JPS59501532A - 条件非制御の複製挙動を持つプラスミド - Google Patents
条件非制御の複製挙動を持つプラスミドInfo
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- JPS59501532A JPS59501532A JP58502971A JP50297183A JPS59501532A JP S59501532 A JPS59501532 A JP S59501532A JP 58502971 A JP58502971 A JP 58502971A JP 50297183 A JP50297183 A JP 50297183A JP S59501532 A JPS59501532 A JP S59501532A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
条件非制御の複製挙動を持つプラスミドこの発明は、組換えDNA技術分野にお
いてクローニングベクター及び産生ベクターとして有用で複製挙動が複製に好適
な条件下で制御されない(非制御の)新規なプラスミド、及びかようなプラスミ
ドの製法に関する。
技術的背景
条件非制御の複製挙at持つプラスミド(plaamムWith aonr3j
L−tiomL uwontrou@a rePliO&tiOn behav
tour) (いわゆるランアウェイプラスミド: runaway plae
社a)は、例えば公開ヨーロッパ特許出i第78101877.5号によって知
られている。これらのプラスミドの複製は温度依存性であって、プラスミドを保
有する宿主細菌がある温度例えば約50℃の温度で培養されるときは制御された
一定の低コピー数を示し、その宿主細菌が異なる温度例えば約36℃以上の温度
で培養されるときは非制御のコピー数を示すのである@
上記特許出願に開示されたプラスミドは、ニジエリ辷ア・コリ中で自律的に復製
することが知られている野生型プラスミドのプラスミドR1の化学的突然変異誘
発法(mutag@己5ation)によって単離された。この突然変異誘発法
は2段階で行われた。
すなわち第1段階は、プラスミドコピー数が30℃で約1〜2で、40°Cでは
4〜5倍高いプラスミド保育細菌クローンの単離からなり、第2段階はプラスミ
ドがより高い温度で制御されないコピー数を示した刑急クローンのM4離力)ら
なるものである。
このようにランアウェイ$劾を示すプラスミドは親プラスミドの二重変異体であ
った。
上記特許出願には、またミニプラスミドを開示しており、これは小さいサイズで
あることがら比峻的容易に宿主細菌iこ形質転換されるのでクローニングベクタ
ーとして4月である。これらのミニプラスミドは、温度依存性のランアウェイQ
%挙劾の原因である遺伝子ご保持していた。
上記特許出願に開示されたプラスミドは、クローニング及び産生ベクターとして
、外米DNAの挿入されたフラグメントの遺伝子産物合成るのに用いることがで
きる。このプラスミドの温度依存性複製は、例えば真核オリジンのDNAフラグ
メントからの増幅された潰の遺伝子産物を産生Tるのに利用できる。・4伝子産
物のかような増幅は、例えば培養媒体にクロラムフエニコーyを添加して行われ
る通常のプラスミドDNA増幅技術では、クロラムフェニコールの存在が蛋白合
成を停止させるので、有効でなかった。
上記特許願で開示されたプラスミドは、挿入された外来遺伝子が、そのプラスミ
ドが形質転換されるべき細菌に対し有害な産物合成の遺伝情報を指定している場
合に、クローニングペクシと腫生ベクターとして育利に用いることができる。と
いうのはそのプラスミドは低温においては低コピー数を有し結局はとんど遺伝子
表現モしないからである。このことは、低温で行われる培養の増殖段階では細菌
が損傷されに(いことを意味Tる。
発明の開示
この発明は、プロモーターからの転写がプラスミド複製を調節するようなしかた
で挿入された少t(ともひとつの調節可能なプロモーター(r@gu藷tabl
・prometer)を有する新規なプラスミドに関する。特にこの発明は、そ
のプラスミドを有する宿主微生物がプロモーターからの転写の増大を保証する条
件下で培養されると、調節可能なプロモーターが実質的に増大されるかもしくは
制御され1工い復i=起こさせるプラスミドに関する。この発明はさらI2:か
ようなプラスミドの製法−と関する。このプラスミドはクローニング及び産生ベ
クターとして有用である。
プラス叉ドに挿入され所望の遺伝子産物合成の遺伝情報を指定Tる。購造逗伝子
の表現を制御するために、調節可能なプロモーターをニー人することが知られて
いる。しかし形成されるプラスミドコピー数を調節することができる調節可能な
プロモーターfプラスミドに挿入することは新規であると信じられる。
この発明は、第一の態様として、調節可能なプロモーターが、このプロモーター
からの転写が複製?−節Tるようなしかた、特に項入石れた転写によってプラス
ミドコピー数が実質的に増大される力)もしくは制卸されなくなるに至るような
しかたで挿入されたプラスミドにIiAする。この明細書及び請求の範囲におい
て1調節可能なプロモーター1という用語は、プロモーターの転写開始ら度に謁
丁。活性が、そのプロモーターを持つプラスミド:4:有下る宿主細菌の培聾栄
件を調節Tることもこよって、−顧可能なブロモ−を意味する。かような調節可
能なプロモーターは、例えは外米プロモーター、すなわちプロモーターの挿入さ
れているプラスミドが本来もっていない(@シていない)プロモーターであって
もよい。このプロモーターは、そのプロモーターの部位内の特別なりNA構造に
よって先天的に調節可能である。かようなプロモーターの一例は、公知のランア
ウェイプラスミド(後記説明参照ンに見出される。又はこのプロモーターは、正
の制御を行いつる調節因子によって制御可能であってもよく(すなわちプロモー
ターが例えば宿主細胞が生育される培地にある講究物質を添加することにより正
に誘発されないとプラスミドは非制御の複製1こ到達しない〕、又はこの調節因
子は負の制御を行ってもよい。後者のタイプの制御因子は、その活性が宿主細胞
の培養条件な調整することによって調節可能であるリプレッサーとしても知られ
ている。そのリプレッサー遺伝子はプロモーターととも橿こプラスミド自体にあ
ってもよ(、同じ宿主微伍吻中の別のプラスミドでもよく、又は宿主微生物の染
色体に位置していてもよい。このリプレッサー遺伝子は挿入されたプロモーター
からの転写を抑制する産物の遺伝情報を指定しその結果、復製は低い一定レベル
に保持される。ある理由でリプレッサーが不活化されるようになると、かような
制御はなくなり転写が増大する。
特別の記載?しなければ、この明細署と請求の範囲に用いられる”プロモーター
”の用語は通常、宿主細胞の培養条件の変化に先天的に応答する活性を有するプ
ロモーターと調節因子によって制御されるプロモーターの両者を意味する。また
1調節可能なプロモーターが挿入されたプラスミドゝの表現は、プロモーターと
そのプロモーターによって調節されたレプリコンが同じDNAフラグメントに挿
入され、そのプロモーターとレプリコンが最終的に異なるンースから誘導されて
いるこの発明のプラスミドに用いることを意図するものである。そしてこのこと
は、所望の最終プラスミド組立ての1段階において、プロモーターがレプリコン
の誘導されたプラスミドに挿入されたことを意味する。1実質的に増大されるか
もしくは制御されないプラスミドコピー数”の用語は、宿主微生物の培養条件を
プロモーター刀)らの転写の増大を保証するように変えその結果プラスミドがそ
の複製制御を失ったとき、そのプラスミドコピー数は、その微生物集団の一世代
時間で約40〜50%もしくはそれ以下で指数的に増大するという事実にてらし
て理解される。この増大は、宿主細胞が通常4〜5もしくはそれ以下の倍化の後
成育を停止するまで続く。そしてその時点でa胞中のプラスミドDNAの遣はD
MA全量の約40〜70%であり、すなわちプラスミドコピー数が約25〜10
00もしくはそn以上のファクターで増大する。換言丁れば、プラスミドコピー
数が定常状態に到達しないのである。このタイプの制御されない複製挙動も1ラ
ンアウエイ”挙動と呼称される。
R1型プラスミドの複製制御原理について、この発明の発明者らが新たに得た知
識はこの発明のプラスミドの組立てに利用される(この原理の詳細な説明につい
ては、′発明の詳細な説明1を参照のこと)。この発明の原理にしたがって、調
節可能なプロモーターがプラスミドに挿入されると、例えばプロモーターの抑制
解除作用によってプロモーターからの増大された転写によってプラスミドコピー
数が実質的に増大されるかつ制御されナクする1こ至る。このことはプロモータ
ーとともに挿入されかつある条件下でプロモーターを制御する遺伝子産物含酸の
4伝情報を指定するリプレッサー遺伝子が、異なる条件下で不活化するようにな
ると、プロモーターからの転写はもはや阻害されず、音場制御されないプラスミ
ドコピー数になるということを意味する。
このことは、条件分捉えると復製性能が異なるかもしれない公知のランアウェイ
プラスミド(こ比べて1要な改良である。挿入される外来プロモーターは通常、
非常に強力(すなわち転写開始の頻rWが「jbい)なのでかような条件変化で
は効果がない刀)ら、このことはこの発明のプラスミドも同ゆであるという徴挨
は全くない。
調節可能なプロモーターの活性を調節することのできる培瘍染件のひとつは、宿
主故生吻か場昼される温度である。プロモーターの活性は、それ目体温度依存性
であってもよ(、すなわち培査中の温度変化に反応する小、又はその調節因子は
温度感受性で、例えば温度感受性リプレッサーであってもよい。
この調節可能なプロモーターは、プロモーターからの転写を制御する温度感受性
λclリプレッサーの遺伝子?付加的に有するDNAフラグメントの一部として
挿入しつる、バクテリオファージλからのプロモーターであってもよい。このλ
プロモーターはλPRもしくはλPLでもよく、とくにλPRでもよい。しかし
、この発明の原理にしたがってプラスミド1こ挿入されかつ温77α外の外的因
子Iこ影瀞さnる他のプロモーター系も採用できもすなわち、化学物質で誘導可
能2:l)もしくは代謝物によって調節可能+’jlac、trp及びaeoプ
ロモーターのようなプロモーターである。
この発明のプラスミドの好巡な例は、そのプロモーター調節システムがそのプラ
スミドの温度依存性の複製挙動を生ずるプラスミドである。特1こそのプラスミ
ドが実質的φこ増大されるかもしくは制御されないプラスミドコピー数を示す温
度は、コピー数が低い場合の温度より高い温度である。その転写パターンが例え
ば温度感受性リプレッサーの存在によって温度依存性である調河可能なプロモー
ターな有するこの発明のプラスミドは、約30°Cのごときひとつの温度で一定
の低いコピー数を示す。
というのはこの温度でプロモーターが抑制されその結果それからの転写が低いレ
ベルに保持されるからである。一方約36〜42°Cのi囲の温度のようなより
高い温度では、その調節システムが不活化されるに至りプロモーターの抑制解除
を起こし結局プロモーターからの転写が増大されるので実質的に増大されるか又
は制御されないプラスミドコピー数を示す。ランアウェイ複製は約59°C以上
の温度で行うのが好ましい。
以下の説明においては、その複製が温度感受性の調節システム、特に温度域受性
のリプレッサーによって制御されるプラスミドにだけ言及されているが、プラス
ミドの複製が調節されつる他のタイプの条件も前記説明のように層像のしかたで
利用できる。
この発明のひとつのタイプのプラスミドは、調節可能なプロモーターが、プラス
ミドのひとつの本来もっている復製調節遺伝子(nativs repl−1o
ation regwLatory gone)の一部の代りに挿入されたプラ
スミドである。この明a苔と請求の範囲のためにかようなプラスミドはA型プラ
スミドと命名される。このプラスミドがプラスミドR1の$;4体であるとき、
そのプラスミドから除去される調節遺伝子はoopB遺伝子であり、これはプラ
スミドの本来もっている複i咀害剤のひとつを合成する遺伝情報を指定している
。このaopB JIl伝子を除去するとプラスミドコピー数がわずかに安定し
て増大する。かくしてそのプラスミドは約30°C1cおいて約20〜40のコ
ピーl薗抱、任ましくは20〜30コピーl細飽、特に20〜25のコピー/旧
胞を有する。しかし温度が約40°Cに上昇すると調節可能なプロモーターのリ
プレッサー機能が失活して複製が制御されな(なり、少なくとも約500〜10
00コピー/細胞の範囲のプラスミドコピー数になる。このことは、なかでもプ
ラスミド中に挿入された外米DNAフラグメントの大きさに左右され(DNAフ
ラグメントが大きい程、形成されるプラスミドコピー数は小さくなる)、かよう
な外来DNA及び/又はそのプラスミドが形質転換されるべき微生物菌株の遺伝
子産物の効果である。しかしある場合には、そのプラスミドはより高い温度で数
千コピー数範囲まで生成することがある。いずれにしても全DNA量に対する高
温におけるプラスミドDNA 看は約40〜75%で通常50〜60%である。
この発明の他のタイプのプラスミドは、約30°Cの温度のごときひとつの温度
で約3〜5コピーl細胞のコピー数を有し、そして約42”Cの温度のごときよ
り高い温度では、前記の因子によって約少な(とも500〜1000コピーl細
胞、ある場合には数千コピー/細胞にまで達する制御されないコピー数を有する
プラスミドである。かようなプラスミドは、そのプラスミドが本米有する単一も
しくは複数の複製制a遺伝子の上流側に(upstream)に調節可能なプロ
モーターを挿入することSこよって得ることができる。この明細書と請求の範囲
のために、かようなプラスミドをB型プラスミドと命名する。プラスミドR1誘
導体の場合、調節可能なプロモーターはa OpE遺伝子とQ O!IA遺伝子
の両者の上流側に挿入された。したがってプラスミドに上記コピー数パターン?
示させるこれら両方の本来存在する運裂阻畜剤は、保持されたのである。しかし
もしそのプラスミドがpar部位を欠くプラスミドである場合は〔プラスミドに
分配(partitioni■)の原因であるその部位が存在するとそのプラス
ミドは安定に遺伝されるという効果があり、この効果はpar部位中の1以上の
遺伝子に2囚する〕、そのプラスミドは、低温における低コピー数のために、低
温において約1%/世代の頻腿で失われる。したがって、そのプラスミドのラン
アウェイ複製が確実に全細胞集団に連続して起こるように、かようなプラスミド
にpar部位を挿入するのが有利であろう。
B型プラスミドには、大きなコピー数範囲?もっという利点が茄わる。低温にお
けるコピー数は非常に低いので、その産物スミドに挿入することができる。この
ことは真核逮伝子類の産物の場合に時々ある。これらの遺伝子は従来、例えば医
興産業において高い関心がもたれているものである。低温では複製速度が低いの
で、外来遺伝子は少しも表現されないか又は細胞がそれによって損傷されないよ
うな少量だけ表現され、そして通常の条件下低温で培養することができる。この
ことは、いままで製造が全(不可能であるか又は非常に困難であったある種のポ
リペプチド類の製造を著しく強化もしくは容易にするものである。
この発明の第3番目のタイプのプラスミドは、約30°Cのごとさひとつの温度
で約0.5〜1コピーl細胞の範囲のコピー数を有しく数値0.5は複製の頻度
が1/絽胞周期より小さいことを意味すると解される)、そして約42℃の温度
のごときより高い温度では上記因子によって約少なくとも500〜1000コピ
ーl細胞、ある場合には数千コピー数範囲にまで達する制御されないコピー数を
持つプラスミドである。かようなプラスミドは、本来もっているひとつの複製調
節遺伝子の一部がその復製部位から切りとられ復製部位以外に、すなわちその遺
伝子が本来位置していない座位に挿入され、その複製部位に調節可能なプロモー
ター−Pgするプラスミドである。この明細書と請求の範囲ではこのプラスミド
をa型プラスミドと命名Tる。プラスミドR1誘導体の場合は、それからa o
pB遺伝子が切りとられ、そのaopB遺伝子がそのもとの座位でなくてその復
製部位以外のKaoRl 座位に再挿入される。たとえそうであってもoopB
インヒビター蛋白はそのプラスミドの複製に対し、プラスミドが上記コピー数パ
ターンを示すようなしかたで17を与える。し2))Lそのプラスミドがpar
部位を欠いているプラスミドである場合、そのプラスミドは、低温において極端
に低コピー数であるため、低温では約5%/世代の頻度で張失する。したがって
、プラスミドのランアウェイ複製が全細胞集団に確実に連続して起こるようにこ
のプラスミドにpar部位を挿入Tることは、B型プラスミドの場合より一層有
利であろう。低温と高温ソれぞれにおける複製挙動と、それ故にこのプラスミド
を用いる利点は他の点ではB型プラスミドと同様である。
この発明は第2の態様として、複製部位からの転写を調節する第1の調節可能な
プロモーターに那えて、第2のプロモーターがJ現を$2プロモーターで制御さ
れる構造遺伝子を挿入させるし刀)たで挿入されたプラスミドご提供するもので
ある。
この第2のプロモーターは制御可能であってもよい。すなわち第1の調節可能な
プロモーターご調節するのと同様の手段によって、宿主細胞が培養される条件ご
調節することによってその機能e調節することがでさるのである。laaプロモ
ーター、trpプロモーター、dsoプロモーター、reaAプロモーター、λ
PLプロモーターその他のごとき多数のプロモーターかこの目的に有用であると
現在注目されている。λPLプロモーターは温度感受性のOIリプレッサーで調
節され、それ故増幅条件が同じであり、その績果宿主a胞の培、養が単純化され
産物の増幅がプラスミドDNAの増幅と同時に起こるので、構造遺伝子の表現を
制#Tる第2プロモーターとして待に有利なことが分力)る。
また第2プロモーターはSlの調節可能なプロモーターと同一物であってもよい
ことは留意されるべきである。
42プロモーターは大型、B型及び0型の各プラスミ・ドに挿入できる。かよう
なプラスミドは約3o”c’において、一定の低コピー数を有し、そして非常に
小さい遺伝子表現をもつか又は全(遺伝子表現を持たず、そして約36〜42“
Cの範囲の温度で実質的に増大されるかもしくは制御されないプラスミドコピー
数と、」3伝子表現?有する。このプラスミドとしては、39°C以上の温度で
制御されないプラスミドコピー数と非常に諸い遺伝子表現2仔するものが好まし
い。
この発明のプラスミドはクローニングベクターと産生ベクターとして使用するこ
とがでさ、すなわち、工業や医薬用の広範囲のQ品、特にポリペプチド類と通日
もしくはそのフラグメント、酵$項及び酵素と栄誉培地中の化合物との反応によ
る非蛋白pp物、ホルモン類のごとき低分子遺産・勿、韮びに核m=得るための
組換えDNA技術の分野に使用できるプラスミドであり、a核消伝子持に4乳動
物の遺伝子産物が特に重要である。クローニング産生ベクターとして有用である
ためには、必須ではないが、プラスミドは、少なくともひとつの制御JJエンド
ヌクレアーゼに対しこのエンドヌクレアーゼによって切断しつる特異な座位牙イ
イすることが有利である。この座位は、外米DNAのフラグメント?挿入すれば
、得られた組換えプラスミドを自律的に、1!製させ、かつプラスミドに挿入さ
れた調節可能なプロモーターに複製部位の転写?調節させて、このプロモーター
かラン転写が増大される際に、プラスミドコピー数が実質的に増大されるか又は
制御されな(なるに至る座位でなければならない。刀)くして復製部位に位置す
る制限座位はクローニング座位としては許容できない。というのはこれはプラス
ミドの復製性脂分失わさせるからである。
この発明のプラスミドは、副面可能ナプロモーターを、プラスミドに、このプロ
モーターからの転写が復製を調節するよう1jシかたで挿入し、このように処理
されたプラスミド分、そのプロモーターからの転写か増大されるときに実質的に
増大される2))もしくは制御されないプラスミドコピー数?示すプラスミドを
スクリーニングすることによって、同定することからなる方法で!1′iてられ
る。調節可能なプロモーターかλPRであるときこのプロモーターは、プラスミ
ドとファージDNAを混合し、過当なエンドヌクレアーゼで制限し、熱で不活化
しそして混合勿?運店反応に付し、その連結反応混合物を微生物に形質転換する
ことによって挿入できる。
力)ようなプラスミドの組立ては、プラスミド上の異なる座位1こランダムにプ
ロモーターを挿入することによって行うことができる。調節可能のプロモーター
ρ)らの増大された転写を保証する条件下で補御さnない複製挙動をもつプラス
ミド牙スクリーニングすることによって、正しい挿入が同定される。かようなプ
ラスミドの血便なひとつのスクリーニング法は、檜々の条件においてプラスミド
保有細胞の成育性能ご分析することからなる方法である。徊主細胞中のプラスミ
ドDNAの量は異なる方法、特にそれ自体公知の方法のアガロースゲル電気泳動
法によって測定できる。このスクリーニング法は容易に高速で行われる。
A型プラスミドの組立てlこ関するこの発明の特定の態様において、その組立て
法は、ひとつの本来存在している調量遺伝子の一部とそのプロモーターを取り除
き、プラスミド’R1からのcopB R伝子の場合は制8艮エンドヌクレアー
ゼBg14よって切断し、そしてこの座位に調節可能なプロモーターを含む、B
gllフラグメントのごとき、DNAフラグメント?挿入することからなる方法
である。
B型プラスミドの組立て(こ関するこの発明の他の態様iこ2いて、その組立て
法は、プラスミドに、調節可能なプロモーターを本来存在しているQ 98!i
!1 @システムの上流側の位Aで丁申入しくプラスミド)11秀導体の場合は
、 BglI[による部分的14iii限によってoopE i!伝子の上流側
のBgl1g位)こ)、連結し次いでエシェリヒア・コリのごとき問題の微生物
に形質転換することからなる方法である。またこのプラスミドは、部分的に切除
された本末もっている複製調節遺伝子を有するプラスミドを出発gJ質として用
い、その本来もっている調節遺伝子をそのもとの座位に再m人する( R1型プ
ラスミドの場合はcopB 逆伝千3EgllL座位に再叩入することによる)
ことによって組立てることができるっ
a型プラスミドの組立てに関するこの発明の第3の態様は、出発物質としてA型
プラスミド牙用いて、ひとつの本来もっているAV3遺伝子を、それが野生型親
では位置していな1′J)つたプラスミドの部位に挿入しくR1型プラスミドの
場合は、=、aoR1フラグメントとしてのoopBaJ伝子?プラスミドの傅
α部位以外ノKQORI 座位1こ、 hL3oRIでの制限(こよって・71
人すること1こよる)、連侍しそして形質転換する0と′D)らする方法である
。
この発明の34の1様は、調コ可能なプロモーターを申入するのに和えて、帛2
プロモーターを、このプロモーターによって表現が調節可能な溝造埴伝子の挿入
?許容する適切な制限部位に、挿入することρ)らなる万&である。上記のよう
に、この座位はそのプラスミドの復長部位日に位置していてはいけない。
この発明のプラスミドはミニプラスミドである。Tryゎち、それらの野生型数
プラスミドよりもかなり小さい。一般に約2.5〜15.OX 10 ダルトン
のi市の大さぎで、多(の場合2.5〜10.OX 10 ダルトン、通常4.
0〜12.5 X 10 ダルトン、特に4.0〜5.OX 10 ダルトンで
ある。
公知のランアウェイプラスミドの非id ’41 IN H挙動は、それが形質
転換される特定の細菌株、その組jが培湛される培地、及び挿入されるDNAに
左右されるようである。この依存性は多分、公知プラスミドのランアウェイ復製
$効が部分的に、その転写速度をわずかに増大させるaopEグロモーター中の
単一ヌクレオチドを=aすること4こよって起り、そしてその転写速度がそのプ
ラスミドに挿入される外米DNAのみならず、A連する訓菌の棟と歯株及び/又
はその堵遥培地に関する環境変[ヒによって影響をうけることかあるという事実
によるものであろう。この発明のプラスミドは、強力戸外来プラスミドが活性化
/抑制解除されるとかような変化か有意でないように転写速度コ増大させるので
、同様には限定されないようである。結局これらのプラスミドは広範囲の1株に
形質転換することができて、取扱う上で、公知のランアウェイプラスミドよりも
信積性が高い。
孟たこの発明には、R1以外の野生型プラスミド由来のプラスミド及び又は2.
0oli以外の1ラスミドt& l’微生イカ中に見出されたプラスミドも倉ま
れる。;た本末プラスミドを持ってぃない微生物中に保持されつる上記タイプの
プラスミドを組立てることも考えることができる。いくつかの異なった微生物プ
ラスミドのa裂システムは多くの面で類似していることが示されている。例えば
、丁べての公知のプラスミドはもし復製コ起こしたいならば転写を必要とする。
この発明の原理を利用することによって、クローニングベクターとしてすでに使
用中でかつ所望の微生物で良好に機能することが知られているプラスミドがラン
アウェイ挙J1優ることができるように、他のプラスミドに非副・卸の・1製表
現型を伝達することができる。かくして、調節可能なプロモーター例えばλPR
を、かようなプラスミド中の適正な位I直に、このプロモーターからの転写が復
製を調節するしがたで挿入することによって、非制御の復製かプロモーターから
の増大した転写を保証する条件下で起るのである。
発明の詳細な説明
R1型プラスミドの復製制御システム
基本的レプリコン(Basic rapliaon)現在まで、RI型プラスミ
ドの複製制御システムは知られていない。プラスミドR1のa裂と複製制御に必
要な遺伝情報が耐性トランスファーファクター内に位置する3つのPstlフラ
グメントからなる25004基対の長い部分に保有されていることが見出された
のである(Molin et &1.. :r、 Baat、 138.197
9.7O−79)。
この部位は1i、本釣レプリコン”と定義され、4つの重要な要素すなわち3つ
の遺伝子(aopA、 aapB及びrepA)と夏裂オリジンを有する(Mo
1.in et al、 MiorObiOIOgy、 1981.408−1
1)。この基本的レプリコンの機能地図を第1図に示した。遺伝子repAは復
製を行うため正に必要とされ名機能の遺伝情報を指定する。その遺伝子産物(そ
のDNA配列による)は278のアミノ虐からなり分子童が約33000 ダル
トンの蛋白である(Rosan at al、、 Mol。
G@n、 ()emt、 179.1980.527〜37)oこの蛋白は明確
には同定されていないが、そのrepA遺伝子から蛋白を形成する容置は、1a
OZ遺伝子との翻訳遺伝子融合体を使用することによって明確に示された(Id
ght and Mo1in、 Mo1. Gem、 Gen5t、 184.
1981.56−61)。I’1epA inの生化学的機能はまだ充分に探究
されていないがRspA蛋白は複製開始因子であると信じられる。
遺伝子oopAは、高度に二次構造e−1−1する小さり(80〜90ヌクレオ
チド長)不安定なRNA分子(すなわちそれはへヤピンループご形成している)
合成の遺伝情報を指定している(8tou−gprdat al、 、 Pro
o、 Natl、 Aaad、 8c+i、 tTsA 78.1981.60
08−6012)。
0opA−RNAは復製のインヒビターである。GopA−RNAのヌクレオチ
ド配列に影響する突然変異は増大したコピー数に導くことができる(oop突然
変異体〕。Q OpA突然変異体のDNA配列分析によれば、すべての突然変異
が5つの橿基内のループ部分にきわだって群がっていることを示している。これ
らの突然変異によって、野生型プラスミドに対するインヒビターの活性か著しく
減少するか又は全くなくなることになる。それ故に、そのインヒビターの特異性
はそのループ部分に存在すると結論することができる。またそのヌクレオチド配
列が知られているすべてのcopA突然変異体において、0opA−RNA中の
シトシンがウラシルで′、i慢されていた(もしくはある場合はアデニンによっ
て、、i侯)ということは驚くべきことである。このことはσopA−RNAが
核誦/核嘴相互作用によって作用することを強く暗示している。この、漬倫はさ
らに、次の事実により強化される。すなわちその事実曇こよって野生型プラスミ
ドに対してすべてのGopA活性を失ったこれらのcopA突黒変真黒変異体れ
ら自身に対していくらかの0opA活性2床持しているということである。さら
にこの野生型0opA−RNAは再々、copA突然変異体プラスミドに対する
阻害効果を減少している。それ故a opA突然変異体はインヒビターで変化す
るだけでな(標的のcopTでも変化し、単一の橿基111換によって表現型的
に二重突然変異体(double mu−tant)になる。 a opB遺伝
子は分子1111,000ダルトンの86アミノ酸の1基性蛋白合成の遺伝情報
を指定している。この蛋白は多1形成される。c opB遺伝子とそのプロモー
ターが欠失するとコピー数か8倍に増大するに至る。それ故copB &白は、
復製インヒビターとして、すなわちプラスミドR1の復製の調節において負に作
用する制御要素として作用Tると結論される(MoLin at al、、 M
o1. Gen、 Genet、 1B1.1981.123〜30)。
二重突然変異体(oopAoopB)は、いわゆるランアウェイ復製のために宿
主微生物に対して無条件に致死性である。したがってこの2つの制御遺伝子産物
は相乗的に作用する。
基本的レプリコンの転写活性
基本的レプリフン内に3つの転写開始座位がある。丁なわちaopB プロモー
ター、rep人プロモーター(Iaight am Mo1in、 Mol。
Gsn、Ganat、 184.1981.56−61)及びaopA J 伝
子のプロモーター(Stougzad at all、 op、 :it、)で
ある。原遺のものはその元の部位乃)ろハIxれて転写し、−万前の2者はもと
の部位にむかって転写する。活局両ストランドはa opA部位iこおいて転写
される。
0opB トランスクリプト(transcri′pt)はQQI)B J伝子
ヲ通って続き、このトランスクリプトとrep人グロモーター會こおいて始まる
トランスクリプトの両者はrepA遺伝子を転写する。
BgI ![での制限によって組立てられてcopBか除刀)れるとプラスミド
R1のコピー数か8−10倍管こも−V、X+する。このことは意外なことであ
る。というのはo opB遺伝子プロモーターと00pB jWn:、4E子の
近泣都が除かれると、リ (lopB活牲が失われるとともにrepAプロモー
ターの抑制解除が3こり、2〕copBプロモーターの全r9pA謹現への寄与
が失われ、その債果、I41 Xj’l解除されたrepAプロモーターかc
opEプロモーターρ)らの全repA N写ご効果的に引継ぐ小らである。こ
の全効果jl、repAプロモーターがQ opEプロモーターの強力以上に2
倍項大した強力な有するので、repA遺伝子の転写速反が2倍たけ項71IO
Tる(こうがいない。
この明らかな逆説はoopA遺伝子の活性で説明される。0opA−RliAは
、−運のウリジン(t])で終っているステムご有する正常終結構造でfi−舖
している。EtepA蛋白形説の0opA−RNA制御はかような」正なら冬烟
5こ左方される。対問するストランドの転写が強力な喝せは(収斂転写)、転写
の効率は減少する。repAからの転写が増大すると0opA )ランスクリプ
トか約150−200ヌクノオチドまで拡大する。この拡大しF GopA ト
ランスクリプトはり延庚インヒビメーどしてji !a 化しない。丁な。ちそ
れは実質的に不活化され、RepA潰白1が増卯し、最終的lこプラスミドコピ
ー数が増大する(stougaaa et &1. 、 zuno yo動m1
1.1982゜323−328 )。
復製の制御
2つの遺伝子oopAとa opBからの産物はプラスミドR1の復製?負に制
御する。すなわちこれら産物は復製インヒビターとして機能する。repA−1
ao @合体の組立てと分析7通じて、この2つの0opi伝子の産物がrsp
A遺伝子の表現ご負に制御して作用するということ分示すことができた(Lig
ht and Mo1ix。
Mol、 Gen、 ()enet、 184.1981.56−61)。それ
故にプラスミドR1の復製は、このプラスミドの複製開始にたぶん正に必要な蛋
白の形成を調節することによって制御されているようである。
laa遺伝子融合によって、 oopAとo opBの産物が別個の標的?有す
ることも証明された。0opB i白の標的はrepAプロモーターであり、こ
のOop蛋白はrepAプロモーターにおいて転写開始ご阻フイする作用を行う
。し刀)L、 GopB蛋白はrepAプロモーターの上流側で開始された転写
を妨害することはできない。0opA−RNAは転写には影響しないか、転写後
レベルで作用する。すなわちRam)A−1!lRNAの翻訳を阻害する。
ランアウェイ突然変異体の複製
公開ヨーロッパ特許出i1男78.101877.5号に開示されているプラス
ミドのa製システムは、野生型R1プラスミドについて上記したのと実質的に同
じである。この発明の発明者らによる新しい研究によって、ランアウェイ複製挙
動を有Tる温度依存性プラスミド突然変異体が存在する理由が一部確認された。
上記説明のように、repA遺伝子への転写が増大すると0opA−RNA分子
の失活に至ることがめる。上記特許願に開示されたランアウェイ突然変異体プラ
スミドにおいて、oopBプロモーターは、次に示すように配列しているうちの
ひとつのヌクレオチドを1換することによって突然変異?起こす。
&) ff生型フラ7. i l’ 5’ −−−−TTcTOAAGTcGC
T−−−−3’b) ランフ’)エイ突然変異体 5’ −−TTOTOAAG
T7’GOT−−3メイタリック体文字がヌクレオチド償換?示す。認識されて
いる部位はRNAポリメラーゼ結脅座位である。
この突然変異は、a opBプロモーターからの転写を、特により高い温度で増
大させることが示された。
調節可能なプロモーターを有するプラスミドの複製この発明のプラスミドの組立
てには、この発明の発明者らが新しく得た身生型R1プラスミドの復製システム
の知識ご利用することができた。しかしこの発明のプラスミド複製は、公開ヨー
ロッパ特許lIA第78.101877.5号に開示のランアウェイプラスミド
の場合のように、プラスミドの突然変異によってなされるのではない。その代り
に、外来プロモーターか挿入され、その結果複製部位の転写が少なくとも部分的
にこのプロモーターで制御されている。このプロモーターは、宿主微生物が培養
される条件下での調節によって調節可能であってもよく、プロモーター活性の調
節は、培#:温度又は培養培地の組成を変えることによるなどの種々の手段で行
ってもよい。
調節可能なプロモーターが温度依存性プロモーターの−4から選択されたひとつ
のプロモーターである際は、λPRもしくはλPI、持にλPRのようなバクテ
リオファージλ由来のプロモーターが好ましい。ファージλにおいて、PRプロ
モーターはalリプレッサーによって制御され、このリプレッサーはこの発明の
原理にしたがって、ファージλからλPRとともに誘導され、Bgl 11 フ
ラグメントの形態のプラスミドに挿入される(添付したプラスミド地図第4−1
1図塁照)。野生型clリプレッサーはそれ目体温度感受性ではない。そこで培
4温l?調節することによって41製システムご調節可能にするために、用いた
特種0エリプレッサー(下記実施例参照)は温度感受性であり、突然変異体対立
遺伝子(mutant aue) CI、、ヮによってコードされている(Su
saman and Jacob、 Oomt、 Ram、 Aaaa、 Sa
i、 254.1962.1517)。
このリプレッサーは活性である。すなわちこれはλPRプロモーターを、約30
℃の温度のような低温で抑制するが、一方約69°C以上の温度のごときより高
い温度では変性さnて、そのリプレッサー成能が不活化されλPRの抑制が解除
される。その挿入されたプロモーターが非常に強力であると、その店来repA
への転写が著しく増大し、次いで非制御プラスミド復製にいたる。
また、プロモーターの調節は化学的手段によって行うことができる。すなわち、
プロモーターを誘発する化学吻質?添加して例えばリプレッサー制御プロモータ
ーの活性?不活性化させその糖果プロモーターの抑制を解除させるとか、又はプ
ロモーターを活性化することになるプロモーター透発注の代謝物の形成?保証す
ることによって、宿主微生物が培堡される培地の徂’afi、を調節して行われ
る。化学的に誘発しつるプロモーターの特例は、2つの染色体リプレッサー蛋白
すなわちdeoRJ伝子とCytR遺伝子の産物によって頁制御?受けるE、
0oli カ)らのdθ0プロモーターである。このieoプロモーターは培養
培地にシチジンご添加することによって抑制を解除することができる。
というのはシチジンは、そのリプレッサーに対する親和性によって作用しリプレ
ッサーの高次構造に変化を起こさせ、その結果リプレッサーがリプレッサーとし
て機能するのご停止するからである。加うるに、正の制卸はカタボライトリップ
レッション(catabolite repreasion) f通じてdeo
プロモーターからの表現で行うことができる。サイクリックAMP (OAMP
)によるarp畷白(カタボライトリプレッサー蛋白)の活性化によってむ〇プ
ロモーターの活性が賦活される。高細胞レベルの。AMPは、低レベルのグルコ
ースと相関関係があることが知られている。
すなわち培堡培地からのグルコースの欠如は限られた虚だけのグルコース、例え
ば約0.01%の虚を、グリセロールもしくはコハク14とともに添加すること
によって得られる。グルコースが’lJ3によって消費されると、その糖果a
AMPの細胞間レベルが増大してdeQプロモーターを活性化しそのプロモータ
ーを有するプラスミドの複製速度を増大させるに至る。かくしてdeoプロモー
ターがプラスミドR1誘導体中の。opE遺伝子の上流側に挿入されると、その
プロモーターの透導によって複製が増大するかもしくは全(非制御になる。この
非制御復製挙動は、プラスミドのコピー数かプレインダクションのレベルまで徐
々に減少するよう]こ培イ培地にグルコースを添加することによって逆翫させる
ことができる。化学的に調節可能なプロモーターのもうひとつの例は、栄養培地
中にラクトースを存在させることによって透見され、増大もしくは非制御の復製
1こjJ達させるlaOプロモーターである。この場合もそのプロセスは、ラク
トースが最終的に′a胞によって消費されるような孟のラクトース?培地に添加
することによって逆転させることができる。
調節可能なプロモーターを有するDNAフラグメントを、本来存在しているひと
つの複!i!調節遺伝子の一部分、例えばプラスミドR1のoopB a伝子の
一部を占めるBgLlフラグメントの部分の代りに、適正な位置と配向で挿入す
ると、そのプラスミドA導体の’、Jl’AA度は挿入されたプロモーターによ
って少なくとも一部分が制御される(A型プラスミド)。
調節可能なプロモーター2宵するDNAフラグメントを、本来存在している41
製調節遺伝子のすぐ上流側に正しい配回で挿入すると、プラスミドR1透導体の
oopB UJ伝子の場合、わずかに異なる復製性能?有するプラスミドが得ら
れる(B型プラスミド)。
上記のようにpar部位を欠くB型プラスミドは約1%/世代の頻度で失われる
。培養物中にそのプラスミドが存在するためのセレクションがないと、そのプラ
スミドは約30°Cで1祷される組’I+1から最終的に喪失する。このプラス
ミドを安定比するために、例えばB型プラスミド中の野生型R1プラスミドから
のpar部位EWするD1iAフラグメントご挿入することもできる。
このようにして類似の条件下で培養される旧胞巾におけるプラスミドの完全な安
定性(喪失なし)がもたらされるのである。
プラスミドの安定性は次のようにして測定できる。最初に、par部位だけでf
j(lac遺伝子が挿入されたB型プラスミドを有する則泡と、対照としてLa
a遺伝子?もつがpar部位分もたないB型プラスミドをもつa胞とを、出発コ
ロニー中に両方のプラスミドが確実に存在するように、選択して抗生物質(その
プラスミドが耐性を伝達する)を含膏するプレート上で培養する。次いで両者の
コロニーの試料を全く尻生吻質コ含まtいプレート上にストリークして、例えば
25世代のような多数世代(細胞倍加)の間セレクションなしで成育するにま刀
)せる。最後に、得られた両方のコロニーからのMH&とマツコンキイラクトー
ス指示プレート(maoonkey 1aatose 1ndiaator p
late)上にストリークする。そのプレート上において、 p&r部位含有プ
ラスミド’ft最初に有する細胞は赤色コロニーを形成してそのプラスミドが保
持されたことを示すが、一方par部位なしのプラスミドを最初に有する対照の
細胞は赤色と無色との両方のコロニーご形成し、セレクションなしの期間にプラ
スミドかい(つかの細胞から喪失したことを意味する。このようにしてpar部
位の挿入されたプラスミドは完全に安定化されたことが示される(実施例11参
照)。この安定化効果は、挿入ぢれたDNAフラグメントが、プラスミド含有細
胞ごプラスミドご含有しない珊胞と比較して、その成長速度を減少さ、せる場合
に重要である。
最後に、プラスミドR1のa opB遺伝子のような本来存在している複製調節
遺伝子を有するDliAフラグメントをA型プラスミドの復製部位以外の座位に
挿入すると、特別の亥裂性能?有するプラスミドが得られる(C型プラスミド)
。
B型プラスミドについて先に述べたプラスミドの安定性は、0型プラスミドにつ
いて一層顕著に望まれることである。というのは上記のようにこれらC型プラス
ミドは低温1こ3いて一層低いコピー敗分、イし、それ、Xpar部位を欠いて
いる場合はB型プラスミドよりも高い傾度で失われるゆらである。0型プラスミ
ドは、pNr部泣が存在していないプラスミドの4合、ころにpILr品位3山
人することによって同様ζこ安定1ヒするここができる。
この発明の峙シ;11の態様(こよって、次のよ・ラナプラスミドが提供される
。′fなわうそのプラスミドはJ−の調節可2なプロモーターに加えて、プロモ
ーターが、列えば所望のポリペプチド合成の遺伝情・服?指定する重大された外
来・構造遺伝子の表現を調節Tる復製部位以外、こ泣ユする第二のプロモーター
を有Tるこの;肌1のプロモーターは、刀えばλrRプロモーダーとol遺伝子
とご追J’JOして1−ITるフラグメント上に位置するq■ プロモーターで
もよい。そしてそのCIプロモーターはal遺伝子産物で哨即されλPRの逆方
同に転写する。0■プロモーターによってその表現が調節されつる構造遺伝子f
、QIプロモーターの下流側(dovrr+atrem)に挿入することができ
る。−例として、laoプロモーターを欠< 1ha 遺伝子(laaオペロン
として知られている)がal遺伝子の下流側に遡入されたが、得られた遺伝子産
物の4′、4から、1aciJ伝子の転写は、少な(とも一部分がOfプロモー
ターによって制御されていることか示唆された<’x笥h”>=雰1”ff )
。小(して、この発明Ωプラスミド栄、外来;1伝子1西入711のクローニン
グベクターとして用いることができることが示さ;′1、た。この0■プロモー
ターはOI リプレッーGこよっても調節”T胎でシリ、その店果遺伝子語物の
一$扇がプラスミドDNAの増幅と同時に起こるという利点3荷する。
また第二プロモーターはλ九のようなλプロモーターでもよく又)まroahプ
ロモーターであってもよい。第二プロモーターがλPである場合、このプロモー
ターは、ファージλからのBamHI−Bg1mフラグメントとしてプラスミド
にr4人することができ、カくシてBamHl、 BglI[、3au3A及び
Ba1iのようないくつ力)の制@酵素で生成され71:DNAフラグメントの
挿入用に好都@なりローニング座位(BamHL) ”e産生する。またλpL
は、このプロモーターを有するプラスミドからの適当なりNAフラグメントに挿
入してもよい。またλPLは、項線条件が同じであるように温度感受性のalレ
プレッサーによってfil制御されるので第二プロモーターとして有利である。
−万プロモーター力s rea人の場合、例えばPEM’ff14 (Uhli
nand O1&rk、 J、Baat、 14B、 1981.386−90
)からのBamHI フラグメントとしてこの発明のプラスミドを挿入してもよ
い。このプロモーターは、reOAプロモーター保有プラスミドが形質転換され
た微生物菌株によって異なるしかたで機能Tる。raoA菌株中でr@o^は1
exAリプレツサーによって制御さnlこのリプレッサーはその微生物の染色体
上に位置している。例えば非制御複製か温度で誘導される場合、プラスミドのコ
ピー数としたがってreoAプロモーターの数とか徐々に増加する。IIIXA
リプレッサーは、少′!瀘生産するだけでありそしてrea人プロモータ一部位
に強固に結合する0とによって融能するので、 1exAリプレツサーの利用し
うる瀘は、コピー数が増大するにつれて徐々に滴定される。このようにして、r
ecムが禄々1ζ抑制解除され、プラスミドコピー数が高くなるとreOAから
の転写ρS対応して増大する。
クローニング及び虚壬ベクターとしてのこの晃−男のプラスミドこの発明のプラ
スミド類は、クローニング及び産生ベクターどしてのま能、こ3いて矢のような
チくの特徴を有する。
1)こ几らのプラスミド類は分子省が約4.0〜12.5 X 106グルトン
で小さい◇のである。サイズが小さいので我扱いに使柄で2bつ彫i玩茨効皐が
同上する。
2)これらプラスミド類は制限エンドヌクレアーゼ瑣に対する特異な座位企多致
有Tる。“特異な゛の用語はひとつの特異制限コーンドヌクレアーゼに対してそ
のプラスミドかその酵素によって切断可能なひとつのそしてひとつだけの座位?
竹すること2急味するものである。
すで1こ述べたよっ化、腐袈部位内ζこ位置する制限)y位はクローニング座位
としては許容できない。かくして下記実施例に=c!械のプラスミドにおし)て
、bj限座位の5dllとPstlとは、プラスミドのレプリコン甲に位置して
いるのでクローニング座位としてi切でなく、−万制限座位のEooRI とB
amHI とはこの4(要な部位中に位置していないので外来DNAの尋人に有
用な座位を形成する。爾切な制Φ座位かプラスミド目体に見出されない場合は、
かような座位を有する小さなIIHIAフラグメント(リンカ−として知られて
いる)を実施例4に記載のようにして1ラスミドに迎入して組立てることかでき
る。
しかしながら挿入された構造遺伝子の表現を確実に行わせるだめに、構造遺伝子
自体の上流側で第2プロ玉−ターの下流側に位i1Tる適当な翻訳開始シグナル
(リボンーム結合座位)を有する必要もある。
リボンーム結合座位の存在を保証するひとつの方法は種々のDNAフラグメント
(例えばリンカ−のごとき)を挿入する方法である。そしてこれらのフラグメン
トは合成で作ることができて各々異なる構遺遺伝子に対する翻訳開始シグナルを
有する。一方、微生物にて表現されることがすでに知られている遺伝子含BDN
Aフラグメントを完全にランアウェイクローニングベクターに挿入してもよく、
かくして適正な翻訳開始シグナルの存在が保証される。
3)上記のように、できるだけ小さいクローニングベクターご有するのか有利で
あるが、そのクローニングベクターが、プラスミド官有細胞の同定及び/又は選
択に有用ないわゆるマーカーの表現用の遺伝子を有することが多くの目的にとっ
て実用的である。最も有用なマーカーは、例えばアンピシリン耐性のような抗生
物質耐性である。というのはこれは組換えプラスミドを微生吻償主に形質転換す
る処理をした後、その組換えプラスミドを受け入れなかった微生物を容易に逆選
択することができるからである。下記実施例に、i12載のすべてのプラスミド
に存在する他のマーカーは CI遺伝子1こよって暗号化恣れているλ免疫であ
る。この発明のプラスミドのさらに宵、用な法1は、特異な座位がそのなかに位
1している、選択可能な表現型を伝達する遺伝子が存在していることである。
この座位にDNAフラグメントを挿入Tるとその遺伝子の挿入失活が起こる。こ
の例としては、Laa+表現型モ伝1する遺伝子については実耐例9(こ、クロ
ラムフェニコール耐性牙暗号化している遺伝については実施例12に記載されて
いる。
マーカーク1えば抗生物質)耐性を、クローニングベクターとして用いら几るべ
きこの発明のプラスミドに導入したいときは、転位(transpositio
n)によるか又はそれ自体公知の方法で外米DNAフラグメント?挿入すること
によって行うことかでさる。
かよう1j転位の例は実施例4に示す。
・竹ユ)ミ方tlミ
この発明はまた、A節可能なプロモーターが、転写が複製ごA節するようなし刀
)だ、持にプロモーターからの転写か増大するとプラスミドコピー数がAK的に
増大Tる2:l)もしくは非制御(こなるようなしかたで挿入されたプラスミド
を有する微生物を4JL、2’a可m11プロモーターからの転写の増大を保証
しその舖果プラスミドコピー数が実質的に増大Tるかもしくは産制・IIcなる
一j!件下での少なくともひとつの培A期分仔し、次いで攻生−’:’A ”d
a吻2:l)らプラスミドの遺伝子産物を収]することからなる、プラスミド
MAの遺伝子産物の製造法を提供するものである。堵従自体は、1司jの微生@
種に最適なことが知られている通常の栄a−g地?含む通常の技術を用いて適切
に行われる。
またX1伝子産甥の収膚は、製造された特定の遺伝子産物の本質と性貫、宿主歳
午吻の性貞などに通する公知の方法にしたがって行われる。この発明はさらに、
この発明のプラスミドが鵬胞の所望数が得られるまで、接擁と増殖の段階におい
て一定の低コピー数Jこμる条件下で形質#i摸された宿主微生物を培弄し次い
でその宿主微笠吻ご、プラスミドコピー数が実質的に壜入するか又は非制御tこ
なる条件下で培養する方法ご提供するものである。
したがって、培養は、はじめに、プロモーターからのどんな転写もプラスミドの
コピー数に有意に7彫響しない条件下で行ってもよく、その後プロモーターの活
性分誘発する物質を、堵フ培地に、実質的に夏裂か増大するか又は非制御になる
澁で添加される。所望により、これらの培養条件は、プラスミドの実質的な増福
を得るのに充分を期間であるか、改生物培:a@の実質的な損傷ご回避するのに
充分短かい期間の後に逆転させてもよい。前記物質は培養媒体から除去されると
プラスミドコピー数が最終的にプレインダクションレベルに到達するまで徐々に
減少するにいたる。ここにおいて、1除去される”の用語は、問題の吻貢ご培λ
媒体から完全になくすことを意味する必要はないか、その勿筑がもはやいかなる
効果も有しない程度の1度にまで減少させるlこTぎないことな意味する。
ある物質によって誘発されるよりもむしろ阻害されるプロモーターを用いるもう
ひとつの方法において、微生物培養物は最初、使用される特定のプロモーターの
活性を阻害する一vJ賞の存在下で培嗟されてもよく、その後、その@質の4度
?、例えば4膚媒体?希沢するか又は徐々に討胞iこよって消謹させるかによっ
て、プロモーター?活性化させるにいたる程度に減少させ、その舖果、プラスミ
ドコピー数に実質的に増重さ丁か又は非制御にさせる。所望により、この培1条
件は、プラスミヒのAS的な増逼?得るのに充分な期ト」であるが讃生吻−!A
物の実彦的損傷を回避するのに充分急い期間の後プラスミドコピー数がプレイン
ダクションのレベルに到達するまで徐々に減少するにいたる量でプロモーター活
性の阻害力λを、添加することによって置き換えてもよい。
また微生物を培養Tる条件にrま、プラスミドコピー数が実質的に増加するか又
は非DI#になる温度かその近傍温度におけるある培養期間が少な(とも含まれ
ていてもよい。
調節可能なプロモーターが@1依浮性か又は11濃受性の因子で調節される際は
、この発明のプラスミドで形質転換された微生物の生産規模の培養物までの増殖
は、増加するプラスミドと遺伝子産物のよ1f8こよる故生物式育のどんな用言
をも避けるために、プラスミドが一定の低コピー故壬示す温度又はその近傍1度
で行うのが好ましい。次いでその温度を、プラスミドがI質的に増大もしくは産
制−のコピー数を示す温yに変えてもよい。生産期l!lは、致午例の成育がプ
ラスミドからのプラスミドDNA及び/又は遺伝子の産物によって阻害されるま
でのことが多いが、適切な生産期間の後、遺伝子産物の収1か行われる。
特定の条件によっては、プラスミドの遺伝子産物の1か増大する(次いでこの産
物は培養物から連理的もしくは間欠的に収攬できる)とともに、宿主微生物が存
続し成育し浣けることができるように、プラスミドコピー数か実質的に増大する
か又は非制御状態薯こなる温度にごく近い温プで」銹的に當帝培傳を行うことが
好ましい場合がある。
一方その微生物は、プラスミドコピー数が一定である温度で用度規模の培養まで
増殖させてもよい。次いで温度をプラスミドコピ一式が尖ス的Jこ鳥人するか又
は非瓶御になる1gもしくはその近傍の温度に変える。次いでプラスミドの実S
的増幅を得るのに充分な期間であるが微生物培地のいかなる実質的損傷を避ける
のに充分垣乍い′iA間、前記温度を保持する。その&温度を、−主の低いプラ
スミドコピー数を保証する温度にもう−ri変化させ、プラスミドコピー数牙徐
々に減少させる後者の温度で、該コピー数が最明のレベルに到達するまで逗産培
逼を続ける。この層養法は、プラスミドに油入される外来遺伝子が、約30″C
より高い温度では生存できない生物力)ら白米のものであって、その請来かよう
な遺伝子の遺伝子産物かより高い温度で変性され名ことがある場合、特に1要で
ある。さらに、この培誓法を採用すると通′S%雀伝子産物の収率が高い(実施
例16参照。Th1in et al、、 Gene 6.1979.91−1
06. $11表を比破せよ)。
プラスミドコピー数か実質的に増大するn)・61.<は非制御になる温度は、
プラスミドが一定で低いコピー数を有Tる温度よりも高くてもよい。この高い温
度は例えば約66〜42°Cの範囲のIaL?である。
図面の説明
次に図面:2説明Tる。
第1図は爵生長プラスミドR1の復製6位の概略図である。
第2図は下記第3〜14図Qご用いられている記号の手引きである。支び
第3〜14図は冥n例もこ記載のプラスミドの制限地文を示T041 a iこ
、プラスミドR1のi、本釣レプリコンの概略図か示され、その中の縦線を入れ
た部分は翻訳された部位(trawlatecLregion) a’意味し、
ブランク部分はトランスクリプト企意味し、点線部分は可能なトランスクリプト
ご意味する。丸の中にヘヤピンル−1め拡大図が0opA−RNA の高度の二
次構造?説明するために示されている。Orbは=裂のオリジンを示す。水平の
矢印は転写の方向と意味する。
第2図;こ下記茅3〜14図に用いられている記号の手引きモ示した。AはR1
型プラスミドからの工rAi、Bはバクテリオファージλ(xnλ4)白米のD
NA’P、CはT!13 )ランスポゾン(EDλTn3 zzらの〕からのD
IAL、DはプラスミドpBR,!i22刀)らのDNAを、Eはプラスミドp
MO871からのDNAを、7はプラスミl’ f)7111424 カラノD
NAg、GはプラスミF psK9104 カラのDNAを、旧ゴ楢這送伝子と
重要な5位2、工は転7方回の表示を付したプロモーター?、及び+Tはプラス
ミドの大きさのスケール?それぞれXK味−fる。ブランク部分はプラスミドp
EEU14からのDMAを意味Tる。
23〜14図)こけ各5(施例に5己戟のプラスミドの口線卵j限地図が示され
R1型プラス′ミドの遺伝子型は水平線上に記入して示されている。し2こがっ
てcopE4ま、copB通伝子遺伝 opA遺伝子との間のrepAプロモー
、ターからの転写で抑制Tるポリペプチド置数の遺伝子情報2指定する遺伝子を
示す。copAはF、apA−mR4(Aのi訳ご阻害するL(4JA分子をコ
ードする遺伝子2示す。OriはH”Aの増殖型オリジン蕾示す3aphA は
カナマイシンに対する耐性な暗号化する遺伝子ご示す。blaはアンピシリンに
対する耐性Ti:vi号化する]λ伝子を示T61anAとl&oτと1aaZ
は挿入され7’zlaOオペロンご示し、 1aaAはトランスアセチラーゼ、
1aaYはパーミアーゼ及び1aoZはβ−ガラクトシダーゼそれぞれの甘酸の
遺伝情報を指定Tる。” 857 はλPRプロモーターの温度感受性リプレッ
サー合成の遺伝情報を指定する遺伝子分示す。t npRとtnpAはTn3ト
ランスポジション械1シをコードTる遺伝子を示す。parはプラスミドの分配
の135を因である部位を示す。reQAは組換え蛋日の遺伝情報を指定Tる遺
伝子を示す。またprecAはreaAプロモーターを示す。
水平−の下側には制限酵素の座位が示され、PはPstlを、B2はBgli
f、S、はsal Iを、EはIce oRl を、R3はH1nd厘 ご、E
amHI座位との融合体を、0は01alをそれぞれ意味する。第11図に2い
て、記入されているプラスミドは他の図中のプラスミドと同じスケールで画かれ
ている。括弧でかこんで挿入した部分は挿入されたlaa通伝遺伝示T0原料と
方法
用いたエシェリヒア・コリに一12菌株は08H50であった(Δpro−1a
o 、 rpsL i JlMiller + 時er論nts 江Mo1se
ular Gene−tias、0old 9ring 1krbor Lab
oratory、001(l Spring Harbor、New York
。
1972)。いくつかの1ラスミド(441ff)とバクテリオファージ(第2
表〕が用いられた。
用いた実験技術は、未生物遺伝学の分野で用いられる標準技術(J、 Mill
er : Dcperim@ztta in Mo1e6uLar Gemti
as、 OoM 険1ng H&−rbor、 Mm York 1972)と
遺伝干燥作法(D&n1sh、 Botstai ancl Roth iA
manual for Gonetic 二場1n・ssring ; Adv
anoed 玉otertaIG@n1ltio+!0ola Spring
館bor、 New York、 1980 )であった。
丁べての’aM aia +1、LE 4m (Eertani、 、7.3a
Qt、 62.1951.293)又はA”Bミニマル培地(Olark &2
1IIiMaal(pe、 J、 1Jol、 Biol、 23.1967゜
99)中でqtされた。そして用いたプレートはLB号地と1.5%基天含Hの
LAプレートでめった。プラスミドの装造と分析は、StO携驕rd ancL
Mo1in、 Anal、 Bioahsm、 118.1981.191に
記載の方法奢こしたがってdye b67&nt density gradi
ent centrifugation法?用いて行つに。プラスミドイ辻」」
定のためのD NAの標識と浴屏>7i+勿の・授遣は、Mo1in at a
l、、 J、 B&ot、 138.1979.70にしたがって行った。プラ
スミドDNAの相対同寸は、グラジェント中の染色体バンド千のそれに対するプ
ラスミドバンド中に存在する標−哉されたチミジンの)よとしてン珪り疋された
。
ノミ施ヅ]1こ用いた制御dエンドヌクレアーゼ追は製造メーカー提供の現尼壷
こし1こかつて匣用した。部分制限は酵素の10借希釈剛で行った。
さらに下記のスクリーニング法分用いた。
1、 λ免疫性(immJ”)についてのスクリーニング記載された全A彪例に
3いて、”85ヮ突然変異体の対立遺伝子を用い1こ。この遺伝子を相゛するプ
ラスミドは、宿主のエシェリヒア・コリのfirllti−30”Cにおける浴
困ファージの!′8染に対し耐性にする。I耐性nHiJを珈択するために、油
清ごプレートにひろげるj!iJに10L1以上のλb2ファージの粒子?那え
る。生存しCいるコロニーとさらにそれらのプラスミド−途について試験し2、
oopB−についてのスクリーニングlacプロモーターが除去されたlacオ
ペロンとrepAプロモーターとの遺伝子融合体コ組立て次いでp15プラスミ
ド(PGA46)に挿入される。ひとつの得られたハイブリッドプラスミドpJ
L217は、Δlao宿主のエシェリヒア・コリ菌株中に存在するとLaa 表
現型の原因である。
Laa fi現型は、マツコン牛イラクドース指示プレートで容易に検出される
(赤色コロニー〕。pJI+217 ”x有するaJ泡中にaopB+遺伝子が
存在するとLaa−表現型になり該指示プレート上に白色コロニーとして現れる
。カ(シて。opB+ハイブリッドは、プラスミドDNAがプラスミドpJL2
17 f有するエシェリヒア・コリΔlao細胞に形質転換されるとき、Laa
−コロニーとして容易にスコアされる。
第 1 表
使用したプラスミド類
1)KN1562 S、 Mo1in at &工、、 J、Baot、、 1
38.1979. l)p、 70−79゜pB1322 F、 Boliva
r et ml、、 (Jam 2.1977、 L 95゜pJL217 r
spAプロモーターを有するpKN1562からの5au3Aフラグメントip
、TL207のEgll座位に挿入して組立てられた。laaプロモーターなし
のlao遺伝子分有するハイブリッドプラスミド。
pOU16Light &nd Mo1in、 Mo1.Gen、 Gen5t
、184. 1981. p。
第 1 表 (涜き)
pGA46 An and F’riesen、 T、 Baat、140.1
979. W、 400〜407゜
I−+1JO9030asIM3Aban at al、、 J、 hat、
143.1980. p、 971゜p IJ○3710&8adaban o
t al、、 op、 oit、、 971゜!−V1(1424プラスミドp
VH17つ)らのdeoプロモーターを有する 5au3Aフラグメント(Va
lentin−Hanssnet al、、 mMBo 、T、、 1982.
317) ’E”、プラスミドpMO1403のBamHI座位(Oasムba
n et al、、 op。
ait、、 971)に1申入するP、 Valentin−Hansen法1
こよって組立てられた。
p3Ks104 1aaプロモーターとpM13mp7 XIDらの翻訳開始部
位を汀するPiru 1 フラグメント(Measinget al、。
Nualeio Aoida Res、 9.1981.309) f、plJ
Q 1403のSm&l座位に挿入し、次いで1aoZセグメント間に対応組換
え?行う、M、 0aaaムbΔn法によって組立てられた。
pKN1a4 Nordntr6m at al、、 Plasmid 4.1
980.322゜pJL3 Mo1in at al、 、 Mol、 gen
、 Gonet、 181.1981.123−130゜pVli 1451
Valentin−H&n5en at al、、 op、 cit。
pBEiυ14 IJhlin感01ark、 J、 hot、 14B、 1
981.386−90゜pMO14030asadaban et al、、
J、 hot、 143.1980.971゜第 2 表
使用したバクテリオファージ
EI)λ4 Dempsey s Willetts、 、r、 Baat、
126.1976、 p、 166゜EDλTn3Norutr′6m、 Mo
1in、 Aagaard−Hsns*n、 Plasmid、 4゜+980
. pp、 215−27゜
プラスミドPKM1562は、その後の研究によって付は加えられた若干の改変
?除いて、Mo1in at al、 ; ”Oluatering of G
enesInvolved in Replication、 0Op7−be
r 0ontrol、 lnoompaitibilit7゜&nd 5tab
1e Maixtenanao of the Rosistanae Fla
amid R1ar6−19”、J。
扼at、 138.1979. pp、 70−79ζこ記載されているのとす
べての主要部で同速にして組立てられたプラスミドR1の誘導体である。
1)KN1562は6.9 X 11]’ダルトンの分子盪を有し、copA”
、copB”、repA”、aphA” 、△parの遺伝子型を有する(第3
図3照)。これtマカナマイシン附性モイする。このプラスミドは野生型プラス
ミドの一1裂性能ご可し、3−57高速成育細胞のコピ一致を有し、かつpar
遺伝子(分配のための遺伝子)を欠いているので1%/世代の頻度で失われる。
pKN1562−= Bg’Hで刊1貝してcopE 遺伝子の一部を除去し、
その付看凋?店合することによって他のプラスミドpJL2Qが組立てらnる。
このプラスミドの分子寸は6.7 X 106 グルトンであり、遺伝子gi−
、opA”、ΔcopB 、 repA”、aphA”、Δparである。この
プラスミドは25−40 /高速成育細凰のコピー数を有し、このプラスミドの
喪失はない。このプラスミドもカナマイシン耐性ご伝達する。
プラスミドの命名
ム本出願の実施例及び図面にpJBL・・・と命名されたプラスミドは不出願に
2いてはpOU・・・にデえられた。
、ノー≦a七101
potT5iの1立てと、IO注表示
プラスミドpJL120とファージコDλ4かろのDNAが椋孕法にしたがって
裂遺さ九に。プラスミドとファージMAこか各々20μfowlの最終(ぐ友と
100μl L:’)最終容積で混合され、Bgllで30分間制限され70“
Cで10分間加悪口て不活化さn1T4DNA Vガーゼで一夜15℃で連結さ
れた。この連結反応混合gJ企エシェリヒア・コリ菌株C3H50に形質転換さ
れた。その形質転換細胞は、fJlo の212粒子の懸濁液をひろげた50μ
f/H1のカナマイシン含有のプレート上で選択された。このプレートは30°
Cで20時間培養された。
生存コロニイ分再分離して、30℃でのクロススドリー牛ングによってλb2に
対する耐性の試験、42℃でKmプレート上にストリークして42℃での培4拭
験、及びプラスミドDNAを作製してアガロースゲルで分析することによるプラ
スミドの分子値測定の試験を行った。このようにして、プラスミドpO1751
は、Ktllとλ感染に対する耐性を伝達し、宿主細菌を、培養に対し温度感受
性にし、p、TI+20中に約1.6X10 ダルトンに相当するファージDI
JAの挿入部分を有することが見出された。このプラスミドの全分子量は8.4
X 10 ダルトンであった。これらの性質はすべて、新しいエシェリヒア・
コリ受容体菌株がpOU5111iAで形質転換されるときにそのプラスミドの
表現型性能のすべてを得るので、このプラスミドに保有されている。
DNAはpOU51 から製造され、そのプラスミドはそのプラスミドDNAを
精製し、それごひとつもしくは複数の1f11漫酵素で切断し、得られたフラグ
メントをアガロースゲル電気水助法で分升することによって、制限酵素で地図r
ヒした(第4図多照)。
このようにして挿入された1、6 X 10 ダルトンのフラグメントは、al
リプレッサー遺伝子(60℃昏こおけるλ免疫性の原因である)とλPRプロ
毎−ターター儒する、ファージλからのBgllフラグメントとして同定された
。挿入されたフラグメントの配同号測定し第4図に示した。この制限地図〃)ら
さらにpOU51は、そのプラスミドごクローニングベクターとして用いること
がでさるようにする制限エンドヌクレアーゼEeIORI用の特異な座位を有−
Tることが分力)る。
′a胞の成育についてのこのプラスミドの効果は、媒体中の培婆吻を30°Cで
培誉することによって研究された。成育が指数的になった時に温度が42℃會と
変えられ、細胞培養が硯けられた(分光光学的に測定)。42℃での培養の1.
5〜2時間で培誉吻は成育を停止した。
プラスミドDNAの虚は、0.2%のグIνコースと1%のカサミノ哨を神充し
たA”B @ニマル媒体中で培養する10.Leづつの培−物から、原料と方法
の項に記載したのと同株薯ζして分定した。
ひとつの10ffij培養物を30°Cにて50μC1の3H−チミジンで標識
をつけた。その他は42°Cに変化した頁後、fffU胞が成育を停止するまで
その同位体を受容した。プラスミドの相対虜は30°Cにおいて、25〜40プ
ラスミドコピー/細胞に相当する2%であった。42 °Cに3いてその相対前
は1000以上のプラスミドコピー1iIiaI胞に相当する50 %以上であ
った。
このプラスミドの性質は第5表に示した。
エシェリヒア・コリasu50/pov514味は、ドイツのDeutsahe
Sammlung vm Mi3croorganismon、 Griaeb
aahatraaae 8. ’D−3400市ttiqen(以下DSMと略
称)に寄託番号2467にて寄託されている。
実施例2
potT53の組立てと特性表示
出発”?71fとして実施例1に記載されたプラスミドを用い、pOU51 k
I(indllで品分的に、4iII限することによって、カナマイシン耐性
を暗号化している]λ伝子が除η)れているかλ免疫性を暗号化している遺伝子
を保持した漂題のプラスミドか5徂立てられた。このプラスミドかエシェリヒア
・コリ菌株の0H350に形質転換された。p、T]1cL53は3.2X10
6ダルトンの分子1と次の遺伝子型+ oopA”、ΔoopB 、 repA
” 、△parSinnλ“、ΔaphAを有する。
このプラスミドを実施例1の記載と1司様にして制限jテ素で地図化した(第5
図参照)。この制限地1つ)らpoff53 は、そのプラスミド?クローニン
グベクターとして使用可能とする、制限エンドスフレアーゼ1eoRI の特異
座位を有することが分かる。
所望のプラスミドが宿主訓;虜に存在することを示Tために、a胞培膚吻が、λ
感染に対する耐性を試験するために前記のようにしてλb2ファージ粒子を含有
するプレート上で−44された。
その則泡はざら薯と、50μ9/−d−を含有するプレート上のレプリカブレー
ティングコロニーによってカナマイシンに対Tる感受性が試験された。温度感受
性成育ご試験するために’xfBFmが42°Cでプレート上にストリークされ
実施例1に記載さnたしかたで培養された。
プラスミドDNA″tが実施例1vこム己載のしかたで測定したところ、その細
胞は30°Cで20〜40 プラスミドコピー?有し、42°Cでは1000以
上のプラスミドコピーを有することが判明した。プラスミドの喪失は全(な、C
11つだ。
このプラスミドの性質は第5表に示した。
K、 0oli 081150/pOU53 ttj林はDSMに寄託番号24
68号で寄託されている。
尖λり、」3
pOU56U)見lてと特性表示
pot753に、転位−11伝子とアンピシリン耐性(β−ラクタマーゼ)の遺
伝子とを含む、λ::でn3フアージからのTn3 F’ランスボゾンご生体内
1八Tること、によって(Mordstr6m、 Mo1in込1asgesr
d−Haxurar、、 Plaamid 4.1980.215〜27 )標
題のプラスミドが現車てられた。プラスミドDNAは、プラスミドpGU53
及びその染色体中にλ′I′n3ファージを有する菌株とから単層されγこ。そ
のプラスミドDMAは、アンピシリン耐性とλ免疫性を選択するエシェリヒア・
コリ菌株OSH50に形質転換さCた。
pOU56は5.5 X 10’ダルトンの分子−と下記遺伝子型:C叩r。
ΔQOpB1 repA”、ΔaphA、1mm2”、 1)l&” (::T
n3) を有’j6゜このプラスミドご実雁例11こ記載されたのと同様にして
制御具酵素でマツプ化した(第6図参照)。この制限マツプは、Tn3トランス
ポゾンがp OH26に挿入された位置を示し、さらにプラスミドが制限エンド
ヌクレアーゼのKaoRI とBamHl 各々の特異座位を有すること?示し
ている。このプラスミドはプラスミドpOU57製造用の出発物質として有用で
あるが(下記実施例4参照)、転位遺伝子の存在によって抗生″’ilJ 質耐
性が他の則菌に形質転換されつるから、クローニングベクターとしては好ましく
ない。
宿主細胞中に所望プラスミドが存在するのを示Tために、前記のようにして細胞
培養物をλb2ファージ粒子含有のプレート上で培誉してλ感染に対する耐性を
試験した。さらに細胞を、50μg/dのアンピシリン含有のプレート上でアン
ピシリン耐性ご試験した。−反感受性成育の試験は前記の方法で行った。
pOU56はpOU53と同じ復製性能を宵Tることが分力)った。
このプラスミドの性能を第5表に示した。
エシェリヒア・コリ08H50/pOU56菌株は、寄託番号2469号でDS
Mに寄託されている。
実施例4
po[T57 (A型プラスミド)の組立てと特性表示プラスミドpOU56が
全トランスポゾンご有することから、このプラスミドからのTn3のトランスポ
ジションの可能性をなくするために、このプラスミドf Bam1ll とzo
oRI座位で切断し、β−ラクタマーゼをコードTる遺伝子を保持したままで、
トランスポジション−A伝子を除去した。その付看、橘のアニーリングを行うた
めに、プラスミドpB1322からの小さなりamH1−KOORIフラグメン
トヲ挿入しプラスミドpO1TI+57を作製した。
このプラスミドをE、 Goli困株05H50に形質互換した。poσ57は
4.2 X 10 ダルトンの分子1と次の遺伝子型: oopA”、Δoop
B 、 repA 、△par 、ΔaphA 、 1mmλ” 、bla”(
ΔTn3)をnする。
このプラスミドご実施例1に記載したのと同様にして制限酵素でマツプ化した(
第7.預多照)。この制限地図から、pOU57は、制限エンドヌクレアーゼx
amHI とFicoRl の各々に対する特異座位?■し−このことρ)らク
ローニングベクターとして性用なことか分かる。
箔生則抱中に所望のプラスミドが存在していることを示すためζこ、@B胞層−
吻ご前記のようにしてλb2ファージ粒子を倉荷するプレート上で%tmしてフ
ァージ感染に対する耐性を試験した。さらlここのa胞は前記のしかたでアンピ
シリン耐性を試該した。このプラスミドの分子、迂はアガロースゲル′1気泳励
法によって測定した。温度、感受性成育の試験は前記方法で行った。
pOU57はpOσ53と同じ復製性能を有Tることが分力)った。
このプラスミドの性能ご第5図に示した。
E、1loii 08H50/ p057 = a ハ寄fE済号247o号r
DSM Ic寄託されている。
実施例5
pOU71 (B型プラスミド)の;且立てと特性表示実施例4に記載の1ラス
ミドと出発物質として用い、pot?57のBg111座位1こcopB遺伝子
の一部?含む、pKN1562 からのBg’llフラグメントを2季人するこ
と(こよって、CI−λPRリプレッサープロモーターシステムと、R1型プラ
スミドのQ OpEインヒビターの野生型遺伝子との両者を再する標題のプラス
ミド牙組立てた。このプラスミドを’E、 0oli 08H50対・法会こ形
質転換した。pQU7’I は分子;よが4.3 X in ダルトンで、次の
遺伝子5 : copA”、copE”、repA”、△p&r 、△aphA
、 innλ“、bla ご)!Tる。
このプラスミドを実施例1に記載したのと開陳にして制限酵素でマツプ化した(
第8図参照)。この制限地−η)らpOυ71かpOU57 と向じ特異制限坐
位を冒することが分D)る。
病上−11+ 鷹中苓こ所望のプラスミドか存在することを示すために、−ニン
グの項(木、;J+の第25頁但l膨文偏37頁)に記載の方法でoopB 、
4伝子の存在をスクリーニングした。五Jt感受性戎背の試験は前J己の方法で
行った。横麦[こ、30℃におけるプラスミドコピー数?、放射沌僚識法と傾斜
遠心分点法fこよって(測定した。
プラスミドの・ikf婁旭例1の方法で測定したところ、その訓点は30°Cで
3〜5プラスミドコピー3.42℃で1800以上のプラスミドコピー仔するこ
とが分かった。30℃でこのプラスミドは1う7世代の層成で9失した。
乙のプラスミドの住十’P45表に示す。
E、 0oli asH50/pcU71 J株は寄託番号2471号でDSM
に寄託されている。
実施例6
pOU73 (O型プラスミド〕のaXしてと付性表示実施例4に記載のプラス
ミドを用い、copB遺伝子を有Tる、pOU16 ’IJhらの1ccoR)
フラグメントをpOU57のEacR1座位に挿入することによって、cI−λ
PRリプレッサープロモーターシステムのみならず0opEインヒビターのため
の遺伝子を有Tる標題のプラスミドか組立てられた。このプラスミドとE、 0
oli菌株0f9H50に形質転換した。poσ73は分子孟が4.4 X 1
06ダルトンで、次の遺伝子m : 001)A”、aopB” 、repA”
、△par。
ΔaphA 、 innλ1、bla+ を有Tる。
このプラスミドご実施例1に記載したのと同様にして制限酵素で地図化した(第
9図参照)。この制限マツプ力)ら、aopB通伝子遺伝本来位置していないプ
ラスミドの部位に挿入されたことか分かる。さらに、このプラスミドは制限エン
ドヌクレアーゼBamHI のための特異座位を有しているのでクローニングベ
クターとして有用であることか分かる。
potr71と同じスクリーニング法ご用いた。
プラスミドDNA量を実施例1に一記載の方法で測定したところ、この細胞は、
30℃では0.5〜1プラスミドコピーを有し、42°Cでは1000以上のプ
ラスミドコピーを傅することが分かった。
30°Cにおいて、このプラスミドは5%/世代以上の頻度で長失される。
このプラスミドの性能を第5表iこ示す。
E、0o110!1lH50/pot773 画法は寄託、;1号2472号で
DSMに寄詐されている。
実、座♂j7
pOU75 (B型プラスミド)の組立てと特性表示実施例5に記載のプラスミ
ドモ出発@質として用い、pOTT71を)lind[[で部分的に制限T己こ
とによって、E!coP、1座位が除去されfこ4’JJプラスミドが組立てら
れた。このプラスミド?E、 0o11 i4株O8)!50に形質転換した。
pov75は分子−11が4.2 X 106ダルトンで、次の遺伝子型: a
opA”、copE+、repA”、ΔpILr、△aphA 、 immJ”
、bla” f”frTるっこのプラスミドを実施例1に記載したのと同様にし
て1lill限酵素で地図化した(第10 図参照)。この制限地因刀)ら、H
1ndllフラグメントの除去によってpQT771のKooRl %位が除去
されたことが分力)る。
その宿主到胞に所望のプラスミドか存在するのを示すtめ:こ、昶I胞、′F!
!−rt勿について、削記方法で温度感受性成育のみならず、λ感染耐性とアン
ピシリン耐性の試験を行った。またこのプラスミドル′i酵素で制限することに
よってEaoRl 座位がないことを試験した。
pot775はpOU71と同じ渓製性能を有することか分力)つた。
このプラスミドの性質を第5表に示す。
M、 0oli 08150/POU751fi株は寄託番号2473号でD8
Mに寄託さ九ている。
実施例8
遺伝子産物の増幅
プラスミドpMc903 (Casadaban at al、、 J、 Ba
ct、 143゜1980、971 )を制限酵素BamHIとBglIIで切
断し、lac遺伝子を有するBamHI −B gl IIフラグメントを作っ
た。プラスミドpOU71をBamHIで切断し、上記で得られたBamHI
−Bgl IIフラグメントをその座位に第11図に示すように挿入し次いでT
4DNAI)ガーゼで連結しプラスミドpOU106 を作製しE、 coli
菌株C3H50に形質転換した。その細胞を、50μ〃讐アンピシリン含有のマ
ツコンキイラクトース指示プレート(J。
Miller、 Experiments in Mo1ecular Gen
etics、 ColdSpring Harbor、 1972参照)上にス
トリークし、30℃で培養し赤色コロニー(Lac”)を選択した。次いで温度
を42℃に変え遺伝子産物(β−ガラクトシダーゼ)の増幅を測定し第3表に示
した。この測定はJ 、 Miller op、 cit、によって記載された
方法にしたがって行った。
第 3 表
遺伝子産物の増幅
0 10 0 10
10 21
25 34
55 62 60 20
83 107 90 47
1、酵素活性/全蛋白量、すなわちβ−ガラクトシダーゼ/細胞の増加
2、プラスミドpOU106によって伝達されるβ−ガラクトシダーゼ
3 プラスミドpKN410で伝達されるβ−ラクタマーゼ(Uhlin at
al 、、 Gene 6.1979+ TableII、 p、 100)
この表から、遺伝子産物増幅のレベルは、他のランアウェイベクターについて得
られたレベルに匹敵するものであることが分かる(例えばUhlin at a
l、、 Gene6.1979.9l−106)。
β−ガラクトシダーゼ遺伝子が表現されるプロモーターは、T’+RR:322
からのDNAフラグメント上に位置するcIプロモーター及び/又はテトラサイ
クリンプロモーターであり、それは比較的弱いけれども、影響因子として無視す
ることはできない。そしてこの因子はcIプロモーターと同方向に転写する。
プラスミドは、挿入されたlac遺伝子のすぐ下流側に制限エンドヌクレアーゼ
のための特異座位を有し、このことからクローニングベクターとして有用なこと
が分かる。
このプラスミドの性能を第5表に示す。
E、coli C3H50/pOU106菌株は寄託番号2474号でDSMに
寄託されている。
実施例9
pOU79 (B型プラスミド)の組立てと特性表示プラスミドpOU71を、
BamHI で完全に切断し、pst Iで部分的に切断し、pst Iで部分
的に切断して詔いて、予めBamHIとpst Iとして完全に切断されたとこ
ろのpMc871(Casadaban、 et al、、 J、Bact、、
14.1987.171)からのDNAフラグメント(lacオペロンを有す
る)と連結した。
この連結混合物をE、 coli菌株C3H50に形質転換し、そして50μy
/−のアンピシリン含有のマツコンキイラクトース指示プレート上で30℃にて
培養しアンピシリン副生を選択した。
30℃20時間の培養の後、そのプレートを短時間(1−2時間)42℃で培養
した。Lac (白)からLao” (赤)表現型へと変化したコロニーをさ−
らに分析した。tlA題のプラスミドはひとつのかようなコロニーから同定され
た。pOU79の分子量は8.8X10’ダルトンで、次の遺伝子型:copA
+、cOpB+、repA %Δpar 、 1mmλ 、bla 、lac
−、−有する。
このプラスミドを実施例1の記載と同様にして制限酵素で地図化した(第12図
参照)。この制限マツプから、このプラスミドが、lac遺伝子のすぐ上流側に
制限エンドヌクレアーゼBamHI のための特異座位を有することが分かる。
この座位に正しい配向でプロモーター含有DNAフラグメントを挿入すると、l
ao遺伝子の転写を行ない、その結果30℃においてかようなハ・イブリッドプ
ラスミドを有する細胞のLac+表現型を生ずる。
またこのプラスミドは、1acZ遺伝子の一端に位置する、制限エンドヌクレア
ーゼEocRI のための特異座位を有する。この座位にEcoRIフラグメン
トを挿入するとlac Z遺伝子の産物であるβ−ガラクトシダーゼの活性を消
去し、その結果Laa−表現型になったり、これは30℃から42℃へ温度を変
化させた後、マツコンキイラクトース指示プレート上に無色のコロニーが形成し
て容易にスコアされる(前記事項参照)。したがってこのプラスミドはクローニ
ングベクターとして有用であるっpOU79は、pOUl1と同じ複製性能を有
することが分かった。
このプラスミドの性質は第5表に示した。
E、coli C3H50/pOU79菌株は寄託番号2481号でDSMに寄
託されている。
実施例10
pOU82 (B型プラスミド)の組立てと特性表示プラスミドpOU79をB
amHIで完全に切断し、Sal Iで部分的に切断した。次いでlacプロモ
ーターが除去されたlacオペロン含有のPSKS104からのBamHI−5
alIフラグメントと、1acZ遺伝子の第一番目の4つのコドンとを挿入しp
OU80 (図示せず)を組立てた。
pOU80はLac″″であり、lac遺伝子のすぐ上流側にBamHI座位と
EcoRI座位を有する。さらに、1)SKS104中のlac遺伝子がpMc
1403から誘導されるから(Ca5adabanat al、、 J、 Ba
ct、 143.1980.971)、lac Z中に通常見出されるEcoR
I座位はみとめられない。
標題のプラスミドは、pOU80の1acZ遺伝子(pOU79 の地図第12
図参照)中のEco RI −C1a Iフラグメントを、de。
プロモーターと1acZ遺伝子のアミノ終末端とを有する、pVH1424から
のEco RI −C1a Iフラグメントで置換することによって組立てた。
この置換によってlac Z遺伝子が再組立てされ、そしてdeoプロモーター
の存在によって、得られたハイブリッドプラスミドpOU82は、Eρoli菌
株C3H50に形質転換するとLaa+表現型を伝達する。pOU82は、分子
量が8.1×10 ダルトンで、次の遺伝子型: 0OpA 、C0pB 、
rlB])A。
Δpar 、1mm A 、bla+、lac+を有する。
このプラスミドは、par部位を欠いているので30℃にて最終的に細胞から失
われ、このことは非選択的マツコンキイラクトース指示プレート上で容易に観察
することができる(実施例11参照)。
このプラスミドを実施例1に記載したのと同様にして制限酵素で地図化した(第
13図参照)。この制限地図から、このプラスミドは制限エンドヌクレアーゼの
EcoRIとBamHIの各々のための特異座位を有し、このことからこのプラ
スミドをクローニングベクターとして用いることができることが分かる。
pOU82はpOUl1と同じ複数性能を有することが見出された。
このプラスミドの性質を第5表に示す。
E、aoliCSH50/pOU82の菌株は寄託番号2482号ニテDSMに
寄託されている。
実施例11
pOU91 (B型プラスミド)の組立てと特性表示分配について安定なプラス
ミドを組立てるために、pOU82をEcoRIで切断し、プラスミドR1誘導
体のpKN184(Nordstr6m et al、、 Plasmid I
!、 1980.322 )の野生型par部位を含むEcoRI−Aフラグメ
ントをこの座位に挿入し次いで連結した。得られたプラスミド(pOU90.図
示せず)をE、 coli菌株C3H50に形質転換した。そしてこの細胞は、
50μy/lne アンピシリン含有プレート上で30℃にて選択的に培養され
た。対照としてpOU82含有細胞を、両者の出発コロニー中に確実にプラスミ
ドが存在するように類似の方法で培養した。次に両コロニーの試料をいずれの抗
生物質も含有しないプレート上にス) IJ−りし、次いでその細胞を25細胞
世代成育するにまかせた。Laa+表現型の安定な遺伝をスクリーニングするた
めに、得られた両コロニーからの細胞をマツコンキイラクトース指示プレート上
にストリークした。30℃でpOU90が形質転換された細胞は赤色のコロニー
を生成したーこれはこのプラスミドが保持されていたことを示す。一方pOU8
2が形質転換された対照細胞は赤色と無色の両方のコロニーを生成した。これは
、セレクション・フリーの期間pOU82はいくつかの細胞から失われたことを
意味する。
次いで中間プラスミドpO!J90をBamHIで完全に、5au3Aで部分的
に切断してプラスミドの大きさを小さくシ、標題のプラスミドを作製した。E、
coli菌株C3H50に形質転換した後、プラスミドの安定性を前記のしか
たで測定した。pOU91は、分子ヌが12.5X106ダルトンで、次の遺伝
子型: copA”、copB XrepA+、par”、immλ 、bla
、 lac を有する。
このプラスミドを実施例1に記載したのと同様にして制限酵素で地図化した(第
14図参照)。この制限地図から、pOU91が制限エンドヌクレアーゼのEc
oRIとBamHI 各々のための特異座位を有し、このことからこのプラスミ
ドが゛クローニングベクターとして有用であることが分かる。
pOUL91は、pOUl1 と同じ複製性能を有するが、pOUl1と比較し
て、このプラスミドは30℃において完全に安定である。
このプラスミドの性質を第5表に示す。
E、 Co11 C5H,50/pOU91菌株は寄託番号2483号でDSM
で一寄託されている。
実施例12
pOUl 01 (B型プラスミド)の組立てと特性表示実施例7に記載のプラ
スミドを出発物質として用い、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラー
ゼ(cat”) 合mの遺伝情報を指定する遺伝子を有する5au3Aフラグメ
ントをpOU75のBamHIに挿入することによって、宿主細胞にクロラムフ
ェニコール耐性を付与した標題のプラスミドを組立てた。このプラスミドをE、
coli菌株C3H50に形質転換した。−、poUlolは、分子量が4.
7 X 10 ’ ダルトンで次の遺伝子型:copA 、copB 、 re
pA、ΔaphA 、imm^、bla、、catを有する。
このプラスミドを実施例1の記載と同様にして制限酵素でマツプ化した(第15
図参照)。この制限地図から、p’OU101は制限エンドヌクレアーゼEco
RIの特異座位を有し、したがってこのプラスミドがクローニングベクターと
して用いつるということが分かる。さらにEcoRIフラグメントが挿入される
とcut 遺伝子を失活させ EcoRIハイブリッドがスクリーニング可能に
なる。
宿主細胞中に所望のプラスミドが存在することを示すために、細胞培養物のλ感
染の性とアンピシリン耐性について前記の方法で試験した。さらにこの細胞は2
0μy/ゴのクロラムフェニコール含有のプレート上で培養物を培養することに
よってクロラムフェニコール耐性の試験を行った。またこの細胞は温度感受性成
育についても前記方法で試験した。pOUlolはpOU71と同じ複製性能を
有することが判明した。
このプラスミドの性質は第5表に示す。
E、coli C3H50/pOU101 の菌株は寄託番号2757号でDS
Mに寄託されている。
実施例13
pOUllo の組立てと特性表示
lac Z遺伝子の一部を含有するEcoRI −C1a Iフラグメントをプ
ラスミドPOU80(実施例10に記載。pOU79の地図第12図参照)から
除去し、プラスミドp VH1451(Valentin −Hansen e
t al、、 the EMBOJournal 1 、1982 )からの、
deoプロモーターと1acZのアミン終末端とを有するEcoRI−C1aI
フラグメントで置換した。得られたプラスミドはI)OU83と命名した(第1
6図ぴ照)。
]−aC遺伝子、及びCIリプレッサー遺伝子と^PRプロモーターを有するD
NAフラグメントを除去するために、プラスミドpOU83をBam HIとB
gl IIで部分的に制限した。連結反応とC3H50への形質転換の後、所望
の性能を有するプラスミドを単離したが、deoプロモーターとcopB遺伝子
とがクロース融合体(close fusion)を形成していた。このプラス
ミドはpOU 110と命名され、分子量が3.2X10’ダルトンで次の遺伝
子型:C0pA+、CopB+、repA+、Δpar 、 bla+を有する
。
このプラスミドを実施例1に記載したのと同様にい■限酵素で地図化した(第1
7図参照)。この制限地図から、このプラスミドは制限エンドヌクレアーゼEa
oRIとBam HI各々のための特異座位を有し、このことからこのプラスミ
ドをクローニングベクターとして用いうることが分かる。
E、 coli菌株50929 (cytR、lac、deo、recA)−こ
れlこはすでにpOU 110が形質転換されていたーのカルチャーを、グルコ
ースなしのLB培地中で一夜培養したところ、非制御のプラスミド複製が2X1
08細胞/rn1以上の細胞密度で起こった。
E、 coli C9H50/pOU l 10菌株は寄託番82758号でD
SMに寄託されている。
実施例14
pOU130 の組立てと特性表示
プラスミド1)OU91をBan HIで切断し、次いでそのBamHI座位を
エクソヌクレアーゼBa131で除去しプラスミドpOU92(図示せず)を作
製した。このプラスミドをEcoRIとC1a I で制限し、プラスミドpM
C1403(Casadaban at al、l J、 Bact、 143
.1980 、971)からの対応するEcoRI −C1a Iフラグメント
を挿入し、deOプロモーターなしのlacオペロンを有するプラスミドpOU
93を作った。
かようにして作られたBamHI座位にcap B 遺伝子を有するBglII
フラグメントを挿入してプラスミドpOU130を作製しく第18図参照)、次
いで連結しE、 coli菌株C3H50に形質転換した。この細胞を501m
/dアンピシリン含有のマツコンキイラクトース指示プレートにストリークし3
0℃で培養して赤色コロニー(Lac”)を選択した。次いで温度を42℃に変
えた。β−ガラクトシダーゼの増幅を第5表に示す。42℃で45分間培養した
後、温度を38℃以下に下げた。この温度変化後に測定されたβ−ガラクトシダ
ーゼの増幅を第5表に示す。
第4表
プラスミドDNAの増幅後の
a30℃ 定常状1 0.03 1
b30℃ ・12℃ 0.7 23
C30℃ 42℃37℃ 2.5 83a LB培地中;30℃で指数的にi′
g養されたpOT−7130を有するC3H50の細胞
b 30℃での指数的培養の後、培養物の温度を42℃1ど変え、その温度で培
養を2時間続けた。
c 30℃での指数的培養の後、培養物の温度を42℃に変え、45分間後、培
養物の温度を37℃に変えて90分間培養。
d 原料と方法の項参照。β−ガラクトシダーゼの比活性をLight and
Mo1in、 Gen、 Genet、 1981 、 (pp、 56−6
1 )に記載しであるのと同様にして示した。
この表から、低温にもどすと、遺伝子産物の増幅が著しく改善され、そのためこ
の方法が問題の遺伝子産物の最大の表現を得るのに特に有用であることを示して
いることが分かる。
β−ガラクトシダーゼは、本質的にかような遺伝子融合体から表現されるので(
Light and Mo1in、 J 、Ba1t 、 151 。
1982.1129〜1135 )、酵素の活性のレベルは、この発明のプラス
ミドの遺伝子産物の増幅容量を正確に反映している。
E、 coli CH350/pOU130の菌株は寄託番号2759号でDS
Mに寄託されている。
実施例15
pLc31の組立てと特性表示
pOU75をBamHI で切断した。recAプロモーターと遺伝子を有する
、プラスミドpBEU 14 (TJhlin and C1ark 、 J
。
Baot、 148.1981.386−90 )からのBan HIフラグメ
ントを挿入し、次いでエシェリヒア・コリ菌株C3H50に形質転換した。標題
のプラスミドは、分子量が6.3X10’ダルトンで、次の遺伝子型: rea
A 、 bla+、copA+、copB+、r6pA+、immλ を有する
。
このプラスミドを実施例1に記載したのと同様にして制限酵素で地図化した(第
19図参照)。この制限地図から、pLc31が、外来遺伝子の挿入に適切な、
制限酵素EaoRI の特異座位を、recAプロモーターの下流側に有するこ
とが分かる。
pLc31はpOU71と同じ複製性能を有することが見出された。
pLc31を有する細胞を30℃で培養したところ、保有されているプロモータ
ーは充分に抑制され、温度を42℃に変えると、18XAリプレツサーが徐々に
タイトレートされ、recAからの転写が開始されrecA遺伝子産物の産生が
増幅されるにいたった。そしてこのことはポリアクリルアミドゲル電気泳動法で
検出できた。
このプラスミドの性能を第5表に示した。
E 、 coli C8H50/ pLC31菌株は寄託番号2718号でDS
Mに寄託されている。
実施例16
pLC32の組立てと特性表示
λPL プロモーターとbla遺伝子を有し、制限座位EcoRI、SmaI
、 BamHI 、 5alI、 PstI及びHind mからリンカ−を備
えたプラスミドPLC28(Remaut et al、、 Gene 15.
1981 。
pp、8l−93)をEcoRIで切断し、プラスミドpOU51のEcoRI
座位に挿入しく実施例1参照)、次いで連結し、E、 aoli菌株C5H3O
に形質転換した。このプラスミドpLC32(第20図参照)−10,6x10
6ダルトンの分子量を有する−を、PstI で、部分的にダイジェストし、次
いで連結し、カナマイシン耐性でアンピシリン感受性のプラスミドを選択するL
coli菌株C3H50に形質転換した。得られたプラスミドはpCL32と
命名され、分子量が7.7X10 ダルトンで次の遺伝子型copA 、 co
pB 、 repA 、 aphA 、 1mmλ を有する0このプラスミド
を実施例1の記載と同様にして制限酵素で地図化した(第21図参照)。この制
限地図から、λPLプロモーターが、このプラスミドをクローニングベクターと
して好都合たらしめる特異EcoRI座位のすぐ上流側に位置していることが分
かる。
pLC32はpOU 51と同じ複製性能を有することが見出された。
このプラスミドの性質を第5表に示す。
E、aoli菌株C5H5o7pLc 32は寄託番号2719号でDSMに寄
託されている。
第 5 表
pOU53 人 EcoRI なし 25.>1000 ありpOU56 Ap
、λ EcoRI 、BamHI なし 25ン1000 ありpOU57 A
p、^ EccRI 、 BamHI なし 25ン1000 ありpOU71
Ap、λ EcoRI、 BamHI なし 3.>1000 なしくno)
pOU73 Ap、^ BamHI なし 1;>1000 なしpOU75
Ap、入 BamHI なし :94000 なしpOU106 Ap2人 B
amHI なし 3i1000 なし−′マ” Ap+人、 Lacc+1Ec
oRI、 BamHI Lac (EcoRI)3;>1000 なしTl0U
IOI Ap、 Cm、^ EcoRI Cm5(EcoRI)31100Q
なしpOU130 Ap、λ、 Lac” EcoRI なし 3岬■ ありp
l、C31、Ap、 RecA 、λEcoRI Rec A−:ytooo
なしpLo 32 Km +人 EC0RL なし 25.1>1000 あり
pOUllo Ap EcoRLBamHI なし a) なしa) 温度依存
性でないコピー数
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、386−90゜四 区 同
鍜 鍜 尿
r−m−−1−□コ −−−
ど−−
国際調査報告
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1.調節可能なプロモーターが、このプロモーターからの転写が複製を調節する ようなしかたで挿入されたプラスミド。 2、調節可能なプロモーターが、このプロモーターからの転写が複製を調節し、 その結果増大された転写番とよってプラスミドコピー数が実質的に増大されるが 又は制御されなくなるに至るしかたで挿入されたプラスミド。 3、 プロモーターが、そのプロモーターの部位内の特定のDNA構造によって 先天的に調節可能なプロモーターである請求の範囲第1項又は第2項のプラスミ ド。 4、プロモーターが調節因子によって制御可能である請求の範囲第1項又は第2 項のプラスミド。 5、調節因子が正の制御を行う調節因子である請求の範囲第4項のプラスミド。 6、調節因子が負の制御を行う調節因子である請求の範囲第4項のプラスミド。 7、調節可能なプロモーターからの増大された転写によってプラスミドコピー数 が実質的に増大されるか又は制御されなくなるに至ることが該プロモーターの抑 制解除によって起こる請求の範囲第2項のプラスミド。 8、プロモーターが化学的に調節可能なプロモーターである請求の範囲上記全請 求の範囲のいずれかのプラスミド。 9、プロモーターがlacプロモーター、trpプロモーター又はaeoプロモ ーターである請求の範囲第8項のプラスミド。 10、プロモーターの活性が温度依存性であるか又は温度感受性調節因子によっ て制御される請求の範囲第1〜7項のいずれかのプラスミド。 11、プロモーターがλプロモーターであり、該プロモーターからの転写を制御 する温度感受住人CIリプレッサーのための遺伝子も存在する請求の範囲第10 項のプラスミド。 12、λプロモーターがλPR又はλPLである請求の範囲第11項のプラスミ ド。 13、λプロモーターがλPRである請求の範囲第12項のプラスミド。 14、前記調節可能なプロモーターからの転写が、プラスミドに、低温では一定 の低いコピー数を示させ、より高い温度では実質的に増大されるかもしくは制御 されないコピー数を示させる上記全請求の範囲のいずれかのプラスミド。 15、前記調節可能なプラスミドからの転写が、約30℃の温度で一定の低いコ ピー数を示させ、約36−42℃の範囲の温度で実質的に増大されるかもしくは 制御されないコピー数を示させる請求の範囲第14項のプラスミド。 16、約39℃の温度以上の温度で制御されないプラスミドコピー数を示す請求 の範囲第15項のプラスミド。 17、ひとつの本来もっている複製調節遺伝子の一部が除去され調節可能なプロ モーターで置換された上記全請求の範囲のいずれかのプラスミド。 18、該プラスミドを有する宿主微生物が一定p低いプラスミドコピー数を保証 する条件下で培養される際には、20−40コピー/細胞、好ましくは20−3 0コピー/細胞、及び特に20−25コピー/′細胞のそれぞれの範囲のコピー 数を有し、その宿主微生物がプラスミドコピー数の実質的Iこ増大されるかもし くは制御されなくなる番と至る異なる条件下で培養される際には、少なくとも約 500−1000コピー/細胞の範囲のコピー数を有する請求の範囲第17項の プラスミド。 19、約30℃のごときひとつの温度において、約20−40コピー/細胞、好 ましくは20−30コピー/細胞、及び特に20−25コピー/細胞のそれぞれ の範囲のコピー数を有し、約42℃の温度のごときより高い温度において、少な くとも約500〜1000コピー/細胞の範囲の制御されないプラスミドコピー 数を有する請求の範囲第18項のプラスミド。 20、copB遺伝子が除去され調節可能なプロモーターによって置換されたR 1型プラスミドである請求の範囲第17−19項のいずれかのプラスミド。 21 該プラスミドを有する宿主微生物が一定の低いプラスミドコピー数を保証 する条件下で培養される際には約3−5コピー/細胞の範囲のコピー数を有し、 その宿主微生物がプラスミドコピー数の実質的に増大されるかもしくは制御され なくなるに至る異なる条件下で培養される際には少なくとも約500〜1000 コピー/細胞の範囲のコピー数を有するプラスミド。 22、約30℃の温度のごときひとつの温度で約3−5コピー/細胞の範囲のプ ラスミドコピー数を有し、約42℃の温度のごときより高い温度で少なくとも約 500〜1000コピー/細胞の範囲の制御されないプラスミドコピー数を有す る請求の範囲第21項のプラスミド。 23、調節可能なプロモーターが、プラスミドの本来もっているひとつ又は複数 の複製制御遺伝子の上流側に挿入された請求の範囲第1〜16項のいずれかのプ ラスミド。 24、該プラスミドを有する宿主微生物が一定の低いプラスミドコピー数を保証 する条件下に培養される際には約3−5コピー/細胞の範囲のコピー数を有し、 その宿主微生物が、プラスミドコピー数の実質的に増大されるかもしくは制御さ れなくなるに至る異なる条件下で培養される際には少なくとも約500〜100 0コピー/細胞の範囲のコピー数を有する請求の範囲第23項のプラスミド。 25、約30℃の温度のごときひとつの温度で約3〜5コピー/細胞の範囲のプ ラスミドコピー数を有し、約42℃の温度のごときより高い温度で少なくとも約 500〜1000コピー数/細胞の範囲の制御されないプラスミドコピー数を有 する請求の範囲第24項のプラスミド。 26、調節可能なプロモーターが0OpB遺伝子とcopA遺伝子の上流側に挿 入されたR1型プラスミドである請求の範囲第23〜25項のいずれかのプラス ミド。 27、プラスミドを有する宿主微生物が一定の低いプラスミドコピー数を保証す る条件下で培養される際、とは約0.5−1コピー/細胞の範囲のコピー数を有 し、その宿主微生物がプラスミドコピー数の実質的に増大されるかもしくは制御 されなくなるに至る異なる条件下で培養される際には少なくとも約500〜10 00コピー/細胞の範囲のコピー数を有するプラスミド。 2& 約30℃の温度のごときひとつの温度で約0.5〜1コピー/細胞の範囲 のプラスミドコピー数を有し、約42℃の温度のごときより高い温度で少なくと も約500〜1000コピー/細胞の範囲の制御されないプラスミドコピー数を 有する請求の範囲第27項のプラスミド。 29、本来もっているひとつの複製調節遺伝子の一部が除去された複製部位置こ 調節可能なプロモーターを有し、その本来もっている複製調節遺伝子がその本来 位置していない部位に挿入された請求の範囲第1〜16項のいずれかのプラスミ ド。 30、該プラスミドを有する宿主微生物が一定の低いプラスミドコピー数を保証 する条件下で培養される際には約0.5〜1コピー/細胞の範囲のコピー数を有 し、その宿主微生物がプラスミドコピー数の実質的に増大されるかもしくは制御 されなくなるに至る条件下で培養される際には少なくとも約500〜1000 コピー/細胞の範囲のコピー数を有する請求の範囲第29項のプラスミド。 31、約30℃の温度のごときひとつの温度で約0.5〜1コピー/細胞の範囲 のプラスミドコピー数を有し、約42℃の温度のごときより高い温度で少なくと も約500〜1000コピー/細胞の範囲の制御されないプラスミドコピー数を 有する請求の範囲第30項のプラスミド。 32、oopB遺伝子がそのプラスミドの複製部位以外のEcoRI座位に挿入 されたR1型プラスミドである請求の範囲第29〜31項のいずれかのプラスミ ド。 33、複製部位からの転写を調節する第1の調節可能なプロモーターに加えて、 第2プロモーターが、このプロモーターによってその表現が制御される構造遺伝 子を挿入できるしかたで挿入された上記全請求の範囲のいずれかのプラスミド。 34、前記遺伝子の表現を調節する第2プロモーターが制御可能である請求の範 囲第33項のプラスミド。 35、構造遺伝子の表現を制御する前記第2の挿入されたプロモーターがλPL プロモーターである請求の範囲第33項又は第34項のプラスミド。 36、約30℃で一定の低いプラスミドコピー数を有しかつ遺伝子表現がごく少 ないか全くなく、約36−42℃の範囲の温度でプラスミドコピー数が実質的に 増大されるか又は制御されずかつ遺伝子表現を有する請求の範囲第33〜35項 のいずれかのプラスミド。 37.39℃の温度以上の温度で制御されないプラスミドコピー数と非常に貰い 遺伝子表現を宵する請求の範囲第36項のプラスミド。 38、プラスミドを有する細胞の同定及び/又は選択のために有用なマーカーを 有する上記全請求の範囲のいずれかのプラスミド。 39、マーカーが宿主細胞に抗小姉謝牲を伝達する遺伝子を有する請求の範囲第 38項のプラスミド。 40 もうひとつの遺伝子の挿入に際し、その融合から表現の検出ができる遺伝 子融合を許容する遺伝子を有する上記全請求の範囲のいずれかのプラスミド。 41、プラスミドがミニプラスミドであることを特徴とする上記全請求の範囲の いずれかのプラスミド。 42、プラスミドに本来関係のない単一もしくは複数の遺伝子を追加して有する 上記全請求の範囲のいずれかのプラスミド。 43、請求の範囲第1−42項のプラスミドが挿入された微生物。 44、細菌である請求の範囲第43項の微生物、45、グラム陰性で中温性の細 菌である請求の範囲第44項の微生物。 46、エシェリヒア・コリである請求の範囲第45項の微生物。 47、調節可能なプロモーターをプラスミドに、該プロモーターからの転写が複 製を調節するようなしかたで挿入し、かように処理されたプラスミドを、該プロ モーターからの転写が増大される際に実質的に増大されるか又は制御されないプ ラスミドコピー数を示すこれらプラスミドをスクリーニングすることによって同 定することからなる請求の範囲第1〜42項のプラスミドの組立て法。 48、本来もっているひとつの複製調節遺伝子の一部を除去し、この部分的に除 去された本来もっている複製調節遺伝子の座位に調節可能なプロモーターを有す るDNAフラグメントを挿入することからなる請求の範囲第47項の方法。 49、制限エンドヌクレアーゼBglllで切断することによってプラスミドか らoopB遺伝子を除去し、この座位に調節されたプロモーターを有するBgl I[フラグメントを挿入することからなる請求の範囲第48項の方法。 50、調節可能なプロモーターをプラスミドに、本来もっている複製制御の単一 もしくは複数の遺伝子の上流側で挿入することからなる請求の範囲第47項の方 法。 51、copBとC0pAの上流側のBgln座位に調節可能なプロモーターを 挿入することからなる請求の範囲第50項の方法。 52、出発原料として、部分的に除去された本来もっている複製調節遺伝子を有 するプラスミドを用い、その本来もっている複製調節遺伝子をそのもとの座位に 再挿入して本来もっている複数の複製制御遺伝子すべてが存在するプラスミドを 組立てることからなる請求の範囲第47項の方法。 53、出発物質として部分的に除去されたC0pB遺伝子を有するプラスミドを 用い、とのC!OpB遺伝子をBglIr座位に挿入し00pB遺伝子と0Op A遺伝子の両方が存在するプラスミドを組立てることからなる請求の範囲第52 項の方法。 54、出発物質として部分的に除去された本来もっている複製調節遺伝子を有す るプラスミドを用い、それが本来位置していないプラスミドの部位にひとつの本 来もっている複製調節遺伝子を挿入することからなる請求の範囲第47項の方法 。 55、出発物質として部分的に除去されたcopEill伝子を有するプラスミ ドを用い、このC0pB遺伝子をプラスミドの複製部位以外のEcoRI座位に 挿入することからなる請求の範囲第54項の方法。 56、調節可能なプロモーターの挿入に加えて、前記第2プロモーターを、この 第2プロモーターによって表現が調節可能な構造遺伝子が挿入できる適切な制御 座位に挿入することからなる請求の範囲第33項のプラスミドの組立て方法。 57 前記調節可能なプロモーターからの増大された転写によってプラスミドコ ピー数が実質的に増大されるか又は制御されなくなるに至るのを保証する条件下 での少なくともひとつの培養期間を有する培養を、請求の範囲第1〜42項のプ ラスミドをもつ微生物について行い、次いでこの微生物培養物からプラスミドの 遺伝子産物を収穫することからなる、プラスミドDNAの遺伝子産物の製造方法 。 58、請求の範囲第1〜42項のプラスミドが形質転換された宿主微生物を、接 種及び増殖段階で一定の低いプラスミドコピー数になる条件下で所望の細胞数が 得られるまで培養し、次いてその宿主微生物をプラスミドコピー数が実質的に増 大されるかもしくは制御されなくなるに至る条件下で培養することからなる請求 の範囲第57項の方法。 59、プロモーターからのいずれの転写もプラスミドコピー数に有意に影響しな い条件下での培養期間の後、プロモーター活性を誘発する物質が、プラスミドコ ピー数が実質的に増大されるか又は制御されなくなるに至る量で添加される請求 の範囲第57項又は第58項の方法。 60、プラスミドの実質的な増幅を得るのに充分であるが微生物培養物のいずれ の実質的な損傷も回避するのに充分短かい期間、プラスミドコピー数が実質的に 増大されるかもしくは制御されなくなるに至る条件を維持した後で、プロモータ ー活性を誘発する物質が培養媒体から除去され、プラスミドコピー数が徐々に減 少し前記誘発前のレベルに至らせる請求の範囲第59項の方法。 61、プロモーター活性を実質的に阻害する物質の存在下での培養期間の後、そ の物質の濃度が、プロモーターが活性化されプラスミドコピー数が実質的に増大 されるか又は制御されなくなるに至る程度に減少される請求の範囲第57項又は 第58項の方法。 62、プラスミドの実質的な増幅を得るのに充分であるが微生物培養物のいずれ の実質的な損傷も回避するのに充分短かい期間、プラスミドコピー数が実質的に 増大されるかもしくは制御されなくなるに至る条件を維持し、プロモーター活性 を阻害する物質が、プラスミドコピー数が徐々に減少して誘発前のレベル2こい たる量で添加される請求の範囲第61項の方法。 63、宿主微生物の培養される条件が、プラスミドコピー数が実質的に増大され るか又は制御されない温度又はその近傍の温度での少なくともひとつの培養期間 からなる請求の範囲第57項又は第58項の方法。 64、プラスミドコピー数が実質的に増大されるか又は制御されない温度での培 養が、宿主微生物の成育がプラスミドからのプラスミドDNAもしくは遺伝子の 産物の形成によって阻害されるまで続けられる請求の範囲第63項の方法。 65、量産規模の培養が、プラスミドの遺伝子産物の形成量を増大するとともに 、宿主微生物の存続と連続的成育を許容するように、プラスミドコピー数が実質 的に増大されるか又は制御されない温度に近い温度で行われ、次いでその遺伝子 産物が培養物から連続的もしくは間欠的に収穫される請求の範囲第63項の方法 。 66、微生物培養物を量産サイズに到達するまで増殖させた後、温度がプラスミ ドコピー数が実質的に増大されるか制御されない温度もしくはその近傍の温度に 変えられ、次いでこの温度がプラスミドの実質的な増幅を得るのに充分であるが 微生物培醤物のいずれの実質的な損傷を避けるのに充分短かい期間、維持され、 その後その温度が低い一定のプラスミドコピー数を保証し、プラスミドコピー数 を最初のレベルに到達するまで徐々に減少させる温度:こもう−変度えられ、る 請求の範囲第6.3項の方法。 67、プラスミドコピー数が実質的に増大されるか又は制限されない温度が、プ ラスミドが一定の低いコピー薮を有する温度よりも高い請求の範囲第63〜66 項のいずれかの方法。 68 プラスミドが一定の低いコピー数を有する温度が約30”Cの温度であり 、プラスミドが実質的に増大されるか又は制御されないコピー数を有する温度が 約36〜42°Cの範囲にある請求の範囲第67項の方法。 69、プラスミドを有する細胞の同定及び/又は選択に有用なマーカーを有する DNAフラグメントを挿入することからなる請求の範囲第1〜42項のいずれか のプラスミドの製造方法。 70、マーカーが宿主微生物に抗生物質耐性を伝達する遺伝子である請求の範囲 第69項の方法。
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