WO2015183052A1 - 재설계 유전자회로를 이용한 아미노카프론산의 감지 및 정량 방법 - Google Patents

재설계 유전자회로를 이용한 아미노카프론산의 감지 및 정량 방법 Download PDF

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염수진
권길광
김문정
김하성
나유진
이대희
정흥채
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한국생명공학연구원
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • G01—MEASURING; TESTING
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    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing

Definitions

  • the present inventors have developed a technology that can detect and quantify various compounds using genetically engineered cells that can overcome the limitations of the device analysis (Korean Patent No. 1,222,056, Korean Patent Application No. 10-2013 -0164442, Korean Patent Application 10-2012-0066846, PCT / KR2014 / 001360).
  • the preceding inventions are directed to a method of constructing a genetic circuit that sensitively detects microenzyme activity in a single cell using a transcriptional regulator that can detect various compounds in a cell.
  • the present inventors have developed and reported a gene circuit capable of detecting phenolic compounds, isoprene, toluene, and benzene compounds through fluorescence expression in gene circuits (Korean Patent No.
  • the present invention (a) a gene encoding a protein for converting from aminocapronic acid to ⁇ -caprolactam; (b) an nitR gene encoding a NitR protein that recognizes ⁇ -caprolactam; (c) at least one reporter gene selected from the group consisting of a gene encoding a fluorescent protein and an antibiotic resistance gene; (d) a promoter that regulates expression of the nitR gene; And (e) provides a redesigned gene circuit for aminocapronic acid detection comprising a nitA promoter that is coupled to NitR (protein) that recognizes the ⁇ -caprolactam to induce the expression of the reporter gene downstream.
  • the synthetic gene circuit of the present invention is composed of a gene encoding a protein for converting aminocapronic acid into ⁇ -caprolactam, a nitR gene encoding a NitR protein that recognizes the converted ⁇ -caprolactam, and a binding site, the nitA promoter.
  • the NitR protein reacted in proportion to the amount of aminocaproic acid induces the expression of the fluorescent protein through the regulation of transcription of the nitA promoter. . As shown in FIG.
  • a novel gene encoding a protein for converting aminocaproic acid into ⁇ -caprolactam in an aqueous solution is secured in a metagenome derived from a tidal flat and developed as a core component of a detection technology using the gene circuit.
  • the discovery of a new caprolactam converting enzyme from the metagenome, and developing it as a core component of the detection technology using the gene circuit is secured in a metagenome derived from a tidal flat and developed as a core component of a detection technology using the gene circuit.
  • nitR-PnitA transcriptional regulators are classified into XylS / AraC type transcriptional regulators by complementary sequence analysis.
  • XylS / AraC transcriptional control group is characterized by the presence of a complementary Helix-turn-Helix sequence at the C-terminal end as an active type factor to recognize and bind to a specific genetic sequence and to act as a dimer. In general, it binds to a specific genetic sequence structurally and physically restricts the corresponding gene to inhibit transcriptional expression, and when the target factor is recognized, the gene is structurally released to initiate transcriptional expression.
  • the redesigned gene circuit may include not only the promoter, but preferably RBS (Ribosome Binding Site) and / or transcription terminator that facilitates expression of the reporter protein. That is, as a site for regulating the expression of the regulatory protein, in addition to the promoter, it may include RBS and / or transcription terminator.
  • RBS Ribosome Binding Site
  • the transcription terminator may preferably be rrnBT1T2 or tL3, and besides this, any transcription terminator commonly used in the art may be used to constitute the present invention.
  • a gene circuit including a gene for converting ⁇ -caprolactam from aminocaproic acid and CL-GESS were introduced through heat shock.
  • One E. coli DH5 ⁇ single colony was incubated at 37 ° C. for about 24 hours by LB plated with 50 ⁇ g / ml ampicillin and 12.5 ⁇ g / ml chloramphenicol.
  • DH5 ⁇ -pNitA-T7RNAP / T7CLGESS was prepared by transforming the DH5 ⁇ -pNitA-T7RNAP strain prepared in 3-1 to the plasmid containing the T7CLGESS plasmid prepared in 3-2 and the ⁇ -caprolactam transgene, thereby preparing DH5 ⁇ -pNitA-T7RNAP / T7CLGESS.
  • Single colonies of pNitA-T7RNAP / T7CLGESS strains were incubated at 37 ° C. for about 24 hours by plating LB with 50 ⁇ g / ml of ampicillin and 12.5 ⁇ g / ml of chloramphenicol on a solid medium.

Abstract

본 발명은 재설계 유전자회로를 이용한 아미노카프론산의 감지 및 정량 방법에 관한 것으로, 본 발명에 따른 아미노카프론산을 인지하는 재설계 유전자회로는 아미노카프론산의 양에 비례하여 형광단백질의 발현을 유도하여 아미노카프론산을 빠르게 감지 및 정량화 할 수 있으므로, 아미노카프론산의 정량 분석이 필요한 분야에서 유용하게 쓰일 수 있다.

Description

재설계 유전자회로를 이용한 아미노카프론산의 감지 및 정량 방법
본 발명은 재설계 유전자회로를 이용한 아미노카프론산의 감지 및 정량방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 나일론 6의 전구체로 활용되는 ε-카프로락탐의 전구체인 아미노카프론산을 감지할 수 있는 유전자회로를 이용한 아미노카프론산의 감지 및 정량 방법에 관한 것이다.
아미노카프론산(Aminocaproic acid)은 아미노산 라이신의 아날로그로서 혈액 중 플라스미노겐(plasminogen) 시스템의 대표적인 저해약물로서 과다 출혈, 수술 시 지혈제 등으로 쓰이는 항섬유소제제(antifibrinolytic agent)이다. 또한 아미노카프론산은 ε-카프로락탐(ε-caprolactam)의 대표적 전구체이다. 아미노카프론산으로부터 생성되는 ε-카프로락탐은 합성 폴리머 나일론 6, 합성 가죽, 폴리우레탄 링커의 전구체로 활용되는 물질로서 세계 시장에서 톤당 $2,700 ~ 3,300로 각광받고 있는 모노머이다. ε-카프로락탐은 6-아미노헥산산(ε-아미노헥산산, 6-아미노카프론산)의 락탐형 유기 화합물로, ε-카프로락탐 단량체의 개환 중합 반응에 의해 나일론-6가 생산된다. 따라서 ε-카프로락탐의 생산을 위한 기질로서 아미노카프론산의 생합성에 관한 연구가 수행 중이다. 예를 들어, ε-카프로락탐의 전구체인 6-아미노헥사에노익산을 효소적 방법으로 합성하는 방법(미국 공개특허 제2009-0137759호); 6-아미노카프론산, ε-카프로락탐, 헥사메틸렌디아민 또는 레불린산 경로를 가지는 비-천연 미생물 유기체(미국 공개특허 제2010-0317069); 아디페이트, 6-아미노카프론산 또는 ε-카프로락탐 경로를 가지는 비-천연 미생물 유기체(미국 등록특허 제7799545)에 관해 연구가 알려져 있다.
따라서 생산된 아미노카프론산의 신속하고 정확한 감지 및 정량 방법이 개발되면 아미노카프론산의 생합성을 위한 고속탐색을 통한 분자진화, 고효율 효소공정 개발, 새로운 미생물균주 개발 등에 효과적으로 이용될 수 있다. 하지만, 현재로서는 아미노카프론산 정량 및 검출은 전형적인 방법으로서 HPLC 및 LC-MS를 이용한 분석법만이 이용되고 있다(Wu YH et al. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 15;885-886:61-5, 2012). 이러한 분석기계를 통한 방법은 미량분석(최소 62.5 ng/㎖ = 0.47 mM)이 가능하지만 고가의 장비가 필요하고, 분석 전 불순물 및 효소, 세포성분의 제거를 위한 여과 및 전처리가 필요하다. 특히 분석시간이 길게 소요되고 단계가 복잡하여 하루 처리할 수 있는 샘플의 수가 최대 수백 개로서 효율적이지 않으며, 수백만 개 이상의 대량 시료를 단시간에 비교 분석해야 하는 생합성효소의 개량, 신규 효소 탐색 등 초고속 탐색의 목적으로 쓰기에는 매우 부적합하다.
본 발명자들은 이러한 기기분석의 한계를 극복할 수 있는 유전자재설계 세포를 활용한 다양한 화합물질을 감지하고 정량할 수 있는 기술을 개발한 바 있다(대한민국 등록특허 제1,222,056호, 대한민국 특허 출원 10-2013-0164442, 대한민국 특허출원 10-2012-0066846, PCT/KR2014/001360). 상기 선행발명들은, 세포 내에서 다양한 화합물을 감지할 수 있는 전사 조절인자를 이용하여 단일세포 내 미량 효소활성을 민감하게 감지하는 유전자회로를 구성하는 방법에 대한 것이다. 예를 들어 본 발명자들은 페놀계 화합물과 이소프렌류, 톨루엔류 및 벤젠류 화합물을 유전자회로의 형광 발현을 통해 감지할 수 있는 유전자회로를 개발하여 보고한바 있다(대한민국 등록특허 제1,222,056호). 이러한 유전자회로를 신규효소 탐색에 이용하게 되면, 환경이나 메타게놈 라이브러리를 비롯한 다양한 유전자 집단에서 유용유전자를 고속으로 획득할 수 있고, 화합물에 대한 민감도를 조절하여 표적효소 활성을 증가시키는 분자진화 연구 및 효소공정개발도 가능하다. 하지만 이러한 가능성에도 불구하고 중요 고분자원료인 아미노카프론산 화합물을 감지할 수 있는 유전자회로의 구성은 아직 알려진 바 없다.
이에, 본 발명자들은 아미노카프론산을 감지 및 정량할 수 있는 방법을 개발하고자 예의 노력한 결과, 수용액에서 아미노카프론산을 ε-카프로락탐으로 전환하는 메타게놈 유전자에서 수득한 신규 효소와 ε-카프로락탐을 감지하여 형광신호를 발생하는 유전자회로를 이용하여, 아미노카프론산을 감지하는 인공 유전자회로를 제작하고, 상기 재설계 유전자회로를 포함하는 미생물을 이용할 경우, 미량의 아미노카프론산을 초민감도로 감지 및 정량할 수 있는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 아미노카프론산을 감지하기 위한 재설계 유전자회로를 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 아미노카프론산을 감지하기 위한 재설계 유전자회로를 포함하는 아미노카프론산 감지용 재조합 미생물을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 아미노카프론산 감지용 재조합 미생물을 이용한 아미노카프론산 감지 및 정량방법을 제공하는데 있다.
상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 아미노카프론산으로부터 ε-카프로락탐으로 전환하는 단백질을 코딩하는 유전자; (b) ε-카프로락탐을 인지하는 NitR 단백질을 코딩하는 nitR 유전자; (c) 형광 단백질을 코딩하는 유전자 및 항생제 저항성 유전자로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 리포터 유전자; (d) 상기 nitR 유전자의 발현을 조절하는 프로모터; 및 (e) 상기 ε-카프로락탐을 인지한 NitR(단백질)이 결합하여 하류의 리포터 유전자의 발현을 유도하는 nitA 프로모터를 포함하는 아미노카프론산 감지용 재설계 유전자회로를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 아미노카프론산 감지용 재설계 유전자회로를 함유하는 아미노카프론산 감지용 재조합 미생물을 제공한다.
본 발명은 또한, (a) 상기 아미노카프론산 감지용 재조합 미생물과 아미노카프론산 함유가능성 있는 샘플을 접촉시키는 단계; 및 (b) 아미노카프론산을 감지하여 발현이 유도된 리포터 단백질의 활성을 분석하여 아미노카프론산의 존재 여부를 감지하는 단계를 포함하는 아미노카프론산의 감지 방법을 제공한다.
본 발명은 또한, (a) 상기 아미노카프론산 감지용 재조합 미생물과 아미노카프론산을 함유하는 샘플을 접촉시키는 단계; 및 (b) 상기 샘플 내에 존재하는 아미노카프론산에 의해 발현이 유도된 리포터 단백질의 활성을 분석하여, 샘플 내에 존재하는 아미노카프론산을 정량하는 단계를 포함하는 아미노카프론산의 정량 방법을 제공한다.
본 발명은 또한, (a) 상기 아미노카프론산 감지용 재조합 미생물과 메타게놈 라이브러리 샘플을 접촉시키는 단계; (b) 상기 샘플 내에 존재하는 아미노카프론산에 의해 발현이 유도된 리포터 단백질의 활성을 분석하여, 샘플 내에 아미노카프론산을 정량하는 단계; 및 (c) 아미노카프론산이 함유된 샘플에 함유된 균주를 아미노카프론산 생산균주로 선별하는 단계.를 포함하는 아미노카프론산 생산균주의 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 서열번호 1 또는 서열번호 28로 표시되는 수용액상에서 아미노카프론산으로부터 ε-카프로락탐으로 전환하는 단백질을 코딩하는 유전자 및 상기 유전자로 형질전환된 미생물을 제공한다.
본 발명은 또한, 서열번호 1 또는 서열번호 28로 표시되는 수용액상에서 아미노카프론산으로부터 ε-카프로락탐으로 전환하는 단백질을 코딩하는 유전자가 코딩하는 수용액상에서 아미노카프론산으로부터 ε-카프로락탐으로 전환하는 단백질 및 상기 단백질을 이용하여 아미노카프론산 을 ε-카프로락탐으로 전환하는 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 아미노카프론산을 인지하는 재설계 유전자회로는 아미노카프론산의 양에 비례하여 ε-카프로락탐을 만들고, ε-카프로락탐의 양에 비례하여 ε-카프로락탐 조절유전자가 형광단백질의 발현을 유도하도록 함으로써, 아미노카프론산을 빠르게 감지 및 정량화할 수 있어, 아미노카프론산의 정량적 분석 및 아미노카프론산 생합성 효소의 활성 분석 등의 목적에 이용할 수 있는 효과가 있다. 본 발명을 통해 10 μM 정도의 극미량의 아미노카프론산도 고감도로 감지 가능하며, 기존에는 불가능하였던 세포 단위의 분석이 가능하므로, 고속 탐색을 통해 자연계 미생물 메타게놈 라이브러리로부터 신규 아미노카프론산 생산 균주 및 유전자를 탐색하는 과정에도 본 발명의 효율적 이용이 가능하다.
도 1은 본 발명에 따른 아미노카프론산 감지용 재설계 유전자회로(ACA-GESS)를 함유하는 미생물을 나타낸 모식도이다.
도 2는 본 발명에 따른 아미노카프론산 감지용 재설계 유전자회로(ACA-GESS) 의 여러 농도의 아미노카프론산에 대한 감도를 검증하기 위하여 형광 플레이트 리더로 측정한 결과이다.
도 3은 본 발명의 아미노카프론산의 감지 및 정량 능력을 향상시키기 위한 T7-ACA-GESS 유전자 재설계 회로를 함유하는 미생물을 나타낸 모식도이다.
도 4a 및 4b는 본 발명의 아미노카프론산의 감지 및 정량 능력을 향상 시키기 위한 T7-ACA-GESS 유전자 재설계 회로를 구축하는 내용을 나타낸 모식도이다.
도 5는 실시예 5의 형질전환체(2 플라스미드 시스템)의 아미노카프론산에 대한 감도 평가를 나타낸 그래프이다.
도 6은 실시예 6의 형질전환체(1 플라스미드 시스템)의 아미노카프론산에 대한 감도 평가를 나타낸 그래프이다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법 및 이하에 기술하는 실험 방법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명은 (a) 아미노카프론산으로부터 ε-카프로락탐으로 전환하는 단백질을 코딩하는 유전자; (b) ε-카프로락탐을 인지하는 NitR 단백질을 코딩하는 nitR 유전자; (c) 형광 단백질을 코딩하는 유전자 및 항생제 저항성 유전자로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 리포터 유전자; (d) 상기 nitR 유전자의 발현을 조절하는 프로모터; 및 (e) 상기 ε-카프로락탐을 인지한 NitR(단백질)이 결합하여 하류의 리포터 유전자의 발현을 유도하는 nitA 프로모터를 포함하는 아미노카프론산 감지용 재설계 유전자회로에 관한 것이다.
본 발명은 [(a) 아미노카프론산으로부터 ε-카프로락탐으로 전환하는 단백질을 코딩하는 유전자가 chromosomal DNA에 삽입된 형질전환체]; 및 [(b) ε-카프로락탐을 인지하는 NitR 단백질을 코딩하는 nitR 유전자; (c) 형광 단백질을 코딩하는 유전자 및 항생제 저항성 유전자로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 리포터 유전자; (d) 상기 nitR 유전자의 발현을 조절하는 프로모터; 및 (e) 상기 ε-카프로락탐을 인지한 NitR(단백질)이 결합하여 하류의 리포터 유전자의 발현을 유도하는 nitA 프로모터를 포함하는 카프로락탐 감지용 재설계 유전자회로]를 포함하는 아미노카프론산 감지용 재설계 유전자회로에 관한 것이다.
본 발명은 재설계 유전자회로를 이용하여 다양한 화합물을 감지하여, 결국 다양한 화합물 합성 효소 활성을 고감도로 간편하게 감지하는 기술(GESS: Green fluorescence linked enzyme screening system)(대한민국 등록특허 제1,222,056호)를 응용하여, 아미노카프론산 감지 및 정량에 적용한 것으로, 아미노카프론산의 정량을 효율적으로 신속하고 고감도로 분석할 수 있는 방법이다.
본 발명의 합성 유전자회로는 아미노카프론산을 ε-카프로락탐으로 전환하는 단백질을 코딩하는 유전자와 전환된 ε-카프로락탐을 인지하는 NitR 단백질을 코딩하는 nitR 유전자와 그 결합부위인 nitA 프로모터로 구성되며, 아미노카프론산의 양에 비례하여 이와 반응한 NitR 단백질이 nitA 프로모터의 전사 조절을 매개하여 형광단백질의 발현을 유도하도록 함으로써, 최종적으로 아미노카프론산을 정량적으로 분석 가능한 재설계 유전자회로라고 할 수 있다. 도 1에서 보는 바와 같이 아미노카프론산으로쿠터 ε-카프로락탐을 전환하고, ε-카프로락탐은 NitR 단백질의 대표적인 기질로써, 본 발명에서 제작한 아미노카프론산 감지 유전자회로에 의해 아미노카프론산의 정량적인 형광 분석을 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 아미노카프론산으로부터 ε-카프로락탐으로 전환하는 단백질은 수용액 상에서 전환효율을 가지는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 따른 아미노카프론산 분석 방법은 수용액상에서 아미노카프론산으로부터 ε-카프로락탐으로 전환하는 유전자와 아미노카프론산으로부터 생성되는 ε-카프로락탐을 감지 및 정량하기 위한 재설계 유전자회로가 필요하다. 이러한 유전자회로는 ε-카프로락탐을 감지 및 정량 기술(대한민국 특허 출원 번호 10-2013-0138399)를 활용하여, 새로운 감지 미생물을 구축하였다(도 1). 본 발명의 가장 중요한 일 양태에서는 수용액상에서 아미노카프론산으로부터 ε-카프로락탐으로 전환하는 단백질을 코딩하는 신규 유전자를 갯벌 유래의 메타게놈에서 확보하여 본 유전자회로 이용 감지기술의 핵심 부품으로 개발하고 있다. 또한, 상기 메타게놈으로부터 신규 카프로락탐 전환효소를 발굴하여, 이를 본 유전자회로 이용 감지기술의 핵심 부품으로 개발하고 있다.
상기 (a) 아미노카프론산으로부터 ε-카프로락탐으로 전환하는 단백질을 코딩하는 유전자는 미생물 내에서 나머지 (b) 내지 (e)의 구성들과 독립되어 존재할 수 있고, 메타게놈의 형태, 나머지 구성들과 다른 발현벡터에 클로닝된 형태, 또는 미생물의 염색체 DNA에 삽입된 형태로 존재할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 수용액상에서 아미노카프론산으로부터 ε-카프로락탐으로 전환하는 메타게놈 유래 신규단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 1 또는 서열번호 28로 표시되고, 메타게놈 유래 신규단백질은 서열번호 29의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 그러나, 본 발명의 (a) 아미노카프론산으로부터 ε-카프로락탐으로 전환하는 단백질을 코딩하는 유전자는 상기 서열에 한정되지 않고, 아미노카프론산을 카프로락탐으로 전환하는 기능이 있는 효소를 암호화하는 유전자이면 특별한 제한없이 모두 본 발명에 이용될 수 있다. 상기 nitR 유전자는 Alcaligenes faecalis JM3 유래로서 서열번호 2로 표시되며, 상기 nitA 프로모터 유전자는 Alcaligenes faecalis JM3 유래로서 서열번호 3으로 표시되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 수용액상에서 아미노카프론산으로부터 ε-카프로락탐으로 전환하는 메타게놈 유래 신규단백질로부터 합성되는 ε-카프로락탐을 인지하는 NitR 단백질이 결합하여 하류의 리포터 유전자의 발현을 유도하는 nitA 프로모터가 포함된 부위는 상기 NitR 단백질이 결합하여 하류의 리포터 유전자가 발현될 수 있도록 리포터유전자의 프로모터를 활성화하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 수용액상에서 아미노카프론산으로부터 ε-카프로락탐으로 전환하는 메타게놈 유래 신규 유전자와 그에 따른 ε-카프로락탐을 인식하는 nitR 유전자를 코딩하는 유전자와 상기 NitR 단백질의 발현을 조절하는 프로모터는 상호작동가능하게 연결되어 있는 것을 특징으로 할 수 있다.
Rhodococcus rhodochrous J1 의 니트릴라아제(NitA, nitrilase)는 ε-카프로락탐에 의해 하위 유전자의 발현이 활성화된다고 보고되어 있고, 이는 니트릴(nitrile)분해 오페론의 조절단백질인 NitR이 세포 내에 투과된 ε-카프로락탐을 인식하여 NitA 전사를 조절하는 nitA 프로모터를 활성화 시키는 과정에 의한 것으로 확인 되었다.
또한, R. rhodochrous J1 유래 nitR-PnitA 전사조절 인자는 Streptomyces 종에 이종 재조합되어 목적 단백질의 과발현 유도를 위한 발현 시스템에 적용되었으며, 외부에서 첨가된 ε-카프로락탐에 의해 nitA 프로모터 하류에 존재하는 목적 유전자의 발현이 효과적으로 과발현 된다는 보고가 있다.
상기 nitR-PnitA 전사조절 인자는 상보적인 서열 분석에 의하여 XylS/AraC 형태의 전사조절 인자군으로 분류된다. XylS/AraC 전사조절군은 활성형 인자로서 C-말단부에 상보적인 Helix-turn-Helix 서열이 존재하여 특정 유전서열을 인식하여 결합하며 이량체로 역할을 하는 것을 특징으로 한다. 일반적으로 특정 유전서열에 결합되어 해당하는 유전자를 구조적/물리적으로 제한을 주어 전사발현을 저해하다가 목적 인자가 인식되면 유전자의 구조적인 풀어주어 전사발현을 개시하도록 하는 특징을 갖는다.
상기 nitR 유전자 및 nitA 프로모터는 나이트릴레이즈(nitrilase) 활성이 있는 균주 유래의 nitR 유전자 및 nitA 프로모터인 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 나이트릴레이즈(nitrilase) 활성이 있는 균주는 Aeribacillus pallidus, A. pallidus DAC521, A. pallidus RAPc8, Arabidopsis thaliana, Arthrobacter sp., Arthrobacter sp. J-1, Alcaligenes faecalis, A. faecalis JM3, A. faecalis ATCC 8750, A. faecalis MTCC 10757, A. faecalis MTCC 126, Alcaligenes sp., Alcaligenes sp. ECU0401, Aspergillus niger, A. niger K10, Fusarium solani, F. solani IMI 196840, F. solani O1, Mus musculus, Sorghum bicolor, Homo sapiens, Acidovorax facilis, A. facilis 72W, Acinetobacter sp., Agrobacterium sp., Arabis hirsuta, Bacillus subtilis, B. subtilis E9, Bacillus sp., Bacillus sp. OxB-1, Bacillus sp. UG-5B, Bradyrhizobium japonicum, B. japonicum USDA110, Brassica napus, B. rapa, B. rapa subsp. pekinensis, Comamonas testosteroni, Fusarium oxysporum, F. oxysporum f. sp. melonis, Gibberella moniliformis, Halomonas sp. alphaCH3, Hordeum vulgare, Klebsiella pneumoniae, K. pneumoniae subsp. ozaenae, Nocardia. globerula, N.globerula NHB-2, Nocardia sp., Penicillium marneffei, P. multicolor, Pseudomonas fluorescens, P. fluorescens 11387, P. fluorescens EBC 191, P. putida, P. putida 11388, P. putida MTCC 5110, Pseudomonas sp., Rhizobium sp. 11401, Rhodobacter sphaeroides, R. sphaeroides LHS-305, Rhodococcus equi, R.equi CCTCC.M.205114, R. fascians, R. fascians MTCC-1531, R. rhodochrous, R.rhodochrous ATCC 33278, R. rhodochrous ATCC 39484, R. rhodochrous J1, R.rhodochrous K22, R. rhodochrous MTCC-291, R. rhodochrous PA-34, R.rhodochrous tg1-A6, Rhodococcus sp., Rhodococcus sp. ATCC39484, Rhodococcus sp. NCIMB 11215, Rhodococcus sp. NCIMB 11216, Rhodococcus sp. NDB 1165, Sorghum bicolor, Synechocystis sp., Synechocystis sp. PCC6803 및 Zea mays일 수 있다.
본 발명의 일 양태에서는 NitR 단백질을 코딩하는 nitR 유전자와 nitA 프로모터는 Alcaligenes faecalis JM3 유래의 것을 사용하였다. A. faecalis JM3 유래 nitR-PnitA 시스템은 상기 R. rhodochrous J1 유래의 유전자와 동일하게 ε-카프로락탐에 의한 발현조절이 되며 이종인 대장균 내에서도 안정적으로 효과가 유지된다는 보고가 있어, 본 발명에서는 ε-카프로락탐을 감지하는 유전자 회로에 적용하였다. 하지만 본 발명에 있어서, A. faecalis JM3 유래 nitR-PnitA 시스템으로만 제한하는 것은 아니며, 사용가능한 ε-카프로락탐을 감지 할 수 있는 조절 단백질은 나이트릴레이즈가 보고 되어 있는 균주의 조절 단백질로도 사용 될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 형광단백질은 GFP, GFPUV, sfGFP 및 RFP로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 항생제 저항성 유전자는 엠피실린 저항성 유전자, 카나마이신 저항성 유전자, 클로람페니콜 저항성 유전자 및 테트라사이클린 저항성 유전자로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 재설계 유전자회로는 RBS(ribosome binding site)를 코딩하는 유전자를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 리포터 유전자는 형광 단백질을 코딩하는 유전자 및 항생제 저항성 유전자로 구성된 이중 리포터 유전자인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 재설계 유전자회로는, 상기 프로모터뿐만 아니라, 바람직하게는, 리포터 단백질의 발현을 용이하게 해주는 RBS(Ribosome Binding Site) 및/또는 전사종결인자를 포함할 수 있다. 즉, 상기 조절 단백질의 발현을 조절하는 부위로써, 상기 프로모터 이외에도 RBS 및/또는 전사종결인자를 포함할 수 있는 것이다.
일반적으로 단백질의 발현은 mRNA에서 개시코돈인 AUG(메티오닌) 혹은 GUG(발린)에서 시작하는데, 리보좀이 단백질 내부의 잔기에 위치한 AUG 혹은 GUG와 단백질 개시코돈으로서의 AUG와 GUG의 구분은 DNA의 퓨린 염기가 풍부한 RBS(또는 샤인-달가노 연속부분; Shine-Dalgarno(SD) sequence)에 의하여 결정되며 이 RBS는 종마다 서열이 차이가 나는 것으로 알려져 있다. 본 발명에서 숙주인 대장균에서 리포터 단백질의 발현을 용이하게 하기 위하여 대장균용 RBS(RBSε), 또는 모든 균주에 통합적으로 사용가능한 RBS(RBSx)를 사용할 수 있으며, 본 발명의 일 실시예로서 T7 RBS 또한 사용가능할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 전사종결인자는, 바람직하게는, rrnBT1T2 또는 tL3일 수 있고, 이것 이외에도, 당업계에서 통상적으로 사용되는 여하한 전사종결인자를 사용하여 본 발명을 구성할 수 있다.
본 발명에서 리포터는 형광단백질 및 항생제 저항성 유전자로부터 선택된 하나 이상일 수 있다. 형광단백질로는 바람직하게 GFP, GFPUV, sfGFP 또는 RFP를 사용할 수 있고, 본 발명의 목적을 달성할 수 있는 한 본 발명에 사용할 수 있는 형광 단백질은 이러한 예에 한정되지 않는다. 또한, 상기 항생제 저항성 유전자는 엠피실린 저항성 유전자, 카나마이신, 클로람페니콜, 테트라사이클린 등 항생제에 저항성인 유전자 등 통상의 항생제 저항성 유전자를 사용할 수 있다.
본 발명의 일 구체 예로써, 리포터는 형광단백질과 항생제 저항성 유전자 둘 모두로 구성된 이중리포터(dual reporter), 둘 이상의 리포터로 구성된 다중 리포터일 수 있다.
용어 "벡터(vector)"는 적합한 숙주 내에서 DNA를 발현시킬 수 있는 적합한 조절 서열에 작동가능하게 연결된 DNA 서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다.
벡터는 플라스미드, 파지 입자, 또는 간단하게 잠재적 게놈 삽입물일 수 있다. 적당한 숙주로 형질전환 되면, 벡터는 숙주 게놈과 무관하게 복제하고 기능할 수 있거나, 또는 일부 경우에 게놈 그 자체에 통합될 수 있다. 플라스미드가 현재 벡터의 가장 통상적으로 사용되는 형태이므로, 본 발명의 명세서에서 "플라스미드(plasmid)" 및 "벡터(vector)"는 때로 상호 교환적으로 사용된다. 그러나, 본 발명은 당업계에 알려진 또는 알려지게 되는 바와 동등한 기능을 갖는 벡터의 다른 형태를 포함한다. 포유동물 세포 배양물 발현을 위한 전형적인 발현 벡터는 예를 들면 pRK5(EP 307,247호), pSV16B(WO 91/08291호) 및 pVL1392(Pharmingen)을 기초로 한다.
"발현 조절 서열(expression control sequence)"이라는 표현은 특정한 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열의 발현에 필수적인 DNA 서열을 의미한다.
그러한 조절 서열은 전사를 실시하기 위한 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함한다. 예를 들면, 원핵생물에 적합한 조절 서열은 프로모터, 임의로 오퍼레이터 서열 및 리보좀 결합 부위를 포함한다. 진핵 세포는 프로모터, 폴리아데닐화 시그날 및 인핸서가 이에 포함된다. 플라스미드에서 유전자의 발현 양에 가장 영향을 미치는 인자는 프로모터이다. 고 발현용의 프로모터로서 SRα 프로모터와 사이토메가로바이러스(cytomegalovirus) 유래 프로모터 등이 바람직하게 사용된다.
본 발명의 DNA 서열을 발현시키기 위하여, 매우 다양한 발현 조절 서열중 어느 것이라도 벡터에 사용될 수 있다. 유용한 발현 조절서열의 예에는, 예를 들어, SV40 또는 아데노바이러스의 초기 및 후기 프로모터들, lac 시스템, trp 시스템, TAC 또는 TRC 시스템, T3 및 T7 프로모터들, 파지 람다의 주요 오퍼레이터 및 프로모터 영역, fd 코드 단백질의 조절 영역, 3-포스포글리세레이트 키나제 또는 다른 글리콜분해 효소에 대한 프로모터, 상기 포스파타제의 프로모터들, 예를 들어 Pho5, 효모 알파-교배 시스템의 프로모터 및 원핵세포 또는 진핵 세포 또는 이들의 바이러스의 유전자의 발현을 조절하는 것으로 알려진 구성과 유도의 기타 다른 서열 및 이들의 여러 조합이 포함된다. T7 RNA 폴리머라아제 프로모터 Φ10은 이. 콜라이에서 단백질 NSP를 발현시키는데 유용하게 사용될 수 있다.
핵산은 다른 핵산 서열과 기능적 관계로 배치될 때 "작동가능하게 연결(operably linked)"된다. 이것은 적절한 분자(예를 들면, 전사 활성화 단백질)은 조절 서열(들)에 결합될 때 유전자 발현을 가능하게 하는 방식으로 연결된 유전자 및 조절 서열(들)일 수 있다. 예를 들면, 전서열(pre-sequence) 또는 분비 리더(leader)에 대한 DNA는 폴리펩타이드의 분비에 참여하는 전단백질로서 발현되는 경우 폴리펩타이드에 대한 DNA에 작동가능하게 연결되고; 프로모터 또는 인핸서는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩서열에 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보좀 결합 부위는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보좀 결합 부위는 번역을 용이하게 하도록 배치되는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 일반적으로, "작동가능하게 연결된"은 연결된 DNA 서열이 접촉하고, 또한 분비 리더의 경우 접촉하고 리딩 프레임 내에 존재하는것을 의미한다. 그러나, 인핸서(enhancer)는 접촉할 필요가 없다. 이들 서열의 연결은 편리한 제한 효소 부위에서 라이게이션(연결)에 의해 수행된다. 그러한 부위가 존재하지 않는 경우, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터(oligonucleotide adaptor) 또는 링커(linker)를 사용한다.
본원 명세서에 사용된 용어 "발현 벡터"는 통상 이종의 DNA의 단편이 삽입된 재조합 캐리어(recombinant carrier)로서 일반적으로 이중 가닥의 DNA의 단편을 의미한다. 여기서, 이종 DNA는 숙주 세포에서 천연적으로 발견되지 않는 DNA인 이형 DNA를 의미한다. 발현 벡터는 일단 숙주 세포내에 있으면 숙주 염색체 DNA와 무관하게 복제할 수 있으며 벡터의 수 개의 카피 및 그의 삽입된(이종) DNA가 생성될 수 있다.
당업계에 주지된 바와 같이, 숙주세포에서 형질감염 유전자의 발현 수준을 높이기 위해서는, 해당 유전자가, 선택된 발현 숙주 내에서 기능을 발휘하는 전사 및 해독 발현 조절 서열에 작동가능하도록 연결되어야만 한다. 바람직하게는 발현 조절서열 및 해당 유전자는 세균 선택 마커 및 복제 개시점(replication origin)을 같이 포함하고 있는 하나의 발현 벡터 내에 포함되게 된다. 발현 숙주가 진핵 세포인 경우에는, 발현 벡터는 진핵 발현 숙주 내에서 유용한 발현 마커를 더 포함하여야만 한다.
다른 관점에서, 본 발명은 상기 아미노카프론산 감지용 재설계 유전자회로를 함유하는 아미노카프론산 감지용 재조합 미생물에 관한 것이다.
본 발명에서, 상기 유전자회로가 도입되는 숙주 미생물은 대장균, 슈도모나스, 효모, 식물세포, 동물세포 등을 사용할 수 있다.
본 발명에 따르면 아미노카프론산 감지 재설계 유전자회로를 적합한 미생물 숙주내로 형질전환(transformation)시키는 데, 형질전환의 효율을 높이기 위해서, 바람직하게 전기천공법(electroporation)을 사용할 수 있다.
상술한 발현 벡터에 의해 형질전환 또는 형질 감염된 숙주 세포는 본 발명의 또 다른 측면을 구성한다. 본원 명세서에 사용된 용어 "형질전환"은 DNA를 숙주로 도입하여 DNA가 염색체외 인자로서 또는 염색체 통합완성에 의해 복제가능하게 되는 것을 의미한다. 본원 명세서에 사용된 용어 "형질감염"은 임의의 코딩 서열이 실제로 발현되든 아니든 발현 벡터가 숙주 세포에 의해 수용되는 것을 의미한다.
발명의 숙주 세포는 원핵 또는 진핵생물 세포일 수 있다. 또한, DNA의 도입 효율이 높고, 도입된 DNA의 발현효율이 높은 숙주가 통상 사용된다. 이. 콜라이, 슈도모나스, 바실러스, 스트렙토마이세스, 진균, 효모와 같은 주지의 진핵 및 원핵 숙주들, 스포도프테라 프루기페르다(SF9)와 같은 곤충 세포, CHO 및 생쥐 세포같은 동물 세포, COS 1, COS 7, BSC 1, BSC 40 및 BMT 10과 같은 아프리카 그린 원숭이 세포, 및 조직배양된 인간 세포는 사용될 수 있는 숙주 세포의 예이다. 본 발명의 NSP 단백질을 코딩하는 cDNA를 클로닝할 때에는 동물세포를 숙주로 하는 것이 바람직하다. 본 발명에서는 어류 기원의 CHSE-214, FHM, RTG-2 및 EPC를 예시하였으나 물론 이에 제한되는 것은 아니다. COS 세포를 이용하는 경우에는 COS 세포에서 SV40 라지 T안티겐(large T antigen)이 발현하고 있으므로 SV40의 복제개시점을 갖는 플라스미드는 세포중에서 다수 카피(copy)의 에피솜(episome)으로 존재하도록 되고 통상보다 고 발현이 기대될 수 있다. 도입된 DNA 서열은 숙주 세포와 동일한 종으로부터 얻을 수 있거나, 숙주 세포와 다른 종의 것일 수 있거나, 또는 그것은 어떠한 이종 또는 상동성 DNA를 포함하는 하이브리드 DNA 서열일 수 있다.
물론 모든 벡터와 발현 조절 서열이 본 발명의 DNA 서열을 발현하는데 모두 동등하게 기능을 발휘하지는 않는다는 것을 이해하여야만 한다. 마찬가지로 모든 숙주가 동일한 발현 시스템에 대해 동일하게 기능을 발휘하지는 않는다. 그러나 당업자라면 과도한 실험적 부담 없이 본 발명의 범위를 벗어나지 않는 채로 여러 벡터, 발현 조절 서열 및 숙주 중에서 적절한 선택을 할 수 있다. 예를 들어, 벡터를 선택함에 있어서는 숙주를 고려하여야 하는데, 이는 벡터가 그 안에서 복제되어야만 하기 때문이다. 벡터의 복제 수, 복제 수를 조절할 수 있는 능력 및 당해 벡터에 의해 코딩되는 다른 단백질, 예를 들어 항생제 마커의 발현도 또한 고려되어야만 한다. 발현 조절 서열을 선정함에 있어서도, 여러 가지 인자들을 고려하여야만 한다. 예를 들어, 서열의 상대적 강도, 조절가능성 및 본 발명의 DNA 서열과의 상용성 등, 특히 가능성있는 이차 구조와 관련하여 고려하여야 한다. 단세포 숙주는 선정된 벡터, 본 발명의 DNA 서열에 의해 코딩되는 산물의 독성, 분비 특성, 단백질을 정확하게 폴딩시킬 수 있는 능력, 배양 및 발효 요건들, 본 발명 DNA 서열에 의해 코딩되는 산물을 숙주로부터 정제하는 것의 용이성 등의 인자를 고려하여 선정되어야만 한다. 이들 변수의 범위 내에서, 당업자는 본 발명의 DNA 서열을 발효 또는 대규모 동물 배양에서 발현시킬 수 있는 각종 벡터/발현 조절 서열/숙주 조합을 선정할 수 있다. 발현 클로닝에 의해 NSP 단백질의 cDNA를 클로닝 하려고 할 때의 스크리닝법으로서 바인딩법(binding법), 페닝법(panning법), 필름에멀션법(film emulsion 법)등이 적용될 수 있다.
본 발명의 정의상 "실질적으로 순수한"이란 본 발명에 따른 폴리펩타이드 및 폴리펩타이드를 코딩하는 DAN 서열이 박테리아로부터 유래된 다른 단백질을 실질적으로 포함하지 않는 것을 의미한다.
재조합 단백질을 발현하기 위한 숙주세포는 짧은 시간 내 고농도 균체 배양이 가능하고 유전자 조작이 용이하고 유전학적, 생리적 특징이 잘 밝혀져 있는 대장균(Escherichia coli), 고초균(Bacillus subtillis) 등과 같은 원핵세포가 널리 이용되어 왔다. 그러나, 단백질의 번역 후 수식(post-translational modification), 분비과정 및 활성형의 3차원 구조, 단백질의 활성상태의 문제점들을 해결하기 위해 최근 단세포 진핵세포인 효모 계열(Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae, Hansenula polymorpha 등), 사상성 진균류(filamentous fungi), 곤충세포(insect cells), 식물세포, 포유동물세포(mammalian cells) 등 고등생물에 이르기까지 재조합 단백질 생산의 숙주세포로 활용하고 있으므로, 실시예에서 예시된 대장균 뿐만 아니라 다른 숙주세포를 이용하는 것은 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 용이하게 적용가능하다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 (a) 아미노카프론산으로부터 ε-카프로락탐으로 전환하는 단백질을 코딩하는 유전자; (b) ε-카프로락탐을 인지하는 NitR 단백질을 코딩하는 nitR 유전자; (c) 형광 단백질을 코딩하는 유전자 및 항생제 저항성 유전자로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 리포터 유전자; (d) 상기 nitR 유전자의 발현을 조절하는 프로모터; 및 (e) T7 RNA 폴리머라아제에 의하여 활성화되고, 상기 리포터 유전자의 발현을 유도하는 T7 프로모터를 함유하는 유전자 회로를 포함하고, T7 RNA 폴리머라아제를 코딩하는 유전자와 ε-카프로락탐을 인지한 NitR 단백질이 결합하여, 하류의 T7 RNA 폴리머라아제를 코딩하는 유전자의 발현을 유도하는 nitA 프로모터가 염색체 상에 삽입되어 있는 아미노카프론산 감지용 재조합 미생물에 관한 것이다.
본 발명의 감지신호를 획기적으로 증폭하는 일 양태로서 상기 아미노카프론산 감지용 재조합 미생물의 감지 능력을 향상시키기 위하여 유전자회로를 하기와 같이 개선하였다. 즉, 숙주세포의 염색체 상에, 상기 NitR 단백질의 발현을 조절하는 nitA 프로모터하위에 T7 RNA polymerase를 삽입하여 염색체 DNA에서 발현하도록 하고, 상기 아미노카프론산으로부터 ε-카프로락탐으로 전환하는 유전자와 그에 따른 ε-카프로락탐을 인식하는 nitR 유전자를 코딩하는 유전자, 형광단백질 상위에 T7 promoter을 코딩하여 상호작동가능하게 연결되어 있는 것을 특징으로 할 수 있다(도 4). 더욱 자세하게는 아미노카프론산에 의하여 생성되는 ε-카프로락탐에 의하여 NitR 단백질이 발현하고, 이에 따라 숙주세포의 염색체 DNA 에 있는 nitA 프로모터에 의해 T7 RNA polymerase가 발현된다. 발현된 T7 RNA polymerase에 의해 T7 promoter가 활성화되어 결국 하위 유전자인 sfGFP 형광 단백질이 발현된다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 (a) 상기 아미노카프론산 감지용 재조합 미생물과 아미노카프론산 함유가능성 있는 샘플을 접촉시키는 단계; 및 (b) 아미노카프론산을 감지하여 발현이 유도된 리포터 단백질의 활성을 분석하여 아미노카프론산의 존재 여부를 감지하는 단계를 포함하는 아미노카프론산의 감지 방법에 관한 것이다.
또 다른 관점에서 본 발명은 (a) 상기 아미노카프론산 감지용 재조합 미생물과 아미노카프론산을 함유하는 샘플을 접촉시키는 단계; 및 (b) 상기 샘플 내에 존재하는 아미노카프론산에 의해 발현이 유도된 리포터 단백질의 활성을 분석하여, 샘플 내에 존재하는 아미노카프론산을 정량하는 단계를 포함하는 아미노카프론산의 정량 방법에 관한 것이다.
본 발명에서, 상기 리포터 단백질의 활성 측정은 미생물 콜로니 이미지 분석, 형광스펙트럼 분석, 형광유세포분석(FACS), 항생제 내성 측정법을 이용하여 측정할 수 있다.
본 발명에 따르면, 상기 유전자회로로 형질전환된 미생물은 아미노카프론산을 감지할 수 있는 감지 미생물(sensing microorganism)이 된다. 바람직하게는, 감지 반응을 최적화하기 위하여 세포생장-재설계 유전자회로의 활성화 단계가 분리되도록 기질 첨가시기를 조절할 수 있다. 예를 들어, 기질 처리 단계는 영양배지에서 성장된 건강한 미생물을 회수하는 단계 및 회수된 미생물을 최소배지에서 기질로 처리하는 단계로 이루어질 수 있다.
상기 영양 배지 또는 최소배지는 기술 분야에 일반적으로 사용될 수 있는 다양한 배지가 적용 가능할 것이다.
바람직하게는, 형질전환된 미생물의 세포 성장(OD600)이 약 0.4 ∼ 0.6 사이일 때 기질을 처리하여 효소 활성화반응을 최적화할 수 있고, 더욱 바람직하게는 활성화반응을 16 ∼ 24시간 진행시켜 효소반응을 최적화할 수 있다.
아미노카프론산을 감지하는 재설계 유전자회로를 함유한 재조합 미생물에 임의의 아미노카프론산을 처리하면 세포내 효소유전자의 기능 및 활성도에 따라서 상기 화합물의 농도가 변화하게 된다. 따라서 아미노카프론산의 발현유도 기능에 의한 형광, 항생제저항성 등 리포터의 정량적 증가를 형광분석기, 항생제저항성 등 다양한 측정기술을 이용하여 탐색하면 세포내외의 아미노카프론산을 고감도로 감지 및 정량할 수 있는 새로운 측정방법을 제공하게 된다.
또한, 본 발명에서 리포터로 사용되는 형광단백질, 항생제저항성 단백질은 고도의 민감성 측정방법을 적용할 수 있을 뿐만 아니라, 세포막을 통과하지 않고 특정세포 내부에 한정되므로 그 세포 내에서 발현되는 외래 유전자의 특성을 개별적으로 발휘하게 된다. 따라서 하나하나의 세포(single cell)가 독립적인 반응조 및 분석기의 역할을 수행하게 되므로 효소반응에 의해 유리된 아미노카프론산을 감지하여 발현이 유도된 리포터의 활성을 측정하는 수단으로 수백-수천만 개의 대량 시료를 형광유세포분석기(FACS), 미세콜로니 형광이미지분석, 형광스펙트럼분석, 항생제 선택배지를 이용한 대량탐색 등을 이용하여 측정할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 본 발명에서 구축한 재설계 유전자회로의 시스템 검증 및 아미노카프론산 에 대한 정량적 신호 분석하기 위하여, 아미노카프론산으로부터 ε-카프로락탐이 전환되는 유전자(메타게놈의 형태, 3HBD를 별도의 발현벡터에 클로닝한 형태, 3HBD를 대장균의 chromosomal DNA에 삽입한 형태)와 CL-GESS(대한민국 특허 출원 번호 10-2013-0138399)를 함께 도입한 대장균 DH5α을 아미노카프론산(6-aminocaproic acid)이 포함된 액체 배지에 도말하여 형광발현정도를 측정한 결과, 도 2, 도 5 및 도 6에서 보는 바와 같이 아미노카프론산이 포함된 배지에서 아미노카프론산의 농도별로 형광값이 관찰되는 것을 확인하였다(도 2, 도 5 및 도 6).
또 다른 관점에서, 본 발명은 (a) 상기 아미노카프론산 감지용 재조합 미생물과 메타게놈 라이브러리 샘플을 접촉시키는 단계; (b) 상기 샘플 내에 존재하는 아미노카프론산에 의해 발현이 유도된 리포터 단백질의 활성을 분석하여, 샘플 내에 아미노카프론산을 정량하는 단계; 및 (c) 아미노카프론산이 함유된 샘플에 함유된 균주를 아미노카프론산 생산균주로 선별하는 단계를 포함하는 아미노카프론산 생산균주의 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 아미노카프론산 감지용 재조합 미생물과 상기 메타게놈 라이브러리 샘플을 접촉시키는 단계는 메타게놈 라이브러리의 균주와 아미노카프론산 감지용 재조합 미생물을 공배양하거나, 상기 아미노카프론산 감지용 재조합 미생물에 상기 메타게놈 라이브러리에 포함된 균주의 배양액을 처리하여 수행할 수 있다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 수용액상에서 아미노카프론산으로부터 ε-카프로락탐으로 전환하는 단백질을 코딩하는 유전자 및 상기 유전자로 형질전환된 미생물에 관한 것이다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 수용액상에서 아미노카프론산으로부터 ε-카프로락탐으로 전환하는 단백질을 코딩하는 유전자가 코딩하는 아미노카프론산으로부터 ε-카프로락탐으로 전환하는 단백질 및 상기 단백질을 이용하여 아미노카프론산 을 ε-카프로락탐으로 전환하는 방법에 관한 것이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
[실시예 1]
재설계 유전자회로의 구축
본 발명은 효소에 의해 다양한 전구체로부터 생성되는 아미노카프론산을 감지하기 위한 재설계 유전자회로를 구축하기 위해, 선행연구에서 얻어진 CL-GESS 유전자회로(대한민국 특허 출원 번호 10-2013-0138399)와 아미노카프론산로부터 ε-카프로락탐을 전환하는 유전자를 포함하는 유전자회로를 숙주세포에 공동 형질전환을 하였다(도 1).
먼저, CL-GESS는 를 구축하기 위한 유전자 클로닝 과정은 다음과 같다. 먼저 선행연구를 통해 구축한 GESS 플라스미드를 기반으로 기질분해효소 조절 유전자(dmpR) 및 리포터 발현을 위한 프로모터 부분을 Alcaligenes faecalis JM3 유래의 nitR 유전자로 치환하기 위해 리컴비니어링(recombineering) 방법을 도입하였다.
먼저, GESS 플라스미드인 pGESS-T2는 대한민국 공개특허 제2010-0131995호에 기재된 방법으로 제작하였으며, 제작방법은 다음과 같다.
pHCEIIB 벡터(바이오리더스, 한국)로부터 425bp의 rrnBT1T2전사종결인자를 서열번호 4와 5 프라이머로 PCR 반응하여 증폭하고, pGESS-T1으로부터 dmpR과 dmp operator promoter 영역, 그리고 GFP 리포터 단백질 부분의 2,831bp의 PCR 산물을 서열번호 6와 7의 프라이머로 증폭한후 GFP 리포터 단백질의 C-말단에 상동성 재조합 방법으로 삽입하였다. 이렇게 구성된 pGESS-T1-1은 5,901bp로 구성되며 pGESS-T1의 리포터 단백질에 전사종결인자가 삽입된 형태의 클론이다. pGESS-T1-1을 EcoRI으로 절단한 후 pKD46 벡터로부터 서열번호 8과 9 프라이머로 PCR 증폭한 tL3 전사종결인자를 dmpR의 C-말단에 라이게이션시키고 전기천공법으로 대장균에 도입시켜 최종적으로 6,171bp의 pGESS-T2를 구성하였다,
서열번호 4: 5'-ATGGACAAGCTGTACAAGTAAGCTTCTGTTTTGGCGGATGAGAGAAGA -3'
서열번호 5: 5'-AGCGGATAACAATTTCACACAGAAACAGCTATGACCATGATTACGCCAAGAGTTTGTAGAAACGCAAAAAGG-3'
서열번호 6: 5'-TCTCTCATCCGCCAAAACAGGAATTCCTAGCCTTCGATGCCGATTT-3'
서열번호 7: 5'-TCTTCTCTCATCCGCCAAAACAGAAGCTTACTTGTACAGCTTGTCCAT-3'
서열번호 8: 5'-CCCGAATTCTTCTTCGTCTGTTTCTACTG-3'
서열번호 9: 5'-CCCGAATTCAATGGCGATGACGCATCCTCA-3'
상기 pGESS-T2를 벡본으로 하여, 전사조절인자 NitR 단백질과 상호작용하는 nitA 프로모터(PnitA) 및 nitA 프로모터 하류에 위치한 리포터 단백질 서열은 nitR 유전자와 반대방향으로 위치하게 하여 각 유전자의 발현에 대한 불필요한 간섭을 배제하였다. 전사조절 인자인 nitR은 A. faecalis 균주의 유전체를 추출한 후 서열번호 10, 11의 프라이머를 이용한 PCR(polymerase chain reaction)을 통해 얻었으며, nitA 프로모터 부분도 동일하게 A. faecalis 유전체를 주형으로 서열번호 12, 13의 프라이머를 이용하여 PCR을 통해 얻었다. 마지막으로 얻어진 PnitA-nitRPnitR 유전자 단편은 PCR 반응을 통하여 최종적으로 CL-GESS를 구성하였다.
서열번호 10: 5'- CGACAAGGAGGATGTCCATGGATGGAGCAATGGTCCACCA -3'
서열번호 11: 5'- AGAAGGAATAAGCTTGCCGGCCTTCATGATGATG-3'
서열번호 12: 5'- GGGGCCGGCAAGCTTGCCGGCCTTCATGATGATG-3'
서열번호 13: 5'- AAGGCCGGCAAGCTTGCCGGCCCCAGGT-3'
상기 방법으로 제조된 CL-GESS 유전자회로와 메타게놈 라이브러리를 공동 형질전환 한 후, 50mM 아미노카프론산과 50㎍/㎖의 앰피실린, 12.5㎍/㎖ 의 클로람페니콜이 첨가된 LB 고체 배지에 도말 하였다. 37℃에서 24시간 배양후 형광 현미경을 이용해 형광 단백질이 발현된 콜로니를 얻었다. 고체배지에서 형성된 콜로니를 다시 2 ㎖ 시험관에 37℃에서 10시간 진탕 배양 후, LB 액체 배지에 50㎍/㎖의 앰피실린, 12.5㎍/㎖ 의 클로람페니콜, 다양한 농도의 아미노카프론산과 그리고 배양액 1%를 첨가하여, 37℃에서 24시간 진탕 배양하여 형광 발현을 유도하여 재 측정하였다. 형광 발현이 확인된 콜로니에서 플라스미드를 추출하였고, CL-GESS 유전자회로와 아미노카프론산로부터 ε-카프로락탐을 전환하는 유전자를 포함하는 유전자 회로를 분리 정제하였다. 아미노카프론산로부터 ε-카프로락탐을 전환하는 유전자를 포함하는 유전자회로는 높은 수율의 농도를 확보하여, 전체 서열 분석을 수행하였다. 상기 서열을 서열번호 1에 나타내었다.
[실시예 2]
재설계 유전자회로의 시스템 검증 및 아미노카프론산에 대한 정량적 신호 분석
실시예 1에서 구축한 재설계 유전자회로의 아미노카프론산에 대한 정량적 감지기능을 확인하기 위하여 아미노카프론산로부터 ε-카프로락탐을 전환하는 유전자를 포함하는 유전자회로와 CL-GESS를 열 충격을 통해 도입한 대장균 DH5α 단일 콜로니를 50㎍/㎖의 앰피실린, 12.5㎍/㎖ 의 클로람페니콜을 첨가한 LB이 고체배지에 도말하여 약 24시간 동안 37℃에서 배양하였다. 고체배지에서 형성된 콜로니를 다시 2 ㎖ 시험관에 37℃에서 10시간 진탕 배양 후, LB 액체 배지에 50㎍/㎖의 앰피실린, 12.5㎍/㎖ 의 클로람페니콜, 다양한 농도의 아미노카프론산과 그리고 배양액 1%를 첨가하여, 37℃에서 24시간 진탕 배양하여 형광 발현을 유도하였다. 그 결과 아미노카프론산 농도에 따른 형광이 발현되는 것을 형광플레이트 리더기를 통하여 확인하였다 (도 2).
또한, 아미노카프론산을 10 μM 내지 50 mM로 첨가하여 ACA-GESS를 단일 세포 단위로 마이크로 플레이트리더기를 이용하여 분석한 결과, 10 μM 아미노 카프론산에서부터 미세하게 감지되기 시작해 농도가 증가할수록 형광양이 증가하는 것을 확인할 수 있었다(표 1 및 도 2).
표 1
ACA 농도(μM) GFP/OD
0 0
10 543.0711
25 621.0021
50 800
100 1010.951
250 1125.377
500 1419
500 1419.022
1000 1870.275
5000 2938.553
10000 3827.626
25000 4806.025
50000 7020.556
상기 결과로부터, 본 발명에서 구축된 아미노카프론산 감지 시스템은 아미노카프론산에 의해서만 형광발현이 되는 것을 알 수 있었으며, 10 μM 수준의 아미노카프론산도 감지할 수 있는 것을 확인하였다.
[실시예 3]
아미노카프론산에 대한 정량적 신호 증폭을 위한 재설계 유전자회로의 구축
실시예 2에서 확인한 재설계 유전자회로의 아미노카프론산에 대한 정량 감지능을 보다 향상시키기 위하여 T7-ACA-GESS 유전자 회로를 구축하였다 (도 3). 상기 NitR 단백질의 발현을 조절하는 프로모터 하위에 T7 RNA polymerase를 삽입된 단편을 대장균 DH5α의 chromosomal DNA에서 발현하도록 하고, 상기 아미노카프론산으로부터 ε-카프로락탐으로 전환하는 유전자와 그에 따른 ε-카프로락탐을 인식하는 nitR 유전자를 코딩하는 유전자, 형광단백질 상위에 T7 promoter을 코딩하여 상호작동가능하게 연결되어 있는 것을 특징으로 할 수 있다 (도 3).
3-1: DH5α-pNitA-T7RNAP 세포 구축
먼저 숙주세포 chromosomal DNA 의 상위 유전자 발현의 종결을 위해 rrnBT1 terminator를 서열번호 14과 15, pNitA 프로모터 유전자는 서열번호 16과 17의 프라이머를 사용하고, T7 RNA polymerase는 서열번호 18과 19의 프라이머를 사용하여 각각 PCR로 증폭하여, 증폭산물을 정제한 후, 서열번호 20과 21의 프라이머로 3개의 유전자를 잇는 overlap PCR을 수행하였다. 이후 overlap PCR을 통해 얻어진 rrnBT1 terminator-pNitA-T7 RNA polymerase 유전자와 bglA flanking region과kanamycine이 삽입된 벡터를 서열번호 22과 23 프라이머로 증폭하여, gibson assembly 방법을 이용하여 연결을 하였다. bglA flanking region-kanamycinerrnBT1 terminator-pNitA-T7 RNA polymerase-bglA flanking region을 서열번호 24와 25의 프라이머로 증폭한 후 상동성 재조합(homologous recombination)방법으로 DH5α의 chromosomal DNA의 BglA 사이트에 삽입하였다 (도 4).
서열번호 14: 5'-ttaattaaaggcatcaaataaaacgaaagg -3'
서열번호 15: 5'-ggcgcgcccagctgtcta-3'
서열번호 16 : 5'-ccgccctacacagctgggcgcgcccccccaaccctcttgttcac-3'
서열번호 17 : 5'-atgtatatctccttgtcgcggtatcc-3'
서열번호 18 : 5'-
ggataccgcgacaaggagatatacatatgaacacgattaacatcgctaagaacg-3'
서열번호 19 : 5'-ttacgcgaacgcgaagtccgactctaagat-3'
서열번호 20 :
5'-cggcgagaagctgggccgcgggaattcgatttaattaaaggcatcaaataaaacgaaagg-3'
서열번호 21 :
5'-tcgtgaggatgcgtcatcgccattgaattcttacgcgaacgcgaagtccgactctaagat-3'
서열번호 22 :
5'-atcttagagtcggacttcgcgttcgcgtaagaattcaatggcgatgacgcatcctcacga-3'
서열번호 23 :
5'-cctttcgttttatttgatgcctttaattaaatcgaattcccgcggcccagcttctcgccg-3'
서열번호 24: 5'-gtcagcaatgacttttttcagttcagtcag-3'
서열번호 25: 5'- ggactatcgctggaagtcgccgcgcagggg-3'
3-2: T7CLGESS plasmid 구축
실시예 1의 방법으로 제조된 CLGESS의 pNitA를 T7 promoter로 치환하기 위하
여, 서열번호 26과 27 프라이머를 이용하여 inverse PCR method 를 이용하여 pNitA 는 없애고 T7 promoter로 치환하였다(도 4).
서열번호 26 : 5'- atcctgattaactttataaggagatatacatatgagca -3'
서열번호 27 : 5'- ccctatagtgagtcgtattaaagcttttgacggctagctc -3'
3-3: DH5α-pNitA-T7RNAP/T7CLGESS의 구축
3-1에서 제조한 DH5α-pNitA-T7RNAP 균주에 3-2에서 제조한 T7CLGESS 플라스미드 및 ε-카프로락탐 전환유전자가 함유된 플라스미드를 형질전환시켜, DH5α-pNitA-T7RNAP/T7CLGESS를 제조하고, DH5α-pNitA-T7RNAP/T7CLGESS 균주 단일 콜로니를 50㎍/㎖의 앰피실린, 12.5㎍/㎖ 의 클로람페니콜을 첨가한 LB이 고체배지에 도말하여 약 24시간 동안 37℃에서 배양하였다. 고체배지에서 형성된 콜로니를 다시 2 ㎖ 시험관에 37℃에서 10시간 진탕 배양 후, LB 액체 배지에 50㎍/㎖의 앰피실린, 12.5㎍/㎖ 의 클로람페니콜, 다양한 농도의 아미노카프론산과 그리고 배양액 1%를 첨가하여, 37℃에서 24시간 진탕 배양하여 형광 발현을 유도하였다. 그 결과 아미노카프론산 농도에 따른 형광이 발현되는 것을 형광플레이트 리더기를 통하여 확인하였다.
[실시예 4]
메타게놈 유전자로부터 카프로로락탐 전환효소의 도출
본 발명자들은 선행연구에서 얻어진 CL-GESS 유전자회로(대한민국 특허 출원 번호 10-2013-0138399)를 통해 상기 실시예 1의 메타게놈 유전자로부터 아미노카프론산을 -카프로락탐으로 전환하는, 서열번호 28의 염기 서열 및 서열번호 29의 아미노산 서열을 갖는 카프로락탐 전환효소 '3HBD'를 발굴하였고, 이를 본 발명의 ACA-GESS 시스템에 적용하였다.
보다 구체적으로, 상기 실시예 1에서 얻어진 상기 서열번호 1의 유전자 염기 서열을 기초로 하여 하기 프라이머(primer)를 고안하였다.
정방향 프라이머(서열번호: 30)
(F, 5'-TTTCATATGAACTTAACGGGAAAA-3')
역방향 프라이머(서열번호: 31)
(R, 5'-TTTCTCGAGTTATTGCGCTACCCAAC-3')
상기 프라이머는 각각 NdeI 과 XhoI 제한효소 절단부분으로 설계하였으며, 상기 서열번호 1의 유전자를 주형으로 상기 프라이머를 이용하여 PCR을 실시하였고, 그 결과 3HBD의 유전자를 증폭시킬 수 있었다. 이렇게 증폭된 3HBD의 PCR 산물을, 제한효소 NdeI 및 XhoI을 이용하여, 플라스미드 벡터 pET28(+)(Novagen, 미국)에 삽입함으로써, pET28(+)-3HBD 발현벡터를 제작하였다.
[실시예 5]
카프로락탐 전환효소 유전자를 포함하는 발현벡터와 CL-GESS가 함께 도입된형질 전환 미생물의 제조(2- 플라스미드 시스템)
상기 실시예 4에서 제조한 pET28(+)-3HBD 발현벡터와 실시예 1에서 얻어진 CL-GESS의 발현벡터를 열 충격을 통해 대장균 EPI300(DE3) 균주(Novagen, 미국)에 형질전환시켰다. 상기와 같은 형질전환 전에, 상기 실시예 4에서 제조한 pET28(+)-3HBD 발현벡터는 CL-GESS 발현벡터와의 벡터 호환성(vector compatibility)를 위해 pET28(+)-3HBD의 벡터 백본(vector backbone)의 개시점(origin)을 gibson assembly 방법으로 'p15A'로 전환하였다. 상기와 같이 벡터 백본의 개시점이 p15A로 바뀐 pET28(+)-3HBD 발현벡터와 CL-GESS의 발현벡터가 함께 형질전환되므로, 이를 2-플라스미드 시스템이라고 한다.
[실시예 6]
카프로락탐 전환효소 유전자가 미생물의 chromosomal DNA에 삽입되고, CL-GESS가 도입된 형질 전환 미생물의 제조(1-플라스미드 시스템)
본 발명자들은 본 발명의 재설계 유전자회로를 이용함에 균주의 플라스미드 안정성을 더욱 향상시키기 위하여 단 1개의 발현벡터만이 도입된 시스템을 고안하였고, 그 결과 카프로락탐 전환효소의 유전자를 발현벡터에 삽입하여 도입하는 것이 아니라, 상기 카프로락탐 전환효소의 유전자를 미생물의 chromosomal DNA에 삽입하여 변형 미생물을 제조하고, 상기 변형 미생물에 실시예 1에서 제조한 CL-GESS를 도입함으로써, 결과적으로 미생물 내에 CL-GESS 발현벡터 단 1개만이 도입된 새로운 ACA-GESS 시스템을 구현하였다. 상기와 같이 미생물 내에는 CL-GESS의 발현벡터만이 형질전환되므로, 이를 1-플라스미드 시스템이라고 한다.
표 2
3HBD Concentration 1,141bp
template 1 pET28-3HBD 10ng/㎕~100ng/㎕ 1 1
primer 32 Lactams-Gib-Ins-F1 50pmole/㎕ 1 1
primer 33 Lactams-Gib-Ins-R1 50pmole/㎕ 1 1
Gc buffer 5X 10 20
dNTP 10mM 1 2
DMSO 100% 1.5 3
Phusion pol 0.5 1
DW 34 71
total 50 100
표 3
Vector Concentration 5,177bp
template 1 pGEM-int-T7CLgess 10ng/㎕~100ng/㎕ 1 1
primer 34 Lactams-Gib-Vec-F1 50pmole/㎕ 1 1
primer 35 Lactams-Gib-Vec-R1 50pmole/㎕ 1 1
Gc buffer 5X 10 20
dNTP 10mM 1 2
DMSO 100% 1.5 3
Phusion pol 0.5 1
DW 34 71
total 50 100
상기와 같은 1-플라스미드 시스템은, 구체적으로, 실시예 4의 pET28a-3HBD 발현벡터를 주형으로 하고 서열번호 32 및 서열번호 33의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행함으로써 'T7 promoter - 3HBD - T7 terminator'의 유전자 컨스트럭트를 포함하는 삽입 부분(1.141bp)을 증폭하였고, 상기 pGEM-int-T7CLgess를 주형으로 하고 서열번호 34 및 서열번호 35의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행함으로써 벡터 부분(5,177bp)을 증폭하였으며, 위의 PCR을 통해 만들어진 PCR 산물을 DpnI로 처리하여 절단하고, gel elution하였으며, gibson reaction으로 결합시켰다. 반응 결과물을 콜로니 PCR(Km-int-F1/#6 프라이머)한 후 제조된 중간 서열을 확인하였다.
상기와 같이 제조된 중간 플라스미드를 주형으로 하고 서열번호 36 및 서열번호 37의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행함으로써, 상동 재조합될 산물(3,181bp)을 증폭하였고, PCR 후 DpnI로 처리하여 절단하고, gel elution하여 정제하였다. 정제한 상동 재조합 산물(3,181bp)은 한국 등록특허 10-0681815 및 PLoS One. 2013 Nov 11;8(11):e79979에 개시된 실험 방법에 따라 pKD46이 들어있는 E. coli에 형질전환시켰다. 요약하면, pKD46 DNA를 E.coli host에 형질전환하여 30C(pKD46은 temp sensitive ori를 가지고 있음), LA에서 배양하였다. 콜로니 1개를 LA에 접종하고, 30C에서 하룻밤 배양하였다. LA broth 100ml에 50mM arabinose와 1%(v/v) seed를 접종하여 Od600이 0.5가 될때 까지 배양하여 electrocompetent cell을 만들었다. 세포를 50ul씩 분주한 후 제조된 3,181bp PCR product 100ng을 형질전환한 후 37℃에서 1시간 후 recover한 다음, LK plate에 spreading 한 후 37C에서 배양하였다. 배양된 세포를 서열번호 38/서열번호 39 프라이머로 콜로니 PCR하여 ~3.4kb product가 생성되는 콜로니를 선별하여 시퀀스를 확인하여, 상기 상동 재조합 산물(3,181bp)이 EPI300(DE3)의 BglA 유전자 위치에 삽입된 EPI300(DE3)-3HBD 균주가 확립되었음을 확인하였고, 그런 다음 실시예 1에서 얻어진 CL-GESS의 발현벡터를 열 충격을 통해 상기 EPI300(DE3)-3HBD 균주에 형질전환시킴으로써 제조되었다.
[실시예 7]
실시예 5(2-플라스미드 시스템) 및 실시예 6(1-플라스미드 시스템)의 재설계 유전자회로의 시스템 검증 및 아미노카프론산에 대한 정량적 신호 분석
먼저, 실시예 5에서 구축한 재설계 유전자회로인 2-플라스미드 시스템의 아미노카프론산에 대한 정량적 감지기능을 확인하기 위하여, 상기 2-플라스미드 시스템의 대장균 단일 콜로니를 50㎍/㎖의 앰피실린, 30㎍/㎖의 카나마이신이 첨가한 LB이 고체배지에 도말하여 약 24시간 동안 37℃에서 배양하였다. 고체배지에서 형성된 콜로니를 다시 2㎖ 시험관에 37℃에서 10시간 진탕 배양 후, LB 액체 배지에 50㎍/㎖의 앰피실린, 30㎍/㎖의 카나마이신 다양한 농도의 아미노카프론산과 그리고 배양액 1%를 첨가하여, 37℃에서 16시간 진탕 배양하여 형광 발현을 유도하였다.
그리고, 실시예 6에서 구축한 재설계 유전자회로인 1-플라스미드 시스템의 아미노카프론산에 대한 정량적 감지기능을 확인하기 위하여, 상기 1-플라스미드 시스템의 대장균 단일 콜로니를 50㎍/㎖의 앰피실린이 함유된 LB이 고체배지에 도말하여 약 24시간 동안 37℃에서 배양하였다. 고체배지에서 형성된 콜로니를 다시 2㎖ 시험관에 37℃에서 10시간 진탕 배양 후, LB 액체 배지에 50㎍/㎖의 앰피실린, 다양한 농도의 아미노카프론산과 그리고 배양액 1%를 첨가하여, 37℃에서 16시간 진탕 배양하여 형광 발현을 유도하였다.
상기와 같은 두 시스템의 아미노카프론산 농도에 따른 형광 발현을 형광플레이트 리더기를 통해 확인하였다.
아미노카프론산을 10 μM 내지 50 mM로 첨가하여 ACA-GESS를 단일 세포 단위로 마이크로 플레이트리더기를 이용하여 분석한 결과, 10 μM 아미노카프론산에서부터 미세하게 감지되기 시작해 농도가 증가할수록 형광양이 증가하는 것을 확인할 수 있었다(도 5 및 도 6). 또한 실시예 5에서 구축한 재설계 유전자회로인 2-플라스미드 시스템의 아미노카프론산에 대한 정량적 감지기능 평가 결과를 하기 표 4에 나타낸다. 아울러, 실시예 6에서 구축한 재설계 유전자회로인 1-플라스미드 시스템의 아미노카프론산에 대한 정량적 감지기능 평가 결과를 하기 표 5에 나타낸다.
표 4
ACA 농도(μM) GFP/OD
0 0
10 3012.898
25 5058.951
50 8448.549
100 9870.941
500 13487.95
1000 16695.07
5000 19481.86
10000 23023.96
30000 39898.59
표 5
ACA 농도(μM) GFP/OD
0 0
10 11406.84
25 12607.39
50 15440.75
100 21036.93
500 28249.12
1000 38020.7
5000 44581.11
10000 48566.69
30000 71556.16
상기 결과로부터, 본 발명에서 구축된 아미노카프론산 감지 시스템은 아미노카프론산에 의해서만 형광발현이 되는 것을 알 수 있었으며, 아미노카프론산을 10μM이라는 극미량 수준까지 감지할 수 있음을 알 수 있다.
이상으로, 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
본 발명에 따른 아미노카프론산을 인지하는 재설계 유전자회로는 아미노카프론산의 양에 비례하여 형광단백질의 발현을 유도하도록 함으로써, 아미노카프론산을 빠르게 감지 및 정량화할 수 있어, 고속 탐색을 통해 자연계 미생물 메타게놈 라이브러리로부터 신규 아미노카프론산 생산 균주 및 유전자를 탐색하는 과정에 본 발명의 효율적 이용이 가능하다.

Claims (40)

  1. 다음을 포함하는 아미노카프론산 감지용 재설계 유전자회로;
    (a) 아미노카프론산으로부터 ε-카프로락탐으로 전환하는 효소단백질을 코딩하는 유전자;
    (b) ε-카프로락탐을 인지하는 NitR 단백질을 코딩하는 nitR 유전자;
    (c) 형광 단백질을 코딩하는 유전자 및 항생제 저항성 유전자로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 리포터 유전자;
    (d) 상기 nitR 유전자의 발현을 조절하는 프로모터; 및
    (e) 상기 ε-카프로락탐을 인지한 NitR (단백질)이 결합하여 하류의 리포터 유전자의 발현을 유도하는 nitA 프로모터.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 아미노카프론산으로부터 ε-카프로락탐으로 전환하는 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 1 또는 서열번호 28로 표시되는 것을 특징으로 하는 아미노카프론산 감지용 재설계 유전자회로.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 nitR 유전자 및 nitA 프로모터는 나이트릴레이즈(nitrilase) 활성이 있는 균주 유래의 nitR 유전자 및 nitA 프로모터인 것을 특징으로 하는 아미노카프론산 감지용 재설계 유전자회로.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 나이트릴레이즈 (nitrilase) 활성이 있는 균주는 Aeribacillus pallidus, A. pallidus DAC521, A. pallidus RAPc8, Arabidopsis thaliana, Arthrobacter sp., Arthrobacter sp. J-1, Alcaligenes faecalis, A. faecalis JM3, A. faecalis ATCC 8750, A. faecalis MTCC 10757, A. faecalis MTCC 126, Alcaligenes sp., Alcaligenes sp. ECU0401, Aspergillus niger, A. niger K10, Fusarium solani, F. solani IMI 196840, F. solani O1, Mus musculus, Sorghum bicolor, Homo sapiens, Acidovorax facilis, A. facilis 72W, Acinetobacter sp., Agrobacterium sp., Arabis hirsuta, Bacillus subtilis, B. subtilis E9, Bacillus sp., Bacillus sp. OxB-1, Bacillus sp. UG-5B, Bradyrhizobium japonicum, B. japonicum USDA110, Brassica napus, B. rapa, B. rapa subsp. pekinensis, Comamonas testosteroni, Fusarium oxysporum, F. oxysporum f. sp. melonis, Gibberella moniliformis, Halomonas sp. alphaCH3, Hordeum vulgare, Klebsiella pneumoniae, K. pneumoniae subsp. ozaenae, Nocardia. globerula, N.globerula NHB-2, Nocardia sp., Penicillium marneffei, P. multicolor, Pseudomonas fluorescens, P. fluorescens 11387, P. fluorescens EBC 191, P. putida, P. putida 11388, P. putida MTCC 5110, Pseudomonas sp., Rhizobium sp. 11401, Rhodobacter sphaeroides, R. sphaeroides LHS-305, Rhodococcus equi, R.equi CCTCC.M.205114, R. fascians, R. fascians MTCC-1531, R. rhodochrous, R.rhodochrous ATCC 33278, R. rhodochrous ATCC 39484, R. rhodochrous J1, R.rhodochrous K22, R. rhodochrous MTCC-291, R. rhodochrous PA-34, R.rhodochrous tg1-A6, Rhodococcus sp., Rhodococcus sp. ATCC39484, Rhodococcus sp. NCIMB 11215, Rhodococcus sp. NCIMB 11216, Rhodococcus sp. NDB 1165, Sorghum bicolor, Synechocystis sp., Synechocystis sp. PCC6803 및 Zea mays로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 아미노카프론산 감지용 재설계 유전자회로.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 nitR 유전자는 Alcaligenes faecalis JM3 유래로서 서열번호 2로 표시되는 것을 특징으로 하는 아미노카프론산 감지용 재설계 유전자회로.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 nitA 프로모터 유전자는 Alcaligenes faecalis JM3 유래로서 서열번호 3으로 표시되는 것을 특징으로 하는 아미노카프론산 감지용 재설계 유전자회로.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 리포터 유전자와 상기 리포터 유전자의 발현을 조절하는 프로모터는 상호작동가능하게 연결되어 있는 것을 특징으로 하는 아미노카프론산 감지용 재설계 유전자회로.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 리포터 유전자의 발현을 유도하는 nitA 프로모터를 포함하는 부위에 ε-카프로락탐과 결합한 상기 ε-카프로락탐을 인지하는 NitR 단백질이 결합하여 nitA 프로모터를 활성화시켜, 상기 리포터 유전자의 발현을 유도하는 것을 특징으로 하는 아미노카프론산 감지용 재설계 유전자회로.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 ε-카프로락탐에 의해 발현이 유도되는 nitR 유전자를 코딩하는 유전자와 상기 NitR 단백질의 발현을 조절하는 프로모터는 상호작동가능하게 연결되어 있는 것을 특징으로 하는 아미노카프론산 감지용 재설계 유전자회로.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 형광단백질은 GFP, GFPUV, sfGFP 및 RFP로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 아미노카프론산 감지용 재설계 유전자회로.
  11. 제1항에 있어서,
    상기 항생제 저항성 유전자는 엠피실린 저항성유전자, 카나마이신 저항성 유전자, 클로람페니콜 저항성 유전자 및 테트라사이클린 저항성 유전자로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 아미노카프론산 감지용 재설계 유전자회로.
  12. 제1항에 있어서,
    RBS (ribosome binding site)를 코딩하는 유전자를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 아미노카프론산 감지용 재설계 유전자회로.
  13. 제1항에 있어서,
    상기 리포터 유전자는 형광 단백질을 코딩하는 유전자 및 항생제 저항성 유전자로 구성된 이중 리포터 유전자인 것을 특징으로 하는 아미노카프론산 감지용 재설계 유전자회로.
  14. 제1항에 있어서,
    상기 nitR 유전자와 상기 nitR 유전자의 발현을 조절하는 프로모터가 2 이상 포함되어 있는 것을 특징으로 하는 아미노카프론산 감지용 재설계 유전자회로.
  15. 제1항에 있어서,
    상기 리포터 유전자 및 상기 리포터 유전자의 발현을 유도하는 nitA 프로모터가 2 이상 포함되어 있는 것을 특징으로 하는 아미노카프론산 감지용 재설계 유전자회로.
  16. 제1항에 있어서,
    상기 (i) 아미노카프론산으로부터 ε-카프로락탐으로 전환하는 효소단백질을 코딩하는 유전자는 (ii)~(v)와 독립되어 포함되는 것을 특징으로 하는 아미노카프론산 감지용 재설계 유전자회로.
  17. 제1항의 아미노카프론산 감지용 재설계 유전자회로를 함유하는 아미노카프론산 감지용 재조합 미생물.
  18. 제17항에 있어서,
    미생물은 세균, 효모, 식물세포 및 동물세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 아미노카프론산 감지용 재조합 미생물.
  19. (a) 아미노카프론산으로부터 ε-카프로락탐으로 전환하는 효소단백질을 코
    딩하는 유전자;
    (b) ε-카프로락탐을 인지하는 NitR 단백질을 코딩하는 nitR 유전자;
    (c) 형광 단백질을 코딩하는 유전자 및 항생제 저항성 유전자로 구성된 군
    에서 선택된 하나 이상의 리포터 유전자;
    (d) 상기 nitR 유전자의 발현을 조절하는 프로모터; 및
    (e) T7 RNA 폴리머라아제에 의하여 활성화되고, 상기 리포터 유전자의 발현
    을 유도하는 T7 프로모터를 함유하는 유전자 회로를 포함하고,
    T7 RNA 폴리머라아제를 코딩하는 유전자와 ε-카프로락탐을 인지한 NitR 단백질이 결합하여, 하류의 T7 RNA 폴리머라아제를 코딩하는 유전자의 발현을 유도하는 nitA 프로모터가 염색체 상에 삽입되어 있는 아미노카프론산 감지용 재조합 미생물.
  20. 제19항에 있어서,
    상기 아미노카프론산으로부터 ε-카프로락탐으로 전환하는 효소단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 1 또는 서열번호 28로 표시되는 것을 특징으로 하는 아미노카프론산 감지용 재조합 미생물.
  21. 제19항에 있어서,
    상기 nitR 유전자 및 nitA 프로모터는 나이트릴레이즈(nitrilase) 활성이 있는 균주 유래의 nitR 유전자 및 nitA 프로모터인 것을 특징으로 하는 아미노카프론산 감지용 재조합 미생물.
  22. 제21항에 있어서,
    상기 나이트릴레이즈 (nitrilase) 활성이 있는 균주는 Aeribacillus pallidus, A. pallidus DAC521, A. pallidus RAPc8, Arabidopsis thaliana, Arthrobacter sp., Arthrobacter sp. J-1, Alcaligenes faecalis, A. faecalis JM3, A. faecalis ATCC 8750, A. faecalis MTCC 10757, A. faecalis MTCC 126, Alcaligenes sp., Alcaligenes sp. ECU0401, Aspergillus niger, A. niger K10, Fusarium solani, F. solani IMI 196840, F. solani O1, Mus musculus, Sorghum bicolor, Homo sapiens, Acidovorax facilis, A. facilis 72W, Acinetobacter sp., Agrobacterium sp., Arabis hirsuta, Bacillus subtilis, B. subtilis E9, Bacillus sp., Bacillus sp. OxB-1, Bacillus sp. UG-5B, Bradyrhizobium japonicum, B. japonicum USDA110, Brassica napus, B. rapa, B. rapa subsp. pekinensis, Comamonas testosteroni, Fusarium oxysporum, F. oxysporum f. sp. melonis, Gibberella moniliformis, Halomonas sp. alphaCH3, Hordeum vulgare, Klebsiella pneumoniae, K. pneumoniae subsp. ozaenae, Nocardia. globerula, N.globerula NHB-2, Nocardia sp., Penicillium marneffei, P. multicolor, Pseudomonas fluorescens, P. fluorescens 11387, P. fluorescens EBC 191, P. putida, P. putida 11388, P. putida MTCC 5110, Pseudomonas sp., Rhizobium sp. 11401, Rhodobacter sphaeroides, R. sphaeroides LHS-305, Rhodococcus equi, R.equi CCTCC.M.205114, R. fascians, R. fascians MTCC-1531, R. rhodochrous, R.rhodochrous ATCC 33278, R. rhodochrous ATCC 39484, R. rhodochrous J1, R.rhodochrous K22, R. rhodochrous MTCC-291, R. rhodochrous PA-34, R.rhodochrous tg1-A6, Rhodococcus sp., Rhodococcus sp. ATCC39484, Rhodococcus sp. NCIMB 11215, Rhodococcus sp. NCIMB 11216, Rhodococcus sp. NDB 1165, Sorghum bicolor, Synechocystis sp., Synechocystis sp. PCC6803 및 Zea mays로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 아미노카프론산 감지용 재조합 미생물.
  23. 제19항에 있어서,
    상기 nitR 유전자는 Alcaligenes faecalis JM3 유래로서 서열번호 2로 표시되는 것을 특징으로 하는 아미노카프론산 감지용 재조합 미생물.
  24. 제19항에 있어서,
    상기 nitA 프로모터 유전자는 Alcaligenes faecalis JM3 유래로서 서열번호 3으로 표시되는 것을 특징으로 하는 아미노카프론산 감지용 재
    조합 미생물.
  25. 제19항에 있어서,
    상기 형광단백질은 GFP, GFPUV, sfGFP 및 RFP로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 아미노카프론산 감지용 재조합 미생물.
  26. 제19항에 있어서,
    상기 항생제 저항성 유전자는 엠피실린 저항성 유전자, 카나마이신 저항성 유전자, 클로람페니콜 저항성 유전자 및 테트라사이클린 저항성 유전자로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 아미노카프론산 감지용 재조합 미생물.
  27. 제1항에 있어서,
    상기 리포터 유전자는 형광 단백질을 코딩하는 유전자 및 항생제 저항성 유전자로 구성된 이중 리포터 유전자인 것을 특징으로 하는 아미노카프론산 감지용 재조합 미생물.
  28. 제19항에 있어서,
    상기 (i) 아미노카프론산으로부터 ε-카프로락탐으로 전환하는 단백질을 코딩하는 유전자는 (ii)~(v)와 독립되어 포함되는 것을 특징으로 하는 아미노카프론산 감지용 재조합 미생물.
  29. 제19항에 있어서,
    미생물은 세균, 효모, 식물세포 및 동물세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 아미노카프론산 감지용 재조합 미생물.
  30. 다음 단계를 포함하는 아미노카프론산의 감지방법:
    (a) 제17항 또는 제19항의 아미노카프론산 감지용 재조합 미생물과 아미노카프론산 함유가능성 있는 샘플을 접촉시키는 단계; 및
    (b) 아미노카프론산을 감지하여 발현이 유도된 리포터 단백질의 활성을 분석하여 아미노카프론산의 존재 여부를 감지하는 단계.
  31. 제30항에 있어서,
    상기 리포터 단백질의 활성 측정은 미생물 콜로니 이미지 분석, 형광스펙트럼 분석, 형광유세포분석 (FACS) 및 항생제 내성 측정법으로 구성된 군에서 선택되는 방법을 이용하는 것을 특징으로 하는 방법.
  32. 다음 단계를 포함하는 아미노카프론산의 정량방법:
    (a) 제17항 또는 제19항의 아미노카프론산 감지용 재조합 미생물과 아미노카프론산을 함유하는 샘플을 접촉시키는 단계; 및
    (b) 상기 샘플 내에 존재하는 아미노카프론산에 의해 발현이 유도된 리포터 단백질의 활성을 분석하여, 샘플 내에 존재하는 아미노카프론산을 정량하는 단계.
  33. 제21항에 있어서,
    상기 리포터 단백질의 활성 측정은 미생물 콜로니 이미지 분석, 형광스펙트럼 분석, 형광유세포분석 (FACS) 및 항생제 내성 측정법으로 구성된 군에서 선택되는 방법을 이용하는 것을 특징으로 하는 방법.
  34. 다음 단계를 포함하는 아미노카프론산 생산균주의 스크리닝 방법:
    (a) 제17항 또는 제19항의 아미노카프론산 감지용 재조합 미생물과 메타게놈
    라이브러리 샘플을 접촉시키는 단계;
    (b) 상기 샘플 내에 존재하는 아미노카프론산에 의해 발현이 유도된 리포터
    단백질의 활성을 분석하여, 샘플 내에 아미노카프론산을 정량하는 단계; 및
    (c) 아미노카프론산이 함유된 샘플에 함유된 균주를 아미노카프론산 생산균
    주로 선별하는 단계.
  35. 서열번호 1로 표시되는 아미노카프론산으로부터 ε-카프로락탐으로 전환하는 단백질을 코딩하는 유전자.
  36. 제35항의 유전자로부터 코딩되는 아미노카프론산으로부터 ε-카프로락탐으로 전환하는 단백질.
  37. 제35항의 아미노카프론산으로부터 ε-카프로락탐으로 전환하는 단백질을 코딩하는 유전자로 형질전환된 미생물.
  38. 제36항의 아미노카프론산으로부터 ε-카프로락탐으로 전환하는 단백질을 이용하여 아미노카프론산을 ε-카프로락탐으로 전환하는 방법.
  39. 제1항에 있어서,
    상기 아미노카프론산으로부터 ε-카프로락탐으로 전환하는 단백질은 서열번호 29로 표시되는 것을 특징으로 하는 아미노카프론산 감지용 재설계 유전자회로.
  40. 제19항에 있어서,
    상기 아미노카프론산으로부터 ε-카프로락탐으로 전환하는 효소단백질은 서열번호 29로 표시되는 것을 특징으로 하는 아미노카프론산 감지용 재조합 미생물.
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