ES2355148T3 - Procedimiento de eliminación de secuencias de genes seleccionables. - Google Patents

Abstract

Un proceso para la integración de ácido nucleico no marcado en el cromosoma de una célula procariota que comprende: a) introducir un casete de ADN lineal en una célula, en el que dicho casete de ADN lineal comprende: i) un gen marcador de selección; ii) dos sitios de reconocimiento de recombinasas específicas de sitio de tipo dif que flanquean a dicho gen marcador de selección; y iii) dos regiones que flanquean dichos sitios de reconocimiento de recombinasas específicas de sitio de tipo dif que son homólogas a las dos regiones que flanquean el sitio de integración en el cromosoma de de la célula; b) cultivar dicha célula en condiciones de manera que el casete de ADN lineal se integre en el cromosoma celular por recombinación homóloga; y c) cultivar dicha célula en condiciones de manera que una recombinasa endógena específica de sitio, presente en el cromosoma de la célula, actúe para escindir el gen marcador de selección por recombinación específica de sitio entre los sitios de reconocimiento de recombinasas específicas de sitio de tipo dif.

Description

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La invención se refiere a un proceso para la eliminación de secuencias de genes marcadores de selección, en particular secuencias de genes de antibióticos, de moléculas de ácido nucleico. La invención se refiere 5 adicionalmente a la aplicación de este proceso en la integración y deleción de genes cromosómicos no marcados y en el control de la expresión génica.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Los genes de resistencia a antibióticos u otros genes marcadores de selección se usan rutinariamente para seleccionar la inserción cromosómica de genes heterólogos o la delección de genes nativos para crear nuevas 10 cepas de bacterias. Estos genes marcadores de selección también se usan rutinariamente para seleccionar la presencia de plásmidos en células bacterianas. Sin embargo, la conservación de genes marcadores de selección en células hospedadoras bacterianas, tanto integrados en el cromosoma como presentes en los plásmidos, causa varios problemas.

En primer lugar, la presencia de genes marcadores de selección en los cromosomas de hospedadores 15 reduce la diversidad de plásmidos que pueden propagarse en una célula, ya que estos también dependen de genes marcadores de selección para su selección y conservación. Adicionalmente, en la producción de agentes bioterapéuticos no se desean bacterias modificadas genéticamente que contengan genes de resistencia a antibióticos en los cromosomas, en particular para vacunas de ADN y en aplicaciones de terapia génica, ya que el ADN cromosómico representará un nivel contaminante bajo del producto final y conllevará el riesgo de transferir, al 20 paciente o al ambiente, el gen de resistencia a antibióticos mediante bacterias patógenas. Tampoco se desean genes de resistencia a antibióticos en plásmidos, ya que constituyen una carga metabólica en la producción de proteínas recombinantes y una preocupación en cuanto a bioseguridad cuando se está fabricando el plásmido para su uso en terapia génica y aplicaciones de vacunas de ADN.

Por lo tanto es muy deseable poder insertar o delecionar genes de cromosomas de células bacterianas sin 25 dejar atrás genes de resistencia a antibióticos u otros marcadores de selección y poder eliminar de los plásmidos, estos genes marcadores de selección, cuando ya no sean necesarios. Hasta ahora, se han desarrollado un par de estrategias para insertar y delecionar genes cromosómicos no marcados (es decir sin gen marcador de selección) en células bacterianas y para delecionar genes marcadores de plásmidos.

Una estrategia para la inserción y delección de genes no marcados se basa en integrar un plásmido, que 30 contiene un gen marcador de selección, en el cromosoma de una célula hospedadora bacteriana, mediante un solo evento de recombinación homóloga, seguido de la eliminación del plásmido por un segundo evento de recombinación (resolución) para producir de manera esperada el genotipo deseado (Leenhouts et al., 1996; Link et al., 1997). Una desventaja principal de esta estrategia es que si la inserción o la deleción reducen la eficacia biológica de la célula, en cuanto a su capacidad de supervivencia, el evento de resolución regenerará 35 invariablemente el tipo silvestre en lugar del genotipo mutante. Por lo tanto esta estrategia es muy ineficaz.

Una estrategia alternativa es usar un doble evento de recombinación para integrar eficazmente un casete génico de resistencia a antibiótico flanqueado por regiones de homología cromosómica en el cromosoma bacteriano. Los sitios de reconocimiento de una recombinasa específica de sitio (SSR) flanquean directamente al gen de resistencia a antibiótico. Después de la integración cromosómica, una recombinasa expresada en trans escinde el 40 gen de resistencia a antibiótico. Como ejemplos de sitios de recombinasas/dianas específicas de sitio usados para escindir el gen de resistencia a antibiótico se incluyen Cre/IoxP del bacteriófago P1 (Dale y Ow, 1991), FLP/FRT (Datsenko y Wanner, 2000) y R/RS (Sugita et al., 2000) de levaduras. De manera alternativa, el flanqueo de genes de resistencia a antibióticos con sitios de resolución internos permite la escisión por una transposasa expresada en trans (Sanchis et al., 1997). La desventaja de esta estrategia es que esto requiere la expresión de una recombinasa 45 o transposasa exógena, en la célula diana. Por lo tanto la célula debe transformarse dos veces.

Actualmente, los genes marcadores de selección también se eliminan de plásmidos usando recombinasas específicas de sitio como se describe para las aplicaciones cromosómicas anteriores, o más comúnmente, por digestión con endonucleasas de restricción. La estrategia con recombinasas requiere un gen adicional de recombinasa específica de sitio presente en cis o en trans en un plásmido auxiliar. La estrategia de digestión 50 mediante restricción requiere varias fases extra de manipulación del ADN del plásmido. Estas dos estrategias implican varias manipulaciones complejas.

Dada la creciente importancia en cuanto a la generación de moléculas de ácido nucleico sin genes marcadores de selección, en particular genes de resistencia a antibióticos, existe una necesidad de desarrollar procesos mejorados y más sencillos para la inserción y deleción de genes no marcados y para eliminar de plásmidos 55 genes marcadores de selección.

El documento WO01/18222 describe un método para la integración de ADN heterólogo en Escherichia coli con eliminación concreta de marcadores y replicones usados durante la construcción. Entre las secuencias a integrar se insertan secuencias de replicación y marcadores de resistencia entre dos sitios para una recombinasa específica de sitio. Mediante la expresión de la recombinasa éstos consiguen escindirse del cromosoma en el que están integradas las secuencias. El método se ilustra con FRT/FLP y otros sistemas tales como también dif/Xer. La 5 recombinasa se expresa a partir del plásmido, no se menciona otra forma de hacerlo. Por lo tanto D1 no anticipa innovación de ninguna de las reivindicaciones.

Barre et al., describen el análisis de la función de FtsK en la resolución del plásmido en E. coli mediante XerC y XerD. Los plásmidos indicadores, basados en pUC18 o pGB2 que comprenden dos sitios dif de reconocimiento de recombinasas específicas de sitio (por ejemplo, también la resistencia a antibióticos está dentro 10 de estos dos sitios) se resuelven en dos (plásmidos) in vivo. También se resuelve in vivo (por ejemplo se escinde) un casete de resistencia a Km insertado cromosómicamente flanqueado por dos sitios dif en una cepa que es cromosómicamente XerC y en la que la XerC endógena se expresa a partir del plásmido. Por lo tanto, se considera que D2 no anticipa innovación de ninguna de las reivindicaciones que requieran que la recombinasa esté presente en el cromosoma de las células. 15

Recchia et a., describen el análisis de la función de FtsK en la resolución del plásmido en E. coli mediante XerC y XerD. Los genes indicadores, basados en pUC18 o pBR322 que comprenden dos sitios dif, cer, psi o dib de reconocimiento de recombinasas específicas de sitio se resuelven en dos (plásmidos) en cepas RecA+ y RecA- in vivo en cepas XerC+. Además uno de los plásmidos que se resuelve de esta manera es pSDC124 en una cepa XerC+ WT (por ejemplo XerC en el cromosoma; Fig. 1) o en una cepa Xer+ en la que la XerC cromosómica se 20 expresa a partir del promotor WT p/ac (Fig. 2). Del protocolo de construcción en D8 (página 796, columna derecha, tercer párrafo; véase también la Tabla II o D3) es evidente que pSDC124 posee dos repeticiones directas de un sitio dit, y entre ellos se unen el gen de resistencia a kanamicina de pUC4K. Este fragmento KmR de 1,3 kb se escinde después de la resolución del plásmido mediante recombinación mediada por XerC, produciendo el plásmido pMIN33 (producto de resolución) y un círculo no-replicón de 1,3 kb que comprende el KmR. Por lo tanto la resolución de este 25 plásmido pSDC124 en una cepa WT con XerC sobre el cromosoma (D3, Fig. 1; y D8, Fig. 5) o en una cepa con una XerC cromosómica inducible (D3, Fig. 2) conduce a un producto de resolución (RP) que es pMIN33 y que carece de un gen de resistencia a kanamicina presente en el plásmido original pSDC124 y observado después de la recombinación en el círculo no-replicón. Por lo tanto D3 y D8 proporcionan, en una célula procariota, un proceso de eliminación de un marcador de selección, insertado entre dos sitios (de tipo) dif, a partir de un plásmido mediante 30 una recombinasa endógena específica de sitio presente en el cromosoma de esta célula.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

Se describe un proceso para eliminar un gen marcador de selección de una molécula de ácido nucleico en una célula que comprende cultivar una célula que comprende una molécula de ácido nucleico que comprende un gen marcador de selección flanqueado por sitios de reconocimiento de recombinasas específicas de sitio en 35 condiciones tales que una recombinasa endógena específica de sitio en la célula actúa para escindir el gen marcador de selección por recombinación específica de sitio entre los sitios de reconocimiento de recombinasas específicas de sitio. Los sitios de reconocimiento de recombinasas específicas de sitio pueden ser sitios de tipo dif.

Las células procariotas contienen recombinasas endógenas específicas de sitio que resuelven dímeros cromosómicos generados por RecA. Estas recombinasas son XerC/XerD en bacterias gram-negativas tales como 40 Escherichia coli (Leslie y Sherratt, 1995) y RipX/CodV en bacterias gram-positivas tales como Bacillus subtilis (Sciochetti et al. 2001). Estas recombinasas endógenas específicas de sitio actúan en sitios dif presentes en el cromosoma procariota. Un solo sitio dif se encuentra normalmente presente en un cromosoma procariota. Cuando se generan dímeros cromosómicos, la recombinasa específica de sitio actúa para promover la recombinación entre dos sitios dif para escindir el ADN intermedio y generar monómeros cromosómicos. 45

Las recombinasas endógenas específicas de sitio de procariotas tales como XerC/XerD y RipX/CodV también resuelven dímeros de plásmidos generados por RecA actuando en sitios de resolución diméricos que se producen de manera natural en plásmidos. Por ejemplo, el plásmido CoIE1 contiene un sitio de resolución dimérico denominado cer y el plásmido pSC101 contiene un sitio de resolución dimérico denominado psi. Cuando se forman dímeros en plásmidos, las recombinasas endógenas específicas de sitio actúan para escindir el ADN entre dos sitios 50 de resolución diméricos, produciendo monómeros de plásmidos. Sin embargo, a diferencia de los sitios dif, si las secuencias accesorias de ~ 200 pb también están presentes en el plásmido (Hayes y Sherratt, 1997) las recombinasas específicas de sitio actúan solamente en sitios de resolución diméricos restringidos al plásmido.

Las células eucariotas también contienen recombinasas endógenas específicas de sitio que actúan para escindir el ADN entre dos sitios de reconocimiento de recombinasas específicas de sitio. Por ejemplo, la 55 recombinasa Flp del plásmido de dos micrómetros de la levadura actúa para monomerizar concatómeros escindiendo el ADN entre sitios FRT.

Investigaciones experimentales en el mecanismo de acción de recombinasas específicas de sitio, en sitios dif en procariotas, han demostrado que estas recombinasas específicas de sitio también actúan para escindir el ADN

entre sitios dif en tándem presentes en un plásmido o en un cromosoma procariota (Barre et al., 2000, Recchia et al., 1999). Sin embargo, no ha existido ninguna sugerencia de que las recombinasas endógenas específicas de sitio pudieran usarse en modificación por ingeniería genética para proporcionar un proceso mejorado de integración y deleción de genes no marcados para proporcionar un proceso simplificado para eliminar, de plásmidos, genes marcadores de selección. 5

El proceso descrito anteriormente aprovecha la capacidad de las recombinasas endógenas específicas de sitio en células para actuar sobre sitios de reconocimiento de recombinasas específicas de sitio, tales como sitios de tipo dif, para eliminar genes marcadores de selección de una molécula de ácido nucleico sin introducir ninguna recombinasa exógena en trans como requieren los procesos actuales para eliminar genes marcadores de selección.

La célula en la que se realiza el proceso puede ser cualquier célula que contenga recombinasas endógenas 10 específicas de sitio que actúen en sitios de reconocimiento de recombinasas específicas de sitio. La célula puede ser una célula procariota o una célula eucariota. La célula puede ser una célula procariota que contenga recombinasas endógenas específicas de sitio que actúen en sitios de tipo dif. Las recombinasas endógenas específicas de sitio en la célula procariota que actúan en sitios de tipo dif pueden presentarse en el cromosoma de la célula procariota.

Cuando la célula es una célula procariota, esta puede ser una célula bacteriana que puede ser una célula 15 bacteriana gram negativa o una célula bacteriana gram positiva. Las células bacterianas gram negativas útiles para el proceso incluyen células de E. coli, Shigella, Vibrio y Salmonella, por ejemplo, Salmonella typhimurium. La célula bacteriana gram negativa puede ser una célula de E. coli. Las células de E. coli contienen las recombinasas específicas de sitio XerC/XerD que actúan en sitios de tipo dif. Las células bacterianas gram positivas útiles para el proceso incluyen Bacillus, Streptomyces, Listeria, Mycobacterium, Lactobacillus y Lactococcus. La célula bacteriana 20 gram positiva puede ser una célula de Bacillus subtilis. Las células de B. subtilis contienen las recombinasas específicas de sitio RipX/CodV que actúan en sitios de tipo dif. Cuando la célula es una célula procariota, puede ser una célula RecA+ o una célula RecA-. Cuando la célula es una célula eucariota, esta puede ser una célula de levadura.

Como se usa en este documento, la expresión “sitio de reconocimiento de recombinasas específicas de 25 sitio” incluye cualquier sitio que, cuando está presente en tándem en una molécula de ácido nucleico, puede verse afectado por recombinasas endógenas específicas de sitio en la célula en la que se realiza el proceso, para escindir la parte de la molécula de ácido nucleico entre los sitios tándem y producir una molécula de ácido nucleico que contenga un solo sitio de recombinasas específicas de sitio. Los sitios de reconocimiento de recombinasas específicas de sitio que flanquean el gen marcador de selección pueden ser iguales o diferentes. 30

Los sitios de reconocimiento de recombinasas específicas de sitio pueden ser sitios de tipo dif. La expresión “sitios de tipo dif” se refiere a sitios de reconocimiento de recombinasas específicas de sitio que son sitios de resolución de dímeros que pueden verse afectados por recombinasas endógenas específicas de sitio en células procariotas en las que se realiza el proceso. Los sitios de tipo dif que flanquean el gen marcador de selección pueden ser iguales o diferentes. 35

El sitio de reconocimiento de recombinasas específicas de sitio puede ser el sitio FRT de levaduras. Los sitios de tipo dif pueden incluir sitios dif encontrados en cromosomas bacterianos, tales como el sitio dif del cromosoma de E. coli (Cornet et al, 1996) y el sitio dif del cromosoma de B. subtilis (Sciochetti et al. 2001). Adicionalmente los sitios de tipo dif ejemplares incluyen sitios de tipo dif encontrados en plásmidos bacterianos, tales como el sitio cer del plásmido CoIEI de E. Coli, o el sitio psi del plásmido pSC101 de Salmonella (Cornet et al, 1996). 40 En la siguiente Tabla 1 se proporcionan las secuencias de estos sitios de tipo dif. Sin embargo, un experto apreciará que, en el proceso, también pueden usarse sitios de tipo dif distintos a los indicados en la Tabla 1 de otros cromosomas y plásmidos celulares.

También se describe el uso de sitios híbridos de tipo dif formados por combinación de sitios de tipo dif de origen natural de plásmidos y cromosomas. Un ejemplo de dicho sitio híbrido es el sitio híbrido dif-psi que también se 45 conoce como el sitio pif (Cornet et al, 1996), cuya secuencia se proporciona en la siguiente Tabla 1. Adicionalmente los sitios híbridos para su uso en el proceso pueden desarrollarse generando secuencias híbridas y determinando la capacidad de estas secuencias híbridas para actuar como sitios de tipo dif usando ensayos de recombinación simples tales como los descritos por Barre et al, 2000.

Aunque los sitios de tipo dif usados en el proceso derivan de un plásmido, la molécula de ácido nucleico 50 debe comprender adicionalmente secuencias accesorias que son necesarias para que actúen las recombinasas específicas de sitio. Estas secuencias accesorias son sitios de unión de 180 pb para las proteínas PepA y ArgR que se describen en Pham et al, 2002 y Bregu et al, 2002.

Tabla 1: Sitios de tipo dif ejemplares para su uso en la invención

Nombre del sitio (y origen)

Secuencia (5'-3')

Ecdif (cromosoma de E. coli)

GGTGCGCATAATGTATATTATGTTAAAT

cer (plásmido ColEl de E. coli)

GGTGCGTACAATTAAGGGATTATGGTAAAT

psi (plásmido pSC101 de Salmonella)

GTGCGCGCAAGATCCATTATGTTAAAC

pif (híbrido dif-psi)

GGTGCGCGCAAGATCCATTATGTTAAAT

Bsdif (cromosoma de B. subtilis)

ACTTCCTAGAATATATATTATGTAAACT

Para un experto será evidente que la naturaleza de los sitios de reconocimiento de recombinasas específicas de sitio, tales como los sitios de tipo dif, incluidos en la molécula de ácido nucleico, dependerán de las recombinasas específicas de sitio que son endógenas en la célula en la que se realiza el proceso. El proceso 5 proporciona una ventaja sobre los procesos de la técnica anterior ya que no requieren la introducción de una recombinasa exógena en trans. Por lo tanto, los sitios de reconocimiento de recombinasas específicas de sitio deben poder verse afectados por recombinasas endógenas específicas de sitio en la célula en la que se realiza el proceso. Sin embargo, esto no significa que los sitios de reconocimiento de recombinasas específicas de sitio deban ser también endógenos en la célula en la que se realiza el proceso. Por ejemplo, hay pruebas de que las recombinasas 10 específicas de sitio de una especie son puede actuar como sitios de tipo dif de otras especies (Neilson et al, 1999). Además, se ha demostrado que, las recombinasas específicas de sitio, resuelven sitios de tipo dif que son diferentes (Cornet et al, 1994), por ejemplo un sitio dif de E.Coli y un híbrido psi-dif. Por lo tanto, los sitios de reconocimiento de recombinasas específicas de sitio, tales como sitios de tipo dif, que flanquean el gen marcador de selección pueden ser iguales o diferentes. Un experto podrá seleccionar o desarrollar sitios de reconocimiento de recombinasas 15 específicas de sitio, preferiblemente sitios de tipo dif, usados para flanquear el gen marcador de selección de manera que se realice el proceso.

El gen marcador de selección puede ser cualquier gen que pueda usarse para detectar la presencia de la molécula de ácido nucleico. En la técnica, en general, se usan genes de resistencia a antibióticos para identificar células que contienen una molécula de ácido nucleico particular, sea un plásmido o un casete de ADN lineal 20 integrado en el cromosoma. El gen marcador de selección puede ser, por lo tanto, un gen de resistencia a antibióticos que permita la identificación de células que contienen la molécula de ácido nucleico por cultivo en un medio que contiene el antibiótico. En la técnica se conocen genes de resistencia a antibióticos y pueden usarse cualquiera de estos genes. Los ejemplos de genes de resistencia a antibióticos que pueden usarse incluyen genes que transmiten resistencia a kanamicina, amplicilina, cloramfenicol, tetraciclina, neomicina, blasticidina, higromicina, 25 puromicina y zeocina.

El proceso puede comprender cultivar la célula en presencia de presión selectiva sobre el gen marcador de selección y posteriormente eliminar la presión selectiva sobre el gen marcador de selección. El cultivo de la célula en presencia de una presión selectiva sobre el gen marcador de selección permite la selección de células que contienen la molécula de ácido nucleico que comprende el gen marcador de selección. La eliminación de la presión selectiva 30 sobre el gen marcador de selección permite sobrevivir a las células en las que se produce la recombinación específica de sitio para escindir el gen marcador de selección. Por lo tanto, cuando el gen marcador de selección es un gen de resistencia a antibióticos, el proceso puede comprender cultivar dicha célula en presencia del antibiótico para seleccionar las células que contienen la molécula de ácido nucleico y posteriormente cultivar dicha célula en ausencia del antibiótico. 35

La molécula de ácido nucleico puede comprender adicionalmente un segundo gen que permita selección positiva de células a partir de las cuales se ha escindido el gen marcador de selección. El segundo gen que permite la selección positiva puede incorporarse adyacente al gen marcador de selección, estando ambos genes flanqueados por sitios de reconocimiento de recombinasas específicas de sitio, tales como sitios de tipo dif, de manera que, si se produce la recombinación específica de sitio, ambos genes se escinden. Cuando la molécula de 40 ácido nucleico comprende un segundo gen que permite la selección positiva de células a partir de las cuales se ha escindido el gen marcador de selección, el proceso puede comprender adicionalmente cultivar la célula en condiciones tales que, si el segundo gen (y por tanto el gen marcador de selección) no se ha escindido, se produce la muerte celular.

Los genes adecuados que permiten la selección positiva incluyen genes que son tóxicos para la célula en 45 determinadas condiciones. Por ejemplo, el gen SacB expresa la enzima levansacarasa que convierte la sacarosa en un compuesto que es tóxico para E. Coli (Link et al., 1997). Una célula que comprende una molécula de ácido nucleico que comprende un gen de resistencia a antibiótico y un gen SacB flanqueados por sitios de reconocimiento de recombinasas específicas de sitio puede cultivarse en presencia del antibiótico para seleccionar las células que contienen la molécula de ácido nucleico. Las células pueden posteriormente cultivarse en ausencia del antibiótico, 50 permitiendo la supervivencia de células en las que se ha escindido el gen de resistencia a antibióticos así como de

células en las que no se ha producido la recombinación. Si después las células se siembran en placas sobre agar nutriente que contiene sacarosa, cualquier célula que no haya perdido ni el gen de resistencia a antibiótico ni el gen SacB, como resultado de la recombinación entre los sitios de reconocimiento de recombinasas específicas de sitio, se destruirá.

Sin embargo, como se muestra en los ejemplos, la escisión del gen marcador por recombinasas endógenas 5 específicas de sitio es, sorprendentemente, lo suficientemente eficaz que generalmente no es necesario incluir un segundo gen para la selección positiva. Esto es una ventaja adicional del proceso.

El proceso descrito anteriormente puede comprender adicionalmente la etapa de introducir la molécula de ácido nucleico en la célula. En la técnica se conocen métodos de transformación en células procariotas y transfección en células eucariotas y se describen, por ejemplo en Sambrook (Molecular Cloning; A Laboratory 10 Manual, Segunda Edición, 1989).

La molécula de ácido nucleico que comprende el gen marcador de selección flanqueado por sitios de reconocimiento de recombinasas específicas de sitio, tales como sitios de tipo dif, puede ser un casete de ADN lineal integrado en el cromosoma de la célula o de un plásmido.

Cuando la molécula de ácido nucleico que comprende el gen marcador de selección es un casete de ADN 15 lineal integrado en el cromosoma de la célula, el proceso elimina el gen marcador de selección del cromosoma y por lo tanto puede usarse como parte de un proceso para la integración de ácido nucleico no marcado en el cromosoma de una célula.

La invención proporciona un proceso para la integración de ácido nucleico no marcado en el cromosoma de una célula procariota que comprende: 20

a) introducir un casete de ADN lineal en una célula, en el que dicho casete de ADN lineal comprende:

i) un gen marcador de selección;

ii) dos sitios de reconocimiento de recombinasas específicas de sitio de tipo dif flanqueando a dicho gen marcador de selección; y

iii) dos regiones que flanquean a dichos sitios de reconocimiento de recombinasas específicas de sitio 25 de tipo dif que son homólogas a las dos regiones que flanquean el sitio de integración en el cromosoma de la célula;

b) cultivar dicha célula en condiciones de manera que el casete de ADN lineal esté integrado en el cromosoma de la célula por recombinación homóloga; y

c) cultivar dicha célula en condiciones de manera que la recombinasa endógena específica de sitio, en el 30 cromosoma de la célula, actúe para escindir el gen marcador de selección por recombinación específica de sitio, entre los sitios de reconocimiento de recombinasas específicas de sitio de tipo dif.

Las células, los sitios de reconocimiento de recombinasas específicas de sitio, las recombinasas específicas de sitio y los genes marcadores de selección empleados en el proceso de la invención son los mismos a los descritos con respecto al proceso anterior. Sin embargo, los sitios de reconocimiento de recombinasas 35 específicas de sitio son sitios de tipo dif.

El proceso de acuerdo con la invención puede usarse para la deleción o para la integración de genes no marcados y, por consiguiente, la naturaleza de la molécula de ácido nucleico cambiará. Cuando el proceso de la invención se usa para la deleción de un gen endógeno, las dos regiones que flanquean los sitios de reconocimiento de recombinasas específicas de sitio de tipo dif son homólogas a las dos regiones que flanquean el gen a 40 delecionar. Cuando el proceso de acuerdo con la invención se usa para la integración de un gen exógeno, las dos regiones que flanquean los sitios de reconocimiento de recombinasas específicas de sitio de tipo dif son homólogas a las dos regiones que flanquean el sitio de integración y el casete de ADN lineal comprende adicionalmente el gen exógeno a integrar, siempre que el gen exógeno no esté localizado entre los dos sitios de reconocimiento de recombinasas específicas de sitio de tipo dif. Será evidente para el experto que el gen exógeno a integrar no pueda 45 localizarse entre los sitios de reconocimiento de recombinasas específicas de sitio y esto daría lugar al gen exógeno que se escindiría por recombinasas endógenas específicas de sitio junto con el gen marcador de selección.

El proceso de acuerdo con la invención puede usarse no solo para delecionar genes completos sino también para delecionar partes de genes y regiones reguladoras de genes. De manera similar, puede usarse para integrar partes de genes exógenos en lugar de genes exógenos completos. 50

La búsqueda potencial de poder integrar moléculas de ácido nucleico y por tanto delecionar genes endógenos o integrar genes exógenos por recombinación homóloga, se ha documentado ampliamente en la técnica anterior. La ventaja del proceso de la invención sobre los métodos de la técnica anterior es que permite realizar la integración del ácido nucleico sin dejar atrás un gen marcador de selección y sin necesidad de introducir una

recombinasa exógena en trans para promover la eliminación del gen marcador de selección, según se requiera por procesos actuales en la técnica.

El casete de ADN lineal usado en el proceso de la invención puede producirse construyendo un plásmido que comprenda los elementos necesarios y linealizando el plásmido usando una endonucleasa de restricción. De manera alternativa, el casete de ADN lineal puede ensamblarse por PCR, que produce ADN lineal, en el que los 5 cebadores de PCR contienen secuencias en sus extremos 5’ que son homólogas a la diana cromosómica. Después, se fabrican células competentes de la cepa diana y se transforman o transfectan con ADN del plásmido linealizado o un producto PCR.

Las condiciones necesarias para la integración del casete de ADN por recombinación homóloga variarán de acuerdo con la célula procariota usada en el proceso de la invención. Para integrar el casete de ADN lineal en el 10 cromosoma diana de B. subtilis, es suficiente una transformación simple y selección de clon (por ejemplo por resistencia a antibióticos). Sin embargo, en E.Coli, la enzima RecBCD degrada rápidamente el ADN lineal, de manera que puede usarse la integración cromosómica en una cepa RecBCD- (Jasin y Schimmel, 1984; Winas et al., 1985) seguido por la trasducción de P1 en una cepa RecBCD+, si se desea (Williams et al., 1998). Cuando la cepa diana es RecA-, puede ser necesario un plásmido auxiliar que exprese recA. Una alternativa es usar un plásmido 15 auxiliar que exprese las funciones Red de lambda, bet exo y gam; estas inhiben RecBCD y permiten la integración cromosómica incluso en ausencia de RecA (Murphy, 1998).

Preferiblemente, la etapa b) del proceso de la invención comprende adicionalmente cultivar la célula en presencia de una presión selectiva sobre el gen marcador de selección. El cultivo de células en presencia de presión selectiva sobre el gen marcador de selección, permite la selección de células en las que se ha integrado el casete de 20 ADN lineal en el cromosoma. Cuando el gen marcador de selección es un gen de resistencia a antibióticos, esta etapa comprende cultivar las células en presencia de un antibiótico. Preferiblemente, la etapa c) comprende cultivar la célula en ausencia de cualquier presión selectiva, por ejemplo, en ausencia de antibiótico. El cultivo de células en ausencia de presión selectiva permite la supervivencia de células a las cuales se ha escindido el gen marcador de selección. La Figura 1 proporciona un resumen de un proceso preferido de la invención. La molécula de ácido 25 nucleico puede comprender adicionalmente un gen para la selección positiva de células en las que se ha producido la recombinación, como se describe en relación al proceso descrito anteriormente. Sin embargo, como se ha indicado anteriormente, la escisión del gen marcador de selección por recombinasas endógenas específicas de sitio, es tan eficaz que generalmente no es necesario un gen para la selección positiva de células en las que se ha producido la recombinación. 30

Se describe un proceso en el que la molécula de ácido nucleico que comprende el gen marcador de selección, en relación en el proceso descrito anteriormente, es un plásmido. Un proceso para la eliminación de un gen marcador de selección de un plásmido puede comprender introducir un plásmido que comprenda un gen marcador de selección flanqueado por sitios de reconocimiento de recombinasas específicas de sitio en una célula y cultivar dicha célula en condiciones de manera que una recombinasa endógena específica de sitio actúe para 35 escindir el gen marcador de selección del plásmido por recombinación específica de sitio entre los sitios de reconocimiento de recombinasas específicas de sitio.

Las células, los sitios de reconocimiento de recombinasas específicas de sitio, las recombinasas específicas de sitio y los genes marcadores de selección empleados en este proceso pueden ser los mismos a los descritos con respecto a los procesos descritos anteriormente. En particular, los sitios de reconocimiento de 40 recombinasas específicas de sitio pueden ser sitios de tipo dif.

Cuando la célula es una célula procariota, ésta puede ser una célula RecA+. En la fabricación industrial del ADN plasmídico para aplicaciones tales como vacunas de ADN o terapia génica, existen regulaciones rigurosas sobre la proporción del producto que es ADN monomérico, superenrollado. Estos requisitos indican que el ADN plasmídico se ha cultivado siempre en cepas RecA-, como recombinación homóloga debido a RecA genera 45 multímeros de plásmido que reducen la proporción de plásmido monomérico. Sin embargo, las cepas RecA+ son significativamente más viables que las cepas RecA-, ya que RecA es esencial para la reparación de horquillas de replicación estancadas que se producen durante la replicación cromosómica. En un cultivo de una cepa RecA-, hasta el 50% de las células no contendrán un cromosoma (Cox et al., 2000). La presencia de sitios de reconocimiento de recombinasas específicas de sitio, en particular sitios de tipo dif, en los plásmidos usados en el proceso, permiten al 50 plásmido producirse en células RecA+ sin que se produzca la multimerización del plásmido.

La célula puede cultivarse en presencia de presión selectiva sobre el gen marcador de selección y posteriormente puede cultivarse en ausencia de presión selectiva sobre el gen marcador de selección. El cultivo de la célula en presencia de presión selectiva permite la selección de células que contienen el plásmido. La eliminación de la presión selectiva sobre el gen marcador de selección permite la supervivencia de las células a las que se ha 55 escindido el gen marcador de selección. La molécula de ácido nucleico puede comprender adicionalmente un gen para la selección positiva de células en las que la se ha producido la recombinación, como se describe en relación al proceso descrito anteriormente. Sin embargo, como se ha indicado anteriormente, la escisión del gen marcador de selección por recombinasas endógenas específicas de sitio es tan eficaz que generalmente no es necesario un gen para la selección positiva de células en las que se ha producido la recombinación. 60

El proceso puede comprender adicionalmente conservar el plásmido en la célula mediante un sistema alternativo no dependiente de un gen marcador de selección. La célula y el plásmido pueden construirse de tal manera que, después de la eliminación del gen marcador de selección, el plásmido pueda conservarse mediante un sistema de conservación alternativo que no sea dependiente del gen marcador de selección. Cuando el gen marcador de selección es un gen de resistencia a antibióticos, el proceso permite la selección de células 5 transformadas que contienen el plásmido en presencia del antibiótico y, después de la delección del gen de resistencia a antibiótico, permite la conservación del plásmido mediante un sistema sin antibiótico:

El sistema sin antibiótico que permite la conservación del plásmido después de la eliminación del gen de resistencia a antibiótico puede ser de valoración operador represor (ORT). Cuando se usa la ORT para mantener el plásmido después de la eliminación del gen de resistencia a antibiótico, el plásmido comprende adicionalmente un 10 operador susceptible de unirse a un represor y la célula comprende adicionalmente un primer gen presente en el cromosoma que codifica a dicho represor y un segundo gen presente en el cromosoma que es esencial para el crecimiento celular y está funcionalmente asociado al mismo operador que está presente en el plásmido. En ausencia del plásmido, el represor se une al operador aguas arriba del segundo gen esencial, inhibiendo por lo tanto la expresión del gen esencial de manera que no existe crecimiento celular. En cambio, cuando en plásmido está 15 presente en cantidades suficientes, el operador en el plásmido valora al represor de manera que el gen esencial se expresa y existe crecimiento celular. La ORT se describe con detalle en el documento WO97/09435, Hanak y Cranenburgh, 2001 y en Cranenburgh et al., 2001. En las células y plásmidos descritos en este documento, puede usarse cualquiera de los genes esenciales, secuencias operadoras y secuencia represoras indicadas en el documento WO97/09435, en Hanak y Cranenburgh, 2001 y en Cranenburgh et al., 2001 para permitir la 20 conservación del plásmido después de la deleción del resistencia a antibiótico.

El plásmido puede comprender el operador lac y la célula puede comprender un primer gen, que codifica al represor lac presente en el cromosoma, y un segundo gen presente en el cromosoma que es esencial para el crecimiento de la célula y está funcionalmente asociado con el operador lac. En la figura 2 se ilustra el proceso de acuerdo con ese aspecto de la invención en la que el operador lac está incluido en el plásmido. 25

Una aplicación adicional para los procesos de la invención es la regulación de la expresión génica. La regulación de la expresión génica es importante ya que un nivel bajo de expresión antes de la inducción puede conducir a una carga metabólica o a efectos tóxicos desde la proteína recombinante, reduciendo o inhibiendo de esta manera el crecimiento celular y reduciendo significativamente la producción. En procariotas, para una transcripción eficaz, un promotor debe estar adyacente a un gen o a un operón. Tradicionalmente, la regulación de la 30 expresión génica se ha conseguido usando un segundo gen que expresa una proteína represora que se une a un operador en la región promotora del gen de interés, bloqueando su expresión. Por lo tanto, la expresión de gen de interés se controla controlando la expresión del represor. Como alternativa, los terminadores de la transcripción se insertan entre el promotor y el transgen de expresión de interés impidiendo la expresión. Los terminadores de la transcripción o el casete génico están flanqueados por sitios de recombinación específicos de sitio de manera que se 35 impide la expresión del gen en el casete hasta que se expresa el gen de recombinasa exógena específica de sitio, poniendo por tanto al promotor en las proximidades del transgen y permitiendo la expresión génica. Sin embargo, ambas estrategias se encuentran problemas con bajo nivel de expresión de la recombinasa exógena específica de sitio o el represor. Estos problemas se evitan usando recombinasas endógenas específicas de sitio que actúan en sitios de reconocimiento de recombinasas específicas de sitio, preferiblemente sitios de tipo dif, para controlar la 40 expresión por recombinación incluso cuando se elimina la presión de selección externa (por ejemplo selección de antibióticos).

Por lo tanto, de acuerdo con la invención, se proporciona un proceso para controlar la expresión de un gen de interés que comprende cultivar una célula procariota que comprende:

i) una primera molécula de ácido nucleico que comprende un gen de interés que está asociado funcionalmente 45 con un operador; y

ii) una segunda molécula de ácido nucleico que comprende un gen marcador de selección y un gen represor flanqueado por sitios de reconocimiento de recombinasas específicas de sitio de tipo dif, en el que dicho represor es susceptible de unirse a dicho operador

en condiciones en las que la recombinasa endógena específica de sitio en las células actúa para escindir el gen 50 marcador de selección y dicho gen represor por recombinación específica de sitio, entre los sitios de reconocimiento de recombinasas específicas de sitio de tipo dif, permitiendo por lo tanto la expresión de un gen de interés.

La primera y segunda molécula de ácido nucleico usada en este proceso puede ser ADN plasmídico o casetes ADN lineales integrados en el cromosoma de la célula. Preferiblemente, las dos moléculas de ácido nucleico son casetes lineales integrados en el cromosoma de la célula. Como alternativa, la primera molécula de ácido 55 nucleico puede ser un casete de ADN lineal integrado en el cromosoma de la célula y la segunda molécula de ácido nucleico puede ser un plásmido o viceversa.

De acuerdo con una segunda realización de este aspecto de la invención, se proporciona un proceso para

controlar la expresión de un gen de interés que comprende cultivar una célula procariota que comprende una molécula de ácido nucleico que comprende:

i) un gen de interés funcionalmente unido a un promotor; y

ii) un gen marcador de selección y un terminador de la transcripción flanqueados por sitios de reconocimiento de recombinasas específicas de sitio de tipo dif , en el que dicho gen marcador de selección y terminador de la 5 transcripción flanqueados por sitios de reconocimiento de recombinasas específicas de sitio de tipo dif, se localizan entre el gen de interés y el promotor que controla la expresión de dicho gen de interés

en condiciones en las que una recombinasa endógena específica de sitio, presente en el cromosoma de la célula, actúa para escindir el gen marcador de selección y dicho terminador de la transcripción, por recombinación específica de sitio entre los sitios de reconocimiento de recombinasas específicas de sitio de tipo dif, permitiendo por 10 lo tanto la expresión de un gen de interés.

Las células, los sitios de reconocimiento de recombinasas específicas de sitio, las recombinasas específicas de sitio y los genes marcadores de selección empleados en el proceso de este aspecto de la invención, son los mismos que los descritos con respecto al proceso descrito anteriormente. En particular, los sitios de reconocimiento de recombinasas específicas de sitio son sitios de tipo dif. La molécula de ácido nucleico puede ser 15 un plásmido o puede ser un casete de ADN lineal integrado en el cromosoma.

Preferiblemente, la célula se cultiva en presencia de presión selectiva en el gen marcador de selección seguido de eliminación de presión selectiva. Esta realización se muestra en las Figuras 3 y 4. La molécula de ácido nucleico puede comprender adicionalmente un gen para la selección positiva de células en las que se ha producido la recombinación, como se describe en relación al el proceso descrito anteriormente. 20

Los procesos de la invención también pueden realizarse para eliminar un gen marcador de selección de una molécula de ácido nucleico in vitro. Por ejemplo, el proceso puede usarse in vitro para eliminar un gen marcador de selección de un plásmido antes de introducirlo en una célula. En estas circunstancias, el plásmido puede contener un segundo gen que permite la selección positiva de células que contienen el plásmido después de su introducción en una célula. Se describe un proceso para eliminar un gen marcador de selección de una molécula de ácido 25 nucleico in vitro que comprende proporcionar una molécula de ácido nucleico que comprende un gen marcador de selección flanqueado por sitios de reconocimiento de recombinasas específicos de sitio, preferiblemente sitios de tipo dif , con una recombinasa específica de sitio que actúe para escindir el gen marcador de selección por recombinación específica de sitio entre los sitios de reconocimiento de recombinasas específicas de sitio. La recombinasa específica de sitio proporcionada el proceso puede ser cualquiera de las recombinasas procariotas o 30 eucariotas que se sabe que actúan en sitios de reconocimiento de recombinasas específicas de sitio, preferiblemente sitios de tipo dif, como se ha descrito anteriormente.

Se describen células hospedadores y moléculas de ácido nucleico para su uso en los procesos descritos anteriormente.

Se describe una molécula de ácido nucleico que comprende un gen marcador de selección flanqueado por 35 sitios de reconocimiento de recombinasas específicas de sitio. Anteriormente se han descrito los sitios de reconocimiento de recombinasas específicas de sitio adecuados y los genes marcadores de selección para incluir en las moléculas de ácido nucleico. Los sitios de reconocimiento de recombinasas específicas de sitio pueden ser sitios de tipo dif. La molécula de ácido nucleico puede ser un casete de ADN lineal o un plásmido. Cuando la molécula de ácido nucleico es un casete de ADN lineal, este puede comprender adicionalmente regiones de homología que son 40 homólogas a las regiones que flanquean la localización cromosómica en la que este se pretende integrar. El casete de ADN lineal puede comprender adicionalmente un gen exógeno. Cuando la molécula de ácido nucleico es un plásmido, puede comprender adicionalmente una secuencia operadora de manera que el plásmido pueda conservarse por ORT después de la deleción del gen marcador de selección.

Se describe una célula que comprende una molécula de ácido nucleico como se ha descrito anteriormente. 45 La célula es una célula procariota adecuada. Las células adecuadas incluyen células indicadas anteriormente. Cuando la célula comprende un plásmido que comprende un operador para conservar por ORT después de la delección del gen marcador de selección, la célula puede comprender un primer gen presente en el cromosoma que codifica al represor que se une al operador en el plásmido y un segundo gen presente en el cromosoma que está funcionalmente asociado con el mismo operador y que es esencial para el crecimiento celular, como se ha descrito 50 con más detalle anteriormente. La célula que comprende un plásmido puede ser una célula RecA+. Como se ha indicado anteriormente, la presencia en los plásmidos de sitios de reconocimiento de recombinasas específicas de sitio, tales como sitios de tipo dif , hace que puedan cultivarse en células RecA+ si el problema de multimerización (Figura 5).

Se describe un proceso para producir un ADN plasmídico monomérico superenrollado en una célula RecA+ 55 que comprende cultivar una célula RecA+ que comprende un plásmido, caracterizado por que el plásmido comprende un sitio de reconocimiento de recombinasas específicas de sitio, tal como un sitio de tipo dif. La presencia del sitio de reconocimiento de recombinasas específicas de sitio, tal como un sitio de tipo dif, impide el

problema de multimerización (Figura 5), permitiendo por lo tanto que se produzca el ADN monomérico superenrollado, que cumple con los requisitos reguladores. Los sitios de reconocimiento de recombinasas específicas de sitio adecuados, tales como sitios de tipo dif, para incluir en el plásmido se han descrito anteriormente. Preferiblemente, la célula RecA+ es una célula de E. coli.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS 5

Figura 1: Delección génica y escisión del marcador de selección usando recombinación específica de sitio en sitios dif. Para la inserción génica, un gen puede clonarse en el sitio de multi-clonación y, en caso necesario, el sitio de inserción puede ser una región intergénica.

Figura 2: Escisión del marcador de selección de un plásmido usando recombinación específica de sitio en sitios dif seguido de la eliminación de la presión de selección (por ejemplo antibiótico). 10

Figura 3: Escisión del marcador de selección y represor de un plásmido usando recombinación específica de sitio en sitios dif seguido de la eliminación de la presión de selección (por ejemplo antibiótico). Cuando el gen represor se elimina la expresión del transgen a partir del promotor se vuelve constitutiva.

Figura 4: Escisión del marcador de selección de un plásmido usando recombinación específica de sitio en sitios dif seguido de la eliminación de la presión de selección (por ejemplo antibiótico) para poner a un transgen bajo 15 el control de un promotor aguas arriba. La expresión del transgen se impide mediante un casete génico que consiste en un gen de resistencia a antibiótico y terminadores de la transcripción situados entre el promotor y el transgen. Cuando este casete se elimina por recombinación entre sitios dif, se permite la expresión del transgen a partir del promotor.

Figura 5: Resolución de multímeros plasmídicos en células RecA+. RecA convierte monómeros plasmídicos en 20 dímeros por recombinación homóloga. Si un sitio de resolución dimérico (por ejemplo cer y sus secuencias accesorias) está presente, las recombinasas naturales específicas de sitio (por ejemplo XerC y XerD) convertirán este dímero de nuevo a una forma monomérica.

Figura 6: Para amplificar cat e incorporar sitios dif flanqueantes, se usaron los cebadores 5DIFCAT y 3DIFCAT. Este se clonó en pTOPO para crear el plásmido de delección precursor pTOPO-DIFCAT. 25

Figura 7: A) Diagrama de los locus de resolución e integrantes de tipo silvestre durante la delección cromosómica de msbB. B) Gel de agarosa de productos PCR generados usando los cebadores SML y SMR. El locus msbB de tipo silvestre proporciona un producto de 1428 pb. La integración del casete ∆msbB-ADifCAT da como resultado un aumento de tamaño a 1460 pb, y la escisión de cat en sitios dif da como resultado el producto PCR final de 462 pb. 30

Figura 8: A) Diagrama de los locus de resolución e integrantes de tipo silvestre durante la integración cromosómica de rbpA. B) Gel de agarosa de productos PCR generados usando los cebadores Int F y Int R. El locus de integración de tipo silvestre entre ubiB y fadR proporciona un producto de 510 pb. La integración del casete rbp-DifCAT da como resultado el aumento de tamaño a 1936 pb y la escisión de cat en sitios dif da como resultado el producto PCR final de 938 pb. 35

La invención se describirá ahora con más detalle a modo de ejemplo con referencia a la delección e integración de genes cromosómicos. Se apreciará que, en los sistemas descritos en los Ejemplos, pueden hacerse modificaciones.

EJEMPLOS

Ejemplo 1: Delección de genes cromosómicos no marcados 40

Este ejemplo ilustra cómo se deleciona el gen msbB (Somerville et al., 1995) del cromosoma de E. coli para generar una nueva cepa con una actividad de endotoxina reducida.

En primer lugar, el gen cat de resistencia a cloranfenicol se amplificó del plásmido pK03 (Link et al., 1997) usando los cebadores 5DIFCAT y 3DIFCAT. Éstos cebadores de 81 nt se incorporaron en una región de homología 3’ que flanquea al gen cat en pK03 con un extremo 5’ que incluye un sitio dif de 28 pb y sitios de restricción Bsu36l y 45 Nsil. El producto PCR se clonó en pCR2.1 (Invitrogen) usando el método de clonación TOPO para crear un plásmido precursor de delección génica pTOPO-DifCAT (Figura 6).

Para crear una cepa con una delección génica msbB, el casete dif-cat-dif de pTOPO-DifCAT se amplificó por PCR usando cebadores con extremos 5’ homólogos en las regiones cromosómicas que flanquean msbB (msb.int F y msb.int R) para crear el producto PCR DifCAT. La cepa DH1 de E. coli se transformó con el plásmido de 50 selección de tetraciclina pTP223 que proporciona las funciones génicas Red a lambda para la protección e integración de ADN lineal (Murphy, 1998). DH1(pTP223) se transformó después con el producto PCR DifCAT y los integrantes (DH1::DifCAT∆msbB) se seleccionaron en cloranfenicol.

Para amplificar una parte del locus msbB, se usaron los cebadores SML y SMR, por diagnóstico PCR (figura 7). En DH1 de tipo silvestre, esto proporcionó un producto de 1428 pb para el locus natural msbB (carril 2). El locus integrante tenía 1460 pb, pero esta PCR también amplificó un producto de 462 pb, indicando una delección de msbB, ya que una proporción de la población experimentó recombinación mediada por XerCD incluso en presencia de cloranfenicol (carril 3). El subcultivo, en ausencia de antibióticos, dio como resultado la pérdida de pTP223 y la 5 generación de clones resolutivos, sensibles a cloranfenicol, solamente con el locus de delección msbB de 462 pb, detectado por PCR (carriles 4-7). La delección de msbB se confirmó por secuenciación de ADN.

Ejemplo 2: Inserción de genes cromosómicos no marcados

Este ejemplo muestra la inserción de un gen exógeno, el gen de ribonucleasa pancreática bovina rbpA, en un espacio cromosómico entre dos genes naturales (ubiB y fadA) en la cepa de E. coli DH1lacdapD. 10

El plásmido prbpA-DifCAT se construyó con rbpA adyacente a Dif-CAT de pTOPO-DifCAT. prbpA-DifCAT se usó como un molde de PCR con los cebadores Int F y Int R, de 70 nt. Los 20 pb en el extremo 3’ de cada cebador eran homólogos al molde y tenían un extremo 5’ de 50 pb con homología con el locus ubiB-fadA diana. Se produjo un fragmento de integración por PCR de 1691 pb y se transformó en DH1lacdapD(pTP223) para crear el integrante DH1lacdapD::rbpA-DifCAT(pTP223). 15

Para amplificar una parte del locus ubiB-fadA, por diagnóstico PCR (figura 8), se usaron los cebadores UbiB F y UbiB R. En DH1lacdapD de tipo silvestre, este proporcionó un producto de 510 pb para el locus msbB natural (carril 2). El locus integrante tenía 1936 pb, pero esta PCR también amplificó un producto de 938 pb, indicando una inserción rbpA, ya que una proporción de la población experimentó recombinación mediada por XerCD incluso en presencia de cloranfenicol (carril 3). La cepa integrante se trató con el plásmido auxiliar pTP223 y el gen cat se 20 escindió de DH1lacdapD mediante cultivo sin antibiótico y el gen integrado rbpA se detectó como un producto PCR de 938 pb (carriles 4-7). La inserción de rbpA se confirmó por secuenciación de ADN.

Ejemplo 3: Cálculo de frecuencias de escisión génicas

Estos ejemplos determinan la frecuencia de recombinación mediada por XerCD en sitios dif, medida por la escisión de genes de resistencia a antibióticos flanqueados por dif integrados en dos locus cromosómicos de E. coli 25 DH1.

Se usaron dos cepas integrantes (DH1::ΔmsbB-DifCAT y DH1::rbpA-DifCAT), con genes de resistencia a cloranfenicol flanqueados por dif insertados en diferentes locus cromosómicos (locus msbB y locus ubiB-fadA respectivamente). Estos se inocularon por triplicado en 5 ml de caldo LB que contenía 20 μg ml-1 de cloranfenicol y se cultivaron durante el día hasta una densidad óptica (DO600) de aproximadamente 0.5. Se inocularon matraces 30 agitadores que contenían 50 ml de caldo LB a una DO600 inicial de 0,005. Los matraces agitadores se incubaron a 37°C con agitación a 200 rpm. durante un período de 24 horas. Después del primer periodo de cultivo de 24 horas, se registró la DO600 y se usó un volumen calculado para inocular otro matraz agitador de 50 ml, para proporcionar de nuevo una DO de partida de 0,005. Este procedimiento de subcultivo se repitió a intervalos de 24 horas durante un periodo total de 96 horas. Después del cultivo, se calculó el número de generaciones para cada uno de los seis 35 matraces.

Después de 48 y 96 horas de cultivo, los cultivos se diluyeron en serie en caldo LB y se sembraron en placas sobre agar LB para producir colonias individuales. Para calcular la frecuencia de recombinación mediada por XerCD en los sitios dif, se reprodujeron 100 colonias para cada uno de los seis cultivos mantenidas sobre agar LB +/- 20 µg ml-1 de cloranfenicol. Los clones que se habían vuelto sensibles a cloranfenicol se exploraron por PCR 40 usando cebadores para PCR de diagnóstico para amplificar la región del locus modificada (cebadores SML y SMR para el locus msbB; UbiB F y UbiB R para el locus ubiB-fadA). Los datos resultantes se usaron para calcular las frecuencias de escisión génica de resistencia a antibióticos mediada por XerCD como se muestra en la Tabla 2.

Tabla 2. Frecuencias de escisión génica por recombinación Xer, específica de sitio, en sitios dif. Las frecuencias se indican en dos puntos de tiempo para la escisión de un gen de resistencia a cloranfenicol. 45

Escisión génica en el locus msbB Escisión génica en el locus ubiB-fadA

Tiempo (horas)

48 96 48 96

Generaciones

19,7 39,2 18,7 37,9

Frecuencia de escisión

6,3% 7,0% 1,0% 2,8%

Estos datos ilustran que tan solo dos días después del cultivo de las cepas integrantes, la frecuencia de escisión es tan alta (1-6%) que necesitan explorarse menos de 100 colonias para identificar el recombinante deseado.

Apéndice: Cebadores

Los cebadores se escriben en dirección 5’ a 3’. 5

5DIFCAT:

CCTTAGGATGCATGGTGCGCATAATGTATATTATGTTAAATCCCTTATGCGACTCCTGCATCCCTTTCGTCTTCGAATAAA

3DIFCAT:

CCTTAGGATGCATATTTAACATAATATACATTATGCGCACCATCCGCTTATTATCACTTATTCAGGCGTAGCACC10 AGGCGT

Msb-int F:

TGCGGCGAAAACGCCACATCCGGCCTACAGTTCAATGATAGTTCAACAGAAGTGTGCTGGAATTCGCCCT

Msb-int R:

TTGGTGCGGGGCAAGTTGCGCCGCTACACTATCACCAGATTGATTTTTGCATCTGCAGAATTCGCCCTTA 15

Int F:

AAACCCGCCCCTGACAGGCGGGAAGAACGGCAACTAAACTGTTATTCAGTTTGCGCCGACATCATAACGG

IntR:

GCCGGATGCGGCGTGAACGCCTTATCCGGTCTACCGATCCGGCACCAATGGCTACGGTTTGATTAGGGAA

SML: 20

TGACCTGGTGATTGTCACCC

SMR:

TAAACCAGCAGGCCGTAAAC

UbiB F:

GATCGCCTGTTTGGCGATGC 25

UbiB R:

GAATCTGATGGAACGCAAAG

REFERENCIAS:

Barre, F.-X., Aroyo, M., Colloms, S. D., Helfrich, A., Comet, F. y Sherratt, D. J., 2000. FtsK functions in the processing of a Holliday junction intermediate during bacterial chromosome segregation. Genes & Dev. 14: 2976-30 2988.

Bregu, M., Sherratt, D. J. y Colloms, S. D., 2002. Accessory factors determine the order of strand exchange in Xer recombination at psi. EMBO J. 21: 3888-3897.

Comet, F., Mortier, I., Pate, J. y Louarn, J.-M., 1994. Plasmid pSC101 harbors a recombination site, psi, which is able to resolve plasmid multimers and to substitute for the analogous chromosomal Escherichia coli site dif. J. 35 Bacteriol. 176, 3188-3195.

Cranenburgh, R. M., Hanak, J. A. J., Williams, S. G., y Sherratt, D. J. (2001). Escherichia coli strains that allow antibiotic-free plasmid selection and maintenance by repressor titration. Nucleic Acids Res. 29: e26.

Cox, M. M., Goodman, M. F., Kreuzer, K. N., Sherratt, D. J., Sandler, S. J., Marians, K. J., 2000. The importance of repairing stalled replication forks. Nature 404: 37-41. 40

Dale, E. C. y Ow, D. W., 1991. Gene transfer with subsequent removal of the selection gene from the host genome. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 10558-10562.

Datsenko, K. A. y Wanner, B. L., 2000. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 6640-6645.

Hanak, J. A. J. y Cranenburgh, R. M., 2001. Antibiotic free plasmid selection and maintenance in bacteria. In Recombinant protein production with prokaryotic and eukaryotic cells. Kluwer Academic Publishers. p. 111-124.

Jasin,M. y Schimmel,P., 1984. Deletion of an essential gene in Escherichia coli by site-specific recombination with 5 linear DNA fragments. J Bacteriol. 159: 783-786.

Leenhouts, K., Buist, G., Bolhuis, A., ten Berge, A., Kiel, J., Mierau, I., Dabrowska, M., Venema, G. y Kok, J., 1996. A general system for generating unlabelled gene replacements in bacterial chromosomes. Mol. Gen. Genet. 253: 217-224.

Leslie, N. R. y Sherratt, D. J., 1995. Site-specific recombination in the replication terminus region of Escherichia 10 coli: functional replacement of dif. EMBO J. 14: 1561-1570.

Link, A. J., Phillips, D. y Church, G. M., 1997. Methods for generating precise deletions and insertions in the genome of wild-type Escherichia coli: application to open reading frame characterization. J. Bacteriol. 1997:6228-6237.

McCulloch, R., Coggins, L. W., Colloms, S. D. y Sherratt, D. J., 1994. Xer-mediated site-specific recombination at 15 cer generates Holliday junctions in vivo. EMBO J. 13: 1844-1855.

Murphy, K. C., 1998. Use of bacteriophage X. recombination functions to promote gene replacement in Escherichia coli. J. Bactiol. 180: 2063-2071.

Recchia, G. D., Aroyo, M., Wolf, D., Blakely, G y Sherratt, D. J., 1999. FtsK-dependant and -independent pathways of Xer site-specific recombination. EMBO J. 18: 5724-5734. 20

Sanchis, V., Agaisse, H., Chaufaux, J. y Lereclus, D., 1997. A recombinase-mediated system for elimination of antibiotic resistance gene markers from genetically engineered Bacillus thuringiensis strains. Appl. Environ. Micro-biol. 63: 779-784.

Sciochetti, S.A., Piggot, P.J. y Blakely, G.W., 2001. Identification and characterisation of the dif site from Bacillus subtilis. J. Bacteriol. 183: 1058-1068. 25

Somerville, J. E., Cassiano, L., Bainbridge, B., Cunningham, M. D. y Darveau, R. P., 1995. A novel Escherichia coli lipid A mutant that produces an antiinflammatory lipopolysaccharide. J. Clin. Invest. 97: 359-365.

Sugita, K., Kasahara, T, Matsunaga, E, Ebinuma, H, 2000. A transformation vector for the production of marker-free transgenic plants containing a single copy transgene at high frequency. Plant J. 22:461-469.

Williams, S. G., Cranenburgh, R.M., Weiss, A. M. E., Wrighton, C. J., Sherratt, D. J. y Hanak, J. A. J., 1998. 30 Repressor titration: a novel system for selection and maintenance of recombinant plasmids. Nucleic Acids Res., 26: 2120-2124.

Winans S.C., Elledge S.J., Krueger, J.H., Walker, G.C., 1985. Site-Directed Insertion and Deletion Mutagenesis with Cloned Fragments in Escherichia col. J. Bacteriol., 161: 1219-1221.

Claims (27)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un proceso para la integración de ácido nucleico no marcado en el cromosoma de una célula procariota que comprende:

   a) introducir un casete de ADN lineal en una célula, en el que dicho casete de ADN lineal comprende:

   i) un gen marcador de selección;

   ii) dos sitios de reconocimiento de recombinasas específicas de sitio de tipo dif que flanquean a dicho gen 5 marcador de selección; y

   iii) dos regiones que flanquean dichos sitios de reconocimiento de recombinasas específicas de sitio de tipo dif que son homólogas a las dos regiones que flanquean el sitio de integración en el cromosoma de de la célula;

   b) cultivar dicha célula en condiciones de manera que el casete de ADN lineal se integre en el cromosoma 10 celular por recombinación homóloga; y

   c) cultivar dicha célula en condiciones de manera que una recombinasa endógena específica de sitio, presente en el cromosoma de la célula, actúe para escindir el gen marcador de selección por recombinación específica de sitio entre los sitios de reconocimiento de recombinasas específicas de sitio de tipo dif.
2. 2. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 1 en el que la célula es una célula bacteriana. 15
3. 3. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 2 en el que la célula es una célula bacteriana gram negativa.
4. 4. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 2 en el que la célula es una célula bacteriana gram positiva.
5. 5. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 3 en el que la célula es una célula de E. coli.
6. 6. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 4 en el que la célula es una célula de B. subtilis.
7. 7. Un proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 6 en el que la célula es una célula 20 RecA+.
8. 8. Un proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 en el que los sitios de reconocimiento de recombinasas específicas de sitio de tipo dif que flanquean al gen marcador de selección son iguales.
9. 9. Un proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 en el que los sitios de 25 reconocimiento de recombinasas específicas de sitio de tipo dif que flanquean al gen marcador de selección son diferentes.
10. 10. Un proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 en el que al menos uno de los sitios de tipo dif se selecciona del sitio dif de E. coli y del sitio dif de B. subtilis.
11. 11. Un proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 en el que al menos uno de los 30 sitios de tipo dif se selecciona de los sitios de tipo dif, cer y psi del plásmido y la molécula de ácido nucleico comprende adicionalmente secuencias accesorias.
12. 12. Un proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 en el que al menos uno de los sitios de tipo dif es el sitio híbrido de tipo dif, pif y la molécula de ácido nucleico comprende adicionalmente secuencias accesorias. 35
13. 13. Un proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 en el que el gen marcador de selección es un gen de resistencia a antibiótico.
14. 14. Un proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 para la delección de genes no marcados en el que las dos regiones que flanquean a dichos sitios de reconocimiento de recombinasas específicas de sitio de tipo dif son homólogas a las dos regiones que flanquean al gen a delecionar en el cromosoma de la 40 célula.
15. 15. Un proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 para la integración de genes no marcados en el que las dos regiones que flanquean a los sitios de reconocimiento de recombinasas específicas de sitio de tipo dif son homólogas a las dos regiones que flanquean al sitio de integración y el casete de ADN lineal comprende adicionalmente el gen exógeno a integrar, siempre que el gen exógeno no se localice entre los dos sitios 45 de reconocimiento de recombinasas específicas de sitio de tipo dif.
16. 16. Un proceso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 en el que la etapa b) comprende

    adicionalmente cultivar la célula en presencia de una presión selectiva en el gen marcador de selección.
17. 17. El proceso de acuerdo con la reivindicación 16 en el que la etapa c) comprende cultivar la célula en ausencia de cualquier presión selectiva.
18. 18. Un proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17 en el que la molécula de ácido nucleico comprende adicionalmente un gen para selección positiva de células en las que se ha producido la 5 recombinación.
19. 19. Un proceso para controlar la expresión de un gen de interés que comprende cultivar una célula procariota que comprende:

    i) una primera molécula de ácido nucleico que comprende un gen de interés que está funcionalmente asociado a un operador; y 10

    ii) una segunda molécula de ácido nucleico que comprende un gen marcador de selección y un gen represor flanqueados por sitios de reconocimiento de recombinasas específicas de sitio de tipo dif, en el que dicho represor es susceptible de unirse a dicho operador

    en condiciones de manera que una recombinasa endógena específica de sitio presente en el cromosoma de la célula actúa para escindir el gen marcador de selección y dicho gen represor por recombinación específica de sitio 15 entre los sitios de reconocimiento de recombinasas específicas de sitio de tipo dif permitiendo de esta manera la expresión de un gen de interés.
20. 20. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 19 que comprende las características de una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 13.
21. 21. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 19 o con la reivindicación 20 en el que la primera y segunda 20 molécula de ácido nucleico son casetes de ADN lineal integrados en el cromosoma de la célula.
22. 22. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 19 o con la reivindicación 20 en el que la primera y segunda molécula de ácido nucleicos son plásmidos.
23. 23. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 19 o con la reivindicación 20 en el que la primera molécula de ácido nucleico es un casete de ADN lineal integrado en el cromosoma de la célula y la segunda molécula de ácido 25 nucleico es un plásmido.
24. 24. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 19 o con la reivindicación 20 en el que la primera molécula de ácido nucleico es un plásmido y la segunda molécula de ácido nucleico es un casete de ADN lineal integrado en el cromosoma de la célula.
25. 25. Un proceso para controlar la expresión de un gen de interés que comprende cultivar una célula procariota 30 que comprende una molécula de ácido nucleico que comprende

    i) un gen de interés unido funcionalmente a un promotor; y

    II) un gen marcador de selección y un terminador de la transcripción flanqueados por sitios de reconocimiento de recombinasas específicas de sitio de tipo dif, en el que dicho gen marcador de selección y terminador de la transcripción flanqueados por sitios de reconocimiento de recombinasas específicas de sitio de tipo dif se 35 localizan entre el gen de interés y el promotor de control de expresión de dicho gen de interés

    en condiciones de manera que una recombinasa endógena específica de sitio presente, en el cromosoma de la célula, actúa para escindir, por recombinación específica de sitio, el gen marcador de selección y dicho terminador de la transcripción, entre los sitios de reconocimiento de recombinasas específicas de sitio de tipo dif, permitiendo de esta manera la expresión de un gen de interés. 40
26. 26. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 25 que comprende las características de una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 13.
27. 27. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 25 o con la reivindicación 26 en el que la molécula de ácido nucleico es un plásmido o es un casete de ADN lineal integrado en el cromosoma.

    M. Escalera de ADN Kb 1. Control negativo (sin ADN) 2. Tipo silvestre (ADNg DH1) 3. ADNg integrante (DH1::msbB-DifCAT) 4.-7. Clones resolutivos (DH1msbB)

    M. Escalera de ADN Kb 1. Control negativo (sin ADN) 2. Tipo silvestre (ADNg DH1) 3. ADNg integrante (DH1::rbpA-DifCAT) 4.-7. Clones resolutivos (DH1lacdapD-rbpA)