ES2228541T3 - Expresion regulada de genes clonados usando un ciclo genetico en cascada. - Google Patents
Expresion regulada de genes clonados usando un ciclo genetico en cascada.Info
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Abstract
Un circuito genético en cascada comprendiendo: a) una o más construcciones de ácido nucleico codificando el regulador transcripcional NahR o una forma mutante del mismo y el regulador transcripcional XylS o una forma mutante del mismo; en dónde dichos reguladores transcripcionales codificados son preparados en un orden jerárquico tal que la expresión del regulador transcripcional NahR localizado corriente arriba o la forma mutante del mismo estimula la expresión del regulador transcripcional XylS localizado corriente abajo o la forma mutante del mismo y;. en dónde el regulador transcripcional NahR o la forma mutante del mismo y el regulador transcripcional XylS o la forma mutante del mismo son sensibles al mismo inductor b) un promotor diana final; en dónde dicho promotor diana final es sensible de forma dosis-dependiente al regulador transcripcional XylS o a la forma mutante del mismo.
Description
Expresión regulada de genes clonados usando un
ciclo genético en cascada.
Esta solicitud reivindica prioridad a la
Solicitud de Patente Española ES-9901383, depositada
el 22 de Junio de 1999 en el nombre de Cebolla et al.,
titulada "Tightly regulated overexpression of cloned genes using a
cascade genetic circuit", y a la Solicitud Española
ES-200001389, depositada el 31 de Mayo de 2000 en el
nombre de Cebolla et al., titulada "Regulated expression of
cloned genes using a cascade genetic circuit", cada una de estas
solicitudes se incorpora aquí a modo de referencia en su integridad
incluyendo todas las figuras.
La presente invención se refiere al diseño de
circuitos de cascada transcripcional para amplificar la expresión
génica. Esto también se refiere al uso de estos sistemas para la
sobreproducción de polipéptidos tales como proteínas terapéuticas,
enzimas, hormonas, factores de crecimiento, y apoliproteínas in
vitro, y en células, esto es, cultivos celulares. Esto tiene una
gran utilidad industrial, por ejemplo, en la biotecnología e
industrias farmacéuticas.
La sobreexpresión de los genes clonados es muy
conveniente para la producción de tanto polipéptidos recombinantes o
metabolitos celulares específicos para investigación básica, y las
industrias farmacéutica y biotecnológica generalmente. La producción
de grandes cantidades de genes clonados se ha obtenido
tradicionalmente combinando la amplificación génica con promotores
fuertes regulados por represores. No obstante, estas estrategias
convencionales normalmente poseen los inconvenientes que: 1) el
mantenimiento de los vectores de expresión de plásmidos normalmente
requiere la selección con antibióticos, motivando el desgaste
metabólico y costes adicionales para la producción industrial a gran
escala (Nilson y Skogman 1986); 2) la expresión de niveles bajos se
indica cuando se refiere a proteínas tóxicas, y en evitar la
acumulación de mutaciones en los productos de proteínas
recombinantes en ellas mismas (Mertens et al., 1995; Vilette
et al. 1995), que es difícil de alcanzar cuando el gen
clonado está en multicopia debido al múltiple número de copias de
los vectores plasmídicos tradicionales y el alto nivel basal
("goteo") de expresión de los promotores tradicionalmente más
usados. pej., tac o trc; 3) inductores tradicionales,
pej., IPTG en la expresión de sistemas lac, son caros y poseen
cierto grado de toxicidad (Figge et al. 1988); 4) la alta
expresión de proteínas recombinantes ha mostrado reducir la tasa de
crecimiento de las células huésped y, concomitantemente, la síntesis
general de proteínas (Bentley et al., 1990; Dong et
al. 1995), presumiblemente debido al aumento del desgaste
metabólico en el huésped; y 5) un número considerable de sistemas de
expresión existente sólo replican en E. coli, que puede
limitar la expresión de ciertas proteínas, pej., aquellas deseadas
para ser secretadas.
Un sistema de expresión alternativo que satisface
alguno de los requisitos anteriores usan vectores del transposón
miniTn5 (de Lorenzo y Timmis 1994) para insertar genes heterólogos
en el cromosoma bacteriano, permitiendo así alta estabilidad de
expresión (Cebolla et al. 1993; Suárez et al. 1997).
Suárez en particular describe la producción estable de la toxina
pertúsica en Bortedetella bronchiseptica mediante la
inserción cromosómica mediada por miniTn5, y expresión usando un
sistema regulador de salicilato. El salicilato es un inductor de
benzoato, 1000 veces menos caro que el IPTG (SIGMA catálogo de
1998). El sistema está basado en el gen regulador nahR, que codifica
un regulador positivo activado por salicilato y su promotor diana
PsaI (de Lorenzo et al. 1993). No obstante, los
niveles de expresión obtenidos son relativamente pobres (0,1% de
proteína total). Este bajo nivel es debido probablemente a que los
genes están en monocopia en el cromosoma.
Si el rendimiento puede ser mejorado manteniendo
las ventajas de los bajos niveles basales, estabilidad, amplio rango
de huésped, y bajo coste, el sistema regulador nahR/PsaI
poseerá gran utilidad industrial.
Hemos diseñado un sistema en cascada que permite
una expresión 10 a 20 veces mayor sobre el sistema estándar
nahR/Psal mientras se retiene considerablemente una o más de
las ventajas innatas del sistema. Para alcanzar esto, otro elemento
regulador, xylS2 y su promotor diana Pm, se acopla a la
expresión de PsaI en un circuito en cascada. El gen regulador
xylS2 responde al inductor común y posee mayor capacidad de
expresión génica que el estándar nahR/Psal. La activación
sinérgica del promotor Pm por el activador transcripcional
XylS2 puede alcanzarse mediante el incremento simultáneo de
la concentración intracelular y la actividad específica de
activador/regulador en presencia de un inductor de derivado de
benzoato común, pej., salicilato.
Por lo tanto, en un primer aspecto la invención
proporciona un circuito en cascada, que comprende:
- a)
- una o más construcciones de ácido nucleico que codifican el regulador transcripcional NahR o una forma mutante del mismo y el regulador transcripcional XylS o una forma mutante del mismo;
- en donde dichos reguladores transcripcionales codificados se disponen en un orden jerárquico como la expresión del regulador transcripcional de NahR localizado corriente arriba o la forma mutante del mismo estimula la expresión del regulador transcripcional de XylS localizado corriente abajo o la forma mutante del mismo y;
- en donde el regulador transcripcional NahR o la forma mutante del mismo y el regulador transcripcional XylS o la forma mutante del mismo son responsables del mismo inductor
- b)
- un promotor diana final;
- en donde dicho promotor diana final es responsable en un modo dependiente de dosis del regulador transcripcional XylS o la forma mutante del mismo.
En ciertas realizaciones preferidas, puede ser
útil introducir el promotor diana final sólo, pej., vía PCR, en un
genoma huésped en una posición específica para determinar el efecto
sobre la expresión de la secuencia corriente abajo. Para realizar
esto, será primero deseable desactivar o desactivar "knock out"
el promotor nativo, gen, o secuencia de ácido nucleico. En otras
realizaciones preferidas, como se ha descrito antes, son preferibles
genes heterólogos y secuencias para usar en el circuito en cascada
y, concordantemente, puede ser introducido.
En una realización especialmente preferida, el
circuito en cascada genética además comprende un sitio de clonación
múltiple corriente abajo del promotor diana final.
En otra realización preferida, el circuito en
cascada genética, o al menos una porción del mismo, está presente
como integración cromosómica en una célula huésped. En una
realización diferente, no necesariamente exclusiva, al menos una de
dichas o más construcciones de ácido nucleico está presente como un
plásmido autoreplicativo.
En otra realización más, el circuito en cascada
genética, o al menos una porción del mismo, es sensible a un
inductor, preferiblemente un inductor que es capaz de inducir la
expresión de más de un regulador en la cascada. En realizaciones
preferidas, el inductor es un derivado de benzoato, preferiblemente,
aunque no necesariamente, salicilato.
En otro aspecto, la invención presenta una
célula, tejido, u organismo que comprende el circuito en cascada
genética de cualquiera de las reivindicaciones precedentes.
Preferiblemente, la célula se selecciona del grupo consistente en
células procariotas y eucariotas. En lo referente a células
eucariotas, son preferidas células de mamíferos, insectos,
levaduras, y plantas. En lo referente a células procariotas, son
preferidas células bacterianas gram-negativas.
En aún otro aspecto, la invención presenta
métodos de regulación de la expresión de una secuencia de ácido
nucleico, que comprende el establecimiento de un circuito en cascada
genética de acuerdo con cualquiera de las realizaciones del circuito
en cascada genética descrito antes; situando dicha secuencia de
ácido nucleico bajo control de dicho promotor diana final; e
induciendo dicho circuito en cascada genética para estimular la
expresión de dicha secuencia de ácido nucleico.
Preferiblemente la secuencia de ácido nucleico
codifica una polipéptido seleccionado del grupo consistente en
enzimas, hormonas, factores de crecimiento, apolipoproteínas,
proteínas terapéuticas, proteínas diagnósticas, y porciones o
derivados de las mismas. En otras realizaciones preferidas, la
secuencia de ácido nucleico codifica una molécula antisentido,
ribozima, rRNA, tRNA, snRNA, o simplemente una molécula diagnóstica
de RNA. En ciertas realizaciones preferidas, el ácido nucleico
codifica un producto de gen marcador útil en el diagnóstico.
Usando genes reguladores de los circuitos control
para la expresión de operones catabólicos, se construyó un sistema
de expresión en cascada para amplificar la expresión génica. El
sistema está basado en las características de activación del
promotor Pm por el activador transcripcional mutante XylS2.
La fuerza de la activación Pm depende de la cantidad de proteína
XylS2 y su actividad específica, que está potenciado por la
presencia de salicilato y otros derivados de benzoato. Para acoplar
el aumento de la actividad intrínseca XylS2 y la concentración
intracelular XylS2, la expresión de xylS2 está bajo el control del
promotor Psal y el activador transcripcional NahR, que es también
activado en respuesta a inductores comunes. La acción sinergística
de ambos reguladores transcripcionales lleva a amplificaciones de 10
a 20 veces de la capacidad de expresión génica con atención a cada
sistema de expresión individual.
Una realización del sistema comprende un cassette
con los genes reguladores nahR/Psal::xylS2 flanqueados por
las secuencias invertibles que facilitan la inserción estable en el
cromosoma de una célula, pej., una bacteria gram negativa. Un modulo
de expresión complementario conteniendo el promotor diana Pm
corriente arriba de un sitio de multiclonación para facilitar la
clonación de un DNA recombinante se usa como parte del sistema. El
modulo de expresión se puede introducir en un plásmido multicopia o
también transferirse al cromosoma, pej., vía vectores de
distribución minitransposón (si la estabilidad de la expresión y/o
el nivel basal más bajo se desean). Para conseguir esto, el modulo
de expresión con el promotor Pm y los genes heterólogos están
preferiblemente flanqueados por sitios de restricción raros. pej.
Notl, con además utilidad en la clonación.
Un sistema de expresión ideal debería estar
regulado estrechamente (esto es, tener un nivel basal muy bajo de
expresión y un alto nivel de expresión en presencia de un inductor).
Para fermentaciones a gran escala, es muy conveniente que el
inductor sea barato y que la sobreexpresión del gen sea estable,
preferiblemente sin presión selectiva. La capacidad del cultivo para
alcanzar una elevada biomasa debería afectarse lo mínimo posible, y
de forma conveniente para el uso de un amplio rango de organismos.
La expresión inducida por salicilato usando nahR/Psal en el
cromosoma de bacterias gram negativas ha demostrado ser muy estable
y estrechamente, regulada (Suárez et al. 1996). No obstante,
el nivel de expresión obtenido es muy bajo debido la presencia de
una copia simple y capacidad de expresión génica limitada.
En contraposición, el sistema de expresión
xylS/Pm ha demostrado tener un rango excepcional de actividad
que depende de la actividad específica del regulador transcripcional
Xy1S y en la concentración intercelular de XylS; manipulación que
también afecta a la expresión (Kessler et al. 1994).
La actividad transcripcional Pm in
vivo parece no ser saturable debido a que, a pesar de la
sobre-expresión de XylS, la expresión a partir de Pm
continua en respuesta al inductor
3-metil-benzoato. No obstante, los
sistemas de expresión basados en el sistema xylS/Pm mantienen
cantidades constantes de expresión de xylS, lo que
desaprovecha el incremento potencial en la capacidad de expresión
génica si la expresión xylS pudiera ser inducible. Tal como
los Solicitantes demuestran aquí, esto se puede obtener por
acoplamiento de la expresión de xylS a otro sistema de expresión
(primer sistema). Si la señal que induce la expresión del regulador
transcripcional era la misma que lo activa, la señal podría producir
sinergia en la activación de la expresión génica a partir del
promotor Pm.
La presente invención describe esto:
amplificación de la señal sinérgica usando sistemas de expresión
acoplados. Para usar reguladores respondiendo a una señal común,
nahR/Psal, se usó como un primer sistema regulador y
xylS2, un mutante de xylS capaz de responder a
salicilato (Ramos et al. 1986), como un segundo sistema
regulador. Un fragmento de 1,2 Kb con el gen xylS2 se clonó
por digestión con HindIII y digestión parcial con
Ncol, e inserción en los mismos sitios de pFH2 (Tabla 1). El
plásmido resultante pNS2 se digerió con Notl y el fragmento con
xylS2 se insertó en el plásmido pCNB4 (de Lorenzo et
al. 1993). Este regulador se deja bajo el control del sistema
nahR/Psal y flanqueado por las secuencias de inserción de
miniTn5. El plásmido resultante pCNB4-S2 (Figura 2a)
tiene un origen de replicación R6K (Kahn et al. 1979), que
puede tan sólo replicarse en cepas expresando proteína \pi. E.
coli \lambdapir lisógeno puede expresar esta proteína y
así, replicar el plásmido de distribución miniTn5 (Herrero et
al. 1990).
Usando la cepa donadora de vectores miniTn5
S17-1(\lambdapir) se puede transferir el
cassette regulador a otras cepas gram negativas usando la
conjugación biparental estándar, y seleccionar para las bacterias
receptoras usando marcadores selectivos determinados por el
minitransposón (Herrero et al. 1990; de Lorenzo y Timmis
1994). Para verificar que es una inserción por transposición y que
el plásmido R6K no se ha insertado, las colonias transconjugadas se
comprobaron para la pérdida de \beta-lactamasa del
plásmido suicida. Cada cepa con cassette regulador
nahR/Psal::xylS2 podría producir la proteína reguladora XylS2
en respuesta a salicilato (Figura 1).
Esta cepa puede entonces usarse para la inserción
por conjugación o transformación de un segundo cassette regulador
que contiene el promotor Pm fusionado con el gen heterólogo de
interés. Tal construcción, pTSPm, es un vector miniTn5 que contiene
en las secuencias de inserción un gen de resistencia a la
estreptomicina, el promotor Pm, y un sitio de restricción Notl
(Figura 2a) para insertar el gen heterólogo.
Para construir pTSPm, un fragmento con el
interposón omega (Fellay et al. 1987) se insertó en el sitio
BamHI del vector pUC
18Sfi-Km^{R}-xylS-Pm-Sfi
(de Lorenzo et al. 1993) que eliminó un fragmento con
Km^{R} y xylS. El plásmido resultante se digerió con SffI y
el fragmento más grande se clonó en el esqueleto pUT de un vector
miniTn5 (Herrero et al. 1990) para obtener el plásmido pTSPm.
Vectores auxiliares de la Tabla I se pueden usar para clonar genes
heterólogos y entonces subclonarlos en el sitio NotI de
pTSPm.
Un segundo vector de expresión con un origen de
replicación ColE1 (pCCD5) contiene el promotor Pm corriente arriba
de un sitio de multiclonación, y una buena secuencia de inicio de
traducción a conveniencia en la clonación de genes heterólogos
(Figura 2b). El plásmido pCCD5 se construyó clonando un fragmento
Apol conteniendo el terminador transcripcional rrnBTl
producido tal como un fragmento de PCR a partir de
pKK232-8 utilizando los oligos
5'-GCAAATTTCCAGGCATCAAATAA y
5'-GGGAATTCCCTGGCAGTTTATGG, en el sitio
EcoRI de pFH2 (Tabla 1). Siguiendo la ligación, resulta en
un único sitio EcoRI y aquellos plásmidos con MCSs intacto
se pueden seleccionar. El promotor Pm se obtuvo por PCR,
usando los oligos A-Pm
(5'-GTGTCAAATTTGATAGGGATAAGTCC-)') y
Pm-E
(5'-GCCTGAATTCAGGCATTGACGAAGGCA-3')
como cebadores, y pUC
18Sfi-Km^{R}-xylSPm-Sfi como molde. La
digestión con Apol (subrayado) del fragmento amplificado (0,4 Kb)
dio un fragmento compatible con los extremos EcoRI, pero sólo
el extremo del fragmento corriente abajo del promotor Pm regeneró el
sitio EcoRI en la unión. Por lo tanto, la introducción del fragmento
Pm ApoI en el sentido propio en los plásmidos intermediarios
subrayados EcoRl, proporcionó vectores que contenían el promotor
Pm prediciendo un MCS intacto, con todos los elementos claves
flanqueados por sitios NotI.
Esta última característica puede permitir clonar
en vectores de distribución mini-Tn5 si se requiere
la monocopia o estabilidad del sistema de expresión. Existen hasta 8
productores diferentes en los vectores miniTn5 con el sitio NotI
donde la fusión Pm se puede clonar (de Lorenzo 1994). Los
vectores resultantes se pueden entonces insertar en el cromosoma de
la bacteria receptora por conjugación. Alternativamente, los genes
clonados en pCCD5 bajo el control Pm pueden ser transformados
en cepas con el cassette regulador en el cromosoma para
sobreexpresar el gen heterólogo del plásmido.
Figura 1. Representación esquemática de una
realización de circuito regulador en cascada. Un cassette de
expresión conteniendo el gen nahR y el promotor Psal
controla la expresión de xylS2. En presencia de un inductor
común, NahR activa la expresión de xylS2. Los altos niveles
intracelulares simultáneos de XylS2 y la estimulación de la
actividad transcripcional específica XylS2 alcanza niveles de
expresión amplificados de un gen dado bajo el control del promotor
Pm.
Figura 2. Realizaciones del esquema del vector
para la expresión de una realización de un circuito genético. (a)
vectores construidos miniTn5. El esquema en la parte superior
representa el esqueleto del plásmido suicida pUT con el origen de
replicación R6K (oriR6K), el gen de la transposasa (tnp*), el gen
\beta-lactamasa que confiere resistencia a la
ampicilina (bla), el origen de movilización (mob), y
las secuencias de inserción (extremo I y extremo O) representados
como líneas tramadas horizontales. El cassette regulador en
pCNB4-S2 y el cassette de expresión en pTSPm están
debajo del esquema pUT. El sitio de restricción NotI es raro
porque éste reconoce 8 nucleótidos. (b) Esquema del vector de
expresión pCCD5 (linearizado) que contiene el promotor Pm
corriente arriba de un MCS donde el gen heterólogo puede ser
clonado. También contiene un origen de replicación M13 que permite
formar plásmidos de DNA de cadena simple por mutagénesis dirigida a
un sitio. Como un ejemplo, la estrategia de clonación de los
diferentes fragmentos que forman la fusión lpp'-`ompA'-'phoA
se muestra.
La Figura 3, Esquema de realización de un ejemplo
de la construcción de vectores miniTn5 para una inserción en
monocopia de los genes heterólogos por transposición. tnp* es el gen
transposasa. Las secuencias de inserción se llaman extremo I y
extremo O que son sustrato de la transposasa. El DNA flanqueado por
las secuencias de inserción se puede transposar a la cepa del
receptor. El sitio NotI sirve para introducir en las secuencias de
inserción cualquier gen que se ha clonado previamente en los
vectores auxiliares que contienen sitios de clonación múltiples
flanqueados por los sitios NotI (Tabla I y por ejemplo, pUC 18Not en
el esquema).
Figura 4. Comparación de la producción de
\beta-galactosidasa en Unidades Miller (MU) entre
el sistema de cascada regulador y los sistemas simples. (a) Cinética
de producción de la \beta-galactosidasa tras la
adición de un inductor. Se añadió salicilato 2 mM a los cultivos
(DO600=0,2), y la actividad \beta-galactosidasa se
monitorizó a diferentes intervalos. Símbolos vacíos: sin salicilato.
Símbolos rellenos: con salicilato 2 mM; nahR/Psal::trp':
:'lacZ (cuadrado), xylS2/Pm:trp'::'lacZ (triángulo), y
nahR/Psal::xylS2/Pm::trp'::'lacZ (círculo). (b) Producción de
\beta-galactosidasa a diferentes concentraciones
de salicilato con nahR/Psal (círculo relleno),
xylS2/Pm (triángulo) y nahR/Psal::xylS2/Pm (círculo
hueco).
Figura 5. Capacidad para la regulación de
circuitos simples y con dos cascadas usando una jerarquía diferente
de reguladores corriente arriba y corriente abajo. S: salicilato
2mM. B: benzoato 2 mM. 3,5 dClS:
3,5-diclorosalicilato 2 mM. Valores basales de
\beta-galactosidasa de cada circuito establecidos
en E. coli fueron los siguientes: nahR/Psal (barras
negras), 65 MU; xylS2/Pm (barras abiertas), 192 MU;
nahR/Psal\phi xylS2/Pm (barras grises), 169 MU,
xylS2/Pm\phi tnahR/Psal (barras tramadas) circuito de
cascada fue de 69 Unidades Miller. Los datos eran los valores
promedio de tres experimentos individuales. Las desviaciones
estándar correspondientes se muestran en las barras de error.
Figura 6. Capacidad para la regulación de
circuitos simples y cascada en Pseudomonas putida. Las cepas
que llevan en el cromosoma diferentes minitransposones (primera
columna) conteniendo el sistema regulador descrito en la leyenda se
ensayaron para su acumulación de
\beta-galactosidasa en respuesta a benzoato 2 mM.
La cuarta columna exhibió los reguladores y orden secuencial en la
cepa correspondiente. Los datos son valores promedio de tres
experimentos individuales. Se indicaron los valores basales en
Unidades de Miller.
Figura 7. El análisis de la expresión génica del
sistema de cascada en P. putida con
nahR4-Psal como primer sistema regulador y
xy1S/Pm como el segundo.; (a) acumulación de
\beta-galactosidasa sin inductor (-), salicilato 2
mM (S), o benzoato 2 mM (B) con el sistema de cascada (izquierdo) o
elsistema simple xy1S/Pm::trp'::'lacZ (derecho). (b) Western
blot para la detección de la producción de XylS en cultivos
de P. putida (nahR4/Psal:: xy1S/Pm::trp'::'lacZ) tras
la incubación con diferentes efectores.
Ejemplo
1.1
Este ejemplo ilustra la base racional,
construcción y validación de un circuito de cascada para la
expresión génica relativa al circuito simple.
Para ensayar la eficiencia de los circuitos
genéticos amplificados, un plásmido que contiene una fusión de Pm a
trp'::'lacZ se construyó. Un fragmento NotI con esta fusión
se clonó en el sitio NotI de pTSPm, resultando en el plásmido
pTSPm-lacZ. La fusión Pm se insertó en el cromosoma
de E. coli CC118 (Herrero 1990) por apareamiento con la cepa
donadora S17-I (\lambdapir) que contenía el
plásmido pTSPm-lacZ en LB-citrato
0,8% a 30EC durante 4 horas. El conjunto de bacterias creció en
estreptomicina 25 mg/l y rifampicina 50 mg/l se usó como recipiente
en un aparejamiento con la cepa donadora E.coli
S17-1(\lambdapir)
(pCNB4-S2). Para seleccionar los transconjugados, el
producto apareado se puso en placas LB con rifampicina,
estreptomicina y kanamicina (25 mg/l). Se seleccionaron diez
colonias sensibles a ampicilina (100 mg/1) para posterior análisis
de la actividad \beta-galactosidasa (Miller 1972).
Los cultivos de colonias del transconjugante se hicieron crecer
durante toda la noche en medio LB (extracto de levadura 5 g/l,
triptona 10 g/l, 5 g/1 NaCl) a 37ºC mediante agitación. Los cultivos
se diluyeron 1:100 en medio fresco sin selección del antibiótico y
se incubaron durante 2 horas a 37ºC. Se añadió salicilato (2 mM) a
las suspensiones celulares, que entonces se agitaron a 30ºC durante
5 horas. La producción de \beta-galactosidasa sin
inductor estaba en el rango entre 100 y 400 Unidades de Miller
dependiendo del transconjugante. La expresión lacZ puede ser
inducida dramáticamente cuando los cultivos se inducen con
salicilato hasta 25.000-50.000 MU, que corresponden
a la capacidad de expresión génica de 150 a 400 veces dependiendo
del transconjugante. La variación en el nivel de expresión y
capacidad entre los transconjugantes es probablemente debida a la
proximidad del origen de replicación OriC debido a que hay
más copias del gen promedio por célula (Sousa et al.
1997).
Para comparar la expresión de lacZ a
partir del sistema de cascada con los sistemas muestra que responden
a salicilato, E. coli CC118RSL9 y CC118FH26 se usaron que
contenían inserciones de las construcciones miniTn5 con las fusiones
nahR/Psal::lacZ y xylS2/Pm::lacZ contenidas,
respectivamente, en los plásmidos pCNB4-lacZ y
pCNB2-lacZ (de Lorenzo et al. 1993).
La tasa de inducción en respuesta a salicilato y los valores
absolutos obtenidos por los sistemas simples eran
10-20 veces inferiores que aquellos obtenidos con el
sistema de cascada de CC1184S2PT32. La acumulación de
\beta-galactosidasa alcanzó el valor máximo a las
5 horas y la tasa efectiva de síntesis fue equivalente a los
sistemas simples (Figura 4a). A 0,5 mM de concentración de
salicilato la tasa de inducción alcanzó la actividad máxima a 90%. A
partir de las 10 cepas transconjugantes con el sistema regulador en
cascada, los que produjeron la capacidad de expresión génica máxima
(CC 1184S2PT32) y producción máxima de
\beta-galactosidasa (CC 1184S2PT97) se
seleccionaron. Por SDS-PAGE y densitometría, se
estimó la producción de \beta-galactosidasa para
ser un 9% del total de la proteína en CC1184S2PT32 y alrededor de un
12% en CC1184S2PT97. En contraposición, menos de un 0,6% de la
producción de \beta-galactosidasa se obtuvo con el
sistema simple.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
Ejemplo
1.2
Este ejemplo ilustra el uso comparativo de los
circuitos de cascada para la sobreexpresión del lacZ en un cromosoma
versus la configuración de un plásmido, para comparar con circuitos
simples, y para determinar la estabilidad relativa.
Desde que la amplificación de la expresión se vio
que podía aumentar si el regulador o promotor simple estaban en el
plásmido (debido al incremento de dosis del gen), fue evaluada la
conveniencia relativa de usar diferentes configuraciones de
activador/promotor para sobreproducir proteínas recombinantes. Para
hacer esto, usamos los mismos plásmidos miniTn5 pero usando la cepa
CC118\lambdapir dónde pueden replicar. Las cepas con plásmidos
pCNB4-lacZ o pCNB2-lacZ dieron
evidencia del incremento 10 ó 30 veces más cómo corresponde a la
expresión en la monocopia, indicando una dosis elevada de genes. La
comparación del sistema simple (no cascada) en los plásmidos con el
sistema en cascada en el cromosoma indicó que el nivel basal es de 3
a 64 veces menos que la bacteria con pCNB4-lacZ o
pCNB2-lacZ, respectivamente. Bajo condiciones
inducidas, el nivel de producción de
\beta-galactosidasa con el sistema en cascada en
el cromosoma fue más del doble del circuito simple nahR/Psal
y 50-89% del nivel del circuito xylS2/Pm en
el plásmido. Para combinar la fuerte regulación con un alto nivel de
rendimiento, se construyó una cepa del fago \lambdapir
lisogenizado que contiene el casete regulador
nahR/Psal::xylS2. La configuración del plásmido de la fusión
del Pm al gen heterólogo alcanzó el nivel máximo de producción de
\beta-galactosidasa y un nivel bajo de expresión
basal con respecto a la cepa pCNB4-lacZ. No
obstante, la estabilidad del sistema de cascada en la configuración
cromosómica bajo condiciones de sobreexpresión es del 100% después
de 40-50 generaciones. Por otro lado, el sistema del
plásmido mostró poblaciones bacterianas que perdían la habilidad de
expresar lacZ en un medio con un nivel de actividad
enzimática en las primeras cinco horas de inducción. Bajo
condiciones inducidas, la concentración final de células viables en
la configuración cromosómica fue alrededor de 10 veces más que
cuando lacZ fue sobreexpresado de los plásmidos. Esta
observación podría ser explicada por la presencia de otros genes
dentro del plásmido necesarios para la replicación y el
mantenimiento que son multicopia también y cuya expresión puede
causar carga metabólica.
Los cultivos crecieron a 37ºC en LB con (cepas
con plásmidos) o sin ampicilina 150 \mug/ml. Se fabricaron
cultivos de dilución 1:100 en el mismo medio sin selección
antibiótica y se incubaron durante 2 horas a 37ºC.
^{a}Se incubaron series de suspensiones
celulares con (+2OHB) o sin (-2OHB) salicilato a una concentración
final de 2 mM a 30ºC. Los niveles de
\beta-galactosidasa se midieron enzimáticamente y
se tomaron para el muestreo en SDS-PAGE después de 5
horas.
^{b}La medición de la cantidad relativa de
\beta-galactosidasa en las células se hizo por
densitometría del tinte de coomasie 8% SDS-PAGE.
^{c}El ensayo de estabilidad se completó
haciendo una serie de cultivos sin adicionar antibiótico y con la
presencia o ausencia de 2mM de salicilato a 30ºC. Después de una
estimación de 40-51 generaciones, los cultivos se
diluyeron y se colocaron en agar LB con X-gal. El
número de colonias azules contra las colonias blancas se cuentan
cómo porcentaje de cepas que mantienen el sistema de expresión. Se
realizaron tres experimentos independientes para cada cepa y
condición. Cómo era esperado, las desviaciones de los valores de la
estabilidad cambiaron considerablemente entre las cepas que
contenían los plásmidos, probablemente debido a la apariencia
hipotética de las cepas sanas durante el cultivo. Los valores
extremos (max. y min.) obtenidos se muestran. Esos casos con
resultados repetitivos se muestran como valores singulares.
^{d}No determinado= 0,5%
Éste ejemplo ilustra el uso del sistema de
expresión en cascada con un vector autoreplicativo de expresión con
el promotor Pm para sobreexpresar el DNA recombinante que
codifica por una proteína de membrana.
La expresión de una proteína del plásmido puede
ser diseñada y realizada de diferentes modos y con una gran variedad
de métodos genéticos, y variedad de antecedentes genéticos, en los
que una persona entendida en el campo está al corriente. Los
plásmidos descritos aquí demuestran tan sólo una de las posibles
realizaciones. Específicamente, los plásmidos descritos aquí
anteriormente necesitan el fago \lambdapir lisogenizado
para conservarse. Para evitar el requerimiento de la proteína \pi
para el mantenimiento del plásmido, construimos un plásmido basado
en la expresión Pm con un origen
auto-replicativo en ColE1 (derivados) (Fig. 2b).
El plásmido pCCD5 se construyó en base a pFH2
(Tabla I), que incluye un MCS versátil que permite la fácil
construcción de genes truncados. pCCD5 contiene un terminador
transcripcional (rrnBTl) para reducir la ultralectura desde
los promotores corriente arriba hasta Pm. Desde que los
casetes completos de expresión están flanqueados por sitios de
restricción NotI, se pueden obtener una gran variedad de
construcciones mini-Tn5 de fácil clonación en el
mismo sitio (de Lorenzo y Timmis 1994), y seguidamente
construcciones de DNA que se introducen en cadenas con el
minitransposón CNB4-S4. Para probar el sistema,
clonamos la secuencia híbrida lpp'-`ompA'-'phoA dentro. Esta
fusión específica codifica por una proteína de membrana externa.
Éstas son normalmente difíciles de clonar utilizando los sistemas de
expresión tradicional porqué éstos dañan a las células cuando se
sobreexpresan. Utilizamos el clon pCCD5 a pCR
lpp'-`ompA'-'phoA de pTX101 (Francisco et al. 1991)
utilizando los oligos
5'-GAGGAATTCAATCTAGAGGGTATTAATA y
5'-CGGGATCCCCGTTGTCCGGACGAGTGCC. El fragmento
fue limitado con EcoRI y BamHI y insertado en los
mismos sitios que pCCD5, resultando el plásmido p5LOA2. La
codificación del gen de la fosfatasa alcalina phoA, fue
clonado de pPHO7 (Gutiérrez y Devedjian, 1989) cómo un fragmento
BamHI en p5LOA2 (figura 2b). El plásmido resultante,
p5LOA2-AP, fue introducido en la E.coli
CC1184S2 por transformación. Los cultivos bacterianos con CC1184S2
(p5LOA2-AP) produjeron más del 20% del total de las
proteínas después de la adición de salicilato sin la detección de
ningún producto en la tintura de SDS-PAGE Coomasie
en condiciones no inducidas. El nivel máximo de proteínas se alcanzó
después de 2-3 horas de la
inducción.
inducción.
Este ejemplo ilustra cómo las moléculas efectoras
NahR y XylS2 pueden amplificar sinérgicamente la expresión de un gen
cuando son integradas adecuadamente en un circuito de cascada
genética. Se incubaron cultivos exponenciales de E. coli
CC1184S2PMT32 (cascada) y circuitos simples en cadenas de E.
coli CC118RSL9 y CC118FH26 durante 5 horas a 30ºC con diferentes
derivados de benzoato (Tabla 3). La actividad de la
\beta-galactosidasa de los cultivos incubados con
los compuestos utilizados mostró que el sistema de circuito en
cascada tiene más capacidad de expresión génica que los circuitos
simples (Tabla 3). Se observó, que en comparación con el salicilato,
otras moléculas derivadas del benzoato, pej., asantranilato y
5-cloro-salicilato, podrían también
incrementar la producción de \beta-galactosidasa
cómo mínimo en un 10%.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
Este ejemplo ilustra que hay condiciones
específicas para el segundo sistema regulador para obtener la
capacidad de expresar un gen mediante un circuito en cascada.
Específicamente, la actividad del promotor diana debería ser
dosis-dependiente por encima de un amplio rango de
concentraciones intracelulares del regulador segundo (o
terminal).
Para ver la importancia de la organización
reguladora en la amplificación del efecto, fue estudiado el efecto
intercambiador de los reguladores corriente arriba y corriente abajo
en la cascada basada en XylS2/NahR mediante la fabricación de E.
coli 2NRSL7. El cromosoma de esta cepa contiene los elementos de
DNA xylS2/Pm::nahR y Psal::trp'::'lacZ contenidos en
minitransposones especializados y es por esto que fue equivalente a
la cepa de E coli CC1184S2PT32 excepto por el orden de los
reguladores en el sistema acoplado. Cómo se muestra en la figura 5,
la capacidad de respuesta del sistema acoplado reverso en respuesta
al salicilato no incrementó la capacidad por encima del elemento
singular nahR/Psal::lacZ. Siguiendo en la misma línea, el
sistema acoplado reverso de E. coli 2NRSL7 fue completamente
insensible al benzoato efector solamente XylS2. Estas observaciones
indican que la sobreexpresión de nahR no resultó en un
incremento en paralelo de la actividad del Psal, pero sí un
exceso no productivo del segundo regulador porque la misma capacidad
de expresión génica del Psal podría ser obtenida en una
concentración relativamente baja de NahR. Estudios del mecanismo de
activación del Psal indicaron que el sitio diana para este
activador es ocupado a pesar de las condiciones de inducción (Huang.
y Schell, 1991). De esta forma, el promotor Psal aparece
dependiendo exclusivamente de la presencia o ausencia del salicilato
y la sobreexpresión del nahR no produce una elevada actividad
del promotor. Estos resultados juntos, indican que la eficiencia del
acoplamiento en una cascada de regulación requiere propiedades
específicas del regulador/promotor corriente abajo que incluye, al
menos, que la activación del promotor diana final sea
dosis-dependiente, preferiblemente por encima de un
amplio rango de concentraciones de regulador. Esto es así para XylS2
pero no para NahR. Así, la escasa sensibilidad de los dos
reguladores para el mismo efector no dio un aumento en el efecto a
menos que se estableciera la jerarquía apropiada.
Ejemplo
5.1
Este ejemplo muestra que el sistema de
amplificación en cascada puede ser diseñado para responder a
moléculas diseñadas en microorganismos diferentes que E.
coli. Se realizó un diseño de una cepa especializada de P.
putida que llevaba un circuito control de cascada de benzoato.
La racionalidad del circuito aquí descrito comprende un primer
regulador y un segundo regulador, cada uno de los cuáles reacciona
con el benzoato. Cuando el regulador corriente abajo (XylS2) ya
responde a su inductor (Fig. 6), el diseño de la nueva cascada
implica mayormente la modificación del sistema regulador corriente
arriba. Para terminar, se emplearon dos mutantes nahR
codificando por variantes sensibles a benzoato nahR3 y
nahR4 utilizando los plásmidos pCNB43 y pCNB44
respectivamente (Cebolla et al., 1997). Éstos fueron
ensamblados en un sistema acoplado nahR3/Psal::xylS2 y
nahR4Psal::xylS2, junto con el segmento reportero
Pm::lacZ, y después fueron insertados en el cromosoma de la
cepa de P. putida KT2442 para producir P.putida
43S2PmL y P.putida 44S2PmL. La inducción de estas cepas por
benzoato se comparó con las cepas de P.putida que llevan
cualquiera de los elementos simples NSL7 (nahR/Psal::lacZ),
43L (nahR3/Psal::lacZ),44L (nahR4/Psal: :lacZ) y S2PmL
(xy1S2/Pm::lacZ) o la cascada con el tipo salvaje
nahR variante 4S2PmL insensible al benzoato (Fig. 6). La
cascada con mutantes nahR sensibles al benzoato incrementaron
de 6 a 35 veces la capacidad de expresión del gen en respuesta al
benzoato comparado con los sistemas de expresión simple con
nahR3, nahR4 o xylS2. En contraposición, la cascada en
circuito con el tipo salvaje nahR en 4S2PmL
(nahR/Psal::xylS2, Pm::lacZ) en Pseudomonas mostró una
capacidad de inducción reducida por benzoato (\sim7 veces), debido
a la ausencia de la respuesta del regulador corriente arriba al
benzoato. Estas figuras correspondieron a las predicciones hechas de
la inducción simultánea de cada regulador tras la adquisición de la
capacidad de reaccionar con benzoato por NahR.
Ejemplo
5.2
Este ejemplo ilustra los experimentos diseñados
para eliminar la posibilidad de que la propiedad amplificadora fuera
sólo una característica particular de la forma mutante de XylS
(XylS2) y no del tipo salvaje.
El regulador del tipo salvaje xylS, puede
ser activado por benzoato pero no por salicilato, fue utilizado como
regulador secundario (Ramos et al. 1986). Cómo primer
regulador, utilizamos un efector mutante del regulador nahR,
nahR4, que es capaz de reconocer el benzoato en adición con
salicilato (Cebolla et al. 1997). Para conseguir esto, se
construyó el plásmido pNS mediante el cambio del fragmento Ncol
del pCNB1 (de Lorenzo et al. 1993) con el correspondiente
del pNS2. Se clonó un fragmento de Notl del pNS con xylS en
el correspondiente sitio Notl del plásmido pCNB44 (Cebolla
et al. 1997), dando lugar al plásmido
pCNB44-S, que contiene
nahR4-Psal-:xylS, y el gen de resistencia a
kanamicina en las secuencias de transposones miniTn5. La fusión de
Pm::trp::lacZ en pTPm-lacZ y su
contenido en pCNB44-S fueron insertados en el
cromosoma de Pseudomonas putida KT2442 por conjugación a
través de una cepa donante de E. coli
S17-1\lambdapir, y seleccionada con los
antibióticos apropiados. Fueron ensayados dos transconjugantes con
el sistema de cascada para su capacidad para expresar lacZ
con salicilato y benzoato. El nivel de expression fue alrededor de 4
veces mayor con el sistema en cascada que con el sistema de
regulación simple xylS/Pm (Fig. 7). Estas cepas también
produjeron alrededor de 4 veces más de
\beta-galactosidasa en presencia de salicilato que
con benzoato. Esto fue debido a la incapacidad del XylS para
responder al salicilato cómo mostró el análisis de western blot
(Figura 7). Se observó un incremento en la acumulación de XylS
cuando los cultivos fueron inducidos con salicilato. Sin embargo,
XylS tiene una débil actividad transcripcional porqué no hubo
efector para XylS. En contraposición, con la acumulación de XylS en
benzoato, el XylS producido es más activo debido a la presencia del
efector productivo. Así pues, la presencia de un efector común para
ambos reguladores es preferente para el efecto de amplificación.
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Todas las referencias citadas aquí están
incorporadas en su totalidad. Aquellos expertos en el tema
comprenderán que el espíritu y alcance de la invención está mucho
más allá de las numerosas realizaciones ya descritas y
ejemplificadas aquí.
<110> Ramírez, Angel C.
\hskip1cmMartín, Carolina S.
\hskip1cmPrieto, Víctor de Lorenzo
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> EXPRESIÓN REGULADA DE GENES CLONADOS
USANDO UN CICLO GENÉTICO EN CASCADA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 031035.0002
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140> PCT/ IB/ 00/ 00830
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
2000-06-22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> ES-9901383
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
1999-06-22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> ES-200001389
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2000-05-31
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.1
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
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<211> 23
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<212> DNA
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<213> Escherichia coli
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<400> 1
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\hskip-.1em\dddseqskipgcaaatttcc aggcatcaaa taa
\hfill23
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<210> 2
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<211> 23
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<212> DNA
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<213> Escherichia coli
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<400> 2
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<210> 3
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<212> DNA
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<213> Escherichia coli
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<400> 3
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<210> 4
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\hskip-.1em\dddseqskipgcctgaattc aggcattgac gaaggca
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<210> 5
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\hskip-.1em\dddseqskipgaggaattca atctagaggg tattaata
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<210> 6
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\hskip-.1em\dddseqskipcggatcccc gttgtccgga cgagtgcc
\hfill28
Claims (17)
1. Un circuito genético en cascada
comprendiendo:
- a)
- una o más construcciones de ácido nucleico codificando el regulador transcripcional NahR o una forma mutante del mismo y el regulador transcripcional XylS o una forma mutante del mismo;
- en dónde dichos reguladores transcripcionales codificados son preparados en un orden jerárquico tal que la expresión del regulador transcripcional NahR localizado corriente arriba o la forma mutante del mismo estimula la expresión del regulador transcripcional XylS localizado corriente abajo o la forma mutante del mismo y;.
- en dónde el regulador transcripcional NahR o la forma mutante del mismo y el regulador transcripcional XylS o la forma mutante del mismo son sensibles al mismo inductor
- b)
- un promotor diana final;
- en dónde dicho promotor diana final es sensible de forma dosis-dependiente al regulador transcripcional XylS o a la forma mutante del mismo.
2. El circuito en cascada genética de la
reivindicación 1 comprendiendo además un sitio de clonación múltiple
corriente abajo de dicho promotor diana final.
3. El circuito en cascada genética de la
reivindicación 1 ó 2 en dónde como mínimo una o más de dichas
construcciones de ácido nucleico está presente cómo integración
cromosómica.
4. El circuito en cascada genética de cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 3 en dónde cómo mínimo una o más de
dichas construcciones de ácido nucleico está presente cómo un
plásmido autoreplicativo.
5. El circuito en cascada genética de cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 4 en dónde dicho inductor es un derivado
de benzoato.
6. El circuito en cascada genética de la
reivindicación 5 en dónde dicho derivado de benzoato es salicilato,
antranilato, 2-acetilsalicilato,
4-clorosalicilato,
5-clorosalicilato,
3,5-diclorosalicilato,
5-metoxisalicilato, 3-metilbenzoato,
2-metoxibenzoato, 3-metilsalicilato,
4-metilsalicilato, o
5-metilsalicilato.
7. El circuito en cascada genética de cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 6 en dónde la expresión del regulador
transcripcional XylS o la forma mutante del mismo está modulada
mediante una molécula de ácido nucleico con la actividad moduladora
transcripcional de Psal.
8. El circuito en cascada genética de cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 7 en dónde dicho promotor diana final
comprende una molécula de ácido nucleico teniendo la actividad de
promotor de Pm.
9. El circuito en cascada genética de cualquiera
de las reivindicaciones de 1 a 8 en dónde la forma mutante del
regulador transcripcional NahR es NahR3 ó NahR4.
10. El circuito en cascada genética de cualquiera
de las reivindicaciones de 1 a 9 en dónde la forma mutante del
regulador transcripcional XylS es XylS2.
11. Una célula comprendiendo el circuito en
cascada genética de cualquiera de las reivindicaciones
precedentes.
12. La célula de la reivindicación 11 en dónde
dicha célula es procariota.
13. La célula de la reivindicación 12 en dónde
dicha célula procariota es una célula bacteriana gram negativa.
14. La célula de la reivindicación 13 en dónde
dicha célula bacteriana gram negativa es una célula Pseudomonas
putida o Escherichia coli.
15. Un método de regulación de la expresión de la
secuencia de un ácido nucleico, comprendiendo:
proporcionar la célula de cualquiera de las
reivindicaciones de 11 a 14;
colocar dicha secuencia de ácido nucleico bajo
control de dicho promotor diana final; y
inducir dicho circuito en cascada genética para
estimular la expresión de dicha secuencia de ácido nucleico.
16. El método de la reivindicación 15 en dónde
dicha secuencia de ácido nucleico codifica por un componente
seleccionado del grupo de enzimas, hormonas, factores de
crecimiento, apolipoproteínas, proteínas terapéuticas, moléculas
diagnósticas o proteínas, moléculas antisentido, ribosomas, rRNAs,
tRNAs, snRNAs, y porciones o derivados de los mismos.
17. El método de la reivindicación 16 en dónde
dicho componente codificado es una molécula marcadora
diagnóstica.
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