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Verwandte
Anmeldungen
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Diese
Anmeldung beansprucht die Priorität der Spanischen Patentanmeldung
ES-9901383, eingereicht am 22. Juni 1999 im Namen von Cebolla et
al. mit dem Titel "Strikt
regulierte Überexpression
klonierter Gene mittels eines genetischen Kaskadenschaltkreises" sowie der Spanischen
Patentanmeldung ES-200001389, eingereicht am 31. Mai 2000 im Namen
von Cebolla et al. mit dem Titel "Regulierte Expression klonierter Gene
mittels eines genetischen Kaskadenschaltkreises", die beide durch Bezugnahme in ihrer
Gesamtheit einschließlich
aller Zeichnungen hier einbezogen sind.
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Gebiet der
Erfindung
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Die
Erfindung betrifft die Konzeption transkriptioneller Kaskadenschaltkreise
zur Amplifikation der Genexpression. Sie betrifft ferner die Verwendung
dieser Systeme zur Überproduktion
von Polypeptiden, wie zum Beispiel therapeutische Proteine, Enzyme,
Hormone, Wachstumsfaktoren und Apolipoproteine, in vito und in Zellen,
i.e. in Zellkulturen. Dies weist eine hohe industrielle Anwendbarkeit
auf, zum Beispiel in der biotechnologischen und pharmazeutischen
Industrie.
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Hintergrund
der Erfindung
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Die Überexpression
klonierter Gene ist sehr zweckmäßig zur
Produktion sowohl rekombinanter Polypeptide als auch spezifischer
zellulärer
Metabolite für
die Grundlagenforschung und die pharmazeutische und biotechnologische
Industrie im allgemeinen. Die Herstellung großer Mengen klonierter Gene
wurde traditionell durch Kombinieren von Genamplifikation mit starken,
durch Repressoren regulierten Promotoren erreicht.
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Diese
konventionellen Strategien weisen jedoch typischerweise die Nachteile
auf, dass: (1) die Erhaltung von Plasmidexpressionsvektoren üblicherweise
die Selektion mit Antibiotika erfordert, was zu einer metabolischen
Belastung und zusätzliche
Kosten für
eine industrielle Produktion im Großmaßstab führt (Nilson and Skogman, 1986);
(2) sich ein niedriges Expressionsniveau zeigt, wenn es sich um
toxische Proteine handelt sowie zur Vermeidung von Mutationen in
den rekombinanten Proteinprodukten selbst (Mertens et al., 1995;
Vilette et al., 1995), was schwierig zu erreichen ist, wenn das
klonierte Gen aufgrund der multiplen Kopienzahl traditioneller Plasmidvektoren
und dem hohen basalen ("leaky") Expressionsniveau
der meisten traditionelll verwendeten Promotoren, zum Beispiel tac
oder trc, in multipler Kopienzahl vorliegt; (3) traditionelle Induktoren,
zum Beispiel IPTG in Iac-Expressionssystemen, teuer sind und ein
gewisses Ausmaß an
Toxizität besitzen
(Figge et al., 1988); (4) gezeigt wurde, dass eine hohe Expression
rekombinanter Proteine die Wachstumsrate der Wirtszelle und gleichzeitig
die gesamte Proteinsynthese reduziert (Bentley et al., 1990; Dong
et al., 1995), vermutlich aufgrund einer erhöhten metabolischen Belastung
des Wirts; und (5) eine beträchtliche Anzahl
der existierenden Expressionssysteme nur in E. coli repliziert,
was die Expression bestimmter Proteine limitieren kann, zum Beispiel
derjenigen, die sekretiert werden.
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Ein
alternatives Expressionssystem, das einige der obigen Erfordernisse
erfüllt,
verwendet Mini-Tn5 Transponsonvektoren (de Lorenzo and Timmis, 1994),
um heterologe Gene in das bakterielle Chromosom zu inserieren, wodurch
eine hohe Stabilität
der Expression ermöglicht
wird (Cebolla et al., 1993; Suarez et al., 1997). Suarez beschreibt
insbesondere die stabile Produktion von Pertussistoxin in Bordetella
bronchiseptica durch Mini-Tn5 vermittelte chromosomale Insertion
und Expression mittels eines regulatorischen Salicylat-Systems.
Salicylat ist ein Induktor von Benzoat, der 1000 mal billiger ist
als IPTG (SIGMA Katalog 1998). Das System basiert auf dem regulatorischen
Gen nahR, das einen positiven Regulator, der durch Salicylat aktiviert
wird, und seinen Zielpromotor Psal kodiert (de Lorenzo et al., 1993).
Die erhaltenen Expressionsniveaus sind jedoch relativ gering (0.1%
des Gesamtproteins). Dieses geringe Niveau liegt wahrscheinlich
daran, dass die Gene in Monokopie im Chromosom vorliegen.
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Falls
die Ausbeute erhöht
werden könnte,
während
die Vorteile geringer basaler Niveaus, Stabilität, breiter Wirtsbereich und
geringe Kosten erhalten würden,
würde das
nahR/Psal regulatorische System große industrielle Anwendbarkeit
besitzen.
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Zusammenfassung
der Erfindung
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Wir
haben ein Kaskadensystem konzipiert, das gegenüber dem nahR/Psal Standardsystem
eine 10- bis 20-fach höhere
Expression erlaubt, während
einer oder mehr der immanenten Vorteile dieses Systems im wesentlichen
beibehalten werden. Um dies zu erreichen, wird ein weiteres regulatorisches
Element, xylS2 und sein Zielpromotor Pm, in einem Kaskadenschaltkreis
an die Psal Expression gekoppelt. Das regulatorische Gen xylS2 spricht
auf den gemeinsamen Induktor an und weist eine höhere Genexpressionskapazität auf als Standard
nahR/Psal. Die synergistische Aktivierung des Pm Promotors durch
den transkriptionellen Aktivator XylS2 kann durch die simultane
Erhöhung
der intrazellulären
Konzentration und der spezifischen Aktivität von Aktivator/Repressor in
der Gegenwart eines Derivats von Benzoat, zum Beispiel Salicylat,
als gemeinsamem Induktor erreicht werden.
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Dementsprechend
weist die Erfindung in einem ersten Aspekt einen genetischen Kaskadenschaltkreis auf,
der umfasst:
- (a) ein oder mehr Nukleinsäurekonstrukte,
die den transkriptionellen Regulator NahR oder eine Mutante davon
und den transkriptionellen Regulator XylS oder eine Mutante davon
kodieren;
wobei die kodierten transkriptionellen Regulatoren
in hierarchischer Ordnung derart angeordnet sind, dass die Expression
des oberhalb gelegenen transkriptionellen Regulators NahR oder der
Mutante davon die Expression des transkriptionellen Regulators XylS
oder der Mutante davon stimuliert; und
wobei der transkriptionelle
Regulator NahR oder die Mutante davon und der transkriptionelle
Regulator XylS oder die Mutante davon auf den gleichen Induktor
ansprechen;
- (b) einen finalen Zielpromotor;
wobei der finale Zielpromotor
in dosisabhängiger
Weise auf den transkriptionellen Regulator XylS oder die Mutante
davon anspricht.
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In
bestimmten bevorzugten Ausführungsformen
kann es sinnvoll sein, den finalen Zielpromotor alleine, beispielsweise
via PCR, an die gewünschte
Position in einem Wirtsgenom einzubringen, um den Effekt auf die Expression
der Sequenz unterhalb (downstream) zu bestimmen. Zu diesem Zweck
kann es zunächst
erstrebenswert sein, den nativen Promotor, das Gen oder die Nukleinsäuresequenz
abzuschalten oder auszuknocken. In anderen bevorzugten Ausführungsformen,
wie nachfolgend beschrieben, werden für die Verwendung mit dem Kaskadenschaltkreis
heterologe Gene und Sequenzen bevorzugt und können demzufolge eingeführt werden.
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In
einer besonders bevorzugten Ausführungsform
umfasst der genetische Kaskadenschaltkreis zusätzlich eine multiple Klonierungsstelle
downstream des finalen Zielpromotors.
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In
einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
liegt der genetische Kaskadenschaltkreis oder zumindest ein Teil
davon als chromosomale Integration in einer Wirtszelle vor. In einer
anderen, sich nicht notwendigerweise gegenseitig ausschließenden Ausführungsform
liegt zumindest eines der ein oder mehr Nukleinsäurekonstrukte als autoreplikatives
Plasmid vor.
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In
einer weiteren Ausführungsform
spricht der genetische Kaskadenschaltkreis oder zumindest ein Teil davon
auf einen Induktor an, vorzugsweise auf einen Induktor, der zur
Induktion der Expression von mehr als einem Regulator in der Kaskade
imstande ist. In bevorzugten Ausführungsformen ist der Induktor
ein Derivat von Benzoat, vorzugsweise, aber nicht notwendigerweise,
Salicylat.
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In
einem anderen Aspekt weist die Erfindung eine Zelle, ein Gewebe
oder einen Organismus auf, der den genetischen Kaskadenschaltkreis
gemäß einem
der vorangehenden Ansprüche
umfasst. Vorzugsweise wird die Zelle aus der Gruppe ausgewählt, die
aus prokaryontischen und eukaryontischen Zellen besteht. Bei eukaryontischen
Zellen werden Säugetier-,
Insekten-, Hefe- und Pflanzenzellen bevorzugt. Bei prokaryontischen
Zellen werden gram-negative bakterielle Zellen bevorzugt.
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In
einem weiteren Aspekt weist die Erfindung Verfahren zur Regulation
der Expression einer Nukleinsäuresequenz
auf, das umfasst: Etablieren eines genetischen Kaskadenschaltkreises
gemäß einer
beliebigen der oben beschriebenen Ausführungsformen eines genetischen
Kaskadenschaltkreises; Anordnen der Nukleinsäuresequenz unter die Kontrolle
des finalen Zielpromotors; und Induzieren des genetischen Kaskadenschaltkreises,
um die Expression der Nukleinsäuresequenz
zu stimulieren.
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Vorzugsweise
kodiert die Nukleinsäuresequenz
ein Polypeptid, das aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus Enzymen,
Hormonen, Wachstumsfaktoren, Apolipoproteinen, therapeutischen Proteinen,
diagnostischen Proteinen und Teilen oder Derivaten davon besteht.
In anderen bevorzugten Ausführungsformen
kodiert die Nukleinsäuresequenz
ein Antisense Molekül,
ein Ribozym, eine rRNA, tRNA, snRNA oder einfach ein diagnostisches
RNA-Molekül.
In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen
kodiert die Nukleinsäure
ein in der Diagnostik verwendbares Reportergenprodukt.
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Genaue Beschreibung
der Erfindung
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Durch
Verwendung regulatorischer Gene von Kontrolschaltkreisen zur Expression
katabolischer Operons wurde ein Kaskadenexpressionssystem zur Amplifikation
der Genexpression konstruiert. Dieses System basiert auf den Aktivierungseigenschaften
des Pm Promotors durch den mutierten transkriptionellen Aktivator XylS2.
Die Stärke
der Pm Aktivierung hängt
sowohl von der Menge an XylS2 Protein als auch seiner spezifischen
Aktivität
ab, welche durch die Gegenwart von Salicylat und anderer Derivate
von Benzoat erhöht
wird. Um die Erhöhung
der intrinsischen XylS2 Aktivität
und die intrazelluläre
XylS2 Konzentration zu koppeln, ist die Expression von xylS2 unter
der Kontrolle des Psal Promotors und des transkriptionellen Aktivators
NahR, der als Antwort auf gemeinsame Induktoren ebenfalls aktiviert
wird. Die synergistische Wirkung beider transkriptioneller Regulatoren
führt im
Vergleich zu jedem individuellen Expressionssystem zu einer 10-
bis 20-fachen Amplifikation der Genexpressionskapazität.
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Eine
Ausführungsform
des Systems umfasst eine Kassette mit den regulatorischen Genen nahR/Psal::xylS2
flankiert von transposablen Sequenzen, welche die stabile Insertion
in das Chromosom einer Zelle, zum Beispiel ein gram-negatives Bakterium,
erleichtern. Ein komplementäres
Expressionsmodul, das den Zielpromotor upstream einer multiplen
Klonierungsstelle zur Erleichterung der Klonierung rekombinanter DNA
enthält,
wird als ein Teil des Systems verwendet. Das Expressionsmodul kann
in Form eines Plasmids mit hoher Kopienzahl (multicopy plasmid)
eingebracht oder sonst in das Chromosom transferiert werden, zum Beispiel über Minitransposon-Abgabevektoren
(falls entweder die Stabilität
der Expression und/oder das niedrigste basale Niveau gewünscht sind).
Zu diesem Zweck wird das Expressionsmodul mit dem Pm Promotor und
dem (den) heterologen Gen(en) vorzugsweise von seltenen Restriktionsschnittstellen,
zum Beispiel NotI, zum weiteren Nutzen bei der Klonierung flankiert.
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Ein
ideales Expressionssystem sollte strikt reguliert sein (i.e. sollte
ein sehr geringes basales Expressionsniveau und ein hohes Expressionsniveau
in der Gegenwart eines Induktors aufweisen). Für Fermentationen im Großmaßstab ist
es sehr zweckdienlich, wenn der Induktor billig ist, und wenn die Überexpression
des Gens stabil ist, vorzugsweise ohne Selektionsdruck. Die Kapazität der Kultur,
eine hohe Biomasse zu erreichen, sollte so wenig wie möglich beeinträchtigt werden,
und sollte zur Anwendung in einer großen Zahl von Organismen geeignet
sein. Es wurde nachgewiesen, dass die Salicylat-induzierte Expression
mittels nahR/Psal im Chromosom von gram-negativen Bakterien sehr
stabil und strikt reguliert ist (Suarez et al., 1996). Das erhaltene
Expressionsniveau ist jedoch aufgrund des Vorhandenseins einer singulären Kopie
und limitierter Genexpressionskapazität sehr gering.
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Im
Gegensatz dazu wurde gezeigt, dass das xylS/Pm Expressionssystem
einen außerordentlichen Aktivitätsbereich
aufweist, der sowohl von der spezifischen Aktivität des transkriptionellen
Regulators als auch der intrazellulären Konzentration von XylS
abhängt;
die Manipulation von beiden beeinträchtigt die Expression (Kessler
et al., 1994).
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Die
transkriptionelle Aktivität
von Pm in vivo scheint nicht sättigbar
zu sein, da die Expression ausgehend vom Pm trotz Überexpression
von XylS als Antwort auf den Induktor 3- Methyl-benzoat weiterläuft. Die Expressionssysteme
basierend auf dem xylS/Pm System halten jedoch konstante Mengen
an xylS Expression aufrecht, was die potentielle Erhöhung der
Genexpressionskapazität
schwächt,
wenn die xylS Expression induzierbar gemacht werden könnte. Wie
der Anmelder hier zeigt, kann dies durch Kopplung der Expression
von xylS an ein anderes Expressionssystem (erstes System) erreicht
werden. Falls das Signal, das die Expression des transkriptionellen
Regulators induziert, das gleiche wäre wie das, welches es aktiviert,
könnte
das Signal eine Synergie in der Aktivierung der Genexpression ausgehend
vom Pm Promotor erzeugen.
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Die
Erfindung beschreibt diese synergistische Signalamplifikation mit
Hilfe gekoppelter Expressionssysteme. Um Regulatoren, die auf ein
gemeinsames Signal ansprechen, zu verwenden, wurde nahR/Psal als ein
erstes regulatorisches System verwendet und xylS2, eine Mutante
von xylS, die auf Salicylat anspricht (Ramos et al., 1986), als
ein zweites regulatorisches System. Ein 1.2 kb Fragment mit dem
xylS2 Gen wurde mittels Verdau mit HindIII und Partialverdau mit
NcoI und Insertion in die gleichen Schnittstellen von pFH2 kloniert (Tabelle
1). Das resultierende Plasmid pNS2 wurde mit NotI verdaut, und das
Fragment mit xylS2 wurde in das Plasmid pCNB4 (de Lorenzo et al.,
1993) inseriert. Dieser Regulator wird unter der Kontrolle des nahR/Psal Systems
belassen und durch die Insertionssequenzen von Mini-Tn5 flankiert.
Das erhaltene Plasmid pCNB4-S2 (2a) besitzt
einen R6K Replikationsursprung (Kahn et al., 1979), der nur in Stämmen replizieren
kann, die das π Protein
exprimieren. E. coli λpir
lysogen kann dieses Protein exprimieren und somit das Mini-Tn5 Abgabeplasmid
replizieren (Herrero et al., 1990).
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Durch
Verwendung des Donorstamms des Mini-Tn5 Vektors S17-1(λpir) kann
die regulatorische Kassette durch eine standardmäßige biparentale Konjugation
in andere gram-negative Stämme
transferiert werden, und Empfängerbakterien
können unter
Verwendung selektiver Marker, die vom Minitransposon bestimmt werden,
selektiert werden (Herrero et al., 1990; de Lorenzo and Timmis,
1994). Um zu verifizieren, dass es sich um eine Insertion durch
Transposition handelt, und dass Plasmid R6K nicht inseriert wurde,
werden die Kolonien der Transkonjuganten auf den Verlust der β-Laktamase
des Suizid-Plasmids
hin überprüft. Jeder Stamm
mit der regulatorischen Kassette nahR/Psal::xylS2 würde das
regulatorische Protein XylS2 als Antwort auf Salicylat erzeugen
(1).
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Dieser
Stamm kann anschließend
zur Insertion einer zweiten regulatorischen Kassette, die den an
das heterologe Gen von Interesse fusionierten Pm Promotor enthält, mittels
Konjugation oder Transformation verwendet werden. Ein solches Konstrukt,
pTSPm, ist ein Mini-Tn5 Vektor, der innerhalb der Insertionssequenzen ein
Streptomycin-Resistenzgen, den Pm Promotor und eine NotI Restriktionsschnittstelle
enthält
(2a), um das heterologe Gen zu inserieren.
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Um
pTSPm zu konstruieren, wurde ein Fragment mit dem Omega Interposon
(Fellay et al., 1987) in die BamHI Schnittstelle des Vektors pUC18Sfi-KmR-xylS-Pm-Sfi (de Lorenzo et al., 1993) inseriert,
was ein Fragment mit KmR und xylS entfernte.
Das erhaltene Plasmid wurde mit SfiI verdaut, und das größte Fragment wurde
in das pUT Grundgerüst
eines Mini-Tn5 Vektors
(Herrero et al., 1990) kloniert, um das Plasmid pTSPm zu erhalten.
Die Hilfsvektoren aus Tabelle 1 können verwendet werden, um die
heterologen Gene zu klonieren und im Anschluss in die NotI Schnittstelle
von pTSPm subzuklonieren.
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Ein
zweiter Expressionsvektor mit einem ColE1 Replikationsursprung (pCCD5)
enthält
den Pm Promotor upstream einer multiplen Klonierungsstelle sowie
eine gute Translationsinitiationssequenz für die Einfachheit bei der Klonierung
heterologer Gene (2b). Das Plasmid pCCD5 wurde
konstruiert durch Klonieren eines ApoI Fragments, das den transkriptionellen
Terminator rrnBT1 enthält,
und das aus pKK232-8 mit den Oligos 5'-GCAAATTTCCAGGCATCAAATAA und 5'-GGGAATTCCCTGGCAGTTTATGG als PCR-Fragment erzeugt
wurde, in die EcoRI Schnittstelle von pFH2 (Tabelle 1). Nach Ligation
ergibt sich eine singuläre
EcoRI Schnittstelle, und die Plasmide mit einer intakten MCS können selektiert
werden. Der Pm Promotor wurde mittels PCR unter Verwendung der Oligos
A-Pm (5'-GTGTCAAATTTGATAGGGATAAGTCC-3') und Pm-E (5'-GCCTGAATTCAGGCATTGACGAAGGCA-3') als Primer und
pUC18Sfi-KmR-xylS-Pm-Sfi als Template erhalten. Ein
Verdau des amplifizierten Fragments (0.4 kb) mit ApoI (unterstrichen)
ergab ein mit EcoRI Termini kompatibles Fragment, aber nur die Äußerste des
Fragments downstream des Pm Promotors regenerierte die EcoRI Schnittstelle
in der Verbindungsstelle. Daher hat die Einführung des Pm ApoI Fragments
in der korrekten Orientierung in die mit EcoRI linearisierten Plasmidintermediate
Vektoren zur Folge, die den Pm Promotor vor einer intakten MCS enthalten,
wobei alle Schlüsselelemente
von NotI Schnittstellen flankiert werden.
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Diese
letzte Merkmal kann es ermöglichen,
in Mini-Tn5 Abgabevektoren zu klonieren, falls eine Monokopie oder
die Stabilität
des Expressionssystems erforderlich sind. Es gibt bis zu acht verschiedene
Marker in Mini-Tn5 Vektoren mit der NotI Schnittstelle, worin die
Pm Fusion kloniert werden kann (de Lorenzo, 1994). Die daraus resultierenden
Vektoren können
im Anschluss mittels Konjugation in das Chromosom der Empfängerbakterien
inseriert werden. Alternativ können
die in pCCDS unter Pm Kontrolle klonierten Gene in Stämme mit
der regulatorischen Kassette im Chromosom transformiert werden,
um die heterologen Gene vom Plasmid aus überzuexprimieren.
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Kurze Beschreibung
der Zeichnungen
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1:
Schematische Darstellung einer Ausführungsform eines regulatorischen
Kaskadenschaltkreises. Eine Expressionskassette, die das nahR Gen
und den Psal Promotor enthält,
kontrolliert die Expression von xylS2. In der Gegenwart eines gemeinsamen
Induktors aktiviert NahR die Expression von xylS2. Simultane hohe
intrazelluläre
Niveaus an XylS2 und die Stimulation der XylS2-spezifischen transkriptionellen
Aktivität führen zu
amplifizierten Expressionsniveaus eines gegebenen Gens unter Kontrolle
des Pm Promotors.
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2:
Schematische Vektorausführungsformen
für die
Expression in einer Ausführungsform
eines genetischen Schaltkreises. (a) Konstruierte Mini-Tn5 Vektoren.
Das Schema im oberen Teil stellt das Grundgerüst des Suizid-Plasmids pUT
mit dem Replikationsursprung R6K (oriR6K), dem Transposase-Gen (tnp*),
dem β-Lactamase-Gen
(bla), das Ampicillin-Resistenz verleiht, dem Mobilisierungsursprung
(mob) und den Insertionssequenzen (I-Ende und O-Ende) dar, die als
horizontale schraffierte Linien dargestellt sind. Die regulatorischen
Kassette in pCNB4-S2 und die Expressionskassette in pTSPm sind unterhalb
des pUT Schemas dargestellt. Die Restriktionsschnittstelle NotI
ist selten, da sie 8 Nukleotide erkennt. (b) Schema des Expressionsvektors
pCCDS (linearisiert), der den Pm Promotor upstream einer MCS enthält, in die
ein heterologes Gen kloniert werden kann. Er enthält ferner
einen M13 Replikationsursprung, der es ermöglicht, einzelsträngige DNA-Plasmide
zur ortsgerichteten Mutagenese herzustellen. Als ein Beispiel ist
die Klonierungsstrategie verschiedener Fragmente gezeigt, welche
die lpp'-'ompA'-'phoA Fusion bilden.
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3:
Schematische Darstellung eines Beispiels für die Konstruktion von Mini-Tn5
Vektoren für
eine Insertion heterologer Gene in Monokopie mittels Transposition.
tnp* ist das Transposase-Gen. Die Insertionssequenzenw erden als
I-Ende und O-Ende bezeichnet, die das Substrat der Transposase sind.
Die durch die Insertionssequenzen flankierte DNA kann in den Rezeptorstamm
transponiert werden. Die NotI Schnittstelle dient dazu, innerhalb
der Insertionssequenzen ein beliebiges Gen einzuführen, das
zuvor in die Hilfsvektoren kloniert wurde, welche multiple Klonierungsstellen
flankiert von NotI Schnittstellen enthalten (Tabelle 1 und, zum
Beispiel, pUC18Not im Schema).
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4:
Vergleich der Produktion von β-Galaktosidase
in Miller Units (MU) zwischen dem regulatorischen Kaskadensystem
und den einfachen Systemen. (a) Kinetik der β-Galaktosidaseproduktion nach Zugabe des
Induktors. 2 mM Salicylat wurde zu den Kulturen (OD600 = 0.2) zugegeben,
und die β-Galaktosidaseaktivität wurde
in unterschiedlichen Zeitintervallen kontrolliert. Leere Symbole:
ohne Salicylat. Gefüllte
Symbole: mit 2 mM Salicylat. nahR/Psal::trp'::'lacZ
(Quadrate), xylS2/Pm::trp'::'lacZ (Dreiecke) und nahR/Psal::xylS2/Pm::trp'::'lacZ (Kreise). (b)
Produktion von β-Galaktosidase
bei verschiedenen Salicylatkonzentrationen mit nahR/Psal (gefüllte Kreise),
xylS2/Pm (Dreiecke), nahR/Psal::xylS2/Pm (leere Kreise).
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5:
Kapazität
zur Regulation von einfachen Schaltkreisen und zwei Kaskaden unter
Verwendung einer unterschiedlichen Hierarchie von upstream und downstream
Regulatoren. S: 2 mM Salicylat. B: 2 mM Benzoat. 3,5 dClS: 2 mM
3,5-Dichlor-salicylat. Basale Werte der β-Galaktosidaseaktivität von jedem der in E. coli
etablierten Schaltkreise waren die folgenden: nahR/Psal (schwarze
Balken), 65 MU; xylS2/Pm (offene Balken), 192 MU; nahR/Psal⌀xylS2/Pm
(graue Balken), 169 MU; xylS2/Pm⌀nahR/Psal (schraffierte Balken)69 Miller
Units. Die Ergebnisse sind Durchschnittswerte aus drei unabhängigen Experimenten.
Die entsprechenden Standardabweichungen sind durch Fehlerbalken
angezeigt.
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6:
Kapazität
zur Regulation von Einzel- und Kaskadenschaltkreisen in Pseudomonas
putida. Stämme,
die im Chromosom verschiedene Minitransposons (Spalte 1) tragen, welche
das in der Legende beschrieben regulatorische System enthalten,
wurden auf ihre β-Galaktosidaseakkumulation
als Antwort auf 2 mM Benzoat untersucht. Die vierte Spalte zeigt
die Regulatoren und die sequentielle Anordnung im entsprechenden
Stamm. Die Ergebnisse sind Durchschnittswerte aus drei unabhängigen Experimenten.
Basale Werte in Miller Units sind angegeben.
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7:
Genexpressionsanalyse des Kaskadensystems in P. putida mit nahR4/Psal
als erstem regulatorischem System und xylS/Pm als zweitem. (a) β-Galaktosidaseakkumulation
ohne Induktor (-), mit 2 mM Salicylat (S) oder 2 mM Benzoat (B)
mit dem Kaskadensystem (links) oder dem einfachen System xylS/Pm::trp'::'lacZ (rechts). (b)
Western-Blot zur Detektion der XylS Produktion in Kulturen von P.
putida (nahR4/Psal::xylS/Pm::trp'::'lacZ) nach Inkubation
mit verschiedenen Effektoren.
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BEISPIELE
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Beispiel 1: Vergleich
der Überexpression
von lacZ in einem Kaskadenschaltkreis relativ zu einem einfachen Schaltkreis
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Beispiel 1.1
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Konstruktion eines Kaskadenschaltkreises
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Dieses
Beispiel veranschaulicht die rationale Basis, die Konstruktion und
die Validierung eines Kaskadenschaltkreises zur Genexpression relativ
zu einem einfachen Regelkreis.
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Um
die Effizienz des genetischen Verstärkerschaltkreises zu untersuchen,
wurde ein Plasmid konstruiert, das eine Fusion vom Pm mit trp'::'lacZ enthält. Ein
NotI Fragment mit dieser Fusion wurde in die NotI Schnittstelle
von pTSPm kloniert, was das Plasmid pTSPm-lacZ ergab. Die Pm Fusion
wurde durch Paaren (mating) mit dem Donorstamm 517-1 (λpir), der
das Plasmid pTSPm-lacZ enthält,
in LB-0.8% Citrat für
vier Stunden bei 30°C
in das Chromosom von E. coli CC118 (Herrero et al., 1990) inseriert.
Der Pool an Bakterien, die auf 25 mg/l Streptomycin und 50 mg/l
Rifampicin wuchsen, wurde als Empfänger in einer Paarung mit dem Donorstamm
E. coli 517-1 (λpir)
(pCNB4-S2) verwendet. Um Transkonjuganten zu selektieren, wurde
das Produkt der Paarung auf LB Platten mit Rifampicin, Streptomycin
und Kanamycin (25 mg/l) selektiert. Zehn gegenüber Ampicillin (100 mg/ml)
sensitive Kolonien wurden für
die weitere Analyse der β-Galaktosidaseaktivität selektiert
(Miller, 1972). Kulturen aus den Kolonien der Transkonjuganten wurden über Nacht
in LB Medium (5 g/l Hefeextrakt, 10 g/l Trypton, 5 g/l NaCl) bei
37°C unter
Schütteln
angezogen. Die Kulturen wurden 1:100 in frischem Medium ohne Antibiotikaselektion
verdünnt
und zwei Stunden bei 37°C
inkubiert. Salicylat (2 mM) wurde zu den Zellsuspensionen hinzugegeben,
die im Anschluss fünf
Stunden bei 30°C
geschüttelt
wurden. Die β-Galaktosidaseproduktion
ohne Induktor lag abhängig
vom Transkonjugant im Bereich zwischen 100 und 400 Miller Units.
Die lacZ Expression konnte dramatisch bis zu 25000–50000 MU
induziert werden, wenn die Kulturen mit Salicylat induziert wurden,
was abhängig
vom Transkonjugant einer Genexpressionskapazität von 150 bis 400 mal entsprach.
Die Variation im Expressionsniveau und der Kapazität unter
den Transkonjuganten erfolgt wahrscheinlich aufgrund der Nähe zum Replikationsursprung
OriC, da es im Durchschnitt mehrere Genkopien pro Zelle gibt (Sousa
et al., 1997).
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Um
die Expression von lacZ im Kaskadensystem mit den einfachen Systemen
zu vergleichen, welche auf Salicylat ansprechen, wurden E. coli
CC118RSL9 und CC118FH26 verwendet, die Insertionen der Mini-Tn5
Konstrukte mit den nahR/Psal::lacZ und xylS2/Pm::lacZ Fusionen umfassten,
welche in den Plasmiden pCNB4-lacZ und pCNB2-lacZ (de Lorenzo et
al., 1993) enthalten waren. Die Induktionsrate als Antwort auf Salicylat
und die in den einfachen Systemen erhaltenen absoluten Werten waren
10–20
mal niedriger als die mit dem Kaskadensystem aus CC1184S2PT32 erhaltenen.
Die Akkumulation von β-Galaktosidase
erreichte einen Maximalwert nach fünf Stunden, und die effektive
Syntheserate war äquivalent
zu den einfachen Systemen (4a). Bei
einer Konzentration von 0.5 mM Salicylat erreichte die Induktionsrate
90% der maximalen Aktivität.
Von den zehn Transkonjuganten-Stämmen
mit dem regulatorischen Kaskadensystem wurden diejenigen ausgewählt, welche
die maximale Genexpressionskapazität (CC1184S2PT32) und die maximale β-Galaktosidaseproduktion
(CC1184S2PT97) hervorbrachten. Mit Hilfe von SDS-PAGE und Densitometrie
wurde abgeschätzt,
dass die β-Galaktosidaseproduktion
9% des Gesamtproteins in CC1184S2PT32 und 12% in CC1184S2PT97 betrug.
Im Gegensatz dazu wurde mit dem einfachen System weniger als 0.6% β-Galaktosidaseproduktion
erhalten.
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Tabelle
1: Hilfsplasmide für
die Klonierung in pTSPm
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Beispiel 1.2
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Vergleich eines Kaskadensystems
in verschiedenen Konfigurationen mit einem einfachen System
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Dieses
Beispiel veranschaulicht die komparative Verwendung von Kaskadenschaltkreisen
zur lacZ Überexpression
in einem Chromosom versus in einer Plasmidkonfiguration, um es mit
einfachen Schaltkreisen zu vergleichen und die relative Stabilität zu bestimmen.
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Da
sich die Amplifikation der Expression erhöhen könnte, wenn der einfache Regulator/Promotor
in einem Plasmid vorläge
(aufgrund der Erhöhung
der Gendosis), wurde der relative Nutzen der Verwendung verschiedener
Konfigurationen von Aktivator/Promotor zur Überproduktion rekombinanter
Proteine evaluiert. Zu diesem Zweck wurden die gleichen Plasmide
Mini-Tn5, aber der
Stamm CC118λpir
verwendet, in dem sie replizieren können. Die Stämme mit
dem Plasmid pCNB4-lacZ oder pCNB2-lacZ zeigten Zuwachsraten von
10- bis 30-fach mit Bezug zur Expression in Monokopie, was eine
erhöhte
Gendosis anzeigt. Der Vergleich von einfachen (Nicht-Kaskade) Systemen
in Plasmiden mit dem Kaskadensystem im Chromosom zeigte, dass das basale
Niveau 3 bis 64 mal geringer ist als in den Bakterien mit pCNB4-lacZ
bzw. pCNB2-lacZ. Unter Induktionsbedingungen betrug das Niveau der β-Galaktosidaseproduktion
bei dem Kaskadensystem im Chromosom mehr als das 2-fache von dem
des einfachen Schaltkreises nahR/Psal and 50–89% des Niveaus des xylS2/Pm Schaltkreises
im Plasmid. Um die strikte Regulation mit höheren Werten in der Produktausbeute
zu kombinieren, wurde ein Stamm mit der regulatorischen Kassette
nahR/Psal::xylS2 konstruiert, der einen lysogenen λpir Phagen
tragt, um die Replikation von pTSPm-lacZ zu ermöglichen. Die Plasmidkonfiguration
der Fusion von Pm mit dem heterologen Gen erreichte das maximale
Niveau der β-Galaktosidaseproduktion
und ein niedrigeres Niveau an basaler Expression im Vergleich zu
dem Stamm, der pCNB4-lacZ enthält.
Die Stabilität
des Kaskadensystems in der chromosomalen Konfiguration unter Bedingungen
von Überexpression
beträgt
jedoch nach 40–50
Generationen 100%. Im Gegensatz dazu zeigte das Plasmidsystem bakterielle
Populationen, welche die Fähigkeit
verlieren, lacZ in einem Ausmaß zu
exprimieren, das mit dem Niveau der enzymatischen Aktivität in den
ersten fünf
Stunden der Induktion korreliert. Unter Induktionsbedingungen war
die finale Konzentration lebensfähiger
Zellen in der chromosomalen Konfiguration etwa 10 mal höher, als
wenn lacZ von Plasmiden überexprimiert
wurde. Diese Beobachtung könnte
durch die Gegenwart anderer, für
die Replikation und Erhaltung erforderlicher Gene im Plasmid erklärt werden,
die ebenfalls in multiplen Kopien vorliegen und deren Expression
eine metabolische Belastung verursachen könnte.
-
Tabelle
2: Vergleich der β-Galaktosidaseaktivitäten und
der Stabilität
der heterologen Gene von Kaskaden- und singulären Expressionssystemen in
verschiedenen Konfigurationen
-
-
Die
Kulturen wurden bei 37°C
in LB mit (Stämme
mit Plasmiden) oder ohne 150 μg/ml
Ampicillin angezogen. 1:100 Verdünnungen
der Kulturen wurden im gleichen Medium ohne Antibitikaselektion
hergestellt und zwei Stunden bei 37°C inkubiert.
-
Beispiel 2: Verwendung
des Kaskadesystems zur Überexpression
eines Ipp'::'ompA'::'phoA Gens darin
-
Diese
Beispiel veranschaulicht die Verwendung eines Kaskadenexpressionssystems
mit einem autoreplikativen Expressionsvektor mit dem Pm Promotor
zur Überexpression
einer rekombinanten DNA, die ein Membranprotein kodiert.
-
Die
Expression eines Proteins von einem Plasmid kann auf vielfältige Weise
und mit einer Vielzahl von genetischen Hintergründen konzipiert und implementiert
werden, wie dem Durchschnittsfachmann bewusst ist. Die hier beschriebenen
Plasmide demonstrieren nur eine der vielen Ausführungsformen. Im speziellen
benötigen
die beschriebenen Plasmide zur Erhaltung einen lysogenen λpir Phagen.
Um das Erfordernis des Proteins π für die Plasmiderhaltung
zu vermeiden, konstruierten wir ein auf Pm basierendes Expressionsplasmid mit
dem autoreplikativen ColE1 Replikationsursprung (Derivate) (2b).
-
Das
Plasmid pCCD5 wurde basierend auf pFH2 (Tabelle 1) konstruiert,
das eine vielseitige MCS umfasst, welche die einfache Konstruktion
trunkierter Gene ermöglicht.
pCCD5 enthält
einen transkriptionellen Terminator (rrnBT1), um das Durchlesen
(readthrough) von Promotoren oberhalb (upstream) vom Pm zu reduzieren.
Da die gesamte Expressionskassette von NotI Restriktionsschnittstellen
flankiert wird, kann eine einfache Klonierung in die gleichen singulären Schnittstellen
einer Vielzahl von Mini-Tn5 Konstrukten (de Lorenzo und Timmis,
1994) und die anschließende
Einführung
der DNA-Konstrukte
in Stämme
mit dem CNB4-S4 Minitransposon erreicht werden. Um dieses System
zu testen, klonierten wir darin eine lpp'-'ompA'-'phoA Hybridsequenz. Diese spezifische
Fusion kodiert ein Protein der äußeren Membran.
Diese sind üblicherweise
mit Hilfe traditioneller Expressionssysteme schwierig zu klonieren,
da sie, wenn überexprimiert,
Zellen schädigen. Wir
verwendeten pCCD5, um lpp'-'ompA'-'phoA aus pTX101 (Francisco et al., 1991)
mittels PCR unter Verwendung der Oligos 5'-GAGGAATTCAATCTAGAGGGTATTAATA und 5'-CGGGATCCCCGTTGTCCGGACGAGTGCC zu klonieren.
Dieses Fragment wurde mit EcoRI und BamHI geschnitten und in die
gleichen Schnittstellen von pCCD5 inseriert, was das Plasmid p5LOA2
ergab. Ein Gen, das die alkalische Phosphatase phoA kodiert, wurde
aus pPHO7 (Gutierrez and Devedjian, 1989) als ein BamHI Fragment
in p5LOA2 kloniert (2b). Das resultierende Plasmid
p5LOA2-AP wurde mittels Transformation in E. coli CC1184S2 eingebracht.
Die bakteriellen Kulturen mit CC1184S2 (p5LOA2-AP) erzeugten nach
Zugabe von Salicylat mehr als 20% des Gesamtproteins, ohne Detektion
jedweden Produkts in Coomassie-gefärbter SDS-PAGE unter uninduzierten
Bedingungen. Das maximale Proteinniveau wurde nach 2–3 Stunden
Induktion erreicht.
-
Beispiel 3: Induktion
eines Kaskadesystems unter Verwendung von verschiedenen Derivaten
von Salicylat
-
Dieses
Beispiel veranschaulicht, wie die Effektormoleküle NahR und XylS2 die Genexpression
synergistisch amplifizieren können,
wenn sie richtig in einen genetischen Kaskadenschaltkreis integriert
sind. Exponentielle Kulturen von E. coli CC1184S2PMT32 (Kaskade)
und einfache Schaltkreise in den E. coli Stämmen CC118RSL9 und CC118FH26
wurden mit verschiedenen Derivaten von Benzoat fünf Stunden bei 30°C inkubiert
(Tabelle 3). Die β-Galactosidaseaktivität der mit
den Testverbindungen inkubierten Kulturen zeigte, dass der Kaskadenschaltkreis
eine höhere
Genexpressionskapazität
aufweist als die einfachen Regelkreise (Tabelle 3). Es wurde beobachtet,
dass im Vergleich zu Salicylat andere Derivate von Benzoat, zum
Beispiel Antranilat und 5-Chlor-salicylat, die β-Galactosidaseproduktion ebenfalls um
mindestens 10% erhöhen
konnten.
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Tabelle
3: Induktionsraten der β-Galactosidaseaktivität in der
Gegenwart verschiedener aromatischer Verbindungen.
-
Beispiel 4: Die Effizienz
der Amplifikationskaskade hängt
von den Charakteristika des terminalen positiven Regulators ab
-
Dieses
Beispiel veranschaulicht, dass es spezifische Erfordernisse für das zweite
regulatorische System gibt, um die Amplifikation der Genexpressionskapazität durch
einen Kaskadenschaltkreis zu erzielen. Insbesondere sollte die Aktivität des Zielpromotors über einen
weiten Bereich der intrazellulären
Konzentrationen des zweiten (oder terminalen) Regulators dosis-abhängig sein.
-
Um
die Bedeutung der regulatorischen Hierarchie für den Amplifikationseffekt
zu sehen, wurde der Effekt des Vertauschens des oberhalb (upstream)
und des unterhalb gelegenen (downstream) Regulators in der auf XylS2/NahR
basierenden Kaskade durch Konstruieren von E. coli 2NRSL7 untersucht.
Das Chromosom dieses Stammes trägt
die DNA-Elemente
xylS2/Pm::nahR und Psal::trp'::'lacZ, die von spezialisierten
Minitransposons getragen werden, und war somit äquivalent zum E. coli Stamm
CC1184S2PT32 mit Ausnahme der Reihenfolge der Regulatoren im gekoppelten
System. Wie in 5 gezeigt, erhöhte sich
die Kapazität
des revers-gekoppelten Systems, das auf Salicylat anspricht (24-fache
Induktion) nicht über
die Kapazität
des singulären
nahR/Psal::lacZ Elements. Entlang derselben Linie war das revers-gekoppelte
System von E. coli 2NRSL7 vollständig
insensitiv gegenüber
dem nur-XylS2 Effektor Benzoat. Diese Beobachtungen zeigen, dass
die Überexpression
von nahR keinen parallelen Anstieg der Psal-Aktivität zur Folge
hat, aber einen nicht-produktiven Überschuss des zweiten Regulators,
da die gleiche Genexpressionskapazität ausgehend von Psal konnte
bei einer relativ geringen Konzentration von NahR erreicht werden.
Untersuchungen über
den Mechanismus der Psal Aktivierung zeigten, dass die Zielstelle
für diesen
Aktivator ungeachtet der Induktionsbedindungen besetzt ist (Huang
and Schell, 1991). Somit scheint der Psal Promotor ausschließlich von
der Gegenwart oder dem Fehlen von Salicylat abzuhängen, und
die Überexpression
von nahR erzeugt keine höhere
Promotoraktivität.
Insgesamt zeigen diese Ergebnisse, dass die Effizienz der Kopplung
in einer regulatorischen Kaskade spezifische Eigenschaften des downstream
Regulators/Promotors erfordert, die zumindest umfassen, dass die
Aktivierung des finalen Zielpromotors in einer dosis-abhängigen Weise
erfolgt, vorzugsweise über
einen weiten Bereich an Regulatorkonzentrationen. Dies trifft für XylS2,
aber nicht für
NahR zu. Folglich gewährt
die bloße
Sensitivität
der beiden Regulatoren für
den gleichen Effektor keinen Verstärkungseffekt, außer die
passende Hierarchie wurde etabliert.
-
Beispiel 5: Neukonzeption
des Kaskadensystems, um die Genexpression als Antwort auf Benzoat
in Pseudomonas putida zu amplifizieren
-
Beispiel 5.1
-
Dieses
Beispiel zeigt, dass das Kaskadenverstärkersystem konzipiert werden
kann, um auf Signalmoleküle
in anderen Mikroorganismen als E. coli anzusprechen. Es wurde die
Konzeption eines spezialisierten P. putida Stammes durchgeführt, der
einen Benzoat Kaskadenkontrollschaltkreis trägt. Das Grundprinzip des hier beschriebenen
Schaltkreises umfasst sowohl einen ersten Regulator als auch einen
zweiten Regulator, von denen ein jeder auf Benzoat anspricht. Da
der downstream Regulator (XylS2) bereits auf diesen Induktor anspricht
(6), umfasste die Konzeption einer neuen Kaskade
hauptsächlich
die Modifikation upstream regulatorischen Systems. Zu diesem Zweck
wurden zwei nahR Mutanten, welche die Benzoat-responsiven Varianten
nahR3 und nahR4 kodieren, unter Verwendung von pCNB43 bzw. pCNB44
Plasmiden everwendet (Cebolla et al., 1997). Diese wurden zusammen
mit dem Reportersegment Pm::lacZ in die gekoppelten Systeme nahR3/Psal::xylS2
und nahR4/Psal::xylS2 eingebaut und anschließend in das Chromosom des P.putida
Stammes KT2442 inseriert, um P. putida 43S2PmL und P. putida 44S2PmL
zu ergeben. Die Induktion dieser Stämme durch Benzoat wurde mit
der von P. putida Stämmen
verglichen, welche entweder die einfachen Elemente NSL7 (nahR/Psal::lacZ),
43L (nahR3/Psal::lacZ), 44L (nahR4/Psal::lacZ) und S2PmL (xylS2/Pm::lacZ)
oder die Kaskade mit der Benzoat-insensitiven Wildtyp nahR-Variante
4S2PmL tragen (6). Die Kaskade mit den Benzoat-responsiven
nahR Mutanten erhöhte
im Vergleich mit den singulären
Expressionssystemen mit nahR3, nahR4 oder xylS2 die Genexpressionskapazität als Antwort
auf Benzoat von 6-fach auf 35-fach. Im Gegensatz dazu zeigte der
Kaskadenschaltkreis mit dem Wildtyp nahR in 4S2PmL (nahR/Psal::xylS2, Pm::lacZ)
in Pseudomonas aufgrund des Fehlens einer Antwort des upstream Regulators
auf Benzoat eine reduzierte Induktionskapazität durch Benzoat (ungefähr siebenfach).
Diese Zahlen entsprechen den Vorhersagen aufgrund der simultanen
Induktion eines jeden Regulators nach Erwerb der Fähigkeit,
durch NahR auf Benzoat anzusprechen.
-
Beispiel 5.2
-
Dieses
Beispiel veranschaulicht Experimente, die konzipiert wurden, um
die Möglichkeit
auszuschließen,
dass die Amplifikationseigenschaft nur ein spezielles Merkmal der
Mutante von XylS (XylS2) und nicht des Wildtyps war.
-
Der
Wildtyp-Regulator xylS, der durch Benzoat, aber nicht durch Salicylat
aktiviert werden kann, wurde als zweiter Regulator verwendet (Ramos
et al., 1986). Als ersten Regulator verwendeten wir eine Effektormutante
des nahR Regulators, nahR4, die zusätzlich zu Salicylat Benzoat
erkennen kann (Cebolla et al., 1997). Um dies zu erreichen, wurde
das Plasmid pNS durch Austausch des NcoI Fragments von pCNB1 (de
Lorenzo et al., 1993) gegen das entsprechende Fragment aus pNS2
konstruiert. Ein NotI Fragment aus pNS mit xylS wurde in die entsprechende
NotI Schnittstelle des Plasmids pCNB44 (Cebolla et al., 1997) kloniert,
was zum Plasmid pCNB44-S führte,
das nahR4-Psal::xylS und das Kanamycin-Resistenzgen innerhalb der
transposablen Mini-Tn5 Sequenzen enthält. Die Pm::trp::lacZ Fusion
in pTPm-lacZ und die in pCNB44-S Enthaltene wurden mittels Konjugation
durch den Donorstamm E. coli 517-1λpir in das Chromosom von Pseudomonas
putida KT2442 inseriert und mit den geeigneten Antibiotika selektiert.
Zwei Transkonjuganten mit dem Kaskadesystem wurden auf ihre Fähigkeit
untersucht, lacZ mit Salicylat und Benzoat zu exprimieren. Das Expressionsniveau
war mit dem Kaskadesystem etwa viermal höher als mit dem einfachen regulatorischen
System xylS/Pm (7). Diese Stämme produzierten in der Gegenwart
von Salicylat auch ungefähr
viermal mehr β-Galactosidase als
mit Benzoat. Dies erfolgte aufgrund der Unfähigkeit von XylS, auf Salicylat
anzusprechen, wie durch Western-Blot Analyse gezeigt (7).
Eine erhöhte
Akkumulation von XylS wurde beobachtet, wenn die Kulturen mit Salicylat
induziert wurden. XylS besitzt jedoch eine geringe transkriptionelle
Aktivität,
da es keinen Effektor für
XylS gab. Im Gegensatz zur Akkumulation von XylS in Benzoat ist
das erzeugte XylS wegen der Gegenwart eines produktiven Effektors
aktiver. Daher wird die Gegenwart eines gemeinsamen Effektors für beide
Regulatoren für
den Amplifikationseffekt bevorzugt.
-
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Alle
hier zitierten Referenzen werden hierin in ihrer Gesamtheit einbezogen.
Fachleute werden erkennen, dass der Schutzumfang der Erfindung weit über die
zahlreichen Ausführungsformen
hinausgeht, die hier bereits beschrieben und beispielhaft dargestellt
sind.
-
