PT1766036E - Processo para a remoção de sequências de genes marcadores de selecção - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO

"PROCESSO PARA A REMOÇÃO DE SEQUÊNCIAS DE GENES MARCADORES DE SELECÇÃO"

CAMPO DA INVENÇÃO A invenção refere-se a um processo para a remoção de sequências de genes marcadores de selecção, em particular sequências de genes de antibióticos, de moléculas de ácido nucleico. A invenção refere-se ainda à aplicação deste processo na integração não marcada e deleção de genes cromossómicos e no controlo da expressão génica.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Os genes de resistência a antibióticos ou outros genes marcadores de selecção são utilizados de modo rotineiro para seleccionar a inserção cromossómica de genes heterólogos ou a deleção de genes nativos para criar novas estirpes de bactérias. Estes genes marcadores de selecção são também utilizados de modo rotineiro para seleccionar a presença de plasmideos em células bacterianas. Contudo, a retenção de genes marcadores de selecção em células hospedeiras bacterianas, quer estes estejam integrados no cromossoma ou presentes em plasmideos, dá origem a vários problemas. 1

Em primeiro lugar, a presença de genes marcadores de selecção no cromossoma do hospedeiro reduz a variedade de plasmideos que podem ser propagados numa célula, na medida em que estes também se baseiam em genes marcadores de selecção para a sua selecção e manutenção. Além disso, as bactérias geneticamente modificadas contendo genes de resistência a antibióticos no cromossoma são indesejáveis para a produção bioterapêutica, em particular para vacinas de ADN e aplicações de terapia génica, na medida em que o ADN cromossómico irá representar um contaminante de baixo nivel do produto final e comporta o risco de transferência de genes de antibióticos para bactérias patogénicas no doente ou para o ambiente. Os genes de resistência a antibióticos em plasmideos são também indesejáveis, na medida em que constituem um fardo metabólico na produção de proteínas recombinantes e uma preocupação de biossegurança quando o plasmideo está a ser fabricado para utilização em aplicações de terapia génica e vacina de ADN. É por isso altamente desejável ser capaz de inserir genes em, ou remover genes de, cromossomas de células bacterianas sem deixar ficar genes de resistência a antibióticos ou outros genes marcadores de selecção e ser capaz de remover estes genes marcadores de selecção de plasmideos quando eles já não são necessários. Até à data, foram desenvolvidas um par de estratégias para inserções e deleções de gene cromossómicos não marcados (i. e., sem gene marcador de selecção) em células bacterianas e para deleção de genes marcadores de plasmideos.

Uma estratégia para a inserção e deleção de genes não marcados baseia-se na integração de um plasmideo contendo um gene marcador de selecção no cromossoma da célula hospedeira bacteriana, através de um único evento de recombinação homóloga, 2 seguido pela remoção do plasmídeo por um segundo evento de recombinação (resolução) para produzir, expectavelmente, o genótipo desejado (Leenhouts et al. 1996; Link et al., 1997). Uma desvantagem principal desta abordagem é que se a inserção ou deleção reduz a aptidão da célula em termos da sua capacidade para sobreviver, o evento de resolução irá invariavelmente regenerar o tipo selvagem em vez do genótipo mutante. Esta abordagem é por isso altamente ineficiente.

Uma estratégia alternativa é utilizar um evento de recombinação duplo para integrar eficientemente uma cassete do gene de resistência ao antibiótico, flanqueada por regiões de homologia cromossómica no cromossoma bacteriano. Os sítios de reconhecimento para uma recombinase específica para um sítio (SSR) flanqueiam imediatamente o gene de resistência ao antibiótico. Após a integração cromossómica, uma recombinase expressa em trans excisa o gene de resistência ao antibiótico. Exemplos de recombinases específicas para um sítio/sítios alvo utilizados para excisão de genes de antibióticos incluem Cre/loxP do bacteriófago Pl (Dale e Ow, 1991), FLP/FRT (Datsenko e Wanner, 2000) e R/RS (Sugita et al., 2000) de leveduras. Alternativamente, flanquear os genes de resistência a antibióticos com sítios de resolução internos permite a excisão por uma transposase expressa em trans (Sanchis et al., 1997). A desvantagem desta estratégia é que requer que seja expressa uma recombinase ou transposase exógena na célula alvo. A célula deve por isso ser transformada duas vezes.

Os genes marcadores de selecção são também presentemente removidos dos plasmídeos utilizando recombinases específicas para um sítio como descrito para as aplicações cromossómicas acima, ou, mais frequentemente, por digestão com endonucleases 3 de restrição. A abordagem de recombinase requer que um gene de recombinase específica para um sítio adicional esteja presente em cis ou num plasmídeo auxiliar em trans. A abordagem de digestão de restrição requer vários estádios extra de manipulação de ADN plasmídico. Ambas estas abordagens envolvem várias manipulações complexas.

Dada a importância crescente da criação de moléculas de ácido nucleico sem genes marcadores de selecção, em particular genes de resistência a antibióticos, existe uma necessidade de desenvolver processos melhorados e mais simples para a inserção e deleção de genes não marcados e para remover genes marcadores de selecção de plasmídeos. 0 documento WOOl/18222 divulga um método para a integração de ADN heterólogo em Escherichia coli com remoção precisa de marcadores e replicões utilizados durante a construção. Entre as sequências a serem integradas é inserido entre dois sítios de recombinase específica para um sítio marcadores de resistência e sequências de replicação. Por expressão da recombinase estes são excisados do cromossoma onde as sequências foram integradas. 0 método é exemplificado com FRT/FLP e outros sistemas, tal como também dif/Xer. A recombinase é expressa do plasmídeo, não são mencionados outros métodos. Assim, Dl não antecipa novidade de qualquer uma das reivindicações.

Barre et al. descreve a análise da função de FtsK na resolução do plasmídeo em E. coli através de XerC e XerD. Os plasmídeos repórter, baseados em pUCl8 ou pGB2 compreendendo dois sítios de reconhecimento de recombinase específicos para dif (e. g., também a resistência a antibiótico está entre ambos estes sítios) são resolvidos em dois (plasmídeos) in vivo. 4

Também uma cassete de resistência a Km inserido no cromossoma flanqueada por dois sitios dif é resolvida in vivo (e. g., excisada) na estirpe que é cromossomicamente XerC e na qual o XerC endógeno é expresso a partir do plasmideo. Assim, considera-se que D2 não antecipa a novidade de nenhuma das reivindicações que necessitam da recombinase para estar presente no cromossoma das células.

Recchia et al. divulga a análise da função de FtsK na resolução do plasmideo em E. coli através de XerC e XerD. Plasmideos repórter, baseados em pUC18 ou pBR322 compreendendo dois sitios de reconhecimento específicos para o sítio dif, cer, psi ou dib são resolvidos em dois (plasmideos) em estirpes RecA+ e RecA~ in vivo em estirpes XerC+. Também um dos plasmideos que é resolvido de igual modo é pSDC124 quer numa estirpe XerC+ WT (e. g., XerC no cromossoma; Fig. 1) ou numa estirpe Xer+ na qual o XerC cromossómico é expresso a partir do promotor WT p/ac (Fig. 2). A partir do protocolo da construção em D8 (página 796, coluna da direita, terceiro parágrafo; ver também Tabela II de D3) é claro que o pSDC124 possui duas repetições directas de um sítio dit e entre eles fica o gene de resistência à canamicina de pUC4K. Este fragmento KmR de 1,3 kb é excisado após resolução do plasmideo através de recombinação mediada por XerC, produzindo o plasmideo pMIN33 (produto de resolução) e um círculo de não replicão de 1,3 kb compreendendo o KmR. Por isso, a resolução deste plasmideo pSDC124 numa estirpe WT com XerC no cromossoma (D3, Fig. 1; e D8, Fig. 5) ou numa estirpe com um XerC cromossómico indutível (D3, Fig. 2) conduz a um produto de resolução (RP) que é pMiN33 e que é desprovido de um gene de resistência à canamicina presente no plasmideo pSDC124 original e que se encontra após recombinação no círculo de não replicão.

Por isso, ambos D3 e D8 proporcionam um processo, numa célula 5 procariótica, de remoção de um marcador de selecção, inserido entre dois sítios (tipo-) dif, de um plasmídeo por uma recombinase específica para um sítio endógena presente no cromossoma dessa célula.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO É descrito um processo para remover um gene marcador de selecção de uma molécula de ácido nucleico numa célula compreendendo cultivar uma célula compreendendo uma molécula de ácido nucleico compreendendo um gene marcador de selecção flanqueado por sítios de reconhecimento de recombinase específica para um sítio, em condições tais que uma recombinase específica para um sítio endógena na célula actua para excisar o gene marcador de selecção por recombinação específica para um sítio entre os sítios de reconhecimento de recombinase específica para um sítio. Os sítios de reconhecimento de recombinase específica para um sítio podem ser sítios tipo-dif.

As células procarióticas contêm recombinases específicas endógenas para um sítio que resolvem dímeros cromossómicos gerados por RecA. Estas recombinases são XerC/XerD em bactérias gram-negativas, tais como Escherichia coli (Leslie e Sherratt, 1995) e RipX/CodV em bactérias gram-positivas tais como Bacillus subtilis (Sciochetti et al. 2001). Estas recombinases específicas endógenas para um sítio actuam em sítios dif presentes no cromossoma procariótico. Um único sítio dif está normalmente presente num cromossoma procariótico. Quando são criados dímeros cromossómicos, a recombinase específica para um sítio actua para promover a recombinação entre dois sítios dif 6 para excisar o ADN interveniente e criar monómeros de cromossoma.

Recombinases de procarióticos específicas para um sítio endógenas, tais como XerC/XerD e RipX/CodV também resolvem dímeros de plasmídeo criados por RecA actuando nos sítios de resolução de dímeros que ocorrem naturalmente em plasmídeos. Por exemplo, o plasmídeo ColEl contém um sítio de resolução de dímero denominado cer e o plasmídeo pSClOl contém um sítio de resolução de dímero denominado psi. Quando são formados os dímeros de plasmídeos, as recombinases específicas endógenas para um sítio actuam para excisar o ADN entre dois sítios de resolução de dímero, resultando em monómeros de plasmídeo.

Contudo, ao contrário dos sítios dif, as recombinases específicas para um sítio apenas actuam nos sítios de resolução de dímero com origem em plasmídeos se estiverem também presentes sequências acessórias de -200 pb no plasmídeo (Hayes e Sherratt, 1997). Células eucarióticas também contêm recombinases específicas endógenas para um sítio que actuam para excisar ADN entre dois sítios de reconhecimento de recombinase específica para um sítio. Por exemplo, a recombinase Flp do plasmídeo de levedura de dois mícron actua para monomerizar concatâmeros excisando o ADN entre os sítios FRT.

Investigações experimentais no mecanismo de acção de recombinases específicas para um sítio nos sítios dif em procariotas demonstraram que estas recombinases específicas para um sítio também actuam para excisar ADN entre sítios dif em tandem presentes num plasmídeo ou num cromossoma procariótico (Barre et al., 2000, Recchia et al., 1999). Contudo, não havia 7 sugestão que as recombinases específicas endógenas para um sítio pudessem ser utilizadas em engenharia genética para proporcionar um processo melhorado da integração e deleção do gene não marcado e para proporcionar um processo simplificado para remover genes marcadores de selecção de plasmídeos. 0 processo descrito acima explora a capacidade das recombinases específicas endógenas para um sítio em células actuarem nos sítios de reconhecimento de recombinase específica para um sítio, tais como sítios de tipo dif, para remover genes marcadores de selecção de uma molécula de ácido nucleico sem introduzir uma recombinase exógena em trans, como requerido por processos correntes para remover genes marcadores de selecção. A célula na qual o processo é realizado pode ser qualquer célula contendo recombinases específicas endógenas para um sítio que actua nos sítios de reconhecimento de recombinase específica para um sítio. A célula pode ser uma célula procariótica ou uma célula eucariótica. A célula pode ser uma célula procariótica que contém recombinases específicas endógenas para um sítio que actuam nos sítios tipo-dif. As recombinases específicas endógenas para um sítio na célula procariótica que actuam em sítios de tipo-dif podem estar presentes no cromossoma da célula procariótica.

Quando a célula é uma célula procariótica, pode ser uma célula bacteriana que pode ser uma célula bacteriana gram negativa ou uma célula bacteriana gram positiva. Células bacterianas gram negativas úteis para o processo incluem células de E. colif Shigella, Vibrio e Salmonella, e. g., Salmonella typhimurium. A célula bacteriana gram negativa pode ser uma célula de E. coli. As células de E. coli contêm as recombinases específicas XerC/XerD para um sítio que actuam em sítios de tipo-díf. As células bacterianas gram positivas úteis para o processo incluem Bacillus, Streptomyces, Listeria, Mycobacterium, Lactobacillus e Lactococcus. A célula bacteriana gram positiva pode ser uma célula de Bacillus subtilis. As células de B. subtilis contêm as recombinases específicas para um sítio RipX/CodV que actuam como sítios de tipo-dif. Quando a célula é uma célula procariótica, pode ser uma célula RecA+ ou uma célula RecA~. Quando a célula é uma célula eucariótica, pode ser uma célula de levedura.

Como aqui utilizado, o termo "sítio de reconhecimento de recombinase específica para um sítio" inclui qualquer sítio que, quando presente em tandem numa molécula de ácido nucleico, é capaz de ser actuada por recombinases específicas endógenas para um sítio na célula na qual o processo ocorre para excisar a porção da molécula de ácido nucleico entre os sítios em tandem e produzir uma molécula de ácido nucleico contendo um sítio único de recombinase específica para um sítio. Os sítios de reconhecimento de recombinase específica para um sítio que flanqueiam o gene marcador de selecção podem ser iguais ou diferentes.

Os sítios de reconhecimento de recombinase específica para um sítio podem ser sítios de tipo-dif. 0 termo "sítios de tipo dif" refere-se a sítios de reconhecimento de recombinase específica para um sítio que são sítios de resolução de dímero que são capazes de ser actuados por recombinases específicas endógenas para um sítio em células procarióticas nas quais o processo é realizado. Os sítios de tipo-dif que flanqueiam o gene marcador de selecção podem ser iguais ou diferentes. 9 0 sítio de reconhecimento da recombinase específica para um sítio pode ser o sítio FRT de levedura. Os sítios de tipo-dif podem incluir sítios dif que se encontram em cromossomas bacterianos, tais como o sítio dif do cromossoma de E. coli (Cornet et al., 1996) e o sítio dif do cromossoma de B. subtilis (Sciochetti et al. 2001). Sítios exemplares adicionais de tipo-dif incluem sítios tipo-dif que se encontram em plasmídeos bacterianos, tal como o sítio cer do plasmídeo ColEl de E. coli ou o sítio psi do plasmídeo pSClOl de Salmonella (Cornet et al., 1996). As sequências destes -dif são proporcionadas na Tabela 1 abaixo. Contudo, será óbvio para um especialista que sítios de tipo-díf diferentes dos listados na Tabela 1 de outros cromossomas e plasmídeos celulares podem também ser utilizados no processo. É também descrita a utilização de sítios de tipo-dif híbridos formados combinando sítios de tipo-dif que ocorrem naturalmente a partir de plasmídeos e cromossomas. Um exemplo de um tal sítio híbrido é o sítio híbrido dif-psi também conhecido como o sítio pif (Cornet et al., 1996), cuja sequência é apresentada na Tabela 1 abaixo. Outros sítios híbridos para utilização no processo podem ser desenvolvidos através da criação de sequências híbridas e determinando a capacidade dessas sequência híbridas actuarem como sítios de tipo-díf utilizando testes de recombinação simples tais como aqueles descritos por Barre et al, 2000.

Quando os sítios de tipo-díf utilizados no processo são derivados de um plasmídeo, a molécula de ácido nucleico deve compreender ainda sequências acessórias que são necessárias para as recombinases específicas para que um sítio actue. Estas sequências acessórias são sítios de ligação de 180 pb para as 10 proteínas PepA e ArgR que são descritas em Pham et al, 2002 e Bregu et al, 2002.

Tabela 1: Sítios de tipo-dif exemplares para utilização na invenção

Nome do sítio (e origem) sequência (5'-3') Ecdif (cromossoma de E. coli) GGTGCGCATAATGTATATTATGTTAAAT cer (plasmídeo ColEI de E. coli) GGTGCGTACAATTAAGGGATTATGGTAAAT psi (plasmídeo pSClOl de Salmonella) GTGCGCGCAAGATCCATTATGTTAAAC pif (híbrido dlf-psl) GGTGCGCGCAAGATCCATTATGTTAAAT Bsdif (cromossoma de B. subtílís) ACTTCCTAGAATATATATTATGTAAACT

Será óbvio para o especialista na técnica que a natureza dos sítios de reconhecimento de recombinase específica para um sítio, tais como os sítios de tipo-dif, incluídos na molécula de ácido nucleico irão depender das recombinases específicas para um sítio que são endógenas para a célula na qual o processo ocorre. O processo proporciona uma vantagem em relação a processos na técnica anterior na medida em que não requer a introdução de uma recombinase exógena em trans. Os sítios de reconhecimento de recombinase específica para um sítio devem por isso ser capazes de serem actuados por recombinases específicas endógenas para um sítio na célula na qual o processo ocorre. Contudo, isto não significa que os sítios de reconhecimento de recombinase específica para um sítio devem também ser endógenas para a célula na qual o processo está a decorrer. Por exemplo, 11 há evidência que as recombinases especificas para um sitio de uma espécie sejam capazes de actuar em sitios de tipo-dif de outra espécie (Neilson et al, 1999) . Além disso, foi demonstrado que recombinases especificas para um sitio resolvem sitios de tipo-dif que são diferentes i (Cornet et al, 1994), e. g., um sitio dif de E. coli e um hibrido psi-dif. Os sitios de reconhecimento de recombinase especifica para um sitio, tais como os sitios de tipo-dif, que flanqueiam o gene marcador de selecção podem, por isso, ser iguais ou diferentes. 0 especialista na técnica será capaz de seleccionar ou desenvolver sitios de reconhecimento de recombinase especifica para um sitio, de um modo preferido, sitios de tipo-dif, para utilizar no flanqueamento do gene marcador de selecção de modo a que o processo possa ocorrer. 0 gene marcador de selecção pode ser qualquer gene que pode ser utilizado para detectar a presença da molécula de ácido nucleico. Em geral, os genes de resistência a antibióticos são utilizados na técnica para identificar células que contêm uma molécula de ácido nucleico particular, seja ela um plasmídeo ou uma cassete de ADN linear integrada no cromossoma. 0 gene marcador de selecção pode por isso ser um gene de resistência a antibiótico que permite a identificação das células que contêm a molécula de ácido nucleico através da cultura num meio contendo o antibiótico. Os genes de resistência a antibióticos são conhecidos na técnica e qualquer um destes genes pode ser utilizado. Exemplos de genes de resistência a antibióticos que podem ser utilizados incluem genes que conferem resistência a canamicina, ampicilina, cloranfenicol, tetraciclina, neomicina, blasticidina, higromicina, puromicina e zeocina. 12 0 processo pode compreender cultivar a célula na presença de pressão selectiva no gene marcador de selecção e subsequentemente remover a pressão selectiva no gene marcador de selecção. Cultivar a célula na presença de uma pressão selectiva no gene marcador de selecção permite a selecção de células que contêm a molécula de ácido nucleico que compreende o gene marcador de selecção. A remoção da pressão selectiva no gene marcador de selecção permite que células nas quais a recombinação específica para um sítio excisa o gene marcador de selecção ocorreu para sobreviver. Quando o gene marcador de selecção é um gene de resistência a antibiótico, o processo pode assim compreender cultivar a referida célula na presença do antibiótico para seleccionar as células que contêm a molécula de ácido nucleico e subsequentemente cultivar a referida célula na ausência do antibiótico. A molécula de ácido nucleico pode ainda compreender um segundo gene que permite a selecção positiva de células das quais o gene marcador de selecção foi excisado. 0 segundo gene que permite a selecção positiva pode ser incorporado adjacente ao gene marcador de selecção, com ambos os genes flanqueados por sítios de reconhecimento de recombinase específica para um sítio, tal como sítios de tipo-dif, de modo a que ambos os genes são excisados se a recombinação específica para um sítio ocorre. Quando a molécula de ácido nucleico compreende um segundo gene que permite a selecção positiva de células a partir das quais o gene marcador de selecção foi excisado, o processo pode ainda compreender a célula em condições tais que a morte celular ocorrer se o segundo gene (e consequentemente o gene marcador de selecção) não foi excisado. 13

Os genes adequados que permitem selecção positiva incluem genes que são tóxicos para a célula em determinadas condições. Por exemplo, o gene sacB expressa a enzima levansucrase que converte a sacarose num composto que é tóxico para E. coli (Link et al., 1997). Uma célula que compreende uma molécula de ácido nucleico compreendendo um gene de resistência a antibiótico e um gene sacB flanqueado por sitios de reconhecimento de recombinase especifica para um sitio pode ser cultivada na presença do antibiótico para seleccionar células que contêm a molécula de ácido nucleico. As células podem subsequentemente ser cultivadas na ausência do antibiótico, permitindo a sobrevivência das células nas quais o gene de resistência ao antibiótico foi excisado, assim como células nas quais não ocorreu a recombinação. Se as células são então plaqueadas em agar nutriente contendo sacarose, qualquer célula que não perdeu o gene de resistência ao antibiótico e o gene sacB como resultado da recombinação entre os sitios de reconhecimento de recombinase especifica para um sitio será morta.

Contudo, como mostrado nos exemplos, a excisão do gene marcador por recombinases especificas endógenas para um sítio é, surpreendentemente, suficientemente eficiente para que seja normalmente desnecessário incluir um segundo gene para selecção positiva. Isto é uma vantagem adicional do processo. 0 processo descrito acima pode ainda compreender o passo de introduzir a molécula de ácido nucleico na célula. Os métodos de transformar células procarióticas e transfectar células eucarióticas são bem conhecidos na técnica e são descritos, por exemplo em Sambrook (Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Segunda Edição, 1989). 14 A molécula de ácido nucleico compreendendo o gene marcador de selecção flanqueado por sítios de reconhecimento de recombinase específica para um sítio, tal como sítios de tipo-dif, podem ser uma cassete de ADN linear integrada no cromossoma da célula ou um plasmídeo.

Quando a molécula de ácido nucleico compreendendo o gene marcador de selecção é uma cassete de ADN linear integrada no cromossoma da célula, o processo remove o gene marcador de selecção do cromossoma e pode por isso ser utilizado como parte de um processo para a integração de ácido nucleico não marcado no cromossoma de uma célula. A invenção proporciona um processo para a integração de ácido nucleico não marcado no cromossoma de uma célula procariótica compreendendo: a) introduzir uma cassete de ADN linear numa célula, em que a referida cassete de ADN linear compreende: i) um gene marcador de selecção; ii) dois sítios de tipo-dif de reconhecimento de recombinase específica para um sítio flanqueando o referido gene marcador de selecção; e iii) duas regiões que flanqueiam os referidos sítios de reconhecimento de recombinase específica para um sítio tipo-dif que são homólogos às duas regiões que flanqueiam o sítio de integração no cromossoma da célula; 15 b) cultivar a referida célula em condições tais que a cassete de ADN linear seja integrada no cromossoma da célula através de recombinação homóloga; e c) cultivar a referida célula em condições tais que uma recombinase específica para um sítio endógeno no cromossoma da célula actue para excisar o gene marcador de selecção através de recombinação específica para um sítio entre os sítios de reconhecimento de recombinases específicas para um sítio tipo-dif.

As células, sítios de reconhecimento de recombinase especifica para um sítio, recombinases específicas para um sítio e genes marcadores de selecção empregues no processo da invenção são iguais às descritas em relação ao processo acima. Contudo, os sítios de reconhecimento de recombinase específica para um sítio são sítios de tipo-díf. 0 processo de acordo com a invenção pode ser utilizado para a deleção de gene não marcado ou integração do gene não marcado e a natureza da molécula de ácido nucleico irá alterar consequentemente. Quando o processo da invenção é utilizado para a deleção de um gene endógeno, as duas regiões que flanqueiam os sítios de reconhecimento de recombinase específica para um sítio de tipo-díf são homólogos para as duas regiões que flanqueiam o gene a ser eliminado. Quando o processo de acordo com a invenção é utilizado para a integração de um gene exógeno, as duas regiões que flanqueiam os sítios de reconhecimento de recombinase específica para um sítio de tipo-dif são homólogos para as duas regiões que flanqueiam o sítio de integração e a cassete de ADN linear que compreende ainda o gene exógeno a ser integrado, desde que o gene exógeno não esteja localizado entre 16 os dois sítios de reconhecimento de recombinase específica para um sítio de tipo-dif. Será óbvio para o especialista que o gene exógeno a ser integrado não pode estar localizado entre os sítios de reconhecimento de recombinase específica para um sítio na medida em que isto resultaria no gene exógeno a ser excisado por recombinases específicas endógenas para um sítio juntamente com o gene marcador de selecção. 0 processo de acordo com a invenção pode ser utilizado não apenas para eliminar genes inteiros, mas também para eliminar porções de genes e regiões de genes reguladoras. De um modo semelhante, pode ser utilizado para integrar porções de genes exógenos em vez de genes exógenos completos. 0 potencial da investigação de ser capaz de integrar moléculas de ácido nucleico e desse modo eliminar genes endógenos ou integrar genes exógenos por recombinação homóloga tem sido extensivamente documentado na técnica anterior. A vantagem do processo da invenção em relação aos métodos da técnica anterior é que permite que a integração do ácido nucleico ocorra sem deixar um gene marcador de selecção para trás e sem a necessidade de introduzir uma recombinase exógena em trans para promover a remoção do gene marcador de selecção, como requerido pelos processos na técnica actual. A cassete de ADN linear utilizada no processo da invenção pode ser produzida através da construção de um plasmídeo compreendendo os elementos necessários e linearização do plasmídeo utilizando uma endonuclease de restrição. Alternativamente, a cassete de ADN linear pode ser montada por PCR, que produz ADN linear, em que os iniciadores de PCR contêm uma sequência nas suas extremidades 5' que é homóloga ao alvo 17 cromossómico. As células competentes da estirpe alvo são então produzidas e transformadas ou transfectadas com ADN de plasmídeo linearizado ou um produto de PCR.

As condições necessárias para a integração da cassete de ADN por recombinação homóloga irá variar de acordo com a célula procariótica utilizada no processo da invenção. Para integrar a cassete de ADN linear no cromossoma alvo de B. subtilis, é suficiente a simples transformação e selecção de clones (e. g., através de resistência a antibióticos) . Em E. coli, contudo, a enzima RecBCD degrada rapidamente ADN linear, de modo a que a integração cromossómica numa estirpe RecBCD- pode ser utilizada (Jasin e Schimmel, 1984; Winas et ai., 1985) seguida por transdução Pl numa estirpe RecBCD+ se desejado (Williams et al., 1998) . Quando a estirpe alvo é RecA“, pode ser necessário um plasmideo auxiliar que expressa recA. Uma alternativa é utilizar um plasmideo auxiliar expressando as funções de lambda Red bet, exo e gam; estes inibem RecBCD e permitem a integração cromossómica mesmo a ausência de RecA (Murphy, 1998).

De um modo preferido, o passo b) do processo da invenção compreende ainda cultivar a célula na presença de uma pressão selectiva no gene marcador de selecção. Cultivar a célula na presença de pressão selectiva no gene marcador de selecção permite a selecção de células nas quais a cassete de ADN linear foi integrada no cromossoma. Quando o gene marcador de selecção está num gene de resistência a antibiótico, este passo compreende cultivar as células na presença de um antibiótico. De um modo preferido, o passo c) compreende cultivar a célula na ausência de qualquer pressão selectiva, e. g., na ausência de antibiótico. Cultivar as células na ausência de pressão selectiva permite a sobrevivência de células das quais o gene 18 marcador de selecção foi excisado. A Figura 1 proporciona um sumário de um processo preferido da invenção. A molécula de ácido nucleico pode ainda compreender um gene para a selecção positiva de células nas quais ocorreu recombinação, como descrito em relação ao processo descrito acima. Contudo, como indicado anteriormente, a excisão do gene marcador de selecção por recombinases especificas endógenas para um sitio é suficientemente eficiente que um gene para a selecção positiva de células nas quais tenha ocorrido recombinação não seja geralmente necessário. É descrito um processo em que a molécula de ácido nucleico compreendendo o gene marcador de selecção referido no processo descrito acima é um plasmideo. Um processo para a remoção de um gene marcador de selecção de um plasmideo pode compreender a introdução de um plasmideo compreendendo um gene marcador de selecção flanqueado por sitios de reconhecimento de recombinase especifica para um sitio numa célula e cultivar a referida célula em condições tais que uma recombinase especifica para um sitio endógena actua na excisão do gene marcador de selecção do plasmideo por recombinação especifica para um sitio entre os sitios de reconhecimento de recombinase especifica para um sitio.

As células, sitios de reconhecimento de recombinase especifica para um sitio, recombinases especificas para um sitio e genes marcadores de selecção empregues neste processo podem ser iguais àquelas descritas em relação aos processos descritos acima. Em particular, os sitios de reconhecimento de recombinase especifica para um sitio podem ser sitios de tipo-dif. 19

Quando a célula é uma célula procariótica, pode ser uma célula RecA+. No fabrico industrial de ADN plasmidico para aplicações, tais como vacinas de ADN ou terapia génica, existem regulamentos de restrição na proporção do produto que é ADN super enrolado, monomérico. Estes requisitos significam que o ADN plasmidico foi sempre cultivado em estirpes RecA', como recombinação homóloga devido a RecA gerar multimeros de plasmideo que reduzem a proporção de plasmideo monomérico. Contudo, as estirpes RecA+ são significativamente mais viáveis do que as estirpes RecA', na medida em que RecA é essencial para reparar garfos de replicação fixos que ocorrem durante a replicação do cromossoma. Numa cultura de uma estirpe RecA', até 50% das células não contém um cromossoma (Cox et ai., 2000). A presença de sitios de reconhecimento de recombinase específica para um sitio, em particular sitios de tipo-díf, nos plasmídeos utilizados no processo permitem que o plasmideo seja produzido nas células RecA+ sem que ocorra multimerização do plasmideo. A célula pode ser cultivada na presença de pressão selectiva no gene marcador de selecção e pode subsequentemente ser cultivada na ausência de pressão selectiva no gene marcador de selecção. Cultivar a célula na presença de pressão selectiva permite a selecção de células contendo o plasmideo. A remoção de pressão selectiva no gene marcador de selecção permite a sobrevivência de células das quais o gene marcador de selecção foi excisado. A molécula de ácido nucleico pode compreender ainda um gene para a selecção positiva de células nas quais a recombinação ocorreu, como descrito em relação ao processo descrito acima. Contudo, como indicado anteriormente, a excisão do gene marcador de selecção por recombinases especificas endógenas para um sitio é suficientemente eficiente para que um 20 gene para a selecção positiva de células nas quais ocorreu recombinação não é geralmente necessário. 0 processo pode ainda compreender a manutenção do plasmideo na célula por meio de um sistema alternativo não dependente de um gene marcador de selecção. A célula e o plasmideo podem ser construídos de moda a que, após a remoção do gene marcador de selecção, o plasmideo seja capaz de ser mantido através de um sistema de manutenção alternativo que não é dependente do gene marcador de selecção. Quando o gene marcador de selecção é um gene de resistência a antibiótico, o processo permite a selecção de células transformadas contendo o plasmideo na presença do antibiótico e, após deleção do gene de resistência ao antibiótico, permite a manutenção do plasmideo através de um sistema sem antibiótico: 0 sistema sem antibiótico que permite a manutenção do plasmideo após a remoção do gene de resistência ao antibiótico pode ser a titulação do repressor do operador (ORT). Quando é utilizado o ORT para manter o plasmideo após a deleção do gene de resistência ao antibiótico, o plasmideo compreende ainda um operador susceptível de se ligar através de um repressor e a célula compreende ainda um primeiro gene presente no cromossoma que codifica o referido repressor e um segundo gene presente no cromossoma que é essencial para o crescimento celular e está funcionalmente associado com o mesmo operador que está presente no plasmideo. Na ausência do plasmideo, o repressor liga-se ao operador a montante do segundo gene essencial, inibindo, desse modo, a expressão do gene essencial de modo a que não exista crescimento celular. Em contraste, quando o plasmideo está presente em números suficientes, o operador no plasmideo titula o repressor de modo a que o gene essencial seja expresso e as 21 células cresçam. ORT é descrito em detalhe no documento WO97/09435, Hanak e Cranenburgh, 2001 e Cranenburgh et al.r 2001. Qualquer um dos genes essenciais, sequências de operador e sequências repressoras referidos no documento WO97/09435, Hanak e Cranenburgh, 2001 e Cranenburgh et al., 2001 pode ser utilizado nas células e plasmideos aqui descritos para permitir a manutenção do plasmideo após a deleção do gene de resistência ao antibiótico. O plasmideo pode compreender o operador lac e a célula pode compreender um primeiro gene que codifica o repressor lac presente no cromossoma e um segundo gene presente no cromossoma que é essencial para o crescimento celular e está funcionalmente associado ao operador lac. O processo de acordo com este aspecto da invenção é ilustrado na figura 2 em que o operador lac é incluído no plasmideo.

Uma aplicação adicional para os processos da invenção está na regulação da expressão génica. A regulação da expressão génica é importante como um baixo nível de expressão antes da indução poder conduzir a um fardo metabólico ou efeitos tóxicos da proteína recombinante, reduzindo assim, ou inibindo do crescimento celular e reduzindo significativamente o rendimento. Em procariotas um promotor deve ser adjacente a um gene ou um operão para transcrição eficaz. Tradicionalmente, a regulação da expressão génica foi alcançada utilizando um segundo gene que expressa uma proteína repressora que se liga a um operador na região do promotor do gene de interesse, bloqueando a sua expressão. A expressão do gene de interesse é assim controlada através do controlo da expressão do repressor. Alternativamente, os terminadores de transcrição são inseridos entre o promotor e o transgene de expressão de interesse evitando a expressão. Os 22 terminadores de transcrição ou a cassete do gene é flanqueada por sítios de recombinação específica para um sítio de modo a que a expressão do gene na cassete seja prevenida até o gene da recombinase específico para o sítio específico exógeno ser expresso, colocando assim o promotor na vizinhança do transgene e permitindo a expressão génica. Contudo, ambas estas estratégias encontram problemas com o baixo nível de expressão da recombinase específica para um sítio exógena ou o repressor. Estes problemas são evitados através da utilização de recombinases específicas endógenas para um sítio que actuam nos sítios de reconhecimento de recombinase específica para um sítio, de um modo preferido, sítios de tipo-dif, para controlar a expressão por um evento de recombinação quando é removida uma pressão de selecção externa (e. g., selecção de antibiótico).

De acordo com a invenção, é por isso proporcionado um processo para controlar expressão de um gene de interesse compreendendo cultivar uma célula procariótica compreendendo: i) uma primeira molécula de ácido nucleico compreendendo um gene de interesse que está funcionalmente associada com um operador; e ii) uma segunda molécula de ácido nucleico compreendendo um gene marcador de selecção e um gene repressor flanqueado por sítios de reconhecimento de recombinase específica para um sítio de tipo-dif, em que o referido repressor é susceptível de se ligar ao referido operador em condições tais que uma recombinase específica para um sítio endógena na célula actua para excisar o gene marcador de selecção e o referido gene repressor por recombinação específica 23 para um sítio entre os sítios de reconhecimento de recombinase específica para um sítio de tipo-díf, permitindo desse modo a expressão de um gene de interesse. A primeira e a segunda moléculas de ácido nucleico utilizadas neste processo podem ser ADN plasmídico ou cassetes de ADN linear integrados no cromossoma da célula. De um modo preferido, ambas as moléculas de ácido nucleico são cassetes lineares integradas no cromossoma da célula. Alternativamente, a primeira molécula de ácido nucleico pode ser uma cassete de ADN linear integrada no cromossoma da célula e a segunda molécula de ácido nucleico pode ser um plasmídeo ou vice-versa.

De acordo com uma segunda forma de realização este aspecto da invenção, é proporcionado um processo para controlar a expressão de um gene de interesse compreendendo cultivar uma célula procariótica compreendendo uma molécula de ácido nucleico compreendendo i) um gene de interesse ligado funcionalmente a um promotor; e ii) um gene marcador de selecção e um terminador de transcrição flanqueado por sítios de reconhecimento de recombinase específica para um sítio de tipo-díf, em que o referido gene marcador de selecção e terminador de transcrição flanqueado por sítios de reconhecimento de recombinase específica para um sítio de tipo-dif estão localizados entre o gene de interesse e o promotor que controla a expressão do referido gene de interesse 24 em condições tais que uma recombinase especifica para um sitio endógena presente no cromossoma da célula actua para excisar o gene marcador de selecção e o referido terminador de transcrição através de recombinação especifica para um sitio entre os sítios de reconhecimento de recombinase específica para um sítio de tipo-dif, permitindo desse modo a expressão do gene de interesse.

As células, sítios de reconhecimento de recombinase específica para um sítio, recombinases específicas para um sítio e genes marcadores de selecção empregues no processo deste aspecto da invenção são iguais àqueles descritos em relação ao processo descrito acima. Em particular, os sítios de reconhecimento de recombinases específicas para um sítio são sítios de tipo-díf. A molécula de ácido nucleico pode ser um plasmídeo ou pode ser uma cassete de ADN linear integrada no cromossoma.

De um modo preferido, a célula é cultivada na presença de pressão selectiva no gene marcador de selecção seguido por remoção da pressão selectiva. Esta forma de realização é mostrada nas Figuras 3 e 4. A molécula de ácido nucleico pode compreender ainda um gene para a selecção positiva de células nas quais a recombinação ocorreu, como descrito em relação ao processo descrito acima.

Os processos da invenção podem também ser realizados para remover um gene marcador de selecção de uma molécula de ácido nucleico in vitro. Por exemplo, o processo pode ser utilizado in vitro para remover um gene marcador de selecção de um plasmídeo antes de o introduzir numa célula. Nestas circunstâncias, o plasmídeo pode conter um segundo gene que 25 permite que a selecção positiva das células contendo o plasmideo após a sua introdução numa célula. É descrito um processo para remover um gene marcador de selecção de uma molécula de ácido nucleico in vitro compreendendo fornecer uma molécula de ácido nucleico compreendendo um gene marcador de selecção flanqueado por sítios de reconhecimento de recombinase especifica para um sitio, de um modo preferido, sítios de tipo-dif, com uma recombinase específica para um sítio que actua para excisar o gene marcador de selecção por recombinação específica para um sítio entre os sítios de reconhecimento de recombinase específica para um sítio. A recombinase específica para um sítio fornecida no processo pode ser qualquer uma dessas recombinases procarióticas ou eucarióticas que são conhecidas por actuarem nos sítios de reconhecimento de recombinase específica para um sítio, de um modo preferido, sítios de tipo-dif, como descrito anteriormente. São descritas células hospedeiras e moléculas de ácido nucleico para utilização nos processos descritos acima. É descrita uma molécula de ácido nucleico compreendendo um gene marcador de selecção flanqueado por sítios de reconhecimento de recombinase específica para um sítio. Sítios de reconhecimento de recombinase específica para um sítio e genes marcadores de selecção adequados para inclusão nas moléculas de ácido nucleico são discutidos acima. Os sítios de reconhecimento de recombinase específica para um sítio podem ser sítios de tipo-díf. A molécula de ácido nucleico pode ser uma cassete de adn linear ou um plasmideo. Quando a molécula de ácido nucleico é uma cassete de ADN linear, pode compreender ainda regiões de homologia que são homólogas às regiões flanqueadoras da localização cromossómica na qual se pretende 26 que seja integrada. A cassete de ADN linear pode ainda compreender um gene exógeno. Quando a molécula de ácido nucleico é um plasmideo, pode compreender ainda uma sequência operadora de modo a que o plasmideo possa ser mantido por ORT após deleção do gene marcador de selecção. É descrita uma célula compreendendo uma molécula de ácido nucleico como descrita acima. A célula é uma célula procariótica. Células adequadas incluem as células discutidas acima. Quando a célula compreende um plasmideo compreendendo um operador para a manutenção por ORT após deleção do gene marcador de selecção, a célula pode compreender um primeiro gene presente no cromossoma que codifica o repressor que se liga ao operador no plasmideo e um segundo gene presente no cromossoma que está funcionalmente associado com o mesmo operador e essencial para o crescimento celular, como descrito em maior detalhe acima. A célula compreendendo um plasmideo pode ser uma célula RecA+. Como referido acima, a presença dos sitios de reconhecimento de recombinase especifica para um sitio, tais como os sitios de tipo-dif, nos plasmideos permite que sejam cultivados em células RecA+ sem o problema da multimerização (Figura 5). É descrito um processo para produzir um ADN plasmidico super enrolado, monomérico numa célula RecA+ compreendendo cultivar uma célula RecA+ compreendendo um plasmideo, caracterizado por o plasmideo compreende um sitio de reconhecimento de recombinase especifica para um sitio, tal como um sitio de tipo-dif. A presença do sitio de reconhecimento da recombinase especifica para um sitio, tal como um sitio de tipo-dif, previne o problema de multimerização (Figura 5), permitindo desse modo que o ADN super enrolado monomérico que cumpre os requisitos de regulação seja produzido. Sitios de reconhecimento de recombinase 27 específica para um sítio adequados, tais como os sítios de tipo-dif, para incluir no plasmídeo são descritos acima. De um modo preferido, a célula RecA+ é uma célula de E. coli. BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS:

Figura 1: Deleção do gene e excisão de marcador de selecção utilizando recombinação específica para um sítio nos sítios dif. Para a inserção do gene, pode ser clonado um gene no sítio de multi-clonagem e o sítio de inserção pode ser uma região intergénica se necessário.

Figura 2: Excisão do marcador de selecção de um plasmídeo utilizando recombinação específica para um sítio nos sítios dif após a remoção da pressão de selecção (e. g., antibiótico).

Figura 3: Excisão de marcador de selecção e repressor de um plasmídeo utilizando recombinação específica para um sítio nos sítios dif após a remoção da pressão de selecção (e. g., antibiótico). Com o gene repressor removido, a expressão do transgene do promotor torna-se constitutiva.

Figura 4: Excisão do marcador de selecção de um plasmídeo utilizando recombinação específica para um sítio nos sítios dif após a remoção da pressão de selecção (e. g., antibiótico) para colocar um transgene sob o controlo de um promotor a montante. A expressão do transgene é prevenida por uma cassete de genes que consiste num gene de resistência a antibiótico e terminadores de transcrição colocados entre o promotor e o transgene. Com esta cassete 28 removida por recombinação entre sítios dif, a expressão do transgene do promotor é permitida.

Figura 5: Resolução de multímeros de plasmídeo em células RecA+. RecA converte monómeros de plasmídeo em dímeros por recombinação homóloga. Se um sítio de resolução de dímero dif (e. g., cer e as suas sequências acessórias) está presente, as recombinases específicas para um sítio nativas (e. g., XerC e XerD) irá converter este dímero de volta a uma forma monomérica.

Figura 6: Os iniciadores 5DIFCAT e 3DIFCAT foram utilizados para amplificar cat e incorporar sítios dif flanqueadores. Este foi clonado em pTOPO para criar a deleção do plasmídeo precursor pTOPO-DIFCAT.

Figura 7: A) Diagrama do tipo selvagem, loci integrantes e resolventes durante a deleção cromossómica de msbB. B) Gel de agarose de produtos de PCR criados utilizando os iniciadores SML e SMR. 0 locus de tipo selvagem msbB produz um produto de 1428 pb. A integração da cassete AmsbB-ADifCAT resulta num aumento no tamanho de 1460 pb e a excisão de cat nos sítios dif resulta no produto final de PCR, de 462 pb.

Figura 8: A) Diagrama do tipo selvagem, loci integrantes e resolventes durante a integração cromossómica de rbpA. B) Gel de agarose de produtos de PCR criados utilizando os iniciadores Int F e Int R. A integração do locus de tipo selvagem entre ubiB e fadR produz um produto de 510 pb. A integração da cassete rbp-DifCAT resulta num aumento no tamanho para 1936 pb e a excisão de cat nos sítios dif resulta no produto final de PCR, de 938 pb. 29 A invenção será agora descrita em mais detalhe a titulo de exemplo com referência à deleção e integração do gene cromossómico. Será entendido que podem ser realizadas modificações nos sistemas descritos nos Exemplos.

EXEMPLOS

Exemplo 1: Deleção do gene cromossómico não marcado

Este exemplo ilustra como o gene msbB (Somerville et al., 1995) foi eliminado a partir do cromossoma de E. coli para criar uma nova estirpe com uma actividade de endotoxina reduzida.

Em primeiro lugar, o gene de resistência a cloranfenicol cat foi amplificado a partir do plasmideo pK03 (Link et al., 1997) utilizando os iniciadores 5DIFCAT e 3DIFCAT. Estes iniciadores de 81 nt incorporaram uma região de homologia 3' que flanqueia o gene cat em pK03 com uma cauda 5' que incluiu um sitio dif de 28 pb e os sítios de restrição de Bsu361 e NsiI. Este produto de PCR foi clonado no pCR2.1 (Invitrogen) utilizando o método de clonagem TOPO para criar um plasmideo de deleção do gene precursor, pTOPO-DifCAT (Figura 6).

Para criar uma estirpe com uma deleção do gene msbB, a cassete dif-cat-dif de pTOPO-DifCAT foi amplificada por PCR utilizando os iniciadores com extremidades 5' homólogas em relação às regiões cromossómicas que flanqueiam msbB (msb.int F e msb.int R) para criar o produto de PCR DifCAT. A estirpe de E. coli DHl foi transformada com um plasmideo pTP223 seleccionado com tetraciclina que proporciona o gene Red de lambda que 30 funciona para a protecção e integração de ADN linear (Murphy, 1998). A DHl(pTP223) foi então transformada com o produto de PCR DifCAT, e os integrantes (DHl::DifCATAmsbB) foram seleccionados em cloranfenicol.

Os iniciadores SML e SMR foram utilizados para amplificar uma parte do locus msbB através de PCR de diagnóstico (figura 7) . Em DHl tipo selvagem, isto produziu um produto de 1428 pb para o locus de msbB nativo (pista 2). 0 locus integrante foi 1460 pb, mas esta PCR também amplificou um produto de 462 pb, indicando uma deleção de msbB, como uma proporção da população foram submetidos a recombinação mediada por XerCD mesmo na presença de cloranfenicol (pista 3). A subcultura na ausência de antibióticos resultou na perda de pTP223 e na criação de clones resolventes, sensíveis ao cloranf enicol com apenas o locus de deleção de msbB de 462 pb detectado por PCR (pistas 4-7). A deleção de msbB foi confirmada por sequenciação de ADN.

Exemplo 2: Inserção do gene cromossómlco não marcado

Este exemplo apresenta a inserção de um gene exógeno, o gene da ribonuclease pancreática de bovino rbpA, num espaço cromossómico entre dois genes nativos (ubiB e fadA) na estirpe DHllacdapD de E. coli. O plasmídeo prbpA-DifCAT foi construído com rbpA adjacente a Dif-CAT de pTOPO-DifCAT. O prbpA-DifCAT foi utilizado como um molde de PCR com os iniciadores de 70 nt Int F e Int R. Os 20 pb na extremidade 3' de cada iniciador foi homólogo ao molde e havia uma cauda de 50 pb 5' com homologia com o locus alvo 31 ubiB-fadA. Um fragmento de integração de PCR de 1691 pb foi produzido e transformado em DHllacdapD(pTP223) para criar o integrante OBllacdapD::rbpA-DifCAT (pTP223).

Os iniciadores UbiB F e UbiB R foram utilizados para amplificar uma parte do locus ubiB-fadA por PCR de diagnóstico (figura 8). Em DHllacdapD selvagem, isto produziu um produto de 510 pb para o locus de msbB nativo (pista 2). O locus integrante tinha 1936 pb, mas esta PCR também amplificou um produto de 938 pb, indicando uma inserção de rbpA, como uma proporção da população foi submetido a recombinação mediada por XerCD mesmo na presença de cloranfenicol (pista 3). A estirpe integrante foi curada do plasmideo auxiliar pTP223 e o gene cat excisado de DHllacdapD cultivando sem antibióticos e o gene rbpA integrado detectado como um produto de PCR de 938 pb (pistas 4-7) . A inserção de rbpA foi confirmada por sequenciação de ADN.

Exemplo 3: Estimativa das frequências de excisão do gene

Este exemplo determina a frequência da recombinação mediada por XerCD nos sitios dif, medidos pela excisão de genes de resistência a antibióticos flanqueados por dif integrados nos dois loci cromossómicos de E. coli DHl.

Foram utilizadas duas estirpes integrantes (DHl::AmsbB-DifCAT e DHl::rbpA-DifCAT), com genes de resistência a cloranfenicol flanqueados por dif inseridos em loci cromossómicos diferentes (loci msbB e ubiB-fadA, respectivamente). Estes foram inoculados em triplicado em 5 mL de caldo LB contendo 20 pg mlT1 de cloranf enicol e cultivados ao longo do dia, até uma densidade óptica (D060o) de aproximadamente 32 0,5. Frascos de agitação contendo 50 mL de caldo LB foram inoculados para uma D06oo de partida de 0,005. Os frascos de agitação foram incubados a 37 °C com agitação a 200 r.p.m. durante um periodo de 24 horas. Após as primeiras 24 horas de período de crescimento, a D06oo foi registada e foi utilizado um volume calculado para inocular outro frasco de agitação de 50 mL, novamente para produzir uma DO inicial de 0,005. Este processo de subcultura foi repetido a intervalos de 24-horas durante um periodo total de 96 horas. O número de gerações de cada um dos seis frascos foi calculado após subcultura.

Após 48 e 96 horas de crescimento, as culturas foram diluídas em série em caldo LB e plaqueadas em LB agar para produzir colónias isoladas. Para estimar a frequência de recombinação mediada por XerCD nos sítios dif, 100 colónias para cada uma das seis culturas foram rastros de réplicas em LB agar + /- 20 pg mL-1 de cloranf enicol. Os clones que se tornaram sensíveis a cloranfenicol foram rastreados por PCR utilizando iniciadores de PCR de diagnóstico para amplificar a região modificada do locus (iniciadores de SML e SMR para o locus msbB; UbiB F e UbiB R para o locus ubiB-fadA) . Os dados resultantes foram utilizados para calcular as frequências de excisão do gene de resistência a antibiótico mediado por XerCD, como mostrado na Tabela 2.

Tabela 2. As frequências de excisão do gene por recombinação específica de Xer para um sítio em sítios dif. As frequências são relatadas em dois pontos de tempo para a excisão de um gene de resistência a cloranfenicol. 33

Excisão do gene no locus msbB Excisão do Gene no locus ubiB-fadA Tempo (horas) 48 96 48 96 Criações 19, 7 39,2 18, 7 37,9 Frequência de excisão 6,3% 7, 0% 1, 0% 2, 8%

Estes resultados ilustram que após apenas dois dias de cultura de estirpes integrantes, a frequência de excisão é suficientemente elevada (1-6%) para que menos de 100 colónias necessitem de ser rastreadas para identificar o recombinante desejado.

Apêndice: Iniciadores

Os iniciadores estão escritos de 5' para 3'. 5DIFCAT:

CCTTAGGATGCATGGTGCGCATAATGTATATTATGTTAAATCCCTTATGCGACTCCTGCA

TCCCTTTCGTCTTCGAATAAA 3DIFCAT:

CCTTAGGATGCATATTTAACATAATATACATTATGCGCACCATCCGCTTATTATCACTTA

TTCAGGCGTAGCACCAGGCGT

Msb-int F :

TGCGGCGAAAACGCCACATCCGGCCTACAGTTCAATGATAGTTCAACAGAAGTGTGCTGG

AATTCGCCCT 34

Msb-int R:

TTGGTGCGGGGCAAGTTGCGCCGCTACACTATCACCAGATTGATTTTTGCATCTGCAGAA

TTCGCCCTTA

Int F:

AAACCCGCCCCTGACAGGCGGGAAGAACGGCAACTAAACTGTTATTCAGTTTGCGCCGAC

ATCATAACGG

IntR:

GCCGGATGCGGCGTGAACGCCTTATCCGGTCTACCGATCCGGCACCAATGGCTACGGTTT

GATTAGGGAA SML:

TGACCTGGTGATTGTCACCC SMR:

TAAACCAGCAGGCCGTAAAC

UbiB F:

GATCGCCTGTTTGGCGATGC

UbiB R:

GAATCTGATGGAACGCAAAG REFERENCIAS:

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Lisboa, 14 de Janeiro de 2011 38

Claims (27)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Processo para a integração de ácido nucleico não marcado no cromossoma de uma célula procariótica compreendendo: a) introdução de uma cassete de ADN linear numa célula, em que a referida cassete de ADN linear compreende: i) um gene marcador de selecção; ii) dois sítios de reconhecimento de recombinase específica para um sítio de tipo-dif flanqueando o referido gene marcador de selecção; e iii) duas regiões que flanqueiam os referidos sítios de reconhecimento de recombinase específica para um sítio de tipo-dif que são homólogas às duas regiões flanqueadoras do sítio de integração no cromossoma da célula; b) cultivar a referida célula em condições tais que a cassete de ADN linear seja integrada no cromossoma celular por recombinação homóloga; e c) cultivar a referida célula em condições tais que uma recombinase específica para um sítio endógena presente no cromossoma da célula, actue para excisar o gene marcador de selecção por recombinação específica para um sítio entre os sítios de reconhecimento de recombinase específica para um sítio de tipo-dif. 1
2. 2. Processo de acordo com a revindicação 1, em que a célula é uma célula bacteriana.
3. 3. Processo de acordo com a reivindicação 2, em que a célula é uma célula bacteriana gram negativa.
4. 4. Processo de acordo com a reivindicação 2, em que a célula é uma célula bacteriana gram positiva.
5. 5. Processo de acordo com a reivindicação 3, em que a célula é uma célula de E. coli.
6. 6. Processo de acordo com a reivindicação 4, em que a célula é uma célula de B. subtilis.
7. 7. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 6, em que a célula é uma célula RecA+.
8. 8. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, em que os sitios de reconhecimento de recombinase especifica para um sitio de tipo-dif flanqueando o gene marcador de selecção são os mesmos.
9. 9. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, em que os sitios de reconhecimento de recombinase especifica para um sitio de tipo-díf que flanqueiam o gene marcador de selecção são diferentes.
10. 10. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, em que, pelo menos, um dos sitios de tipo-dif é seleccionado a partir do sitio dif de E. coli e do sitio dif de B. subtilis. 2
11. 11. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, em que, pelo menos, um dos sitios de tipo-dif é seleccionado dos sitios de tipo-dif do plasmídeo cer e psi e a molécula de ácido nucleico compreende ainda sequências acessórias.
12. 12. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, em que, pelo menos, um dos sitios de tipo-dif é o sitio pif híbrido tipo dif e a molécula de ácido nucleico compreende ainda sequências acessórias.
13. 13. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, em que, o gene marcador de selecção é um gene de resistência a antibiótico.
14. 14. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, para a deleção do gene não marcado em que as duas regiões que flanqueiam os referidos sitios de reconhecimento de recombinase especifica para um sitio de tipo-dif são homólogas às duas regiões que flanqueiam o gene a ser eliminado no cromossoma da célula.
15. 15. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, para a integração do gene não marcado, em que as duas regiões que flanqueiam os sitios de reconhecimento de recombinase especifica para um sitio de tipo-dif são homólogas às duas regiões que flanqueiam o sitio de integração e a cassete de ADN linear compreende ainda o gene exógeno a ser integrado, desde que o gene exógeno não esteja localizado entre os dois sitios de reconhecimento de recombinase especifica para um sitio de tipo-dif. 3
16. 16. Processo de qualquer uma das reivindicações 1 a 15, em que o passo b) compreende ainda cultivar a célula na presença de uma pressão selectiva no gene marcador de selecção
17. 17. Processo de acordo com a reivindicação 16, em que o passo c) compreende cultivar a célula na ausência de qualquer pressão selectiva.
18. 18. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17, em que a molécula de ácido nucleico compreende ainda um gene para a selecção positiva de células nas quais ocorreu recombinação.
19. 19. Processo para controlar a expressão de um gene de interesse compreendendo cultivar uma célula procariótica compreendendo: i) uma primeira molécula de ácido nucleico compreendendo um gene de interesse que está funcionalmente associado a um operador; e ii) uma segunda molécula de ácido nucleico compreendendo um gene marcador de selecção e um gene repressor flanqueado pelos sítios de reconhecimento de recombinase específica para um sítio de tipo-dif, em que o referido repressor é susceptivel de se ligar ao referido operador em condições tais que uma recombinase específica para um sítio endógena presente no cromossoma da célula, actue para excisar o gene marcador de selecção e o referido gene repressor por recombinação específica para um sítio entre os 4 sítios de reconhecimento de recombinase específica para um sítio de tipo dif, permitindo desse modo à expressão de um gene de interesse.
20. 20. Processo de acordo com a reivindicação 19 compreendendo as características de qualquer uma das reivindicações 2 até 13.
21. 21. Processo de acordo com a reivindicação 19 ou reivindicação 20, em que a primeira e segunda moléculas de ácido nucleico são cassetes de adn linear integrados no cromossoma da célula.
22. 22. Processo de acordo com a reivindicação 19 ou reivindicação 20, em que a primeira e segunda moléculas de ácido nucleico são plasmídeos.
23. 23. Processo de acordo com a reivindicação 19 ou reivindicação 20, em que a primeira molécula de ácido nucleico é uma cassete de ADN linear integrada no cromossoma da célula e a segunda molécula de ácido nucleico é um plasmídeo.
24. 24. Processo de acordo com a reivindicação 19 ou reivindicação 20, em que a primeira molécula de ácido nucleico é um plasmídeo e a segunda molécula de ácido nucleico é uma cassete de ADN linear integrada no cromossoma da célula.
25. 25. Processo para controlar a expressão de um gene de interesse compreendendo cultivar uma célula procariótica compreendendo uma molécula de ácido nucleico que compreende i) um gene de interesse ligado funcionalmente a um promotor; e 5 ii) um gene marcador de selecção e um terminador de transcrição flanqueado por sítios de reconhecimento de recombinase específica para um sítio de tipo-dif, em que o referido gene marcador de selecção e terminador de transcrição flanqueado por sítios de reconhecimento de recombinase específica para um sítio de tipo-díf estão localizados entre o gene de interesse e o promotor que controla a expressão do referido gene de interesse em condições tais que uma recombinase específica para um sítio endógena presente no cromossoma da célula, actuar para excisar o gene marcador de selecção e referido terminador de transcrição por recombinação específica para um sítio entre os sítios de reconhecimento de recombinase específica para um sítio de tipo-dif, permitindo desse modo a expressão de um gene de interesse.
26. 26. Processo de acordo com a reivindicação 25 compreendendo as características de qualquer uma das reivindicações 2 é 13.
27. 27. Processo de acordo com a reivindicação 25 ou reivindicação 26, em que a molécula de ácido nucleico é um plasmídeo ou é uma cassete de ADN linear integrada no cromossoma. Lisboa, 14 de Janeiro de 2011 6 1/5 Figura 1 Gene de resistência a antibiótico

    Produto de PCR Cromossoma alvo Flanco esquerdo'-'zzb Gene a ser eliminado

    Flanco direito=H Delecção do gene cromossómico por recombinação homóloga

    Flanco direito Delecção do gene cromossómico por recombinação entre sítios dif Flanco esquerdo Sítio de multiclonageiTLjfl/ —\—V-*· Figura 2 Sítio dif

    Transgene 2/5 Figura 3 Sítio dif

    Sem expressão Expressão Figura 4 Promotor

    Transgene 3/5 Figura 5 Sítio dif ^SSPrigem de replicação Promotor

    origem de replicação Transgene

    origem de replicação | recombinação Promotor «jpjfí específica Sítio dif *· sBa 1 ► icOStaeOI Transgene

    origem de replicação Promotor Figura 6

    4/5 Figura 7 A) SML SMR pykA \ msbB L ebA 3^ SML-SMRPCR: 1428 bp locus DH1 ::Dif-CATAmsbB l Integração de AmsbB-DifCAT pykA^ SliÍlL \ _^cat \ SMR SML-SMRPCR: 1460 bp Excisão de DifCAT

    > SML-SMRPCR:462 bp B)

    Marcador em escada de kb 1. Controlo negativo (sem DNA) 2. Tipo selvagem (DH1 ADNg) 3. ADNg integrante (DH1 ::AmsbB-DifCAT) 4.7. Clones resolventes (DHIAmsbB) 5/5 Figura 8 A)

    locus DH1 lacdapD ubiB UbiB F-UblB R PCR! 510 bp ^ Integração de rbpA-DifCAT UbiB R fadA

    3“ UbiB F-UblB R PCR: 1936 bp DH1 lacdapD:: rbpA-DifCAT 1E Excisão de DifCAT

    UbiB F-UbiB R PCR: 938 bp DHl/acdapD-rbpA B)

    Marcador em escada de kb 1. Controlo negativo (sem DNA) 2. Tipo selvagem (DH1 /acdapD ADNg) 3. ADNg integrante (DH1 lacdapD:.rbpA-DifCAT) 4.7 Clones resolventes (DH1 lacdapD-rbpA)