FI89941B - Plasmider med villkorligt replikeringsuppfoerande - Google Patents
Plasmider med villkorligt replikeringsuppfoerande Download PDFInfo
- Publication number
- FI89941B FI89941B FI841976A FI841976A FI89941B FI 89941 B FI89941 B FI 89941B FI 841976 A FI841976 A FI 841976A FI 841976 A FI841976 A FI 841976A FI 89941 B FI89941 B FI 89941B
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- plasmid
- copy number
- promoter
- gene
- temperature
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/67—General methods for enhancing the expression
- C12N15/68—Stabilisation of the vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/67—General methods for enhancing the expression
- C12N15/69—Increasing the copy number of the vector
Landscapes
- Genetics & Genomics (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Description
89941
Plasmidit, joilla on ehdollinen replikoitumiskäyttäytyminen
Keksintö koskee uusia plasmideja, jotka ovat hyödyllisiä 5 kloonaus- ja tuotantovektoreina yhdistelmä-DNA-tekniikassa, ja joiden repiikoitusmiskäyttäytyminen on ohjaamaton edullisissa olosuhteissa, sekä menetelmää tällaisten plasmidien valmistamiseksi.
10 Plasmidit, joilla on ehdollinen ohjaamaton replikoitumiskäyttäytyminen (ns. karkuriplasmidit), tunnetaan esim. julkaistusta EP-patenttihakemuksesta 78101877.5. Näiden plasmidien replikoituminen riippuu lämpötilasta siten, että plasmidit muodostavat pienen ohjatun vakioluvun kopioita, kun 15 plasmideja kantavia isäntäbakteereja kasvatetaan yhdessä lämpötilassa, esim. noin 30°C:ssa, ja lisääntyneen kopiolu-vun, kun isäntäbakteereja kasvatetaan eri lämpötilassa, esim. yli 36°C:ssa.
20 Edellä mainitun patenttihakemuksen sisältämät plasmidit eristettiin suorittamalla kemiallinen mutaatio plasmidille Rl, joka on tyypiltään villiplasmidi, ja jonka tiedetään replikoituvan autonomisesti Escherichia colissa. Mutantit aikaansaatiin kahdessa vaiheessa, joista ensimmäisessä vai-.:25 heessa eristettiin plasmidia kantava bakteeriklooni, jossa plasmidikopioiden lukumäärä oli noin 1-2 30°C:ssa ja 4-5 kertaa korkeampi 40°C:ssa, ja toisessa vaiheessa eristettiin "" bakteeriklooni, jonka plasmidi tuotti lisäntyneen kopioluvun korkeammassa lämpötilassa. Karkurikäyttäytymistä osoittavat 30 plasmidit olivat näin ollen kantaplasmidin kaksoismutantte- ' ja.
Edellä mainitussa patenttihakemuksessa selostetaan myös miniplasmideja, jotka ovat hyödyllisiä kloonausvektoreina, -35 koska ne voidaan pienen kokonsa vuoksi suhteellisen helposti : transformoida isäntäsoluihin. Nämä miniplasmidit ovat säi lyttäneet ne geenit, jotka antavat lämpötilasta riippuvaisen karkurireplikoitumiskäyttäytymisen.
89941 2
Edellä mainitussa patenttihakemuksessa selostettuja plasmi-deja voidaan käyttää kloonaus- ja tuotantovektoreina, joiden avulla pystytään saamaan aikaan liitettyjen vieraiden DNA-jaksojen koodittamia geenituotteita. Plasmidien lämpötilasta 5 riippuvaista replikoitumista voidaan käyttää hyväksi haluttaessa tuottaa suurempia määriä geenituotteita DNA-jaksoista, jotka ovat alkuperältään esim. eukaryoottisia. Tällainen geenituotemäärän lisääminen ei ole ollut mahdollista tavanomaisilla plasmidi-DNA:n määrän lisäämismenetelmillä, joissa 10 työskennellään esim. lisäämällä kasvualustaan kloramfeni-kolia, koska kloramfenikolin läsnäolo pysäyttää proteiini-synteesin.
Edellä mainitussa patenttihakemuksessa selostettuja plasmi-15 deja voidaan edullisesti käyttää kloonaus- ja tuotantovektoreina sellaisissa tapauksisa, joissa liitetty vieras geeni koodittaa sille bakteerille haitallista tuotetta, johon plasmidi on transformoitu, koska matalissa lämpötiloissa plasmideilla on pieni kopioluku ja sen seurauksena geenin · 20 ilmentyminen on vähäistä. Tämä merkitsee sitä, että viljelmän eksponentiaalisen kasvuvaiheen aikana, joka suoritetaan matalassa lämpötilassa, ei bakteereille todennäköisesti ai-heudu haittaa.
•25 Nyt esillä oleva keksintö koskee uusia plasmideja, jotka sisältävät vähintään yhden säädeltävän promoottorin, joka on sijoitettu sillä tavalla, että sen transkriptio säätelee plasmidin replikoitumista. Tarkemmin sanottuna keksintö koskee plasmideja, joissa säädeltävä promoottori saa aikaan 30 oleellisesti lisääntyneen replikoitumisen, kun plasmideja sisältäviä mikro-organismeja kasvatetaan sellaisissa olosuhteissa, jotka takaavat lisääntyneen, promoottorista lähtien tapahtuvan transkription. Lisäksi keksintö koskee menetelmää tällaisten plasmidien valmistamiseksi. Plasmideja käytetään '5 kloonaus- ja tuotantovektoreina.
On ennestään tunnettua, että säädeltävä promoottori voidaan liittää ohjaamaan sellaisen rakennegeenin ilmentymistä, joka
II
3 89941 on sijoitettu plasmidiin ja koodittaa haluttua geenituotet-ta. Sen sijaan uskotaan olevan uutta sisällyttää plasmidei-hin säädeltävä promoottori, jonka avulla on mahdollista säädellä muodostuvaa plasmidikopiolukua.
5
Ensinnäkin keksintö koskee plasmidia, johon on liitetty säädeltävä promoottori sillä tavalla, että tästä promoottorista lähtevä transkriptio säätelee replikoi tiimistä erityisesti niin, että lisääntynyt transkriptio johtaa oleellisesti li-10 sääntyneeseen plasmidikopiolukuun. Tässä selostuksessa ja patenttivaatimuksissa termillä "säädeltävä promoottori" tarkoitetaan promoottoria, jonka transkriptionaloitusaktiivi-suutta voidaan säädellä muuntamalla niitä olosuhteita, joissa kasvatetaan niitä mikro-organismeja, jotka sisältävät 15 promoottoria kantavan plasmidin. Tällainen säädeltävä promoottori voi olla esimerkiksi vieras promoottori eli sellainen promoottori, joka ei luonnossa kuulu sellaiseen plasmidiin, johon se nyt on sisällytetty. Plasmidi saattaa olla myötäsyntyisesti säädeltävissä erityisesti promoottorialu-20 eella olevasta DNA-rakenteesta johtuen. Esimerkki tällaisista plasmideista löytyy tunnetuista karkuriplasmideista (ks. myöhempää selostusta). Vaihtoehtoisesti promoottori voi olla ohjattavissa säätelytekijän avulla, joka voi suorittaa posi-tiivistä ohjausta siten, että plasmidi ei kykene replikoi-.':'25 maan ohjaamattomasti, jollei promoottoria indusoida positii-visesti esim. lisäämällä indusoivaa ainetta siihen kasvualustaan, jossa isäntäsoluja kasvatetaan, tai säätelytekijä voi suorittaa negatiivista ohjausta. Viimeksi mainittua ‘ ‘ tyyppiä edustava säätelytekijä tunnetaan myös repressorina, 30 jonka toiminta-aktiivisuus voi myös olla säädeltävissä isän- . : täsolujen kasvuolosuhteita muuntamalla. Repressorigeeni voi- : daan sijoittaa plasmidiin itseensä yhdessä promoottorin kanssa tai samassa isännässä olevaan erilliseen plasmidiin ____; tai isäntämikro-organismin kromosomiin. Repressorigeeni koo- -35 dittaa tuotetta, joka estää mukaan liitetystä promoottorista lähtevää transkriptiota niin, että replikoituminen pysyy matalalla vakiotasolla. Kun repressori jostakin syystä in-aktivoituu, ei säätelyä enää ole ja transkriptio kiihtyy.
89941 4
Ellei toisin ole ilmoitettu, tarkoiteaan tässä selostuksessa ja patenttivaatimuksissa käytetyllä termillä "promoottori" tavallisesti sekä sellaista promoottoria, jonka aktiivisuus myötäsyntyisesti reagoi isäntäsolujen kasvuolosuhteiden muu-5 toksiin, että sellaisia promoottoreja, jotka ovat säätelytekijän ohjaamia. Sanonnalla "plasmidi, johon säädeltävä promoottori on liitetty", tarkoitetaan myös sellaisia keksinnön mukaisia plasmideja, joissa promoottori ja promoottorin säätelyssä oleva replikoni on liitetty samaan DNA-jaksoon ja 10 promoottori ja replikoni on viime kädessä johdettu eri lähteistä; tämä tarkoittaa, että halutun loppuplasmidin yhdessä rakennusvaiheessa promoottori on liitetty plasmidiin, josta replikoni on peräisin. Termillä "oleellisesti lisääntynyt tai ohjaamaton plasmidikopioluku" tarkoitetaan sitä, että 15 muutettaessa isäntäorganismin kasvuolosuhteita niin, että plasmidi menettää replikoitumisen ohjauksensa ja sen seurauksena transkriptio kiihtyy, plasmidikopioluku kasvaa eksponentiaalisesti generaatioajan ollessa noin 40-50 % tai tätäkin pienempi mikrobipopulaation solunjakautumisajasta 20 eli generaatioajasta. Kiihtyminen jatkuu siihen asti kun isäntäsolu lakkaa kasvamasta, tavallisesti 4-5 solunjakautumista harvemman solunjakautumisen jälkeen, jossa vaiheessa solun plasmidi-DNA-määrä on noin 40-70 % koko DNA-määrästä eli plasmidikopioluku kasvaa noin 25 - 1000-kertaiseksi tai :‘25 suuremmaksi. Toisin sanoen plasmidikopioluku ei saavuta stationäärivaihetta. Tämäntyyppistä ohjaamatonta käyttäytymistä nimitetään myös "karkurikäyttäytymiseksi".
Keksinnön tekijöiden äskettäin Rl-tyypin plasmidien repii-30 koitumisen ohjausperiaatteesta saavuttamaa tietoa on käytetty hyväksi keksinnön mukaisten plasmidien rakentamisessa (tämä periaate on selostettu tarkemmin jäljempänä). Kun säädeltävä promoottori sijoitetaan keksinnön periaatteen mukaisesti plasmidiin, kiihtynyt promoottorista lähtevä trans-35 kriptio, joka aikaansaa oleellisesti lisääntyneen plasmidi-kopioluvun, voi aiheutua esim. promoottorin repression poistumisesta. Tämä merkitsee sitä, että promoottorin kanssa samanaikaisesti liitetty repressorigeeni, joka koodittaa tie-
II
5 89941 tyissä olosuhteissa promoottoria ohjaavaa geenituotetta, inaktivoituu eri olosuhteissa niin, ettei promoottorista lähtevä transkriptio enää esty, vaan johtaa lopulta lisääntyneeseen plasmidikopiolukuun.
5 Tämä on tärkeä parannus verrattuna ennestään tunnettuihin karkuriplasmideihin, joilla voi vaihtelevissa olosuhteissa olla erilaisia replikoitumisominaisuuksia. Ei ole olemassa mitään viitteitä siihen, että asia olisi näin keksinnön mu-10 kaisten plasmidien kohdalla, koska mukana liitetty vieras plasmidi on tavallisesti niin voimakas (so. transkription-aloitusfrekvenssi on korkea), että olosuhteiden vaihtelulla ei ole vaikutusta.
15 Se lämpötila, jossa isäntämikro-organismia kasvatetaan, on yksi niistä viljelyolosuhteista, joiden avulla on mahdollista säädellä säädeltävän promoottorin aktiivisuutta. Promoottorin aktiivisuus itse voi olla lämpötilasta riippuvainen eli se reagoi lämpötilan muutoksille kasvatuksen aikana tai 20 säätötekijä voi olla lämpöherkkä, esimerkiksi lämpöherkkä repressori.
Säädeltävä promoottori voi olla bakteriofagi X:sta saatu '· promoottori, joka voi olla liitetty osana sellaista DNA-pa- : : 25 lasta, joka lisäksi kantaa lämpötilaherkkää Xcl-repressoria, joka ohjaa promoottorin transkriptiota, λ-promoottori voi olla joko \PR tai \PL, erityisesti \PR. Kuitenkin keksinnön periaatteita noudattaen voidaan plasmideihin sisällyttää muita promoottorijärjestelmiä, joihin vaikuttavat muut ul-. 30 koiset tekijät kuin lämpötila, kuten promoottoreita, joita voidaan indusoida kemikaaleilla tai säädellä aineenvaihduntatuotteilla, kuten lac-, trp- ja deo-promoottorit.
Edullinen keksinnön mukainen toteutustapa on sellainen, jos-35 sa promoottoriin perustuva säätelyjärjestelmä johtaa lämpötilasta riippuvaiseen plasmidin käyttäytymiseen. Tarkemmin sanottuna se lämpötila, jossa plasmidi tuottaa oleellisesti lisääntyneen plasmidikopioluvun, on korkeampi kuin se lämpö- 6 89941 tila, jossa kopioluku on pieni. Keksinnön mukaiset plasmi-dit, jotka kantavat säädeltävää promoottoria, jonka trans-kriptiokäyttäytyminen on lämpötilasta riippuvainen johtuen lämpötilaherkän repressorin läsnäolosta, tuottavat matalan 5 vakioluvun kopioita yhdessä lämpötilassa, kuten esim.
30°C:ssa, koska tässä lämpötilassa promoottori on tukahdutettu ja siitä lähtevä transkriptio pysyy näin ollen matalalla tasolla, mutta korkeammassa lämpötilassa, kuten lämpötila-alueella noin 36-42°C, plasmidit tuottavat oleellisesti 10 lisääntyneen kopioluvun, koska säätelyjärjestelmä on tällä lämpötila-alueella inaktivoituneena aiheuttaen promoottorin repression poistumisen ja sen seurauksena promoottorista lähtevän transkription lisääntymisen.
15 Seuraavassa selotuksessa viitataan vain sellaisiin plasmi- deihin, joiden replikoitumista ohjaava säätelyjärjestelmä on lämpötilaherkkä, ja kyseessä on erityisesti lämpötilaherkän repressorin aikaansaama ohjaus, mutta on selvää, että voidaan käyttää muunkin tyyppisiä olosuhteita, joiden avulla 20 plasmidin replikoitumista voidaan säädellä, kuten edellä on selostettu.
Eräs keksinnön mukainen plasmidityyppi on sellainen, jossa säädeltävä plasmidi on sijoitettu kohtaan, joka kuuluu osal-: 25 le jotakin plasmidin luontaista replikoitumisen säätely- geeniä. Tämän selostuksen ja patenttivaatimusten tarkoituksia varten tällaiselle plasmidille on annettu nimi A-tyypin plasmidi. Kun plasmidi on plasmidin Rl johdannainen, plasmi-dista poistettu säätelygeeni on copB-geeni, joka koodittaa . 30 erästä plasmidin luontaista replikoitumisen estäjää. Kun copB-geeni poistetaan, saadaan aikaan vähäinen, pysyvä lisäys plasmidin kopioluvussa. Näin plasmidin kopioluku on ··: noin 20-40, mielellään 20-30 ja erityisesti 20-25 kopiota solua kohti noin 30°C:ssa. Kuitenkin, kun lämpötila noste-Ί5 taan noin 40°C:een, inaktivoituu säädeltävän promoottorin repressorin toiminta ja repiikoituminen muuttuu ohjaamattomaksi johtaen plasmidikopiolukuun, joka on alueella vähintään 500-1000 kopiota solua kohti riippuen mm. plasmidiin
II
89 9 41 7 sijoitetun mahdollisen vieraan DNA-jakson koosta (mitä suurempi DNA-jakso, sitä pienempi muodostuneiden plasmidikopi-oiden lukumäärä), tällaisen vieraan DNA:n geenituotteiden vaikutuksesta ja/tai mikronikannasta, johon plasmidi on 5 transformoitu. Joissakin tapauksissa voi plasmidi korkeammassa lämpötilassa kuitenkin muodostaa jopa useita tuhansia kopioita solua kohti. Joka tapauksessa korkeassa lämpötilassa plasmidi-DNA-määrä on noin 40-75 %, tavallisesti 50-60 %, koko DNA-määrästä.
10
Toinen keksinnön mukainen plasmidityyppi on sellainen, jossa kopioluku on noin 3-5 kopiota solua kohti yhdessä lämpötilassa, kuten noin 30°C:ssa, ja kopioluku on lisääntynyt eli alueella vähintään noin 500-1000 kopiota solua kohti riip-15 puen edellä hahmotelluista tekijöistä, ja joissakin tapauksissa jopa useita tuhansia solua kohti, korkeammassa lämpötilassa, kuten noin 42°C:ssa. Tällainen plasmidi voidaan saada aikaan sijoittamalla säädeltävissä oleva promoottori plasmidin luontaisen(sten) replikoitumisenohjausgeenin(ien) 20 yläpuolelle. Tämän selostuksen ja patenttivaatimusten tarkoituksia varten tällaiselle plasmidille on annettu nimi B-tyypin plasmidi. Plasmidin Rl johdannaisten ollessa kyseessä säädeltävä promoottori on sijoitettu sekä copB- että copA-geenin yläpuolelle niin, että nämä molemmat luontaiset rep-:“:'25 likoitumisen estäjät on säilytetty, mistä syystä plasmideil-la on edellä kuvattu kopiolukukäyttäytyminen. Kuitenkin, jos plasmidi on sellainen, että siitä puuttuu par-alue (jakautu-misalueen läsnäolo plasmidissa saa aikaan sen, että plasmidi periytyy stabiilisti; tämä vaikutus johtuu par-alueen yhdes-.30 tä tai useammasta geenistä), plasmidi menetetään noin 1 % taajuudella sukupolvea kohti matalassa lämpötilassa, koska kopioluku on matalassa lämpötilassa pienempi. Näin ollen saattaa olla edullista sijoittaa par-alue tällaiseen plasmi-diin, jotta plasmidin karkurireplikoituminen saadaan myöhem-35 min tapahtumaan populaation kaikissa soluissa.
B-tyypin plasmidilla on lisäetuna laaja kopiolukualue. Koska kopioluku on hyvin pieni matalassa lämpötilassa, on plasmi- 89941 8 deihin mahdollista sijoittaa sellaisia vieraita geenejä, joiden tuotteet ovat osittain toksisia (pienentävät kasvunopeutta) tai jopa letaalisia mikro-organismille, joka on transformoitu plasmidilla. Tilanne on joskus tämä eukaryoot-5 tisten geenien tuotteilla, jotka yleensä ovat suurimman mielenkiinnoin kohteina esim. lääketeollisuudessa. Koska repii-koitumisnopeus on pieni matalassa lämpötilassa, eivät vieraat geenit ilmenny tällöin lainkaan tai ne ilmentyvät vain pienessä määrin, mistä syystä solut eivät vahingoitu lain-10 kaan ja niitä voidaan kasvattaa matalassa lämpötilassa normaaliolosuhteissa. Tämä parantaa ja helpottaa suuresti eräiden sellaisten polypeptidien valmistusmenetelmiä, joita ei tähän mennessä ole lainkaan ollut mahdollista valmistaa tai joita on ollut hyvin vaikea valmistaa.
15
Kolmas tämän keksinnön mukainen plasmidityyppi on sellainen, jonka kopioluku on alueella 0,5-1 kopio solua kohti (luvulla 0,5 tarkoitetaan sitä, että replikoitumistaajuus on vähemmän kuin yksi solua kohti) yhdessä lämpötilassa, kuten noin 20 30°C:ssa, ja korkeammassa lämpötilassa, kuten noin 42°C:ssa, kopioluku on lisääntynyt ollen vähintään noin 500-1000 kopiota solua kohti, riippuen edellä hahmotelluista tekijöistä, ja joissakin tapauksissa jopa useita tuhansia kopioita solua kohti. Tällainen plasmidi voi kantaa säädeltävää pro-•25 moottoria replikoitumisalueella, josta osa luontaisesta rep-likoitumisen säätögeenistä on poistettu ja sen jälkeen sijoitettu replikoitumisalueen ulkopuolelle kohtaan, jossa se ei luonnonmukaisesti sijaitse. Tämän selostuksen ja patenttivaatimusten tarkoituksia varten tästä plasmidista käyte-30 tään nimeä C-tyypin plasmidi. Kun kyseessä ovat plasmidin Rl johdannaiset, joista copB-geeni on poistettu, on copB-geeni sijoitettu takaisin, mutta ei alkuperäiseen kohtaan, vaan EcoRI-kohtaan replikoitumisalueen ulkopuolelle. Tässäkin tapauksessa copB-inhibiittoriproteiini vaikuttaa plasmidin 35 replikoitumiseen, mutta sillä tavalla, että plasmidilla on edellä selostettu kopiolukukäyttäytyminen. Kuitenkin, jos plasmidilta puuttuu par-alue, plasmidi menetetään noin 5 % taajuudella sukupolvea kohti matalassa lämpötilassa, koska
II
o y -r 1 9 kopioluku on näin pieni matalassa lämpötilassa. Näin ollen tämän plasmidin ollessa kyseessä on vielä edullisempaa kuin B-tyypin plasmideilla sijoittaa plasmidiin par-alue, jotta voidaan varmistua siitä, että plasmidin karkurireplikoitumi-5 nen tapahtuu myöhemmin kaikissa polulaation soluissa. Repii -koitumiskäyttäytyminen vastaavasti matalassa ja korkeassa lämpötilassa ja tästä johtuvat edut tätä plasmidia käytettäessä ovat muuten samanlaisia kuin B-tyypin plasmideilla.
10 Vielä eräs tämän keksinnön kohteena oleva seikka liittyy plasmidiin, johon ensimmäisen replikoitumisalueesta alkavaa transkriptiota ohjaavan säädeltävän promoottorin rinnalle on sijoitettu toinen promoottori sillä tavalla, että mukaan voidaan liittää rakennegeeni, jonka ilmentymistä toinen pro-15 moottori ohjaa. Tämä toinen promoottori voi olla ohjattavissa eli voi olla mahdollista säädellä sen toimintaa muuntamalla isäntäsolun kasvatusolosuhteita samoin kuin tehtiin säädeltäessä ensimmäistä säädeltävää promoottoria. Tähän tarkoitukseen sopivina pidetään tällä hetkellä mm. seuraavia 20 promoottoreja: lac-promoottori, trp-promoottori, deo-pro- moottori, recA-promoottori, \PL-promoottori jne. \PL-promoot-tori saattaa osoittautua erittäin edulliseksi toisena pro-moottorina, joka ohjaa rakennegeenin ilmentymistä, koska myös se on lämpötilalle herkän cl-repressorin säätelyn alai-:’· -25 nen, ja näin ollen vahvistusominaisuudet ovat samat, mistä syystä isäntäsolujen viljely on yksinkertaisempaa ja tuot-teen määrän kasvu tapahtuu samanaikaisesti plasmidi-DNA:n määrän kasvun kanssa. Huomattakoon, että toinen promoottori voi myös olla ensimmäisen säädeltävän promoottorin kanssa . 30 identtinen.
Toinen promoottori voidaan liittää A-tyypin, B-tyypin ja C-tyypin plasmideihin. Tällaisella plasmidilla on pieni va-kiokopioluku ja hyvin vähän tai ei lainkaan geenin ilmenty-35 mistä noin 30°C:ssa, mutta lämpötila-alueella noin 36-42°C
plasmidikopioluku ja geenin ilmentyminen ovat oleellisesti lisääntyneet. Mielellään plasmidilla on lisääntynyt plasmi- 89941 10 dikopioluku ja hyvin suuri geenin ilmentyminen yli 39°C:n lämpötiloissa.
Keksinnön mukaisia plasmideja voidaan käyttää kloonaus- ja 5 tuotantovektoreina eli plasmideina, joita voidaan käyttää yhdistelmä-DNA-tekniikassa haluttaessa tuottaa mitä erilaisimpia tuotteita teknisiin tai lääketieteellisiin tarkoituksiin, erityisesti polypeptidejä tai niiden osia, entsyymejä tai ei-proteiinituotteita, jotka syntyvät entsyymireaktiossa 10 ravinnealustan sisältämän yhdisteen kanssa, pienimolekyylisiä tuotteita, kuten hormoneja ja nukleiinihappoja, ja erityisen mielenkiinnon kohteena ovat eukaryoottisten geenien, erityisesti nisäkäsgeenien tuotteet. Ollakseen käyttökelpoinen kloonaus- ja tuotantovektorina on edullista, vaikkakaan 15 ei välttämätöntä, että plasmidi sisältää vähintään yhden restriktioendonukleaasin tunnistuskohdan. Tämän kohdan pitäisi olla sellainen, joka vieraan DNA-jakson liittämisen jälkeen sallii näin syntyneen yhdistelmäplasmidin autonomisen replikoitumisen ja sallii lisäksi sen, että plasmidiin 20 sijoitettu säädeltävä promoottori ohjaa replikoitumisalueen transkriptiota saaden aikaan oleellisesti lisääntyneen plas-midikopioluvun, kun promoottorista lähtevä transkriptio kiihtyy. Näin ollen replikoitumisalueen sisällä sijaitsevia restriktiokohtia ei hyväksytä kloonauskohdiksi, koska ne *25 aiheuttaisivat plasmideille replikoitumisominaisuuksien me- ·· netyksen.
Keksinnön mukainen plasmidi rakennetaan siten, että liitetään säädeltävä promoottori plasmidiin sillä tavalla, että _ 30 tästä promoottorista lähtevä transkriptio ohjaa replikoitu-mista, ja näin käsitelty plasmidi identifioidaan seulomalla esiin ne plasmidit, jotka tuottavat oleellisesti lisääntyneen plasmidikopioluvun, kun promoottorista lähtevä transkriptio kiihtyy. Kun \PR on säädeltävä promoottori, se voi-35 daan liittää sekoittamalla keskenään plasmidi ja faagi-DNA, suorittamalla katkaisu asianmukaisella endonukleaasilla, inaktivoimalla lämmön avulla ja suorittamalla yhteenliittä- n 89941 minen seoksessa ja transformoimalla mikro-organismi liitos-seoksella.
Tällaisten plasmidien rakentaminen voidaan suorittaa sijoit-5 tamalla promoottori satunnaisesti plasmidin eri kohtiin.
Oikea liitännäinen voidaan tunnistaa seulomalla esiin sellaiset plasmidit, joilla on ohjaamaton replikoitumiskäyttäy-tyminen sellaisissa olosuhteissa, jotka takaavat säädeltävästä promoottorista lähtevän kiihtyneen transkription. Täl-10 laisten plasmidien seulonta tapahtuu yksinkertaisesti siten, että analysoidaan plasmidia kantavien solujen kasvuominai-suudet eri olosuhteissa. Plasmidi-DNA:n määrä isäntäsoluissa voidaan mitata eri tavoin, erityisesti käyttämällä agaroosi-geelielektroforeesia sinänsä tunnetulla tavalla. Tämä seu-15 lontamenetelmä on helppo ja nopea.
Erityisessä keksinnön mukaisessa toteutustavassa, jossa rakennetaan A-tyypin plasmideja, menetellään siten, että poistetaan osa luontaisesta säätögeenistä ja sen promoottorista, 20 esim. katkaisemalla restriktioendonukleaasilla Bglll, kun poistetaan copB-geeni plasmidista Rl, ja sen jälkeen liitetään tähän kohtaan DNA-jakso, kuten Bglll-jakso, joka sisäl-• tää säädeltävän promoottorin.
...25 Toisessa keksinnön toteutustavassa, jossa rakennetaan B-tyypin plasmidi, toimitaan siten, että luontaisen replikoituna -senohjausjärjestelmän yläpuolelle plasmidiin sijoitetaan säädeltävä promoottori, ja plasmidin Rl johdannaisten ollessa kyseessä suoritetaan liittäminen copB-geenin yläpuolella 30 olevaan Bglll-kohtaan aikaansaamalla osittainen katkaisu
Bglllrlla, ja sen jälkeen suoritetaan yhteenliittäminen ja kyseinen mikro-organismin, kuten E. colin, transformointi. Vaihtoehtoisesti voidaan plasmidi rakentaa käyttämällä lähtöaineena. A- tyypin plasmidia, josta luontainen replikoituna -' 35 sen ohjausgeeni on osittain poistettu, ja toimia siten, että luontainen ohjausgeeni sijoitetaan takaisin alkuperäiseen kohtaansa, ja jos kyseessä on Rl-tyypin plasmidi, sijoitetaan copB-geeni takaisin BglII-kohtaan.
12 ϋ 9 9 41
Kolmannessa keksinnön toteutustavassa, jossa rakennetaan C-tyypin plasmidi, toimitaan siten, että käytetään lähtöaineena A-tyypin plasmidia, liitetään luontainen säätögeeni sellaiseen plasmidialueeseen, jossa se ei sijaitse villityyppi-5 sessä kantaplasmidissaan, ja jos kyseessä ovat Rl-tyypin plasmidit, liitetään copB-geeni EcoRI-jaksona plasmidin replikoi tumisalueen ulkopuolella olevaan EcoRI-kohtaan käyttämällä apuna EcoRI-katkaisua, ja sen jälkeen suoritetaan liittäminen ja transformointi.
10
Neljännessä keksinnön toteutustavassa toimitaan niin, että säädeltävän promoottorin lisäksi liitetään toinen promoottori asianmukaiseen restriktiokohtaan siten, että se sallii rakennegeenin sijoittamisen niin, että sen ilmentyminen on 15 toisen promoottorin ohjauksen alainen. Kuten edellä on mainittu, tämä kohta ei saa sijaita plasmidin replikoitumisalueen sisällä.
Keksinnön mukaiset plasmidit ovat miniplasmideja eli ne ovat 20 huomattavasti pienempiä kuin niiden villityyppiset kanta- plasmidit. Yleensä niiden koko on alueella noin 2,5 - 15,0 x 106 daltonia, usein 2,5 - 10,0 x 106 daltonia, tavallisesti 4,0 - 12,5 x 106 daltonia, ja erityisesti 4,0 - 5,0 x 106 daltonia.
‘25
Ennestään tunnettujen karkuriplasmidien ohjaamaton replikoi-tumiskäyttäytyminen näyttää riippuvan siitä erityisestä bakteerikannasta, joka transformoidaan, kasvuvällaineesta, jossa bakteeria kasvatetaan ja liitetystä DNA:sta. Tämä riippu-30 vuus johtuu luultavasti siitä, että ennestään tunnettujen plasmidien karkurikäyttäytyminen aiheutuu osaksi siitä, että copB-promoottorin yksi nukleotidi on korvautunut aiheuttaen vähäisen kasvun transkriptionopeuteen, johon voidaan vaikuttaa ympäristöä muuttamalla, mitä tulee bakteerilajiin tai 5 -kantaan ja/tai kasvualustaan, sekä plasmidiin sisällytetyllä vieraalla DNA:11a. Keksinnön mukaiset plasmidit eivät näytä olevan näiden rajoitusten alaisia, sillä vahva vieras promoottori kiihdyttää aktivoituna tai repression poistuttua li 13 899 41 transkriptionopeutta siinä määrin, että tällaisilla muutoksilla ei ole merkitystä. Näin ollen näillä plasmideilla voidaan transformoida mitä erilaisimpia kantoja ja ne ovat myös käsittelyn kannalta luotettavampia kuin ennestään tunnetut 5 karkuriplasmidit.
Tämä keksintö ulottuu myös sellaisiin plasmideihin, jotka on johdettu muista villityyppisistä plasmideista kuin Rl ja/tai löytyvät muista plasmideja ylläpitävistä mikro-organismeista 10 kuten E. coli. On myös näköpiirissä se mahdollisuus, että voidaan rakentaa edellä kuvatun tyyppinen plasmidi, jota voidaan pitää yllä sellaisissa mikro-organismeissa, jotka eivät luonnostaan ylläpidä plasmideja. Useiden eri mikrobi-plasmidien replikoitumisjärjestelmän on osoitettu olevan 15 monessa suhteessa samanlainen. Esimerkiksi kaikki tunnetut plasmidit vaativat transkriptiota, jos replikoitumisen on tarkoitus tapahtua. Keksinnön mukaista periaatetta käyttämällä on mahdollista siirtää ohjaamattoman replikoitumisen fenotyyppi toisiin plasmideihin niin, että jo kloonausvekto-20 reina käytössä olevat plasmidit, joiden tiedetään toimivan hyvin halutussa mikro-organismissa, saavat karkurikäyttäytymisen. Niinpä sijoittamalla säädeltävä promoottori, esim. XPR, oikeaan kohtaan tällaiseen plasmidiin sillä tavalla, että tässä promoottorista lähtevä transkriptio ohjaa repii-...25 koitumista, tapahtuu ohjaamaton replikoituminen olosuhteis- - sa, jotka takaavat promoottorin kiihtyneen transkription.
-4: Rl-tyypin plasmidien replikoitumisenohiausiäriestelmä
Perusrepiikoni 30 Viime aikoihin asti ei Rl-tyypin plasmidien replikoitumi-senohjausjärjestelmää ole tunnettu. Nyt tiedetään, että se geneettinen informaatio, joka tarvitaan plasmidin Rl repii-koitumiseen ja replikoitumisen ohjaukseen, sisältyy 2500 emäsparin pituiseen alueeseen, jossa on kolme PstI-jaksoa 35 resistenssinsiirtotekijän sisällä (Molin et ai,. J. Bact. 138. 1979, 70-79).
14 89941 Tämä alue on määritelty perusreplikoniksi ja se sisältää neljä tärkeätä elementtiä, nimittäin kolme geeniä (copA, copB ja repA) ja replikoitumisen alkukohdan (Molin et ai., Microbiology, 1981, 408-11). Perusreplikonin fysikaalinen, 5 geneettinen ja toiminnallinen kartta on esitetty kuviossa 1. Geeni repA koodittaa funktiota, joka tarvitaan positiivisesti replikoitumisessa. Geenituote (DNA-sekvenssin mukaan) on 278 aminohappoa sisältävä proteiini, jonka molekyylipaino on noin 33 000 daltonia (Rosen et ai., Mol. Gen. Genet. 179.
10 1980, 527-37) . Tätä proteiinia ei ole identifioitu yksise litteisesti, mutta kyky muodostaa proteiinia repA-geenistä on selvästi osoitettu käyttämällä translationaalisia geeni-fuusioita IacZ-geenin kanssa (Light & Molin, Mol. Gen.
Genet. 184. 1981, 56-61). RepA-proteiinin biologista funk-15 tiota ei ole vielä täysin selvitetty, mutta sen uskotaan olevan replikoitumisenaloitustekijä.
CopA-geeni koodittaa pientä (80-90 nukleotidia), pysymätöntä RNA-molekyyliä, joka sisältää suuren märän sekundääristä 20 rakennetta (so. se muodosta hiusneulalenkkejä) Stougaard et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 78, 1981, 6008-6012). CopA-RNA on replikoitumisen estäjä; mutaatiot, jotka vaikuttavat CopA-RNA:n nukleotidisekvenssiin, voivat johtaa suurentunee-seen kopiolukuun (cop-mutantit). CopA-mutanttien DNA-sek-...25 venssin analyysi osoittaa, että kaikki mutaatiot ovat hämmästyttävässä määrin kertyneet 5 emäksen kohdalle silmukka-alueella. Nämä mutaatiot johtavat erittäin suuresti pienentyneeseen tai täydelliseen menetykseen estovaikutuksessa, joka kohdistuu villityyppiseen plasmidiin. Näin ollen voi-30 daan vetää se johtopäätös, että spesifinen esto-ominaisuus sijaitsee silmukassa. On myös hämmästyttävää, että kaikissa copA-mutanteissa, joiden nukleotidisekvenssi tunnetaan, CopA-RNA:n sytosiini on korvattu urasiililla (tai yhdessä tapauksessa adeniinilla). Tämä viittaa voimakkaasti siihen, ;5 että CopA-RNA toimii nukleiinihappo-nukleiinihappo-vuorovai-kutuksella. Tätä johtopäätöstä vahvistaa lisäksi se seikka, että jopa ne copA-mutantit, jotka ovat menettäneet CopA-ak-tiivisuuden villityyppistä plasmidia vastaan, ovat säilyttä-
II
89941 15 neet jonkin verran CopA-aktiivisuutta itseään vastaan. Lisäksi villityyppisellä CopA-RNA:lla on useimmiten heikentynyt estovaikutus copA-mutanttiplasmideja vastaan. Näin ollen copA-mutantti ei ole muuttunut ainoastaan inhibiittorissa, 5 vaan myös kohteessa copT, joten yksi ainoa korvautunut emäs johtaa fenotyyppisesti kaksoismutanttiin.
CopB-geeni koodittaa 86 aminohapon suuruista emäksistä proteiinia, jonka molekyylipaino on 11 000 daltonia. Tätä pro-10 teiinia muodostuu huomattavia määriä. Kun copB-geeni pro-moottoreineen poistetaan, saavutetaan kahdeksankertainen kopioluvun kasvu, joten on päätelty, että copB-proteiini toimii replikoitumisen inhibiittorina eli negatiivisena oh-jauselementtinä plasmidin Rl replikoitumisen säätelyssä (Mo-15 Iin et ai., Mol. Gen. Genet. 181. 1981, 123-30).
Kaksoismutantti (copAcopB) on täysin letaalinen isäntämikro-organismille ns. karkurireplikoitumisesta johtuen. Näin ollen nämä kaksi ohjausgeenien tuotetta toimivat synergisti-20 sesti.
Perusreplikonissa tapahtuva transkriptiotoiminta . Perusreplikonissa on kolme transkriptionaloituskohtaa, copB- promoottori, repA-promoottori (Light & Molin, Mol. Gen. Ge-...25 net. 184. 1981, 56-61) ja copA-geenin promoottori (Stougaard " „ et ai., op. cit.). Viimeksi mainittu suorittaa transkrip tiota alkualueesta poispäin, kun taas kaksi ensin mainittua suorittavat transkriptiota alkualueeseen päin. Näin ollen molemmat säikeet tulevat transkriboiduiksi copA-alueella.
30 Cop-B-transkripti jatkuu ohi copB-geenin ja tämä transkripti : ja se transkripti, joka alkaa repA-promoottorista, kattavat kumpikin repA-geenin.
Kun tehdään copB-geenin poistoja suorittamalla leikkaus 35 Bgllltlla, saadaan aikaan 8-10-kertainen kasvu plasmidin Rl kopioluvussa. Tämä on yllättävää, koska copB-geenin promoottori ja copB-rakennegeeniä lähellä oleva osa ovat poistuneet, mistä seuraa 1) copB-aktiivisuuden menetys ja repA- 16 S9941 promoottorin repression poistuminen sekä 2) copB-promootto-rin repA-promoottorin kokonaisilmentymiseen kohdistaman vai-kutuksen menetys, jolloin repA-promoottori, jonka repressio on poistunut, ottaa tehokkaasti copB-promoottorilta haltuun-5 sa repA:n kokonaistranskription. Kokonaisvaikutuksen pitäisi olla vain kaksinkertainen lisääntyminen repA-geenin trans-kriptionopeudessa, koska repA-promoottorin voimakkuus on kaksinkertainen copB-promoottorin voimakkuuteen verrattuna.
10 Tämä ilmeinen paradoksi voidaan selittää copA-geenin aktiivisuudella. CopA-RNA päättyy normaaliin päätösrakenteeseen, jonka vartalon lopussa on U-sarja. RepA-proteiinin muodostumisen CopA-RNA-ohjaus riippuu tällaisesta oikeasta päättymisestä. Jos vastapäisen säikeen transkriptio on vahva (kon-15 vergentti transkriptio), päättymisen tehokkuus laskee. RepA-promoottorista lähtevä lisääntynyt transkriptio johtaa CopA-transkriptin pitenemiseen noin 150-200 nukleotidilla. Pidentynyt CopA-transkripti ei toimi replikoitumisen estäjänä eli se on oleellisesti ottaen inaktivoitunut, ja näin ollen muo-20 dostuu suurempi määrä RepA-proteiinia ja viimein myös suurempi määrä plasmidikopioita (Stougaard et ai., the EMBO Journall, 1982, 323-328).
Repii koi tiimi s en ohjaus ...25 copA- ja copB-geenin tuotteet ohjaavat plasmidin Rl repli- koitumista negatiivisesti eli ne siis toimivat replikoitumisen estäjinä. Kun repA-lac-fuusiota rakennettiin ja analysoitiin, voitiin osoittaa, että molemmat cop-geenituotteet ohjaavat negatiivisesti repA-geenin ilmentymistä (Light & 30 Molin, Mol. Gen. Genet. 184. 1981, 56-61). Näin ollen plasmidin Rl replikoituminen näyttää ohjautuvan sen mukana, miten sellaisen proteiinin muodostumista säädellään, jota tarvitaan positiivisesti luultavasti plasmidin replikoitumisen aloituksessa.
lac-geenifuusioiden avulla voitiin myös osoittaa, että copA-ja copB-tuotteilla on eri kohteet. CopB-proteiinin kohde on A-promoottori, jossa se toimii transkription aloituksen :5
II
17 8 9 941 estäjänä. CopB-proteiini ei kuitenkaan kykene sekaantumaan sellaiseen transkriptioon, joka alkaa repA-promoottorin yläpuolelta. CopA-RNA ei vaikuta transkriptioon, mutta se vaikuttaa transkription jälkeen eli estää RepA-mRNA:n luentaa.
5
Karkurimutanttien replikoituminen
Se plasmidien replikoitumistapa, jota on selostettu julkaistussa EP-patenttihakemuksessa 78.101877.5, on oleellisesti sama kuin edellä on selostettu villityyppisten Rl-plasmidien 10 kohdalla. Tämän keksinnön tekijöiden viime aikoina suorittama tutkimus on nyt osittain paljastanut syyn siihen, miksi esiintyy lämpötilasta riippuvaisia mutantteja, joilla on karkurireplikoitumiskäyttäytyminen. Kuten edellä on selostettu, voi lisääntynyt repA-geenin suuntaan tapahtuva trans -15 kriptio johtaa CopA-RNA-molekyylin inaktivoitumiseen. Edellä mainitussa patenttihakemuksessa selostetuissa karkurimutant-tiplasmideissa on copB-promoottorissa tapahtunut sellainen mutaatio, että yksi nukleotidi on korvautunut sekvenssissä seuraavalla tavalla: 20 a) Villityyppinen plasmidi: 5'-......TTCTCAAGT£GCT... -3' b) Karkurimutantti : 5'-......TTCTCAAGTTGCT...-31
Alleviivatut nukleotidit osoittavat korvautunutta nukleoti-[-:-25 dia. Kuvattu alue on RNA-polymeraasin sitoutumiskohta.
Tämän mutaation osoitettiin saavan aikaan lisääntyneen transkription copB-promoottorista lähtien erityisesti kor-keammissa lämpötiloissa.
30 Säädeltävää promoottoria kantavien plasmidien replikoitumi-: : nen Tämän keksinnön mukaisia plasmideja rakennettaessa on käytetty hyväksi äskettäin villityyppisten Rl-plasmidien repli-.35 koitumistavasta saavuttamaamme tietoa. Tämän keksinnön mukaisten plasmidien replikoitumista ei ole kuitenkaan tehty sellaiseksi, että se perustuisi niihin mutaatioihin, joita on julkaistussa EP-patenttihakemuksessa 78.101877.5 kuva- 18 89941 tuissa karkuriplasmideissa. Nyt on liitetty vieras promoottori siten, että tämä promoottori ainakin osittain ohjaa replikoitumisalueen transkriptiota. Promoottori voi olla säädeltävissä muuntamalla niitä olosuhteita, joissa mikro-5 organismia kasvatetaan, ja promoottoriaktiivisuuden säätö voidaan toteuttaa eri tavoin, kuten muuttamalla kasvatusläm-pötilaa tai kasvualustan koostumusta.
Kun säädeltävä promoottori valitaan lämpötilasta riippuvais-10 ten promoottorien joukosta, se on mielellään bakteriofagi X:sta johdettu promoottori kuten XPR tai XPL, erityisesti XPR. Faagi X:ssa PR-promoottoria ohjaa cl-repressori, joka keksinnön periaatteiden mukaisesti saadaan faagista X yhdessä XPR:n kanssa ja liitetään plasmidiin Bglll-palaseksi (ks. 15 liitteenä olevia plasmidikarttoja, kuviot 4-11). Villityyp-pinen cl-repressori ei itsessään ole lämpötilalle herkkä, joten käytetty erityinen cl-repressori (ks. seuraavia esimerkkejä) on lämpötilaherkkä, jota koodittaa mutanttialleeli cl857 (Sussman & Jacob, Compt. Rend. Acad. Scil 254. 1962, 20 1517), ja näin ollen replikoitumistapa voidaan säädellä kas- vatuslämpötilaa muuttamalla. Repressori on aktiivinen eli se tukahduttaa XPR-promoottorin matalissa lämpötiloissa, kuten noin 30°C:ssa, kun taas korkeammissa lämpötiloissa, kuten yli 39°C:ssa, se denaturoituu saaden aikaan repressorivaiku--•-25 tuksen inaktivoitumisen ja XPR:ään kohdistuvan repression poistumisen. Koska liitetty promoottori on hyvin voimakas, tapahtuu repA:n suuntaan tapahtuvan transkription erittäin voimakas lisääntyminen, joka vuorostaan saa aikaan plasmidin lisääntyneen replikoitumisen.
30
Vaihtoehtoisesti voidaan promoottorin säätö saada aikaan kemiallisesti eli muuntamalla isäntämikro-organismin kasvualustaa joko lisäämällä promoottoria indusoivaa kemikaalia, . joka vaikuttaa esim. siten, että promoottorin aktiivisuutta 35 ohjaava repressori inaktivoituu ja tämän seurauksena promoottoriin kohdistuva repressio poistuu, tai takaamalla promoottoria indusoivan aineenvaihduntatuotteen muodostuminen niin, että promoottori aktivoituu. F. colin deo-promoottori 39941 19 on erityisesimerkki kemiallisesti indusoitavasta promoottorista, johon kohdistuu kahden kromosomaalisen repressiopro-teiinin, deoR- ja cytR-geenin tuotteiden, suorittama negatiivinen ohjaus. Deo-promoottorin repressiovaikutus voidaan 5 poistaa lisäämällä kasvualustaan sytidiiniä, koska sytidiini tarttuu repressoriin aiheuttaen siihen konformationaalisen muutoksen, jonka tuloksena se lakkaa toimimasta repressori-na. Lisäksi voidaan deo-promoottorista lähtevään ilmentymiseen kohdistaa positiivinen ohjaus kataboliittirepression 10 välityksellä. Kun crp-proteiini (catabolite repressor protein, kataboliittirepressoriproteiini) aktivoidaan syklisellä AMP:llä (cAMP), deo-promoottoriaktiivisuus stimuloituu; tiedetään, että solun sisältämät suuret cAMP-pitoisuudet ovat yhteydessä mataliin glukoosipitoisuuksiin tai glukoosin 15 puuttumiseen kasvualustasta, ja suuri cAMP-pitoisuus voidaan saavuttaa lisäämällä alustaan vain rajoitettu määrä glukoosia, esim. noin 0,01 %, ja lisäksi vielä muuta hiililähdet-tä, kuten glyserolia tai sukkinaattia. Kun solu on kuluttanut glukoosin loppuun, tästä seuraava solunsisäinen cAMP-20 määrän kasvu aktivoi deo-promoottorin, joka aikaansaa promoottoria kantavan plasmidin replikoitumisnopeuden kasvun. Näin ollen, jos deo-promoottori liitetään plasmidi Rl:n joh-: dannaiseen copB-geenin yläpuolelle, saa promoottorin indu- soituminen aikaan lisääntyneen tai täysin ohjaamattoman rep-.•:25 likoitumisen. Ohjaamaton replikoitumiskäyttäytyminen voidaan kääntää päinvastaiseksi lisäämällä kasvualustaan glukoosia, jolloin plasmidin kopioluku laskee hitaasti indusointia edeltävälle tasolle. Toinen esimerkki kemiallisesti säädeltävästä promoottorista on lac-promoottori, joka indusoituu 30 kasvualustan sisältämän laktoosin vaikutuksesta, ja seurauksena on lisääntynyt replikoituminen. Myös tässä tapauksessa : voidaan prosessi kääntää annostelemalla laktoosi siten, että solut käyttävät sen ajan mittaan loppuun.
•35 Kun säädeltävää promoottoria kantava DNA-palanen sijoitetaan : · oikeaan asemaan ja suuntaan kohtaan, josta osa luontaisesta replikoitumista säätelevästä geenistä on poistettu, esim. sen Bglll-palasen paikalle, joka kattaa osan plasmidin Rl : 9 9 ' 1 20 7 ' 1 copB-geenistä, saadaan aikaan plasmidijohdannainen, jonka replikoitumisnopeus on ainakin osaksi liitetyn promoottorin ohjauksessa (A-tyypin plasmidi).
5 Kun säädeltävää promoottoria kantava DNA-palanen sijoitetaan oikeaan suuntaan välittömästi luontaisen replikoitumista säätelevän geenin yläpuolelle, joka plasmidi Rl-johdannaisten tapauksessa on copB-geeni, saadaan tulokseksi plasmidi, jolla on hieman erilaiset replikoitumisominaisuudet (B-tyy-10 pin plasmidi).
Kuten edellä on mainittu, B-tyypin plasmidit, joista puuttuu par-alue, menetetään noin 1 % taajuudella sukupolvea kohti. Jollei plasmidien säilymiseen viljelmässä kohdisteta valin-15 tapainetta, plasmidi menetetään lopulta soluista noin 30°C:ssa tapahtuvassa kasvatuksessa. Jotta plasmidi saataisiin stabiloiduksi, on B-tyypin plasmidiin mahdollista sisällyttää esim. villityyppisestä Rl-plasmidista saatu, par-aluetta kantava DNA-palanen, jolloin saavutetaan plasmidin 20 täydellinen stabiilisuus (ei menetetä lainkaan) soluissa, joita kasvatetaan samoissa olosuhteissa. Plasmidin stabiilisuus voidaan määrittää kasvattamalla ensin soluja, joissa on :: B-tyypin plasmideja, joihin on liitety lac-geenejä sekä par- alue, ja verrokkeina soluja, jotka sisältävät B-tyypin plas--25 mideja, joissa on lac-geenit mutta ei par-aluetta, selektiivisesti levyillä, jotka sisältävät antibioottia (joita vastaan plasmidit antavat vastustuskyvyn), jotta voidaan varmistua kummankin plasmidilaadun läsnäolosta lähtöpesäkkeis-sä. Molemmista pesäkkeistä viirutetaan sen jälkeen näytteet 30 levyille, joissa ei ole antibioottia, jolloin solut jäävät kasvamaan ilman valintapainetta useiden sukupolvien (solujen jakautuminen) ajaksi, kuten esimerkiksi 25 sukupolven ajaksi. Lopuksi kummastakin näin saadusta pesäkkeestä viirute-: taan näyte McConkey-laktoosi -indikaattorilevyille, joissa 35 alunperin par-aluetta kantavan plasmidin sisältäneet solut muodostavat punaisia pesäkkeitä, mikä osoittaa, että plasmidit ovat säilyneet, kun taas verrokkisolut, joiden plasmi-deissa ei alun perin ollut par-aluetta, muodostavat sekä
II
21 89 941 punaisia että värittömiä pesäkkeitä, mikä tarkoittaa, että valintapaineettomana aikana eräät solut ovat menettäneet plasmidinsa. Näin on tullut osoitetuksi, että par-alueen sisältävät plasmidit ovat tulleet täysin stabiileiksi (ks.
5 esimerkki 11). Tämä stabiloiva vaikutus on erityisen tärkeä, jos liitetty DNA-jakso pienentää plasmidia kantavien solujen kasvunopeutta verrattuna plasmidivapaiden solujen kasvunopeuteen.
10 Lopuksi, kun luontaista replikoitumisenohjausgeeniä kantava DNA-jakso, kuten plasmidin Rl copB-geeni, sijoitetaan A-tyypin plasmidin replikoitumisalueen ulkopuolella olevaan kohtaan, saadaan erityisiä replikoitumisominaisuuksia omaava plasmidi (C-tyypin plasmidi).
15
Edullisena ominaisuutena pidetty plasmidin pysyvyys, jota on edellä selostettu B-tyypin plasmidien yhteydessä, on vielä selvempi C-tyypin plasmideilla, koska, kuten edellä on mainittu, näillä on vieläkin pienempi kopioluku matalassa läm-20 pötilassa ja ne menetetään suuremmalla taajuudella kuin B-tyypin plasmidit, jos niiltä puuttuu par-alue. C-tyypin plasmidit voidaan stabiloida vastaavasti sijoittamalla par-alue plasmidiin, joka ei ennestään sitä sisällä.
:"25 Tämän keksinnön eräs erityispiirre koskee lisäksi plasmidia, joka ensimmäisen säädeltävän promoottorin ohella kantaa toista promoottoria, joka sijaitsee replikoitumisalueen ul--’· kopuolella ja säätelee liitetyn, vieraan rakennegeenin, ku ten esim. haluttua polypeptidiä koodittavan geenin, ilmenty-30 mistä. Tämä lisäpromoottori voi olla esimerkiksi cl-promoot-tori, joka sijaitsee jaksossa, joka sisältää lisäksi Xpr-promoottorin, ja cl-geenin, ja jota cl-promoottoria ohjaa cl-geenituote, ja joka cl-promoottori tulee transkriboiduksi — vastakkaiseen suuntaan XPR:ään verrattuna, cl-promoottorin •35 alapuolelle on mahdollista liittää rakennegeeni, jota tämä promoottori säätelee. Esimerkiksi lac-geenejä (tunnetaan lac-operonina), joista puuttuu lac-promoottori, on sijoitettu cl-geenin alapuolelle, ja saavutettu suurempi geenituote- 22 39941 määrä viittasi siihen, että lac-geenien transkriptio oli ainakin osittain cl-promoottorin ohjauksessa (ks. esimerkki 8). Näin ollen on voitu osoittaa, että keksinnön mukaisia plasmideja on mahdollista käyttää kloonausvektoreina vierai-5 den geenien liittämisessä, cl-promoottorilla on se etu, että se on myös säädeltävissä cl-repressorilia, joten geenituotteen määrä lisääntyy samanaikaisesti plasmidi-DNA-määrän lisääntymisen kanssa.
10 Toinen promoottori voi myös olla λ-promoottori, kuten XPL, tai se voi olla recA-promoottori. Kun toinen promoottori on XPL, se voidaan sijoittaa plasmidin faagista X otettuna BamHl-BglII-palasena, jolloin saadaan aikaan edullinen kloo-nauskohta (BamHl) erilaisten restriktioentsyymien, kuten 15 BamHl, Bglll, Sau3A ja Bell, avulla saatujen DNA-jaksojen liittämistä varten. XPL voidaan myös liittää sopivaan DNA-palaseen, joka on saatu promoottoria kantavasta plasmidista. Xpl on edullinen toisena promoottorina, koska lämpötilalle herkkä cl-repressori ohjaa myös sitä, joten määrän kasvun 20 edellyttämät ominaisuudet ovat samat.
Jos toisaalta promoottori on recA, se voidaan sisällyttää keksinnön mukaiseen plasmidiin BamHl-palasena, joka on peräisin esim. pBEU14:sta (Uhlin and Clark, J. Bact. 148.
:35 1981, 386-90). Tämä promoottori toimii eri tavoin riippuen siitä mikrobikannasta, joka on transformoitu recA-promootto-ria kantavalla plasmidilla. recA-kannassa recA:ta ohjaa lexA-repressori, joka sijaitsee mikro-organismin kromosomissa. Kun esimerkiksi ohjaamaton replikoituminen indusoidaan 30 lämpötilan avulla, plasmidin kopioluku ja näin ollen recA-promoottorimäärä kasvaa vähitellen. Koska lexA-repressoria syntyy vain pieni määrä ja se toimii sitoutumalla tiukasti recA-promoottorialueeseen, tarjolla oleva lexA-repressori-määrä titrautuu vähitellen kopioluvun kasvaessa. Näin ollen j5 recArn repressio poistuu vähitellen, ja kopioluvun kasvaessa recArsta lähtevä transkriptio vastaavasti.
Il 23 89941
Keksinnön mukaiset plaamidit kloonaus- ia tuotantovektoreina Kloonaus- ja tuotantovektoreina on keksinnön mukaisilla plasmideilla joukko luonteenomaisia piirteitä: 5 1) Plasmidit ovat pieniä, sillä niiden molekyylipaino on noin 4,0 - 12,5 x 106 daltonia. Pieni koko helpottaa käsittelyä ja parantaa transformoitumistehoa.
2) Plasmideissa on joukko ainoita restriktioentsyymien 10 tunnistuskohtia. Termillä "ainoa" tarkoitetaan sitä, että plasmidissa on tietylle restriktioendonukleaasille vain yksi ainoa katkaisukohta.
Kuten jo edellä on mainittu, ei replikoitumisalueen sisällä 15 olevia restriktiokohtia hyväksytä kloonauskohdiksi. Näin ollen seuraavissa esimerkeissä kuvatuissa plasmideissa olevat Sali- ja Pstl-katkaisukohdat eivät sovellu kloonauskohdiksi, koska ne sijaitsevat plasmidin replikonissa, kun taas EcoRl- ja BamHI-katkaisukohdat eivät sijaitse tällä kriitti-20 sellä alueella ja ovat näin ollen käyttökelpoisia vieraan DNA:n liittämiskohtia. Jos plasmidissa itsessään ei ole sopivaa katkaisukohtaa, se voidaan liittää siihen pienenä DNA-jaksona (nimeltään sidoksenmuodostaja), joka sisältää tällaisen kohdan, kuten esimerkissä 4 on selostettu.
/25
Jotta voitaisiin taata liitetyn rakennegeenin ilmentyminen, tarvitaan myös asianmukainen luennanaloitussignaali (ri-bosomaalinen sidoskohta), joka sijaitsee rakennegeenin itsensä yläpuolella, mutta toisen promoottorin alapuolella.
. 3.0
Yksi tapa varmistaa ribosomaalisen sidoskohdan läsnäolo on se, että liitetään erilaisia DNA-palasia (esim. sidoksenmuo-dostajina), jotka voidaan valmistaa synteettisesti, ja joista jokainen kantaa eri rakennegeenin luennanaloitussignaa--35 lia. Vaihtoehtoisesti voidaan karkurikloonausvektoreihin sijoittaa in toto DNA-jakso, jonka kantaman geenin jo ennestään tiedetään ilmentyvän mikro-organismeissa, jolloin voidaan taata oikean luennanaloitussignaalin läsnäolo.
09941 24 3) Vaikka, kuten edellä on mainittu, kloonausvektorin on edullista olla niin pieni kuin mahdollista, saattaa monia tarkoituksia ajatellen olla käytännöllistä, että kloonaus-vektorissa on ns. merkkiä ilmentävä geeni, sillä tämän avul-5 la on helppo tunnistaa ja/tai valita plasmidia kantavat solut. Hyödyllinen merkki on antibioottiresistenssi, esimerkiksi ampisilliiniresistenssi, koska sen avulla on helppo yhdistelmäplasmidilla tapahtuneen transformoinnin jälkeen erottaa ne solut, jotka eivät ole saaneet yhdistelmäplasmi-10 dia. Toinen merkki, joka on läsnä kaikissa seuraavissa esimerkeissä kuvatuissa plasmideissa, on X-immuniteetti, jota cl-geeni koodittaa. Vielä eräs keksinnön mukaisten plasmi-dien hyödyllinen ominaisuus voi olla sellaisen geenin läsnäolo, joka välittää valittavissa olevan fenotyypin, jonka 15 geenin sisällä on ainut katkaisukohta. Kun tähän kohtaan sijoitetaan DNA-jakso, on seurauksena liittämisestä johtuva geenin inaktivoituminen. Tästä on esitetty tapaus esimerkissä 9 niin, että kyseessä on Lac+-fenotyypin välittävä geeni, ja esimerkissä 12 niin, että kyseessä on kloramfenikolire-20 sistenssiä koodittava geeni. Kun keksinnön mukaiseen plas-midiin halutaan kloonausvektorina käyttöä varten sijoittaa merkki, kuten antibioottiresistenssi, tämä voidaan suorittaa paikan vaihdolla tai sijoittamalla vieras DNA-palanen sinänsä tunnetulla tavalla. Esimerkki tällaisesta paikanvaihdosta .-'25 on esitetty esimerkissä 4.
Viljelymenetelmät
Keksintö tarjoaa myös menetelmän plasmidi-DNA:n geenituotteen valmistamiseksi siten, että viljellään mikro-organis-30 mia, joka sisältää säädeltävää promoottoria kantavan plasmi-din siten, että transkriptio säätelee replikoitumista erityisesti niin, että promoottorista lähtevä lisääntynyt transkriptio johtaa oleellisesti lisääntyneeseen plasmidiko-piolukuun, ja kyseisessä menetelmässä on ainakin yksi sel-35 lainen viljelyjakso, jonka olosuhteet takaavat säädeltävästä promoottorista lähtevän lisääntyneen transkription, joka johtaa oleellisesti lisääntyneeseen plasmidikopiolukuun, ja mikrobiviljelmästä otetaan talteen plasmidin geenituote.
1/ 25 39941
Viljely sinänsä voidaan suorittaa tavanomaisilla menetelmillä, mukaanluettuna tavanomaiset ravinnealustat, joiden tiedetään olevan optimaalisia kyseessä olevalle mikrobilajille. Myös geenituote otetaan talteen ennestään tunnetuilla mene-5 telmillä, jotka on sovitettu kyseisen geenituotteen ominaisuuksien, isäntämikro-organismien ominaisuuksien jne, mukaisiksi. Tämä keksintö tarjoaa myös menetelmän, jolla isäntä-mikro- organismia, joka on transformoitunut keksinnön mukaisella plasmidilla, kasvatetaan sellaisissa olosuhteissa, 10 jotka johtavat pieneen vakioplasmidikopiolukuun alkukasva-tusvaiheessa ja lisääntymisvaiheessa, kunnes haluttu solu-määrä on saavutettu, ja jolla sen jälkeen kasvatetaan isäntämikro- organismia olosuhteissa, jotka johtavat oleellisesti lisääntyneeseen plasmidikopiolukuun.
15 Näin ollen viljely voidaan aluksi suorittaa sellaisissa olosuhteissa, joissa promoottorista lähtevä transkriptio ei oleellisesti vaikuta plasmidin kopiolukuun, ja vasta tämän jälkeen lisätään kasvualustaan riittävä määrä ainetta, joka 20 indusoi promoottorin toimimaan niin, että tapahtuu oleellisesti lisääntynyt replikoituminen. Haluttaessa nämä viljely-olosuhteet voidaan kääntää sellaisen ajan kuluttua, joka on riittävä plasmidimäärän oleelliseksi lisäämiseksi, mutta riittävän lyhyt estämään mikrobikasvuaton olennaisen vahin-.‘•'25 goittumisen, ja aine poistetaan kasvualustasta niin, että seurauksena plasmidikopioluku laskee saavuttaen lopulta in-dusointia edeltäneen tason. Tässä yhteydessä termillä "poistaa" ei välttämättä tarkoiteta kyseisen aineen täydellistä poissaoloa kasvualustasta, vaan ainoastaan aineen pitoisuu-. 30 den vähentämistä sellaiselle tasolle, ettei se enää vaikuta.
'·' Vaihtoehtoisessa menetelmässä, jossa käytetään tietyllä ai- neella inhiboitavaa eikä indusoitavaa promoottoria, mikrobia voidaan ensin viljellä kyseisen promoottorin aktiivisuutta ..· 35 inhiboivan aineen läsnäollessa, ja sen jälkeen aineen pitoisuus alennetaan esim. laimentamalla kasvualusta tai siten, että solut vähitellen kuluttavat aineen loppuun, jolloin promoottori aktivoituu ja saa aikaan oleellisesti lisäänty- 39941 26 neen plasmidikopioluvun. Haluttaessa voidaan viljelyolosuhteet kääntää, kun on kulunut riittävä aika plasmidimäärän lisääntymisen saavuttamiseksi, mutta vielä ei kuitenkaan mikrobikasvustolle ole aiheutunut vahinkoa, ja kääntäminen 5 tapahtuu lisäämällä promoottorin aktiivisuutta estävä määrä ainetta, jolloin plasmidikopioluku pienenee hitaasti ja saavuttaa lopulta indusointia edeltäneen tason.
Mikro-organismin viljelyolosuhteet voivat sisältää myös ai-10 nakin yhden jakson, jonka aikana lämpötila on sellainen tai lähellä sitä lämpötilaa, jossa plasmidikopioluku on oleellisesti lisääntynyt.
Jos säädeltävä promoottori on riippuvainen lämpötilasta tai 15 lämpötilalle herkän tekijän ohjauksessa, on edullista, että keksinnön mukaisella plasmidilla transformoituneen mikro-organismin viljely tuotantokokoa olevaan viljelmään asti suoritetaan lähellä sitä lämpötilaa tai siinä lämpötilassa, jossa plasmidilla on matala vakiokopioluku, jotta vältettäi-20 siin kasvavan plasmidimäärän tai geenituoteväkevyyden mikrobin kasvua estävä vaikutus. Sitten lämpötila voidaan siirtää sellaiseen lämpötilaan, jossa plasmidin kopioluku on oleellisesti lisääntynyt. Sopivan tuotantoajän jälkeen, mielellään sitten, kun plasmidi-DNA:n ja/tai geenituotteen määrä :'25 estää mikro-organismin kasvun, otetaan tuote talteen. Erityisolosuhteista riippuen voi olla hyvä suorittaa viljely jatkuvasti lämpötilassa, joka vain lähestyy sitä lämpötilaa, jossa plasmidikopioluku lisääntyy, jotta voidaan pitää isän-tämikro-organismi hengissä ja jatkuvassa kasvussa ja saman -30 aikaisesti saada muodostumaan suurempia määriä plasmidin geenin aikaansaamaa tuotetta (jota sitten voidaan jatkuvasti tai ajoittain ottaa talteen sinänsä tunnetulla tavalla).
Vaihtoehtoisesti voidaan mikro-organismi kasvattaa tuotanto-35 kokoiseksi viljelmäksi lämpötilassa, jossa plasmidikopioluku on vakio, ja sen jälkeen lämpötila siirretään sille tasolle tai lähelle sitä tasoa, jossa plasmidikopioluku on oleellisesti lisääntynyt, ja tätä lämpötilaa pidetään yllä sellai- 89 9 41 27 nen aika, joka riittää plasmidimäärän oleelliseen kohoamiseen, mutta on riittävän lyhyt, jottei mikrobiviljelmä vahingoitu oleellisesti, ja sen jälkeen lämpötila siirretään vielä kerran sille tasolle, jossa plasmidikopioluku on va-5 kio, ja tuotantoviljelyä jatketaan tässä viimeksi mainitussa lämpötilassa, joka aiheuttaa plasmidikopioluvun hitaan laskun lopuksi alkuperäiselle tasolle. Tämä viljelymenetelmä on erityisen tärkeä, kun plasmidiin sijoitettu vieras geeni on saatu organismista, joka ei elä yli 30°C:ssa, koska tällai-10 sen geenin aikaansaamat geenituotteet saattavat denaturoitua korkeammissa lämpötiloissa. Lisäksi geenituotesaannot ovat yleensä suurempia, kun käytetään tätä viljelymenetelmää (ks. esimerkki 16, vrt. Uhlin et ai., Gene 6, 1979, 91-106, taulukko II) .
15 Lämpötila, jossa plasmidin kopioluku on oleellisesti lisääntynyt, voi olla korkeampi kuin se lämpötila, jossa plasmi-dilla on matala vakiokopioluku. Tämä korkeampi lämpötila voi olla esim. alueella noin 36-42°C.
20
Seuraavaksi selostetaan piirroksia, joissa: kuvio 1 on kaaviokuva villityyppisen plasmidin Rl replikoi-; tumisalueesta, :’:'25 kuvio 2 on seuraavissa kuvioissa käytettyjen symbolien avain, ja kuviot 3-14 esittävät esimerkeissä kuvattujen plasmidien restriktiokarttoja.
. 30 Kuvio 1 on kaavioesitys plasmidin Rl perusreplikonista, jos-; : sa varjostetut alueet tarkoittavat luetuksi tulevia alueita, avoimet alueet tarkoittavat transkriptejä, ja katkoviivat tarkoittavat mahdollisia transkriptejä. Renkaan sisälle piirretyllä suurennetulla hiusneulamutkan kuvalla on tarkoi-..'35 tus tuoda esille CopA-RNA:n suuri sekundäärisen rakenteen määrä. Ori tarkoittaa replikoitumisen alkua. Vaakasuorassa olevat nuolet tarkoittavat transkription suuntaa.
28 39941
Kuvio 2 on seuraavissa kuvioissa käytettyjen symbolien avain, jossa A tarkoittaa Rl-tyypin plasmidien DNA:ta, B tarkoittaa bakteriofagista λ (ED\4) saatua DNA:ta, C tarkoittaa transposonista Tn3 (ED\Tn3) saatua DNA:ta, D tar-5 koittaa plasmidista pBR322 saatua DNA:ta, E tarkoittaa plas-midista pMC87l saatua DNA:ta, F tarkoittaa plasmidista pVHl424 saatua DNA:ta, G tarkoittaa plasmidista pSKS104 saatua DNA:ta, H tarkoittaa rakennegeenejä ja tärkeitä kohtia, I tarkoittaa promoottoria, johon on merkitty transkription 10 suunta ja J tarkoittaa plasmidin kokoasteikkoa. Tyhjä alue tarkoittaa plasmidista pBEU14 saatua DNA:ta.
Kuvioissa 3-14 on esitetty esimerkeissä kuvattujen plasmidien lineaariset restriktiokartat, joissa Rl-tyypin plasmidien 15 genotyypit on merkitty vaakasuoran viivan yläpuolelle. Näin ollen copB tarkoittaa geeniä, joka koodittaa sellaista poly-peptidiä, joka tukahduttaa repA-promoottorista lähtevän transkription geenien copB ja copA välillä; copA tarkoittaa geeniä, joka koodittaa sellaista RNA-molekyyliä, joka estää 20 RepA-mRNA:n luetuksi tulemisen; repA tarkoittaa geeniä, joka koodittaa sellaista proteiinia, joka tarvitaan plasmidin Rl replikoitumiseen; ori tarkoittaa replikoitumisen vegetatii-vista alkukohtaa; aphA tarkoittaa kanamysiiniä koodittavaa geeniä; bla tarkoittaa ampisilliiniresistenssiä koodittavaa ;35 geeniä; IacA, IacY ja IacZ tarkoittavat liitettyä lac-ope- ronia, joista IacA koodittaa trans-asetylaasia, IacY koodittaa permeaasia ja IacZ koodittaa β-galaktosidaasia; cl857 tarkoittaa geeniä, joka koodittaa XPR-promoottorin lämpöti-laherkkää repressoria, tnpR ja tnpA geenejä, jotka kooditta-30 vat Tn3:n paikanvaihtofunktioita; par tarkoittaa aluetta, jolle kuuluu plasmidin jakautuminen; recA tarkoittaa yhdis-telmäproteiinia koodittavaa geeniä; ja PrecA tarkoittaa recA-promoottoria. Vaakasuoran viivan alapuolella on esitetty restriktioentsyymien katkaisukohdat, joista P tarkoittaa j5 PstI, B2 tarkoittaa Bglll, Sx tarkoittaa Sali, E tarkoittaa
EcoRI, H3 tarkoittaa Hindlll, Bx tarkoittaa BamHI, S tarkoittaa Smal, 6363^ tarkoittaa Bglll- ja BamHI-kohdan fuusiota ja C tarkoittaa Clal. Kuviossa 11 esitetty plasmidi on piirret- 11 • j 9 9 41 29 ty samaan mittakaavaan kuin muiden kuvioiden plasmidit ja kaarisululla merkitty liitännäinen tarkoittaa mukaan liitettyjä lac-geenejä.
5 Käytetty Escherichia coli K-12-kanta oli CSH50 (Δ pro-lac, rpsL; ks. J. Miller: Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1972). Käytössä oli useita plasmideja (taulukko 1) ja bakteriofageja (taulukko 2).
10 Kokeissa käytettiin tavallisia mikrobigenetiikan menetelmiä (J. Miller: Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1972) ja yhdistelmägeenitek-niikkaa (Davis, Botstein and Roth; A Manual for Genetic Engineering; Advanced Bacterial Genetics, Cold Spring 15 Harbor, New York, 1980) .
Kaikkia soluja kasvatettiin LB-alustassa (Bertani, J. Bact.
62. 1951, 293) tai A+B-minimialustassa (Clark and Maaloe, J. Mol. Biol. 21, 1967, 99) ja levyinä käytettiin LA-levyjä, 20 joissa oli LB-alustaa ja 1,5 % agaria. Plasmidi-DNA:n valmistus ja analysointi suoritettiin käyttämällä dye-boyant -tiheysgradienttisentrifugointia menetelmällä Stougaard & Molin, Anal. Biochem. 118. 1981, 191. DNA:n merkitseminen ja lysaattien valmistaminen plasmidipitoisuuden määrittämiseksi :25 suoritettiin menetelmällä Molin et ai., J. Bact., 138. 1979, 70. Plasmidi-DNA:n suhteellinen määrä mitattiin gradientin plasmidiraidan sisältämän merkityn tymidiinin määränä ver-rattuna gradienttien kromosomiraidan vastaavaan määrään.
. 30 Esimerkkien restriktioentsyymirestriktiot suoritettiin valmistajan ohjeiden mukaan. Osittaiset restriktioentsyymeillä ' tapahtuneet katkaisut suoritettiin käyttämällä entsyymejä 10-kertaisesti laimennettuina.
..'35 Lisäksi käytettiin seuraavia seulontamenetelmiä: 30 89941 l. Seulonta λ-immuniteetin suhteen (immX+)
Kaikissa kuvatuissa esimerkeissä käytetään cl857-alleelimu-tanttia. Tätä geeniä kantavat plasmidit tekevät E. coli -isännän vastustuskykyiseksi lyyttisten λ-faagien aiheutta-5 malle infektiolle 30°C:ssa. Vastustuskykyisten solujen löytämiseksi levyille lisätään 108 Xb2-faagia ennen bakteerien levittämistä. Eloonjääneet pesäkkeet tutkitaan plasmidipi-toisuuden suhteen.
10 2 . Seulonta copB'1': n suhteen
Rakennetaan yhdistelmägeeni repA-promoottorista ja lac-ope-ronista, josta lac-promoottori on poistettu, ja sijoitetaan se plasmidiin pi5 (pGA46). Yhdellä saaduista yhdistelmäplas-mideista, p«JL217, on Lac+-fenotyyppi Alac E. coli - isäntä-15 kantaan sijoitettuna.
Lac+-fenotyyppi on helppo havaita McConkey-laktoosi-indi-kaattorilevyillä (punaiset pesäkkeet). Jos copB+-geeni on läsnä pJL217:ää kantavissa soluissa, on seurauksena Lac'-20 fenotyyppi, joka ilmenee valkoisina pesäkkeinä indikaattori- levyillä. Näin ollen copB+-hybridit on helppo erottaa Lac'-pesäkkeinä, kun plasmidi-DNA transformoidaan E. coli Alac-soluihin, joissa on plasmidi pJL2l7.
: 25 Taulukko 1 Käytetyt plasmidit
Plasmidi Lähde_ pKN1562 S. Molin et ai., J. Bact., 138, 1979, sivut 70-30 79.
pBR322 F. Bolivar et ai., Gene 2, 1977, s. 95.
pJL217 Rakennettu sijoittamalla repA-promoottoria kantava, pKN1562:sta saatu Sau3A-palanen pJL207:n Bglll-kohtaan, joka on hybridiplasmidi, joka kan-35 taa lac-geenejä ilman lac-promoottoria.
pOU16 Light & Molin, Mol. Gen. Genet. 184, 1981, s. 57.
PGA46 An & Friesen, J. Bact. 140, 1979, sivut 400-407.
pMC903 Casadaban et ai, J. Bact. 143, 1980, s. 971.
Il 31 89941 pMC87l Casadaban et al, op. cit.f 1971.
pVH1424 P. Valentin-Hansenin rakentama sijoittamalla plasmidista pVHl7 saatu deo-promoottoria kantava Sau3A-palanen (Valentin-Hansen et ai., EMBO J., 5 1982, 317) plasmidin pMC1403 BamHI-kohtaan (Casa daban et al, op. cit., 971). pSKS104 C. Casadabanin rakentama sijoittamalla pM13mp7:stä saatu PvuII-palanen, jossa on promoottori ja luennanaloitusalue (Messing et al., 10 Nucleic Acids Res. £, 1981, 309) pMC1403:n Smal- kohtaan ja suorittamalla sen jälkeen homologinen rekombinaatio IacZ-jaksojen välillä. pKN184 Nordström et al, Plasmid 4, 1980, 322.
pJL3 Molin et al., Mol. Gen. Genet. 181, 1981, 123- 15 130.
pVH1451 Valentin-Hansen et al., op. cit.
pBEU14 Uhlin & Clark, J. Bact. 148, 1981, 386-90.
pMC1403 Casadaban et al, J. Bact. 143, 1980, s. 971.
20 Taulukko 2 Käytetyt bakteriofagit
Faagi Lfrhd.e_ EDX4 Dempsey & Willetts, J. Bact. 126, 1976, s. 166.
::25 ED\Tn3 Nordström, Molin, Aagaard-Hansen, Plasmid, 4, 1980, sivut 215-217.
Kantaplasmidit
Plasmidi pKN1562 on plasmidin Rl johdannainen ja kaikilta . 30 oleellisilta osiltaan rakennettu menetelmällä Molin et al.: "Clustering of Genes Involved in Replication, Copy Number Control, Incompatibility, and Stable Maintenance of the Resistance Plasmid Rldrd-19", J. Bact. 138. 1979, sivut 70-79, lukuunottamatta myöhemmän tutkimuksen mukanaan tuomia ..'35 harvoja muutoksia. pKN1562:n molekyylipaino on 6,9 x 106 daltöniä ja sen genotyyppi on seuraava: copA+, copB+, repA+, aphA+, Apar (ks. kuvio 3). Se kantaa kanamysiiniresistens-siä. Plasmidilla on villityyppisen plasmidin replikoitumis- 32 o 9 9 41 ominaisuudet, mikä tarkoittaa kopiomäärää 3-5 nopeasti kasvavaa solua kohti, ja plasmidi menetetään 1 % taajuudella sukupolvea kohti, koska par-geeni puuttuu (jakautumisgeeni).
5 Kun pKNl562 katkaistaan BglII:lla niin, että osa copB-gee-nistä poistuu ja tarttuvat päät liitetään yhteen, saadaan aikaan toinen plasmidi, pJL20. Tämän plasmidin molekyylipai-no on 6,7 x 106 daltonia ja sen genotyyppi on seuraava: copA+, ΔοορΒ, repA+, aphA+, Apar. Plasmidin kopioluku on 25-10 40 nopeasti kasvavaa solua kohti eikä plasmidin menetyksiä esiinny. Myös tämä plasmidi saa aikaan kanamysiiniresistens-sin.
Plasmidien nimitykset 15 Huomattakoon, että tässä patenttihakemuksessa käytetään uutta nimitystä pOU... plasmideista, joista on käytetty nimitystä pJEL... perushakemuksen esimerkeissä ja piirroksissa.
Esimerkki 1 20 POU51:n rakentaminen ia karakterisointi
Plasmidin pJL20 ja faagin ED\4 DNA valmistettiin tavanomaisilla menetelmillä. Plasmidi- ja faagi-DNA sekoitettiin keskenään niin, että kunkin lopulliseksi pitoisuudeksi tuli 20 μg/ml, ja lopullinen tilavuus oli 100 μΐ, katkaistiin •:25 Bglllrlla 10 minuuttia, inaktivoitiin lämmön avulla 10 minuuttia 70°C:ssa ja liitettiin yhteen T4 DNA-ligaasin avulla 15°C yön ajan. E. coli -kanta CSH50 transformoitiin liittä-misseoksesta otetuilla erilllä. Transformantit valittiin levyillä, jotka sisälsivät 50 Mg/ml kanamysiiniä, ja joille 30 oli levitetty suspensiona noin 109 Xb2-hiukkasta. Levyjä inkuboitiin 20 tuntia 30°C:ssa.
Eloon jääneet pesäkkeet eristettiin uudestaan ja niiden Xb2-resistenssi tutkittiin ristikkäisviirutuksella 30°C:ssa, j5 kasvu 42°C:ssa tutkittiin viiruttamalla Km-levyille 42°C:ssa ja plasmidin molekyylipaino määritettiin valmistamalla plas-midi-DNA ja analysoimalla se agaroosigeelillä.
li 89941 33 Tällä tavalla löydettiin plasmidi pOU51, joka antaa vastustuskyvyn Lm- ja X-tartunnan suhteen, tekee isäntäorganismin kasvultaan lämpötilalle herkäksi ja sisältää pJL20:ssa faa-gi-DNA-liitännäisen, jonka koko on noin 1,6 x 106 daltonia.
5 Plasmidin kokonaismolekyylipaino oli 8,4 x 106 daltonia.
Nämä ominaisuudet ovat kaikki plasmidin kantamia, koska uudet E. coli -vastaanottajakannat saavat kaikki plasmidin fenotyyppiset ominaisuudet, kun ne transformoituvat pOU51-DNA:11a.
10 pOU51:stä valmistettiin DNA ja plasmidi kartoitettiin res-triktioentsyymeillä siten, että plasmidi-DNA puhdistettiin, katkaistiin restriktioentsyymillä(eillä) ja näin syntyneet palaset analysoitiin agaroosigeelielektroforeesilla (ks. ku-15 vio 4). Liitetty 1,6 x 106 daltonin palanen saatiin tällä tavalla identifioiduksi faagin Bglll-palaseksi, joka kantoi cl-repressorigeeniä (antaa X-immuniteetin 30°C:ssa) ja Xpr-promoottoria, ja liitetyn palasen suunta määritettiin kuviossa 4 esitetyksi. Restriktiokartasta ilmenee selvästi, 20 että pOU51:ssä on yksi ainoa EcoRI-restriktioendonukleaasin tunnistuskohta, jonka ansiosta plasmidia on mahdollista käyttää kloonausvektorina.
Plasmidin vaikutus solujen kasvuun tutkittiin suorittamalla . :2.5 kasvatus kasvatusalustassa 30°C:ssa. Siinä vaiheessa, kun 4..; kasvu oli eksponentiaalista, lämpötila nostettiin 42°C:een ja solujen kasvua seurattiin (määritettiin spektrofotometri-sesti). Kun kasvatusta oli jatkettu 1,5-2 tuntia 42°C:ssa, kasvu pysähtyi.
30
Plasmidi-DNA-pitoisuus määritettiin edellä kuvatulla tavalla : 10 ml:n viljelmistä, joissa käytettiin A+B-minimialustaa, johon oli lisätty 0,2 % glukoosia ja 1 % kasaminohappoja.
- Yksi 10 ml:n viljelmä merkittiin 50 ^Ci:llä 3H-tymidiiniä .35 30°C:ssa ja toinen sai isotoopin heti, kun lämpötila oli nostettu 42°C:een, ja vaikutuksen annettiin jatkua solujen kasvun loppumiseen asti. Plasmidi-DNA:n suhteellinen pitoisuus oli 2 % 30°C:ssa vastaten 25-40 plasmidikopiota solua 34 89941 kohti. 42°C:ssa suhteellinen pitoisuus oi yli 50 % vastaten yli 1000 plasmidikopiota solua kohti.
Plasmidin ominaisuudet on esitetty taulukossa 5.
5
Kanta E. coli CSH50/pOU51 taltioitiin saksalaiseen mikro-organismikokoelmaan (Deutsche Sammlung von Mikro-organismen, Grisebachstrasse 8, D-3400 Gottingen), josta kokoelmasta käytetään seuraavassa lyhennettä DSM, ja siellä sille annet-10 tiin kokoelmanumero 2467.
Esimerkki 2 pOU53:n rakentaminen ia karakterisointi Käyttämällä lähtöaineena esimerkin 1 mukaista plasmidia ja 15 suorittamalla osittainen tämän pOU51:n katkaisu HindIII:lla, saatiin rakennetuksi otsikon plasmidi, josta oli poistunut kanamysiiniresistenssiä koodittava geeni, mutta johon oli jäänyt jäljelle λ-immuniteettia koodittava geeni. Plasmidi transformoitiin E. coli -kantaan CHS50. pOU53:n molekyyli-20 paino oli 3,2 x 106 daltonia ja sen genotyyppi oli seuraava: copA+, AcopB, repA+, Apar, imm\+, AaphA.
Plasmidi kartoitettiin restriktioentsyymeillä esimerkissä 1 kuvatulla tavalla (ks. kuvio 5). Restriktiokartasta voidaan .-:25 havaita, että pOU53:ssa on yksi ainoa EcoRI-restriktioen- donukleaasin tunnistuskohta, joka antaa mahdollisuuden käyttää plasmidia kloonausvektorina.
Jotta saataisiin osoitetuksi halutun plasmidin läsnäolo 30 isäntäsoluissa, soluviljelmiä kasvatettiin edellä kuvatulla tavalla levyillä, joissa oli Xb2-faagihiukkasia, joiden avulla voitiin todeta resistenssi λ-infektion suhteen. Li-säksi solut testattiin kanamysiiniherkkyyden suhteen kasvattamalla pesäkkeistä toisinnot levyillä, joissa oli 50 μg ka-35 namysiiniä/ml. Lämpötilan suhteen herkän kasvun tutkimiseksi solut viirutettiin levyille 42°C:ssa ja kasvatettiin esimerkissä 1 kuvatulla tavalla.
Il .. 8 9 9 41 35
Kun plasmidi-DNA-pitoisuus mitattiin esimerkissä 1 kuvatulla tavalla, solujen havaittiin sisältävän 20-40 plasmidikopiota 30°C:ssa ja yli 1000 plasmidikopiota 42°C:ssa. Plasmideja ei menetetty lainkaan.
5
Plasmidin ominaisuudet on esitetty taulukossa 5.
Kanta E. coli CSH50/pOU53 on taltioitu DSM-kokoelmiin numerolla 2468.
10
Esimerkki 3 pOU56:n rakentaminen ia karakterisointi
Otsikon plasmidi rakennettiin liittämällä Tn3-transposoni in vivo X::Tn3-faagista plasmidiin pOU53, paikanvaihdon ja am-15 pisilliiniresistenssin geenit (β-laktamaasi) mukaanluettuina (Nordström, Molin ja Aagaard-Hansen, Plasmid 4, 1980, 215-27). Plasmidi-DNA eristettiin kannasta, jossa oli XTN3-faagi kromosomeissa ja plasmidi pOU53. Plasmidi-DNA transformoitiin E. coli -kantaan CSH50 valitsemalla ampisilliiniresis-20 tenssin ja X-immuniteetin suhteen. pOU56:n molekyylipaino on 6,5 x 106 daltonia ja sen genotyyppi oli seuraava: copA+, AcopB, repA+, AaphA, immX+, bla+ (::Tn3).
Plasmidi kartoitettiin restriktioentsyymeillä esimerkissä 1 .-:25 kuvatulla tavalla (ks. kuvio 6) . Restriktiokartasta ilmenee, missä kohdassa Tn3-transposoni sijaitsee pOU56:ssa, ja lisäksi ilmenee, että plasmidissa on yksi ainoa tunnistuskohta "·; kutakin plasmidiendonukleaasia EcoRI ja BamHI varten. Vaikka plasmidi onkin hyödyllinen lähtöaine plasmidin pOU57 (ks.
30 esimerkki 4 jäljempänä) valmistuksessa, se ei ole edullinen i kloonausvektorina, koska paikanvaihtogeenin vuoksi antibi- oottiresistenssi voi siirtyä muihin bakteereihin.
____; Jotta saataisiin osoitetuksi halutun plasmidin läsnäolo .35 isäntäsolussa, soluviljelmiä kasvatettiin Xb2-faagihiukkasia : '* sisältävillä levyillä edellä kuvatulla tavalla, jolloin voitiin todeta vastustuskyky λ-tartunnan suhteen. Solut tutkittiin lisäksi ampisilliiniresistenssin suhteen levyillä, 36 3 9 9 41 joissa oli 50 μg ampisilliiniä per ml. Lämpötilaherkän kasvun koe suoritettiin edellä kuvatulla tavalla.
pOU56:n replikoitumisominaisuudet havaittiin samoiksi kuin 5 pOU53:n.
Tämän plasmidin ominaisuudet on esitetty taulukossa 5.
Kanta E. coli CSH50/pOU56 taltioitiin DSM-kokoelmiin nume-10 rolla 2469.
Esimerkki 4 pOU57;n rakentaminen ia karakterisointi (A-tyypin plasmidi) Jotta plasmidista pOU56 saataisiin eliminoiduksi Tn3:n pai-15 kanvaihtomahdollisuus, joka johtuu plasmidin kantamasta ko konaisesta transposonista, plasmidi katkaistiin BamHl- ja EcoRI-kohdasta niin, että paikanvaihtogeeni poistui, mutta β-laktamaasia koodittava geeni jäi jäljelle. Jotta saataisiin aikaan tarttuvien päiden yhteenliittyminen, liitettiin 20 mukaan pieni BamHl-EcoRI-palanen plasmidista pBR322, jolloin saatiin plasmidi pOU57. Plasmidi transformoitiin E. coli -kantaan CSH50. pOU57:n molekyylipaino oli 4,2 x 106 dalto-nia ja sen genotyyppi oli seuraava: copA+, AcopB, repA+,
Apar, AaphA, immX+, bla+ (ATn3) .
. · :2.5
Plasmidi kartoitettiin restriktioentsyymeillä esimerkissä 1 kuvatulla tavalla (ks. kuvio 7). Restriktiokartasta ilmenee, että pOU57:ssä on yksi ainoa tunnistuskohta kullekin res-triktioentsyymille BamHl ja EcoRI, mikä antaa mahdollisuuden 30 käyttää sitä kloonausvektorina.
Jotta saatiin osoitetuksi halutun plasmidin läsnäolo isän-täsolussa, soluviljelmiä kasvatettiin Xb2-faagihiukkasia sisältävillä levyillä edellä kuvatulla tavalla, jolloin voi-35 tiin todeta vastustuskyky X-tartunnan suhteen. Solut tutkittiin lisäksi ampisilliiniresistenssin suhteen edellä kuvatulla tavalla. Plasmidin molekyylipaino määritettiin agaroo-
II
37 39941 sigeelielektroforeesilla. Lämpötilalle herkän kasvun koe suoritettiin edellä kuvatulla tavalla.
pOU57:llä havaittiin olevan samat replikoitumisominaisuudet 5 kuin pOU53:lla.
Tämän plasmidin ominaisuudet on esitetty taulukossa 5.
Kanta E. coli CSH50/pOU57 taltioitiin DSM-kokoelmiin nume- 10 rolla 2470.
Esimerkki 5 pQU71:n rakentaminen ia karakterisointi (B-tyypin plasmidi) Käyttämällä lähtöaineena esimerkissä 4 kuvattua plasmidia ja 15 liittämällä tämän pOU57:n Bglll-kohtaan pKN562:sta otettu
BglII-palanen, jossa oli mukana osa copB-geenistä, saatiin rakennetuksi otsikon plasmidi, jossa oli sekä cI-XPR-repres-sori-promoottorijärjestelmä että Rl-plasmidien villityyppi-nen copB-inhibiittorin geeni. Plasmidi transformoitiin E.
20 coli -kantaan CSH50. pOU71:n molekyylipaino oli 4,3 x 106 daltöniä ja sen genotyyppi oli seuraava: copA+, copB+, repA+, Apar, AaphA, immX+, bla+.
Plasmidi kartoitettiin restriktioentsyymillä esimerkissä 1 .:25 kuvatulla tavalla (ks. kuvio 8). Restriktiokartasta käy ilmi, että pOU71:llä on samat ainoat restriktiokohdat kuin . pOU57:llä.
Jotta saatiin osoitetuksi halutun plasmidin läsnäolo isän-30 täsolussa, soluviljelmät tutkittiin X-tartunnan vastustusky- vyn ja ampisilliiniresistenssin suhteen edellä kuvatulla tavalla. Sitten plasmidit seulottiin copB-geenin läsnäolon ____ suhteen menetelmällä, jota on kuvattu tässä hakemuksessa : kohdassa "Seulonta copB+:n suhteen" (käännöksen sivulla 29).
-35 Lämpötilalle herkän kasvun koe suoritettiin edellä kuvatulla menetelmällä. Lopuksi määritettiin plasmidikopioluku " ' 30°C:ssa suorittamalla radioaktiivinen merkitseminen ja gra- dienttisentrifugointi.
„ 39941
Kun plasmidi-DNA-pitoisuus mitattiin esimerkissä 1 kuvatulla tavalla, solujen havaittiin sisältävän 3-5 plasmidikopiota 30°C:ssa ja yli 1000 plasmidikopiota 42°C:ssa. 30°C:ssa plasmidi menetettiin 1 % taajuudella sukupolvea kohti.
5 Tämän plasmidin ominaisuudet on esitetty taulukossa 5.
Kanta E. coli CSH50/pOU71 taltioitiin DSM-kokoelmiin numerolla 2471.
10
Esimerkki 6 pOU73;n rakentaminen ia karakterisointi (C-tyypin plasmidi) Käyttämällä lähtöaineena esimerkissä 4 kuvattua plasmidia ja liittämällä tämän pOU57:n EcoRI-kohtaan pOU16:sta saatu 15 EcoRI-palanen, jossa oli copB-geeni, saatiin rakennetuksi otsikon plasmidi, jossa oli copB-inhibiittorigeeni sekä cl-\PR-repressori-promoottorijärjestelmä. Plasmidi transformoitiin E. coli -kantaan CSH50. pOU73:n molekyylipaino oli 4,4 x 106 daltonia ja sen genotyyppi oli seuraava: copA+, copB+, 20 repA+, Apar, AaphA, imm\+, bla+.
Plasmidi kartoitettiin restriktioentsyymeillä esimerkissä 1 kuvatulla tavalla (ks. kuvio 9). Restriktiokartasta käy il-:·. mi, että copB-geeni on sijoittunut sellaiselle plasmidin .-:2.5 alueelle, jossa se ei sijaitse luonnostaan. Lisäksi käy ilmi, että plasmidissa on yksi ainoa BamHI-restriktioendonuk-leaasin tunnistuskohta, mikä antaa mahdollisuuden käyttää plasmidia kloonausvektorina.
30 Seulonnassa käytettiin samoja menetelmiä kuin pOU7l:n seu-'·' lonnassa.
Kun plasmidi-DNA-pitoisuus mitattiin esimerkissä l kuvatulla tavalla, havaittiin solujen sisältävän 0,5-1 plasmidikopiota 35 30°C:ssa ja yli 1000 plasmidikopiota 42°C:ssa. 30°C:ssa plasmidi menetettiin yli 5 % taajuudella sukupolvea kohti.
Tämän plasmidin ominaisuudet on esitetty taulukossa 5.
89941 39
Kanta E. coli CSH50/pOU73 on taltioitu DSM-kokoelmiin numerolla 2472.
Esimerkki 7 5 pOU75:n rakentaminen ia karakterisointi (B-tyypin plasmidi) Käyttämällä lähtöaineena esimerkissä 5 kuvattua plasmidia ja katkaisemalla tämä pOU71 osittain Hindlll:11a, saatiin rakennetuksi otsikon plasmidi, josta oli poistettu EcoRI-koh-ta. Plasmidi transformoitiin E. coli -kantaan CSH50. pOU75:n 10 molekyylipaino oli 4,2 x 106 daltonia ja sen genotyyppi oli seuraava: copA+, copB+, repA+, Apar, AaphA, immX+, bla+.
Plasmidi kartoitettiin restriktioentsyymillä esimerkissä 1 kuvatulla tavalla (ks. kuvio 10). Restriktiokartasta ilme-15 nee, että Hindlll-palasen poisto johtaa pOU71:n EcoRI-kohdan poistumiseen.
Jotta saatiin osoitetuksi halutun plasmidin läsnäolo isän-täsolussa, soluviljelmät tutkittiin λ-tartunnan vastustusky-20 vyn ja ampisilliiniresistenssin suhteen sekä lämpötilalle herkän kasvun suhteen edellä kuvatulla tavalla. Plasmidi tutkittiin myös EcoRI-kohdan menetyksen suhteen suorittamalla katkaisu tällä entsyymillä.
r:25 pOU75:llä havaittiin olevan samat replikoitumisominaisuudet kuin pOU71:llä.
V; Tämän plasmidin ominaisuudet on esitetty taulukossa 5.
30 Kanta E. coli CSH50/pOU75 taltioitiin DSM-kokoelmiin nume-rolla 2473.
Esimerkki 8
Geenituotteen määrän kasvu •35 Plasmidi pMC903 (Casadaban et ai., J. Bact. 143. 1980, 971) - “ katkaistiin restriktioentsyymeillä BamHI ja Bglll niin, että saatiin BamHI-BglII-palanen, jossa oli lac-geenejä. Plasmidi pOU71 katkaistiin BamHI:llä ja edellä saatu BamHI-BglII-pa- 40 39941 lanen sijoitettiin tähän kohtaan, kuten kuviossa 11 on esitetty ja sen jälkeen suoritettiin liittäminen T4 DNA-ligaa-sin avulla, minkä seurauksena saatiin plasmidi pOU106, joka transformoitiin E. coli -kantaan CSH50. Soluja vedettiin 5 viiruiksi McConkey-laktoosi-indikaattorilevyille (ks. J.
Miller, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor, 1972), joissa oli 50 μg ampisilliinia/ml, ja inkuboi-tiin 30°C:ssa punaisten pesäkkeiden löytämiseksi (Lac+) . Sitten lämpötila nostettiin 42°C:een ja geenituotteen (β-10 galaktosidaasi) määrän lisääntyminen mitattiin taulukossa 3 esitetyllä tavalla. Mittaus suoritettiin J. Millerin kuvaamalla tavalla, op. cit.
Taulukko 3 15 Geenituotteen määrän kasvu
Keksinnön mukainen Ennestään tunnettu plasmidi plasmidi_(pKN410)_
Minuutteja Geenituotteen2 Minuutteja Geenituotteen 20 lämpötilan akkumuloitunut lämpötilan akkumuloitunut nostosta suhteellinen nostosta suhteellinen 42°C:een ominaisaktii- 42°C:een ominaisaktii- : :': _visuus1_visuus3_ 0 10 0 10 .-:25 10 21 25 34 55 62 60 20 83 107 90 47 30 1 Entsyymiaktiivisuus per kokonaisproteiinimäärä, so. β- galaktosidaasimäärän kasvu solussa.
2 Plasmidin pOUl06 välittämä β-galaktosidaasi.
3 Plasmidin pKN410 välittämä β-laktamaasi (Uhlin et ai., Gene, £, 1979, taulukko II, s. 100).
35
Taulukosta ilmenee, että geenituotteen määrän kasvu on verrattavissa siihen, joka saavutetaan muilla karkurivektoreil-la (esim. Uhlin et ai., Gene, £, 91-106).
89941 41
Promoottori, jonka vaikutuksesta β-galaktosidaasigeeni ilmentyy, on cl-promoottori ja/tai tetrasykliinipromoottori, jotka sijaitsevat pBR322:sta saadussa DNA-palasessa, ja vaikka se onkin suhteellisen heikko, sitä ei voida jättää 5 pois laskuista vaikuttavana tekijänä, ja se saa aikaan transkription samaan suuntaan kuin cl-promoottori.
pOU106 kartoitettiin restriktioentsyymeillä esimerkissä 1 kuvatulla tavalla (ks. kuvio 11). Restriktiokartasta ilme-10 nee, että plasmidissa on yksi ainoa BamHI-restriktioendonuk-leaasin tunnistuskohta heti liitettyjen lac-geenien alapuolella, mikä antaa mahdollisuuden käyttää plasmidia kloonaus -vektorina.
15 Tämän plasmidin ominaisuudet on esitetty taulukossa 5.
Kanta E. coli CSH50/pOU106 taltioitiin DSM-kokoelmiin numerolla 2474.
20 Esimerkki 9 pOU79:n rakentaminen ia karakterisointi iB-twpin Plasmidi) Plasmidi pOU71 katkaistiin täysin BamHIrllä ja osittain : Pstlrllä ja siihen liitettiin DNA-palanen (kantoi lac-opero- nia) plasmidista pMC871 (Casadaban et ai., J. Bact., 143. .-:2.5 1980, 971), joka oli katkaistu täysin BamHIrllä ja Pstlrllä.
E. coli -kanta CSH50 transformoitiin liittämisseoksella ja ·;·; suoritettiin valinta ampisilliiniresistenssin suhteen inku- boimalla 30°C:ssa McConkey-laktoosi-indikaattorilevyillä, 30 joissa oli 50 μg ampisilliiniä/ml. Ensin levyjä inkuboitiin 20 tuntia 30°C:ssa ja sen jälkeen lyhyt aika (1-2 tuntia) ;_ : 42°C:ssa, ja pesäkkeet, joiden fenotyyppi muuttui Lac'rsta (valkoinen) Lac+:aan (punainen), analysoitiin tarkemmin.
; Otsikon plasmidi identifioitiin yhdestä tällaisesta pesäk- .35 keestä. pOU79:n molekyylipaino oli 8,8 x 106 daltonia ja sen : genotyyppi oli seuraava: copA+, copB+, repA+, Apar, immX+, bla+, lac+.
89941 42
Plasmidi kartoitettiin restriktioentsyymeillä esimerkissä 1 kuvatulla tavalla (ks. kuvio 12). Restriktiokartasta käy ilmi, että plasmidilla on yksi ainoa BamHI-restriktioentsyy-min tunnistuskohta juuri lac-geenien yläpuolella. Kun pro-5 moottoria kantava DNA-palanen sijoitetaan tähän kohtaan oikeassa suunnassa, saadaan aikaan lac-geenien transkriptio, jonka seurauksena tällaista yhdistelmäplasmidia kantavat solut saavat Lac+-fenotyypin 30°C:ssa. Lac+-solut on helppo tunnistaa McConkey-laktoosi-indikaattorilevyillä.
10
Plasmidissa on myös yksi ainut EcoRI-restriktioendonukleaa-sin tunnistuskohta, joka sijaitsee IacZ-geenin päässä. Kun EcoRI-palanen sijoitetaan tähän kohtaan, eliminoituu lacZ-geenituotteen, β-galaktosidaasin, aktiivisuus, ja syntyy 15 Lac'-fenotyyppi, joka on helppo löytää värittöminä pesäkkeinä McConkey-laktoosi-indikaattorilevyiltä, kun lämpötila on nostettu 30°C:sta 42°Creen (ks. aiempaa selostusta). Näin ollen plasmidi soveltuu kloonausvektoriksi.
20 pOU79:llä havaittiin olevan samat restriktio-ominaisuudet kuin pOU71:lla.
Tämän plasmidin ominaisuudet on esitetty taulukossa 5.
:-25 Kanta E. coli CSH50/pOU79 on taltioitu DSM-kokoelmiin numerolla 2481.
Esimerkki 10 pOU82:n rakentaminen ia karakterisointi (Β-twpin plasmidi) 30 Plasmidi pOU79 katkaistiin täysin BamHIrllä ja osittain Sällillä ja siihen liitettiin pSKS104:stä saatu BamHI-Sall-palanen, jossa oli lac-operoni, josta lac-promoottori oli poistettu, sekä IacZ-geenin neljä ensimmäistä kodonia, jolloin saatiin pOU80 (ei ole piirrettynä).
35 pOU80 on Lac' ja siinä on BamHI-kohta ja EcoRI-kohta heti lac-geenien yläpuolella. Lisäksi IacZ-geenissä tavallisesti oleva EcoRI-kohta puuttuu, koska pSKS104:n lac-geenit on
II
43 89941 saatu pMC1403:sta (Casadaban et ai., J. Bact., 143. 1980, 971) .
Otsikon plasmidi rakennettiin korvaamalla pOU80:n lacZ-gee-5 nin EcoRI-Cla-palanen (ks. pOU79:n karttaa, kuvio 12) pVHl424:stä saadulla EcoRl-Clal-palasella, jossa oli deo-promoottori ja IacZ-geenin aminopään pää. Tällä korvaamisella saadaan IacZ-geeni rakennetuksi uudelleen, ja deo-pro-moottorin läsnäolosta johtuen välittää saatu yhdistelmä-10 plasmidi, pOU81, Lac+-fenotyypin, kun sillä transformoidaan E. coli -kanta CSH50. pOU80:n molekyylipaino oli 8,1 x 106 daltöniä ja sen genotyyppi oli seuraava: copA+, copB+, repA+, Apar, imm\+, bla+, lac+.
15 Plasmidi menetetään lopulta soluista 30°C:ssa, koska par-alue puuttuu, mikä on helppo huomata ei-selektiivisillä McConkey-laktoosi -indikaattorilevyillä (ks. esimerkki 11).
Plasmidi kartoitettiin restriktioentsymeillä esimerkissä 1 20 kuvatulla tavalla (ks. kuvio 13). Restriktiokartasta ilmenee, että plasmidissa on yksi ainut tunnistuskohta kullekin restriktioendonukleaasille EcoRI ja BAMHI, mikä antaa mahdollisuuden käyttää plasmidia kloonausvektorina.
.:25 pOU82:11a on samat replikoitumisominaisuudet kuin pOU71:llä.
Tämän plasmidin ominaisuudet on esitetty taulukossa 5.
Kanta E. coli CSH50/pOU82 on taltioitu DSM-kokoelmiin nume-30 rolla 2482.
Esimerkki 11 pOU91:n rakentaminen ia karakterisointi (B-tyypin plasmidi) Jotta saataisiin aikaan jakautumisen suhteen stabiili plas-35 midi, pOU82, katkaistiin EcoRI:llä ja EcoRI-A-palanen, joka sisälsi plasmidi Rl -johdannaisen, pKNl84, villityyppisen par-alueen (Nordström et ai.. Plasmid 4, 1980, 322), sijoitettiin tähän kohtaan ja suoritettiin yhteenliittäminen.
89941 44 Näin saatu plasmidi (pOU90, ei ole piirretty esiin) transformoitiin E. coli -kantaan CSH50, ja soluja kasvatettiin selektiivisesti 30°C:ssa levyillä, joissa oli 50 μς ampisil-liinia/ml. Vertailutarkoituksessa kasvatettiin plasmidin 5 pOU82 sisältäviä soluja samalla tavalla, jotta saatiin varmistetuksi plasmidien läsnäolo molemmissa lähtöpesäkkeissä. Seuraavaksi kummastakin pesäkkeestä viirutettiin näytteet levyille, joissa ei ollut lainkaan antibioottia, ja solujen annettiin kasvaa 25 solusukupolven ajan. Jotta saataisiin 10 seulotuksi Lac+-fenotyypin pysyvä säilyminen, näin saaduista pesäkkeistä viirutettiin soluja McConkey-laktoosi-indikaat-torilevyille 30°C:ssa, jolloin pOU90:llä transformoituneet solut muodostivat punaisia pesäkkeitä, joka osoitti, että tämä plasmidi oli pysynyt, kun taas pOU82:lla transformoitu-15 neet vertailusolut saivat aikaan sekä punaisia että värittömiä pesäkkeitä, mikä tarkoittaa, että ilman valintapainetta kasvatettaessa jotkin solut olivat menettäneet pOU82:n.
Sitten väliplasmidi pOU90 katkaistiin täysin BamHIrllä ja 20 osittain Sau3A:lla, jotta plasmidin koko saatiin pienemmäksi, ja näin syntyi otsikon plasmidi. E. coli -kanta CSH50 transformoitiin ja plasmidin pysyvyys määritettiin edellä kuvatulla tavalla. pOU91:n molekyylipaino oli 12,5 x 106 daltonia ja sen genotyyppi oli seuraava: copA+, copB+, repA+, :25 par+, imm\+, bla+, lac+.
Plasmidi kartoitettiin restriktioentsyymeillä esimerkissä 1 kuvatulla tavalla (ks. kuvio 14). Restriktiokartasta ilmenee, että pOU91:ssä on yksi ainoa tunnistuskohta kullekin 30 endonukleaasille EcoRI ja BamHI, mikä antaa mahdollisuuden käyttää plasmidia kloonausvektorina.
pOU91:llä havaittiin olevan samanlaiset replikoitumisominai-suudet kuin pOU7l:llä, mutta plasmidi oli täysin pysyvä 35 30°C:ssa päinvastoin kuin pOU71.
Tämän plasmidin ominaisuudet on esitetty taulukossa 5.
; 89941 45
Kanta E. coli CSH50/pOU91 on taltioitu DSM-kokoelmiin numerolla 2483.
Esimerkki 12 5 pQU101:n rakentaminen ia karakterisointi (B-tyypin plasmidi) Käyttämällä lähtöaineena esimerkissä 7 kuvattua plasmidia ja liittämällä tämän pOU75:n BamHI-kohtaan Sau3A-palanen, joka koodittaa kloramfenikoliasetyylitransferaasia (cat+), saatiin otsikon plasmidi, joka antaa isännälle kloramfenikoli-10 resistenssin. E coli CSH50 transformoitiin tällä plasmidil-la. pOU101:n molekyylipaino oli 4,7 χ 106 daltöniä ja sen genotyyppi oli seuraava: copA+, copB+, repA+, Apar, AaphA, immX+, bla+, cat+.
15 Plasmidi kartoitettiin restriktioentsyymillä esimerkissä 1 kuvatulla tavalla (ks. kuvio 15). Restriktiokartasta ilmenee, että pOU101:ssä on yksi ainoa EcoRI-restriktioendonuk-leaasin tunnistuskohta, joka antaa mahdollisuuden käyttää plasmidia kloonausvektorina. Lisäksi EcoRI-palasten liittä-20 minen inaktivoi cat+-geenin, mikä tekee mahdolliseksi EcoRI-hybridien seulonnan.
Jotta saataisiin osoitetuksi halutun plasmidin läsnäolo isäntäsolussa, soluviljelmät tutkittiin X-tartunnan vastus-: ":2β tuskyvyn suhteen ja ampisilliinivastustuskyvyn suhteen edel-lä kuvatulla tavalla. Lisäksi solut tutkittiin kloramfeniko-livastustuskyvyn suhteen kasvattamalla viljelmä levyillä, - joissa oli 20 μg/ml kloramfenikolia. Solut tutkittiin myös lämpötilalle herkän kasvun suhteen edellä kuvatulla tavalla. .3.0 pOU101:llä havaittiin olevan samanlaiset r epli koit umi s ominaisuudet kuin pOU71:llä.
Tämän plasmidin ominaisuudet on esitetty taulukossa 5.
-35 Kanta E. coli CSH50/pOU101 on taltioitu DSM-kokoelmiin nume-: ' rolla 2757.
46 < j 9 9 41
Esimerkki 13 pOUllO :n rakentaminen ia karakterisointi
Plasmidista pOU80 (selostettu esimerkissä 10, ks. pOU79:n karttaa, kuvio 12) poistettiin EcoRI-Clal-palanen ja korvat- 5 tiin plasmidista pVHl451 (Valentin-Hansen et ai., the EMBO Journal 1, 1982) saadulla EcoRI-Clal-palasella, jossa oli deo-promoottori ja IacZ-geenin aminopään pää. Saadulle plas-midille annettiin nimi pOU83 (ks. kuvio 16).
10 Plasmidi pOU83 hajotettiin osittain BamHI:llä ja BglII:lla, jotta saatiin poistetuksi lac-geenit ja DNA-palanen, jossa oli cl-repressorigeeni ja \PR-promoottori. Kun oli suoritettu yhteenliittäminen ja CSH50:n transformointi, saatiin eristetyksi halutuilla ominaisuuksilla varustettu plasmidi, 15 jossa deo-promoottori ja copB-geeni olivat liittyneet yhteen läheisesti. Plasmidin, jolle annettiin nimitys pOUllO, mole-kyylipaino oli 3,2 x 106 daltonia ja sen genotyyppi oli seu-raava: copA+, copB+, repA+, Apar, bla+.
20 Plasmidi kartoitettiin restriktioentsyymeillä esimerkissä 1 kuvatulla tavalla (ks. kuvio 17). Restriktiokartasta ilmenee, että plasmidissa on yksi ainoa tunnistuskohta kullekin restriktioendonukleaasille EcoRI ja BamHI, mikä antaa mahdollisuuden käyttää plasmidia kloonausvektorina.
:25 • j Kun pOUllO:llä transformoituneita kannan E. coli S0929 (cytR, lac, deo; recA) soluja kasvatettiin yön yli LB-alus-tassa ilman glukoosia, tapahtui ohjaamaton plasmidin repli-koituminen solutiheydellä yli 2 x 108 solua/ml.
.30 ; Kanta E. coli CSH50/pOU110 on taltioitu DSM-kokoelmiin nume- : rolla 2758.
Esimerkki 14 35 pOUl30:n rakentaminen ia karakterisointi
Plasmidi pOU9l katkaistiin BamHI:llä ja BamHI-kohta poistettiin eksonukleaasin Bal31 avulla niin, että saatiin plasmidi pOU92 (ei ole piirretty esiin). Plasmidi katkaistiin I! 47 39941
EcoRI:llä ja Clal:llä ja siihen liitettiin plasmidista pMC1403 (Casadaban et ai., J. Bact. 143. 1080, 971) saatu vastaava EcoRI-Clal-palanen, jolloin saatiin aikaan plasmidi pOU93, jossa oli lac-operoni ilman deo-promoottoria. Näin 5 saatuun BamHI-kohtaan liitettiin Bglll-palanen, jossa oli copB-geeni, jolloin saatiin plasmidi pOU130 (ks. kuvio 18) ja sen jälkeen suoritettiin yhteenliittäminen ja E. coli -kannan CSH50 transformointi. Soluja viirutettiin McConkey-laktoosi-indikaattorilevyille, joissa oli 50 μg ampisil-10 liiniä/ml, ja inkuboitiin 30°C:ssa punaisten pesäkkeiden valitsemiseksi (Lac+) . Sitten lämpötila nostettiin 42°C:een, jolla aikaansaatu β-galaktosidaasimäärän suureneminen on esitetty taulukossa 4. Kun oli inkuboitu 45 minuuttia 42°C:ssa, lämpötila laskettiin 38°C:een. Lämpötilan muutta-15 misen jälkeen saatu β-galaktosidaasimäärän kasvu on esitetty taulukossa 4.
Taulukko 4 β-galaktosidaasin ilmentyminen pOU130:sta, kun plasmidi- 20 DNA:n määrää on kasvatettu_
Kasvuolosuhteet %-galaktosidaasin Määrän kasvun _ominaisaktiivisuus kerroin_ a30°C; tasainen tila 0,03 l b30°C; 42 °C 0,7 23 r :2S c30°C; 42°C 37°C 2,5 83 a CSH50-soluja, joissa on pOU130, kasvatetaan eksponentiaalisesti LB-alustassa 30°C:ssa. b Viljelmän 30°C:ssa tapahtuneen eksponentiaalisen kasvun . 3.0 jälkeen lämpötila nostettiin 42°C:een, jossa kasvatusta jatkettiin 2 tuntia.
c Viljelmän 30°C:ssa tapahtuneen eksponentiaalisen kasvun jälkeen lämpötila nostettiin 45 minuutiksi 42°C:een ja sen jälkeen se laskettiin 90 minuutiksi 37°C:een.
..‘35 d Katso edellä olevaa menetelmiä ja materiaaleja koskevaa selostusta, β-galaktosidaasin ominaisaktiivisuudet on ilmaistu julkaisussa Light and Molin, Mol. Gen. Genet. 1081 (sivut 56-61) kuvatulla tavalla.
48 8 9 9 41
Taulukosta ilmenee, että geenituotteen määrä kasvaa huomattavasti, kun lämpötilaa vielä korottamisen jälkeen lasketaan, mikä osoittaa, että juuri tällä menetelmällä saavutetaan mahdollisimman suuri määrä kyseistä geenituotetta.
5
Koska β-galaktosidaasi ilmentyy rakenteellisesti tällaisesta geenifuusiosta (Light & Molin, J. Bact. 151. 1982, 1129-1135), entsyymiaktiivisuuden määrät vastaavat keksinnön mukaisten plasmidien kykyä lisätä geenituotemäärää.
10
Kanta E. coli CSH50/pOUl30 on taltioitu DSM-kokoelmiin numerolla 2759.
Esimerkki 15 15 pLC31:n rakentaminen ia karakterisointi pOU75 katkaistiin BamHIrllä ja siihen liitettiin plasmidista pBEU14 (Uhlin and Clark, J. Bact. 148. 1981, 386-90) saatu BamHI-palanen, jossa oli recA-promoottori ja geeni, ja sen jälkeen transformoitiin E. coli -kanta CSH50. Otsikon plas-20 midien molekyylipaino oli 6,3 x 106 daltonia ja sen geno- tyyppi oli seuraava: recA, bla+, copA+, copB+, repA+, immX+.
Plasmidi kartoitettiin restriktioentsyymillä esimerkissä 1 kuvatulla tavalla (ks. kuvio 19). Restriktiokartasta ilme-.'•25 nee, että pLC3l sisältää yhden ainoan EcoRI-restriktioent- syymin tunnistuskohdan, joka on recA-promoottorin alapuolella, ja joka soveltuu vieraiden geenien liittämiseen.
pLC31:llä havaittiin olevan samat replikoitumisominaisuudet •30 kuin pOU71:llä.
Kun pLC31:n sisältäviä soluja kasvatetaan 30°C:ssa, promoottori pysyy täysin tukahdutettuna, mutta sen jälkeen, kun : lämpötila nostettiin 42°C:een, lexA-repressori titrautui 35 vähitellen ja recA:sta lähtevä transkriptio alkoi johtaen suurempaan recA-geenituotemäärän, mikä voitiin todeta poly-akryyliamidigeelielektroforeesilla.
49 8 9 941 Tämän plasmidin ominaisuudet on esitetty taulukossa 5.
Kanta E. coli CSH50/pLC31 on taltioitu DSM-kokoelmiin numerolla 2718.
5
Esimerkki 16 pLC33:n rakentaminen ia karakterisointi
Plasmidi PLc28 (Remaut et ai., Gene 15, 1981, sivut 81-92), jossa oli XPL-promoottori ja bla-geeni, ja joka oli varus-10 tettu sidoksenmuodostajalla, joka sisälsi EcoRIrn, Smal:n, BamHIm, Salien, Pstl:n ja HindIII:n katkaisukohdat, katkaistiin EcoRI:llä ja sijoitettiin plasmidin pOU51 (ks. esimerkki 1) EcoRI-kohtaan, ja sen jälkeen suoritettiin yhteenliittäminen ja E. coli -kannan CSH50 transformointi. Tämä 15 plasmidi, pLC32', (ks. kuvio 20), jonka molekyylipaino oli 10,6 x 106 daltonia, hajotettiin BamHIrllä ja Bal31-eksonuk-leaasilla sidoksenmuodostajan poistamiseksi olosuhteissa, joita on selostettu julkaisussa T. Maniatis et ai., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Labo-20 ratory, Cold Spring Harbor, New York, sivut 135-139, ja sen jälkeen liitetään uudestaan yhteen ja transformoidaan E. coli -kanta C600 (R.K. Appleyard, Genetics, 3jJ, 1954, sivut 440-452) ja valitaan plasmidit, jotka ovat kanamysiinille ja ampisilliinille vastustuskykyisiä. Saadulle plasmidille an-:":25 nettiin nimi pLC33 ja sen molekyylipaino oli 10,3 x 106 daltonia ja sen genotyyppi oli seuraava: copA+, copB', repA+, aphA+, immX+, bla+.
Plasmidi kartoitettiin esimerkissä 1 kuvatuilla restriktio-. 3.0 entsyymeillä (ks. kuvio 22) . Restriktiokartasta ilmenee, • että \PL-promoottori on heti ainoan EcoRI-kohdan yläpuolel la, mikä tekee plasmidista edullisen kloonausvektorina.
pLC33:lla havaittiin olevan samat replikoitumisominaisuudet ..•35 kuin pOU51:llä.
Tämän plasmidin ominaisuudet on esitetty taulukossa 5.
50 89941
Kanta E. coli C600/pLC33 taltioitiin DSM-kokoelmiin numerolla 2945.
Esimerkki 17 5 pLC34:n rakentaminen ia karakterisointi
Plasmidi PLc28 (Remaut et ai., Gene 1£, 1981, sivut 81-93), jossa oli XPL-promoottori ja bla-geeni, ja joka oli varustettu sidoksenmuodostajalla, joka sisälsi EcoRI:n, Smal:n, BamHIin, Sallin, Pstl:n ja HindIII:n katkaisukohdat, kat-10 kaistiin EcoRI:llä ja sijoitettiin plasmidin pOU51 (ks. esimerkki 1) EcoRI-kohtaan, ja sen jälkeen suoritettiin yhteenliittäminen ja E. coli -kannan CSH50 transformointi. Plasmidi, pLC32', (ks. kuvio 20), jonka molekyylipaino oli 10,6 x 106 daltöniä, hajotettiin BamHlillä ja Bal31-eksonukleaasil-15 la bla-geenin poistamiseksi olosuhteissa, joita on selostettu julkaisussa T. Maniatis et ai., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, sivut 135-139, ja sen jälkeen liitettiin yhteen uudestaan ja transformoitiin E. coli -kanta 20 C600 (R.K. Appleyard, Genetics, 39., 1954, sivut 440-452) ja valittiin plasmidit, jotka olivat kanamysiinille resistenttejä ja ampisilliinille herkkiä. Saadulle plasmidille annettiin nimi pLC34 ja sen molekyylipaino oli 8,4 χ 106 daltonia ja sen genotyyppi oli seuraava: copA+, copB', repA+, aphA+, ::25 imm\+.
Plasmidi kartoitettiin esimerkissä 1 kuvatuilla restriktio-entsyymeillä (ks. kuvio 23). Restriktiokartasta ilmenee, että \PL-promoottori on heti EcoRI-kohdan yläpuolella, mikä . 30 tekee plasmidista edullisen kloonausvektorin.
pLC34:llä havaittiin olevan samat replikoitumisominaisuudet ·: kuin pOU51:llä.
35 Tämän plasmidin ominaisuudet on esitetty taulukossa 5.
Kanta E. coli C600/pLC34 taltioitiin DSM-kokoelmiin numerolla 2946.
Il 51 89941
Taulukko 5
Mini Rl-XPR-plasmidien ominaisuudet kloonausvektoreina
Relevantti Ainoa(t) Seulonta Kopioluku Stabiili feno- tunnistus- (liitännäis- solua periyty- tyyppi kohta (dat) inaktivoitu- kohti niinen
Plasmidi_minen)_30°C 42°C_ pOU51 Km, λ EcoRI Ei lainkaan 25 >1000 Kyllä pOU53 λ EcoRI Ei lainkaan 25 >1000 Kyllä pOU56 Ap, λ EcoRI, BamHI Ei lainkaan 25 >1000 Kyllä pOU57 Ap, λ EcoRI, BamHI Ei lainkaan 25 >1000 Kyllä pOU71 Ap, λ EcoRI, BamHI Ei lainkaan 3 >1000 Ei pOU73 Ap, λ BamHI Ei lainkaan 1 >1000 Ei pOU75 Ap, λ BamHI Ei lainkaan 3 >1000 Ei pOUlOö Ap, X BamHI Ei lainkaan 3 >1000 Ei pOU79 Ap,X,Lac(+) EcoRI, BamHI Lac-(EcoRI) 3 >1000 Ei pOU82 Ap,A,Lac+ EcoRI, BamHI Ei lainkaan 3 >1000 Ei pOU91 Ap,X,Lac , EcoRI, BamHI Ei lainkaan 3 >1000 Kyllä
Par P0U191 Ap, Cm, λ EcoRI CmS (EcoRI) 3 >1000 Ei pOUl30 Ap,X,Lac+ EcoRI Ei lainkaan 3 >1000 Kyllä pLC31 Ap,RecA+ EcoRI RecA- 3 >1000 Ei pLC33 Km, λ ,Ap EcoRI Ei lainkaan 25 >1000 Kyllä pLC34 Km,λ EcoRI Ei lainkaan 25 >1000 Kyllä • pCUllO Ap EcoRI, BamHI Ei lainkaan a) Ei 3) -j- Kopioluku ei ole riippuvainen lämpötilasta 89941 52
Kirjallisuusviitteet 1. Published European Patent Application No. 78101877.5 2. Molin et ai., J. Bact. 138, 1979, pp. 70-79.
3. Molin et ai., Microbiology, 1981, pp. 408-11.
4. Rosen et ai., Mol. Gen. Genet. 179, 1980, pp. 527-37.
5. Light and Molin, Mol. Gen. Genet. 189, 1981, pp. 56-61.
6. Stougaard et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 78, 1981, pp. 6008-12.
7. Molin et ai., Mol. Gen. Genet. 181, 1981, pp. 123-30.
8. Stougaard et ai., the EMBO Journal 1, 1982, pp. 323-28.
: ·.. 9. Sussman and Jacob, Compt. Rend. Acad. Sei. 259, 1962, p. 1517.
...: 10. Sninsky et ai., Gene 16, 1981, p. 275.
11. Uhlin et ai., Gene 6, 1979, pp. 91-106.
12. J. Miller: Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring - Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, /: 1972.
13. Davis, Botstein and Roth: A Manual for Genetic Engineering’,
Advanced Bacterial Genetics,
Cold Spring Harbor, New York, 1980.
14. Bertani, J. Bact. 62, 1954, p. 293.
53 39941 15. Bolivar et al.. Gene 2, 1977, p. 95.
16. An & Friesen, J. Bact. 1*40, 1979, pp. -100-407.
17. Casadaban et ai., J. Bact. 743, 1980, p. 971.
18. Dempsey & Willetts, J. Bact. 126, 197G, p. 1G6.
19. Nordström, Molin, Aagaard-Hansen, Plasmid 4, 1980, pp. 215-17.
20. Stougaard & Molin, Anal. Biochem. 118, 1981, p. 191.
21. Nordström et ai., Plasmid 4, 1980, p.322.
22. Valentin-Hansen et ai., the EMBO Journal 1, 1982, p. 317.
23. Messing et ai., Nucleic Acids Res. 9, 1981, p. 309.
24. Uhlin & Clark, J. Bact. 743, 1981, pp. 386-90.
Claims (65)
- 89941 54
- 1. Plasmidi, joka on käyttökelpoinen kloonausvektorina, ja jonka koko on enintään noin 15,0 x 101 daltonia, tunnettu siitä, että plasmidissa on: 5 (a) sisäänviety säädeltävä promoottori asemassa ja asennos sa, joka sallii promoottorista lähtevän transkription repli-koitumisalueelle; (b) mainitun replikoitumisalueen käsittäessä geenin, joka koodaa geenituotetta, joka tarvitaan positiivisesti repii- 10 kaatiota varten, ja lisääntyneen transkription säädeltävältä promoottorilta, mikä johtaa lisääntyneeseen geenituotteen tasoon, jota tarvitaan positiivisesti replikaatiota varten; (c) lisääntyneen tason johtaessa plasmidin replikaationopeu-teen, joka on korkeampi kuin isäntäsolun kasvunopeus, minkä 15 seurauksena saadaan lisääntynyt plasmidin kopioluku, joka yleensä 4-5 solujakautumisen jälkeen on kasvanut kertoimella 25-1000.
- 2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen plasmidi, tunnettu sii-20 tä, että plasmidi on myötäsyntyisesti säädeltävissä johtuen promoottorialueella sijaitsevasta erityisestä DNA-rakenteesta.
- 3. Patenttivaatimuksen l mukainen plasmidi, tunnettu sii-.2S tä, että promoottoria voidaan ohjata säätelytekijän avulla.
- 4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen plasmidi, tunnettu sii-: tä, että säätelytekijä aikaansaa positiivisen ohjauksen. --.30 5. Patenttivaatimuksen 3 mukainen plasmidi, tunnettu sii tä, että säätelytekijä aikaansaa negatiivisen ohjauksen. Patenttivaatimuksen 1 mukainen plasmidi, tunnettu siitä, että mainittuun promoottoriin kohdistuvan repression 35 poistuminen saa aikaan säädeltävästä promoottorista lähtevän transkription lisääntymisen, mikä johtaa geenituotteen, jota tarvitaan positiivisesti replikaatiota varten, lisääntyneeseen tasoon. 55 89941
- 7. Minkä tahansa edellä olevan patenttivaatimuksen mukainen plasmidi, tunnettu siitä, että promoottori on säädeltävissä kemiallisesti.
- 8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen plasmidi, tunnettu sii tä, että promoottori on lac-, trp- tai deo-promoottori.
- 9. Minkä tahansa patenttivaatimuksista 1-6 mukainen plasmidi, tunnettu siitä, että promoottorin aktiivisuus on läm- 10 pötilasta riippuvainen tai lämpötilalle herkän säätelytekijän ohjauksessa.
- 10. Patenttivaatimuksen 9 mukainen plasmidi, tunnettu siitä, että promoottori on X-promoottori, joka sisältää myös 15 lämpötilalle herkän Xcl-repressorin geenin, joka ohjaa mainitusta promoottorista lähtevää transkriptiota.
- 11. Patenttivaatimuksen 10 mukainen plasmidi, tunnettu siitä, että X-promoottori on joko XPR tai XPL. 20
- 12. Patenttivaatimuksen 11 mukainen plasmidi, tunnettu siitä, että λ-promoottori on XPR.
- 13. Minkä tahansa edellä olevan patenttivaatimuksen mukai-*.25 nen plasmidi, tunnettu siitä, että mainitusta säädeltävästä promoottorista lähtevä transkriptio saa plasmidin osoitta-·:· maan matalaa vakiokopiolukua matalissa lämpötiloissa ja oleellisesti kasvanutta kopiolukua korkeammissa lämpötiloissa. ,*.3£>
- 14. Patenttivaatimuksen 13 mukainen plasmidi, tunnettu siitä, että mainitusta säädeltävästä promoottorista lähtevä transkriptio saa plasmidin osoittamaan matalaa vakiokopiolukua noin 30°C:ssa ja oleellisesti kasvanutta kopiolukua :-.35 lämpötila-alueella noin 36-42°C. 89941 56
- 15. Patenttivaatimuksen 14 mukainen plasmidi, tunnettu siitä, että plasmidi osoittaa kasvanutta kopiolukua yli noin 39°C:n lämpötiloissa.
- 16. Minkä tahansa edellä olevan patenttivaatimuksen mukai nen plasmidi, tunnettu siitä, että osa sen luontaisesta rep-likoitumista ohjaavasta geenistä on poistettu ja korvattu säädeltävällä promoottorilla.
- 17. Patenttivaatimuksen 16 mukainen plasmidi, tunnettu sii tä, että kasvatettaessa plasmidin sisältäviä isäntämikro-organismeja olosuhteissa, jotka takaavat matalan vakiokopio-luvun, niiden kopioluku on alueella 20-40, edullisesti 20-30 ja erityisesti 20-25 kopiota solua kohti, ja kasvatettaessa 15 isäntämikro-organismeja eri olosuhteissa, jotka johtavat oleellisesti lisääntyneeseen kopiolukuun, niiden kopioluku on alueella vähintään 500-1000 kopiota solua kohti.
- 18. Patenttivaatimuksen 17 mukainen plasmidi, tunnettu sii- 20 tä, että sen plasmidikopioluku on alueella noin 20-40, edullisesti 20-30 ja erityisesti 20-25 kopiota solua kohti yhdessä lämpötilassa, kuten noin 30°C:ssa, ja sen plasmidikopioluku on lisääntynyt ollen alueella vähintään noin 500-1000 kopiota solua kohti korkeammassa lämpötilassa, kuten 25 noin 42°C:ssa.
- 19. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 16-18 mukainen plas midi, tunnettu siitä, että se on Rl-tyypin plasmidi, josta copB-geeni on poistettu ja korvattu säädeltävällä promoot- .-30 torilla.
- 20. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 16-19 mukainen plas midi, tunnettu siitä, että kasvatettaessa plasmidin sisältäviä isäntämikro-organismeja olosuhteissa, jotka takaavat 35 matalan plasmidin vakiokopioluvun, sen kopioluku on alueella noin 3-5 kopiota solua kohti, ja kasvatettaessa isäntämikro-organismeja eri olosuhteissa, jotka johtavat oleellisesti 57 89941 lisääntyneeseen plasmidin kopiolukuun, sen kopioluku on alueella vähintään 500-1000 kopiota solua kohti.
- 21. Patenttivaatimuksen 20 mukainen plasmidi, tunnettu sii-5 tä, että sen plasmidikopioluku on alueella noin 3-5 kopiota solua kohti yhdessä lämpötilassa, kuten noin 30°C:ssa, ja sen plasmidikopioluku on lisääntynyt ollen alueella vähintään noin 500-1000 kopiota solua kohti korkeammassa lämpötilassa, kuten noin 42°C:ssa. 10
- 22. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 1-15 mukainen plasmidi, tunnettu siitä, että siihen on sijoitettu säädeltävä promoottori plasmidin luontaisen(sten) replikaation ohjaus-geenin (ien) yläpuolelle. 15
- 23. Patenttivaatimuksen 22 mukainen plasmidi, tunnettu siitä, että kasvatettaessa isäntämikro-organismia olosuhteissa, jotka takaavat matalan vakiokopioluvun, sen kopioluku on alueella noin 3-5 kopiota solua kohti, ja kasvatettaessa 20 isäntämikro-organismia eri olosuhteissa, jotka johtavat oleellisesti kasvaneeseen plasmidikopiolukuun, sen kopioluku on alueella vähintään noin 500-1000 kopiota solua kohti.
- 24. Patenttivaatimuksen 23 mukainen plasmidi, tunnettu sii-:.:2-5 tä, että sen plasmidikopioluku on alueella noin 3-5 kopiota solua kohti yhdessä lämpötilassa, kuten noin 30°C:ssa, ja *:- sen plasmidikopioluku on lisääntynyt ollen alueella vähin-;Y; tään noin 500-1000 kopiota solua kohti, korkeammassa lämpötilassa, kuten noin 42°C:ssa. .-.3:0
- 25. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 22-24 mukainen plasmidi, tunnettu siitä, että se on Rl-tyypin plasmidi, johon on sijoitettu säädeltävä promoottori copB- ja copA-geenin yläpuolelle. .-'.35
- 26. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 22-25 mukainen plasmidi, tunnettu siitä, että kasvatettaessa isäntämikro-organismia olosuhteissa, jotka takaavat matalan plasmidin va- 09941 se kiokopioluvun, sen kopioluku on alueella noin 0,5-1 kopiota solua kohti, ja kasvatettaessa isäntämikro-organismia eri olosuhteissa, jotka johtavat oleellisesti kasvaneeseen plas-midikopiolukuun, sen kopioluku on alueella vähintään noin 5 500-1000 kopiota solua kohti.
- 27. Patenttivaatimuksen 26 mukainen plasmidi, tunnettu siitä, että sen plasmidikopioluku on alueella noin 0,5-1 kopiota solua kohti yhdessä lämpötilassa, kuten noin 30°C:ssa, ja 10 sen plasmidikopioluku on lisääntynyt ollen alueella vähintään noin 500-1000 kopiota solua kohti, korkeammassa lämpötilassa, kuten noin 42°C:ssa.
- 28. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 1-15 mukainen plasmi-15 di, tunnettu siitä, että siinä on säädeltävä promoottori replikoitumisalueella, josta osa luontaisesta replikoituna -sensäätelygeenistä on poistettu, ja että luontainen replikoi tumisensäätelygeeni on sijoitettu alueelle, jossa se ei luonnostaan sijaitse. 20
- 29. Patenttivaatimuksen 28 mukainen plasmidi, tunnettu siitä, että kasvatettaessa plasmidin sisältäviä isäntämikro-organismeja olosuhteissa, jotka takaavat matalan plasmidin vakiokopioluvun, sen kopioluku on alueella noin 0,5-1 ko- 25 piota solua kohti, ja kasvatettaessa isäntämikro-organismia erilaisissa olosuhteissa, jotka johtavat oleellisesti kasvaneeseen plasmidikopiolukuun, sen kopioluku on alueella vähintään noin 500-1000 kopiota solua kohti.
- 30. Patenttivaatimuksen 29 mukainen plasmidi, tunnettu sii tä, että sen plasmidikopioluku on alueella noin 0,5-1 kopiota solua kohti yhdessä lämpötilassa, kuten noin 30°C:ssa, ja sen plasmidikopioluku on lisääntynyt ollen alueella vähintään noin 500-1000 kopiota solua kohti, korkeammassa lämpö-35 tilassa, kuten noin 42°C:ssa.
- 31. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 28-30 mukainen plasmidi, tunnettu siitä, että se on Rl-tyypin plasmidi, jossa li 59 89941 copB-geeni on sijoitettu EcoRI-kohtaan plasmidin replikoitu-misalueen ulkopuolelle.
- 32. Minkä tahansa edellä olevan patenttivaatimuksen mukai-5 nen plasmidi, tunnettu siitä, että siihen on ensimmäisen, replikoitusmisalueesta lähtevää transkriptiota ohjaavan säädeltävän promoottorin lisäksi sijoitettu toinen promoottori siten, että mukaan voidaan liittää rakennegeeni, jonka ilmentyminen on mainitun toisen promoottorin ohjauksessa. 10
- 33. Patenttivaatimuksen 32 mukainen plasmidi, tunnettu siitä, että toinen mainitun geenin ilmentymistä säätelevä promoottori on ohjattavissa.
- 34. Patenttivaatimuksen 32 tai 33 mukainen plasmidi, tun nettu siitä, että toinen rakennegeenin ilmentymistä ohjaava promoottori on XPL-promoottori.
- 35. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 32-34 mukainen plas-20 midi, tunnettu siitä, että sillä on alhainen plasmidin va- kiokopioluku ja hyvin vähän tai ei lainkaan geenin ilmentymistä noin 30°C:ssa ja oleellisesti lisääntynyt plasmidiko-pioluku ja geenin ilmentyminen lämpötila-alueella noin 36-42 °C. :.-2:5
- 36. Patenttivaatimuksen 35 mukainen plasmidi, tunnettu sii-:- tä, että sillä on lisääntynyt plasmidikopioluku ja hyvin suuri geenin ilmentyminen yli 39°C lämpötiloissa. „- SO 37. Minkä tahansa edellä olevan patenttivaatimuksen mukai nen plasmidi, tunnettu siitä, että se sisältää merkin, jota voidaan käyttää hyväksi plasmidin sisältävien solujen tunnistamisessa ja/tai valitsemisessa. : 35 38. Patenttivaatimuksen 37 mukainen plasmidi, tunnettu sii tä, että merkki on geeni, joka antaa isäntämikro-organismil-le vastustuskyvyn antibiootin suhteen. 60 39941
- 39. Minkä tahansa edellä olevan patenttivaatimuksen mukainen plasmidi, tunnettu siitä, että se sisältää geenin, joka tekee mahdolliseksi geenifuusion toisen geenin sijoittamisen yhteydessä, josta geenifuusiosta on mahdollista havaita il- 5 mentyminen.
- 40. Minkä tahansa edellä olevan patenttivaatimuksen mukainen plasmidi, tunnettu siitä, että se on miniplasmidi.
- 41. Minkä tahansa edellä olevan patenttivaatimuksen mukai nen plasmidi, tunnettu siitä, että se sisältää lisäksi geenin tai geenejä, jotka eivät luonnostaan liity plasmidiin.
- 42. Menetelmä patenttivaatimusten 1-41 mukaisen plasmidin 15 rakentamiseksi, tunnettu siitä, että plasmidiin sijoitetaan säädeltävä promoottori sillä tavalla, että mainitusta promoottorista lähtevä transkriptio säätelee replikoitumista ja näin käsitelty plasmidi tunnistetaan seulomalla esiin ne plasmidit, jotka osoittavat oleellisesti lisääntynyttä plas-20 midikopiolukua, kun mainitusta promoottorista lähtevä trans kriptio kasvaa.
- 43. Patenttivaatimuksen 42 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että poistetaan osa luontaisesta replikoitumisen sää- 25 telygeenistä ja tähän luontaisesta replikoitumisen säätely-geenistä poistettuun kohtaan sijoitetaan DNA-jakso, jossa on säädeltävä promoottori.
- 44. Patenttivaatimuksen 43 mukainen menetelmä, tunnettu -.3:0 siitä, että plasmidista poistetaan copB-geeni suorittamalla katkaisu Bglll-restriktioentsyymillä ja sijoitetaan tähän kohtaan Bglll-fragmentti, joka sisältää säädeltävän promoottorin.
- 45. Patenttivaatimuksen 44 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että plasmidiin sijoitetaan säädeltävä promoottori luontaisen replikoitumisgeenin(ien) yläpuolelle. ei 3 9 941
- 46. Patenttivaatimuksen 45 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että säädeltävä promoottori sijaitsee BglII-kohdassa, joka on copB- ja copA-geenin yläpuolella.
- 47. Patenttivaatimuksen 42 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että käytetään lähtöaineena plasmidia, josta luontainen replikoi tiimistä säätelevä geeni on osaksi poistettu, ja asetetaan luontainen replikoitumista säätelevä geeni alkuperäiselle paikalleen niin, että saadaan plasmidi, jossa kaik-10 ki luontaiset replikoitumisenohjausgeenit ovat läsnä.
- 48. Patenttivaatimuksen 47 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että käytetään lähtöaineena plasmidia, josta copB-geeni on osittain poistettu ja sijoitetaan copB-geeni takai- 15 sin Bglll-kohtaan niin, että syntyy plasmidi, jossa copB-geeni ja copA-geeni ovat kumpikin läsnä.
- 49. Patenttivaatimuksen 42 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että lähtöaineena käytetään plasmidia, josta luontai- 20 nen replikoitumisensäätöalue on osittain poistettu, ja sijoitetaan yksi luontainen replikoitumisensäätelygeeni sellaiselle plasmidialueelle, jossa se ei luonnostaan sijaitse.
- 50. Patenttivaatimuksen 49 mukainen menetelmä, tunnettu .-.25 siitä, että käytetään lähtöaineena plasmidia, josta copB- geeni on osittain poistettu, ja sijoitetaan copB-geeni Eco-RI-kohtaan, joka on plasmidin replikoitumisalueen ulkopuolella.
- 51. Menetelmä patenttivaatimuksen 32 mukaisen plasmidin ra kentamiseksi, tunnettu siitä, että säädeltävän promoottorin lisäksi sijoitetaan mainittu toinen promoottori asianmukai- ____ seen restriktiokohtaan, niin että voidaan liittää rakenne- geeni, jonka ilmentyminen on mainitun toisen promoottorin •35 säädeltävissä.
- 52. Menetelmä plasmidi-DNA:n geenituotteen valmistamiseksi, tunnettu siitä, että viljellään patenttivaatimusten 1-41 62 39941 mukaista plasmidia kantavia mikro-organismeja ainakin yhden sellaisen viljelyjakson ajan, jonka olosuhteissa voidaan taata mainitusta säädeltävästä promoottorista lähtevän transkription lisääntyminen, joka johtaa oleellisesti lisäänty- 5 neeseen plasmidikopiolukuun, ja mikrobiviljelmästä otetaan talteen plasmidin geenituote.
- 53. Patenttivaatimuksen 52 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että viljellään isäntämikro-organismia, joka on 10 transformoitunut patenttivaatimusten 1-41 mukaisella plasmi-dilla, olosuhteissa, jotka johtavat matalaan vakioplasmidi-kopiolukuun alkukasvu- ja lisääntymisvaiheessa, kunnes haluttu solumäärä on saavutettu, ja sen jälkeen viljellään mikro-organismia sellaisissa olosuhteissa, jotka johtavat 15 oleellisesti lisääntyneeseen plasmidikopiolukuun.
- 54. Patenttivaatimuksen 52 tai 53 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että sen jälkeen, kun on viljelty olosuhteissa, joissa mahdollinen promoottorista lähtevä transkriptio ei 20 vaikuta plasmidin kopioiukuun oleellisesti, kasvualustaan lisätään ainetta, joka indusoi promoottorin aktiivisuutta niin, että saadaan aikaan oleellisesti lisääntynyt plasmidi-kopioluku. :25 55. Patenttivaatimuksen 54 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että pidetään yllä niitä olosuhteita, jotka johtavat oleellisesti lisääntyneeseen plasmidikopiolukuun, niin kauan, että plasmidimäärä on oleellisesti lisääntynyt, mutta kuitenkin niin lyhyt aika, että mikrobiviljelmä ei vahingoi- 30 tu oleellisessa määrin, ja promoottorin aktiivisuutta indusoiva aine poistetaan kasvualustasta niin, että seurauksena on plasmidikopioluvun hidas lasku indusointia edeltäneelle tasolle. j5 56. Patenttivaatimuksen 52 tai 53 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että sen viljelyjakson jälkeen, joka on suoritettu promoottoriaktiivisuutta inhiboivan aineen läsnäollessa, aineen pitoisuutta alennetaan siinä määrin, että pro- II «3 S9941 moottori aktivoituu ja plasmidikopioluku lisääntyy oleellisesti .
- 57. Patenttivaatimuksen 56 mukainen menetelmä, tunnettu 5 siitä, että sen jälkeen, kun on pidetty yllä olosuhteita, jotka johtavat oleellisesti lisääntyneeseen kopiolukuun, riittävän pitkä aika, jotta on saavutettu oleellisesti lisääntynyt plasmidikopioluku, mutta riittävän lyhyt aika, jotta on vältytty mikrobiviljelmän oleelliselta vahingoittu-10 miselta, lisätään promoottorin aktiivisuutta estävää ainetta sellainen määrä, että saavutetaan plasmidikopioluvun hidas lasku indusointia edeltäneelle tasolle.
- 58. Patenttivaatimuksen 52 tai 53 mukainen menetelmä, tun-15 nettu siitä, että olosuhteet, joissa isäntämikro-organismia kasvatetaan, sisältävät ainakin yhden viljelyjakson sellaisessa lämpötilassa tai lähellä sellaista lämpötilaa, jossa plasmidikopioluku on oleellisesti lisääntynyt.
- 59. Patenttivaatimuksen 58 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että viljelyä lämpötilassa, jossa plasmidikopioluku on oleellisesti lisääntynyt, jatketaan siihen asti, kunnes isäntämikro-organismin kasvu estyy plasmidi-DNA:n tai plas-midien geenituotteiden muodostumisen vuoksi. ;-:25
- 60. Patenttivaatimuksen 58 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että tuotantomittakaavainen viljely suoritetaan pitämällä jatkuvasti yllä lämpötilaa, joka on lähellä sitä lämpötilaa, jossa plasmidikopioluku on oleellisesti lisäänty-30 nyt, jotta isäntämikro-organismi pysyy elossa ja kasvaa jatkuvasti ja samanaikaisesti muodostuu lisääntyvä määrä plas-midin geenituotetta, ja sen jälkeen geenituotetta otetaan jatkuvasti tai jaksottaisesti talteen viljelmästä. -35 61. Patenttivaatimuksen 58 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että sen jälkeen, kun mikrobiviljelmä on kasvatettu tuotantokokoon asti, lämpötila siirretään siihen lämpötilaan tai lähelle sitä lämpötilaa, jossa plasmidikopioluku on 64 89941 oleellisesti lisääntynyt, ja tätä lämpötilaa pidetään yllä niin pitkään, että saavutetaan plasmidin oleellinen määrällinen lisääntyminen, mutta riittävän lyhyt aika niin, että vältytään mikrobiviljelmän oleelliselta vahingoittumiselta, 5 ja sen jälkeen lämpötila siirretään vielä kerran sille tasolle, joka takaa matalan vakioplasmidikopioluvun niin, että plasmidikopioluku laskee hitaasti saavuttaen lopulta alkuperäisen tason.
- 62. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 58-61 mukainen mene telmä, tunnettu siitä, että lämpötila, jossa plasmidikopioluku on oleellisesti lisääntynyt, on korkeampi kuin se lämpötila, jossa plasmidilla on matala vakiokopioluku.
- 63. Patenttivaatimuksen 62 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että lämpötila, jossa plasmidilla on matala vakiokopioluku, on noin 30°C, ja lämpötila, jossa plasmidilla on oleellisesti lisääntynyt kopioluku, on alueella noin 36-42°C. 20
- 64. Menetelmä jonkin patenttivaatimuksen 1-41 mukaisen plasmidin valmistamiseksi, tunnettu siitä, että sijoitetaan mukaan DNA-palanen, joka kantaa plasmidin sisältävien solujen tunnistamiseen ja/tai valikoimiseen käyttökelpoista . :*25 merkkiä.
- 65. Patenttivaatimuksen 64 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että merkkigeeni välittää isäntämikro-organismille vastustuskyvyn antibiootin suhteen. Il 65 89941
Applications Claiming Priority (6)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DK415182 | 1982-09-16 | ||
DK415182 | 1982-09-16 | ||
DK427082 | 1982-09-24 | ||
DK427082 | 1982-09-24 | ||
PCT/DK1983/000084 WO1984001171A1 (en) | 1982-09-16 | 1983-09-09 | Plasmids with conditional uncontrolled replication behaviour |
DK8300084 | 1983-09-09 |
Publications (4)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
FI841976A FI841976A (fi) | 1984-05-16 |
FI841976A0 FI841976A0 (fi) | 1984-05-16 |
FI89941B true FI89941B (fi) | 1993-08-31 |
FI89941C FI89941C (fi) | 1993-12-10 |
Family
ID=26067368
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
FI841976A FI89941C (fi) | 1982-09-16 | 1984-05-16 | Plasmider med villkorligt replikeringsuppfoerande |
Country Status (11)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP0109150B1 (fi) |
JP (2) | JPH0753111B2 (fi) |
AU (1) | AU569043B2 (fi) |
CA (1) | CA1313829C (fi) |
DE (2) | DE109150T1 (fi) |
FI (1) | FI89941C (fi) |
HU (1) | HU201116B (fi) |
IE (1) | IE58059B1 (fi) |
IL (1) | IL69741A (fi) |
NO (1) | NO175488C (fi) |
WO (1) | WO1984001171A1 (fi) |
Families Citing this family (14)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5702916A (en) * | 1982-09-16 | 1997-12-30 | Gx Biosystems A/S | Biological Containment |
US4710473A (en) * | 1983-08-10 | 1987-12-01 | Amgen, Inc. | DNA plasmids |
GB8407498D0 (en) * | 1984-03-22 | 1984-05-02 | Biogen Nv | High copy number expression vectors |
GB2166743B (en) * | 1984-11-13 | 1989-01-05 | Solvay | Process for a thermo-inducible gene expression in gram positive bacteria and bacillus subtilis strains containing plasmids which induce such an expression |
US5173418A (en) * | 1985-05-10 | 1992-12-22 | Benzon Pharma, A/S | Production in Escherichia coli of extracellular Serratia spp. hydrolases |
US4874703A (en) * | 1985-08-26 | 1989-10-17 | Eli Lilly And Company | Expression vectors for use in E. coli |
ATE107697T1 (de) * | 1986-03-26 | 1994-07-15 | Genexpress Aps | Biologische eindämmung. |
US5593860A (en) * | 1987-08-14 | 1997-01-14 | Bio-Technology General Corp. | Expression plasmids containing the deo promoter, and bacterial hosts containing the plasmids |
NZ225760A (en) * | 1987-08-14 | 1991-02-26 | Bio Technology General Corp | Expression plasmids containing the deo promoter and bacterial hosts containing these plasmids |
CA2057715A1 (en) * | 1990-12-19 | 1992-06-20 | Charles L. Hershberger | Method for enhancing the structural stability of recombinant dna expression vectors |
GB9215540D0 (en) * | 1992-07-22 | 1992-09-02 | Celltech Ltd | Protein expression system |
WO2000028048A1 (en) * | 1998-11-09 | 2000-05-18 | Genecare Development Aps | Novel plasmids for use in medicine and method of producing same |
US6991786B1 (en) * | 2000-08-30 | 2006-01-31 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Anti-microbial biotherapeutic agents: alternatives to conventional pharmaceutical antibiotics |
US7758854B2 (en) | 2001-08-30 | 2010-07-20 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Anti-microbial agents |
Family Cites Families (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE2759053A1 (de) * | 1977-12-30 | 1979-07-12 | Uhlin | Verfahren zum herstellen von genprodukten von plasmid-dns |
FI793884A (fi) * | 1978-12-26 | 1980-06-27 | Cetus Corp | Stabila plasmider med stort kopieantal |
CA1198067A (en) * | 1981-02-27 | 1985-12-17 | David H. Gelfand | Stable high copy number plasmids |
IL65775A (en) * | 1981-05-18 | 1985-05-31 | Genentech Inc | Microbial hybrid promotors and plasmids and e.coli comprising them |
DK410783D0 (da) * | 1982-09-16 | 1983-09-09 | Benzon A Salfred | Fremgangsmade til stabilisering af plasmider |
GB8308236D0 (en) * | 1983-03-25 | 1983-05-05 | Celltech Ltd | Dna vectors |
-
1983
- 1983-09-09 JP JP58502971A patent/JPH0753111B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1983-09-09 WO PCT/DK1983/000084 patent/WO1984001171A1/en active IP Right Grant
- 1983-09-09 HU HU356483A patent/HU201116B/hu not_active IP Right Cessation
- 1983-09-09 AU AU19487/83A patent/AU569043B2/en not_active Ceased
- 1983-09-15 IL IL6974183A patent/IL69741A/xx not_active IP Right Cessation
- 1983-09-16 IE IE217783A patent/IE58059B1/en not_active IP Right Cessation
- 1983-09-16 DE DE1983305438 patent/DE109150T1/de active Pending
- 1983-09-16 CA CA000436866A patent/CA1313829C/en not_active Expired - Fee Related
- 1983-09-16 EP EP83305438A patent/EP0109150B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1983-09-16 DE DE19833382607 patent/DE3382607T2/de not_active Expired - Lifetime
-
1984
- 1984-05-15 NO NO841935A patent/NO175488C/no unknown
- 1984-05-16 FI FI841976A patent/FI89941C/fi not_active IP Right Cessation
-
1990
- 1990-01-11 JP JP2006100A patent/JP2604478B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
DE109150T1 (de) | 1984-10-25 |
EP0109150A3 (en) | 1985-10-09 |
JPH02238891A (ja) | 1990-09-21 |
FI89941C (fi) | 1993-12-10 |
IL69741A (en) | 1990-11-05 |
IE832177L (en) | 1984-03-16 |
EP0109150B1 (en) | 1992-08-12 |
NO175488C (no) | 1994-10-19 |
DE3382607T2 (de) | 1993-03-11 |
NO841935L (no) | 1984-05-15 |
HU201116B (en) | 1990-09-28 |
FI841976A (fi) | 1984-05-16 |
EP0109150A2 (en) | 1984-05-23 |
CA1313829C (en) | 1993-02-23 |
AU1948783A (en) | 1984-04-04 |
WO1984001171A1 (en) | 1984-03-29 |
NO175488B (no) | 1994-07-11 |
DE3382607D1 (de) | 1992-09-17 |
IE58059B1 (en) | 1993-06-30 |
JPS59501532A (ja) | 1984-08-30 |
AU569043B2 (en) | 1988-01-21 |
JP2604478B2 (ja) | 1997-04-30 |
FI841976A0 (fi) | 1984-05-16 |
JPH0753111B2 (ja) | 1995-06-07 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
FI86439B (fi) | Stabiliserade plasmider. | |
Reynolds et al. | Enhancement of bacterial gene expression by insertion elements or by mutation in a CAP-cAMP binding site | |
Takiff et al. | Genetic analysis of the rnc operon of Escherichia coli | |
FI89941B (fi) | Plasmider med villkorligt replikeringsuppfoerande | |
Wong et al. | Identification of a positive retroregulator that stabilizes mRNAs in bacteria. | |
US4806471A (en) | Plasmids with conditional uncontrolled replication behavior | |
Stern et al. | Role of the intercistronic region in post‐transcriptional control of gene expression in the histidine transport operon of Salmonella typhimurium: involvement of REP sequences | |
Ma et al. | Analysis of the promoter and regulatory sequences of an oxygen-regulated bch operon in Rhodobacter capsulatus by site-directed mutagenesis | |
Berman et al. | Selection of lac gene fusions in vivo: ompR-lacZ fusions that define a functional domain of the ompR gene product | |
Tabuchi et al. | Genetic organization and nucleotide sequence of the stability locus of IncFII plasmid NR1 | |
US5545541A (en) | Stabilization of unstably inherited replicons | |
US20130203113A1 (en) | METHOD OF STABILIZING mRNA | |
Thomas et al. | Identification of a seventh operon on plasmid RK2 regulated by the korA gene product | |
US5242809A (en) | Gal operon of streptomyces | |
Pérez-Morga et al. | A short DNA sequence from λ phage inhibits protein synthesis in Escherichia coli rap | |
Altier et al. | A recombinase-based selection of differentially expressed bacterial genes | |
DK171215B1 (da) | Plasmider med betinget ukontrolleret replikationstærskel samt fremgangsmåde til fremstilling af et genprodukt ved dyrkning af en mikroorganisme indeholdende et sådant plasmid | |
US4845031A (en) | Recombinant DNA process for producing useful polypeptides | |
US5346830A (en) | Gene expression system based on regulatory elements of bateriophage P2 and satellite phage P4 | |
Brana et al. | Stability of the hybrid plasmid pIM138 and its curing by some eliminating agents | |
RU2312146C1 (ru) | Вектор на основе репликона бактериофага n15 и рекомбинантный вектор для регулируемой экспрессии целевого гена в клетках escherichia coli, штамм escherichia coli, обеспечивающий возможность регуляции числа копий вектора, и система экспрессии | |
Wróbel et al. | Replication of plasmids derived from P1, F, R1, R6K and RK2 replicons in amino acid‐starved Escherichia coli stringent and relaxed strains | |
Davies et al. | Sequence rearrangements in the plasmid ColV, I-K94 | |
DK167883B1 (da) | Stabiliserede plasmider, bakterier indeholdende samme, fremgangsmaade til fremstilling af genprodukt af plasmid-dna og dna fragment omfattende r1 fordelingsfunktion | |
NO870630L (no) | Stabilisering av ustabilt nedarvede replikoner. |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
BB | Publication of examined application | ||
MM | Patent lapsed | ||
MM | Patent lapsed |
Owner name: BENZON PHARMA A/S |