JPS59501532A - 条件非制御の複製挙動を持つプラスミド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 条件非制御の複製挙動を持つプラスミドこの発明は、組換えＤＮＡ技術分野にお いてクローニングベクター及び産生ベクターとして有用で複製挙動が複製に好適 な条件下で制御されない（非制御の）新規なプラスミド、及びかようなプラスミ ドの製法に関する。

技術的背景 条件非制御の複製挙ａｔ持つプラスミド（ｐｌａａｍムＷｉｔｈ　ａｏｎｒ３ｊ Ｌ−ｔｉｏｍＬ　ｕｗｏｎｔｒｏｕ＠ａ　ｒｅＰｌｉＯ＆ｔｉＯｎ　ｂｅｈａｖ ｔｏｕｒ）　（いわゆるランアウェイプラスミド：　ｒｕｎａｗａｙ　ｐｌａｅ 社ａ）は、例えば公開ヨーロッパ特許出ｉ第７８１０１８７７．５号によって知 られている。これらのプラスミドの複製は温度依存性であって、プラスミドを保 有する宿主細菌がある温度例えば約５０℃の温度で培養されるときは制御された 一定の低コピー数を示し、その宿主細菌が異なる温度例えば約３６℃以上の温度 で培養されるときは非制御のコピー数を示すのである＠ 上記特許出願に開示されたプラスミドは、ニジエリ辷ア・コリ中で自律的に復製 することが知られている野生型プラスミドのプラスミドＲ１の化学的突然変異誘 発法（ｍｕｔａｇ＠己５ａｔｉｏｎ）によって単離された。この突然変異誘発法 は２段階で行われた。

すなわち第１段階は、プラスミドコピー数が３０℃で約１〜２で、４０°Ｃでは ４〜５倍高いプラスミド保育細菌クローンの単離からなり、第２段階はプラスミ ドがより高い温度で制御されないコピー数を示した刑急クローンのＭ４離力）ら なるものである。

このようにランアウェイ＄劾を示すプラスミドは親プラスミドの二重変異体であ った。

上記特許出願には、またミニプラスミドを開示しており、これは小さいサイズで あることがら比峻的容易に宿主細菌ｉこ形質転換されるのでクローニングベクタ ーとして４月である。これらのミニプラスミドは、温度依存性のランアウェイＱ ％挙劾の原因である遺伝子ご保持していた。

上記特許出願に開示されたプラスミドは、クローニング及び産生ベクターとして 、外米ＤＮＡの挿入されたフラグメントの遺伝子産物合成るのに用いることがで きる。このプラスミドの温度依存性複製は、例えば真核オリジンのＤＮＡフラグ メントからの増幅された潰の遺伝子産物を産生Ｔるのに利用できる。・４伝子産 物のかような増幅は、例えば培養媒体にクロラムフエニコーｙを添加して行われ る通常のプラスミドＤＮＡ増幅技術では、クロラムフェニコールの存在が蛋白合 成を停止させるので、有効でなかった。

上記特許願で開示されたプラスミドは、挿入された外来遺伝子が、そのプラスミ ドが形質転換されるべき細菌に対し有害な産物合成の遺伝情報を指定している場 合に、クローニングペクシと腫生ベクターとして育利に用いることができる。と いうのはそのプラスミドは低温においては低コピー数を有し結局はとんど遺伝子 表現モしないからである。このことは、低温で行われる培養の増殖段階では細菌 が損傷されに（いことを意味Ｔる。

発明の開示 この発明は、プロモーターからの転写がプラスミド複製を調節するようなしかた で挿入された少ｔ（ともひとつの調節可能なプロモーター（ｒ＠ｇｕ藷ｔａｂｌ ・ｐｒｏｍｅｔｅｒ）を有する新規なプラスミドに関する。特にこの発明は、そ のプラスミドを有する宿主微生物がプロモーターからの転写の増大を保証する条 件下で培養されると、調節可能なプロモーターが実質的に増大されるかもしくは 制御され１工い復ｉ＝起こさせるプラスミドに関する。この発明はさらＩ２：か ようなプラスミドの製法−と関する。このプラスミドはクローニング及び産生ベ クターとして有用である。

プラス叉ドに挿入され所望の遺伝子産物合成の遺伝情報を指定Ｔる。購造逗伝子 の表現を制御するために、調節可能なプロモーターをニー人することが知られて いる。しかし形成されるプラスミドコピー数を調節することができる調節可能な プロモーターｆプラスミドに挿入することは新規であると信じられる。

この発明は、第一の態様として、調節可能なプロモーターが、このプロモーター からの転写が複製？−節Ｔるようなしかた、特に項入石れた転写によってプラス ミドコピー数が実質的に増大される力）もしくは制卸されなくなるに至るような しかたで挿入されたプラスミドにＩｉＡする。この明細書及び請求の範囲におい て１調節可能なプロモーター１という用語は、プロモーターの転写開始ら度に謁 丁。活性が、そのプロモーターを持つプラスミド：４：有下る宿主細菌の培聾栄 件を調節Ｔることもこよって、−顧可能なブロモ−を意味する。かような調節可 能なプロモーターは、例えは外米プロモーター、すなわちプロモーターの挿入さ れているプラスミドが本来もっていない（＠シていない）プロモーターであって もよい。このプロモーターは、そのプロモーターの部位内の特別なりＮＡ構造に よって先天的に調節可能である。かようなプロモーターの一例は、公知のランア ウェイプラスミド（後記説明参照ンに見出される。又はこのプロモーターは、正 の制御を行いつる調節因子によって制御可能であってもよく（すなわちプロモー ターが例えば宿主細胞が生育される培地にある講究物質を添加することにより正 に誘発されないとプラスミドは非制御の複製１こ到達しない〕、又はこの調節因 子は負の制御を行ってもよい。後者のタイプの制御因子は、その活性が宿主細胞 の培養条件な調整することによって調節可能であるリプレッサーとしても知られ ている。そのリプレッサー遺伝子はプロモーターととも橿こプラスミド自体にあ ってもよ（、同じ宿主微伍吻中の別のプラスミドでもよく、又は宿主微生物の染 色体に位置していてもよい。このリプレッサー遺伝子は挿入されたプロモーター からの転写を抑制する産物の遺伝情報を指定しその結果、復製は低い一定レベル に保持される。ある理由でリプレッサーが不活化されるようになると、かような 制御はなくなり転写が増大する。

特別の記載？しなければ、この明細署と請求の範囲に用いられる”プロモーター ”の用語は通常、宿主細胞の培養条件の変化に先天的に応答する活性を有するプ ロモーターと調節因子によって制御されるプロモーターの両者を意味する。また １調節可能なプロモーターが挿入されたプラスミドゝの表現は、プロモーターと そのプロモーターによって調節されたレプリコンが同じＤＮＡフラグメントに挿 入され、そのプロモーターとレプリコンが最終的に異なるンースから誘導されて いるこの発明のプラスミドに用いることを意図するものである。そしてこのこと は、所望の最終プラスミド組立ての１段階において、プロモーターがレプリコン の誘導されたプラスミドに挿入されたことを意味する。１実質的に増大されるか もしくは制御されないプラスミドコピー数”の用語は、宿主微生物の培養条件を プロモーター刀）らの転写の増大を保証するように変えその結果プラスミドがそ の複製制御を失ったとき、そのプラスミドコピー数は、その微生物集団の一世代 時間で約４０〜５０％もしくはそれ以下で指数的に増大するという事実にてらし て理解される。この増大は、宿主細胞が通常４〜５もしくはそれ以下の倍化の後 成育を停止するまで続く。そしてその時点でａ胞中のプラスミドＤＮＡの遣はＤ ＭＡ全量の約４０〜７０％であり、すなわちプラスミドコピー数が約２５〜１０ ００もしくはそｎ以上のファクターで増大する。換言丁れば、プラスミドコピー 数が定常状態に到達しないのである。このタイプの制御されない複製挙動も１ラ ンアウエイ”挙動と呼称される。

Ｒ１型プラスミドの複製制御原理について、この発明の発明者らが新たに得た知 識はこの発明のプラスミドの組立てに利用される（この原理の詳細な説明につい ては、′発明の詳細な説明１を参照のこと）。この発明の原理にしたがって、調 節可能なプロモーターがプラスミドに挿入されると、例えばプロモーターの抑制 解除作用によってプロモーターからの増大された転写によってプラスミドコピー 数が実質的に増大されるかつ制御されナクする１こ至る。このことはプロモータ ーとともに挿入されかつある条件下でプロモーターを制御する遺伝子産物含酸の ４伝情報を指定するリプレッサー遺伝子が、異なる条件下で不活化するようにな ると、プロモーターからの転写はもはや阻害されず、音場制御されないプラスミ ドコピー数になるということを意味する。

このことは、条件分捉えると復製性能が異なるかもしれない公知のランアウェイ プラスミド（こ比べて１要な改良である。挿入される外来プロモーターは通常、 非常に強力（すなわち転写開始の頻ｒＷが「ｊｂい）なのでかような条件変化で は効果がない刀）ら、このことはこの発明のプラスミドも同ゆであるという徴挨 は全くない。

調節可能なプロモーターの活性を調節することのできる培瘍染件のひとつは、宿 主故生吻か場昼される温度である。プロモーターの活性は、それ目体温度依存性 であってもよ（、すなわち培査中の温度変化に反応する小、又はその調節因子は 温度感受性で、例えば温度感受性リプレッサーであってもよい。

この調節可能なプロモーターは、プロモーターからの転写を制御する温度感受性 λｃｌリプレッサーの遺伝子？付加的に有するＤＮＡフラグメントの一部として 挿入しつる、バクテリオファージλからのプロモーターであってもよい。このλ プロモーターはλＰＲもしくはλＰＬでもよく、とくにλＰＲでもよい。しかし 、この発明の原理にしたがってプラスミド１こ挿入されかつ温７７α外の外的因 子Ｉこ影瀞さｎる他のプロモーター系も採用できもすなわち、化学物質で誘導可 能２：ｌ）もしくは代謝物によって調節可能＋’ｊｌａｃ、ｔｒｐ及びａｅｏプ ロモーターのようなプロモーターである。

この発明のプラスミドの好巡な例は、そのプロモーター調節システムがそのプラ スミドの温度依存性の複製挙動を生ずるプラスミドである。特１こそのプラスミ ドが実質的φこ増大されるかもしくは制御されないプラスミドコピー数を示す温 度は、コピー数が低い場合の温度より高い温度である。その転写パターンが例え ば温度感受性リプレッサーの存在によって温度依存性である調河可能なプロモー ターな有するこの発明のプラスミドは、約３０°Ｃのごときひとつの温度で一定 の低いコピー数を示す。

というのはこの温度でプロモーターが抑制されその結果それからの転写が低いレ ベルに保持されるからである。一方約３６〜４２°Ｃのｉ囲の温度のようなより 高い温度では、その調節システムが不活化されるに至りプロモーターの抑制解除 を起こし結局プロモーターからの転写が増大されるので実質的に増大されるか又 は制御されないプラスミドコピー数を示す。ランアウェイ複製は約５９°Ｃ以上 の温度で行うのが好ましい。

以下の説明においては、その複製が温度感受性の調節システム、特に温度域受性 のリプレッサーによって制御されるプラスミドにだけ言及されているが、プラス ミドの複製が調節されつる他のタイプの条件も前記説明のように層像のしかたで 利用できる。

この発明のひとつのタイプのプラスミドは、調節可能なプロモーターが、プラス ミドのひとつの本来もっている復製調節遺伝子（ｎａｔｉｖｓ　ｒｅｐｌ−１ｏ ａｔｉｏｎ　ｒｅｇｗＬａｔｏｒｙ　ｇｏｎｅ）の一部の代りに挿入されたプラ スミドである。この明ａ苔と請求の範囲のためにかようなプラスミドはＡ型プラ スミドと命名される。このプラスミドがプラスミドＲ１の＄；４体であるとき、 そのプラスミドから除去される調節遺伝子はｏｏｐＢ遺伝子であり、これはプラ スミドの本来もっている複ｉ咀害剤のひとつを合成する遺伝情報を指定している 。このａｏｐＢ　ＪＩｌ伝子を除去するとプラスミドコピー数がわずかに安定し て増大する。かくしてそのプラスミドは約３０°Ｃ１ｃおいて約２０〜４０のコ ピーｌ薗抱、任ましくは２０〜３０コピーｌ細飽、特に２０〜２５のコピー／旧 胞を有する。しかし温度が約４０°Ｃに上昇すると調節可能なプロモーターのリ プレッサー機能が失活して複製が制御されな（なり、少なくとも約５００〜１０ ００コピー／細胞の範囲のプラスミドコピー数になる。このことは、なかでもプ ラスミド中に挿入された外米ＤＮＡフラグメントの大きさに左右され（ＤＮＡフ ラグメントが大きい程、形成されるプラスミドコピー数は小さくなる）、かよう な外来ＤＮＡ及び／又はそのプラスミドが形質転換されるべき微生物菌株の遺伝 子産物の効果である。しかしある場合には、そのプラスミドはより高い温度で数 千コピー数範囲まで生成することがある。いずれにしても全ＤＮＡ量に対する高 温におけるプラスミドＤＮＡ　看は約４０〜７５％で通常５０〜６０％である。

この発明の他のタイプのプラスミドは、約３０°Ｃの温度のごときひとつの温度 で約３〜５コピーｌ細胞のコピー数を有し、そして約４２”Ｃの温度のごときよ り高い温度では、前記の因子によって約少な（とも５００〜１０００コピーｌ細 胞、ある場合には数千コピー／細胞にまで達する制御されないコピー数を有する プラスミドである。かようなプラスミドは、そのプラスミドが本米有する単一も しくは複数の複製制ａ遺伝子の上流側に（ｕｐｓｔｒｅａｍ）に調節可能なプロ モーターを挿入することＳこよって得ることができる。この明細書と請求の範囲 のために、かようなプラスミドをＢ型プラスミドと命名する。プラスミドＲ１誘 導体の場合、調節可能なプロモーターはａ　ＯｐＥ遺伝子とＱ　Ｏ！ＩＡ遺伝子 の両者の上流側に挿入された。したがってプラスミドに上記コピー数パターン？ 示させるこれら両方の本来存在する運裂阻畜剤は、保持されたのである。しかし もしそのプラスミドがｐａｒ部位を欠くプラスミドである場合は〔プラスミドに 分配（ｐａｒｔｉｔｉｏｎｉ■）の原因であるその部位が存在するとそのプラス ミドは安定に遺伝されるという効果があり、この効果はｐａｒ部位中の１以上の 遺伝子に２囚する〕、そのプラスミドは、低温における低コピー数のために、低 温において約１％／世代の頻腿で失われる。したがって、そのプラスミドのラン アウェイ複製が確実に全細胞集団に連続して起こるように、かようなプラスミド にｐａｒ部位を挿入するのが有利であろう。

Ｂ型プラスミドには、大きなコピー数範囲？もっという利点が茄わる。低温にお けるコピー数は非常に低いので、その産物スミドに挿入することができる。この ことは真核逮伝子類の産物の場合に時々ある。これらの遺伝子は従来、例えば医 興産業において高い関心がもたれているものである。低温では複製速度が低いの で、外来遺伝子は少しも表現されないか又は細胞がそれによって損傷されないよ うな少量だけ表現され、そして通常の条件下低温で培養することができる。この ことは、いままで製造が全（不可能であるか又は非常に困難であったある種のポ リペプチド類の製造を著しく強化もしくは容易にするものである。

この発明の第３番目のタイプのプラスミドは、約３０°Ｃのごとさひとつの温度 で約０．５〜１コピーｌ細胞の範囲のコピー数を有しく数値０．５は複製の頻度 が１／絽胞周期より小さいことを意味すると解される）、そして約４２℃の温度 のごときより高い温度では上記因子によって約少なくとも５００〜１０００コピ ーｌ細胞、ある場合には数千コピー数範囲にまで達する制御されないコピー数を 持つプラスミドである。かようなプラスミドは、本来もっているひとつの複製調 節遺伝子の一部がその復製部位から切りとられ復製部位以外に、すなわちその遺 伝子が本来位置していない座位に挿入され、その複製部位に調節可能なプロモー ター−Ｐｇするプラスミドである。この明細書と請求の範囲ではこのプラスミド をａ型プラスミドと命名Ｔる。プラスミドＲ１誘導体の場合は、それからａ　ｏ ｐＢ遺伝子が切りとられ、そのａｏｐＢ遺伝子がそのもとの座位でなくてその復 製部位以外のＫａｏＲｌ　座位に再挿入される。たとえそうであってもｏｏｐＢ インヒビター蛋白はそのプラスミドの複製に対し、プラスミドが上記コピー数パ ターンを示すようなしかたで１７を与える。し２））Ｌそのプラスミドがｐａｒ 部位を欠いているプラスミドである場合、そのプラスミドは、低温において極端 に低コピー数であるため、低温では約５％／世代の頻度で張失する。したがって 、プラスミドのランアウェイ複製が全細胞集団に確実に連続して起こるようにこ のプラスミドにｐａｒ部位を挿入Ｔることは、Ｂ型プラスミドの場合より一層有 利であろう。低温と高温ソれぞれにおける複製挙動と、それ故にこのプラスミド を用いる利点は他の点ではＢ型プラスミドと同様である。

この発明は第２の態様として、複製部位からの転写を調節する第１の調節可能な プロモーターに那えて、第２のプロモーターがＪ現を＄２プロモーターで制御さ れる構造遺伝子を挿入させるし刀）たで挿入されたプラスミドご提供するもので ある。

この第２のプロモーターは制御可能であってもよい。すなわち第１の調節可能な プロモーターご調節するのと同様の手段によって、宿主細胞が培養される条件ご 調節することによってその機能ｅ調節することがでさるのである。ｌａａプロモ ーター、ｔｒｐプロモーター、ｄｓｏプロモーター、ｒｅａＡプロモーター、λ ＰＬプロモーターその他のごとき多数のプロモーターかこの目的に有用であると 現在注目されている。λＰＬプロモーターは温度感受性のＯＩリプレッサーで調 節され、それ故増幅条件が同じであり、その績果宿主ａ胞の培、養が単純化され 産物の増幅がプラスミドＤＮＡの増幅と同時に起こるので、構造遺伝子の表現を 制＃Ｔる第２プロモーターとして待に有利なことが分力）る。

また第２プロモーターはＳｌの調節可能なプロモーターと同一物であってもよい ことは留意されるべきである。

４２プロモーターは大型、Ｂ型及び０型の各プラスミ・ドに挿入できる。かよう なプラスミドは約３ｏ”ｃ’において、一定の低コピー数を有し、そして非常に 小さい遺伝子表現をもつか又は全（遺伝子表現を持たず、そして約３６〜４２“ Ｃの範囲の温度で実質的に増大されるかもしくは制御されないプラスミドコピー 数と、」３伝子表現？有する。このプラスミドとしては、３９°Ｃ以上の温度で 制御されないプラスミドコピー数と非常に諸い遺伝子表現２仔するものが好まし い。

この発明のプラスミドはクローニングベクターと産生ベクターとして使用するこ とがでさ、すなわち、工業や医薬用の広範囲のＱ品、特にポリペプチド類と通日 もしくはそのフラグメント、酵＄項及び酵素と栄誉培地中の化合物との反応によ る非蛋白ｐｐ物、ホルモン類のごとき低分子遺産・勿、韮びに核ｍ＝得るための 組換えＤＮＡ技術の分野に使用できるプラスミドであり、ａ核消伝子持に４乳動 物の遺伝子産物が特に重要である。クローニング産生ベクターとして有用である ためには、必須ではないが、プラスミドは、少なくともひとつの制御ＪＪエンド ヌクレアーゼに対しこのエンドヌクレアーゼによって切断しつる特異な座位牙イ イすることが有利である。この座位は、外米ＤＮＡのフラグメント？挿入すれば 、得られた組換えプラスミドを自律的に、１！製させ、かつプラスミドに挿入さ れた調節可能なプロモーターに複製部位の転写？調節させて、このプロモーター かラン転写が増大される際に、プラスミドコピー数が実質的に増大されるか又は 制御されな（なるに至る座位でなければならない。刀）くして復製部位に位置す る制限座位はクローニング座位としては許容できない。というのはこれはプラス ミドの復製性脂分失わさせるからである。

この発明のプラスミドは、副面可能ナプロモーターを、プラスミドに、このプロ モーターからの転写が復製を調節するよう１ｊシかたで挿入し、このように処理 されたプラスミド分、そのプロモーターからの転写か増大されるときに実質的に 増大される２））もしくは制御されないプラスミドコピー数？示すプラスミドを スクリーニングすることによって、同定することからなる方法で！１′ｉてられ る。調節可能なプロモーターかλＰＲであるときこのプロモーターは、プラスミ ドとファージＤＮＡを混合し、過当なエンドヌクレアーゼで制限し、熱で不活化 しそして混合勿？運店反応に付し、その連結反応混合物を微生物に形質転換する ことによって挿入できる。

力）ようなプラスミドの組立ては、プラスミド上の異なる座位１こランダムにプ ロモーターを挿入することによって行うことができる。調節可能のプロモーター ρ）らの増大された転写を保証する条件下で補御さｎない複製挙動をもつプラス ミド牙スクリーニングすることによって、正しい挿入が同定される。かようなプ ラスミドの血便なひとつのスクリーニング法は、檜々の条件においてプラスミド 保有細胞の成育性能ご分析することからなる方法である。徊主細胞中のプラスミ ドＤＮＡの量は異なる方法、特にそれ自体公知の方法のアガロースゲル電気泳動 法によって測定できる。このスクリーニング法は容易に高速で行われる。

Ａ型プラスミドの組立てｌこ関するこの発明の特定の態様において、その組立て 法は、ひとつの本来存在している調量遺伝子の一部とそのプロモーターを取り除 き、プラスミド’Ｒ１からのｃｏｐＢ　Ｒ伝子の場合は制８艮エンドヌクレアー ゼＢｇ１４よって切断し、そしてこの座位に調節可能なプロモーターを含む、Ｂ ｇｌｌフラグメントのごとき、ＤＮＡフラグメント？挿入することからなる方法 である。

Ｂ型プラスミドの組立て（こ関するこの発明の他の態様ｉこ２いて、その組立て 法は、プラスミドに、調節可能なプロモーターを本来存在しているＱ　９８！ｉ ！１　＠システムの上流側の位Ａで丁申入しくプラスミド）１１秀導体の場合は 、　ＢｇｌＩ［による部分的１４ｉｉｉ限によってｏｏｐＥ　ｉ！伝子の上流側 のＢｇｌ１ｇ位）こ）、連結し次いでエシェリヒア・コリのごとき問題の微生物 に形質転換することからなる方法である。またこのプラスミドは、部分的に切除 された本末もっている複製調節遺伝子を有するプラスミドを出発ｇＪ質として用 い、その本来もっている調節遺伝子をそのもとの座位に再ｍ人する（　Ｒ１型プ ラスミドの場合はｃｏｐＢ　逆伝千３ＥｇｌｌＬ座位に再叩入することによる） ことによって組立てることができるっ ａ型プラスミドの組立てに関するこの発明の第３の態様は、出発物質としてＡ型 プラスミド牙用いて、ひとつの本来もっているＡＶ３遺伝子を、それが野生型親 では位置していな１′Ｊ）つたプラスミドの部位に挿入しくＲ１型プラスミドの 場合は、＝、ａｏＲ１フラグメントとしてのｏｏｐＢａＪ伝子？プラスミドの傅 α部位以外ノＫＱＯＲＩ　座位１こ、　ｈＬ３ｏＲＩでの制限（こよって・７１ 人すること１こよる）、連侍しそして形質転換する０と′Ｄ）らする方法である 。

この発明の３４の１様は、調コ可能なプロモーターを申入するのに和えて、帛２ プロモーターを、このプロモーターによって表現が調節可能な溝造埴伝子の挿入 ？許容する適切な制限部位に、挿入することρ）らなる万＆である。上記のよう に、この座位はそのプラスミドの復長部位日に位置していてはいけない。

この発明のプラスミドはミニプラスミドである。Ｔｒｙゎち、それらの野生型数 プラスミドよりもかなり小さい。一般に約２．５〜１５．ＯＸ　１０　ダルトン のｉ市の大さぎで、多（の場合２．５〜１０．ＯＸ　１０　ダルトン、通常４． ０〜１２．５　Ｘ　１０　ダルトン、特に４．０〜５．ＯＸ　１０　ダルトンで ある。

公知のランアウェイプラスミドの非ｉｄ　’４１　ＩＮ　Ｈ挙動は、それが形質 転換される特定の細菌株、その組ｊが培湛される培地、及び挿入されるＤＮＡに 左右されるようである。この依存性は多分、公知プラスミドのランアウェイ復製 ＄効が部分的に、その転写速度をわずかに増大させるａｏｐＥグロモーター中の 単一ヌクレオチドを＝ａすること４こよって起り、そしてその転写速度がそのプ ラスミドに挿入される外米ＤＮＡのみならず、Ａ連する訓菌の棟と歯株及び／又 はその堵遥培地に関する環境変［ヒによって影響をうけることかあるという事実 によるものであろう。この発明のプラスミドは、強力戸外来プラスミドが活性化 ／抑制解除されるとかような変化か有意でないように転写速度コ増大させるので 、同様には限定されないようである。結局これらのプラスミドは広範囲の１株に 形質転換することができて、取扱う上で、公知のランアウェイプラスミドよりも 信積性が高い。

孟たこの発明には、Ｒ１以外の野生型プラスミド由来のプラスミド及び又は２． ０ｏｌｉ以外の１ラスミドｔ＆　ｌ’微生イカ中に見出されたプラスミドも倉ま れる。；た本末プラスミドを持ってぃない微生物中に保持されつる上記タイプの プラスミドを組立てることも考えることができる。いくつかの異なった微生物プ ラスミドのａ裂システムは多くの面で類似していることが示されている。例えば 、丁べての公知のプラスミドはもし復製コ起こしたいならば転写を必要とする。

この発明の原理を利用することによって、クローニングベクターとしてすでに使 用中でかつ所望の微生物で良好に機能することが知られているプラスミドがラン アウェイ挙Ｊ１優ることができるように、他のプラスミドに非副・卸の・１製表 現型を伝達することができる。かくして、調節可能なプロモーター例えばλＰＲ を、かようなプラスミド中の適正な位Ｉ直に、このプロモーターからの転写が復 製を調節するしがたで挿入することによって、非制御の復製かプロモーターから の増大した転写を保証する条件下で起るのである。

発明の詳細な説明 Ｒ１型プラスミドの復製制御システム 基本的レプリコン（Ｂａｓｉｃ　ｒａｐｌｉａｏｎ）現在まで、ＲＩ型プラスミ ドの複製制御システムは知られていない。プラスミドＲ１のａ裂と複製制御に必 要な遺伝情報が耐性トランスファーファクター内に位置する３つのＰｓｔｌフラ グメントからなる２５００４基対の長い部分に保有されていることが見出された のである（Ｍｏｌｉｎ　ｅｔ　＆１．．　：ｒ、　Ｂａａｔ、　１３８．１９７ ９．７Ｏ−７９）。

この部位は１ｉ、本釣レプリコン”と定義され、４つの重要な要素すなわち３つ の遺伝子（ａｏｐＡ、　ａａｐＢ及びｒｅｐＡ）と夏裂オリジンを有する（Ｍｏ １．ｉｎ　ｅｔ　ａｌ、　ＭｉｏｒＯｂｉＯＩＯｇｙ、　１９８１．４０８−１ １）。この基本的レプリコンの機能地図を第１図に示した。遺伝子ｒｅｐＡは復 製を行うため正に必要とされ名機能の遺伝情報を指定する。その遺伝子産物（そ のＤＮＡ配列による）は２７８のアミノ虐からなり分子童が約３３０００　ダル トンの蛋白である（Ｒｏｓａｎ　ａｔ　ａｌ、、　Ｍｏｌ。

Ｇ＠ｎ、　（）ｅｍｔ、　１７９．１９８０．５２７〜３７）ｏこの蛋白は明確 には同定されていないが、そのｒｅｐＡ遺伝子から蛋白を形成する容置は、１ａ ＯＺ遺伝子との翻訳遺伝子融合体を使用することによって明確に示された（Ｉｄ ｇｈｔ　ａｎｄ　Ｍｏ１ｉｎ、　Ｍｏ１．　Ｇｅｍ、　Ｇｅｎ５ｔ、　１８４． １９８１．５６−６１）。Ｉ’１ｅｐＡ　ｉｎの生化学的機能はまだ充分に探究 されていないがＲｓｐＡ蛋白は複製開始因子であると信じられる。

遺伝子ｏｏｐＡは、高度に二次構造ｅ−１−１する小さり（８０〜９０ヌクレオ チド長）不安定なＲＮＡ分子（すなわちそれはへヤピンループご形成している） 合成の遺伝情報を指定している（８ｔｏｕ−ｇｐｒｄａｔ　ａｌ、　、　Ｐｒｏ ｏ、　Ｎａｔｌ、　Ａａａｄ、　８ｃ＋ｉ、　ｔＴｓＡ　７８．１９８１．６０ ０８−６０１２）。

０ｏｐＡ−ＲＮＡは復製のインヒビターである。ＧｏｐＡ−ＲＮＡのヌクレオチ ド配列に影響する突然変異は増大したコピー数に導くことができる（ｏｏｐ突然 変異体〕。Ｑ　ＯｐＡ突然変異体のＤＮＡ配列分析によれば、すべての突然変異 が５つの橿基内のループ部分にきわだって群がっていることを示している。これ らの突然変異によって、野生型プラスミドに対するインヒビターの活性か著しく 減少するか又は全くなくなることになる。それ故に、そのインヒビターの特異性 はそのループ部分に存在すると結論することができる。またそのヌクレオチド配 列が知られているすべてのｃｏｐＡ突然変異体において、０ｏｐＡ−ＲＮＡ中の シトシンがウラシルで′、ｉ慢されていた（もしくはある場合はアデニンによっ て、、ｉ侯）ということは驚くべきことである。このことはσｏｐＡ−ＲＮＡが 核誦／核嘴相互作用によって作用することを強く暗示している。この、漬倫はさ らに、次の事実により強化される。すなわちその事実曇こよって野生型プラスミ ドに対してすべてのＧｏｐＡ活性を失ったこれらのｃｏｐＡ突黒変真黒変異体れ ら自身に対していくらかの０ｏｐＡ活性２床持しているということである。さら にこの野生型０ｏｐＡ−ＲＮＡは再々、ｃｏｐＡ突然変異体プラスミドに対する 阻害効果を減少している。それ故ａ　ｏｐＡ突然変異体はインヒビターで変化す るだけでな（標的のｃｏｐＴでも変化し、単一の橿基１１１換によって表現型的 に二重突然変異体（ｄｏｕｂｌｅ　ｍｕ−ｔａｎｔ）になる。　ａ　ｏｐＢ遺伝 子は分子１１１１，０００ダルトンの８６アミノ酸の１基性蛋白合成の遺伝情報 を指定している。この蛋白は多１形成される。ｃ　ｏｐＢ遺伝子とそのプロモー ターが欠失するとコピー数か８倍に増大するに至る。それ故ｃｏｐＢ　＆白は、 復製インヒビターとして、すなわちプラスミドＲ１の復製の調節において負に作 用する制御要素として作用Ｔると結論される（ＭｏＬｉｎ　ａｔ　ａｌ、、　Ｍ ｏ１．　Ｇｅｎ、　Ｇｅｎｅｔ、　１Ｂ１．１９８１．１２３〜３０）。

二重突然変異体（ｏｏｐＡｏｏｐＢ）は、いわゆるランアウェイ復製のために宿 主微生物に対して無条件に致死性である。したがってこの２つの制御遺伝子産物 は相乗的に作用する。

基本的レプリコンの転写活性 基本的レプリフン内に３つの転写開始座位がある。丁なわちａｏｐＢ　プロモー ター、ｒｅｐ人プロモーター（Ｉａｉｇｈｔ　ａｍ　Ｍｏ１ｉｎ、　Ｍｏｌ。

Ｇｓｎ、Ｇａｎａｔ、　１８４．１９８１．５６−６１）及びａｏｐＡ　Ｊ　伝 子のプロモーター（Ｓｔｏｕｇｚａｄ　ａｔ　ａｌｌ、　ｏｐ、　：ｉｔ、）で ある。原遺のものはその元の部位乃）ろハＩｘれて転写し、−万前の２者はもと の部位にむかって転写する。活局両ストランドはａ　ｏｐＡ部位ｉこおいて転写 される。

０ｏｐＢ　トランスクリプト（ｔｒａｎｓｃｒｉ′ｐｔ）はＱＱＩ）Ｂ　Ｊ伝子 ヲ通って続き、このトランスクリプトとｒｅｐ人グロモーター會こおいて始まる トランスクリプトの両者はｒｅｐＡ遺伝子を転写する。

ＢｇＩ　！［での制限によって組立てられてｃｏｐＢか除刀）れるとプラスミド Ｒ１のコピー数か８−１０倍管こも−Ｖ、Ｘ＋する。このことは意外なことであ る。というのはｏ　ｏｐＢ遺伝子プロモーターと００ｐＢ　ｊＷｎ：、４Ｅ子の 近泣都が除かれると、リ　（ｌｏｐＢ活牲が失われるとともにｒｅｐＡプロモー ターの抑制解除が３こり、２〕ｃｏｐＢプロモーターの全ｒ９ｐＡ謹現への寄与 が失われ、その債果、Ｉ４１　Ｘｊ’ｌ解除されたｒｅｐＡプロモーターかｃ　 ｏｐＥプロモーターρ）らの全ｒｅｐＡ　Ｎ写ご効果的に引継ぐ小らである。こ の全効果ｊｌ、ｒｅｐＡプロモーターがＱ　ｏｐＥプロモーターの強力以上に２ 倍項大した強力な有するので、ｒｅｐＡ遺伝子の転写速反が２倍たけ項７１ＩＯ Ｔる（こうがいない。

この明らかな逆説はｏｏｐＡ遺伝子の活性で説明される。０ｏｐＡ−ＲｌｉＡは 、−運のウリジン（ｔ］）で終っているステムご有する正常終結構造でｆｉ−舖 している。ＥｔｅｐＡ蛋白形説の０ｏｐＡ−ＲＮＡ制御はかような」正なら冬烟 ５こ左方される。対問するストランドの転写が強力な喝せは（収斂転写）、転写 の効率は減少する。ｒｅｐＡからの転写が増大すると０ｏｐＡ　）ランスクリプ トか約１５０−２００ヌクノオチドまで拡大する。この拡大しＦ　ＧｏｐＡ　ト ランスクリプトはり延庚インヒビメーどしてｊｉ　！ａ　化しない。丁な。ちそ れは実質的に不活化され、ＲｅｐＡ潰白１が増卯し、最終的ｌこプラスミドコピ ー数が増大する（ｓｔｏｕｇａａａ　ｅｔ　＆１．　、　ｚｕｎｏ　ｙｏ動ｍ１ １．１９８２゜３２３−３２８　）。

復製の制御 ２つの遺伝子ｏｏｐＡとａ　ｏｐＢからの産物はプラスミドＲ１の復製？負に制 御する。すなわちこれら産物は復製インヒビターとして機能する。ｒｅｐＡ−１ ａｏ　＠合体の組立てと分析７通じて、この２つの０ｏｐｉ伝子の産物がｒｓｐ Ａ遺伝子の表現ご負に制御して作用するということ分示すことができた（Ｌｉｇ ｈｔ　ａｎｄ　Ｍｏ１ｉｘ。

Ｍｏｌ、　Ｇｅｎ、　（）ｅｎｅｔ、　１８４．１９８１．５６−６１）。それ 故にプラスミドＲ１の復製は、このプラスミドの複製開始にたぶん正に必要な蛋 白の形成を調節することによって制御されているようである。

ｌａａ遺伝子融合によって、　ｏｏｐＡとｏ　ｏｐＢの産物が別個の標的？有す ることも証明された。０ｏｐＢ　ｉ白の標的はｒｅｐＡプロモーターであり、こ のＯｏｐ蛋白はｒｅｐＡプロモーターにおいて転写開始ご阻フイする作用を行う 。し刀）Ｌ、　ＧｏｐＢ蛋白はｒｅｐＡプロモーターの上流側で開始された転写 を妨害することはできない。０ｏｐＡ−ＲＮＡは転写には影響しないか、転写後 レベルで作用する。すなわちＲａｍ）Ａ−１！ｌＲＮＡの翻訳を阻害する。

ランアウェイ突然変異体の複製 公開ヨーロッパ特許出ｉ１男７８．１０１８７７．５号に開示されているプラス ミドのａ製システムは、野生型Ｒ１プラスミドについて上記したのと実質的に同 じである。この発明の発明者らによる新しい研究によって、ランアウェイ複製挙 動を有Ｔる温度依存性プラスミド突然変異体が存在する理由が一部確認された。

上記説明のように、ｒｅｐＡ遺伝子への転写が増大すると０ｏｐＡ−ＲＮＡ分子 の失活に至ることがめる。上記特許願に開示されたランアウェイ突然変異体プラ スミドにおいて、ｏｏｐＢプロモーターは、次に示すように配列しているうちの ひとつのヌクレオチドを１換することによって突然変異？起こす。

＆）　ｆｆ生型フラ７．　ｉ　ｌ’　５’　−−−−ＴＴｃＴＯＡＡＧＴｃＧＣ Ｔ−−−−３’ｂ）　ランフ’）エイ突然変異体　５’　−−ＴＴＯＴＯＡＡＧ Ｔ７’ＧＯＴ−−３メイタリック体文字がヌクレオチド償換？示す。認識されて いる部位はＲＮＡポリメラーゼ結脅座位である。

この突然変異は、ａ　ｏｐＢプロモーターからの転写を、特により高い温度で増 大させることが示された。

調節可能なプロモーターを有するプラスミドの複製この発明のプラスミドの組立 てには、この発明の発明者らが新しく得た身生型Ｒ１プラスミドの復製システム の知識ご利用することができた。しかしこの発明のプラスミド複製は、公開ヨー ロッパ特許ｌＩＡ第７８．１０１８７７．５号に開示のランアウェイプラスミド の場合のように、プラスミドの突然変異によってなされるのではない。その代り に、外来プロモーターか挿入され、その結果複製部位の転写が少なくとも部分的 にこのプロモーターで制御されている。このプロモーターは、宿主微生物が培養 される条件下での調節によって調節可能であってもよく、プロモーター活性の調 節は、培＃：温度又は培養培地の組成を変えることによるなどの種々の手段で行 ってもよい。

調節可能なプロモーターが温度依存性プロモーターの−４から選択されたひとつ のプロモーターである際は、λＰＲもしくはλＰＩ、持にλＰＲのようなバクテ リオファージλ由来のプロモーターが好ましい。ファージλにおいて、ＰＲプロ モーターはａｌリプレッサーによって制御され、このリプレッサーはこの発明の 原理にしたがって、ファージλからλＰＲとともに誘導され、Ｂｇｌ　１１　フ ラグメントの形態のプラスミドに挿入される（添付したプラスミド地図第４−１ １図塁照）。野生型ｃｌリプレッサーはそれ目体温度感受性ではない。そこで培 ４温ｌ？調節することによって４１製システムご調節可能にするために、用いた 特種０エリプレッサー（下記実施例参照）は温度感受性であり、突然変異体対立 遺伝子（ｍｕｔａｎｔ　ａｕｅ）　ＣＩ、、ヮによってコードされている（Ｓｕ ｓａｍａｎ　ａｎｄ　Ｊａｃｏｂ、　Ｏｏｍｔ、　Ｒａｍ、　Ａａａａ、　Ｓａ ｉ、　２５４．１９６２．１５１７）。

このリプレッサーは活性である。すなわちこれはλＰＲプロモーターを、約３０ ℃の温度のような低温で抑制するが、一方約６９°Ｃ以上の温度のごときより高 い温度では変性さｎて、そのリプレッサー成能が不活化されλＰＲの抑制が解除 される。その挿入されたプロモーターが非常に強力であると、その店来ｒｅｐＡ への転写が著しく増大し、次いで非制御プラスミド復製にいたる。

また、プロモーターの調節は化学的手段によって行うことができる。すなわち、 プロモーターを誘発する化学吻質？添加して例えばリプレッサー制御プロモータ ーの活性？不活性化させその糖果プロモーターの抑制を解除させるとか、又はプ ロモーターを活性化することになるプロモーター透発注の代謝物の形成？保証す ることによって、宿主微生物が培堡される培地の徂’ａｆｉ、を調節して行われ る。化学的に誘発しつるプロモーターの特例は、２つの染色体リプレッサー蛋白 すなわちｄｅｏＲＪ伝子とＣｙｔＲ遺伝子の産物によって頁制御？受けるＥ、　 ０ｏｌｉ　カ）らのｄθ０プロモーターである。このｉｅｏプロモーターは培養 培地にシチジンご添加することによって抑制を解除することができる。

というのはシチジンは、そのリプレッサーに対する親和性によって作用しリプレ ッサーの高次構造に変化を起こさせ、その結果リプレッサーがリプレッサーとし て機能するのご停止するからである。加うるに、正の制卸はカタボライトリップ レッション（ｃａｔａｂｏｌｉｔｅ　ｒｅｐｒｅａｓｉｏｎ）　ｆ通じてｄｅｏ プロモーターからの表現で行うことができる。サイクリックＡＭＰ　（ＯＡＭＰ ）によるａｒｐ畷白（カタボライトリプレッサー蛋白）の活性化によってむ〇プ ロモーターの活性が賦活される。高細胞レベルの。ＡＭＰは、低レベルのグルコ ースと相関関係があることが知られている。

すなわち培堡培地からのグルコースの欠如は限られた虚だけのグルコース、例え ば約０．０１％の虚を、グリセロールもしくはコハク１４とともに添加すること によって得られる。グルコースが’ｌＪ３によって消費されると、その糖果ａ　 ＡＭＰの細胞間レベルが増大してｄｅＱプロモーターを活性化しそのプロモータ ーを有するプラスミドの複製速度を増大させるに至る。かくしてｄｅｏプロモー ターがプラスミドＲ１誘導体中の。ｏｐＥ遺伝子の上流側に挿入されると、その プロモーターの透導によって複製が増大するかもしくは全（非制御になる。この 非制御復製挙動は、プラスミドのコピー数かプレインダクションのレベルまで徐 々に減少するよう］こ培イ培地にグルコースを添加することによって逆翫させる ことができる。化学的に調節可能なプロモーターのもうひとつの例は、栄養培地 中にラクトースを存在させることによって透見され、増大もしくは非制御の復製 １こｊＪ達させるｌａＯプロモーターである。この場合もそのプロセスは、ラク トースが最終的に′ａ胞によって消費されるような孟のラクトース？培地に添加 することによって逆転させることができる。

調節可能なプロモーターを有するＤＮＡフラグメントを、本来存在しているひと つの複！ｉ！調節遺伝子の一部分、例えばプラスミドＲ１のｏｏｐＢ　ａ伝子の 一部を占めるＢｇＬｌフラグメントの部分の代りに、適正な位置と配向で挿入す ると、そのプラスミドＡ導体の’、Ｊｌ’ＡＡ度は挿入されたプロモーターによ って少なくとも一部分が制御される（Ａ型プラスミド）。

調節可能なプロモーター２宵するＤＮＡフラグメントを、本来存在している４１ 製調節遺伝子のすぐ上流側に正しい配回で挿入すると、プラスミドＲ１透導体の ｏｏｐＢ　ＵＪ伝子の場合、わずかに異なる復製性能？有するプラスミドが得ら れる（Ｂ型プラスミド）。

上記のようにｐａｒ部位を欠くＢ型プラスミドは約１％／世代の頻度で失われる 。培養物中にそのプラスミドが存在するためのセレクションがないと、そのプラ スミドは約３０°Ｃで１祷される組’Ｉ＋１から最終的に喪失する。このプラス ミドを安定比するために、例えばＢ型プラスミド中の野生型Ｒ１プラスミドから のｐａｒ部位ＥＷするＤ１ｉＡフラグメントご挿入することもできる。

このようにして類似の条件下で培養される旧胞巾におけるプラスミドの完全な安 定性（喪失なし）がもたらされるのである。

プラスミドの安定性は次のようにして測定できる。最初に、ｐａｒ部位だけでｆ ｊ（ｌａｃ遺伝子が挿入されたＢ型プラスミドを有する則泡と、対照としてＬａ ａ遺伝子？もつがｐａｒ部位分もたないＢ型プラスミドをもつａ胞とを、出発コ ロニー中に両方のプラスミドが確実に存在するように、選択して抗生物質（その プラスミドが耐性を伝達する）を含膏するプレート上で培養する。次いで両者の コロニーの試料を全く尻生吻質コ含まｔいプレート上にストリークして、例えば ２５世代のような多数世代（細胞倍加）の間セレクションなしで成育するにま刀 ）せる。最後に、得られた両方のコロニーからのＭＨ＆とマツコンキイラクトー ス指示プレート（ｍａｏｏｎｋｅｙ　１ａａｔｏｓｅ　１ｎｄｉａａｔｏｒ　ｐ ｌａｔｅ）上にストリークする。そのプレート上において、　ｐ＆ｒ部位含有プ ラスミド’ｆｔ最初に有する細胞は赤色コロニーを形成してそのプラスミドが保 持されたことを示すが、一方ｐａｒ部位なしのプラスミドを最初に有する対照の 細胞は赤色と無色との両方のコロニーご形成し、セレクションなしの期間にプラ スミドかい（つかの細胞から喪失したことを意味する。このようにしてｐａｒ部 位の挿入されたプラスミドは完全に安定化されたことが示される（実施例１１参 照）。この安定化効果は、挿入ぢれたＤＮＡフラグメントが、プラスミド含有細 胞ごプラスミドご含有しない珊胞と比較して、その成長速度を減少さ、せる場合 に重要である。

最後に、プラスミドＲ１のａ　ｏｐＢ遺伝子のような本来存在している複製調節 遺伝子を有するＤｌｉＡフラグメントをＡ型プラスミドの復製部位以外の座位に 挿入すると、特別の亥裂性能？有するプラスミドが得られる（Ｃ型プラスミド） 。

Ｂ型プラスミドについて先に述べたプラスミドの安定性は、０型プラスミドにつ いて一層顕著に望まれることである。というのは上記のようにこれらＣ型プラス ミドは低温１こ３いて一層低いコピー敗分、イし、それ、Ｘｐａｒ部位を欠いて いる場合はＢ型プラスミドよりも高い傾度で失われるゆらである。０型プラスミ ドは、ｐＮｒ部泣が存在していないプラスミドの４合、ころにｐＩＬｒ品位３山 人することによって同様ζこ安定１ヒするここができる。

この発明の峙シ；１１の態様（こよって、次のよ・ラナプラスミドが提供される 。′ｆなわうそのプラスミドはＪ−の調節可２なプロモーターに加えて、プロモ ーターが、列えば所望のポリペプチド合成の遺伝情・服？指定する重大された外 来・構造遺伝子の表現を調節Ｔる復製部位以外、こ泣ユする第二のプロモーター を有Ｔるこの；肌１のプロモーターは、刀えばλｒＲプロモーダーとｏｌ遺伝子 とご追Ｊ’ＪＯして１−ＩＴるフラグメント上に位置するｑ■　プロモーターで もよい。そしてそのＣＩプロモーターはａｌ遺伝子産物で哨即されλＰＲの逆方 同に転写する。０■プロモーターによってその表現が調節されつる構造遺伝子ｆ 、ＱＩプロモーターの下流側（ｄｏｖｒｒ＋ａｔｒｅｍ）に挿入することができ る。−例として、ｌａｏプロモーターを欠＜　１ｈａ　遺伝子（ｌａａオペロン として知られている）がａｌ遺伝子の下流側に遡入されたが、得られた遺伝子産 物の４′、４から、１ａｃｉＪ伝子の転写は、少な（とも一部分がＯｆプロモー ターによって制御されていることか示唆された＜’ｘ笥ｈ”＞＝雰１”ｆｆ　） 。小（して、この発明Ωプラスミド栄、外来；１伝子１西入７１１のクローニン グベクターとして用いることができることが示さ；′１、た。この０■プロモー ターはＯＩ　リプレッーＧこよっても調節”Ｔ胎でシリ、その店果遺伝子語物の 一＄扇がプラスミドＤＮＡの増幅と同時に起こるという利点３荷する。

また第二プロモーターはλ九のようなλプロモーターでもよく又）まｒｏａｈプ ロモーターであってもよい。第二プロモーターがλＰである場合、このプロモー ターは、ファージλからのＢａｍＨＩ−Ｂｇ１ｍフラグメントとしてプラスミド にｒ４人することができ、カくシてＢａｍＨｌ、　ＢｇｌＩ［、３ａｕ３Ａ及び Ｂａ１ｉのようないくつ力）の制＠酵素で生成され７１：ＤＮＡフラグメントの 挿入用に好都＠なりローニング座位（ＢａｍＨＬ）　”ｅ産生する。またλｐＬ は、このプロモーターを有するプラスミドからの適当なりＮＡフラグメントに挿 入してもよい。またλＰＬは、項線条件が同じであるように温度感受性のａｌレ プレッサーによってｆｉｌ制御されるので第二プロモーターとして有利である。

−万プロモーター力ｓ　ｒｅａ人の場合、例えばＰＥＭ’ｆｆ１４　（Ｕｈｌｉ ｎａｎｄ　Ｏ１＆ｒｋ、　Ｊ、Ｂａａｔ、　１４Ｂ、　１９８１．３８６−９０ ）からのＢａｍＨＩ　フラグメントとしてこの発明のプラスミドを挿入してもよ い。このプロモーターは、ｒｅＯＡプロモーター保有プラスミドが形質転換され た微生物菌株によって異なるしかたで機能Ｔる。ｒａｏＡ菌株中でｒ＠ｏ＾は１ ｅｘＡリプレツサーによって制御さｎｌこのリプレッサーはその微生物の染色体 上に位置している。例えば非制御複製か温度で誘導される場合、プラスミドのコ ピー数としたがってｒｅｏＡプロモーターの数とか徐々に増加する。ＩＩＩＸＡ リプレッサーは、少′！瀘生産するだけでありそしてｒｅａ人プロモータ一部位 に強固に結合する０とによって融能するので、　１ｅｘＡリプレツサーの利用し うる瀘は、コピー数が増大するにつれて徐々に滴定される。このようにして、ｒ ｅｃムが禄々１ζ抑制解除され、プラスミドコピー数が高くなるとｒｅＯＡから の転写ρＳ対応して増大する。

クローニング及び虚壬ベクターとしてのこの晃−男のプラスミドこの発明のプラ スミド類は、クローニング及び産生ベクターどしてのま能、こ３いて矢のような チくの特徴を有する。

１）こ几らのプラスミド類は分子省が約４．０〜１２．５　Ｘ　１０６グルトン で小さい◇のである。サイズが小さいので我扱いに使柄で２ｂつ彫ｉ玩茨効皐が 同上する。

２）これらプラスミド類は制限エンドヌクレアーゼ瑣に対する特異な座位企多致 有Ｔる。“特異な゛の用語はひとつの特異制限コーンドヌクレアーゼに対してそ のプラスミドかその酵素によって切断可能なひとつのそしてひとつだけの座位？ 竹すること２急味するものである。

すで１こ述べたよっ化、腐袈部位内ζこ位置する制限）ｙ位はクローニング座位 としては許容できない。かくして下記実施例に＝ｃ！械のプラスミドにおし）て 、ｂｊ限座位の５ｄｌｌとＰｓｔｌとは、プラスミドのレプリコン甲に位置して いるのでクローニング座位としてｉ切でなく、−万制限座位のＥｏｏＲＩ　とＢ ａｍＨＩ　とはこの４（要な部位中に位置していないので外来ＤＮＡの尋人に有 用な座位を形成する。爾切な制Φ座位かプラスミド目体に見出されない場合は、 かような座位を有する小さなＩＩＨＩＡフラグメント（リンカ−として知られて いる）を実施例４に記載のようにして１ラスミドに迎入して組立てることかでき る。

しかしながら挿入された構造遺伝子の表現を確実に行わせるだめに、構造遺伝子 自体の上流側で第２プロ玉−ターの下流側に位ｉ１Ｔる適当な翻訳開始シグナル （リボンーム結合座位）を有する必要もある。

リボンーム結合座位の存在を保証するひとつの方法は種々のＤＮＡフラグメント （例えばリンカ−のごとき）を挿入する方法である。そしてこれらのフラグメン トは合成で作ることができて各々異なる構遺遺伝子に対する翻訳開始シグナルを 有する。一方、微生物にて表現されることがすでに知られている遺伝子含ＢＤＮ Ａフラグメントを完全にランアウェイクローニングベクターに挿入してもよく、 かくして適正な翻訳開始シグナルの存在が保証される。

３）上記のように、できるだけ小さいクローニングベクターご有するのか有利で あるが、そのクローニングベクターが、プラスミド官有細胞の同定及び／又は選 択に有用ないわゆるマーカーの表現用の遺伝子を有することが多くの目的にとっ て実用的である。最も有用なマーカーは、例えばアンピシリン耐性のような抗生 物質耐性である。というのはこれは組換えプラスミドを微生吻償主に形質転換す る処理をした後、その組換えプラスミドを受け入れなかった微生物を容易に逆選 択することができるからである。下記実施例に、ｉ１２載のすべてのプラスミド に存在する他のマーカーは　ＣＩ遺伝子１こよって暗号化恣れているλ免疫であ る。この発明のプラスミドのさらに宵、用な法１は、特異な座位がそのなかに位 １している、選択可能な表現型を伝達する遺伝子が存在していることである。

この座位にＤＮＡフラグメントを挿入Ｔるとその遺伝子の挿入失活が起こる。こ の例としては、Ｌａａ＋表現型モ伝１する遺伝子については実耐例９（こ、クロ ラムフェニコール耐性牙暗号化している遺伝については実施例１２に記載されて いる。

マーカーク１えば抗生物質）耐性を、クローニングベクターとして用いら几るべ きこの発明のプラスミドに導入したいときは、転位（ｔｒａｎｓｐｏｓｉｔｉｏ ｎ）によるか又はそれ自体公知の方法で外米ＤＮＡフラグメント？挿入すること によって行うことかでさる。

かよう１ｊ転位の例は実施例４に示す。

・竹ユ）ミ方ｔｌミ この発明はまた、Ａ節可能なプロモーターが、転写が複製ごＡ節するようなし刀 ）だ、持にプロモーターからの転写か増大するとプラスミドコピー数がＡＫ的に 増大Ｔる２：ｌ）もしくは非制御（こなるようなしかたで挿入されたプラスミド を有する微生物を４ＪＬ、２’ａ可ｍ１１プロモーターからの転写の増大を保証 しその舖果プラスミドコピー数が実質的に増大Ｔるかもしくは産制・ＩＩｃなる 一ｊ！件下での少なくともひとつの培Ａ期分仔し、次いで攻生−’：’Ａ　”ｄ 　ａ吻２：ｌ）らプラスミドの遺伝子産物を収］することからなる、プラスミド ＭＡの遺伝子産物の製造法を提供するものである。堵従自体は、１司ｊの微生＠ 種に最適なことが知られている通常の栄ａ−ｇ地？含む通常の技術を用いて適切 に行われる。

またＸ１伝子産甥の収膚は、製造された特定の遺伝子産物の本質と性貫、宿主歳 午吻の性貞などに通する公知の方法にしたがって行われる。この発明はさらに、 この発明のプラスミドが鵬胞の所望数が得られるまで、接擁と増殖の段階におい て一定の低コピー数Ｊこμる条件下で形質＃ｉ摸された宿主微生物を培弄し次い でその宿主微笠吻ご、プラスミドコピー数が実質的に壜入するか又は非制御ｔこ なる条件下で培養する方法ご提供するものである。

したがって、培養は、はじめに、プロモーターからのどんな転写もプラスミドの コピー数に有意に７彫響しない条件下で行ってもよく、その後プロモーターの活 性分誘発する物質を、堵フ培地に、実質的に夏裂か増大するか又は非制御になる 澁で添加される。所望により、これらの培養条件は、プラスミドの実質的な増福 を得るのに充分を期間であるか、改生物培：ａ＠の実質的な損傷ご回避するのに 充分短かい期間の後に逆転させてもよい。前記物質は培養媒体から除去されると プラスミドコピー数が最終的にプレインダクションレベルに到達するまで徐々に 減少するにいたる。ここにおいて、１除去される”の用語は、問題の吻貢ご培λ 媒体から完全になくすことを意味する必要はないか、その勿筑がもはやいかなる 効果も有しない程度の１度にまで減少させるｌこＴぎないことな意味する。

ある物質によって誘発されるよりもむしろ阻害されるプロモーターを用いるもう ひとつの方法において、微生物培養物は最初、使用される特定のプロモーターの 活性を阻害する一ｖＪ賞の存在下で培嗟されてもよく、その後、その＠質の４度 ？、例えば４膚媒体？希沢するか又は徐々に討胞ｉこよって消謹させるかによっ て、プロモーター？活性化させるにいたる程度に減少させ、その舖果、プラスミ ドコピー数に実質的に増重さ丁か又は非制御にさせる。所望により、この培１条 件は、プラスミヒのＡＳ的な増逼？得るのに充分な期ト」であるが讃生吻−！Ａ 物の実彦的損傷を回避するのに充分急い期間の後プラスミドコピー数がプレイン ダクションのレベルに到達するまで徐々に減少するにいたる量でプロモーター活 性の阻害力λを、添加することによって置き換えてもよい。

また微生物を培養Ｔる条件にｒま、プラスミドコピー数が実質的に増加するか又 は非ＤＩ＃になる温度かその近傍温度におけるある培養期間が少な（とも含まれ ていてもよい。

調節可能なプロモーターが＠１依浮性か又は１１濃受性の因子で調節される際は 、この発明のプラスミドで形質転換された微生物の生産規模の培養物までの増殖 は、増加するプラスミドと遺伝子産物のよ１ｆ８こよる故生物式育のどんな用言 をも避けるために、プラスミドが一定の低コピー故壬示す温度又はその近傍１度 で行うのが好ましい。次いでその温度を、プラスミドがＩ質的に増大もしくは産 制−のコピー数を示す温ｙに変えてもよい。生産期ｌ！ｌは、致午例の成育がプ ラスミドからのプラスミドＤＮＡ及び／又は遺伝子の産物によって阻害されるま でのことが多いが、適切な生産期間の後、遺伝子産物の収１か行われる。

特定の条件によっては、プラスミドの遺伝子産物の１か増大する（次いでこの産 物は培養物から連理的もしくは間欠的に収攬できる）とともに、宿主微生物が存 続し成育し浣けることができるように、プラスミドコピー数か実質的に増大する か又は非制御状態薯こなる温度にごく近い温プで」銹的に當帝培傳を行うことが 好ましい場合がある。

一方その微生物は、プラスミドコピー数が一定である温度で用度規模の培養まで 増殖させてもよい。次いで温度をプラスミドコピ一式が尖ス的Ｊこ鳥人するか又 は非瓶御になる１ｇもしくはその近傍の温度に変える。次いでプラスミドの実Ｓ 的増幅を得るのに充分な期間であるが微生物培地のいかなる実質的損傷を避ける のに充分垣乍い′ｉＡ間、前記温度を保持する。その＆温度を、−主の低いプラ スミドコピー数を保証する温度にもう−ｒｉ変化させ、プラスミドコピー数牙徐 々に減少させる後者の温度で、該コピー数が最明のレベルに到達するまで逗産培 逼を続ける。この層養法は、プラスミドに油入される外来遺伝子が、約３０″Ｃ より高い温度では生存できない生物力）ら白米のものであって、その請来かよう な遺伝子の遺伝子産物かより高い温度で変性され名ことがある場合、特に１要で ある。さらに、この培誓法を採用すると通′Ｓ％雀伝子産物の収率が高い（実施 例１６参照。Ｔｈ１ｉｎ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｇｅｎｅ　６．１９７９．９１−１ ０６．　＄１１表を比破せよ）。

プラスミドコピー数か実質的に増大するｎ）・６１．＜は非制御になる温度は、 プラスミドが一定で低いコピー数を有Ｔる温度よりも高くてもよい。この高い温 度は例えば約６６〜４２°Ｃの範囲のＩａＬ？である。

図面の説明 次に図面：２説明Ｔる。

第１図は爵生長プラスミドＲ１の復製６位の概略図である。

第２図は下記第３〜１４図Ｑご用いられている記号の手引きである。支び 第３〜１４図は冥ｎ例もこ記載のプラスミドの制限地文を示Ｔ０４１　ａ　ｉこ 、プラスミドＲ１のｉ、本釣レプリコンの概略図か示され、その中の縦線を入れ た部分は翻訳された部位（ｔｒａｗｌａｔｅｃＬｒｅｇｉｏｎ）　ａ’意味し、 ブランク部分はトランスクリプト企意味し、点線部分は可能なトランスクリプト ご意味する。丸の中にヘヤピンル−１め拡大図が０ｏｐＡ−ＲＮＡ　の高度の二 次構造？説明するために示されている。Ｏｒｂは＝裂のオリジンを示す。水平の 矢印は転写の方向と意味する。

第２図；こ下記茅３〜１４図に用いられている記号の手引きモ示した。ＡはＲ１ 型プラスミドからの工ｒＡｉ、Ｂはバクテリオファージλ（ｘｎλ４）白米のＤ ＮＡ’Ｐ、ＣはＴ！１３　）ランスポゾン（ＥＤλＴｎ３　ｚｚらの〕からのＤ ＩＡＬ、ＤはプラスミドｐＢＲ，！ｉ２２刀）らのＤＮＡを、Ｅはプラスミドｐ ＭＯ８７１からのＤＮＡを、７はプラスミｌ’　ｆ）７１１１４２４　カラノＤ ＮＡｇ、ＧはプラスミＦ　ｐｓＫ９１０４　カラのＤＮＡを、旧ゴ楢這送伝子と 重要な５位２、工は転７方回の表示を付したプロモーター？、及び＋Ｔはプラス ミドの大きさのスケール？それぞれＸＫ味−ｆる。ブランク部分はプラスミドｐ ＥＥＵ１４からのＤＭＡを意味Ｔる。

２３〜１４図）こけ各５（施例に５己戟のプラスミドの口線卵ｊ限地図が示され Ｒ１型プラス′ミドの遺伝子型は水平線上に記入して示されている。し２こがっ てｃｏｐＥ４ま、ｃｏｐＢ通伝子遺伝　ｏｐＡ遺伝子との間のｒｅｐＡプロモー 、ターからの転写で抑制Ｔるポリペプチド置数の遺伝子情報２指定する遺伝子を 示す。ｃｏｐＡはＦ、ａｐＡ−ｍＲ４（Ａのｉ訳ご阻害するＬ（４ＪＡ分子をコ ードする遺伝子２示す。ＯｒｉはＨ”Ａの増殖型オリジン蕾示す３ａｐｈＡ　は カナマイシンに対する耐性な暗号化する遺伝子ご示す。ｂｌａはアンピシリンに 対する耐性Ｔｉ：ｖｉ号化する］λ伝子を示Ｔ６１ａｎＡとｌ＆ｏτと１ａａＺ は挿入され７’ｚｌａＯオペロンご示し、　１ａａＡはトランスアセチラーゼ、 １ａａＹはパーミアーゼ及び１ａｏＺはβ−ガラクトシダーゼそれぞれの甘酸の 遺伝情報を指定Ｔる。”　８５７　はλＰＲプロモーターの温度感受性リプレッ サー合成の遺伝情報を指定する遺伝子分示す。ｔ　ｎｐＲとｔｎｐＡはＴｎ３ト ランスポジション械１シをコードＴる遺伝子を示す。ｐａｒはプラスミドの分配 の１３５を因である部位を示す。ｒｅＱＡは組換え蛋日の遺伝情報を指定Ｔる遺 伝子を示す。またｐｒｅｃＡはｒｅａＡプロモーターを示す。

水平−の下側には制限酵素の座位が示され、ＰはＰｓｔｌを、Ｂ２はＢｇｌｉ　 ｆ、Ｓ、はｓａｌ　Ｉを、ＥはＩｃｅ　ｏＲｌ　を、Ｒ３はＨ１ｎｄ厘　ご、Ｅ ａｍＨＩ座位との融合体を、０は０１ａｌをそれぞれ意味する。第１１図に２い て、記入されているプラスミドは他の図中のプラスミドと同じスケールで画かれ ている。括弧でかこんで挿入した部分は挿入されたｌａａ通伝遺伝示Ｔ０原料と 方法 用いたエシェリヒア・コリに一１２菌株は０８Ｈ５０であった（Δｐｒｏ−１ａ ｏ　、　ｒｐｓＬ　ｉ　ＪｌＭｉｌｌｅｒ　＋　時ｅｒ論ｎｔｓ　江Ｍｏ１ｓｅ ｕｌａｒ　Ｇｅｎｅ−ｔｉａｓ、０ｏｌｄ　９ｒｉｎｇ　１ｋｒｂｏｒ　Ｌａｂ ｏｒａｔｏｒｙ、００１（ｌ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ 　。

１９７２）。いくつかの１ラスミド（４４１ｆｆ）とバクテリオファージ（第２ 表〕が用いられた。

用いた実験技術は、未生物遺伝学の分野で用いられる標準技術（Ｊ、　Ｍｉｌｌ ｅｒ　：　Ｄｃｐｅｒｉｍ＠ｚｔｔａ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅ６ｕＬａｒ　Ｇｅｍｔｉ ａｓ、　ＯｏＭ　険１ｎｇ　Ｈ＆−ｒｂｏｒ、　Ｍｍ　Ｙｏｒｋ　１９７２）と 遺伝干燥作法（Ｄ＆ｎ１ｓｈ、　Ｂｏｔｓｔａｉ　ａｎｃｌ　Ｒｏｔｈ　ｉＡ　 ｍａｎｕａｌ　ｆｏｒ　Ｇｏｎｅｔｉｃ　二場１ｎ・ｓｓｒｉｎｇ　；　Ａｄｖ ａｎｏｅｄ　玉ｏｔｅｒｔａＩＧ＠ｎ１ｌｔｉｏ＋！０ｏｌａ　Ｓｐｒｉｎｇ　 館ｂｏｒ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　１９８０　）であった。

丁べての’ａＭ　ａｉａ　＋１、ＬＥ　４ｍ　（Ｅｅｒｔａｎｉ、　、７．３ａ Ｑｔ、　６２．１９５１．２９３）又はＡ”Ｂミニマル培地（Ｏｌａｒｋ　＆２ １ＩＩｉＭａａｌ（ｐｅ、　Ｊ、　１Ｊｏｌ、　Ｂｉｏｌ、　２３．１９６７゜ ９９）中でｑｔされた。そして用いたプレートはＬＢ号地と１．５％基天含Ｈの ＬＡプレートでめった。プラスミドの装造と分析は、ＳｔＯ携驕ｒｄ　ａｎｃＬ 　Ｍｏ１ｉｎ、　Ａｎａｌ、　Ｂｉｏａｈｓｍ、　１１８．１９８１．１９１に 記載の方法奢こしたがってｄｙｅ　ｂ６７＆ｎｔ　ｄｅｎｓｉｔｙ　ｇｒａｄｉ ｅｎｔ　ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ法？用いて行つに。プラスミドイ辻」」 定のためのＤ　ＮＡの標識と浴屏＞７ｉ＋勿の・授遣は、Ｍｏ１ｉｎ　ａｔ　ａ ｌ、、　Ｊ、　Ｂ＆ｏｔ、　１３８．１９７９．７０にしたがって行った。プラ スミドＤＮＡの相対同寸は、グラジェント中の染色体バンド千のそれに対するプ ラスミドバンド中に存在する標−哉されたチミジンの）よとしてン珪り疋された 。

ノミ施ヅ］１こ用いた制御ｄエンドヌクレアーゼ追は製造メーカー提供の現尼壷 こし１こかつて匣用した。部分制限は酵素の１０借希釈剛で行った。

さらに下記のスクリーニング法分用いた。

１、　λ免疫性（ｉｍｍＪ”）についてのスクリーニング記載された全Ａ彪例に ３いて、”８５ヮ突然変異体の対立遺伝子を用い１こ。この遺伝子を相゛するプ ラスミドは、宿主のエシェリヒア・コリのｆｉｒｌｌｔｉ−３０”Ｃにおける浴 困ファージの！′８染に対し耐性にする。Ｉ耐性ｎＨｉＪを珈択するために、油 清ごプレートにひろげるｊ！ｉＪに１０Ｌ１以上のλｂ２ファージの粒子？那え る。生存しＣいるコロニーとさらにそれらのプラスミド−途について試験し２、 ｏｏｐＢ−についてのスクリーニングｌａｃプロモーターが除去されたｌａｃオ ペロンとｒｅｐＡプロモーターとの遺伝子融合体コ組立て次いでｐ１５プラスミ ド（ＰＧＡ４６）に挿入される。ひとつの得られたハイブリッドプラスミドｐＪ Ｌ２１７は、Δｌａｏ宿主のエシェリヒア・コリ菌株中に存在するとＬａａ　表 現型の原因である。

Ｌａａ　ｆｉ現型は、マツコン牛イラクドース指示プレートで容易に検出される （赤色コロニー〕。ｐＪＩ＋２１７　”ｘ有するａＪ泡中にａｏｐＢ＋遺伝子が 存在するとＬａａ−表現型になり該指示プレート上に白色コロニーとして現れる 。カ（シて。ｏｐＢ＋ハイブリッドは、プラスミドＤＮＡがプラスミドｐＪＬ２ １７　ｆ有するエシェリヒア・コリΔｌａｏ細胞に形質転換されるとき、Ｌａａ −コロニーとして容易にスコアされる。

第　１　表 使用したプラスミド類 １）ＫＮ１５６２　Ｓ、　Ｍｏ１ｉｎ　ａｔ　＆工、、　Ｊ、Ｂａｏｔ、、　１ ３８．１９７９．　ｌ）ｐ、　７０−７９゜ｐＢ１３２２　Ｆ、　Ｂｏｌｉｖａ ｒ　ｅｔ　ｍｌ、、　（Ｊａｍ　２．１９７７、　Ｌ　９５゜ｐＪＬ２１７　ｒ ｓｐＡプロモーターを有するｐＫＮ１５６２からの５ａｕ３Ａフラグメントｉｐ 、ＴＬ２０７のＥｇｌｌ座位に挿入して組立てられた。ｌａａプロモーターなし のｌａｏ遺伝子分有するハイブリッドプラスミド。

ｐＯＵ１６Ｌｉｇｈｔ　＆ｎｄ　Ｍｏ１ｉｎ、　Ｍｏ１．Ｇｅｎ、　Ｇｅｎ５ｔ 、１８４．　１９８１．　ｐ。

第　１　表　（涜き） ｐＧＡ４６　Ａｎ　ａｎｄ　Ｆ’ｒｉｅｓｅｎ、　Ｔ、　Ｂａａｔ、１４０．１ ９７９．　Ｗ、　４００〜４０７゜ Ｉ−＋１ＪＯ９０３０ａｓＩＭ３Ａｂａｎ　ａｔ　ａｌ、、　Ｊ、　ｈａｔ、　 １４３．１９８０．　ｐ、　９７１゜ｐ　ＩＪ○３７１０＆８ａｄａｂａｎ　ｏ ｔ　ａｌ、、　ｏｐ、　ｏｉｔ、、　９７１゜！−Ｖ１（１４２４プラスミドｐ ＶＨ１７つ）らのｄｅｏプロモーターを有する　５ａｕ３Ａフラグメント（Ｖａ ｌｅｎｔｉｎ−Ｈａｎｓｓｎｅｔ　ａｌ、、　ｍＭＢｏ　、Ｔ、、　１９８２． ３１７）　’Ｅ”、プラスミドｐＭＯ１４０３のＢａｍＨＩ座位（Ｏａｓムｂａ ｎ　ｅｔ　ａｌ、、　ｏｐ。

ａｉｔ、、　９７１）に１申入するＰ、　Ｖａｌｅｎｔｉｎ−Ｈａｎｓｅｎ法１ こよって組立てられた。

ｐ３Ｋｓ１０４　１ａａプロモーターとｐＭ１３ｍｐ７　ＸＩＤらの翻訳開始部 位を汀するＰｉｒｕ　１　フラグメント（Ｍｅａｓｉｎｇｅｔ　ａｌ、。

Ｎｕａｌｅｉｏ　Ａｏｉｄａ　Ｒｅｓ、　９．１９８１．３０９）　ｆ、ｐｌＪ Ｑ　１４０３のＳｍ＆ｌ座位に挿入し、次いで１ａｏＺセグメント間に対応組換 え？行う、Ｍ、　０ａａａムｂΔｎ法によって組立てられた。

ｐＫＮ１ａ４　Ｎｏｒｄｎｔｒ６ｍ　ａｔ　ａｌ、、　Ｐｌａｓｍｉｄ　４．１ ９８０．３２２゜ｐＪＬ３　Ｍｏ１ｉｎ　ａｔ　ａｌ、　、　Ｍｏｌ、　ｇｅｎ 、　Ｇｏｎｅｔ、　１８１．１９８１．１２３−１３０゜ｐＶｌｉ　１４５１　 Ｖａｌｅｎｔｉｎ−Ｈ＆ｎ５ｅｎ　ａｔ　ａｌ、、　ｏｐ、　ｃｉｔ。

ｐＢＥｉυ１４　ＩＪｈｌｉｎ感０１ａｒｋ、　Ｊ、　ｈｏｔ、　１４Ｂ、　１ ９８１．３８６−９０゜ｐＭＯ１４０３０ａｓａｄａｂａｎ　ｅｔ　ａｌ、、　 Ｊ、　ｈｏｔ、　１４３．１９８０．９７１゜第　２　表 使用したバクテリオファージ ＥＩ）λ４　Ｄｅｍｐｓｅｙ　ｓ　Ｗｉｌｌｅｔｔｓ、　、ｒ、　Ｂａａｔ、　 １２６．１９７６、　ｐ、　１６６゜ＥＤλＴｎ３Ｎｏｒｕｔｒ′６ｍ、　Ｍｏ １ｉｎ、　Ａａｇａａｒｄ−Ｈｓｎｓ＊ｎ、　Ｐｌａｓｍｉｄ、　４゜＋９８０ ．　ｐｐ、　２１５−２７゜ プラスミドＰＫＭ１５６２は、その後の研究によって付は加えられた若干の改変 ？除いて、Ｍｏ１ｉｎ　ａｔ　ａｌ、　；　”Ｏｌｕａｔｅｒｉｎｇ　ｏｆ　Ｇ ｅｎｅｓＩｎｖｏｌｖｅｄ　ｉｎ　Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ、　０Ｏｐ７−ｂｅ ｒ　０ｏｎｔｒｏｌ、　ｌｎｏｏｍｐａｉｔｉｂｉｌｉｔ７゜＆ｎｄ　５ｔａｂ １ｅ　Ｍａｉｘｔｅｎａｎａｏ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｒｏｓｉｓｔａｎａｅ　Ｆｌａ ａｍｉｄ　Ｒ１ａｒ６−１９”、Ｊ。

扼ａｔ、　１３８．１９７９．　ｐｐ、　７０−７９ζこ記載されているのとす べての主要部で同速にして組立てられたプラスミドＲ１の誘導体である。

１）ＫＮ１５６２は６．９　Ｘ　１１］’ダルトンの分子盪を有し、ｃｏｐＡ” 、ｃｏｐＢ”、ｒｅｐＡ”、ａｐｈＡ”　、△ｐａｒの遺伝子型を有する（第３ 図３照）。これｔマカナマイシン附性モイする。このプラスミドは野生型プラス ミドの一１裂性能ご可し、３−５７高速成育細胞のコピ一致を有し、かつｐａｒ 遺伝子（分配のための遺伝子）を欠いているので１％／世代の頻度で失われる。

ｐＫＮ１５６２−＝　Ｂｇ’Ｈで刊１貝してｃｏｐＥ　遺伝子の一部を除去し、 その付看凋？店合することによって他のプラスミドｐＪＬ２Ｑが組立てらｎる。

このプラスミドの分子寸は６．７　Ｘ　１０６　グルトンであり、遺伝子ｇｉ− 、ｏｐＡ”、ΔｃｏｐＢ　、　ｒｅｐＡ”、ａｐｈＡ”、Δｐａｒである。この プラスミドは２５−４０　／高速成育細凰のコピー数を有し、このプラスミドの 喪失はない。このプラスミドもカナマイシン耐性ご伝達する。

プラスミドの命名 ム本出願の実施例及び図面にｐＪＢＬ・・・と命名されたプラスミドは不出願に ２いてはｐＯＵ・・・にデえられた。

、ノー≦ａ七１０１ ｐｏｔＴ５ｉの１立てと、ＩＯ注表示 プラスミドｐＪＬ１２０とファージコＤλ４かろのＤＮＡが椋孕法にしたがって 裂遺さ九に。プラスミドとファージＭＡこか各々２０μｆｏｗｌの最終（ぐ友と １００μｌ　Ｌ：’）最終容積で混合され、Ｂｇｌｌで３０分間制限され７０“ Ｃで１０分間加悪口て不活化さｎ１Ｔ４ＤＮＡ　Ｖガーゼで一夜１５℃で連結さ れた。この連結反応混合ｇＪ企エシェリヒア・コリ菌株Ｃ３Ｈ５０に形質転換さ れた。その形質転換細胞は、ｆＪｌｏ　の２１２粒子の懸濁液をひろげた５０μ ｆ／Ｈ１のカナマイシン含有のプレート上で選択された。このプレートは３０° Ｃで２０時間培養された。

生存コロニイ分再分離して、３０℃でのクロススドリー牛ングによってλｂ２に 対する耐性の試験、４２℃でＫｍプレート上にストリークして４２℃での培４拭 験、及びプラスミドＤＮＡを作製してアガロースゲルで分析することによるプラ スミドの分子値測定の試験を行った。このようにして、プラスミドｐＯ１７５１ は、Ｋｔｌｌとλ感染に対する耐性を伝達し、宿主細菌を、培養に対し温度感受 性にし、ｐ、ＴＩ＋２０中に約１．６Ｘ１０　ダルトンに相当するファージＤＩ ＪＡの挿入部分を有することが見出された。このプラスミドの全分子量は８．４ 　Ｘ　１０　ダルトンであった。これらの性質はすべて、新しいエシェリヒア・ コリ受容体菌株がｐＯＵ５１１１ｉＡで形質転換されるときにそのプラスミドの 表現型性能のすべてを得るので、このプラスミドに保有されている。

ＤＮＡはｐＯＵ５１　から製造され、そのプラスミドはそのプラスミドＤＮＡを 精製し、それごひとつもしくは複数の１ｆ１１漫酵素で切断し、得られたフラグ メントをアガロースゲル電気水助法で分升することによって、制限酵素で地図ｒ ヒした（第４図多照）。

このようにして挿入された１、６　Ｘ　１０　ダルトンのフラグメントは、ａｌ 　リプレッサー遺伝子（６０℃昏こおけるλ免疫性の原因である）とλＰＲプロ 毎−ターター儒する、ファージλからのＢｇｌｌフラグメントとして同定された 。挿入されたフラグメントの配同号測定し第４図に示した。この制限地図〃）ら さらにｐＯＵ５１は、そのプラスミドごクローニングベクターとして用いること がでさるようにする制限エンドヌクレアーゼＥｅＩＯＲＩ用の特異な座位を有− Ｔることが分力）る。

′ａ胞の成育についてのこのプラスミドの効果は、媒体中の培婆吻を３０°Ｃで 培誉することによって研究された。成育が指数的になった時に温度が４２℃會と 変えられ、細胞培養が硯けられた（分光光学的に測定）。４２℃での培養の１． ５〜２時間で培誉吻は成育を停止した。

プラスミドＤＮＡの虚は、０．２％のグＩνコースと１％のカサミノ哨を神充し たＡ”Ｂ　＠ニマル媒体中で培養する１０．Ｌｅづつの培−物から、原料と方法 の項に記載したのと同株薯ζして分定した。

ひとつの１０ｆｆｉｊ培養物を３０°Ｃにて５０μＣ１の３Ｈ−チミジンで標識 をつけた。その他は４２°Ｃに変化した頁後、ｆｆｆＵ胞が成育を停止するまで その同位体を受容した。プラスミドの相対虜は３０°Ｃにおいて、２５〜４０プ ラスミドコピー／細胞に相当する２％であった。４２　°Ｃに３いてその相対前 は１０００以上のプラスミドコピー１ｉＩｉａＩ胞に相当する５０　％以上であ った。

このプラスミドの性質は第５表に示した。

エシェリヒア・コリａｓｕ５０／ｐｏｖ５１４味は、ドイツのＤｅｕｔｓａｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ　ｖｍ　Ｍｉ３ｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｏｎ、　Ｇｒｉａｅｂ ａａｈａｔｒａａａｅ　８．　’Ｄ−３４００市ｔｔｉｑｅｎ（以下ＤＳＭと略 称）に寄託番号２４６７にて寄託されている。

実施例２ ｐｏｔＴ５３の組立てと特性表示 出発”？７１ｆとして実施例１に記載されたプラスミドを用い、ｐＯＵ５１　ｋ 　Ｉ（ｉｎｄｌｌで品分的に、４ｉＩＩ限することによって、カナマイシン耐性 を暗号化している］λ伝子が除η）れているかλ免疫性を暗号化している遺伝子 を保持した漂題のプラスミドか５徂立てられた。このプラスミドかエシェリヒア ・コリ菌株の０Ｈ３５０に形質転換された。ｐ、Ｔ］１ｃＬ５３は３．２Ｘ１０ ６ダルトンの分子１と次の遺伝子型＋　ｏｏｐＡ”、ΔｏｏｐＢ　、　ｒｅｐＡ ”　、△ｐａｒＳｉｎｎλ“、ΔａｐｈＡを有する。

このプラスミドを実施例１の記載と１司様にして制限ｊテ素で地図化した（第５ 図参照）。この制限地１つ）らｐｏｆｆ５３　は、そのプラスミド？クローニン グベクターとして使用可能とする、制限エンドスフレアーゼ１ｅｏＲＩ　の特異 座位を有することが分かる。

所望のプラスミドが宿主訓；虜に存在することを示Ｔために、ａ胞培膚吻が、λ 感染に対する耐性を試験するために前記のようにしてλｂ２ファージ粒子を含有 するプレート上で−４４された。

その則泡はざら薯と、５０μ９／−ｄ−を含有するプレート上のレプリカブレー ティングコロニーによってカナマイシンに対Ｔる感受性が試験された。温度感受 性成育ご試験するために’ｘｆＢＦｍが４２°Ｃでプレート上にストリークされ 実施例１に記載さｎたしかたで培養された。

プラスミドＤＮＡ″ｔが実施例１ｖこム己載のしかたで測定したところ、その細 胞は３０°Ｃで２０〜４０　プラスミドコピー？有し、４２°Ｃでは１０００以 上のプラスミドコピーを有することが判明した。プラスミドの喪失は全（な、Ｃ １１つだ。

このプラスミドの性質は第５表に示した。

Ｋ、　０ｏｌｉ　０８１１５０／ｐＯＵ５３　ｔｔｊ林はＤＳＭに寄託番号２４ ６８号で寄託されている。

尖λり、」３ ｐＯＵ５６Ｕ）見ｌてと特性表示 ｐｏｔ７５３に、転位−１１伝子とアンピシリン耐性（β−ラクタマーゼ）の遺 伝子とを含む、λ：：でｎ３フアージからのＴｎ３　Ｆ’ランスボゾンご生体内 １八Ｔること、によって（Ｍｏｒｄｓｔｒ６ｍ、　Ｍｏ１ｉｎ込１ａｓｇｅｓｒ ｄ−Ｈａｘｕｒａｒ、、　Ｐｌａａｍｉｄ　４．１９８０．２１５〜２７　）標 題のプラスミドが現車てられた。プラスミドＤＮＡは、プラスミドｐＧＵ５３　 及びその染色体中にλ′Ｉ′ｎ３ファージを有する菌株とから単層されγこ。そ のプラスミドＤＭＡは、アンピシリン耐性とλ免疫性を選択するエシェリヒア・ コリ菌株ＯＳＨ５０に形質転換さＣた。

ｐＯＵ５６は５．５　Ｘ　１０’ダルトンの分子−と下記遺伝子型：Ｃ叩ｒ。

ΔＱＯｐＢ１　ｒｅｐＡ”、ΔａｐｈＡ、１ｍｍ２”、　１）ｌ＆”　（：：Ｔ ｎ３）　を有’ｊ６゜このプラスミドご実雁例１１こ記載されたのと同様にして 制御具酵素でマツプ化した（第６図参照）。この制限マツプは、Ｔｎ３トランス ポゾンがｐ　ＯＨ２６に挿入された位置を示し、さらにプラスミドが制限エンド ヌクレアーゼのＫａｏＲＩ　とＢａｍＨｌ　各々の特異座位を有すること？示し ている。このプラスミドはプラスミドｐＯＵ５７製造用の出発物質として有用で あるが（下記実施例４参照）、転位遺伝子の存在によって抗生″’ｉｌＪ　質耐 性が他の則菌に形質転換されつるから、クローニングベクターとしては好ましく ない。

宿主細胞中に所望プラスミドが存在するのを示Ｔために、前記のようにして細胞 培養物をλｂ２ファージ粒子含有のプレート上で培誉してλ感染に対する耐性を 試験した。さらに細胞を、５０μｇ／ｄのアンピシリン含有のプレート上でアン ピシリン耐性ご試験した。−反感受性成育の試験は前記の方法で行った。

ｐＯＵ５６はｐＯＵ５３と同じ復製性能を宵Ｔることが分力）った。

このプラスミドの性能を第５表に示した。

エシェリヒア・コリ０８Ｈ５０／ｐＯＵ５６菌株は、寄託番号２４６９号でＤＳ Ｍに寄託されている。

実施例４ ｐｏ［Ｔ５７　（Ａ型プラスミド）の組立てと特性表示プラスミドｐＯＵ５６が 全トランスポゾンご有することから、このプラスミドからのＴｎ３のトランスポ ジションの可能性をなくするために、このプラスミドｆ　Ｂａｍ１ｌｌ　とｚｏ ｏＲＩ座位で切断し、β−ラクタマーゼをコードＴる遺伝子を保持したままで、 トランスポジション−Ａ伝子を除去した。その付看、橘のアニーリングを行うた めに、プラスミドｐＢ１３２２からの小さなりａｍＨ１−ＫＯＯＲＩフラグメン トヲ挿入しプラスミドｐＯ１ＴＩ＋５７を作製した。

このプラスミドをＥ、　Ｇｏｌｉ困株０５Ｈ５０に形質互換した。ｐｏσ５７は ４．２　Ｘ　１０　ダルトンの分子１と次の遺伝子型：　ｏｏｐＡ”、Δｏｏｐ Ｂ　、　ｒｅｐＡ　、△ｐａｒ　、ΔａｐｈＡ　、　１ｍｍλ”　、ｂｌａ”（ ΔＴｎ３）をｎする。

このプラスミドご実施例１に記載したのと同様にして制限酵素でマツプ化した（ 第７．預多照）。この制限地図から、ｐＯＵ５７は、制限エンドヌクレアーゼｘ ａｍＨＩ　とＦｉｃｏＲｌ　の各々に対する特異座位？■し−このことρ）らク ローニングベクターとして性用なことか分かる。

箔生則抱中に所望のプラスミドが存在していることを示すためζこ、＠Ｂ胞層− 吻ご前記のようにしてλｂ２ファージ粒子を倉荷するプレート上で％ｔｍしてフ ァージ感染に対する耐性を試験した。さらｌここのａ胞は前記のしかたでアンピ シリン耐性を試該した。このプラスミドの分子、迂はアガロースゲル′１気泳励 法によって測定した。温度、感受性成育の試験は前記方法で行った。

ｐＯＵ５７はｐＯσ５３と同じ復製性能を有Ｔることが分力）った。

このプラスミドの性能ご第５図に示した。

Ｅ、１ｌｏｉｉ　０８Ｈ５０／　ｐ０５７　＝　ａ　ハ寄ｆＥ済号２４７ｏ号ｒ 　ＤＳＭ　Ｉｃ寄託されている。

実施例５ ｐＯＵ７１　（Ｂ型プラスミド）の；且立てと特性表示実施例４に記載の１ラス ミドと出発物質として用い、ｐｏｔ？５７のＢｇ１１１座位１こｃｏｐＢ遺伝子 の一部？含む、ｐＫＮ１５６２　からのＢｇ’ｌｌフラグメントを２季人するこ と（こよって、ＣＩ−λＰＲリプレッサープロモーターシステムと、Ｒ１型プラ スミドのＱ　ＯｐＥインヒビターの野生型遺伝子との両者を再する標題のプラス ミド牙組立てた。このプラスミドを’Ｅ、　０ｏｌｉ　０８Ｈ５０対・法会こ形 質転換した。ｐＱＵ７’Ｉ　は分子；よが４．３　Ｘ　ｉｎ　ダルトンで、次の 遺伝子５　：　ｃｏｐＡ”、ｃｏｐＥ”、ｒｅｐＡ”、△ｐ＆ｒ　、△ａｐｈＡ 　、　ｉｎｎλ“、ｂｌａ　ご）！Ｔる。

このプラスミドを実施例１に記載したのと開陳にして制限酵素でマツプ化した（ 第８図参照）。この制限地−η）らｐＯυ７１かｐＯＵ５７　と向じ特異制限坐 位を冒することが分Ｄ）る。

病上−１１＋　鷹中苓こ所望のプラスミドか存在することを示すために、−ニン グの項（木、；Ｊ＋の第２５頁但ｌ膨文偏３７頁）に記載の方法でｏｏｐＢ　、 ４伝子の存在をスクリーニングした。五Ｊｔ感受性戎背の試験は前Ｊ己の方法で 行った。横麦［こ、３０℃におけるプラスミドコピー数？、放射沌僚識法と傾斜 遠心分点法ｆこよって（測定した。

プラスミドの・ｉｋｆ婁旭例１の方法で測定したところ、その訓点は３０°Ｃで ３〜５プラスミドコピー３．４２℃で１８００以上のプラスミドコピー仔するこ とが分かった。３０℃でこのプラスミドは１う７世代の層成で９失した。

乙のプラスミドの住十’Ｐ４５表に示す。

Ｅ、　０ｏｌｉ　ａｓＨ５０／ｐｃＵ７１　Ｊ株は寄託番号２４７１号でＤＳＭ に寄託されている。

実施例６ ｐＯＵ７３　（Ｏ型プラスミド〕のａＸしてと付性表示実施例４に記載のプラス ミドを用い、ｃｏｐＢ遺伝子を有Ｔる、ｐＯＵ１６　’ＩＪｈらの１ｃｃｏＲ） フラグメントをｐＯＵ５７のＥａｃＲ１座位に挿入することによって、ｃＩ−λ ＰＲリプレッサープロモーターシステムのみならず０ｏｐＥインヒビターのため の遺伝子を有Ｔる標題のプラスミドか組立てられた。このプラスミドとＥ、　０ ｏｌｉ菌株０ｆ９Ｈ５０に形質転換した。ｐｏσ７３は分子孟が４．４　Ｘ　１ ０６ダルトンで、次の遺伝子ｍ　：　００１）Ａ”、ａｏｐＢ”　、ｒｅｐＡ” 、△ｐａｒ。

ΔａｐｈＡ　、　ｉｎｎλ１、ｂｌａ＋　を有Ｔる。

このプラスミドご実施例１に記載したのと同様にして制限酵素で地図化した（第 ９図参照）。この制限マツプ力）ら、ａｏｐＢ通伝子遺伝本来位置していないプ ラスミドの部位に挿入されたことか分かる。さらに、このプラスミドは制限エン ドヌクレアーゼＢａｍＨＩ　のための特異座位を有しているのでクローニングベ クターとして有用であることか分かる。

ｐｏｔｒ７１と同じスクリーニング法ご用いた。

プラスミドＤＮＡ量を実施例１に一記載の方法で測定したところ、この細胞は、 ３０℃では０．５〜１プラスミドコピーを有し、４２°Ｃでは１０００以上のプ ラスミドコピーを傅することが分かった。

３０°Ｃにおいて、このプラスミドは５％／世代以上の頻度で長失される。

このプラスミドの性能を第５表ｉこ示す。

Ｅ、０ｏ１１０！１ｌＨ５０／ｐｏｔ７７３　画法は寄託、；１号２４７２号で ＤＳＭに寄詐されている。

実、座♂ｊ７ ｐＯＵ７５　（Ｂ型プラスミド）の組立てと特性表示実施例５に記載のプラスミ ドモ出発＠質として用い、ｐＯＴＴ７１を）ｌｉｎｄ［［で部分的に制限Ｔ己こ とによって、Ｅ！ｃｏＰ、１座位が除去されｆこ４’ＪＪプラスミドが組立てら れた。このプラスミド？Ｅ、　０ｏ１１　ｉ４株Ｏ８）！５０に形質転換した。

ｐｏｖ７５は分子−１１が４．２　Ｘ　１０６ダルトンで、次の遺伝子型：　ａ ｏｐＡ”、ｃｏｐＥ＋、ｒｅｐＡ”、ΔｐＩＬｒ、△ａｐｈＡ　、　ｉｍｍＪ” 、ｂｌａ”　ｆ”ｆｒＴるっこのプラスミドを実施例１に記載したのと同様にし て１ｌｉｌｌ限酵素で地図化した（第１０　図参照）。この制限地因刀）ら、Ｈ １ｎｄｌｌフラグメントの除去によってｐＱＴ７７１のＫｏｏＲｌ　％位が除去 されたことが分力）る。

その宿主到胞に所望のプラスミドか存在するのを示すｔめ：こ、昶Ｉ胞、′Ｆ！ ！−ｒｔ勿について、削記方法で温度感受性成育のみならず、λ感染耐性とアン ピシリン耐性の試験を行った。またこのプラスミドル′ｉ酵素で制限することに よってＥａｏＲｌ　座位がないことを試験した。

ｐｏｔ７７５はｐＯＵ７１と同じ渓製性能を有することか分力）つた。

このプラスミドの性質を第５表に示す。

Ｍ、　０ｏｌｉ　０８１５０／ＰＯＵ７５１ｆｉ株は寄託番号２４７３号でＤ８ Ｍに寄託さ九ている。

実施例８ 遺伝子産物の増幅 プラスミドｐＭｃ９０３　（Ｃａｓａｄａｂａｎ　ａｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｂａ ｃｔ、　１４３゜１９８０、９７１　）を制限酵素ＢａｍＨＩとＢｇｌＩＩで切 断し、ｌａｃ遺伝子を有するＢａｍＨＩ　−Ｂ　ｇｌ　ＩＩフラグメントを作っ た。プラスミドｐＯＵ７１をＢａｍＨＩで切断し、上記で得られたＢａｍＨＩ　 −Ｂｇｌ　ＩＩフラグメントをその座位に第１１図に示すように挿入し次いでＴ ４ＤＮＡＩ）ガーゼで連結しプラスミドｐＯＵ１０６　を作製しＥ、　ｃｏｌｉ 菌株Ｃ３Ｈ５０に形質転換した。その細胞を、５０μ〃讐アンピシリン含有のマ ツコンキイラクトース指示プレート（Ｊ。

Ｍｉｌｌｅｒ、　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｇｅｎ ｅｔｉｃｓ、　ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　１９７２参照）上にス トリークし、３０℃で培養し赤色コロニー（Ｌａｃ”）を選択した。次いで温度 を４２℃に変え遺伝子産物（β−ガラクトシダーゼ）の増幅を測定し第３表に示 した。この測定はＪ　、　Ｍｉｌｌｅｒ　ｏｐ、　ｃｉｔ、によって記載された 方法にしたがって行った。

第　３　表 遺伝子産物の増幅 ０　１０　０　１０ １０　２１ ２５　３４ ５５　６２　６０　２０ ８３　１０７　９０　４７ １、酵素活性／全蛋白量、すなわちβ−ガラクトシダーゼ／細胞の増加 ２、プラスミドｐＯＵ１０６によって伝達されるβ−ガラクトシダーゼ ３　プラスミドｐＫＮ４１０で伝達されるβ−ラクタマーゼ（Ｕｈｌｉｎ　ａｔ 　ａｌ　、、　Ｇｅｎｅ　６．１９７９＋　ＴａｂｌｅＩＩ、　ｐ、　１００） この表から、遺伝子産物増幅のレベルは、他のランアウェイベクターについて得 られたレベルに匹敵するものであることが分かる（例えばＵｈｌｉｎ　ａｔ　ａ ｌ、、　Ｇｅｎｅ６．１９７９．９ｌ−１０６）。

β−ガラクトシダーゼ遺伝子が表現されるプロモーターは、Ｔ’＋ＲＲ：３２２ からのＤＮＡフラグメント上に位置するｃＩプロモーター及び／又はテトラサイ クリンプロモーターであり、それは比較的弱いけれども、影響因子として無視す ることはできない。そしてこの因子はｃＩプロモーターと同方向に転写する。

プラスミドは、挿入されたｌａｃ遺伝子のすぐ下流側に制限エンドヌクレアーゼ のための特異座位を有し、このことからクローニングベクターとして有用なこと が分かる。

このプラスミドの性能を第５表に示す。

Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｃ３Ｈ５０／ｐＯＵ１０６菌株は寄託番号２４７４号でＤＳＭに 寄託されている。

実施例９ ｐＯＵ７９　（Ｂ型プラスミド）の組立てと特性表示プラスミドｐＯＵ７１を、 ＢａｍＨＩ　で完全に切断し、ｐｓｔ　Ｉで部分的に切断し、ｐｓｔ　Ｉで部分 的に切断して詔いて、予めＢａｍＨＩとｐｓｔ　Ｉとして完全に切断されたとこ ろのｐＭｃ８７１（Ｃａｓａｄａｂａｎ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、Ｂａｃｔ、、 　１４．１９８７．１７１）からのＤＮＡフラグメント（ｌａｃオペロンを有す る）と連結した。

この連結混合物をＥ、　ｃｏｌｉ菌株Ｃ３Ｈ５０に形質転換し、そして５０μｙ ／−のアンピシリン含有のマツコンキイラクトース指示プレート上で３０℃にて 培養しアンピシリン副生を選択した。

３０℃２０時間の培養の後、そのプレートを短時間（１−２時間）４２℃で培養 した。Ｌａｃ　（白）からＬａｏ”　（赤）表現型へと変化したコロニーをさ− らに分析した。ｔｌＡ題のプラスミドはひとつのかようなコロニーから同定され た。ｐＯＵ７９の分子量は８．８Ｘ１０’ダルトンで、次の遺伝子型：ｃｏｐＡ ＋、ｃＯｐＢ＋、ｒｅｐＡ　％Δｐａｒ　、　１ｍｍλ　、ｂｌａ　、ｌａｃ　 −、−有する。

このプラスミドを実施例１の記載と同様にして制限酵素で地図化した（第１２図 参照）。この制限マツプから、このプラスミドが、ｌａｃ遺伝子のすぐ上流側に 制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩ　のための特異座位を有することが分かる。

この座位に正しい配向でプロモーター含有ＤＮＡフラグメントを挿入すると、ｌ ａｏ遺伝子の転写を行ない、その結果３０℃においてかようなハ・イブリッドプ ラスミドを有する細胞のＬａｃ＋表現型を生ずる。

またこのプラスミドは、１ａｃＺ遺伝子の一端に位置する、制限エンドヌクレア ーゼＥｏｃＲＩ　のための特異座位を有する。この座位にＥｃｏＲＩフラグメン トを挿入するとｌａｃ　Ｚ遺伝子の産物であるβ−ガラクトシダーゼの活性を消 去し、その結果Ｌａａ−表現型になったり、これは３０℃から４２℃へ温度を変 化させた後、マツコンキイラクトース指示プレート上に無色のコロニーが形成し て容易にスコアされる（前記事項参照）。したがってこのプラスミドはクローニ ングベクターとして有用であるっｐＯＵ７９は、ｐＯＵｌ１と同じ複製性能を有 することが分かった。

このプラスミドの性質は第５表に示した。

Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｃ３Ｈ５０／ｐＯＵ７９菌株は寄託番号２４８１号でＤＳＭに寄 託されている。

実施例１０ ｐＯＵ８２　（Ｂ型プラスミド）の組立てと特性表示プラスミドｐＯＵ７９をＢ ａｍＨＩで完全に切断し、Ｓａｌ　Ｉで部分的に切断した。次いでｌａｃプロモ ーターが除去されたｌａｃオペロン含有のＰＳＫＳ１０４からのＢａｍＨＩ−５ ａｌＩフラグメントと、１ａｃＺ遺伝子の第一番目の４つのコドンとを挿入しｐ ＯＵ８０　（図示せず）を組立てた。

ｐＯＵ８０はＬａｃ″″であり、ｌａｃ遺伝子のすぐ上流側にＢａｍＨＩ座位と ＥｃｏＲＩ座位を有する。さらに、１）ＳＫＳ１０４中のｌａｃ遺伝子がｐＭｃ １４０３から誘導されるから（Ｃａ５ａｄａｂａｎａｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｂａ ｃｔ、　１４３．１９８０．９７１）、ｌａｃ　Ｚ中に通常見出されるＥｃｏＲ Ｉ座位はみとめられない。

標題のプラスミドは、ｐＯＵ８０の１ａｃＺ遺伝子（ｐＯＵ７９　の地図第１２ 図参照）中のＥｃｏ　ＲＩ　−Ｃ１ａ　Ｉフラグメントを、ｄｅ。

プロモーターと１ａｃＺ遺伝子のアミノ終末端とを有する、ｐＶＨ１４２４から のＥｃｏ　ＲＩ　−Ｃ１ａ　Ｉフラグメントで置換することによって組立てた。

この置換によってｌａｃ　Ｚ遺伝子が再組立てされ、そしてｄｅｏプロモーター の存在によって、得られたハイブリッドプラスミドｐＯＵ８２は、Ｅρｏｌｉ菌 株Ｃ３Ｈ５０に形質転換するとＬａａ＋表現型を伝達する。ｐＯＵ８２は、分子 量が８．１×１０　ダルトンで、次の遺伝子型：　０ＯｐＡ　、Ｃ０ｐＢ　、　 ｒｌＢ］）Ａ。

Δｐａｒ　、１ｍｍ　Ａ　、ｂｌａ＋、ｌａｃ＋を有する。

このプラスミドは、ｐａｒ部位を欠いているので３０℃にて最終的に細胞から失 われ、このことは非選択的マツコンキイラクトース指示プレート上で容易に観察 することができる（実施例１１参照）。

このプラスミドを実施例１に記載したのと同様にして制限酵素で地図化した（第 １３図参照）。この制限地図から、このプラスミドは制限エンドヌクレアーゼの ＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩの各々のための特異座位を有し、このことからこのプラ スミドをクローニングベクターとして用いることができることが分かる。

ｐＯＵ８２はｐＯＵｌ１と同じ複数性能を有することが見出された。

このプラスミドの性質を第５表に示す。

Ｅ、ａｏｌｉＣＳＨ５０／ｐＯＵ８２の菌株は寄託番号２４８２号ニテＤＳＭに 寄託されている。

実施例１１ ｐＯＵ９１　（Ｂ型プラスミド）の組立てと特性表示分配について安定なプラス ミドを組立てるために、ｐＯＵ８２をＥｃｏＲＩで切断し、プラスミドＲ１誘導 体のｐＫＮ１８４（Ｎｏｒｄｓｔｒ６ｍ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｌａｓｍｉｄ　Ｉ ！、　１９８０．３２２　）の野生型ｐａｒ部位を含むＥｃｏＲＩ−Ａフラグメ ントをこの座位に挿入し次いで連結した。得られたプラスミド（ｐＯＵ９０．図 示せず）をＥ、　ｃｏｌｉ菌株Ｃ３Ｈ５０に形質転換した。そしてこの細胞は、 ５０μｙ／ｌｎｅ　アンピシリン含有プレート上で３０℃にて選択的に培養され た。対照としてｐＯＵ８２含有細胞を、両者の出発コロニー中に確実にプラスミ ドが存在するように類似の方法で培養した。次に両コロニーの試料をいずれの抗 生物質も含有しないプレート上にス）　ＩＪ−りし、次いでその細胞を２５細胞 世代成育するにまかせた。Ｌａａ＋表現型の安定な遺伝をスクリーニングするた めに、得られた両コロニーからの細胞をマツコンキイラクトース指示プレート上 にストリークした。３０℃でｐＯＵ９０が形質転換された細胞は赤色のコロニー を生成したーこれはこのプラスミドが保持されていたことを示す。一方ｐＯＵ８ ２が形質転換された対照細胞は赤色と無色の両方のコロニーを生成した。これは 、セレクション・フリーの期間ｐＯＵ８２はいくつかの細胞から失われたことを 意味する。

次いで中間プラスミドｐＯ！Ｊ９０をＢａｍＨＩで完全に、５ａｕ３Ａで部分的 に切断してプラスミドの大きさを小さくシ、標題のプラスミドを作製した。Ｅ、 　ｃｏｌｉ菌株Ｃ３Ｈ５０に形質転換した後、プラスミドの安定性を前記のしか たで測定した。ｐＯＵ９１は、分子ヌが１２．５Ｘ１０６ダルトンで、次の遺伝 子型：　ｃｏｐＡ”、ｃｏｐＢ　ＸｒｅｐＡ＋、ｐａｒ”、ｉｍｍλ　、ｂｌａ 　、　ｌａｃ　を有する。

このプラスミドを実施例１に記載したのと同様にして制限酵素で地図化した（第 １４図参照）。この制限地図から、ｐＯＵ９１が制限エンドヌクレアーゼのＥｃ ｏＲＩとＢａｍＨＩ　各々のための特異座位を有し、このことからこのプラスミ ドが゛クローニングベクターとして有用であることが分かる。

ｐＯＵＬ９１は、ｐＯＵｌ１　と同じ複製性能を有するが、ｐＯＵｌ１と比較し て、このプラスミドは３０℃において完全に安定である。

このプラスミドの性質を第５表に示す。

Ｅ、　Ｃｏ１１　Ｃ５Ｈ，５０／ｐＯＵ９１菌株は寄託番号２４８３号でＤＳＭ で一寄託されている。

実施例１２ ｐＯＵｌ　０１　（Ｂ型プラスミド）の組立てと特性表示実施例７に記載のプラ スミドを出発物質として用い、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラー ゼ（ｃａｔ”）　合ｍの遺伝情報を指定する遺伝子を有する５ａｕ３Ａフラグメ ントをｐＯＵ７５のＢａｍＨＩに挿入することによって、宿主細胞にクロラムフ ェニコール耐性を付与した標題のプラスミドを組立てた。このプラスミドをＥ、 　ｃｏｌｉ菌株Ｃ３Ｈ５０に形質転換した。−、ｐｏＵｌｏｌは、分子量が４． ７　Ｘ　１０　’　ダルトンで次の遺伝子型：ｃｏｐＡ　、ｃｏｐＢ　、　ｒｅ ｐＡ、ΔａｐｈＡ　、ｉｍｍ＾、ｂｌａ、、ｃａｔを有する。

このプラスミドを実施例１の記載と同様にして制限酵素でマツプ化した（第１５ 図参照）。この制限地図から、ｐ’ＯＵ１０１は制限エンドヌクレアーゼＥｃｏ 　ＲＩの特異座位を有し、したがってこのプラスミドがクローニングベクターと して用いつるということが分かる。さらにＥｃｏＲＩフラグメントが挿入される とｃｕｔ　遺伝子を失活させ　ＥｃｏＲＩハイブリッドがスクリーニング可能に なる。

宿主細胞中に所望のプラスミドが存在することを示すために、細胞培養物のλ感 染の性とアンピシリン耐性について前記の方法で試験した。さらにこの細胞は２ ０μｙ／ゴのクロラムフェニコール含有のプレート上で培養物を培養することに よってクロラムフェニコール耐性の試験を行った。またこの細胞は温度感受性成 育についても前記方法で試験した。ｐＯＵｌｏｌはｐＯＵ７１と同じ複製性能を 有することが判明した。

このプラスミドの性質は第５表に示す。

Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｃ３Ｈ５０／ｐＯＵ１０１　の菌株は寄託番号２７５７号でＤＳ Ｍに寄託されている。

実施例１３ ｐＯＵｌｌｏ　の組立てと特性表示 ｌａｃ　Ｚ遺伝子の一部を含有するＥｃｏＲＩ　−Ｃ１ａ　Ｉフラグメントをプ ラスミドＰＯＵ８０（実施例１０に記載。ｐＯＵ７９の地図第１２図参照）から 除去し、プラスミドｐ　ＶＨ１４５１（Ｖａｌｅｎｔｉｎ　−Ｈａｎｓｅｎ　ｅ ｔ　ａｌ、、　ｔｈｅ　ＥＭＢＯＪｏｕｒｎａｌ　１　、１９８２　）からの、 ｄｅｏプロモーターと１ａｃＺのアミン終末端とを有するＥｃｏＲＩ−Ｃ１ａＩ フラグメントで置換した。得られたプラスミドはＩ）ＯＵ８３と命名した（第１ ６図ぴ照）。

］−ａＣ遺伝子、及びＣＩリプレッサー遺伝子と＾ＰＲプロモーターを有するＤ ＮＡフラグメントを除去するために、プラスミドｐＯＵ８３をＢａｍ　ＨＩとＢ ｇｌ　ＩＩで部分的に制限した。連結反応とＣ３Ｈ５０への形質転換の後、所望 の性能を有するプラスミドを単離したが、ｄｅｏプロモーターとｃｏｐＢ遺伝子 とがクロース融合体（ｃｌｏｓｅ　ｆｕｓｉｏｎ）を形成していた。このプラス ミドはｐＯＵ　１１０と命名され、分子量が３．２Ｘ１０’ダルトンで次の遺伝 子型：Ｃ０ｐＡ＋、ＣｏｐＢ＋、ｒｅｐＡ＋、Δｐａｒ　、　ｂｌａ＋を有する 。

このプラスミドを実施例１に記載したのと同様にい■限酵素で地図化した（第１ ７図参照）。この制限地図から、このプラスミドは制限エンドヌクレアーゼＥａ ｏＲＩとＢａｍ　ＨＩ各々のための特異座位を有し、このことからこのプラスミ ドをクローニングベクターとして用いうることが分かる。

Ｅ、　ｃｏｌｉ菌株５０９２９　（ｃｙｔＲ、ｌａｃ、ｄｅｏ、ｒｅｃＡ）−こ れｌこはすでにｐＯＵ　１１０が形質転換されていたーのカルチャーを、グルコ ースなしのＬＢ培地中で一夜培養したところ、非制御のプラスミド複製が２Ｘ１ ０８細胞／ｒｎ１以上の細胞密度で起こった。

Ｅ、　ｃｏｌｉ　Ｃ９Ｈ５０／ｐＯＵ　ｌ　１０菌株は寄託番８２７５８号でＤ ＳＭに寄託されている。

実施例１４ ｐＯＵ１３０　の組立てと特性表示 プラスミド１）ＯＵ９１をＢａｎ　ＨＩで切断し、次いでそのＢａｍＨＩ座位を エクソヌクレアーゼＢａ１３１で除去しプラスミドｐＯＵ９２（図示せず）を作 製した。このプラスミドをＥｃｏＲＩとＣ１ａ　Ｉ　で制限し、プラスミドｐＭ Ｃ１４０３（Ｃａｓａｄａｂａｎ　ａｔ　ａｌ、ｌ　Ｊ、　Ｂａｃｔ、　１４３ ．１９８０　、９７１）からの対応するＥｃｏＲＩ　−Ｃ１ａ　Ｉフラグメント を挿入し、ｄｅＯプロモーターなしのｌａｃオペロンを有するプラスミドｐＯＵ ９３を作った。

かようにして作られたＢａｍＨＩ座位にｃａｐ　Ｂ　遺伝子を有するＢｇｌＩＩ フラグメントを挿入してプラスミドｐＯＵ１３０を作製しく第１８図参照）、次 いで連結しＥ、　ｃｏｌｉ菌株Ｃ３Ｈ５０に形質転換した。この細胞を５０１ｍ ／ｄアンピシリン含有のマツコンキイラクトース指示プレートにストリークし３ ０℃で培養して赤色コロニー（Ｌａｃ”）を選択した。次いで温度を４２℃に変 えた。β−ガラクトシダーゼの増幅を第５表に示す。４２℃で４５分間培養した 後、温度を３８℃以下に下げた。この温度変化後に測定されたβ−ガラクトシダ ーゼの増幅を第５表に示す。

第４表 プラスミドＤＮＡの増幅後の ａ３０℃　定常状１　０．０３　１ ｂ３０℃　・１２℃　０．７　２３ Ｃ３０℃　４２℃３７℃　２．５　８３ａ　ＬＢ培地中；３０℃で指数的にｉ′ ｇ養されたｐＯＴ−７１３０を有するＣ３Ｈ５０の細胞 ｂ　３０℃での指数的培養の後、培養物の温度を４２℃１ど変え、その温度で培 養を２時間続けた。

ｃ　３０℃での指数的培養の後、培養物の温度を４２℃に変え、４５分間後、培 養物の温度を３７℃に変えて９０分間培養。

ｄ　原料と方法の項参照。β−ガラクトシダーゼの比活性をＬｉｇｈｔ　ａｎｄ 　Ｍｏ１ｉｎ、　Ｇｅｎ、　Ｇｅｎｅｔ、　１９８１　、　（ｐｐ、　５６−６ １　）に記載しであるのと同様にして示した。

この表から、低温にもどすと、遺伝子産物の増幅が著しく改善され、そのためこ の方法が問題の遺伝子産物の最大の表現を得るのに特に有用であることを示して いることが分かる。

β−ガラクトシダーゼは、本質的にかような遺伝子融合体から表現されるので（ Ｌｉｇｈｔ　ａｎｄ　Ｍｏ１ｉｎ、　Ｊ　、Ｂａ１ｔ　、　１５１　。

１９８２．１１２９〜１１３５　）、酵素の活性のレベルは、この発明のプラス ミドの遺伝子産物の増幅容量を正確に反映している。

Ｅ、　ｃｏｌｉ　ＣＨ３５０／ｐＯＵ１３０の菌株は寄託番号２７５９号でＤＳ Ｍに寄託されている。

実施例１５ ｐＬｃ３１の組立てと特性表示 ｐＯＵ７５をＢａｍＨＩ　で切断した。ｒｅｃＡプロモーターと遺伝子を有する 、プラスミドｐＢＥＵ　１４　（ＴＪｈｌｉｎ　ａｎｄ　Ｃ１ａｒｋ　、　Ｊ　 。

Ｂａｏｔ、　１４８．１９８１．３８６−９０　）からのＢａｎ　ＨＩフラグメ ントを挿入し、次いでエシェリヒア・コリ菌株Ｃ３Ｈ５０に形質転換した。標題 のプラスミドは、分子量が６．３Ｘ１０’ダルトンで、次の遺伝子型：　ｒｅａ Ａ　、　ｂｌａ＋、ｃｏｐＡ＋、ｃｏｐＢ＋、ｒ６ｐＡ＋、ｉｍｍλ　を有する 。

このプラスミドを実施例１に記載したのと同様にして制限酵素で地図化した（第 １９図参照）。この制限地図から、ｐＬｃ３１が、外来遺伝子の挿入に適切な、 制限酵素ＥａｏＲＩ　の特異座位を、ｒｅｃＡプロモーターの下流側に有するこ とが分かる。

ｐＬｃ３１はｐＯＵ７１と同じ複製性能を有することが見出された。

ｐＬｃ３１を有する細胞を３０℃で培養したところ、保有されているプロモータ ーは充分に抑制され、温度を４２℃に変えると、１８ＸＡリプレツサーが徐々に タイトレートされ、ｒｅｃＡからの転写が開始されｒｅｃＡ遺伝子産物の産生が 増幅されるにいたった。そしてこのことはポリアクリルアミドゲル電気泳動法で 検出できた。

このプラスミドの性能を第５表に示した。

Ｅ　、　ｃｏｌｉ　Ｃ８Ｈ５０／　ｐＬＣ３１菌株は寄託番号２７１８号でＤＳ Ｍに寄託されている。

実施例１６ ｐＬＣ３２の組立てと特性表示 λＰＬ　プロモーターとｂｌａ遺伝子を有し、制限座位ＥｃｏＲＩ、ＳｍａＩ　 、　ＢａｍＨＩ　、　５ａｌＩ、　ＰｓｔＩ及びＨｉｎｄ　ｍからリンカ−を備 えたプラスミドＰＬＣ２８（Ｒｅｍａｕｔ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｇｅｎｅ　１５． １９８１　。

ｐｐ、８ｌ−９３）をＥｃｏＲＩで切断し、プラスミドｐＯＵ５１のＥｃｏＲＩ 座位に挿入しく実施例１参照）、次いで連結し、Ｅ、　ａｏｌｉ菌株Ｃ５Ｈ３Ｏ に形質転換した。このプラスミドｐＬＣ３２（第２０図参照）−１０，６ｘ１０ ６ダルトンの分子量を有する−を、ＰｓｔＩ　で、部分的にダイジェストし、次 いで連結し、カナマイシン耐性でアンピシリン感受性のプラスミドを選択するＬ 　ｃｏｌｉ菌株Ｃ３Ｈ５０に形質転換した。得られたプラスミドはｐＣＬ３２と 命名され、分子量が７．７Ｘ１０　ダルトンで次の遺伝子型ｃｏｐＡ　、　ｃｏ ｐＢ　、　ｒｅｐＡ　、　ａｐｈＡ　、　１ｍｍλ　を有する０このプラスミド を実施例１の記載と同様にして制限酵素で地図化した（第２１図参照）。この制 限地図から、λＰＬプロモーターが、このプラスミドをクローニングベクターと して好都合たらしめる特異ＥｃｏＲＩ座位のすぐ上流側に位置していることが分 かる。

ｐＬＣ３２はｐＯＵ　５１と同じ複製性能を有することが見出された。

このプラスミドの性質を第５表に示す。

Ｅ、ａｏｌｉ菌株Ｃ５Ｈ５ｏ７ｐＬｃ　３２は寄託番号２７１９号でＤＳＭに寄 託されている。

第　５　表 ｐＯＵ５３　人　ＥｃｏＲＩ　なし　２５．＞１０００　ありｐＯＵ５６　Ａｐ 、λ　ＥｃｏＲＩ　、ＢａｍＨＩ　なし　２５ン１０００　ありｐＯＵ５７　Ａ ｐ、＾　ＥｃｃＲＩ　、　ＢａｍＨＩ　なし　２５ン１０００　ありｐＯＵ７１ 　Ａｐ、λ　ＥｃｏＲＩ、　ＢａｍＨＩ　なし　３．＞１０００　なしくｎｏ） ｐＯＵ７３　Ａｐ、＾　ＢａｍＨＩ　なし　１；＞１０００　なしｐＯＵ７５　 Ａｐ、入　ＢａｍＨＩ　なし　：９４０００　なしｐＯＵ１０６　Ａｐ２人　Ｂ ａｍＨＩ　なし　３ｉ１０００　なし−′マ”　Ａｐ＋人、　Ｌａｃｃ＋１Ｅｃ ｏＲＩ、　ＢａｍＨＩ　Ｌａｃ　（ＥｃｏＲＩ）３；＞１０００　なしＴｌ０Ｕ ＩＯＩ　Ａｐ、　Ｃｍ、＾　ＥｃｏＲＩ　Ｃｍ５（ＥｃｏＲＩ）３１１００Ｑ　 なしｐＯＵ１３０　Ａｐ、λ、　Ｌａｃ”　ＥｃｏＲＩ　なし　３岬■　ありｐ ｌ、Ｃ３１、Ａｐ、　ＲｅｃＡ　、λＥｃｏＲＩ　Ｒｅｃ　Ａ−：ｙｔｏｏｏ　 なしｐＬｏ　３２　Ｋｍ　＋人　ＥＣ０ＲＬ　なし　２５．１＞１０００　あり ｐＯＵｌｌｏ　Ａｐ　ＥｃｏＲＬＢａｍＨＩ　なし　ａ）　なしａ）　温度依存 性でないコピー数 文献目録 １、Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ　Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｐａｔｅｎｔ　Ａｐｐｌｉｃａｔ ｉｏｎ　Ｎｏ。

７８１０１８７７、５ ２、Ｍｏ１ｉｎ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｂａｃｔ、　１３８．１９７９．　ｐ ｐ、　７０−７９８、Ｍｏ１ｉｎ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ 、　１９８１．　ｐｐ、　４０８−１１゜４、Ｒｏｓｅｎ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｍ ｏ１．　Ｇｅｎ、　Ｇｅｎｅｔ、　１７９．１９８０．　ｐｐ。

５２７−３７゜ ５、Ｌｉｇｈｔ　ａｎｄ　Ｍｏ１ｉｎ、　Ｍｏ１．　Ｇｅｎ、　Ｇｅｎｅｔ、　 １８４．１９８１　＋　Ｐｐ。

５６−６１゜ ６、Ｓｔｏｕｇａａｒｄ　ｅｔ　ａｌ　、　、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃ ａｄ、　Ｓｃｘ、　ＵＳＡ　７８＋１９８１　、　ｐｐ、　６００８−１２゜７ 、Ｍｏ１ｉｎ　ｅｔ、　ａｌ、　、　Ｍｏｌ　Ｇｅｎ、　Ｇｅｎｅｔ、　１８１ 　、１９８１　、　ｐｐ、１２３−３０゜ ８、Ｓｔｏｕｇａａｒｄ　ｅｔ　ａｌ、　、　ｔｈｅ　ＥＭＢＯＪｏｕｒｎａｌ 　１．１９８２゜ｐｐ、　３２３−２８゜ ９、Ｓｕｓｓｍａｎ　ａｎｄ　Ｊａｏｏｂ、　Ｃｏｍｐｔ、　Ｒｅｎｄ、　Ａｃ ａｄ、　Ｓｃｉ、　２５４゜１９６２、　ｐ、　１５１７゜ １０、　５ｎｉｎｓｋｙ　ａｔ　ａｌ、　Ｇｅｎｅ　１６．１９８１　、　ｐ、 　２７５゜１１、Ｕｋｔｌ、ｉｎ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｇｅｎｅ　６．１９７９． 　ｐｐ、　９１−１０６゜１２、Ｊ、　Ｍｉｌｌｅｒ　：　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎ ｔｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ。

Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ。

Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　１９７２゜１ ３、Ｄａｖｉｓ、　Ｂｏｔｓｔｅｉｎ　ａｎｄ　Ｒｏｔｈ　：　Ａ　Ｍａｎｕａ ｌ　ｆｏｒ　ＧｅｎｅｔｉｃＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　；　ＡｄｖａｎｃｅｄＢ ａｃｔｅｒｉａｌ　Ｇｅ’ｎｅｔ：ｉｃｓ＋Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂ ｏｒ。

Ｎｅｖｒ　Ｙｏｒｋ＋　１９８０゜ １４、Ｂ１３ｒｔａｎｉｌ　Ｊ、　Ｂａｃｔ、６２．１９５４１　ｐ、２９３゜ １５、Ｂｏｌｉｖａｒ　ａｔ　ａｌ、、Ｇｅｎｅ　２．１９７７、ｐ、９５゜１ ６、Ａｎ　＆　Ｆｒ１ｅｓｅｎ　、Ｊ、Ｂａｃｔ、１４０，１９７９．ｐｐ、４ ００−４０７゜１７、Ｃａ５ａｄａｂａｎ　ｅｔ　ａｌ、、Ｂａｃｔ、１４３， １９８０．ｐ、９７．ｌ。

１８、Ｄｅｍｐｓｅｙ　＆　Ｗｉｌｌｅｔｔｓ、Ｊ、Ｂａｃｔ、１２６，１９７ ６、ｐ、１６６゜１９、Ｎｏｒｄｓｔｒａｍ＋ＭＯ１１ｎ＋Ａａｇａａｒ（Ｉ　 Ｈａｎｓｅｎ＋　ＰｌａＳｍｌｄ　４＋１９８０、　ｐｐ、　２１５−１７゜ ２０、Ｓｔｏｕｇａａｒｄ　＆　Ｍｏ１ｉｎ、　Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｓｍ、 　１１８．１９８１　＋　１）。

１９１゜ ２１、Ｎｏｒｄｓｔｒδ’ｍ　ｅｔ　ａｌ、　＋　Ｐｌａｓｍｉｄ　４　、１９ ８０．　ｐ、　３２２゜２２、Ｖａｌｅｎｔｉｎ−Ｈａｎｓｅｎ　ａｔ　ａｌ、 、ｔｈｅ　ＥＭＢＯＪｏｕｒｎａｌ　ｌ。

１９８２、ｐ、３１７゜ ２３、Ｍｅｓｓｉｎｇ　ｅｔ　ａｌ、、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、 ９＋　１９８Ｌｐ、３０９゜ ２４、Ｕｈｌｉｎ　＆　Ｃ１ａｒｋ、Ｊ、Ｂａｃｔ、１４８．１９８Ｌ　１）ｐ 、３８６−９０゜四　区　同 鍜　鍜　尿 ｒ−ｍ−−１−□コ　−−− ど−− 国際調査報告

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．調節可能なプロモーターが、このプロモーターからの転写が複製を調節する ようなしかたで挿入されたプラスミド。 ２、調節可能なプロモーターが、このプロモーターからの転写が複製を調節し、 その結果増大された転写番とよってプラスミドコピー数が実質的に増大されるが 又は制御されなくなるに至るしかたで挿入されたプラスミド。 ３、　プロモーターが、そのプロモーターの部位内の特定のＤＮＡ構造によって 先天的に調節可能なプロモーターである請求の範囲第１項又は第２項のプラスミ ド。 ４、プロモーターが調節因子によって制御可能である請求の範囲第１項又は第２ 項のプラスミド。 ５、調節因子が正の制御を行う調節因子である請求の範囲第４項のプラスミド。 ６、調節因子が負の制御を行う調節因子である請求の範囲第４項のプラスミド。 ７、調節可能なプロモーターからの増大された転写によってプラスミドコピー数 が実質的に増大されるか又は制御されなくなるに至ることが該プロモーターの抑 制解除によって起こる請求の範囲第２項のプラスミド。 ８、プロモーターが化学的に調節可能なプロモーターである請求の範囲上記全請 求の範囲のいずれかのプラスミド。 ９、プロモーターがｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター又はａｅｏプロモ ーターである請求の範囲第８項のプラスミド。 １０、プロモーターの活性が温度依存性であるか又は温度感受性調節因子によっ て制御される請求の範囲第１〜７項のいずれかのプラスミド。 １１、プロモーターがλプロモーターであり、該プロモーターからの転写を制御 する温度感受住人ＣＩリプレッサーのための遺伝子も存在する請求の範囲第１０ 項のプラスミド。 １２、λプロモーターがλＰＲ又はλＰＬである請求の範囲第１１項のプラスミ ド。 １３、λプロモーターがλＰＲである請求の範囲第１２項のプラスミド。 １４、前記調節可能なプロモーターからの転写が、プラスミドに、低温では一定 の低いコピー数を示させ、より高い温度では実質的に増大されるかもしくは制御 されないコピー数を示させる上記全請求の範囲のいずれかのプラスミド。 １５、前記調節可能なプラスミドからの転写が、約３０℃の温度で一定の低いコ ピー数を示させ、約３６−４２℃の範囲の温度で実質的に増大されるかもしくは 制御されないコピー数を示させる請求の範囲第１４項のプラスミド。 １６、約３９℃の温度以上の温度で制御されないプラスミドコピー数を示す請求 の範囲第１５項のプラスミド。 １７、ひとつの本来もっている複製調節遺伝子の一部が除去され調節可能なプロ モーターで置換された上記全請求の範囲のいずれかのプラスミド。 １８、該プラスミドを有する宿主微生物が一定ｐ低いプラスミドコピー数を保証 する条件下で培養される際には、２０−４０コピー／細胞、好ましくは２０−３ ０コピー／細胞、及び特に２０−２５コピー／′細胞のそれぞれの範囲のコピー 数を有し、その宿主微生物がプラスミドコピー数の実質的Ｉこ増大されるかもし くは制御されなくなる番と至る異なる条件下で培養される際には、少なくとも約 ５００−１０００コピー／細胞の範囲のコピー数を有する請求の範囲第１７項の プラスミド。 １９、約３０℃のごときひとつの温度において、約２０−４０コピー／細胞、好 ましくは２０−３０コピー／細胞、及び特に２０−２５コピー／細胞のそれぞれ の範囲のコピー数を有し、約４２℃の温度のごときより高い温度において、少な くとも約５００〜１０００コピー／細胞の範囲の制御されないプラスミドコピー 数を有する請求の範囲第１８項のプラスミド。 ２０、ｃｏｐＢ遺伝子が除去され調節可能なプロモーターによって置換されたＲ １型プラスミドである請求の範囲第１７−１９項のいずれかのプラスミド。 ２１　該プラスミドを有する宿主微生物が一定の低いプラスミドコピー数を保証 する条件下で培養される際には約３−５コピー／細胞の範囲のコピー数を有し、 その宿主微生物がプラスミドコピー数の実質的に増大されるかもしくは制御され なくなるに至る異なる条件下で培養される際には少なくとも約５００〜１０００ コピー／細胞の範囲のコピー数を有するプラスミド。 ２２、約３０℃の温度のごときひとつの温度で約３−５コピー／細胞の範囲のプ ラスミドコピー数を有し、約４２℃の温度のごときより高い温度で少なくとも約 ５００〜１０００コピー／細胞の範囲の制御されないプラスミドコピー数を有す る請求の範囲第２１項のプラスミド。 ２３、調節可能なプロモーターが、プラスミドの本来もっているひとつ又は複数 の複製制御遺伝子の上流側に挿入された請求の範囲第１〜１６項のいずれかのプ ラスミド。 ２４、該プラスミドを有する宿主微生物が一定の低いプラスミドコピー数を保証 する条件下に培養される際には約３−５コピー／細胞の範囲のコピー数を有し、 その宿主微生物が、プラスミドコピー数の実質的に増大されるかもしくは制御さ れなくなるに至る異なる条件下で培養される際には少なくとも約５００〜１００ ０コピー／細胞の範囲のコピー数を有する請求の範囲第２３項のプラスミド。 ２５、約３０℃の温度のごときひとつの温度で約３〜５コピー／細胞の範囲のプ ラスミドコピー数を有し、約４２℃の温度のごときより高い温度で少なくとも約 ５００〜１０００コピー数／細胞の範囲の制御されないプラスミドコピー数を有 する請求の範囲第２４項のプラスミド。 ２６、調節可能なプロモーターが０ＯｐＢ遺伝子とｃｏｐＡ遺伝子の上流側に挿 入されたＲ１型プラスミドである請求の範囲第２３〜２５項のいずれかのプラス ミド。 ２７、プラスミドを有する宿主微生物が一定の低いプラスミドコピー数を保証す る条件下で培養される際、とは約０．５−１コピー／細胞の範囲のコピー数を有 し、その宿主微生物がプラスミドコピー数の実質的に増大されるかもしくは制御 されなくなるに至る異なる条件下で培養される際には少なくとも約５００〜１０ ００コピー／細胞の範囲のコピー数を有するプラスミド。 ２＆　約３０℃の温度のごときひとつの温度で約０．５〜１コピー／細胞の範囲 のプラスミドコピー数を有し、約４２℃の温度のごときより高い温度で少なくと も約５００〜１０００コピー／細胞の範囲の制御されないプラスミドコピー数を 有する請求の範囲第２７項のプラスミド。 ２９、本来もっているひとつの複製調節遺伝子の一部が除去された複製部位置こ 調節可能なプロモーターを有し、その本来もっている複製調節遺伝子がその本来 位置していない部位に挿入された請求の範囲第１〜１６項のいずれかのプラスミ ド。 ３０、該プラスミドを有する宿主微生物が一定の低いプラスミドコピー数を保証 する条件下で培養される際には約０．５〜１コピー／細胞の範囲のコピー数を有 し、その宿主微生物がプラスミドコピー数の実質的に増大されるかもしくは制御 されなくなるに至る条件下で培養される際には少なくとも約５００〜１０００　 コピー／細胞の範囲のコピー数を有する請求の範囲第２９項のプラスミド。 ３１、約３０℃の温度のごときひとつの温度で約０．５〜１コピー／細胞の範囲 のプラスミドコピー数を有し、約４２℃の温度のごときより高い温度で少なくと も約５００〜１０００コピー／細胞の範囲の制御されないプラスミドコピー数を 有する請求の範囲第３０項のプラスミド。 ３２、ｏｏｐＢ遺伝子がそのプラスミドの複製部位以外のＥｃｏＲＩ座位に挿入 されたＲ１型プラスミドである請求の範囲第２９〜３１項のいずれかのプラスミ ド。 ３３、複製部位からの転写を調節する第１の調節可能なプロモーターに加えて、 第２プロモーターが、このプロモーターによってその表現が制御される構造遺伝 子を挿入できるしかたで挿入された上記全請求の範囲のいずれかのプラスミド。 ３４、前記遺伝子の表現を調節する第２プロモーターが制御可能である請求の範 囲第３３項のプラスミド。 ３５、構造遺伝子の表現を制御する前記第２の挿入されたプロモーターがλＰＬ 　プロモーターである請求の範囲第３３項又は第３４項のプラスミド。 ３６、約３０℃で一定の低いプラスミドコピー数を有しかつ遺伝子表現がごく少 ないか全くなく、約３６−４２℃の範囲の温度でプラスミドコピー数が実質的に 増大されるか又は制御されずかつ遺伝子表現を有する請求の範囲第３３〜３５項 のいずれかのプラスミド。 ３７．３９℃の温度以上の温度で制御されないプラスミドコピー数と非常に貰い 遺伝子表現を宵する請求の範囲第３６項のプラスミド。 ３８、プラスミドを有する細胞の同定及び／又は選択のために有用なマーカーを 有する上記全請求の範囲のいずれかのプラスミド。 ３９、マーカーが宿主細胞に抗小姉謝牲を伝達する遺伝子を有する請求の範囲第 ３８項のプラスミド。 ４０　もうひとつの遺伝子の挿入に際し、その融合から表現の検出ができる遺伝 子融合を許容する遺伝子を有する上記全請求の範囲のいずれかのプラスミド。 ４１、プラスミドがミニプラスミドであることを特徴とする上記全請求の範囲の いずれかのプラスミド。 ４２、プラスミドに本来関係のない単一もしくは複数の遺伝子を追加して有する 上記全請求の範囲のいずれかのプラスミド。 ４３、請求の範囲第１−４２項のプラスミドが挿入された微生物。 ４４、細菌である請求の範囲第４３項の微生物、４５、グラム陰性で中温性の細 菌である請求の範囲第４４項の微生物。 ４６、エシェリヒア・コリである請求の範囲第４５項の微生物。 ４７、調節可能なプロモーターをプラスミドに、該プロモーターからの転写が複 製を調節するようなしかたで挿入し、かように処理されたプラスミドを、該プロ モーターからの転写が増大される際に実質的に増大されるか又は制御されないプ ラスミドコピー数を示すこれらプラスミドをスクリーニングすることによって同 定することからなる請求の範囲第１〜４２項のプラスミドの組立て法。 ４８、本来もっているひとつの複製調節遺伝子の一部を除去し、この部分的に除 去された本来もっている複製調節遺伝子の座位に調節可能なプロモーターを有す るＤＮＡフラグメントを挿入することからなる請求の範囲第４７項の方法。 ４９、制限エンドヌクレアーゼＢｇｌｌｌで切断することによってプラスミドか らｏｏｐＢ遺伝子を除去し、この座位に調節されたプロモーターを有するＢｇｌ Ｉ［フラグメントを挿入することからなる請求の範囲第４８項の方法。 ５０、調節可能なプロモーターをプラスミドに、本来もっている複製制御の単一 もしくは複数の遺伝子の上流側で挿入することからなる請求の範囲第４７項の方 法。 ５１、ｃｏｐＢとＣ０ｐＡの上流側のＢｇｌｎ座位に調節可能なプロモーターを 挿入することからなる請求の範囲第５０項の方法。 ５２、出発原料として、部分的に除去された本来もっている複製調節遺伝子を有 するプラスミドを用い、その本来もっている複製調節遺伝子をそのもとの座位に 再挿入して本来もっている複数の複製制御遺伝子すべてが存在するプラスミドを 組立てることからなる請求の範囲第４７項の方法。 ５３、出発物質として部分的に除去されたＣ０ｐＢ遺伝子を有するプラスミドを 用い、とのＣ！ＯｐＢ遺伝子をＢｇｌＩｒ座位に挿入し００ｐＢ遺伝子と０Ｏｐ Ａ遺伝子の両方が存在するプラスミドを組立てることからなる請求の範囲第５２ 項の方法。 ５４、出発物質として部分的に除去された本来もっている複製調節遺伝子を有す るプラスミドを用い、それが本来位置していないプラスミドの部位にひとつの本 来もっている複製調節遺伝子を挿入することからなる請求の範囲第４７項の方法 。 ５５、出発物質として部分的に除去されたｃｏｐＥｉｌｌ伝子を有するプラスミ ドを用い、このＣ０ｐＢ遺伝子をプラスミドの複製部位以外のＥｃｏＲＩ座位に 挿入することからなる請求の範囲第５４項の方法。 ５６、調節可能なプロモーターの挿入に加えて、前記第２プロモーターを、この 第２プロモーターによって表現が調節可能な構造遺伝子が挿入できる適切な制御 座位に挿入することからなる請求の範囲第３３項のプラスミドの組立て方法。 ５７　前記調節可能なプロモーターからの増大された転写によってプラスミドコ ピー数が実質的に増大されるか又は制御されなくなるに至るのを保証する条件下 での少なくともひとつの培養期間を有する培養を、請求の範囲第１〜４２項のプ ラスミドをもつ微生物について行い、次いでこの微生物培養物からプラスミドの 遺伝子産物を収穫することからなる、プラスミドＤＮＡの遺伝子産物の製造方法 。 ５８、請求の範囲第１〜４２項のプラスミドが形質転換された宿主微生物を、接 種及び増殖段階で一定の低いプラスミドコピー数になる条件下で所望の細胞数が 得られるまで培養し、次いてその宿主微生物をプラスミドコピー数が実質的に増 大されるかもしくは制御されなくなるに至る条件下で培養することからなる請求 の範囲第５７項の方法。 ５９、プロモーターからのいずれの転写もプラスミドコピー数に有意に影響しな い条件下での培養期間の後、プロモーター活性を誘発する物質が、プラスミドコ ピー数が実質的に増大されるか又は制御されなくなるに至る量で添加される請求 の範囲第５７項又は第５８項の方法。 ６０、プラスミドの実質的な増幅を得るのに充分であるが微生物培養物のいずれ の実質的な損傷も回避するのに充分短かい期間、プラスミドコピー数が実質的に 増大されるかもしくは制御されなくなるに至る条件を維持した後で、プロモータ ー活性を誘発する物質が培養媒体から除去され、プラスミドコピー数が徐々に減 少し前記誘発前のレベルに至らせる請求の範囲第５９項の方法。 ６１、プロモーター活性を実質的に阻害する物質の存在下での培養期間の後、そ の物質の濃度が、プロモーターが活性化されプラスミドコピー数が実質的に増大 されるか又は制御されなくなるに至る程度に減少される請求の範囲第５７項又は 第５８項の方法。 ６２、プラスミドの実質的な増幅を得るのに充分であるが微生物培養物のいずれ の実質的な損傷も回避するのに充分短かい期間、プラスミドコピー数が実質的に 増大されるかもしくは制御されなくなるに至る条件を維持し、プロモーター活性 を阻害する物質が、プラスミドコピー数が徐々に減少して誘発前のレベル２こい たる量で添加される請求の範囲第６１項の方法。 ６３、宿主微生物の培養される条件が、プラスミドコピー数が実質的に増大され るか又は制御されない温度又はその近傍の温度での少なくともひとつの培養期間 からなる請求の範囲第５７項又は第５８項の方法。 ６４、プラスミドコピー数が実質的に増大されるか又は制御されない温度での培 養が、宿主微生物の成育がプラスミドからのプラスミドＤＮＡもしくは遺伝子の 産物の形成によって阻害されるまで続けられる請求の範囲第６３項の方法。 ６５、量産規模の培養が、プラスミドの遺伝子産物の形成量を増大するとともに 、宿主微生物の存続と連続的成育を許容するように、プラスミドコピー数が実質 的に増大されるか又は制御されない温度に近い温度で行われ、次いでその遺伝子 産物が培養物から連続的もしくは間欠的に収穫される請求の範囲第６３項の方法 。 ６６、微生物培養物を量産サイズに到達するまで増殖させた後、温度がプラスミ ドコピー数が実質的に増大されるか制御されない温度もしくはその近傍の温度に 変えられ、次いでこの温度がプラスミドの実質的な増幅を得るのに充分であるが 微生物培醤物のいずれの実質的な損傷を避けるのに充分短かい期間、維持され、 その後その温度が低い一定のプラスミドコピー数を保証し、プラスミドコピー数 を最初のレベルに到達するまで徐々に減少させる温度：こもう−変度えられ、る 請求の範囲第６．３項の方法。 ６７、プラスミドコピー数が実質的に増大されるか又は制限されない温度が、プ ラスミドが一定の低いコピー薮を有する温度よりも高い請求の範囲第６３〜６６ 項のいずれかの方法。 ６８　プラスミドが一定の低いコピー数を有する温度が約３０”Ｃの温度であり 、プラスミドが実質的に増大されるか又は制御されないコピー数を有する温度が 約３６〜４２°Ｃの範囲にある請求の範囲第６７項の方法。 ６９、プラスミドを有する細胞の同定及び／又は選択に有用なマーカーを有する ＤＮＡフラグメントを挿入することからなる請求の範囲第１〜４２項のいずれか のプラスミドの製造方法。 ７０、マーカーが宿主微生物に抗生物質耐性を伝達する遺伝子である請求の範囲 第６９項の方法。