DK167883B1 - Stabiliserede plasmider, bakterier indeholdende samme, fremgangsmaade til fremstilling af genprodukt af plasmid-dna og dna fragment omfattende r1 fordelingsfunktion - Google Patents

Description

i DK 167883 B1

Den foreliggende opfindelse angår stabiliseringen af plasmider, som er nyttige inden for rekombinant DNA-teknologiområdet til fremstilling af gener og produkter deraf.

Den fortsatte bevaring af de fleste naturlige plasmider, selv i 5 fraværelse af selektionstryk (faktorer, som kun sikrer væksten af de organismer, der indeholder plasmiderne; et eksempel er et antibiotikum i næringsmediet i tilfælde af et plasmid, der bærer et gen, som meddeler resistens over for antibiotikummet), tyder på, at plasmid-bevaringsfunktioner er blevet udviklet for at sikre den fortsatte 10 tilstedeværelse af disse ekstrakromosomale elementer med høj effektivitet. Plasmidbevaringsfunktionerne består primært af replikations-generne, herunder disses kontrolområder, som regulerer plasmidkon-centrationen i cellen. I voksende celler overvåger replikationskon-trolsystemet antallet af plasmidkopier og korrigerer afvigelser fra 15 gennemsnittet ved at forøge eller nedsætte sandsynligheden for plas-midreplikation. Imidlertid kan intet replikationskontrolsystem forhindre, at der opstår celler med meget få eller blot én kopi af plasmidet, og ud fra sådanne celler er muligheden for dannelse af en plasmidfri dattercelle åbenlys. Dette problem er naturligvis størst, 20 hvad angår lavkopitalplasmider. Endvidere resulterer en passiv fordeling af plasmidmolekyler ved celledeling uundgåeligt i en vis frekvens af plasmidfri celler. Da tabet af et plasmidmolekyle fra en celle er irreversibelt, er konsekvenserne af en sådan ustabil situation, at hele populationen til sidst bliver plasmidfri.

25 Udover en tilfældig fordeling af plasmider ved celledeling kan andre faktorer have indflydelse på hyppigheden af tabet af plasmider fra en kultur af celler, der dyrkes i fraværelse af selektion for bevaring af plasmidet. Fx kræver visse plasmider et specifikt rekombinations-system for at adskille to nyligt replikerede molekyler (Austin et 30 al., Cell 25, 1981, s. 729-736). Uden adskillelse vil der dannes multimerer (sammengribende), og herved kan selv et højt kopital af et plasmid synes som et lavkopitalplasmid, hvad angår fordeling til datterceller, eftersom sandsynligheden for at genere plasmidfrie celler forøges med stigende antal plasmidmolekyler, som hænger sammen 35 i multimere strukturer. Et andet fænomen, der ofte iagttages inden for rekombinant DNA-teknologien, er omdannelsen af en stabil klo- DK 167883 Bl 2 ningsvektor til et ustabilt hybridplasmid som følge af indsætningen af et DNA-fragment, hvis tilstedeværelse enten forårsager en nedgang i plasmidkopital eller medfører et skadeligt produkt, som har en negativ indflydelse på cellevækst.

5 I alle disse tilfælde forekommer plasmidsegregering og -tab med en frekvens (høj eller lav), som ikke let kan kontrolleres udefra.

Stabiliteten af naturlige plasmider og især lavkopitalplasmider tyder på, at der udover replikationskontrolsysternet er et andet sæt bevaringsfunktioner, som aktivt deltager i en ordnet fordeling af plas-10 midmolekylerne ved celledeling. Sådanne funktioner er blevet betegnet fordelingsfunktioner, og undersøgelser, fx Meacock et al., Cell 20, 1980, s. 529-542, Nordstrom et al., Plasmid 4, 1980, s. 332-349,

Seelke et al., Plasmid 7, 1982, s. 163-179, har nu vist, at disse i det mindste delvis er indkodet af plasmideme selv (i par-områder).

15 Således har visse plasmidsletningsmutanter mistet deres stabile bevaring eller nedarvning på trods af deres normale vildtypereplikations-opførsel, hvilket tyder på, at en plasmidspecificeret funktion, som sikrer stabilitet, er blevet fjernet (jfr. Nordstrom et al., op. cit.).

20 Da mange af de plasmider, som anvendes som vektorer i rekombinant DNA-tekno logi, har fået fjernet en stor mængde DNA i sammenligning med vildtypestamplasmidet, er de tilbøjelige til at blive ustabilt nedarvet. Dette udgør et alvorligt problem, da ustabilitet hos et plasmid i sidste instans resulterer i et fuldstændigt tab af plas-25 midet fra cellerne og under alle omstændigheder reducerer det relative udbytte af plasmidindkodede genprodukter. Dette problem er særlig udtalt ved produktion i stor målestok af genprodukter, hvor vækst af mikroorganismer under selektionstryk, fx et antibiotikum, normalt ikke kan lade sig gøre og ofte i det mindste er uønskeligt ud 30 fra et miljø synspunkt, og hvor mikroorganismerne dyrkes i et stort antal generationer. Vektorer, som kun er til stede i få kopier pr. celle, er mest tilbøjelige til at blive ustabilt nedarvet og derfor gå tabt fra cellerne. Selv plasmider, der sædvanligvis har et relativt højt kopital, hvilket sikrer en relativ stabilitet af plasmidet, 35 har i visse tilfælde vist sig at blive ustabile, når DNA-fragmenter, DK 167883 B1 3 der bærer gener, som ikke naturligt er forbundet med plasmidet, indsættes deri.

Den foreliggende opfindelse angår plasmider, der replikerer i gramnegative bakterier, og som er ejendommelige ved, at de bærer ét eller 5 flere indsatte gener, der ikke naturligt er forbundet med plasmidet, og som desuden bærer et indsat DNA-fragment, som udøver en fordelingsfunktion, hvilket DNA-fragment er kortere end 19 kb, og hvilket DNA-fragment omfatter den plasmidstabiliserende DNA-sekvens Ri parområde A, den plasmidstabiliserende DNA-sekvens RI par-område B eller 10 både Ri par-område A og RI par-omårde B. Udtrykket "indsat" skal betyde, at genet eller generne eller DNA-fragmentet er blevet indført i plasmidet i et trin under konstruktionen af det færdige plasmid.

In nærværende sammenhæng betegner udtrykket "en fordelingsfunktion" en funktion, som sikrer en ordnet fordeling af plasmidmolekylerne ved 15 celledeling, og som indkodes af et område på et plasmid, der afhængig af den type plasmid, som udtrykker funktionen, kan omfatte ét eller flere gener. Som nævnt ovenfor findes sådanne områder i naturligt forekommende eller vildtypeplasmider, men plasmider, der udtrykker en Par+-fænotype, dvs. på hvilke fordelingsgenerne er til stede, og som 20 også bærer ét eller flere indsatte gener, der ikke naturligt er forbundet med plasmidet, anses for at være hidtil ukendte. I denne sammenhæng er plasmider defineret som naturligt forekommende ekstrak-romosomale elementer i mikroorganismer, hvilke elementer er mulige at isolere som sådanne, eller derivater deraf.

25 Plasmiderne ifølge opfindelsen kan anvendes som klonings- eller produktionsvektorer inden for rekombinant DNA-teknologiområdet med det formål at udvinde en lang række produkter til tekniske eller medicinske formål, der direkte eller indirekte er medieret af det eller de indsatte gener, især polypeptider og proteiner eller fragmenter 30 deraf, enzymer og et antal ikke-proteinøse produkter af reaktioner med enzymer, lavmolekylære produkter såsom hormoner, og nukleinsyrer; produkter fra eukaryote gener, især pattedyrsgener, har særlig interesse.

4 UK Ί67883 di I overensstemmelse med den foreliggende opfindelse er fordelingsfunktionen en funktion, der i naturen udtrykkes af et område fra vildtyperesistensplasmidet RI, og som derfor i det følgende betegnes som et Ri par-område. Ifølge den foreliggende opfindelse har et 5 sådant område vist sig at forårsage delvis eller fuld stabilitet ikke alene hos ustabile RI miniplasmider, som bærer ét eller flere gener, der ikke er naturligt forbundet med plasmidet, men også hos hyppigt segregerende plasmider, der ikke er forbundet med plasmidet RI, og som bærer ét eller flere gener, der ikke naturligt er forbundet med 10 plasmidet. Et andet eksempel på en særlig værdifuld fordelingsfunktion er den fordelingsfunktion, som findes på vildtypeplasmidet F (Seelke et al., op. cit.), der også meddeler en høj grad af stabilitet til modtagerplasmidet. I det følgende vil der primært blive henvist til RI Par-funktionen, men det er klart, at mange af de 15 fænomener, som er forbundet med Ri Par-funktionen, også gælder for andre Par-funktioner.

Det er tidligere blevet angivet, at plasmid RI's fordelingsfunktion udøves af det såkaldte EcoRl-A-fragment (jfr. Nordstrom et al. ,

Plasmid 4, 1980, s. 332-349). I forbindelse med den forskning, der 20 har ført til den foreliggende opfindelse, har det overraskende vist sig, at £coRl-A-fragmentet, der har en længde på ca. 19 kb (19.000 basepar), omfatter to og kun to adskilte områder, som meddeler modtagerplasmidet en Par+-fænotype. Disse områder er anbragt i hver sin ende af EcoRl-A-fragmentet, og ingen anden DNA-sekvens i EcoRl-A-25 fragmentet antages for tiden at have nogen plasmidstabiliserende funktion. Til nærværende formål er de to områder blevet betegnet parområde A og par-område B, forkortet til henholdsvis parÅ og parB.

Da det er en fordel at operere med så små DNA-fragmenter som muligt, fordi små fragmenter er lettere at indsætte i plasmiderne, og de 30 resulterende plasmider er lettere at transformere til værtsceller, angår opfindelsen plasmider, der bærer et indsat DNA- fragment, som er kortere end EcoRl - fragmentet fra plasmid RI, og som indeholder et RI par-område. Dette indsatte DNA-fragment omfatter sædvanligvis som sin hovedbestanddel RI par-område A, RI par- område B eller både RI 35 par-område A og Ri par-område B. Dette betyder, at i det væsentlige hele DNA-fragmentet, som er indsat i værtsplasmidet, udgøres af ét af DK 167883 B1 5 de to eller begge par-områderne, og at resten af DNAet på fragmenterne fortrinsvis er til stede for at tilvejebringe hensigtsmæssige restriktionssteder, der forsyner DNA-fragmenterne med de ønskede ender, som umiddelbart er kompatible med et tilsvarende eller kompa-5 tibelt restriktionssted på modtagerplasmidet. Sådanne ender kan også tilvejebringes ved hjælp af linkere. Det skal dog bemærkes, at DNA-fragmentet, som omfatter par-område A, og DNA-fragmentet, der omfatter par-område B, kan indføres separat og sekventielt i det samme plasmid, som derefter fænotypisk vil være identisk med et plasmid, i 10 hvilket fænotypen ParA+, ParB+ er blevet etableret ved at indsætte par-område A og par-område B på samme DNA-fragment. Hvis det fx ønskes yderligere at stabilisere et plasmid, der allerede bærer et par-område såsom parB-området, kan plasmidet kløves med et hensigtsmæssigt restriktionsenzym, og et DNA-fragment, som har ender, der er 15 kompatible med dette restriktionssted, og som bærer det andet parområde såsom park-området, kan derefter indsættes. Den modsatte proces, dvs. indsætning på tilsvarende måde af et parB-område på et plasmid, der allerede bærer et parA-område, kan også udføres.

I overensstemmelse hermed er interessante plasmider plasmider, hvor 20 det indsatte DNA-fragment, som omfatter RI par-område A og RI parområde B, har en længde, som ikke overstiger ca. 6 kb, især ikke ca.

4 kb, navnlig ikke 3 kb. Når det indsatte DNA-fragment omfatter RI par-område A, har det normalt en længde, der ikke overstiger ca.

4 kb, især ikke ca. 2,5 kb, navnlig ikke ca. 2 kb. Når det indsatte 25 DNA-fragment omfatter RI par-område B, har det normalt en længde, som ikke overstiger ca. 2 kb, især ikke ca. 1,5 kb, navnlig ikke ca.

1 kb. Størrelsen af £coRl-A-fragmentet, kan reduceres på forskellige måder såsom ved delvis restriktion af £coRl-A-fragmentet med restriktionsenzymet PstI, eller ved at udskære hvert RI par-område fra det 30 store fragment og overføre hvert område sekventielt til det samme DNA-fragment, som derefter kan indsættes i det plasmid, der skal stabiliseres.

De plasmider, som stabiliseres i overensstemmelse med opfindelsens princip, kan enten være plasmider, som er naturligt forbundne med det 35 indsatte fordelingsområde, såsom Rl-miniplasmider, der stabiliseres ved hjælp af et indsat RI par-område (Rl-miniplasmider har fået DK 167883 B1 6 slettet meget af det oprindelige RI DNA og indeholder derfor ikke sædvanligvis i sig selv et RI par-område), eller de kan være plasmider, som ikke er naturligt forbundne med fordelingsfunktionen. Det er interessant at bemærke, at effektive fordelingsfunktioner, som kan 5 anvendes ifølge den foreliggende opfindelse, er i stand til at sikre en tilfredsstillende stabilitet af ikke alene plasmider, med hvilke de er naturligt forbundne såsom i tilfælde af stabilisering af RI-miniplasmider med et RI par-område, men også plasmider, med hvilke fordelingsfunktionen ikke er naturligt forbundet. Et eksempel på 10 sidstnævnte er indsætning af et RI par-område i et ikke-Rl plasmid såsom et pMBl plasmid eller derivat deraf såsom et pBR322 plasmid eller derivat deraf (disse plasmider er sædvanligvis stabile, men er tilbøjelige til at blive ustabile, når ét eller flere gener, der ikke er naturligt forbundne med plasmidet, indsættes). Et andet eksempel 15 er anvendelsen af et Ri par-område til stabilisering af visse plas-midtyper, som i det mindste i ét trin under dyrkningen af bakterier, som indeholder plasmidet, har et lavt kopital, fx et kopital på 0,5-5 kopier pr. celle såsom promiskuøse plasmider (plasmider, der er i stand til at replikere i mange forskellige værtsstammer eller -arter; 20 denne klasse omfatter de såkaldte shuttle-vektorer, der kan replikere i to eller flere typer mikroorganismer) med lavt kopital og derivater deraf, fx RK2. Bortset fra RI omfatter andre plasmider fra inkom-patibilitetsgruppen IncFII, der kræver stabilisering, fx R100 og R6.

Én type plasmider, for hvilke stabilisering ifølge den foreliggende 25 opfindelse er vigtig, er betinget runaway-replikationsplasmider, dvs. plasmider, der, når værtsmikroorganismer, som indeholder plasmiderne, dyrkes under visse betingelser, har et konstant lavt plasmidkopital, og som, når mikroorganismerne, som indeholder plasmiderne, dyrkes under visse andre betingelser, mister deres replikationskontrol, 30 således at plasmidkopitallet forøges eksponentielt, indtil værtscellen ophører med at vokse. Runaway-replikationsplasmider, for hvilke stabilisering ifølge opfindelsen er særlig vigtig, er runaway-repli-kationsplasmider med et kopital, der ikke overstiger ca. 3-5 kopier pr. celle, og især plasmider, hvis kopital ikke overstiger ca. 0,5-1 35 kopi pr. celle (tallet 0,5 skal betegne, at replikationsfrekvensen er mindre end 1 pr. cellecyklus), når mikroorganismer, som indeholder plasmiderne, dyrkes under sådanne betingelser, som sikrer et sådant DK 167883 B1 7 lavt plasmidkopital, og som, når værtsmikroorganismerne dyrkes under visse andre betingelser, der sikrer et væsentligt forøget plasmidkopital, har et kopital i området mindst ca. 500-1000 kopier pr. celle.

5 Det lave plasmidkopital under visse betingelser (typisk en lav temperatur såsom en temperatur på ca. 30°C) er ønskeligt, når plasmiderne anvendes som vektorer til indsætning af fremmede gener, som koder for produkter, der er delvis toxiske eller dødelige for værtscellen, da generne som følge af plasmidernes lille replikationshyppighed ved fx 10 en lav temperatur kun udtrykkes i små mængder om overhovedet, således at cellerne forbliver ubeskadigede i opformeringstrinnet af dyrkningen. I plasmider med et så ekstremt lavt kopital som det ovenfor anførte under de i opformeringstrinnet anvendte betingelser, såsom dyrkning af celler ved en lav temperatur, medfører mangelen på et 15 par-område imidlertid, at plasmidet går tabt fra den mikrobielle population med en frekvens på ca. 1% pr. generation for plasmider med et kopital, der ikke overstiger 3-5 kopier pr. celle, når disse dyrkes under betingelser, som sikrer et sådant lavt kopital. Tabsfrekvensen for plasmider med et kopital, der ikke overstiger ca. 0,5-1 20 kopi pr. celle, er ca. 5%/celle/generation. Det er klart, at plasmiderne vil gå tabt fra cellerne, før cellerne har nået en sådan densitet i næringsmediet, at det er økonomisk at inducere runaway-replikation, medmindre de har en fordelingsfunktion til stabilisering deraf; dette er særlig tilfældet ved produktion i stor målestok, som 25 kræver mange hundrede generationers cellevækst for at komme op på en kultur i produktionsstørrelse.

En sådan runaway-replikation kan gøres betinget ved at indsætte en regulerbar promotor oven for det eller de naturlige replikationskon-trolgener på plasmidet (en detaljeret beskrivelse af dette fænomen 30 findes i nærværende ansøgers samtidigt indleverede ansøgning med titlen "Plasmider med betinget ukontrolleret replikationsopførsel", der er indleveret på samme dag som nærværende ansøgning). Plasmider med runaway-replikationsopførsel kan være af mange forskellige typer, men foretrukne runaway-replikationsplasmider er Rl-type plasmider.

DK 167883 B1 8 I nærværende beskrivelse betegner udtrykket "stabilitet" (og dermed forbundne udtryk) en tabsfrekvens for plasmidet fra værtscellen på mindre end 2 x 10"^ pr. celle pr. generation. Det er faktisk muligt at opnå plasmider, som er lige så stabile som vildtypeplasmider, dvs.

5 med en tabs frekvens på mindre end 3 x 10" ^ pr. celle pr. generation, hvilket svarer til niveauet for mutationshyppighed af gener, ved at inkorporere en Par-funktion i plasmidet. Denne tabsfrekvensværdi (LF) er tydelig, når plasmideme er stabiliseret med både RI par-område A og RI par-område B, såsom når hele EcoRl-A-fragmentet er blevet 10 indsat i plasmideme.

Som nævnt ovenfor er Par+-fænotypen hos plasmid Ri imidlertid blevet lokaliseret til hvert separat par-område på FcoRl-A-fragmentet. Det har vist sig, at hvert af disse par-områder har en stabiliserende virkning på ustabile plasmider, som kan defineres som plasmider, der 15 mangler en stabiliserende eller fordelende funktion. Sådanne plasmider, som fænotypisk er Par , går sædvanligvis tabt fra værtscellen med højere eller lavere frekvens; fx går plasmid RI - derivater, hvorfra par-området er blevet fjernet, således tabt fra værtscellen med en frekvens på ca. 1,5 x 10'^ pr. celle pr. generation. Tilsvarende 20 går plasmid pl5-derivater, som er Par , tabt med en frekvens på ca.

1 x 10"^ pr. celle pr. generation, og nogle plasmid pMBl (pBR322) derivater (såsom det i eksempel 3.3 beskrevne) kan gå tabt med en frekvens på ca. 6 x 10'^/celle/generation. Modsat har Rl-plasmider, som er stabiliseret med enten parA eller parB alene, en LF-værdi på 25 ca. 10pr. celle pr. generation svarende til 100 ganges stabilisering, når et DNA-fragment, der bærer ét af disse par-områder, indsættes i en ustabil vektor; tallene for et tilsvarende p!5-derivat er ca. 8 x 10(ParA+), 1 x 10'^ (ParB+), og tallene for et tilsvarende pMBl-derivat er 5 x 10"^ (ParB+). Plasmider, som bærer både parA- og 30 parB-området, har en LF-værdi på ca. 10"^ pr. celle pr. generation eller en 10^ ganges stabilisering. For at lette overskueligheden er resultaterne for stabiliserede og usta -liserede replikons af forskellig oprindelse vist i tabel 1. Dette viser, at hvert par-område virker uafhængigt af det andet, at par-områderne er omtrent lige 35 effektive til stabilisering af i det mindste RI- og pl5-plasmider, og at deres virkning er kumulativ. Denne viden kan udnyttes, når man bestemmer den grad, hvormed et ustabilt plasmid skal stabiliseres.

DK 167883 B1 9

Hvis en mindre drastisk stabilisering er nødvendig, dvs. hvis det antages, at det plasmid, som skal stabiliseres, ikke er overordentligt ustabilt (med en LF-værdi på mindre end 10'^/celle/generation), kan det være tilstrækkeligt at indsætte et DNA-fragment, som indehol-5 der ét af par-områderne for at opnå en tilfredsstillende stabilitet, dvs. forhindre et gradvis tab af plasmidet fra en bakteriepopulation til produktion i stor målestok i løbet af flere hundrede generationer. Hvis plasmidet på den anden side er meget ustabilt (med en LF-værdi på mere end 10"^), kan det være nødvendigt eller i det mindste 10 fordelagtigt at indsætte begge par-områder for at sikre en ekstrem stabilitet hos plasmiderne.

Tabel 1

Tabsfrekvenser/celle/generation af forskellige replikons 15 Tabsfrekvens x 10"^/celle/generation

Type Par-fænotype replikon Par ParA+ ParB+ ParA+ ParB+ R1 150 0,6 1,0 0,04 20 pl5 100 8,0 0,01 0,01 pMBl (pBR322) 60 ND1 0,5 0,1 ND = ingen data

Disse målelige LF-værdier kan udnyttes, når plasmider af en af de 25 ovennævnte typer skal anvendes som vektorer til produktion af genprodukter, og således skal indeholde mindst ét gen, der ikke naturligt er forbundet med plasmidet. I et yderligere aspekt angår den foreliggende opfindelse således en fremgangsmåde til fremstilling af et genprodukt fra plasmid DNA, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig 30 ved, at bakterier, som indeholder et plasmid ifølge et hvilket som helst af kravene 1-16, dyrkes, og genproduktet af plasmidet udvindes fra bakteriekulturen. Dyrkningen som sådan udføres hensigtsmæssigt under anvendelse af sædvanlige teknikker, herunder sædvanlige næringsmedier, som vides at være optimale for den pågældende bakteri-35 eart. Det er værd at anføre, at der som følge af stabiliseringen ikke DK 167883 B1 10 kræves nogen specifik sammensætning af næringsmediet. Udvindingen af genproduktet udføres også i henhold til velkendte metoder, som er tilpasset arten og egenskaberne af det bestemte genprodukt, som fremstilles, værtsbakteriens egenskaber, etc. Dyrkningen fortsætter i 5 mindst 100 bakteriegenerationer; ved produktion i stor målestok kan antallet af cellegenerationer, som er nødvendigt for at opformere bakterien, overstige 100 generationer. Under disse omstændigheder udvælges plasmidets LF-værdi ved tilstedeværelsen af et par-område deri på en sådan måde, at tabet af plasmidet er mindre end 2 x 10' 10 ‘Vcelle/generation. Denne LF-værdi kan sædvanligvis opnås ved hjælp af ét par- område alene. I nogle tilfælde foretrækkes det imidlertid at opnå LF-værdier for plasmidet på mindre end 10"-Vcelle/generation, især mindre end 5 x 10‘^/celle/generation.

Selv om disse meget lave LF-værdier i visse tilfælde kan opnås ved 15 indsætning af bare ét par-område (især RI par-område B) , kræves sædvanligvis tilstedeværelsen af begge RI par-områder.

I et yderligere aspekt angår opfindelsen gram-negative bakterier, som indeholder plasmider ifølge opfindelsen. Det er en særlig fordel ved plasmiderne ifølge opfindelsen, at der ikke kræves særlige mutanter 20 eller stammer for at sikre bevaring af plasmidet. Således kan der anvendes en hvilken som helst bakterieart og -stamme, som er i stand til at indeholde sådanne plasmider, såsom gramnegative bakterier. Et specifikt eksempel på en bakterie, i hvilken plasmider ifølge den foreliggende opfindelse kan replikere og bevare deres stabilitet, er 25 Escherichia coli.

Den foreliggende opfindelse angår sluttelig et DNA-fragment, som er kortere end 19 kb og som er ejendommelig ved, at det omfatter Ri parområdet A, Ri par-området B eller både RI par-område A og RI parområde B. Dette betyder, at i det væsentlige hele DNA-fragmentet, som 30 indsættes i værtsplasmidet, består af ét af de to eller begge parområderne, og det resterende DNA er til stede for at tilvejebringe hensigtsmæssige restriktionssteder til indsætning i et kompatibelt restriktionssted på modtagerplasmidet. Det indsatte DNA-fragment, der omfatter RI par-område A og Ri par-område B, bør i henhold til dette 35 princip have en længde, der ikke overstiger ca. 6 kb, især ikke ca.

DK 167883 B1 11 4 kb, navnlig ikke 3 kb. Når DNA-fragmentet omfatter RI par-område A, har det sædvanligvis en længde, som ikke overstiger ca. 4 kb, især ikke ca. 2,5 kb, navnlig ikke ca. 2 kb. Når DNA-fragmentet omfatter RI par-område B, har det sædvanligvis en længde, som ikke overstiger 5 ca. 2 kb, især ikke ca. 1,5 kb, navnlig ikke ca. 1 kb. Det har overraskende vist sig, at sådanne små og derfor let indførlige DNA-frag-menter har bevaret deres stabiliserende funktion, da parA-området ved restriktionsenzymkortlægning er blevet reduceret til et område med en længde på ca. 1800 bp (basepar), og parB-området er blevet reduceret 10 til ca. 900 bp. Det er muligt, at genet eller generne, som faktisk meddeler en Par+-fænotype, er endnu mindre.

Et alvorligt problem ved konstruktion af hybridplasmider med en Par+-fænotype har været mangelen på hurtige og enkle metoder til screening for denne fænotype. Sædvanligvis kan de korrekte hybridplasmider 15 identificeres ved Par+-fænotypen, der medfører høj stabilitet af plasmidet ved vækst af plasmidet uden selektionstryk. Denne type screening er imidlertid langvarig og er under alle omstændigheder kun relevant, hvis stamplasmidet nedarves ustabilt. Alternative screeningsmetoder er nu blevet udviklet som beskrevet nedenfor.

20 a) Screening for indsætning af ParA+-fragmenter

Hvis to forskellige plasmider (fra hver sin inkompatibilitetsgruppe), der begge bærer par A+-området, findes i samme celle, fordriver de hinanden med en vis frekvens (inkompatibilitet), sandsynligvis fordi de konkurrerer om cellens fordelingsmekanismer. Denne type par-25 medieret inkompatibilitetsfænotype kan udnyttes til screening for par-hybrider. Et ParA+-plasmid kan fx transformeres til en Alac E. coli-stamme (fx CSH50), der indeholder et andet plasmid, som bærer lac-generne og parA+-området. Normalt vil det indkommende plasmid udøve par+-medieret inkompatibilitet mod det ParA+-plasmid, som 30 allerede findes i cellen. Som følge af Lac+-fænotypen hos det plasmid, der allerede findes i cellen, detekteres en sådan inkompatibilitet let, hvis transformanter udvælges på grundlag af en resistens -markør, som kun findes på det indkommende plasmid, hvorimod tilstedeværelsen eller fraværelsen af det plasmid, der allerede findes i 35 cellen, iagttages på indikatorsubstrater såsom McConkey-lactosepla- DK 167883 B1 12 der. Replikaudpladning af kolonier fra sådanne plader til nye tilsvarende plader afslører selv lave niveauer af fordrivning af det plasmid, som allerede findes i cellen, i form af farveløse kolonier, som viser forekomsten af Lac -celler. En yderligere stabilitetstest eller 5 mere omfattende inkompatibilitetstest kan være påkrævet for at teste egenskaberne af potentielle parA+-hybridplasmider. Herved er det muligt - ved at anvende den korrekte (kompatible eller måske netop inkompatible) kombination af indkommende og allerede foreliggende plasmider - hurtigt at screene for indsætning af Inc+ (Par+)-frag-10 menter i et hvilket som helst plasmid, hvad enten det er ustabilt eller stabilt.

b) Screening for indsætning af parB+-fragmenter

Eftersom det også er blevet påvist, at to urelaterede plasmider, der begge bærer parB+-området, er inkompatible med hinanden, kan samme 15 screenings strategi som den, der er beskrevet for konstruktionen af parå+-hybrider, anvendes til konstruktioner af parB+-hybrider.

c) Screening for indsætning af parA+, B+-fragmenter

Udover at kunne fordrive både parA+- og parB+-hybridplasmider i henhold til ovenstående beskrivelser muliggør EcoRL-A-fragmentet med 20 Tn5-indsætningen en direkte udvælgelse (Km®-) for plasmider, som bærer parA+, parB+-fragmentet. På trods af fragmentets store størrelse selekteres der således let for selv meget få hybrider. Et mindre DNA-fragment, som omfatter begge par+-områder, udøver naturligvis også inkompatibilitet mod både parA+- og parB+-plasmider.

25 Opfindelsen belyses nærmere under henvisning til tegningen, hvor fig. 1-5 og 7-17 viser restriktionskort over de i eksemplerne beskrevne plasmider, fig. 6 viser et detaljeret kort (ikke tegnet i samme målestok) af Psti-D-fragmentet fra Ri, og 30 fig. 18 viser stabilitetskurver for forskellige typer replikon bærende forskellige par-områder sammenlignet med Par -replikons.

DK 167883 Bl 13 I fig. 1-5 og 7-17 vises lineære restriktionskort over de i eksemplerne beskrevne plasmider, hvor plasmidernes fænotyper og genotyper er vist oven for den vandrette linje, som betegner stamplasmidet.

Således betegner parA ét af de områder af plasmid RI, som sikrer 5 bevaring af plasmidet, parB betegner det andet område af plasmid Ri, som sikrer bevaring af plasmidet; icel betegner et gen, som medierer immunitet over for colicin El; ori eller oriV betegner initierings-stedet for plasmidreplikation; bla betegner et gen, som indkoder ampicillinresistens; IR betegner en inverteret gentagen struktur på 10 Tn5; Km®· betegner kanamycinresistens; Cm® betegner chloramphenicol-resistens; Ap® betegner ampicillinresistens; Te® betegner tetracy-clinresistens; repA betegner et gen, der koder for et protein, som kræves for Rl-replikation; lacZ, lacY og lacA betegner det indsatte lac-operon, hvoraf lacZ koder for /3-galactosidase, lacY koder for 15 permease, og lacA koder for transacetylase; repA-lacZ' betegner en fusion mellem repA- og lacZ-generne; copB betegner et gen, der koder for et polypeptid, som represserer transkription fra repA-promotoren (på RI-plasmider); copA betegner et gen, der koder for et RNA-mole-kyle, som inhiberer translation af RepA-RNA; dggy betegner et gen, 20 som koder for en temperaturfølsom λ-repressor, som kontrollerer λΡ^-promotoraktivitet; Pdeo betegner deo-promotoren. Pilen viser tran-skriptionsretningen, og "trekanterne" betegner indsætninger af DNA.

De sorte områder og de hvide områder betegner indsatte gener; den stiplede linje betegner en sletning.

25 Under den vandrette linje er stederne for restriktionsenzymer vist, hvor E betegner PcoRl; P betegner PstI, Bj^ betegner BamHI undtagen i fig. 1 og 5, hvor det uden for Tn5 DNA betegner Ball; Hp betegner tfpal; Ev betegner PcoRV; B2 betegner BglII; betegner Sall; H3 betegner Rindlll; og C betegner Clal.

30 I fig. 6 er PstI-D-fragmentet blevet kortlagt yderligere; tallene over den vandrette linje viser antallet af basepar mellem restriktionsstederne. Under den vandrette linje er stederne for restriktionsenzymer vist, hvor betegner Rsal; P betegner PstI; og betegner Hpal.

DK 167883 B1 14 I fig- 18 vises stabilitetskurver for Ri-, pl5- og pBR322-derivater, som er konstrueret og testet i eksemplerne. Hver kurve betegner gennemsnittet for mindst to væskekulturer, som er overvåget i over 100 generationer. Det fremgår af figuren, at plasmider, som indehol-5 der både parA og parB nedarves yderst stabilt, hvilket også er tilfældet med plasmider, som kun indeholder parB, og mini-Rl-plasmider, som kun er stabiliseret med parA.

Det fremgår af kurverne for Par -plasmider, at frekvensen af plasmid-bærende celler indledningsvis reduceres eksponentielt som forventet 10 på grund af en konstant tabshyppighed. I senere stadier synes frekvensen for plasmidbærende celler at reduceres hurtigere (vist med de fuldt optrukne linjer) som følge af en lidt hurtigere væksthastighed for plasmidfri celler. Den stiplede linje viser kurven, som er korrigeret med hensyn til denne større væksthastighed for at vise den 15 virkelige tabsfrekvens.

I modsætning hertil går plasmider, som fænotypisk er Par , tabt med en frekvens på 1,5 x 10'^/celle/generation for RI-plasmider, 1 x 10" Vcelle/generation for pl5-plasmider og 6 x lO’^/celle/generation for visse pBR322-plasmider, hvorpå der er beskrevet et eksempel i ek-20 sempel 3.3. Tabsfrekvenserne for pl5 Par - og pBR322 Par -derivater er faktisk overraskende høje i betragtning af disse vektorers kopital. Kopitallet af pl5 er fx i størrelsesordenen 15-20 pr. celle, hvorfor der kan forudsiges en tabshyppighed på 10"^/celle/generation, hvis man antager, at plasmiderne fordeles binomialt. Den iagttagne 25 høje tabshyppighed kan imidlertid let forklares ved, at pl5-replikons danner recA-afhængige sammenhængende molekyler, antageligv'is på grund af mangelen på en ΙοχΡ-lignende adskillelsesfunktion (Austin et al.,

Cell 25, 1981, s. 729-736). Også pBR322-derivater vides at danne sammenhængende molekyler, og når kopitallet daler på grund af fx 30 store klonede fragmenter, følger en væsentlig ustabilitet.

MATERIALER OG METODER

Den anvendte stamme af Escherichia coli K-12 var CSH50 (Δ pro-lac, rpsL; jfr. J. Miller, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring DK 167883 B1 15

Harbor, New York, 1972). Der anvendtes flere plasmider og bacterio-phager (tabel 2).

De anvendte forsøgsteknikker var standardteknikker, som anvendes inden for området mikrobiel genetik (J. Miller, Experiments in Mole 5 cular Genetics, Cold Spring Harbor, New York, 1972) og genetisk manipulation (Davis, Botstein og Roth, A Manual for Genetic Engi neering; Advanced Bacterial Genetics, Cold Spring Harbor, New York, 1980).

Alle celler blev dyrket i LB-medium (Bertani, J. Bact. 62, 1951, 10 s. 293) med 0,2% glucose og 1 /zg/ml thiamin eller A+B-minimalmedium (Clark og Måløe, J. Mol. Biol. 23, 1967, s. 99) beriget med 0,2% glucose og 1% casaminosyrer. De anvendte plader var LA-plader indeholdende LB-medium og 1,5% agar.

McConkey-lactoseindikatorplader blev fremstillet som anbefalet af fa-15 brikanten (Difco), og X-gal-plader blev fremstillet ved at tilsætte 20-40 /zg/ml 5-brom-4-chlorindolyl-/?-D-galactosid til A+B-minimal-medium beriget med 0,2% glucose og 1 Mg/ml thiamin.

Fysisk-kemiske metoder

Der blev fremstillet klarede lysater i henhold til den af Clewell og 20 Helinski, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 62, 1969, s. 1159-1166, beskrevne metode.

Fremstilling i lille målestok af plasmid DNA blev udført i henhold til den af Birnboim et al., Nucl. Acids Res. 7, 1979. s. 1513-1523, beskrevne metode.

25 Fremstilling i stor målestok og analyse af plasmid DNA blev udført under anvendelse af "dye buoyant" densitetsgradientcentrifugering i henhold til Stougaard og Molin, Anal. Biochem. 118, 1981, s. 181.

Der blev udført polyacrylamidgelelektroforese og agarosegelelektro-forese af DNA-præparaterne i det væsentlige som beskrevet af Molin og 30 Nordstrom, Methods in Plasmid Biology, Odense Universitet, 1982.

DK 167883 B1 16

Restriktionsendonukleaserne blev anvendt i overensstemmelse med de forskrifter, der er givet af fabrikanten (Boehringer, Mannheim eller Biolabs, New England), ved 37eC. Dobbelt- og tripeldigerering blev udført ved at starte med det enzym, der krævede den laveste salt-5 koncentration, og derefter justere med yderligere puffer, før det næste enzym blev tilsat.

Behandling med exonukleasen Bal31 blev udført som følger: 0,1 enhed Bal31 blev sat til 50 μg lineært DNA, og der blev udtaget prøver ved 1', 2', 4', 8', 16', 32' og 60' til 60 mM EDTA, ekstraheret med 10 phenol, ethanoludfældet og gensuspenderet i 20 μΐ TE-puffer. Halvdelen af de 20 μΐ blev digereret med det passende restriktionsenzym, der blev underkastet agarosegelelektroforese for at bestemme den gennemsnitlige størrelse af DNA-sletningerne. Til den anden halvdel sattes den passende linker, og blandingen blev ligateret i 48 timer 15 med et overskud af T4 DNA-ligase.

Ligation af kløvet plasmid DNA blev udført som anbefalet af fabrikanten med undtagelse af stumpendeligation, hvor der tilsattes et overskud af T4 DNA-ligase og ATP.

Mikrobiologiske metoder 20 Fordelingstest I: Konstruktionen af Lac+-vektorer gjorde det muligt at bestemme Par+-fænotypen af et plasmid ved simpelt hen at udstryge på ikke-selektive McConkey-lactoseplader eller X-gal-plader. Bakterier (Δ lac), som indeholder disse plasmider, medierer en Lac+-fænotype, der let iagttages som farvede kolonier på indikatorpla-25 derne, hvorimod plasmidfri celler har en Lac -fænotype og optræder som farveløse kolonier.

Fordelingstest II (anvendt for Lac -plasmider): En koloni fra en selektiv plade (en plade indeholdende et antibiotikum) blev udstrøget på en anden selektiv plade. Fra denne plade blev én koloni udstrøget 30 på en LA-plade således, at der blev dannet enkeltkolonier. Fra LA-pladen blev ca. 10 kolonier suspenderet i 1 ml 0,9% NaCl til en fortynding på henholdsvis 10"^ og 10"-*. 0,1 ml af 10'^- og 10"-*- DK 167883 B1 17 fortyndingerne blev udstrøget på IA-plader. Ud fra disse plader blev 50 koloniers resistensmønster (200 kolonier, hvis der forventes en svag ustabilitet) testet på de hensigtsmæssige selektive plader. Tabsfrekvensen (LF- værdien) beregnes derefter på grundlag af formlen 5 LF = 1 - (u) ^/27) hvor v står for frekvensen af plasmidbærende celler og under den forudsætning, at én koloni vokser i 27 generationer. Inherent i denne metode er en stor statistisk fluktuation.

Fordelingstest III: Kvantitative målinger af stabiliteten af Lac+- og 10 Lac -plasmider. En hel koloni blev taget fra en selektiv plade og re-suspenderet i 1 ml 0,9% NaCl til en koncentration på 10® celler/ml.

2 x 0,1 ml af 10'3-fortyndingen blev anvendt til at pode 2 x 10 ml LB-medium, og podningen blev udført ved 30°C under omrystning. Ved en celledensitet på ca. 5 x 10® celler/ml blev kulturerne fortyndet 10^ 15 og 105 gange. 0,1 ml af 104-fortyndingen (5 x 103 celler) blev anvendt til at pode 10 ml frisk LB-medium, og 0,4 ml af 103-fortyndingen blev udstrøget på McConkey-lactoseplader, og pladerne blev podet ved 30°C natten over. Fortyndingen fra 5 x 10®/ml til 20 5 x 102/ml svarer til 20 generationers vækst (2 ), således at foran- 20 dringen i frekvensen af plasmidbærende celler fra én fortynding til den næste svarer til den forandring, som forekommer i løbet af 20 generationers vækst. Mere generelt kan LF-værdien beregnes som følger: = (1 - LF)®1 og v2 = (1 - LF)§2 25 hvor v^ og 1/2 er frekvensen af plasmidbærende celler efter henholdsvis g^ og g2 generationer, og LF er tabsfrekvensen pr. celle pr. generation. Heraf følger, at j/j/j/2 = (1 - LF)SrS2

°S

30 LF = 1 - (1^/1/3) (1/(Sl'S2)) DK 167883 B1 18

Ved at anvende denne formel undgås fejl som følge af fluktuationer i antallet af podende celler på tidspunktet 0. En mere hensigtsmæssig opskrivning af denne formel er LF = In(i/1/i/2)/(g2-gl) 5 Inkompatibilitetstest

Der blev screenet for plasmider, som formodedes at bære et indsat par-område ved at udnytte den iagttagelse, at to i øvrigt kompatible replikons, der bærer samme par-område, er inkompatible med hinanden, hvilket medfører tab af ét af de to plasmider i fraværelse af se-10 lektionstryk. Testen udføres ved at transformere det plasmid, som skal testes, til en bakteriestamme, der bærer et andet plasmid, idet der udvælges for begge plasmider på dobbeltselektive plader. Efter udstrygning på en dobbeltselektiv plade (en plade indeholdende to forskellige antibiotika) blev inkompatibiliteten målt enten kvalita-15 tivt eller kvantitativt.

Til den kvalitative inkompatibilitetstest blev en koloni fra den dob-beltselektive plade udstrøget på en LA-plade til dannelse af enkeltkolonier. Omkring 10 kolonier fra denne plade blev resuspenderet i 1 ml 0,9% NaCl og fortyndet til henholdsvis 10"^ og 10"-*. 0,1 ml af 20 lO"^- og 10"-*-fortyndingerne blev udstrøget på IA-plader. Fra disse plader blev 50 kolonier (eller 200 kolonier, hvis der forventedes en svag inkompatibilitet) testet på de hensigtsmæssige selektive plader.

Hvis et Lac+-plasmid blev indbefattet i testen, blev der anvendt McConkey-lactoseindikatorplader i stedet for replikaudstrygning på 25 selektive plader. I tilfælde af Lac+-plasmider blev screeningen således udført ved at transformere formodede Par+-plasmider til en stamme, som allerede indeholdt et Par+-hybridp lasmid, der medierede en Lac+- fænotype. Plasmidinkompatibilitet og således bevis for en specifik Par+-fænotype hos det indkommende plasmid detekteres let 30 ved at screene for Lac -kolonier på McConkey-plader, hvilket viser, at det Par+-plasmid, som først fandtes i cellen, var blevet destabi-liseret. Et eksempel på denne screeningsprocedure er beskrevet i eksempel 4.

DK 167883 B1 19

Kvantitative inkompatibilitetsmålinger blev udført ved at måle tabs-frekvenserne af Lac+-plasmider efter at have etableret heteroplasmid-populationer som beskrevet ovenfor. LF-værdierne blev målt som beskrevet i afsnittet "Fordelingstest III".

5 Genetiske teknikker

Transformation af bakterier blev udført i henhold til Cohen et al.,

Proc. Natl. Åcad. Sci. USA 62, 1972, s. 2110-2114, med den modifikation, at når der forventedes en lav transformationsfrekvens, blev behandlingen af de kompetente celler med DNA på is forlænget i flere 10 timer, og cellerne blev efter varmechok igen afkølet på is i 5-30 minutter. Denne behandling forøgede signifikant transformationsfrekvensen.

Infektion med bacteriophag λ blev udført ved at dyrke 10 ml's kulturer natten over i LB-medium beriget med 0,2% maltose (for at inducere 15 malB-proteinet, som er λ-receptoren) under rystning. Cellerne blev vasket med 0,9% NaCl og resuspenderet i 2 ml 0,01 M magnesiumsulfat og inkuberet i 1 time. Fortyndinger af λ-suspensionen (10®, 10'^·, 10'2) blev fremstillet, og 0,1 ml af phagfortyndingen blev anvendt til at inficere 0,2 ml af suspensionen af sultede celler. 10®-, 10-1-20 og 10'2-fortyndingerne af infektionsblandingerne blev udstrøget på selektive plader.

Til transponering af plasmider med Tn5 (KmR), hvis kilde var phagen λ b221::Tn5, hvis fastgørelsessted var blevet slettet, således at den var ude af stand til at lysogenisere, blev der anvendt en suspension 25 af phagen til at inficere celler, som indeholdt det plasmid, til hvilket transpositionen var ønsket. Infektionen blev udført som ovenfor beskrevet, og kanamycinresistente celler blev udvalgt. Flere tusinde kanamycinresistente kolonier blev samlet, og 0,1 ml af en 10'2-fortynding deraf blev anvendt til at inokulere 100 ml LB-medium.

30 Kulturen blev dyrket natten over, og plasmid DNA blev fremstillet ud fra denne blanding af celler og anvendt til at transformere E. coli K12 stamme CSH50 til kanamycinresistens.

DK 167883 B1 20

Tabel 2

Plasmider og phager

Plasmid/phag Kilde 5 __ pKN184 Nordstrom et al., Plasmid 4, 1980, s. 322.

pSF2124 So et al., Mol. Gen. Genet. 142, 1975, s. 239- 249.

pJL99 Light & Molin, Mol. Gen. Genet. 184, 1981, s. 56- 10 61.

pGA46 An & Friesen, J. Bact. 140, 1979, s. 400-407.

pKN501 Molin et al., J. Bact. 138, 1979, s. 70-79.

pF1403-ll Konstrueret ved at indsætte AluI-Wael-fragmentet fra det basale replikon af plasmid F i Smal-15 stedet på pMC1403 (Casadaban et al., J. Bact.

143, 1980, s. 971), hvorved der dannedes en fusion mellem E-genet fra plasmid F og lacZ-genet fra pMC1403.

pHP34 Prentki et al., Gene 17, 1982, s. 189-196.

20 pMC903 Casadaban et al., J. Bact. 143, 1980, s. 971.

pKN1562 Molin et al., J. Bact. 138, 1979, s. 70-79.

pVH1424 Konstrueret af P. Valentin-Hansen ved at indsætte et Sau3A-fragment bærende deo-promotoren fra plasmid pVH17 (Valentin-Hansen et al., EMBO J., 25 1982, s. 317) i BamHI-stedet på plasmid pMC1403 (Casadaban et al., op. cit., s. 971). pSKS104 Konstrueret af M. Casadaban ved at indsætte et

FvuII-fragment indeholdende lac-promotoren og translationsindledningsområdet fra pM13mp7 (Mes-30 sing et al., Nucleic Acids Res. 9, 1981, s. 309) i Smal-stedet på pMC1403 efterfulgt af homolog rekombination mellem lacZ-segmenterne. pBR322 Bolivar et al., Gene 2, 1977, s. 95.

pMBl Betlach et al., Fed. Proc. 35, 1976, s. 2037- 35 ’ 2043.

λ b221::Tn5 D.E. Berg, "Insertion and excision of the trans- posable kanamycin resistance determinant Tn5", i DK 167883 B1 21 DNA Insertion Elements, Plasmids and Episomes, (red. A.I. Bukhari et al.).

EDA4 Dempsey og Willetts, J. Bact. 126, 1976, s. 166.

5 EKSEMPEL 1

Indsætning af Tn5 (KmR) i EcoRl-A-fragmentet fra RI

Celler af E. coli K-12 stamme CSH50 indeholdende plasmid pKN184, et plasmid, som består af plasmid pSF2124 og det 19 kb lange EcoRl-A-fragment (bærende parA- og parS-områderne) fra plasmid RI (Nordstrom 10 et al., Plasmid 4, 1980, s. 322), blev inficeret som beskrevet i MATERIALER OG METODER med en suspension af bacteriophag Ab211::Tn5.

Efter udvælgelse for kanamycinresistens på LA-plader indeholdende 200 pg/ml kanamycin blev kolonierne indsamlet og blandet. 0,1 ml af en 10"^-fortynding deraf blev anvendt til at pode 100 ml LB-medium.

15 Kulturen blev dyrket natten over, og plasmid DNA fremstillet fra kulturen blev anvendt til at transformere E. coli K-12 stamme CSH50, idet der blev udvalgt for kanamycinresistens på plader, som indeholdt 200 pg/ml kanamycin.

Herved fandtes et plasmid, pOUl, som medierer resistens over for 20 kanamycin og har en indsætning af phag DNA svarende til ca. 5 kb (5000 basepar). Plasmidet havde en molekylvægt/størrelse på 34 kb, som blev målt ved at fremstille plasmid DNA og analysere på agarose-geler, og følgende fænotype: KmR, ApR, ParA+, ParB+.

Plasmid DNA blev fremstillet ud fra pOUl, og plasmidet blev kortlagt 25 med restriktionsenzymer ved at rense plasmid DNA'et, spalte det med ét eller flere restriktionsenzymer og analysere de resulterende fragmenter ved hjælp af agarosegelelektroforese (jfr. fig. 1). Herved blev λ::Tn5-fragmentet indsat i EcoRl-A-fragmentet fra pKN184 identificeret som bærende genet kodende for kanamycinresistens, og place-30 ringen af fragmentet blev bestemt som vist i fig. i. Plasmid pOUl blev anvendt til yderligere analyse og plasmidkonstruktioner.

22

Ulv Ib/OiSJ b l

Stammen E. coli CSH50/p0Ul er deponeret i Deutsche Sammlung von Mikroorganismen, Grisebachstrasse 8, D-3400 Gottingen, der i det følgende er forkortet til DSM, under deponeringsnummeret 2712.

Deponeringen er foretaget i overensstemmelse med Budapesttraktaten.

5 EKSEMPEL 2

Konstruktion af et plasmid, som egner sig til kloning af par+-fragmenter

Plasmid pJL99 (Light & Molin, Hol. Gen. Genet. 184-, 1981, s. 56-61) bærer en fusion mellem repA-genet fra plasmid RI og lac-operonet; 10 plasmidet medierer en Lac+-fænotype. Pstl-Sall-fragmentet, som bærer repA-lac-fusionen, blev udskåret fra pJL99 og indsat i pGA46, som er et pl5-replikon (An & Friesen, J. Bact. 140, 1979, s. 400-407) til dannelse af plasmidet pJLl24. Et kort over dette plasmid er vist i fig. 2. Plasmid pJLl24 medierer også en Lac+-fænotype på McConkey-15 lactoseindikatorplader, men det viste sig, at indsætning af DNA- fragmenter med ringe eller ingen promotoraktivitet i Psti-stedet på pJLl24 interfererer med repA-promotorens aktivitet på en sådan måde, at disse hybrider ikke længere viser sig som Lac+ på McConkey-lactoseindikatorplader. På de mere følsomme X-gal-indikatorplader er 20 transformerede kolonier imidlertid Lac+, hvilket viser, at udtryk -kelse af ^-galactosidase er nedsat, men ikke fuldstændigt undertrykt i hybriderne. pJL124 kan derfor anvendes til at klone Psfcl-fragmen-ter, eftersom hybridplasmider let detekteres på McConkey-lactoseindikatorplader som Lac - transf ormanter. Eftersom pJL124 er et pl5-25 replikon og således ustabilt, hvilket let detekteres, da celler, hvorfra plasmidet er gået tabt, danner farveløse kolonier på lactoseindikatorplader uden selektionstryk, kan der endvidere på X-galplader screenes for Psfcl- fragmenter, som er i stand til at stabilisere pJL124.

DK 167883 B1 23

Programmet for isolering af Psti-par+-fragmenter består således af følgende trin: 1) Ligation af pJL124.kløvet med PstI og Psti-fragmenter fra et andet plasmid.

5 2) Transformation til CSH50 med udstrygning på McConkey-lactose- plader indeholdende chloramphenicol.

3) Testning af kloner, der viser sig som Lac på McConkey-lac-toseplader, for stabil nedarvning af Lac+-fænotypen på X-gal-indikatorplader (jfr. MATERIALER OG METODER).

10 Stammen E. coli CSH50/pJL124 er deponeret i DSM under deponerings-nummeret 2760.

Deponeringen er foretaget i overensstemmelse med Budapesttraktaten. EKSEMPEL 3

Stabilisering af ustabile plasmider med parA- og parB-områderne 15 1. Mini-Ri replikon

Plasmid p0U71 (DSM deponeringsnummer 2471), som er et runaway-repli-kationsderivat af plasmid pKN1562, som omfatter plasmid Ri's basale replikon, λΡ^-promotoren og clg^-repressorgenet fra phag EDX4, genet kodende for /3-lactamase fra Tn3-transposonen og et unikt EcoRl-sted 20 (en detaljeret beskrivelse af konstruktionen af pOU71 findes i nærværende ansøgers samtidigt indleverede ansøgning med benævnelsen "Plasmider med betinget ukontrolleret replikationsopførsel", der er indleveret samme dag som nærværende ansøgning), blev kløvet med EcoRl, og EcoRl-A: :Tn5-fragmentet fra pOUl (jfr. eksempel 1) blev indsat 25 efterfulgt af ligation og transformation af E. coli stamme CSH50, idet kanamycinresistente celler blev udvalgt på LA-plader, som indeholdt 50 pg/ml kanamycin.

Transformanterne blev screenet for pOU71's runaway-replikationsfæ-notype ved udstrygning på LA-plader indeholdende 50 pg/ml kanamycin DK 167883 B1 24 og inkubation ved 42°C. Celler, som indeholder runaway-replikations-plasmider, ophører til sidst med at vokse under disse betingelser.

Herved blev plasmid pOU71-184 identificeret, hvilket plasmid havde en størrelse på 25,5 kb og følgende fænotype: ParA+, ParB+, Ap®, Km®·.

5 Plasmidet blev kortlagt med restriktionsenzymer som beskrevet i eksempel 1 (jfr. fig. 3). Det fremgår af restriktionskortet, at PcoRl-A::Tn5-fragmentet er blevet indsat korrekt i EcoRl-stedet på pOU71.

Celler, som indeholdt plasmidet, blev dyrket på LA-plader i 100 generationer uden selektionstryk, dvs. uden at blive dyrket på plader in-10 deholdende et antibiotikum; ved bestemmelse i henhold til den i MATERIALER OG METODER beskrevne procedure (fordelingstest II) iagttoges det ikke, at cellerne mister plasmidet, hvorimod pOU71 gik tabt fra celler, som blev dyrket under tilsvarende betingelser, med en frekvens på 1% pr. generation. Det blev således bestemt, at pOU71-184 15 nedarves stabilt med en tabsfrekvens på ca. 10'^/celle/generation.

Stammen E. coli CSH50/pOU71-184 er deponeret i DSM under deponeringsnummeret 2763.

Deponeringen er foretaget i overensstemmelse med Budapesttraktaten.

2. pl5-replikon 20 Plasmid pJLl24 (jfr. eksempel 2), som er et Par pl5-replikon, blev spaltet med restriktionsenzymet Pst I og blandet med plasmid pKN184 (jfr. eksempel 1), som var blevet delvis kløvet med PstI, efterfulgt af ligation. Ligationsblandingen blev transformeret til E. coli stamme CSH50, idet der blev udvalgt for chloramphenicolresistens på 25 McConkey-lactoseindikatorplader indeholdende 50 Mg/ml chloramphenicol.

Cellerne indeholdende pJL124, som bar ét eller flere Pstl-fragmenter (jfr. eksempel 2), blev testet for stabil nedarvning af Lac+-fænotypen på X-gal-plader. Et af de stabilt nedarvede plasmider viste sig 30 at indeholde både parA- og parB - området. Dette plasmid, pOU2, har en størrelse på 24 kb og følgende fænotype: Cm®, Lac+, ParA+, ParB+.

DK 167883 B1 25

Plasmidet blev kortlagt med restriktionsenzymer som beskrevet i eksempel 1 (jfr. fig. 4). Det fremgår af restriktionskortet, at et PstI- fragment er blevet slettet fra PcoRl-A-fragmentet.

Cellerne indeholdende plasmidet blev dyrket på X-gal-plader i 100 ge-5 nerationer uden selektionstryk, og det blev bestemt, at pOU2 nedarves stabilt med en LF-værdi på mindre end 10'^/celle/generation i modsætning til pJL124, som gik tabt fra cellerne med en frekvens på 0,5-1¾/celle/generation.

Stammen E. coli CSH50/p0U2 er deponeret i DSM under deponeringsnum-10 meret 2713.

Deponeringen er foretaget i overensstemmelse med Budapesttraktaten.

3. pMBl-replikon

Plasmid pF1403-ll (jfr. tabel 2) er et ustabilt nedarvet derivat af pBR322 (et pMBl-r ep likon), som bærer en fusion mellem et gen fra 15 plasmid F og lac-operonet, Plasmidet medierer en Ap^·, Lac+-fænotype. .EcoRl-A::Tn5-fragmentet fra plasmid pOUl (eksempel 1) blev indsat i det unikke i?coRl-sted på plasmid pF1403-ll umiddelbart oven for genfusionen efterfulgt af ligation og transformation til E. coli stamme CSH50, idet der blev udvalgt for Ap®· på plader, som indeholdt 20 50 pg/ml ampicillin, Km^· på plader indeholdende 50 /xg/ml kanamycin og

Lac+ på McConkey-lactoseindikatorplader.

Det resulterende plasmid pOUlO blev kortlagt med restriktionsenzymer som beskrevet i eksempel 1 (jfr. fig. 5), og indsætningen af EcoRl-A::Tn5-fragmentet blev verificeret. Plasmidet har en størrelse på 25 34 kb og følgende fænotype: Km^, Ap^, Lac+, ParA+, ParB+.

Plasmidet blev testet for stabil nedarvning som beskrevet i eksempel 3.1. Det blev således påvist, at pOUlO nedarves stabilt med en LF-værdi på mindre end 10'^/celle/generation, hvorimod pF1403-ll gik

O

tabt fra cellerne med en frekvens på 6 x 10'J pr. generation.

DK 167883 B1 26

Stammen E. coli CSH50/pOU10 er deponeret i DSM under deponeringsnummeret Ulk.

Deponeringen er foretaget i overensstemmelse med Budapesttraktaten. EKSEMPEL 4 5 Kloning af Psti-fragmenter fra EcoRl-A-fragmentet, som stabiliserer pJL124

RcoRl-A-fragmentet blev kløvet med et antal restriktionsenzymer, og det resulterende fysiske kort er vist i fig. 1. Det fremgår af denne figur, at fragmentet består af mange Psti-fragmenter. For at reducere 10 størrelsen af det fragment, der medierer Par+-fænotypen, forsøgte man at subklone par-områder, der eventuelt blev båret på ét eller flere af Psti-fragmenterne, i screeningsvektoren pJL124 (jfr. eksempel 2). Analyse af flere kloner med den korrekte fænotype - Lac på McConkey-lactoseplader og stabil nedarvning i fraværelse af selektionstryk -15 viste, at Psti-D-fragmentet (jfr. fig. i) medierede denne fænotype.

Intet andet enkelt Psti-fragment var i stand til at stabilisere pJL124. Det område, der var ansvarligt for stabilisering af pJL124, og som var placeret inde i det 1,8 kb lange Ps ti-fragment, blev betegnet parB.

20 For at analysere Psti-D-fragmentet yderligere, blev fragmentet klonet i det unikke Pstl-sted i bla-genet på pBR322, hvorved dannedes pOU93 (jfr. fig. 7; plasmidet er deponeret i DSM under deponeringsnummeret 2724). Restriktionskortlægning af dette plasmid viste, at Pstl-D-fragmentet indeholder tre Rsal-steder (jfr. fig. 6). Rsal danner 25 stumpe ender, og det 900 bp lange Rsal-fragment blev derfor indsat i Smal-stedet på plasmid pHP34 (Prentki et al., Gene 17, 1982, s. 189-196) på følgende måde. pOU93 blev kløvet med Rsal og blandet med pHP34, der var blevet kløvet med Smal, efterfulgt af ligation. Ligationsblandingen blev transformeret til E. coli stamme CSH50, som 30 allerede indeholdt plasmid pOU94 (et pl5-derivat, som fænotypisk er Lac+ og ParB+; jfr. fig. 8; plasmidet er deponeret i DSM under depo- DK 167883 B1 27 neringsnummeret 2725), idet der blev udvalgt for ampicillinresistens på plader indeholdende 50 /zg/ml ampicillin.

Som følge af den inkompatibilitet, som udtrykkes af parB+-områder, som bæres på forskellige plasmider, går pOU94 tabt, når et andet 5 plasmid, som fænotypisk er ParB+, indføres i E. coli-cellerne, hvorved det er muligt at udvælge for korrekte indsætninger og transfor-manter ved at stryge cellerne ud på McConkey-plader og screene for farveløse kolonier (Lac ). Et sådant inkompatibelt plasmid pHP34-derivat, der viste sig at indeholde det 900 bp lange Rsal-fragment, 10 fik betegnelsen pOU13. Plasmidet har en størrelse på 5,3 kb og følgende fænotype: TcR, ApR, ParB+.

Plasmidet blev kortlagt med restriktionsenzymer som beskrevet i eksempel 1 (jfr. fig. 9). Kortlægningen viste, at Rsal - fragmentet var blevet omdannet til et 900 bp langt EcoRl - fragment, idet Smal-stedet 15 på pHP34 er flankeret af to EcoRl-steder.

Stammen £. coli CSH50/pOU13 er deponeret i DSM under deponerings-nummeret 2716.

Deponeringen er foretaget i overensstemmelse med Budapesttraktaten.

Det 900 bp lange £coRl - fragment fra pOU13 blev indsat i EcoRl-stedet 20 på pOUlOl, som er et ApR, CmR runaway mini-Rl-derivat (en detaljeret beskrivelse af konstruktionen af pOUlOl findes i nærværende ansøgers samtidigt indleverede ansøgning med titlen "Plasmider med betinget ukontrolleret replikationsopførsel", der er indleveret samme dag som nærværende ansøgning), med et unikt £coRl-sted i cat-genet (genet, 25 der koder for CmR), til dannelse af plasmid pOU14, som har en størrelse på 8,2 kb og følgende fænotype: Cm^, ApR, ParB+.

Plasmidet blev kc . tlagt med restriktionsenzymer som beskrevet i eksempel 1 (jfr. fig. 10).

Plasmidet blev testet for stabil nedarvning som beskrevet i eksempel 30 3.1. Det blev således påvist, at ved 30°C nedarves pQU14 stabilt med DK 167883 Bl 28 en LF-værdi på mindre end 1 x ICT^/celle/generation, hvorimod pOUlOl går tabt fra cellerne med en frekvens på 1% pr. generation.

Stammen E. coli CSH50/pOU14 er deponeret i DSM under deponeringsnummeret 2717.

5 Deponeringen er foretaget i overensstemmelse med Budapesttraktaten. EKSEMPEL 5

Stabilisering af mini-Rl plasmider med parB- fragmentet

Plasmid pOU90, som er et runaway-replikationsderivat af pKN1562, som omfatter plasmid RI's basale replikon, AP^-promotoren og clg^-10 repressoren fra phag EDA4, genet kodende for β-lactamase fra Tn3- transposonen og fcoRl-A-fragmentet fra pKN184 (en detaljeret beskrivelse af konstruktionen af p0U90 findes i nærværende ansøgers samtidigt indleverede ansøgning med benævnelsen "Plasmider med betinget ukontrolleret replikationsopførsel", der er indleveret samme dag som 15 nærværende ansøgning), i hvilket derivat FcoRl-A-fragmentet fra pKN184 er blevet indsat, blev kløvet med Sall og ligateret til dannelse af plasmid pOU61. Plasmidet blev transformeret til E. coli stamme CSH50, idet der blev udvalgt for Lac fænotype på McConkey-plader.

20 pOU61 blev kortlagt med restriktionsenzymer som beskrevet i eksempel 1 (jfr. fig. 11). Af restriktionskortet fremgår det, at pOU61 bærer den 3,6 kb lange højre ende af EcoRl-A-fragmentet indeholdende parB-området. Plasmidet har en størrelse på 10 kb og følgende fænotype:

ParB+, ApR, Lac . Plasmidet blev testet for stabil nedarvning som 25 beskrevet i eksempel 3.1. Det blev således påvist, at pOU61 nedarves stabilt med en LF-værdi på mindre end 1 x 10‘^/celle/generation.

Stammen E. coli CSH50/pOU61 er deponeret i DSM under deponerings-nummeret 2723.

Deponeringen er foretaget i overensstemmelse med Budapesttraktaten.

DK 167883 B1 29 EKSEMPEL 6

Stabilisering af plasmid pF1403-ll med parB-fragmentet

Plasmid pOUl (jfr. eksempel 1) blev kløvet med Sall og blandet med plasmid pF1403-ll, som også var blevet kløvet med Sall efterfulgt af 5 ligation og transformation til E. coli stamme CSH50, idet der blev udvalgt for ampicillinresistente kolonier på McConkey-lactoseindika-torplader. Nogle af disse Lac+-kloner blev screenet for stabil ned-arvning af Lac+-fænotypen på McConkey-plader som beskrevet i MATERIALER OG METODER.

10 De stabilt nedarvede plasmider blev kortlagt med restriktionsenzymer som beskrevet i eksempel 1 (jfr. fig. 12). Det fremgår af restriktionskortet, at de bærer Sall-fragmentet fra pOUl, hvorpå parB-områ-det er placeret. Plasmidet bestående af pF1403-ll og SalI-fragmentet fra pOUl fik betegnelsen pOU12. Det havde en størrelse på 16 kb og 15 følgende fænotype: ParB+, Lac+, Ap^. pOU12 blev nedarvet stabilt med en LF-værdi på mindre end 5 x 10'^/celle/generation.

Stammen E. coli CSH50/pOU12 er deponeret i DSM under deponerings-nummeret 2715.

Deponeringen er foretaget i overensstemmelse med Budapesttraktaten.

20 EKSEMPEL 7

Stabilisering af pl5-plasmider med parA-fragmentet

Plasmid pMC903 (Casadaban et al., J. Bact. 143, 1980, s. 971) blev kløvet med EcoRL, og FcoRl-fragmentet fra plasmid pOU43 (jfr. fig.

13; DSM deponeringsnummer 2720) bærende parå-området blev indsat 25 efterfulgt af ligation og transformation til E. coli stamme CSH50.

Det resulterende plasmid fik betegnelsen pOU45 og havde en størrelse på 13,4 kb og følgende fænotype: ParA+, Lac , Ap®·, Km^·.

30 UK Tb/bbJ b l

Plasmidet blev kortlagt med restriktionsenzymer som beskrevet i eksempel 1 (jfr. fig. 14). Af restriktionskortet fremgår det, at parA-området er blevet indsat i lac-operonet, som derved inaktiveres.

Da plasmidet blev testet for stabilitet som beskrevet i MATERIALER OG 5 METODER, viste det sig, at det blev nedarvet stabilt med en LF-værdi på 8 x 10'^/celle/generation, hvorimod pMC903 har en LF-værdi på 1%/celle/generation.

Stammen E. coli CSH50/pOU45 er deponeret i DSM under deponeringsnummeret 2721.

10 Deponeringen er foretaget i overensstemmelse med Budapesttraktaten. EKSEMPEL 8

Stabilisering af mini-Rl plasmider med parA-området £ coRl - fragmentet fra pOU43 blev indsat i et mini-Rl plasmid, pOU82 (DSM deponeringsnummer 2482), der omfatter plasmid RI's basale re-15 plikon, λΡ^-promotoren og cl-repressorgenet fra phag EDA4, genet, som koder for /3-lactamase, fra Tn3-transposonen, deo-promotoren og den aminoterminale ende af lacZ-genet fra pVH1424, og resten af lac-operonet fra pSKS104 (en detaljeret beskrivelse af konstruktionen af pOU82 findes i nærværende ansøgers samtidigt indleverede ansøgning 20 med benævnelsen "Plasmider med betinget ukontrolleret replikation-sopførsel", som er indleveret samme dag som nærværende ansøgning).

Plasmid pOU82 medierer Ap®· og Lac+-fænotyperne og har et unikt ÆcoRl-sted, som er anvendeligt til kloning af £coRl-fragmenter. Dette plasmid går tabt med en frekvens på 1% pr. generation i fraværelse af 25 selektionstryk.

Et plasmid, i hvilket det 2,4 kb lange £coRl-fragment var blevet indsat i én orientering, fik betegnelsen p0U47. Plasmidet havde en størrelse på 14 kb og følgende fænotype: ParA+, Lac+, Ap®\ DK 167883 B1 31 pOU47 blev kortlagt med restriktionsenzymer som beskrevet i eksempel 1 (jfr. fig. 15).

Stammen E. coli CSH50/pOU47 er deponeret i DSM under deponerings-nummeret 2722.

5 Deponeringen er foretaget i overensstemmelse med Budapesttraktaten.

EcoRl-fragmentet, der bar parA-området, blev yderligere reduceret med 400 bp ved hjælp af exonukleasen Bal31; sletningsproceduren blev udført som beskrevet i MATERIALER OG METODER under anvendelse af det unikke BamHI-sted på p0U47. Det konstruerede plasmid fik betegnelsen 10 p0U472. Plasmidet havde en størrelse på 13 kb og følgende fænotype:

ParA+, Lac+, Ap®·.

pOU472 blev kortlagt med restriktionsenzymer som beskrevet i eksempel 1 (jfr. fig. 16). Det fremgår af restriktionskortet, at p0U472 bærer det 2,0 kb lange EcoRl-fragment, som genereres ved BaI31-sletningen.

15 Da plasmidet blev testet for stabilitet som beskrevet i MATERIALER OG METODER, viste det sig at blive nedarvet stabilt, hvilket betyder, at hele parA-området er indeholdt i det 2,0 kb lange EcoRl-fragment.

Stammen E, coli CSH50/pOU472 er deponeret i DSM under deponeringsnummeret 2726.

20 Deponeringen er foretaget i overensstemmelse med Budapesttraktaten. EKSEMPEL 9

Konstruktion af et mini-Rl plasmid bærende parA-området

Plasmid pOU90 (jfr. eksempel 5) blev spaltet med BamHI og delvis med Sau3A for at slette en del af EcoRl-A-fragmentet, idet de 6 kb, der 25 sidder yderst til venstre, blev bevaret, efterfulgt af ligation. Det resulterende plasmid pOU91 blev transformeret til E. coli stamme GSH50. pOTJ91 har en størrelse på 18,75 kb og følgende fænotype: Par+, DK 167883 B1 32

ApR, Lac+. Plasmidet blev kortlagt med restriktionsenzymer som beskrevet i eksempel 1 (jfr. fig. 17).

Plasmidstabilitet blev bestemt ved at dyrke celler, som indeholdt pOU91 (og som kontrol celler, der indeholdt pOU82), på McConkey-5 plader uden selektionstryk ved 30°C i 25 generationer; de celler, som var transformeret med pOU91, dannede røde kolonier (Lac+), hvorimod celler, der var transformeret med pOU82, dannede både røde og hvide kolonier, hvilket viste, at pOU82 under den selektionsfri periode var gået tabt fra nogle af cellerne.

10 Stammen E. coli CSH/pOU91 er deponeret i DSM under deponeringsnummeret 2483.

Deponeringen er foretaget i overensstemmelse med Budapest traktaten. EKSEMPEL 10

Konstruktion af et parA+, parB+ mini-Ri-plasmid 15 Plasmid pOU82 (jfr. eksempel 8) kløves med EcoRl, og EcoRl - fragmentet fra pOU43 (jfr. eksempel 7 og fig. 13) bærende parA-området indsættes. Fra dette EcoRl-fragment slettes de 500 bp, som sidder yderst til venstre, herunder ét EcoRl-sted, ved hjælp af exonukleasen BaI31.

I dette plasmids unikke EcoRl-sted sættes EcoRl - fragmentet fra p0U13 20 (jfr. eksempel 4 og fig. 9). Det resulterende plasmid, som medierer en ParA+-, ParB+-fænotype, kan derefter transformeres til E. coli stamme CSH50, som allerede bærer plasmid pOU94, og screenes for i det væsentlige som beskrevet i eksempel 4 med undtagelse af, at p0U82 derivatet medierer en svag Lac+-fænotype, hvilket betyder, at kolo-25 nier af celler, som indeholder dette plasmid, kun vil være røde i centrum og farveløse i kanten, når de dyrkes på McConkey-lactose-indikatorplader.

Claims (27)

1. Plasmid, der replikerer i gram-negative bakterier, kendetegnet ved, at det bærer et eller flere indsatte gener, som ikke naturligt er forbundet med plasmidet, og som er stabiliseret ved et indsat DNA-fragment, som er kortere end 19 kb, hvilket DNA-fragment omfatter den plasmidstabiliserende DNA-sekvens 20 RI par-område A, den plasmidstabiliserende DNA-sekvens RI par-område B eller både RI par-område A og RI par-område B.

2. Plasmid ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det indsatte DNA-fragment omfatter RI par region A og RI par region B og har en længde, der ikke overstiger 25 6 kb, især ikke 4 kb, navnlig ikke 3 kb.

3. Et plasmid ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det indsatte DNA-fragment omfatter RI par-område A og har en længde, der ikke overstiger 4 kb, især ikke 2,5 kb, navnlig ikke 2 kb. DK 167883 B1 34

4. Et plasmid ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det indsatte DNA-fragment omfatter RI par-område B og har en længde, der ikke overstiger 2 kb, især ikke overstiger 1,5 kb, navnlig ikke 1 kb.

5. Et plasmid ifølge hvilket som helst af kravene 1-4, kendetegnet ved, at det yderligere omfatter et gen, der koder for antibiotikaresistens.

6. Et plasmid ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det er et pl5-plasmid eller et derivat 10 deraf eller et højkopitals-plasmid med et bredt værtsspektrum, eller et derivat deraf.

7. Et plasmid ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det er et pMBl-plasmid eller et derivat deraf, såsom et pBR322plasmid eller et derivat deraf.

8. Et plasmid ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det i det mindste i ét trin under dyrkningen af bakterier, der indeholder plasmidet, har et lavt kopital.

9. Et plasmid ifølge krav 8, 20 kendetegnet ved, at det har et kopital på ca. 0,5-5 kopier pr. celle.

10. Et plasmid ifølge krav 8 eller 9, kendetegnet ved, at det vælges blandt plasmider af inkom-patibilitetsgruppen IncFII, herunder RI og derivater deraf; 25. og derivater deraf; og lavkopitalsplasmider med et bredt værts spektrum og derivater deraf.

11. Et plasmid ifølge krav 8 eller 9, kendetegnet ved, at det er et betinget runaway-replika-30 tionsplasmid. DK 167883 B1 35

12. Et plasmid ifølge krav 11, kendetegnet ved, at det, når værtsmikroorganismer indeholdende plasmidet dyrkes under betingelser, der sikrer et lavt, konstant plasmidkopital, har et kopital, der ikke overstiger ca. 3-5 5 kopier pr. celle, og som, når værtsmikroorganismerne dyrkes under andre betingelser, som sikrer et væsentligt forøget plasmidkopital, har et kopital i et område, der er mindst ca. 500-1000 kopier pr. celle.

13. Et plasmid ifølge krav 12, 10 kendetegnet ved, at det har et plasmidkopital, der ikke overstiger ca. 3-5 kopier pr. celle ved én temperatur, og et plasmidkopital, der er i området mindst ca. 500-1000 kopier pr. celle ved en højere temperatur.

14. Plasmid ifølge krav 12 eller 13, 15 kendetegnet ved, at plasmidkopitallet, når det ikke overstiger ca. 3-5 kopier pr. celle, er i området ca. 0,5-1 kopi pr. celle.

15. Et plasmid ifølge krav 1, 12, 13 eller 14, kendetegnet ved, at en regulerbar promoter er indsat oven 20 for plasmidets native replikationskontrolgen R.

16. Et plasmid ifølge et hvilket som helst af kravene 12-15, kendetegnet ved, at det er et plasmid af RI-type.

17. Gram-negativ bakterie, kendetegnet ved, at den indeholder et plasmid ifølge et 25 hvilket som helst af de foregående krav.

18. Bakterie ifølge krav 17, kendetegnet ved, at den er Escherichia coli.

19. Fremgangsmåde til fremstilling af et genprodukt af plasmid-DNA, kendetegnet ved, at bakterier, som indeholder et plasmid 30 ifølge et hvilket som helst af kravene 1-16, dyrkes, og genproduktet af plasmidet udvindes fra bakteriekulturen. DK 167883 B1 36

20. Fremgangsmåde ifølge krav 19, kendetegnet ved, at dyrkningen udføres i mindst 100 bakteriegenerationer.

21. Fremgangsmåde ifølge krav 20, 5 kendetegnet ved, at tabet af plasmidet er mindre end 2 x 10"^/celle/generation.

22. Fremgangsmåde ifølge krav 21, kendetegnet ved, at tabet af plasmidet er mindre end 10" ^/celle/generation.

23. Fremgangsmåde ifølge krav 22, kendetegnet ved, at tabet af plasmidet er mindre end 5 x 10“6/celle/generation.

24. DNA-fragment, som er kortere end 19 kb, kendetegnet ved, at det omfatter RI par-området A, Ri 15 par-området B eller både RI par-område A og RI par-område B.

25. DNA-fragment ifølge krav 24 omfattende RI par-områderne A og B, kendetegnet ved, at det har en længde, der ikke overstiger 6 kb, især ikke 4 kb, navnlig ikke 3 kb.

26. DNA-fragment ifølge krav 24 omfattende RI par-området A, 20 kendetegnet ved, at det har en længde, der ikke overstiger 4 kb, især ikke 2,5 kb, navnlig ikke 2 kb.

27. DNA-fragment ifølge krav 24 omfattende RI par-området B, kendetegnet ved, at det har en længde, der ikke overstiger 2 kb, især ikke 1,5 kb, navnlig ikke 1 kb.