Europäische Patentanmeldung 83 305 438.0
A/S Alfred Benzon
I.-Plasmid, dadurch gekennzeichnet, daß
ein regulierbarer Promotor in der Weise inseriert ist, daß die Transkription von diesem Promotor die Replikation
reguliert.
2. Plasmid, dadurch gekennzeichnet, daß
ein regulierbarer Promotor in der Weise inseriert ist, daß die Transkription von diesem Promotor die Replikation
reguliert, so daß eine erhöhte Transkription zu einer wesentlich erhöhten oder unktontrollierten
Plasmid-Kopienzahl führt. .
3. Plasmid nach Anspruch 1 und/oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Promotor so beschaffen
ist, daß er, aufgrund einer besonderen DNA-Struktur innerhalb der Region des Promotors in stabiler
Weise regulierbar ist.
4. Plasmid nach Anspruch 1 und/oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Promotor mittels
eines regulierenden Faktors kontrollierbar ist.
5. Plasmid nach Anspruch U, dadurch gekennzeichnet, daß der regulierende Faktor so be-
■ ' schaffen ist, daß er eine positive Kontrolle ausübt.
6. Plasmid nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß der regulierende Faktor so beschaffen
ist, daß er eine negative Kontrolle ausübt.
17. Plasmid nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die erhöhte Transkription von
dem regulierbaren Promotor, die zu einer wesentlich erhöhten oder unkontrollierten Plasmid-Kopienzahl führt,
durch Derepression des genannten Promotors verursacht
wird.
8. Plasmid nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß
der Promotor so beschaffen ist, daß er chemisch regulierbar ist.
9. Plasmid nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß der Promotor ein lac-Promotor,
ein trp-Promotor oder ein deo-Promotor ist.
10. Plasmid nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 7,
dadurch gekennzei chne t, daß die Aktivität
des Promotors temperaturabhängig ist oder durch einen temperaturempfindlichen regulierenden Faktor
gesteuert wird.
11. Plasmid nach Anspruch 10, dadurch g e k e η η -
ze i c. h n'e t, daß der Promotor ein A-Promotor ist
und daß zusätzlich das Gen für einen temperaturempfindlichen Acl-Repressor anwesend ist, der die Transkription
von dem genannten Promotor kontrolliert.
12. Plasmid nach Anspruch 11, dadurch g e k e η η zeichnet,
daß der A--Promotor entweder APp oderAPL ist.
13- Plasmid nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß der .A. -Promotor Apr ist.
14. Plasmid nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß
die Transkription von dem genannten,
! regulierbaren Promotor das Plasmid veranlaßt, bei niedrigen
Temperaturen eine konstante, niedrige Kopienzahl und bei höheren Temperaturen eine wesentlich erhöhte
oder unkontrollierte Kopienzahl zu zeigen.
15- Plasmid nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß die Transkription von dem genannten,
regulierbaren Promotor das Plasmid veranlaßt, bei einer Temperatur von etwa 300C eine konstante,
,Q niedrige Kopienzahl und bei einer Temperatur im Bereich
von etwa 36 bis 420C eine wesentlich erhöhte Kopienzahl
zu zeigen.
16. Plasmid nach Anspruch 15, dadurch g e k e η η -
] ' zeichnet, daß es bei Temperaturen oberhalb
von etwa 390C eine unkontrollierte Plasmid-Kopienzahl
zeigt.
17. Plasmid nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet, daß ein Teil eines nativen Regulationsgens der Replikation
deletiert und durch den regulierbaren Promotor ersetzt wurde.
p. 18. Plasmid nach Anspruch 17, dadurch g e k e η η zeichnet,
daß es, wenn der Wirtsmikroorganismus, der das Plasmid enthält, unter Bedingungen wächst, die
eine konstante, niedrige Plasmidkopienzahl sicherstellen, eine Kopienzahl im Bereich von 20 bis 40,
vorzugsweise 20 bis 30 und insbesondere 20 bis 25 Ko-
pien pro Zelle aufweist und, wenn der Wirtsmikroorganismus bei anderen, zu wesentlich erhöhten oder unkontrollierten
Plasmidkopienzahlen führenden Bedingungen wächst, eine Kopienzahl im Bereich von etwa 500 bis 10O0
Kopien pro Zelle aufweist.
19- Plasmid nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß es eine Plasmid-Kopienzahl im Be-
reich von etwa 20 bis 40, vorzugsweise 20 bis 30 und insbesondere 20 bis 25 Kopien pro Zelle bei einer
Temperatur, beispielsweise bei einer Temperatur von etwa 3O0C, und eine unkontrollierte Plasmidkopienzahl
im Bereich von mindestens etwa 500 bis 1000 Kopien pro Zelle bei einer höheren Temperatur, beispielsweise bei
einer Temperatur von etwa 420C, aufweist.
20. Plasmid nach mindestens einem der Ansprüche 17 bis
19, dadurch g e k e η η ζ e i c h η e t, daß es ein R1-Typ-Plasmid ist, von dem das copB-Gen deletiert und
durch einen regulierbaren Promotor ersetzt wurde.
21. Plasmid,dadurch ge k e η η ζ e i ch η e t,.daß
es, wenn der Wirtsmikroorganismus, der das Plasmid enthält, unter Bedingungen wächst, die eine konstante,
niedrige Plasmidkopienzahl sicherstellen, eine Kopienzahl im Bereich von 3 bis 5 Kopien pro Zelle aufweist
und , wenn der Wirtsmikroorganismus bei anderen, zu wesentlich erhöhten oder unkontrollierten Plasmidkopienzahlen
führenden Bedingungen wächst, eine Kopienzahl im Bereich von etwa 500 bis 1000 Kopien pro Zelle aufweist.
22. Plasmid nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß es eine Plasmid-Kopienzahl im Bereich
von etwa 3 bis^ 5 Kopien pro Zelle bei einer
Temperatur, beispielsweise bei einer Temperatur von etwa 3O0C, und eine unkontrollierte Plasmidkopienzahl
im Bereich von mindestens etwa 500 bis 1000 Kopien pro
Zelle bei einer höheren Temperatur, beispielsweise bei einer Temperatur von etwa 420C, aufweist.
23- Plasmid nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 16,
dadurch gekennzeichnet, daß der regulierbare Promotor stromaufwärts des (der) nativen Replikations-Kontrollgens
(-gene) des Plasmids inseriert wurde.
_5-
24. Plasmid nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, daß, wenn der Wirtsmikroorgahismus der
das Plasmid enthält, unter Bedingungen wächst, die eine konstante, niedrige Plasmid-Kopienzahl sicherstellen,
eine Kopienzahl im Bereich von etwa 3 bis 5 Kopien pro Zelle aufweist, und, wenn der Wirtsmikroorganismus
unter anderen, zu wesentlich erhöhten oder unkontrollierten Plasmid7Kopien ihl führenden
Bedingungen wächst,eine Kopienzahl im Bereich von mindestens etwa 500 bis 1000 pro Zelle aufweist.
25. Plasmid nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß es eine Plasmid-Kopienzahl im
Bereich von etwa 3 bis 5 Kopien pro Zelle bei einer Temperatur, beispielsweise bei einer Temperatur von
etwa 300C, und eine unkontrollierte Plasmid-Kopienzahl im Bereich von mindestens etwa 500 bis 1000 Kopien
pro Zelle bei einer höheren Temperatur, beispielsweise bei einer Temperatur von etwa 420C, aufweist.
26. Plasmid nach mindestens einem der Ansprüche 23 bis 25, dadurch gekennzeichnet, daß es ein
R1-Typ-Plasmid ist, in dem der regulierbare Promotor
stromaufwärts der copB- und copA-Gene inseriert ist.
27- Plasmid, dadurch gekennzeichnet, daß es, wenn der Wirtsmikroorganismus, der das Plasmid
enthält, unter Bedingungen wächst, die eine konstante, niedrige Plasmidkopienzahl sicherstellen, eine Kopienzahl
im Bereich von 0,5 bis 1 Kopie pro Zelle aufweist und, wenn der Wirtsmikroorganismus bei anderen, zu wesentlich
erhöhten oder unkontrollierten Plasmid-Kopienzahlen führenden Bedingungen wächst, eine Kopienzahl
im Bereich von etwa 500 bis 1000 Kopien pro Zelle aufweist.
28. Plasmid nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, daß es eine Plasmid-Kopienzahl im
_6-
Bereich von etwa 0,5 bis 1 Kopie pro Zelle bei einer Temperatur, beispielsweise bei einer Temperatur von
etwa 3O0C, und eine unkontrollierte Plasmid-Kopienzahl
im Bereich von mindestens etwa 500 bis 1000 Kopien pro Zelle bei einer höheren Temperatur, beispielsweise bei einer Temperatur von etwa 42°C, aufweist.
29. Plasmid nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß es einen
regulierbaren Promotor in der Replikationsregion trägt, aus der ein Teil eines nativen Regulationsgens der
Implikation deletiert wurde und daß das native Regulationsgen der Replikation in einer Region inseriert
wurde, in der das Gen natürlicherweise nicht lokalisiert ist.
30. Plasmid nach Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, daß es, wenn der Wirtsmikroorganismus,
der das Plasmid enthält, unter Bedingungen wächst, die eine konstante, niedrige Plasmidkopienzahl sicherstellen,
eine Kopienzahl im Bereich von 0,5 bis 1 Kopie pro Zelle aufweist und , wenn der Wirtsmikroorganismus bei
anderen, zu wesentlich erhöhten oder unkontrollierten Plasmid-Kopienzahlen führenden Bedingungen wächst,
eine Kopienzahl im Bereich von etwa 500 bis 1000 Kopien
pro Zelle aufweist.
31. Plasmid nach Anspruch 30, dadurch g e k e η η -
ze i c h η e t, daß es eine Plasmid-Kopienzahl im Bereich
von etwa 0,5 bis 1 Kopie pro Zelle bei einer Temperatur, beispielsweise bei einer Temperatur von
etwa 3O0C, und eine unkontrollierte Plasmid-Kopienzahl im Bereich von mindestens etwa 500 bis 1000 Kopien
pro Zelle bei einer höheren Temperatur, beispielsweise bei einer Temperatur von etwa 420C, aufweist.
32. Plasmid nach mindestens einem der Ansprüche 29 bis 31, dadurch gekennzeichnet,, daß ein R1-Typ-
— Ί —
Plasmid ist, in dem das copB-Gen in der EcoRI-Er~
kennungsstelle auf erhalb der Replikationsregion des Plasmids inseriert wurde.
33. Plasmid nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß
zusätzlich zu dem ersten, regulierbaren Promotor, der die Transkription von der Beplikationsregion reguliert,
ein zweiter Promotor in einer Weise inseriert wurde, die das Inserieren eines Strukturgens erlaubt, dessen
Expression vom genannten zweiten Promotor kontrolliert wird.
34. Plasmid nach Anspruch 33, dadurch g e k e η η zeichnet,
daß der zweite Promotor, der die Expression des genannten Gens reguliert, steuerbar
ist.
35. Plasmid nach Anspruch 33 und/oder 34, dadurch g e kennzeichnet,
daß der zweite, inserierte Promotor, der die Expression des Stukturgens steuert,
der /vP.-Promotor ist.
36. Plasmid nach mindestens einem der Ansprüche 33 bis 35, dadurch gekennzeichnet, daß es bei
33°C eine konstante, niedrige Plasmid-Kopienzahl und wenig oder gar keine Expression aufweist und bei einer
Temperatur im Bereich von 36 bis 420C eine wesent
lich erhöhte oder unkontrollierte Plasmid-Kopienzahl, sowie Genexpression aufweist.
37- Plasmid nach Anspruch 36, dadurch gekennzeichnet, daß es bei Temperaturen oberhalb
von 39°C eine unkontrollierte Plasmid-Kopienzahl und
eine sehr hohe Genexpression aufweist.
38. Plasmid nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß
-δι es einen Marker trägt, der für die Identifizierung
und/oder Selektion von Zellen, die das Plasmid enthalten,
geeignet ist.
39. Plasmid nach Anspruch 38, dadurch gekennzeichnet, daß der Marker ein Gen ist, das dem
Wirtsmikroorganisraus Antibiotikaresistenz vermittelt.
40. Plasmid nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet, daß es ein Gen trägt, das nach der Insertion eines anderen
Gens eine Genfusion'erlaubt, und es durch diese Genfusion
möglich wird, Expression festzustellen.
41. Plasmid nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß
es ein Miniplasmid ist.
42. Plasmid nach mindestens einem der vorhergehenden An-
sprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es zusätzlich ein oder mehrere Gene trägt, das (die) nicht
natürlicherweise mit dem Plasmid verwandt ist (sind).
43.- Mikroorganismus, dadurch gekennzeichnet,
daß er ein Plasmid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 42 trägt
44. Mikroorganismus nach Anspruch 43, dadurch g e k e η η
zeichnet, daß.er ein Bakterium ist.
45. Mikroorganismus nach Anspruch 44, dadurch g e k e η η
zeichnet, daß es ein .gramnegatives und mesophi·
les Bakterium ist.
46. Mikroorganismus nach Anspruch 45, dadurch g e k e η η
zeichnet, daß es ein Escherichia coli ist.
47. Verfahren zum Konstruieren eines Plasmids gemäß einem
der Ansprüche 1 bis 42, dadurch gekennzeichnet, daß ein regulierbarer Promotor in ein Plasmid
in der Weise inseriert wird, daß die Transkription von diesem Promotor die Replikation reguliert und daß
■das so behandelte Plasmid durch Screening nach solchen
Plasmiden identifiziert wird, die eine wesentlich erhöhte oder unkontrollierte Plasmid-Kopienzahl zeigen,
wenn die Transkription vom genannten Promotor erhöht ist.
10
48. Verfahren nach Anspruch 47, dadurch gekennzeichnet, daß ein Teil eines nativen Regulationsgens für die Replikation deletiert wird und ein DNA-Fragment.,'
das den regulierbaren Promotor enthält, an der Stelle des teilweise deletierten Regulationsgens
für die Replikation inseriert wird.
49. Verfahren nach Anspruch 48, dadurch gekennzeichnet, daß das copB-Gen aus dem Plasmid durch
Schneiden mit der Restriktionsendonuklease BgIII deletiert und an dieser Stelle ein Bglll-Fragment, enthaltend
den regulierbaren Promotor, inseriert wird.
50. Verfahren nach Anspruch 47, dadurch g e k e η η -
zeichnet, daß der regulierbare Promotor stromaufwärts des (der) nativen Replikations-Kontrollgens
(-gene) inseriert wird.
51. Verfahren nach Anspruch 50, dadurch g e k e η η -
zeichnet, daß der regulierbare Promotor an der Bglll-Erkennungsstelle stromaufwärts der copB- und
copA-Gene inseriert wird.
52. Verfahren nach Anspruch 47, dadurch g e k e η η -
zeichnet, daß, ausgehend von einem Plasmid mit
dem teilweise deletierten, nativen Regulationsgen für die Replikation, das native Regulationsgen für die Replikation
an seiner ursprünglichen Stelle reinseriert wird,
-ιοί um ein Plasmid zu konstruieren, in dem alle nativen
Replikations-Kontrollgene vorhanden sind.
53- Verfahren nach Anspruch 52, dadurch g e k e η η <zeichnet,
daß, ausgehend von einem Plasmid mit einem teilweise deletiertem copB-Gen, das copB-Gen an
der Bglll-Erkennungsstelle reinseriert wird, um ein
Plasmid zu konstruieren, in dem sowohl das copB- als
auch das copA-Gen vorhanden sind.
10
54. Verfahren nach Anspruch 47, dadurch gekennzeichnet, daß, ausgehend von einem Plasmid mit
einem teilweise deletierten, nativen Regulationsgen
der Replikation, ein natives Regulationsgen der Replikation in einer Region des Plasmids inseriert wird,
in der es nicht natürlicherweise lokalisiert ist.
55. Verfahren nach Anspruch 54, dadurch gekennzeichnet, daß, ausgehend von einem Plasmid mit
einem teilweise deletiertem copB-Gen, das copB-Gen an der EcoRI-Erkennungsstelle außerhalb der Replikationsregion
des Plasmids inseriert wird.
56. Verfahren zum Konstruieren eines Plasmids nach Anspruch 33, dadurch gekennzeichnet, daß ,zusätzlich
zum Inserieren des regulierbaren Promotorsder genannte zweite Promotor an einer geeigneten Restriktions-Erkennungsstelle
inseriert wird, so daß die Insertion eines Strukturgens ermöglicht wird, dessen Expression
durch den genannten zweiten Promotor regulierbar ist.
57. Verfahren zum Herstellen eines Genprodukts einer Plasmid-DNA,
dadurch gekennze ichnet, daß
ein Mikroorganismus, der ein Plasmid gemäß einem der
Ansprüche 1 bis 42 trägt, kultiviert wird, enthaltend
zumindest eine Zeitspanne der Kultivierung unter Bedingungen, die eine erhöhte Transkription von dem genannten
regulierbaren Promotor sicherstellen, wobei die
erhöhte Transkription zur Folge hat, daß eine wesentlich erhöhte oder unkontrollierte Plasmid-Kopienzahl
erhalten wird und Ernten eines Genprodukts des Plasmids aus der mikrobiellen Kultur.
58. Verfahren nach Anspruch 57, dadurch gekennzeichnet, daß ein Wirtsmikroorganismus kultiviert
wird, der mit einem Plasmid gemäß einem der Ansprüche bis 42 transformiert wurde, unter Bedingungen, die zu
einer konstanten, niedrigen Plasmid-Kopienzahl während der Anwachs- und Vermehrungsstadien führen, bis die
gewünschte Zahl der Zellen erhalten ist und anschließend ν der Wirtsmikroorganismus unter Bedingungen kultiviert
.wird, die zu einer wesentlich erhöhten oder unkontrollierten
Plasmid-Kopienzahl führen.
59. Verfahren nach Anspruch 57 oder 58, dadurch gekennzeichnet, daß nach einer Zeitspanne
der Kultivierung unter Bedingungen, in denen jedwede Transkription von dem Promotor die Kopienzahl des
Plasmids nicht signifikant beeinflußt, eine die Promotoraktivität induzierende Substanz zu dem Kulturmedium in
einer Menge zugegeben wird, die zu einer wesentlich erhöhten oder unkontrollierten Plasmid-Kopienzahl führt
60. Verfahren nach Anspruch 59, dadurch gekennzeichnet, daß nach dem Aufrechterhalten der Bedingungen,
die zu einer wesentlich erhöhten oder unkontrollierten Plasmid-Kopienzahl führen, während eines
Zeitraums, der ausreicht, um eine wesentliche Vermehrung des Plasmids zu erhalten, jedoch ausreichend
kurz ist, um jedwede wesentliche Schädigung der mikrobiellen Kultur zu vermeiden, die, die Promotoraktivität
induzierende Substanz,aus dem Kulturmedium entfernt wird, wodurch ein langsamer Abbau der Plasmid-Kopienzahl
auf das vor-der Induktion vorhandene Maß bewirkt wi. rd
61. Verfahren nach Anspruch 57 und/oder 58, dadurch ge-
kennzeichnet, daß nach einer Zeitspanne
der Kultivierung in Anwesenheit einer Substanz, die im wesentlichen die Promotoraktivität inhibiert, die
Konzentration dieser Subastanz auf ein Maß reduziert wird, das zu einer Aktivierung des Promotors und einer
wesentlich erhöhten oder unkontrollierten Plasmid-Kopienzahl
führt.
62. Verfahren nach Anspruch 61, dadurch g e k e η η -
zeichnet, daß, nach dem Aufrechterhalten der Bedingungen, die zu einer wesentlich erhöhten oder unkontrollierten
Plasmid-Kopienzahl führen, während eines Zeitraums, der ausreicht, um eine wesentliche Vermehrung
des Plasraids zu erhalten, jedoch ausreichend kurz ist, um jedwede wesentlich Schädigung der mikrobiellen
Kultur zu vermeiden, die, die Promotoraktivität inhibierende Substanz aus dem Kulturmedium .entfernt wird,
wodurch ein langsamer Abbau der Plasmid-Kopienzahl auf das vor der Induktion vorhandene Maß bewirkt wird.
63. Verfahren nach Anspruch 57 und/oder 58, dadurch g ekennzeichne
t,.daß die Bedingungen, unter denen der Wirtsorganismus kultiviert wird, zumindest
eine Zeitspanne der Kultivierung bei oder in der ,{iahe
einer Temperatur enthält, bei der die Plasmid-Kopienzahl wesentlich erhöht oder unkontrolliert ist.
64. Verfahren nach Anspruch 63, dadurch gekennzeichnet, daß die Kultivierung bei der Tempera-
tür, bei der die Plasmid-Kopienzahl wesentlich erhöht oder unkontrolliert ist, solange beibehalten wird, bis
das Wachstum des Wirtsmikroorganismus durch die Bildung von Plasmid-DNA oder Genprodukten des Plasmids inhibiert
wird ^
65. Verfahren nach Anspruch 63, dadurch gekennzeichnet, daß eine Stufenproduktion kontinuierlich
bei einer Temperatur durchgeüfhrt wird, die diejenige
Temperatur darstellt, bei der die Plasmid-Kopienzahl
wesentlich erhöht oder unkontrolliert ist, um das überleben und kontinuierliche Wachstum des Wirtsmikroorganismus
gleichzeitig mit der Bildung von wachsenden
g Mengen eines Genprodukts des Plasmids zu erlauben und
das Genprodukt sodann kontinuierlich oder intermittierend aus der Kultur geerntet wird.
66. Verfahren nach Anspruch 63, dadurch g e k e η η -
~ ~, Q zeichnet, daß nach der Vermehrung der mikrobiellen
Kultur, um den Produktionsmaßstab zu erreichen, die Temperatur auf oder in die Nähe einer Temperatur geshiftet
wird, bei der die Plasmid-Kopienzahl wesentlich erhöht oder unkontrolliert ist, und diese Temperatur
.,. für eine Zeitspanne erhalten bleibt, die ausreicht, um
eine wesentliche Vermehrung des Plasmids zu erreichen, jedoch kurz genug ist, um jedwede wesentliche Schädigung
der mikrobiellen Kultur zu vermeiden, wonach die Temperatur wieder auf eine Temperatur geshiftet wird, die eine
__ niedrige, konstante Plasmid-Kopienzahl sicherstellt,
wodurch ein langsamer Abbau der Kopienzahl des Plasmids verursacht wird, bis das Anfangsmaß erreicht wird.
67. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 63 bis 66,
__ dadurch gekennzeichnet, daß die Temperatur, bei der die Plasmid-Kopienzahl wesentlich erhöht oder
unkontrolliert ist, höher ist, als die Temperatur, bei der das Plasmid eine konstante, niedrige Kopienzahl
aufweist.
68. Verfahren nach Anspruch 67, dadurch gekennzeichnet, daß die Temperatur, bei der das Plasmid
eine konstante, niedrige Kopienzahl hat, eine Temperatur von etwa 3O0C ist und die Temperatur, bei
der das Plasmid eine wesentlich erhöhte oder unkon-35
trollierte Kopienzahl hat,im Bereich von etwa 36 bis 420C
liegt.
1 69. Verfahren zum Herstellen eines Plasmids nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 42, dadurch gekennzeichnet, daß ein DNA-Fragment, das einen Marker
trägt, der zur Identifikation und/oder Selektion von
5 'Zellen geeignet \st, die das Plasmid enthalten, inseriert
wird.
70. Verfahren nach Anspruch 69, dadurch gekennzeichnet, daß der Marker ein Gen ist, das dem
Wirtsmikroorganismus Antibiotikaresistenz vermittelt. 10