CN114480473A - 调控植物对菌核病抗病性的新型基因及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种调控植物对菌核病抗病性的新型基因及其应用。本发明揭示了miR319a与植物对核盘菌的抗菌性状密切相关，下调miR319a可增强植物对核盘菌的抗菌性。本发明还揭示了与植物对核盘菌的抗菌性密切相关的新的信号通路miR319a‑TCP4‑WRKY‑JA/SA，上调该通路中TCP4的表达可增强植物的抗菌性，促进TCP4与WRKY启动子的结合、促进WRKY的转录激活可增强植物的抗菌性。因此，下调miR319a或调控miR319a‑TCP4‑WRKY‑JA/SA信号通路可应用于实现植物品种的改良。

Description

调控植物对菌核病抗病性的新型基因及其应用

技术领域

本发明属于生物技术以及植物学领域，更具体地，本发明涉及调控植物对菌核病抗病性的新型基因及其应用。

背景技术

植物在生长发育的过程中遭受着各种各样的微生物(包括细菌、真菌等)以及植食性昆虫的威胁，所以植物需要一套非常复杂的防御体系来抵抗这些昆虫的侵害。植物的自身免疫被激活时，会启动先天免疫反应，激发一系列的生理生化反应和基因的表达，先天免疫反应包括细胞膜表面的模式识别受体激发的免疫反应(PTI)和植物专化性的抗性蛋白(R蛋白)识别受体，分泌效应蛋白激发的免疫反应(ETI)。植物的免疫反应被激发后，包括茉莉酸(JA)，水杨酸(SA)，H₂O₂等在植物体内编织起一个复杂的防御信号网络。

除此之外，植物还拥有组成型防御体系，包括植物表面的蜡质、角质层、木质素等物理屏障。而构成这些防御网络的基本单元是植物中的基因，过表达或敲除某个基因可能会影响到其中的一些防御通路，从而显示出对昆虫抗性的增强或减弱。

MicroRNAs(miRNAs)是一类长为20～24nt的非编码RNA，其广泛存在于真核生物中。miRNAs来源于不完全互补配对的发夹结构，成熟miRNA在以AGO1为主的沉默复合体RISC的作用下对靶基因mRNA进行剪切或翻译抑制从而调控植物生长发育、生物和非生物胁迫等过程。miRNA在靶向于靶基因后，会对靶基因本身及其所参与的信号通路、下游途径等造成一系列的影响。

目前，植物对微生物的抗性的分子机制的研究还处于初级阶段，发掘微生物抗性相关的基因或信号途径，增强对微生物抗性分子机制的了解，将有助于田间对于微生物的防治。

发明内容

本发明的目的在于提供调控植物对菌核病抗病性的新型基因及其应用。

在本发明的第一方面，提供一种防治植物菌核病的方法，包括：(a)下调植物中miR319a或其前体的表达或活性；或(b)调节植物中miR319a-TCP4-WRKY-JA/SA信号通路，促进TCP4-WRKY-JA/SA介导的免疫作用。

在一个优选例中，(a)中，包括：在植物中敲除或沉默miR319a或其前体，抑制miR319a的活性；较佳地，包括：以特异性干扰miR319a或其前体的干扰分子来沉默miR319a或其前体，以CRISPR系统进行基因编辑从而敲除miR319a或其前体，以同源重组的方法敲除miR319a或其前体，或在含有miR319a或其前体的植物中将miR319a或其前体进行功能丧失性突变。

在另一优选例中，所述的沉默miR319a或其前体包括：利用基于Target mimicry技术的miR319a沉默体下调miR319a或其前体的表达。

在另一优选例中，(b)中包括：抑制miR319a与TCP4的结合；上调TCP4的表达或活性；和/或，促进TCP4与WRKY启动子的结合、促进WRKY的转录激活。

在另一优选例中，(b)中，包括：在植物中引入TCP4的上调剂，从而提高植物中TCP4的表达或活性；较佳地，所述上调剂包括编码TCP4的多核苷酸或构建物。

在另一优选例中，(b)中，包括：对TCP4的miR319a结合区域进行突变，阻止miR319a与TCP4的结合；较佳地，将miR319a与TCP4的结合区域的第10位突变为U，第12位突变为G，第15～18位突变为AAGU；或

在另一优选例中，(b)中，包括：在WRKY启动子区引入TCP4结合位点(当其已存在结合位点时，包括引入更多的结合位点)；较佳地所述TCP4结合位点为CATATG；较佳地通过基因编辑或定点突变引入所述TCP4结合位点。

在另一优选例中，所述对TCP4的miR319a结合区域进行突变为同义突变，不改变TCP4的功能，特别是其与WRKY的相互作用的功能。

在另一优选例中，所述的促进TCP4-WRKY-JA/SA介导的免疫作用包括：通过促进PR2，PR3和PDF1.2b的表达而促进免疫作用。

在本发明的另一方面，提供一种miR319a或其前体的下调剂的用途，用于防治植物菌核病，或用于制备防治植物菌核病的制剂；较佳地，所述的下调剂包括：敲除或沉默miR319a或其前体的试剂，抑制miR319a活性的试剂；较佳地，包括：特异性干扰miR319a或其前体表达的干扰分子，针对miR319a或其前体的CRISPR基因编辑试剂、同源重组试剂或定点突变试剂，所述定点突变试剂将miR319a或其前体进行功能丧失性突变。

在本发明的另一方面，提供调节植物中miR319a-TCP4-WRKY-JA/SA信号通路的调节剂的用途，用于防治植物菌核病，或用于制备防治植物菌核病的制剂；其中，所述调节剂包括：TCP4的上调剂，其可提高植物中TCP4的表达或活性；较佳地，所述上调剂包括编码TCP4的多核苷酸或构建物；或，TCP4的miR319a结合区域进行突变的试剂，其阻止miR319a与TCP4的结合；较佳地，将miR319a与TCP4结合区域的第10位突变为U，第12位突变为G，第15～18位突变为AAGU；或，在WRKY启动子区引入TCP4结合位点的试剂；较佳地所述试剂为基因编辑或定点突变试剂；较佳地所述TCP4结合位点为CATATG。

在一个优选例中，所述的植物是表达miR319a、TCP4、WRKY或其同源物的植物，或具有miR319a-TCP4-WRKY-JA/SA信号通路的植物；较佳地，所述的植物包括(但不限于)：十字花科植物，禾本科植物。

在另一优选例中，所述的WRKY为启动子区包括CATATG序列的WRKY；较佳地包括：WRKY70，WRKY33或WRKY75。

在另一优选例中，所述的上调、促进、提高或增强表示显著性的上调、促进、提高或增强，如上调、促进、提高或增强20％、40％、60％、80％、90％或更高。

在另一优选例中，所述的弱化、减弱、降低、抑制或下调表示显著性的弱化、减弱、降低、抑制或下调，如弱化、减弱、降低、抑制或下调20％、40％、60％、80％、90％或更低。

在另一优选例中，所述的功能丧失性突变包括：使得miR319a序列变化、丧失结合能力；较佳地，通过基因编辑，在miR319a序列中进行碱基的插入、缺失或突变。

在本发明的另一方面，提供一种TCP4的突变体，其miR319a结合区域发生突变，所述突变包括：miR319a与TCP4结合区域的第10位突变为U，第12位突变为G，第15～18位突变为AAGU。

在本发明的另一方面，提供一种植物miR319a或包含其的miR319a-TCP4-WRKY-JA/SA信号通路的用途，用于作为鉴定植物菌核病抗性的分子标记，或用作定向筛选菌核病抗性植物的分子标记物。

在本发明的另一方面，提供一种定向选择或鉴定植物的方法，所述方法包括：鉴定测试植物中的miR319a或TCP4的表达或它们的结合情况，或鉴定植物中miR319a-TCP4-WRKY-JA/SA信号通路的情况；若是该测试植物的miR319a高表达(如比常规的同类植物中表达水平高，如高10％以上、20％以上、50％以上、80％以上)、TCP4低表达(如比常规的同类植物中表达水平低，如低10％以上、20％以上、50％以上、80％以上)、miR319a与TCP4结合强(如比常规的同类植物中结合水平强，如强10％以上、20％以上、50％以上、80％以上)、或TCP4与WRKY启动子的结合弱(如比常规的同类植物中结合水平弱，如弱10％以上、20％以上、50％以上、80％以上)，则其为菌核病易感性的植株；若是该测试植物的miR319a低表达(如比常规的同类植物中表达水平低，如低10％以上、20％以上、50％以上、80％以上)、TCP4高表达(如比常规的同类植物中表达水平高，如高10％以上、20％以上、50％以上、80％以上)、miR319a与TCP4结合弱(如比常规的同类植物中结合水平弱，如弱10％以上、20％以上、50％以上、80％以上)、或TCP4与WRKY启动子的结合强(如比常规的同类植物中结合水平强，如强10％以上、20％以上、50％以上、80％以上)，则其为菌核病抗性的植株。

在另一优选例中，所述高表达或高活性，是指与同类或同种植物的表达或活性的平均值相比，表达或活性具有统计学意义的提高。

在另一优选例中，所述低表达或低活性，是指与同类或同种植物的表达或活性的平均值相比，表达或活性具有统计学意义的降低。

在本发明的另一方面，提供一种筛选防治植物菌核病的物质(潜在物质)的方法，包括：(1)将候选物质加入到表达miR319a-TCP4-WRKY-JA/SA信号通路的体系中；(2)检测所述体系，观测其中miR319a-TCP4-WRKY-JA/SA信号通路基因的表达、活性或相互结合水平：若其中miR319a的表达或活性显著降低(如与未添加候选物质的对照组相比，低10％以上、20％以上、50％以上、80％以上)，则表明该候选物质为可防治植物菌核病的物质，若其中TCP4的表达或活性显著提高(如与未添加候选物质的对照组相比，高10％以上、20％以上、50％以上、80％以上)，则表明该候选物质为可防治植物菌核病的物质，若其中miR319a与TCP4结合显著减弱(如与未添加候选物质的对照组相比，弱10％以上、20％以上、50％以上、80％以上)，则表明该候选物质为可防治植物菌核病的物质，或，若其中TCP4与WRKY启动子结合显著增强(如与未添加候选物质的对照组相比，强10％以上、20％以上、50％以上、80％以上)，则表明该候选物质为可防治植物菌核病的物质。

在另一优选例中，还包括设置对照组，从而明确分辨测试组中miR319a-TCP4-WRKY-JA/SA信号通路基因的表达或活性与对照组的差异。

在另一优选例中，所述的候选物质包括(但不限于)：针对miR319a、TCP4、WRKY基因或其编码的蛋白或它们的上游或下游蛋白或基因设计的调控分子，如上调剂、小分子化合物基因编辑构建物等。

在另一优选例中，所述的植物是表达miR319a、TCP4、WRKY或其同源物的植物，或具有miR319a-TCP4-WRKY-JA/SA信号通路的植物；较佳地，所述的植物包括(但不限于)：十字花科植物，禾本科植物；或，所述的WRKY为启动子区包括CATATG序列的WRKY；较佳地包括：WRKY70，WRKY33或WRKY75。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1、miR319a转基因白菜提高菌核病感病性，5周大的转基因和野生型植株被选择并接种直径9mm的核盘菌菌饼；

(A)田间栽培的Bre，eMIR319a和5mTCP4-1植株感病表型；

(B)2015年和2016年Bre，eMIR319a和5mTCP4-1的感病率。n>50；

(C)大田栽培的Bre，eMIR319a和5mTCP4-1植株的感病叶片比例。n>30，Student’st-test，*P<0.05；**P<0.01；

(D)田间栽培的eMIR319a，Bre和5mTCP4-1植株中叶片相对病斑面积。n>30，Student’s t-test，**P<0.01；

(E，F)核盘菌侵染Bre和eMIR319a不同时间后植株的感病表型及台盼蓝染色结果；

(G)核盘菌侵染Bre和eMIR319a后60h内病斑面积的变化。Student’s t-test，**P<0.01；

(H)核盘菌侵染Bre和eMIR319a后48小时内叶片发病率的变化；n>80；

(I)核盘菌侵染Bre和eMIR319a 72h内PRs和PDF1.2b基因相对表达量的变化；其中，Student’s t-test，**P<0.01。

图2、miR319和TCPs在核盘菌侵染后的野生型植株中的累积量。

(A)Northern blot检测野生型在受核盘菌侵染前和侵染12h后miR319的累积量；

(B)野生型植株在受核盘菌侵染前以及侵染12h后pri-miR319a和TCP基因的表达量。Student’s t-test，*P<0.05；**P<0.01。

图3、BrpTCP4-1转基因大白菜提高菌核病的抗性。

(A)在野生型和BrpTCP4-1过表达植株(5mTCP4-1)中TCP4与miR319关系的示意图，过表达植株中与野生型不同的碱基被标注为红色；

(B，C)菌核病侵染不同时间后Bre和5mTCP4-1植株的感病表型(B)和台盼蓝染色(C)；

(D)Bre和5mTCP4-1植株在病原菌侵染72h内的病斑面积。n>20，Student’s t-test，*P<0.05；**P<0.01；

(E)核盘菌侵染Bre和5mTCP4-1后48h内的叶片感病率。n>50；

(F)PRs和PDF1.2b在核盘菌侵染前后的Bre和5mTCP4-1中的相对表达量。Student’s t-test，*P<0.05；**P<0.01。

图4、eMIR319a与野生型植株RNA-seq结果比较分析。

(A)eMIR319a与野生型差异表达基因分析；(B)eMIR319a中下调基因的GO富集分析；(C)eMIR319a下调基因中植物免疫相关的基因Rich factor。Rich factor＝显著下调基因数/各基因家族成员总数；(D)候选基因在Bre，eMIR319a和5mTCP4-1植株中的相对表达量。Student’s t-test，*P<0.05；**P<0.01。

图5、BrpTCP4-1直接结合WRKYs启动子CATATG序列激活WRKYs转录。

(A-D)EMSA试验显示BrpTCP4-1能够在体外结合WRKYs启动子CATATG序列。被标记的含CATATG序列的探针与TCP4-MBP融合蛋白进行孵育，同时单独的序列或序列与MBP孵育作为阴对照，未标记的探针以及突变探针作为冷竞争；(E)用来做ChIP-qPCR试验的DNA片段。P1，P4，P5和P6为有候选结合位点的片段，P2，P3和P7为不含候选结合位点的片段；(F)ChIP-qPCR试验结果表明BrpTCP4-1在体内特异性结合P1、P4、P5和P6片段；(G-I)瞬时转化试验检测YFP的相对表达量。Student’s t-test，*P<0.05；**P<0.01；(J-L)核盘菌侵染前(0h)及侵染后(48h)BrpWRKY33-2，BrpWRKY70-1和BrpWRKY75-1在野生型，5mTCP4-1以及eMIR319a植株中的相对表达量。Student’s t-test，*P<0.05；**P<0.01。

图6、miR319a/TCP4通路通过调控WRKYs影响植物抗菌核病的模式图。

图7、大田栽培的eMIR319a和Bre的感病表型。

(A)田间栽培的miR319a过表达大白菜(eMIR319a)的感病表型；

(B)田间栽培的miR319a过表达大白菜(eMIR319a)和野生型大白菜(Bre)的照片；

(C)普通显微镜下野生型和eMIR319a大白菜叶片表型；

(D)扫描电子显微镜下野生型和eMIR319a大白菜叶片表型；

图8、BrpTCP4在野生型和过表达植株中的相对表达量。

图9、BrpTCP4在eMIR319a中的相对表达量(Fold-change)。

图10、下调基因的GO富集结果。

图11、BrpTCP4-1结合序列分析；

(A)BrpTCP4-1蛋白的序列信息以及结构域分析；

(B)大白菜中AtWRKY70的同源基因分析；

(C)在BrpWRKY70-1，BrpWRKY70-2和BrpWRKY70-3启动子区域筛选得到15个候选结合位点；

(D)BrpWRKY33-2和BrpWRKY75-1的启动子序列上筛选到的结合序列；

(E)构建BrpTCP4-1-MBP载体并纯化得到TCP4-MBP融合蛋白；

(F)EMSA试验确定能够与BrpTCP4-1结合的序列。

图12、TCP4在WRKY启动子上结合位点分析。

图13、瞬时转化试验载体构建的示意图。A-F：BrpWRKYs启动子驱动YFP载体(pBrpWRKY70-1，pBrpWRKY33-2，pBrpWRKY75-1)，CATATG序列突变后BrpWRKYs启动子驱动YFP载体(pBrpWRKY70-1-m1，pBrpWRKY70-1-m2，pBrpWRKY70-1-m3，pBrpWRKY75-1，pBrpWRKY75-1m1，pBrpWRKY33-2以及pBrpWRKY33-2m1)，以及35S驱动BrpTCP4-1载体的构建示意图。

具体实施方式

本发明人经过深入的研究，发现miR319a与植物对核盘菌的抗菌性状密切相关，下调miR319a可增强植物对核盘菌的抗菌性；本发明还揭示了与植物对核盘菌的抗菌性密切相关的新的信号通路miR319a-TCP4-WRKY-JA/SA，上调该通路中TCP4的表达可增强植物的抗菌性，促进TCP4与WRKY启动子的结合、促进WRKY的转录激活可增强植物的抗菌性。因此，下调miR319a、调控miR319a-TCP4-WRKY-JA/SA信号通路可应用于实现植物品种的改良。

miR319a

本发明中，来源于大白菜的“miR319a”是具有以下序列的miRNA：

miR319a：UUGGACUGAAGGGAACUCCCU(SEQ ID NO:1)；

本发明中，所述的miR319a也包括其同源物，也即存在于大白菜以外的其它物种中、与本发明上述的序列具有同源性且功能与本发明中miR319a相同的miRNA。由于miR319a在多种物种中保守性地存在，应理解，本发明中并不仅限于实施例中具体列举的miR319a。

miR319a的前体天然地存在于植物中，在了解了miR319a的序列后，本领域技术人员可以确定其前体。当进行人工改造时，所述的miR319a或其前体或基于它们所设计的靶向性序列可以是人工合成的或被置于构建物或表达盒中，这是本领域技术人员在本发明的指引下容易制备的。

在得知了所述的miR319a的功能后，可以采用本领域人员熟知的多种方法来下调所述的miR319a的表达，这些方法均可被包含在本发明中。作为一种实施方式，提供了一种下调植物中miR319a或其前体的表达的方法，包括：(1)将干扰miR319a或其前体表达的干扰分子转入植物细胞、组织、器官或种子，获得转化入所述干扰分子的植物细胞、组织、器官或种子；(2)将步骤(1)获得的转入了所述干扰分子的植物细胞、组织、器官或种子再生成植物。较佳地，所述方法还包括：(3)选择出转入了所述载体的植物细胞、组织或器官；和(4)将步骤(3)中的植物细胞、组织或器官再生成植物。作为另一种实施方式，采用CRISPR/Cas9系统进行基因编辑，从而敲除或下调靶基因。合适的sgRNA靶位点，会带来更高的基因编辑效率，所以在着手进行基因编辑前，可以设计并找到合适的靶位点。在设计特异性靶位点后，还需要进行体外细胞活性筛选，以获得有效的靶位点用于后续实验。

作为一种更为具体的实施方式，提供了一种降低植物中miR319a的表达的方法，所述的方法包括：(1)构建基于target mimicry技术的miR319a沉默体，其包括IPS基因序列中以及位于该序列中的mimicry miR319a序列；(2)将(1)获得的miR319a沉默体转入植物细胞、组织、器官或种子，获得转化入所述干扰分子的植物细胞、组织、器官或种子；(3)将步骤(2)获得的转入了所述miR319a沉默体的植物细胞、组织、器官或种子再生成植物。较佳地，所述方法还包括：(iii)选择出转入了所述载体的植物细胞、组织或器官；和(iv)将步骤(iii)中的植物细胞、组织或器官再生成植物。

发明还提供了用于下调所述的miR319a或其前体的物质，其通过下调miR319a或其前体从而发挥改良植物的性状的功能。所述物质可以是：下调剂、核酸抑制物、拮抗剂、阻滞剂、阻断剂等，只要它们能够下调miR319a或其前体的表达水平。所述的生物分子可以是核酸水平(包括DNA、RNA)的，也可以是蛋白水平的。所述的miR319a或其前体的下调剂是指任何可降低miR319a活性、降低miR319a或其前体的稳定性、下调miR319a的表达、减少miR319a有效作用时间、或抑制miR319a或其前体的转录和翻译的物质，这些物质均可用于本发明，作为对于下调miR319a或其前体有用的物质。它们可以是化合物、化学小分子、生物分子。所述的生物分子可以是核酸水平(包括DNA、RNA)的，也可以是蛋白水平的。例如，所述的下调剂是：特异性干扰miR319a或其前体表达的干扰RNA分子或反义核苷酸；或是特异性编辑miR319a或其前体的基因编辑试剂，等等。

作为本发明的优选方式，所述物质包括特异性下调miR319a或其前体的干扰分子或基于Target mimicry技术的miR319a沉默体。本发明还提供包含所述干扰分子或沉默体的表达载体，优选植物表达载体；更优选适合于进行后续转基因操作(如应用农杆菌的转基因操作)的表达载体。本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含有本发明所述的启动子和/或目的基因序列的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。

TCP4

如本发明所用，除非特别说明，所述的TCP4可以指TCP4-1、TCP4-2、TCP4-3(它们均能与miR319a结合)或与其发挥同样功能的家族基因，其能与所述miR319a相互结合，例如本发明实施例中，提供了来自大白菜的TCP4-1基因，其具有SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。所述的TCP4可以是gDNA或cDNA，也可以包含启动子。其编码基因也包括与本发明所提供的序列相简并的序列。

本发明也包括TCP4的变异形式，此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。

本发明中，所述的TCP4也包括其同源物。应理解，虽然本发明中优选研究了获自特定物种大白菜的TCP4，但是获自其它物种的与所述TCP4高度同源(如具有60％以上，如70％，80％，85％、90％、95％、甚至98％序列相同性)的其它基因序列或其简并的序列也在本发明考虑的范围之内。

本发明还包括一种突变形式的TCP4基因，其其miR319a结合区域发生突变，所述突变包括：结合区域的第10位突变为U，第12位突变为G，第15～18位突变为AAGU。该突变为同义突变，并不改变TCP4基因所编码的蛋白的功能，但是其却消除了与miR319a结合的位点，从而可避免与miR319a的结合，提高植物的抗核盘菌的能力。

包含所述TCP4序列的载体，以及用所述的载体或TCP4序列经基因工程产生的宿主细胞也包括在本发明中。本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含合适的表达载体。

宿主细胞通常是植物细胞。转化植物一般可使用农杆菌转化或基因枪转化等方法，例如叶盘法、水稻幼胚转化法等；优选的是农杆菌法。对于转化的植物细胞、组织或器官可以用常规方法再生成植株，从而获得相对于野生型而言性状发生改变的植物。

miR319a-TCP4-WRKY-JA/SA信号通路

如本发明所用，所述的“(信号)通路”是指由一系列蛋白或基因发生相互制约或相互作用而形成的信号系统，其一般会导致一些细胞事件的发生。所述的miR319a-TCP4-WRKY-JA/SA信号通路包括(但不限于)：miR319a、TCP4基因(和/或其编码的蛋白)、WRKY(和/或其编码的蛋白)，该WRKY进一步参与JA/SA相关的植物抗性信号通路。

SA是一种酚类小分子，SA及其盐类是一类植物激素，调控植物体内一些重要的代谢过程，例如促进开发、去顶端优势、促进侧生生长等；SA诱导多种植物对生物胁迫或非生物胁迫产生持续抗性上起到信号分子的作用。

JA是一种茉莉酸类化合物，是一种植物激素，普遍存在于植物体中，作用于与生长发育相关的生理过程，如萌发、筛老、果实成熟、根的生长等，同时在抵御生物和非生物胁迫等生物学过程中起着重要的作用。

在miR319a-TCP4-WRKY-JA/SA信号通路中，所述的miR319a处于信号通路的上游，所述的WRKY-JA/SA处于信号通路的下游。

本发明人发现，所述的信号通路中，miR319a高表达时，其靶基因TCP4发生下调，其结合于WRKYs启动子靶位点(CATATG)的比例下降，WRKY的转录激活下降，WRKY参与的JA和SA介导的植物免疫过程被负调控，植物对于核盘菌侵染的免疫能力下降，易于被核盘菌侵染。

反之，若是过表达TCP4(较佳地突变其上的miR319a作用位点)，其表达上调后，结合于WRKYs启动子靶位点(CATATG)的比例上升，WRKY的转录激活被上调，植物对于核盘菌侵染的免疫能力提高，其抗菌能力强。

当用于作为人工调控的靶标时或人为建立筛选系统时，以上的基因或其编码的蛋白可以是天然存在的，比如其可被纯化和分离自哺乳动物；也可以是重组制备的，比如可以根据常规的基因重组技术来生产重组的蛋白。此外，任何不影响这些蛋白的生物活性的变化形式都是可用的，如它们的功能未发生改变的衍生物或变异体。

改良植物的方法

如本文所用，所述的“植物”包括表达miR319a或包含miR319a-TCP4-WRKY-JA/SA信号通路的植物，所述“植物”也存在水杨酸信号途径和/或茉莉酸信号途径。根据本领域的知识，存在miR319a或包含miR319a-TCP4-WRKY-JA/SA信号通路的植物，其内在存在如本发明所主张的作用机制，可以实现如本发明所主张的技术效果。

所述的植物可以是多种植物，例如但不限于：十字花科植物，如大白菜(Brassicarapa)，拟南芥(Arabidopsis thaliana)；禾本科植物，如水稻(Oryza sativa)，小米(Setaria italica)，狗尾草(Setaria viridis)，Panicum hallii var.hallii，黍(Panicum miliaceum)，Dichanthelium oligosanthes，玉米(Zea mays)，高粱(Sorghumbicolor)，画眉草(Eragrostis curvula)，大麦(Hordeum vulgare)，二穗短柄草(Brachypodium distachyon)，小麦(Triticum aestivum)；豆科植物，如花生(Arachishypogaea)；凤梨科植物，如菠萝(Ananas comosus)；兰科植物，如石斛(Dendrobiumcatenatum)；棕榈科植物；睡莲科植物；罂粟科植物；桃金娘科植物；茄科植物，如马铃薯(Solanum tuberosum)，烟草(Nicotiana tabacum)；梧桐科植物；等等。

所述的“菌核病”为由核盘菌属(Sclerotinia)引起的植物病害。发病部位由菌丝体集结成结构松紧不一，表面光滑或粗糙，形状、大小、颜色不同的菌核。

本领域已知，miR319a通过调控其靶基因TCPs(TEOSINTE BRANCHED1/CYCLOIDEA/PCF)的表达调控植物叶片细胞分裂等过程，然而对于miR319a/TCPs参与植物抗病过程了解甚少。在本发明中，本发明人发现miR319a过表达植物受核盘菌侵染后在发病率，病斑面积和扩散速度上都显著高于野生型，SA和JA介导的抗病途径响应弱于野生型，更易感染菌核病。在核盘菌侵染后，miR319a表达上升，而其靶基因TCPs选择性下调。在植物中过表达miR319a靶基因BrpTCP4-1后植株感病率、病斑面积及扩散速度降低，抗病基因表达量升高，提高了对菌核病抗性。通过RNA-seq提示，WRKY是miR319a/TCP4通路的下游基因；随后通过EMSA、ChIP-qPCR和烟草瞬时转化等实验表明BrpTCP4能够直接结合在WRKY33-2，WRKY70-1和WRKY75-1启动子CATATG序列上，并特异性激活WRKYs的转录。此外，在核盘菌侵染前后，WRKY75-1，WRKY70-1和WRKY33-2的表达量在miR319a过表达植株中显著低于野生型，同时在BrpTCP4-1过表达植株中显著高于野生型。以上结果表明，miR319a/TCP4通路通过调控WRKYs影响植物菌核病抗性。

基于本发明人的新发现，本发明提供了一种改良植物的方法，所述方法包括：抑制植物体内miR319a的表达或活性，进而提高植物对于菌核病的抵抗能力。

基于本发明人的新发现，本发明提供了一种改良植物的方法，所述方法包括：调控植物体内miR319a-TCP4-WRKY-JA/SA信号通路，促进TCP4-WRKY-JA/SA介导的免疫作用，进而提高植物对于菌核病的抵抗能力。

作为本发明的优选方式，提供了一种使植株的性状表现为对于菌核病的抵抗能力更强的方法，包括：下调miR319a的表达或活性；抑制miR319a与TCP4的结合；上调TCP4的表达或活性；和/或，促进TCP4与WRKY启动子的结合、促进WRKY的转录激活。

应理解，在得知了所述miR319a以及包含miR319a的miR319a-TCP4-WRKY-JA/SA信号通路(较佳地，也包括其下游基因)的功能后，可以采用本领域人员熟知的多种方法来调节所述的miR319a的表达或活性或调节所述miR319a-TCP4-WRKY-JA/SA信号通路。比如可以采用本领域人员熟知的多种方法来降低miR319a表达或使之缺失表达。或采用本领域技术人员熟知的方法来促进或减弱蛋白-蛋白，蛋白-基因，基因-基因之间的相互作用，增强或减弱信号通路的运行。

本发明中，可通过运用调节剂促进TCP4-WRKY-JA/SA的作用来进行调控，所述调节剂可包括促进剂、激动剂、激活剂。所述的“上调”、“促进”包括了蛋白活性的“上调”、“促进”或蛋白表达的“上调”、“促进”，且它们为具有统计学意义的“上调”、“促进”。任何可提高TCP4-WRKY-JA/SA信号通路蛋白的活性、提高该信号通路蛋白的稳定性、上调该信号通路基因的表达、增加该信号通路蛋白有效作用时间的物质这些物质均可用于本发明，作为对于提高植物对于菌核病的抗性有用的物质。它们可以是化合物、化学小分子、生物分子。所述的生物分子可以是核酸水平(包括DNA、RNA)的，也可以是蛋白水平的。

作为本发明的优选方式，所述调节剂包括：TCP的上调剂，其可提高植物中TCP4的表达或活性；较佳地，所述上调剂包括编码TCP4的多核苷酸或构建物；或，TCP4的miR319a结合区域进行突变的试剂，其阻止miR319a与TCP4的结合；较佳地，其将TCP4与miR319a结合区域的第10位突变为U，第12位突变为G，第15～18位突变为AAGU；或，在WRKY启动子区引入TCP4结合位点的试剂；较佳地所述试剂为基因编辑或定点突变试剂；较佳地所述TCP4结合位点为CATATG。

植物定向筛选或靶向性筛选

在得知了miR319a或miR319a-TCP4-WRKY-JA/SA信号通路的功能以后，可以以其为分子标记物，来进行植物的定向筛选。也可基于该新发现来筛选通过调节这一机制，从而定向调控植物对于核盘菌的抗性的物质或潜在物质。

因此，本发明提供了一种定向选择或鉴定植物的方法，所述方法包括：鉴定测试植物中的miR319a的表达或序列特征，或鉴定植物中miR319a-TCP4-WRKY-JA/SA信号通路的蛋白-蛋白、基因-蛋白、基因-基因的相互作用和/或激活情况；若是该测试植物的miR319a高表达、TCP4低表达、miR319a与TCP4结合强、或TCP4与WRKY启动子的结合弱，则其为菌核病易感性的植株；反之，若是该测试植物的miR319a低表达、TCP4高表达、miR319a与TCP4结合弱、或TCP4与WRKY启动子的结合强，则其为菌核病抗性的植株。

本发明还提供了一种筛选防治植物菌核病的物质/潜在物质的方法，包括：(1)将候选物质加入到表达miR319a-TCP4-WRKY-JA/SA信号通路的体系中；(2)检测所述体系，观测其中miR319a-TCP4-WRKY-JA/SA信号通路基因的表达、活性或相互结合水平：若其中miR319a的表达或活性显著降低、TCP4的表达或活性显著提高、miR319a与TCP4结合显著减弱、或TCP4与WRKY启动子结合显著增强，则表明该候选物质为可防治植物菌核病的物质。

以蛋白或基因或其上特定的区域作为靶点，来筛选作用于该靶点的物质的方法是本领域人员所熟知的，这些方法均可用于本发明。所述的候选物质可以选自：肽、聚合肽、拟肽、非肽化合物、碳水化合物、脂、抗体或抗体片段、配体、有机小分子、无机小分子和核酸序列等。根据待筛选的物质的种类，本领域人员清楚如何选择适用的筛选方法。

经过大规模的筛选，可以获得一类特异性作用于miR319a或miR319a-TCP4-WRKY-JA/SA信号通路，对植物核盘菌抗性有调控作用的潜在物质。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

材料和方法

基因信息

miR319a：uuggacugaagggaacucccu(SEQ ID NO:1)

BrpTCP4-1(SEQ ID NO:2)：

atggcagaagacgacgaagctcaccgcttcctccaccctccagcaccgccgtcttcttcttcaatgagacgccgcgctacgtcggaggtggcgaacggcggctgcggcgagatagtcgaggtgcaaggaggtcacattgtgcggtccacgggaaggaaagaccggcacagcaaagtctgcacggcgaaagggccacgtgaccggcgcgtgaggctatcggctcacacggcgagtcagttctacgacgttcaagaccggcttgggttcgaccggccgagcaaagccgttgactggcttatcaaaaaagcgaagacttccatcgacgagctcgctcagcttccgccgtgggatccggcggatgcgattcgcaacgccgccgcgaacgctaaaccgagaagaaccgccgcgaaagctcgagtttctccatctcctccgccgcagcagcttcagttcagcggcggaacggccgtgggattcgccggagcaacggaacgtcggagtaatgataataaccagtcgagctttcttccgccgtcgatggactcagattcgattgctgacactataaagtcgtttttcccggtggttggctccacggcggaggctccgccgcatcagcttatgcacaactaccatcatcatcatccgccggatttgctttcaagaaccaatagtcaaaaccaagatctccgtctctcgctgcaaccgttcccggatggtccaccgtcgcttctccaccaccaccaccactccgtagccgagcctgttctgttctacgggcagagcaacccgctagggtatgacacgtcgacgggtggctgggagcaacagtcaattcagagactggtggcttggaacagcggcggagcaaacgatacaggaaacggaggaggaggaggagggtttctgtttgctcctcctcctaatcatcctacttcaacgacgtcgtttcagccagtacttggccaaagccagctttattctcagaggggtccccttcagtccagttacagtcccatgatccgtgcttggtttgatcctactcaccaccatcatcaatccatctccactgacgatctcaaccaccaccaccaccatatgcctccgccaattgcttcaggtgagttctcttccggttttcgggtaccagcacggtttcagggtcaagaagaggagcagcacgacggtctaaacaacaaaccgtcctctgcttctcgccattga

BrpTCP4-2(SEQ ID NO:3)：

atggcagacgaagctcacaactttctccaccctccagcaccaccaccgccttcttcaatgagccaccgcgaggcggcgaacggcggctgcggcgagatagtcgaggtgcaaggaggtcacattgtccggtcgacgggaaggaaagatcggcacagcaaagtctgcacggccaaagggccacgtgaccggcgcgtgaggctatcggctcacacggcgattcagttctacgacgttcaggaccgcctcggcttcgaccggccaagcaaagccgtcgactggcttatcaagaaggctaaagcttccatcgacgagctcgctcagcttccgccgtggaaccccgccgacgcaatgcgcaacgccgccgcaaacgcgaaaccgagaagaaccgccgctaaaactcgaatctctccgtcgccgccgccgccgtcgcagcagcaacagaaccagcttcagttcggtggattcgacggagcggcggagcatcgggggaacgagaacgagtcgagttttctcccgccgtcgatggattcggattctatcgctgacactataaagtcgttcttcccggtggttggctcttcgacggaagctcctcctccgaaccagcttatacacagcaactaccatcatcatcacccaccggatttgctttctcgaactaatagccacaaccaagatctccgtctctcgctgcactccttcccggatggtccaccgtcgcttctccaccaccaccactccgcgtccgcctccaccgccgagccagttctgttctacgggcagagcaatccgctagggtatgacacgtcgacgggtggttgggagcagcagtcaattcagaggctggtggcttggaacagcggcggagcaaccgagacaggaaacggaggaggaggaggaggaggagggtttctctttgctcctccagctccttcgacgacgtcgtttcagccagtacttggccaaagcccgccttgttctccgaggggtccccttcagtccagttacagtcccatgatccgtgcttggtttgatcctcaccaccaccatcagtccatctccaccgatgatctcaaccaccatattcctcacccggttcaccaaggtgaattctcttccggtttccgcataccagcacggtttcagggccaagaagaggagcagcacgatggtttctccaacaaaccgtcatctgcttcctccatttctcgccatcgttaa

BrpTCP4-3(SEQ ID NO:4)：

atggcagacgaccacgacgaagctcaccacttcctccaccctcaaccaccgccgccttcttcaatgaggcaccgcgctgcgtcagacgagatagtggaggtgcaaggaggtcacattgtacggtcgacggggagaaaagaccggcacagcaaagtctgcacggccaaagggccacgtgaccggcgcgtgaggctgtcggctcacacggcgattcagttctacgacgttcaagaccgccttggcttcgaccgtccgagcaaagccgttgactggctgatcagaaaggctcagacttccatcgacgagctcgctcagcttcctccgtggagtcccgccgacgctattcgcaacgcgaaaccgagaagaaccgccgccaaaactaaaatctctccgtcgccgccgccgccgcaacgggaacagcttcagttcggtggtgcacggtccggtggattcgacggagcggcggagcttccgagttttcttccgccgtcgacggattcagagtcgtttttcccggtggttggctcctcgacggaagctcctccgagtcaagatctccgtttatcgctgcactcgttcccggatggtccaccgtcgcttctccaccgccaccactcagctcccgagcctgttctgttctacggacagagcaatccgtttgggtacgatggctgggagcaacagtcgattcagagactggtggcttgtaacggcggcggagcaaccgatacaggaaacggaggaggagggtttctctttgctccttctccgacgacgtcgtatcagccagtacttggccaaagtcagctttgttctcagaggggttcccttcagtccagttacacgcccatgatccgtgcttggtttgatcctcatcaccatcagtccatctccaccgaggatctcagccatcatattcctccgccggtgtttgcctcaggtgaattctcttccggttttcgcgtgccagcacggtttcagggtcaagaggaggaacagcaggacggtctaaccaacaaaccgtcctctgcttcctctgtttctcgccattga

BrpWRKY70-1(SEQ ID NO:5)：

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BrpWRKY70-2(SEQ ID NO:6)：

atggatattgttagtaataacaaagcaataatgctaaaagttatggaccaactcgttcaaggccatgagttggccactaagcttcaacagctcctctctcaacacgggtcgggtcgtggtgcagcaggggatctcgtggctaaaatctcggcatcttttagtgacacaatctctgctcttgattccttcgaacccatcccctcctctctcttcaccgccgttgaaggctctcaaaatgcttcctgcaacaacgacggcaagcttgaggattccgttgatagtcggaaaagattgggacccgtcaagggtaaaagaggatgctacaagagaaaaaagagagctgacacgtggactgtagagtcaactctacttgaggacgcattttcttggaggaaatatggaaaaaaggagattcttaatgccaaattcccaagaagttactttaggtgcacacataaatacactcaagggtgcaaggcaacaaagcaagtacagaagctagagctcgaacccaggatgttcagtatcacatacattggaaaccacacgtgcgacacggacgaagtaacaccaaatatcaatccttgtgttcatcatgatgacggcatcatggattctgaagagttcaagtgtcctagtttgaggacctcgatgaatgaagaggaagataaccatcatcatggttcgtccacggagagtgacttgcaattggtgtggcaagaaatgttggtgtttggagaggaacataatcatcatcatcatgaggctatttatggttgcggtgaaactagtgcatctatttatggtttggataccacggatctttggagttggcagcgatttccggttcaacgataa

BrpWRKY70-3(SEQ ID NO:7)：

atggatattgctagtaataacaaagcaataaagctaaaagttagggaccaacttcttcaaggccacgagatgaccactaaggttcagcaactcctctctcaagacgggtcggatttgggtccagcgaaggatctcgtggagaaaatattggggtctttcaatgacataatctctgctcttgattccttcgaacccatctccccgtctgctctagtcacagccgtcgaaggctctcaaaatgcttcctgcgacaacgacggcaagcttgaggattctggcgatagtcataaaaaattgggaccagttaagggtaaaagaggatgctacaagagaaagaagaaatcagagacatggactgtagagtctaccgtacttgaggacacattttcttggaggaaatatggacagaaacagattcttaataccaaattcccaagaagttactttaggtgcacacacaaatacactcaagggtgcaaggcaacaaagcaagtgcagaagctagagtctgagcccaggatgttcagcatcacatacatcggaaaccacacgtgtaataccaacgaagtaacacccaaaatcaagccttgtattcatcacgatgagatcatcacggattctgaagagatccagagtcctagtttgatgacctcgatgaaggaagaggaagaaaatcaccatcatggttcgtcaacggagagtgacttgcaattggtgtggcaggaaatgttggtctttgaagaggaacaccatcatcatcatgaggctgtttacggttgtggtgaaactagtacatctatcaatggtttggattccgcggatctgtggagttggcagcagttttcggtttag

BrpWRKY33-2(SEQ ID NO:8)：

atgaatggttctgttaattggtcgcaacaaaccgcaagagcatcaccagcatctttggaagatcttgagatcccaccaaagttcagatcatttgctccttcttcaatcttaacctctccttccacttgtttcagcccctctctatttctagattcccctgcttttgtctcctcctctgctaacgttcttgcttctccaaccacaggagctctcatcacaaacgaaagtaaccataaaagtataactgaggaagagaagactaacaaaaacaacaacagccttagcctctttgatttctcatttcagacacaaccatcaggactttctgctcccacaacaacaacaaacagttctgtcttacaatggagccaaacagatactcgtccaaacaacagcactcagcaagctgtaccttacaacggaagggagcaaaggaaaggagaggatggttacaactggagaaagtacggacagaaacaggttaaagggagtgagaatcctcggagttactacaagtgtactttcccgagttgtccaacgaagaagaaagtggagatgtctttggaaggtcagatcacagagattgtgtataaaggaagccataaccatccgaaacctcagtccactagaagatcatcttcttcttcttcgacgtttcactcaggtggacttgatcatcatggttcttctgattcatttgctattcagcaagaagataatactacttctggttctcttggagacgatgagttatcggttatcagcagagatgaagaagattgtgggagtgaacctgaagcaaagagatggaaaggagagaacgagacaaacggtgggaatggtaatggaagcaagacagtgagagagccgaggattgttgtgcagacaacaagtgacatagacattcttgatgatggttatagatggagaaagtacggtcagaaagtcgtcaaagggaacccaaatccaaggagttattacaagtgcacaaccacaggttgtccagtgagaaaacatgttgagagggcatcaaatgatatgagagcggtgatcacaacctacgaagggaaacacaaccacgacgtacctgcagctcgtggtagcggttactctacaaacagactggcacaagatccttcttcagcaccaattagaccaaatgctattgctggtcactctcattacactacttcttctcaagcaccatatacacttcagatgctgcagcacaacaacaacactaacgcagggccttttggttacgctatgaacaacaataacaacaactttcaaacgcaacaaaataactttgttggtggagggttctctatagcaaaagaagaaccaaacgaggagtcttcctcctcgtttttcgattcgtttttgtcctga

BrpWRKY75-1(SEQ ID NO:9)：

atggaaggatatgatgatggatcgttgtatgctccgtttctgtcgctgaaaccacatcaaagcctttctaagtcggagttagaacaaggcagagaagaagcctcaaaagttagagaaggttcctccagaagcaaggagttgaaaaagaagaagggaaagaaacaaaagtttgcgtttcagacaaggagccaagttgatattcttgatgatggctatcgttggagaaaatatggccaaaaagctgtcaagaacaacaagttccctaggagttactataggtgcacacatggaggatgcaatgtaaagaagcaagtgcaaagattaacatcggaccaagaagttgtagtcacgacctacgaaggagtccactcgcatcccatcgaaaaatctacagaaaatttcgagcatattctcacccaaatgcaaatctactcttctttttaa

过表达MIR319a的大白菜(eMIR319a)的建立

克隆得到834bp长的BrpMIR319a2基因组(KJ130320.1)序列，并用双酶切法将片段连入pCAMBIA3301载体中，随后利用真空抽滤转化法转入Bre中，以ppt为目标抗性筛选得到阳性转基因植株，并进行鉴定。

过表达BrpTCP4-1的大白菜(eMIR319a)的建立

克隆得到BrpTCP4-1的全长CDS序列以及其启动子序列，通过双酶切法连入去除CaMV 35S启动子的pCAMBIA1301载体，随后利用真空抽滤转化法转入Bre中，以Hyp为目标抗性筛选得到阳性转基因植株，并进行鉴定。BrpTCP4-1-MBP载体构建

克隆得到BrpTCP4-1的全长CSD序列，通过双酶切方法连入pMAL-C2x载体中。

BrpWRKYs启动子

pBrpWRKY70-1(SEQ ID NO:10)：

ttttggtgaaattgagagagtttttggtgggtttttctctctctattggtgtgggtgatatgattaaagggaagagaagtgtgtgtaaatataatggagataagaacttgcaatgatgagatctttttttggagagaggaagatgtgaggaaatgagaaggaagagagagatgggttaagacaagagagtgtgatataaacttatccaccctttttcatttgcttaggagagccccgtgacgttttcccgaatgacagagcgatcacgtcactcgtcccttggaacggaataatacatagttttgatcagccttggatcgcaattcgtattttcactgattgcatatcatcttctgaaatagaatccaactcttatttgatctagtaagatattgattacataaatattaattaagttgaaataatcatatgaataaaaagtaatatcgactttttgctataacagtataactcattcgctttccagttatactaacctaccaggtaacttcgttaattataaaatacggtgcatcaaaactcaaaagcaaaacgtctcagcttctactttattttatattgaactttattttataatctttttttgaaaagtactagtcactttcgatgcattttcgtgaaaaaatatagttagactgataaaccctaatttctttaataaagagcatatgttattttgtgaaaaggtataataatattagcttgtatttttatatctatttaatttacttcttttgtcgtaatatcatagaaactattttaagaggtgttgatagtcgactcactggtccctcactatcttaatgcatcatcgtataatacatccgtggattctcttcgcttaaatatgcctacctggtatagtcgccctcactcatctaaccaagttttaactaaagattggtgatatttatacaaaccattggaaaatttgataacgaaacagtacaaaactatatgaatctgtagacgtttatcacttttacggttgcgcaggtacatgagttttactgcagtgttgtaaattcagggaactaacacgatgaacttaagccgaaaattttcctttttgattcctttatataatttctaaaacacaatactataaggactatgtaaaaaatgaaatttccttttcttacttacggcgtgctatatttctttttttatctttattttttgtaactggcgtactgtactatatttcgatccgcagtatttctattataattttagtggtccttatggaaaagcactaggattttctagttaggtaaacaataagttgtaggtatgcaagagttaaataaaaaagttgtatgcaagtttaatactaaaatacaaaaagaaggtttttgtttgtttcaaatactttttttttgtttcttatgattctgccagttaataataattttcttaagaaattttcatttatctagtattatatattttatattaatcaaatttttagatgatgaaaactgtgctatcaatgtgcatacataaattcttccatgttattatcattctattctaagttaagtttatttaaaaagtgttactgtcgattatgttatatatatatatatatatatgtatatatatatatattcttatcggtatattcacattatgtgaattcttaaagatcaaacatgcgcacacgttagataatccattgattttttctttgctaaggttttgatctagagaatctctgatgtattactccatttttattttaaaatggggcagcaccaaaagaaagttgggttttactcgaatgtattattctattttttattcaaaaaatattccaaaatgatttcacttttatttaattaataattgttagtaacacattctacttataaaaattatcaaataaccccaactatcttatgtttataaaacttatataaaaaatataatttatttatattaaacaattattttaaaaaagtacaataatcatatata

pBrpWRKY33-2(SEQ ID NO:11)：

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pBrpWRKY75-1(SEQ ID NO:12)：

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CATATG序列突变后BrpWRKYs启动子驱动YFP载体构建

pBrpWRKY70-1-m1(SEQ ID NO:13)：

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pBrpWRKY75-1m1(SEQ ID NO:16)：

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实施例1、miR319a过表达大白菜对菌核病更敏感

本发明人在田间栽培miR319a过表达大白菜(eMIR319a)和野生型大白菜(Bre)，发现eMIR319a更易感病(图7；图1A)，表现出更高的感病率，相对叶片病斑面积及叶片感病率(图1B-D)。

更具体地，根据图1B，在2015年和2016年的两次测定中，菌核病侵染不同时间后eMIR319a和Bre植株相比，植株感病百分比极为显著地提高。根据图1C，在2015年和2016年的两次测定中，菌核病侵染不同时间后eMIR319a和Bre植株相比，叶片的感病百分比极为显著地提高。根据图1D，在2015年和2016年的两次测定中，菌核病侵染不同时间后eMIR319a和Bre植株相比，病斑面积极为显著地增加。

上述发现提示，miR319a参与植物的抗病过程。

为了验证这一点，本发明人选用5周大的培养箱中栽培的eMIR319a和野生型Bre植株，分别在第6片叶上接种菌核病病原菌(即核盘菌Sclerotinia sclerotiorum)，在22℃，80～85％相对湿度，16-h光照:8-h黑暗的光周期下进行培养并测定叶片感病率，病斑面积等表型。

结果发现，菌核病在eMIR319a中发病更快，病斑扩散速度更快，同时台盼蓝染色也表明，核盘菌在eMIR319a中造成的细胞死亡面积远大于在Bre中的面积(图1E-H)。更具体地，根据图1E-F，核盘菌侵染Bre和eMIR319a不同时间后，eMIR319a植株的染病情况更为严重。根据图1G，核盘菌侵染Bre和eMIR319a不同时间后，eMIR319a植株的病斑区域随着时间增加而显著增加。根据图1H，核盘菌侵染Bre和eMIR319a不同时间后，eMIR319a植株的叶片发病率更高。

病原菌侵染诱导植物抗病响应通常伴随着参与PR，PDF等基因的变化。为了进一步检测eMIR319a和Bre中PRs和PDF的变化，本发明人检测了核盘菌侵染不同时间后植株的PRs和PDF表达量的变化。结果显示，核盘菌侵染后，PR2，PR3和PDF1.2b在Bre和eMIR319a中都受到了诱导，而PR2，PR3和PDF1.2b在eMIR319a中的表达量却显著低于Bre(图1I)。

以上结果表明，eMIR319a较野生型更易受核盘菌侵染。

实施例2、BrpTCP4-1过表达提高植株菌核病抗性

为了探究核盘菌侵染后是否也影响miR319a的表达，本发明人用Northern Blot检测核盘菌侵染前后的野生型植株中成熟miR319的累积量。结果发现，侵染后miR319累积量增加(图2A)。

同时，本发明人发现pri-miR319a的表达量在侵染后显著提高，同时miR319a的靶基因TCPs选择性降低(BrpTCP3，BrpTCP4和BrpTCP10)。这些结果表明，miR319a和BrpTCPs受菌核病侵染影响(图2B)。

本发明人发现，大白菜中有3条TCP4的同源基因(BrpTCP4-1，BrpTCP4-2和BrpTCP4-3)，选择BrpTCP4-1作为代表进行之后的研究。为了成功过表达BrpTCP4-1，本发明人对其miR319a结合位点进行了同义突变(结合区域的第10位突变为U，第12位突变为G，第15～18位突变为AAGU)，并构建了BrpTCP4-1自身启动子驱动的过表达植株(5mTCP4-1)(图3A；图8)。随后，对5mTCP4-1和Bre进行病原菌侵染并测定相关表型，结果发现5mTCP4-1植株的叶片发病率、病斑面积都显著低于Bre。

同样，台盼蓝染色显示，5mTCP4-1的死亡细胞面积小于Bre。

此外，田间试验也表明5mTCP4-1比Bre有更高的抗病性：具有更低的感病率，相对叶片感病面积更低，且具有更低的叶片发病率(图1A-D，图3A-E)。

本发明人进一步对核盘菌侵染后的PRs和PDF表达量进行检测，结果发现，5mTCP4-1的PR2，PR3和PDF1.2b表达量显著高于Bre，从表达量的变化趋势可知5mTCP4-1的SA和JA途径对于核盘菌的侵染反应较Bre更快更强(图3F)。

实施例3、WRKY表达在eMIR319a植株中受到抑制

在前述的结果中，本发明人发现miR319a过表达植株降低大白菜对菌核病的抗性，同时BrpTCP4-1过表达大白菜则增强菌核病抗性，因此本发明人猜测miR319a/TCP4通路对植物抗病性的影响可能是因为影响了一些特定基因的表达。

本发明人选取了田间栽培的eMIR319a和Bre植株相同部位的健康叶片进行RNA-seq分析，与Bre进行比较后本发明人在eMIR319a中筛选得到15459个上调基因(log₂fold-change>0)，其中3702(23.95％)个基因在eMIR319a中显著上调(p<0.05，log₂fold-change≥2)，同时本发明人筛选到16451个下调基因(log₂fold-change>0)，其中5498个基因在eMIR319a中显著下调(p<0.05，log₂fold-change≤2)(图4A)，在eMIR319a中，3个TCP4的同源基因都显著下调(图9)。

随后本发明人特别关注了eMIR319a中显著下调的基因，并对5498个显著下调的基因进行Gene Ontology分析。结果显示，共有13个defense/immunity相关的生物过程(例如“innate immune response”和“defense response，incompatible interaction”)，13个激素相关的生物过程(例如response to jasmonic acid和hormone-mediated signalingpathway)以及9个活性氧相关的生物过程(例如response to oxidative stress和positive regulation of reactive oxygen species biosynthetic process)被显著下调(p<0.05，gene count≥3)。此外，31个光合作用相关的生物过程(例如‘photosynthesis’，‘regulation of photosynthesis，light reaction’和‘photosystemII assembly’)和10个非生物胁迫相关的生物过程(例如‘response to cold’和‘responseto salt stress’)也被显著下调(图4B；图10)。

进一步地，本发明人分析了下调基因中抗病相关的转录因子家族，发现大量的转录因子被下调，包括了NAC，MYB，bHLH(下调基因数占各自基因家族成员数比例在12.33-20.97％)。此外本发明人还发现8个PR基因，包括PR2和PR3，在eMIR319a中显著下调，与本发明人先前的RT-qPCR结果相同，同时16个NBS-LRR基因(nucleotide-binding siteleucine-rich repeat)也显著下调(图4C)。在这些基因家族中，WRKY基因家族参与多个植物生物过程，包括生长发育以及生物与非生物胁迫响应。

随后，本发明人在eMIR319a，Bre和5mTCP4-1中检测WRKY的表达量，发现大量WRKY基因在eMIR319a中显著下调，同时在5mTCP4-1中显著上调。

这些结果提示，miR319a/TCP4途径与WRKY存在相关性(图4D；图5J-K)。

实施例4、BrpTCP4-1结合WRKY启动子并激活其转录

前述结果表明，WRKY受到miR319a/TCP4通路的影响。由于miR319a并不直接影响WRKY的表达，本发明人推测miR319a是通过TCP4影响WRKY的表达的。WRKY33，WRKY75和WRKY70被报道参与SA和JA途径，并能够提高菌核病抗性，因此本发明人将这三个WRKY基因作为候选基因进一步研究。

TCPs是一类转录因子家族，其编码蛋白中包含一个长为59个氨基酸的bHLH结构域具有DNA结合功能(图11A)，因此本发明人猜测TCP4可能能够结合WRKY的启动子并影响它们的转录。本发明人首先以WRKY70作为代表，通过与AtWRKY70作比对，在大白菜中得到3个AtWRKY70的同源基因(图11B)(BrpWRKY70-1，BrpWRKY70-2，BrpWRKY70-3)，根据TCP结合特点，本发明人在BrpWRKY70-1，BrpWRKY70-2和BrpWRKY70-3启动子区域共筛选得到15个候选结合位点，并将这15个候选结合位点划分为11个片段(图11C)。

随后，本发明人构建BrpTCP4-1-MBP载体并纯化得到TCP4-MBP融合蛋白(图11E)，通过EMSA试验发现仅有含CATATG序列的片段能够与BrpTCP4-1结合(图11F)，竞争性试验证明了结合的特异性(图5A，B)。

此外，本发明人在BrpWRKY33-2和BrpWRKY75-1的启动子序列上各筛选得到一个相同的结合序列(图11D)，并通过EMSA竞争性试验证明了BrpTCP4-1同样能够特异性结合在BrpWRKY33-2和BrpWRKY75-1启动子该片段上(图5C，D)。

为了证明此结合在体内也存在，本发明人用ChIP-qPCR试验检测BrpTCP4-1抗体处理后，含CATATG序列片段和不含CATATG序列片段的富集量。结果发现含CATATG的片段(P1，P4，P5和P6)被大量累积，而不含CATATG的片段(P2，P3和P7)则没有累积(图5E，F)，表明此结合在体内也存在。

此外，本发明人还分析了大白菜其他WRKY基因启动子序列，发现CATATG广泛存在于WRKY启动子序列上，表明BrpTCP4-1可能对其他WRKY基因也存在潜在的作用(图12)。

为了进一步探究BrpTCP4-1对BrpWRKYs的作用，本发明人利用烟草进行了瞬时转化试验。本发明人分别构建了BrpWRKYs启动子驱动YFP载体(pBrpWRKY70-1，pBrpWRKY33-2，pBrpWRKY75-1)，CATATG序列突变后BrpWRKYs启动子驱动YFP载体(pBrpWRKY70-1-m1，pBrpWRKY70-1-m2，pBrpWRKY70-1-m3，pBrpWRKY75-1，pBrpWRKY75-1m1，pBrpWRKY33-2以及pBrpWRKY33-2m1)，以及35S驱动BrpTCP4-1载体(图13)，并同时将BrpTCP4-1和对应的pBrpWRKYs载体共同转入烟草叶片中，相应的空载作为对照。在处理3天后提取RNA并测定YFP的表达量，结果显示BrpTCP4-1能够特异的结合于CATATG上并激活BrpWRKYs的转录(图5G-I)。

结合EMSA和ChIP-qPCR结果可知，BrpTCP4-1可以特异性结合在BrpWRKYs启动子序列CATATG上并激活其转录。

为了进一步探究在病原菌侵染下WRKYs在转基因和野生型植株中的变化情况，本发明人对病原菌侵染前(0h)和侵染48h的eMIR319a，5mTCP4-1和Bre的植株检测WRKYs的表达量。结果表明，无论是转基因还是野生型植株，侵染后都能诱导表达BrpWRKYs的表达，而eMIR319a中BrpWRKYs的表达量显著低于野生型植株，同时BrpWRKYs在5mTCP4-1植株中的表达量显著高于野生型(图5J-L)。

结合以上结果，可以得出miR319a/TCP4通路通过结合于BrpWRKYs，促进BrpWRKYs的转录，进而调控大白菜对于菌核病的抗性，如图6，更具体地，miR319a高表达时，其靶基因TCP4发生下调，其结合于WRKYs启动子靶位点(CATATG)的比例下降，WRKY(参与JA和SA介导的植物免疫过程)的转录激活下降，植物对于核盘菌侵染的免疫能力下降，易于被核盘菌侵染。另一方面，若是过表达TCP4(较佳地突变其上的miR319a作用位点)，其表达上调后，结合于WRKYs启动子靶位点(CATATG)的比例上升，WRKY(参与JA和SA介导的植物免疫过程)的转录激活被上调，植物对于核盘菌侵染的免疫能力提高，其抗菌能力强。

实施例5、筛选方法

(1)基于miR319a表达或活性的筛选

植株：前述建立的eMIR319a植株，其过表达miR319a。

测试组：培养所述过表达miR319a的eMIR319a植株，给予或引入候选物质；

对照组：培养所述过表达miR319a的eMIR319a植株，不给予或引入候选物质。

分别检测测试组和对照组中miR319a的表达或活性情况、或检测miR319a与BrpTCP4-1的相互结合情况，并进行比较。如果测试组中miR319a的表达或活性在统计学上低于(如低30％或更低)对照组，就表明该候选物是有利于促进植物抗菌性的潜在物质；如果测试组中miR319a与BrpTCP4-1的相互结合在统计学上低于(如低30％或更低)对照组，就表明该候选物是有利于促进植物抗菌性的潜在物质。

(2)基于miR319a-TCP4-WRKY-JA/SA信号通路进行筛选

大白菜植物细胞：其表达包括miR319a-TCP4-WRKY-JA/SA的信号通路。

测试组：培养所述大白菜植物细胞，给予候选物质；

对照组：培养所述大白菜植物细胞，不给予候选物质。

分别检测测试组和对照组中TCP4对WRKY启动子上CATATG位点的结合情况，并进行比较。如果测试组中TCP4对WRKY启动子上CATATG位点的结合更强，就表明该候选物是有利于促进植物抗菌性的潜在物质。

结论与讨论

miR319基因家族是一个古老的miRNA基因家族，其能够通过调控靶基因TCPs调控植物表型。miR319/TCP4通路在叶片发育及细胞周期的调控中有重要作用。

在本发明中，发现在大白菜中过表达miR319a后更易菌核病，而过表达miR319a靶基因TCP4能够提高大白菜对菌核病的抗性。本发明的结果表明，miR319a/TCP4参与植物对多种病原菌的抵抗。同样，本发明人还发现病原菌侵染能够抑制TCP基因表达，表明TCP4参与抗菌核病能力。

因为病原菌侵染后miR319a在水稻和芸薹属植物中累积，本发明人推测miR319a的累积会影响一些植物免疫相关基因的表达。RNA-seq结果表明，大量抗病相关的基因家族成员在eMIR319a中下调，同时RT-qPCR结果表明，在5mTCP4-1中WRKY基因表达上调，因此本发明人将WRKY基因作为候选基因。由于miR319a不能直接影响WRKY基因的表达，提示miR319a通过TCP4影响WRKY。由于TCP是转录因子家族，所以本发明人认为TCP4直接影响WRKY的转录，EMSA，ChIP-qPCR以及瞬时转化烟草试验证明BrpTCP4-1特异性结合WRKY基因CATATG序列并激活WRKY的转录。WRKY33，WRKY70和WRKY75能够参与JA和SA介导的植物免疫过程，提高植物的抗病性，因此miR319a/TCP4通路能够通过影响WRKYs的表达影响植物的抗病性。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 中国科学院分子植物科学卓越创新中心

<120> 调控植物对菌核病抗病性的新型基因及其应用

<130> 205931

<160> 17

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> RNA

<213> 大白菜(Brassica rapa)

<400> 1

uuggacugaa gggaacuccc u 21

<210> 2

<211> 1224

<212> DNA

<213> 大白菜(Brassica rapa)

<400> 2

atggcagaag acgacgaagc tcaccgcttc ctccaccctc cagcaccgcc gtcttcttct 60

tcaatgagac gccgcgctac gtcggaggtg gcgaacggcg gctgcggcga gatagtcgag 120

gtgcaaggag gtcacattgt gcggtccacg ggaaggaaag accggcacag caaagtctgc 180

acggcgaaag ggccacgtga ccggcgcgtg aggctatcgg ctcacacggc gagtcagttc 240

tacgacgttc aagaccggct tgggttcgac cggccgagca aagccgttga ctggcttatc 300

aaaaaagcga agacttccat cgacgagctc gctcagcttc cgccgtggga tccggcggat 360

gcgattcgca acgccgccgc gaacgctaaa ccgagaagaa ccgccgcgaa agctcgagtt 420

tctccatctc ctccgccgca gcagcttcag ttcagcggcg gaacggccgt gggattcgcc 480

ggagcaacgg aacgtcggag taatgataat aaccagtcga gctttcttcc gccgtcgatg 540

gactcagatt cgattgctga cactataaag tcgtttttcc cggtggttgg ctccacggcg 600

gaggctccgc cgcatcagct tatgcacaac taccatcatc atcatccgcc ggatttgctt 660

tcaagaacca atagtcaaaa ccaagatctc cgtctctcgc tgcaaccgtt cccggatggt 720

ccaccgtcgc ttctccacca ccaccaccac tccgtagccg agcctgttct gttctacggg 780

cagagcaacc cgctagggta tgacacgtcg acgggtggct gggagcaaca gtcaattcag 840

agactggtgg cttggaacag cggcggagca aacgatacag gaaacggagg aggaggagga 900

gggtttctgt ttgctcctcc tcctaatcat cctacttcaa cgacgtcgtt tcagccagta 960

cttggccaaa gccagcttta ttctcagagg ggtccccttc agtccagtta cagtcccatg 1020

atccgtgctt ggtttgatcc tactcaccac catcatcaat ccatctccac tgacgatctc 1080

aaccaccacc accaccatat gcctccgcca attgcttcag gtgagttctc ttccggtttt 1140

cgggtaccag cacggtttca gggtcaagaa gaggagcagc acgacggtct aaacaacaaa 1200

ccgtcctctg cttctcgcca ttga 1224

<210> 3

<211> 1221

<212> DNA

<213> 大白菜(Brassica rapa)

<400> 3

atggcagacg aagctcacaa ctttctccac cctccagcac caccaccgcc ttcttcaatg 60

agccaccgcg aggcggcgaa cggcggctgc ggcgagatag tcgaggtgca aggaggtcac 120

attgtccggt cgacgggaag gaaagatcgg cacagcaaag tctgcacggc caaagggcca 180

cgtgaccggc gcgtgaggct atcggctcac acggcgattc agttctacga cgttcaggac 240

cgcctcggct tcgaccggcc aagcaaagcc gtcgactggc ttatcaagaa ggctaaagct 300

tccatcgacg agctcgctca gcttccgccg tggaaccccg ccgacgcaat gcgcaacgcc 360

gccgcaaacg cgaaaccgag aagaaccgcc gctaaaactc gaatctctcc gtcgccgccg 420

ccgccgtcgc agcagcaaca gaaccagctt cagttcggtg gattcgacgg agcggcggag 480

catcggggga acgagaacga gtcgagtttt ctcccgccgt cgatggattc ggattctatc 540

gctgacacta taaagtcgtt cttcccggtg gttggctctt cgacggaagc tcctcctccg 600

aaccagctta tacacagcaa ctaccatcat catcacccac cggatttgct ttctcgaact 660

aatagccaca accaagatct ccgtctctcg ctgcactcct tcccggatgg tccaccgtcg 720

cttctccacc accaccactc cgcgtccgcc tccaccgccg agccagttct gttctacggg 780

cagagcaatc cgctagggta tgacacgtcg acgggtggtt gggagcagca gtcaattcag 840

aggctggtgg cttggaacag cggcggagca accgagacag gaaacggagg aggaggagga 900

ggaggagggt ttctctttgc tcctccagct ccttcgacga cgtcgtttca gccagtactt 960

ggccaaagcc cgccttgttc tccgaggggt ccccttcagt ccagttacag tcccatgatc 1020

cgtgcttggt ttgatcctca ccaccaccat cagtccatct ccaccgatga tctcaaccac 1080

catattcctc acccggttca ccaaggtgaa ttctcttccg gtttccgcat accagcacgg 1140

tttcagggcc aagaagagga gcagcacgat ggtttctcca acaaaccgtc atctgcttcc 1200

tccatttctc gccatcgtta a 1221

<210> 4

<211> 1053

<212> DNA

<213> 大白菜(Brassica rapa)

<400> 4

atggcagacg accacgacga agctcaccac ttcctccacc ctcaaccacc gccgccttct 60

tcaatgaggc accgcgctgc gtcagacgag atagtggagg tgcaaggagg tcacattgta 120

cggtcgacgg ggagaaaaga ccggcacagc aaagtctgca cggccaaagg gccacgtgac 180

cggcgcgtga ggctgtcggc tcacacggcg attcagttct acgacgttca agaccgcctt 240

ggcttcgacc gtccgagcaa agccgttgac tggctgatca gaaaggctca gacttccatc 300

gacgagctcg ctcagcttcc tccgtggagt cccgccgacg ctattcgcaa cgcgaaaccg 360

agaagaaccg ccgccaaaac taaaatctct ccgtcgccgc cgccgccgca acgggaacag 420

cttcagttcg gtggtgcacg gtccggtgga ttcgacggag cggcggagct tccgagtttt 480

cttccgccgt cgacggattc agagtcgttt ttcccggtgg ttggctcctc gacggaagct 540

cctccgagtc aagatctccg tttatcgctg cactcgttcc cggatggtcc accgtcgctt 600

ctccaccgcc accactcagc tcccgagcct gttctgttct acggacagag caatccgttt 660

gggtacgatg gctgggagca acagtcgatt cagagactgg tggcttgtaa cggcggcgga 720

gcaaccgata caggaaacgg aggaggaggg tttctctttg ctccttctcc gacgacgtcg 780

tatcagccag tacttggcca aagtcagctt tgttctcaga ggggttccct tcagtccagt 840

tacacgccca tgatccgtgc ttggtttgat cctcatcacc atcagtccat ctccaccgag 900

gatctcagcc atcatattcc tccgccggtg tttgcctcag gtgaattctc ttccggtttt 960

cgcgtgccag cacggtttca gggtcaagag gaggaacagc aggacggtct aaccaacaaa 1020

ccgtcctctg cttcctctgt ttctcgccat tga 1053

<210> 5

<211> 831

<212> DNA

<213> 大白菜(Brassica rapa)

<400> 5

atggatgttg ctaataataa caaagcaata aagctaaaag ctaggcacca actcgttcaa 60

ggccgcgagg tggccactaa gcttcagcat ctcctctttc aacatgggtt gggtcttaac 120

tcagcggatg atctgatggc taaaatcttg ggatctttca ataactcaat ctctgctctt 180

gattccttag aacccatctc ctcctcctcc tctcttgtca ccgccgttga aggctctcaa 240

aatgcttcct gcgacaacga cggcaagctt gaggattccg gtgatagtcg gaaaagactt 300

ggacccgtta agggtaaaag aggatgctac aaaagaaaga agagatcgga gacgtggact 360

gtagagtcga ccgtacttga tgacgcattt tcatggagga agtatggaca gaaggagatt 420

cttaatgcca tattcccaag aagttacttt cggtgcacac ataaattcac tcaagggtgc 480

aaggcaacaa agcaagtgca gaagctagag cccgaatcca agatgttcaa catcacatac 540

ataggaaacc acacgtgtaa cactaaagaa gtatcaccca agatcaagcc ttgtgttcat 600

catgatgaga tcattatgca ttctgaagat agtccaagtt tgacgaccac gatgaaggaa 660

gaggaagaga atcatcatca tggttcttcc actgagagtg acttgcaatt agtgtggcaa 720

gaaatattgg tgtgtgaaga agaacatctt cagcatcatc atgaggctat ttatggttgt 780

ggtgaaacta gtgtcaatgg tttggattcc ccagatcttt ggagttggta g 831

<210> 6

<211> 858

<212> DNA

<213> 大白菜(Brassica rapa)

<400> 6

atggatattg ttagtaataa caaagcaata atgctaaaag ttatggacca actcgttcaa 60

ggccatgagt tggccactaa gcttcaacag ctcctctctc aacacgggtc gggtcgtggt 120

gcagcagggg atctcgtggc taaaatctcg gcatctttta gtgacacaat ctctgctctt 180

gattccttcg aacccatccc ctcctctctc ttcaccgccg ttgaaggctc tcaaaatgct 240

tcctgcaaca acgacggcaa gcttgaggat tccgttgata gtcggaaaag attgggaccc 300

gtcaagggta aaagaggatg ctacaagaga aaaaagagag ctgacacgtg gactgtagag 360

tcaactctac ttgaggacgc attttcttgg aggaaatatg gaaaaaagga gattcttaat 420

gccaaattcc caagaagtta ctttaggtgc acacataaat acactcaagg gtgcaaggca 480

acaaagcaag tacagaagct agagctcgaa cccaggatgt tcagtatcac atacattgga 540

aaccacacgt gcgacacgga cgaagtaaca ccaaatatca atccttgtgt tcatcatgat 600

gacggcatca tggattctga agagttcaag tgtcctagtt tgaggacctc gatgaatgaa 660

gaggaagata accatcatca tggttcgtcc acggagagtg acttgcaatt ggtgtggcaa 720

gaaatgttgg tgtttggaga ggaacataat catcatcatc atgaggctat ttatggttgc 780

ggtgaaacta gtgcatctat ttatggtttg gataccacgg atctttggag ttggcagcga 840

tttccggttc aacgataa 858

<210> 7

<211> 852

<212> DNA

<213> 大白菜(Brassica rapa)

<400> 7

atggatattg ctagtaataa caaagcaata aagctaaaag ttagggacca acttcttcaa 60

ggccacgaga tgaccactaa ggttcagcaa ctcctctctc aagacgggtc ggatttgggt 120

ccagcgaagg atctcgtgga gaaaatattg gggtctttca atgacataat ctctgctctt 180

gattccttcg aacccatctc cccgtctgct ctagtcacag ccgtcgaagg ctctcaaaat 240

gcttcctgcg acaacgacgg caagcttgag gattctggcg atagtcataa aaaattggga 300

ccagttaagg gtaaaagagg atgctacaag agaaagaaga aatcagagac atggactgta 360

gagtctaccg tacttgagga cacattttct tggaggaaat atggacagaa acagattctt 420

aataccaaat tcccaagaag ttactttagg tgcacacaca aatacactca agggtgcaag 480

gcaacaaagc aagtgcagaa gctagagtct gagcccagga tgttcagcat cacatacatc 540

ggaaaccaca cgtgtaatac caacgaagta acacccaaaa tcaagccttg tattcatcac 600

gatgagatca tcacggattc tgaagagatc cagagtccta gtttgatgac ctcgatgaag 660

gaagaggaag aaaatcacca tcatggttcg tcaacggaga gtgacttgca attggtgtgg 720

caggaaatgt tggtctttga agaggaacac catcatcatc atgaggctgt ttacggttgt 780

ggtgaaacta gtacatctat caatggtttg gattccgcgg atctgtggag ttggcagcag 840

ttttcggttt ag 852

<210> 8

<211> 1392

<212> DNA

<213> 大白菜(Brassica rapa)

<400> 8

atgaatggtt ctgttaattg gtcgcaacaa accgcaagag catcaccagc atctttggaa 60

gatcttgaga tcccaccaaa gttcagatca tttgctcctt cttcaatctt aacctctcct 120

tccacttgtt tcagcccctc tctatttcta gattcccctg cttttgtctc ctcctctgct 180

aacgttcttg cttctccaac cacaggagct ctcatcacaa acgaaagtaa ccataaaagt 240

ataactgagg aagagaagac taacaaaaac aacaacagcc ttagcctctt tgatttctca 300

tttcagacac aaccatcagg actttctgct cccacaacaa caacaaacag ttctgtctta 360

caatggagcc aaacagatac tcgtccaaac aacagcactc agcaagctgt accttacaac 420

ggaagggagc aaaggaaagg agaggatggt tacaactgga gaaagtacgg acagaaacag 480

gttaaaggga gtgagaatcc tcggagttac tacaagtgta ctttcccgag ttgtccaacg 540

aagaagaaag tggagatgtc tttggaaggt cagatcacag agattgtgta taaaggaagc 600

cataaccatc cgaaacctca gtccactaga agatcatctt cttcttcttc gacgtttcac 660

tcaggtggac ttgatcatca tggttcttct gattcatttg ctattcagca agaagataat 720

actacttctg gttctcttgg agacgatgag ttatcggtta tcagcagaga tgaagaagat 780

tgtgggagtg aacctgaagc aaagagatgg aaaggagaga acgagacaaa cggtgggaat 840

ggtaatggaa gcaagacagt gagagagccg aggattgttg tgcagacaac aagtgacata 900

gacattcttg atgatggtta tagatggaga aagtacggtc agaaagtcgt caaagggaac 960

ccaaatccaa ggagttatta caagtgcaca accacaggtt gtccagtgag aaaacatgtt 1020

gagagggcat caaatgatat gagagcggtg atcacaacct acgaagggaa acacaaccac 1080

gacgtacctg cagctcgtgg tagcggttac tctacaaaca gactggcaca agatccttct 1140

tcagcaccaa ttagaccaaa tgctattgct ggtcactctc attacactac ttcttctcaa 1200

gcaccatata cacttcagat gctgcagcac aacaacaaca ctaacgcagg gccttttggt 1260

tacgctatga acaacaataa caacaacttt caaacgcaac aaaataactt tgttggtgga 1320

gggttctcta tagcaaaaga agaaccaaac gaggagtctt cctcctcgtt tttcgattcg 1380

tttttgtcct ga 1392

<210> 9

<211> 444

<212> DNA

<213> 大白菜(Brassica rapa)

<400> 9

atggaaggat atgatgatgg atcgttgtat gctccgtttc tgtcgctgaa accacatcaa 60

agcctttcta agtcggagtt agaacaaggc agagaagaag cctcaaaagt tagagaaggt 120

tcctccagaa gcaaggagtt gaaaaagaag aagggaaaga aacaaaagtt tgcgtttcag 180

acaaggagcc aagttgatat tcttgatgat ggctatcgtt ggagaaaata tggccaaaaa 240

gctgtcaaga acaacaagtt ccctaggagt tactataggt gcacacatgg aggatgcaat 300

gtaaagaagc aagtgcaaag attaacatcg gaccaagaag ttgtagtcac gacctacgaa 360

ggagtccact cgcatcccat cgaaaaatct acagaaaatt tcgagcatat tctcacccaa 420

atgcaaatct actcttcttt ttaa 444

<210> 10

<211> 2001

<212> DNA

<213> 大白菜(Brassica rapa)

<400> 10

ttttggtgaa attgagagag tttttggtgg gtttttctct ctctattggt gtgggtgata 60

tgattaaagg gaagagaagt gtgtgtaaat ataatggaga taagaacttg caatgatgag 120

atcttttttt ggagagagga agatgtgagg aaatgagaag gaagagagag atgggttaag 180

acaagagagt gtgatataaa cttatccacc ctttttcatt tgcttaggag agccccgtga 240

cgttttcccg aatgacagag cgatcacgtc actcgtccct tggaacggaa taatacatag 300

ttttgatcag ccttggatcg caattcgtat tttcactgat tgcatatcat cttctgaaat 360

agaatccaac tcttatttga tctagtaaga tattgattac ataaatatta attaagttga 420

aataatcata tgaataaaaa gtaatatcga ctttttgcta taacagtata actcattcgc 480

tttccagtta tactaaccta ccaggtaact tcgttaatta taaaatacgg tgcatcaaaa 540

ctcaaaagca aaacgtctca gcttctactt tattttatat tgaactttat tttataatct 600

ttttttgaaa agtactagtc actttcgatg cattttcgtg aaaaaatata gttagactga 660

taaaccctaa tttctttaat aaagagcata tgttattttg tgaaaaggta taataatatt 720

agcttgtatt tttatatcta tttaatttac ttcttttgtc gtaatatcat agaaactatt 780

ttaagaggtg ttgatagtcg actcactggt ccctcactat cttaatgcat catcgtataa 840

tacatccgtg gattctcttc gcttaaatat gcctacctgg tatagtcgcc ctcactcatc 900

taaccaagtt ttaactaaag attggtgata tttatacaaa ccattggaaa atttgataac 960

gaaacagtac aaaactatat gaatctgtag acgtttatca cttttacggt tgcgcaggta 1020

catgagtttt actgcagtgt tgtaaattca gggaactaac acgatgaact taagccgaaa 1080

attttccttt ttgattcctt tatataattt ctaaaacaca atactataag gactatgtaa 1140

aaaatgaaat ttccttttct tacttacggc gtgctatatt tcttttttta tctttatttt 1200

ttgtaactgg cgtactgtac tatatttcga tccgcagtat ttctattata attttagtgg 1260

tccttatgga aaagcactag gattttctag ttaggtaaac aataagttgt aggtatgcaa 1320

gagttaaata aaaaagttgt atgcaagttt aatactaaaa tacaaaaaga aggtttttgt 1380

ttgtttcaaa tacttttttt ttgtttctta tgattctgcc agttaataat aattttctta 1440

agaaattttc atttatctag tattatatat tttatattaa tcaaattttt agatgatgaa 1500

aactgtgcta tcaatgtgca tacataaatt cttccatgtt attatcattc tattctaagt 1560

taagtttatt taaaaagtgt tactgtcgat tatgttatat atatatatat atatatgtat 1620

atatatatat attcttatcg gtatattcac attatgtgaa ttcttaaaga tcaaacatgc 1680

gcacacgtta gataatccat tgattttttc tttgctaagg ttttgatcta gagaatctct 1740

gatgtattac tccattttta ttttaaaatg gggcagcacc aaaagaaagt tgggttttac 1800

tcgaatgtat tattctattt tttattcaaa aaatattcca aaatgatttc acttttattt 1860

aattaataat tgttagtaac acattctact tataaaaatt atcaaataac cccaactatc 1920

ttatgtttat aaaacttata taaaaaatat aatttattta tattaaacaa ttattttaaa 1980

aaagtacaat aatcatatat a 2001

<210> 11

<211> 2001

<212> DNA

<213> 大白菜(Brassica rapa)

<400> 11

attacgaata cattataatt agcaaaaaaa aaaacagatt taatcagtaa aaaacattaa 60

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tttgtctctg ttaaatgagc ttccgtagct tcttgctcgt tcttggccgt caacctcttt 180

gtcttccata accaaaaatt tcatgcatca aaatatttta ctcaaaacca aaataaaatg 240

ttttgaacat gttctagcat ttgaccatat gacaatacaa aactactaga agctttttat 300

gacacatgaa tgattaaatg attaataaaa atatactata ataatatgaa gtacttaatc 360

aattaagcat tatacatgag ctaaccaaac acgtcacatg atcatggttc aagacccatg 420

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taacgtagct aagcccttca tgaaacgtga ctgccatgga taaacagctc gtcttcaccc 540

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gtgattagtc acaatcctaa gatcctactt ggtcccacac tagatataca ctactaataa 1260

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<212> DNA

<213> 大白菜(Brassica rapa)

<400> 12

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<210> 13

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<212> DNA

<213> 大白菜(Brassica rapa)

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aaagtacaat aatcatatat a 2001

<210> 14

<211> 2001

<212> DNA

<213> 大白菜(Brassica rapa)

<400> 14

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aaagtacaat aatcatatat a 2001

<210> 15

<211> 2001

<212> DNA

<213> 大白菜(Brassica rapa)

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<210> 16

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<211> 2001

<212> DNA

<213> 大白菜(Brassica rapa)

<400> 17

attacgaata cattataatt agcaaaaaaa aaaacagatt taatcagtaa aaaacattaa 60

gaagattgat gaatcctctt cttggcgttc tctgcttcat cagttgcttc aacttgcatt 120

tttgtctctg ttaaatgagc ttccgtagct tcttgctcgt tcttggccgt caacctcttt 180

gtcttccata accaaaaatt tcatgcatca aaatatttta ctcaaaacca aaataaaatg 240

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gacacatgaa tgattaaatg attaataaaa atatactata ataatatgaa gtacttaatc 360

aattaagcat tatacatgag ctaaccaaac acgtcacatg atcatggttc aagacccatg 420

agtcgctgaa ccgcatgttt cagtggcttg aaccacgtac ctggccgaca aaaaaggctt 480

taacgtagct aagcccttca tgaaacgtga ctgccatgga taaacagctc gtcttcaccc 540

tatccatcag agactccgac gaccgtcgcg atggcttagc ctcttgcgtt ggaaccttat 600

taacgctgac gtttatagag tgagagattt tgaaatcttt ggctatacga gatgtgtatc 660

tcacttgctt tccctgtgct agagattgtt aactataaat gatccaggaa gcaaacatag 720

ccacgtcttt tgtacgtgtt agctgtagag actatagacg tgtattaaaa gcaagaggcc 780

ttttatttta ctcttgggct tttgggctca aattgtggtc ggatcggatt atattgcaag 840

agactgatca cttgatccat ccactcagca ctaattgtca gtagagttca ctaatgtttt 900

tatatatccc tcaatgtctc atctcacttt ttgatgtgca aatgaaaagt ccgaggaaga 960

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ggcatcctaa agaatgatga aagcaagccg cctcgttcaa agtcaaggcc acaaggtctg 1680

accatctcca tcttctaatc ttttcaacgg tcaaacattg tacaccttct cagaaactac 1740

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ataacagaac cagacaaaac a 2001

Claims (13)

1.一种防治植物菌核病的方法，包括：

(a)下调植物中miR319a或其前体的表达或活性；或

(b)调节植物中miR319a-TCP4-WRKY-JA/SA信号通路，促进TCP4-WRKY-JA/SA介导的免疫作用。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，(a)中，包括：在植物中敲除或沉默miR319a或其前体，抑制miR319a的活性；较佳地，包括：以特异性干扰miR319a或其前体的干扰分子来沉默miR319a或其前体，以CRISPR系统进行基因编辑从而敲除miR319a或其前体，以同源重组的方法敲除miR319a或其前体，或在含有miR319a或其前体的植物中将miR319a或其前体进行功能丧失性突变。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，(b)中，包括：

抑制miR319a与TCP4的结合；

上调TCP4的表达或活性；和/或

促进TCP4与WRKY启动子的结合、促进WRKY的转录激活。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，(b)中，包括：

在植物中引入TCP4的上调剂，从而提高植物中TCP4的表达或活性；较佳地，所述上调剂包括编码TCP4的多核苷酸或构建物；或

对TCP4的miR319a结合区域进行突变，阻止miR319a与TCP4的结合；较佳地，将miR319a与TCP4结合区域的第10位突变为U，第12位突变为G，第15～18位突变为AAGU；或

在WRKY启动子区引入TCP4结合位点；较佳地所述TCP4结合位点为CATATG；较佳地通过基因编辑或定点突变引入所述TCP4结合位点。

5.如权利要求1所述，其特征在于，所述的促进TCP4-WRKY-JA/SA介导的免疫作用包括：通过促进PR2，PR3和PDF1.2b的表达而促进免疫作用。

6.一种miR319a或其前体的下调剂的用途，用于防治植物菌核病，或用于制备防治植物菌核病的制剂；较佳地，所述的下调剂包括：敲除或沉默miR319a或其前体的试剂，抑制miR319a活性的试剂；较佳地，包括：特异性干扰miR319a或其前体表达的干扰分子，针对miR319a或其前体的CRISPR基因编辑试剂、同源重组试剂或定点突变试剂，所述定点突变试剂将miR319a或其前体进行功能丧失性突变。

7.调节植物中miR319a-TCP4-WRKY-JA/SA信号通路的调节剂的用途，用于防治植物菌核病，或用于制备防治植物菌核病的制剂；其中，所述调节剂包括：

TCP4的上调剂，其可提高植物中TCP4的表达或活性；较佳地，所述上调剂包括编码TCP4的多核苷酸或构建物；或

TCP4的miR319a结合区域进行突变的试剂，其阻止miR319a与TCP4的结合；较佳地，将miR319a与TCP4结合区域的第10位突变为U，第12位突变为G，第15～18位突变为AAGU；或

在WRKY启动子区引入TCP4结合位点的试剂；较佳地所述试剂为基因编辑或定点突变试剂；较佳地所述TCP4结合位点为CATATG。

8.如权利要求1～7任一所述，其特征在于，所述的植物是表达miR319a、TCP4、WRKY或其同源物的植物，或具有miR319a-TCP4-WRKY-JA/SA信号通路的植物；较佳地，所述的植物包括：十字花科植物，禾本科植物；或

所述的WRKY为启动子区包括CATATG序列的WRKY；较佳地包括：WRKY70，WRKY33或WRKY75。

9.一种TCP4的突变体，其miR319a结合区域发生突变，所述突变包括：miR319a与TCP4结合区域的第10位突变为U，第12位突变为G，第15～18位突变为AAGU。

10.一种植物miR319a或包含其的miR319a-TCP4-WRKY-JA/SA信号通路的用途，用于作为鉴定植物菌核病抗性的分子标记，或用作定向筛选菌核病抗性植物的分子标记物。

11.一种定向选择或鉴定植物的方法，其特征在于，所述方法包括：鉴定测试植物中的miR319a或TCP4的表达或它们的结合情况，或鉴定植物中miR319a-TCP4-WRKY-JA/SA信号通路的情况；

若是该测试植物的miR319a高表达、TCP4低表达、miR319a与TCP4结合强、或TCP4与WRKY启动子的结合弱，则其为菌核病易感性的植株；

若是该测试植物的miR319a低表达、TCP4高表达、miR319a与TCP4结合弱、或TCP4与WRKY启动子的结合强，则其为菌核病抗性的植株。

12.一种筛选防治植物菌核病的物质的方法，包括：

(1)将候选物质加入到表达miR319a-TCP4-WRKY-JA/SA信号通路的体系中；

(2)检测所述体系，观测其中miR319a-TCP4-WRKY-JA/SA信号通路基因的表达、活性或相互结合水平：

若其中miR319a的表达或活性显著降低，则表明该候选物质为可防治植物菌核病的物质，

若其中TCP4的表达或活性显著提高，则表明该候选物质为可防治植物菌核病的物质，

若其中miR319a与TCP4结合显著减弱，则表明该候选物质为可防治植物菌核病的物质，或

若其中TCP4与WRKY启动子结合显著增强，则表明该候选物质为可防治植物菌核病的物质。

13.如权利要求11或12任一所述的方法，其特征在于，所述的植物是表达miR319a、TCP4、WRKY或其同源物的植物，或具有miR319a-TCP4-WRKY-JA/SA信号通路的植物；较佳地，所述的植物包括：十字花科植物，禾本科植物；或

所述的WRKY为启动子区包括CATATG序列的WRKY；较佳地包括：WRKY70，WRKY33或WRKY75。

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