리고뉴클레오타이드는 비암호화 부위를 포함하는 이에 한정되지 않는 UCP2의 폴리뉴클레오타이드에 특이적이다. UCP2 표적은 UCP2의 변이체; SNP를 위시한 UCP2의 돌연변이체; UCP2의 비암호화 서열; 대립형질유전자, 단편물 등을 포함한다. 바람직하게는 상기 올리고뉴클레오타이드는 안티센스 RNA 분자이다.
본 발명의 일 구체예에 따라서, 상기 표적 핵산 분자는 UCP2 폴리뉴클레오타이드 단독에 한정되지 않고, UCP2의 이소폼, 수용체, 상동체, 비암호화 부위등으로 연장된다.
일 구체예에서, 올리고뉴클레오타이드는 변이체, 대립형질체, 상동체, 돌연변이체, 유도체, 단편물 및 이에 상보적 서열을 포함하나 이에 한정되지 않는 UCP2 표적의 천연 안티센스 서열 (암호화 및 비암호화 부위에 대한 천연 안티센스)를 표적화한다. 바람직하게는, 상기 올리고뉴클레오타이드는 안티센스 RNA 또는 DNA 분자이다.
일 구체예에서, 본 발명의 올리고머성 화합물은 상기 화합물의 하나 이상의 뉴클레오타이드 위치에 상이한 염기가 존재하는 변이체를 또한 포함한다. 예를 들어, 첫 번째 뉴클레오타이드가 아데닌이면, 이 위치에서 티미딘, 구아노신, 시티딘 또는 다른 천연 또는 비천연 뉴클레오타이드를 포함하는 변이체들이 생성될 수 있다. 이것은 상기 안티센스 또는 dsRNA 화합물의 임의의 위치에서 행하여 질 수 있다. 이러한 화합물들은 본 발명에서 설명된 방법을 사용하여 표적 핵산의 발현을 저해하는 능력을 결정하는 것에 대해 시험할 수 있다.
특정 구체예에서, 상기 안티센스 화합물과 표적 간의 상동성, 서열 일치성 또는 상보성은 약 50% 내지 약 60%이다. 특정 구체예에서, 상동성, 서열 일치성 또는 상보성은 약 60% 내지 약 70%이다. 특정 구체예에서, 상동성, 서열 일치성 또는 상보성은 약 70% 내지 약 80%이다. 특정 구체예에서, 상동성, 서열 일치성 또는 상보성은 약 80% 내지 약 90%이다. 특정 구체예에서, 상동성, 서열 일치성 또는 상보성은 약 90%, 약 92%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 또는 약 100%이다.
안티센스 화합물은 상기 화합물이 표적 핵산에 결합하는 것이 상기 표적 핵산의 정상적인 기능을 방해하여 활성의 손실을 초래하고 특이적 결합이 소망되는 조건하에서 상기 안티센스 화합물이 비-표적 핵산 서열과의 비특이적 결합을 회피하게 하는 충분한 정도의 상보성이 있을 때 특이적으로 하이브리드화 될 수 있다. 그러한 조건들은, 예를 들어, 생체 내 시험 또는 요법적 치료의 경우에서의 생리적 조건, 및 시험관 내 시험의 경우 시험이 시행되는 조건을 포함한다.
안티센스 화합물은, DNA, RNA, 키메릭, 치환체 등이건 간에, 상기 화합물이 표적 DNA나 RNA 분자에 결합하는 것이 표적 DNA나 RNA의 정상적인 기능을 방해하여 유용성을 손실을 초래하고, 및 특이적 결합이 소망되는 조건, 즉 생체 내 시험의 경우 생리적 조건, 및 시험관 내 시험의 경우 시험이 실행되는 조건하에서 상기 안티센스 화합물이 비-표적 서열에 비특이적으로 결합되는 것이 회피될 정도로 충분한 상보성이 있을 때, 특이적으로 하이브리드화될 수 있다.
일 구체예에서, 예를 들어, PCR, 하이브리드화 등을 사용하여 동정되고 확대된 안티센스 서열, 서열 번호 2와 3에 설정된 하나 이상의 서열을 포함하지만 이에 한정되지 않는 UCP2를 표적화하는 것은 UCP2의 발현과 기능을 조절한다. 일 구체예에서, 발현 또는 기능이 대조군에 비해 상향 조절된다. 일 구체예에서, 발현 또는 기능이 대조군에 비해 하향조절된다.
일 구체예에서, 올리고뉴클레오타이드들은 예를 들어 PCR, 하이브리드화 등을 사용하여 확인되고 확대된 안티센스 서열을 위시한, 서열번호 4 내지 14에 설정된 핵산 서열들을 포함한다. 이러한 올리고뉴클레오타이드들은 하나 이상의 변형된 뉴클레오타이드, 더 짧거나 긴 단편물, 변형된 결합을 포함할 수 있다. 변형된 결합 또는 뉴클레오타이드간 연결은 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등을 포함한다. 일 구체예에서, 상기 뉴클레오타이드 인 유도체를 포함한다. 본 발명의 변형된 올리고뉴클레오타이드에서 당 또는 당 유사체 분체에 부착될 수 있는 인 유도체(또는 변형된 인산기)는 모노포스페이트, 디포스페이드, 트리포스페이트, 알킬포스페이트, 알칸포스페이트, 포스포로티오에이트 등 일 수 있다. 전술한 인산 유사체의 제조 및 이들의 뉴클레오타이드, 변형된 뉴클레오타이드 및 올리고뉴클레오타이드 자체로의 혼입은 공지되어 있고 여기서 설명할 필요가 없다.
안티센스의 특이성 및 민감성은 당해분야의 숙련자에게 치료 용도로도 이용된다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드들을 동물 및 인간에서 질병 상태의 치료에 치료적 분체로서 사용되었다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드들은 인간에게 안전하고 효과적으로 투여되었고, 수많은 임상 시험이 현재 시행중이다. 따라서, 올리고뉴클레오타이드들은 세포, 조직 및 동물, 특히 인간을 치료하기 위한 치료 섭생법에서 유용하도록 설정될 수 있는 유용한 치료 양식이 될 수 있다는 것이 확립된다.
본 발명의 구체예에서, 올리고머성 안티센스 화합물들, 특히 올리고뉴클레오타이드들은 표적 핵산 분자와 결합하고 표적 유전자에 의해 암호화된 분자의 발현 및/또는 기증을 조절한다. 간섭될 DNA의 기능은, 예를 들어, 복제 및 전사를 포함한다. 간섭될 RNA의 기능은 예를 들어, 단백질 번역 부위로의 RNA의 위치이동, RNA로부터 단백질의 번역, RNA의 스플라이싱으로 하나 이상의 mRNA 종을 산출하는 것, RNA에 의해 연계되거나 용이하게 될 수 있는 촉매 활성과 같은 모든 역동적 기능을 포함한다. 상기 기능은 원하는 기능에 의존하여 상향 조절되거나 저해될 수 있다.
상기 안티센스 화합물은 안티센스 올리고머성 화합물, 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 외부 가이드 서열(EGS) 올리고뉴클레오타이드, 차등 스플라이서, 프라이머, 프로브 및 상기 표적 핵산의 적어도 일부분과 하이브리드화하는 다른 올리고머성 화합물을 포함한다. 그러한 것으로서, 이러한 화합물은 단일 쇄, 이중쇄, 부분적으로 단일 쇄 또는 환형 올리고머성 화합물의 형태로 도입될 수 있다.
안티센스 화합물을 특정 핵산 분자에 표적화시키는 것은, 본 발명의 맥락에서, 다중 단계 과정일 수 있다. 이러한 과정은 통상 그 기능이 조절될 표적 핵산의 동정으로 시작된다. 이러한 표적 핵산은, 예를 들어, 그 발현이 특정 질환이나 질병 상태와 연관이 있는 세포성 유전자(또는 그 유전자로부터 전사된 mRNA), 또는 감염성 제제로부터의 핵산 분자일 수 있다. 본 발명에서, 상기 표적 핵산은 커플링 방지 단백질 2(UCP2)를 암호화한다.
상기 타겟팅 과정은 안티센스 상호작용이 일어나서 원하는 효과, 예컨대, 발현의 조절이 결과되는 표적 핵산 내의 적어도 하나의 표적 부위, 세그먼트 또는 장소를 결정하는 것을 통상 포함한다. 본 발명의 맥락 내에서, 용어 "부위"는 적어도 하나의 확인가능한 구조, 기능 또는 특성을 가지는 표적 핵산의 일부분으로서 정의된다. 표적 핵산의 부위 내에 세그먼트가 있다. "세그먼트"는 표적 핵산 내의 부위의 더 작은 또는 하위 부분으로 정의된다. "장소"는 본 발명에서 사용되는 바와 같이 표적 핵산 내 위치로서 정의된다.
일 구체예에서, 상기 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 커플링 방지 단백질 2(UCP2)의 천연 안티센스 서열과 결합하며 UCP2(서열번호: 1)의 발현 및/또는 기능을 조절한다. 안티센스 서열들의 예는 서열번호: 2 내지 14를 포함한다.
일 구체예에서, 상기 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 커플링 방지 단백질 2(UCP2) 폴리뉴클레오타이드의 하나 이상의 세그먼트와 결합하고 UCP2의 발현 및/또는 기능을 조절한다. 상기 세그먼트는 UCP2 센스 또는 안티센스 폴리뉴클레오타이드의 적어도 5 개 연속되는 뉴클레오타이드들을 포함한다.
일 구체예에서, 상기 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 UCP2의 천연 아티센스 서열에 특이적이며, 여기서 상기 올리고뉴클레오타이드들이 UCP2의 천연 안티센스 서열에 결합하는 것이 UCP2의 발현 및/또는 기능을 조절하는 것이다.
일 구체예에서, 올리고뉴클레오타이드 화합물은 서열번호: 4 내지 14에 설정된 서열, PCR, 하이브리드화 등을 사용하여 확인되고 확장된 안티센스 서열을 포함한다. 이러한 올리고뉴클레오타이드는 하나 이상의 변형된 뉴클레오타이드, 더 짧거나 긴 단편물, 변형된 결합 등을 포함한다. 변형된 결합 또는 뉴클레오타이드간 연결체의 예는 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등을 포함한다. 일 구체예에서, 상기 뉴클레오타이드는 인 유도체를 포함한다. 본 발명의 변형된 올리고뉴클레오타이드에서 당 또는 당 유사 분체에 부착될 수 있는 인 유도체(또는 변형된 포스페이트 기)는 모노포스페이트, 디포스페이트, 트리포스페이트, 알킬포스페이트, 알칸포스페이트, 포스포로티오에이트 등 일 수 있다. 상기 포스페이트 유사체의 제조 및 이의 뉴클레오타이드, 변형된 뉴클레오타이드 및 올리고뉴클레오타이드 자체로의 혼입은 공지되어 있고 여기서 설명할 필요가 없다.
당해 분야에 공지된 바와 같이, 번역 개시 코돈이 일반적으로 5'-AUG(전사된 mRNA 분자에서; 상응하는 DNA에서는 5'-ATG)이기 때문에, 상기 번역 개시 코돈은 또한 "AUG 코돈" "출발 코돈" 또는 "AUG 출발 코돈"으로 지칭된다. 소수의 유전자들은 RNA 서열 5'-GUG, 5'-UUG 또는 5'-CUG을 가지는 번역 개시 코돈을 가진다; 및 5'-AUA, 5'-ACG 및 5'-CUG은 생체 내에서 기능하는 것으로 나타난다. 따라서, 용어 "번역 개시 코돈" 및 "출발 코돈"은, 각각의 경우에 개시 아미노산이 일반적으로 메티오닌(진핵생물) 또는 포밀메티오닌(원핵생물)이더라도, 많은 코돈 서열을 포함할 수 있다. 진핵 및 원핵 유전자는 두 개 이상의 교번 출발 코돈을 가질 수 있고, 이들 중 임의의 하나가 특정 세포 유형 또는 조직에서 또는 특정 조건하에서 번역 개시에 선호적으로 이용될 수 있다. 본 발명의 맥락에서, "출발 코돈" 및 "번역 개시 코돈"은 그러한 코돈의 서열(들)에 관계없이 커플링 방지 단백질 2(UCP2)를 암호화하는 유전자로부터 전사된 mRNA의 번역을 생체 내에서 개시하는 데 사용되는 코돈 또는 코돈들로 지칭된다. 유전자의 번역 종결 코돈(또는 "정지 코돈")은 세 가지 서열 즉 5'-UAA, 5'-UAG 및 5'-UGA(상응하는 DNA 서열은 각각 5'-TAA, 5'- TAG 및 5'-TGA) 중 하나를 가진다.
용어 "출발 코돈 부위" 및 "번역 개시 코돈 부위"는 번역 개시 코돈으로부터 어느 일 방향(즉, 5' 또는 3')으로 약 25 내지 약 50 개 인접한 뉴클레오타이드를 포함하는 그러한 mRNA 또는 유전자의 일 부분을 지칭한다. 유사하게, 용어 "정지 코돈 부위" 및 "번역 종결 코돈 부위"는 번역 종결 코돈으로부터 어느 일 방향(즉, 5' 또는 3')으로 약 25 개 내지 약 50 개 인접 뉴클레오타이드를 포함하는 그러한 mRNA 또는 유전자의 일부를 지칭한다. 결론적으로, "출발 코돈 부위"(또는 "번역 개시 코돈 부위") 및 "정지 코돈 부위"(또는 "번역 종결 코돈 부위")는 모두 본 발명의 안티센스 화합물로 표적화 될 수 있는 부위이다.
번역 개시 코돈 및 번역 종결 코돈 간의 부위를 지칭하는 것으로 당해 분야에 알려진, 오픈 리딩 프레임(Open reading frame:ORF) 또는 "코딩 부위"는 또한 효과적으로 표적화될 수 있는 부위이다. 본 발명의 맥락에서, 표적화된 부위는 유전자의 오픈 리딩 프레임(ORF)의 개시 또는 종결 코돈을 포함하는 유전자 내 부위이다.
다른 표적 부위는 번역 개시 코돈으로부터 5' 방향으로 mRNA부분을 지칭하는 것으로 해당분야에 공지되며, 따라서 mRNA(또는 유전자 상에서 상응하는 뉴클레오타이드)의 5' 캡 장소 및 번역 개시 코돈 사이의 뉴클레오타이드를 포함하는, 5' 미번역 부위 (5'Untranslated region:UTR)를 포함한다. 여전히 다른 표적 부위는 번역 종결 코돈에서 3' 방향으로 mRNA의 부분을 지칭하는 것으로 당해 분야에서 공지되어 있고, mRNA(또는 유전자 상에서 상응하는 뉴클레오타이드들)의 번역 종결 코돈과 3' 말단 사이의 뉴클레오타이드를 포함하는 3' 미번역 부위 (3'UTR)을 포함한다. mRNA의 5' 캡 장소는 5'-5' 트리포스페이트 연결을 통해 mRNA의 5'-최근접 잔기에 연결된 N7-메틸화된 구아노신 잔기를 포함한다. mRNA의 5' 캡 부위는 5' 캡 구조 자체는 물론 캡 위치에 인접한 처음 50 개 뉴클레오타이드를 포함하는 것으로 나타난다. 본 발명의 다른 표적 부위는 5' 캡 부위이다.
비록 특정 진핵 mRNA 전사체가 직접적으로 번역된다고 해도, 많은 것들은 번역되기 전에 전사체로부터 절제되는 "인트론"으로 공지된 하나 이상의 부위를 포함한다. 나머지 (및 따라서 번역되는) 부위는 "엑손"으로 알려져있고 같이 스플라이스되어 연속적인 mRNA 서열을 형성한다. 일 구체예에서, 슬라이스 장소, 즉 인트론-엑손 접점 또는 엑손-인트론 접점을 표적화하는 것은 특히 이상한 스플라이싱이 질병에 연루된 또는 특정 스플라이스 산물의 과다생성이 질병과 연루된 상황에 유용하다. 재배치 또는 삭제로 인한 이상한 융합 접합부가 타겟 장소의 다른 구체예이다. 상이한 유전자원으로부터 두 개(또는 그 이상) mRNA를 스플라이싱의 과정을 통해 생성된 mRNA 전사체는 "융합 전사체"로 공지되어 있다. 인트론들은, 예를 들어, DNA 또는 프리-mRNA에 표적화된 안티센스 화합물을 사용하여 효과적으로 표적화될 수 있다.
일 구체예에서, 상기 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 타겟 폴리뉴클레오타이드의 코딩 및/또는 비코딩 부위에 결합되며 타겟 분자의 발현 및/또는 기능을 조절한다.
일 구체예에서, 상기 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 천연 안티센스 폴리뉴클레오타이드와 결합하고 타겟 분자의 발현 및/또는 기능을 조절한다.
일 구체예에서, 상기 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 폴리뉴클레오타이드와 결합하고 타겟 타겟 분자의 발현 및/기능을 조절한다.
차등 RNA 전사체는 DNA의 동일한 게놈성 부위로부터 생성될 수 있다. 이러한 차등 전사체는 일반적으로 "변이체"로 알려져 있다. 더 상세하게는 "프리-mRNA 변이체"는 동일한 게놈성 DNA로부터 생성된, 시작 또는 종결 위치에서 동일한 게놈성 DNA로부터 선택된 다른 전사체와 상이하며 인트론 및 엑손 서열을 둘 다 포함하는 전사체이다.
하나 이상의 엑손 또는 인트론 부위, 또는 스플라이싱 동안의 이의 부분이 절제될 때, 프리-mRNA 변이체들은 더 적은 "mRNA 변이체"를 생성한다. 결론적으로, mRNA 변이체들은 가공된 프리-mRNA 변이체들이고, 각 유일한 프리-mRNA 변이체는 스플라이싱의 결과로서 반드시 항상 유일한 mRNA 변이체를 생성해야 한다. 이러한 mRNA 변이체들은 "차등(alternative) 스플라이스 변이체"로 알려져 있다. 프리-mRNA 변이체의 스플라이싱이 일어나지 않으면, 상기 프리-mRNA 변이체는 mRNA 변이체와 동일하다.
변이체들은 전사의 개시 또는 종결하는 교호적 신호를 통해 생성될 수 있다. 프리-mRNA 및 mRNA들은 하나 이상의 출발 코돈 또는 종결 코돈을 가질 수 있다. 교호적 출발 코돈을 사용하는 프리-mRNA 또는 mRNA로부터 유래한 변이체는 프리-mRNA 또는 mRNA의 "교호적 출발 변이체"로 알려져 있다. 교호적 종결 코돈을 사용하는 그러한 전사체는 프리-mRNA 또는 mRNA의 "교호적 종결 변이체"로서 알려져 있다. 교호적 종결 변이체의 하나의 특정 유형은 생성된 다중 전사체가 전사 기작에 의한 "폴리A 종결 신호들" 중 하나의 교호적 선택으로 기인하며, 이로써 유일한 폴리A 장소에서 종결하는 전사체를 생성하는 "폴리A 변이체"이다. 본 발명의 맥락에서, 본 명세서에서 설명된 유형의 변이체는 표적 핵산의 구체예이다.
상기 안티센스 화합물이 하이브리드화 되는 표적 핵산 상에서의 위치는 활성 안티센스 화합물이 표적화되는 표적 부위의 적어도 5-뉴클레오타이드 긴 부분으로 정의된다.
특정 예증적 표적 세그먼트의 특정 서열이 본 명세서에 설정되어 있지만, 해당분야의 기술자는 이러한 것은 본 발명의 범위 내에 있는 특정 구체예를 예증하고 설명하는 것으로 된 것임을 인지할 것이다. 추가의 표적 세그먼트들은 본 개시의 관점에서 해당분야의 통상을 기술자에 의해 용이하게 확인될 수 있다.
상기 예증적 바람직한 표적 세그먼트 내에서 선택된 적어도 5개의 뉴클레오타이드의 일단을 포함하는 5-100개 뉴클레오타이드 길이의 표적 세그먼트가 표적화가 적절한 것으로 생각된다.
표적 세그먼트는 상기 예증적 바람직한 표적 세그먼트의 5'-말단으로부터 적어도 5 개 연속 뉴클레오타이드를 포함하는 DNA 또는 RNA 서열을 포함할 수 있다(나머지 뉴클레오타이드들은 표적 세그먼트의 5' 말단의 직전 상류에서 시작하고 및 DNA 또는 RNA가 약 5 내지 약 100 개 뉴클레오타이드들을 포함할 때까지 계속되는 동일한 DNA 또는 RNA의 연속적인 일단이다). 유사하게, 바람직한 표적 세그먼트들은 상기 예증적 바람직한 표적 세그먼트 중 하나의 3'-말단으로부터 적어도 5개 연속 뉴클레오타이드들을 포함하는 DNA 또는 RNA 서열에 의해 표시된다(나머지 뉴클레오타이드들은 상기 표적 세그먼트의 3'-말단 직전 하류로 시작되어 약 5 내지 약 100개 뉴클레오타이드를 포함할 때까지 연속되는 동일한 DNA 또는 RNA의 연속적인 일단이다). 본 명세서에서 설명된 표적 세그먼트로 무장된 당해 분야의 숙련자는 과도한 실험 없이 추가의 바람직한 표적 세그먼트를 인식할 수 있을 것이다.
일단 하나 이상의 표적 부위, 세그먼트 또는 장소가 인식 되면, 상기 표적에 상보적인, 즉 충분한 특이성으로 잘 하이브리드화하여 소정의 효과를 주는 안티센스 화합물을 선택한다.
본 발명의 구체예에서, 상기 올리고뉴클레오타이드들은 특정 표적의 안티센스 본쇄에 결합한다. 상기 올리고뉴클레오타이드들은 적어도 5 개 뉴클레오타이드 길이이고 합성될 수 있어서, 각 올리고뉴클레오타이드는 중첩 서열들을 표적화하며 이로써 올리고뉴클레오타이드들은 표적 폴리뉴클레오타이드의 전체 길이를 망라하도록 합성된다. 상기 표적은 또한 코딩은 물론 넌코딩 부위를 포함한다.
일 구체예에서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드에 의해 특정 핵산을 표적화하는 것이 바람직하다. 안티센스 화합물을 특정 핵산에 표적화하는 것은 다단계 과정이다. 이 과정은 통상 이의 기능이 조절될 핵산 서열의 동정으로 개시된다. 이러한 것은, 예를 들어, 그 발현이 특정 질환이나 질병 상태와 연관이 있는 세포성 유전자(또는 그 유전자로부터 전사된 mRNA), 또는 예들 들어, 넌코딩 RNA(non-coding RNA:ncRNA)와 같은 비코딩 폴리뉴클레오타이드일 수 있다.
RNA들은 (1) 단백질로 번역되는 메신저 RNA(mRNA), 및 (2) 비-단백질-코딩 RNA(ncRNA)로 분류될 수 있다. ncRNA는 마이크로RNA, 안티센스 전사체, 고도의 정지 코돈 및 임의의 상당한 "오픈 리딩 프레임"이 결여된 다른 전사 단위체(Transcriptional Units: TU)를 포함한다. 많은 ncRNA들은 단백질-코딩 부위의 3' 비번역 부위(3'UTR)에서 개시 장소로부터 출발하는 것으로 나타난다. ncRNA들은 희귀하며 FANTOM 콘소시움에 의해 서열분석된 ncRNA의 적어도 절반은 폴리아데닐화된 것으로 보이지 않는다. 명백한 이유로 인하여, 대부분 연구자들은 가공되고 세포질로 배출되는 폴리아데닐화된 mRNA에 집중하였다. 최근에, 비-폴리아데닐화된 핵 RNA의 일단이 매우 클 수 있다는 것과 많은 그러한 전사체들이 소위 유전자간 부위로부터 발생될 수 있다는 것이 나타났다. ncRNA들이 유전자 발현을 조절할 수 있게 하는 기작은 표적 전사체와의 염기쌍에 의한다. 염기쌍의 의해 기능 하는 RNA들은 (1) 동일한 유전적 위치에 암호화되나 그들이 작용하는 그래서 그들 표적에 완벽한 상보성을 보이는 RNA에 대한 반대 본쇄상에서 암호화된 시스 암호화된 RNA 및 (2) 그것이 작용하고 및 그들의 표적과 완벽한 염기쌍 능력을 보이지 못하는 RNA로부터 떨어진 염색체 상의 위치에 암호화된 트랜스-암호화된 RNA들로 나눌 수 있다.
이론에 얽매이지 않고, 본 명세서에서 설명된 안티센스 올리고뉴클레오타이드에 의한 안티센스 폴리뉴클레오타이드의 방해는 상응하는 센스 메신저 RNA의 발현을 변경시킬 수 있다. 그러나, 이러한 조절은 불일치성(안티센스 녹다운은 메신저 RNA 상승을 결과한다) 또는 일치성(안티센스 녹다운은 동시에 메신저 RNA 감소를 결과한다)일 수 있다. 이러한 경우, 안티센스 올리고뉴클레오타이드들은 안티센스 전사체의 중첩 또는 비중첩부에 표적화될 수 있고, 이는 이의 녹다운 또는 격리를 결과하게 된다. 코딩은 물론 비코딩 안티센스는 동일한 방식으로 표적화 될 수 있고 그러한 어느 하나의 카테고리는 상응하는 전사체를 규제할 수 있다 - 일치성 또는 불일치성 방식으로. 표적에 대항해서 사용하기 위한 신규 올리고뉴클레오타이드를 동정하는 데 사용되는 전략은 안티센스 올리고뉴클레오타이드 또는 원하는 표적을 조절하는 다른 수단에 의한 안티센스 RNA 전사체의 녹다운에 기초할 수 있다.
전략 1: 불일치성 조절의 경우, 안티센스 전사체를 녹다운하는 것은 통상적인(센스) 유전자의 발현을 증가시킨다. 후자 유전자가 공지된 또는 추정되는 약물 표적을 암호화한다면, 이의 안티센스 카운터파트의 녹다운은 수용체 효현제 또는 효소 자극제의 활동을 의태할 수 있다는 것을 생각할 수 있다.
전략 2: 일치성 규제의 경우, 안티센스 및 센스 전사체 둘 다 동시에 녹다운시킬 수 있고, 따라서 통상적인(센스) 유전자 발현의 시너지성 감소를 이룰 수 있게된다. 예를 들어, 만약 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 녹다운을 수행한다면, 이러한 전략을 사용하여 센스 전사체에 표적화된 안티센스 올리고뉴클레오타이드 및 다른 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 상응하는 안티센스 전사체, 또는 중첩되는 센스 및 안티센스 전사체를 동시에 표적화하는 단일의 에너지적으로 대칭적인 안티센스 올리고뉴클레오타이드에 적용할 수 있다.
본 발명에 따라서, 안티센스 화합물은 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 리보자임, 외부 가이드 서열(EGS) 올리고뉴클레오타이드, siRNA 화합물, siRNA 화합물과 같은 단일- 또는 이중-본쇄 RNA 간섭(RNAi) 화합물, 및 표적 핵산의 적어도 일부와 하이브리드화되고 그것의 기능을 조절하는 다른 올리고머성 화합물을 포함한다. 그러한 것으로서, 이것은 DNA, RNA, DNA-유사, RNA-유사, 또는 이의 혼합물일 수 있거나, 이러한 것들의 하나 이상의 의태물일 수 있다. 이러한 화합물은 단일 본쇄, 이중 본쇄, 환형 또는 헤어핀 올리고머성 화합물일 수 있고, 내부 또는 말단 벌지, 미스매치 또는 루프를 포함할 수 있다. 안티센스 화합물은 일상적으로 선형으로 제조되나 결합될 수 있거나 다르게는 선형 및/또는 분지형으로 제조될 수 있다. 안티센스 화합물은, 예를 들어, 하이브리드화되어 완전 또는 부분적으로 이중본쇄의 화합물의 하이브리드화 및 형성을 허용하기에 충분한 자기-상보성을 가지는 전체적으로 또는 부분적으로 이중 본쇄의 화합물 또는 단일 본쇄를 형성하는 두 개의 본쇄와 같은 작제물을 포함할 수 있다. 상기 두 개의 본쇄는 내부적으로 연결되어서 자유 3' 또는 5' 말단을 남길 수 있고 또는 연결되어 연속적인 헤어핀 구조 또는 루프를 형성할 수 있다. 상기 헤어핀 구조는 5' 또는 3' 말단 상에서 오버행을 포함하여 단일 본쇄 특성의 돌출부를 형성할 수 있다. 상기 이중 본쇄 화합물은 조건적으로 말단에 오버행을 포함할 수 있다. 더구나, 변형은 선택된 말단, 선택된 뉴클레오타이드 위치, 당 위치 또는 뉴클레오시드간 연결체 중 하나에 부착된 접합체 군을 포함할 수 있다. 대안적으로, 상기 두 개의 본쇄는 비-핵산 분체 또는 연결 군에 의해 연결될 수 있다. 오직 하나의 본쇄로부터 형성될 때, dsRNA는 자체에서 이중화되어 듀플렉스를 형성하는 자기-상보적 헤어핀-유형 분자의 형태를 취할 수 있다. 따라서, 상기 dsRNA는 완전히 또는 부분적으로 이중 본쇄일 수 있다. 유전자 발현의 특이적 조절은 형질전환(transgenic) 세포 계열에서 dsRNA 헤어핀을 안정적으로 발현시킴으로써 달성될 수 있지만, 특정 구체예에서, 유전자 발현 또는 기능이 상향 조절된다. 두 개의 본쇄 또는 자체에서 이중화되어 듀플렉스를 형성하는 자기-상보성 헤어핀 유형 분자의 형태를 띠는 단일 본쇄로부터 형성될 때, 상기 두 개의 본쇄(또는 단일 본쇄의 듀플렉스-형성 부위)는 왓슨-크릭 형태로 염기 쌍을 짓는 상보적 RNA 본쇄이다.
일단 시스템으로 도입되면, 본 발명의 화합물은 하나 이상의 효소 또는 구조 단백질의 활동을 이끌어내서 표적 핵산의 절단 또는 다른 변형을 실행하게 하거나 또는 점유에 기초한 기작을 통해 작용할 수 있다. 일반적으로, 핵산들(올리고뉴클레오타이드들을 포함하는)은 "DNA-유사체"(즉, 일반적으로 하나 이상의 2'-데옥시 당 및 일반적으로 U 염기보다는 T을 가지는) 또는 "RNA-유사체"(즉, 일반적으로 하나 이상의 2'-하이드록실 또는 2'-변형된 당 및 T 염기보다는 U를 가지는)로서 설명될 수 있다. 핵산 나선 구조는 하나 유형 이상의 구조, 가장 통상적으로는 A- 및 B-형태를 취한다. 일반적으로, B-형태-유사 구조를 가지는 올리고뉴클레오타이드는 "DNA-유사체"이고 A-형태 유사 구조를 가지는 것은 "RNA-유사체"인 것으로 판단된다. 특정(키메릭) 구체예에서, 안티센스 화합물은 A- 및 B-형태 부위를 둘 다 포함할 수 있다.
일 구체예에서, 상기 소정의 올리고뉴클레오타이드 또는 안티센스 화합물은 하기 것 중 적어도 하나를 포함한다: 안티센스 RNA, 안티센스 DNA, 키메릭 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 변형된 연결체를 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 간섭 RNA(RNAi), 짧은 간섭 RNA(siRNA); 마이크로 간섭 RNA(miRNA); 작은 일시적 RNA(stRNA); 또는 짧은 헤어핀 RNA(shRNA); 작은 RNA-유도 유전자 활성(RNAa); 작은 활성화 RNA(saRNA), 또는 이의 조합물.
dsRNA는 유전자 발현을 활성화하는 데, 이는 "작은 RNA-유도 유전자 활성화" 또는 RNAa(small RNA-induced gene activation)으로 지칭되는 기작이다. 유전자 프로모터를 표적화하는 dsRNA들은 연관된 유전자의 강력한 전사 활성을 유도한다. RNAa는 "작은 활성화 RNA"(small activating RNA:saRNA)로 지칭되는 합성 dsRNA들을 사용하여 인간 세포에서 증명된다. 현재 RNAa가 다른 유기체에서 보존되어 있는 것은 알려지지 않고 있다.
작은 간섭 RNA(siRNA) 및 마이크로RNA(miRNA)와 같은 작은 이중 본쇄 RNA(dsRNA)는 RNA 간섭(RNAi)으로 공지된 진화적으로 보존된 기작의 개시자 인 것이 발견되었다. RNAi는 리모델링 크로마틴을 통해 유전자 사일런싱을 변함없이 이끌고 있어, 전사를 억제하며, 상보적 mRNA를 감소시키거나 단백질 번역을 차단한다. 그러나, 후술하는 실시예에서 상세히 설명되는 경우와 같이, 올리고뉴클레오타이드들은 커플링 방지 단백질2(UCP2) 폴리뉴클레오타이드 및 이의 암호화된 산물의 발현 및/또는 기능을 증가시키는 것으로 나타난다. dsRNA들은 작은 활성화 RNA (saRNA)로서 작용할 수 있다. 이론에 얽매이지 않고, 유전자 프로모터의 서열을 표적화함으로써, saRNA들은 dsRNA-유도 전사 활성화 (RNAa)로 지칭되는 현상에서 표적 유전자 발현을 유도할 수 있을 것이다.
다른 구체예에서, 본 명세서에서 확인된 "바람직한 표적 세그먼트"들은 커플링 방지 단백질 2(UCP2) 폴리뉴클레오타이드들의 발현을 조절하는 추가의 화합물을 검출하는 데 사용될 수 있다. "조절자"는 UCP2을 암호화하는 핵산 분자의 발현을 감소시키거나 증가시키는 및 바람직한 표적 세그먼트에 상보적인 것과 5-뉴클레오타이드 부분을 적어도 포함하는 그러한 화합물이다. 스크리닝 방법은 UCP2의 센스 또는 천연 안티센스 폴리뉴클레오타이드를 암호화하는 핵산분자의 바람직한 표적 세그먼트를 하나 이상의 후보 조절자와 접촉시키고, UCP2 폴리뉴클레오타이드를 암호화하는 핵산 분자, 즉 서열번호 4 내지 14의 발현을 감소 또는 증가 시키는 하나 이상의 후보 조절자를 선택하는 단계를 포함한다. 일단 후보 조절자 또는 조절자들이 UCP2 폴리뉴클레오타이드를 암호화하는 핵산 분자의 발현을 조절(예 감소 또는 증가시키는 것)을 할 수 있다고 보이면, 상기 조절자는 UCP2 폴리뉴클레오타이드의 기능의 추가적 연구에, 또는 본 발명에 따른 연구, 진단 또는 치료제제로서 사용하기 위해 채용될 수 있다.
천연 안티센스 서열을 표적화하는 것은 바람직하게는 표적 유전자의 기능을 조절한다. 예를 들어, UCP2 유전자(예컨대, 수탁번호 NM_003355)이다. 일 구 체예에서, 상기 타겟은 UCP2 유전자의 안티센스 폴리뉴클레오타이드이다. 일 구체예에서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 UCP2 폴리뉴클레오타이드(예컨대, 수탁번호 NM_003355)의 센스 및/또는 천연 안티센스 서열, 변이체, 대립형질 유전자, 이소폼, 상동체, 돌연변이체, 유도체, 단편물 및 이에 상보적인 서열을 표적화한다. 바람직하게는 상기 올리고뉴클레오타이드는 안티센스 분자이고, 상기 표적은 안티센스 및/또는 센스 UCP2 폴리뉴클레오타이드의 코딩 및 비코딩 부위를 포함한다.
본 발명의 바람직한 표적 세그먼트는 또한 본 발명의 각각의 상보적인 안티센스 화합물과 조합하여 안정화된 이중 본쇄(듀플렉스된) 올리고뉴클레오타이드를 형성한다.
그러한 이중 본쇄 올리고뉴클레오타이드 분체는 해당분야에서 표적 발현을 조절하고 번역을 규제하는 것은 물론 안티센스 기작을 통해 RNA 가공을 조절하는 것으로 나타나 있다. 더욱이, 상기 이중-본쇄 분체는 화학 변형에 처해질 수 있다. 예를 들어, 그러한 이중 본쇄 분체는 듀플렉스의 안티센스 본쇄를 표적과 통상적인 하이브리드화를 시킴으로써 표적을 저해함으로써 표적의 효소적 분해를 개시하는 것으로 나타났다.
일 구체예에서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 커플링 방지 단백질 2(UCP2) 폴리뉴클레오타이드(예컨대, 수탁번호 NM_003355), 이의 변이체, 대립형질, 이소폼, 상동체, 돌연변이체, 유도체, 단편물 및 상보성 서열을 표적화한다. 바람직하게는, 상기 올리고뉴클레오타이드가 안티센스 분자이다.
본 발명의 구체예에 따라서, 상기 표적 핵산 분자는 UCP2 에만 한정되지 않고, UCP2 분자의 이소폼, 수용체, 상동체 등의 임의의 것에 연장된다.
일 구체예에서, 올리고뉴클레오타이드는 UCP2 폴리뉴클레오타이드, 예를 들어, 서열번호 2와 3에 설정된 폴리뉴클레오타이드들의 천연 안티센스 서열, 및 이의 임의의 변이체, 대립형질체, 상동체, 변이체, 유도체, 단편물 또는 상보적 서열을 표적화한다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 예는 서열번호 4 내지 14에 설정되어 있다.
일 구체예에서, 상기 올리고뉴클레오타이드는 UCP2 폴리뉴클레오타이드와 관련된 비코딩 센스 및/또는 안티센스 서열을 제한없이 포함하는 UCP2 안티센스의 핵산 서열에 상보적이거나 결합하며 UCP2 분자의 발현 및/또는 기능을 조절한다.
일 구체예에서, 상기 올리고뉴클레오타이드는 서열 번호 2와 3에 설정된 UCP2 천연 안티센스의 핵산 서열에 상보적이거나 결합하며 UCP2 분자의 발현 및/또는 기능을 조절한다.
일 구체예에서, 올리고뉴클레오타이드는 서열번호 4 내지 14의 적어도 5 개 연속적인 뉴클레오타이드의 서열을 포함하며 UCP2 분자의 발현 및/또는 기능을 조절한다.
상기 폴리뉴클레오타이드 표적은 UCP2, 이의 동족 구성체, UCP2의 변이체; SNP들을 위시한 UCP2의 돌연변이체; UCP2의 비코딩 서열; UCP2의 대립형질체; 종 변이체, 단편물 등을 위시한 UCP2을 포함한다. 바람직하게는, 상기 올리고뉴클레오타이드는 안티센스 분자이다.
일 구체예에서, UCP2 폴리뉴클레오타이드를 표적화하는 올리고뉴클레오타이드는 하기의 것을 포함한다: 안티센스 RNA, 간섭 RNA(RNAi), 짧은 간섭 RNA (siRNA); 마이크로 간섭 RNA(miRNA); 작은 일시적 RNA(stRNA); 또는 짧은 헤어핀 RNA (shRNA); 작은 RNA-유도 유전자 활성화(RNAa); 또는 작은 활성화 RNA(saRNA).
일 구체예에서, 커플링 방지 단백질 2(UCP2) 폴리뉴클레오타이드, 예컨대, 서열번호 2 및 3을 표적화하면 이러한 표적의 발현 또는 기능을 조절하게 된다. 일 구체예에서, 발현 또는 기능이 대조군에 비해 상향 조절된다. 일 구체예에서, 발현 또는 기능이 대조군에 비해 하향 조절된다.
일 구체예에서, 안티센스 화합물은 서열번호 4 내지 14에 설정된 서열이다. 이러한 올리고뉴클레오타이드는 하나 이상의 변형된 뉴클레오타이드, 더 짧거나 긴 단편물, 변형된 결합등을 포함한다.
일 구체예에서, 서열번호 4 내지 14는 하나 이상의 LNA 뉴클레오타이드를 포함한다.
원하는 표적 핵산의 조절은 당해 분야의 공지된 몇가지 방식으로 수행될 수 있다. 예를 들어, 안티센스 올리고뉴클레오타이드, siRNA 등의 효소성 핵산 분자 (예컨대, 리보자임)는 다른 별도의 핵산 분자를 뉴클레오타이드 염기 서열-특이성 방식으로 반복적으로 절단하는 능력을 위시한, 하나 이상의 다양한 반응을 촉매할 수 있는 핵산 분자이다. 그러한 효소성 핵산 분자는 예를 들어, 임의의 RNA 전사체를 실질적으로 표적화하는 데 사용될 수 있다.
그것들의 서열-특이성 때문에, 트랜스-절단 효소성 핵산 분자는 인간 질병에 대한 치료제로서 약속을 나타낸다(Usman & McSwiggen, (1995) Ann. Rep. Med. Chem. 30, 285-294; Christoffersen and Marr, (1995) J. Med. Chem. 38, 2023-2037). 효소성 핵산 분자들은 세포성 RNA의 배경 내에서 특이적 RNA 표적을 절단하도록 고안할 수 있다. 그러한 절단은 mRNA를 비기능적으로 만들고 RNA로부터의 단백질 발현을 폐지시킨다. 이러한 방식으로, 질병 상태와 관계된 단백질의 합성은 선택적으로 저해될 수 있다.
일반적으로, RNA 절단 활성을 가진 효소성 핵산은 먼저 표적 RNA에 결합함으로써 작용한다. 그러한 결합은 표적 RNA를 절단하는 작용을 하는 분자의 효소성 부위에 근접되게 확보되어 있는 효소성 핵산의 표적 결합 부위를 통해 일어난다. 따라서, 상기 효소성 핵산은 먼저 염기쌍을 통해 표적 RNA를 인식한 후 결합하며, 일단 정확한 부위에 결합되면, 표적 RNA를 효소적으로 절단하도록 작용한다. 그러한 표적 RNA의 전략적 절단은 암호화된 단백질의 합성을 지시하는 그의 능력을 파괴 하게 될 것이다. 효소성 핵산이 결합되고 그의 RNA 표적을 절단한 후, 이는 그 RNA로부터 방출되어 다른 표적을 탐색하게 되고 반복적으로 새로운 표적과 결합 하고 절단하게 된다.
시험관 내 선택 (진전) 전략과 같은 몇가지 방법(Orgel, (1979) Proc. R. Soc. London, B 205, 435)을 사용하여 포스포디에스테르 연결 및 아미드 연결의 절단과 결찰과 같은 다양한 반응을 촉매할 수 있는 신규의 핵산 촉매를 발전시키는 데 사용할 수 있다.
촉매 활성에 최적인 리보자임의 발달은 유전자 발현을 조절하는 목적상, RNA-절단 리보자임을 사용하는 임의의 전략에 상당히 기여할 수 있을 것이다. 해머머리 모양의 리보자임은 예를 들어, 포화(10 mM) 농도의 Mg2+ 조효소 존재하에서 약 1 min-1의 촉매속도(kcat)로 기능한다. 인공적 "RNA 리가제" 리보자임은 약 100 min-1의 속도로 상응하는 자기-조절 반응을 촉매하는 것으로 나타났다. 추가로, DNA로 구성된 기질 결합 분지물을 가지는 특정 변형된 해머머리 모양의 리보자임은 100 min-1에 근접한 다중 턴오버 속도로 RNA 절단을 촉매하는 것으로 나타났다. 최종적으로, 상기 해머머리 모양체의 촉매적 중심 내의 특정 잔기를 어떤 뉴클레오타이드 유사체와 치환하게 되면, 촉매 속도에서 10 배나 향상된 변형된 리보자임을 생성한다. 이러한 발견은 리보자임들이 최고의 자가-절단 리보자임에 의해 시험관내에서 나타나는 것보다 유의하게 큰 촉매 속도로 화학 변형을 촉매할 수 있다는 것을 증명한다. 특정 자가-절단 리보자임의 구조가 최적화되어 최대의 촉매 활성를 부여하며 또는 RNA 포스포디에스테르 절단에 대해 유의하게 더 빠른 속도를 보이는 전체적으로 신규한 RNA 모티프가 만들어질 수 있다는 것이 가능하다.
"해머 머리모양" 모델에 적합한 RNA 촉매에 의한 RNA 기질의 분자간 절단은 1987년에 최초 밝혀졌다(Uhlenbeck, O. C. (1987) Nature, 328: 596-600). RNA 촉매는 회수되고 다중 RNA 분자와 반응하여, 이것이 진정 촉매라는 것을 증명하였다.
"해머머리모양' 모티프에 기반하여 고안된 촉매성 RNA등을 사용하여 표적 서열과 염기 짝짓기에 필요한 것을 유지시키도록 촉매 RNA에서 적절한 염기 변화를 만듦으로써 특이적 표적 서열을 절단하였다. 이것은 촉매 RNA를 사용하여 특이적 표적 서열을 절단할 수 있으며, "해머머리모양" 모델에 따라 고안된 촉매성 RNA들은 생체 내에서 특이적 기질 RNA를 절단할 수 있다는 것을 나타낸다.
RNA 간섭(RNAi)은 포유동물 및 포유동물 세포에서 유전자 발현을 조절하는 강력한 도구가 되었다. 이러한 방법은 발현 플라즈미드나 바이러스 및 siRNAs로 가공되는 작은 헤어핀 RNA들에 대한 코딩 서열을 사용하여, RNA 자체 또는 DNA로서 작은 간섭 RNA(siRNA)의 전달을 요한다. 이러한 시스템은 프리-siRNA를 세포질로 효과적으로 전달할 수 있게 하고 세포질에서 이들은 활성적이며, 및 조절되고 조직 특이성 프로모터를 유전자 발현에 사용되도록 한다.
일 구체예에서, 올리고뉴클레오타이드 또는 안티센스 화합물은 리보핵산(RNA) 및/또는 데옥시리보핵산(DNA)의 올리고머나 폴리머, 또는 이의 의태물, 키메라, 유사체 또는 상동체를 포함한다. 이 용어는 천연 발생 뉴클레오타이드, 당 및 공유결합성 뉴클레오시트 간(백본) 연결로 구성되는 올리고뉴클레오타이드는 물론 유사하게 기능하는 비천연적으로 발생하는 부위를 가지는 올리고뉴클레오타이드를 포함한다. 그러한 변형된 또는 치환된 올리고뉴클레오타이드들은, 예를 들어, 향상된 세포 흡착, 표적 핵산에 대한 향상된 친화도 및 뉴클레아제 존재하에서 증가된 안정성 때문에, 천연 형태도 더 요구된다.
본 발명에 따라서, 상기 올리고뉴클레오타이드 또는 "안티센스 화합물"은 안티센스 올리고뉴클레오타이드(예컨대, RNA, DNA, 의태체, 키메라, 유사체 또는 동족체), 리보자임, 외부 가이드 서열(EGS) 올리고뉴클레오타이드, siRNA 화합물, siRNA 화합물과 같은 단일- 또는 이중 본쇄 RNA 간섭(RNAi) 화합물, saRNA, aRNA, 및 표적 핵산의 적어도 일부분과 하이브리드화하고 그 기능을 조절하는 다른 올리고머성 화합물을 포함한다. 그러한 것으로서, DNA, RNA, DNA-유사체, RNA-유사체, 또는 이의 혼합물일 수 있고 또는 이것들 중 하나 이상의 의태물일 수 있다. 이러한 화합물들은 단일-본쇄, 이중-본쇄, 환형 또는 헤어핀 올리고머성 화합물일 수 있고, 내부 또는 말단 벌지, 미스매치 또는 루프와 같은 구조적 요소를 포함할 수 있다. 안티센스 화합물은 일상적으로 선형으로 제조되나 결합될 수 있거나 다르게는 선형 및/또는 분지형으로 제조될 수 있다. 안티센스 화합물은, 예를 들어, 하이브리드화되어 완전 또는 부분적으로 이중본쇄의 화합물의 하이브리드화 및 형성을 허용하기에 충분한 자기-상보성을 가지는 전체적으로 또는 부분적으로 이중 본쇄의 화합물 또는 단일 본쇄를 형성하는 두 개의 본쇄와 같은 작제물을 포함할 수 있다. 상기 두 개의 본쇄는 내부적으로 연결되어서 자유 3' 또는 5' 말단을 남길 수 있고 또는 연결되어 연속적인 헤어핀 구조 또는 루프를 형성할 수 있다. 상기 헤어핀 구조는 5' 또는 3' 말단 상에서 오버행을 포함하여 단일 본쇄 특성의 돌출부를 형성할 수 있다. 상기 이중 본쇄 화합물은 조건적으로 말단에 오버행을 포함할 수 있다. 더구나, 변형은 선택된 말단, 선택된 뉴클레오타이드 위치, 당 위치 또는 뉴클레오시드간 연결체 중 하나에 부착된 접합체 군을 포함할 수 있다. 대안적으로, 상기 두 개의 본쇄는 비-핵산 분체 또는 연결 군에 의해 연결될 수 있다. 오직 하나의 본쇄로부터 형성될 때, dsRNA는 자체에서 이중화되어 듀플렉스를 형성하는 자기-상보적 헤어핀-유형 분자의 형태를 취할 수 있다. 따라서, 상기 dsRNA는 완전히 또는 부분적으로 이중 본쇄일 수 있다. 유전자 발현의 특이적 조절은 형질전환(transgenic) 세포 계열에서 dsRNA 헤어핀을 안정적으로 발현시킴으로써 달성될 수 있다. 두 개의 본쇄 또는 자체에서 이중화되어 듀플렉스를 형성하는 자기-상보성 헤어핀 유형 분자의 형태를 띠는 단일 본쇄로부터 형성될 때, 상기 두 개의 본쇄(또는 단일 본쇄의 듀플렉스-형성 부위)는 왓슨-크릭 형태로 염기 쌍을 짓는 상보적 RNA 본쇄이다.
일단 시스템으로 도입되면, 본 발명의 화합물은 하나 이상의 효소 또는 구조 단백질의 활동을 이끌어내서 표적 핵산의 절단 또는 다른 변형을 실행하게 하거나 또는 점유에 기초한 기작을 통해 작용할 수 있다. 일반적으로, 핵산들(올리고뉴클레오타이드들을 포함하는)은 "DNA-유사체"(즉, 일반적으로 하나 이상의 2'-데옥시 당 및 일반적으로 U 염기보다는 T을 가지는) 또는 "RNA-유사체"(즉, 일반적으로 하나 이상의 2'-하이드록실 또는 2'-변형된 당 및 T 염기보다는 U를 가지는)로서 설명될 수 있다. 핵산 나선 구조는 하나 유형 이상의 구조, 가장 통상적으로는 A- 및 B-형태를 취한다. 일반적으로, B-형태-유사 구조를 가지는 올리고뉴클레오타이드는 "DNA-유사체"이고 A-형태 유사 구조를 가지는 것은 "RNA-유사체"인 것으로 판단된다. 특정 (키메릭) 구체예에서, 안티센스 화합물은 A- 및 B-형태 부위를 둘 다 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 안티센스 화합물들은 약 5 내지 약 80개 뉴클레오타이드(즉 약 5 내지 약 80개 연결된 뉴클레오시드) 길이의 안티센스 부분을 포함할 수 있다. 이것은 안티센스 본쇄의 길이 내지 안티센스 화합물의 부분을 지칭한다. 환언하면, 본 발명의 단일-본쇄 안티센스 화합물은 5 내지 약 80개 뉴클레오타이드를 포함하고 본 발명의 이중 본쇄 안티센스 화합물은 (예를 들어 dsRNA와 같은) 길이가 5 내지 80개 뉴클레오타이드인 센스 및 안트센스 본쇄 또는 부분을 포함한다. 당해 분야의 통상의 기술자는 이것은 길이가 5, 6, 7,8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 또는 80개 뉴클레오타이드인 안티센스 부분을 또는 이 속의 임의의 범위를 표시하는 것으로 이해할 것이다.
일 구체예에서, 본 발명의 안티센스 화합물은 길이가 10 내지 50개 뉴클레오타이드인 안티센스 부분을 가진다. 해당분야의 통상의 기술자는 이것은 길이가 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50개 뉴클레오타이드인 또는 이 중에서 임의의 범위의 안티센스 부분을 가지는 올리고뉴클레오타이드를 구체화하는 것으로 이해할 것이다. 특정 구체예에서, 상기 올리고뉴클레오타이드는 길이가 15 개 뉴클레오타이드인 것이다
일 구체예에서, 본 발명의 안티센스 또는 올리고뉴클레오타이드 화합물은 길이가 12 또는 13 내지 30개 뉴클레오타이드인 안티센스 부분을 가진다. 당해분야의 통상의 기술자는 이것은 길이가 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30개 뉴클레오타이드인 또는 이 속의 임의의 범위인 안티센스 부분을 가지는 안티센스 화합물을 구체화한다는 것을 이해할 것이다.
일 구체예에서, 본 발명의 올리고머성 화합물은 상기 화합물에서 하나 이상의 뉴클레오타이드 위치에서 상이한 염기가 존재하는 변이체를 포함한다. 예를 들어, 첫 번 뉴클레오타이드가 아데노신이라면, 이 위치에서 티미딘, 구아노신, 시티딘 또는 다른 천연 또는 비천연 뉴클레오타이드를 포함하는 변이체들이 생성될 수 있다. 이것은 상기 안티센스 또는 dsRNA 화합물의 임의의 위치에서 행하여 질 수 있다. 이러한 화합물들은 본 발명에서 설명된 방법을 사용하여 표적 핵산의 발현을 저해하는 능력을 결정하는 것에 대해 시험할 수 있다..
특정 구체예에서, 상기 안티센스 화합물과 표적 간의 상동성, 서열 일치성 또는 상보성은 약 40% 내지 약 60%이다. 특정 구체예에서, 상동성, 서열 일치성 또는 상보성은 약 60% 내지 약 70%이다. 특정 구체예에서, 상동성, 서열 일치성 또는 상보성은 약 70% 내지 약 80%이다. 특정 구체예에서, 상동성, 서열 일치성 또는 상보성은 약 80% 내지 약 90%이다. 특정 구체예에서, 상동성, 서열 일치성 또는 상보성은 약 90%, 약 92%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 또는 약 100%이다.
일 구체예에서, 예를 들어, 서열번호 2 내지 14에서 설정된 핵산 분자와 같은, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 하나 이상의 치환 또는 변형을 포함한다. 일 구체예에서, 상기 뉴클레오타이드는 잠금 핵산(LNA)으로 치환된다.
일 구체예에서, 상기 올리고뉴클레오타이드는 UCP2과 관련된 코딩 및/또는 비코딩 서열의 핵산 분자 센스 및/또는 안티센스의 하나 이상의 부위를 및 서열번호 1 내지 3에 설정된 서열을 표적화한다. 상기 올리고뉴클레오타이드는 또한 서열번호 1 내지 3의 중첩 부위에 표적화된다.
본 발명의 특정 바람직한 올리고뉴클레오타이드는 키메릭 올리고뉴클레오타이드이다. 본 발명의 맥락에서 "키메릭 올리고뉴클레오타이드" 또는 "키메라"는 두 개 이상의 화학적으로 구별되는 부위를 포함하는, 각각은 적어도 하나의 뉴클레오타이드로 구성되는, 올리고뉴클레오타이드이다. 이러한 올리고뉴클레오타이드는 일반적으로, 하나 이상의 유익한 특성(예를 들어, 증가된 뉴클레아제 내성, 세포 내로의 증가된 흡수, 표적에 대한 증가된 결합 친화도와 같은)을 부여하는, 변형된 뉴클레오타이드의 적어도 하나의 부위, 및 RNA:DNA 또는 RNA:RNA 하이브리드를 절단할 수 있는 효소에 기질인 부위를 포함한다. 예로써, RNase H는 RNA:DNA 듀플렉스의 RNA 본쇄를 절단하는 세포성 엔도뉴클레아제이다. RNase H를 활성화시키면, 따라서, RNA 표적의 절단을 결과하게 되고, 이로써 유전제 발현의 안티센스 조절의 효율을 크기 향상시키게 된다. 결론적으로, 키메릭 올리고뉴클레오타이드를 사용할 때, 동일한 표적 부위에 하이브리드화하는 포스포로티오에이트 데옥시올리고뉴클레오타이드와 비교하여, 더 짧은 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 비견될 만한 결과를 얻을 수 있다. RNA 표적의 절단은 일상적으로 젤 전기영동으로 검출될 수 있고, 필요시, 해당분야에 공지된 관련 핵산 하이브리드화 기술에 의해 검출될 수 있다. 일 구체예에서, 키메릭 올리고뉴클레오타이드는 표적 결합 친화도를 증가시키도록 변형된 적어도 하나의 부위, 및 통상적으로, RNAse H에 대한 기질로서 작용하는 부위를 포함한다. 이러한 표적(이 경우, ras 암호화 핵산)에 대한 올리고뉴클레오타이드의 친화도는 올리고뉴클레오타이드 및 표적이 해리될 때의 온도인 올리고뉴클레오타이드/표적 쌍의 Tm을 측정함으로써 결정된다; 해리는 분광학적으로 검출된다. Tm이 높을수록, 표적에 대한 올리고뉴클레오타이드의 친화도는 커진다.
본 발명의 키메릭 안티센스 화합물은 전술한 바와 같은 두 개 이상의 올리고뉴클레오타이드, 변형된 올리고뉴클레오타이드, 올리고 뉴클레오시드 및/또는 올리고뉴클레오타이드 의태물의 복합 구조물로서 형성될 수 있다. 그러한 화합물은 당해분야에 하이브리드물 또는 갭머(gapmer)로 지칭된다. 그러한 하이브리드 구조체의 제조를 교시하는 대표적인 미국 특허는 미국 특허 제5,013,830호; 제5,149,797호; 제5, 220,007호; 제5,256,775호; 제5,366,878호; 제5,403,711호; 제5,491,133호; 제5,565,350호; 제5,623,065호; 제5,652,355호; 제5,652,356호; 및 제5,700,922호를 포함하나, 이에 한정되지 않으며, 이들 각각은 본 발명의 참조문헌으로 기입된다.
일 구체예에서, 변형된 올리고뉴클레오타이드의 부위는 당의 2' 위치에서 변형된 적어도 하나의 뉴클레오타이드, 가장 바람직하게는 2'-O-알킬, 2'-O-알킬-O-알킬 또는 2'-플루오로-변형 뉴클레오타이드를 포함한다. 다른 구체예에서, RNA 변형은 RNA의 3' 말단에 있는 피리미딘류, 비염기성 잔기 또는 역전된 염기의 리보스 상에서의 2'-플루오로, 2'-아미노 및 2'-O-메틸 변형을 포함한다. 그러한 변형은 일상적으로 올리고뉴클레오타이드에 혼입될 수 있고, 이러한 올리고뉴클레오타이드들은 주어진 표적에 대하여, 2'-데옥시올리고뉴클레오타이드보다 더 높은 Tm(즉, 더 높은 표적 결합 친화도)를 가지는 것으로 나타난다. 그러한 증가된 친화도의 효과는 유전자 발현의 RNAi 올리고뉴클레오타이드 저해를 더 크게 향상시킨다. RNAse H는 RNA:DNA 듀플렉스의 RNA 본쇄를 절단하는 세포성 엔도뉴클레아제이다; 이러한 효소를 활성화시키면 따라서 RNA 표적의 절단을 결과하게 되고, RNAi 저해의 효율을 크게 향상시킬 수 있다. RNA 표적의 절단은 젤 전기영동에 의해 통상 증명될 수 있다. 일 구체예에서, 상기 키메릭 올리고뉴클레오타이드는 또한 뉴클레아제 저항을 향상시키도록 변형된다. 세포들은 핵산을 분해할 수 있는 다양한 엑소- 및 엔도-뉴클레아제를 포함한다. 많은 뉴클레오타이드 및 뉴클레오시드 변형은 이들이 혼입된 올리고뉴클레오타이드가 천연 올리로데옥시뉴클레오타이드 보다 뉴클레아제 절단에 더 내성적으로 만드는 것으로 나타났다. 뉴클레아제 내성은 올리고뉴클레오타이드를 세포 추출물 또는 분리된 뉴클레아제 용액과 항온처리하고 시간에 따라 잔류한 온전한 올리고뉴클레오타이드의 양을, 통상적으로는 젤 전기영동에 의해 측정함으로써 측정된다. 뉴클레아제 내성을 향상시키도록 변형된 올리고뉴클레오타이드는 비변형된 올리고뉴클레오타이드보다 더 오랫동안 온전히 살아남는다. 다양한 올리고뉴클레오타이드 변형은 뉴클레아제 내성을 향상시키거나 부여한다는 것이 증명되었다. 적어도 하나의 포스포로티오에이트 변형을 포함하는 올리고뉴클레오타이드는 현재 더욱 바람직하다. 특정의 경우, 표적 결합 친화도를 향상시키는 올리고뉴클레오타이드 변형은 또한, 독립적으로 뉴클레아제 내성을 향상시킬 수 있다.
본 발명에 대하여 고려되는 특정의 바람직한 올리고뉴클레오타이드의 예는, 변형된 백본을 포함하는 것들, 예를 들어 포스포로티오에이트, 포스포트리에스테르, 메틸 포스포네이트, 짧은 사슬 알킬 또는 시클로알킬 당분체간 연결체 또는 짧은 사슬 헤테로아톰 또는 헤테로시클릭 당분체간 연결체를 포함한다. 가장 바람직한 것은 포스포로티오에이트 백본을 가진 올리고뉴클레오타이드 및 헤테로아톰 백본을 가진 것, 특히 CH2 --NH--O--CH2, CH,--N(CH3)--O--CH2 [메틸렌(메틸이미노) 또는 MMI 백본으로 알려진], CH2 --O--N (CH3)--CH2, CH2 -N (CH3)--N (CH3)--CH2 및 O--N (CH3)--CH2 --CH2 백본을 가진 것으로서, 여기서 천연 포스포디에스테르 백본은 O--P--O--CH으로 표시된다). De Mesmaeker 등.(1995) Acc. Chem. Res. 28:366-374에 의해 개시된 아미드 백본들 또한 바람직하다. 또한 바람직한 것은 모르폴리노 백본 구조체를 가진 올리고뉴클레오타이드이다(Summerton 및 Weller, 미국 특허 제5,034,506호). 다른 구체예에서, 펩타이드 핵산(PNA) 백본과 같은, 올리고뉴클레오타이드의 포스포디에스테르 백본은 폴리아미드 백본으로 대체되면, 상기 뉴클레오타이드는 폴리아미드 백본의 aza 질소 원자에 직접 또는 간접적으로 결합된다. 올리고뉴클레오타이드는 또한 하나 이상의 치환된 당 분체를 포함할 수 있다. 바람직한 올리고뉴클레오타이드들은 2' 위치에서 하기의 것 중 하나를 포함한다: OH, SH, SCH3, F, OCN, OCH3 OCH3, OCH3 O(CH2)n CH3, O(CH2)n NH2 or O(CH2)n CH3 여기서 n은 1 내지 약 10이고; C1 내지 C10 저급 알킬, 알콕시알콕시, 치환된 저급 알킬, 알카릴 또는 아랄킬; Cl; Br; CN; CF3; OCF3; O--, S--, 또는 N-알킬; O--, S--, 또는 N-알케닐; SOCH3; SO2 CH3; ONO2; NO2; N3; NH2; 헤테로시클로알킬; 헤테로시클로알카릴; 아미노알킬아미노; 폴리알킬아미노; 치환된 실릴; RNA 절단 기; 리포터 기; 인터칼레이터; 올리고뉴클레오타이드의 약력학적 특성을 향상시키는 기; 또는 올리고뉴클레오타이드의 약동학적 특성을 향상시키는 기 및 유사한 특성을 가지는 다른 치환체. 바람직한 변형은 2'-메톡시에톡시 [2'-O-CH2 CH2 OCH3, 또한 2'-O-(2-메톡시에틸)로도 알려진]을 포함한다. 다른 바람직한 변형은 2'-메톡시 (2'-O--CH3), 2'-프로폭시 (2'-OCH2 CH2CH3) 및 2'-플루오로 (2'-F)를 포함한다. 유사한 변형은 또한 올리고뉴클레오타이드 상에서 다른 위치, 특히 3' 말단 뉴클레오타이드 상의 당의 3' 위치 및 5' 말단 뉴클레오타이드의 5' 위치에서 만들어 질 수 있다. 올리고뉴클레오타이드는 또한 펜토퓨라노실 기 대신에 시클로부틸과 같은 당 의태체를 가질 수 있다.
올리고뉴클레오타이드는 또한, 추가로 또는 대안적으로, 뉴클레오염기(해당 분야에서 단순히 "염기"로 지칭) 변형 또는 치환을 포함할 수 있다. 본 발명에서 사용된 바와 같이, "비변형된" 또는 "천연" 뉴클레오타이드는 아데닌(A), 구아닌(G), 티민(T), 시토신(C) 및 유라실(U)을 포함한다. 변형된 뉴클레오타이드는 천연 핵산에서 희귀하게 또는 일시적으로만 발견되는 뉴클레오타이드, 예컨대, 하이포크산틴, 6-메틸아데닌, 5-Me 피리미딘, 특히 5-메틸시토신(5-메틸-2' 데옥시시토신 및 당해분야에서는 5-Me-C로 지칭되는), 5-하이드록시메틸시토신(HMC), 글리코실 HMC 및 젠토비오실 HMC는 물론 합성 뉴클레오타이드, 예를 들어, 2-아미노아데닌, 2-(메틸아미노)아데닌, 2-(이미다졸릴알킬)아데닌, 2-(아미노알킬아미노)아데닌 또는 다른 헤테로치환된 알킬아데닌, 2-티오유라실, 2-티오티민, 5- 브로모유라실, 5-하이드록시메틸유라실, 8-아자구아닌, 7-데아자구아닌, N6(6-아미노헥실)아데닌 및 2,6-디아미노퓨린을 포함한다. 당해 분야에 공지된 "통괄적인(universal)" 염기, 즉 이노신을 포함할 수 있다. 5-Me-C 치환은 0.6-1.2ºC 만큼 핵산 듀플렉스 안정성을 증가시키는 것으로 나타났고 현재 바람직한 염치 치환이다.
본 발명의 올리고뉴클레오타이드의 다른 변형은 올리고뉴클레오타이드의 활성 또는 세포 흡수를 향상시키는 하나 이상의 분체나 접합체를 올리고뉴클레오타이드에 화학적으로 연결하는 것을 포함한다. 그러한 분체는 콜레스테롤 분체, 콜레스테릴 분체, 지방족 사슬, 예를 들어, 도데칸디올 또는 운데실 잔기, 폴리아민 또는 폴리에틸렌 글리콜 사슬 또는 아다만탄 아세트산을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 친유성 분체를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 및 그러한 올리고뉴클레오타이드를 제조하는 방법은 예를 들어, 미국 특허 제5,138,045호, 제5,218,105호 및 제5,459,255호에 공지되어 있다.
주어진 올리고뉴클레오타이드의 모든 위치가 균일하게 변형될 필요가 없고, 실제 전술한 변형의 하나 이상이 단일 올리고뉴클레오타이드에, 또는 올리고뉴클레오타이드 내의 심지어 단일 뉴클레오시드 내에서 혼입될 수 있다. 본 발명은 또한 상기 정의된 바와 같은 키메릭 올리고뉴클레오타이드인 올리고뉴클레오타이드를 포함한다.
다른 관점에서, 본 발명의 핵산 분자는 비염기성 뉴클레오타이드, 폴리에터, 폴리아민, 폴리아미드, 펩타이드, 탄수화물, 지질 또는 폴리탄화수소 화합물을 포함하나 이에 한정되지 않는 다른 분체와 접합될 수 있다. 당해 분야의 숙련자는 이러한 분자들이 당, 염기 또는 포스페이트 기 상의 몇 개 위치에서 핵산 분자를 포함하는 하나 이상의 임의의 뉴클레오타이드에 연결될 수 있다는 것을 인식할 것이다.
본 발명에 따라 사용되는 올리고뉴클레오타이드는 고형상 합성법의 공지된 기술을 통해 편리하게 그리고 통상적으로 만들어질 수 있다. 그러한 합성용 장비는 Applied Biosystems를 위시한 판매사에 의해 판매된다. 그러한 합성의 임의의 다른 수단이 또한 사용될 수 있다; 상기 올리고뉴클레오타이드의 실제 합성은 당해 분야의 통상의 기술자의 능력 내에 있다. 또한 유사한 기술을 사용하여 포스포로티오에이트 및 알킬화된 유도체와 같은 다른 올리고뉴클레오타이드를 제조하는 것이 공지되어 있다. 또한 유사한 기술 및 비오틴, 플루오레세인, 아크리딘 또는 소랄렌-변형 아미다이트 및/또는 CPG(버지니아주의 스털링시에 소재한 Glen Research로부터 입수가능한)과 같은 상업적으로 이용가능한 변형된 아미다이트 미 제어된 포어 글래스(controlled-pore glass: CPG) 생산품을 사용하여 형광적으로 표지된, 비오티닐화된 또는, 콜레스테롤-변형올리고뉴클레오타이드와 같은 다른 변형된 올리고뉴클레오타이드를 합성하는 것이 공지되어 있다.
본 발명에 따라서, MOE, ANA, FANA, PS 등과 같은 현재의 화학으로 구성된 올리고뉴클레오타이드의 활동의 능력, 특이성 및 기간을 향상시키고 및 투여 경로를 확장시키기 위한, LNA 단량체의 용도와 같은 변형물의 용도가 제공된다. 이것은 현재 올리고뉴클레오타이드 내의 단량체중 일부를 LNA 단량체로 치환함으로써 성취될 수 있다. LNA 변형된 올리고뉴클레오타이드는 모 화합물과 유사한 크기를 가지거나 더 크거나 바람직하게는 더 작을 수 있다. 그러한 LNA-변형 올리고뉴클레오타이드가 약 70% 이하, 더 바람직하게는 약 60% 이하, 가장 바람직하게는 50%이하의 LNA 단량체를 포함하며 그들 크기는 약 5와 25개 뉴클레오타이드 사이, 더욱 바람직하게는 약 12 내지 20개 뉴클레오타이드인 것이 바람직하다.
바람직한 변형된 올리고뉴클레오타이드 백본은 포스포로티오에이트, 키랄 포스포로티오에이트s, 포스포로디티오에이트, 포스포트리에스테르, 아미노알킬포스포트리에스테르, 3' 알킬렌 포스포네이트 및 키랄 포스포네이트를 위시한 메틸 및 다른 알킬 포스포네이트, 포스피네이트, 3'-아미노 포스포아미데이트 및 아미노알킬포스포아미데이트, 티오노포스포아미데이트를 위시한 포스포아미데이트, 티오노알킬포스포네이트, 티오노알킬포스포트리에스테르, 및 정상 3'-5' 연결체를 가진 보라노포스페이트, 이들의 2'-5'연결 유사체, 및 뉴클레오시드 단위체들의 인접 쌍이 3'-5' 내지 5'-3' 또는 2'-5' 내지 5'-2' 연결된 역전된 극성을 가지는 것을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 다양한 염, 혼합된 염 및 자유 산 형태 또한 포함된다.
상기 인 함유 연결체의 제조를 교시하는 대표적인 미국 특허들은 미국 특허 제3,687,808호; 제4,469,863호; 제4,476,301호; 제5,023,243호; 제5,177,196호; 제5,188,897호; 제5,264,423호; 제5,276,019호; 제5,278,302호; 제5,286,717호; 제5,321,131호; 제5,399,676호; 제5,405,939호; 제5,453,496호; 제5,455,233호; 제5,466,677호; 제5,476,925호; 제5,519,126호; 제5,536,821호; 제5,541,306호; 제5,550,111호; 제5,563,253호; 제5,571,799호; 제5,587,361호; 및 제5,625,050호를 포함하나 이에 한정되지 않으며, 이들 각각은 본 명세서에 참조문헌에 기입된다.
인 원자를 포함하지 않는 바람직한 변형된 올리고뉴클레오타이드 백본은 단쇄 알킬 또는 시클로알킬 뉴클레오시드 간 연결체, 혼합된 헤테로원자 및 알킬 또는 시클로알킬 뉴클레오시드 간 연결체, 도는 하나 이상의 단쇄 헤테로원자 또는 헤테로시클릭 뉴클레오시드 간 연결체에 의해 형성된 백본을 가진다. 이러한 것은 모르폴리노 연결체(부분적으로 뉴클레오시드의 당 부분으로부터 형성된)를 가지는 것들을 포함한다; 실옥산 백본; 설파이드, 설폭사이드 및 설폰 백본; 포름아세틸 및 티오포름아세틸 백본; 메틸렌 포름아세틸 및 티오포름아세틸 백본; 알켄 함유 백본; 설파에미트 백본; 메틸렌이미노 및 메틸렌하이드라지노 백본; 설포네이트 및 설폰아미드 백본; 아미드 백본; 및 혼합된 N, O, S 및 CH2 성분 을 함유한 다른 것들.
상기 올리고뉴클레오시드의 제조를 교시한 대표적인 미국 특허는 미국 특허 제5,034,506호; 제5,166,315호; 제5,185,444호; 제5,214,134호; 제5,216,141호; 제5,235,033호; 제5,264, 562호; 제5,264,564호; 제5,405,938호; 제5,434,257호; 제5,466,677호; 제5,470,967호; 제5,489,677호; 제5,541,307호; 제5,561,225호; 제5,596, 086호; 제5,602,240호; 제5,610,289호; 제5,602,240호; 제5,608,046호; 제5,610,289호; 제5,618,704호; 제5,623,070호; 제5,663,312호; 제5,633,360호; 제5,677,437호; 및 제5,677,439호를 포함하나 이에 한정되지 않고, 이들 각각은 본 명세서에서 참조문헌에 기입된다.
다른 바람직한 올리고뉴클레오타이드 의태물에서, 당 및 뉴클레오시드 간 연결체 둘 다, 즉 뉴클레오타이드 단위체의 백본은 신규 기로 대체될 수 있다. 염기 단위체가 적절한 핵산 표적 화합물과의 하이브리드화를 위해 유지된다. 하나의 그러한 올리고머성 화합물, 뛰어난 하이브리드화 특성을 가진 것으로 나타난 올리고뉴클레오타이드 의태체는 펩타이드 핵산(peptide nuclic acid:PNA)일 수 있다. PNA 화합물에서, 올리고뉴클레오타이드의 당-백본은 아미드 함유 백본, 특히 아미노에틸글리신 백본으로 대체된다. 뉴클레오염기가 유지되고 백본의 아미드 부분의 아자 질소 원자에 직접 또는 간접적으로 결합된다. PNA 화합물의 제조를 교시하는 대표적인 미국 특허는 미국 특허 제 5,539,082호; 제5,714,331호; 및 제5,719,262호를 포함하나 이에 한정되지 않고, 이들의 각각은 본 명세서에서 참조문헌으로 기입된다. PNA 화합물의 추가 교시는 문헌[Nielsen, et al., (1991) Science 254, 1497-1500]에서 발견될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 포스포로티오에이트 백본을 가지는 올리고뉴클레오타이드 및 헤테로원자 백본을 가지는 올리고뉴클레오시드, 및 특히 메틸렌 (메틸이미노) 또는 MMI 백본으로 알려진 -CH2-NH-O-CH2-,-CH2-N (CH3)-O-CH2-, CH2-O-N (CH3)-CH2-,-CH2N(CH3)-N(CH3) CH2-및 -O-N(CH3)-CH2-CH2-을 가진 올리고뉴클레오시드가 바람직하고, 여기거, 천연 포스포디에스테르 백본은 상기 참조된 미국 특허 제5,489,677호의 -O-P-O-CH2-로서 및 상기 참조된 미국 특허 제5,602,240호의 아미드 백본으로서 표시된다. 또한 바람직한 것은 상기 참조된 미국 특허 제5,034,506호의 모르폴리노 백본 구조를 가지는 올리로뉴클레오타이드이다.
변형된 올리고뉴클레오타이드는 또한 하나 이상의 치환된 당 분체를 포함할 수 있다. 바람직한 올리고뉴클레오타이드는 2' 위치에서 하기 것 중 하나를 포함한다: OH; F; O-, S-, or N-알킬; O-, S-, 또는 N-알케닐; O-, S- 또는 N-알키닐; 또는 O 알킬-O-알킬, 여기서 알킬, 알케닐 및 알키닐은 C 에서 CO 알킬 또는 C2 에서 CO 알케닐 및 알키닐로 치환되거나 치환되지 않을 수 있다. 특히 바람직한 것은 O (CH2)n OmCH3, O(CH2)n,OCH3, O(CH2)nNH2, O(CH2)nCH3, O(CH2)nONH2, 및 O(CH2nON(CH2)nCH3)2이고 여기서 n 및 m은 1 내지 약 10일 수 있다. 다른 바람직한 올리고뉴클레오타이드는 2' 위치에서 하기 것 중 하나를 포함한다: C 에서 CO로, (저급 알킬, 치환된 저급 알킬, 알카릴, 아르알킬, O-알카릴 또는 O-아르알킬, SH, SCH3, OCN, Cl, Br, CN, CF3, OCF3, SOCH3, SO2CH3, ONO2, NO2, N3, NH2, 헤테로시클로알킬, 헤테로시클로알카릴, 아미노알킬아미노, 폴리알킬아미노, 치환된 실릴, RNA 절단기, 리포터 기, 인터칼레이터, 올리고뉴클레오타이드의 약력학적 특성을 향상시키는 기; 또는 올리고뉴클레오타이드의 약동학적 특성을 향상시키는 기 및 유사한 특성을 가지는 다른 치환체. 바람직한 변형은 2'-메톡시에톡시 [2'-O-CH2 CH2 OCH3, 또한 2'-O-(2-메톡시에틸) 또는 2'-MOE 로도 알려진], 예 알콕시알콕시 기를 포함한다. 다른 바람직한 변형은 후술하는 실시예에서 설명되는 바와 같이, DMAOE로 또한 공지된 2'-디메틸아미노옥시에톡시, 예컨대, O(CH2)2ON(CH3)2 기, 및 2'-디메틸아미노에톡시에톡시(해당분야에서 2'-O-디메틸아미노에톡시에틸 또는 2'- DMAEOE로 공지된), 예컨대, 2'-O-CH2-O-CH2-N (CH2)2.를 포함한다.
다른 바람직한 변형은 2'-메톡시 (2'-O CH3), 2'-아미노프로폭시(2'-O CH2CH2CH2NH2) 및 2'-플루오로(2'-F)를 포함한다. 유사한 변형이 상기 올리고뉴클레오타이드 상의 다른 위치, 특히 3' 말단 뉴클레오타이드 또는 2'-5' 연결된 올리고뉴클레오타이드 상의 당의 3' 위치 및 5' 말단 뉴클레오타이드의 5' 위치에서 이루어질 수 있다. 올리고뉴클레오타이드는 또한 펜타퓨라노실 당 대신에 시클로부틸 분체와 같은 당 의태물을 가질 수 있다. 그러한 변형된 당 구조의 제조를 교시하는 대표적인 미국 특허는 미국 특허 제4,981,957호; 제5,118,800호; 제5,319,080호; 제5,359,044호; 제5,393,878호; 제5,446,137호; 제5,466,786호; 제5,514,785호; 제5,519,134호; 제5,567,811호; 제5,576,427호; 제5,591,722호; 제5,597,909호; 제5,610,300호; 제5,627,053호; 제5,639,873호; 제5,646,265호; 제5,658,873호; 제5,670,633호; 및 제5,700,920호를 포함하나 이에 한정되지 않고, 이들 각각은 참조문헌에 기입된다.
올리고뉴클레오타이드는 또한 뉴클레오염기(당해 분야에서 단순히 "염기"로 지칭) 변형 또는 치환을 또한 포함할 수 있다. 본 발명에서 사용된 바와 같이, "비변형" 또는 "천연" 뉴클레오타이드들은 퓨린 염기들인 아데닌(A) 및 구아닌(G), 및 피리미딘 염기인 티민(T), 시토신(C) 및 유라실(U)을 포함한다. 변형된 뉴클레오타이드들은 5-메틸시토신(5-me-C), 5-하이드록시메틸 시토신, 크산틴, 하이포크산틴, 2- 아미노아데닌, 아데닌과 구아닌의 6-메틸과 다른 알킬 유도체, 아데닌과 구아닌의 2-프로필과 다른 알킬 유도체, 2-티오유라실, 2-티오티민과 2-티오시토신, 5-할로유라실 및 시토신, 5-프로피닐 유라실과 시토신, 6-아조 유라실, 시토신과 티민, 5-유라실(슈도-유라실), 4-티오유라실, 8-할로, 8-아미노, 8-티올, 8-티오알킬, 8-하이드록실 및 다른 8-치환된 아데닌과 구아닌, 5-할로 특히 5-브로모, 5-트리플루오로메틸과 다른 5-치환된 유라실과 시토신, 7-메틸퀴아닌과 7-메틸아데닌, 8-아자구아닌과 8-아자아데닌, 7-데아자구아닌과 7-데아자아데닌 및 3-데아자구아닌과 3-데아자아데닌과 같은 다른 합성 및 천연 뉴클레오타이드를 포함한다.
더욱이, 뉴클레오타이드는 미국 특허 제3,687,808호에 개시된 것, 문헌['The Concise Encyclopedia of Polymer Science And Engineering', pages 858-859, Kroschwitz, J.I., ed. John Wiley & Sons, 1990]에 개시된 것, 문헌[Englisch et al., ‘Angewandle Chemie, International Edition', 1991, 30, page 613]에 개시된 것 및 문헌[Sanghvi, Y.S., Chapter 15, ‘Antisense Research and Applications', pages 289-302, Crooke, S.T. and Lebleu, B. ea., CRC Press, 1993]에 개시된 것을 포함한다. 이러한 뉴클레오타이드들 중 특정한 것은 본 발명의 올리고머성 화합물들의 결합 친호도를 증가시키는 것에 특히 유용하다. 이러한 것들은 2-아미노프로필아데닌, 5-프로피닐유라실 및 5-프로피닐시토신을 위시한 N-2, N-6 및 0-6 치환된 퓨린을 포함한다. 5-메틸시토신 치환은 0.6-1.2℃만큼 핵산 듀플렉스 안정성을 증가시키는 것으로 나타났고(Sanghvi, Y.S., Crooke, S.T. and Lebleu, B., eds, ‘안티센스 Research and Applications', CRC Press, Boca Raton, 1993, pp. 276-278) 및 현재 바람직한 염기 치환으로서, 특히 2'-O메톡시에틸 당 변이와 조합될 때는 더욱 바람직하다.
상기 변형된 뉴클레오타이드는 물론 다른 변형된 뉴클레오타이드를 제조하는 것을 교시한 대표적인 미국 특허는 미국 특허 제3,687,808호; 제4,845,205호; 제5,130,302호; 제5,134,066호; 제5,175,273호; 제5,367,066호; 제5,432,272호; 제5,457,187호; 제5,459,255호; 제5,484,908호; 제5,502,177호; 제5,525,711호; 제5,552,540호; 제5,587,469호; 제5,596,091호; 제5,614,617호; 제5,750,692호 및 제5,681,941호를 포함하나 이에 한정되지 않고, 이들 각각은 참조문헌에 기입된다.
본 발명의 올리고뉴클레오타이드의 다른 변형은 상기 올리고뉴클레오타이드의 활성, 세포 분포 및 세포 흡수를 향상시키는 하나 이상의 분체 또는 접합체를 상기 올리고뉴클레오타이드에 화학적으로 연결하는 것을 포함한다
그러한 분체는, 콜레스테롤 분체, 콜릭 산, 티오에터, 예컨대, 헥실-S-트리티올, 티오콜레스테롤, 지방족 사슬, 예컨대, 도데칸디올 또는 운데실 잔기, 인지질, 예컨대, 디헥사데실-rac-글리세롤 또는 트리에틸암모니움 1,2-디-O-헥사데실-rac-글리세로-3-H-포스포네이트, 폴리아민 또는 폴리에틸렌 글리콜 사슬 또는 아다만탄 아세트 산, 팔미틸 분체 또는 옥타데실아민 또는 헥실아미노-카르보닐-t 옥시콜레스테롤 분체와 같은 지질 분체를 포함하나 이에 한정되지 않는다.
그러한 올리고뉴클레오타이드 접합체의 제조를 교시하는 대표적인 미국 특허는 미국 특허 제4,828,979호; 제4,948,882호; 제5,218,105호; 제5,525,465호; 제5,541,313호; 제5,545,730호; 제5,552, 538호; 제5,578,717, 5,580,731호; 제5,580,731호; 제5,591,584호; 제5,109,124호; 제5,118,802호; 제5,138,045호; 제5,414,077호; 제5,486, 603호; 제5,512,439호; 제5,578,718호; 제5,608,046호; 제4,587,044호; 제4,605,735호; 제4,667,025호; 제4,762,779호; 제4,789,737호; 제4,824,941호; 제4,835,263호; 제4,876,335호; 제4,904,582호; 제4,958,013호; 제5,082, 830호; 제5,112,963호; 제5,214,136호; 제5,082,830호; 제5,112,963호; 제5,214,136호; 제5,245,022호; 제5,254,469호; 제5,258,506호; 제5,262,536호; 제5,272,250호; 제5,292,873호; 제5,317,098호; 제5,371,241, 5,391, 723호; 제5,416,203, 5,451,463호; 제5,510,475호; 제5,512,667호; 제5,514,785호; 제5,565,552호; 제5,567,810호; 제5,574,142호; 제5,585,481호; 제5,587,371호; 제5,595,726호; 제5,597,696호; 제5,599,923호; 제5,599, 928호 및 제5,688,941호를 포함하나 이에 한정되지 않고, 이들 각각은 본 명세서에 참조문헌에 기입된다.
약물 발견: 본 발명의 화합물은 약물 발견 및 표적 실증의 분야에 적용될 수 있다. 본 발명은 상기 화합물 및 확인된 바람직한 표적 세그먼트를 커플링 방지 단백질 2(UCP2) 폴리뉴클레오타이드 및 질병 상태, 표현형 또는 조건 사이에 존재하는 관계를 설명하는 약물 발견의 노력에 사용하는 것을 포괄한다. 이러한 방법은 UCP2 폴리뉴클레오타이드을 검출하거나 조절하는 것을 포함하는 것으로서, 샘플, 조직, 세포 또는 유기체를 본 발명의 화합물과 접촉시키고, 특정 시간에 UCP2 폴리뉴클레오타이드 및/또는 관련 표현형 도는 화학적 종말점의 핵산 또는 단백질 수준을 측정하고 및 조건적으로 측정치를 비처리된 샘플 또는 본 발명의 다른 화합물로 처리된 샘플과 비교하는 것을 포함한다. 이러한 방법은 또한 표적 실증의 과정에 대하여 미지의 유전자의 기능을 결정하기 위하여 또는 특정, 질병, 조건 또는 증상을 치료 또는 예방에 표적으로서 특정 유전자 산물의 유용성을 결정하는 다른 실험과 병렬적 또는 조합적으로 수행될 수 있다.
유전자 발현의 상향 조절 또는 저해의 평가:
[00166] 외인성 핵산을 숙주 세포나 유기체에 전달은 상기 세포나 유기체에서의 상기 핵산의 존재를 직접 검출함으로써 평가될 수 있다. 그러한 검출은 당해분야에 공지된 몇가지 방법으로 이루어 질 수 있다. 예를 들어, 외인성 핵산의 존재는 서던 블랏 또는 상기 핵산과 연관된 뉴클레오타이드 서열을 특이적으로 증폭시키는 폴리머라제 사슬 반을 (PCR) 기술을 사용하여 검출될 수 있다. 상기 외인성 핵산의 발현은 유전자 발현 분석을 포함한 통상적인 방법을 사용하여 측정될 수 있다. 예를 들어, 외인성 핵산으로부터 생성된 mRNA를 노던 블랏 및 역전사 PCR (reverse-transcription PCR:RT-PCR)를 사용하여 검출하고 정량화할 수 있다.
외인성 핵산으로부터 얻은 RNA의 발현 또한 효소 활성 또는 리포터 단백질 활성을 측정함으로써 검출될 수 있다. 예를 들어, 안티센스 조절 활성은, 상기 외인성 핵산이 효현자 RNA를 생성하는 중이라는 것을 나타내는 지표로서 표적 핵산 발현에서의 감소나 증가로서 간접적으로 측정될 수 있다. 서열 보존에 기초하여, 프라이머들을 표적 유전의의 코딩 부위를 증폭하는 것으로 고안하고 및 사용될 수 있다. 임의의 코딩 또는 비코딩 부위를 사용할 수 있지만, 우선, 각 유전자로부터 가장 고도로 발현되는 코딩 부위를 사용하여 모델 대조군 유전자를 수립할 수 있다. 각 대조군 유전자는 리포터 코딩 부위 및 이의 폴리(A) 신호 사이의 각 코딩 부위를 삽입함으로써 조립될 수 있다. 이러한 플라즈미드는 상기 유전자의 상류 부위에 리포터 유전자 및 3' 비코딩 부위에 잠재적인 RNAi 표적을 가진 mRNA를 생성하게 될 것이다. 개별적인 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 효율은 리포터 유전자의 조절에 의해 검정될 것이다. 본 발명의 방법에 유용한 리포터 유전자는 아세포하이드록시산 신타제(acetohydroxyacid synthase: AHAS), 알칼라인 포스파타제 (alkaline phosphatase: AP), 베타 갈락토시다제(beta galatosidase: LacZ), 베타 글루코로니다제(beta glucoronidase: GUS), 클로람페니콜 아세틸트란스퍼라제(chloramphenicol acetyltransferase: CAT), 녹색 형광 단백질(green fluorescent protein: GFP), 적색 형광 단백질(red fluorescent protein: RFP), 황색 형광 단백질(yellow fluorescent protein: YFP), 시안 형광 단백질(cyan fluorescent protein: CFP), 고추냉이 페록시다제(horseradish peroxidase: HRP), 루시퍼라제(luciferase: Luc), 노팔린 신타제(nopaline sybthase: NOS), 옥토파인 신타제(octopine synthase: OCS) 및 이의 유도체들을 포함한다. 임피실린, 블레오마이신, 클로람페니콜, 젠타마이신, 하이그로마이신, 카나마이신, 린코마이신, 메토트렉세이트, 포스피노트리신, 퓨로마이신, 및 테트라사이클린에 내성을 부여하는 다중 선택성 마커가 이용가능하다. 리포터 유전자의 조절을 결정하는 방법은 당해분야에 공지되어 있고, 형광측정 방법(예. 형광 분광법, Fluorescence Activated Cell Sorting(FACS), 형광 현미경법), 항생제 내성 결정법을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
UCP2 단백질 및 mRNA 발현은 당해분야에 공지된 방법 및 본 명세서 상에서 설명된 방법을 사용하여 분석될 수 있다. 예를 들어, ELISA와 같은 면역분석법을 사용하여 단백질 수준을 측정할 수 있다. UCP2 ELISA 분석 키트는 예를 들어 R&D Systems(Minneapolis, MN)에서 상업적으로 이용가능하다.
구체예에서, 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 처리된 샘플 (예컨대, 세포 또는 조직, 생체 내 또는 시험관 내)에서의 UCP2 발현 (예컨대, mRNA 또는 단백질)은 UCP2 발현을 대조군 샘플과 비료함으로써 평가된다. 예를 들어, 단백질 또는 핵산의 발현은 당해 분야의 숙련자에게 공지된 방법을 사용하여 허위-처리된 또는 미처리된 샘플과 비교될 수 있다. 대안적으로, 대조군 안티센스 올리고뉴클레오타이드(예컨대, 변경 또는 다른 서열을 가지는 것)으로 처리된 샘플과 비교는 원하는 정보에 따라서 이루어질 수 있다. 다른 구체예에서, 처리된 대 비처리된 샘플에서의 UCP2 단백질 또는 핵산의 발현 차이는 처리된 샘플 대 비처리된 샘플에서 상이한 핵산(연구자에 의해 적절하다고 생각되는 임의의 표준물, 예컨대, 하우스키핑 유전자를 포함하는)의 발현에서의 차이와 비교될 수 있다.
관찰된 차이는 대조군과 비교하는 데 사용하기에 바람직한 것, 예를 들어, 비율 또는 분율의 형태로, 표시될 수 있다. 구체예에서, 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오타이드로 처리된 샘플에서 UCP2 mRNA 또는 단백질의 수준은 미처리 샘플 또는 대조군 핵산으로 처리된 샘플에 비하여 약 1.25 배 내지 약 10 배 이상 증가하거나 감소한다. 구체예에서, UCP2 mRNA 또는 단백질의 수준은 적어도 약 1.25 배, 적어도 약 1.3 배, 적어도 약 1.4 배, 적어도 약 1.5 배, 적어도 약 1.6 배, 적어도 약 1.7 배, 적어도 약 1.8 배, 적어도 약 2 배, 적어도 약 2.5 배, 적어도 약 3 배, 적어도 약 3.5 배, 적어도 약 4 배, 적어도 약 4.5 배, 적어도 약 5 배, 적어도 약 5.5 배, 적어도 약 6 배, 적어도 약 6.5 배, 적어도 약 7 배, 적어도 약 7.5 배, 적어도 약 8 배, 적어도 약 8.5 배, 적어도 약 9 배, 적어도 약 9.5 배, 또는 적어도 약 10 배 이상으로 증가하거나 감소한다.
키트, 탐색 시약, 진단제 및 치료제
본 발명의 화합물을 진단, 치료 및 예방을 위해 및 키트의 탐색제제와 성분으로서 사용할 수 있다. 더욱이, 정교한 특이성을 가지고 유전자 발현을 저해할 수 있는 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 통상의 기술자가 사용하여 특정 유전자의 기능을 설명하거나 또는 생물학적 경로의 다양한 구성원의 기능을 구별할 수 있다.
다양한 키트와 진단체 및 생물학적 시스템에서 사용되기 위해, 본 발명의 화합물은 단독으로 또는 다른 화합물 또는 치료제와 조합한 것으로서, 세포와 조직 내에서 발현된 유전자의 일부나 전체 상보체의 발현 패턴을 설명하기 위한 차등 및/또는 조합적 분석에 도구로서 유용하다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, 용어 "생물학적 시스템" 또는 "시스템"은 발현하는 임의의 유기체, 세포, 세포 배양물 또는 조직으로서 정의되며 또는 커플링 방지 단백질 2(UCP2) 유전자의 생성물의 발현하는 능력이 있는 것으로 만들 수 있다. 이것은 인간, 형질전환 동물, 세포, 세포 배양물, 조직, 이종이식편, 이식편 및 이의 조합물을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
비제한적 실시예로서, 하나 이상의 안티센스 화합물로 처리된 세포나 조직 내에서의 발현 패턴은 대조군 세포나 안티센스 화합물로 처리되지 않은 조직과 비교하고, 및 생성된 패턴들은, 예를 들어, 조사된 유전자의 질병 연합, 신호 경로, 세포성 국소화, 발현 수준, 크기, 구조 또는 기능에 관계함에 따라, 상기 패턴은 차등적 수준의 유전자 발현에 대하여 분석된다. 이러한 분석은 발현 패턴에 영향을 끼치는 다른 화합물의 존재나 부재하에서 자극된 또는 비자극된 세포 상에서 수행된다.
해당 분야에 공지된 유전자 발현 분석 방법의 예는 DNA 어레이 또는 마이트로어레이, SAGE(serial analysis of gene expression), READS(restriction enzyme amplification of digested cDNAs), TOGA(total gene expression analysis), 단백질 어레이 및 프로테오믹스, 발현된 서열 태그(expressed sequence tag: EST) 시퀀싱, 공제 RNA 핑거프린팅(subtractive RNA fingerprinting:SuRF), 공제 클로닝(substractive cloning), 차등 디스플레이(differential display:DD), 비교 게놈성 하이브리드화(comparative genomic hybridization), FISH(fluorescent in situ hybridization) 기술 및 질량 분광분석법을 포함한다.
본 발명의 화합물들은 이러한 화합물들이 커플링 방지 단백질 2(UCP2)을 암호화하는 핵산과 하이브리드화하기 때문에 연구 및 진단에 유용하다. 예를 들어, 효과적인 UCP2 조절자가 되는 그러한 효율과 본 발명에서 개시된 바와 같은 조건하에서 하이브리드화하는 올리고뉴클레오타이드들은 각각 유전자 증폭 또는 검출에 적합한 조건하에서 효과적인 프라이머 또는 프로브이다. 이러한 프라이머 및 프로브들은 UCP2를 암호화하는 핵산 분자의 특이적 검출을 요하는 방법에 및 UCP2의 검출 또는 추가 연구에 사용되는 상기 핵산 분자의 증폭에 유용하다. 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 특히 프라이머 및 프로브가 UCP2를 암호화하는 핵산과 하이브리드화하는 것은 당해분야에서 공지된 수단에 의해 검출될 수 있다. 그러한 수단은 효소가 올리고뉴클레오타이드와 접합하는 것, 올리고뉴클레오타이드의 방사표지, 또는 다른 적절한 검출 수단을 포함할 수 있다. 샘플 내에서 그러한 UCP2의 수준을 검출하는 그러한 검출 수단을 사용하는 키트가 또한 제조될 수 있다.
안티센스의 특이성 및 민감성은 또한 당해분야의 기술자에 의해 치료용도로 이용된다. 안티센스 화합물은 인간을 위시한 동물에서 질병 상태를 치료하는 치료 분체로서 사용되었다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드 약물들은 인간에게 안전하고 효과적으로 투여되었고, 수많은 임상 시험이 현재 시행중이다. 따라서, 올리고뉴클레오타이드들은 세포, 조직 및 동물, 특히 인간을 치료하기 위한 치료 섭생법에서 유용하도록 설정될 수 있는 유용한 치료 양식이 될 수 있다는 것이 확립된다.
치료제에 대해서, UCP2 폴리뉴클레오타이드의 발현을 조절함으로써 치료될 수 있는 질병 또는 질환을 가지는 것으로 의심되는 동물 특히 인간은 본 발명에 따른 안티센스 화합물을 투여함으로써 치료된다. 예를 들어, 하나의 비제한적 구체예에서, 상기 방법은 치료가 필요한 동물에 UCP2 조절체의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함한다. 본 발명의 UCP2 조절체는 UCP2의 활성 또는 UCP2 단백질의 발현을 효과적으로 조절한다. 일 구체예에서, 동물에서 UCP2의 활성 또는 발현은 대조군에 비해, 약 10% 저해된다. 바람직하게는 동물에서 UCP2의 활성이나 발현은 약 30% 저해된다. 더욱 바람직하게는 동물에서 UCP2의 활성이나 발현은 50% 이상 저해된다. 따라서, 상기 올리고머성 화합물은 커플링 방지 단백질 2(UCP2) mRNA의 발현을 대조군에 비하여 적어도 10%, 적어도 50%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 조절한다.
일 구체예에서, 동물에서 커플링 방지 단백질 2(UCP2)의 활성 또는 발현은 대조군에 비하여 약 10% 증가된다. 바람직하게는, 동물에서 UCP2의 활성이나 발현은 약 30% 증가된다. 더욱 바람직하게는, 동물에서 UCP2의 활성이나 발현은 50% 이상 증가된다. 따라서, 상기 올리고머성 화합물은 UCP2 mRNA의 발현을 대조군에 비하여, 적어도 10%, 적어도 50%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 조절한다.
예를 들어, 커플링 방지 단백질 2(UCP2)의 발현의 감소는 동물의 혈청, 혈액, 지방 조직, 간 또는 다른 체액, 조직 또는 기관에서 측정될 수 있다. 바람직하게는, 분석될 액체, 조직 또는 기관내에 포함된 세포는 UCP2 펩타이드 및/또는 UCP2 단백질 자체를 암호화하는 핵산 분자를 포함한다.
본 발명의 화합물은 화합물의 유효량을 적절한 약학적 허용 희석제 또는 담체에 첨가함으로써 약학 조성물로서 이용될 수 있다. 본 발명의 상기 화합물의 용도 및 방법은 예방적으로 유용할 수 있다.
접합체
본 발명의 올리고뉴클레오타이드의 다른 변형은 올리고뉴클레오타이드의 활성, 세포 분포 또는 세포 흡수를 향상시키는 하나 이상의 분체 또는 접합체를 상기 올리고뉴클레오타이드에 화학적으로 연결하는 것을 포함한다. 이러한 분체 또는 접합체는 일차 또는 이차 하이드록실 기와 같은 관능기에 공유결합된 접합체 기를 포함할 수 있다. 본 발명의 접합체 기는 인터칼레이터, 리포터 분자, 폴리아민, 폴리아미드, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리에터, 올리고머의 약력적 특성을 향상 시키는 기, 및 올리고머의 약동학적 특성을 향상시키는 기를 포함한다. 일반적인 접합체 기는 콜레스테롤, 지질, 인지질, 비오틴, 페나진, 폴레이트, 페난트리딘, 아트라퀴논, 아크리딘, 플루오리세인, 로다민, 쿠마린 및 염료를 포함한다. 본 발명의 맥락에서 약력학적 특성을 향상시키는 기는 흡수를 향상시키고, 분해에 저항성을 향상시키고, 및 표적 핵산과 서열-특이적 하이브리드화를 강화시키는 기를 포함한다. 본 발명의 맥락에서, 약동학적 특성을 향상시키는 기는 본 발명의 화합물의 흡수, 분포, 대사 또는 배출을 향상시키는 기를 포함한다. 대표적인 접합체 기는 1992년 10월 23일 출원된 국제 특허 출원 번호 제PCT/US92/09196호(출원일: 1992년 10월 23일) 및 미국 특허 제6,287,860호에 개시되어 있고, 이들은 본 명세서에서 참조문헌으로 기입된다. 접합체 분체는 콜레스테롤 분체, 콜릭 산, 티오에터, 예컨대, 헥실-5-트리티올, 티오콜레스테롤, 지방족 사슬, 예컨대, 도데칸디올 또는 운데실 잔기, 인지질, 예컨대, 디헥사데실-rac-글리세롤 또는 트리에틸암모니움 1,2-디-O-헥사데실-rac-글리세로-3-H-포스포네이트, 폴리아민 또는 폴리에틸렌 글리콜 사슬 또는 아다만탄 아세트 산, 팔미틸 분체 또는 옥타데실아민 또는 헥실아미노-카르보닐-옥시콜레스테롤 분체와 같은 지질 분체를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 올리고뉴클레오타이드는 또한 활성 약물 물질, 예를 들어, 아스피린, 와파린, 페닐부타존, 이부프로펜, 수프로펜, 펜부펜, 케토프로펜, (S)-(+)-프라노프로펜, 카프로펜, 댄실사르코신, 2,3,5-트리아이오도벤조 산, 플루페남 산, 폴린 산, 벤조티아디아자이드, 클로로티아자이드, 디아제핀, 인도메티신, 바르비투레이트, 세팔로스포린, 설파 약물, 항비만제, 항균제 또는 항생제에 접합될 수 있다.
그러한 올리고뉴클레오타이드 접합체의 제조를 교시하고 있는 대표적인 미국 특허는 미국 특허 제4,828,979호; 제4,948,882호; 제5,218,105호; 제5,525,465호; 제5,541,313호; 제5,545,730호; 제5,552,538호; 제5,578,717호; 제5,580,731호; 제5,580,731호; 제5,591,584호; 제5,109,124호; 제5,118,802호; 제5,138,045호; 제5,414,077호; 제5,486,603호; 제5,512,439호; 제5,578,718호; 제5,608,046호; 제4,587,044호; 제4,605,735호; 제4,667,025호; 제4,762,779호; 제4,789,737호; 제4,824,941호; 제4,835,263호; 제4,876,335호; 제4,904,582호; 제4,958,013호; 제5,082,830호; 제5,112,963호; 제5,214,136호; 제5,082,830호; 제5,112,963호; 제5,214,136호; 제5,245,022호; 제5,254,469호; 제5,258,506호; 제5,262,536호; 제5,272,250호; 제5,292,873호; 제5,317,098호; 제5,371,241호; 제5,391,723호; 제5,416,203호; 제5,451,463호; 제5,510,475호; 제5,512,667호; 제5,514,785호; 제5,565,552호; 제5,567,810호; 제5,574,142호; 제5,585,481호; 제5,587,371호; 제5,595,726호; 제5,597,696호; 제5,599,923호; 제5,599,928호 및 제5,688,941호를 포함하나 이에 한정되지 않는다.
제형
본 발명의 화합물은 또한, 예를 들어, 리포좀, 수용체-표적화된 분자, 경구, 직장, 국소, 또는 다른 제형과 같이, 섭취, 분포 및/또는 흡착을 돕기 위한 다른 분자, 분자 구조 또는 화합물 혼합물에 혼합, 캡슐화, 접합 또는 다르게는 결합 될 수 있다. 그러한 섭취, 분포 및/또는 흡수-조력 제형의 제조를 교시하는 대표적인 미국 특허는 미국 특허 제5,108,921호; 제5,354,844호; 제5,416,016호; 제5,459,127호; 제5,521,291호; 제5,543,165호; 제5,547,932호; 제5,583,020호; 제5,591,721호; 제4,426,330호; 제4,534,899호; 제5,013,556호; 제5,108,921호; 제5,213,804호; 제5,227,170호; 제5,264,221호; 제5,356,633호; 제5,395,619호; 제5,416,016호; 제5,417,978호; 제5,462,854호; 제5,469,854호; 제5,512,295호; 제5,527,528호; 제5,534,259호; 제5,543,152호; 제5,556,948호; 제5,580,575호; 및 제5,595,756호를 포함하나 이에 한정되지 않고, 이들 각각은 본 명세서에서 참조문헌에 기입된다.
비록 상기 안티센스 올리고뉴클레오타이드가 표적 발현 및/또는 기능을 조절하기 위해 벡터의 맥락으로 투여될 필요는 없다 하더라도, 본 발명의 구체예는, 안티센스 올리고 뉴클레오타이드의 발현용 발현 벡터 작제물에 관한 것으로서, 이는 프로모터, 하이브리드 프로모터 유전자 서열을 포함하며, 강한 구성적 프로모터 활성 또는 원할 때 유도되는 프로모터 활성을 가진다.
일 구체예에서, 발명의 실행에서 전술한 안티센스 올리고뉴클레오타이드들 중 적어도 하나에 적절한 핵산 전달 시스템을 부여한다. 일 구체예에서, 상기 시스템은 상기 폴리뉴클레오타이드에 작동적으로 연결된 비바이러스성 벡터를 포함한다. 그러한 비바이러스성 벡터의 예는 올리고뉴클레오타이드 단독(예컨대, 서열번호 4 내지 14 중 임의의 하나 이상) 또는 적절한 단백질, 폴리사카라이드 또는 지질 제형과 조합된 것을 포함한다.
다른 적절한 핵산 전달 시스템은 바이러스성 벡터로서, 일반적으로는, 아데노바이러스, 아데노바이러스-화합 바이러스(adenovirus-associated virus:AAV), 헬퍼-의존성 아데노바이러스, 레트로바이러스, 또는 일본-리포좀 복합체의 헤마글루틴 바이러스(hemagglutinatin virus of Japan-liposome:HVJ) 중 적어도 하나에서 나온 서열을 포함한다. 바람직하게는, 상기 바이러스성 벡터는 폴리뉴클레오타이드 예컨대, 사이토메갈로바이러스(cytomegalovirus:CMV) 프로모터에 작동적으로 연결된 강한 진핵성 프로모터를 포함한다.
추가의 바람직한 벡터는 바이러스성 벡터, 융합 단백질 및 화학적 접합체를 포함한다. 리트로바이러스성 벡터는 몰로니 무린 백혈병 바이러스 및 HIV-기반 바이러스를 포함한다. 하나의 바람직한 HIV-기반 바이러스성 벡터는 gag 및 pol 유전자가 HIV 게놈으로부터 출처되고 및 env 유전자는 다른 바이러스에서 출처된 두 개의 벡터를 포함한다. DNA 바이러스 벡터가 바람직하다. 이러한 벡터는 오소팍스 또는 아디팍스 벡터와 같은 팍스 벡터, 헤르페스 심플렉스 I 바이러스(herpes simplex I virus:HSV) 벡터와 같은 헤르페스 벡터, 아데노바이러스 벡터 및 아데노-화합 바이러스 벡터를 포함한다.
본 발명의 안티센스 화합물은 인간을 위시한 동물에 투여시, 생물학적 활성 대사물 또는 이의 잔기를(직접적 또는 간접적) 투여할 수 있는 임의의 약학적 허용 염, 에스테르류, 그러한 에스테르류의 염 또는 다른 화합물을 포함한다.
용어 "약학적 허용염"은 본 발명의 화합물의 생리적 및 약학적 허용염을 지칭한다: 예를 들어, 모 화합물의 소망의 생물학적 활성을 유지하지만 원치않는 독소적 효과를 부여하지 않는 염. 올리고뉴클레오타이드의 경우, 약학적 허용염의 바람직한 예 및 이의 용도는 미국 특허 제6,287,860호에 더 설명되어 있고, 이는 본 명세서에서 참조문헌에 기입된다.
본 발명은 또한 본 발명의 안티센스 화합물을 포함하는 약학적 조성물 및 제형을 또한 포함한다. 본 발명의 약학적 조성물은 국소 또는 전신적 치료가 요하는 것에 따라 및 치료될 부위에 따라서 다양한 방식으로 투여될 수 있다. 투여는 국소적(눈 속으로, 및 질과 직장 전달을 위시한 점막내로를 포함하는), 폐내, 예를 들어, 네뷸라이저를 사용하는 것을 포함하여, 분말 또는 에어로졸의 흡입 또는 살포에 의해서, 기관지내, 비강내, 표피 및 경피내), 경구 또는 비경구 적일 수 있다. 비경구 투여는 정맥내, 동맥내, 피하내, 복강내, 또는 근육내 주사, 주입, 또는 두개내, 척추강내 또는 심실내 투여를 포함한다.
중추 신경 내의 조직을 치료하기 위해, 예를 들어 뇌척수로 주사 또는 주입함으로써 투여될 수 있다. 안티센스 RNA를 뇌척수액으로 투여하는 것은 예를 들어, 미국 특허 출원 공개 제2007/0117772호(발명의 명칭: "Methods for slowing familial ALS disease progression")에 설명되어 있고, 이는 전체로서 본 명세서에 참조문헌에 기입된다.
본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오타이드가 중추신경계의 세포로 투여될 것으로 의도되는 것일 때, 혈뇌장벽을 넘어 상기 안티센스 올리고뉴클레오타이드을 침투시키는 것을 촉진할 수 있는 하나 이상의 제제를 하용하여 투여가 될 수 있다. 주사는, 예를 들어, 내비피질 또는 해마에서, 이루어 질 수 있다. 아데노바이러스 벡트를 투여함으로써 신경영양학적 인자를 근육 조직의 운동신경에 전달하는 것은 예를 들어, 미국 특허 제6,632,427호(발명의 명칭 "Adenoviral-vector-mediated gene transfer into medullary motor neurons")에 설명되어 있고, 이는 본 명세서에 참조문헌에 기입된다. 벡터를 뇌에, 예를 들어, 선조체, 시상, 해마, 또는 흑질에 직접적으로 전달하는 것은 당해분야에 공지되어 있고, 예를 들어, 미국 특허 제6,756,523호(발명의 명칭: "Adenovirus vectors for the transfer of foreign genes into cells of the central nervous system particularly in brain")에 설명되어 있고 이는 본 명세서에 참조문헌에 기입된다. 투여는 주사와 같이 빠를 수 있고, 서방 제형의 느린 주입 또는 투여와 같이 오랜 시간에 걸쳐 일어날 수 있다.
상기 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 또한 원하는 약학적 또는 약력학적 특성을 제공하는 제제와 연계 또는 접합될 수 있다. 예를 들어, 상기 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 트랜스페린 수용체에 대한 항체와 같이, 혈뇌 장애를 넘는 것을 촉진하는 거으로 해당분야에 공지된 임의의 물질과 연계되고 및 정맥 내 주사로 투여될 수 있다. 상기 안티센스 화합물은, 예를 들어, 안티센스 화합물이 더욱 효과적으로 만드는 및/또는 혈뇌 장벽을 넘어서 상기 안티센스 화합물을 전달을 증가시키는 바이러스성 벡터와 결합될 수 있다. 삼투성 혈뇌 장벽 붕괴는 예를 들어, 메조 에리트리톨, 자일리톨, D(+) 갈락토즈, D(+) 락토즈, D(+) 자일로즈, 덜시톨, 미오-이노시톨, L(-) 프럭토즈, D(-) 만니톨, D(+) 글루코즈, D(+) 아라비노즈, D(-) 아라비노즈, 셀로비오즈, D(+) 말토즈, D(+) 라피보즈, L(+) 람노즈, D(+) 멜리비오즈, D(-) 리보즈, 아도니톨, D(+) 아라비톨, L(-) 아라비톨, D(+) 퓨코즈, L(-) 퓨코즈, D(-) 라이속스, L(+) 라이속스, 및 L(-) 라이속스를 포함하나 이에 한정되지 않는 당, 또는 글루타민, 리신, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파트산, 시스테인, 글루탐산, 글리신, 히스티딘, 루이신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 타이로신, 발린, 및 타우린을 포함하나 이에 한정되지 않는 아미노산을 주입함으로써 이루어질 수 있다. 혈뇌 장벽 침투를 향상시키는 방법 및 물질은 예를 들어, 미국 특허 제4,866,042호(발명의 명칭: "Method for the delivery of genetic material across the blood brain barrier"), 제6,294,520호(발명의 명칭: "Material for passage through the blood-brain barrier") 및 제6,936,589호(발명의 명칭: "Parenteral delivery systems")에 설명되어 있고, 이들 모두는 전체적으로 본 명세서에 참조문헌에 기입된다.
상기 안티센스 화합물은 또한, 예를 들어, 리포좀, 수용체-표적화된 분자, 경구, 직장, 국소, 또는 다른 제형과 같이, 섭취, 분포 및/또는 흡착을 돕기 위한 다른 분자, 분자 구조 또는 화합물 혼합물에 혼합, 캡슐화, 접합 또는 다르게는 결합될 수 있다. 예를 들어, 양이온성 지질은 올리고뉴클레오타이드 섭취를 용이하게 하는 제형에 포함될 수 있다. 섭취를 용이하게 하는 것으로 나타난 하나의 그러한 조성물은 LIPOFECTIN(GIBCO-BRL, Bethesda, MD에서 판매)이다.
적어도 하나의 2'-O-메톡시에틸 변경을 가지는 올리고뉴클레오타이드는 특히 경구 투여용으로 유용한 것으로 믿어진다. 국소 투여용 약학적 조성물 및 제형은 경피 패취, 연고, 로션, 크림, 젤, 점적제, 좌약, 스프레이, 액체 및 분말을 포함할 수 있다. 통상적인 약학적 담체, 수성, 분말 또는 오일성 기재, 농후제 등이 필요하거나 바람직할 수 있다. 코팅된 콘돔, 장갑 등이 유용할 수 있다.
단위 투약 형태로 편리하게 제시된, 본 발명의 약학적 제형은, 약학 산업에 공지된 통상적인 기술에 따라 제조될 수 있다. 그러한 기술은 활성 성분을 약학적 담체(들) 또는 부형제(들)과 연합시키는 단계를 포함한다. 일반적으로, 상기 제형은 활성 성분을 액체 담체 또는 잘게 분쇄된 고형 담체 또는 둘 다와 균일적으로 잘 연합시키고, 다음, 필요 시, 생성물을 조형함으로써 제조된다.
본 발명의 조성물은 정제, 캡슐, 젤 캡슐, 액체 시럽, 연질 젤, 좌약 및 관장제와 같은, 그러나 이에 한정되지 않는 많은 가능한 투약 형태 중 임의의 것으로 제형될 수 있다. 본 발명의 조성물은 또한 수성, 비수성 또는 혼합 매질 내의 현탁액으로서 제형될 수 있다. 수성 현탁액은 를 들어, 소듐 카르복시 메틸셀룰로즈, 소르비톨 및/또는 덱스트란을 위시한 현탁액의 점도를 증가시키는 물질을 더 포함할 수 있다. 상기 현탁액은 또한 안정제를 포함할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 용액, 에멀젼, 포움, 리포좀-함유 제형을 포함 하나 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 약학적 조성물 및 제형은 하나 이상의 침투 향상제, 담체, 부형제 또는 다른 활성 또는 비활성 성분을 포함할 수 있다.
에멀젼은 일반적으로 하나의 액체다 다른 하나에 통상 직경이 0.1 μm가 넘는 방울 형태로 분산되어 있는 이질적 시스템이다. 에멀젼은 분산 상에 더하여 추가의 성분을 포함할 수 있고, 수성 상, 오일 상 에서 용액으로서 또는 자체로 분리된 상으로서 존재할 수 있는 활성 약물을 포함할 수 있다. 마이크로에멀젼은 본 발명의 구체예로서 포함된다. 에멀젼 및 이들의 용도는 당해 분야에 공지되어 있고, 미국 특허 제6,287,860호에 설명되어 있다.
본 발명의 제형은 리포좀성 제형을 포함한다. 본 발명에서 사용된 바와 같이, 용어 "리포좀"은 구형 이중층 또는 이중층들이 배열된 양쪽성 지질로 구성된 소포를 의미한다. 리포좀은 단일층 또는 다중층 소포가고 친유성 물질로부터 형성된 막 및 전달될 조성물을 그 내부에 함유하는 수성 내부를 가진다. 양이온성 리포좀은 양하전된 리포좀으로 음하전된 DNA 분자와 상호작용하여 안정한 복합체를 형성하는 것으로 판단된다. pH-민감성 또는 음하전된 리포좀은 DNA와 복합체를 이루기 보다는 DNA를 감싸는 것으로 판단된다. 양이온성 또는 비이온성 리포좀 둘 다를 사용하여 DNA를 세포에 전달하였다.
리포좀들은 또한 "입체적으로 안정된" 리포좀을 포함하는데, 이는 본 발명에서 사용된 바와 같이, 하나 이상의 특수화된 지질을 포함하는 리포좀을 지칭한다. 리포좀에 혼입될 때, 이러한 특수화된 지질은 그러한 특수화된 지질이 없는 리포좀에 비하여 순환 존속기간이 향상된 리포좀을 결과한다. 입체적으로 안정화된 리포좀의 예는 리포좀의 소포-형성 지질 부분의 일부가 하나 이상의 당지질을 포함하거나 폴리에틸렌 글리콜(Polyethylene glycol:PEG) 분체와 같은 하나 이상의 친수성 중합체로 유도된 것이다. 리포좀 및 이들의 용도는 미국 특허 제6,287,860호에 더 설명되어 있다.
본 발명의 약학 제형 및 조성물은 또한 계면활성제를 포함할 수 있다. 약물 생성물, 제형 및 에멀젼에서의 계면활성제 용도는 당해분야에 공지되어 있다. 계면 활성제 및 이의 용도는 미국 특허 제6,287,860호에 더 설명되어 있고, 이는 본 명세서에 참조문헌에 기입된다.
일 구체예에서, 본 발명은 다양한 침투 향상제를 포함하여 핵산, 특히 올리고뉴클레오타이드의 효과적인 전달을 수행한다. 세포막을 넘어서 비-친유성 약물을 확산시키는 것을 돕는 것에 더하여, 약물 향상제는 또한 친유성 약물의 투과성을 향상시킨다. 침투 향상제는 다섯가지의 넓은 카테고리, 예컨대, 계면활성제, 지방산, 담즙염, 킬레이팅 제제, 및 비-킬레이팅 비계면활성제 중에 하나에 속하는 것으로 분류될 수 있다. 침투 향상제 및 이의 용도는 미국 특허 제6,287,860호에 더 설명되어 있고, 이는 본 명세서에 참조문헌에 기입된다.
당해 분야의 기술자는 제형들이 의도된 용도, 예컨대, 투여 경로에 따라 통상 고안된다는 것을 인식할 것이다.
국소 투여용 바람직한 제형은 본 발명의 올리고뉴클레오타이드가, 지질, 리포좀, 지방산 에스테르, 스테로이드, 킬레이팅 제제, 계면활성제와 같은 국소 전달제와 혼합되어진 것을 포함한다. 바람직한 지질 및 리포좀은 중성 (예. 디올레오일-포스파티딜 DOPE 에탄올아민, 디미리스토일포스파티딜 콜린 DMPC, 디스테아로일포스파티딜 콜린) 음이온성(예컨대, 디미리스토일포스파티딜 글리세롤 DMPG) 및 양이온성(예컨대, 디올레오일테트라메틸아미노프로필 DOTAP 및 디올레오일-포스파티딜 에탄올아민 DOTMA)인 것을 포함한다.
국소 또는 다른 투여용으로서, 본 발명의 올리고뉴클레오타이드는 리포좀 내에 캡슐화되거나 이와, 특히, 양이온성 리포좀과 복합체를 형성할 수 있다. 대안으로, 올리고뉴클레오타이드는 지질, 특히 양이온성 지질과 복합화된다. 바람직한 지방산과 에스테르, 이의 약학적 허용염 및 이의 용도는 미국 특허 제6,287,860호에 더 설명되어 있다.
경구 투여용 조성물 및 제형은 분말이나 과립, 미소입자, 나노입자, 물 또는 비수성 매질에서의 현탁애이나 용액, 캡슐, 젤 캡슐, 향낭, 정제 또는 미니정제를 포함한다. 농후제, 향미제, 희석제, 에멀젼화제, 분산조제, 또는 결합제가 바람직할 수 있다. 바람직한 경구 제형은 본 발명의 올리고뉴클레오타이드가 하나 이상의 침투 향상제인 계면활성제 및 킬레이터와 조합하여 투여되는 것이다. 바람직한 계면활성제는 지방산 및/또는 이의 에스테르나 염, 담즙산 및/또는 이의 염을 포함한다. 바람직한 답즙산/염 및 지방산과 이들의 용도는 미국 특허 제6,287,860호에 더 설명되어 있고, 이는 본 명세서에 참조문헌에 기입된다. 또한 바람직한 것은 침투 향상제, 예를 들어, 지방산/염과 조합된 담즙산/염이다. 특히 바람직한 조합은 라우르 산, 카프르 산 및 UDCA의 나트륨염이다. 또한, 침투 향상제는 폴리옥시에틸렌-9-라우릴 에터, 폴리옥시에틸렌-20-세틸 에터를 포함한다. 본 발명의 올리고뉴클레오타이드는, 경구적으로, 스프레이된 건조 입자 또는 복합화되어 미소 또는 나노입자를 포함하는 과립 형태로 전달될 수 있다. 올리고뉴클레오타이드 복합화 제제 및 이의 용도는 미국 특허 제6,287,860호에 더 설명되어 있고, 이는 본 명세서에 참조문헌에 기입된다.
비경구, 척추강 내 또는 심실 내 투여용 조성물과 제형은 완충액, 희석제, 및 침투 향상제와 같지만, 이에 한정되지 않는 다른 적절한 첨가제, 및 다른 약학적 허용 담체나 부형제를 또한 포함하는 멸균 수성액을 포함할 수 있다.
본 발명의 특정 구체예는 하나 이상의 올리고머성 화합물 및 비-안티센스 기작으로 작용하는 하나 이상의 다른 화학요법적 제제를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 그러한 화학요법적 제제의 예는 다우노루비신, 다우노마이신, 닥티노마이신, 독소루비신, 에피루비신, 이다루비신, 에소루비신, 블레오마이신, 마포스파미드, 이포스파미드, 시토신 아라비노시드, 비스콜로에틸-니트로스유레아, 부설판, 미토마이신 C, 악티노마이신 D, 미트라마이신, 프레드니손, 하이드록시프로제스트론, 테스토스테론, 타목시펜, 다카바진, 프로카바진, 헥사메틸멜라민, 펜타메틸멜라민, 미톡산트론, 아마사크린, 클로람부실, 메틸시클로헥실니트로스유레아, 질소 머스타드, 멜팔란, 시클로포스파미드, 6-머캅토퓨린, 6-티오구아닌, 시타라빈, 5-아자시티딘, 하이드록시유레아, 데옥시코포마이신, 4-하이드록시페록시시클로-포스포아미드, 5-플루오로유라실(5-fluorouracil:5-FU), 5-플루오로데옥시우리딘(5-fluorodeoxyuridine:5-FUdR), 메톡트렉세이트(methorexate:MTX), 콜치신, 탁솔, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 에토포사이드(VP-16), 트리메트렉세이트, 이리노테칸, 토포테칸, 젬시타빈, 테니포시드, 시스플라틴 및 디에틸스틸베스트롤(diethylstilbestrol: DES)을 포함한다. 본 발명의 화합물과 사용될 때, 그러한 화학요법적 제제는 그러한 하나 이상의 화학요법 제제와 개별적으로 (예컨대, 5-FU 및 올리고뉴클레오타이드), 순차적으로 (예컨대, 5-FU 및 올리고뉴클레오타이드를 시간에 걸쳐 투여후 MTX 및 올리고뉴클레오타이드 투여), 또는 조합하여 (예컨대, 5-FU, MTX 및 올리고뉴클레오타이드, 또는 5-FU, 방사요법 및 올리고뉴클레오타이드) 사용될 수 있다. 비스테로이드성 항염증약물 및 코르티코스테로이드을 포함하나 이에 한정되지 않는 항염증 약물 및 리비비린, 비다라빈, 아시클로비르를 포함하나 이에 한정되지 않는 항바이러스성 약물을 본 발명의 조성물과 조합할 수 도 있다. 안티센스 화합물과 다른 비-안티센스 약물의 조합은 본 발명의 범위에 속한다. 두 개 이상의 조합된 화합물을 같이 또는 순차적으로 사용될 수 있다.
다른 구체예에서, 본 발명의 조성물은 제1 핵산에 표적화된 하나 이상의 안티센스 화합물, 특히 올리고뉴클레오타이드 및 제2 핵산 표적에 표적화된 하나 이상의 추가의 안티센스 화합물을 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 제1 표적은 커플링 방지 단백질 2(UCP2)의 특별한 안티센스 서열일 수 있고, 제2 표적은 다른 뉴클레오타이드 서열의 부위일 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 조성물은 동일한 커플링 방지 단백질 2(UCP2) 핵산 표적의 상이한 부위에 표적화된 두 개 이상의 안티센스 화합물을 포함할 수 있다. 안티센스 화합물의 많은 예가 본 명세서에서 설명되어 있고 다른 것들은 당해 분야에 공지된 적절한 화합물 중에서 선택될 수 있다. 두 개 이상의 조합된 화합물을 같이 또는 순차적으로 사용할 수 있다.
투약:
치료 조성의 제형화 및 후속적인 투여 (투약)는 해당분야의 기술자에 속하여 있다. 투약은 수일 내지 수개월 지속되는 치료 기간을 가지고, 치료될 질병 상태의 정도 및 반응성에 의존하여 또는 치유가 유효하거나 또는 질병 상의 감소가 성취될 때까지 수행된다. 최적의 투약 스케줄은 환자의 신체에서의 약물 축적을 측정함으로써 계산될 수 있다. 통상의 기술자는 최적의 투약량, 투여 방법 및 반복율을 용이하게 결정할 수 있다. 최적 투약량은 올리고뉴클레오타이드들의 상대적인 효능에 따라 변할 수 있고 및 시험관 내 및 생체 내 동물 모델에서 유효한 것으로 발견된 EC50 값에 기초하여 일반적으로 추정될 수 있다. 일반적으로, 투약량은 몸무게 kg 당 0.01 μg 내지 100 g이고, 매일, 매주 매년 또는 매 2년 내지 매 20년에 한 번 이상 주어질 수 있다. 해당분야의 통상의 기술자는 체액 또는 조직에서의 약물의 체류기간과 농도 측정치에 기준 하여 투약 반복 속도를 용이하게 정할 수 있다. 성공적인 치료 후, 환자를 유지 치료하게 하여 질병 상태의 재발을 막는 것이 바람직할 수 있고, 여기서 상기 올리고뉴클레오타이드는 몸무게 kg 당 0.01 μg 내지 100 g 범위의 유지 투여량으로, 매일 한번 이상 내지 매 20년에 한번 투여될 수 있다.
구체예에서, 환자는 적어도 약 1, 적어도 약 2, 적어도 약 3, 적어도 약 4, 적어도 약 5, 적어도 약 6, 적어도 약 7, 적어도 약 8, 적어도 약 9, 적어도 약 10, 적어도 약 15, 적어도 약 20, 적어도 약 25, 적어도 약 30, 적어도 약 35, 적어도 약 40, 적어도 약 45, 적어도 약 50, 적어도 약 60, 적어도 약 70, 적어도 약 80, 적어도 약 90, 또는 적어도 약 100 mg/kg 몸무게의 약물 투여량으로 치료된다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 특정 주사량은 예를 들어, 미국 특허 제7,563,884호(발명의 명칭: "Antisense modulation of PTP1B expression")에 더 설명되어 있고 이는 본 명세서에 참조문헌에 기입된다.
본 발명의 다양한 구체예가 설명되었는 바, 이들은 한정적이 아닌 예증적 방식으로만 제시된 것임을 이해하여야 한다. 개시된 구체예에 대한 많은 변화가 본 발명의 사상과 범위를 벗어나지 않고 본 발명에서의 개시내용에 따라 만들 수 있다. 따라서, 본 발명의 폭과 범위는 전술한 구체예의 어느 것에 의해서도 제한되지 않는다.
본 발명에서 언급된 모든 문서는 본 발명의 참조문헌에 기입된다. 본 출원서에서 언급된 공개물 및 특허 문헌은 각 개별 공개물 또는 특허 문서가 그렇게 개별적으로 뜻하는 것과 동일한 정도로 모든 목적상 본 명세서에 참조된다. 본 문서에 다양한 참조문헌의 인용함으로써, 본 출원인은 임의의 특정 참조문헌이 본 발명에 "선행기술"이라고 허용하지 않는다. 본 발명의 조성물 및 방법의 구체적 예가 하기 실시예에 설명된다.
실시예
하기 비제한적 실시예는 본 발명의 선택된 구체예를 설명하기 위한 것이다. 제시된 비율에서의 변화 및 성분의 요소에서의 대체물은 해당 분야의 숙련자에게는 당연한 것이 될 것이고 본 발명의 구체예의 범위에 속한다.
실시예 1: 커플링 방지 단백질 2(UCP2)에 안티센스한 핵산 분자 및/또는 UCP2 폴리뉴클레오타이드의 센스 본쇄에 특이적인 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 설계
전술한 바와 같이, 용어 "-에 특이적인 올리고뉴클레오타이드" 또는 "-을 표적화하는 올리고뉴클레오타이드"는 (i) 표적화된 유전자의 일부분과 안정한 복합체를 형성할 수 있는, 또는 (ii) 표적화된 유전자의 mRNA 전사체의 일부분과 안정한 듀플렉스를 형성할 수 있는 서열을 가지는 올리고뉴클레오타이드을 지칭한다.
적절한 올리고뉴클레오타이드들의 선택은 핵산 서열을 자동적으로 배열하고 동일성 또는 상동성의 부위를 지시하는 컴퓨터 프로그램을 사용함으로써 이행될 수 있다. 그러한 프로그램을 사용하여, 예를 들어, GenBank와 같은 데이터베이스를 검색함으로써 또는 PCR 산물을 서열분석함으로써 얻어진 핵산 서열들을 비교할 수 있다. 적절한. 일정 종으로부터 얻은 핵산 서열을 비교하면, 종 간의 적절한 정도의 동일성을 보이는 핵산 서열을 선택할 수 있다. 서열화되지 않은 유전자의 경우, 서던 블랏을 수행하여 표적 종과 다른 종의 유전자 간에 동일성 정도를 결정한다. 당해 분야에서 공지된 바와 같이, 서던 블랏을 다양한 엄중성에서 수행함으로써, 동일성의 적절한 척도를 얻는 것이 가능하다. 이러한 방식은 조절될 개체의 표적 핵산 서열과 고도의 상보성을 그리고 다른 종의 상응하는 핵산 서열에는 낮은 정도의 상보성을 나타내는 올리고뉴클레오타이드들을 선택할 수 있게 한다. 당해 분야의 기술자는 본 발명에 사용하기에 적절한 유전자 부위를 선택하는 데 상당한 여유가 있다는 것을 인식할 것이다.
안티센스 화합물은 화합물의 표적 핵산과 결합이 상기 표적 핵산의 정상적 기능을 방해하여 기능 및/또는 활성의 변화를 야기하고, 특이적 결합이 요청되는 조건 하, 예를 들어, 생체 내 분석이나 치료적 처치의 경우에서 생리적 조건 및 시험관 내 시험의 경우 시험이 실행되는 조건 하에서, 상기 안티센스 화합물이 비-표적 핵산 서열에 비특이적 결합을 회피할 충분한 정도의 상보성이 있을 때 "특이적으로 하이브리드화"될 수 있다.
본 발명에서 설명된 상기 올리고 뉴클레오타이드들의 하이브리드화 특성은 해당분야에서 공고된 것과 같이 하나 이상의 시험관 내 시험법으로 결정될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에서 설명된 올리고뉴클레오타이드의 특징은 표적 천연 안티센스 및 잠재적 약물 분자 간의 결합 강도를 용융 곡선 분석법을 사용하여 결정함으로써 얻어질 수 있다.
상기 표적 천연 안티센스 및 잠재적 약물 분자(분자) 간의 결합 강도는 분자간 작용의 강도를 측정하는 확립된 임의의 방법, 예컨대, 용융 곡선 시험법을 이용하여 추정될 수 있다.
용융 곡선 시험법은 상기 천연 안티센스/분자 복합체에 대하여 이중 본쇄에서 단일본쇄 형태로의 빠른 전환이 일어날 때의 온도를 특정하는 것이다. 이러한 온도는 두 개 분자간의 상호작용 강도의 신뢰성 있는 척도로서 광범위하게 수용되고 있다.
용융 곡선 시험법은 실제 천연 안티센스 RNA 분자의 cDNA 복제물 또는 상기 분자의 결합 위치에 상응하는 합성 DNA 또는 RNA 뉴클레오타이드 상에서 수행될 수 있다. 이러한 분석법을 수행하는 데 필요한 모든 제제를 포함하는 다중 키트는 이용가능하다(예컨대, Applied Biosystems Inc. MeltDoctor 키트). 이러한 키트들은 이중 본쇄 DNA(dsDNA) 결합 색소(ABI HRM 색소 SYBR Green, SYTO 등과 같은) 중 하나을 포함하는 적절한 완충액을 포함한다. 상기 dsDNA 색소들의 특징은 자유 형태일 때는 아무런 형광을 발산하지 않지만, dsDNA와 결합될 때는 고도로 형광인 것이다.
상기 시험법을 수행하기 위해, 상기 cDNA 또는 상응하는 올리고뉴클레오타이드를 특히 제작자의 지시에 의해 정의된 농도로 분자와 혼합한다. 혼합물을 95℃로 가열하여 모든 예비형성된 dsDNA 복합체를 해리한 후, 서서히 실온으로 또는 키트 제작사가 정한 낮은 온도로 냉각하여 상기 DNA 분자가 어닐링하도록 한다. 다음, 새로이 형성된 복합체를 서서히 95℃로 가열하면서 동시에 이 반응에 의해 생성된 형광량에 대한 데이터를 연속 수집한다. 형광 강도는 반응물에 존재하는 dsDNA의 양에 반비례한다. 상기 데이터는 상기 키트와 양립할 수 있는 실시간 PCR 장비(예컨대, ABI의 StepOne Plus Real Time PCR System 또는 lightTyper 기기, Roche Diagnostics, Lewes, UK)를 사용하여 수집될 수 있다.
용융 피크는 적절한 소프트웨어 (예를 들어, lightTyper(Roche) 또는 SDS Dissociation Curve, ABI)를 사용하여 온도 (x-축)에 대하여 온도에 관한 형광의 음성 유도체를 (y 축 상에서 -d(형광)/dT))을 플라팅시킴으로써 만들어 질 수 있다. 상기 데이터를 분석하여 dsDNA 복합체로부터 단일 본쇄 분자로의 빠른 전이의 온도를 확인한다. 이러한 온도는 Tm으로 지칭되며 두 개 분자 간의 상호작용 강도에 직접적으로 비례한다. 일반적으로 Tm은 40℃를 초과할 것이다.
실시예 2: UCP2 폴리뉴클레오타이드의 조절
HEPG2 세포를 안티센스 올리고뉴클레오타이드로 처리
ATCC (cat# HB-8065)에서 구입한 HepG2 세포를 배양배지에서 (MEM/EBSS (Hyclone cat #SH30024, 또는 Mediatech cat # MT-10-010-CV) +10% FBS(Mediatech cat# MT35-011-CV)+ 페니실린/스트렙토마이신(Mediatech cat# MT30-002-CI)) 37oC 및 5% CO2 조건하에서 배양하였다. 실험 당일, 6-웰 플레이트 내의 상기 배지를 새로운 배양 배지로 교환하였다. 모든 안티센스 올리고뉴클레오타이드들은 20 μM의 농도로 희석시켰다. 이 용액의 2 μl를 400 μl의 Opti-MEM 배지(Gibco cat#31985-070) 및 4 μl의 리포펙타민(Lipofectamine) 2000(Invitrogen cat# 11668019)으로 실온에서 20분간 처리하고 HEPG2 세포가 있는 상기 6-웰 플레이트의 각 웰에 적용하였다. 상기 올리고뉴클레오타이드 용액 대신 2 μl의 물을 함유한 유사 혼합물을 허위(mock)-형질감염 대조군으로서 사용하였다. 37℃ 및 5% CO2에서 3-18 시간 항온 처리 후, 배지를 신선한 배양 배지로 교환하였다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드 첨가 48 시간 후, 배지를 제거하고 Promega의 SV Total RNA Isolation System(cat # Z3105) 또는 Qiagen의 RNeasy Total RNA Isolation 키트(cat# 74181)를 제작자 지시대로 사용하여 RNA를 세포로부터 추출하였다. 600 ng의 RNA를 역전사 반응에 사용하였고 이 반응은 Thermo Scientific의 Verso cDNA 키트(cat#AB1453B) 또는 High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit(cat# 4368813)를 제작사의 지시대로 사용하여 수행하였다. 이러한 역전사 반응에서 얻은 cDNA는, ABI Taqman Gene Expression Mix(cat#4369510) 및 ABI 에서 설계한 프라이머/프로브(Applied Biosystems Taqman Gene Expression Assay: Hs00163349_m1, Applied Biosystems Inc., Foster City CA)를 이용한 실시간 PCR에 의한 유전자 발현을 조사하는 데 이용하였다. 하기 PCR 사이클을 이용하였다: 50℃에서 2 분간, 95℃에서 10 분간, (95℃에서 15초간, 60℃에서 1 분간)의 40 사이클, Mx4000 열 순환기(thermal cycler, Stratagene) 사용. 안티센스 올리고뉴클레오타이드로 처리후 유전자 발현에서의 배수 변화는 처리된 샘플과 허위 형질변환(mock-transfected) 샘플 간의 18S-표준화 dCt 값에서의 차이에 기반하여 계산되었다.
결과: 실시간 PCR의 결과, HepG2 세포에서의 UCP2 mRNA 수준은 UCP2 안티센스 Hs.627373에 대해 설계된 두 개의 올리고뉴클레오타이드 및 Sorgelawbu.aApr07 UCP2에 대해 설계된 두 개의 올리고뉴클레오타이드로 처리한 48 시간 후에 유의하게 증가된다(도 1).
본 발명이 하나 이상의 실행 예에 관하여 예증 되고 설명되었지만, 이 본 명세서와 첨부된 도면을 독해하고 이해할 때 해당분야의 숙련자는 동등한 변개 및 변형을 할 수 있다. 또한, 본 발명의 특정한 특징이 수 가지 실행 예 중 한 가지에 대해서만 개시되었을 수 있으나, 그러한 특징은, 다른 실행 예의 하나 이상의 다른 특징들과 조합되어, 임의의 주어진 또는 특정한 적용에 대하여 바람직하고 유리한 것이 될 수 있다.
본 발명이 하나 이상의 실행 예에 관하여 예증 되고 설명되었지만, 이 본 명세서와 첨부된 도면을 독해하고 이해할 때 해당 분야의 숙련자는 동등한 변개 및 변형을 할 수 있다. 또한, 본 발명의 특정한 특징이 수 가지 실행 예 중 한 가지에 대해서만 개시되었을 수 있으나, 그러한 특징은, 다른 실행 예의 하나 이상의 다른 특징들과 조합되어, 임의의 주어진 또는 특정한 적용에 대하여 바람직하고 유리한 것이 될 수 있다.
요약서에서, 본 기술 개시내용의 본질을 빠르게 확인할 수 있다. 이는 하기 특허청구범의의 범주나 의미를 해석하거나 제한하는 것으로 사용되지 않을 것이라는 분별하에서 제출된 것이다.
SEQUENCE LISTING <110> OPKO CuRNA, LLC <120> TREATMENT OF UNCOUPLING PROTEIN 2 (UCP2) RELATED DISEASES BY INHIBITION OF NATURAL ANTISENSE TRANSCRIPT TO UCP2 <130> WO2011/079263 <140> PCT/US2010/062001 <141> 2010-12-23 <150> US61/289538 <151> 2009-12-23 <160> 14 <170> PatentIn version 1.71 <210> 1 <211> 1646 <212> DNA <213> Homo sapiens <300> <308> NM_003355 <309> 2010-11-03 <313> (1)..(1646) <400> 1 cactgcgaag cccagctgcg cgcgccttgg gattgactgt ccacgctcgc ccggctcgtc 60 cgacgcgccc tccgccagcc gacagacaca gccgcacgca ctgccgtgtt ctccctgcgg 120 ctcggacaca tagtatgacc attaggtgtt tcgtctccca cccattttct atggaaaacc 180 aaggggatcg ggccatgata gccactggca gctttgaaga acgggacacc tttagagaag 240 cttgatcttg gaggcctcac cgtgagacct tacaaagccg gattccggca gagttcctct 300 atctcgtctt gttgctgatt aaaggtgccc ctgtctccag tttttctcca tctcctggga 360 cgtagcagga aatcagcatc atggttgggt tcaaggccac agatgtgccc cctactgcca 420 ctgtgaagtt tcttggggct ggcacagctg cctgcatcgc agatctcatc acctttcctc 480 tggatactgc taaagtccgg ttacagatcc aaggagaaag tcaggggcca gtgcgcgcta 540 cagccagcgc ccagtaccgc ggtgtgatgg gcaccattct gaccatggtg cgtactgagg 600 gcccccgaag cctctacaat gggctggttg ccggcctgca gcgccaaatg agctttgcct 660 ctgtccgcat cggcctgtat gattctgtca aacagttcta caccaagggc tctgagcatg 720 ccagcattgg gagccgcctc ctagcaggca gcaccacagg tgccctggct gtggctgtgg 780 cccagcccac ggatgtggta aaggtccgat tccaagctca ggcccgggct ggaggtggtc 840 ggagatacca aagcaccgtc aatgcctaca agaccattgc ccgagaggaa gggttccggg 900 gcctctggaa agggacctct cccaatgttg ctcgtaatgc cattgtcaac tgtgctgagc 960 tggtgaccta tgacctcatc aaggatgccc tcctgaaagc caacctcatg acagatgacc 1020 tcccttgcca cttcacttct gcctttgggg caggcttctg caccactgtc atcgcctccc 1080 ctgtagacgt ggtcaagacg agatacatga actctgccct gggccagtac agtagcgctg 1140 gccactgtgc ccttaccatg ctccagaagg aggggccccg agccttctac aaagggttca 1200 tgccctcctt tctccgcttg ggttcctgga acgtggtgat gttcgtcacc tatgagcagc 1260 tgaaacgagc cctcatggct gcctgcactt cccgagaggc tcccttctga gcctctcctg 1320 ctgctgacct gatcacctct ggctttgtct ctagccgggc catgctttcc ttttcttcct 1380 tctttctctt ccctccttcc cttctctcct tccctctttc cccacctctt ccttccgctc 1440 ctttacctac caccttccct ctttctacat tctcatctac tcattgtctc agtgctggtg 1500 gagttgacat ttgacagtgt gggaggcctc gtaccagcca ggatcccaag cgtcccgtcc 1560 cttggaaagt tcagccagaa tcttcgtcct gcccccgaca gcccagccta gcccacttgt 1620 catccataaa gcaagctcaa ccttgg 1646 <210> 2 <211> 243 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (228)..(228) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (501)..(501) <223> n is a, c, g, or t <400> 2 cagagaccca tggaaacaaa cagctcaccc agcttcctct tgggcttctc actccaggtg 60 gctggggcaa gcagggaaat gaagatactc accatagcaa ctacactggg acctatagaa 120 cagggcctga ccttattcct gtttccctcc agcttgccca cgaggctcag tgaagaaaaa 180 aaaaagaaag aaaaggagaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaanaa aaaaaaaaaa 240 aaa 243 <210> 3 <211> 802 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (17)..(17) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (20)..(20) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (24)..(24) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (748)..(748) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (898)..(898) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (918)..(918) <223> n is a, c, g, or t <400> 3 tggcgtttag ggaccaggac actaaaggcc ccggcggggc gggagcaccc agcgtgacct 60 cacgctccta cacacagaca agcaaacggg ccggcccccg cacgtgacaa ggcagagccg 120 ggcccaggcc agctgcctgt ccagccctgg gatgagaaaa ggcgtcagga gatggaccgg 180 gcctggttcg cctttaattg gctgacccgt cctgtggggg taactgacgc gtgaacagcc 240 aacaattggg ccctctggcc gggacaaaca cgtgcgtttg gggagtagaa gaaggctggt 300 attaacctcc attttacaat gaggaaacgg agtcccaaag acgttcagtc atcttcctga 360 tattcacaca cttacaccct ggtcaggccg gcgccatatg tgttttcacc agcagaaggg 420 actgccaggg aacagctgag gggaccagag ctgggatggg cctggataat tatagcggaa 480 agaaaaacac gccgagcgca tggtcctggc agaagcagcg tggaaacaga agtcaaggca 540 gattatttct gccatgagga gatcttgcca tgtaggaaaa aagaaagaaa gagaggaaag 600 aaagacagag agagagagag gaaagacaga aagacaagaa agaaagagaa agaaagaaaa 660 gaaaaaaaaa aagaaaagat aaagtttttt tgtggcactg tgagtctccc tccgccaggt 720 tctctagctt ttgcgctgag ctctgtctgg ctgtgcattc cggagaggct cggcaaattt 780 gctgtgagat tgctgagcaa ca 802 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (443)..(443) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (453)..(454) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (939)..(939) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (993)..(993) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1012)..(1013) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1017)..(1017) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1020)..(1021) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1027)..(1027) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1039)..(1039) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1043)..(1043) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1052)..(1052) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1058)..(1058) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1067)..(1067) <223> n is a, c, g, or t <400> 4 ttcactgagc ctcgtgggca a 21 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 5 tcttcatttc cctgcttgcc c 21 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 6 cttcatttcc ctgcttgccc 20 <210> 7 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 7 aggtcccagt gtagttgct 19 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> n is a, c, g, or t <400> 8 tgggcaagct ggagggaaac a 21 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> n is a, c, g, or t <400> 9 tcctctctct ctctctgtct 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 10 gcctttagtg tcctggtccc 20 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 11 cccgtttgct tgtctgtgtg t 21 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 12 gttccctggc agtcccttct 20 <210> 13 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 13 taccagcctt cttctactcc c 21 <210> 14 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 14 gtctttcctc tctctctctc t 21

Claims (37)

  1. 서열번호 2 또는 3에서 선택된 천연 안티센스 서열에 상보적인 10 내지 30개 뉴클레오타이드 길이의 합성 올리고뉴클레오타이드로서, 서열번호 4 내지 9, 11 및 13 중 하나에 제시된 뉴클레오타이드 서열들로 구성되고 커플링 방지 단백질 2(UCP2) 유전자의 기능 또는 발현 또는 기능과 발현 모두를 상향조절하는 안티센스 화합물인, 합성 올리고뉴클레오타이드.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 올리고뉴클레오타이드는 15 내지 30개 뉴클레오타이드 길이임을 특징으로 하는, 합성 올리고뉴클레오타이드.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 올리고뉴클레오타이드는 다음에서 선택된 하나 이상의 변경을 추가로 포함함을 특징으로 하는 합성 올리고뉴클레오타이드: 적어도 하나의 변경된 당분체, 적어도 하나의 변경된 뉴클레오시드간 연결체, 적어도 하나의 변경된 뉴클레오타이드, 및 이들의 조합.
  4. 청구항 3에 있어서, 상기 올리고뉴클레오타이드는 다음에서 선택된 적어도 하나의 변경된 당분체를 추가로 포함함을 특징으로 하는 합성 올리고뉴클레오타이드: 2'-O-메톡시에틸 변경 당분체, 2'-메톡시 변경 당분체, 2'-O-알킬 변경 당분체, 비시클릭 당분체 및 이들의 조합.
  5. 청구항 3에 있어서, 상기 올리고뉴클레오타이드는 다음에서 선택된 적어도 하나의 변경된 뉴클레오시드간 연결체를 추가로 포함함을 특징으로 하는 합성 올리고뉴클레오타이드: 포스포로티오에이트, 2'-O-메톡시에틸(MOE), 2'-플루오로, 알킬포스포네이트, 포스포로디티오에이트, 알킬포스포노티오에이트, 포스포아미데이트, 카바메이트, 카보네이트, 포스페이트트리에스테르, 아세트아미데이트, 카르복시메틸 에스테르, 및 이들의 조합.
  6. 청구항 3에 있어서, 상기 올리고뉴클레오타이드는 다음에서 선택된 적어도 하나의 변경된 뉴클레오타이드를 추가로 포함함을 특징으로 하는 합성 올리고뉴클레오타이드: 펩타이드 핵산(peptide nucleic acid:PNA), 잠금 핵산(locked nucleic acid:LNA), 아라비노-핵산 및 이들의 조합.
  7. 청구항 1에 따른 합성 올리고뉴클레오타이드 및 약학적 허용 부형제를 포함하고, 다음에서 선택된 UCP2 폴리뉴클레오타이드 관련 질병을 치료하기 위한 약학적 조성물: 암, 악액질, 신경성 식욕부진증, 신경성 과식증, 고인슐린혈증, 글루코즈 불내성, 당뇨병, 비만, 증후군 X, 면역학적 기능장애, 체온 기능장애, 심혈관 질병이나 질환, 죽상동맥경화증, 만성 염증성 질환, 염증, 신장 질병 또는 질환, 신경퇴행성 질환이나 질병, 및 뇌졸중.
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