JPH02238891A - 遺伝子産物の製造方法 - Google Patents
遺伝子産物の製造方法Info
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/67—General methods for enhancing the expression
- C12N15/68—Stabilisation of the vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/67—General methods for enhancing the expression
- C12N15/69—Increasing the copy number of the vector
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
この発明は、組換えＤＮＡ技術分野においてクローニン
グベクター及び生産ベクターとして有用で複製挙動が複
製に好適な条件下で制御されない（非制御の）新規なプ
ラスミド、かようなプラスミドの製法およびそのプラス
ミドの遺伝子の産物の製造方法に関する。
グベクター及び生産ベクターとして有用で複製挙動が複
製に好適な条件下で制御されない（非制御の）新規なプ
ラスミド、かようなプラスミドの製法およびそのプラス
ミドの遺伝子の産物の製造方法に関する。
技術的背景
条件非制御の複製挙動を持つプラスミド（ｐｌａｓｍｉ
ｄｓ ｗｉｔｈ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ ｕｎ
ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄｒｅｐｌｉｃａＬｉｏｎ ｂｅｈ
ａｖｉｏｕｒ） （いわゆるランアウエイプラスミド：
ｒｕｎａｗａｙ ｐｌａｓｍｉｄ）は、例えば公開ヨ
ーロッパ特許出願第７８１０１８７７．５号によって知
られている。これらのプラスミドの複製は温度依存性で
あって、プラスミドを保有４゛る宿主細菌がある温度例
えば約３０℃の温度で培養されるときは制御された一定
の低コピー数を示し、その宿主細菌が異なる温度例えば
約３６℃以上の温度で培養されるときは非制御のコピー
数を示すのである。
ｄｓ ｗｉｔｈ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ ｕｎ
ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄｒｅｐｌｉｃａＬｉｏｎ ｂｅｈ
ａｖｉｏｕｒ） （いわゆるランアウエイプラスミド：
ｒｕｎａｗａｙ ｐｌａｓｍｉｄ）は、例えば公開ヨ
ーロッパ特許出願第７８１０１８７７．５号によって知
られている。これらのプラスミドの複製は温度依存性で
あって、プラスミドを保有４゛る宿主細菌がある温度例
えば約３０℃の温度で培養されるときは制御された一定
の低コピー数を示し、その宿主細菌が異なる温度例えば
約３６℃以上の温度で培養されるときは非制御のコピー
数を示すのである。
上記特許出願に公開されたプラスミドは、エシエリヒア
・コリ中で自立的に複製することが知られている野生型
プラスミドのプラスミドＴＩ Ｉの化学的突然変異誘発
法（ｍｕＬａｇｅｎｉｓａｔｉｏｎ）によって単離され
た。この突然変異誘発法は２段階で行われた。すなわち
第１段階は、プラスミドコピー数が３０℃で約１〜２で
、４０℃では４〜５倍高いプラスミド保ｎ細閑クローン
の弔離からなり、第２段階はプラスミドがより高い温度
で制御されないコピー敗を示した細菌クローンの単離か
らなるしのである。このようにランアウエイ挙動を示す
プラスミドは親プラスミドの二重変異体であった。
・コリ中で自立的に複製することが知られている野生型
プラスミドのプラスミドＴＩ Ｉの化学的突然変異誘発
法（ｍｕＬａｇｅｎｉｓａｔｉｏｎ）によって単離され
た。この突然変異誘発法は２段階で行われた。すなわち
第１段階は、プラスミドコピー数が３０℃で約１〜２で
、４０℃では４〜５倍高いプラスミド保ｎ細閑クローン
の弔離からなり、第２段階はプラスミドがより高い温度
で制御されないコピー敗を示した細菌クローンの単離か
らなるしのである。このようにランアウエイ挙動を示す
プラスミドは親プラスミドの二重変異体であった。
上記特許出願には、またミニプラスミドを開示しており
、これは小さいサイズであることから比較的容易に宿主
細菌に形質転換されるのでクローニングベクターとして
有用である。これらのミニプラスミドは、温度依存性の
ランアウエイ複製挙動の原因である遺伝子を保持してい
た。
、これは小さいサイズであることから比較的容易に宿主
細菌に形質転換されるのでクローニングベクターとして
有用である。これらのミニプラスミドは、温度依存性の
ランアウエイ複製挙動の原因である遺伝子を保持してい
た。
上記特許出願に開示されたプラスミドは、クロニング及
び産生ベクターとして、外来１） Ｎ Ａの挿入された
フラグメントの遺伝子産物を得るのに用いることができ
る。このプラスミドの温度依存性複製は、例えば真核オ
リジンのＤＮＡフラグメントから増幅されたｍの遺伝子
産物を産生ずるのに利用できる。遺伝子産物のかような
増幅は、例えば培養媒体にクロラムフエニコールを添加
して行われる通常のプラスミドＤＮＡ増幅技術では、ク
ロラムフエニコールの存在が蛋白合成を停止さＵ゜るの
で、有効でなかった。
び産生ベクターとして、外来１） Ｎ Ａの挿入された
フラグメントの遺伝子産物を得るのに用いることができ
る。このプラスミドの温度依存性複製は、例えば真核オ
リジンのＤＮＡフラグメントから増幅されたｍの遺伝子
産物を産生ずるのに利用できる。遺伝子産物のかような
増幅は、例えば培養媒体にクロラムフエニコールを添加
して行われる通常のプラスミドＤＮＡ増幅技術では、ク
ロラムフエニコールの存在が蛋白合成を停止さＵ゜るの
で、有効でなかった。
上記特許願で開示されたプラスミドは、挿入された外来
遺伝子が、そのプラスミドが形質転換されるべき細菌に
対し有害な産物合成の逍伝情報を指定している場合に、
クーニングベクターと産生ベクターとして有利に用いる
ことができる。というのはそのプラスミドは低温におい
ては低コピー数を有し結局ほとんど遺伝子発現をしない
からである。このことは、低温で行われる培養の増殖段
階では細菌が損傷されにくいことを意味する。
遺伝子が、そのプラスミドが形質転換されるべき細菌に
対し有害な産物合成の逍伝情報を指定している場合に、
クーニングベクターと産生ベクターとして有利に用いる
ことができる。というのはそのプラスミドは低温におい
ては低コピー数を有し結局ほとんど遺伝子発現をしない
からである。このことは、低温で行われる培養の増殖段
階では細菌が損傷されにくいことを意味する。
発明の開示
この発明は、プロモーターからの転写がプラスミド複製
を調節するようなしかたで挿入された少なくともひとつ
の調節可能なプロモーター（ｒｅｇｕｌａＬａｂｌｅ
ｐｒｏｍｏｔｅｒ）を有する新規なプラスミドに関する
。特にこの発明は、そのプラスミドを有する宿主微生物
がプロモーターからの転写の増大を保証する条件下で培
養されると、調節可能なプロモーターが実質的に増大さ
れるかもしくは制御されない複製を起こさＵ゜るプラス
ミドに関する。この発明はさらにかようなプラスミドの
製法に関する。このプラスミドはクローニングベクター
及び産生ベクターとして有用である。
を調節するようなしかたで挿入された少なくともひとつ
の調節可能なプロモーター（ｒｅｇｕｌａＬａｂｌｅ
ｐｒｏｍｏｔｅｒ）を有する新規なプラスミドに関する
。特にこの発明は、そのプラスミドを有する宿主微生物
がプロモーターからの転写の増大を保証する条件下で培
養されると、調節可能なプロモーターが実質的に増大さ
れるかもしくは制御されない複製を起こさＵ゜るプラス
ミドに関する。この発明はさらにかようなプラスミドの
製法に関する。このプラスミドはクローニングベクター
及び産生ベクターとして有用である。
プラスミドに挿入された所望の遺伝子産物合成の遺伝情
報を指定する構造遺伝子の発現を制御するために、調節
可能なプロモーターを挿入４゜ることか知られている。
報を指定する構造遺伝子の発現を制御するために、調節
可能なプロモーターを挿入４゜ることか知られている。
しかし形成されるプラスミドコピー数をＵ．ＥＪ節４゛
ることかできる調節可能なプロモーターをプラスミドに
挿入することは新規であると信じられる。
ることかできる調節可能なプロモーターをプラスミドに
挿入することは新規であると信じられる。
この発明は、・第一の態様として、シ，１節可能なプロ
モーターが、このプロモーターからの転写が複製を調節
するようなしかた、特に増大された転写によってプラス
ミドコピー数が実質的に増大されるかもしくは制御され
なくなるに至るようなしかたで挿入されたプラスミドに
関する。この明細書及び請求の耘囲において“調節可能
なプロモーター”という用語は、プ【１モーターの転写
開始速度に関する活性が、そのプロモーターを’ｌ！ｊ
つプラスミドを有する宿主細菌の培養条件を調節するこ
とによって、調節可能なプロモーを意味する。かような
調節可能なブ【１モーターは、例えば外来プロモーター
、すなわちプロモーターの挿入されているプラスミドが
本来もっていない（関連していない）プロモーターであ
ってらよい。このプロモーターは、そのプロモーターの
部位内の特別なＤＮＡ構造によって先天的に調節可能で
ある。かようなブτＪモーターの一例は、公知のランア
ウエイプヂスミド（後記説明参照）に見出される。又は
このプロモーターは、正の制御を行いうる！Ｊ１１節因
子によって制御可能であってもよく（ずなイつらプロモ
ーターが例えば宿主細胞が生育される培地に、ある誘発
物質を添加ずることに占り正に誘発されないとプラスミ
ドは非制御の複製に到達しない）、又はこの凋節因子は
負の制御を行ってもよい。後者のタイプの制御因子は、
その活性が宿主細胞の培養条件に調節することによって
調節可能であるリブレツザーとしても知られている。そ
のリブレツザー遺伝子はプロモーターとともにプラスミ
ド自体にあってもよく、同じ宿主微生物中の別のプラス
ミドでもよく、又は宿主微生物の染色体に位置していて
もよい。このリプレッサー遺伝子は挿入されたプロモー
ターからの転写を抑制する産物の遺伝情報を指定しその
結果、複製は低い一定レベルに保持される。ある理由で
リプレッサーが不活化されるようになると、かような制
御はなくなり転写が増大ずる。
モーターが、このプロモーターからの転写が複製を調節
するようなしかた、特に増大された転写によってプラス
ミドコピー数が実質的に増大されるかもしくは制御され
なくなるに至るようなしかたで挿入されたプラスミドに
関する。この明細書及び請求の耘囲において“調節可能
なプロモーター”という用語は、プ【１モーターの転写
開始速度に関する活性が、そのプロモーターを’ｌ！ｊ
つプラスミドを有する宿主細菌の培養条件を調節するこ
とによって、調節可能なプロモーを意味する。かような
調節可能なブ【１モーターは、例えば外来プロモーター
、すなわちプロモーターの挿入されているプラスミドが
本来もっていない（関連していない）プロモーターであ
ってらよい。このプロモーターは、そのプロモーターの
部位内の特別なＤＮＡ構造によって先天的に調節可能で
ある。かようなブτＪモーターの一例は、公知のランア
ウエイプヂスミド（後記説明参照）に見出される。又は
このプロモーターは、正の制御を行いうる！Ｊ１１節因
子によって制御可能であってもよく（ずなイつらプロモ
ーターが例えば宿主細胞が生育される培地に、ある誘発
物質を添加ずることに占り正に誘発されないとプラスミ
ドは非制御の複製に到達しない）、又はこの凋節因子は
負の制御を行ってもよい。後者のタイプの制御因子は、
その活性が宿主細胞の培養条件に調節することによって
調節可能であるリブレツザーとしても知られている。そ
のリブレツザー遺伝子はプロモーターとともにプラスミ
ド自体にあってもよく、同じ宿主微生物中の別のプラス
ミドでもよく、又は宿主微生物の染色体に位置していて
もよい。このリプレッサー遺伝子は挿入されたプロモー
ターからの転写を抑制する産物の遺伝情報を指定しその
結果、複製は低い一定レベルに保持される。ある理由で
リプレッサーが不活化されるようになると、かような制
御はなくなり転写が増大ずる。
特別の記載をしなければ、この明細書と請求の範囲に用
いられる“プロモーター”の用語は通常、宿主細胞の培
養条件の変化に先天的に応答する活性を有するプロモー
ターと調節因子によって制御されるプロモーターの両者
を怠味ずる。また“シ．１節可能なプロモーターが挿入
されたプラスミド”の発現は、プロモーターとそのプロ
モーターによって調節されたレプ２リコンが同じＤＮＡ
フラグメントに挿入され。そのプロモーターとレブリコ
ンが最終的に異なるソースから誘導されているこの発明
のプラスミドに用いることを意図するものである。そし
てこのことは、所望の最終プラスミド組立ての１段階に
おいて、プロモーターがレブリコンの誘導されたプラス
ミドに挿入されたことを意味する。“実質的に増大され
るかもしくは制御されないプラスミドコピー数”の用語
は、宿主微生物の培養条件をプロモーターからの転写の
増大を保証するように変えその結果プラスミドがその複
製制御を失ったとき、そのプラスミドコピー数は、その
微生物集団の一世代時間で約４０〜５０しくけそれ以下
で指数的に増大ずるという事実にてらして理解される。
いられる“プロモーター”の用語は通常、宿主細胞の培
養条件の変化に先天的に応答する活性を有するプロモー
ターと調節因子によって制御されるプロモーターの両者
を怠味ずる。また“シ．１節可能なプロモーターが挿入
されたプラスミド”の発現は、プロモーターとそのプロ
モーターによって調節されたレプ２リコンが同じＤＮＡ
フラグメントに挿入され。そのプロモーターとレブリコ
ンが最終的に異なるソースから誘導されているこの発明
のプラスミドに用いることを意図するものである。そし
てこのことは、所望の最終プラスミド組立ての１段階に
おいて、プロモーターがレブリコンの誘導されたプラス
ミドに挿入されたことを意味する。“実質的に増大され
るかもしくは制御されないプラスミドコピー数”の用語
は、宿主微生物の培養条件をプロモーターからの転写の
増大を保証するように変えその結果プラスミドがその複
製制御を失ったとき、そのプラスミドコピー数は、その
微生物集団の一世代時間で約４０〜５０しくけそれ以下
で指数的に増大ずるという事実にてらして理解される。
この増大は、宿主細胞が通常４〜５らしくはそれ以下の
倍化の後生育を停止するまで続く。そしてその時点で細
胞中のプラスミドＤＮＡｆｆｉはＤＮＡ全量の約４０〜
７０％であり、すなわちプラスミドコピー数が約２５〜
１０００もしくはそれ以上のファクターで増大ずる。換
言すれば、プラスミドコピー数が定常状態に到達しない
のである。このタイプの制御されない復製挙動も“ラン
アウエイ”挙動と呼称される。
倍化の後生育を停止するまで続く。そしてその時点で細
胞中のプラスミドＤＮＡｆｆｉはＤＮＡ全量の約４０〜
７０％であり、すなわちプラスミドコピー数が約２５〜
１０００もしくはそれ以上のファクターで増大ずる。換
言すれば、プラスミドコピー数が定常状態に到達しない
のである。このタイプの制御されない復製挙動も“ラン
アウエイ”挙動と呼称される。
Ｒｌ型プラスミドの複製制御原理について、この発明の
発明者らが新たに得た知識はこの発明のプラスミドの組
立てに利用される（この原理の詳細な説明については、
“発明の詳細な説明“を参照のこと）。この発明の原理
にしたがって、調節可能なプロモーターがプラスミドに
挿入されると、例えばプロモーターの抑制解除作用によ
ってプロモーターからの増大された転写によってプラス
ミドコピー数が実質的に増大されるかつ制御されなくな
るに至る。このことはプロモーターとともに挿入されか
つある条件下でプロモーターを制御する遺伝子産物合成
の遺伝情報を指定ずるりブレツザー遺伝子が、異なる条
件下で不活化するようになると、プロモーターからの転
写はもはや阻害されず、結局制御されないプラスミドコ
ピー数になるということを息味ずる。
発明者らが新たに得た知識はこの発明のプラスミドの組
立てに利用される（この原理の詳細な説明については、
“発明の詳細な説明“を参照のこと）。この発明の原理
にしたがって、調節可能なプロモーターがプラスミドに
挿入されると、例えばプロモーターの抑制解除作用によ
ってプロモーターからの増大された転写によってプラス
ミドコピー数が実質的に増大されるかつ制御されなくな
るに至る。このことはプロモーターとともに挿入されか
つある条件下でプロモーターを制御する遺伝子産物合成
の遺伝情報を指定ずるりブレツザー遺伝子が、異なる条
件下で不活化するようになると、プロモーターからの転
写はもはや阻害されず、結局制御されないプラスミドコ
ピー数になるということを息味ずる。
このことは、条件を変えると複製性能が異なるからしれ
ない公知のランアウエイプラスミドに比べて重要な改良
である。挿入される外来プロモーターは通常、非常に強
力（ずな４つち転写開始の頻度が高い）なのでかような
条件変化では効果がないから、このことはこの発明のプ
ラスミドら同様であるという徴候は全くない。
ない公知のランアウエイプラスミドに比べて重要な改良
である。挿入される外来プロモーターは通常、非常に強
力（ずな４つち転写開始の頻度が高い）なのでかような
条件変化では効果がないから、このことはこの発明のプ
ラスミドら同様であるという徴候は全くない。
調節可能なプロモーターの活性を調節することのできる
培養条件のひとつは、宿主微生物が培Ｊ１される温度で
ある。プロモーターの活性は、それ自体温度依存性であ
ってらよく、ずなわら培谷中の温度変化に反応するか、
又はその調節因子は温度感受性で、例えば温度感受性リ
ブレツザーであってもよい。
培養条件のひとつは、宿主微生物が培Ｊ１される温度で
ある。プロモーターの活性は、それ自体温度依存性であ
ってらよく、ずなわら培谷中の温度変化に反応するか、
又はその調節因子は温度感受性で、例えば温度感受性リ
ブレツザーであってもよい。
この温度可能なプロモーターは、プロモーターからの転
写を制御する温度感受性λｃｌリプレッサーの遺伝子を
付加的に有するＤＮＡフラングメントの一部として挿入
しうる、バクテリオファージλからのプロモーターであ
ってらよい。このλプロモーターはえＰ．もしくはλＰ
Ｌでもよく、とくにλＰＲでもよい。しかし、この発明
の原理にしたがってプラスミドに挿入されかつ温度以外
の外的因子に影響される他のプロモーター系も採用でき
る。すなわち、化学物質で誘導可能からしくは代謝物に
よって調節可能な１ａｃ１Ｌｒｐ及びｄｅｏプロモータ
ーのようなプロモーターである。
写を制御する温度感受性λｃｌリプレッサーの遺伝子を
付加的に有するＤＮＡフラングメントの一部として挿入
しうる、バクテリオファージλからのプロモーターであ
ってらよい。このλプロモーターはえＰ．もしくはλＰ
Ｌでもよく、とくにλＰＲでもよい。しかし、この発明
の原理にしたがってプラスミドに挿入されかつ温度以外
の外的因子に影響される他のプロモーター系も採用でき
る。すなわち、化学物質で誘導可能からしくは代謝物に
よって調節可能な１ａｃ１Ｌｒｐ及びｄｅｏプロモータ
ーのようなプロモーターである。
この発明のプラスミドの好適な例は、そのプロモーター
調節システムがそのプラスミドの温度依存性の複製挙動
を生ずるプラスミドである。特にそのプラスミドが実質
的に増大されるかもしくは制御されないプラスミドコピ
ー数を示す温度は、コピー数が低い場合の温度より高い
温度である。
調節システムがそのプラスミドの温度依存性の複製挙動
を生ずるプラスミドである。特にそのプラスミドが実質
的に増大されるかもしくは制御されないプラスミドコピ
ー数を示す温度は、コピー数が低い場合の温度より高い
温度である。
その転写パターンが例えば温度感受性リブレブザーの存
在によって温度依存性である調節可能なプロモーターを
有するこの発明のプラスミドは、約３０℃のごときひと
つの温度で一定の低いコピー数を示す。というのはこの
温度でプロモーターが抑制されその結果それからの転写
が低いレベルに保持されるからである。一方約３６〜４
２℃の範囲の温度のようなより高い温度では、その調節
システムが不活化されるに至りプロモーターの抑制解除
を起こし結局プロモーターからの転写が増大されるので
実質的に増大されるか又は制御されないプラスミドコビ
一敗を示す。ランアウエイ複製は約３９℃以上の温度で
行うのが好ましい。
在によって温度依存性である調節可能なプロモーターを
有するこの発明のプラスミドは、約３０℃のごときひと
つの温度で一定の低いコピー数を示す。というのはこの
温度でプロモーターが抑制されその結果それからの転写
が低いレベルに保持されるからである。一方約３６〜４
２℃の範囲の温度のようなより高い温度では、その調節
システムが不活化されるに至りプロモーターの抑制解除
を起こし結局プロモーターからの転写が増大されるので
実質的に増大されるか又は制御されないプラスミドコビ
一敗を示す。ランアウエイ複製は約３９℃以上の温度で
行うのが好ましい。
以下の説明においては、その複製が温度感受性の調節シ
ステム、特に温度感受性のりブレツザーによって制御さ
れるプラスミドにだけ言及されているが、プラスミドの
複製が調節されうる池のタイプの条件も前記説明のよう
に類似のしかたで利用できる。
ステム、特に温度感受性のりブレツザーによって制御さ
れるプラスミドにだけ言及されているが、プラスミドの
複製が調節されうる池のタイプの条件も前記説明のよう
に類似のしかたで利用できる。
この発明のひとつのタイプのプラスミドは、ｙＪＡ＋節
可能なプロモーターが、プラスミドのひとつの本来らっ
ている複製調節遺伝子（ｎａＬｉｖｅｒｅｐｌｉｃａｔ
ｉｏｎ ｒｅｇｕｌａＬｏｒｙ ｇｅｎｅ）の一部の代
りに挿入されたプラスミドである。この明細書とＢｉ’
ｒ求の範囲のためにかようなプラスミドはＡ型プラスミ
ドと命名される。このプラスミドがプラスミドＩｔ １
の誘導体であるとき、そのプラスミドから除去される調
節遺伝子はｃｏｐＢ遺伝子であり、これはプラスミドの
本来もっている複製阻害剤のひとつを合成する遺伝情報
を指定している。このｃｏｐＢ遺伝子を除去するとプラ
スミドコピー数はわずかに安定して増大ずる。かくして
そのプラスミドは約３０℃において約２０〜４０のコピ
ー／細胞、好ましくは２０〜３０コピー／細胞、特に２
０〜２５のコピー／細胞を有する。しかし温度か約４０
℃に上昇すると調節可能なプロモーターのりブレツザー
機能が失活して複製が制御されなくなり、少なくとも約
５００〜１０００コピー／細胞の範囲のプラスミドコピ
ー数になる。このことは、なかでらプラスミド中に挿入
された外来ＤＮＡフラグメントの大きさに左右され（Ｄ
ＮＡフラグメントが大きい・程、形成されるプラスミド
コピー数が小さくなる）、かような外来ＤＮＡ及び／又
はそのプラスミドが形質転換されるべき微生物細菌の遺
伝子産物の効果である。しかしある場合には、そのプラ
スミドはより高い温度で数千コピー／細胞まで生成する
ことがある。いずれにしても全１）ＮＡｍに対する高温
にお１ノるプラスミドＤＮΔｍは約４０〜７５％で通常
５０〜６０％である。
可能なプロモーターが、プラスミドのひとつの本来らっ
ている複製調節遺伝子（ｎａＬｉｖｅｒｅｐｌｉｃａｔ
ｉｏｎ ｒｅｇｕｌａＬｏｒｙ ｇｅｎｅ）の一部の代
りに挿入されたプラスミドである。この明細書とＢｉ’
ｒ求の範囲のためにかようなプラスミドはＡ型プラスミ
ドと命名される。このプラスミドがプラスミドＩｔ １
の誘導体であるとき、そのプラスミドから除去される調
節遺伝子はｃｏｐＢ遺伝子であり、これはプラスミドの
本来もっている複製阻害剤のひとつを合成する遺伝情報
を指定している。このｃｏｐＢ遺伝子を除去するとプラ
スミドコピー数はわずかに安定して増大ずる。かくして
そのプラスミドは約３０℃において約２０〜４０のコピ
ー／細胞、好ましくは２０〜３０コピー／細胞、特に２
０〜２５のコピー／細胞を有する。しかし温度か約４０
℃に上昇すると調節可能なプロモーターのりブレツザー
機能が失活して複製が制御されなくなり、少なくとも約
５００〜１０００コピー／細胞の範囲のプラスミドコピ
ー数になる。このことは、なかでらプラスミド中に挿入
された外来ＤＮＡフラグメントの大きさに左右され（Ｄ
ＮＡフラグメントが大きい・程、形成されるプラスミド
コピー数が小さくなる）、かような外来ＤＮＡ及び／又
はそのプラスミドが形質転換されるべき微生物細菌の遺
伝子産物の効果である。しかしある場合には、そのプラ
スミドはより高い温度で数千コピー／細胞まで生成する
ことがある。いずれにしても全１）ＮＡｍに対する高温
にお１ノるプラスミドＤＮΔｍは約４０〜７５％で通常
５０〜６０％である。
この発明の他のタイプのプラスミドは、約３０℃の温度
のごときひとつの温度で約３〜５コピー／細胞のコピー
数を有し、そして約４２℃の温度のごときより高い温度
では、前記の因子によって少なくとも約５００〜１００
０コピー／細胞、ある場合には数千コピー／細胞にまで
達する制御されないコピー数を有するプラスミドである
。かようなプラスミドは、そのプラスミドが本来有する
単一もしくは複数の複製制御遺伝子の上流側に（ ｕｐ
ｓｔｒｅａｍ）に調節可能なプロモーターを挿入するこ
とによって得ることができる。この明細書と請求の範囲
のために、゛かようなプラスミドをＢ型プラスミドと命
名する。プラスミドＲ１誘導体の場合、調節可能なプロ
モーターはｃｏｐＢ遺伝子とｃｏｐ＾遺伝子の両者の上
流側に挿入された。したがってプラスミドに上記コピー
数パターンを示させるこれら両方の本来存在する複製阻
害剤は、保持されたのである。しかしもしそのプラスミ
ドがｐａｒ部位を欠くプラスミドである場合は［プラス
ミドに．分配（Ｊ）ａｒＬｉＬｉｏｎｉｎｇ）の原囚で
あるその部位が存在するとそのプラスミドは安定に遺伝
されるという効果があり、この効果はｐａｒ部位中の１
以上の遺伝子に起因する］、そのプラスミドは、低温に
おける低コピー数のために、低温において約１％／ｌ代
の頻度で失われる。したがって、そのプラスミドのラン
アウエイ複製が確実に全細胞集団に連続して起こるよう
に、かようなプラスミドにｐａｒ部位を挿入するのが有
利であろう。
のごときひとつの温度で約３〜５コピー／細胞のコピー
数を有し、そして約４２℃の温度のごときより高い温度
では、前記の因子によって少なくとも約５００〜１００
０コピー／細胞、ある場合には数千コピー／細胞にまで
達する制御されないコピー数を有するプラスミドである
。かようなプラスミドは、そのプラスミドが本来有する
単一もしくは複数の複製制御遺伝子の上流側に（ ｕｐ
ｓｔｒｅａｍ）に調節可能なプロモーターを挿入するこ
とによって得ることができる。この明細書と請求の範囲
のために、゛かようなプラスミドをＢ型プラスミドと命
名する。プラスミドＲ１誘導体の場合、調節可能なプロ
モーターはｃｏｐＢ遺伝子とｃｏｐ＾遺伝子の両者の上
流側に挿入された。したがってプラスミドに上記コピー
数パターンを示させるこれら両方の本来存在する複製阻
害剤は、保持されたのである。しかしもしそのプラスミ
ドがｐａｒ部位を欠くプラスミドである場合は［プラス
ミドに．分配（Ｊ）ａｒＬｉＬｉｏｎｉｎｇ）の原囚で
あるその部位が存在するとそのプラスミドは安定に遺伝
されるという効果があり、この効果はｐａｒ部位中の１
以上の遺伝子に起因する］、そのプラスミドは、低温に
おける低コピー数のために、低温において約１％／ｌ代
の頻度で失われる。したがって、そのプラスミドのラン
アウエイ複製が確実に全細胞集団に連続して起こるよう
に、かようなプラスミドにｐａｒ部位を挿入するのが有
利であろう。
Ｂ型プラスミドには、大きなコピー数範囲をもつという
利点が加わる。低温におけるコピー数は非常に低いので
、その産物がそのプラスミドの形質転換ざれた微生物に
対して幾分有毒で（成長速度を低下させる）又は致死姓
である外米遺伝子をプラスミドに挿入することができる
。このことは真核遺伝子類の産物の場合に時々ある。こ
れらの遺伝子は従来、例えば医薬産業において高い関心
がもたれているものである。低温では複製速度が低いの
で、外来遺伝子は少しも発現さされないか又は細胞がそ
れによって損傷されないような少爪だけ発現され、そし
て通常の条件下低温で培養することができる。このこと
は、いままで製造が全く不可能であるか又は非常に困難
であったある種のポリペプチド類の製造を著しく強化ら
しくは容易にするものである。
利点が加わる。低温におけるコピー数は非常に低いので
、その産物がそのプラスミドの形質転換ざれた微生物に
対して幾分有毒で（成長速度を低下させる）又は致死姓
である外米遺伝子をプラスミドに挿入することができる
。このことは真核遺伝子類の産物の場合に時々ある。こ
れらの遺伝子は従来、例えば医薬産業において高い関心
がもたれているものである。低温では複製速度が低いの
で、外来遺伝子は少しも発現さされないか又は細胞がそ
れによって損傷されないような少爪だけ発現され、そし
て通常の条件下低温で培養することができる。このこと
は、いままで製造が全く不可能であるか又は非常に困難
であったある種のポリペプチド類の製造を著しく強化ら
しくは容易にするものである。
この発明の第３番目のタイプのプラスミドは、約３０℃
のこときびとつの温度で約０．５〜１コピー／細胞の範
囲のコピー数を有し（数値０．５は複製の頻度がｌ／細
胞周期より小さいことを息味すると解される）、そして
約４２℃の温度のごときより高い温度では上記因子によ
って少なくとも約５００〜！０００コピー／細胞、ある
場合には数千コピー／細胞にまで達する制御されないコ
ピー数を持つプラスミドである。かようなプラスミドは
、本来もっているひとつの？ｆｔ製〃．リ節遺伝子の一
部がその複製部位から切りとられ複製部位以外に、ずな
わらその遺伝子が本来位置していない座位に挿入され、
その複製部位に調節可能なプロモーターを有するプラス
ミドである。この明細書と請求の範囲ではこのプラスミ
ドをＣ型プラスミドと命名する。プラスミドＲｌｌ導体
の場合は、それからｃｏｐＢ遺伝子が切りとられ、その
ｃｏｐＢ遺伝子がそのもとの座位でなくてその複製部位
以外のＣｃｏＲ Ｉ座位に再挿入される。たとえそうで
あってらｃｏｐｌｌインヒビター蛋白はそのプラスミド
の複製に対し、プラスミドが上記コピー数パターンを示
すようなしかたで影響を与える。しかしそのプラスミド
．がｐａｒ部位を欠いているプラスミドである場合、そ
のプラスミドは、低温において極端に低コピー数である
ため、低温では約５％／世代の頻度で喪失する。
のこときびとつの温度で約０．５〜１コピー／細胞の範
囲のコピー数を有し（数値０．５は複製の頻度がｌ／細
胞周期より小さいことを息味すると解される）、そして
約４２℃の温度のごときより高い温度では上記因子によ
って少なくとも約５００〜！０００コピー／細胞、ある
場合には数千コピー／細胞にまで達する制御されないコ
ピー数を持つプラスミドである。かようなプラスミドは
、本来もっているひとつの？ｆｔ製〃．リ節遺伝子の一
部がその複製部位から切りとられ複製部位以外に、ずな
わらその遺伝子が本来位置していない座位に挿入され、
その複製部位に調節可能なプロモーターを有するプラス
ミドである。この明細書と請求の範囲ではこのプラスミ
ドをＣ型プラスミドと命名する。プラスミドＲｌｌ導体
の場合は、それからｃｏｐＢ遺伝子が切りとられ、その
ｃｏｐＢ遺伝子がそのもとの座位でなくてその複製部位
以外のＣｃｏＲ Ｉ座位に再挿入される。たとえそうで
あってらｃｏｐｌｌインヒビター蛋白はそのプラスミド
の複製に対し、プラスミドが上記コピー数パターンを示
すようなしかたで影響を与える。しかしそのプラスミド
．がｐａｒ部位を欠いているプラスミドである場合、そ
のプラスミドは、低温において極端に低コピー数である
ため、低温では約５％／世代の頻度で喪失する。
したがって、プラスミドのランアウェイ複製が全細胞集
団に確実に連続して起こるようにこのプラスミドにｐａ
ｒ郎位を挿入することは、Ｂ型プラスミドの場合より一
層有利であろう。低温と高温それぞれにおける複製挙動
と、それ故にこのプラスミドを用いる利点は他の点では
Ｂ型プラスミドと同様である。
団に確実に連続して起こるようにこのプラスミドにｐａ
ｒ郎位を挿入することは、Ｂ型プラスミドの場合より一
層有利であろう。低温と高温それぞれにおける複製挙動
と、それ故にこのプラスミドを用いる利点は他の点では
Ｂ型プラスミドと同様である。
この発明は第２の態様として、複製部位からの転写を！
Ｉ．！節する第１の調節可能なプロモーターに加えて、
第２のプロモーターが、発現を第２プロモーターで制御
される構造遺伝子を挿入させるしかたで挿入されたプラ
スミドを［％ （Ｊ％するものである。この第２のプロ
モーターは制御可能であってもよい。ずなイつち第１の
調節可能なブロモークーを調節ずるのと同様の手段によ
って、宿主細胞が培谷される条件を調節することによっ
てその機能を調節することができるのである。１ａｃプ
ロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｄｅｏプロモーター
、ｒｅｃ＾プロモーター、λＰ．プロモーターその他の
ごとき多数のプロモーターがこの口的に有用であると現
在注目されて（．１る。λＰＬプロモーターは温度感受
性のｃｌリプレッサーで調節され、それ故増幅条件が同
じであり、その結果宿主細胞の培養が中純化され産物の
増幅がプラスミドＤＮＡの増輻と同時に起こるので、構
造遺伝子の発現を制御する第２プロモーターとして特に
有用なことが分かる。
Ｉ．！節する第１の調節可能なプロモーターに加えて、
第２のプロモーターが、発現を第２プロモーターで制御
される構造遺伝子を挿入させるしかたで挿入されたプラ
スミドを［％ （Ｊ％するものである。この第２のプロ
モーターは制御可能であってもよい。ずなイつち第１の
調節可能なブロモークーを調節ずるのと同様の手段によ
って、宿主細胞が培谷される条件を調節することによっ
てその機能を調節することができるのである。１ａｃプ
ロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｄｅｏプロモーター
、ｒｅｃ＾プロモーター、λＰ．プロモーターその他の
ごとき多数のプロモーターがこの口的に有用であると現
在注目されて（．１る。λＰＬプロモーターは温度感受
性のｃｌリプレッサーで調節され、それ故増幅条件が同
じであり、その結果宿主細胞の培養が中純化され産物の
増幅がプラスミドＤＮＡの増輻と同時に起こるので、構
造遺伝子の発現を制御する第２プロモーターとして特に
有用なことが分かる。
また第２プロモーターは第１の調節可能なプロモーター
と同一物であってもよいことは留意されるべきである。
と同一物であってもよいことは留意されるべきである。
第２プロモーターはＡ型、Ｂ型及びＣ型の各プラスミド
に挿入できる。かようなプラスミドは約３０℃において
、一定の低コピー数を有し、そしてごくわずか遺伝子発
現を行うか又は全く遺伝子発現を行わず、そして約３６
〜４２℃の範囲の温度で実質的に増大されるかもしくは
制御されないプラスミドコピー数を有し、遺伝子発現を
行う。
に挿入できる。かようなプラスミドは約３０℃において
、一定の低コピー数を有し、そしてごくわずか遺伝子発
現を行うか又は全く遺伝子発現を行わず、そして約３６
〜４２℃の範囲の温度で実質的に増大されるかもしくは
制御されないプラスミドコピー数を有し、遺伝子発現を
行う。
このプラスミドとしては、３９℃以上の温度で制御され
ないプラスミドコピー数を有し非常に高い遺伝子発現を
行うものが好ましい。
ないプラスミドコピー数を有し非常に高い遺伝子発現を
行うものが好ましい。
この発明のプラスミドはクローニングベクターと産生ベ
クターとして使用することができ、ずなわら、工業や医
薬用の広範囲の製品、特にポリベプヂド類と蛋白もしく
はそのフラグメント、酵素類及び酵素と栄養培地中の化
合物との反応による非蛋白産物、ホルモン類のごとき低
分子ｍ産物、並びに核酸を得るための組換えＤＮＡ技術
の分野に使用できるプラスミドであり、真核遺伝子持に
咄乳動物の遺伝子産物が特に重要である。クローニング
産生ベクターとしてイイ用であるためには、必須ではな
いが、プラスミドは、少なくともひとつの制限エンドヌ
クレアーゼに対しこのエンドヌクレアーゼによって切断
しうる特異な座位を有することが有利である。この座位
は、外来ＤＮＡのフラグメントを挿入すれば、得られた
組換えプラスミドを自律的に複製させ、かつプラスミド
に挿入された調節可能なプ【１モーターに曳製部位の転
写を調節させて、このプロモーターからの転写が増大さ
れる際に、プラスミドコピー数が実質的に増大されるか
又は制御されなくなるに至る座位でなければならない。
クターとして使用することができ、ずなわら、工業や医
薬用の広範囲の製品、特にポリベプヂド類と蛋白もしく
はそのフラグメント、酵素類及び酵素と栄養培地中の化
合物との反応による非蛋白産物、ホルモン類のごとき低
分子ｍ産物、並びに核酸を得るための組換えＤＮＡ技術
の分野に使用できるプラスミドであり、真核遺伝子持に
咄乳動物の遺伝子産物が特に重要である。クローニング
産生ベクターとしてイイ用であるためには、必須ではな
いが、プラスミドは、少なくともひとつの制限エンドヌ
クレアーゼに対しこのエンドヌクレアーゼによって切断
しうる特異な座位を有することが有利である。この座位
は、外来ＤＮＡのフラグメントを挿入すれば、得られた
組換えプラスミドを自律的に複製させ、かつプラスミド
に挿入された調節可能なプ【１モーターに曳製部位の転
写を調節させて、このプロモーターからの転写が増大さ
れる際に、プラスミドコピー数が実質的に増大されるか
又は制御されなくなるに至る座位でなければならない。
かくして複製部位に位置する制限座位はクローニング座
位としては許容できない。というのはこれはプラスミド
の復製性能を失わせるからである。
位としては許容できない。というのはこれはプラスミド
の復製性能を失わせるからである。
この発明のプラスミドは、調節可能なプロモーターを、
プラスミドに、このプロモーターからの転写が複製をＪ
ＡＩ節するようなしかたで挿入し、このように処理され
たプラスミドを、そのプロモーターからの転写が増大さ
れるときに実質的に増大されるかもしくは制御されない
プラスミドコピー数を示すプラスミドをスクリーニング
することによって、同定することからなる方法で組立て
られる。調節可能なプロモーターがλＰＲであるときこ
のプロモーターは、プラスミドとファージＩ）ＮΔを混
合し、適当なエンドヌクレアーゼで制限し、熱で不活化
しそして混合物を連結反応に付し、その連結反応混合物
を微生物に形質転換することによって挿入できる。
プラスミドに、このプロモーターからの転写が複製をＪ
ＡＩ節するようなしかたで挿入し、このように処理され
たプラスミドを、そのプロモーターからの転写が増大さ
れるときに実質的に増大されるかもしくは制御されない
プラスミドコピー数を示すプラスミドをスクリーニング
することによって、同定することからなる方法で組立て
られる。調節可能なプロモーターがλＰＲであるときこ
のプロモーターは、プラスミドとファージＩ）ＮΔを混
合し、適当なエンドヌクレアーゼで制限し、熱で不活化
しそして混合物を連結反応に付し、その連結反応混合物
を微生物に形質転換することによって挿入できる。
かようなプラスミドの組立ては、プラスミド上の異なる
座位にランダムにプロモーターを挿入することによって
行うことができる。調節可能のプロモーターからの増大
された転写を保証する条件下で制御されない複製挙動を
もつプラスミドをスクリーニングすることによって、正
しい挿入が同定される。かようなプラスミドの簡便なひ
とつのスクリーニング法は、種々の条件においてプラス
ミド保有細胞の成育性能を分析することからなる方法で
ある。宿主細胞中のプラスミドＤＮＡのｍは異なる方法
、特にそれ自体公知の方法のアガロースゲル電気泳動法
によって測定できる。このスクリーニング法は容易に高
速で行われる。
座位にランダムにプロモーターを挿入することによって
行うことができる。調節可能のプロモーターからの増大
された転写を保証する条件下で制御されない複製挙動を
もつプラスミドをスクリーニングすることによって、正
しい挿入が同定される。かようなプラスミドの簡便なひ
とつのスクリーニング法は、種々の条件においてプラス
ミド保有細胞の成育性能を分析することからなる方法で
ある。宿主細胞中のプラスミドＤＮＡのｍは異なる方法
、特にそれ自体公知の方法のアガロースゲル電気泳動法
によって測定できる。このスクリーニング法は容易に高
速で行われる。
Δ型プラスミドの組立てに関するこの発明の特定の態様
において、その組立ての法は、ひとつの本来存在してい
る調節遺伝子の一部とそのプラスミドを取り除き、プラ
スミド［｛１からのｃｏｐｌ３遺伝子の場合は制限エン
ドヌクレアーゼＢｇｌｌｌよって切断し、そしてこの座
位に調節可能なプロモーターを含む、Ｂｇｌｌｌフラグ
メントのごとき、ＤＮＡフラグメントを挿入ずることか
らなる方法である。
において、その組立ての法は、ひとつの本来存在してい
る調節遺伝子の一部とそのプラスミドを取り除き、プラ
スミド［｛１からのｃｏｐｌ３遺伝子の場合は制限エン
ドヌクレアーゼＢｇｌｌｌよって切断し、そしてこの座
位に調節可能なプロモーターを含む、Ｂｇｌｌｌフラグ
メントのごとき、ＤＮＡフラグメントを挿入ずることか
らなる方法である。
Ｂ型プラスミドの組立てに関するこの発明の他の態様に
おいて、その組立て法は、プラスミドに、調節可能なプ
ロモーターを本来存在している複製制御システムの上流
側の位置で挿入し（プラスミドＲｔ誘導体の場合は、Ｂ
ｇｌ■による部分的制限によってｃｏｐＢ遺伝子の」二
流側のＢｇｌｌｌ座位に）、連結し次いでエシエリヒア
・コリのごとき問題の微生物に形質転換することからな
る方法である。
おいて、その組立て法は、プラスミドに、調節可能なプ
ロモーターを本来存在している複製制御システムの上流
側の位置で挿入し（プラスミドＲｔ誘導体の場合は、Ｂ
ｇｌ■による部分的制限によってｃｏｐＢ遺伝子の」二
流側のＢｇｌｌｌ座位に）、連結し次いでエシエリヒア
・コリのごとき問題の微生物に形質転換することからな
る方法である。
またこのプラスミドは、部分的に切除された本来もって
いる複製調節遺伝子を有するプラスミドを出発物質とし
て用い、その本来もっている調節遺伝子をそのもとの座
位に再挿入する（ＲＩ型プラスミドの場合はｃｏｐＢ遺
伝子をＩｌｇｌＩＩ座位に再挿入することによる）こと
によって組立てることができる。
いる複製調節遺伝子を有するプラスミドを出発物質とし
て用い、その本来もっている調節遺伝子をそのもとの座
位に再挿入する（ＲＩ型プラスミドの場合はｃｏｐＢ遺
伝子をＩｌｇｌＩＩ座位に再挿入することによる）こと
によって組立てることができる。
Ｃ型プラスミドの組立てに関するこの発明の第３の態様
は、出発物質としてＡ型プラスミドを用いて、ひとつの
本来もっている調節遺伝子を、それが野生型親では位置
していなかったプラスミドの部位に挿入しＣＩｌｌ型プ
ラスミドの場合は、ＥｃｏＲＩフラグメントとしてのｃ
ｏｐＢ遺伝子をプラスミドの複製部位以外のＩＥｃｏＲ
Ｉ座位に、ＥｃｏＲ ｌでの制限によって挿入するこ
とによる）、連結しそして形質転換することからなる方
法である。
は、出発物質としてＡ型プラスミドを用いて、ひとつの
本来もっている調節遺伝子を、それが野生型親では位置
していなかったプラスミドの部位に挿入しＣＩｌｌ型プ
ラスミドの場合は、ＥｃｏＲＩフラグメントとしてのｃ
ｏｐＢ遺伝子をプラスミドの複製部位以外のＩＥｃｏＲ
Ｉ座位に、ＥｃｏＲ ｌでの制限によって挿入するこ
とによる）、連結しそして形質転換することからなる方
法である。
この発明の第４の態様は、調節可能なプロモーターを挿
入するのに加えて、第２プロモーターを、このプロモー
ターによって発現が調節可能な｛１１ク造遺伝子の挿入
を許容する適切な制限部位に、挿入することからなる方
法である。上記のように、この座位はそのプラスミドの
複製部位内に位置していてはいけない。
入するのに加えて、第２プロモーターを、このプロモー
ターによって発現が調節可能な｛１１ク造遺伝子の挿入
を許容する適切な制限部位に、挿入することからなる方
法である。上記のように、この座位はそのプラスミドの
複製部位内に位置していてはいけない。
この発明のプラスミドはミニプラスミドである。
ケなイつち、それらの野生型親プラスミドよりしかなり
小さい。一般に約２．５〜１５．０ Ｘ １０”ダルト
ンの範の大きさで、多くの場合２．５〜ＩＯ．ＯＸ １
０’ダルトン、通常４．０ 〜１２．５Ｘ １０’ダル
トン、特１１．０ 〜５．０×１０６ダルトンである。
小さい。一般に約２．５〜１５．０ Ｘ １０”ダルト
ンの範の大きさで、多くの場合２．５〜ＩＯ．ＯＸ １
０’ダルトン、通常４．０ 〜１２．５Ｘ １０’ダル
トン、特１１．０ 〜５．０×１０６ダルトンである。
公知のランアウエイプラスミドの非制御複製挙動は、そ
れが形質転換される特定の細菌株、その細菌が培養され
る培地、及び挿入されるＤＮＡに左右されるようである
。この依存性は多分、公知プラスミドのランアウェイ複
製挙動が部分的に、その転写速度をイっずかに増大さＵ
゛るｃｏｐｌｌプロモーター中の単一ヌクレオチドを置
換４′ることによって起り、そしてその転写速度がその
プラスミドに挿入される外来ＤＮＡのみならず関連する
細菌の種と菌株及び／又はその培養培地に関する環境変
化によって影響を受けることがあるという事実によるも
のであろう。この発明のプラスミドは、強力な外来プラ
スミドが活性化／抑制解除されるとかような変化が何意
でないように転写速度を増大させるので、同様には限定
されないようである。
れが形質転換される特定の細菌株、その細菌が培養され
る培地、及び挿入されるＤＮＡに左右されるようである
。この依存性は多分、公知プラスミドのランアウェイ複
製挙動が部分的に、その転写速度をイっずかに増大さＵ
゛るｃｏｐｌｌプロモーター中の単一ヌクレオチドを置
換４′ることによって起り、そしてその転写速度がその
プラスミドに挿入される外来ＤＮＡのみならず関連する
細菌の種と菌株及び／又はその培養培地に関する環境変
化によって影響を受けることがあるという事実によるも
のであろう。この発明のプラスミドは、強力な外来プラ
スミドが活性化／抑制解除されるとかような変化が何意
でないように転写速度を増大させるので、同様には限定
されないようである。
結局これらのプラスミドは広範囲の閑株に形質転換する
ことができて、取扱う上で、公知のランアウエイプラス
ミドよりも信頼性が高い。
ことができて、取扱う上で、公知のランアウエイプラス
ミドよりも信頼性が高い。
またこの発明には、Ｉｌ＋以外の野生型プラスミド由来
のプラスミド及び又はＥ． Ｃｏｌｉ以外のプラスミド
保育微生物中に見出されたプラスミドら含まれる。また
本来プラスミドを持っていない微生物中に保持されうる
上記タイプのプラスミドを組立てることら考えることが
できる。いくつかの異なった微生物プラスミドの複製シ
ステムは多くの面てＦＪｉ （ＩＩしていることが示さ
れている。例えば、ケベでの公知のプラスミドはもし複
製を起こしたいならば転写を必要とする。この発明の原
理をＩ’ｌｌ用することによって、クローニングベクタ
ーとしてすでに使用中でかつ所望の微生物で良好に機能
することが知られているプラスミドがランアウエイ挙動
を得ることができろように、他のプラスミドに非制御の
複製表現型を伝達することができる。
のプラスミド及び又はＥ． Ｃｏｌｉ以外のプラスミド
保育微生物中に見出されたプラスミドら含まれる。また
本来プラスミドを持っていない微生物中に保持されうる
上記タイプのプラスミドを組立てることら考えることが
できる。いくつかの異なった微生物プラスミドの複製シ
ステムは多くの面てＦＪｉ （ＩＩしていることが示さ
れている。例えば、ケベでの公知のプラスミドはもし複
製を起こしたいならば転写を必要とする。この発明の原
理をＩ’ｌｌ用することによって、クローニングベクタ
ーとしてすでに使用中でかつ所望の微生物で良好に機能
することが知られているプラスミドがランアウエイ挙動
を得ることができろように、他のプラスミドに非制御の
複製表現型を伝達することができる。
かくして、調節可能なプロモーター例えばλＰ，ｌを、
かようなプラスミド中に適正な位置に、このプロモータ
ーからの転写が複製を調節ずるしかたで挿入４゜ること
によって、非制御の複製がプロモーターからの増大した
転写を保証する条件下て起こるのである。
かようなプラスミド中に適正な位置に、このプロモータ
ーからの転写が複製を調節ずるしかたで挿入４゜ること
によって、非制御の複製がプロモーターからの増大した
転写を保証する条件下て起こるのである。
（以下余白）
Ｉｔ ｌ型プラスミドの複製制御システム基本的レブリ
コン（Ｂａｓｉｃ ｒｅｐｌｉｃｏｎ）現在まで、１１
型プラスミドの複製制御システｌ１は知られていない。
コン（Ｂａｓｉｃ ｒｅｐｌｉｃｏｎ）現在まで、１１
型プラスミドの複製制御システｌ１は知られていない。
プラスミドＩ’ｌｌの複製と複製制御に必要な遺伝情報
が耐性トランスファーファクター内に位置する３つのＰ
ｓｔｌフラグメントからなる２５００塩基対の長い部分
に保打されていることが見出されたものである（Ｍｏｌ
ｉｎ ｅＬ ａｌ．， Ｊ．Ｂａｃｋ． Ｈ８， １９
７９． ７０−７９）。
が耐性トランスファーファクター内に位置する３つのＰ
ｓｔｌフラグメントからなる２５００塩基対の長い部分
に保打されていることが見出されたものである（Ｍｏｌ
ｉｎ ｅＬ ａｌ．， Ｊ．Ｂａｃｋ． Ｈ８， １９
７９． ７０−７９）。
この部位は０基本的レプリコン”と定表され、４つの重
要な要素ずなイつら３つの逍伝子（ｃｏｐ＾，ｃｏｐｌ
ｌ及びｒａｐ＾）と複製開始点を有する（Ｍｏｌｉｎ
ａｔａｌ．， Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ． １９８１
． ４０８−１１）。この基本的レプリコンの機能地図
を第１図に示した。遺伝子ｒａｐ＾は複製を行うため正
に必要とされる機能の遺伝情報を指定する。その遺伝子
産物（そのＤＮＡ配列による）は２７８のアミノ酸から
なり分子量が約３３０００ダルトンの蛋白である（Ｒｏ
ｓｅｎ Ｃｔ ａｌ．，Ｍｏｌ． Ｇｅｎ． Ｇｅｎｅ
ｔ． １７９． １９８０． ５２７〜３７）。この蛋
白は明確には同定されていないが、そのｒｅｐＡ遺伝子
から蛋白を形成する容量は、ＩａｃＺ遺伝子との翻訳遺
伝子融合体を使用することによって明確に示された（Ｌ
ｉｇｈｔ ａｎｄ Ｍｏｌｉｎ， Ｍｏｌ． Ｇｅｎ．
ＧｅｎａＬ，１８４， １９８１． ５６−６１）
。Ｒｅｌ）＾蛋白の生化学的機能はまだ充分に探究され
ていないがＲｅｐＡ蛋白は複製開始因子であると信じら
れる。
要な要素ずなイつら３つの逍伝子（ｃｏｐ＾，ｃｏｐｌ
ｌ及びｒａｐ＾）と複製開始点を有する（Ｍｏｌｉｎ
ａｔａｌ．， Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ． １９８１
． ４０８−１１）。この基本的レプリコンの機能地図
を第１図に示した。遺伝子ｒａｐ＾は複製を行うため正
に必要とされる機能の遺伝情報を指定する。その遺伝子
産物（そのＤＮＡ配列による）は２７８のアミノ酸から
なり分子量が約３３０００ダルトンの蛋白である（Ｒｏ
ｓｅｎ Ｃｔ ａｌ．，Ｍｏｌ． Ｇｅｎ． Ｇｅｎｅ
ｔ． １７９． １９８０． ５２７〜３７）。この蛋
白は明確には同定されていないが、そのｒｅｐＡ遺伝子
から蛋白を形成する容量は、ＩａｃＺ遺伝子との翻訳遺
伝子融合体を使用することによって明確に示された（Ｌ
ｉｇｈｔ ａｎｄ Ｍｏｌｉｎ， Ｍｏｌ． Ｇｅｎ．
ＧｅｎａＬ，１８４， １９８１． ５６−６１）
。Ｒｅｌ）＾蛋白の生化学的機能はまだ充分に探究され
ていないがＲｅｐＡ蛋白は複製開始因子であると信じら
れる。
遺伝子ｃｏｐＡ？よ、高度に二次構造を有する小さ《（
８０〜９０ヌクレオチド長）不安定なＲＮＡ分子（４−
なわちそれはへヤピンルーブを形成している）合成の遺
伝情報を指定している（Ｓｔｏｕｇａａｒｄ ａｔ ａ
ｌ．，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．
ＵＳＡ７８． １９８１， ６００８６０１２）。Ｃ
ｏｐ＾−ＲＮＡは複製のインヒビターであるＣｏＰＡ−
ＲＮＡのヌクレオチド配列に影響する突然変異は増大し
たコピー数に導くことができる（ ｃｏｐ突然変異体）
。ｃｏｐ＾突然変異体のＤＮＡ配列分析によれば、すべ
ての突然変異が５つの塩基内のループ部分にきわだって
群がっていることを示している。これらの突然変異によ
って、野生型プラスミドに対するインヒビターの活性が
昔しく減少するか又は全くな《なることになる。それ故
に、そのインヒビターの特異性はそのループ部分にγｊ
在ずると結論することができる。またそのヌクレオヂド
配列が知られているずべてのｃｏｐ＾突然変５ｌＩＸ体
において、Ｃｏｌ’Ａ−ＲＮＡ中のシトシンがウラシル
で置換されていた（もしくはある場合はアデニンによっ
て置換）ということは驚くべきことである。このことは
Ｃｏｒ’八−ＲＮ＾が核酸／核酸相互作ＩＩ＋によって
作）Ｉ１４−ることを強く暗示している。この結論はさ
らに、次の事実により強化される。ずな４つらその事実
によって野生型プラスミドに対してずべてのＣＯ１）Ａ
活性を失ったこれらのｃｏｐＡ突然変異体でらそれら自
身に対していくらかのＣｏｐ＾活性を保持しているとい
うことである。さらにこの野生型Ｃｏｐ＾−１？Ｎ＾は
再々、ｃｏｐＡ突然変異体プラスミドに対４゛る阻害効
果を減少している。それ故ｃｏｐ＾突然変異体はインヒ
ビターで変化するだけでなく標的のｃｏｐＴでも変化し
、単一の塩基置換によって表現型的に二重突然変異体（
ｄｏｕｂｌｅ ｍｕｔａｎｔ）になる。ｃｏｐｎｉＱ伝
子は分子ｆｆｉｌｌ，０００グルトンの８６アミノ酸の
塩基性蛋白合成の遺伝情報を指定している。この蛋白は
多量形成される。ｃｏｐＢ遺伝子とそのプロモーターが
欠宋するとコピー数が８倍に増大するに至る。
８０〜９０ヌクレオチド長）不安定なＲＮＡ分子（４−
なわちそれはへヤピンルーブを形成している）合成の遺
伝情報を指定している（Ｓｔｏｕｇａａｒｄ ａｔ ａ
ｌ．，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．
ＵＳＡ７８． １９８１， ６００８６０１２）。Ｃ
ｏｐ＾−ＲＮＡは複製のインヒビターであるＣｏＰＡ−
ＲＮＡのヌクレオチド配列に影響する突然変異は増大し
たコピー数に導くことができる（ ｃｏｐ突然変異体）
。ｃｏｐ＾突然変異体のＤＮＡ配列分析によれば、すべ
ての突然変異が５つの塩基内のループ部分にきわだって
群がっていることを示している。これらの突然変異によ
って、野生型プラスミドに対するインヒビターの活性が
昔しく減少するか又は全くな《なることになる。それ故
に、そのインヒビターの特異性はそのループ部分にγｊ
在ずると結論することができる。またそのヌクレオヂド
配列が知られているずべてのｃｏｐ＾突然変５ｌＩＸ体
において、Ｃｏｌ’Ａ−ＲＮＡ中のシトシンがウラシル
で置換されていた（もしくはある場合はアデニンによっ
て置換）ということは驚くべきことである。このことは
Ｃｏｒ’八−ＲＮ＾が核酸／核酸相互作ＩＩ＋によって
作）Ｉ１４−ることを強く暗示している。この結論はさ
らに、次の事実により強化される。ずな４つらその事実
によって野生型プラスミドに対してずべてのＣＯ１）Ａ
活性を失ったこれらのｃｏｐＡ突然変異体でらそれら自
身に対していくらかのＣｏｐ＾活性を保持しているとい
うことである。さらにこの野生型Ｃｏｐ＾−１？Ｎ＾は
再々、ｃｏｐＡ突然変異体プラスミドに対４゛る阻害効
果を減少している。それ故ｃｏｐ＾突然変異体はインヒ
ビターで変化するだけでなく標的のｃｏｐＴでも変化し
、単一の塩基置換によって表現型的に二重突然変異体（
ｄｏｕｂｌｅ ｍｕｔａｎｔ）になる。ｃｏｐｎｉＱ伝
子は分子ｆｆｉｌｌ，０００グルトンの８６アミノ酸の
塩基性蛋白合成の遺伝情報を指定している。この蛋白は
多量形成される。ｃｏｐＢ遺伝子とそのプロモーターが
欠宋するとコピー数が８倍に増大するに至る。
それ故ｃｏｐｌ３蛋白は、複製インヒビターとして、す
なわちプラスミドＲ１の複製の調節において負に作用す
る制御要素として作用すると結論される（Ｍｏｌｉｎ
ｅＬ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｇｃｎ． Ｇｅ
ｎｃｎｔ． １８１， １９８１．１２３〜３０）
。
なわちプラスミドＲ１の複製の調節において負に作用す
る制御要素として作用すると結論される（Ｍｏｌｉｎ
ｅＬ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｇｃｎ． Ｇｅ
ｎｃｎｔ． １８１， １９８１．１２３〜３０）
。
二重突然変異体（ ｃｏｐＡｃｏｐＢ）は、いわゆるラ
ンアウエイ複製のために宿主微生物に対して無条件に致
死性である。したがってこの２つの制御遺伝子産物は相
乗的に作用する。
ンアウエイ複製のために宿主微生物に対して無条件に致
死性である。したがってこの２つの制御遺伝子産物は相
乗的に作用する。
基本的レプリコンの転写活性
基本的レプリコン内に３つの転写開始座位がある。すな
わちｃｏｐＢプロモーター、ｒｃｐＡプロモーター（Ｌ
ｉｇｈｔ ａｎｄ Ｍｏｌｉｎ． Ｍｏｌ． Ｇｅｎ．
ＧｅｎｅＬ． １８４．１９８１． ５６−６１）及
びｃｏｐ＾遺伝子のプロモーター（Ｓｔｏｕｇａａｄ
ｅｔ ａｌ．． ＯＰ． ｃｉｔ．）である。最後のも
のはその元の部位からはなれて転写し、一方前の２者は
もとの部位にむかって転写する。結局両ストランドはｃ
ｏｐＡ部位において転写される。ＣｏｐＢトランスクリ
プト（ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ）はｃｏｐＢ遺伝子を通
って続き、このトランスクリブトとｒｅｐ＾プロモータ
ーにおいて始まるトランスクリプトの両台はｒｃｐＡ遺
伝子を転写する。
わちｃｏｐＢプロモーター、ｒｃｐＡプロモーター（Ｌ
ｉｇｈｔ ａｎｄ Ｍｏｌｉｎ． Ｍｏｌ． Ｇｅｎ．
ＧｅｎｅＬ． １８４．１９８１． ５６−６１）及
びｃｏｐ＾遺伝子のプロモーター（Ｓｔｏｕｇａａｄ
ｅｔ ａｌ．． ＯＰ． ｃｉｔ．）である。最後のも
のはその元の部位からはなれて転写し、一方前の２者は
もとの部位にむかって転写する。結局両ストランドはｃ
ｏｐＡ部位において転写される。ＣｏｐＢトランスクリ
プト（ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ）はｃｏｐＢ遺伝子を通
って続き、このトランスクリブトとｒｅｐ＾プロモータ
ーにおいて始まるトランスクリプトの両台はｒｃｐＡ遺
伝子を転写する。
Ｂｇｌｌｌでの制限によって組立てられてｃｏｐｌｌが
除かれるとプラスミドＩｔ １のコピー数が８−ＩＯ倍
にも増加する。このことは意外なことである。というの
はｃｏｐＢ遺伝子プロモーターとｃｏ ｐ １３ ＋Ｍ
造遺伝子の近位部が除かれると、ｌ） ｃｏｐＢ活性が
失イっれろととらにｒｅｐ＾プロモーターの抑制解除が
おこり、２） ｃｏｐｌｌプロモーターの全ｒｅｐ＾発
現への寄与が失われ、その結果、抑制解除されたｒｅｐ
ＡプロモーターがｃｏｐＢプロモーターからの全ｒｅｐ
Ａ転写を効果的に引＠もぐからである。この全効果は、
ｒｅｐ＾ブ〔ノモーターがｃｏｐＢプロモーターの強力
以上に２倍増大した強力を有するので、ｒｅｐ＾遺伝子
の転写速度が２倍だけ増加するにちがいない。
除かれるとプラスミドＩｔ １のコピー数が８−ＩＯ倍
にも増加する。このことは意外なことである。というの
はｃｏｐＢ遺伝子プロモーターとｃｏ ｐ １３ ＋Ｍ
造遺伝子の近位部が除かれると、ｌ） ｃｏｐＢ活性が
失イっれろととらにｒｅｐ＾プロモーターの抑制解除が
おこり、２） ｃｏｐｌｌプロモーターの全ｒｅｐ＾発
現への寄与が失われ、その結果、抑制解除されたｒｅｐ
ＡプロモーターがｃｏｐＢプロモーターからの全ｒｅｐ
Ａ転写を効果的に引＠もぐからである。この全効果は、
ｒｅｐ＾ブ〔ノモーターがｃｏｐＢプロモーターの強力
以上に２倍増大した強力を有するので、ｒｅｐ＾遺伝子
の転写速度が２倍だけ増加するにちがいない。
この明らかな逆説はｃｏｐＡ遺伝子の活性で説明される
。Ｃｏｐ＾−ＲＮ＾は、一連のウリジン（Ｕ）で終わっ
ているステムを有する正常終結構造で終結している。Ｒ
ｅｐ＾蛋白形成のＣｏｐＡ − ＲＮＡ制御はかような
適性な終結に左右される。対向するストランドの転写が
強力な場合は（収斂転写）、転写の効率は緘少４′る。
。Ｃｏｐ＾−ＲＮ＾は、一連のウリジン（Ｕ）で終わっ
ているステムを有する正常終結構造で終結している。Ｒ
ｅｐ＾蛋白形成のＣｏｐＡ − ＲＮＡ制御はかような
適性な終結に左右される。対向するストランドの転写が
強力な場合は（収斂転写）、転写の効率は緘少４′る。
ｒＧｐ八からの転写が増大４゜るとｅｏｐ八Ｉ・ランス
クリプトが約１５０−２００ヌクレオヂドまで拡大する
。
クリプトが約１５０−２００ヌクレオヂドまで拡大する
。
この拡大したＣｏｐ＾トランスクリプトは複製インヒビ
ターとしては機能しない。ずなイっちそれは実質的に不
活化され、Ｒｅｐ＾蛋白量が増加し、最終的にプラスミ
ドコピー数が増大ずる（Ｓｔｏｕｇａａｄ ａｔ ａｌ
．，ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ ｌ， １９８２． ３
２３−３２８）。
ターとしては機能しない。ずなイっちそれは実質的に不
活化され、Ｒｅｐ＾蛋白量が増加し、最終的にプラスミ
ドコピー数が増大ずる（Ｓｔｏｕｇａａｄ ａｔ ａｌ
．，ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ ｌ， １９８２． ３
２３−３２８）。
複製の制御
２つの遺伝子ｃｏｐＡとｃｏｐ［ｌからの産物はプラス
ミドｒｔ Ｉの複製を負に制御する。すなわちこれら産
物は複製インヒビターとして機能する。ｒａｐ＾−１ａ
ｃ融合体の組立てと分υ〒を通じて、この２つのＣｏｐ
遺伝子の産物がｒｅｐ＾遺伝子の発現を負に制御して作
用するということを示すことができた（ＬｉｇｈＬ ａ
ｎｄＭｏｌｉｎ， Ｍｏｌ． Ｇｅｎ． Ｇｅｎ
ｅｔ、１８４、１９８１， ５６．６１）。
ミドｒｔ Ｉの複製を負に制御する。すなわちこれら産
物は複製インヒビターとして機能する。ｒａｐ＾−１ａ
ｃ融合体の組立てと分υ〒を通じて、この２つのＣｏｐ
遺伝子の産物がｒｅｐ＾遺伝子の発現を負に制御して作
用するということを示すことができた（ＬｉｇｈＬ ａ
ｎｄＭｏｌｉｎ， Ｍｏｌ． Ｇｅｎ． Ｇｅｎ
ｅｔ、１８４、１９８１， ５６．６１）。
それ故にプラスミドｒｔｌの複製は、このプラスミドの
複製開始にたぶん正に必要な蛋白の形成を調節すること
によって制御されているようである。
複製開始にたぶん正に必要な蛋白の形成を調節すること
によって制御されているようである。
１ａｃ遺伝子融合によって、ｃｏｐＡとｃｏｐＢの産物
が別個の標的を有することも証明された。Ｃｏｐｌ３蛋
白の標的はｒｅｐＡプロモーターであり、このＣｏｐ蛋
白はｒｅｐ＾プロモーターにおいて転写開始を阻害する
作用を行う。しかしＣｏｐＢ蛋白はｒｅｐ＾プロモータ
ーの上流側で開姶れた転写を妨害することはできない。
が別個の標的を有することも証明された。Ｃｏｐｌ３蛋
白の標的はｒｅｐＡプロモーターであり、このＣｏｐ蛋
白はｒｅｐ＾プロモーターにおいて転写開始を阻害する
作用を行う。しかしＣｏｐＢ蛋白はｒｅｐ＾プロモータ
ーの上流側で開姶れた転写を妨害することはできない。
Ｃｏｐ＾−ＲＮＡは転写には影響しないが、転写後レベ
ルで作用ずる。すなわちＲｅｐＡ−ｍＲＮ＾の翻訳を阻
害する。
ルで作用ずる。すなわちＲｅｐＡ−ｍＲＮ＾の翻訳を阻
害する。
ランアウエイ突然変異体の複製
公開ヨーロッパ特許出願第７８．１０１８７７．５号に
開示されているプラスミドの複製システムは、野生型Ｉ
ｔ ｌプラスミドについて上記したのと実質的に同じで
ある。この発明の発明者らによる新しい研究によって、
ランアウエイ複製挙動を有する温度依存性プラスミド突
然変異体が存在する理由が一部確認された。上記説明の
ように、ｒａｐ＾遺伝子への転写が増大するとＣｏｐ＾
−ＲＮＡ分子の失活に至ることがある。上記特許願に開
示されたランアウエイ突然変異体プラスミドにおいて、
ｃｏｐＢプロモーターは、次に示すように配列している
うちのひとつのヌクレオヂドを置換することによって突
然変異を起こす。
開示されているプラスミドの複製システムは、野生型Ｉ
ｔ ｌプラスミドについて上記したのと実質的に同じで
ある。この発明の発明者らによる新しい研究によって、
ランアウエイ複製挙動を有する温度依存性プラスミド突
然変異体が存在する理由が一部確認された。上記説明の
ように、ｒａｐ＾遺伝子への転写が増大するとＣｏｐ＾
−ＲＮＡ分子の失活に至ることがある。上記特許願に開
示されたランアウエイ突然変異体プラスミドにおいて、
ｃｏｐＢプロモーターは、次に示すように配列している
うちのひとつのヌクレオヂドを置換することによって突
然変異を起こす。
ａ）野生型プラスミド ５’− ・−ＴｒＣＴＣ
ＡＡＧＴＣＧＣＴ−・・−３゜ｂ）ランアウエイ突然変
異体 ５’ − ・−・ＴＴＣＴＣＡＡＧＴｒＧＣＴ−
・・−３゜アンダーラインをつけた文字がヌクレオチド
置換を示す。記載されている部位はＲＮＡボリメラーゼ
結合座位である。
ＡＡＧＴＣＧＣＴ−・・−３゜ｂ）ランアウエイ突然変
異体 ５’ − ・−・ＴＴＣＴＣＡＡＧＴｒＧＣＴ−
・・−３゜アンダーラインをつけた文字がヌクレオチド
置換を示す。記載されている部位はＲＮＡボリメラーゼ
結合座位である。
この突然変異は、ｃｏｐＢプロモーターからの転写を、
特により高い温度で増大させることが示された。
特により高い温度で増大させることが示された。
調節可能なプロモーターを有するプラスミドの複製
この発明のプラスミドの組立てには、この発明の発明者
らが新しく得た野生型Ｒ１プラスミドの？ｕ ＵＪシス
テムの知識を利用することができた。しかしこの発明の
プラスミド複製は、公開ヨーロッパ特許願第７８． １
０１８７７．５号に開示のランアウエイ？ラスミドの場
合のように、プラスミドの突然変異によってなされるの
ではない。その代わりに、外来プロモーターが挿入され
、その結果複製部位の転写が少なくとも部分的にこのプ
ロモーターで制御されている。このプロモーターは、宿
主微生物が培養される条件下での調節によって調節可能
であってらよく、プロモーター活性の調節は、培養温度
又は培養培地の組成を変えることによるなどの種々の手
段で行ってらよい。
らが新しく得た野生型Ｒ１プラスミドの？ｕ ＵＪシス
テムの知識を利用することができた。しかしこの発明の
プラスミド複製は、公開ヨーロッパ特許願第７８． １
０１８７７．５号に開示のランアウエイ？ラスミドの場
合のように、プラスミドの突然変異によってなされるの
ではない。その代わりに、外来プロモーターが挿入され
、その結果複製部位の転写が少なくとも部分的にこのプ
ロモーターで制御されている。このプロモーターは、宿
主微生物が培養される条件下での調節によって調節可能
であってらよく、プロモーター活性の調節は、培養温度
又は培養培地の組成を変えることによるなどの種々の手
段で行ってらよい。
調節可能なプロモーターが温度依存性プロモーターの群
から選択されたひとつのプロモーターである際は、λｌ
》■もしくはえＰＬ特にλＰｌＩのようなバクテリオフ
ァージ入山来のプロモーターが好ましい。ファージλに
おいて、Ｐ■プロモーターはＣｌリブレツザーによって
制御され、このリヲレツザーはこの発明の原理にしたが
って、ファージλからλＰＲとともに誘導され、ｌ１ｇ
ｌＩＩフラグメントの形態のプラスミドに挿入される（
添加したプラスミド地図第４−ｌ１図参照）。野生型ｃ
ｌリプレツザーはそれ自体温度感受性ではない。そこで
培養温度を調節することによって複製システムを調節可
能にするために、用いた特殊ｃｌリプレツザ−（下記実
施例参照）は温度感受性であり、突然変異体対立遺伝子
（ｍｕｔａｎｔ ａｌｌｅ） ｃ Ｉ ＊ｓｔによって
コードされている（Ｓｕｓｓｍａｎ ａｎｄ Ｊａｃｏ
ｂ， Ｃｏｍｔ．Ｒｅｎｄ ．八ｃａｄ． Ｓｃｉ．
２５４， １９６２． １５１７）。このリブレッサ
ーは活性である。すなわちこれはλＰＲプロモーターを
、約３０゜Ｃの温度のような低温で抑制するが、一方約
３９℃以上の温度のごときより高い温度では変性されて
、そのリプレツザー機能が不活化されλＰＲの抑制が解
除される。その挿入されたプロモーターが非常に強力で
あると、その結果ｒｅｐＡへの転写が著しく増大し、次
いで非制御プラスミド複製にいたる。
から選択されたひとつのプロモーターである際は、λｌ
》■もしくはえＰＬ特にλＰｌＩのようなバクテリオフ
ァージ入山来のプロモーターが好ましい。ファージλに
おいて、Ｐ■プロモーターはＣｌリブレツザーによって
制御され、このリヲレツザーはこの発明の原理にしたが
って、ファージλからλＰＲとともに誘導され、ｌ１ｇ
ｌＩＩフラグメントの形態のプラスミドに挿入される（
添加したプラスミド地図第４−ｌ１図参照）。野生型ｃ
ｌリプレツザーはそれ自体温度感受性ではない。そこで
培養温度を調節することによって複製システムを調節可
能にするために、用いた特殊ｃｌリプレツザ−（下記実
施例参照）は温度感受性であり、突然変異体対立遺伝子
（ｍｕｔａｎｔ ａｌｌｅ） ｃ Ｉ ＊ｓｔによって
コードされている（Ｓｕｓｓｍａｎ ａｎｄ Ｊａｃｏ
ｂ， Ｃｏｍｔ．Ｒｅｎｄ ．八ｃａｄ． Ｓｃｉ．
２５４， １９６２． １５１７）。このリブレッサ
ーは活性である。すなわちこれはλＰＲプロモーターを
、約３０゜Ｃの温度のような低温で抑制するが、一方約
３９℃以上の温度のごときより高い温度では変性されて
、そのリプレツザー機能が不活化されλＰＲの抑制が解
除される。その挿入されたプロモーターが非常に強力で
あると、その結果ｒｅｐＡへの転写が著しく増大し、次
いで非制御プラスミド複製にいたる。
また、プロモーターの調節は化学的手段によって行うこ
とができる。すなわち、プロモーターを誘発する化学物
質を添加して例えばリブレツザー制御プロモーターの活
性を不活性化させその結果プロモーターの抑制を解除さ
せるとか、又はプロモーターを活性化することになるプ
ロモーター誘発性の代謝物の形成を保証することによっ
て、Ｔｄ主微生物が培養される培地の組成を調節して行
われる。化学的に誘発しうるプロモーターの特例は、２
つの染色体リプレッサー蛋白すなわちｄｅｏＲ遺伝子と
ｃｙＬＩ？遺伝子の産物によって負制御を受ける１ミＣ
ｏｌｉからのｄｅｏブロモークーである。この＋１００
プロモーターは培養培地にシチジンを添加することによ
って制御を解除することができる。というのはシチジン
は、そのリプレツザーに対する新和性によって作用しり
プレッザーの高次構造に変化を起こさせ、その結果リプ
レッサーがリブレツザーとして機能するのを停止するか
らである。加うるに、正の制御はカタボライトリップレ
ッション（ｃａＬａｂｏｌｉｔｅ ｒｅｐｒｅｓｓｉｏ
ｎ）を通じてｄｅｏプロモーターからの発現で行うこと
ができる。ザイクリック八ＭＰ （ ｃＡＭＰ）による
ｃｒｐ蛋白（カタボライトリブレツザー蛋白）の活性化
によってｄｅｏプロモーターの活性が賦活される。高細
胞レベルのｃＡＭＰは、低レベルのグルコースの相関関
係があることが知られている。すなわち培養培地からの
グルコースの欠如は限られたｍだけのグルコース、例え
ば約０．Ｏｌ％のｍを、グリセロールもしくはコハク酸
塩とともに添加することによって得られる。グルコース
が細胞によって消費されると、その結果ｃＡＭＰの細胞
間レベルが増大して（１００プロモーターを活性化しそ
のプロモーターを有するプラスミドの複製速度を増大さ
せるに至る。かくしてｄｅｏプロモーターがプラスミド
Ｒ１誘導体中のｃｏｐＢ遺伝子の上流側に挿入されると
、そのプロモーターの誘導によって複製が増大するから
しくは全く非制御になる。この非制御複製挙動は、プラ
スミドのコピー敗がプレインダクションのレベルまで徐
々に紘少するように培養培地にグルコースを添加するこ
とによって逆転させることができる。化学的に調節可能
なプロモーターのらうひとつの例は、栄養培地中にラク
トースを存在させることによって誘発され、増大もしく
は非制御の複製に判達させるＩａｃプロモーターである
。この場合もそのプロセスは、ラクトースが最終的に細
胞によで消費されるような量のラクトースを培地に添加
することによって逆転さＵ・ることができる。
とができる。すなわち、プロモーターを誘発する化学物
質を添加して例えばリブレツザー制御プロモーターの活
性を不活性化させその結果プロモーターの抑制を解除さ
せるとか、又はプロモーターを活性化することになるプ
ロモーター誘発性の代謝物の形成を保証することによっ
て、Ｔｄ主微生物が培養される培地の組成を調節して行
われる。化学的に誘発しうるプロモーターの特例は、２
つの染色体リプレッサー蛋白すなわちｄｅｏＲ遺伝子と
ｃｙＬＩ？遺伝子の産物によって負制御を受ける１ミＣ
ｏｌｉからのｄｅｏブロモークーである。この＋１００
プロモーターは培養培地にシチジンを添加することによ
って制御を解除することができる。というのはシチジン
は、そのリプレツザーに対する新和性によって作用しり
プレッザーの高次構造に変化を起こさせ、その結果リプ
レッサーがリブレツザーとして機能するのを停止するか
らである。加うるに、正の制御はカタボライトリップレ
ッション（ｃａＬａｂｏｌｉｔｅ ｒｅｐｒｅｓｓｉｏ
ｎ）を通じてｄｅｏプロモーターからの発現で行うこと
ができる。ザイクリック八ＭＰ （ ｃＡＭＰ）による
ｃｒｐ蛋白（カタボライトリブレツザー蛋白）の活性化
によってｄｅｏプロモーターの活性が賦活される。高細
胞レベルのｃＡＭＰは、低レベルのグルコースの相関関
係があることが知られている。すなわち培養培地からの
グルコースの欠如は限られたｍだけのグルコース、例え
ば約０．Ｏｌ％のｍを、グリセロールもしくはコハク酸
塩とともに添加することによって得られる。グルコース
が細胞によって消費されると、その結果ｃＡＭＰの細胞
間レベルが増大して（１００プロモーターを活性化しそ
のプロモーターを有するプラスミドの複製速度を増大さ
せるに至る。かくしてｄｅｏプロモーターがプラスミド
Ｒ１誘導体中のｃｏｐＢ遺伝子の上流側に挿入されると
、そのプロモーターの誘導によって複製が増大するから
しくは全く非制御になる。この非制御複製挙動は、プラ
スミドのコピー敗がプレインダクションのレベルまで徐
々に紘少するように培養培地にグルコースを添加するこ
とによって逆転させることができる。化学的に調節可能
なプロモーターのらうひとつの例は、栄養培地中にラク
トースを存在させることによって誘発され、増大もしく
は非制御の複製に判達させるＩａｃプロモーターである
。この場合もそのプロセスは、ラクトースが最終的に細
胞によで消費されるような量のラクトースを培地に添加
することによって逆転さＵ・ることができる。
調節可能なプロモーターを有するＩ）Ｎ八フラグメント
を、本来存在しているひとつの複製調節遺伝子の一部分
、例えばプラスミドＩｌｌのｃｏｐｌ３遺伝子の一部を
占めるロｇｌ［［フラグメン１・の郎分の代わりに、適
性な位置と配向で挿入すると、そのプラスミド誘導体の
複製速度は挿入されたプ〔ｌモーターによって少なくと
も一部分が制御される（Ａ型プラスミド）。
を、本来存在しているひとつの複製調節遺伝子の一部分
、例えばプラスミドＩｌｌのｃｏｐｌ３遺伝子の一部を
占めるロｇｌ［［フラグメン１・の郎分の代わりに、適
性な位置と配向で挿入すると、そのプラスミド誘導体の
複製速度は挿入されたプ〔ｌモーターによって少なくと
も一部分が制御される（Ａ型プラスミド）。
ＪＡ１節可能なプロモーターを有するＤＮＡフラグメン
トを、本来存在している複製調節遺伝子のすぐ上流側に
正しい配向で挿入すると、プラスミド１ １誘導体のｃ
ｏｐｌｌ遺伝子の場合、イっずかに異なる複製性能を有
するプラスミドが得られる（Ｂ型プラスミド）。
トを、本来存在している複製調節遺伝子のすぐ上流側に
正しい配向で挿入すると、プラスミド１ １誘導体のｃ
ｏｐｌｌ遺伝子の場合、イっずかに異なる複製性能を有
するプラスミドが得られる（Ｂ型プラスミド）。
上記のようにｐａｒ部位を欠くＢ型プラスミドは約１％
／ｌ代の頻度で失われる。培養物中にそのプラスミドが
存在するためのセレクションがないと、そのプラスミド
は約３０℃で培養される細胞から最終的に喪失する。こ
のプラスミドを安定化ずるために、例えばＢ型プラスミ
ド中の野生型１ｔｌプラスミドからのｐａｒ部位を有す
るＤＮＡフラグメントを挿入ずることもできる。このよ
うにして類似の条件下で培養される細胞中におけるプラ
スミドの完全な安定性（喪失なし）がらたらされるので
ある。プラスミドの安定性は次のようにして測定できる
。最初に、ｐａｒ部位だけでな（１ａｃ遺伝子が挿入さ
れたＢ型プラスミドを有する細胞と、対照として１ａｃ
遺伝子をもつがｐａｒ部位をらたないＢ型プラスミドを
もつ細胞とを、出発コロニー中に両方のプラスミドが確
実に存在するように、選択して抗生物質（そのプラスミ
ドが耐性を伝達する）を含有ｔるプレート上で培養する
。次いで両者のコロニーの試料を全く抗生物質を含まな
いプレート上にストリークして、例えば２５ｌ代のよう
な多数Ｕ代（細胞倍加）の間セレクションなしで成育す
るにまかせる。最後に、得られた両方のコロニーからの
細胞をマツコンキイラクトース指示プレート（ＭａｃＣ
ｏｎｋｅｙ １ａｃｔｏｓｅ ｉｎｄｉｃａｔｏｒ ｐ
ｌａｔｅ）上にストリークする。そのプレート上におい
”ζ、ｐａｒ部位含有プラスミドを最初に有する細胞は
赤色コロニーを形成してそのプラスミドが保持されたこ
とを示すが、一方ｐａｒ部位なしのプラスミドを最初に
有する対照の細胞は赤色と無色との両方のコロニーを形
成し、セレクションなしの期間にプラスミドがいくつか
の細胞から喪失したことを意味する。このようにしてｐ
ａｒ部位の挿入されたプラスミドは完全に安定化された
ことが示される（実施例ＩＩ参照）。この安定化効果は
、挿入されたＤＮＡフラグメントが、プラスミド含有細
胞をプラスミドを含育しない細胞と比較して、その成長
速度を減少さ０゛る場合に重要である。
／ｌ代の頻度で失われる。培養物中にそのプラスミドが
存在するためのセレクションがないと、そのプラスミド
は約３０℃で培養される細胞から最終的に喪失する。こ
のプラスミドを安定化ずるために、例えばＢ型プラスミ
ド中の野生型１ｔｌプラスミドからのｐａｒ部位を有す
るＤＮＡフラグメントを挿入ずることもできる。このよ
うにして類似の条件下で培養される細胞中におけるプラ
スミドの完全な安定性（喪失なし）がらたらされるので
ある。プラスミドの安定性は次のようにして測定できる
。最初に、ｐａｒ部位だけでな（１ａｃ遺伝子が挿入さ
れたＢ型プラスミドを有する細胞と、対照として１ａｃ
遺伝子をもつがｐａｒ部位をらたないＢ型プラスミドを
もつ細胞とを、出発コロニー中に両方のプラスミドが確
実に存在するように、選択して抗生物質（そのプラスミ
ドが耐性を伝達する）を含有ｔるプレート上で培養する
。次いで両者のコロニーの試料を全く抗生物質を含まな
いプレート上にストリークして、例えば２５ｌ代のよう
な多数Ｕ代（細胞倍加）の間セレクションなしで成育す
るにまかせる。最後に、得られた両方のコロニーからの
細胞をマツコンキイラクトース指示プレート（ＭａｃＣ
ｏｎｋｅｙ １ａｃｔｏｓｅ ｉｎｄｉｃａｔｏｒ ｐ
ｌａｔｅ）上にストリークする。そのプレート上におい
”ζ、ｐａｒ部位含有プラスミドを最初に有する細胞は
赤色コロニーを形成してそのプラスミドが保持されたこ
とを示すが、一方ｐａｒ部位なしのプラスミドを最初に
有する対照の細胞は赤色と無色との両方のコロニーを形
成し、セレクションなしの期間にプラスミドがいくつか
の細胞から喪失したことを意味する。このようにしてｐ
ａｒ部位の挿入されたプラスミドは完全に安定化された
ことが示される（実施例ＩＩ参照）。この安定化効果は
、挿入されたＤＮＡフラグメントが、プラスミド含有細
胞をプラスミドを含育しない細胞と比較して、その成長
速度を減少さ０゛る場合に重要である。
最後に、プラスミドＲ１のｃｏｐＢ遺伝子のような本来
存在している複製調節遺伝子を有するｌ）ＮΔフラグメ
ントをＡ型プラスミドの段製部位以外の座位に挿入する
と、特別の複製性能を有するプラスミドが得られる（Ｃ
型プラスミド）。
存在している複製調節遺伝子を有するｌ）ＮΔフラグメ
ントをＡ型プラスミドの段製部位以外の座位に挿入する
と、特別の複製性能を有するプラスミドが得られる（Ｃ
型プラスミド）。
Ｂ型プラスミドについて先に述べたプラスミドの安定性
は、Ｃ型プラスミドについて一層顕とに望まれることで
ある。というのは上記のようにこれらＣ型プラスミドは
低温において一層低いコピー数を有し、それ故ｐａｒ部
位を欠いている場合はＢ型プラスミドよりも高い頻度で
失われるからである。Ｃ型プラスミドは、ｐａｒ部位が
ｆｆ在していないプラスミドの場合、これにｐａｒ部位
を挿入することによって同様に安定化すること．ができ
る。
は、Ｃ型プラスミドについて一層顕とに望まれることで
ある。というのは上記のようにこれらＣ型プラスミドは
低温において一層低いコピー数を有し、それ故ｐａｒ部
位を欠いている場合はＢ型プラスミドよりも高い頻度で
失われるからである。Ｃ型プラスミドは、ｐａｒ部位が
ｆｆ在していないプラスミドの場合、これにｐａｒ部位
を挿入することによって同様に安定化すること．ができ
る。
この発明の特別の態様によって、次のようなプラスミド
が提供される。ずなわらそのプラスミドは第一の調節可
能なプロモーターに加えて、プロモーターが、例えば所
望のポリペプチド合成の遺伝情報を指定する挿入された
外来構造遺伝子の発現を調節する複製部位以外に位置す
る第二のプロモーターを有する。この追加のプロモータ
ーは、例えばλＰＲプロモーターとｃｌ遺伝子とを通過
して有するフラグメント上に位置するｃｌプロモーター
でもよい。そしてそのｃｌプロモーターはｃ■遺伝子産
物で制御されλＰＲの逆方向に転写する。
が提供される。ずなわらそのプラスミドは第一の調節可
能なプロモーターに加えて、プロモーターが、例えば所
望のポリペプチド合成の遺伝情報を指定する挿入された
外来構造遺伝子の発現を調節する複製部位以外に位置す
る第二のプロモーターを有する。この追加のプロモータ
ーは、例えばλＰＲプロモーターとｃｌ遺伝子とを通過
して有するフラグメント上に位置するｃｌプロモーター
でもよい。そしてそのｃｌプロモーターはｃ■遺伝子産
物で制御されλＰＲの逆方向に転写する。
ｃｌプロモーターによってその発現が調節されうる措造
遺伝子を、ｃｌプロモーターの下流側（ｄｏｗｎｓｔｒ
ｅａｍ）に挿入することができる。一例として、１ａｃ
プロモーターを欠（ １ａｃ遺伝子（１ａｃオペロンと
して知られている）がｃｌ遺伝子の下流側に挿入された
が、得られた遺伝子産物の増幅から、１ａｃ遺伝子の転
写は、少なくとも一部分がｃｌブロモークーによって制
御されていることが示唆された（実施例８参照）。かく
して、この発明のプラスミドを、外来遺伝子挿入用のク
ローニングベクターとして用いることができることが示
された。このｃｌプ【Ｊモーターはｃｌリツプレツーに
よってもＵＮ節可能であり、その結果遺伝子産物の増幅
がプラスミドＤＮＡの増幅と同時に起こるという利点を
有する。
遺伝子を、ｃｌプロモーターの下流側（ｄｏｗｎｓｔｒ
ｅａｍ）に挿入することができる。一例として、１ａｃ
プロモーターを欠（ １ａｃ遺伝子（１ａｃオペロンと
して知られている）がｃｌ遺伝子の下流側に挿入された
が、得られた遺伝子産物の増幅から、１ａｃ遺伝子の転
写は、少なくとも一部分がｃｌブロモークーによって制
御されていることが示唆された（実施例８参照）。かく
して、この発明のプラスミドを、外来遺伝子挿入用のク
ローニングベクターとして用いることができることが示
された。このｃｌプ【Ｊモーターはｃｌリツプレツーに
よってもＵＮ節可能であり、その結果遺伝子産物の増幅
がプラスミドＤＮＡの増幅と同時に起こるという利点を
有する。
また第二プロモーターはえＰＬのようなλプロモーター
でもよく又はｒｅｃ Ａプロモーターであってもよい。
でもよく又はｒｅｃ Ａプロモーターであってもよい。
第二プロモーターがλｚ）Ｌである場合、このプロモー
ターは、ファージλからのＢａｎ＋ＩＩ ｌ−ＢｇｌＩ
Ｉフラグメントとしてプラスミドに挿入することができ
、かくしてＢａｍｌｌ ｌ ＳＩｌｇｌ ＩＩ ， Ｓ
ａｕ３＾及びＢｃｌｌのようないくつかの制御酵素で生
成されたＤＮＡフラグメントの挿入用に好都合なクロー
ニング座位（ Ｂ．ｌｌＩｌｌｌｌ Ｉ ）を産生ずる
。またλＰｔは、このプロモーターを有するプラスミド
からの適当なＤＮＡフラグメントに挿入してもよい。ま
たλＰ ｔ．は、増幅条件が同じであるように温度感受
性のｃｌレプレッサーによって制御されるので第二プロ
モーターとして有利である。
ターは、ファージλからのＢａｎ＋ＩＩ ｌ−ＢｇｌＩ
Ｉフラグメントとしてプラスミドに挿入することができ
、かくしてＢａｍｌｌ ｌ ＳＩｌｇｌ ＩＩ ， Ｓ
ａｕ３＾及びＢｃｌｌのようないくつかの制御酵素で生
成されたＤＮＡフラグメントの挿入用に好都合なクロー
ニング座位（ Ｂ．ｌｌＩｌｌｌｌ Ｉ ）を産生ずる
。またλＰｔは、このプロモーターを有するプラスミド
からの適当なＤＮＡフラグメントに挿入してもよい。ま
たλＰ ｔ．は、増幅条件が同じであるように温度感受
性のｃｌレプレッサーによって制御されるので第二プロ
モーターとして有利である。
一方プロモーターがｒｅｃ Ａの場合、例えばＰＢＥＵ
ｌ４（Ｏｌｅｆｉｎ ａｎｄ Ｃｌａｒｋ， Ｊ． Ｂ
ａｃｋ． １４８， １９８１． ３８６−９０）から
の１３ａｌｌｌｌｌ ｌフラグメントとしてこの発明の
プラスミドを挿入してもよい。このプロモーターは、ｒ
ｅｃ Ａプロモーター保有プラスミドが形質転換された
微生物菌株によって異なるしかたで機能する。
ｌ４（Ｏｌｅｆｉｎ ａｎｄ Ｃｌａｒｋ， Ｊ． Ｂ
ａｃｋ． １４８， １９８１． ３８６−９０）から
の１３ａｌｌｌｌｌ ｌフラグメントとしてこの発明の
プラスミドを挿入してもよい。このプロモーターは、ｒ
ｅｃ Ａプロモーター保有プラスミドが形質転換された
微生物菌株によって異なるしかたで機能する。
ｒｅｃ Ａ閑株中でｒａｃＡはｌｅｘＡリプレッサーに
よって制御され、このリブレツザーはその微生物の染色
体上に位置している。例えば非制御複製が温度で誘導さ
れる場合、プラスミドのコピー敗としたがってｒｅｃΔ
プロモーターの数とが徐々に増加する。ＩｅｘＡリプレ
ツザーは、少量生産するだけでありモしてｒｅｃΔプロ
モータ一部位に強固に結合することによって機能４゜る
ので， ｌｏｘＡリブレツザーの利用しうるｍは、コピ
ー数が増大ずるにつれて徐々に滴定される。このように
して、ｒｃｃ Ａが徐々に制御解除され、プラスミドコ
ピー数が高くなるとｒｅｃ Ａからの転写が対応して増
大ずる。
よって制御され、このリブレツザーはその微生物の染色
体上に位置している。例えば非制御複製が温度で誘導さ
れる場合、プラスミドのコピー敗としたがってｒｅｃΔ
プロモーターの数とが徐々に増加する。ＩｅｘＡリプレ
ツザーは、少量生産するだけでありモしてｒｅｃΔプロ
モータ一部位に強固に結合することによって機能４゜る
ので， ｌｏｘＡリブレツザーの利用しうるｍは、コピ
ー数が増大ずるにつれて徐々に滴定される。このように
して、ｒｃｃ Ａが徐々に制御解除され、プラスミドコ
ピー数が高くなるとｒｅｃ Ａからの転写が対応して増
大ずる。
クローニング及び産生ベクターとしてのこの発明のプラ
スミド。
スミド。
この発明のプラスミド類は、クローニング及び産生ベク
ターとしての性能において次のような多くの特徴を有す
る。
ターとしての性能において次のような多くの特徴を有す
る。
１）これらのプラスミド類は分子ｍが約４．０〜１２．
５Ｘ １０°ダルトンで小さいものである。サイズが小
さいので取扱いに便利であり形質転換効率が向上ずる。
５Ｘ １０°ダルトンで小さいものである。サイズが小
さいので取扱いに便利であり形質転換効率が向上ずる。
２）これもプラスミド類は制限エンドヌクレアーゼ類に
対する特異な座位を多数有する。“特異な“の用語はひ
とつの特異制限エンドヌクレアーゼに対してそのプラス
ミドがその酵素によって切断可能なひとつのそしとひと
つだけの座位を有することを意味するものである。
対する特異な座位を多数有する。“特異な“の用語はひ
とつの特異制限エンドヌクレアーゼに対してそのプラス
ミドがその酵素によって切断可能なひとつのそしとひと
つだけの座位を有することを意味するものである。
すでに述べたように、複製部位内に位置６゜る制御座位
はクローニング座位としては許容できない。
はクローニング座位としては許容できない。
かくして下記実施例に記載のプラスミドにおいて、制限
座位のＳｄｌｌとＰｓＬＩとは、プラスミドのレブリコ
ン中に位置しているのでクローニング座位として適切で
なく、一方制限座位のＥｃｏＲ ＩとＢａｍｌｌ Ｉと
はこの重要な部位中に位置していないので外来１） Ｎ
Δの導入に有用な座位を形成する。適切な制御座位がプ
ラスミド自体に見出されない場合は、かような座位を有
する小さなＤＮＡフラグメント（リンカーとして知られ
ている）を実施例４に記載のようにしてプラスミドに挿
入して組立てることができる。
座位のＳｄｌｌとＰｓＬＩとは、プラスミドのレブリコ
ン中に位置しているのでクローニング座位として適切で
なく、一方制限座位のＥｃｏＲ ＩとＢａｍｌｌ Ｉと
はこの重要な部位中に位置していないので外来１） Ｎ
Δの導入に有用な座位を形成する。適切な制御座位がプ
ラスミド自体に見出されない場合は、かような座位を有
する小さなＤＮＡフラグメント（リンカーとして知られ
ている）を実施例４に記載のようにしてプラスミドに挿
入して組立てることができる。
しかしながら挿入された構造遺伝子の発現を確実に行わ
せるために、横造遺伝子自体の上流側で第２プロモータ
ーの下流側に位置する適当な翻訳開始シグナル（リポソ
ーム結合座位）を有する必要もある。
せるために、横造遺伝子自体の上流側で第２プロモータ
ーの下流側に位置する適当な翻訳開始シグナル（リポソ
ーム結合座位）を有する必要もある。
リポソーム結合座位の存在を保証するひとつの方法は種
々のＤＮＡフラグメン１・（例えばリンカーのごとき）
を挿入する方法である。そしてこれらのフラグメントは
合成で作ることができて各々異なる構造遺伝子に対する
翻訳開始シグナルを有する。一方、微生物にて発現され
ることがすでに知られている遺伝子含有ＤＮＡフラグメ
ン１・を完全にランアウエイクローニングベクターに挿
入してもよく、かくして適切な翻訳開始シグナルのｒＴ
：在が保証される。
々のＤＮＡフラグメン１・（例えばリンカーのごとき）
を挿入する方法である。そしてこれらのフラグメントは
合成で作ることができて各々異なる構造遺伝子に対する
翻訳開始シグナルを有する。一方、微生物にて発現され
ることがすでに知られている遺伝子含有ＤＮＡフラグメ
ン１・を完全にランアウエイクローニングベクターに挿
入してもよく、かくして適切な翻訳開始シグナルのｒＴ
：在が保証される。
３）上記のように、できるだけ小さいクローニングベク
ターをイ丁するのがｒ丁不りであるが、そのク〔１ニン
グベクターが、プラスミド含何細胞の同定及び／又は選
択に有用ないわゆるマーカーの発現用の遺伝子を育ずる
ことが多くの目的にとって実用的である。最も有用なマ
ーカーは、例えばアンピシリン耐性のような抗生物質耐
性である。というのはこれは組換えプラスミドを微生物
宿主に形質転換する処理をした後、その組換えプラスミ
ドを受け入れなかった微生物を容易に逆選択することが
できるからである。下記実施例に記載のすべてのプラス
ミドに存在する他のマーカーはｃｌ遺伝子によって暗号
化されているλ免疫である。この発明のプラスミドのさ
らに有用な性質は、特異な座位がそのなかに位置してい
る、選択可能な表現型を伝達する遺伝子が存在している
ことである。
ターをイ丁するのがｒ丁不りであるが、そのク〔１ニン
グベクターが、プラスミド含何細胞の同定及び／又は選
択に有用ないわゆるマーカーの発現用の遺伝子を育ずる
ことが多くの目的にとって実用的である。最も有用なマ
ーカーは、例えばアンピシリン耐性のような抗生物質耐
性である。というのはこれは組換えプラスミドを微生物
宿主に形質転換する処理をした後、その組換えプラスミ
ドを受け入れなかった微生物を容易に逆選択することが
できるからである。下記実施例に記載のすべてのプラス
ミドに存在する他のマーカーはｃｌ遺伝子によって暗号
化されているλ免疫である。この発明のプラスミドのさ
らに有用な性質は、特異な座位がそのなかに位置してい
る、選択可能な表現型を伝達する遺伝子が存在している
ことである。
この座位にＤＮＡフラグメントを挿入ずるとその逍伝子
の挿入失活が起こる。この例としては、Ｌａｃ ”表現
型を伝達する遺伝子については実施例９に、クロラムフ
エニコール耐性を暗号化している遺伝については実施剖
１２に記載されている。マーカー例えば抗生物質耐性を
、ク［Ｊ−ニングベクターとして用いられるべきこの発
明のプラスミドに導入したいときは、転位（ ｔｒａｎ
ｓｐｏｓｉＬｉｏｎ）によるか又はそれ自体公知の方法
で外来１） Ｎ Ａフラグメントを挿入ずることによっ
て行うことができろ。かような転位の例は実施例４に示
す。
の挿入失活が起こる。この例としては、Ｌａｃ ”表現
型を伝達する遺伝子については実施例９に、クロラムフ
エニコール耐性を暗号化している遺伝については実施剖
１２に記載されている。マーカー例えば抗生物質耐性を
、ク［Ｊ−ニングベクターとして用いられるべきこの発
明のプラスミドに導入したいときは、転位（ ｔｒａｎ
ｓｐｏｓｉＬｉｏｎ）によるか又はそれ自体公知の方法
で外来１） Ｎ Ａフラグメントを挿入ずることによっ
て行うことができろ。かような転位の例は実施例４に示
す。
培養方法
この発明はまた、調節可能なプロモーターが、転位が複
製を調節するようなしかた、特にプロモーターからの転
写が増大ずるとプラスミドコピー数が実質的に増大ずる
からしくは非制御になるようなしかたで挿入されたプラ
スミドをａずる微生物を培養し、：ＪＭ＋節可能なプロ
モーターからの転写の増大を保証しその結果プラスミド
コピー数が実質的に増大ずるからしくは非制御になる条
件下での少なくとらひとつの培養期を（Ｔし、次いで微
生物培養物からのプラスミドの遺伝子産物を収穫するこ
とからなる、プラスミドＤＮＡの遺伝子産物の製造法を
提供するものである。培養自体は、問題の微生物種のに
最適なことが知られていろ通常の栄養培地を含む通常の
技術を用いて適切に行イっれる。また遺伝子産物の収穫
は、製造された特定の逍伝子産物の本質と性質、宿主微
生物の性質などに適４゛る公知の方法にしたがって行わ
れろ。この発明はさらに、この発明のプラスミドが細胞
の所望敗が得られるまで、接種と増殖の段階において一
定の低コピー数になる条件下で形質転換された宿主微生
物を培養し次いでその宿主微生物を、プラスミドコピー
数が実質的に増大ずるか又は非制御になる条件下で培養
する方法を提供するものである。
製を調節するようなしかた、特にプロモーターからの転
写が増大ずるとプラスミドコピー数が実質的に増大ずる
からしくは非制御になるようなしかたで挿入されたプラ
スミドをａずる微生物を培養し、：ＪＭ＋節可能なプロ
モーターからの転写の増大を保証しその結果プラスミド
コピー数が実質的に増大ずるからしくは非制御になる条
件下での少なくとらひとつの培養期を（Ｔし、次いで微
生物培養物からのプラスミドの遺伝子産物を収穫するこ
とからなる、プラスミドＤＮＡの遺伝子産物の製造法を
提供するものである。培養自体は、問題の微生物種のに
最適なことが知られていろ通常の栄養培地を含む通常の
技術を用いて適切に行イっれる。また遺伝子産物の収穫
は、製造された特定の逍伝子産物の本質と性質、宿主微
生物の性質などに適４゛る公知の方法にしたがって行わ
れろ。この発明はさらに、この発明のプラスミドが細胞
の所望敗が得られるまで、接種と増殖の段階において一
定の低コピー数になる条件下で形質転換された宿主微生
物を培養し次いでその宿主微生物を、プラスミドコピー
数が実質的に増大ずるか又は非制御になる条件下で培養
する方法を提供するものである。
したがって、培養は、はじめに、プロモーターからのど
んな転写もプラスミドのコピー数にｆｒＱに影響しない
条件下で行ってもよく、その後プロモーターの活性を誘
発４”る物質を、培養培地に、実質的に複写が増大ずる
か又は非制御になる量で添加される。所望により、これ
らの培養条件は、プラスミドの実質的な増幅を得るのに
充分な期間であるが、微生物培養物の実質的な損傷を回
避するのに充分短い期間の後に逆転させてもよい。前記
物質は培谷媒体から除去されるとプラスミドコピー数が
最終的にプレインダクションレベルに到達Ｖるまで徐々
に減少するにいたる。ここにおいて、“除去される”の
用語は、問題の物質を培養媒体から完全になくずことを
意味ずる必要はないが、その物質からはやいかなる効果
ら台しない程度の濃度まで減少さＵ゛るにすぎないこと
を念味ずる。
んな転写もプラスミドのコピー数にｆｒＱに影響しない
条件下で行ってもよく、その後プロモーターの活性を誘
発４”る物質を、培養培地に、実質的に複写が増大ずる
か又は非制御になる量で添加される。所望により、これ
らの培養条件は、プラスミドの実質的な増幅を得るのに
充分な期間であるが、微生物培養物の実質的な損傷を回
避するのに充分短い期間の後に逆転させてもよい。前記
物質は培谷媒体から除去されるとプラスミドコピー数が
最終的にプレインダクションレベルに到達Ｖるまで徐々
に減少するにいたる。ここにおいて、“除去される”の
用語は、問題の物質を培養媒体から完全になくずことを
意味ずる必要はないが、その物質からはやいかなる効果
ら台しない程度の濃度まで減少さＵ゛るにすぎないこと
を念味ずる。
ある物質によって誘発されるよりむしろ阻害されるプロ
モーターを用いるらうひとつの方法において、微生物培
養物は最初、使用される特定のプロモーターの活性を阻
害する物質のび在下で培養されでもよく、その後、その
物質の濃度を、例えば培養媒体を希釈するか又は徐々に
細胞によって消費させるかによって、プロモーターを活
性化さＵ゛るにいたる程度に減少させ、その結果、プラ
スミドコピー数を実質的に増加さすか又は非制御にさＵ
゜る。所望により、この培養条件は、プラスミドの実質
的な増幅を得るのに充分な期間であるが微生物培養物の
実質的損傷を回避するのに充分短い期間の後プラスミド
コピー数がプレインダクンヨンのレベルに到達するまで
徐々に減少ずるにいたる量でプロモーター活性の阻害物
質を、添加４′ることによって置き換えてもよい。
モーターを用いるらうひとつの方法において、微生物培
養物は最初、使用される特定のプロモーターの活性を阻
害する物質のび在下で培養されでもよく、その後、その
物質の濃度を、例えば培養媒体を希釈するか又は徐々に
細胞によって消費させるかによって、プロモーターを活
性化さＵ゛るにいたる程度に減少させ、その結果、プラ
スミドコピー数を実質的に増加さすか又は非制御にさＵ
゜る。所望により、この培養条件は、プラスミドの実質
的な増幅を得るのに充分な期間であるが微生物培養物の
実質的損傷を回避するのに充分短い期間の後プラスミド
コピー数がプレインダクンヨンのレベルに到達するまで
徐々に減少ずるにいたる量でプロモーター活性の阻害物
質を、添加４′ることによって置き換えてもよい。
また微生物を培養する条件には、プラスミドコピー数が
実質的に増加するか又は非制御になる温度かその近傍温
度におけるある培養期間が少なくとも含まれていてもよ
い。
実質的に増加するか又は非制御になる温度かその近傍温
度におけるある培養期間が少なくとも含まれていてもよ
い。
調節可能なプロモーターが温度依存性が又は温度感受性
の因子で調節される際は、この発明のプラスミドで形質
転換された微生物の生産規模の培ｉ５物までの増殖は、
増加するプラスミドと遺伝子産物の濃度による微生物育
成のどんな阻害をも避けるために、プラスミドが一定の
低コピー数を示４′温度又はその近傍温度で行うのが好
ましい。次いでその温度を、プラスミドが実質的に増大
もしくは非制御のコピー数を示す温度に変えてもよい。
の因子で調節される際は、この発明のプラスミドで形質
転換された微生物の生産規模の培ｉ５物までの増殖は、
増加するプラスミドと遺伝子産物の濃度による微生物育
成のどんな阻害をも避けるために、プラスミドが一定の
低コピー数を示４′温度又はその近傍温度で行うのが好
ましい。次いでその温度を、プラスミドが実質的に増大
もしくは非制御のコピー数を示す温度に変えてもよい。
生産期間は、微生物の成育がプラスミドからのプラスミ
ドＤＮＡ及び／又は遺伝子の産物によって阻害されるま
でのことが多いが、適切な生産期間の後、遺伝子産物の
収穫が行われる。特定の条件によっては、プラスミドの
遺伝子産物の亀が増大ずる（次いでこの産物は培養物が
連続的もしくはは間欠的に収穫できる）とともに、宿主
微生物が存続し成育し続けることができるように、プラ
スミドコピー数が実質的に増大ずるか又は非制御状態に
なる温度にごく近い温度で連続的に量産培養を行うこと
が好ましい場合がある。
ドＤＮＡ及び／又は遺伝子の産物によって阻害されるま
でのことが多いが、適切な生産期間の後、遺伝子産物の
収穫が行われる。特定の条件によっては、プラスミドの
遺伝子産物の亀が増大ずる（次いでこの産物は培養物が
連続的もしくはは間欠的に収穫できる）とともに、宿主
微生物が存続し成育し続けることができるように、プラ
スミドコピー数が実質的に増大ずるか又は非制御状態に
なる温度にごく近い温度で連続的に量産培養を行うこと
が好ましい場合がある。
一方その微生物は、プラスミドコピー数が一定である温
度でｍ産規模の培養まで増殖させてもよい。次いで温度
をプラスミドコピー数が実質的に増大ずるか又は非制９
１１になる温度もしくはその近傍の温度に変える。次い
でプラスミドの実質的増幅を得るのに充分な期間である
が微生物培地のいかなる実質的損傷を避けるのに充分短
い期間、前記温度を保持する。その後温度を、一定の低
いプラスミドコピー数を保証する温度にらう一度変化さ
せ、プラスミドコピー数を徐々に減少させる後者の温度
で、該コピー数が最初のレベルに到達４゛るまでｍ産培
養を続ける。この培兵法は、プラスミドに挿入される外
来遺伝子か、約３０’Ｃより高い温度では生存できない
生物から由来のものであって、その結果かような遺伝子
の遺伝子産物がより高い温度で変性されることがある場
合、特に重要である。さらに、この培養法を採用すると
通常、遺伝子産物の収率が高い（実施例１６参照。Ｕｈ
ｌｉｎａｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ ６， ４９７９．
９１−１０６，第■表を比較せよ）。
度でｍ産規模の培養まで増殖させてもよい。次いで温度
をプラスミドコピー数が実質的に増大ずるか又は非制９
１１になる温度もしくはその近傍の温度に変える。次い
でプラスミドの実質的増幅を得るのに充分な期間である
が微生物培地のいかなる実質的損傷を避けるのに充分短
い期間、前記温度を保持する。その後温度を、一定の低
いプラスミドコピー数を保証する温度にらう一度変化さ
せ、プラスミドコピー数を徐々に減少させる後者の温度
で、該コピー数が最初のレベルに到達４゛るまでｍ産培
養を続ける。この培兵法は、プラスミドに挿入される外
来遺伝子か、約３０’Ｃより高い温度では生存できない
生物から由来のものであって、その結果かような遺伝子
の遺伝子産物がより高い温度で変性されることがある場
合、特に重要である。さらに、この培養法を採用すると
通常、遺伝子産物の収率が高い（実施例１６参照。Ｕｈ
ｌｉｎａｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ ６， ４９７９．
９１−１０６，第■表を比較せよ）。
プラスミドコピー数が実質的に増大するがもしくは非制
御になる温度は、プラスミドが一定で低いコピー数を有
する温度よりも高くてもよい。この高い温度は例えば約
３６〜４２℃の範囲の温度である。
御になる温度は、プラスミドが一定で低いコピー数を有
する温度よりも高くてもよい。この高い温度は例えば約
３６〜４２℃の範囲の温度である。
図面の説明
次に図面を説明４゜る。
第１図は野生型プラスミドＩｌｌの複製部位の概略図で
ある。
ある。
第２図は下記第３〜２１図に用いられている記号の手引
きである。及び 第３〜２１図は実施例に記載のプラスミドの制限地図を
示す。
きである。及び 第３〜２１図は実施例に記載のプラスミドの制限地図を
示す。
第１図に、プラスミドＩｌｌの基本的レブリコンの概略
図が示され、その中に縦線を入れた部分は翻訳された部
位（ ｔｒａｎｓｌａｔＯｄ ｒｅｇｉｏｎ）を意味し
、ブランク部分はトランスクリプトを意味し、点線部分
は可能なトランスクリプトを意味する。丸の中にヘヤピ
ンループ部の拡大図がＣｏｐ＾−１？Ｎ＾の高度の二次
構造を説明するために示されている。Ｏｒｉは複製開始
点を示す。水平の矢印は転写の方向を意味する。
図が示され、その中に縦線を入れた部分は翻訳された部
位（ ｔｒａｎｓｌａｔＯｄ ｒｅｇｉｏｎ）を意味し
、ブランク部分はトランスクリプトを意味し、点線部分
は可能なトランスクリプトを意味する。丸の中にヘヤピ
ンループ部の拡大図がＣｏｐ＾−１？Ｎ＾の高度の二次
構造を説明するために示されている。Ｏｒｉは複製開始
点を示す。水平の矢印は転写の方向を意味する。
第２図に下記第３〜２１図に用いられている記号の手引
きを示した。Ａはｒｔｔ型プラスミドからのＤＮＡを、
Ｂはバクテリオファージλ（ＥＤλ４）由米のＩ） Ｎ
Ａを、ＣはＴｎ３｝ランスボゾン（ＥＤλ’ｌ’ ｎ
３からの）からのＤＮＡを、！）はプラスミドｐｌｌ
ｌ２３２２からのＩ） Ｎ Ａを、ＥはプラスミドｐＭ
Ｃ８７ １から（７）ＤＮＡを、ＦはプラスミドｐＶＩ
ｌ１４２４からののＤＮＡを、ＧはプラスミドｐｓＫ８
１０４からのＤＮＡを、１１は構造遺伝子七重要な座位
を、１は転写方向の表示を付したプロモーターを、及び
Ｊはプラスミドの大きさのスケールをそれぞれ息味ずる
。ブランク部分はプラスミドｐｌｌｃｕｌ４からのＤＮ
Ａを息味する。
きを示した。Ａはｒｔｔ型プラスミドからのＤＮＡを、
Ｂはバクテリオファージλ（ＥＤλ４）由米のＩ） Ｎ
Ａを、ＣはＴｎ３｝ランスボゾン（ＥＤλ’ｌ’ ｎ
３からの）からのＤＮＡを、！）はプラスミドｐｌｌ
ｌ２３２２からのＩ） Ｎ Ａを、ＥはプラスミドｐＭ
Ｃ８７ １から（７）ＤＮＡを、ＦはプラスミドｐＶＩ
ｌ１４２４からののＤＮＡを、ＧはプラスミドｐｓＫ８
１０４からのＤＮＡを、１１は構造遺伝子七重要な座位
を、１は転写方向の表示を付したプロモーターを、及び
Ｊはプラスミドの大きさのスケールをそれぞれ息味ずる
。ブランク部分はプラスミドｐｌｌｃｕｌ４からのＤＮ
Ａを息味する。
第３〜２１図には各実施例に記載のプラスミドの直線制
限地図が示されｎｔ型プラスミドの遺伝子型は水平線上
に記入して示されている。５したがってｃｏｐＢは、ｃ
ｏｐＢ遺伝子とｃｏｐ＾遺伝子との間のｒｅｐＡプロモ
ーターからの転写を抑制するポリペブチド合成の遺伝子
情報を指定する遺伝子を示す。ｃｏｐＡはＲｅｐ＾−ｍ
ＲＮＡの翻訳を阻害するＲＮＡ分子をコードずる遺伝子
を示ず。Ｏｒｉは複製の増殖型開始点を示す。ａｐｈＡ
はカナマイシンに対する耐性を暗号化する遺伝子を示ず
。ｂｌａはアンピシリンに対する耐性を暗号化する遺伝
子を示ず。１ａｃ＾と１ａｃＹと１ａｃＺは挿入された
１ａｃオペロンを示し、１ａｃＡはトランスアセチラー
ゼ、ＩａｃＹはパーミアーゼ及び１ａｃＺはβ−ガラク
トシダーゼそれぞれの合成遺伝情報を指定する。ｃ ｌ
ｓａｔはλＰＲプロモーターの温度感受性リブレッサ
ー合成の遺伝情報を指定する遺伝子を示ず。ｔｎｐｌｉ
とＬｎｐ＾はＴロ３１・ランスポジション機能をコード
する遺伝子を示す。ｐａ『はプラスミドの分配の原囚で
ある部位を示す。ｒｅｃ＾は組換え蛋白の遣伝情報を指
定する遺伝子を示ず。またＩ’ｒｅｃ＾はｒｅｐＡプロ
モーターを示す。水平線の下側には制限酵素の座位が示
され、Ｐはｒ’ｓＬ［を、Ｂ，は１｛ｇ１■を、Ｓｔは
Ｓａｌｌを、ＥはＥｃｏＲ Ｉを、ｌＩ３はＩｌｉｎｄ
ｔｎを、Ｂ１はＢａｍｌｌ ｌを、ＳはＳｍａｌｌを、
１３ ． Ｂ ，はＢｇｌ■座位とＢａｍｌｌ Ｉ座位
との融合体を、ＣはＣｌａ ｌをそれぞれ意味する。第
１１図において、記入されているプラスミドは他の図中
のプラスミドと同じスケールで画かれている。括弧でか
こんで挿入した部分は挿入された１ａｃ遺伝子を示す。
限地図が示されｎｔ型プラスミドの遺伝子型は水平線上
に記入して示されている。５したがってｃｏｐＢは、ｃ
ｏｐＢ遺伝子とｃｏｐ＾遺伝子との間のｒｅｐＡプロモ
ーターからの転写を抑制するポリペブチド合成の遺伝子
情報を指定する遺伝子を示す。ｃｏｐＡはＲｅｐ＾−ｍ
ＲＮＡの翻訳を阻害するＲＮＡ分子をコードずる遺伝子
を示ず。Ｏｒｉは複製の増殖型開始点を示す。ａｐｈＡ
はカナマイシンに対する耐性を暗号化する遺伝子を示ず
。ｂｌａはアンピシリンに対する耐性を暗号化する遺伝
子を示ず。１ａｃ＾と１ａｃＹと１ａｃＺは挿入された
１ａｃオペロンを示し、１ａｃＡはトランスアセチラー
ゼ、ＩａｃＹはパーミアーゼ及び１ａｃＺはβ−ガラク
トシダーゼそれぞれの合成遺伝情報を指定する。ｃ ｌ
ｓａｔはλＰＲプロモーターの温度感受性リブレッサ
ー合成の遺伝情報を指定する遺伝子を示ず。ｔｎｐｌｉ
とＬｎｐ＾はＴロ３１・ランスポジション機能をコード
する遺伝子を示す。ｐａ『はプラスミドの分配の原囚で
ある部位を示す。ｒｅｃ＾は組換え蛋白の遣伝情報を指
定する遺伝子を示ず。またＩ’ｒｅｃ＾はｒｅｐＡプロ
モーターを示す。水平線の下側には制限酵素の座位が示
され、Ｐはｒ’ｓＬ［を、Ｂ，は１｛ｇ１■を、Ｓｔは
Ｓａｌｌを、ＥはＥｃｏＲ Ｉを、ｌＩ３はＩｌｉｎｄ
ｔｎを、Ｂ１はＢａｍｌｌ ｌを、ＳはＳｍａｌｌを、
１３ ． Ｂ ，はＢｇｌ■座位とＢａｍｌｌ Ｉ座位
との融合体を、ＣはＣｌａ ｌをそれぞれ意味する。第
１１図において、記入されているプラスミドは他の図中
のプラスミドと同じスケールで画かれている。括弧でか
こんで挿入した部分は挿入された１ａｃ遺伝子を示す。
原料と方法
用いたエシエリヒア・コリＫ−１２菌株はＣＳＩＩ５０
テあ つ ノこ（△ｐｒｏ−１ａｃ． ｒｐｓｌ，
； Ｊ．Ｍ目 ｆａｒ；Ｈｘｐｅｒｉａ＋ｃｎｔｓ
ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＧｅｎｅｔｉＣ１ｌ， Ｃ
ｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ ｌｌａｒｂｏｒＬａｂｏｒａＬ
ｏｒｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ ｌｌａｒｂｏｒ，
Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９７２）。いくつかのプラスミ
ド（第１表）とバクテリオファージ（第２表）が用いら
れた。
テあ つ ノこ（△ｐｒｏ−１ａｃ． ｒｐｓｌ，
； Ｊ．Ｍ目 ｆａｒ；Ｈｘｐｅｒｉａ＋ｃｎｔｓ
ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＧｅｎｅｔｉＣ１ｌ， Ｃ
ｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ ｌｌａｒｂｏｒＬａｂｏｒａＬ
ｏｒｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ ｌｌａｒｂｏｒ，
Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９７２）。いくつかのプラスミ
ド（第１表）とバクテリオファージ（第２表）が用いら
れた。
用いた実験技術は、微生物遣伝学の分野で用いられる標
準技術（Ｊ． Ｍｉｌｌｅｒ： Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ
ｓ ｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ． Ｃ
ｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｉｌａｒｂｏｒ， ＮｅｗＹｏ
ｒｋ １９７２）と遺伝子操作法（ Ｄａｖｉｓ， Ｂ
ｏＬｓＬｃｉｎａｎｄ Ｒｏｔｈ； Ａ ｍａｎｕａｌ
ｆｏｒ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ；
＾（ｌｖａｎｃｅｄ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｇｅｎｅｔ
ｉｃｓ， Ｃａｌ＜Ｉ Ｓｐｒｉｎｇｌ１ａｒｂｏｒ，
Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８０）であった。
準技術（Ｊ． Ｍｉｌｌｅｒ： Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ
ｓ ｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ． Ｃ
ｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｉｌａｒｂｏｒ， ＮｅｗＹｏ
ｒｋ １９７２）と遺伝子操作法（ Ｄａｖｉｓ， Ｂ
ｏＬｓＬｃｉｎａｎｄ Ｒｏｔｈ； Ａ ｍａｎｕａｌ
ｆｏｒ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ；
＾（ｌｖａｎｃｅｄ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｇｅｎｅｔ
ｉｃｓ， Ｃａｌ＜Ｉ Ｓｐｒｉｎｇｌ１ａｒｂｏｒ，
Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８０）であった。
すべての細胞は、ＬＢ培地（ＢｅｒＬａｎｉ， Ｊ．
ｌ１ａｃＬ．６２， １９５１， ２９３）又は＾゜Ｂ
ミニマル培地（Ｃｌａｒｋ ａｎｄＭａａｌφａ， Ｊ
． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２３， １９８７． ９９
）中で培養された。そして用いたプレートはＬｒ３培地
と１．５％寒天含有のＬＡプレートであった。プラスミ
ドの製造と分析は、Ｓｔｏｕｇａａｒｄ ａｎｄ Ｍｏ
ｌｉｎ， Ａｎａｌ，Ｈｉｏｃｈｃｍ． １１８， １
９８１． １９１に記載の方法にしたがってｄｙｅ ｂ
ｏｙａｎｔ ｄｅｎｓｉｔｙ ｇｒａｄｉｅｎＬ ｃｅ
ｎｔｒｉｒｕｇａＬｉｏｎ法を用いて行った。プラスミ
ド量測定のためのＤＮＡの標識と溶解産物の製造は、Ｍ
ｏｌｉｎ ｅＬ ａｌ．，Ｊ． １３ａｃＬ． １３ｇ
， １９７９． ７０にしたがって行った。
ｌ１ａｃＬ．６２， １９５１， ２９３）又は＾゜Ｂ
ミニマル培地（Ｃｌａｒｋ ａｎｄＭａａｌφａ， Ｊ
． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２３， １９８７． ９９
）中で培養された。そして用いたプレートはＬｒ３培地
と１．５％寒天含有のＬＡプレートであった。プラスミ
ドの製造と分析は、Ｓｔｏｕｇａａｒｄ ａｎｄ Ｍｏ
ｌｉｎ， Ａｎａｌ，Ｈｉｏｃｈｃｍ． １１８， １
９８１． １９１に記載の方法にしたがってｄｙｅ ｂ
ｏｙａｎｔ ｄｅｎｓｉｔｙ ｇｒａｄｉｅｎＬ ｃｅ
ｎｔｒｉｒｕｇａＬｉｏｎ法を用いて行った。プラスミ
ド量測定のためのＤＮＡの標識と溶解産物の製造は、Ｍ
ｏｌｉｎ ｅＬ ａｌ．，Ｊ． １３ａｃＬ． １３ｇ
， １９７９． ７０にしたがって行った。
プラスミドＤＮＡの相対的ｍは、グラジエント中の染色
体バンド中にそれに対するプラスミドバンド中に存在４
゛る標識されたトミジンの爪として測定された。
体バンド中にそれに対するプラスミドバンド中に存在４
゛る標識されたトミジンの爪として測定された。
実施例に用いた制限エンドヌクレアーゼ類は製造メーカ
ー提供の規定にしたがって使用した。部分制限は酵素の
ｌＯ倍希釈物で行った。
ー提供の規定にしたがって使用した。部分制限は酵素の
ｌＯ倍希釈物で行った。
さらに下記のスクリーニング法を用いた。
ｌ．λ免疫性（ｉｌＩＩＩＩｌλ゜）についてのスクリ
ーニング 記載された全実施例において、ＣＩＢＳ？突然変位体の
対立遺伝子を用いた。この遺伝子を有するプラスミドは
、宿主のエシエリヒア・コリの細胞を３０℃における溶
菌ファージの感染に対し耐性にする。耐性細胞を選択す
るために、細菌をプレートにひろげるｉｉｉＪに１０’
以上のλｂ２ファージの粒子を加える。生存しているコ
ロニーをさらにそれらのプラスミド量について試験した
。
ーニング 記載された全実施例において、ＣＩＢＳ？突然変位体の
対立遺伝子を用いた。この遺伝子を有するプラスミドは
、宿主のエシエリヒア・コリの細胞を３０℃における溶
菌ファージの感染に対し耐性にする。耐性細胞を選択す
るために、細菌をプレートにひろげるｉｉｉＪに１０’
以上のλｂ２ファージの粒子を加える。生存しているコ
ロニーをさらにそれらのプラスミド量について試験した
。
２． ｃｏｐｌ３”についてのスクリーニング１ａｃプ
ロモーターが除去された１ａｃオペ［ＩンとｒｃｐＡプ
ロモーターとの遺伝子融合体を組立て次いでｐｌ５プラ
スミド（ｐＧＡ４６）に挿入される。ひとつの得られた
ハイブリッドプラスミドｐＪＬ２１７は、△１ａｃ宿主
のエシエリヒア・コリ菌株中にγ￥（［するとＬａｃ
’表現型の原因である。
ロモーターが除去された１ａｃオペ［ＩンとｒｃｐＡプ
ロモーターとの遺伝子融合体を組立て次いでｐｌ５プラ
スミド（ｐＧＡ４６）に挿入される。ひとつの得られた
ハイブリッドプラスミドｐＪＬ２１７は、△１ａｃ宿主
のエシエリヒア・コリ菌株中にγ￥（［するとＬａｃ
’表現型の原因である。
Ｌａｃ ”発現型は、マツコンキイラクトース指示プレ
ートで容易に検出される（赤色コロニー）。ｐＪＬ２１
７を有する細胞中にｃｏｐＢ”遺伝子が存在ずるとＬａ
ｃ一表現型になり該指示プレー１・」−に白色コロニー
として現れる。かくしてｃｏｐＢ”ハイブリッドは、プ
ラスミドＤＮＡがプラスミドｐ几２１７を有するエシエ
リヒア・コリ△１ａｃ細胞に形質転換されるとき、Ｌａ
ｃ−コロニーとして容易にスコアされる。
ートで容易に検出される（赤色コロニー）。ｐＪＬ２１
７を有する細胞中にｃｏｐＢ”遺伝子が存在ずるとＬａ
ｃ一表現型になり該指示プレー１・」−に白色コロニー
として現れる。かくしてｃｏｐＢ”ハイブリッドは、プ
ラスミドＤＮＡがプラスミドｐ几２１７を有するエシエ
リヒア・コリ△１ａｃ細胞に形質転換されるとき、Ｌａ
ｃ−コロニーとして容易にスコアされる。
第１表
使用したプラスミド類
プラスミド
ｐＫＮｌ５６２
ｐＢＩ≧３２２
ｐＪＬ２１？
ｐｏｕｔｅ
ｐｃ＾４６
ｐＭｃ９０３
ｐＭＣ８７１
ソース
Ｓ．Ｍｏｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．ＢａｃＬ．，
１３８，１９７９， ｐｐ． ７０−７９．Ｆ．Ｂ
ｏｌｉｖａｒ ｅＬ ａｌ．，Ｇｅｎｅ ２，＋９７
７， ｐ． ９５． ｒｅｐＡプロモーターを有するｐＫＮ ｌ５６２からのＳａｕ３＾フラグメントをｐＪＬ２０７
のＢｇｌロ座位に挿入して組立てられた。１ａｃプロモ
ーターな しの１ａｃ遺伝子を有するハイブリ ッドプラスミド。
１３８，１９７９， ｐｐ． ７０−７９．Ｆ．Ｂ
ｏｌｉｖａｒ ｅＬ ａｌ．，Ｇｅｎｅ ２，＋９７
７， ｐ． ９５． ｒｅｐＡプロモーターを有するｐＫＮ ｌ５６２からのＳａｕ３＾フラグメントをｐＪＬ２０７
のＢｇｌロ座位に挿入して組立てられた。１ａｃプロモ
ーターな しの１ａｃ遺伝子を有するハイブリ ッドプラスミド。
Ｌｉｇｈｔ ａｎｄ Ｍｏｌｉｎ， Ｍｏｌ． Ｇｅｎ
．Ｇｅｎｅｔ． １ｇ４， １９８１， ｐ． ５７
．Ａｎ ａｎｄ Ｆｒｉｅｓｅｎ， Ｊ． Ｂａｃｋ．
１４０１９７９， ｐｐ． ４００〜４０７．Ｇａｓ
ａｄａｂａｎ ｅＬ ａｌ．， Ｊ． Ｂａｃｔ． １
４３，１９８０， ９． ９７１． Ｃａｓａｄａｂａｎ ｅＬ ａｌ．， ｏｐ． ｃｉｔ
．，９７１． 第１表（続き１） プラスミド ｐＶＩＩ１４２４ ｐｓＫｌ０４ ｐＫＮ１８４ ｐＪＬ３ ソース プラスミドｐＶＩＩ１７からのｄｅｏプロモーターを何
ずるＳａｕ３Ａフラグメン ト （Ｖａｌｃｎｌｉｎ−１１ａｎｓｃｎ ａｔ
ａｌ．．ＥＭＩＩＯ Ｊ．， １９８２． ３１７）を
、プラスミドｐＭｃ１４０３のＢａｍｌｌ Ｉ座位（Ｃ
ａｓａｄａｂａｎ ａｔ ａｌ．， ｏｐ． ｃｉｔ．
，９７ｌ）に挿入するｐ． ＶａｌｃｎＬｉｎＩｌａｎ
ｓｅｎ法によって組立てられノこ。
．Ｇｅｎｅｔ． １ｇ４， １９８１， ｐ． ５７
．Ａｎ ａｎｄ Ｆｒｉｅｓｅｎ， Ｊ． Ｂａｃｋ．
１４０１９７９， ｐｐ． ４００〜４０７．Ｇａｓ
ａｄａｂａｎ ｅＬ ａｌ．， Ｊ． Ｂａｃｔ． １
４３，１９８０， ９． ９７１． Ｃａｓａｄａｂａｎ ｅＬ ａｌ．， ｏｐ． ｃｉｔ
．，９７１． 第１表（続き１） プラスミド ｐＶＩＩ１４２４ ｐｓＫｌ０４ ｐＫＮ１８４ ｐＪＬ３ ソース プラスミドｐＶＩＩ１７からのｄｅｏプロモーターを何
ずるＳａｕ３Ａフラグメン ト （Ｖａｌｃｎｌｉｎ−１１ａｎｓｃｎ ａｔ
ａｌ．．ＥＭＩＩＯ Ｊ．， １９８２． ３１７）を
、プラスミドｐＭｃ１４０３のＢａｍｌｌ Ｉ座位（Ｃ
ａｓａｄａｂａｎ ａｔ ａｌ．， ｏｐ． ｃｉｔ．
，９７ｌ）に挿入するｐ． ＶａｌｃｎＬｉｎＩｌａｎ
ｓｅｎ法によって組立てられノこ。
１ａｃプロモーターとｐＭｌ３ｍｐ７からの翻訳開始部
位を有するｒ’ｖｕｌｌフラグメント（Ｍｅｓｓｉｎｇ
ｃＬ ａｔ，，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒ
ｃｓ． ９． １９８１，３０９）を、ｐＭＣｌ４
０３のＳＩＩＩａＩ座位に挿入し、次いで１ａｃＺセグ
メント間に 対応組換えを行う、Ｍ． Ｃａｓａ＋ＩａＬ＋ａｎ法に
よって組立てられた。
位を有するｒ’ｖｕｌｌフラグメント（Ｍｅｓｓｉｎｇ
ｃＬ ａｔ，，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒ
ｃｓ． ９． １９８１，３０９）を、ｐＭＣｌ４
０３のＳＩＩＩａＩ座位に挿入し、次いで１ａｃＺセグ
メント間に 対応組換えを行う、Ｍ． Ｃａｓａ＋ＩａＬ＋ａｎ法に
よって組立てられた。
ＮｏｒｄｓＬｒ６ｌｌｅＬ ａｌ．， Ｐｌａｓｍｉｄ
４，１９８０． ３２２ Ｍｏｌｉｎ ｅＬ ａｌ．， Ｍｏｌ． ｇｅｎ． Ｇ
ｅｎｅＬ１ｇ１． １９８１， １２３−１３０．第１
表（続き２） ｐＶＩＩｌ４５１ ｐＢＥＵｌ４ ｐＭｃ１４０３ Ｖａｌｅｎｔｉｎ−ｌ１ａｎｓｅｎ ｅＬ ａｌ．，
ｏｐ．ｃｉｔ． Ｕｈｌｉｎ ｅ Ｃｌａｒｋ， Ｊ． ＢａｃＬ
． １４８．１９１１１１． ３８６−９０ Ｃａｓａｄａｂａｎ ｅＬ ａｌ．， Ｊ． Ｂａ
ｃｔ． １４３，第２表 使用したバクテリオファージ ｌシＤλ４ ＥＤλＴｎ３ Ｄｅｍｐｓｅｙ ｅ ＷｉｌｌｅＬＬｓ， Ｊ．
Ｂａｃｔ．１２６ １９７６， ｐ． １６６
ＮｏｒｄｓＬｒ８ｍ， Ｍｏｌｉｎ， Ａａｇａａ
ｒｄ−Ｉｌａｎｓｅｎ， ｌ’ｌａｓｍｉｄ， ４
， １９８０， ｐｐ親プラスミド プラスミドｐＫＮ１５６２は、その後の研究によって付
け加えられた若干の改変を除いて、Ｍｏｌｉｎ ｅＬａ
ｌ． ： “Ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ ｏｆ Ｇｅｎｅ
ｓ Ｉｎｖｏｌｖｅｄ ＋ｎＲｃｐｌｉｃａｔｉｏｎ．
Ｃｏｐｙ Ｎｕｍｂｅｒ Ｃｏｎｔｒｏｌ，Ｉｎｃ
ｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ， ａｎｄ Ｓｔａｂｌｅ
Ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ ｏｒＬｂｃ Ｒｅｓｉｓｔ
ａｎｃｅ Ｉ’ｌａｓａ＋ｉｄ Ｉｌｌｄｒｄ−１９”
， Ｊ． ＲａｃＬ１３ｇ， １９７９． ｐ
ｐ． ７０−７９に記載されているのとすべての主要部
で同様にして組立てられたプラスミドＩｔ ｌの誘導体
である。ｐＫＮ１５６２は６．９ＸＩＯ’ダル１・ンの
分子ｍを有し、ｃｏｐ＾゜、ｃｏｐＢ”、ｒｃｐＡ ’
、ａｐｈＡ’、△ｐａｒの遺伝子型を有する（第３図参
照）。これはカナマインン耐性を有する。このプラスミ
ドは野生型プラスミドの複製性能を有し、３−５／高速
成育細胞のコピー数を有し、かつｐａｒ）ｎ伝子（分配
のための遺伝子）を欠いているので１％／１セ代の頻度
で失われる。
４，１９８０． ３２２ Ｍｏｌｉｎ ｅＬ ａｌ．， Ｍｏｌ． ｇｅｎ． Ｇ
ｅｎｅＬ１ｇ１． １９８１， １２３−１３０．第１
表（続き２） ｐＶＩＩｌ４５１ ｐＢＥＵｌ４ ｐＭｃ１４０３ Ｖａｌｅｎｔｉｎ−ｌ１ａｎｓｅｎ ｅＬ ａｌ．，
ｏｐ．ｃｉｔ． Ｕｈｌｉｎ ｅ Ｃｌａｒｋ， Ｊ． ＢａｃＬ
． １４８．１９１１１１． ３８６−９０ Ｃａｓａｄａｂａｎ ｅＬ ａｌ．， Ｊ． Ｂａ
ｃｔ． １４３，第２表 使用したバクテリオファージ ｌシＤλ４ ＥＤλＴｎ３ Ｄｅｍｐｓｅｙ ｅ ＷｉｌｌｅＬＬｓ， Ｊ．
Ｂａｃｔ．１２６ １９７６， ｐ． １６６
ＮｏｒｄｓＬｒ８ｍ， Ｍｏｌｉｎ， Ａａｇａａ
ｒｄ−Ｉｌａｎｓｅｎ， ｌ’ｌａｓｍｉｄ， ４
， １９８０， ｐｐ親プラスミド プラスミドｐＫＮ１５６２は、その後の研究によって付
け加えられた若干の改変を除いて、Ｍｏｌｉｎ ｅＬａ
ｌ． ： “Ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ ｏｆ Ｇｅｎｅ
ｓ Ｉｎｖｏｌｖｅｄ ＋ｎＲｃｐｌｉｃａｔｉｏｎ．
Ｃｏｐｙ Ｎｕｍｂｅｒ Ｃｏｎｔｒｏｌ，Ｉｎｃ
ｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ， ａｎｄ Ｓｔａｂｌｅ
Ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ ｏｒＬｂｃ Ｒｅｓｉｓｔ
ａｎｃｅ Ｉ’ｌａｓａ＋ｉｄ Ｉｌｌｄｒｄ−１９”
， Ｊ． ＲａｃＬ１３ｇ， １９７９． ｐ
ｐ． ７０−７９に記載されているのとすべての主要部
で同様にして組立てられたプラスミドＩｔ ｌの誘導体
である。ｐＫＮ１５６２は６．９ＸＩＯ’ダル１・ンの
分子ｍを有し、ｃｏｐ＾゜、ｃｏｐＢ”、ｒｃｐＡ ’
、ａｐｈＡ’、△ｐａｒの遺伝子型を有する（第３図参
照）。これはカナマインン耐性を有する。このプラスミ
ドは野生型プラスミドの複製性能を有し、３−５／高速
成育細胞のコピー数を有し、かつｐａｒ）ｎ伝子（分配
のための遺伝子）を欠いているので１％／１セ代の頻度
で失われる。
ｐＫＮｌ６５２をＢｇｌ［ｌで制限してｃｏｐＢ遺伝子
の一部を除去し、その付着端を結合することによって他
のプラスミドｐＪＬ２Ｇが組立てられる。このプラスミ
ドの分子量は６．７Ｘ１０＠ダルトンであり、遺伝子型
はｃｏｐＡ ’、ΔｃｏｐＢＳｒｅｐＡ”、ａｐｈＡ”
、Δｐａｒである。このプラスミドは２５−４０／高速
成育細胞のコピー数を有し、このプラスミドの喪失はな
い。
の一部を除去し、その付着端を結合することによって他
のプラスミドｐＪＬ２Ｇが組立てられる。このプラスミ
ドの分子量は６．７Ｘ１０＠ダルトンであり、遺伝子型
はｃｏｐＡ ’、ΔｃｏｐＢＳｒｅｐＡ”、ａｐｈＡ”
、Δｐａｒである。このプラスミドは２５−４０／高速
成育細胞のコピー数を有し、このプラスミドの喪失はな
い。
このプラスミドらカナマイシン耐性を伝達する。
プラスミドの命名
基本出願の実施例及び図而にｐＪ ＥＬ・・・と命名さ
れたプラスミドは本出願においてｐＯＵ・・・に変えら
れた。
れたプラスミドは本出願においてｐＯＵ・・・に変えら
れた。
実施例ｌ
ｐＯＵ５１の組立てと特性表示
プラスミドｐＪＬｌ２ＧとファージＥＤλ４からのＤＮ
Ａが標へ八法にしたがって製造された。プラスミドとフ
ァージＤＮＡとが各々２０μＱの最終濃度と１００μＱ
の最終容積で混合され、ＢｇｌＩｌで３０分間制限され
７０℃で１０分間加熱して不活性され、Ｔ４ＤＮＡリガ
ーゼで一夜１５℃で連結された。この連結反応混合物を
エシエリヒア・コリ菌株ＣＳＩ１５０に形質転換された
。
Ａが標へ八法にしたがって製造された。プラスミドとフ
ァージＤＮＡとが各々２０μＱの最終濃度と１００μＱ
の最終容積で混合され、ＢｇｌＩｌで３０分間制限され
７０℃で１０分間加熱して不活性され、Ｔ４ＤＮＡリガ
ーゼで一夜１５℃で連結された。この連結反応混合物を
エシエリヒア・コリ菌株ＣＳＩ１５０に形質転換された
。
その形質転換細胞は、約１０”のλｂ２粒子の懸濁液を
ひろげた５０μ９／Ｒσのカナマイシン含有のプレート
上で選択された。このプレートは３０℃で２０時間培養
された。
ひろげた５０μ９／Ｒσのカナマイシン含有のプレート
上で選択された。このプレートは３０℃で２０時間培養
された。
生存コロニイを再分離して、３０℃でのクロスストリー
キングによってλｂ２に対する耐性の試験、４２℃でＫ
ｍプレート上にストリークして４２℃での培養試験、及
びプラスミドＤＮＡを作製してアガロースゲルで分析す
ることによるプラスミドの分子ｍ測定の試験を行った。
キングによってλｂ２に対する耐性の試験、４２℃でＫ
ｍプレート上にストリークして４２℃での培養試験、及
びプラスミドＤＮＡを作製してアガロースゲルで分析す
ることによるプラスミドの分子ｍ測定の試験を行った。
このようにして、プラスミドｐＯυ５ｌは、Ｋｎとλ感
染に対する耐性を伝達し、宿主細菌を、培養に対し温度
感受性にし、ｐ几２０中に約１．６Ｘ １０’ダルトン
に相当するファージＤＮＡの挿入部分を有することが見
出された。このプラスミドの全分子量は８．４ＸｌＯ’
ダルトンであった。
染に対する耐性を伝達し、宿主細菌を、培養に対し温度
感受性にし、ｐ几２０中に約１．６Ｘ １０’ダルトン
に相当するファージＤＮＡの挿入部分を有することが見
出された。このプラスミドの全分子量は８．４ＸｌＯ’
ダルトンであった。
これらの性質はすべて、新しいエシエリヒア・コリ受容
体閑株がｐＯＵ５１ＤＮ八で形質転換されるときにその
プラスミ・ドの表現型性能のすべてを得るので、このプ
ラスミドに保有されている。
体閑株がｐＯＵ５１ＤＮ八で形質転換されるときにその
プラスミ・ドの表現型性能のすべてを得るので、このプ
ラスミドに保有されている。
ＤＮＡはｐＯＵ５１から製造され、そのプラスミドはそ
のプラスミ，ドＤＮＡを精製し、それをひとつもしくは
複数の制限酸素で切断し、得られたフラグメントをアガ
ロースゲル電気泳動法で分折ずることによって、制限酵
素で地図化した（第４図参照）。
のプラスミ，ドＤＮＡを精製し、それをひとつもしくは
複数の制限酸素で切断し、得られたフラグメントをアガ
ロースゲル電気泳動法で分折ずることによって、制限酵
素で地図化した（第４図参照）。
このよにうして挿入されたｌ．６Ｘ １０”ダルトンの
フラグメントは、ｃｌリプレッサー遺伝子（３０℃にお
けるλ免疫性の原囚である）とλＰｉプロモーターとを
イ丁する、ファージλからのＢｇｌｌ１フラグメントと
して同定された。挿入されたフラグメントの配向を測定
し第４図に示した。この制限地図からさらにｐＯＵ５１
は、そのプラスミドをクローニングベクターとして用い
ることができるようにする制限エンドヌクレアーゼＥｃ
ｏＲ Ｉ用の特異な座位を有することが分かる。
フラグメントは、ｃｌリプレッサー遺伝子（３０℃にお
けるλ免疫性の原囚である）とλＰｉプロモーターとを
イ丁する、ファージλからのＢｇｌｌ１フラグメントと
して同定された。挿入されたフラグメントの配向を測定
し第４図に示した。この制限地図からさらにｐＯＵ５１
は、そのプラスミドをクローニングベクターとして用い
ることができるようにする制限エンドヌクレアーゼＥｃ
ｏＲ Ｉ用の特異な座位を有することが分かる。
細胞の成育についてのこのプラスミドの効果は、媒体中
の培養物を３０℃で培養することによって研究された。
の培養物を３０℃で培養することによって研究された。
成育が指数的になった時に温度が４２℃に変えられ、細
胞培捉が続けられた（分光光学的に測定）。４２℃での
培養の１．５〜２時間で培養物は成育を停止した。
胞培捉が続けられた（分光光学的に測定）。４２℃での
培養の１．５〜２時間で培養物は成育を停止した。
プラスミドＤＮＡの量は、０．２％のグルコースと１％
のカサミノ酸を補充したＡ″Ｂミニマル媒体中で培養す
る１０ｍｌ２づつの培養物から、原料と方法の項に記載
したのと同様にして測定した。ひとつの１０ｎ＋Ｑ培養
物を３０℃にて５０μＣｉの３１Ｋ−チミジンで標識を
つけた。その他は４２℃に変化した直後、細胞が成育を
停止するまでその同位体を受容した。
のカサミノ酸を補充したＡ″Ｂミニマル媒体中で培養す
る１０ｍｌ２づつの培養物から、原料と方法の項に記載
したのと同様にして測定した。ひとつの１０ｎ＋Ｑ培養
物を３０℃にて５０μＣｉの３１Ｋ−チミジンで標識を
つけた。その他は４２℃に変化した直後、細胞が成育を
停止するまでその同位体を受容した。
プラスミドの相対ｍは３０℃において、２５〜４０プラ
スミドコピー／細胞に相当する２％であった。４２℃に
おいてその相対量は１０００以上のプラスミドコピー／
細胞に相当する５０％以上であった。
スミドコピー／細胞に相当する２％であった。４２℃に
おいてその相対量は１０００以上のプラスミドコピー／
細胞に相当する５０％以上であった。
このプラスミドの性質は第５表に示した。
エシエリヒア・コリＣＳＩｌ５０／ ｐＯＵ５ １の菌
株は、ドイツのＤｅｕｔｓｌ１ｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ
ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ，Ｇｒｉｓｅｂ
ａｃｈｓｔｒａｓｓｅ ８， Ｄ−３４００ Ｇｏｔｔ
ｉｎｇｅｎ（以下ＤＳＭと略称）に寄託番号２４６７に
て寄託されている。
株は、ドイツのＤｅｕｔｓｌ１ｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ
ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ，Ｇｒｉｓｅｂ
ａｃｈｓｔｒａｓｓｅ ８， Ｄ−３４００ Ｇｏｔｔ
ｉｎｇｅｎ（以下ＤＳＭと略称）に寄託番号２４６７に
て寄託されている。
実施例２
ｐＯＵ５３の組立てと特性表示
出発物質として実施例ｌに記載されたプラスミドを用い
、ｐｏｔ＋ｓｔをＩｌｉｎｄＩ［Ｉで部分的に制限する
ことによって、カナマイシン耐性を暗号化している遺伝
子が除かれているがλ免疫性を暗号化している遺伝子を
保持した標題のプラ、スミドが組立てられた。このプラ
スミドがエシエリヒア・コリ菌株のＣＳ１１５０に形質
転換された。ｐＪＩＥＬ５３は３．２Ｘ １０＠ダルト
ンの分子亀と次の遺伝子型： ｃｏｐ＾゛、△ｃｏｐｅ
，ｒｅｐ＾゛、Δｐａｒ， ｉｍａλ゛、△ａｐｈ＾を
有する。
、ｐｏｔ＋ｓｔをＩｌｉｎｄＩ［Ｉで部分的に制限する
ことによって、カナマイシン耐性を暗号化している遺伝
子が除かれているがλ免疫性を暗号化している遺伝子を
保持した標題のプラ、スミドが組立てられた。このプラ
スミドがエシエリヒア・コリ菌株のＣＳ１１５０に形質
転換された。ｐＪＩＥＬ５３は３．２Ｘ １０＠ダルト
ンの分子亀と次の遺伝子型： ｃｏｐ＾゛、△ｃｏｐｅ
，ｒｅｐ＾゛、Δｐａｒ， ｉｍａλ゛、△ａｐｈ＾を
有する。
このプラスミドを実施例Ｉの記載と同様にして制限酵素
で地図化した（第５図参照）。この制限地図からｐＯＵ
５３は、そのプラスミドをク【Ｊ−ニングベクターとし
て使用可能とする、制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲ
ｌの特異座位を有することが分かる。
で地図化した（第５図参照）。この制限地図からｐＯＵ
５３は、そのプラスミドをク【Ｊ−ニングベクターとし
て使用可能とする、制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲ
ｌの特異座位を有することが分かる。
所望のプラスミドが宿主細胞に存在することを示すため
に、細胞培養物が、λ感染に対する耐性を試験するため
に０１記のようにしてλｂ２ファージ粒子を含有するプ
レート上で培養された。その細胞はさらに、５０μ９／
ｍＱ Ｋｍを含有するプレート上のレプリカプレーテイ
グコロニーによってカナマイシンに対ずる感受性が試験
された。温度感受性成育を試験するために細胞が４２℃
でプレート上にストリークされ実施例ｌに記載されたし
かたで培養された。
に、細胞培養物が、λ感染に対する耐性を試験するため
に０１記のようにしてλｂ２ファージ粒子を含有するプ
レート上で培養された。その細胞はさらに、５０μ９／
ｍＱ Ｋｍを含有するプレート上のレプリカプレーテイ
グコロニーによってカナマイシンに対ずる感受性が試験
された。温度感受性成育を試験するために細胞が４２℃
でプレート上にストリークされ実施例ｌに記載されたし
かたで培養された。
プラスミドＤＮＡｆｆｌが実施例Ｉに記載のしかたで測
定したところ、その細胞は３０℃で２０〜４０プラスミ
ドコピーを有し、４２℃では１０００以上のプラスミド
コピーを有することが判明した。プラスミドの喪失は全
くなかった。
定したところ、その細胞は３０℃で２０〜４０プラスミ
ドコピーを有し、４２℃では１０００以上のプラスミド
コピーを有することが判明した。プラスミドの喪失は全
くなかった。
このプラスミドの性質は第５表に示した。
Ｅ．Ｃｏｌｉ ＤＳ１１５０／ｐｏυ５３菌株はＤＳＭ
Ｊ．：７ＦＦ託番号２４６８号で寄託されている。
Ｊ．：７ＦＦ託番号２４６８号で寄託されている。
実施例３
１）ＯＵ５６の組立てと特性表示
ｐＯＵ５３に、転位遺伝子とアンピリシン耐性（β一ラ
クタマーゼ）の遺伝子とを含む、λ：：Ｔｎ３ファージ
からのＴｎ３トランスボゾンを生体内挿入することによ
って（Ｎｏｒｄｓｔｒｏａ， Ｍｏｌｉｎ ａｎｄ Ａ
ａｇａａｒｄ１ｌａｎｓｃｎ， Ｐｌａｓｍｉｄ ４．
１９８０． ２１５〜２７）標題のプラスミドが組立
てられた。プラスミドＤＮＡは、プラスミドｐ０１Ｊ５
３及びその染色体中にλＴｎ３ファージを有する菌株と
から単離された。そのプラスミドＤＮＡは、アンピリシ
ン耐性とλ免疫性を選択するエシエリヒア・コリＩ：Ａ
株ＣＳＩ＋５０に形質転換された。
クタマーゼ）の遺伝子とを含む、λ：：Ｔｎ３ファージ
からのＴｎ３トランスボゾンを生体内挿入することによ
って（Ｎｏｒｄｓｔｒｏａ， Ｍｏｌｉｎ ａｎｄ Ａ
ａｇａａｒｄ１ｌａｎｓｃｎ， Ｐｌａｓｍｉｄ ４．
１９８０． ２１５〜２７）標題のプラスミドが組立
てられた。プラスミドＤＮＡは、プラスミドｐ０１Ｊ５
３及びその染色体中にλＴｎ３ファージを有する菌株と
から単離された。そのプラスミドＤＮＡは、アンピリシ
ン耐性とλ免疫性を選択するエシエリヒア・コリＩ：Ａ
株ＣＳＩ＋５０に形質転換された。
ｐＯＵ５６は６．５Ｘ １０’ダルトンの分子量と下記
遺伝子型： ｃｏｐＡ”、△ｃｏｐｌ３， ｒｅｐ＾６
、△ａｐｈＡＳｉｍ＋ｎλ０、ｂａａ” （ ：：Ｔｎ
３ ）を有する。
遺伝子型： ｃｏｐＡ”、△ｃｏｐｌ３， ｒｅｐ＾６
、△ａｐｈＡＳｉｍ＋ｎλ０、ｂａａ” （ ：：Ｔｎ
３ ）を有する。
このプラスミドを実施例！に記載されたのと同様にして
制限酵素でマップ化した（第６図参照）。
制限酵素でマップ化した（第６図参照）。
この制限マップは、Ｔｎ３トランスボゾンがｐＯＵ５６
に挿入された位置を示し、さらにプラスミドが制限エン
ドヌクレアーゼのＥｃｏＲ １とＢａｍｌｌ Ｉ各々の
特異座位を有することを示している。このプラスミドは
ブｐＯＵ５７製造用の出発物質としてａ用であるが（下
記実施例４参照）、転位遺伝子の存在によって抗生物質
耐性が他の細菌に形質転換されうるから、クローニング
ベターとしては好ましくない。
に挿入された位置を示し、さらにプラスミドが制限エン
ドヌクレアーゼのＥｃｏＲ １とＢａｍｌｌ Ｉ各々の
特異座位を有することを示している。このプラスミドは
ブｐＯＵ５７製造用の出発物質としてａ用であるが（下
記実施例４参照）、転位遺伝子の存在によって抗生物質
耐性が他の細菌に形質転換されうるから、クローニング
ベターとしては好ましくない。
宿主細胞中に所望プラスミドが存在するのを示すために
、前記のようにして細胞培養物をλｂ２ファージ粒子含
有のプレート上で培養してλ感染に対する耐性を試験し
た。さらに細胞を、５０μ９／ＩＩＩＱのアンピシリン
含有のプレート上でアンピシリン耐性を試験した。温度
感受性成育の試験は前記の方法で行った。
、前記のようにして細胞培養物をλｂ２ファージ粒子含
有のプレート上で培養してλ感染に対する耐性を試験し
た。さらに細胞を、５０μ９／ＩＩＩＱのアンピシリン
含有のプレート上でアンピシリン耐性を試験した。温度
感受性成育の試験は前記の方法で行った。
ｐＯＵ５６はｐＯＵ５３と同じ複製性能を有４′るごと
が分かった。
が分かった。
このプラスミドの性能を第５表に示した。
エシエリヒア・コリＣＳＩ＋５０／ｐＯＵ５６菌株は、
寄託番号が２４６９号でＤＳＭに寄託されている。
寄託番号が２４６９号でＤＳＭに寄託されている。
実施例４
ｐｏｔｌ５７ （ Ａ型プラスミド）の組立てと特性表
示プラスミドｐＯ０５Ｂが全トランスボゾンをａするこ
とから、このプラスミドからのＴｎ３のトランスポジシ
ョンの可能性をなくするために、このプラスミドをＢａ
ｍｌｌ １とＥｃｏｌ口座位で切断し、β−ラクタマー
ゼをコードする遺伝子を保持したままで、トランスポジ
ション遺伝しを除去した。その付着喘のアニーリングを
行うために、プラスミドｐＢＲ３２２からの小さなＢａ
ｍｌｌ Ｉ − ＥｃｏＲ Ｉフラグメントを挿入して
プラスミドｐＯＵＬ５７を作製した。このプラスミドを
Ｅ． Ｃｏｌｉ閑株ＣＳｌｌ５０に形質転換した。ｐｏ
［Ｊ５７は４．２Ｘ １Ｇ＠ダルトンの分子量と次の遺
伝子型・ｃｏｐＡ”、△ｃｏｐＢ％ｒｅｐＡ’″、△ｐ
ａｒ，△ａｐＭ， ｉｍｍλ０、ｂｌａ” （ΔＴｎ３
）を有する。
示プラスミドｐＯ０５Ｂが全トランスボゾンをａするこ
とから、このプラスミドからのＴｎ３のトランスポジシ
ョンの可能性をなくするために、このプラスミドをＢａ
ｍｌｌ １とＥｃｏｌ口座位で切断し、β−ラクタマー
ゼをコードする遺伝子を保持したままで、トランスポジ
ション遺伝しを除去した。その付着喘のアニーリングを
行うために、プラスミドｐＢＲ３２２からの小さなＢａ
ｍｌｌ Ｉ − ＥｃｏＲ Ｉフラグメントを挿入して
プラスミドｐＯＵＬ５７を作製した。このプラスミドを
Ｅ． Ｃｏｌｉ閑株ＣＳｌｌ５０に形質転換した。ｐｏ
［Ｊ５７は４．２Ｘ １Ｇ＠ダルトンの分子量と次の遺
伝子型・ｃｏｐＡ”、△ｃｏｐＢ％ｒｅｐＡ’″、△ｐ
ａｒ，△ａｐＭ， ｉｍｍλ０、ｂｌａ” （ΔＴｎ３
）を有する。
このプラスミドを実施例１に記載したのと同様にして制
限酵素でマップ化した（第７図参照）。
限酵素でマップ化した（第７図参照）。
この制限地図から、ｐｏｔｌ５７は、制限エンドヌクレ
アーゼ［ｌａｍｌｌ ｌとＥｃｏｌ目の各々に対する特
異座位をｆ丁し、このことからクローニングベクターと
して汀用なことが分かる。
アーゼ［ｌａｍｌｌ ｌとＥｃｏｌ目の各々に対する特
異座位をｆ丁し、このことからクローニングベクターと
して汀用なことが分かる。
宿主細胞中に所望のプラスミドか存在していることを示
すために、細胞培養物を前記のようにしてλｂ２ファー
ジ粒子を含有するプレート」二で培養してファージ感染
に対する耐性を試験した。さらにこの細胞は前記のしか
たでアンピリシン耐性を試験した。このプラスミドの分
子量はアガロースゲル電気泳動法によって測定した。温
度感受性成育の試験は曲記方法で行った。
すために、細胞培養物を前記のようにしてλｂ２ファー
ジ粒子を含有するプレート」二で培養してファージ感染
に対する耐性を試験した。さらにこの細胞は前記のしか
たでアンピリシン耐性を試験した。このプラスミドの分
子量はアガロースゲル電気泳動法によって測定した。温
度感受性成育の試験は曲記方法で行った。
ｐＯＵ５７はｐｏ［Ｉ５３と同じ複製性能を有すること
が分かった。
が分かった。
このプラスミドの性能を第５図に示した。
ｌＥ．ｃｏｌｉ ＣＳＩＩ５０／ｐＯＵ５？菌株は寄託
番号２４７０号でＤＳＭに寄託されている。
番号２４７０号でＤＳＭに寄託されている。
実施例５
１）ＯＵ７１（Ｉ３型プラスミド）の組立てと特性表示
実施例４に記載のプラスミドを出発物質として用い、β
Ｏｕ５７のＢｇｌｌｌ座位にｃｏｐＢ遺伝子の一部を含
む、ｐＫＮｌ５６２からのＢｇｌＩＩフラグメントを挿
入ずることによって、ｃｌ−λＰ ｎリプレツザープロ
モーターシステムと、Ｒｌ型プラスミドのｃｏｐＲイン
ヒビターの野性型遺伝子との両者を有する標題のプラス
ミドを組立てた。このプラスミドをＥ． ＣｏｌｉＣＳ
＋１５０菌株に形質転換した。ｐＯＬＩ７１は分子！ｉ
ｉ４．３Ｘ１０”ダルトンで、次の遺伝子型： ｃｏｐ
＾゛、ｃ ｏ ｐ １３゜、ｒｃｐＡ”、Δｐａｒ，Δ
ａｐｈ＾、ｉｆｆｉｎλ゛、ｂｌａ＋を有する。
実施例４に記載のプラスミドを出発物質として用い、β
Ｏｕ５７のＢｇｌｌｌ座位にｃｏｐＢ遺伝子の一部を含
む、ｐＫＮｌ５６２からのＢｇｌＩＩフラグメントを挿
入ずることによって、ｃｌ−λＰ ｎリプレツザープロ
モーターシステムと、Ｒｌ型プラスミドのｃｏｐＲイン
ヒビターの野性型遺伝子との両者を有する標題のプラス
ミドを組立てた。このプラスミドをＥ． ＣｏｌｉＣＳ
＋１５０菌株に形質転換した。ｐＯＬＩ７１は分子！ｉ
ｉ４．３Ｘ１０”ダルトンで、次の遺伝子型： ｃｏｐ
＾゛、ｃ ｏ ｐ １３゜、ｒｃｐＡ”、Δｐａｒ，Δ
ａｐｈ＾、ｉｆｆｉｎλ゛、ｂｌａ＋を有する。
このプラスミドを実施例日こ記載したのと同様にして制
限酵素でマップ化した（第８図参照）。
限酵素でマップ化した（第８図参照）。
この制限地図からＰＯＵ７１がｐＯＵ５７と同じ特異制
限座位を有することが分かる。
限座位を有することが分かる。
店主細胞中に所望のプラスミドが存在することを示すた
めに、細胞培養物を前記の方法で、λ感染耐性とアンビ
リシン耐性について試験した。次いでこのプラスミドは
、ｃｏｐＢについてのスクリーニングの項（本願の第３
３頁）に記載の方法でｃｏｐＢ遺伝子の存在をスクリー
ニングした。温度感受性成育の試験は前記方法で行った
。最後に、３０℃におけるプラスミドコピー数を、放射
能標識法と傾斜遠心分離法によって測定した。
めに、細胞培養物を前記の方法で、λ感染耐性とアンビ
リシン耐性について試験した。次いでこのプラスミドは
、ｃｏｐＢについてのスクリーニングの項（本願の第３
３頁）に記載の方法でｃｏｐＢ遺伝子の存在をスクリー
ニングした。温度感受性成育の試験は前記方法で行った
。最後に、３０℃におけるプラスミドコピー数を、放射
能標識法と傾斜遠心分離法によって測定した。
プラスミドのｍを実施例ｌの方法で測定したところ、そ
の細菌は３０℃で３〜５プラスミドコピーを、４２℃で
１０００以上のプラスミドコピーを汀ずることが分かっ
た。３０℃でこのプラスミドは１％／ｌ代の頻度で喪失
した。
の細菌は３０℃で３〜５プラスミドコピーを、４２℃で
１０００以上のプラスミドコピーを汀ずることが分かっ
た。３０℃でこのプラスミドは１％／ｌ代の頻度で喪失
した。
このプラスミドの性能を第５表に示す。
ＩＥ． Ｃｏｌｉ ＣＳＩＩ５０／ｐｏυ７ｌの閑株は
寄託番号２４７１号でＤＳＭに寄託されている。
寄託番号２４７１号でＤＳＭに寄託されている。
実施例６
ｐＯυ７３（Ｃ型プラスミド）の組立てと特性表示実施
例４に記載のプラスミドを用い、ｃｏｐｌ３遺伝子を有
する、ｐＯＵｌ６からのＥｃｏＲＩフラグメントをｐＯ
Ｕ５７のＥｃｏＲ Ｉ座位に挿入することによって、ｃ
ｌλＰＲリプレッサープロモーターシステムのみならず
ＣｏｐＢインヒビターのための遺伝子を有するＬ”！，
Ｗのプラスミドが組立てられた。このプラスミドをＥ．
Ｃｏｌｉ菌株ＣＳＩ＋５０に形質転換した。ｐ００７
３は分子ｍが４．ｆｌＸ１０”ダルトンで、次の遺伝子
型；ｃｏｐＡ”、ｃｏｐＢ”、ｒｅｐＡ ”、△ｐａｒ
、△ａｐｈ＾、ｉＩＩｌｌｎλ０、ｂｌａ’を有する。
例４に記載のプラスミドを用い、ｃｏｐｌ３遺伝子を有
する、ｐＯＵｌ６からのＥｃｏＲＩフラグメントをｐＯ
Ｕ５７のＥｃｏＲ Ｉ座位に挿入することによって、ｃ
ｌλＰＲリプレッサープロモーターシステムのみならず
ＣｏｐＢインヒビターのための遺伝子を有するＬ”！，
Ｗのプラスミドが組立てられた。このプラスミドをＥ．
Ｃｏｌｉ菌株ＣＳＩ＋５０に形質転換した。ｐ００７
３は分子ｍが４．ｆｌＸ１０”ダルトンで、次の遺伝子
型；ｃｏｐＡ”、ｃｏｐＢ”、ｒｅｐＡ ”、△ｐａｒ
、△ａｐｈ＾、ｉＩＩｌｌｎλ０、ｂｌａ’を有する。
このプラスミドを実施例ｌに記載したのと同様にして制
限酵素で地図化した（第９図参照）。この制限マップか
ら、ｃｏｐＢ遺伝子が、本米位置していないプロモータ
の部位に挿入されたことが分かる。さらに、このプラス
ミドは制限エンドヌクレアーゼＢａｍｌｌ Ｉのための
特異座位を有しているのでクローニングベクターとして
有用であることが分かる。
限酵素で地図化した（第９図参照）。この制限マップか
ら、ｃｏｐＢ遺伝子が、本米位置していないプロモータ
の部位に挿入されたことが分かる。さらに、このプラス
ミドは制限エンドヌクレアーゼＢａｍｌｌ Ｉのための
特異座位を有しているのでクローニングベクターとして
有用であることが分かる。
ｐｏｕ’ｙｔと同じスクリーニング法を用いた。
プラスミドＤＮＡｍを実施例！に記載の方法で測定した
ところ、この細胞は、３０℃では０．５〜Ｉプラスミド
コピーを有し、４２℃では１０００以上のプラスミドコ
ピーを有することが分かった。３０℃において、このプ
ラスミドは５％／世代以上の頻度で喪失される。
ところ、この細胞は、３０℃では０．５〜Ｉプラスミド
コピーを有し、４２℃では１０００以上のプラスミドコ
ピーを有することが分かった。３０℃において、このプ
ラスミドは５％／世代以上の頻度で喪失される。
このプラスミドの性能を第５表に示す。
Ｅ． Ｃｏｌｉ ＣＳＩＩ５０／ｐＯＵ７３閑株は寄託
番号２４７２号でＤＳＭに寄託されている。
番号２４７２号でＤＳＭに寄託されている。
実施例７
ｐＯＵ７５ （ Ｂ型プラスミド）の組立てと特性表示
実施例５に記載のプラスミドを出発物質として用い、ｐ
ＯＵ７１をＩＩ ｉ ｎｄ ＩＩＩで部分的に制限する
ことによって、ＥｃｏＲ Ｉ座位が除去された標題プラ
スミドが組立てられた。このプラスミドをＥ． Ｃｏｌ
ｉ閑株ＣＳ１１５０に形質転換した。ｐｏｔｌ７５は分
子量が４．２×１０６ダルトンで、次の遺伝子型： ｃ
ｏｐＡ’、ｃｏｐｌ３”、ｒｅｐ＾゜、△ｐａｒ，Δａ
ｐｈ＾、ｉａｕａλ゜、ｂｌａ”を有する。
実施例５に記載のプラスミドを出発物質として用い、ｐ
ＯＵ７１をＩＩ ｉ ｎｄ ＩＩＩで部分的に制限する
ことによって、ＥｃｏＲ Ｉ座位が除去された標題プラ
スミドが組立てられた。このプラスミドをＥ． Ｃｏｌ
ｉ閑株ＣＳ１１５０に形質転換した。ｐｏｔｌ７５は分
子量が４．２×１０６ダルトンで、次の遺伝子型： ｃ
ｏｐＡ’、ｃｏｐｌ３”、ｒｅｐ＾゜、△ｐａｒ，Δａ
ｐｈ＾、ｉａｕａλ゜、ｂｌａ”を有する。
このプラスミドを実施例ｌに記載したのと同様にして制
限酵素で地図化した（第１０図参照）。
限酵素で地図化した（第１０図参照）。
この制限地図から、Ｉｌｉｎｄ［Ｉフラグメントの除去
によってｐｏｕ’ｙｌのＣｃｏＲＩ座位が除去されるこ
とが分かる。
によってｐｏｕ’ｙｌのＣｃｏＲＩ座位が除去されるこ
とが分かる。
その宿主細胞の所望のプラスミドが存在するのを示すた
めに、細胞培養物について、前記方法で温度感受性成育
のみらず、λ感染耐性とアンピシリン耐性の試験を行っ
た。またこのプラスミドは酵素で制限することによって
ＥｃｏＲ Ｉ座位がないことを試験した。
めに、細胞培養物について、前記方法で温度感受性成育
のみらず、λ感染耐性とアンピシリン耐性の試験を行っ
た。またこのプラスミドは酵素で制限することによって
ＥｃｏＲ Ｉ座位がないことを試験した。
ｐＯυ７５はｐＯＵ７１と同じ複製性能を有することが
分かった。このプラスミドの性質を第５表に示す。
分かった。このプラスミドの性質を第５表に示す。
Ｅ． Ｃｏｌｉ ＣＳＩＩ５０／ｐＯＵ７５菌株はは寄
託番号２４７３号でＤＳＭに寄託されている。
託番号２４７３号でＤＳＭに寄託されている。
実施例８
遺伝子産物の増幅
プラスミドＰＭＣ９０３ （’Ｃａｓａｄａｂａｎ ａ
ｔ ａｌ．， Ｊ．Ｉ１ａｃＬ．１４３， １９８０．
９７１）を制限酵素［３ａｍｌｌ （とｈｌｌ１で切断
し、１ａｃ遺伝子を有するＢａｍｌｌ ｌ − １１ｇ
ｌ １１フラグメントを作った。プラスミドＩ）００７
１をＢａｍｌｌ Ｉで切断し、上記で得られた１３ａｍ
ｌｌ Ｉ − ｒｌｇｌ ＩＩフラグメントをその座位
に第１１図に示すように挿入し次いでＴ４ＤＮ＾リガー
ゼで連結しプラスミドＰＯＵ１０６を作製しＥ． ｃｏ
ｌｉ菌株ＣＳＩ＋５０に形質転換した。その細胞を、５
０μＩＦ／ ｍｌ２アンピシリン含有のマツコンキイラ
クトース指示ズレート（Ｊ．Ｍｉｌｌｅｒ，Ｅｘｐｅｒ
ｉｍｅｎＬｓ ｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉ
ｃｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｉｌａｒｂｏｒ． １
９７２参照）上にストリークし、３０℃で培養し赤色コ
ロニー（Ｌａｃ＋）を選択した。次いで温度を４２℃に
変え遺伝子産物（β−ガラクトシダーゼ）の増幅を測定
し第３表に示した。この測定は、Ｊ．Ｍｉｌｌｅｒｏｐ
．ｃｉｔ．によって記載された方法にしたがって行った
。
ｔ ａｌ．， Ｊ．Ｉ１ａｃＬ．１４３， １９８０．
９７１）を制限酵素［３ａｍｌｌ （とｈｌｌ１で切断
し、１ａｃ遺伝子を有するＢａｍｌｌ ｌ − １１ｇ
ｌ １１フラグメントを作った。プラスミドＩ）００７
１をＢａｍｌｌ Ｉで切断し、上記で得られた１３ａｍ
ｌｌ Ｉ − ｒｌｇｌ ＩＩフラグメントをその座位
に第１１図に示すように挿入し次いでＴ４ＤＮ＾リガー
ゼで連結しプラスミドＰＯＵ１０６を作製しＥ． ｃｏ
ｌｉ菌株ＣＳＩ＋５０に形質転換した。その細胞を、５
０μＩＦ／ ｍｌ２アンピシリン含有のマツコンキイラ
クトース指示ズレート（Ｊ．Ｍｉｌｌｅｒ，Ｅｘｐｅｒ
ｉｍｅｎＬｓ ｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉ
ｃｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｉｌａｒｂｏｒ． １
９７２参照）上にストリークし、３０℃で培養し赤色コ
ロニー（Ｌａｃ＋）を選択した。次いで温度を４２℃に
変え遺伝子産物（β−ガラクトシダーゼ）の増幅を測定
し第３表に示した。この測定は、Ｊ．Ｍｉｌｌｅｒｏｐ
．ｃｉｔ．によって記載された方法にしたがって行った
。
第３表
遺伝子産物の増幅
１．酵素活性／全蛋白量、すなわちβ−ガラクトシダー
ゼ／細胞の増加 ２．プラスミドｐＯυ１０６によって伝達されるβ−ガ
ラクトシダーゼ ３，プラスミドｐＫＮ４１０で伝達れさるβ−ラクタマ
ーゼ （Ｕｈｌｉｎ ｅＬ ａｌ．，Ｇｅｎａ６， １９７９
．ＴａｂｌｅＩＩ ，ｐ．ｌｏＯ）この表から、遺伝子
産物増加のレベルは、他のランアウエイベクターについ
て得られたレベルに匹敵するものであることが分かる（
例えばＵｈｌｉｎａＬａｌ．，Ｇａｎａ６， １９７９
． ９１１０８）。
ゼ／細胞の増加 ２．プラスミドｐＯυ１０６によって伝達されるβ−ガ
ラクトシダーゼ ３，プラスミドｐＫＮ４１０で伝達れさるβ−ラクタマ
ーゼ （Ｕｈｌｉｎ ｅＬ ａｌ．，Ｇｅｎａ６， １９７９
．ＴａｂｌｅＩＩ ，ｐ．ｌｏＯ）この表から、遺伝子
産物増加のレベルは、他のランアウエイベクターについ
て得られたレベルに匹敵するものであることが分かる（
例えばＵｈｌｉｎａＬａｌ．，Ｇａｎａ６， １９７９
． ９１１０８）。
β−ガラクトシダーゼ遺伝子が発現されるプ【Ｉモータ
ーは、ｐ［ｌＲ３２２からのＤｌｒ＾フラグメント上に
位置するｃｌブロモータ及び／又はテトラザイクリンプ
ロモーターであり、それは比較的弱いけれど乙、影響因
子として無視することはできない。
ーは、ｐ［ｌＲ３２２からのＤｌｒ＾フラグメント上に
位置するｃｌブロモータ及び／又はテトラザイクリンプ
ロモーターであり、それは比較的弱いけれど乙、影響因
子として無視することはできない。
そしてこの因子はＣＩプロモーターと同方向に転写する
。
。
ｐＯＵｌ０６は実施例ｌに記載したのと同様にして制限
酵素でマッピングした（第１１図参照）。この制限マッ
プから、このプラスミドは、挿入された１ａｃ遺伝子の
すぐ下流側に制限エンドヌクレアーゼのための特異座位
を有し、このことがらクＣｌ −ニングベクターとして
有用なことが分かる。
酵素でマッピングした（第１１図参照）。この制限マッ
プから、このプラスミドは、挿入された１ａｃ遺伝子の
すぐ下流側に制限エンドヌクレアーゼのための特異座位
を有し、このことがらクＣｌ −ニングベクターとして
有用なことが分かる。
このプラスミドの性能を第５表に示す。
Ｅ． ｃｏｌｉ ＣＳｌｌ５０／ｐＯＵｌ０６菌株（本
寄託番号２４７４号でＤＳＭに・寄託さ・れている。
寄託番号２４７４号でＤＳＭに・寄託さ・れている。
実施例９
ＰＯＵ７９ （ ［３型プラスミド）の組立てと特性表
示プラスミド，）００７１をＢａｍｌｌ ｌで完全に切
断し、ｐｓｔｌで部分的に切断しておいて、あらかじめ
Ｂａｗｌ口とｐｓｔ［として完全に切断されたところの
ブラスミ ドｐＭｃ８７１ （Ｃａｓａｄａｂａｎ．
ｅＬ ａｔ ．，Ｊ，ＢａｃＬ．１４， １９８７
，１７１）からのＤＮＡフラグメント（１ａｃオペロン
を有する）と連結した。
示プラスミド，）００７１をＢａｍｌｌ ｌで完全に切
断し、ｐｓｔｌで部分的に切断しておいて、あらかじめ
Ｂａｗｌ口とｐｓｔ［として完全に切断されたところの
ブラスミ ドｐＭｃ８７１ （Ｃａｓａｄａｂａｎ．
ｅＬ ａｔ ．，Ｊ，ＢａｃＬ．１４， １９８７
，１７１）からのＤＮＡフラグメント（１ａｃオペロン
を有する）と連結した。
この連結混合物をＥ， ｃｏｌｉ菌株ＣＳｌ１５０に形
質転換し、そして５０μ９／Ｉ１１２のアンピシリン含
有のマツコンキイラクトース指示プレート上で３０℃に
て培養しアンビシリン耐生を選択した。３０℃２０時間
の培養の後、そのプレートを短時間（ｌ−２時間）４２
℃で培養した， Ｌａｃ−（白）からＬａｃ ” （赤
）表現型へと変化したコロニーをさらに分析した。標題
のプラスミドはひとつのかようなコロニーから同定され
た。ｐＯＵ７９の分子ｍは８．８Ｘ １０’ダルトンで
、次の遺伝子： ｃｏｐＡ″、ｃｏｐｌド、ｒｃｐＡ
”、△ｐａｒ、ｉｍｍλ、ｂｌａ’、Ｉａｃ’を存する
・ このプラスミドを実施例１の記載と同様にして制限酵素
で地図化した（第１２図参照）。この制限マップから、
このプラスミドが、１ａｃ遺伝子のすぐ上流側に制限エ
ンドヌクレアーゼＩｌａｍｌｌ Ｉのための特異座位を
有することが分かる。この座位に正しい配向でプロモー
ター含有ＤＮＡフラグメントを挿入ずると、１ａｃ遺伝
子の転写を行い、その結果３０℃においてかようなハイ
ブリッドプラスミドを有する細胞のしａＣ”発現型を生
ずる。
質転換し、そして５０μ９／Ｉ１１２のアンピシリン含
有のマツコンキイラクトース指示プレート上で３０℃に
て培養しアンビシリン耐生を選択した。３０℃２０時間
の培養の後、そのプレートを短時間（ｌ−２時間）４２
℃で培養した， Ｌａｃ−（白）からＬａｃ ” （赤
）表現型へと変化したコロニーをさらに分析した。標題
のプラスミドはひとつのかようなコロニーから同定され
た。ｐＯＵ７９の分子ｍは８．８Ｘ １０’ダルトンで
、次の遺伝子： ｃｏｐＡ″、ｃｏｐｌド、ｒｃｐＡ
”、△ｐａｒ、ｉｍｍλ、ｂｌａ’、Ｉａｃ’を存する
・ このプラスミドを実施例１の記載と同様にして制限酵素
で地図化した（第１２図参照）。この制限マップから、
このプラスミドが、１ａｃ遺伝子のすぐ上流側に制限エ
ンドヌクレアーゼＩｌａｍｌｌ Ｉのための特異座位を
有することが分かる。この座位に正しい配向でプロモー
ター含有ＤＮＡフラグメントを挿入ずると、１ａｃ遺伝
子の転写を行い、その結果３０℃においてかようなハイ
ブリッドプラスミドを有する細胞のしａＣ”発現型を生
ずる。
またこのプラスミドは、１ａｃ Ｚ遺伝子の一端に位置
する、制限エンドヌクレアーゼｌＥｃｏＲＩのための特
異座位を有する。この座位にＥｃｏＲ １フラグメント
を挿入ずると１ａｃＺ遺伝子の産物であるβガラクトシ
ダーゼの活性を消去し、その結果Ｌａｃ表現型になった
り、これは３０℃から４２℃へ温度を変化させた後、マ
ツコンキイラクトース指示プレート上に無色のコロニー
が形成して容易にスコアされる（前記事項参照）。した
がってこのプラスミドはクローニングベクターとして有
用である。
する、制限エンドヌクレアーゼｌＥｃｏＲＩのための特
異座位を有する。この座位にＥｃｏＲ １フラグメント
を挿入ずると１ａｃＺ遺伝子の産物であるβガラクトシ
ダーゼの活性を消去し、その結果Ｌａｃ表現型になった
り、これは３０℃から４２℃へ温度を変化させた後、マ
ツコンキイラクトース指示プレート上に無色のコロニー
が形成して容易にスコアされる（前記事項参照）。した
がってこのプラスミドはクローニングベクターとして有
用である。
ｐＯＵ７９は、ρＯυ７Ｉと同じ複製性能を有すること
が分かった。
が分かった。
Ｅ． ｃｏｌｉ ＣＳＩｌ５０／ｐＯＵ７９閑株は寄託
番号２４８１号でＤＳＭに寄託されている。
番号２４８１号でＤＳＭに寄託されている。
実施例１０
ｐＯＵ８２ （ Ｂ型プラスミド）の組立てと特性表示
プラスミドｒ＋ＯＵ７９をＢａｎ＋ｌＩ ｌで完全に切
断し、Ｓａｌ１で部分的に切断した。次いでＩａｃプロ
モーターが除去された１ａｃオペロン含有のＰＳＫ１０
４からのＢａｍｌｌ１ −Ｓａｌ Ｉフラグメントと、
１ａｃ Ｚ遺伝子の第一番目の４つのコドンとを挿入し
ｐｏｕｇｏ （図示せず）を組立てた。
プラスミドｒ＋ＯＵ７９をＢａｎ＋ｌＩ ｌで完全に切
断し、Ｓａｌ１で部分的に切断した。次いでＩａｃプロ
モーターが除去された１ａｃオペロン含有のＰＳＫ１０
４からのＢａｍｌｌ１ −Ｓａｌ Ｉフラグメントと、
１ａｃ Ｚ遺伝子の第一番目の４つのコドンとを挿入し
ｐｏｕｇｏ （図示せず）を組立てた。
ｐＯＵ８０はＬａｃ−であり、１ａｃ遺伝子のすぐ上流
側にＢａｍｌｌ ｌ座位とＣｃｏＲ Ｉ座位を有する更
に、ｐｓＫｓｌ０４中の１ａｃ遺伝子がｐＭｃ１４０３
から誘導されるから（Ｃａｓａｄａｂａｎ ｅｔ ａｌ
．，Ｊ．ＢａｃＬ．ｌ４３， ｌ９８０，９７１） 、
１ａｃＺ中に通常見出されるＥｃｏＲＩ座位はみとめら
れない。
側にＢａｍｌｌ ｌ座位とＣｃｏＲ Ｉ座位を有する更
に、ｐｓＫｓｌ０４中の１ａｃ遺伝子がｐＭｃ１４０３
から誘導されるから（Ｃａｓａｄａｂａｎ ｅｔ ａｌ
．，Ｊ．ＢａｃＬ．ｌ４３， ｌ９８０，９７１） 、
１ａｃＺ中に通常見出されるＥｃｏＲＩ座位はみとめら
れない。
標題のプラスミドは、ｐＯＵ８０のＩａｃＺ遺伝子（
ｐｏｕ７９の地図第１２図参照）中のＥｃｏＲ Ｉ −
Ｃｌａ Ｉフラグメントを、ｄｅｏプロモーターと１
ａｃ Ｚ遺伝子のアミノ終末端とを有する、ｐＶＩｌｌ
４２４からのＥｃｏＲＩ −Ｃｌａ Ｉフラグメントで
置換ずることによって組立てた。このｉ＆換によって１
ａｃ Ｚ遺伝子か再組立てされ、モしてｄｏｏプロモー
ターの存在によって、得られたハイブリッドプラスミド
ｐＯＵ８２は、ＩＥ． ｃｏｌｉ菌株ＣＳＩ１５０に形
質転換するとＬａｃ ”表現型を伝達する。ｐｏｕｇｚ
は、分子量がｇ．ｉｘｔｏ’ダルｌ− ンで、次の遺伝
子型： ｃｏｐＡ”、ｃｏｐＢ％ｒｅｐＡ’″、△ｐａ
ｒ，ｉＩＩＩＩｌｌλ０、ｂｌａ’、１ａｃ”を有する
。
ｐｏｕ７９の地図第１２図参照）中のＥｃｏＲ Ｉ −
Ｃｌａ Ｉフラグメントを、ｄｅｏプロモーターと１
ａｃ Ｚ遺伝子のアミノ終末端とを有する、ｐＶＩｌｌ
４２４からのＥｃｏＲＩ −Ｃｌａ Ｉフラグメントで
置換ずることによって組立てた。このｉ＆換によって１
ａｃ Ｚ遺伝子か再組立てされ、モしてｄｏｏプロモー
ターの存在によって、得られたハイブリッドプラスミド
ｐＯＵ８２は、ＩＥ． ｃｏｌｉ菌株ＣＳＩ１５０に形
質転換するとＬａｃ ”表現型を伝達する。ｐｏｕｇｚ
は、分子量がｇ．ｉｘｔｏ’ダルｌ− ンで、次の遺伝
子型： ｃｏｐＡ”、ｃｏｐＢ％ｒｅｐＡ’″、△ｐａ
ｒ，ｉＩＩＩＩｌｌλ０、ｂｌａ’、１ａｃ”を有する
。
このプラスミドは、ｐａｒ部位を欠いているので３０℃
にて最終的に細胞から失われ、このことは非選択的マツ
コンキイラクトース指示プレー１・上で容易に観察する
ことができる（実施例１１参照）。
にて最終的に細胞から失われ、このことは非選択的マツ
コンキイラクトース指示プレー１・上で容易に観察する
ことができる（実施例１１参照）。
このプラスミドを実施例ｌに記載したのと同様にして制
限酵素で地図化した（第１３図参照）。
限酵素で地図化した（第１３図参照）。
この制限地図から、このプラスミドは制限エンドヌクレ
アーゼのＥｃｏＲ ＩとＢａｍｌｌ Ｉの各々のための
特異座位を有し、このことからこのプラスミドをクロー
ニングベクターとして用いることができることが分かる
。
アーゼのＥｃｏＲ ＩとＢａｍｌｌ Ｉの各々のための
特異座位を有し、このことからこのプラスミドをクロー
ニングベクターとして用いることができることが分かる
。
ｐＯＵ８２はｐＯυ７１と同じ複製性能を有することが
見出された。
見出された。
このプラスミの性質を第５表に示す。
ＩＥ． Ｃｏｌｉ ＣＳＩＩ５０／ｐＯＵ８２の閑株は
寄託番号２４８２号にＤＳＭに寄託されている。
寄託番号２４８２号にＤＳＭに寄託されている。
実施例ｌ１
ｐｏｕ９ｔ （ Ｂ型プラスミド）の組立てと特性表示
分配について安定なプラスミドを組立てるために、ＰＯ
Ｕ８２をＥｃｏＲ Ｉで切断し、プラスミドｒｔ ＋で
誘導体のｐＫＮ１８４ （ＮｏｒｄｓＬｒｏｓ＋ ｅｔ
ａｌ．，Ｐｌａｓｍｉｄ ４１９８０ ３２２）の野
性型ｐａｒ部位を含むＣｃｏＲｌ −Ａフラグメントを
この座位に挿入し次いで連結した。得られたプラスミド
（ｐＯＵ９０、図示せず）をＥ． ｃｏｌｉ菌株ＣＳＩ
＋５０に形質転換した。そしてその細胞は、５０μ７／
ｍＱアンピシリン含有プレート上で３０℃にて選択的に
培養された。対照としてｐＯＵ８２含有細胞を、両者の
出発コロニー中に確実にプラスミドが存在するように類
似の方法で培養した。次ぎに両コロニーの試料をいずれ
の抗生物質ら含有しないプレート上にストリークし、次
いでその細胞を２５細胞世代成育するにまかせた。Ｌａ
ｃ’表現型の安定な遺伝をスクリーニングするために、
得られた両コロ二一からの細胞をマツコンキイラクトー
ス指示プレート上にストリークした。３０℃でｐＯＵ９
０が形質転換された細胞は赤色のコロニーを生成した。
分配について安定なプラスミドを組立てるために、ＰＯ
Ｕ８２をＥｃｏＲ Ｉで切断し、プラスミドｒｔ ＋で
誘導体のｐＫＮ１８４ （ＮｏｒｄｓＬｒｏｓ＋ ｅｔ
ａｌ．，Ｐｌａｓｍｉｄ ４１９８０ ３２２）の野
性型ｐａｒ部位を含むＣｃｏＲｌ −Ａフラグメントを
この座位に挿入し次いで連結した。得られたプラスミド
（ｐＯＵ９０、図示せず）をＥ． ｃｏｌｉ菌株ＣＳＩ
＋５０に形質転換した。そしてその細胞は、５０μ７／
ｍＱアンピシリン含有プレート上で３０℃にて選択的に
培養された。対照としてｐＯＵ８２含有細胞を、両者の
出発コロニー中に確実にプラスミドが存在するように類
似の方法で培養した。次ぎに両コロニーの試料をいずれ
の抗生物質ら含有しないプレート上にストリークし、次
いでその細胞を２５細胞世代成育するにまかせた。Ｌａ
ｃ’表現型の安定な遺伝をスクリーニングするために、
得られた両コロ二一からの細胞をマツコンキイラクトー
ス指示プレート上にストリークした。３０℃でｐＯＵ９
０が形質転換された細胞は赤色のコロニーを生成した。
これはこのプレートが保持されていたことを示ず。
一方ｐＯＵ８２が形質転換された対照細胞は赤色と無色
の両方のコロニーを生成した。これは、セレクンヨン・
フリーの期間ｐＯＵ８２はいくつかの細胞から失われた
ことを意味する。
の両方のコロニーを生成した。これは、セレクンヨン・
フリーの期間ｐＯＵ８２はいくつかの細胞から失われた
ことを意味する。
次いで中間プラスミドｐＯＵ９０をＢａｍｌｌ Ｉで完
全に、Ｓａｕ３Ａで部分的に切断してプラスミドの大き
さを小さくし、標題のプラスミドを作製した。Ｅ．ｃｏ
ｌｉ閑株ＣＳＩ１５０に形質転換した後、プラスミドの
安定性を前記のしかたで測定した。ｐＯＵ９１は、分子
爪が１２．５Ｘ ｔｏ＠ダルトンで、次の遺伝子型：
ｃｏｐＡ’、ｃｏｐＢ”、ｒｅｐＡ’、ｐａｒ Ｓｉ＋
ｕλ０、ｂｌａ’″、１ａｃ”をａずる。
全に、Ｓａｕ３Ａで部分的に切断してプラスミドの大き
さを小さくし、標題のプラスミドを作製した。Ｅ．ｃｏ
ｌｉ閑株ＣＳＩ１５０に形質転換した後、プラスミドの
安定性を前記のしかたで測定した。ｐＯＵ９１は、分子
爪が１２．５Ｘ ｔｏ＠ダルトンで、次の遺伝子型：
ｃｏｐＡ’、ｃｏｐＢ”、ｒｅｐＡ’、ｐａｒ Ｓｉ＋
ｕλ０、ｂｌａ’″、１ａｃ”をａずる。
このプラスミド実施例１に記載したのと同｛子にして制
限酵素で地図化した（第１４図参照）。この制限地図か
ら、ｐｏυ９ｌが制限エンドヌクレアーゼのＥｃｏＲ
ＩとＢａｍｌｌｌ各々のための特異座位を有し、このこ
とからこのプラスミドがクローニングベマターとして有
用であることが分かる。
限酵素で地図化した（第１４図参照）。この制限地図か
ら、ｐｏυ９ｌが制限エンドヌクレアーゼのＥｃｏＲ
ＩとＢａｍｌｌｌ各々のための特異座位を有し、このこ
とからこのプラスミドがクローニングベマターとして有
用であることが分かる。
ｐＯＵＬ９１は、ｐＯＵ７１と同じ複製性能を有するが
、ｐＯＵ７１と比較して、このプラスミドは３０℃にお
いて完全に安定である。
、ｐＯＵ７１と比較して、このプラスミドは３０℃にお
いて完全に安定である。
このプラスミドの性質を第５表に示す。
Ｃ． Ｃｏｌｉ ＣＳＩＩ５０／ｐＯＵ９１菌株は寄託
番号２４８３号でＤＳＭに寄託されている。
番号２４８３号でＤＳＭに寄託されている。
実施例１２
ｐｏｕｔｏｔ （ Ｂ型プラスミド）の組立てと特性表
示実施例７に記載のプラスミドを出発物質として用い、
クロムフエニコールアセチルトランスフエラーゼ（ｃａ
じ）合成の遺伝情報を指定する遺伝子を有するＳａｕ３
ＡフラグメントをｐＯＵ７５のＢａｍｌｌ Ｉに挿入ケ
ることによって、宿主細胞にクロラムフエニコール耐性
を付与した標題のプラスミドを組立てた。このプラスミ
ドをＣ． ｃｏｌｉ菌株ＣＳＩ＋５０に形質転換した。
示実施例７に記載のプラスミドを出発物質として用い、
クロムフエニコールアセチルトランスフエラーゼ（ｃａ
じ）合成の遺伝情報を指定する遺伝子を有するＳａｕ３
ＡフラグメントをｐＯＵ７５のＢａｍｌｌ Ｉに挿入ケ
ることによって、宿主細胞にクロラムフエニコール耐性
を付与した標題のプラスミドを組立てた。このプラスミ
ドをＣ． ｃｏｌｉ菌株ＣＳＩ＋５０に形質転換した。
ｐＯＵｌ０１１；ｌ、分子ｍが４．７Ｘ １０＠ダルト
ンで次め遺伝子型： ｃｏｐＡ”、ｃｏｐｅ”、ｒｅｐ
Ａ″″、ΔａｐｂＡ，ｉｍｍλ０、ｂｌａ”、ｃａｔ”
を有する。
ンで次め遺伝子型： ｃｏｐＡ”、ｃｏｐｅ”、ｒｅｐ
Ａ″″、ΔａｐｂＡ，ｉｍｍλ０、ｂｌａ”、ｃａｔ”
を有する。
このプラスミドを実施例ｌの記載と同様にして制限酵素
でマップ化した（第１５図参照）。この制限地図から、
ｐＯＵ１０１は制限エンドヌクレアーゼ１ｉｃｏｎ Ｉ
の特異座位を有し、したがってこのプラスミドをクロー
ニングベクターとして川いうるということが分かる。さ
らにＥｃｏＲ Ｉフラグメントが挿入されるとｃａｔ
’遺伝子を失活させ、ＥｃｏＲ Ｉハイブリッドがスク
リーニング可能になる。
でマップ化した（第１５図参照）。この制限地図から、
ｐＯＵ１０１は制限エンドヌクレアーゼ１ｉｃｏｎ Ｉ
の特異座位を有し、したがってこのプラスミドをクロー
ニングベクターとして川いうるということが分かる。さ
らにＥｃｏＲ Ｉフラグメントが挿入されるとｃａｔ
’遺伝子を失活させ、ＥｃｏＲ Ｉハイブリッドがスク
リーニング可能になる。
宿主細胞中に所望のプラスミドが存在することを示すた
めに、細胞培捉物のλ感染耐性とアンピシリン耐性につ
いて前記の方法で試験した。さらにこの細胞は２０μｙ
／ｍＱのクロラムフエニコール含有のプレート上で培養
物を培養することによってクロラムフエニコール耐性の
試験を行った。またこの細胞は温度感受性成育について
も前記方法で試験した。ｐＯＵｌ０１はｐＯＵ７１と同
じ複製性能を有することが判明した。
めに、細胞培捉物のλ感染耐性とアンピシリン耐性につ
いて前記の方法で試験した。さらにこの細胞は２０μｙ
／ｍＱのクロラムフエニコール含有のプレート上で培養
物を培養することによってクロラムフエニコール耐性の
試験を行った。またこの細胞は温度感受性成育について
も前記方法で試験した。ｐＯＵｌ０１はｐＯＵ７１と同
じ複製性能を有することが判明した。
このプラスミドの性質は第５表に示す。
Ｅ． ｃｏｌｉ ＣＳＩｌ５０／ｐｏυ１０１の菌株は
寄託番号２７５７号でＤＳＭに寄託されている。
寄託番号２７５７号でＤＳＭに寄託されている。
実施例ｌ３
ｐＯＵ１０１の組立てと特性表示
１ａｃＺ遺伝子の一部を含有するＥｃｏＲ １ − Ｃ
ｌａ ｌフラグメントをプラスミドｐＯＵ８０（実施例
ｌＯに記載。
ｌａ ｌフラグメントをプラスミドｐＯＵ８０（実施例
ｌＯに記載。
ｐＯυ７９の地図第ｌ２図参照）から除去し、プラスミ
ドｐＶＩＩ１４５１ （ＹａｌｃｎＬｉｎ−１１ａｎｓ
ｅｎ ｅｔ ａｌ．， ｔｈｅ ＥＭＢＯｊｏｕｒｎ
ａｌ ｌ， １９８２）からの、ｄｅｏプロモーターと
１ａｃ Ｚのアミノ終末端・とを仔ずる［ＥｃｏＲ Ｅ
− Ｃｌａ Ｉフラグメントで置換した。得られたプ
ラスミドはｐＯＵ８３と命名した（第１６図参照）。
ドｐＶＩＩ１４５１ （ＹａｌｃｎＬｉｎ−１１ａｎｓ
ｅｎ ｅｔ ａｌ．， ｔｈｅ ＥＭＢＯｊｏｕｒｎ
ａｌ ｌ， １９８２）からの、ｄｅｏプロモーターと
１ａｃ Ｚのアミノ終末端・とを仔ずる［ＥｃｏＲ Ｅ
− Ｃｌａ Ｉフラグメントで置換した。得られたプ
ラスミドはｐＯＵ８３と命名した（第１６図参照）。
Ｉａｃ遺伝子、及びｃｌリプレッサー遺伝子とλＰＲ
プロモーターを有するＤＮＡフラグメン１・を除去ずる
ために、プラスミドｐＯＵ８３をＢａｎ＋ＩＩ ＩとＢ
ｇｌ■で郎分的に制限した。連結反応とＣＳＩ１５０へ
の形質転換の後、所望の性能を有するプラスミドを単離
したが、ｄｅｏプロモーターとｃｏｐＢ遺伝子とがクロ
ース融合体（ｃｌｏｓｅ ｆｕｓｉｏｎ）を形成してい
た。このプラスミドはＰＯＵＩＯＩと命名され、分子爪
が３．２ｘ ｔｏ”ダルトンで次の遺伝子型： ｃｏｐ
＾゜、ｃｏｐｌ３”、ｒｅｐ＾゜、ΔｐａｒＳｂｌａ”
を有する。
プロモーターを有するＤＮＡフラグメン１・を除去ずる
ために、プラスミドｐＯＵ８３をＢａｎ＋ＩＩ ＩとＢ
ｇｌ■で郎分的に制限した。連結反応とＣＳＩ１５０へ
の形質転換の後、所望の性能を有するプラスミドを単離
したが、ｄｅｏプロモーターとｃｏｐＢ遺伝子とがクロ
ース融合体（ｃｌｏｓｅ ｆｕｓｉｏｎ）を形成してい
た。このプラスミドはＰＯＵＩＯＩと命名され、分子爪
が３．２ｘ ｔｏ”ダルトンで次の遺伝子型： ｃｏｐ
＾゜、ｃｏｐｌ３”、ｒｅｐ＾゜、ΔｐａｒＳｂｌａ”
を有する。
このプラスミドを実施例Ｉに記載したのと同様にして制
限酵素で地図化した（第１７図参照）。
限酵素で地図化した（第１７図参照）。
この制限地図から、このプラスミドは制限エンドヌクレ
アーゼＩＥｃｏＲ ＩとＢａａｌｌ Ｉ各々のための特
異座位を有し、このことからこのプラスミドをクローニ
ングベクターとして用いうろことが分かる。
アーゼＩＥｃｏＲ ＩとＢａａｌｌ Ｉ各々のための特
異座位を有し、このことからこのプラスミドをクローニ
ングベクターとして用いうろことが分かる。
１シ．ｃｏｌｉ閑株Ｓφ９２９ （ｃｙＬＲＳ１ａｃ，
ｄｅｏ， ｒｅｃＡ）これにはずでにｐＯＵｌｏｌが
形質転換されていたのカルヂャーを、グルコースなしの
しＢ培地中で一夜培養したところ、非制御のプラスミド
複製が２ｘｌＯ’細胞／ｍ（ｌ以上の細胞密度で起こっ
た。
ｄｅｏ， ｒｅｃＡ）これにはずでにｐＯＵｌｏｌが
形質転換されていたのカルヂャーを、グルコースなしの
しＢ培地中で一夜培養したところ、非制御のプラスミド
複製が２ｘｌＯ’細胞／ｍ（ｌ以上の細胞密度で起こっ
た。
Ｅ． ｃｏｌｉ ＣＳｌｌ５０／ｐＯＵｌ１０菌株は寄
託番号２７５８号でＤＳＭｉこ寄託されている。
託番号２７５８号でＤＳＭｉこ寄託されている。
実施例ｌ４
ｐ００１３０の組立てと特性表示
プラスミドｐＯυ９ｌをＢａｎ＋旧で切断し、次いでそ
のＢａｍｌｌ Ｉ座位をエクソヌクレアーゼＢａｌ３１
で除去しプラスミドｐＯυ９２（図示せず）を作製した
。このプラスミドをＥｃｏＲ ＩとＣｌａ Ｉで制限し
、プラスミドｐＭｃ１４０３ （Ｃａｓａｄａｂａｎ
ｅＬ ａｌ．， Ｊ． ＩＳａｃｔ． １４３，
１９８０． ９７１）からの対応ずるＥｃｏＲ Ｉ −
Ｃｌａ ＋フラグメントを挿入し、ｄｅｏプロモータ
ーなしの１ａｃオペロンを有するプラスミドｐｏｔｌ９
３を作った。かようにして作られたＩｌａｍｌｌ Ｉ座
位にｃｏｐＢ遺伝しを有４゜ろＢｇｌＩｌフラグメント
を挿入してプラスミドｐＯＵ１３０を作製し（第１８図
参照）、次いで連結しＥ． ｃｏｌｉ菌株ＣＳｌｌ５０
に形質転換した。この細胞を５０μｍ／ｍｌ２アンピシ
リン含有のマツコンキイラクトース指示プレートにスト
リークし３０℃で培養して赤色コロニー（Ｌａｃ”）を
選択した。次いで温度を４２℃に変えた。β−ガラクト
シダーゼの増幅を第５表に示す。４２℃で４５分間培養
した後、温度を３８゜Ｃ以下に下げた。この温度変化後
に測定されたβ−ガラクトングーゼの増幅を第５表に示
す。
のＢａｍｌｌ Ｉ座位をエクソヌクレアーゼＢａｌ３１
で除去しプラスミドｐＯυ９２（図示せず）を作製した
。このプラスミドをＥｃｏＲ ＩとＣｌａ Ｉで制限し
、プラスミドｐＭｃ１４０３ （Ｃａｓａｄａｂａｎ
ｅＬ ａｌ．， Ｊ． ＩＳａｃｔ． １４３，
１９８０． ９７１）からの対応ずるＥｃｏＲ Ｉ −
Ｃｌａ ＋フラグメントを挿入し、ｄｅｏプロモータ
ーなしの１ａｃオペロンを有するプラスミドｐｏｔｌ９
３を作った。かようにして作られたＩｌａｍｌｌ Ｉ座
位にｃｏｐＢ遺伝しを有４゜ろＢｇｌＩｌフラグメント
を挿入してプラスミドｐＯＵ１３０を作製し（第１８図
参照）、次いで連結しＥ． ｃｏｌｉ菌株ＣＳｌｌ５０
に形質転換した。この細胞を５０μｍ／ｍｌ２アンピシ
リン含有のマツコンキイラクトース指示プレートにスト
リークし３０℃で培養して赤色コロニー（Ｌａｃ”）を
選択した。次いで温度を４２℃に変えた。β−ガラクト
シダーゼの増幅を第５表に示す。４２℃で４５分間培養
した後、温度を３８゜Ｃ以下に下げた。この温度変化後
に測定されたβ−ガラクトングーゼの増幅を第５表に示
す。
第４表
プラスミドＤＮＡの増幅後の
ｃ３０℃ ４２℃３７℃ ２．５
８３ａ ＬＢ培地中３０゜Ｃで指数的に培養さ
れたｐＯＵ１３０を有するＣＳＩ＋５０ノ細胞ｂ ３
０℃での指数的培養の後、培養物の温度を４２℃に変え
、その温度で培養を２時間続けた。
８３ａ ＬＢ培地中３０゜Ｃで指数的に培養さ
れたｐＯＵ１３０を有するＣＳＩ＋５０ノ細胞ｂ ３
０℃での指数的培養の後、培養物の温度を４２℃に変え
、その温度で培養を２時間続けた。
ｃ ３０℃での指数的培養の後、培養物の温度を４２
℃に変え、４５分間後、培養物の温度を３７゜Ｃに変え
て９０分間培養。
℃に変え、４５分間後、培養物の温度を３７゜Ｃに変え
て９０分間培養。
ｄ 原料と方法の項参照。β−ガラクトンダーゼの比活
性をＬｉｇｈｔ ａｎｄ Ｍｏｌｉｎ， Ｇｅｎ． Ｇ
ｃｎａＬ．１９８１， （ｐｐ．５６−６１）に記載し
てあるのと同様にして示した。
性をＬｉｇｈｔ ａｎｄ Ｍｏｌｉｎ， Ｇｅｎ． Ｇ
ｃｎａＬ．１９８１， （ｐｐ．５６−６１）に記載し
てあるのと同様にして示した。
この表から、低温にもどすと、遺伝子産物の増幅が著し
く改善され、そのためこの方法が問題の遺伝子産物の最
大の発現を得るのに特に有用であることを示しているこ
とが分かる。
く改善され、そのためこの方法が問題の遺伝子産物の最
大の発現を得るのに特に有用であることを示しているこ
とが分かる。
β−ガラクトシダーゼは、本質的にかような遺伝子融合
体から表現されるので（Ｌｉｇｈｔ ａｎｄ Ｍｏｌｉ
ｎ，Ｊ． Ｂａｃｔ． １５１， １９８２， １１２
！Ｊ−１１３５）、酵素の活性のレベルは、この発明の
プラスミドの遺伝子産物の増幅容爪を正確に反映してい
る。
体から表現されるので（Ｌｉｇｈｔ ａｎｄ Ｍｏｌｉ
ｎ，Ｊ． Ｂａｃｔ． １５１， １９８２， １１２
！Ｊ−１１３５）、酵素の活性のレベルは、この発明の
プラスミドの遺伝子産物の増幅容爪を正確に反映してい
る。
Ｅ． ｃｏｌｉ ＣＩＩＳ５０／ｐＯｔｌｌ３０の閑株
は寄託番号２５７９号でＤＳＭに寄託されている。
は寄託番号２５７９号でＤＳＭに寄託されている。
実施例１５
ｐＬＣ３ １の組立てと特性表示
ｐｏｕ７ｓをＢａ＋ａｌｌ ！で切断した。ｒｅｃ＾プ
ロモーターと遺伝子を有する、プラスミドｐＢＥＵ１４
（Ｕｈｌｉｎ ａｎｄＣｌａｒｋ， Ｊ． Ｂａｃｔ
． ｌＬ８， １９８１． ３８６−９０）からのＢａ
ｎｌｌ Ｉフラグメントを押入し、次いでエシエリヒア
・コリ菌株ＣＩｌ３５０に形質転換した。標題のプラス
ミドは、分子ｍが６．３Ｘ １０”ダルトンで、次の遺
伝子型： ｒｅｃＡＳｂｌａ’″、ｃｏｐＡ”、ｃｏｃ
Ｂ”、ｒｅｐＡ”、ｉｍ＋ｎλ０を有する。
ロモーターと遺伝子を有する、プラスミドｐＢＥＵ１４
（Ｕｈｌｉｎ ａｎｄＣｌａｒｋ， Ｊ． Ｂａｃｔ
． ｌＬ８， １９８１． ３８６−９０）からのＢａ
ｎｌｌ Ｉフラグメントを押入し、次いでエシエリヒア
・コリ菌株ＣＩｌ３５０に形質転換した。標題のプラス
ミドは、分子ｍが６．３Ｘ １０”ダルトンで、次の遺
伝子型： ｒｅｃＡＳｂｌａ’″、ｃｏｐＡ”、ｃｏｃ
Ｂ”、ｒｅｐＡ”、ｉｍ＋ｎλ０を有する。
このプラスミドを実施例１に記載したのと同様にして制
限酵素で地図化した（第１９図参照）。
限酵素で地図化した（第１９図参照）。
この制限地図から、ｐＬｃ３１が、外来遺伝子の挿入に
適切な、制限酵素ＥｃｏＲ ｒの特異座位をｒｅｃ＾プ
ロモーターの下流側に存することが分かる。
適切な、制限酵素ＥｃｏＲ ｒの特異座位をｒｅｃ＾プ
ロモーターの下流側に存することが分かる。
ｐＬｃ３１はｐＯＵ７１と同じ複製性能を有することが
見出された。
見出された。
ｐＬｃ３１を有する細胞を３０℃で培養したところ、保
存されているプロモーターは充分に抑制され、温度を４
２℃に変えると、ｔｅｘ＾リプレッサーが徐々にタイト
レートされ、ｒｅｃＡからの転写が開始されｒｃｃＡ遺
伝子産物の産土が増幅されるにいたった。
存されているプロモーターは充分に抑制され、温度を４
２℃に変えると、ｔｅｘ＾リプレッサーが徐々にタイト
レートされ、ｒｅｃＡからの転写が開始されｒｃｃＡ遺
伝子産物の産土が増幅されるにいたった。
そしてこのことはポリアクリルアミドゲル電気泳法で検
出できた。
出できた。
このプラスミドの性能を第５表に示した。
Ｅ． ｃｏｌｉ ＣＩＩＳ５０／ｐＬｃ３１菌株は寄託
番号２７１８号で１）ＳＭに寄託されている。
番号２７１８号で１）ＳＭに寄託されている。
実施例！６
ｐＬＣ３２の組立てと特性表示
λＰＬプロモーターとｂｌａ遺伝子を有し、制限座位Ｅ
ｃｏＲ Ｔ 、Ｓｍａ Ｉ 、Ｂａｍｌ目、Ｓａｌ ［
％Ｐｓｔ ［及びｌｌｉｎｄｌｎからリンカーを備え
たプラスミドＰＬｃ２ｇ（Ｒｅａ＋ａｕｔ ｅｔ ａｔ
．， Ｇｅｎｅ １５． １９８１， ｐｐ．８１−９
３）をＥｃｏＲ Ｉで切断し、プラスミドｐｏｕｓｔの
ｌ一ｃｏＲＩ座位に挿入し（実施例２参照）、次いで連
結し、Ｅ． ｃｏｌｉ閑株ＣＳｌ１５０に形質転換した
。このプラスミドｐＬＣ３２゜（第２０図参照） −
１０．６Ｘ １０＠ダルトンの分子量を有するーを、Ｐ
ｓｔｌで部分的にダイジェストし、次いで連結し、カナ
マイシン耐性でアンピシリン感受性のプラスミドを選択
ずるＥ． ｃｏｌｉ菌株ＣＳＩ１５０に形質転換した。
ｃｏＲ Ｔ 、Ｓｍａ Ｉ 、Ｂａｍｌ目、Ｓａｌ ［
％Ｐｓｔ ［及びｌｌｉｎｄｌｎからリンカーを備え
たプラスミドＰＬｃ２ｇ（Ｒｅａ＋ａｕｔ ｅｔ ａｔ
．， Ｇｅｎｅ １５． １９８１， ｐｐ．８１−９
３）をＥｃｏＲ Ｉで切断し、プラスミドｐｏｕｓｔの
ｌ一ｃｏＲＩ座位に挿入し（実施例２参照）、次いで連
結し、Ｅ． ｃｏｌｉ閑株ＣＳｌ１５０に形質転換した
。このプラスミドｐＬＣ３２゜（第２０図参照） −
１０．６Ｘ １０＠ダルトンの分子量を有するーを、Ｐ
ｓｔｌで部分的にダイジェストし、次いで連結し、カナ
マイシン耐性でアンピシリン感受性のプラスミドを選択
ずるＥ． ｃｏｌｉ菌株ＣＳＩ１５０に形質転換した。
得られたプラスミドはｐＬＣ３２と命名され、分子ｍが
７．７ＸｌＯ”ダルトンで次の遺伝子型ｃｏｐＡ ”、
ｃｏｐＢ＼ｒｅｐＡ ”、ａｐｈＡ”、ｉＩＩＩＩＩｌ
λ゜を有する。
７．７ＸｌＯ”ダルトンで次の遺伝子型ｃｏｐＡ ”、
ｃｏｐＢ＼ｒｅｐＡ ”、ａｐｈＡ”、ｉＩＩＩＩＩｌ
λ゜を有する。
このプラスミドを実施例ｌの記載と同様にして制限酵素
で地図化した（第２１図参照）。この制限地図から、λ
１》，プロモーターが、このプラスミドをクローニング
ベクターとして好都合たらしめる特異Ｅｃｏｌ目座位の
すぐ上流側に位置していることが分かる。
で地図化した（第２１図参照）。この制限地図から、λ
１》，プロモーターが、このプラスミドをクローニング
ベクターとして好都合たらしめる特異Ｅｃｏｌ目座位の
すぐ上流側に位置していることが分かる。
ｐＬＣ３２はｐＯυ５１と同じ複製性能を有することが
見出された。
見出された。
このプラスミドの性質を第５表に示す。
Ｅ． ｃｏｌｉ閑株ＣＳＩＩ５０／ ｐＬＣ３２は寄託
番号２１７９号で１）ＳＭに寄託されている。
番号２１７９号で１）ＳＭに寄託されている。
（以下余白）
第５表
ｐＯＵ５３ １
ｐＯＬＩ５６ ＾ｐ，λ
ｐＯＵ５７ ＾ｐ．ｌ
ｐＯＵ？１ Ａｐ．λ
ｐｏｕｙ３ ＾ｐ．λ
饅υ７５ ＾ｐ．λ
ｐＯｔｌｌ０６ ＾ｐ．λ．Ｌａｃ’りｐＯＵ７９
Ａｐ，λ．Ｌａｃ 国 ｐＯＵ８２ ＾ｐ．λ，Ｌａｃ” ｐＯＵ９１ １Ｐ，１．Ｌａｃ’， １’ａｒ’ ｐＯＵｌｏｌ Ａｐ，Ｃａ．λ ｐＯＵ１３０ ＾ｐ．λ．Ｌｉｅ’ ｐＬｃ３１ Ａｐ．ＲｏｃＡ’．λ ｐＬＣ３２ １［ｓ＋，１ ＥｃｏＲ ＥｃｏＲ Ｉ ． Ｂａｍｌｌ Ｉ ＣｃｏＲＩ．Ｉｌａｓｌｌｌ ＥｃｏＲＩ Ｂａｍｌｌｌ Ｂａｍｌｌ Ｂａａｌｌ ８ａｓｌｌｌ ＥｃｏＲＩ Ｂａｍｌｌｌ ＥｃｏＲ Ｉ ， Ｂａｍｌｌ Ｉ ＥｃｏＲＩ．Ｂａｍｌｌｌ ＥｃｏＲＩ ＣｃｏＲＩ εｃｏＲ ＥｃｏＲ Ｉ ２５．＞１０００ ２５，＞１０００ ２５ ＞１０００ ３ ＞１０００ １ ＞１０００ ３，＞１０００ ３，＞１０００ ３．＞１０００ ３．＞１０００ ３ ＞１０００ ３，＞１０００ ３，＞１０００ ３ ＞１０００ ２５ ＞１０００ 文献目録 １ ， Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ Ｎｏ．７８１０１８７７． ５ ２ ． Ｍｏｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｕｒｏｐｅ
ａｎ Ｐａｔｅｎｔ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｂａｃｔ．１３８， １９７９， ｐｐ．’ｙｏ−３
．Ｍｏｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏ
ｂｉｌｏｇｙ，１９８１，ｐｐ．４０８−１１． ４ ． Ｒｏｓｅｎ ａｔ ａｌ．， Ｍｏｌ．
Ｇｅｎ． Ｇｃｎｅｔ． １７９，１９８０．
ｐｐ．５２７−３７． ５ ．Ｌｉｇｈｔ ａｎｄ Ｍｏｌｉｎ，Ｍｏｌ．Ｇ
ｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１８４．＋９１，ｐｐ．５６−６１
． ６、Ｓｔｏｕｇａａｒｄ ｅＬ ａｌ．．Ｉ’ｒｏｃ
．Ｎａｔｌ．＾ｃａｄ．ｓｃｉ．υＳＡ ７８， １
９８１， ρｐ． ６００８−１２．７ ． Ｍｏ
ｌｉｎ ｅＬ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．ＧｅｎｅＬ，
１ｇ１． １９８１，ｐｐ．１２３−３０ ８ ．ＳＬｏｕｇａａｒｄ ａｔ ａｌ．， ｔｈｅ
ＣＭＢＯ ’Ｊｏｕｒｎａｌ ｌ，１９８２，ｐｐ
．３２３−２８． ９ ． Ｓｕｓｓｍａｎ ａｎｄ Ｊａｃｏｂ．
ＣｏｍｐＬ． Ｒｅｎｄ． ＾ｃａｄ．Ｓｃｉ．
２５４， １９６２． ｐ．ｌ５１７１ ０
． Ｓｎｉｎｓｋｙ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ
ｌ６． １９８１， ｐ．２７５．１ １ ．
Ｕｈｌｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ ６．
１９７９， ｐｐ．９１−１０６１ ２ ．Ｊ．
Ｍｉｌｌｅｒ ： ＩＥｘｐｇｒｉｍｅｎＬｓ ｉｎ
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎ−ｅｔｉｃｓ， Ｃｏ
ｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ ＩｌａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｉｌａｒｂｏｒ Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ，１９７２． １ ３ ． Ｄａｖｉｓ ＢｏｔｓＬｅｉｎ ａｎ
ｄ Ｒｏｔｈ ： Ａ Ｍａｎｕａｌ ｆｏｒＧｅｎ
ｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ；＾ｄｖａｎｃｅ
ｄ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｇｅｎ−ｅＬｉｃｓ，
Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｉｌａｒｂｏｒ， Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ． １９８０．１．４ ． Ｂｃｒｔａ
ｎｉ， Ｊ． ［３ａｃｔ． ６２， １９５
４， ｐ． ２９３．ｌ ５ ． Ｂｏｌｉｖａｒ
ｅＬ ａｌ．．Ｇｅｎｅ ２． １９７７， ｐ．
９５．１６．Ａｎ ＆ Ｆｒｅｉｓｅｎ， Ｊ． Ｂａ
ｃｋ． １４０， １９７９， ｐｐ．４００−４
０７． １ ７ ． Ｃａｓａｄａｂａｎ ｅＬ ａｌ，． Ｂ
ａｃｔ． １４３， １９８０， ｐ．９７１． １ ８ ． Ｄｅｍｐｓｅｙ ＆ ＷｉｌｌｅＬｔｓ，
Ｊ． Ｂａｃｋ． １２６， １９７６，ｐ．
ｌ６６． １ ９ ． Ｎｏｒｄｓｔｏｒｍ， Ｍｏｉｉｎ．
Ａａｇａａｒｄ−１ｌａｎｓａｎ， Ｐｌａｓ−ｎ
＋ｉｄ ４． １９８０， ｐｐ．２１５−１７．
２ ０ ． Ｓｔｏｕｇａａｒｄ ＆ Ｍｏｌｉｎ，
Ａｎａｌ． ［ｌｉｏｃｈｅｍ． １１８，１９８１
ｐ．ｌ９１． ２ １ ． Ｎｏｒｄｓｔｏｒｍ ｅｔ ａｌ．． Ｐ
ｌａｓｍｉｄ ４， １９８０， ｐ．３２２． ２ ２ ． Ｖａｌｅｎｔｉｎ−１ｌａｎｓｅｎ
ｅｔ ａｌ．， ｔｈｅ ＥＭＢＯＪｏｕｒ
ｎａｌ ｌ， １９８２． ｐ．３１７．２ ３
．Ｍｅｓｓｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉ
ｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．９，１９８１，ｐ，３０
９． ２ ４ ． Ｕｈｌｉｎ ＆ Ｃｌａｒｋ， Ｊ．
Ｂａｃｔ． １４８， １９８１， ｐｐ．３８
６−９０．
Ａｐ，λ．Ｌａｃ 国 ｐＯＵ８２ ＾ｐ．λ，Ｌａｃ” ｐＯＵ９１ １Ｐ，１．Ｌａｃ’， １’ａｒ’ ｐＯＵｌｏｌ Ａｐ，Ｃａ．λ ｐＯＵ１３０ ＾ｐ．λ．Ｌｉｅ’ ｐＬｃ３１ Ａｐ．ＲｏｃＡ’．λ ｐＬＣ３２ １［ｓ＋，１ ＥｃｏＲ ＥｃｏＲ Ｉ ． Ｂａｍｌｌ Ｉ ＣｃｏＲＩ．Ｉｌａｓｌｌｌ ＥｃｏＲＩ Ｂａｍｌｌｌ Ｂａｍｌｌ Ｂａａｌｌ ８ａｓｌｌｌ ＥｃｏＲＩ Ｂａｍｌｌｌ ＥｃｏＲ Ｉ ， Ｂａｍｌｌ Ｉ ＥｃｏＲＩ．Ｂａｍｌｌｌ ＥｃｏＲＩ ＣｃｏＲＩ εｃｏＲ ＥｃｏＲ Ｉ ２５．＞１０００ ２５，＞１０００ ２５ ＞１０００ ３ ＞１０００ １ ＞１０００ ３，＞１０００ ３，＞１０００ ３．＞１０００ ３．＞１０００ ３ ＞１０００ ３，＞１０００ ３，＞１０００ ３ ＞１０００ ２５ ＞１０００ 文献目録 １ ， Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ Ｎｏ．７８１０１８７７． ５ ２ ． Ｍｏｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｕｒｏｐｅ
ａｎ Ｐａｔｅｎｔ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｂａｃｔ．１３８， １９７９， ｐｐ．’ｙｏ−３
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Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎ−ｅｔｉｃｓ， Ｃｏ
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ｄ Ｒｏｔｈ ： Ａ Ｍａｎｕａｌ ｆｏｒＧｅｎ
ｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ；＾ｄｖａｎｃｅ
ｄ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｇｅｎ−ｅＬｉｃｓ，
Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｉｌａｒｂｏｒ， Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ． １９８０．１．４ ． Ｂｃｒｔａ
ｎｉ， Ｊ． ［３ａｃｔ． ６２， １９５
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ａｃｔ． １４３， １９８０， ｐ．９７１． １ ８ ． Ｄｅｍｐｓｅｙ ＆ ＷｉｌｌｅＬｔｓ，
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Ａａｇａａｒｄ−１ｌａｎｓａｎ， Ｐｌａｓ−ｎ
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Ａｎａｌ． ［ｌｉｏｃｈｅｍ． １１８，１９８１
ｐ．ｌ９１． ２ １ ． Ｎｏｒｄｓｔｏｒｍ ｅｔ ａｌ．． Ｐ
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ｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．９，１９８１，ｐ，３０
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Ｂａｃｔ． １４８， １９８１， ｐｐ．３８
６−９０．
第１図は野生型プラスミドｒＬ１の複製部位の概略図で
ある。第２図は第３〜２１図に用いられている記号の手
引きである。及び第３〜２１図は実施例に記載のプラス
ミドの制限地図を示す。
ある。第２図は第３〜２１図に用いられている記号の手
引きである。及び第３〜２１図は実施例に記載のプラス
ミドの制限地図を示す。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、複製するためにプロモーターからの転写を必要とし
、かつプロモーターからの転写がプラスミドの複製を制
御するような位置と方向に調節可能なプロモーターを挿
入されたプラスミドであって、プロモーターからの転写
が増大するとプラスミドコピー数が実質的に増大される
か制御されなくなるプラスミドを有する微生物を、前記
調節可能なプロモーターからの増大された転写によって
プラスミドコピー数が実質的に増大されるか又は制御さ
れなくなるに至るのを保証する条件下での少なくとらひ
とつの培養期間で培養し、次いで微生物の培養物からプ
ラスミドの遺伝子産物を収穫することからなる、プラス
ミドＤＮＡの遺伝子産物の製造方法。 ２、プラスミド複製を調節するプロモーターが、プロモ
ーター領域内の特別のＤＮＡ構造によって本来調節可能
なプロモーターである請求の範囲第１項の方法。 ３、プロモーターが調節因子によって制御可能である請
求の範囲第１項の方法。 ４、調節因子が正の制御を行う因子である請求の範囲第
３項の方法。 ５、調節因子が負の制御を行う因子である請求の範囲第
３項の方法。 ６、プラスミドコピー数が実質的に増大されるか又は制
御されなくなるに至る制御可能なプロモーターからの増
大された転写が、前記プロモーターの脱抑制によって起
こる請求の範囲第１項の方法。 ７、プロモーターが、化学的に調節可能なプロモーター
である請求の範囲第１〜６項のいずれかの方法。 ８、プロモーターが、１ａｃプロモーター、ｔｒｐプロ
モーターもしくはｄｅｏプロモーターである請求の範囲
第７項の方法。 ９、プロモーターの活性が、温度依存性かまたは温度感
受性の調節遺伝子で制御される請求の範囲第１〜６項の
いずれかの方法。 １０、プロモーターがλプロモーターであり、前記プロ
モーターからの転写を制御する温度感受性λｃＩリプレ
ッサーの遺伝子も存在する請求の範囲第９項の方法。 １１、λプロモーターがλＰ＿ＲもしくはλＰ＿Ｌであ
る請求の範囲第１０項の方法。 １２、λプロモーターがλＰ＿Ｒである請求の範囲第１
１項の方法。 １３、前記の調節可能なプロモーターからの転写によっ
て、プラスミドが低温度では一定の低コピー数を示し、
高温度では実質的に増大されるかまたは制御されないコ
ピー数を示す請求の範囲第１〜１２項のいずれかの方法
。 １４、前記調節可能なプロモーターからの転写によって
、プラスミドが約３０℃の温度では一定の低コピー数を
示し、約３６〜４２℃の範囲の温度では実質的に増大し
たコピー数を示す請求の範囲第１３項の方法。 １５、プラスミドが約３９℃以上の温度で制御されない
プラスミドコピー数を示す請求の範囲第１４項の方法。 １６、プラスミドの本来もっているひとつの複製調節遺
伝子の一部が欠失し、調節可能なプロモーターで置換さ
れている請求の範囲第１〜１５項の方法。 １７、プラスミドを有する微生物が一定の低プラスミド
コピー数を保証する条件下で増殖される場合、プラスミ
ドが、２０〜４０好ましくは２０〜３０および特に２０
〜２５コピー／細胞の範囲のコピー数を有し、宿主微生
物が実質的に増大されるかまたは制御されないプラスミ
ドコピー数に至る異なる条件下で増殖される場合、プラ
スミドが少なくとも約５００〜１０００コピー／細胞の
範囲のコピー数を有する請求の範囲第１６項の方法。 １８、プラスミドが、約３０℃の温度のような温度で、
約２０〜４０、好ましくは２０〜３０および特に２０〜
２５コピー／細胞の範囲のプラスミドコピー数を有し、
約４２℃の温度のような高温で少なくとも約５００〜１
０００コピー／細胞の範囲の制御されないプラスミドコ
ピー数を有する請求の範囲第１７項の方法。 １９、プラスミドが、ｃｏｐＢ遺伝子が欠失し、調節可
能なプロモーターによって置換されているＲ１型プラス
ミドである請求の範囲第１６〜１８項のいずれかの方法
。 ２０、プラスミドを有する宿主微生物が一定の低プラス
ミドコピー数を保証する条件下で増殖される場合、プラ
スミドが約３〜５コピー／細胞の範囲のコピー数を有し
、宿主微生物が実質的に増大されるかまたは制御されな
いプラスミドコピー数に至る異なる条件下で増殖される
場合、プラスミドが、少なくとも約５００〜１０００コ
ピー／細胞の範囲のコピー数を有する請求の範囲第１〜
１５項のいずれかの方法。 ２１、プラスミドが約３０℃の温度のような温度で約３
〜５コピー／細胞の範囲のプラスミドコピー数を有し、
約４２℃の温度のような高温で少なくとも約５００〜１
０００コピー／細胞の範囲の制御されないプラスミドコ
ピー数を有する請求の範囲第２０項の方法。 ２２、調節可能なプロモーターが、プラスミドの本来も
っているひとつの複製制御遺伝子の上流に挿入された請
求の範囲第１〜１５項のいずれかの方法。 ２３、プラスミドを有する宿主微生物が一定の低プラス
ミドコピー数を保証する条件下で増殖される時、プラス
ミドが約３〜５コピー／細胞の範囲のコピー数を有し、
宿主微生物が実質的に増大されるのかまたは制御されな
いプラスミドコピー数を至る異なる条件下で増殖される
場合、プラスミドが少なくとも約５００〜１０００コピ
ー／細胞の範囲のコピー数を有する請求の範囲第２２項
の方法。 ２４、プラスミドが、約３０℃の温度のような温度で約
３〜５コピー／細胞の範囲のプラスミドコピー数を有し
、約４２℃の温度のような高温で少なくとも約５００〜
１０００コピー、／細胞の範囲の制御されないプラスミ
ドコピー数を有する請求の範囲第２３項の方法。 ２５、プラスミドが、調節可能なプロモーターが、ｃｏ
ｐＢ遺伝子とｃｏｐＡ遺伝子の上流に挿入されたＲ１型
プラスミドである請求の範囲第２２〜２４項のいずれか
の方法。 ２６、プラスミドを有する宿主微生物が一定の低プラス
ミドコピー数を保証する条件下で増殖される際、プラス
ミドが約０．５〜１コピー／細胞の範囲のコピー数を有
し、宿主微生物が実質的に増大されるかまたは制御され
ないプラスミドコピー数に至る異なる条件下で増殖され
る際、プラスミドが少なくとも約５００〜１０００コピ
ー／細胞の範囲のコピー数を有する請求の範囲第１〜１
５項のいずれかの方法。 ２７、プラスミドが、約３０℃の温度のような温度で、
約０．５〜１コピー／細胞の範囲のプラスミドコピー数
を有し、約４２℃の温度のような高温で少なくとも約５
００〜１０００コピー／細胞の範囲の制御されないプラ
スミドコピー数を有する請求の範囲第２６項の方法。 ２８、プラスミドが、本来もっているひとつの複製調節
遺伝子の一部が欠失した複製領域中に調節可能なプロモ
ーターを有し、その本来もっているひとつの複製調節遺
伝子が、それが天然には位置していない領域に挿入され
た請求の範囲第１〜１５項のいずれかの方法。 ２９、プラスミドを有する宿主微生物が一定の低プラス
ミドコピー数を保証する条件下で増殖される時に、プラ
スミドが約０．５〜１コピー／細胞の範囲のコピー数を
有し、宿主微生物が実質的に増大されるかまたは制御さ
れないプラスミドコピー数に至る異なる条件下で増殖さ
れる際、プラスミドが少なくとも約５００〜１０００コ
ピー／細胞の範囲のコピー数を有する請求の範囲第２８
項の方法。 ３０、プラスミドが、約３０℃の温度のような温度で約
０．５〜１コピー／細胞の範囲のプラスミドコピー数を
有し、約４２℃の温度のような高温で少なくとも約５０
０〜１０００コピー／細胞の範囲の制御されないコピー
数を有する請求の範囲第２９項の方法。 ３１、プラスミドが、ｃｏｐＢ遺伝子をプラスミドの複
製領域の外側のＥｃｏＲ１部位に挿入したＲ１型プラス
ミドである請求の範囲第２８〜３０項のいずれかの方法
。 ３２、複製領域からの転写を調節する第１の調節可能な
プロモーターに加えて、第２のプロモーターが、構造遺
伝子を挿入できるようなしかたで挿入され、その構造遺
伝子の発現が前記第２のプロモーターで制御される請求
の範囲第１〜３１項のいずれかの方法。 ３３、前記遺伝子の発現を調節する前記第２プロモータ
ーが制御可能である請求の範囲第３２項の方法。 ３４、構造遺伝子の発現を制御する前記第２の挿入プロ
モーターがλＰ＿Ｌプロモーターである請求の範囲第３
２項または３３項の方法。 ３５、プラスミドが約３０℃で、一定の低プラスミドコ
ピー数を有し、その遺伝子発現がごくわずかか全くなく
、約３６〜４２℃の範囲の温度で、実質的に増大される
かもしくは制御されないプラスミドコピー数を有し遺伝
子の発現を行う請求の範囲第３２〜２４項のいずれかの
方法。 ３６、プラスミドが３９℃以上の温度で、制御されない
プラスミドコピー数を有しかつ非常に高い遺伝子発現を
行う請求の範囲第３５項の方法。 ３７、プラスミドが、このプラスミドを有する細胞の同
定および／または選択に有用なマーカーを有する請求の
範囲第１〜３６項のいずれかの方法。 ３８、マーカーが宿主微生物に抗生物質耐性を仲介する
遺伝子である請求の範囲第３７項の方法。 ３９、プラスミドが他の遺伝子を挿入する際に遺伝子融
合を行いうる遺伝子を有し、その遺伝子融合によって発
現の検出が可能である請求の範囲第１〜３８項のいずれ
かの方法。 ４０、プラスミドがミニプラスミドであることを特徴と
する請求の範囲第１〜３９項のいずれかの方法。 ４１、プラスミドがさらにそのプラスミドに本来関係の
ない単一もしくは複数の遺伝子を追加して有する請求の
範囲第１〜４０項のいずれかの方法。 ４２、請求の範囲第１〜４１項のプラスミドが微生物に
挿入された請求の範囲第１項の方法。 ４３、微生物が細菌である請求の範囲第４２項の方法。 ４４、微生物がグラム陰性で中温性の細菌である請求の
範囲第４３項の方法。 ４５、グラム陰性で中温性の細菌がエシエリヒア・コリ
である請求の範囲第４４項の方法。 ４６、請求の範囲第１〜４１項のプラスミドが形質転換
された宿主微生物を、接種および増殖段階では一定の低
プラスミドコピー数になる条件下で所望の細胞数がえら
れるまで培養し、次いで該宿主微生物をプラスミドコピ
ー数が実質的に増大されるかもしくは制御されなくなる
に至る条件下で培養することからなる請求の範囲第１〜
４５項の方法。 ４７、プロモーターからのいずれの転写もプラスミドの
コピー数に有意に影響しない条件下での培養期間の後、
プロモーターの活性を誘発する物質が、プラスミドのコ
ピー数が実質的に増大されるかもしくは制御されないコ
ピー数に至る量で培地に添加される請求の範囲第４６項
の方法。 ４８、プラスミドの実質的な増幅を得るのに充分である
が、微生物培養物のいずれの実質的な損傷を回避するの
に充分短い期間、プラスミドコピー数が実質的に増大さ
れるかもしくは制御されなくなるに至る条件を維持した
後で、プロモーター活性を誘発する物質が培養媒体から
除去され、プラスミドコピー数が徐々に減少し、前記誘
発前のレベルに至らせる請求の範囲第４７項の方法。 ４９、プロモーター活性を実質的に阻害する物質の存在
かでの培養期間の後、その物質の濃度が、プロモーター
が活性化されプラスミドコピー数が実質的に増大される
か又は制御されなくなるに至る程度に減少される請求の
範囲第４６項の方法。 ５０、プラスミドの実質的な増幅を得るのに充分である
が微生物培養物のいずれの実質的な損傷も回避するのに
充分短い期間、プラスミドコピー数が実質的に増大され
るかもしくは制御されなくなるに至る条件を維持し、プ
ロモーター活性を阻害する物質が、プラスミドコピー数
が徐々に減少して誘発前のレベルにいたる量で添加され
る請求の範囲第４９項の方法。 ５１、宿主微生物の培養される条件が、プラスミドコピ
ー数が実質的に増大されるか又は制御されない温度又は
その近傍の温度での少なくともひとつの培養期間からな
る請求の範囲第４６項の方法。 ５２、プラスミドコピー数が実質的に増大されるか又は
制御されない温度での培養が、宿主微生物の成育がプラ
スミドからのプラスミドＤＮＡらしくは遺伝子の産物の
形成によって阻害されるまで続けられる請求の範囲第５
１項の方法。 ５３、量産規模の培養が、プラスミドの遺伝子産物の形
成量を増大するとともに、宿主微生物の存続と連続的成
育を許容するように、プラスミドコピー数が実質的に増
大されるか又は制御されない温度に近い温度で連続的に
行われ、次いでその遺伝子産物が培養物から連続的もし
くは間欠的に収穫される請求の範囲第５１項の方法。 ５４、微生物培養物を量産サイズに到達するまで増殖さ
せた後、温度がプラスミドコピー数が実質的に増大され
るか制御されない温度もしくはその近傍の温度に変えら
れ、次いでこの温度がプラスミドの実質的な増幅を得る
のに充分であるが微生物培養物のいずれの実質的な損傷
を避けるのに充分短い期間、維持され、その後その温度
が、低い一定のプラスミドコピー数を保証し、プラスミ
ドコピー数を最初のレベルに到達するまで徐々に減少さ
せる温度にもう一度変えられる請求の範囲第５１項の方
法。 ５５、プラスミドコピー数が実質的に増大されるか又は
制御されない温度が、プラスミドが一定の低いコピー数
を有する温度よりも高い請求の範囲第５１〜５４項のい
ずれかの方法。 ５６、プラスミドが一定の低いコピー数を有する温度が
約３０℃の温度であり、プラスミドが実質的に増大され
るか又は制御されないコピー数を有する温度が約３６〜
４２℃の範囲にある請求の範囲第５５項の方法。
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| DK4151/82 | 1982-09-16 | ||
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP58502971A Expired - Lifetime JPH0753111B2 (ja) | 1982-09-16 | 1983-09-09 | 条件非制御の複製挙動を持つプラスミド |
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