NO175488B

NO175488B - Plasmider for regulerbart kopitall, samt anvendelse av slike

Info

Publication number: NO175488B
Application number: NO841935A
Authority: NO
Inventors: Soeren Molin; Jens Erik Loeve Larsen; Janice Ann Light
Original assignee: Benzon Pharma As; Benzon As Alfred
Priority date: 1982-09-16
Filing date: 1984-05-15
Publication date: 1994-07-11
Also published as: FI89941B; JPH0753111B2; IE832177L; CA1313829C; AU1948783A; EP0109150A3; NO841935L; DE3382607D1; IE58059B1; DE3382607T2; JPH02238891A; HU201116B; FI841976A; FI89941C; JP2604478B2; FI841976A0; DE109150T1; WO1984001171A1; JPS59501532A; EP0109150A2

Description

Oppfinnelsen vedrører nye plasmider som er nyttige som klonings- og produksjonsvektorer på området rekombinant DNA-teknologi, hvis replikeringsoppførsel er ukontrollert under betingelser som er gunstige for dette. Det henvises spesielt til krav 1, 10, 13 og 16. Oppfinnelsen vedrører også anvendelse av slike plasmider, som beskrevet i krav 22-26.

Plasmider med kondisjonen ukontrollert replikeringsoppførsel (såkalte "runaway"-plasmider) er kjent fra f.eks. den publiserte europeiske patentsøknad nr. 78101877.5. Replikeringen av disse plasmider er temperaturavhengig ved det at plasmidene viser et kontrollert, konstant, lavt kopitall når vertsbakterier som bærer plasmidene dyrkes ved én temperatur, f.eks. ved en temperatur på ca. 30°C, og et ukontrollert kopitall når vertsbakteriene dyrkes ved en annen temperatur, f.eks. en temperatur over ca. 36°C.

De plasmider som er åpenbart i ovennevnte patentsøknad ble isolert ved kjemisk mutagenisering av plasmid RI, et plasmid av vill-type som er kjent for å replikere autonomt i Escherichia coli. Mutageniseringen ble utført i to trinn,.et første trinn som omfattet isolering av en plasmidbærende bakterieklon hvor plasmidkopitallet er ca. 1-2 ved 30°C og 4-5 ganger høyere ved 4 0°C, og et annet trinn som omfattet isolering av en bakterieklon hvor plasmidet viste et ukontrollert kopitall ved den høyere temperatur. De plasmider som viste "runaway"-oppførsel var således dobbelte mutanter av morplasmidet.

Ovennevnte publikasjon åpenbarer også miniplasmider som er nyttige som kloningsvektorer fordi de relativt lett transformeres til vertsbakterier på grunn av sin lille størrelse. Disse miniplasmider har bevart de gener som er ansvarlige for den temperaturavhengige "runaway"-replikeringsoppførsel.

Som klonings- og produksjonsvektorer kan de plasmider som er åpenbart i ovennevnte publikasjon anvendes for å oppnå genprodukter av innsatte fragmenter av fremmed DNA. Den temperaturavhengige replikering av plasmidene kan benyttes for å produsere forsterkede mengder av genprodukter fra DNA-fragmenter av f.eks. eukaryotisk opprinnelse. Slik amplifikasjon av genprodukt har ikke vært til-gjengelig med konvensjonelle plasmid-DNA-amplifikasjonsteknikker som f.eks. virker ved tilsetning av kloramfenikol til dyrknings-mediet, da nærværet av kloramfenikol gjør at proteinsyntesen stanser.

De plasmider som er åpenbart i ovennevnte publikasjon kan med fordel anvendes som klonings- og produksjonsvektorer i slike tilfeller hvor et innsatt fremmed gen koder for et produkt som er' skadelig for den bakterie som plasmidene transformeres til, da plasmidene ved lave temperaturer har et lavt kopitall og følgelig lite av gen-ekspresjon. Dette betyr at under multipliserings-trinnet for kulturen som dyrkes ved lave temperaturer vil bakteriene sannsynligvis ikke bli forringet.

Foreliggende oppfinnelse vedrører nye plasmider som bærer en regulerbar promoter som er innsatt på en slik måte at transkripsjon derfra regulerer plasmidreplikering. Spesielt vedrører oppfinnelsen plasmider i hvilke den regulerbare promoter forårsaker vesentlig øket eller ukontrollert replikering når vertsmikroorganismer som inneholder plasmidene dyrkes under betingelser som sikrer øket transkripsjon fra promoteren. Oppfinnelsen vedrører videre anvendelse av slike plasmider. Plasmidene er nyttige som klonings- og produksjonsvektorer.

Det er kjent å innsette en regulerbar promoter for å kontrol-lere ekspresjonen av et strukturelt gen som er innsatt i plasmidet og koder for et ønsket genprodukt. Det menes imidlertid å være nytt å innsette en regulerbar promoter i plasmider ved hjelp av hvilke det er mulig å regulere antall plasmidkopier som danner seg.

Et første aspekt ved oppfinnelsen vedrører et plasmid i hvilket en regulerbar promoter er blitt innsatt på en slik måte at transkripsjon fra denne promoter regulerer replikering, spesielt på en slik måte at øket transkripsjon fører til et vesentlig øket eller ukontrollert plasmidkopitall. I denne beskrivelse og kravene refererer betegnelsen "regulerbar promoter" til en promoter hvis aktivitet, med hensyn til raten av initiering av transkripsjon, kan reguleres ved hjelp av justering av de betingelser under hvilke vertsmikroorganismer som inneholder de promoter-bærende plasmider dyrkes. En slik regulerbar promoter kan f.eks. være en fremmed promoter, d.v.s. en promoter som ikke er naturlig relatert til plasmidet som den er innsatt i. Promoteren kan iboende være regulerbar på grunn av en spesiell DNA-struktur i promoterens region. Et eksempel på en slik promoter er den ene som finnes i de kjente "runaway"-plasmider (kfr. beskrivelsen nedenunder). Alternativt kan promoteren være kontrollerbar ved hjelp av en regulerende faktor som enten kan utøve positiv kontroll, d.v.s. at plasmidet ikke oppnår ukontrollert replikering med mindre promoteren induseres positivt, f.eks. ved tilsetning av en induserende substans til det medium som vertscellene dyrkes i, eller den regulerende faktor kan utøve negativ kontroll. Sistnevnte type av kontrollerende faktor er også kjent som en repressor hvis aktivitet også kan være regulerbar ved hjelp av justering av vekstbetingelsene for vertscellene. Repressorgenet kan være beliggende på plasmidet selv sammen med promoteren, på et separat plasmid i samme vertsmikroorganisme eller på kromosomer hos vertsmikroorganismen. Repressorgenet koder for et produkt som inhiberer transkripsjon fra den innsatte promoter slik at replikering holdes på et lavt, konstant nivå. Hvis av en eller annen grunn repressoren blir inaktivert, eksisterer ingen slik kontroll, og og transkripsjonen øker.

Med mindre annet er spesifisert, menes vanligvis betegnelsen "promoter", slik den anvendes i foreliggende beskrivelse og krav,

å inkludere både en promoter hvis aktivitet iboende gir respons på endringer i vekstbetingelsene til vertscellene og en promoter som kontrolleres av en regulerende faktor. Uttrykket "et plasmid i hvilket en regulerbar promoter er blitt innsatt" skal også henspille på plasmider i henhold til oppfinnelsen i hvilke promoteren og replikonet som reguleres av promoteren er blitt innsatt på det samme DNA-fragment, idet promoteren og replikonet endelig stammer fra forskjellige kilder; dette betyr at i ett trinn under oppbyggingen av det ønskede endelige plasmid er promoteren blitt innsatt i plasmidet fra hvilket replikonet stammer. Betegnelsen "vesentlig øket eller ukontrollert plasmidkopitall" skal forstås å referere til det faktum at når betegnelsene for dyrking av vertsmikroorganismene endres for å sikre øket transkripsjon fra promoteren slik at plasmidet taper sin replikeringskontroll, øker plasmidkopitallet eksponensielt med en generasjonstid på ca. 40-50%, eller mindre, av verdien for den mikrobielle populasjon. Økningen fortsetter inntil vertscellen

opphører å vokse, vanligvis etter 4-5 cellefordoblinger, eller mindre, ved hvilket punkt innholdet av plasmid-DNA i cellen er ca. 40-70% av den totale mengde av DNA, d.v.s. at plasmidkopitallet øker med en faktor på ca. 25-1000 eller enda mer. Med andre ord, plasmidkopitallet når ikke en rolig tilstand. Denne type ukontrollert replikeringsoppførsel betegnes også 11 runaway "-opp f ørsel.

Vår nylig ervervede kjennskap til replikeringskontroll-prinsippet hos plasmider av Rl-type benyttes ved oppbygging av plasmider i henhold til oppfinnelsen (ytterligere forklaring av dette prinsipp bringes lengre ut i denne beskrivelse). Hvis, i overensstemmelse med oppfinnelsens prinsipp, en regulerbar promoter innsettes i plasmidet, kan øket tran-skripsjon fra promoteren som fører til et vesentlig øket eller ukontrollert plasmidkopitall forårsakes ved f.eks. derepresjon av promoteren. Dette betyr at et repressorgen som er innsatt sammen med promoteren og koder for et genprodukt som kontrollerer promoteren under visse betingelser, blir inaktivert under andre betingelser slik at transkripsjon fra promoteren ikke lenger inhiberes, hvilket til slutt resulterer i et ukontrollert plasmidkopitall.

Dette er en viktig forbedring sammenlignet med de kjente "runaway"-plasmider som, under varierende betingelser, kan oppvise forskjeller i sine replikeringsegenskaper. Det er ingen indika-sjoner på at dette er tilfelle hos plasmidene i henhold til oppfinnelsen da den fremmede promoter som er innsatt normalt vil være en som er så sterk (d.v.s. at frekvensen av initiering av transkripsjon er høy) at slike vekslende betingelser er uten effekt.

Én av betingelsene for dyrkning som gjør det mulig å regulere aktiviteten til den regulerbare promoter er den temperatur ved hvilken vertsmikroorganismene dyrkes. Aktiviteten til promoteren kan være temperaturavhengig i seg selv, d.v.s. å reagere på temperaturendringer under dyrkningen, eller den regulerende faktor kan være temperaturfølsom, f.eks. en temperaturfølsom repressor.

Den regulerbare promoter kan være en promoter fra bakteriofagen X som kan bli innsatt som del av et DNA-fragment som i tillegg bærer genet for en temperaturfølsom X cl-repressor som kontrollerer transkripsjon fra promoteren. X-promoteren kan enten være XP eller XP , spesielt XP_.. Imidlertid kan også andre promotersystemer som er innsatt i plasmidene i henhold til oppfinnelsens prinsipper og influeres av andre eksterne faktorer enn temperatur, også anvendes, f.eks. promotere som er induserbare med kjemikalier eller regulerbare ved hjelp av metabolitter, for eksempel lac-. tr<p-> og deo-promotere.

En foretrukken utførelsesform av plasmidet i henhold til oppfinnelsen er en hvor promoter-reguleringssystemet resulterer i temperaturavhengig replikering hos plasmidet. Spesielt er den temperatur ved hvilken plasmidet viser et vesentlig øket eller ukontrollert plasmidkopitall. en temperatur høyere enn den temperatur ved hvilken kopitallet er lavt. Plasmider i henhold til oppfinnelsen som bærer en regulerbar promoter hvis transkrip-sjonsmønster er temperaturavhengig, f.eks. på grunn av nærvær av en temperaturfølsom repressor, viser et konstant, lavt kopitall ved én temperatur, f.eks. en temperatur på 30°C, da ved denne temperatur promoteren represseres og transkripsjon fra den følgelig holdes på et lavt nivå, og et vesentlig øket eller ukontrollert kopitall ved høyere temperatur, f.eks. en temperatur i området 36-42°C, da det regulerende system blir inaktivert i dette temperaturområde og bevirker derepresjon av promoteren og følgelig øket transkripsjon fra promoteren. Det foretrekkes at "runaway"-replikering finner sted ved temperaturer over ca. 39°C.

I den følgende beskrivelse vil det bli henvist bare til plasmider hvis replikering kontrolleres av et regulerende system som er temperaturfølsomt, spesielt av en temperaturfølsom repressor, selv om det skal forstås at andre typer av betingelser ved hjelp av hvilke plasmidreplikering kan reguleres, også kan benyttes på analog måte, som forklart ovenfor.

Én type plasmid i henhold til oppfinnelsen er et plasmid i hvilket en regulerbar promoter er blitt innsatt istedenfor en del av et nativt replikeringsregulerende gen i plasmidet. For formålene med foreliggende beskrivelse og krav er et slikt plasmid betegnet et plasmid av type A. Når plasmidet er et derivat av plasmid RI, er det regulatorgen som fjernes fra plasmidet cop_B-genet, som koder for én av de native replikeringsinhibitorer i plasmidet. Fjerning av copB-genet resulterer i en svak, stabil

økning i plasmidkopitall. Således har plasmidet et kopitall på 20-40, fortrinnsvis 20-30 og spesielt 20-25 kopier pr. celle ved ca. 30°C. Hvis imidlertid temperaturen heves til ca. 40°C, så inaktiveres repressorfunksjonen til den regulerbare promoter og replikering blir ukontrollert hvilket resulterer i et plasmidkopitall i området minst 500-1000 kopier pr. celle, avhengig blant annet av størrelsen av eventuelt fremmed DNA-fragment som er innsatt i plasmidet (jo større DNA-fragmentet er, desto lavere er tallet på plasmidkopier som dannes), effekten av genprodukter av slikt fremmed DNA og/eller den mikrobielle stamme som plasmidet transformeres til. I noen tilfeller kan imidlertid plasmidet danne opp til flere tusen kopier pr. celle ved den høyere temperatur. I alle fall er innholdet av plasmid-DNA ved den høye temperatur i forhold til det totale DNA-innhold ca. 40-75%, vanligvis 50-60%.

En annen type plasmid i henhold til oppfinnelsen er et plasmid med et kopitall på 3-5 kopier pr. celle ved én temperatur, f.eks. en temperatur på ca. 30°C, og et ukontrollert kopitall i området minst 500-1000 kopier pr. celle, avhengig av de faktorer som er beskrevet ovenfor, og i noen tilfeller opp til flere tusen kopier pr. celle, ved en høyere temperatur, f.eks. en temperatur på ca. 42°C. Et slikt plasmid kan oppnås ved å innsette den regulerbare promoter oppstrøms for plasmidets native replikerings-kontrollgen(er). For formålene med foreliggende beskrivelse og krav betegnes et slikt plasmid et plasmid av type B. I tilfellet av plasmid Rl-derivater er den regulerbare promoter blitt innsatt oppstrøms for både coB- og copA-genene, slik at begge disse native replikeringsinhibitorer er blitt bevart, hvilket forårsaker at plasmidene viser det ovennevnte kopitallmønster. Hvis imidlertid plasmidet er et som mangler par-regionen (nærværet på plasmidet i den region som er ansvarlig for fordeling har den effekt at plasmidet arves stabilt; denne effekt tilskrives ett eller flere gener i par-regionen), vil plasmidet gå tapt med en frekvens på ca. 1% pr. generasjon ved den lave temperatur på grunn av det lave kopitall ved den lave temperatur. Følgelig kan det være fordelaktig å innsette par-regionen i et slikt plasmid for å sikre at "runaway"-replikeringen til plasmidet etterpå vil finne sted i alle celler i populasjonen.

Plasmidet av type B har den ytterligere fordel at det har et stort kopitallområde. Da kopitallet ved den lave temperatur er svært lav, er det mulig å innsette fremmede gener i plasmidene hvis produkter er delvis toksiske (senkning av vekstraten) eller til og med letale for mikroorganismen som plasmidet er transformert til. Dette er av og til tilfelle hos produkter fra eukaryotiske gener, som vanligvis er de som er av største interesse for f.eks. den medisinske industri. På grunn av den lave replikeringshastighet ved den lave temperatur blir fremmede gener enten ikke uttrykt i det hele tatt eller bare i så små mengder at cellene ikke skades ved dette og kan dyrkes ved den lave temperatur under normale betingelser. Dette forbedrer eller forenkler i stor grad fremgangsmåten for fremstilling av visse polypeptider som hittil ikke har vært mulig i det hele tatt, eller bare med stor vanskelighet.

En tredje type plasmid i henhold til oppfinnelsen er et plasmid med et kopitall i området 0,5-1 kopi pr. celle (tallet 0,5 skal forstås å bety at frekvensen av replikering er mindre enn én pr. cellesyklus) ved én temperatur, f.eks. en temperatur på ca. 30°C, og et ukontrollert kopitall i området minst 500-1000 kopier pr. celle, avhengig av de faktorer som er beskrevet ovenfor, og i noen tilfeller opp til flere tusen kopier pr. celle, ved en høyere temperatur, f.eks. en temperatur på ca. 42°C. Et slikt plasmid

kan være et plasmid som bærer den regulerbare promoter i replikeringsregionen fra hvilken en del av et nativt replikeringsregulerende gen er blitt fjernet som deretter er blitt innsatt utenfor 'replikeringsregionen, d.v.s. ved et punkt hvor det naturlig ikke hører hjemme. For formålet med foreliggende beskrivelse og krav betegnes dette plasmid et plasmid av type C. I tilfellet av plasmid Rl-derivater fra hvilke copB-genet er blitt fjernet, så gjeninnsettes copB-genet, ikke ved sitt opprinnelige punkt, men ved EcoRl-punktet utenfor replikeringsregionen. Til og med slik influerer copB-inhibitor-proteinet replikeringen av plasmidet, men på en slik måte at plasmidet viser det ovenfor omtalte kopitall-mønster. Hvis imidlertid plasmidet er et som mangler par-regionen,

så går plasmidet tapt med en frekvens på ca. 5% pr. generasjon ved den lave temperatur på grunn av dette ekstremt lave kopitall ved den lave temperatur. Følgelig ville det være enda mer fordelaktig med dette plasmid enn hva som er tilfelle med plasmidene av type B å innsette par-regionen i plasmidet for å sikre at "runaway"-replikeringen til plasmidet etterpå vil finne sted i alle celler i populasjonen. Replikeringsoppførselen ved henholdsvis de lave og høye temperaturer, og derfor fordelene ved å anvende dette plasmid, er ellers lik den som plasmidene av type B viser.

Et annet aspekt ved oppfinnelsen, beskrevet i krav 19, henspiller på et plasmid i hvilket, i tillegg til den første regulerbare promoter som regulerer transkripsjon fra replikeringsregionen, en annen promoter er blitt innsatt på en måte som tillater innsettelse av et strukturelt gen hvis ekspresjon kontrolleres fra den annen promoter. Denne annen promoter kan være kontrollerbar, d.v.s. at det kan være mulig å regulere dens funksjon ved å justere de betingelser under hvilke vertscellen dyrkes med midler som er lik dem som regulerer den første regulerbare promoter. Et antall promotere er til stede som skal være nyttige for dette formål, f.eks. en lac-promoter, trp-promoter, deo-promoter, recA-promoter, XPTJ-i -promoter etc. XPTLi-romoteren kan vise seg å være spesielt fordelaktig som en annen promoter som kontrollerer ekspresjonen til det strukturelle gen da den også reguleres av den temperaturfølsomme cl-repressor, og derfor er forstørrelsesbetingelsene de samme slik at dyrkningen av vertscellene forenkles, og produktamplifikasjon inntreffer samtidig med forstørrelsen av plasmid-DNA. Det skal bemerkes at en annen promoter også kan være identisk med den første regulerbare promoter.

Den annen promoter kan bli innsatt i plasmider av type A, type B og type C. Et slikt plasmid har et konstant, lavt kopitall og svært lite eller intet av gen-ekspresjon ved ca. 30°C, og et vesentlig øket eller ukontrollert plasmidkopitall, og gen-ekspresjon, ved en temperatur i området 36-42°C. Fortrinnsvis har plasmidet et ukontrollert plasmidkopitall og en svært høy gen-ekspresjon ved temperaturer over 39°C.

Plasmidene i henhold til oppfinnelsen kan anvendes som klonings- og produksjonsvektorer, d.v.s. plasmider som kan anvendes på området rekombinant-DNA-teknologi for formålet med å oppnå et stort utvalg av produkter for tekniske eller medisinske formål, spesielt polypeptider og proteiner eller fragmenter derav, enzymer og de ikke-proteinholdige produkter fra reaksjoner mellom enzymer og en forbindelse i næringsmediet, produkter med lav molekylvekt, f.eks. hormoner og nukleinsyrer; produkter av eukaryotiske, spesielt pattedyr-, gener er av spesiell interesse. For å være nyttig som en klonings- og produksjonsvektor er det fordelaktig, skjønt ikke essensielt, at plasmidet har, for minst én restriksjons-endonuklease, et unikt sete som kan spaltes av denne endonuklease. Setet må være et som, etter innsettelse av et fragment av fremmed DNA, tillater det resulterende rekombinant-plasmid å replikere autonomt og som tillater den regulerbare promoter innsatt i plasmidet å regulere transkripsjonen av replikeringsregionen som, når transkripsjon fra denne promoter økes, fører til et vesentlig øket eller ukontrollert plasmidkopitall. Restriksjonsseter som er beliggende i replikeringsregionen er således ikke tillatelige som kloningsseter, da dette ville forårsake at plasmidet ville tape sine replikeringsegenskaper.

Plasmidet i henhold til oppfinnelsen oppbygges ved en metode som omfatter innsettelse av en regulerbar promoter i et plasmid på en slik måte at transkripsjon fra denne promoter regulerer replikering og identifiserer plasmidet som er således behandlet, ved utsortering for de plasmider som viser et vesentlig øket eller ukontrollert plasmidkopitall når transkripsjon fra promoteren økes. Når den regulerbare promoter er XP , kan den innsettes ved å blande plasmid og fag-DNA, ved å begrense med en passende endonuklease, varme-inaktivering og ligering av blandingen, samt å transformere ligeringsblandingen til en mikroorganisme.

Oppbygging av slike plasmider kan utføres ved å innsette promoteren vilkårlig på forskjellige punkter på plasmidet. Ved sortering med hensyn på plasmider med ukontrollert replikerings-oppførsel under betingelser som sikrer øket transkripsjon fra den regulerbare promoter, identifiseres den korrekte innsettelse. En enkel sortering med hensyn på slike plasmider omfatter analyse av vektegenskapene hos de plasmidbærende celler under de forskjellige betingelser. Mengden av plasmid-DNA i vertscellene kan måles på forskjellige måter, særlig ved hjelp av agarosegel-elektroforese på en måte som er kjent i og for seg. Denne sorteringsmetode utføres lett og hurtig.

Oppbygging av plasmider av type A kan skje ved å fjerne en del av ett nativt regulerende gen og dets promoter, i tilfellet av copB-genet fra plasmid RI ved å spalte med restriksjonsendonukleasen BgÆII, og innsette et DNA-fragment, f.eks. et BgÆII-fragment, inklusive den regulerbare promoter ved dette punkt.

Oppbygging av plasmider av type B kan skje ved å innsette den regulerbare promoter i plasmidet oppstrøms for det native replikeringskontrollsystem, i tilfelle av plasmid Rl-derivater ved Bglll-setet oppstrøms for copB-<g>enet ved hjelp av partiell restriksjon med B<g>lll, ligering og transformasjon til den aktuelle mikroorganisme, f.eks. E. coli. Alternativt kan plasmidet oppbygges ved anvendelse av plasmidet av type A med det delvis fjernede native replikeringsregulerende gen som utgangsmateriale og gjeninnsettelse av det native regulerende gen ved sitt opprinnelige punkt, i tilfelle av plasmider av Rl-type ved gjeninnsettelse av copB-genet ved Bg- eil-setet.

Oppbygging av plasmider av type C kan skje ved anvendelse av plasmid av type A som utgangsmateriale, innsettelse av ett nativt regulerende gen i en region av plasmidet hvor det ikke hører hjemme i villtype-opphavet, i tilfellet av plasmider av Rl-type ved innsettelse av copB-genet som et Eco-Rl-fragment ved EcoRl-setet utenfor replikeringsregionen til plasmidet ved spaltning med EcoRl, ligering og transformasjon.

I tillegg til innsettelse av den regulerbare promoter kan en annen promoter innsettes ved et passende spaltningssete som tillater innsettelse av et strukturelt gen hvis ekspresjon er regulerbar fra den annen promoter. Som nevnt ovenfor, må dette sete ikke være beliggende inne i den replikerte region i plasmidet.

Plasmidene i henhold til oppfinnelsen er miniplasmider, d.v.s. at de er betydelig mindre enn sine opphavsplasmider av villtype. Generelt har de en størrelse i området 2,5-15,0 x 10

6 6 dalton, ofte 2,5-10,0 x 10 dalton, vanligvis 4,0-12,5 x 10

s

dalton, spesielt 4,0-5,0 x 10 dalton.

Den ukontrollerte replikeringsoppførsel hos de kjente "runaway"-plasmider synes å være avhengig av den spesifikke bakteriestamme som den transformeres til, det kulturmedium som bakteriene dyrkes i og den DNA som innsettes. Denne avhengighet skyldes sannsynligvis det faktum at "runaway"-replikerings-oppførselen til de kjente plasmider delvis forårsakes av utbyttingen av et enkelt nukleotid i coB-promoteren som forårsaker en svak økning i transkripsjonsraten som kan påvirkes ved miljø-endringer hva angår den bakterieart og -stamme som er involvert og/eller dyrkningsmediet så vel som av fremmed DNA innsatt i plasmidene. Plasmidene i henhold til oppfinnelsen synes ikke å være blitt begrenset, da den sterke fremmede promoter, når den er aktivert/derepressert, øker transkripsjonsraten i en slik grad at slike endringer er uten betydning. Følgelig kan disse plasmider bli transformert til et stort utvalg av stammer, og de er også mer pålitelige å håndtere enn de kjente "runaway"-plasmider.

Replikeringssystemet til flere forskjellige mikrobielle plasmider er vist å være likt på mange måter. F.eks. krever alle kjente plasmider transkripsjon hvis replikering skal finne sted. Ved nyttiggjørelse av prinsippet i henhold til oppfinnelsen er det mulig å overføre den ukontrollerte replikeringsfenotyp til andre plasmider slik at plasmider som allerede er i bruk som kloningsvektorer og er kjent for å ha god virkning i en ønsket mikroorganisme kan anta "runaway"-oppførsel. Ved derfor å innsette en regulerbar promoter, f.eks. XP , ved en riktig posisjon i slike plasmider på en slik måte at transkripsjon av denne promoter regulerer replikering, vil ukontrollert replikering inntreffe under betingelser som sikrer øket transkripsjon fra promoteren.

Replikeringskontrollsystemet til plasmider av Rl-type

Det grunnleggende replikon

Inntil nylig var replikeringskontrollsystemer til plasmider av Rl-type ikke kjent. Det er nå funnet at den genetiske informasjon som trenges for replikering av plasmid RI og kontroll av replikeringen utføres i en region som er 2500 basepar lang og består av tre Pst1-fragmenter som er lokalisert inne i resistens-overføringsfaktoren (Molin et al., J. Bact. 138, 1979, 70-79).

Denne region er definert som det grunnleggende replikon og inneholder fire viktige elementer, tre gener (copA, copB og repA) og replikeringsopprinnelsen (Molin et al., Microbiology, 1981, 408-11) . Et fysikalsk, genetisk og funksjonelt kart over det grunnleggende replikon er vist i fig. 1. Genet repA koder for en funksjon som positivt trenges for replikering. Genproduktet (i henhold til DNA-sekvensen) er et protein bestående av 278 aminosyrer og har molekylvekt ca. 33.000 dalton (Rosen et al., Mol. Gen. Genet. 179, 1980, 527-37). Dette protein er ikke blitt utvetydig identifisert, men evnen til å danne protein fra repA-genet er tydelig vist ved anvendelse av translasjonene genfusjoner med lacZ-genet (Light & Molin, Mol. Gen. Genet. 184, 1981, 56-61). Den biokjemiske funksjon hos RepA-proteinet er ikke blitt fullstendig utforsket ennå, men RepA-proteinet menes å være en replikeringsinitieringsfaktor.

Genet copA koder for et lite (80-90 nukleotider langt) ustabilt RNA-molekyl med høy grad av sekundær struktur (d.v.s. at det danner hårnålsløyfestruktur) (Stougaard et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 78, 1981, 6008-6012). CopA-RNA er en inhibitor for replikering; mutasjoner som påvirker nukleotidsekvensen i CopA-RNA kan føre til øket kopitall ( cop-mutanter). DNA-sekvensanalyse av copA-mutanter viser at alle mutasjoner er forbausende klasedannet i et sløyfestrukturområde innenfor 5 baser. Disse mutasjoner resulterer i et drastisk redusert eller totalt tap av inhibitor-aktivitet mot plasmidet av villtype. Derfor kan det konkluderes med at spesifisiteten til inhibitoren ligger i sløyfestrukturen. Det er også forbausende at i alle CopA-mutanter hvis nukleotidsek-vens er kjent, er et cytosin i CopA-RNA blitt erstattet med et urasil (eller, i et tilfelle, med et adenin). Dette antyder sterkt at CopA-RNA virker ved nukleidsyrer/nukleinsyrer-veksel-virkning. Denne konklusjon styrkes ytterligere av det faktum at selv de copA-mutanter som har mistet all CopA-aktivitet overfor plasmidet av villtype bevarer en viss CopA-aktivitet overfor seg selv. Videre har copA-RNA av villtype oftest redusert inhiberende effekt overfor coA-mutantplasmider. Derfor blir en copA-mutant ikke bare endret i inhibitoren, men også i målet, copT; en eneste basesubstitusjon fører således til hva som fenotypisk er en dobbeltmutant.

copB-genet koder for et basisprotein med 86 aminosyrer med molekylvekt 11.000 dalton. Dette protein dannes i vesentlige mengder. Fjerning av copB-genet med sin promoter fører til en 8 gangers økning i kopitall; derfor konkluderes det med at copB-proteinet tjener som en replikeringsinhibitor, d.v.s. som et negativt virkende kontrollelement i reguleringen av replikering av plasmid RI (Molin et al., Mol. Gen. Genet. 181, 1981, 123-30).

En dobbelt mutant ( copAcopB) er betingelsesløst letal overfor vertsmikroorganismen på grunn av den såkalte "runaway"-replikering. Derfor virker de to kontrollgenprodukter synergistisk.

Transkripsjonen aktivitet i det grunnleggende replikon

Det er tre transkripsjonsinitieringsseter i det grunnleggende replikon, copB-promoteren, repA-promoteren (Light & Molin, Mol. Gen. Genet. 184, 1981, 56-61) og promoteren for copA-qenet (Stougaard et al., op. eit.). Sistnevnte transkriberer vekk fra opprinnelsesregionen, mens de to førstnevnte transkriberer mot opprinnelsesregionen. Følgelig transkriberes begge strenger i copA-regionen. ( CopB-transkriptet fortsetter forbi copB-genet, og dette transkript og det transkript som starter det repA-promoteren transkriberer begge repA-qenet.)

Fjerninger av copB-<g>enet oppbygget ved restriksjon med Bg_ÆII resulterer i 8-10 ganger øket kopitall av plasmid RI. Dette er overraskende, siden copB-<g>én-promoteren og den proksimale del av det copB-strukturelle gen fjernes, hvilket resulterer i 1) tap av copB-aktivitet og derepresjon av repA-promoteren, og 2) tap av bidrag fra copB-promoteren til total repA-ekspresjon slik at den derepresserte repA-promoter effektivt tar over total repA-transkripsjon fra copB-promoteren. Den totale effekt bør bare være en to ganger økning i transkripsjonsraten av repA-genet da repA-promoteren har en styrke som er to ganger øket over verdien for copB-promoteren. Dette tilsynelatende paradoks forklares av aktiviteten til copA-genet. ( CopA-RNA avsluttes i en normal termineringsstruktur med en stamme som ender i en serie av U'er CopA-RNA-kontroll av dannelsen av RepA-protein anhenger av en slik riktig terminering.) Hvis transkripsjon av den motsatte streng er sterk (konvergent transkripsjon), avtar effektiviteten av termineringen. Øket transkripsjon fra repA-promoteren resulterer i en forlengelse av CopA-transkriptet til ca. 150-2 00 nukleotider. Det forlengede CopA-transkript virker ikke som replikeringsinhibitor, d.v.s. at det er vesentlig inaktivert, hvilket fører til en øket mengde av RepA-protein og til sist til et øket plasmidkopitall (Stoutgaard et al., the EMBO Journal 1, 1982, 323-328).

Kontroll av replikeringen

Produktene fra to gener, copA og copB. kontrollerer negativt replikering av plasmid RI, d.v.s. at de virker som replikeringsinhibitorer. Via oppbygging og analyse av repA- lac-fusi oner kunne det vises at de to cop-genprodukter virker ved negativt å kontrol-lere ekspresjonen av repA-genet (Light & Molin, Mol. Gen. Genet. 184, 1981, 56-61). Derfor synes plasmid Rl-replikering å være kontrollert av reguleringen av dannelsen av et protein som positivt trenges for, antagelig, initieringen av replikering av plasmidet.

Ved hjelp av lac-genfusjoner ble det også vist at copA- og copB-produkter har separate mål. Målet for CopB-proteinet er repA-promoteren, hvor det virker ved å inhibere initiering av transkripsjon. Imidlertid er CopB-proteinet uegnet til å inter-ferere med transkripsjon initiert oppstrøms for repA-promoteren. CopA-RNA påvirker ikke transkripsjonen, men virker ved et post-transkripsjonalt nivå, d.v.s. ved å inhibere translatering av RepA-mRNA.

Replikering av 11 runaway11-mutantene

Replikeringssystemet til plasmidene som er beskrevet i den publiserte europeiske patentsøknad nr. 78.101877.5 er i det vesentlige det samme som beskrevet ovenfor med hensyn til plasmidene av villtype RI. Nylig utført forskning utført av oss har nå delvis fastslått årsaken til eksistensen av temperaturavhengige plasmidmutanter med "runaway"-replikeringsoppførsel. Som forklart ovenfor, kan øket transkripsjon mot reA-<g>enet føre til inaktivering av CopA-RNA-molekylet. I 11 runaway"-mutant-plasmidene som er beskrevet i den ovenfor omtalte publikasjon, muteres copB-promoteren ved utbytting med et enkelt nukleotid i en sekvens, som vist:

a) Vill-type-plasmid: 5'- TTCTCAAGTCGCT...-3'

b) "Runaway"-mutant: 5'- TTCTCAAGTTGCT...-3'

Det understrekede angir nukleotidutbyttingen. Den avmerkede

region er RNA-polymerasebindingssetet.

Denne mutasjon viste seg å forårsake øket transkripsjon fra copB-promoteren, spesielt ved høyere temperaturer.

Replikering av plasmider som bærer en regulerbar promoter

Ved oppbygging av plasmidene i henhold til oppfinnelsen er vår nylig ervervede kjennskap til replikeringssystemet hos plasmidene av villtype RI blitt benyttet. Replikeringen av plasmidene i henhold til oppfinnelsen gjøres imidlertid ikke for å stole på mutasjoner i plasmidet som tilfellet er med de "runaway"-plasmider som er beskrevet i den publiserte europeiske patent-søknad nr. 78.101877.5. I stedet er en fremmed promoter blitt innsatt slik at transkripsjon av replikeringsregionen minst delvis kontrolleres fra denne promoter. Promoteren kan være regulerbar ved justeringer i de betingelser under hvilke vertsmikroorganismene dyrkes, og reguleringen av promoteraktiviteten kan bevirkes ved forskjellige hjelpemidler, f.eks. ved å endre dyrkningstemperaturen eller sammensetningen av vekstmediet.

Når den regulerbare promoter er en som er valgt fra en gruppe av temperaturavhengige promotere, er den fortrinnsvis en promoter som stammer fra bakteriofag X, f.eks. XP K eller XP Li , spesielt XP^R. I fag X kontrolleres P -promoteren av cl-repressoren som, i overensstemmelse med oppfinnelsens prinsipper, stammer fra fag X sammen med XP og innsettes i et plasmid i form av et Bqlll-fragment (se vedlagte plasmidkart, fig. 4-11). Villtype-cl-repressoren er ikke i seg selv temperaturømfintlig, så i den hensikt å gjøre replikeringssystemet regulerbart ved hjelp av justeringer i dyrkningstemperaturen er den spesifikke cl-repressor som anvendes (kfr. de følgende eksempler) temperaturfølsom, kodet av mutanten allele clg57 (Sussman & Jacob, Compt. Rend. Acad. Sei. 254, 1962, 1517). Repressoren er aktiv, d.v.s. at den represserer XP -promoteren, ved lave temperaturer, f.eks. ved en temperatur på ca. 30°C, mens den ved høyere temperaturer, f.eks. temperaturer over ca. 39°C, denatureres hvilket bevirker inaktivering av repressorfunksjonen og derepresjon av ^PR- Da den innsatte' promoter er svært sterk, resulterer dette i drastisk øket transkripsjon mot repA som, på sin side, fører til ukontrollert plasmidreplikering.

Alternativt kan reguleringen av promoteren bevirkes med kjemiske hjelpemidler, d.v.s. justering av sammensetningen av mediet som vertsmikroorganismene dyrkes i, enten ved tilsetning av en kjemikalie som induserer promoteren, f.eks. ved å bevirke inaktivering av den repressor-kontrollerende promoteraktivitet og følgelig derepresjon av promoteren eller ved å sikre dannelse av en promoter-induserende metabolitt som fører til aktivering av promoteren. Et spesifikt eksempel på en kjemisk induserbar promoter er deo-promoteren fra E. coli som er utsatt for negativ kontroll av to kromosomale repressorproteiner, produktene av deoR-og cytR-qenene. Deo-promoteren kan bli derepressert ved tilsetning av cytidin til vekstmediet, da cytidin virker ved affinitet til repressoren hvilket bevirker konformasjonell endring av denne slik at den opphører å virke som repressor. I tillegg kan positiv kontroll utøves på ekspresjonen fra deo-promoteren via effekten av katabolitt-represjon. Aktivering av crp (katabolitt-repressor-protein)-proteinet ved cyklisk AMP (cAMP) resulterer i stimulering av deo-promoterens aktivitet; høye cellenivåer av cAMP er kjent å henge sammen med lave nivåer av glukose i, eller fravær av glukose fra, vekstmediet, som kan oppnås ved å tilsette bare en begrenset mengde glukose til mediet, f.eks. en mengde på ca. 0,01%, sammen med en annen karbonkilde, f.eks. glycerol eller suksinat. Når glukosen forbrukes av cellen, vil den resulterende økning i det intracellulære nivå av cAMP aktivere deo-promoteren hvilket fører til en øket replikeringsrate for det plasmid som bærer promoteren. Hvis derfor deo-promoteren innsettes oppstrøms for copB-genet i et plasmid Rl-derivat, fører induksjon av promoteren til øket eller fullstendig ukontrollert replikering. Den ukontrollerte replikeringsoppførsel kan reverseres ved å tilsette glukose til vekstmediet slik at kopitallet for plasmidet langsomt avtar til pre-induksjonsnivå. Et annet eksempel på en kjemisk regulerbar promoter er den lac-romoter som induseres ved nærvær av laktose i næringsmediet hvilket fører til øket eller ukontrollert replikering. I dette tilfelle kan også prosessen reverseres ved dosering av den mengde laktose som tilsettes mediet slik at det til slutt konsumeres av cellene.

Innsettelse av den riktige posisjon og orientering av et DNA-fragment som bærer en regulerbar promoter istedenfor en del av ett nativt replikeringsregulerende gen, f.eks. istedenfor det Bglll-fragment som dekker en del av copB-genet i plasmid RI, resulterer i et plasmid-derivat hvis replikeringsrate er minst delvis kontrollert av den innsatte promoter (et plasmid av type A).

Innsettelse i den riktige orientering av et DNA-fragment som bærer en regulerbar promoter umiddelbart oppstrøms for det native replikeringsregulerende gen, når det gjelder plasmid Rl-derivater copB-genet, resulterer i et plasmid med svakt annerledes replikeringsegenskaper (et plasmid av type B).

Som nevnt ovenfor, går plasmider av type B som mangler par-regionen tapt med en frekvens på ca. 1% pr. generasjon. Uten seleksjon for nærvær av plasmidene i en kultur går plasmidet til slutt tapt fra celler som dyrkes ved ca. 30°C. I den hensikt å stabilisere plasmidet er det mulig å innsette et DNA-fragment som bærer en par-region fra f.eks. et plasmid av villtype RI i et plasmid av type B som fører til komplett stabilitet (intet tap) av plasmidet fra celler som dyrkes under lignende betingelser. Plasmidstabilitet kan bestemmes ved innledningsvis å dyrke celler som inneholder plasmider av type B i hvilke lac-gener så vel som par-regionen er blitt innsatt og, som kontroll, celler som inneholder plasmider av type B som bærer lac-genene, men ikke par-regionen, selektivt på plater som inneholder et antibiotikum (til hvilket plasmidene formidler resistens) for å sikre nærvær av begge slag plasmid i startkoloniene. Prøver av begge kolonier strykes så ut på plater som ikke inneholder noe antibiotikum slik at cellene vokser uten selektering i et antall generasjoner (cellefordoblinger), f.eks. 25 generasjoner. Endelig strykes celler fra begge de resulterende kolonier ut på McConkey-laktose-indikatorplater hvor de celler som opprinnelig inneholder plasmider som bærer par-regionen danner røde kolonier, hvilket viser at plasmidene er blitt bevart, mens kontrollcellene som opprinnelig inneholdt plasmider uten par-regionen danner både røde og farveløse kolonier, hvilket betyr at under den selekteringsfrie periode er plasmidene gått tapt fra noen av cellene. Det er således vist at plasmider i hvilke par-regionen er blitt innsatt er blitt fullstendig stabile (kfr. eksempel 11). Denne stabiliserende effekt er spesielt betydningsfull hvis et innsatt DNA-fragment forårsaker en reduksjon av vekstraten til de plasmidbærende celler sammenlignet med plasmidfrie celler.

Endelig resulterer innsettelse av et DNA-fragment som bærer det native replikeringsregulerende gen, f.eks. copB-genet i plasmid RI, inn i et punkt utenfor replikeringsregionen til et plasmid av type A i et plasmid med spesielle replikeringsegenskaper (et plasmid av type C).

Ønskeligheten av plasmidstabilitet som er beskrevet ovenfor med hensyn til plasmider av type B er enda mer uttalt når det gjelder plasmider av type C, siden disse, som nevnt ovenfor, har et enda lavere kopitall ved den lave temperatur og derfor går tapt med en høyere frekvens enn plasmider av type B hvis de mangler par-regionen. Plasmidene av type C kan likeledes bli stabilisert ved innsettelse av par-regionen i plasmidene i tilfelle av plasmider hvor den ikke allerede er til stede.

I henhold til et spesielt aspekt ved oppfinnelsen bærer plasmidet, i tillegg til den første regulerbare promoter, en annen promoter som er beliggende utenfor replikeringsregionen, og denne promoter regulerer ekspresjonen av et innsatt fremmed strukturelt gen som f.eks. koder for et ønsket polypeptid. Denne ekstra promoter kan f.eks. være den cl-promoter som er beliggende på det fragment som i tillegg bærer XP -promoteren og cl-genet, idet denne cl-promoter kontrolleres av cl-gen-produktet og transkriberer i den motsatte retning av XP . Nedstrøms for cl-promoteren er det mulig å innsette et struturelt gen hvis ekspresjon kan reguleres av denne promoter. Som eksempel er lac-gener (kjent som lac-operonet) som mangler lac-promoteren blitt innsatt nedstrøms for cl-genet og den genproduktforstørrelse som ble oppnådd antydet at transkripsjon av lac-genene i det minste delvis ble kontrollert av cl-promoteren (kfr. eks. 8). Det ble således vist at det er mulig å anvende plasmidene i henhold til oppfinnelsen som kloningsvektorer for innsettelse av et fremmed gen. cl-promoteren har den fordel at den er regulerbar av cl-repressoren også, slik at forstørrelse av genproduktet finner sted samtidig med forøkelse av plasmid-DNA.

Den annen promoter kan også være en X-promoter, f. eks. ^PL/ eller den kan være en recA-promoter. Hvis den annen promoter er XP , kan den innsettes i plasmidet som et BamHI - BglII-fragment fra fag X, og således produsere et passende kloningspunkt (BamHI) for innsettelse av DNA-fragmenter utviklet av forskjellige restriksjonsenzymer, f. eks. BamHI, B<g>lll, Sau3A of Bc/I. XPT Li kan også innsettes på et passende DNA-fragment fra et plasmid som bærer promoteren. XP Li er fordelaktig som en ekstra promoter fordi den også kontrolleres av den temperaturfølsomme cl-repressor slik at forøkelsesbetingelsene er de samme.

Hvis på den annen side promoteren er recA, kan den innsettes i plasmidet i henhold til oppfinnelsen som et BamHI-fragment fra f.eks. pBEU14 (Uhlin og Clark, J. Bact. 148, 1981, 386-90). Denne promoter funksjonerer på forskjellige måter avhengig av den mikrobielle stamme som det recA-promoter-bærende plasmid er blitt transformert til. I en recA-stamme kontrolleres recA av lexA-repressoren, som er beliggende på kromosomet til mikroorganismen. Ved f.eks. en temperaturinduksjon av ukontrollert replikering øker kopitallet til plasmidet og derfor tallet på recA-promotere gradvis. Da lexA-repressoren bare produseres i små mengder og funksjonerer ved å binde tett til recA-promoter-regionen, vil den tilgjengelige mengde av lexA-repressor gradvis bli titrert når kopitallet øker. Således er det en gradvis derepresjon av recA, og når plasmidkopitallet blir høyere, vil transkripsjonen fra recA øke tilsvarende.

Plasmidene i henhold til oppfinnelsen som klonings- og produksj onsvektorer

I sin kapasitet som klonings- og produksjonsvektorer har plasmidene i henhold til oppfinnelsen en rekke karakteristiske egenskaper: 1) Plasmidene er små, med molekylvekt ca. 4,0-12,5 x 10 dalton. Den lille størrelse forenkler håndteringen og forbedrer

transformasjonseffektiviteten.

2) Plasmidene har en rekke unike seter for restriksjonsendonukleaser. Betegnelsen "unik" skal bety at plasmidet, for en spesifikk restriksjons-endonuklease, har ett og bare ett, sete som kan spaltes av enzymet.

Som allerede nevnt, er restriksjonsseter som er beliggende i replikeringsregionen ikke tillatelige som kloningsseter. I de plasmider som er beskrevet i de følgende eksempler er således restriksjonssetene Sali og Pstl ikke egnet som kloningsseter, da de er beliggende i replikonet til plasmidet, mens restriksjonssetene EcoRI og BamHI ikke er beliggende innen denne kritiske region og således utgjør nyttige seter for innføring av fremmed DNA. Hvis et egnet restriksjonssete ikke kan finnes på selve plasmidet, kan det konstrueres ved innsettelse av et lite DNA-fragment (kjent som en kobler) som inneholder et slikt sete, inn i plasmidet som beskrevet i eksempel 4.

I den hensikt å sikre ekspresjonen av det innsatte strukturelle gen er det imidlertid også nødvendig å ha et passene translasjonelt startsignal (ribosomalt bindingssete) beliggende oppstrøms for selve det strukturelle gen, men nedstrøms for den annen promoter.

Én måte å sikre nærværet av det ribosomale bindingssete på er å innsette et utvalg av DNA-fragmenter (f.eks. som koblere), som kan fremstilles syntetisk, idet hvert bærer translasjon-startsignalet for et annet strukturelt gen. Alternativt kan et DNA-fragment som bærer et gen som allerede er kjent for å bli uttrykt i mikroorganismer, bli innsatt i "runaway"-kloningsvektoren fullt og helt, og således sikre nærvær av

det korrekte translasjonstartsignal.

3) Selv om det, som nevnt ovenfor, er en fordel å ha en så liten kloningsvektor som mulig, er det for mange formål praktisk at kloningsvektoren bærer gener for ekspresjon av en såkalt markør som er nyttig for identifikasjon og/eller seleksjon av celler som bærer plasmidet. Den mest anvendelige markør er antibiotisk resistens, f.eks. ampicillinresistens, da dette tillater, etter behandling for transformering av et rekombinant-plasmid til en mikrobiell vert, en lett mot-utvelgelse av mikroorganismer som ikke har mottatt rekombinant-plasmidet. En annen markør som er til stede i alle de plasmider som er beskrevet i de følgende eksempler er X-immunitet, som utkodes av cl-genet. Én ytterligere nyttig egenskap hos plasmider i henhold til oppfinnelsen kan være nærvær av et gen som formidler en selekterbar fenotyp i hvilken et unikt restriksjonssete er beliggende. Innsettelse av et DNA-fragment på dette sete resulterer i innsettelses-inaktivering hos genet. Et eksempel på dette er beskrevet i eksempel 9 med hensyn til det gen som formidler Lac+-feno-typen, og eksempel 12 med hensyn til det gen som utkoder kloramfenikol-resistens. Når det er ønskelig å innføre en markør, f.eks. antibiotisk resistens, i et plasmid i henhold til oppfinnelsen som skal anvendes som kloningsvektor, kan dette gjøres ved transposisjon eller ved innsettelse av et fremmed DNA-fragment på en i og for seg kjent måte. Et eksempel på en slik transposisjon er vist i eksempel 4.

Dyrkningsmetoder

En fremgangsmåte for fremstilling av et genprodukt av plasmid-DNA omfatter å dyrke mikroorganismer som bærer et plasmid i hvilket en regulerbar promoter er blitt innført på en slik måte at transkripsjon regulerer replikering, spesielt på en slik måte at øket transkripsjon fra denne promoter fører til et vesentlig øket eller ukontrollert plasmidkopitall, idet fremgangsmåten omfatter minst én periode med dyrkning under betingelser som sikrer øket transkripsjon fra den regulerbare promoter hvilket resulterer i et vesentlig øket eller ukontrollert plasmidkopitall, og å høste fra den mikrobielle kultur et genprodukt av plasmidet. Dyrkningen er i og for seg passende utført med konvensjonelle teknikker, inklusive konvensjonelle næringsmedier som er kjent å være optimale for de mikrobielle arter som er på tale. Innhøstin-gen av genproduktet utføres også i overensstemmelse med velkjente metoder som er tilpasset identiteten og egenskapene til det spesielle genprodukt som fremstilles, egenskapene til vertsmikroorganismen o.s.v. Etter dyrkning av vertsmikroorganismen som plasmidet i henhold til oppfinnelsen er blitt transformert til under betingelser som resulterer i et konstant, lavt plasmidkopitall under kimsettings- og multipliseringsstadiene inntil det ønskede antall celler er blitt oppnådd, dyrkes vertsmikroorganismen under betingelser som fører til et vesentlig antall øket eller ukontrollert plasmidkopitall.

Således kan dyrkningen innledningsvis utføres under betingelser hvor transkripsjon fra promoteren ikke i særlig grad influerer på kopitallet til plasmidet, hvoretter en substans som induserer promoteraktivitet settes til dyrkningsmediet i en mengde som fører til vesentlig øket eller ukontrollert replikering. Om ønsket, kan disse dyrkningsbetingelsene reverseres etter et tidsrom som er tilstrekkelig til å oppnå vesentlig amplifikasjon av plasmidet, men tilstrekkelig kort til å unngå vesentlig forringelse av den mikrobielle kultur. Substansen fjernes fra dyrknings-mediet, noe som fører til en langsom nedgang i plasmidkopitall inntil det til slutt når pre-induksjonsnivået. I denne sammenheng trenger betegnelsen "fjernes" ikke å innebære fullstendig fravær av den aktuelle substans fra dyrkningsmediet, men bare en reduksjon i konsentrasjonen av substansen i en utstrekning hvor den ikke lenger har noen effekt.

I en alternativ metode, hvor det anvendes en promoter som snarere inhiberes enn induseres, av en viss substans, kan den mikrobielle kultur innledningsvis bli dyrket i nærvær av den substans som inhiberer aktiviteten til den spesielle promoter som anvendes, hvoretter konsentrasjonen av substansen reduseres, f.eks. ved å fortynne dyrkningsmediet eller ved gradvis å bli oppbrukt av cellene, i en utstrekning som fører til aktivering av promoteren og således bevirker vesentlig øket eller ukontrollert plasmidkopitall. Om ønsket, kan dyrkningsbetingelsene bli reversert etter et tidsrom som er tilstrekkelig til å oppnå vesentlig forøkelse av plasmidet, men tilstrekkelig kort til å unngå enhver vesentlig forringelse av den mikrobielle kultur, ved å tilsette den substans som inhiberer promoteraktivitet i en mengde som fører til langsom nedgang i plasmidkopitall inntil det når pre-induksjonsnivået. De betingelser under hvilke mikroorganismen dyrkes kan også omfatte minst en dyrkningsperiode ved eller nær en temperatur ved hvilken plasmidkopitallet blir vesentlig øket eller ukontrollert.

Hvis den regulerbare promoter er temperaturavhengig eller reguleres av en temperaturømfintlig faktor, foretrekkes det at utbredelse av den mikroorganisme som blir transformert med et plasmid i henhold til oppfinnelsen opp til en produksjons-størrelseskultur utføres ved eller nær den temperatur ved hvilken plasmidet viser et konstant, lavt kopitall i den hensikt å unngå enhver inhibering av mikrobiell vekst ved en økende plasmid- og genproduktkonsentrasjon. Deretter kan temperaturen endres til en temperatur ved hvilken plasmidet viser et vesentlig øket eller ukontrollert kopitall. Etter en passende produksjonsperiode, ofte inntil veksten av mikroorganismen blir inhibert av produksjonen av plasmid-DNA og/eller genprodukter fra plasmidet, utføres inn-høsting av genproduktet. Avhengig av de spesielle betingelser kan det være ønskelig å utføre produksjonsdyrkningen kontinuerlig ved en temperatur som bare nærmer seg den temperatur ved hvilken plasmidkopitallet vesentlig økes eller blir ukontrollert slik at det tillates overlevelse og fortsatt vekst av vertsmikroorganismen sammenhengende med dannelsen av økte mengder av et genprodukt av plasmidet (som da kan høstes kontinuerlig eller avbrutt fra kulturen på en i og for seg kjent måte).

Alternativt kan mikroorganismen formeres til en produksjons-størrelsekultur ved den temperatur ved hvilken plasmidkopitallet er konstant, hvoretter temperaturen endres til en temperatur ved eller nær den temperatur ved hvilken plasmidkopitallet blir vesentlig øket eller ukontrollert, og denne temperatur opprett-holdes i et tidsrom som er tilstrekkelig til å oppnå vesentlig forøkelse av plasmidet, men tilstrekkelig kort til å unngå enhver vesentlig forringelse av den mikrobielle kultur, hvoretter temperaturen én gang til endres til en temperatur som sikrer et lavt, konstant plasmidkopitall, og produksjonsdyrkningen fort-settes ved denne sistnevnte temperatur, hvilket forårsaker langsom nedgang i plasmidkopitallet inntil det når sitt begynnelsesnivå. Denne dyrkningsmetode er spesielt viktig når det fremmede gen som er innsatt i plasmidet stammer fra en organisme som ikke er leve-dyktig ved temperaturer over ca. 30"C slik at genprodukter fra et slikt gen kan bli denaturert ved høyere temperaturer. Videre er utbyttet av genprodukt vanligvis høyere når denne dyrkningsmetode anvendes (kfr. eks. 16; se også Uhlin et al., Gene 6, 1979, 91-106, tabell II).

Den temperatur ved hvilken plasmidkopitallet blir vesentlig øket eller ukontrollert kan være høyere enn den temperatur ved hvilken plasmidet har et konstant, lavt kopitall. Denne høyere temperatur kan f.eks. være en temperatur i området 36-42°C.

Beskrivelse av tegningen

Det henvises til tegningen hvor:

Fig. 1 er et skjematisk riss av replikeringsregionen til villtype-plasmid RI, Fig. 2 er en nøkkel til de symboler som anvendes i de følgende figurer, og Fig. 3-14 viser restriksjonskart for de plasmider som er beskrevet i eksemplene.

I fig. 1 er det vist et skjematisk riss av det grunnleggende replikon i plasmid RI, hvor de skraverte områder betegner de translaterte regioner, de blanke områder betegner transkriptene og de stiplede linjer mulige transkripter. Inne i sirkelen er det forstørrede riss av hårnålsløyfene ment å illustrere den høye grad av sekundær struktur av CopA-RNA. Ori står for opprinnelse for replikering. De horisontalt anbragte piler betegner transkrip-sjonens retning.

I fig. 2 er en nøkkel til de symboler som er anvendt i de følgende figurer vist, hvor A betegner DNA fra plasmider av Rl-type; B betegner DNA som stammer fra bakteriofagen \ (ED\4);

C betegner DNA fra Tn3-transposonet (fra ED\Tn3); D betegner DNA fra plasmid pBR322; E betegner DNA fra plasmid pMC871; F betegner DNA fra plasmid pVH1424; G betegner DNA fra plasmid pSKS104;

H betegner strukturelle gener og viktige seter; I betegner en promoter med en indikasjon på retningen av transkripsjon; og J betegner en skala med dimensjonene til plasmidene. Det blanke område betegner DNA fra plasmid pBEU14.

I fig. 3-14 er lineære restriksjonskart for de plasmider som er beskrevet i eksemplene vist, hvor genotypene til plasmidene av Rl-type som er oppført er indikert over den horisontale linje. Således representerer coB et gen som koder for et polypeptid som represserer transkripsjon fra repA-promoteren mellom copB- og copA-genene; copA representerer et gen som koder for et RNA-molekyl som inhiberer translatering av RepA-mRNA; repA representerer et gen som koder for et protein som kreves for plasmid Rl-replikering; ori betegner den vegetative opprinnelse for replikering; aphA representerer et gen som koder for resistens overfor kanamycin; bla representerer et gen som koder for resistens overfor ampicillin; lacA, lacY og lacZ representerer det innsatte lac-operon, for hvilket lacA koder for transacetylase, lacY koder for permease og lacZ koder for /3-galaktosidase; clg^ representerer et gen som koder for temperaturfølsom repressor i X-promoteren; tnpR og tnA representerer gener som koder for Tn3-transposisjon-funksjoner; par representerer den region som er ansvarlig for plasmidfordeling; recA representerer et gen som koder for et rekombinasjonsprotein; og PrecA representerer recA-promoteren. Under den horisontale linje er setene for restriksjonsenzymer vist, hvor P betegner Pstl; B2 betegner Bq- 611; S1 betegner Sali; E betegner EcoRI; H3 betegner HindiII; B^ betegner BamHI;

S betegner Smal; B2B1 betegner en fusjon mellom et Bqlll-sete og et BamHI-sete; og C betegner Clal. I fig. 11 er det viste plasmid trukket opp i samme skala som plasmidene i de andre figurer, og innsettelsen i parentes representerer de innsatte lac-gener.

Materialer og metoder

Stammen av Escherichia coli K-12 som ble anvendt var CSH50 (A pro- lac, rpsL; kfr. J. Miller: Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York,

1972). Flere plasmider (tabell 1) og bakteriofager (tabell 2) ble anvendt.

Forsøksteknikkene som ble benyttet var standardteknikker anvendt på områdene mikrobiell genetikk (J. Miller: Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor, New York, 1972) og genetisk manipulasjon (Davis, Botstein og Roth: A Manual for Genetic Engineering; Advanced Bacterial Genetics, Cold Spring Harbor, New York, 1980).

Alle celler ble dyrket i LB-medium (Bertani, J. Bact. 62, 1951, 293) eller i A+B minimal-medium (Clark og Maaløe, J. Mol. Biol. 23, 1967, 99), og de anvendte plater var LA-plater som inneholdt LB-medium og 1,5% agar. Fremstilling og analyse av plasmid-DNA ble foretatt ved anvendelse av farvestoff-oppdrift-densitetsgradientsentrifugering ved den metode som er beskrevet av Stoutgaard & Molin, Anal. Biochem. 118, 1981, 191. Merking av DNA og fremstilling av lysater for bestemmelsen av plasmidinnhold ble foretatt i henhold til Molin et al., J. Bact. 138, 1979, 70. Det relative innhold av plasmid-DNA ble målt som mengder av merket tymidin som var til stede i plasmidbåndet i forhold til det som var i kromosomalbåndet i gradientene.

De restriksjonsendonukleaser som ble anvendt i eksemplene, ble anvendt i overensstemmelse med forskrifter fra produsenten.

De partielle restriksjoner ble foretatt med en 10 ganger for-tynning av enzymene.

I tillegg ble følgende utsorteringsmetoder anvendt:

1. Utsortering etter X-immunitet (immX+)

I alle de beskrevne eksempler er clg57-mutanten allele anvendt. Plasmider som bærer dette gen gjør verten E. coli celle-resistent overfor infeksjon med lytiske X-fager ved 30°C. For å utvelge resistente celler tilsettes mer enn 10 Q Xb2-fagpartikler til plater før bakteriene spres ut. Overlevende kolonier testes videre med hensyn på sitt plasmidinnhold.

2. Utsortering av copB+

Genetiske fusjoner mellom repA-promoteren og lac-operonet fra hvilket lac-promoteren er fjernet, bygges opp og innsettes i et pl5-plasmid (pGA46). Et resulterende hybridplasmid, pJL217, er ansvarlig for en Lac+-fenotype når det huses av en A lac-vert-E.coli-stamme.

Lac+fenotypen påvises lett på McConkey-laktose-indikator-plater (røde kolonier). Nærvær av et copB+-gen i celler som huser pJL217 resulterer i en Lac -fenotyp som viser seg som hvite kolonier på indikatorplatene. Således registreres lett cop_B+-hybrider som Lac -kolonier når plasmid-DNA transformeres til E.coli A- lac-celler som huser plasmid pJL217.

Opphavsmidler

Plasmid pKN1562 er et derivat av plasmid RI, i det alt vesentlige oppbygget som beskrevet i Molin et al.: "Clustering of Genes Involved in Replication, Copy Number Control, Incompatibility, and Stable Maintenance of the Resistance Plasmid Rldrd-19", J. Bact. 138, 1979, s. 70-79, med unntagelse av noen få modifikasjoner som ble tilføyd ved senere forskning. pKN1562 har en molekylvekt på 6,9 x 10 dalton og følgende genotyp: copA+. copB+, repA+. aphA+, A par (se fig. 3). Det bærer resistens overfor kanamycin. Plasmidet er i besittelse av replikerings-egenskapene til villtype-plasmidet, har et kopitall på 3-5 pr. hurtigvoksende celle og går tapt med en frekvens på 1% pr. generasjon på grunn av mangelen på par-genet (genet for fordeling).

Ved å begrense pKN1562 med Bqlll for å fjerne en del av copB-genet og ligere de såkalte "sticky ends", oppbygges et annet plasmid, pJL20. Molekylvekten til dette plasmid er 6,7 x 10/r dalton, og dets genotyp er som følger: copA+, A coB, repA+.

A par. Plasmidet har et kopitall på 25-40 pr. hurtigvoksende celle, og det er intet tap av plasmidet. Dette plasmid formidler også resistens overfor kanamycin.

Plasmidbetegnelsene

Det skal bemerkes at de plasmider som er betegnet pJEL... i eksemplene og tegningen for basis-søknaden er "omdøpt" til pOU... i foreliggende beskrivelse.

Eksempel 1

Oppbygging og karakterisering av pOU51

DNA fra plasmid pJL20 og fag EDX4 ble fremstilt i henhold til standardmetoder. Plasmid og fag-DNA ble blandet ved en slutt-konsentrasjon på 20 jtig/ml hver og i et sluttvolum av 100 /zl, fordøyd med Bqlll i 30 minutter, varmeaktivert ved 70°C i 10 minutter og ligert med T4 DNA-ligase natten over ved 15°C. Alikvoter av ligeringsblandingen ble transformert til E. coli-stamme CSH50. Transformanter ble selektert på plater som inneholdt 50 jug/ml kanamycin på hvilket en suspensjon med ca. 10 Q Xb2 partikler var utbredt. Platene ble inkubert i 2 0 timer ved 30°C.

Overlevende kolonier ble reisolert og testet med hensyn på resistens overfor Xb2 ved kryss-oppstreking ved 3 0°C, for vekst ved 42°C ved oppstreking på Km-plater ved 42°C, og for molekylvekten til plasmidet ved fremstilling av plasmid-DNA og analyse på agarosegeler.

På denne måte ble det funnet et plasmid, pOU51, som formidler resistens overfor Km- og overfor X-infeksjon, gjør vertsbakterien temperaturømfintlig for vekst og har en innsettelse av fag-DNA i pJL20 som tilsvarer ca. 1,6 x 10 dalton. Den totale molekylvekt for plasmidet var 8,4 x 10 dalton. Disse egenskaper bæres alle av plasmidet siden nye

E. coli-resipientstammer erverver alle plasmidet's fenotypiske egenskaper ved transformering med pOU51 DNA.

DNA ble fremstilt fra pOU51 og plasmidet kartlagt med restriksjonsenzymer ved rensning av plasmid-DNA, spalting med restriksjonsenzym(er) og analyse av de resulterende fragmenter ved hjelp av agarosegel-elektroforese (kfr. fig. 4). På denne måte ble det innsatte 1,6 x 10 dalton-fragment identifisert som et Bg<_>£II-fragment fra fag X som bærer cl-repressorgenet (som er ansvarlig for X-immunitet ved 30°C) og XP -promoteren, og orienteringen av det innsatte fragment ble målt å være som vist i fig. 4. Fra restriksjonskartet fremgår det videre at pOU51 har et unikt sete for restriksjonsendonukleasen EcoRI som gjør det mulig å anvende, plasmidet som en kloningsvektor.

Plasmidets effekt på veksten av cellene ble undersøkt ved å dyrke en kultur i medium ved 30°C. Ved et tidspunkt da veksten var eksponensiell, ble temperaturen endret til 42°C og cellevekst fulgt (bestemt spektrofotometrisk). I løpet av 1,5-2 timers vekst ved 42°C opphørte kulturen å vokse.

Plasmid-DNA-innholdet ble målt som beskrevet på s. 25 og 2 6 fra 10 ml kulturer som vokste i A+B minimal-medium supplert med 0,2% glukose og 1% casaminosyrer. Én 10 ml kultur ble merket med 50 /LtCi av 3H-tymidm ved 30°C, den annen mottok isotopen like etter en endring til 42°C inntil cellene opphørte å vokse. Det relative innhold av plasmid-DNA var 2% ved 30°C hvilket tilsvarte 25-40 plasmidkopier pr. celle. Ved 42°C var det relative innhold mer enn 50%, tilsvarende mer enn 1000 plasmidkopier pr. celle.

Egenskapene til dette plasmid er vist i tabell 5.

Stammen av E. coli CSH50/pOU51 er deponert i German Collection of Microorganisms (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen, Grisebachstrasse 8, D-3400 Gottingen), i det følgende forkortet til DMS, under tilgjengelighetsnr. 2467.

Eksempel 2

Oppbygging og karakterisering av pOU53

Ved anvendelse av det plasmid som er beskrevet i eks. 1 som utgangsmateriale og ved delvis å spalte pOU51 med Hindlll, ble tittel-plasmidet oppbygget fra hvilket genet for kanamycin-resistens var fjernet, men som hadde bevart genet for X-immunitet. Plasmidet ble transformert til E. coli-stamme CHS50. pOU53 hadde en molekylvekt på 3,2 x 10 dalton og følgende genotyp: copA+,

A copB, repA+, A par, immX+, A aphA.

Plasmidet ble kartlagt med restriksjonsenzymer som beskrevet i eks. 1 (kfr. fig. 5). Fra restriksjonskartet viser det seg at pOU53 har et unikt sete for restriksjonsendonukleasen EcoRI som gjør det mulig å anvende plasmidet som en kloningsvektor.

For å vise nærværet av det ønskede plasmid i vertscellene ble cellekulturer dyrket på plater som inneholdt Xb2 fagpartikler som beskrevet ovenfor, for å teste på resistens mot X-infeksjon. Cellene ble videre testet på sensibilitet overfor kanamycin ved replikk-utplating av kolonier på plater som inneholdt 50 /zg/ml Km. For testing med hensyn på temperaturømfintlig vekst ble cellene streket opp på plater ved 42°C og dyrket på den måte som er beskrevet i eks. 1.

Da plasmid-DNA-innholdet ble målt på den måte som er beskrevet i eks. 1, ble cellene funnet å inneholde 2 0-40 plasmidkopier ved 30°C og mer enn 1000 plasmidkopier ved 42°C. Det var intet tap av plasmidet.

Egenskapene ved dette plasmid er vist i tabell 5.

Stammen av E. coli CSH50/pOU53 er deponert i DSM under tilgjengelighetsnr. 2468.

Eksempel 3

Oppbygging og karakterisering av pOU56

Ved in vivo innsettelse av Tn3-transposonet fra en X::Tn3-fag inklusive genene for transposisjon og ampicillin-resistens (/?-laktamase) (Nordstrom, Molin og Aasgaard-Hansen, Plasmid 4, 1980, 215-27) i pOU53, ble tittelplasmidet oppbygget. Plasmid-DNA ble isolert fra en stamme som bar X Tn3-fagen i kromosomene og plasmid pOU53. Plasmid-DNA ble transformert til E. coli-stamme CSH50 ved selektering for ampicillin-resistens og X-immunitet. pOU56 hadde en molekylvekt på 6,5 x IO<6> dalton og følgende genotyp: copA+,

A copB. repA+, A aphA, imm X+, bla+ (::Tn3).

Plasmidet ble kartlagt med restriksjonsenzymer som beskrevet i eks. 1 (kfr. fig. 6). Restriksjonskartet viser hvor Tn3-transposonet er blitt innsatt i pOU56, og viser videre at plasmidet har et unikt sete for hver av restriksjonsendonukleasene EcoRI og BamHI. Mens plasmidet er nyttig som utgangsmateriale for fremstilling av plasmidet pOU57 (kfr. eks. 4 nedenunder), foretrekkes det ikke som kloningsvektor da, på grunn av nærværet av transposisjonsgenet, antibiotisk resistens kan overføres til andre bakterier.

For å vise nærværet av det ønskede plasmid i vertscellen ble cellekulturer dyrket på plater som inneholdt Xb2-fagpartikler som beskrevet ovenfor, for å teste for resistens overfor X-infeksjon. Cellene ble videre testet med hensyn på ampicillin-resistens på plater som inneholdt 50 /ig/ml ampicillin. Testen på temperatur-følsom vekst ble utført på den måte som er beskrevet ovenfor. pOU56 viste seg å ha samme replikeringsegenskaper som pOU53. Egenskapene til dette plasmid er vist i tabell 5.

Stammen av E. coli CSH50/pOU56 er deponert i DSM under tilgjengelighetsnr. 2469.

Eksempel 4

Oppbygging og karakterisering av pOU57 (et plasmid av type A)

For å eliminere muligheten av transposisjon av Tn3 fra plasmid pOU56 på grunn av at det bærer hele transposonet, ble plasmidet spaltet ved BamHI- og EcoRI-setene for å fjerne transposisjonsgenet mens det gen som koder for /?-laktamase ble bevart. For å bevirke ringdannelse av de "sticky ends", ble et lite BamHI - EcoRI-fragment fra plasmid pBR322 innsatt, hvorved plasmid pOU57 ble produsert. Plasmidet ble transformert til E. coli-stamme CSH50. pOU57 hadde en molekylvekt på 4,2 x 10 dalton, og følgende genotyp: copA+, A copB, repA+, A par, A aphA, imm X+, bla+ (ATn3).

Plasmidet ble kartlagt med restriksjonsenzymer som beskrevet i eks. 1 (kfr. fig. 7). Fra restriksjonskartet fremgår det at pOU57 har unike seter for hver av restriksjonsendonukleasene BamHI og EcoRI som gjør det nyttig som kloningsvektor.

For å vise nærværet av det ønskede plasmid i vertscellen ble cellekulturer dyrket på plater som inneholdt Xb2-fagpartikler som beskrevet ovenfor for å teste med hensyn på resistens mot fag-infeksjon. Cellene ble videre testet med hensyn på ampicillin-resistens på den måte som er beskrevet ovenfor. Molekylvekten til plasmidet ble bestemt ved hjelp av agarosegel-elektroforese. Testen på temperaturømfintlig vekst ble utført på den måte som er beskrevet ovenfor.

pOU57 viste seg å ha samme replikeringsegenskaper som pOU53. Egenskapene til dette plasmid er vist i tabell 5.

Stammen av E. coli CSH50/pOU57 er deponert i DSM under tilgjengelighetsnr. 2470.

Eksempel 5

Oppbygging og karakterisering av pOU71 (et plasmid av type B)

Ved å anvende det plasmid som er beskrevet i eks. 4 som utgangsmateriale og ved å innsette et Bq l 11-fragment fra pKN1562 inklusive en del av copB-genet i Bq- eil-setet til pOU57, ble tittel-plasmidet oppbygget som bar både cl-XP SS.-repressorpromoter-systemet og villtype-genet for coB-inhibitoren av Rl-type-plasmider. Plasmidet ble transformert til E. coli-stamme CSH50. Molekylvekten til pOU71 var 4,3 x 10 dalton, og genotypen var som følger: copA+, copB+, repA+, A par. A aphA, imm X+, bla+.

Plasmidet ble kartlagt med restriksjonsenzymer som beskrevet i eks. 1 (kfr. fig. 8). Fra restriksjonskartet viser det seg at pOU71 har samme unike restriksjonsseter som pOU57.

For å vise nærværet av det ønskede plasmid i vertscellene ble cellekulturer testet med hensyn på resistens overfor X-infeksjon og ampicillin-resistens på den måte som er beskrevet ovenfor. Plasmidene ble så sortert med hensyn på nærvær av copB-genet ved hjelp av den metode som er beskrevet i avsnittet med tittelen "Utsortering av copB+" (s. 26 i foreliggende søknad). Testen på temperaturømfintlig vekst ble utført på den måte som er beskrevet ovenfor. Endelig ble antall plasmidkopier ved 30°C bestemt ved hjelp av radiomerking og gradientsentrifugering.

Da innholdet av plasmid-DNA ble målt på den måte som er beskrevet i eks. 1, ble cellene funnet å inneholde 3-5 plasmidkopier ved 3 0°C og mer enn 1000 plasmidkopier ved 42"C. Ved 30°C ble plasmidet tapt med en frekvens på 1% pr. generasjon.

Egenskapene ved dette plasmid er vist i tabell 5.

Stammen av E. coli CSH50/pOU71 er deponert i DMS under tilgjengelighetsnr. 2471.

Eksempel 6

Oppbygging og karakterisering av pOU73 (et plasmid av type C)

Ved anvendelse av det plasmid som er beskrevet i eks. 4 som utgangsmateriale og ved å innsette et EcoRI-fragment fra pOU16 som bærer copB-<g>enet i EcoRI-setet til pOU57, ble tittelplasmidet oppbygget med genet for cop_B-inhibitoren så vel som cl-XpR-repressor-promotersystemet. Plasmidet ble transformert til E. coli-stamme CSH50. pOU73 hadde en molekylvekt på 4,4 x 10 dalton og følgende genotyp: cp_pA+, copB+, repA+, A par, A aphA, imm X+, bla+.

Plasmidet ble kartlagt med redtriksjonsenzymer som beskrevet i eks. 1 (kfr. fig. 9). Fra restriksjonskartet fremgår det at coB-<g>enet er innsatt i en region i plasmidet hvor det naturlig ikke hører hjemme. Det fremgår videre at plasmidet har et unikt sete for restriksjonsendonukleasen BamHI slik at det kan anvendes som kloningsvektor.

Samme sorteringsmetoder som for pOU71 ble anvendt.

Da innholdet av plasmid-DNA ble målt på den måte som er beskrevet i eks. 1, ble cellene funnet å inneholde 0,5-1 plasmidkopi ved 30°C og mer enn 1000 plasmidkopier ved 42°C. Ved 30°C var plasmidet tapt med en frekvens på mer enn 5% pr. generasjon.

Egenskapene til dette plasmid er vist i tabell 5.

Stammen av E. coli CSH50/pOU73 er deponert i DSM under tilgjengelighetsnr. 2 472.

Eksempel 7

Oppbygging og karakterisering av pOU75 (et plasmid av type B)

Ved anvendelse av det plasmid som er beskrevet i eks. 5 som utgangsmateriale og ved delvis restriksjon av pOU71 med Hindlll, ble tittelplasmidet oppbygget som EcoRI-setet var fjernet fra. Plasmidet ble transformert til E. coli-stamme CSH50. pOU75 hadde en molekylvekt på 4,2 x 10 dalton og følgende genotyp: cop_A+, cop_B+, repA+, A par, A aphA, immX+, bla+.

Plasmidet ble kartlagt med restriksjonsenzymer som beskrevet i eks. 1 (kfr. fig. 10). Fra restriksjonskartet går det frem at fjerning av HindiII-fragmentet resulterer i fjerning av EcoRI-setet i pOU71.

For å vise nærværet av det ønskede plasmid i vertscellen ble cellekulturer testet på resistens mot X-infeksjon og ampicillin-resistens, så vel som temperaturømfintlig vekst på den måte som er beskrevet ovenfor. Plasmidet ble også testet med hensyn på tap av EcoRI-setet ved begrensning med enzymet.

pOU75 viste seg å ha samme replikeringsegenskaper som pOU71. Egenskapene til dette plasmid er vist i tabell 5.

Stammen av E. coli CSH50/pOU75 er deponert i DSM under til-gj engelighetsnr. 2473.

Eksempel 8

Genproduktforøkelse

Plasmid pMC903 (Casadaban et al., J. Bact. 143, 1980, 971) ble spaltet med restriksjonsenzymene BamHI og BgÆII under produksjon av et BamHI - BglII-fragment som bærer lac-gener. Plasmid pOU71 ble spaltet med BamHI, og det BamHI - B<g>lII-fragment som ble oppnådd ovenfor, ved dette sete som vist i fig. 11 fulgt av ligering med T4 DNA-ligase, hvilket produserte plasmidet pOU106 som ble transformert til E. coli-stamme CSH50. Cellene ble streket opp på McConkey laktose-indikator-plater (se J. Miller, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor, 1972) inneholdende 50 jizg/ml ampicillin og inkubert ved 30°C for selektering for røde kolonier (Lac<+>). Temperaturen ble så endret til 42 °C, og forøkelsen av genprodukt (/3-galaktosidase) ble målt som vist i tabell 3. Målingen ble utført i henhold til den metode som er beskrevet av J. Miller, op. eit.

"^Enzymaktivitet pr. total mengde protein, d.v.s. økningen av /3-galaktosidase pr. celle.

<2>yS-galaktosidase formidlet av plasmid pOU106.

<3>/3-laktamase formidlet av plasmid pKN410 (Uhlm et al., Gene 6, 1979, tabell 11, s. 100).

Fra tabellen fremgår det at nivået av genproduktforøkelse er sammenlignbart med det som oppnås med "runaway"-vektorer (f.eks. Uhlin et al., Gene 6, 1979, 91-106).

Den promoter fra hvilken /3-galaktosidase-genet uttrykkes er cl-promoteren og/eller tetracyklinpromoteren som er beliggende på DNA-fragmentet fra pBR322 som, selv om det er relativt svakt, ikke kan sees bort fra som en influerende faktor og som transkriber i samme retning som cl-promoteren.

pOU106 ble kartlagt med restriksjonsenzymer som beskrevet i eks. 1 (kfr. fig. 11). Fra restriksjonskartet fremgår det at plasmidet har et unikt sete for restriksjonsendonukleasen BamHI umiddelbart nedstrøm for de innsatte lac-gener, som gjør plasmidet nyttig som kloningsvektor.

Egenskapene til dette plasmid er vist i tabell 5.

Stammen av E. coli CSH50/pOU106 er deponert under tilgjenge-1ighetsnr. 2474.

Eksempel 9

Oppbygging og karakterisering av pOU79 (et plasmid av type B)

Plasmid pOU71 ble spaltet fullstendig med BamHI og delvis med Pstl og ligert med et DNA-fragment (som bærer lac-operonet) fra plasmid pMC871 (Casadaban et al., J. Bact. 143, 1980, 971) som var blitt spaltet fullstendig med BamHI og Pstl.

Ligeringsblandingen ble transformert til E. coli-stamme CSH50 som selekterer for resistens overfor ampicillin på McConkey-laktose-indikatorplater inneholdende 50 yng/ml ampicillin som ble inkubert ved 30°C. Etter 2 0 timer's inkubering ved 30°C ble platene inkubert i et kort tidsrom (1-2 timer) ved 42°C, og kolonier som vekslet fra en Lac (hvit) til en Lac<+> (rød) fenotyp som ble analysert videre. Tittelplasmidet ble identifisert fra én slik koloni. pOU79 hadde en molekylvekt på 8,8 x 10 dalton og følgende genotyp: copA+, copB+, repA+, A par, immX+, bla+, lac+.

Plasmidet ble kartlagt med restriksjonsenzymer som beskrevet i eks. 1 (kfr. fig. 12). Fra restriksjonskartet fremgår det at plasmidet har et unikt sete for restriksjonsendonukleasen BamHI akkurat oppstrøms for lac-genene. Innsettelse av promoterbærende DNA-fragmenter i den riktige orientering ved dette sete resulterer i transkripsjon av lac-genene som således gir opphav til en Lac+-fenotyp av celler som bærer slike hybridplasmider ved 30°C. Lac+-celler identifiseres lett på McConkey-laktose-indikatorplater.

Plasmidet har også et unikt sete for restriksjonsendonukleasen av EcoRI som er beliggende ved én ende av lacZ-genet. Innsettelse av EcoRI-fragmenter ved dette sete eliminerer aktiviteten til lacZ-genproduktet, /3-galaktosidase, resulterer i en Lac -fenotyp som lett registreres som dannelse av farveløse kolonier på McConkey-laktose-indikatorplater etter en temperaturendring fra 30 til 42°C (kfr. beskrivelsen ovenfor). Plasmidet er således anvendelig som kloningsvektor. pOU7 0 viste seg å ha samme replikeringsegenskaper som pOU71.

Egenskapene til dette plasmid er vist i tabell 5.

Stammen av E. coli CSH50/pOU79 er deponert i DSM under tilgjengelighetsnr. 2481.

Eksempel 10

Oppbygging og karakterisering av pOU82 (et plasmid av type B)

Plasmid pOU79 ble spaltet fullstendig med BamHI og delvis med Sali, og et BamHI - Sall-fragment fra pSKS104 som bærer lac-operonet fra hvilket lac-promoteren var fjernet, og de første fire kodoner av lacZ-genet ble innsatt for å bygge opp pOU80 (ikke vist).

pOU80 er Lac og har et BamHI-sete og et EcoRI-sete akkurat oppstrøms for lac-<g>enene. Videre mangler det EcoRI-sete som normalt finnes i lacZ-genet siden lac-genet i pSKS104 er avledet fra pMC1403 (Casadaban et al., Bact. 143, 1980, 971).

Tittelplasmidet ble oppbygget ved å erstatte et EcoRI - Clal-fragment i lacZ-genet (kfr. kartet for pOU79, fig. 12) for pOU80 med et EcoRI- Clal-fragment fra pVH1424 som bærer deo-promoteren og aminoterminalenden til lacZ-genet. Utbyttingen resulterer i rekonstruksjon av lacZ-genet og, på grunn av nærvær av deo-promoteren, overfører det resulterende hybridplasmid, pOU82, en Lac+-fenotyp ved transformering til E. coli-stamme CSH50. pOU82 hadde en molekylvekt på 8,1 x 10 dalton og følgende genotyp: copA+, copB+, repA, A par, immX+, bla+, lac+.

Plasmidet går til slutt tapt fra cellene ved 30°C på grunn av mangelen på par-regionen, hvilket lett observeres på ikke-selektive McConkey-laktose-indikatorplater (kfr. eks. 11).

Plasmidet ble kartlagt med restriksjonsenzymer som beskrevet i eks. 1 (kfr. fig. 13). Fra restriksjonskartet fremgår det at plasmidet har et unikt sete for hver av restriksjonsendonukleasene EcoRI og BamHI, hvilket gjør det mulig å anvende plasmidet som kloningsvektor.

pOU82 viste seg å ha samme replikeringsegenskaper som pOU71. Egenskapene til dette plasmid er vist i tabell 5.

Stammen av E. coli CSH50/pOU82 er deponert under tilgjengelighetsnr. 2482.

Eksempel 11

Oppbygging og karakterisering av pOU91 (et plasmid av type B)

For å konstruere et plasmid som er stabilt med hensyn til fordeling ble pOU82 spaltet med EcoRI, og EcoRI-A-fragmentet inklusive villtype- par-regionen til et plasmid Rl-derivat, pKN184 (Nordstrom et al., Plasmid 4, 1980, 322), ble innsatt ved dette sete fulgt av ligering. Det resulterende plasmid (pOU90, ikke vist) ble transformert til E. coli-stamme CSH50, og cellene ble dyrket selektivt på plater inneholdende 50 /zg/ml ampicillin ved 30°C. Som kontroll ble celler inneholdende pOU82 dyrket på lignende måte for å sikre nærvær av plasmidene i begge utgangs-kolonier. Deretter ble prøver av begge kolonier streket opp på plater som ikke inneholdt noe antibiotikum, og cellene fikk vokse i 25 cellegenerasjoner. For sortering med hensyn til stabil arv av Laen—fenotypen, ble celler fra begge de resulterende kolonier streket opp på McConkey-laktose-indikatorplater ved 30°C hvor cellene som pOU90 var blitt transformert til, utviklet røde kolonier, hvilket viste at dette plasmid var bevart, mens kontrollcellene som pOU82 var blitt transformert til, utviklet både røde og farveløse kolonier, hvilket betyr at under den selekteringsfrie periode var pOU82 blitt tapt fra noen av cellene.

Det intermediære plasmid, pOU90, ble deretter spaltet fullstendig med BamHI og delvis med Sau3A for å redusere størrelsen på plasmidet, hvorved tittelplasmidet ble produsert. Etter tranformering til E coli-stamme CSH50 ble plasmidets stabilitet bestemt på den måte som er beskrevet ovenfor. pOU91 hadde en molekylvekt på 12,5 x 10 dalton og følgende genotyp: copA+. copB+, repA+. par+, imm\+, bla+, lac+.

Plasmidet ble kartlagt med restriksjonsenzymer som beskrevet i eks. 1 (kfr. fig. 14). Fra restriksjonskartet fremgår det at pOU91 har unike seter for hver av restriksjonsendonukleasene EcoRI og BamHI, hvilket gjør plasmidet nyttig som kloningsvektor.

pOU91 viste seg å ha samme replikeringsegenskaper som pOU71, men i motsetning til pOU71, er plasmidet fullstendig stabilt ved 30°C.

Egenskapene ved dette plasmid er vist i tabell 5.

Stammen av E. coli CSH50/pOU91 er deponert i DSM under tilgjengelighetsnr. 2483.

Eksempel 12

Oppbygging og karakterisering av pOUlOl (et plasmid av type B)

Ved å anvende det plasmid som er beskrevet i eks. 7 som utgangsmateriale og ved å innsette et Sau3A-fragment som bærer det gen som koder for kloramfenikol-acetyl-transferase (cat+) i BamHI-setet til pOU75, ble det tittelplasmid oppbygget som bibragte kloramfenikolresistens til vertscellen. Plasmidet ble transformert til E. coli-stamme CSH50. pOUlOl hadde en molekylvekt på 4,7 x 10 dalton og følgende genotyp: copA+, coB+, repA+, A par,

A aphA, immX+, bla+, cat+.

Plasmidet ble kartlagt med restriksjonsenzymer som beskrevet i eks. 1 (kfr. fig. 15). Fra restriksjonskartet fremgår det at pOUlOl har et unikt sete for restriksjonsnukleasen EcoRI hvilket gjør det mulig å anvende plasmidet som kloningsvektor. Videre inaktiverer innsettelse av EcoRI-fragmenter det cat+-gen som tillater sortering med hensyn på EcoRI-hybrider.

For å vise nærværet av det ønskede plasmid i vertscellen ble cellekulturer testet med hensyn på resistens overfor X-infeksjon og ampicillinresistens på den måte som er beskrevet ovenfor. Videre ble cellene testet med hensyn på resistens overfor klor-amf enikol ved å dyrke kulturer på plater inneholdende 2 0 /ig/ml kloramfenikol. Cellene ble også testet med hensyn på temperaturømfintlig vekst på den måte som er beskrevet ovenfor. pOUlOl viste seg å ha samme replikeringsegenskaper som pOU71.

Egenskapene til dette plasmid er vist i tabell 5.

Stammen av E. coli CSH50/pOU101 er deponert i DMS under tilgjengelighetsnr. 2757.

Eksempel 13

Oppbygging og karakterisering av pOUllO

Det EcoRI - Clal-fragment som inneholdt en del av lacZ-genet ble fjernet fra plasmid pOU80 (beskrevet i eks. 10; kfr. kartet for pOU79, fig. 12) og erstattet med et EcoRI - Clal-fragment fra plasmid pVH1451 (Valentin-Hansen et al., the EMBO Journal 1, 1982) som bærer deo-promoteren og aminoterminalenden til lacZ-<g>enet. Det resulterende plasmid ble betegnet pOU83 (kfr. fig. 16).

Plasmid pOU83 ble delvis spaltet med BamHI og B<q>lll i den hensikt å fjerne lac-genene og det DNA-fragment som bærer cl-repressorgenet og XPR-promoteren. Etter ligering og transformering til CSH50, ble et plasmid med de ønskede egenskaper isolert, hvilket resulterte i en nær fusjon av deo-promoteren og copB-genet. Plasmidet, betegnet pOUllO, hadde en molekylvekt på 3,2 x 10 dalton og følgende genotyp: copA+. copB+, repA, A par, bla+.

Plasmidet ble kartlagt med restriksjonsenzymer som beskrevet i eks. 1 (kfr. fig. 17). Fra restriksjonskartet fremgår det at plasmidet har et unikt sete for hver av restriksjonsnukleasene EcoRI og BamHI hvilket gjør det mulig å anvende plasmidet som kloningsvektor.

Ved dyrkning av E. coli-stamme Scp929 (cytR, lac, deo; recA) , som pOUllO var blitt transformert til, natten over i LB-medium uten glukose, inntraff ukontrollert plasmidreplikering ved en celledensitet på over 2 x 10 celler/ml.

Stammen av E. coli CSH50/pOU110 er deponert i DSM under tilgjengelighetsnr. 2758.

Eksempel 14

Oppbygging og karakterisering av pOU13 0

Plasmid pOU91 ble spaltet med BamHI, og BamHI-setet ble fjernet ved hjelp av exonukleasen Bal31 for produksjon av plasmid pOU92 (ikke vist). Plasmidet ble spaltet med EcoRI og Clal. og et tilsvarende EcoRI - Clal-fragment fra plasmid pMC1403 (Casadaban et al., J. Bact. 143, 1980, 971) ble innsatt for produksjon av plasmid pOU93 som bar lac-operonet uten deo-promoteren. Ved BamHI-setet som således var produsert ble et Bg_ÆII-fragment som bar et coB-gen innsatt for produksjon av plasmid pOU13 0 (kfr. fig. 18) fulgt av ligering og transformering til E. coli-stamme CSH50. Cellene ble streket opp på McConkey-laktose-indikator-plater inneholdende 50 /ig/ml ampicillin og inkubert ved 30°C for selektering for røde kolonier (Lac+). Temperaturen ble deretter endret til 42 °C, og forøkelsen av /3-galaktosidase er vist i tabell 5. Etter 45 minutters inkubering ved 42"C ble temperaturen senket til under 38 °C. /3-galaktosidaseforøkelsen som ble målt etter temperaturendringen er vist i tabell 5.

a Celler av CSH50 som inneholder pOU130 dyrket eksponensielt i

LB medium ved 3 0°C.

b Etter eksponensiell vekst ved 30"C ble kulturen endret til 42 °C, ved hvilken temperatur veksten ble fortsatt i 2 timer, c Etter eksponensiell vekst ved 30°C ble kulturen endret til 4 2°C i 45 minutter, hvoretter den ble endret til 37°C i 90

minutter.

d Se "materialer og metoder". Spesifikke aktiviteter for /3-galaktosidase er uttrykt som beskrevet av Light og Molin, Mol. Gen. Genet. 1981, (s. 56-61).

Fra tabellen fremgår det at genproduktforøkelse forbedres betydelig ved anvendelse av en endring tilbake til lavere temperatur, hvilket viser at denne metode er spesielt nyttig for oppnåelse av maksimal ekspresjon av genproduktene som er på tale.

Da /3-galaktosidase konstitutivt uttrykkes fra en slik genfusjon (Light & Molin, J. Bact. 151, 1982, 1129-1135), reflek-terer nivåene av enzymaktivitet genproduktforøkelseskapasiteten til plasmidene i henhold til oppfinnelsen.

Stammen av E. coli CHS50/pOU13 0 er deponert i DSM under tilgjengelighetsnr. 2759.

Eksempel 15

Oppbygging og karakterisering av pLC31

pOU75 ble spaltet med BamHI, og et BamHI-fragment fra plasmid pBEU14 (Uhlin og Clark, J. Bact. 148, 1981, 386-90) som bærer recA-promoteren og genet ble innsatt, fulgt av transformasjon til E. coli-stamme CSH50. Tittelplasmidet hadde en molekylvekt på 6,3

6

x 10 dalton og følgende genotyp: recA, bla+, copA-f, copB+, reA+, immX+•

Plasmidet ble kartlagt med restriksjonsenzymer som beskrevet i eks. 1 (kfr. fig. 19). Fra restriksjonskartet fremgår det at pLC31 inneholder et unikt sete for restriksjonsenzymet EcoRI ned-strøms for den recA-promoter som er egnet for innsettelse av fremmede gener.

pLC31 viste seg å ha de samme replikeringsegenskaper som pOU71.

Ved dyrkning av celler som inneholdt pLC31 ved 30°C, forble promoteren fullstendig repressert, mens etter en temperaturendring til 42°C lexA-repressoren ble gradvis titrert og transkripsjon fra recA ble initiert, hvilket førte til forøket produksjon av recA-genprodukt som kunne påvises ved polyakrylamidgel-elektroforese.

Egenskapene til dette plasmid er vist i tabell 5.

Stammen av E. coli CSH50/pLC31 er deponert i DSM under tilgjengelighetsnr. 2718.

Eksempel 16

Oppbygging og karakterisering av pLC3 3

Plasmid pLC28 (Remaut et al., Gene 15, 1981, s. 81-93) som bærer XPT-promoteren og bla-genet og forsynt med en kobler omfattende restriksjonssetene EcoRI, Smal, BamHI, Sali, Pstl og Hindlll, ble spaltet med EcoRI og innført i EcoRI-setet i plasmid pOU51 (kfr. eks. 1) fulgt av ligering og transformasjon til E. coli-stamme CSH50. Dette plasmid, pLC32', (kfr. fig. 20), som hadde en molekylvekt på 10,6 x 10 dalton, fordøyd med BamHI og med exonukleasen Bal31 for fjerning av kobleren under de betingelser som er beskrevet i T. Maniatis et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1982, s. 135-139, fulgt av religering og transformasjon til E. coli-stamme C600 (R.K. Appleyard, Genetics 39, 1954, s. 440-452) som selekterer for plasmider som er kanamycin- og ampicillin-resistente. Det resulterende plasmid ble betegnet pLC3 3 og hadde en molekylvekt på 10,3 x 10 dalton og følgende genotyp: cop_A+, copB , repA+, aphA+, immX<+>, bla+.

Plasmidet ble kartlagt med restriksjonssystemer som beskrevet i eks. 1 (kfr. fig. 22). Fra restriksjonskartet fremgår det at XP -promoteren er beliggende umiddelbart oppstrøms for det unike EcoRI-sete som gjør plasmidet egnet som kloningsvektor.

pLC33 viste seg å ha de samme replikeringsegenskaper som pOU51.

Egenskapene til dette plasmid er vist i tabell 5.

Stammen av E. coli C600/pLC3 3 er deponert under tilgjeng-el ighetsnr. 2945.

BIBLIOGRAFI

1. Publisert europeisk patentsøknad nr. ?

2. Molin et al., J. Bact. 138, 1979, s. 70-79.

3. Molin et al., Microbiology, 1981, s. 408-11.

4. Rosen et al., Mol. Gen. Genet. 179, 1980, s. 527-37. 5. Light og Molin, Mol. Gen. Genet, 184, 1981, s. 56-61. 6. Stougaard et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 78, 1981, s. 6008-12. 7. Molin et al., MOI. Gen. Genet. 181, 1981, s. 123-30.

8. Stougaard et al., EMBO Journal 1, 1982, s. 323-28.

9. Sussman og Jacob, Compt. Rend. Acad. Sei. 254, 1962, s. 1517.

10. Sninsky et al., Gene 16, 1981, s. 275.

11. Uhlin et al., Gene 6, 1979, s. 91-106.

12. J. Miller:

Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor

Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1972.

13. Davis, Botstein og Roth:

A Manual for Genetic Engineering; Advanced Bacterial

Genetics, Cold Spring Harbor, New York, 1980.

14. Bertani, J. Bact. 62, 1954, s. 293.

15. Bolivar et al., Gene 2, 1977, s. 95.

16. An & Friesen, J. Bact. 140, 1979, s. 400-407.

17. Casadaban et al., J. Bact. 143, 1980, s. 971.

18. Dempsey & Willetts, J. Bact. 126, 1976, s. 166.

19. Nordstrom , Molin, Aagaard-Hansen, Plasmid 4, 1980,

s. 215-17. 20. Stougaard & Molin, Anal. Biochem. 118, 1981, s. 191.

21. Nordstrom et al., Plasmid 4, 1980, s. 322.

22. Valentin-Hansen et al., EMBO Journal 1, 1982, s. 317.

23. Messing et al., Nucleic Acids Res. 9, 1981, 309.

24. Uhlin & Clark, J. Bact. 148, 1981, s. 386-90.

Claims

1. Plasmid, som har en størrelse på 2,5-15,0 x IO<6> dalton, karakterisert ved at det inneholder: a) en innsatt regulerbar promoter i en posisjon og i en orientering som tillater transkripsjon fra promoteren til replikasj onsregionen; b) nevnte replikasjonsregion omfatter et gen som koder for et genprodukt som er nødvendig for replikasjon, idet øket transkripsjon fra den regulerbare promoter fører til et øket nivå av genproduktet som er nødvendig for replikasjon; c) nevnte økte nivå resulterer i en plasmidreplikasjonsrate som er høyere enn vertscellens vekstrate, hvilket fører til et øket plasmidkopitall som vanligvis etter 4-5 cellefordoblinger, er øket med en faktor på minst 25-1000.

2. Plasmid som angitt i krav 1, karakterisert ved at promoteren er kontroller-bar ved regulering av temperatur eller metabolitt i dyrknings-mediet.

3. Plasmid som angitt i krav 2, karakterisert ved at den regulerende faktor er en som utøver positiv kontroll, eller en faktor som utøver negativ kontroll.

4. Plasmid som angitt i krav 1, karakterisert ved at den økede transkripsjon fra den regulerbare promoter som fører til et vesentlig øket eller ukontrollert plasmidkopitall forårsakes av derepresjon av promoteren.

5. Plasmid som angitt i hvilket som helst av de foregående krav, karakterisert ved at promoteren er en kjemisk regulerbar promoter, såsom en lac-promoter, trp-promoter eller deo-promoter.

6. Plasmid som angitt i hvilket som helst av kravene 1-4, karakterisert ved at aktiviteten til promoteren er temperaturavhengig eller styres av en temperaturfølsom reguleringsfaktor.

7. Plasmid som angitt i krav 6, karakterisert ved at promoteren er en A-promoter, og at genet for en temperaturfølsom A-cl-repressor som kontrollerer transkripsjon fra promoteren, også er tilstede.

8. Plasmid som angitt i krav 7, karakterisert ved at A-promoteren er enten APR eller APL, spesielt APR.

9. Plasmid som angitt i hvilket som helst av de foregående krav, karakterisert ved at transkripsjon fra nevnte regulerbare promoter bevirker at plasmidet viser et konstant, lavt kopitall ved lave temperaturer, f.eks. en temperatur på 30 °C, og et vesentlig øket eller ukontrollert kopitall ved høyere temperaturer, f.eks. en temperatur i området 36-42 °C.

10. Plasmid av type A som angitt i hvilket som helst av de foregående krav, karakterisert ved at en del av et naturlig replikasjonsregulerende gen er fjernet og erstattet med den regulerbare promoter.

11. Plasmid som angitt i krav 10, karakterisert ved at det når vertsmikroorganismer som inneholder plasmidet dyrkes under betingelser som sikrer et konstant, lavt plasmidkopitall, har et kopitall i området 20-40, fortrinnsvis 20-30, spesielt 20-25, kopier pr. celle, og at det, når vertsmikroorganismene dyrkes under andre betingelser, som fører til et vesentlig øket eller ukontrollert plasmidkopitall, har et kopitall i området 500-1000 kopier pr. celle.

12. Plasmid som angitt i krav 11, karakterisert ved at det har et plasmidkopitall i området 20-40, fortrinnsvis 20-30, spesielt 20-25, kopier pr. celle ved én temperatur, f.eks. en temperatur på 30°C, og et ukontrollert plasmidkopitall i området minst 500-1000 kopier pr. celle ved en høyere temperatur, f.eks. en temperatur på 42°C.

13. Plasmid av type B som angitt i hvilket som helst av kravene 1-9, karakterisert ved at en regulerbar promoter er blitt innsatt oppstrøms for det eller de naturlige replikeringskontrollgener i plasmidet.

14. Plasmid som angitt i krav 13, karakterisert ved at det, når vertsmikroorganismer som inneholder plasmidet dyrkes under betingelser som sikrer et konstant, lavt plasmidkopitall, har et kopitall i området 3-5 kopier pr. celle, og at det, når vertsmikroorganismene dyrkes under annerledes betingelser som fører til et vesentlig øket eller ukontrollert plasmidkopitall, har et kopitall i området minst 500-1000 kopier pr. celle.

15. Plasmid som angitt i krav 14, karakterisert ved at det har et plasmidkopitall i området 3-5 kopier pr. celle ved en temperatur på 30°C, og et ukontrollert plasmidkopitall i området 500-1000 kopier pr. celle ved en.høyere temperatur på 42°C.

16. Plasmid av type C som angitt i hvilket som helst av kravene 1-9, karakterisert ved at det bærer en regulerbar promoter i replikeringsregionene fra hvilken en del av et naturlig replikeringsregulerende gen er blitt fjernet, og i hvilket det naturlige replikeringsregulerende gen er blitt innsatt i en region hvor det ikke er plassert naturlig.

17. Plasmid som angitt i krav 16, karakterisert ved at det, når vertsmikroorganismer som inneholder plasmidet dyrkes under betingelser som sikrer et konstant, lavt plasmidkopitall, har et kopitall i området 0,5-1 kopi pr. celle, og at det, når vertsmikroorganismer dyrkes under annerledes betingelser som fører til et vesentlig øket eller ukontrollert plasmidkopitall, har et kopitall i området 500-1000 kopier pr. celle.

18. Plasmid som angitt i krav 17, karakterisert ved at det har et plasmidkopitall i området 0,5-1 kopi pr. celle ved en temperatur på 30°C, og et ukontrollert plasmidkopitall i området 500-1000 kopier pr. celle ved en høyere temperatur på 42°C.

19. Plasmid som angitt i hvilket som helst av kravene 1-9, karakterisert ved at det i tillegg til den første regulerbare promoter som regulerer transkripsjon fra replikeringsregionen, er innsatt en annen promoter i plasmidet, på en måte som muliggjør innsettelse av et strukturelt gen hvis ekspresjon styres fra nevnte annen promoter, hvilken annen promoter er regulerbar, og f. eks. er AP-^-promoteren.

20. Plasmid som angitt i hvilket som helst av de foregående krav, karakterisert ved at det bærer et gen som muliggjør gen-fusjon ved innsetting av et annet gen, fra hvilken fusjon det er mulig å påvise ekspresjon.

21. Plasmid som angitt i hvilket som helst av de foregående krav, karakterisert ved at det i tillegg bærer ett eller flere gener som ikke naturlig er forbundet med plasmidet.

22. Anvendelse av et plasmid i henhold til hvilket som helst av kravene 1-21, for fremstilling av et genprodukt av plasmid-DNA, hvorved mikroorganismer som bærer et slikt plasmid dyrkes, omfattende minst én periode med dyrkning under betingelser som sikrer økt transkripsjon fra nevnte regulerbare promoter, fortrinnsvis én periode hvor konsentrasjonen av en substans som i det vesentlige inhiberer aktiviteten av promoteren, er redusert i en grad som fører til aktivering av promoteren, eller én periode ved eller nær en temperatur ved hvilken plasmidkopi-tallet er vesentlig øket eller ukontrollert, hvilket resulterer i et vesentlig øket eller ukontrollert plasmidkopitall, og å høste, fra den mikrobielle kultur, det ønskede genprodukt.

23. Anvendelse ifølge krav 22, hvorved vertsmikroorganismen, til hvilken et plasmid i henhold til hvilket som helst av kravene 1-21 er blitt transformert, dyrkes under betingelser som resulterer i et konstant, lavt plasmidkopitall under podnings- og multipliseringsstadiene inntil det ønskede antall celler er oppnådd, og deretter dyrke vertsmikroorganismen under betingelser som fører til et vesentlig øket eller ukontrollert plasmidkopitall.

24. Anvendelse ifølge krav 22 eller 23, hvorved etter en periode med dyrkning i nærvær av en substans som i det vesent-lige inhiberer promoteraktivitet, konsentrasjonen av substansen reduseres i en grad som fører til aktivering av promoteren og et vesentlig øket eller ukontrollert plasmidkopitall.

25. Anvendelse ifølge krav 24, hvorved etter opprettholdelse av de betingelser som fører til et vesentlig øket eller ukontrollert kopitall i et tidsrom som er tilstrekkelig til å oppnå vesentlig amplifikasjon av plasmidet, men tilstrekkelig kort til å unngå enhver vesentlig forringelse av den mikrobielle kultur, den substans som inhiberer promoteraktiviet tilsettes i en mengde som fører til en langsom nedgang i plasmidkopitall til pre-induksj onsnivå.

26. Anvendelse ifølge krav 22 eller 23, hvorved de betingelser under hvilke vertsorganismen dyrkes, omfatter minst en periode med dyrkning ved eller nær en temperatur ved hvilken plasmid-kopitallet er vesentlig øket eller ukontrollert.