JP2984239B2 - ストレプトマイセスｇａｌオペロン - Google Patents
ストレプトマイセスｇａｌオペロンInfo
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Description
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ストレプトマイセ
ス（Ｓtreptomyces）galオペロンを有してなる組換型Ｄ
ＮＡ分子に関する。 【０００２】 【従来の技術】ホッジソン、ジャーナル・オブ・ジェネ
ラル・マイクロバイオロジー（Ｈodgson,Ｊ．Ｇen．Ｍi
cro．）１２８,２４１７〜２４３０（１９８２）はスト
レプトマイセス・コエリカラー（Ｓ．coelicolor）Ａ３
(２)が、野性型株におけるグリセロール摂取系の１つで
あるアラビノース摂取系の転写レベルにおける抑制と、
ガラクトース摂取系の抑制をもさせるグルコース抑制系
を有することを報告している。しかし、ホッジソンには
ストレプトマイセス・コエリカラーＡ３(２)による実際
のガラクトース代謝の報告は全くない。 【０００３】オケダら、モレキュラー・アンド・ジェネ
ラル・ジェネティックス(Ｏkeda et al．,Ｍol．Ｇe
n．Ｇenet．)１９６,５０１〜５０７(１９８４)は、グ
ルコース・キナーゼ活性、２−デオキシグルコース感受
性、グルコース利用性およびグルコース抑制が、ストレ
プトマイセス・コエリカラーからファージ・ベクターに
クローンされた当該glk遺伝子を含有する３．５ＫbＤＮ
Ａフラグメントによって形質転換されたストレプトマイ
セス・コエリカラーＡ３(２)glk(グルコース・キナー
ゼ)変異株に全て復元されたことを報告している。セノ
ら、モレキュラー・アンド・ジェネラル・ジェネティッ
クス(Ｓeno etal．,Ｍol．Ｇen．Ｇenet．)１９３,１
１９〜１２８(１９８４)はストレプトマイセス・コエリ
カラーのゼリセロール(gyl)オペロンを報告し、かかる
オペロンが基質誘発性で、カタボライト抑制性であると
述べている。 【０００４】デボウクら、ヌークレイック・アシッズ・
リサーチ(Ｄebouck et al．,Ｎuc．Ａcids．Ｒes．)
１３(６),１８４１〜１８５３(１９８５)はイー・コリ
(Ｅ．coli)のgalオペロンが、ガラクトースの代謝に必
要な酵素、すなわち、galＥ(ウリジン・ジホスホガラク
トース−４−エピメラーゼ)、galＴ(ガラクトース−１
−ホスフェート・ウリジルトランスフェラーゼ)およびg
alＫ(ガラクトキナーゼ)を特定する３つの構造的に近似
した遺伝子からなること、これらの遺伝子がポリシスト
ロニックmＲＮＡからＥ、Ｔ、Ｋの順序で発現されるこ
と、オペロンのプロモーター遠位遺伝子galＫの発現が
その直前のgalＴ遺伝子に翻訳的にカップルされること
が公知であること、このような翻訳的カップルが、gal
Ｔコード付け配列の端と、galＫのリボソーム結合域の
間の構造的オーバーラップから生じること、およびgal
ＴおよびgalＫの翻訳的カップリングが、ガラクトース
の代謝の間のこれらの遺伝子の一律発現を保証すること
を報告している。 【０００５】 【発明が解決しようとする課題およびその課題を解決す
るための手段】本発明はストレプトマイセスgalオペロ
ンgalＫ遺伝子、galＥ遺伝子、galＴ遺伝子、Ｐ２プロ
モーター発現単位またはＰ２プロモーターまたはそのい
ずれかの官能性誘導体からなる組換型ＤＮＡ分子ならび
にストレプトマイセスgalオペロンＰ１プロモーター、
Ｐ１プロモーター調節領域または全galオペロンまたは
そのいずれかの調節可能な官能性誘導体からなる組換型
ＤＮＡ分子に関する。 【０００６】本発明はまた、ストレプトマイセスgalオ
ペロンまたはそのいずれかの調節可能な官能性誘導体お
よびかかるオペロンに作動的に結合した官能性ＤＮＡ分
子からなる組換型ＤＮＡ分子、かかるＤＮＡ分子、所望
により、さらにレプリコンからなる組換型ＤＮＡベクタ
ー、かかるベクターで形質転換された宿主細胞の調製
法、そのような方法で調製された形質転換宿主、当該官
能性ＤＮＡ配列が発現されるような適当な条件下、その
ような形質転換宿主を培養することからなる該官能性Ｄ
ＮＡ配列の発現方法およびそのような発現を調節する条
件下、そのような形質転換宿主を培養することからなる
そのような官能性ＤＮＡ配列の発現を調節する方法に関
する。 【０００７】また、本発明はストレプトマイセスgalオ
ペロンＰ２プロモーター発現単位またはそのいずれかの
官能性誘導体およびその単位に作動的に結合した官能性
ＤＮＡ分子からなる組換型ＤＮＡ分子、そのようなＤＮ
Ａ分子および、所望により、さらにレプリコンからなる
組換型ＤＮＡベクター、そのようなベクターで形質転換
された宿主細胞の調製法、そのような方法で調製された
形質転換宿主および当該官能性ＤＮＡ配列が発現される
ような適当な条件下、そのような形質転換宿主を培養す
ることからなるそのような官能性ＤＮＡ配列の発現方法
に関する。 【０００８】また、本発明はストレプトマイセスgalオ
ペロンＰ１プロモーター調節領域またはそのいずれかの
調節可能な官能性誘導体およびそのような領域に作動的
に結合した官能性ＤＮＡ分子からなる組換型ＤＮＡ分
子、そのようなＤＮＡ分子および、所望により、さらに
レプリコンからなる組換型ＤＮＡベクター、そのような
ベクターで形質転換された宿主細胞の調製法、そのよう
な方法で調製された形質転換宿主、当該官能性ＤＮＡ配
列が発現されるような適当な条件下、そのような形質転
換宿主を培養することからなるそのような官能性ＤＮＡ
配列の発現方法およびそのような発現を調節する条件
下、そのような形質転換宿主を培養することからなるそ
のような官能性ＤＮＡ配列の発現を調節する方法に関す
る。 【０００９】また、本発明はストレプトマイセスgalオ
ペロンＰ１プロモーターまたはそのいずれかの調節可能
な官能性誘導体およびそのような領域に作動的に結合し
た異種官能性ＤＮＡ分子からなる組換型ＤＮＡ分子、そ
のようなＤＮＡ分子および、所望により、さらにレプリ
コンからなる組換型ＤＮＡベクター、そのようなベクタ
ーで形質転換された宿主細胞の調製法、そのような方法
で調製された形質転換宿主、当該官能性ＤＮＡ配列が発
現されるような適当な条件下、そのような形質転換宿主
を培養することからなるそのような官能性ＤＮＡ配列の
発現方法およびそのような発現を調節する条件下、その
ような形質転換宿主を培養することからなるそのような
官能性ＤＮＡ配列の発現調節方法に関する。 【００１０】また、本発明はストレプトマイセスgalオ
ペロンＰ２プロモーターまたはそのいずれかの官能性誘
導体およびそのような領域に作動的に結合した異種官能
性ＤＮＡ分子からなる組換型ＤＮＡ分子、そのようなＤ
ＮＡ分子および、所望により、さらにレプリコンからな
る組換型ＤＮＡベクター、そのようなベクターで形質転
換された宿主細胞の調製法、そのような方法により調製
された形質転換宿主および当該官能性ＤＮＡ配列が発現
されるような適当な条件下、そのような形質転換宿主を
培養することからなるそのような官能性ＤＮＡ配列の発
現方法に関する。 【００１１】また、本発明は、当該宿主を、ストレプト
マイセスgalオペロンまたはそのいずれかの部分あるい
はそのいずれかの官能性誘導体からなり、そのような宿
主をガラクトースを利用できるようにするに十分な組換
型ＤＮＡ分子で形質転換することからなる非ガラクトー
ス利用性宿主微生物または細胞をガラクトースを利用で
きるようにする方法に関する。また、本発明はそのよう
な方法において用いる組換型ベクターおよびそのような
方法で調製された宿主に関する。 【００１２】 【発明の実施の形態】ストレプトマイセスのゲノムが、
３つの構造遺伝子(galＴ、galＥおよびgalＫ)および２
つのプロモーター(Ｐ１およびＰ２)からなるガラクトー
ス代謝用のオペロン(すなわち、galオペロン)を含むこ
とを見出した。galＴ遺伝子の生成物はガラクトース−
１−ホスフェート・ウリジルトランスフェラーゼ(トラ
ンスフェラーゼ)として知られ、galＥ遺伝子の生成物は
ウリジン・ジホスホガラクトース−４−エピメラーゼ
(エピメラーゼ)として知られ、galＫ遺伝子の生成物は
ガラクトース−１−キナーゼ(ガラクトキナーゼ)として
知られている。ストレプトマイセスのガラクトース代謝
におけるgalＴ、galＥおよびgalＴの遺伝子生成物の機
能はつぎの式で示される。 【００１３】 【化７】 【００１４】本明細書において用いられる「プロモータ
ー」なる語はＲＮＡポリメラーゼの結合および転写を可
能とする構造遺伝子の上流のいずれかの領域を意味す
る。「構造遺伝子」なる語はmＲＮＡの合成のための鋳型
として働く、ペプチド用のコード付け配列を意味する。 【００１５】「オペロン」なる語は１つの酵素系の構成員
として機能的に関連した１つまたは１群の酵素の合成に
関与する１群の密接に結合した遺伝子を意味する。オペ
ロンはオペレーター遺伝子、いくつかの構造遺伝子(系
中の酵素数に等しい)および調節遺伝子からなる。「オペ
レーター」または「オペレーター遺伝子」なる語はオペロ
ン内の隣接する構造遺伝子の生合成を制御するＤＮＡ配
列を意味する。「調節遺伝子」なる語は、活性(酵素誘導)
または不活性(酵素抑制)のいずれかにできるレプレッサ
ーの生成を通してオペロン内のオペレーター遺伝子を制
御する遺伝子を意味する。オペロンにおける構造遺伝子
の転写は、それ自体が以下の３径路の１つ以上で制御さ
れるオペレーター遺伝子によりスイッチが入ったり、切
れたりする。(１)誘導酵素系において、調節遺伝子によ
り生成され、細胞内または細胞外のどこかから由来する
ある代謝産物またはシグナル物質(誘発物質)により、該
誘発物質の存在によりオペロンが活性になるように不活
性化できるレプレッサーによりオペロンがスイッチを切
られる。または、(２)抑制酵素系において、調節遺伝子
によって生成された不活性レプレッサーと、いずれかか
らのコンプレッサーの組合せであり、コンプレッサーの
存在がオペロンを不活性にするようなレプレッサー−コ
ンプレッサー複合体によりオペロンがスイッチを切られ
る。または、(３)活性遺伝子系において、ある代謝産物
またはシグナル物質によって活性化できる調節遺伝子に
よりプロモーターがスイッチを入れられる。 【００１６】ストレプトマイセスgalオペロンはストレ
プトマイセスのゲノム中に天然に存在する。「ストレプ
トマイセスgalオペロン」なる語はＰ１プロモーター、Ｐ
２プロモーター、galＴ、galＥおよびgalＫ構造遺伝子
およびそのような構造遺伝子の転写および翻訳に必要な
他のいずれかの調節領域からなるストレプトマイセスの
ゲノムの領域を意味する。「調節領域」なる語はプロモー
ターまたはオペレーターのようなＤＮＡ配列を意味し、
構造遺伝子の転写を調節する。 【００１７】つぎのモデルはストレプトマイセスgalオ
ペロン内の遺伝子発現について示す。Ｐ１プロモーター
はガラクトース誘導プロモーターである(すなわち、ガ
ラクトースの存在外に誘導され、グルコースの存在下に
抑制される)。Ｓ１データによれば、Ｐ２プロモーター
は構成性であり、すなわち、ガラクトースまたはいずれ
かの他の炭素源の存在または非存在にかかわりなく、ス
イッチが入っている。 【００１８】コスミッドpＪＷ３５７(ストレプトマイセ
スおよびイー・コリの両方において複製する能力をコー
ド付けする)を用いてストレプトマイセス・リビダンス
１３２６ＤＮＡについてのコスミッド・ライブラリーを
組み立てた。ついで、このライブラリーを、バクテリオ
ファージＰ１形質導入ガラクトキナーゼ(galＫ)変異を
含むイー・コリ株ＭＭ２９４の誘導体であるイー・コリ
Ｋ２１にトランスフェクションした。トランスフェクシ
ョンした細胞を、コスミッドの存在および活性galＫ遺
伝子の存在の両方用に選択した培地条件下で平板培養し
た。弱い陽性コロニーを単離し、これらのコロニーから
由来するコスミッドＤＮＡをＫ２１株に形質転換させ
る。これらの形質転換は、ガラクトースを唯一の炭素源
として一貫した陽性増殖を生じる２つのコスミッドを生
じた。これらのgalＫ+コスミッドを、ついで、本発明者
らにより、２−デオキシ−ガラクトース選択［ブラウナ
ーら、ジーン(Ｂrawner et al．,Ｇene)、４０,１９
１(１９８５)参照]を用い、ガラクトースを唯一の炭素
源とする培地上で増殖しないとして単離されたストレプ
トマイセス宿主(すなわち、ストレプトマイセス・リビ
ダンス１３２６−１２Ｋ)に形質転換した。ガラクトキ
ナーゼを産生できるか、できないかで株を区別する条件
下、コスミッドのただ１つがストレプトマイセス・リビ
ダンス１３２６−１２Ｋ宿主をgalＫ+とした。さらに研
究した結果、このコスミッドがガラクトキナーゼ活性を
有する遺伝子をコード付けすることが示された。ＤＮＡ
配列分析および蛋白質研究を含むその後の研究はこのス
トレプトマイセス遺伝子はイー・コリおよび酵母ガラク
トキナーゼ遺伝子と相同性を有することが示された。調
節研究はガラクトキナーゼ遺伝子をコード付けするコス
ミッドが染色体コード遺伝子と同様な方法で調節するこ
とを示した。 【００１９】ストレプトマイセス・リビダンスgalオペ
ロンは当初、ストレプトマイセス・リビダンス１３２６
の約９キロベース(Ｋb)域から単離された。該ストレプ
トマイセスgalオペロンを含有するストレプトマイセス
・リビダンス１３２６の約９Ｋb域は実質的に表１のよ
うな地図位置で示される。「実質的」なる語は、(１)制限
部位の相対位置が概略であること、(２)他の有意な影響
をオペロンに及ぼさずに変異により１つ以上の制限部位
が失われ、または得られうること、および(３)示した酵
素、特に、テストしなかった酵素に対する追加の部位が
存在していてもよいことを意味する。本明細書で用いる
制限酵素は商業的に入手できる。全て、ロバーツ、ヌー
クレイック・アシッズ・リサーチ(Ｎuc．Ａcids．Ｒe
s．),１０(５):p１１７(１９８２)に記載されている。 【００２０】 【表１】 地図位置 制限酵素 位置(Ｋb) １ Ｈind ＩＩＩ −．４０ １a Ｎru Ｉ ０ ２ Ｂgl ＩＩ ．７５ ３ ＥcoＲ Ｉ １．０５ ４ Ｐvu ＩＩ １．１５ ５ Ｍlu Ｉ ２．３０ ６ Ｐvu ＩＩ ２．８０ ７ ＥcoＲ Ｉ ４．００ ８ Ｐvu ＩＩ ４．１０ ８a Ｓac Ｉ ４．２５ ９ Ｐvu ＩＩ ５．００ １０ Ｘho Ｉ ５．５０ １１ ＢamＨ Ｉ ５．８０ １２ ＢamＨ Ｉ ６．５０ １３ Ｍlu Ｉ ６．９０ １３a Ｐvu ＩＩ ７．２０ １４ Ｍlu Ｉ ７．８０ １５ ＢamＨ Ｉ ８．００ １６ Ｓph Ｉ ８．３０ 【００２１】図１はストレプトマイセス・リビダンス１
３２６galオペロンの制限エンドヌクレアーゼ地図を示
し、オペロン内の構造遺伝子(galＴ、galＥおよびgal
Ｋ)およびプロモーター(Ｐ１およびＰ２)の位置を示
す。表１および図１から明らかなごとく、ストレプトマ
イセス・リビダンス１３２６galオペロンのプロモータ
ーおよび構造遺伝子の位置は実質的に表２のとおりであ
る。 【００２２】 【表２】【００２３】ストレプトマイセス属の微生物は歴史的に
製薬工業用の抗生物質源として用いられてきた。その結
果、そのような生成物産生用のビヒクルとしてストレプ
トマイセスを用いる生物学的生成物の製造のスケール・
アップに必要な技術が現在利用できる。しかし、ストレ
プトマイセスが該新規組換型ＤＮＡ技術を用いる生活性
分子の生産用のビヒクルとして使用できる前に、イー・
コリで有用であることが示されたものと同様なストレプ
トマイセスにおける調節エレメントを規定する必要があ
る。これらの調節エレメントにはリボソーム結合部位お
よび調節転写エレメントが含まれる。 【００２４】ストレプトマイセスにおけるgalＥ、gal
Ｔ、またはgalＫ遺伝子または遺伝子生成物あるいはgal
オペロンの存在は従来報告されていない。本発明、すな
わち、ストレプトマイセスgalオペロンのクローニング
はストレプトマイセス、他のアクチノマイセス類および
他の宿主生物における調節可能な発現／クローニングベ
クターの組み立てを可能にする。さらに、本発明はスト
レプトマイセスgalオペロンがポリシストロニックであ
るとの発明を導いた。多分、ストレプトマイセスgalオ
ペロンのクローニングの最も重要な特徴は、ストレプト
マイセスgalＫ遺伝子の調節に必須な配列の存在の観察
である。発現系としてのイー・コリからのlacプロモー
ターの最初の使用と直接相似させることができる。事
実、ブロシウスら、プロシーディングス・オブ・ナショ
ナル・アカデミー・オブ・サイエンス・ユー・エス・エ
イ(Ｂrosius et al．,Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．
Ｕ．Ｓ．Ａ．)８１,６９２９〜６９３３(１９８４)はイ
ー・コリlacプロモーターの調節エレメントを利用して
極端に強いイー・コリ・リボソーム・プロモーターを調
節している。ストレプトマイセスgalオペロン・リボソ
ーム・プロモーターも極端に強いようなので、そのよう
なプロモーターはストレプトマイセス、他のアクチノマ
イセス類および他の宿主生物において非常に有用な調節
可能な発現ベクターの組み立を可能にする。本発明はま
た、イー・コリにおいてgalＫ変異株の選択に用いられ
ていた２−デオキシガラクトース選択がストレプトマイ
セスにおけるgalＫ変異株の選択にも作動するという予
期せぬ発見を可能にした[ブラウナーら、ジーン[Ｂrawn
er et al．,Ｇene)４０,１９１(１９８５)参照]。こ
の観察は、以下に記載するごとく、ストレプトマイセス
galＫ遺伝子およびそのコスミッド上への転写、翻訳に
必要な調節領域のクローン能力と組み合わさって、相同
組換により、ストレプトマイセスの染色体に位置したga
lＫ遺伝子への構造遺伝子の直接挿入を可能にする。こ
の操作は分子生物学者が興味のあるＤＮＡフラグメント
をストレプトマイセスの染色体に安定して挿入すること
を可能にする。このアプローチは研究者が、現在、大部
分のストレプトマイセス発現ベクターにより要求されて
いるような抗生物質選択を続ける必要なしに、興味ある
ストレプトマイセス株にタッグ付けもしくはマーク付け
をしたり、該生物に発現カセットを挿入することを可能
にする。 【００２５】本発明はストレプトマイセスgalオペロン
またはそのいずれかの調節可能な官能性誘導体からなる
組換型ＤＮＡ分子に関する。 【００２６】「調節可能な官能性誘導体」なる語はgal
Ｔ、galＥおよびgalＫ遺伝子生成物の調節可能な生成に
ついて天然のストレプトマイセスgalオペロンと実質的
に同じに機能するストレプトマイセスgalオペロンのい
ずれかの誘導体を意味する。このような誘導体にはgal
オペロンの部分的配列およびgalオペロン・コード付け
配列の修飾によって生成された誘導体が包含される。公
知のgalオペロン修飾技術には、例えば、化学的変異誘
発剤での処理、照射または、酵素または組換技術を用い
る挿入、欠失または核酸置換のような直接遺伝子操作が
包含される。天然に生じるストレプトマイセスgalオペ
ロンは本明細書に記載する技術を用いていずれかのガラ
クトース利用ストレプトマイセス株から単離できる。種
々のストレプトマイセス種の多くの株が多くの源から公
に入手可能である。例えば、米国、メリーランド州、ロ
ックビルのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクシ
ョン(ＡＴＣＣ)は公衆が入手可能な約４００種のストレ
プトマイセスを有している。ストレプトマイセスの個々
の株のグルコースを利用する能力は、その株を、ガラク
トースを唯一の炭素源として含有する培地上で増殖させ
るような通常の技術によって容易に測定できる。galオ
ペロンを単離するのに好ましいストレプトマイセス種に
は、ストレプトマイセス・リビダンス、ストレプトマイ
セス・コエリカラー、ストレプトマイセス・アズラエウ
ス(Ｓ．azuraeus)、ストレプトマイセス・アルブス
(Ｓ．albus)、ストレプトマイセス・カルチノスタティ
クス(Ｓ．carzinostaticus)、ストレプトマイセス・ア
ンチフィブリノリチクス(Ｓ．antifibrinolyticus)およ
びストレプトマイセス・ロンギスポルス(Ｓ．longispor
us)が包含される。ストレプトマイセス・リビダンスが
最も好ましい。ストレプトマイセスgalオペロンおよび
そのより小さい部分は他の細胞および生物から相同な配
列を得るための核酸プローブとして有用である。ストレ
プトマイセスgalオペロンはまた、適当な宿主変異株に
おける選択マーカーとして、また、調節エレメントの提
供に有用である。「適当な宿主変異株」なる語は、(a)gal
オペロンを含まないか、(b)非官能性galオペロンを含有
するか、(c)欠損Ｐ１プロモーター、Ｐ２プロモータ
ー、galＴ遺伝子、galＫ遺伝子および／またはgalＥ遺
伝子のような、ストレプトマイセスgalからなる相同構
造遺伝子または調節領域内に欠損を含むためにガラクト
ースを利用しない宿主を意味する。かくして、通常の技
術で調製できる組換型ＤＮＡ分子(ストレプトマイセスg
alオペロンおよびそれに作動的に結合した異種官能性Ｄ
ＮＡ配列からなる)は、相同組換によって宿主ゲノムに
取り込むための通常の技術によって適当な宿主へ形質転
換でき、高価な抗生物質選択を続ける必要なしに該異種
官能性ＤＮＡ配列の調節可能な発現を可能にする。した
がって、そのようなオペロンはまた、高価な抗生物質選
択を続ける必要なく、当該ベクターで形質転換した適当
な宿主変異株において該オペロンに作動的に結合する異
種官能性ＤＮＡ配列の調節可能な発現用の組換型ＤＮＡ
発現ベクター上に取り込まれうる。そのようなオペロン
はまた、ガラクトースを利用しないストレプトマイセ
ス、他のアクチノマイセスおよびgal-イー・コリ株のよ
うな他の原核生物のような細胞、ウイルスおよび微生物
をガラクトース利用性株に形質転換するのに有用であ
る。この形質転換は形質転換宿主に対して多面的効果を
有しうる。「官能性ＤＮＡ配列」なる語はそれによって形
質転換された宿主生物において遺伝子発現単位、構造遺
伝子、プロモーターまたは調節領域として機能するスト
レプトマイセスまたは他のいずれかの源から直接または
間接に誘導されるＤＮＡのいずれかの分離領域を意味す
る。好ましい官能性ＤＮＡ配列には、限定するものでは
ないが、インシュリン、生長ホルモン、組織プラスミノ
ーゲン・アクチベータ、α−１−抗トリプシンまたはワ
クチン製造に用いる抗原のような医薬上重要なポリペプ
チドをコード付けするものが包含される。「異種官能性
ＤＮＡ配列」なる語はストレプトマイセスgalオペロン・
コード付け領域から誘導されない官能性ＤＮＡ配列を意
味する。 【００２７】本発明はまた、ストレプトマイセスgalオ
ペロンＰ２プロモーター発現単位またはそのいずれかの
官能性誘導体からなる組換型ＤＮＡ分子に関する。「Ｐ
２プロモーター発現単位」なる語はストレプトマイセスg
alオペロンＰ２プロモーター、galＥおよびgalＫ構造遺
伝子およびそのような構造遺伝子の転写および翻訳に必
要な他のいずれかの調節領域からなるストレプトマイセ
スgalオペロンの領域を意味する。「官能性誘導体」なる
語は、ストレプトマイセスgalオペロンgalＥおよびgal
Ｋ遺伝子生成物の生成について天然に生じる領域と実質
的に同じに機能するストレプトマイセスgalオペロンＰ
２プロモーター発現単位のいずれかの誘導体を意味す
る。このような誘導体にはストレプトマイセスgalオペ
ロンＰ２プロモーター発現単位の部分配列およびストレ
プトマイセスgalオペロンＰ２プロモーター発現単位・
コード付け配列の修飾によって得られる誘導体が包含さ
れる。そのような修飾を行なう技術は公知であり、いく
つかは前記した。天然に生じるストレプトマイセスgal
オペロンＰ２プロモーター発現単位は通常の技術により
天然のストレプトマイセスgalオペロンから単離でき
る。ストレプトマイセスgalオペロンＰ２発現単位は適
当な宿主変異株における選択マーカーとして、また、調
節エレメントの提供に有用である。「適当な宿主変異株」
なる語は、欠損Ｐ２プロモーター、galＥ遺伝子および
／またはgalＫ遺伝子のようなストレプトマイセスＰ２
プロモーター発現単位からなる相同構造遺伝子または調
節領域内に欠失を含むためガラクトースを利用できない
宿主を意味する。かくして、通常の技術で調整できる組
換型ＤＮＡ分子(ストレプトマイセスgalオペロンＰ２プ
ロモーター発現単位およびそれに作動的に結合した異質
官能性ＤＮＡ配列からなる)は相同組換による宿主ゲノ
ムへの取り込み用の通常の技術により適当な宿主変異株
へ形質転換でき、高価な抗生物質選択を続けることな
く、該異種官能性ＤＮＡ配列の構成的発現を可能にす
る。そのような発現単位は異種官能性ＤＮＡ配列の構成
的発現用の組換型ＤＮＡ発現ベクター上に取り込まれう
る。ストレプトマイセスgalオペロンＰ２プロモーター
発現単位はまた、適当な宿主変異株の相補に有用であ
り、ついで、高価な抗生物質選択を続ける必要のない、
当該ベクターで形質転換された適当な宿主変異株におい
てそのような発現単位に作動的に結合した異種官能性Ｄ
ＮＡ配列の構成的発現に使用される。 【００２８】本発明はストレプトマイセスgalオペロン
Ｐ１プロモーター調節領域またはそのいずれかの調節可
能な官能性誘導体からなる組換型ＤＮＡ分子にも関す
る。「Ｐ１プロモーター調節領域」なる語はストレプトマ
イセスgalオペロンＰ１プロモーター、galＴ、galＥお
よびgalＫ構造遺伝子ならびにそのような構造遺伝子の
転写および翻訳に必要な他のいずれかの調節領域からな
るストレプトマイセスgalオペロンの領域を意味する。
「調節可能な官能的誘導体」なる語は、ストレプトマイセ
スgalオペロンgalＴ、galＥ、およびgalＫ遺伝子生成物
の調節可能な生成に関し、天然に生じる領域と実質的に
同じに機能するストレプトマイセスgalオペロンＰ１プ
ロモーター調節領域のいずれかの誘導体を意味する。こ
のような誘導体にはストレプトマイセスgalオペロンＰ
１プロモーター調節領域の部分配列およびストレプトマ
イセスgalオペロンＰ１プロモーター調節領域コード付
け配列の修飾により生成される誘導体が包含される。そ
のような修飾を行なう技術は公知であり、いくつかは前
記した、天然に生じるストレプトマイセスgalオペロン
Ｐ１プロモーター調節領域は、天然に生じるストレプト
マイセスgalオペロンからのＰ２プロモーターの切除、
点突然変異によるＰ２プロモーターの不活化またはプロ
モーター内への異種ＤＮＡ配列の挿入のような通常の技
術により、天然に生じるストレプトマイセスgalオペロ
ンから単離できる。ストレプトマイセスgalオペロンＰ
１プロモーター調節領域はストレプトマイセスgalオペ
ロンについて前記した用途に有用である。 【００２９】また、本発明はストレプトマイセスgalオ
ペロンＰ２プロモーターまたはそのいずれかの官能性誘
導体からなる組換型ＤＮＡ分子に関する。「官能性誘導
体」なる語は、ＲＮＡポリメラーゼの結合および当該プ
ロモーターに作動的に結合した官能性ＤＮＡ配列の転写
を可能にするについて天然に生じるＰ２プロモーターと
実質的に同じに機能するストレプトマイセスgalオペロ
ンＰ２プロモーターのいずれかの誘導体を意味する。こ
のような誘導体にはストレプトマイセスgalオペロンＰ
２プロモーターの部分配列およびgalオペロンＰ２プロ
モーター・コード付け配列の修飾によって生じた誘導体
が包含される。そのような修飾を行なう技術は公知であ
り、いくつかは前記した。天然に生じるストレプトマイ
セスgalオペロンＰ２プロモーターは通常の技術によ
り、天然に生じたストレプトマイセスgalオペロンから
単離できる。通常の技術で調製できる組換型ＤＮＡ分子
(ストレプトマイセスgalオペロンＰ２プロモーターおよ
びそれに作動的に結合した異種官能性ＤＮＡ配列からな
る)は相同組換によって宿主ゲノムへ取り込むための通
常の技術によって適当な宿主へ形質転換でき、異種官能
性ＤＮＡ配列の構成的発現を可能にする。ストレプトマ
イセスgalオペロンＰ２プロモーターはまた、当該ベク
ターで形質転換したウイルスおよび有核または原核細胞
または生物、特にストレプトマイセスまたは他のアクチ
ノマイセス類において作動的に結合した異種官能性ＤＮ
Ａ配列の構成的発現用の組換型ＤＮＡ発現ベクターへの
取り込みに有用である。 【００３０】本発明はまた、ストレプトマイセスgalオ
ペロンＰ１プロモーターまたはそのいずれかの調節可能
な官能性誘導体からなる組換型ＤＮＡ分子からなる。
「調節可能な官能性誘導体」なる語は、ＲＮＡポリメラー
ゼの結合を可能にし、そのようなプロモーターに作動的
に結合した官能性ＤＮＡ配列の転写を調節するについて
天然に生じるＰ１プロモーターと実質的に同じに機能す
るストレプトマイセスgalオペロンＰ１プロモーターの
いずれかの誘導体を意味する。このような誘導体にはス
トレプトマイセスgalオペロンＰ１プロモーターの部分
配列と、galオペロンＰ１プロモーター・コード付け配
列の修飾により生成する誘導体が包含される。このよう
な修飾を行なう技術は公知であり、いくつかは前記し
た。天然に生じるストレプトマイセスgalオペロンＰ１
プロモーターは通常の技術により天然に生じるストレプ
トマイセスgalオペロンから単離できる。通常の技術の
調製できる組換型ＤＮＡ分子(ストレプトマイセスgalオ
ペロンＰ１プロモーターおよびそれに作動的に結合した
異種官能性ＤＮＡ配列からなる)は、相同組換による宿
主ゲノムに取り込む通常の技術によって適当な宿主変異
株へ形質転換でき、異種官能性ＤＮＡ配列の調節可能な
発現を可能にする。また、ストレプトマイセスgalオペ
ロンＰ１プロモーターは、当該ベクターで形質転換され
たウイルスおよび有核および原核細胞または生物、特
に、ストレプトマイセスまたは他のアクチノマイセス類
において作動的に結合した異種官能性ＤＮＡ配列の調節
可能な発現用組換型ＤＮＡ発現ベクターへの取り込みに
も有用である。 【００３１】また、本発明はストレプトマイセスgalオ
ペロンgalＥ、galＴまたはgalＥ遺伝子またはそのいず
れかの官能性誘導体からなる組換型ＤＮＡ分子にも関す
る。「官能性誘導体」なる語は活性galＥ、galＴまたはga
lＫ型還元子生成物の生成について天然に生じる遺伝子
と実質的に同じに機能するストレプトマイセスgalオペ
ロンgalＥ、galＴまたはgalＫ遺伝子のいずれかの誘導
体を意味する。このような誘導体にはストレプトマイセ
スgalオペロンgalＥ、galＴまたはgalＫ遺伝子の部分配
列およびgalオペロン配列の修飾によって得られる誘導
体が包含される。このような修飾を行なう技術は公知で
あり、いくつかは前記した。天然に生じるストレプトマ
イセスgalオペロンgalＥ、galＴおよび／またはgalＫ遺
伝子は通常の技術により天然に生じるストレプトマイセ
スgalオペロンから単離できる。ストレプトマイセスgal
オペロンgalＥ、galＴおよび／またはgalＫ遺伝子は適
当な宿主変異株における選択マーカーとして使用でき
る。「適当な宿主変異株」なる語は相同galＥ、galＴおよ
び／またはgalＫ遺伝子内に欠失を含むため、ガラクト
ースを利用できない宿主を意味する。かくして、通常の
技術で調製できる組換型ＤＮＡ分子(共に適当な調節領
域に作動的に結合したストレプトマイセスgalオペロンg
alＥ、galＴおよび／またはgalＫ遺伝子および異種官能
性ＤＮＡ配列からなる)は相同組換によって宿主ゲノム
へ取り込むための通常の技術によって適当な宿主変異株
へ形質転換でき、高価な抗生物質選択を続ける必要なし
に形質転換体の検出を可能にする。同様に、共に適当な
調節領域に作動的に結合したストレプトマイセスgalオ
ペロンgalＥ、galＴおよび／またはgalＫおよび異種官
能性ＤＮＡ配列ならびにレプリコンからなる組換型ＤＮ
Ａベクターは通常の技術で適当な宿主変異株に形質転換
でき、高価な抗生物質選択を続ける必要なしに形質転換
体の検出を可能にする。ストレプトマイセスgalオペロ
ンgalＥ、galＫおよび／またはgalＴ遺伝子はまた適当
な宿主変異株の相補に有用である。 【００３２】また、ストレプトマイセスgalオペロンgal
Ｅ遺伝子は異種ＤＮＡ配列に融合できるリボソーム結合
部位と開始コドンを提供するのに有用であり、適当な発
現ベクターに取り込まれ、適当な宿主に形質転換された
場合に、そのようなコード付け配列を可能にする。その
ような異種官能性ＤＮＡ配列が、ストレプトマイセスga
lオペロンＰ２プロモーター発現単位からなる組換型Ｄ
ＮＡ発現ベクターまたは全galオペロン中のgalＥ遺伝子
リボソーム結合部位および開始コドンと融合すると、そ
のようなＤＮＡ配列は、ベクターが適当な宿主生物に形
質転換される場合、構成的に発現される。そのようなＤ
ＮＡ配列が、ストレプトマイセスgalオペロンＰ２プロ
モーター調節領域からなる組換型ＤＮＡ発現ベクター中
のgalＥ遺伝子リボソーム結合部位および開始コドンに
融合すると、そのようなベクターが適当な宿主生物に形
質転換される場合、ガラクトースまたはグルコースの存
在、非存在を制御することにより、そのようなＤＮＡ配
列の発現を調節できる。 【００３３】ストレプトマイセスgalオペロンgalＴ遺伝
子はまた、異種官能性ＤＮＡ配列に融合できるリボソー
ム結合部位および開始コドンを提供するのに有用で、適
当な発現ベクターに取り込まれ、適当な宿主に形質転換
されると、そのようなコード付け配列の発現を可能にす
る。そのようなＤＮＡ配列が、ストレプトマイセスgal
オペロンＰ１プロモーター調節領域からなる組換型ＤＮ
Ａ発現ベクターまたは全galオペロン中でgalＴ遺伝子リ
ボソーム結合部位および開始コドンに融合すると、前記
のように、そのようなベクターで形質転換された宿主に
おけるそのようなコード付け配列の発現を調節できる。 【００３４】また、本発明は、レプリコン、ストレプト
マイセスgalオペロンまたその官能性の、調節可能な誘
導体およびそのようなオペロンに作動的に結合した異種
官能性ＤＮＡ配列からなる組換型ＤＮＡベクターに関す
る。そのようなベクターは通常の技術で調製できる。用
いるレプリコンは当該ベクターにより形質転換されるベ
クターとなるべき宿主生物中にベクターを安定に、染色
体外的に維持する能力を有することが公知のものとすべ
きである。 【００３５】本発明はまた、組換型ＤＮＡベクターから
なる形質転換宿主微生物に関し、該ベクターはレプリコ
ン、ストレプトマイセスgalオペロンまたはその官能
性、調節可能な誘導体および該オペロンに作動的に結合
した異種官能性ＤＮＡ配列を含有する。また、本発明は
適当な宿主微生物をそのようなベクターで形質転換する
ことからなるそのような宿主の調製法に関する。本発明
はこの方法に用いることのできる適当な宿主にはウイル
スおよび有核および原核細胞または生物、特に、ストレ
プトマイセス属のようなアクチノマイセス類が包含され
る。最も好ましい宿主微生物はストレプトマイセス属に
属する。ストレプトマイセスの好ましい種には、ストレ
プトマイセス・リビダンス、ストレプトマイセス・コエ
リカラー、ストレプトマイセス・アズラエウスおよびス
トレプトマイセス・アルブスが包含される。そのような
宿主微生物のそのようなベクターによる形質転換はチャ
ーターら、カレント・トピックス・イン・マイクロバイ
オロジー・アンド・イムノロジー(Ｃhater et al．,
Ｃurr．Ｔop．Ｍicro．Ｉmm．)９６,６９〜９５(１９８
２)の方法のような通常の技術を用いて行なうことがで
きる。本発明はまた、官能性ＤＮＡ配列が発現される適
当な条件下、本発明の形質転換宿主を培養することから
なる本発明の形質転換宿主に含有される官能性ＤＮＡ配
列の発現方法に関する。「適当な条件」なる語は宿主の増
殖を可能にし、官能性ＤＮＡ配列の発現を可能にする条
件を意味する。この適当な条件は当業者が通常の技術を
用いて決定でき、用いる宿主生物および発現させるべき
官能性ＤＮＡ配列のような種々の因子に依存する。本発
明はまた、発現を調節するに適当な条件下、官能性ＤＮ
Ａ配列を含有する形質転換宿主を培養することからなる
該形質転換宿主に含有される官能性ＤＮＡ配列の発現を
調節する方法に関する。「適当な条件」なる語は、ストレ
プトマイセスgalオペロン(および異種官能性ＤＮＡ配
列)を調節することの可能な条件を意味する。「調節可
能」なる語は形質転換宿主細胞の増殖培地におけるガラ
クトースまたはその代謝産物の存在およびグルコースま
たはその代謝産物の存在に対する応答性であることを意
味する。このような調節は形質転換宿主の培地へのガラ
クトースまたはグルコースの添加または削除により行な
うことができる。本発明の形質転換宿主による異種官能
性ＤＮＡコード付け配列の発現の上昇または下降調節に
ついてのガラクトースおよび／またはグルコースの至適
レベルは通常の技術を用い、当業者が容易に決定でき
る。 【００３６】また、本発明はレプリコン、ストレプトマ
イセスgalオペロンＰ２プロモーター発現単位またはそ
の官能性誘導体およびそのような単位に作動的に結合し
た異種官能性ＤＮＡ配列からなる組換ＤＮＡベクターに
関する。そのようなベクターは通常の技術で調製でき
る。用いるレプリコンは該ベクターで形質転換すべき宿
主生物において、安定に、染色体外的にベクターを維持
する能力の知られているものとすべきである。 【００３７】また、本発明は、レプリコン、ストレプト
マイセスgalオペロンＰ２プロモーター発現単位または
その官能性誘導体および該単位に作動的に結合した異種
官能性ＤＮＡ配列を含有する組換型ＤＮＡベクターから
なる形質転換宿主微生物ならびに、そのようなベクター
で適当な宿主微生物を形質転換することからなるそのよ
うな宿主の調製法に関する。「作動的に結合した」なる語
は官能性ＤＮＡ配列が、その発現が発現制御配列の制御
下にあるように発現制御配列(すなわち、ストレプトマ
イセスgalオペロン、Ｐ２プロモーター発現単位、Ｐ１
プロモーター調節領域、Ｐ１プロモーターまたはＰ２プ
ロモーター)に転写的にまたは翻訳的に結合することを
意味する。すなわち、例えば、異種官能性ＤＮＡ配列
は、当該オペロンをストレプトマイセスgalオペロンＰ
１またはＰ２プロモーター転写体に挿入することによ
り、転写的にまたは翻訳的にストレプトマイセスgalオ
ペロンに結合できる。「レプリコン」なる語は、それによ
って形質転換された宿主微生物または細胞にプラスミド
を染色体外的に維持する機能を有するプラスミド上のＤ
ＮＡの領域を意味する。また、ストレプトマイセスgal
オペロンおよびそのより小さい部分が他の細胞および生
物から相同配列を得る核酸プローブとして有用なことが
判明した。本発明の方法で用いることのできる適当な宿
主微生物には、いずれものウイルスまたは有核もしくは
原核細胞もしくは微生物、特に、ストレプトマイセス属
のもののような、いずれかのアクチノマイセス属が包含
される。最も好ましい宿主微生物はストレプトマイセス
属のものである。ストレプトマイセス属の好ましい種に
はストレプトマイセス・リビダンス、ストレプトマイセ
ス・コエリカラー、ストレプトマイセス・アゼラエウス
およびストレプトマイセス・アルブスが包含される。ベ
クターによるこのような宿主微生物の形質転換は前記チ
ャーターらの方法のような通常の技術を用いて行なうこ
とができる。本発明はまた、官能性ＤＮＡ配列が発現さ
れるような適当な条件下、形質転換宿主を培養すること
からなる本発明の形質転換宿主により含有される異種官
能性ＤＮＡ配列の発現方法に関する。「適当な条件」なる
語は宿主の増殖を可能にし、官能性ＤＮＡ配列の発現を
可能にする条件を意味する。この適当な条件は当業者が
通常の技術を用いて決定でき、用いる宿主生物および発
現させるべき官能性ＤＮＡ配列のような種々の因子に依
存する。 【００３８】また、本発明はレプリコン、ストレプトマ
イセスgalオペロンＰ１プロモーター調節領域またはそ
の官能性、調節可能な誘導体およびそのような領域に作
動的に結合した異種官能性ＤＮＡ配列からなる組換ＤＮ
Ａベクターに関する。そのようなベクターは通常の技術
で調製できる。用いるレプリコンは該ベクターで形質転
換すべき宿主生物において、安定に、染色体外的にベク
ターを維持する能力の知られているものとすべきであ
る。 【００３９】また、本発明は、レプリコン、ストレプト
マイセスgalオペロンＰ１プロモーター調節領域または
その官能性、調節可能な誘導体および該領域に作動的に
結合した異種官能性ＤＮＡ配列を含有する組換型ＤＮＡ
ベクターからなる形質転換宿主微生物ならびに、そのよ
うなベクターで適当な宿主微生物を形質転換することか
らなるそのような宿主の調製法に関する。用いることの
できる適当な宿主微生物には、いずれものウイルスまた
は有核もしくは原核細胞もしくは微生物、特に、ストレ
プトマイセス属のもののような、いずれかのアクチノマ
イセス属が包含される。最も好ましい宿主微生物はスト
レプトマイセス属のものである。ストレプトマイセス属
の好ましい種にはストレプトマイセス・リビダンス、ス
トレプトマイセス・コエリカラー、ストレプトマイセス
・アゼラエウスおよびストレプトマイセス・アルブスが
包含される。ベクターによるこのような宿主微生物の形
質転換は前記チャーターらの方法のような通常の技術を
用いて行なうことができる。本発明はまた、官能性ＤＮ
Ａ配列が発現されるような適当な条件下、形質転換宿主
を培養することからなる本発明の形質転換宿主により含
有される異種官能性ＤＮＡ配列の発現方法に関する。
「適当な条件」なる語は宿主の増殖を可能にし、官能性Ｄ
ＮＡ配列の発現を可能にする条件を意味する。この適当
な条件は当業者が通常の技術を用いて決定でき、用いる
宿主生物および発現させるべき官能性ＤＮＡ配列のよう
な種々の因子に依存する。本発明はまた、発現を調節す
るに適当な条件下、官能性ＤＮＡ配列を含有する形質転
換宿主を培養することからなる該形質転換宿主に含有さ
れる官能性ＤＮＡ配列の発現を調節する方法に関する。
「適当な条件」なる語はストレプトマイセスgalオペロン
Ｐ１プロモーター調節領域(および異種官能性ＤＮＡ配
列)を調節可能にする条件でを意味する。「調節可能」な
る語は形質転換宿主細胞の増殖培地中のガラクトースま
たはその代謝産物の存在または非存在およびグルコース
またはその代謝産物の存在または非存在に応答性である
ことを意味する。そのような調節は形質転換宿主の培地
へのガラクトースまたはグルコースの添加または削除に
より行なうことができる。 【００４０】また、本発明はレプリコン、ストレプトマ
イセスgalオペロンＰ２プロモーターまたはその官能性
誘導体およびそのようなプロモーターに作動的に結合し
た異種官能性ＤＮＡ配列からなる組換ＤＮＡベクターに
関する。そのようなベクターは通常の技術で調製でき
る。用いるレプリコンは該ベクターで形質転換すべき宿
主生物において、安定に、染色体外的にベクターを維持
する能力の知られているものとすべきである。 【００４１】また、本発明は、レプリコン、ストレプト
マイセスgalオペロンＰ２プロモーターまたはその官能
性誘導体および該領域に作動的に結合した異種官能性Ｄ
ＮＡ配列を含有する組換型ＤＮＡベクターからなる形質
転換宿主微生物ならびに、そのようなベクターで適当な
宿主微生物を形質転換することからなるそのような宿主
の調製法に関する。用いることのできる適当な宿主微生
物には、ストレプトマイセス属のもののような、いずれ
かのアクチノマイセス属が包含される。最も好ましい宿
主微生物はストレプトマイセス属のものである。ストレ
プトマイセス属の好ましい種にはストレプトマイセス・
リビダンス、ストレプトマイセス・コエリカラー、スト
レプトマイセス・アゼラエウスおよびストレプトマイセ
ス・アルブスが包含される。ベクターによるこのような
宿主微生物の形質転換は前記チャーターらの方法のよう
な通常の技術を用いて行なうことができる。本発明はま
た、官能性ＤＮＡ配列が発現されるような適当な条件
下、形質転換宿主を培養することからなる該形質転換宿
主に含有される異種官能性ＤＮＡ配列の発現方法に関す
る。「適当な条件」なる語は宿主の増殖を可能にし、官能
性ＤＮＡ配列の発現を可能にする条件を意味する。この
適当な条件は当業者が通常の技術を用いて決定でき、用
いる宿主生物および発現させるべき官能性ＤＮＡ配列の
ような種々の因子に依存する。 【００４２】また、本発明はレプリコン、ストレプトマ
イセスgalオペロンＰ１プロモーターまたはそのいずれ
かの官能性、調節可能な誘導体およびそのような領域に
作動的に結合した異種官能性ＤＮＡ配列からなる組換Ｄ
ＮＡベクターに関する。そのようなベクターは通常の技
術で調製できる。用いるレプリコンは該ベクターで形質
転換すべき宿主生物において、安定に、染色体外的にベ
クターを維持する能力の知られているものとすべきであ
る。 【００４３】また、本発明は、レプリコン、ストレプト
マイセスgalオペロンＰ１プロモーターまたはそのいず
れかの官能性、調節可能な誘導体および該領域に作動的
に結合した異種官能性ＤＮＡ配列を含有する組換型ＤＮ
Ａベクターからなる形質転換宿主微生物ならびに、その
ようなベクターで適当な宿主微生物を形質転換すること
からなるそのような宿主の調製法に関する。用いること
のできる適当な宿主微生物には、ウイルスまたは有核も
しくは原核細胞もしくは微生物、特に、ストレプトマイ
セス属のもののような、いずれかのアクチノマイセス属
が包含される。最も好ましい宿主微生物はストレプトマ
イセス属のものである。ストレプトマイセス属の好まし
い種にはストレプトマイセス・リビダンス、ストレプト
マイセス・コエリカラー、ストレプトマイセス・アゼラ
エウスおよびストレプトマイセス・アルブスが包含され
る。ベクターによるこのような宿主微生物の形質転換は
前記チャーターらの方法のような通常の技術を用いて行
なうことができる。本発明はまた、官能性ＤＮＡ配列が
発現されるような適当な条件下、形質転換宿主を培養す
ることからなる本発明の形質転換宿主により含有される
異種官能性ＤＮＡ配列の発現方法に関する。「適当な条
件」なる語は宿主の増殖を可能にし、官能性ＤＮＡ配列
の発現を可能にする条件を意味する。そのような適当な
条件は当業者が通常の技術を用いて決定でき、用いる宿
主生物および発現させるべき異種官能性ＤＮＡ配列のよ
うな種々の因子に依存する。本発明はまた、発現が調節
可能な適当な条件下、異種官能性ＤＮＡ配列を含む形質
転換宿主を培養することからなる該形質転換宿主に含ま
れる官能性ＤＮＡ配列の発現を調節する方法に関する。
「適当な条件」なる語は該galオペロンＰ１プロモーター
(および官能性ＤＮＡ配列)を調節可能にする条件を意味
する。「調節可能」なる語は、形質転換宿主細胞の増殖培
地中のガラクトースまたはその代謝物の存在または非存
在およびグルコースまたはその代謝物の存在に応答性で
あることを意味する。そのような調節は形質転換宿主の
培地へのガラクトースまたはグルコースの添加または削
除によって行なうことができる。 【００４４】 【実施例】つぎに実施例を挙げて本発明をさらに詳しく
説明するが、これに限定されるものではない。以下の実
施例に示すような、通常の技術を用いることにより、当
業者はストレプトマイセスのいずれかのガラクトース利
用性株からgalオペロンを単離できる。さらに、本明細
書においてストレプトマイセスgalオペロンの単離に用
いたと同様な技術を利用することにより、当業者は該ス
トレプトマイセスgalオペロンをストレプトマイセスの
他のガラクトース利用性株、特に、ストレプトマイセス
・コエリカラー、ストレプトマイセス・アズラエウス、
ストレプトマイセス・アルブスおよび他のストレプトマ
イセス・リビダンス株からのgalオペロンの単離に用い
ることができる。 【００４５】以下の実施例で用いる分子遺伝子操作およ
び他の技術は、英国、ノールウィッチ、ジョン・インズ
・ファウンデーションのホップウッドら、ジェネティッ
ク・マニュピレーション・オブ・ストレプトマイセス:
ア・ラボラトリー・マニュアル(Ｈopwood et al．,Ｇ
enetic Ｍanipulation of Ｓtreptomyces:Ａ Ｌabo
rotory Ｍanual)に記載されている。 【００４６】略号 以下の実施例中、つぎの略号を使用する。 ＬＢ:１０gトリプトン、５g酵母エキス、５gＮaＣl ＭＢＳＭ(修飾ＭＢＳＭ):ブラウナーら、ジーン(Ｂrawn
er et al．,Ｇene)４０,１９１(１９８５)参照 ＭＯＰＳ:(３)−Ｎ−モルホリノ−(プロパン−スルホン
酸) ＹＥＭＥ＋ＭgＣl2＋グリシン:(l当り)３g酵母エキス、
５gペプトン、３g麦芽エキス、１０gグルコース、１０g
ＭgＣl2・６Ｈ2Ｏ、３４０gショ糖 Ｓ１:(ＮＨ4)2ＳＯ4(１g／l)、Ｌ−アスパラギン(２g／
l)、Ｋ2ＨＰＯ4(９g／l)、ＮaＨ2ＰＯ4(１g／l)を０．
２％寒天に対して一緒に混合し、オートクレーブする。
ついで、酵母エキス(２０g／l)、ＭgＣl2(５g／l)、Ｃu
Ｃl2(０．１g／l)。微量元素[２０ml／l−ＺnＣl2(４０
mg／l)、ＦeＣl3・６Ｈ2Ｏ(２００mg／l)、ＣuＣl2・２
Ｈ2Ｏ(１０mg／l)、ＮaＢ4Ｏ7・１０Ｈ2Ｏ(１０mg／
l)、(ＮＨ4)6Ｍo7Ｏ24・４Ｈ2Ｏ(１０mg／l)含有]と混
合、濾過、滅菌 ＹＥＭＥ(Ｙmベース):(l当り)酵母エキス(３g)、ペプト
ン(５g)、麦芽エキス(３g)、ＭgＣl2・６Ｈ2Ｏ(２g) Ｙm glu:ＹＥＭＥ＋グルコース(１０g) Ｙm gal:ＹＥＭＥ＋ガラクトース(１０g) 【００４７】細菌株 以下の実施例中、イー・コリのつぎの株を用いる。 ＣＧＳＣ株＃(a) 株名称 性 染色体マーカー ４４７３(galＥ-) Ｗ３１０９ Ｆ- galＥ９(b)g-;ＩＮ(rrnＤ−rrnＥ)１ ４４６７(galＴ-) Ｗ３１０１ Ｆ- galＴ２２(b)g-;ＩＮ(rrnＤ−rrnＥ)１ ４４９８(galＥ-) ＰＬ-２ Ｈfr thi-１,relＡl,９２１Ｅ２８,g-,spoＴ１ 【００４８】（ａ）ＣＧＳＣ株＃は、米国コネチカット
州、ニュー・ヘブン、ピー・オー・ボックス３３３３、
チェダー・ストリート３３３(３３３Ｃeder Ｓtreet,
Ｐ．Ｏ．Ｂox３３３３,Ｎew Ｈaven,Ｃonnecticut,０
６５１０,Ｕ．Ｓ．Ａ．)のエール・ユニバーシティ・ス
クール・オブ・メディシン、イー・コリ・ジェネティッ
ク・ストック・センター・オブ・ザ・デパートメント・
オブ・ヒューマン・ジェネティックス(Ｅ．coli Ｇene
tic Ｓtock Ｃenter of the Ｄepartmentof Ｈum
an Ｇenetics,Ｙale Ｕniversity Ｓchool of Ｍe
dicine)により該株に付された在庫番号である。 (b)galＥ９は旧レダーベルグ(Ｌederberg)gal９、galＴ
２２は旧レダーベルグgal１である。 【００４９】Ｓ１分析 ＲＮＡの５'端および興味あるＲＮＡの長さを同定する
ためにＳ１分析を用いる。以下の実施例において、Ｓ１
分析はウェーバーら、ヌークレイック・アシッズ・リサ
ーチ(Ｗeaver et al．,Ｎucl．Ａsids Ｒes．)７,１
１７５(１９７９)およびバークら、プロシーディングス
・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・
ユー・エス・エイ(Ｂerk et al．,Ｐroc．Ｎatl．Ａc
ad．Ｓci．ＵＳＡ)７５,１２１４(１９７８)の方法に従
って行なったＳ１実験を示す。 【００５０】実施例１ Ａ．ストレプトマイセス・リビダンス・ガラクトキナー
ゼ遺伝子 ストレプトマイセス・リビダンス株１３２６はビッブ
ら、モレキュラー・アンド・ジェネラル・ジェネティッ
クス(Ｂibb et al．,Ｍol．Ｇen．Ｇenetics)１８４,
２３０〜２４０(１９８１)によって記載されており、英
国、ノーウィッチ、ジョン・インズ・ファンデーション
のディ・エイ・ホップウッド(Ｄ．Ａ．Ｈopwood,Ｊohn
Ｉnnes Ｆoundation,Ｎorwich Ｅugland)より得た。
ストレプトマイセス・リビダンス株１３２６およびpＩ
Ｊ６プラスミドを含有するストレプトマイセス・リビダ
ンス株１３２６は、１９８２年６月１日に、米国イリノ
イ州、ペオリアのアグリカルチュラル・リサーチ・カル
チャー・コレクションに、各々、寄託番号ＮＲＲＬ１５
０９１および１５０９２で寄託した。 【００５１】高分子量染色体ＤＮＡはマニアチスら(Ｍa
niatis et al)、「モレキュラー・クローニング・ア・
ラボラトリー・マニュアル」、コールド・スプリング・
ハーバー・ラボラトリー(１９８２)の方法に従って、ス
トレプトマイセス・リビダンス株１３２６から単離し、
１０〜４０％ショ糖グラジエント上でサイズ分別した
(前記アニアチスら、２８４〜２８５頁)。１８〜２４Ｋ
b対のフラクションを合し、１０mＭトリス−ＨＣl／１m
ＭＥＤＴＡ(pＨ８)に対して充分に透析した。コスミッ
ド・シャトル・ベクターpＪＷ３５７を用いて分別した
染色体ＤＮＡを全体としてクローンした。pＪＷ３５７
はＰstＩで切断したpＤＰＴ６をＰst１で切断したpＩＪ
３５０に融合して作製した。pＩＪ３５０はキーゼル
ら、モレキュラー・アンド・ジェネラル・ジェネティッ
クス(Ｋieser et al．,Ｍol．Ｇen．Ｇenet．)１８
５,２２３〜２３８(１９８２)に記載されている。pＤＰ
Ｔ６はテイラーら(Ｔaylor et al．)の米国特許第４
４７６２２７号に記載されているテトラサイクリンおよ
びクロラムフェニコール耐性、pＢＲ３２２ベース・イ
ーコリ・コスミッド・クローニング・ベクターである。
pＪＷ３５７は該クロラムフェニコール耐性遺伝子中に
独特なＥcoＲＩ部位およびテトラサイクリン耐性遺伝子
に独特なＢamＨＩ部位を有する。pＪＷ３５７をＢamＨ
Ｉで消化し、アルカリ性ホスファターゼで脱ホスホリレ
ート化し、前記の分別した染色体ＤＮＡに連結した。 【００５２】連結生成物をバクテリオファージ頭部につ
つみ込み(前記マニアチスら、２６４〜２６５頁に記載
されたin vitroパッケージング系を用い)、イー・コリ
ＭＭ２９４のgalＫ-誘導体であるイー・コリ株Ｋ２１に
トランスフェクションした。この形質転換培養をＬＢ中
で２時間、２５μg／mlクロラムフェニコール添加ＬＢ
中でさらに２時間増殖させ、等容量の炭素源のないＭ９
培地[ミラー、「エクスペリメンツ・イン・モレキュラー
・ジェネティックス」、コールド・スプリング・ハーバ
ー・ラボラトリー(１９７２)参照]で３回洗浄し、クロ
ラムフェニコール３０mg／mlを添加したＭ９寒天[プロ
リン、ヒスチジン、アルギニン、イソロイシン、ロイシ
ン、食塩水および０．５％ガラクトース補足、アグムス
ら、バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサ
ーチ・コミュニケーション(Ａdams et al．,Ｂioche
m．Ｂiophys．Ｒes．Ｃomm．)８９(２),６５０〜６５８
(１９７９)]上で平板培養した。平板当り約２００形質
転換体を平板２０枚に塗抹した。３７℃で３日間インキ
ュベーション後、形質転換体は検出されなかった。この
最少平板にニコチン酸を５μg／mlでスプレーし、イー
・コリ株Ｋ２１のニコチン酸要求を補足し、さらに３７
℃で３日間、ついで室温で２日間インキュベーションを
続けた。インキュベーション後、生存コロニーをクロラ
ムフェニコール３０μg／mlを添加したマッコンキー・
ガラクトース寒天(ＭＡＣ−ＧＡＬ)(前記ミラーら参照)
および０．５％ガラクトース、５μg／mlニコチン酸、
５μg／mlチアミンおよび３０μg／mlクロラムフェニコ
ールで補足したＭ６３最少寒天(前記ミラーら参照)の両
方にパッチした。２つのコロニーのみが、イー・コリＫ
２１をgalＫ+表現型に形質転換するコスミッドＤＮＡを
含有していた。これらのコスミッドをpＳＬＩＶＧＡＬ
−１およびpＳＬＩＶＧＡＬ−２と命名した。両コロニ
ー共、ＭＡＣ−ＧＡＬ上で薄赤色で(すなわち、これら
はgalＫ+)、Ｍ６３培地上で増殖した。 【００５３】プラスミドpＳＬＩＶＧＡＬ−１およびpＳ
ＬＩＶＧＡＬ−２を前記２つのgalＫ+コロニーから単離
し、前記チャーターらの方法に従って、ストレプトマイ
セス・リビダンス株１３２６−１２Ｋ[ストレプトマイ
セス・リビダンス株１３２６のＵＶ変異誘発後、galＫ
欠損株を単離、ブラウナーら、ジーン(Ｂrawner eta
l．,Ｇene)４０,１９１(１９８５)参照]に形質転換し
た。該ストレプトマイセス・リビダンス１３２６−１２
Ｋ(galＫ-)宿主のプラスミド・コード付け相補を前記ブ
ラウナーらの方法に従って、ＭＢＳＭ−gal−チオスト
レプトン平板上で胞子の増殖を観察してテストした。p
ＳＬＩＶＧＡＬ−２はストレプトマイセス１３２６−１
２Ｋ宿主の検知しうる相補を示さなかった。 【００５４】細胞抽出物を、１％グルコースまたはガラ
クトースおよび１０μg／mlチオストレプトンで補足し
たＳＬ培地中で増殖させた培養から調製した。イムノブ
ロット(immunoblot)分析(前記ブラウナーら参照)によ
り、イー・コリ・ガラクトキナーゼに対するウサギ抗血
清を用いて抽出物のガラクトキナーゼ産生を分析した。
イムノブロット分析で検出された蛋白質はほぼイー・コ
リgalＫのサイズであった。この蛋白質はストレプトマ
イセスのガラクトース補足培養において、グルコース培
養におけるよりも数倍高いレベルで出現した。 【００５５】Ｂ．コスミッド内のストレプトマイセス・
リビダンスgalＫ領域の地図 前記のように調製したpＳＬＩＶＧＡＬ１およびpＳＬＩ
ＶＧＡＬ２のgalＫ領域を、コスミッドからのランダム
・フラグメントのpＵＣ１８誘導体へのクローニング[ノ
ーランダーら、ジーン(Ｎorrander et al．,Ｇene)２
６,１０１〜１０６(１９８３)]およびＭＡＣ−ＧＡＬ培
地上でのイー・コリ株ＭＭ２９４(galＫ-)の相補スコア
により同定した。コスミッド・クローンを部分的にＳau
３ＡＩで消化して(２〜４Ｋbフラグメントの収率が最大
となる条件下)、この反応生成物を、つぎの合成ＤＮＡ
配列： 【００５６】 ５' ＧＡＴＣＡＧＡＴＣＴＴＧＡＴＣＡＣＴＡＧＣＴＡＧＣＴＡＧ３' ３' ＴＣＴＡＧＡＡＣＴＡＧＴＧＡＴＣＧＡＴＣＧＡＴＣＣＴＡＧ５' をpＵＣ１８のＢamＨＩ部位に挿入して作製したpＵＣ１
８の誘導体であるpＵＣ１８−ＴＴ６のＢglＩＩ部位に
連結する。１２個のgalＫ+クローン(ＭＡＣ−ＧＡＬ
上、赤)のサイズをスクリーニングする。プラスミドpＳ
ＡＵ１０と命名した１つのクローンは最も小さく、約
１.４Ｋbのインサート・サイズを有していた。 【００５７】pＳＬＩＶＧＡＬ１含有コロニーと異な
り、pＵＣクローンはＭＡＣ−ＧＡＬ培地上で非常に赤
く、ガラクトキナーゼの産生増加を示した。この酵素レ
ベルの増加の最も可能性の高い説明は、ストレプトマイ
セス・リビダンスgalＫ遺伝子が、コスミッドの上流プ
ロモーターより強いイー・コリ・プロモーターに転写さ
れていることである。 【００５８】pＳＡＵ１０のインサートをＥcoＲＩ〜Ｈi
ndＩＩＩフラグメントとして単離し(これらの部位はpＵ
Ｃ１８−ＴＴ６のインサート領域をフランキングす
る)、ストレプトマイセス・リビダンスgalＫ遺伝子のプ
ローブとして用いる。クローニングに用いた染色体ＤＮ
ＡをＥcoＲＩ＋ＭluＩおよびＢamＨＩ＋ＢgｌＩＩで制
限し、サザーン、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バ
イオロジー(Ｓouthern,Ｊ．Ｍol．Ｂiol．)９８,５０３
(１９７５)の方法に従ってプロットする。pＳＡＵ１０
フラグメントをニック・トランスレーションし、該ブロ
ットに雑種形成させる。プローブは染色体消化物におけ
る１．３ＫbＥcoＲＩ−ＭluＩフラグメントおよび５Ｋb
ＢamＨＩ−ＢglＩＩフラグメントを同定した。このデー
タをコスミッド・インサートの地図と比較して、galＫ
遺伝子の位置(地図位置５と７の間、表１参照)を確認し
た。 【００５９】Ｃ．ストレプトマイセス・リビダンスgal
オペロンのＤＮＡ配列 ストレプトマイセス・リビダンスgalオペロンを鎖終止
[サンガーら、プロシーディングス・オブ・ナショナル
・アカデミー・オブ・サイエンス・ユー・エス・エイ
(Ｓanger et al．,Ｐroc．Ｎat'l．Ａcad．Ｓci．
Ｕ．Ｓ．Ａ．)７４,５４６３(１９７７)参照]および化
学的開裂[マキサムおよびギルバート、メソッズ・イン
・エンザイモロジー(Ｍaxam and Ｇilbert,Ｍethods
in Ｅnzymology)６５,４９９(１９８０)]により配列
づけした。galＫの初めの配列はＭ１３mp１０のＢamＨ
ＩおよびＳalＩ部位の各々にショットガン・クローンさ
れたpＳＡＵ６のインサート(pＳＡＵ１０の２．３Ｋb同
胞)のＳau３ＡＩおよびＳalＩフラグメントから由来し
た[メッシング(Ｍessing)]、メソッズ・イン・エンザイ
モロジー、１０１、２０(１９８３)参照]。ストレプト
マイセス・リビダンスgalＴ、galＥおよびgalＫ遺伝子
のアミノ酸配列はコンピュータによって予測され、イー
・コリおよび／またはサッカロマイセス・セレビシエ
(Ｓ．cevevisiae)ガラクトキナーゼ、gal−１−ホスフ
ェート・ウリジル・トランスフェラーゼおよびＵＤＰ−
４−エピメラーゼ酵素のアミノ酸配列との比較によって
分析した。これらの蛋白質の配列は、gal酵素をコード
付ける遺伝子の総または部分ＤＮＡ配列を用いるコンピ
ュータ分析により予測された[デボウクら、ヌークレイ
ック・アシッズ・リサーチ(Ｄebouck et al．,Ｎuc．
Ａcids Ｒes．)１３(６),１８４１〜１８５３(１９８
５)およびシトロンおよびドネルソン、ジャーナル・オ
ブ・バクテリオロジー(Ｃitron and Ｄonelson,Ｊ．
Ｂacteriology)１５８,２６９(１９８４)参照]。ストレ
プトマイセス・リビダンスgalＫ、galＴ、galＥ遺伝子
生成物についての推定蛋白質配列と、それらの各イー・
コリおよび／またはサッカロミセス・セレビシエ遺伝子
生成物の間にいくらかの相同が見出された。 【００６０】ストレプトマイセス・リビダンスgalオペ
ロンの完全ＤＮＡ配列を表３に示す。表３に包含されて
いるものはオペロンのプロモーターについての転写開始
部位およびgalＴ、galＥおよびgalＫ遺伝子生成物の予
測アミノ酸配列である。 【００６１】 【表３】 【表４】 【表５】【表６】 【表７】【表８】 【表９】【表１０】 【表１１】【表１２】 【表１３】【表１４】 【００６２】実施例２ ストレプトマイセス・リビダンスgalオペロンのプロモ
ーター a)Ｐ１プロモーター (i)概要 このプロモーターはガラクトース誘導性、グルコース抑
制性で、全ストレプトマイセスgalオペロン用の調節可
能プロモーターである。Ｓ１データはストレプトマイセ
ス・リビダンスgalオペロンが約３．４Ｋbのポリシスト
ロニック転写体をコード付けすることを示している。転
写体はgalＴについての約１Ｋb、次いで、各galＥおよ
びgalＫについての約１Ｋbからなる(図１参照)。Ｐ１の
ガラクトース誘導は、少なくとも部分的に、５'端が転
写開始部位の上流３１bpに位置するオペレーター配列お
よび該オペレーターを認識するレプレッサ蛋白により介
在される。 【００６３】(ii)実験:Ｐ１プロモーターの単離、位置
決め、特性づけ ストレプトマイセス・リビダンスgalＫ ＡＴＧの上流
配列を、前記ブラウナーのイー・コリgalＫプロモータ
ー・プローブ系を用い、プロモーターについてスクリー
ニングする。ＨindＩＩＩ−ＭluＩフラグメント(表１、
地図位置１〜５参照)をＳau３ＡＩで制限し、pＫ２１の
特有のＢamＨＩ部位に連結し(図２)、実施例１の方法に
従ってイー・コリＫ２１(galＫ-)中に形質転換する。p
Ｋ２１はpＳＫＯ３の誘導体で、イー・コリgalＫ遺伝子
を含有するイー・コリ−ストレプトマイセス・シャトル
・ベクターである。pＳＫＯ３の構成はローゼンベルグ
ら(Ｒosenberg et al．)、ジェネティック・エンジニ
アリング、８(１９８６)に記載されている。galＫを発
現するクローン、すなわち、プロモーター活性を有する
クローンをマッコンキー−ガラクトース平板上で同定し
た。２つのgalＫ＋クローン(pＫ２１ＭＨ１および２と
命名)をストレプトマイセス１３２６−１２Ｋ(galＫ-)
に形質転換した。形質転換体の抽出物をＹmgluおよびＹ
mgal中で培養し、抗イー・コリ・ガラクトキナーゼ抗血
清を用い、ウエスターン・ブロット分析で分析した。こ
のブロットはガラクトース誘導培養からの抽出物におい
て著しく高いガラクトキナーゼのレベルを示した。 【００６４】pＫ２１ＭＨ１および２は制限分析により
４１０bpのＳau３ＡＩインサートを含有することが示さ
れ、これは、サザーン、ジャーナル・オブ・モレキュラ
ー・バイオロジー９８、５０３(１９７５)の方法による
サザーン・ブロット分析により、ＨindＩＩＩおよびＢg
lＩＩ部位内に含有される(表１、地図位置１〜２)。ク
ローンしたフラグメントを、ストレプトマイセス・リビ
ダンス１３２６−１２Ｋおよびイー・コリＫ１２培養か
ら単離したＲＮＡを用いるＳ１分析により分析した。Ｓ
１消化後得られたフラグメントは２９０ヌクレオチド保
護フラグメントである(Ｓau３ＡＩ部位のmＲＮＡ２９０
のbp上流の５'端を示す)。雑種形成実験(この領域の単
ストランドＭ１３クローンを用いる)は転写の方向が図
２に示すごとく、左から右であること(すなわち、転写
はgalＫの方へ進向する)を示している。 【００６５】通常のＤＮＡ配列分析および追加のＳ１地
図作製分析を用いてmＲＮＡの５'端を規定した。Ｐ１の
ガラクトース誘導調節に関与する配列を、ヌクレアーゼ
Ｂal３１により転写開始部位の上流配列を除去すること
により位置づけした。これらの配列除去によるプロモー
ター機能またはガラクトース誘導におけるいずれもの変
化をＰ１同定に用いたイー・コリgalＫプロモーター・
プローブ・プラスミドを用いて評価した。 【００６６】(iii)galプロモーター欠失の構成 Ｐ１転写開始から下流１００bpおよびＰ１転写開始から
上流２１６bpの配列を含むＤＮＡフラグメントをプラス
ミドpＵＣ１９ＴＴ１にクローンしてプラスミドpＨＬ５
を構成する。プラスミドpＵＣ１９ＴＴ１はノーランダ
ーら、ジーン２６、１０１〜１０６(１９８３)に記載さ
れており、pＵＣ１８−ＴＴ６としてのアンカー(Ｕnke
r)を有している。実施例１Ｂ参照。Ｐ１の前の上流配列
中に延長する欠失はpＨＬ５をＨindＩＩＩで線状化し、
ヌクレアーゼＢal３１で端部を処理することにより発生
させることができる。不均一端をＤＮＡポリメラーゼＩ
のクレノウ・フラグメントで修復する。次いで、Ｂal３
１処理pＨＬ５をＢamＨＩで消化し、５％アクリルアミ
ド・ゲル上を泳動させる。分子量１００〜３００ｂｐの
ＤＮＡフラグメントをゲルから溶出し、ＨｉｎｄＩＩお
よびＢamＨＩで消化したＭ１３mp１０にサブクローンす
る。(メッシング(Ｍessing)、メソッズ・イン・エンザ
イモロジイ、１０１、２０(１９８３)参照)。個々の欠
失を、前記サンガーらのジデオキシ鎖終止法により、単
ストランド・ファージＤＮＡから配列づけする。 【００６７】(iv)Ｐ１プロモーター欠失のイー・コリga
lＫ遺伝子への結合 種々のmp１０クローンをＢamＨＩおよびＨindＩＩＩで
消化した。個々の欠失を有するＤＮＡフラグメントを低
融点アガロース・ゲルから単離し、ＢamＨＩおよびＨin
dＩＩＩで消化したpＫ２１に連結した(図２参照)。イー
・コリＭＭ２９４への形質転換後、プラスミドＤＮＡ
を、各欠失誘導体について単離し、ストレプトマイセス
・リビダンス１２Ｋに形質転換した。 【００６８】(v)ストレプトマイセス・リビダンスにお
けるＢal３１−発生欠失の機能的評価 各々のプロモーター欠失について、１つのチオストレプ
トン耐性形質転換体をＹＭベース(ＹＥＭＥ)＋１０μg
／mlチオストレプトン中で後記logまで増殖させた。細
胞をペレット化し、Ｍ５６を培地中で１回洗浄し、Ｍ５
６培地に再懸濁した(前記ミラーら参照)。洗浄した細胞
を、１％ガラクトースまたは１％グルコース補足ＹＭ＋
０．１Ｍ ＭＯＰＳ(pＨ７．２)＋１０μg／mlチオスト
レプトンへの接種に用いた。細胞を１６時間増殖させ、
次いで、ガラクトースキナーゼ活性を検定した。 【００６９】Ｐ１転写用開始部位の上流１２０、６７、
５５、３４、３１、２４、２０、１８、１０または８bp
配列のいずれかを含有する各pＫ２１誘導体をガラクト
ースキナーゼの発現について分析した。結果は、Ｐ１の
ガラクトース誘導に必要な全ての情報(すなわち、ガラ
クトース増殖細胞において産生されたガラクトキナーゼ
のレベルがグルコース増殖細胞におけるレベルより１０
〜２０倍大きい)がＰ１の上流の３１bp配列に含まれる
ことを示した。Ｐ１の上流３４bp配列を残した欠失は、
ガラクトースが６倍量のガラクトキナーゼを誘導するの
で、ガラクトースによって部分的に誘導性である。すな
わち、オペレーターの一端は、−２４および−３１倍の
間の配列内に位置しなければならない。上流配列の２
０、１８、１０または８bpのいずれかを残した残りの欠
失は構成性Ｐ１プロモーター、すなわち、産生したガラ
クトキナーゼのレベルが、細胞をガラクトースまたはグ
ルコースの存在下で増殖させた場合、同等である。Ｐ１
の８および１０bpを有するプロモーター欠失は構成性で
はあるが、ガラクトキナーゼの量は、１８〜１２０bpの
上流配列を有するプロモーター欠失に比べ、１０倍減少
した。この結果はＰ１の−１０および−１８位間の配列
がプロモーター機能に必須であることを示している。 【００７０】このデータは、Ｐ１のガラクトース誘導
が、少なくとも部分的にオペレーター配列に介在される
モデルを支持している。この配列の一端はＰ１転写開始
部位の上流２４〜３１bpである。オペレーターの一部ま
たは全部の除去は部分的または全体的に脱抑制されたプ
ロモーターをもたらす。この配列の他端はこれらの実験
によって規定されないが、ほぼＰ１転写開始部位の上流
２４〜３１bp配列内に含まれると考えられる。さらに、
これらの配列がガラクトース誘導を達成するに必要な最
小領域内に含まれているので、本発明者らはオペレータ
ーの３'端も転写開始部位の上流１００bp内にある可能
性を排除できない。これらのデータは、オペレーター配
列と相互作用する因子がレプレッサー蛋白質であること
を示唆している。最後に、本発明者らは、Ｐ１がレプレ
ッサー以外の因子(すなわち、ラムダファージcＩＩ蛋白
質のような陽性アクチベーター)によって制御されてガ
ラクトース誘発プロモーター転写体を調節しうるという
可能性を排除する証拠を有しない。 【００７１】b)Ｐ２プロモーター (i)概要 ストレプトマイセスgalオペロンのＰ２プロモーターはg
alＥ遺伝子の上流で、galＥおよびgalＫ遺伝子の両方を
転写する。Ｐ２プロモーター発現はＳ１分析によって示
されるように構成的(すなわち、グルコース抑制／ガラ
クトース誘導でない)である。 【００７２】(ii)実験: Ｐ２プロモーターの単離、位置
決め、特性づけ ストレプトマイセスgalオペロンＰ２の存在は、ストレ
プトマイセス・リビダンス１３２６ＤＮＡのＢalＩＩ−
ＭluＩフラグメントをプラスミドpＫ２１に挿入し(図２
参照)、それによって形質転換されたストレプトマイセ
ス・リビダンス１３２６−１２Ｋ中でガラクトキナーゼ
発現が観察される場合に明らかとなった。 【００７３】ＤＮＡ配列分析およびＳ１分析を用いてス
トレプトマイセス・リビダンスgalオペロンＰ２の５'端
を同定した。Ｐ２プロモーター転写体の５'端は予測し
たgalＥ ＡＴＧの上流１００bp内にある。 【００７４】実施例３ ストレプトマイセスgalオペロン内のポリシストロニッ
ク・メッセージの証拠Ｓ１分析を用いてストレプトマイ
セス・リビダンスgalオペロンgalＫ遺伝子の転写体上流
および下流の地図を作製した。一般に、１〜２Ｋbのオ
ーバー・ラップＤＮＡフラグメントをクローンから単離
し、さらに制限し、末端をラベルした。メッセージはga
lＫの３'端からＰ１の上流端まで続く。 【００７５】ストレプトマイセス・リビダンスgalオペ
ロン転写体の３'端は多分、galＫの最初の１００塩基下
流内に生じる。galＫ配列内の部位で３'ラベルしたフラ
グメントは、下流領域に伸長する場合、その全長までは
保護されない。１つの実験は、galＫ翻訳終止の下流５
０〜１００bpで終止する領域で保護されうることを示し
ている。転写ターミネーターの存在はターミネーター・
プローブを用いる通常の技術によって確認できる。gal
オペロン転写体は、当該部位から５'ラベルＰvuＩＩフ
ラグメントの非全長保護が生じるので、明らかにＰvuＩ
Ｉ部位まで伸長しない(表１、地図位置８参照)。 【００７６】２つのＰvuＩＩからの５'端ラベルフラグ
メント、フラグメントＩ(表１、地図位置４〜６参照)お
よびフラグメントＩＩ(表１、地図位置６〜８参照)並び
にpＳau１０インサートを、メッセージの３'から５'端
へのＳ１ウォーキング(warking)のプローブ源として用
いた。この領域の全てのフラグメントは、部分および完
全保護を示すＰ２プロモーター含有フラグメントを除
き、保護された。Ｓ１消化からの完全保護は、Ｐ１の上
流で開始し、galＫの約１００bp下流まで続くポリシス
トロニック・メッセージを示す。 【００７７】前記のデータはストレプトマイセスgalオ
ペロンのポリシストロニックmＲＮＡの間接的証拠であ
る。長い隣接するＤＮＡフラグメント(例えば、４．５
Ｋb ＨindＩＩＩ−ＳacＩフラグメント、表１、地図位
置７参照)を用いるＳ１分析を転写体サイズの確認に用
いた。 【００７８】実施例４ ストレプトマイセス・リビダンスgalオペロンgalＥおよ
びgalＴ遺伝子の位置決め (i)概要 ストレプトマイセス・リビダンスgalオペロンgalＥ遺伝
子はpＳＬＩＶＧＬ１の１．５Ｋb ＰvuＩＩフラグメン
ト(表１の地図位置４〜６)に位置する(図１)。 【００７９】ストレプトマイセス・リビダンスgalオペ
ロンgalＥコード付け配列はＭluＩ部位を通して伸長す
る(表１の地図位置５)。ストレプトマイセス・リビダン
スgalオペロンgal遺伝子はpＳＬＩＶＧＡＬ１の１．１
５ＫbＮru−ＰvuＩＩ領域に位置する(表１の地図位置１
a〜４参照)。ストレプトマイセス・リビダンスgalオペ
ロンgalＥおよびgalＴ転写方向はgalＫ遺伝子と同じで
ある。 【００８０】(ii)実験 pＳＬＩＶＧＡＬ１に含有される他の機能、特に、酵素
ガラクトース・エピメラーゼ(galＥ)または酵素ガラク
トース・トランスフェラーゼ(galＴ)をコード付けする
プラスミドを同定する必要がある。ストレプトマイセス
galオペロンgalＫ遺伝子はそのイー・コリgalＫ宿主を
相補する能力で同定した。かくして、ストレプトマイセ
スgalＴおよびgalＥ遺伝子の同定は、各々、イー・コリ
galＥ-またはgalＴ-宿主の相補によりテストした。イー
・コリgalＴ-株(ＣＧＳＣ株＃４４６７、Ｗ３１０１)お
よび２つのgalＥ-株(ＣＧＳＣ株＃４４７３、Ｗ３１０
９およびＣＧＳＣ株＃４４９８、ＰＬ−２)を得、pＳＬ
ＩＶＧＡＬ１クローンによる相補のテストをした。 【００８１】ストレプトマイセス・リビダンスgalオペ
ロンgalＫ遺伝子を含有する約９ＫbのＨindＩＩＩ−Ｓp
hＩフラグメント(表１、地図位置１〜１６をpＵＣ１９
に挿入した。このフラグメントはpＵＣ１９内で、pＵＣ
１９のＰｌacプロモーターからの転写がストレプトマイ
セスgalＫ遺伝子と同じ方向になるように位置させる。p
ＵＣ１９はヤニッシューペローら、ジーン(Ｙanisch−
Ｐerrou et al．Ｇene)３３, １０３(１９８３)に記
載されている。相補はマッコンキー−ガラクトース平板
上での増殖により検定した。ガラクトースを利用できる
細胞(galＥ+、galＴ+、galＫ+)はこの培地上で赤〜桃色
となる。ＨindＩＩＩ−ＳphＩインサートを有するpＵＣ
１９含有イー・コリ株ＰＬ−２(実施例２参照)はこの指
示薬平板上で桃色になり、ＨindＩＩＩ−ＳphＩフラグ
メントがストレプトマイセス・リビダンスgalＥ遺伝子
を含有することを示した。galＥ遺伝子は４．５Ｋb Ｈ
indＩＩＩ−ＳacＩ(ＳacＩ部位は表１の地図位置７〜８
近辺の領域に近い)フラグメント内に地図作製した。Ｍl
uＩ部位(表１、地図位置５)からＳacＩ部位までの配列
を除くと、イー・コリＰＬ−２のgalＥ相補は検出され
なかった。galＫ遺伝子の５'端はＭluＩ部位から７０bp
にある。したがって、ＭluＩ部位はgalＥ遺伝子の５'ま
たは３'端内に含まれるようである。galＥ転写方向を決
定するため、ＨindＩＩＩ−ＳacＩフラグメントをpＵＣ
１８に挿入した。この配置において、ストレプトマイセ
ス・リビダンスgalＫ遺伝子はＰlacに関して反対の方向
にある。pＵＣ１８ＨindＩＩＩ−ＳphＩクローンはイー
・コリＰＬ−２を相補せず、galＥはgalＫと同じ方向で
転写されることを示している。さらに、ＭluＩ部位はga
lＥ遺伝子の３'端内に含まれると結論された。ＰvuＩＩ
−ＭluＩフラグメント(表１、地図位置４−５)のＤＮＡ
配列分析は予測分子量３３０００ダルトンのポリペプチ
ドをコード付けするオープン・リーディング・フレーム
を決定した。このリーディング・フレームの５'端はＰv
uＩＩ部位から約１７６bpに位置する(表１、地図位置４
参照)。かくして、この配列づけの結果はgalＥの３'端
がＭluＩ部位を横切るという結論を指示している(表
１、地図位置５参照)。 【００８２】pＳＬＩＶＧＡＬ１上のgalＴ遺伝子を位置
づけする同様な実験をgalＴ宿主で試みた。Ｐ１およびg
alＥの５'端間の領域を配列づけしてgalＴ遺伝子を同定
した。ＤＮＡ配列のアミノ酸配列への翻訳は酵母トラン
スフェラーゼに相同な領域を示す蛋白質をコード付けす
るリーディング・フレームを規定する。 【００８３】実施例５ ストレプトマイセス・リビダンスgalオペロンgalＫ遺伝
子のガラクトース誘導 (i)概要 ガラクトースを培地に添加後１時間以内にガラクトキナ
ーゼ発現が誘導される。グルコースの存在下または該糖
添加後６時間以内に追加の炭素源を加えない場合に対
し、ガラクトースの存在下ではガラクトキナーゼの発現
は１０倍も高い。 【００８４】(ii)実験 ストレプトマイセス・リビダンスgalＫ遺伝子のガラク
トース誘導を、ガラクトースの添加後、１、３、６およ
び２４時間におけるガラクトキナーゼ活性の検定により
試験した。ＹＭ＋０．１Ｍ ＭＯＰＳ(pＨ７．２)２リ
ットルにストレプトマイセス・リビダンス１３２６の胞
子２×１０7個を接種した。２１時間増殖後、最終濃度
１％でガラクトースまたはグルコースを加えた。糖添加
１、３、６および２４時間後、細胞を単離し、ガラクト
キナーゼ活性を検定した。全ＲＮＡは前記ホップウッド
らに記載の方法で調製した。 【００８５】ガラクトキナーゼ合成の増加はガラクトー
ス添加１時間後に観察された。この増加は持続した(１
〜２４時間)。誘導培養から単離したＲＮＡのＳ１分析
からgalＫ活性の増加がＰ１プロモーター転写体のレベ
ル増加によることを確認した。Ｓ１データおよび誘導研
究はストレプトマイセスgalオペロンにおける遺伝子発
現についての以下のモデルを示唆した。Ｐ１プロモータ
ーはガラクトース誘導プロモーターである。Ｐ１転写体
はgalＴ、galＥおよびgalＫを包含する。Ｐ２プロモー
ターは構成性で、その転写体はgalＥおよびgalＫを包含
する。 【００８６】イー・コリgalオペロンも２つのプロモー
ターＰ１およびＰ２を有することは興味深い[ナッソ
ら、セル(Ｎusso et al．Ｃell)１２, ８４７(１９７
７)]。Ｐ１はcＡＭＰ−ＣＲＰ結合によって活性化され
るが、Ｐ２はcＡＭＰ−ＣＲＰによって抑制される。イ
ー・コリgalオペロンgalＥコード付け配列翻訳は、ガラ
クトースの非存在下またはグルコースの存在下でもエピ
メラーゼの一定の源を供給する役割をするＰ２において
転写が開始される場合、より効率的である[クイーン
ら、セル(Ｑueen et al．Ｃell)２５, ２４１(１９８
１)参照]。エピメラーゼはガラクトース利用の間、ガラ
クトースをグルコース−１−ホスフェートに変え、ＵＤ
Ｐ−グルコースをイー・コリの細胞壁生合成に必要なＵ
ＤＰ−ガラクトースに変える機能を有する。ストレプト
マイセスgalＫオペロンのＰ２プロモーターも、ガラク
トースの非存在下または二次代謝の間にエピメラーゼお
よびガラクトキナーゼを供給する役割をする可能性があ
る。 【００８７】実施例６ ストレプトマイセス・コエリカラーgalオペロン (i)概要 ストレプトマイセス・コエリカラーgalＫ遺伝子含有フ
ラグメントの制限地図はストレプトマイセス・リビダン
スgalオペロンの制限地図と同じである(図３参照)。 【００８８】ストレプトマイセス・コエリカラーはガラ
クトースを唯一の炭素源とする最少培地上で増殖でき
る。ストレプトマイセス・コエリカラーにおけるガラク
トキナーゼ発現は増殖培地にガラクトースを添加するこ
とにより誘導される。Ｐ１と類似で、ほぼ同一と考えら
れるプロモーターがストレプトマイセス・コエリカラー
galオペロンのガラクトース誘導に関与する。 【００８９】(ii)実験 ストレプトマイセス・コエリカラーgalＫ遺伝子含有の
約１４Ｋb部分Ｓau３Ａフラグメントは英国マンチェス
ターの、ユニバーシティ・オブ・マンチェスター・イン
スティテュート・オブ・サイエンス・アンド・テクノロ
ジーにおいてケイ・ケンダルおよびジェイ・クラム
(Ｋ．ＫendallおよびＪ．Ｃullum)によって単離された
(未公開、私信)。彼等は、ストレプトマイセス・コエリ
カラーgalＫ変異株の相補により３Ｋb ＥcoＲＩフラグ
メント内にストレプトマイセス・コエリカラーgalＫ遺
伝子を位置づけすることができた。ストレプトマイセス
・リビダンスgalオペロン内の多くの制限部位の位置は
ストレプトマイセス・コエリカラーgalＫ遺伝子を含む
ＥcoＲＩフラグメントの上流および下流内に見られるも
のと同じである(図３)。すなわち、ストレプトマイセス
・コエリカラーgalオペロンの遺伝子構成はストレプト
マイセス・リビダンスgalオペロンと同じであるように
考えられる。 【００９０】ストレプトマイセス・コエリカラーgalＫ
遺伝子のガラクトース誘導をイムノブロッティングで試
験した。ストレプトマイセス・コエリカラーをＹＭ＋１
％ガラクトースまたは１％グルコース(ＹmgluまたはＹm
gal)中、２８℃で２０時間増殖させた。ガラクトキナー
ゼ発現は、精製イー・コリ・ガラクトキナーゼに対して
調製したウサギ坑血清を用いて検出した。検出した蛋白
質はイー・コリおよびストレプトマイセス・リビダンス
ｇａｌＫ遺伝子生成物の近似部位であった。ガラクトキ
ナーゼ発現は、ストレプトマイセス・コエリカラーがＹ
ｍ＋ガラクト（Ｙｍｇａｌ）中で増殖した場合のみ検出
されるので、ガラクトース誘導である。 【００９１】ストレプトマイセス・コエリカラーｇａｌ
オペロンのガラクトース誘導がストテプトマイセス・リ
ビダンスＰ１プロモーターに類似するプロモーターによ
って指示されているか否かを決定するためにＳ１ヌクレ
アーゼ保護研究を行った。ＲＮＡを、Ｙｍ＋１％ガラク
トースまたは１％グルコース（ＹｍｇａｌまたはＹｍｇ
ｌｕ）中で増殖させたストレプトマイセス・コエリカラ
ーから単離した。このＲＮＡのＳ１分析に用いた雑種形
成プローブは、ストレプトマイセス・リビダンスＰ１プ
ロモーター、その転写開始部位およびｇａｌＴ遺伝子の
５′端を含む４１０ｂｐＳａｕ３Ａであった。この分析
により検出されたＳ１保護フラグメントは、ガラクトー
ス存在Ｔで増殖したストレプトマイセス・リビダンスか
ら単離したＲＮＡとプローブを雑種形成させた場合、検
出した保護フラグメントと共に泳動した。すなわち、こ
の結果は、ストレプトマイセス・コエリカラーgalオペ
ロンのガラクトース誘導がストレプトマイセス・リビダ
ンスＰ１プロモーターと区別できない配列によって指示
されていることを示している。 【００９２】以下のストレプトマイセス株は唯一の炭素
源としてガラクトースを含有する培地上で増殖できるこ
とが観察された。 ストレプトマイセス・アルブスＪ１０７４(前記英国ノ
ーウィッチのチャーター氏より入手) ストレプトマイセス・カルジノスタティクス(Ｓ．carzi
nostaticus)ＡＴＣＣＮo．１５９４４ ストレプトマイセス・カルジノスタティクスＡＴＣＣ
Ｎo．１５９４５ 【００９３】ストレプトマイセス・アンチフィブリノリ
チクス(Ｓ．antifibrinolyticus)ＡＴＣＣ Ｎo．２１
８６９ ストレプトマイセス・アンチフィブリノリチクスＡＴＣ
Ｃ Ｎo．２１８７０ ストレプトマイセス・アンチフィブリノリチクスＡＴＣ
Ｃ Ｎo．２１８７１ ストレプトマイセス・ロンギスポルス(Ｓ．longisporu
s)ＡＴＣＣ Ｎo．２３９３１ 以上、本発明の好ましい具体例を実施例として記載した
が、本発明はこれらに限定されるものではない。
ス（Ｓtreptomyces）galオペロンを有してなる組換型Ｄ
ＮＡ分子に関する。 【０００２】 【従来の技術】ホッジソン、ジャーナル・オブ・ジェネ
ラル・マイクロバイオロジー（Ｈodgson,Ｊ．Ｇen．Ｍi
cro．）１２８,２４１７〜２４３０（１９８２）はスト
レプトマイセス・コエリカラー（Ｓ．coelicolor）Ａ３
(２)が、野性型株におけるグリセロール摂取系の１つで
あるアラビノース摂取系の転写レベルにおける抑制と、
ガラクトース摂取系の抑制をもさせるグルコース抑制系
を有することを報告している。しかし、ホッジソンには
ストレプトマイセス・コエリカラーＡ３(２)による実際
のガラクトース代謝の報告は全くない。 【０００３】オケダら、モレキュラー・アンド・ジェネ
ラル・ジェネティックス(Ｏkeda et al．,Ｍol．Ｇe
n．Ｇenet．)１９６,５０１〜５０７(１９８４)は、グ
ルコース・キナーゼ活性、２−デオキシグルコース感受
性、グルコース利用性およびグルコース抑制が、ストレ
プトマイセス・コエリカラーからファージ・ベクターに
クローンされた当該glk遺伝子を含有する３．５ＫbＤＮ
Ａフラグメントによって形質転換されたストレプトマイ
セス・コエリカラーＡ３(２)glk(グルコース・キナー
ゼ)変異株に全て復元されたことを報告している。セノ
ら、モレキュラー・アンド・ジェネラル・ジェネティッ
クス(Ｓeno etal．,Ｍol．Ｇen．Ｇenet．)１９３,１
１９〜１２８(１９８４)はストレプトマイセス・コエリ
カラーのゼリセロール(gyl)オペロンを報告し、かかる
オペロンが基質誘発性で、カタボライト抑制性であると
述べている。 【０００４】デボウクら、ヌークレイック・アシッズ・
リサーチ(Ｄebouck et al．,Ｎuc．Ａcids．Ｒes．)
１３(６),１８４１〜１８５３(１９８５)はイー・コリ
(Ｅ．coli)のgalオペロンが、ガラクトースの代謝に必
要な酵素、すなわち、galＥ(ウリジン・ジホスホガラク
トース−４−エピメラーゼ)、galＴ(ガラクトース−１
−ホスフェート・ウリジルトランスフェラーゼ)およびg
alＫ(ガラクトキナーゼ)を特定する３つの構造的に近似
した遺伝子からなること、これらの遺伝子がポリシスト
ロニックmＲＮＡからＥ、Ｔ、Ｋの順序で発現されるこ
と、オペロンのプロモーター遠位遺伝子galＫの発現が
その直前のgalＴ遺伝子に翻訳的にカップルされること
が公知であること、このような翻訳的カップルが、gal
Ｔコード付け配列の端と、galＫのリボソーム結合域の
間の構造的オーバーラップから生じること、およびgal
ＴおよびgalＫの翻訳的カップリングが、ガラクトース
の代謝の間のこれらの遺伝子の一律発現を保証すること
を報告している。 【０００５】 【発明が解決しようとする課題およびその課題を解決す
るための手段】本発明はストレプトマイセスgalオペロ
ンgalＫ遺伝子、galＥ遺伝子、galＴ遺伝子、Ｐ２プロ
モーター発現単位またはＰ２プロモーターまたはそのい
ずれかの官能性誘導体からなる組換型ＤＮＡ分子ならび
にストレプトマイセスgalオペロンＰ１プロモーター、
Ｐ１プロモーター調節領域または全galオペロンまたは
そのいずれかの調節可能な官能性誘導体からなる組換型
ＤＮＡ分子に関する。 【０００６】本発明はまた、ストレプトマイセスgalオ
ペロンまたはそのいずれかの調節可能な官能性誘導体お
よびかかるオペロンに作動的に結合した官能性ＤＮＡ分
子からなる組換型ＤＮＡ分子、かかるＤＮＡ分子、所望
により、さらにレプリコンからなる組換型ＤＮＡベクタ
ー、かかるベクターで形質転換された宿主細胞の調製
法、そのような方法で調製された形質転換宿主、当該官
能性ＤＮＡ配列が発現されるような適当な条件下、その
ような形質転換宿主を培養することからなる該官能性Ｄ
ＮＡ配列の発現方法およびそのような発現を調節する条
件下、そのような形質転換宿主を培養することからなる
そのような官能性ＤＮＡ配列の発現を調節する方法に関
する。 【０００７】また、本発明はストレプトマイセスgalオ
ペロンＰ２プロモーター発現単位またはそのいずれかの
官能性誘導体およびその単位に作動的に結合した官能性
ＤＮＡ分子からなる組換型ＤＮＡ分子、そのようなＤＮ
Ａ分子および、所望により、さらにレプリコンからなる
組換型ＤＮＡベクター、そのようなベクターで形質転換
された宿主細胞の調製法、そのような方法で調製された
形質転換宿主および当該官能性ＤＮＡ配列が発現される
ような適当な条件下、そのような形質転換宿主を培養す
ることからなるそのような官能性ＤＮＡ配列の発現方法
に関する。 【０００８】また、本発明はストレプトマイセスgalオ
ペロンＰ１プロモーター調節領域またはそのいずれかの
調節可能な官能性誘導体およびそのような領域に作動的
に結合した官能性ＤＮＡ分子からなる組換型ＤＮＡ分
子、そのようなＤＮＡ分子および、所望により、さらに
レプリコンからなる組換型ＤＮＡベクター、そのような
ベクターで形質転換された宿主細胞の調製法、そのよう
な方法で調製された形質転換宿主、当該官能性ＤＮＡ配
列が発現されるような適当な条件下、そのような形質転
換宿主を培養することからなるそのような官能性ＤＮＡ
配列の発現方法およびそのような発現を調節する条件
下、そのような形質転換宿主を培養することからなるそ
のような官能性ＤＮＡ配列の発現を調節する方法に関す
る。 【０００９】また、本発明はストレプトマイセスgalオ
ペロンＰ１プロモーターまたはそのいずれかの調節可能
な官能性誘導体およびそのような領域に作動的に結合し
た異種官能性ＤＮＡ分子からなる組換型ＤＮＡ分子、そ
のようなＤＮＡ分子および、所望により、さらにレプリ
コンからなる組換型ＤＮＡベクター、そのようなベクタ
ーで形質転換された宿主細胞の調製法、そのような方法
で調製された形質転換宿主、当該官能性ＤＮＡ配列が発
現されるような適当な条件下、そのような形質転換宿主
を培養することからなるそのような官能性ＤＮＡ配列の
発現方法およびそのような発現を調節する条件下、その
ような形質転換宿主を培養することからなるそのような
官能性ＤＮＡ配列の発現調節方法に関する。 【００１０】また、本発明はストレプトマイセスgalオ
ペロンＰ２プロモーターまたはそのいずれかの官能性誘
導体およびそのような領域に作動的に結合した異種官能
性ＤＮＡ分子からなる組換型ＤＮＡ分子、そのようなＤ
ＮＡ分子および、所望により、さらにレプリコンからな
る組換型ＤＮＡベクター、そのようなベクターで形質転
換された宿主細胞の調製法、そのような方法により調製
された形質転換宿主および当該官能性ＤＮＡ配列が発現
されるような適当な条件下、そのような形質転換宿主を
培養することからなるそのような官能性ＤＮＡ配列の発
現方法に関する。 【００１１】また、本発明は、当該宿主を、ストレプト
マイセスgalオペロンまたはそのいずれかの部分あるい
はそのいずれかの官能性誘導体からなり、そのような宿
主をガラクトースを利用できるようにするに十分な組換
型ＤＮＡ分子で形質転換することからなる非ガラクトー
ス利用性宿主微生物または細胞をガラクトースを利用で
きるようにする方法に関する。また、本発明はそのよう
な方法において用いる組換型ベクターおよびそのような
方法で調製された宿主に関する。 【００１２】 【発明の実施の形態】ストレプトマイセスのゲノムが、
３つの構造遺伝子(galＴ、galＥおよびgalＫ)および２
つのプロモーター(Ｐ１およびＰ２)からなるガラクトー
ス代謝用のオペロン(すなわち、galオペロン)を含むこ
とを見出した。galＴ遺伝子の生成物はガラクトース−
１−ホスフェート・ウリジルトランスフェラーゼ(トラ
ンスフェラーゼ)として知られ、galＥ遺伝子の生成物は
ウリジン・ジホスホガラクトース−４−エピメラーゼ
(エピメラーゼ)として知られ、galＫ遺伝子の生成物は
ガラクトース−１−キナーゼ(ガラクトキナーゼ)として
知られている。ストレプトマイセスのガラクトース代謝
におけるgalＴ、galＥおよびgalＴの遺伝子生成物の機
能はつぎの式で示される。 【００１３】 【化７】 【００１４】本明細書において用いられる「プロモータ
ー」なる語はＲＮＡポリメラーゼの結合および転写を可
能とする構造遺伝子の上流のいずれかの領域を意味す
る。「構造遺伝子」なる語はmＲＮＡの合成のための鋳型
として働く、ペプチド用のコード付け配列を意味する。 【００１５】「オペロン」なる語は１つの酵素系の構成員
として機能的に関連した１つまたは１群の酵素の合成に
関与する１群の密接に結合した遺伝子を意味する。オペ
ロンはオペレーター遺伝子、いくつかの構造遺伝子(系
中の酵素数に等しい)および調節遺伝子からなる。「オペ
レーター」または「オペレーター遺伝子」なる語はオペロ
ン内の隣接する構造遺伝子の生合成を制御するＤＮＡ配
列を意味する。「調節遺伝子」なる語は、活性(酵素誘導)
または不活性(酵素抑制)のいずれかにできるレプレッサ
ーの生成を通してオペロン内のオペレーター遺伝子を制
御する遺伝子を意味する。オペロンにおける構造遺伝子
の転写は、それ自体が以下の３径路の１つ以上で制御さ
れるオペレーター遺伝子によりスイッチが入ったり、切
れたりする。(１)誘導酵素系において、調節遺伝子によ
り生成され、細胞内または細胞外のどこかから由来する
ある代謝産物またはシグナル物質(誘発物質)により、該
誘発物質の存在によりオペロンが活性になるように不活
性化できるレプレッサーによりオペロンがスイッチを切
られる。または、(２)抑制酵素系において、調節遺伝子
によって生成された不活性レプレッサーと、いずれかか
らのコンプレッサーの組合せであり、コンプレッサーの
存在がオペロンを不活性にするようなレプレッサー−コ
ンプレッサー複合体によりオペロンがスイッチを切られ
る。または、(３)活性遺伝子系において、ある代謝産物
またはシグナル物質によって活性化できる調節遺伝子に
よりプロモーターがスイッチを入れられる。 【００１６】ストレプトマイセスgalオペロンはストレ
プトマイセスのゲノム中に天然に存在する。「ストレプ
トマイセスgalオペロン」なる語はＰ１プロモーター、Ｐ
２プロモーター、galＴ、galＥおよびgalＫ構造遺伝子
およびそのような構造遺伝子の転写および翻訳に必要な
他のいずれかの調節領域からなるストレプトマイセスの
ゲノムの領域を意味する。「調節領域」なる語はプロモー
ターまたはオペレーターのようなＤＮＡ配列を意味し、
構造遺伝子の転写を調節する。 【００１７】つぎのモデルはストレプトマイセスgalオ
ペロン内の遺伝子発現について示す。Ｐ１プロモーター
はガラクトース誘導プロモーターである(すなわち、ガ
ラクトースの存在外に誘導され、グルコースの存在下に
抑制される)。Ｓ１データによれば、Ｐ２プロモーター
は構成性であり、すなわち、ガラクトースまたはいずれ
かの他の炭素源の存在または非存在にかかわりなく、ス
イッチが入っている。 【００１８】コスミッドpＪＷ３５７(ストレプトマイセ
スおよびイー・コリの両方において複製する能力をコー
ド付けする)を用いてストレプトマイセス・リビダンス
１３２６ＤＮＡについてのコスミッド・ライブラリーを
組み立てた。ついで、このライブラリーを、バクテリオ
ファージＰ１形質導入ガラクトキナーゼ(galＫ)変異を
含むイー・コリ株ＭＭ２９４の誘導体であるイー・コリ
Ｋ２１にトランスフェクションした。トランスフェクシ
ョンした細胞を、コスミッドの存在および活性galＫ遺
伝子の存在の両方用に選択した培地条件下で平板培養し
た。弱い陽性コロニーを単離し、これらのコロニーから
由来するコスミッドＤＮＡをＫ２１株に形質転換させ
る。これらの形質転換は、ガラクトースを唯一の炭素源
として一貫した陽性増殖を生じる２つのコスミッドを生
じた。これらのgalＫ+コスミッドを、ついで、本発明者
らにより、２−デオキシ−ガラクトース選択［ブラウナ
ーら、ジーン(Ｂrawner et al．,Ｇene)、４０,１９
１(１９８５)参照]を用い、ガラクトースを唯一の炭素
源とする培地上で増殖しないとして単離されたストレプ
トマイセス宿主(すなわち、ストレプトマイセス・リビ
ダンス１３２６−１２Ｋ)に形質転換した。ガラクトキ
ナーゼを産生できるか、できないかで株を区別する条件
下、コスミッドのただ１つがストレプトマイセス・リビ
ダンス１３２６−１２Ｋ宿主をgalＫ+とした。さらに研
究した結果、このコスミッドがガラクトキナーゼ活性を
有する遺伝子をコード付けすることが示された。ＤＮＡ
配列分析および蛋白質研究を含むその後の研究はこのス
トレプトマイセス遺伝子はイー・コリおよび酵母ガラク
トキナーゼ遺伝子と相同性を有することが示された。調
節研究はガラクトキナーゼ遺伝子をコード付けするコス
ミッドが染色体コード遺伝子と同様な方法で調節するこ
とを示した。 【００１９】ストレプトマイセス・リビダンスgalオペ
ロンは当初、ストレプトマイセス・リビダンス１３２６
の約９キロベース(Ｋb)域から単離された。該ストレプ
トマイセスgalオペロンを含有するストレプトマイセス
・リビダンス１３２６の約９Ｋb域は実質的に表１のよ
うな地図位置で示される。「実質的」なる語は、(１)制限
部位の相対位置が概略であること、(２)他の有意な影響
をオペロンに及ぼさずに変異により１つ以上の制限部位
が失われ、または得られうること、および(３)示した酵
素、特に、テストしなかった酵素に対する追加の部位が
存在していてもよいことを意味する。本明細書で用いる
制限酵素は商業的に入手できる。全て、ロバーツ、ヌー
クレイック・アシッズ・リサーチ(Ｎuc．Ａcids．Ｒe
s．),１０(５):p１１７(１９８２)に記載されている。 【００２０】 【表１】 地図位置 制限酵素 位置(Ｋb) １ Ｈind ＩＩＩ −．４０ １a Ｎru Ｉ ０ ２ Ｂgl ＩＩ ．７５ ３ ＥcoＲ Ｉ １．０５ ４ Ｐvu ＩＩ １．１５ ５ Ｍlu Ｉ ２．３０ ６ Ｐvu ＩＩ ２．８０ ７ ＥcoＲ Ｉ ４．００ ８ Ｐvu ＩＩ ４．１０ ８a Ｓac Ｉ ４．２５ ９ Ｐvu ＩＩ ５．００ １０ Ｘho Ｉ ５．５０ １１ ＢamＨ Ｉ ５．８０ １２ ＢamＨ Ｉ ６．５０ １３ Ｍlu Ｉ ６．９０ １３a Ｐvu ＩＩ ７．２０ １４ Ｍlu Ｉ ７．８０ １５ ＢamＨ Ｉ ８．００ １６ Ｓph Ｉ ８．３０ 【００２１】図１はストレプトマイセス・リビダンス１
３２６galオペロンの制限エンドヌクレアーゼ地図を示
し、オペロン内の構造遺伝子(galＴ、galＥおよびgal
Ｋ)およびプロモーター(Ｐ１およびＰ２)の位置を示
す。表１および図１から明らかなごとく、ストレプトマ
イセス・リビダンス１３２６galオペロンのプロモータ
ーおよび構造遺伝子の位置は実質的に表２のとおりであ
る。 【００２２】 【表２】【００２３】ストレプトマイセス属の微生物は歴史的に
製薬工業用の抗生物質源として用いられてきた。その結
果、そのような生成物産生用のビヒクルとしてストレプ
トマイセスを用いる生物学的生成物の製造のスケール・
アップに必要な技術が現在利用できる。しかし、ストレ
プトマイセスが該新規組換型ＤＮＡ技術を用いる生活性
分子の生産用のビヒクルとして使用できる前に、イー・
コリで有用であることが示されたものと同様なストレプ
トマイセスにおける調節エレメントを規定する必要があ
る。これらの調節エレメントにはリボソーム結合部位お
よび調節転写エレメントが含まれる。 【００２４】ストレプトマイセスにおけるgalＥ、gal
Ｔ、またはgalＫ遺伝子または遺伝子生成物あるいはgal
オペロンの存在は従来報告されていない。本発明、すな
わち、ストレプトマイセスgalオペロンのクローニング
はストレプトマイセス、他のアクチノマイセス類および
他の宿主生物における調節可能な発現／クローニングベ
クターの組み立てを可能にする。さらに、本発明はスト
レプトマイセスgalオペロンがポリシストロニックであ
るとの発明を導いた。多分、ストレプトマイセスgalオ
ペロンのクローニングの最も重要な特徴は、ストレプト
マイセスgalＫ遺伝子の調節に必須な配列の存在の観察
である。発現系としてのイー・コリからのlacプロモー
ターの最初の使用と直接相似させることができる。事
実、ブロシウスら、プロシーディングス・オブ・ナショ
ナル・アカデミー・オブ・サイエンス・ユー・エス・エ
イ(Ｂrosius et al．,Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．
Ｕ．Ｓ．Ａ．)８１,６９２９〜６９３３(１９８４)はイ
ー・コリlacプロモーターの調節エレメントを利用して
極端に強いイー・コリ・リボソーム・プロモーターを調
節している。ストレプトマイセスgalオペロン・リボソ
ーム・プロモーターも極端に強いようなので、そのよう
なプロモーターはストレプトマイセス、他のアクチノマ
イセス類および他の宿主生物において非常に有用な調節
可能な発現ベクターの組み立を可能にする。本発明はま
た、イー・コリにおいてgalＫ変異株の選択に用いられ
ていた２−デオキシガラクトース選択がストレプトマイ
セスにおけるgalＫ変異株の選択にも作動するという予
期せぬ発見を可能にした[ブラウナーら、ジーン[Ｂrawn
er et al．,Ｇene)４０,１９１(１９８５)参照]。こ
の観察は、以下に記載するごとく、ストレプトマイセス
galＫ遺伝子およびそのコスミッド上への転写、翻訳に
必要な調節領域のクローン能力と組み合わさって、相同
組換により、ストレプトマイセスの染色体に位置したga
lＫ遺伝子への構造遺伝子の直接挿入を可能にする。こ
の操作は分子生物学者が興味のあるＤＮＡフラグメント
をストレプトマイセスの染色体に安定して挿入すること
を可能にする。このアプローチは研究者が、現在、大部
分のストレプトマイセス発現ベクターにより要求されて
いるような抗生物質選択を続ける必要なしに、興味ある
ストレプトマイセス株にタッグ付けもしくはマーク付け
をしたり、該生物に発現カセットを挿入することを可能
にする。 【００２５】本発明はストレプトマイセスgalオペロン
またはそのいずれかの調節可能な官能性誘導体からなる
組換型ＤＮＡ分子に関する。 【００２６】「調節可能な官能性誘導体」なる語はgal
Ｔ、galＥおよびgalＫ遺伝子生成物の調節可能な生成に
ついて天然のストレプトマイセスgalオペロンと実質的
に同じに機能するストレプトマイセスgalオペロンのい
ずれかの誘導体を意味する。このような誘導体にはgal
オペロンの部分的配列およびgalオペロン・コード付け
配列の修飾によって生成された誘導体が包含される。公
知のgalオペロン修飾技術には、例えば、化学的変異誘
発剤での処理、照射または、酵素または組換技術を用い
る挿入、欠失または核酸置換のような直接遺伝子操作が
包含される。天然に生じるストレプトマイセスgalオペ
ロンは本明細書に記載する技術を用いていずれかのガラ
クトース利用ストレプトマイセス株から単離できる。種
々のストレプトマイセス種の多くの株が多くの源から公
に入手可能である。例えば、米国、メリーランド州、ロ
ックビルのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクシ
ョン(ＡＴＣＣ)は公衆が入手可能な約４００種のストレ
プトマイセスを有している。ストレプトマイセスの個々
の株のグルコースを利用する能力は、その株を、ガラク
トースを唯一の炭素源として含有する培地上で増殖させ
るような通常の技術によって容易に測定できる。galオ
ペロンを単離するのに好ましいストレプトマイセス種に
は、ストレプトマイセス・リビダンス、ストレプトマイ
セス・コエリカラー、ストレプトマイセス・アズラエウ
ス(Ｓ．azuraeus)、ストレプトマイセス・アルブス
(Ｓ．albus)、ストレプトマイセス・カルチノスタティ
クス(Ｓ．carzinostaticus)、ストレプトマイセス・ア
ンチフィブリノリチクス(Ｓ．antifibrinolyticus)およ
びストレプトマイセス・ロンギスポルス(Ｓ．longispor
us)が包含される。ストレプトマイセス・リビダンスが
最も好ましい。ストレプトマイセスgalオペロンおよび
そのより小さい部分は他の細胞および生物から相同な配
列を得るための核酸プローブとして有用である。ストレ
プトマイセスgalオペロンはまた、適当な宿主変異株に
おける選択マーカーとして、また、調節エレメントの提
供に有用である。「適当な宿主変異株」なる語は、(a)gal
オペロンを含まないか、(b)非官能性galオペロンを含有
するか、(c)欠損Ｐ１プロモーター、Ｐ２プロモータ
ー、galＴ遺伝子、galＫ遺伝子および／またはgalＥ遺
伝子のような、ストレプトマイセスgalからなる相同構
造遺伝子または調節領域内に欠損を含むためにガラクト
ースを利用しない宿主を意味する。かくして、通常の技
術で調製できる組換型ＤＮＡ分子(ストレプトマイセスg
alオペロンおよびそれに作動的に結合した異種官能性Ｄ
ＮＡ配列からなる)は、相同組換によって宿主ゲノムに
取り込むための通常の技術によって適当な宿主へ形質転
換でき、高価な抗生物質選択を続ける必要なしに該異種
官能性ＤＮＡ配列の調節可能な発現を可能にする。した
がって、そのようなオペロンはまた、高価な抗生物質選
択を続ける必要なく、当該ベクターで形質転換した適当
な宿主変異株において該オペロンに作動的に結合する異
種官能性ＤＮＡ配列の調節可能な発現用の組換型ＤＮＡ
発現ベクター上に取り込まれうる。そのようなオペロン
はまた、ガラクトースを利用しないストレプトマイセ
ス、他のアクチノマイセスおよびgal-イー・コリ株のよ
うな他の原核生物のような細胞、ウイルスおよび微生物
をガラクトース利用性株に形質転換するのに有用であ
る。この形質転換は形質転換宿主に対して多面的効果を
有しうる。「官能性ＤＮＡ配列」なる語はそれによって形
質転換された宿主生物において遺伝子発現単位、構造遺
伝子、プロモーターまたは調節領域として機能するスト
レプトマイセスまたは他のいずれかの源から直接または
間接に誘導されるＤＮＡのいずれかの分離領域を意味す
る。好ましい官能性ＤＮＡ配列には、限定するものでは
ないが、インシュリン、生長ホルモン、組織プラスミノ
ーゲン・アクチベータ、α−１−抗トリプシンまたはワ
クチン製造に用いる抗原のような医薬上重要なポリペプ
チドをコード付けするものが包含される。「異種官能性
ＤＮＡ配列」なる語はストレプトマイセスgalオペロン・
コード付け領域から誘導されない官能性ＤＮＡ配列を意
味する。 【００２７】本発明はまた、ストレプトマイセスgalオ
ペロンＰ２プロモーター発現単位またはそのいずれかの
官能性誘導体からなる組換型ＤＮＡ分子に関する。「Ｐ
２プロモーター発現単位」なる語はストレプトマイセスg
alオペロンＰ２プロモーター、galＥおよびgalＫ構造遺
伝子およびそのような構造遺伝子の転写および翻訳に必
要な他のいずれかの調節領域からなるストレプトマイセ
スgalオペロンの領域を意味する。「官能性誘導体」なる
語は、ストレプトマイセスgalオペロンgalＥおよびgal
Ｋ遺伝子生成物の生成について天然に生じる領域と実質
的に同じに機能するストレプトマイセスgalオペロンＰ
２プロモーター発現単位のいずれかの誘導体を意味す
る。このような誘導体にはストレプトマイセスgalオペ
ロンＰ２プロモーター発現単位の部分配列およびストレ
プトマイセスgalオペロンＰ２プロモーター発現単位・
コード付け配列の修飾によって得られる誘導体が包含さ
れる。そのような修飾を行なう技術は公知であり、いく
つかは前記した。天然に生じるストレプトマイセスgal
オペロンＰ２プロモーター発現単位は通常の技術により
天然のストレプトマイセスgalオペロンから単離でき
る。ストレプトマイセスgalオペロンＰ２発現単位は適
当な宿主変異株における選択マーカーとして、また、調
節エレメントの提供に有用である。「適当な宿主変異株」
なる語は、欠損Ｐ２プロモーター、galＥ遺伝子および
／またはgalＫ遺伝子のようなストレプトマイセスＰ２
プロモーター発現単位からなる相同構造遺伝子または調
節領域内に欠失を含むためガラクトースを利用できない
宿主を意味する。かくして、通常の技術で調整できる組
換型ＤＮＡ分子(ストレプトマイセスgalオペロンＰ２プ
ロモーター発現単位およびそれに作動的に結合した異質
官能性ＤＮＡ配列からなる)は相同組換による宿主ゲノ
ムへの取り込み用の通常の技術により適当な宿主変異株
へ形質転換でき、高価な抗生物質選択を続けることな
く、該異種官能性ＤＮＡ配列の構成的発現を可能にす
る。そのような発現単位は異種官能性ＤＮＡ配列の構成
的発現用の組換型ＤＮＡ発現ベクター上に取り込まれう
る。ストレプトマイセスgalオペロンＰ２プロモーター
発現単位はまた、適当な宿主変異株の相補に有用であ
り、ついで、高価な抗生物質選択を続ける必要のない、
当該ベクターで形質転換された適当な宿主変異株におい
てそのような発現単位に作動的に結合した異種官能性Ｄ
ＮＡ配列の構成的発現に使用される。 【００２８】本発明はストレプトマイセスgalオペロン
Ｐ１プロモーター調節領域またはそのいずれかの調節可
能な官能性誘導体からなる組換型ＤＮＡ分子にも関す
る。「Ｐ１プロモーター調節領域」なる語はストレプトマ
イセスgalオペロンＰ１プロモーター、galＴ、galＥお
よびgalＫ構造遺伝子ならびにそのような構造遺伝子の
転写および翻訳に必要な他のいずれかの調節領域からな
るストレプトマイセスgalオペロンの領域を意味する。
「調節可能な官能的誘導体」なる語は、ストレプトマイセ
スgalオペロンgalＴ、galＥ、およびgalＫ遺伝子生成物
の調節可能な生成に関し、天然に生じる領域と実質的に
同じに機能するストレプトマイセスgalオペロンＰ１プ
ロモーター調節領域のいずれかの誘導体を意味する。こ
のような誘導体にはストレプトマイセスgalオペロンＰ
１プロモーター調節領域の部分配列およびストレプトマ
イセスgalオペロンＰ１プロモーター調節領域コード付
け配列の修飾により生成される誘導体が包含される。そ
のような修飾を行なう技術は公知であり、いくつかは前
記した、天然に生じるストレプトマイセスgalオペロン
Ｐ１プロモーター調節領域は、天然に生じるストレプト
マイセスgalオペロンからのＰ２プロモーターの切除、
点突然変異によるＰ２プロモーターの不活化またはプロ
モーター内への異種ＤＮＡ配列の挿入のような通常の技
術により、天然に生じるストレプトマイセスgalオペロ
ンから単離できる。ストレプトマイセスgalオペロンＰ
１プロモーター調節領域はストレプトマイセスgalオペ
ロンについて前記した用途に有用である。 【００２９】また、本発明はストレプトマイセスgalオ
ペロンＰ２プロモーターまたはそのいずれかの官能性誘
導体からなる組換型ＤＮＡ分子に関する。「官能性誘導
体」なる語は、ＲＮＡポリメラーゼの結合および当該プ
ロモーターに作動的に結合した官能性ＤＮＡ配列の転写
を可能にするについて天然に生じるＰ２プロモーターと
実質的に同じに機能するストレプトマイセスgalオペロ
ンＰ２プロモーターのいずれかの誘導体を意味する。こ
のような誘導体にはストレプトマイセスgalオペロンＰ
２プロモーターの部分配列およびgalオペロンＰ２プロ
モーター・コード付け配列の修飾によって生じた誘導体
が包含される。そのような修飾を行なう技術は公知であ
り、いくつかは前記した。天然に生じるストレプトマイ
セスgalオペロンＰ２プロモーターは通常の技術によ
り、天然に生じたストレプトマイセスgalオペロンから
単離できる。通常の技術で調製できる組換型ＤＮＡ分子
(ストレプトマイセスgalオペロンＰ２プロモーターおよ
びそれに作動的に結合した異種官能性ＤＮＡ配列からな
る)は相同組換によって宿主ゲノムへ取り込むための通
常の技術によって適当な宿主へ形質転換でき、異種官能
性ＤＮＡ配列の構成的発現を可能にする。ストレプトマ
イセスgalオペロンＰ２プロモーターはまた、当該ベク
ターで形質転換したウイルスおよび有核または原核細胞
または生物、特にストレプトマイセスまたは他のアクチ
ノマイセス類において作動的に結合した異種官能性ＤＮ
Ａ配列の構成的発現用の組換型ＤＮＡ発現ベクターへの
取り込みに有用である。 【００３０】本発明はまた、ストレプトマイセスgalオ
ペロンＰ１プロモーターまたはそのいずれかの調節可能
な官能性誘導体からなる組換型ＤＮＡ分子からなる。
「調節可能な官能性誘導体」なる語は、ＲＮＡポリメラー
ゼの結合を可能にし、そのようなプロモーターに作動的
に結合した官能性ＤＮＡ配列の転写を調節するについて
天然に生じるＰ１プロモーターと実質的に同じに機能す
るストレプトマイセスgalオペロンＰ１プロモーターの
いずれかの誘導体を意味する。このような誘導体にはス
トレプトマイセスgalオペロンＰ１プロモーターの部分
配列と、galオペロンＰ１プロモーター・コード付け配
列の修飾により生成する誘導体が包含される。このよう
な修飾を行なう技術は公知であり、いくつかは前記し
た。天然に生じるストレプトマイセスgalオペロンＰ１
プロモーターは通常の技術により天然に生じるストレプ
トマイセスgalオペロンから単離できる。通常の技術の
調製できる組換型ＤＮＡ分子(ストレプトマイセスgalオ
ペロンＰ１プロモーターおよびそれに作動的に結合した
異種官能性ＤＮＡ配列からなる)は、相同組換による宿
主ゲノムに取り込む通常の技術によって適当な宿主変異
株へ形質転換でき、異種官能性ＤＮＡ配列の調節可能な
発現を可能にする。また、ストレプトマイセスgalオペ
ロンＰ１プロモーターは、当該ベクターで形質転換され
たウイルスおよび有核および原核細胞または生物、特
に、ストレプトマイセスまたは他のアクチノマイセス類
において作動的に結合した異種官能性ＤＮＡ配列の調節
可能な発現用組換型ＤＮＡ発現ベクターへの取り込みに
も有用である。 【００３１】また、本発明はストレプトマイセスgalオ
ペロンgalＥ、galＴまたはgalＥ遺伝子またはそのいず
れかの官能性誘導体からなる組換型ＤＮＡ分子にも関す
る。「官能性誘導体」なる語は活性galＥ、galＴまたはga
lＫ型還元子生成物の生成について天然に生じる遺伝子
と実質的に同じに機能するストレプトマイセスgalオペ
ロンgalＥ、galＴまたはgalＫ遺伝子のいずれかの誘導
体を意味する。このような誘導体にはストレプトマイセ
スgalオペロンgalＥ、galＴまたはgalＫ遺伝子の部分配
列およびgalオペロン配列の修飾によって得られる誘導
体が包含される。このような修飾を行なう技術は公知で
あり、いくつかは前記した。天然に生じるストレプトマ
イセスgalオペロンgalＥ、galＴおよび／またはgalＫ遺
伝子は通常の技術により天然に生じるストレプトマイセ
スgalオペロンから単離できる。ストレプトマイセスgal
オペロンgalＥ、galＴおよび／またはgalＫ遺伝子は適
当な宿主変異株における選択マーカーとして使用でき
る。「適当な宿主変異株」なる語は相同galＥ、galＴおよ
び／またはgalＫ遺伝子内に欠失を含むため、ガラクト
ースを利用できない宿主を意味する。かくして、通常の
技術で調製できる組換型ＤＮＡ分子(共に適当な調節領
域に作動的に結合したストレプトマイセスgalオペロンg
alＥ、galＴおよび／またはgalＫ遺伝子および異種官能
性ＤＮＡ配列からなる)は相同組換によって宿主ゲノム
へ取り込むための通常の技術によって適当な宿主変異株
へ形質転換でき、高価な抗生物質選択を続ける必要なし
に形質転換体の検出を可能にする。同様に、共に適当な
調節領域に作動的に結合したストレプトマイセスgalオ
ペロンgalＥ、galＴおよび／またはgalＫおよび異種官
能性ＤＮＡ配列ならびにレプリコンからなる組換型ＤＮ
Ａベクターは通常の技術で適当な宿主変異株に形質転換
でき、高価な抗生物質選択を続ける必要なしに形質転換
体の検出を可能にする。ストレプトマイセスgalオペロ
ンgalＥ、galＫおよび／またはgalＴ遺伝子はまた適当
な宿主変異株の相補に有用である。 【００３２】また、ストレプトマイセスgalオペロンgal
Ｅ遺伝子は異種ＤＮＡ配列に融合できるリボソーム結合
部位と開始コドンを提供するのに有用であり、適当な発
現ベクターに取り込まれ、適当な宿主に形質転換された
場合に、そのようなコード付け配列を可能にする。その
ような異種官能性ＤＮＡ配列が、ストレプトマイセスga
lオペロンＰ２プロモーター発現単位からなる組換型Ｄ
ＮＡ発現ベクターまたは全galオペロン中のgalＥ遺伝子
リボソーム結合部位および開始コドンと融合すると、そ
のようなＤＮＡ配列は、ベクターが適当な宿主生物に形
質転換される場合、構成的に発現される。そのようなＤ
ＮＡ配列が、ストレプトマイセスgalオペロンＰ２プロ
モーター調節領域からなる組換型ＤＮＡ発現ベクター中
のgalＥ遺伝子リボソーム結合部位および開始コドンに
融合すると、そのようなベクターが適当な宿主生物に形
質転換される場合、ガラクトースまたはグルコースの存
在、非存在を制御することにより、そのようなＤＮＡ配
列の発現を調節できる。 【００３３】ストレプトマイセスgalオペロンgalＴ遺伝
子はまた、異種官能性ＤＮＡ配列に融合できるリボソー
ム結合部位および開始コドンを提供するのに有用で、適
当な発現ベクターに取り込まれ、適当な宿主に形質転換
されると、そのようなコード付け配列の発現を可能にす
る。そのようなＤＮＡ配列が、ストレプトマイセスgal
オペロンＰ１プロモーター調節領域からなる組換型ＤＮ
Ａ発現ベクターまたは全galオペロン中でgalＴ遺伝子リ
ボソーム結合部位および開始コドンに融合すると、前記
のように、そのようなベクターで形質転換された宿主に
おけるそのようなコード付け配列の発現を調節できる。 【００３４】また、本発明は、レプリコン、ストレプト
マイセスgalオペロンまたその官能性の、調節可能な誘
導体およびそのようなオペロンに作動的に結合した異種
官能性ＤＮＡ配列からなる組換型ＤＮＡベクターに関す
る。そのようなベクターは通常の技術で調製できる。用
いるレプリコンは当該ベクターにより形質転換されるベ
クターとなるべき宿主生物中にベクターを安定に、染色
体外的に維持する能力を有することが公知のものとすべ
きである。 【００３５】本発明はまた、組換型ＤＮＡベクターから
なる形質転換宿主微生物に関し、該ベクターはレプリコ
ン、ストレプトマイセスgalオペロンまたはその官能
性、調節可能な誘導体および該オペロンに作動的に結合
した異種官能性ＤＮＡ配列を含有する。また、本発明は
適当な宿主微生物をそのようなベクターで形質転換する
ことからなるそのような宿主の調製法に関する。本発明
はこの方法に用いることのできる適当な宿主にはウイル
スおよび有核および原核細胞または生物、特に、ストレ
プトマイセス属のようなアクチノマイセス類が包含され
る。最も好ましい宿主微生物はストレプトマイセス属に
属する。ストレプトマイセスの好ましい種には、ストレ
プトマイセス・リビダンス、ストレプトマイセス・コエ
リカラー、ストレプトマイセス・アズラエウスおよびス
トレプトマイセス・アルブスが包含される。そのような
宿主微生物のそのようなベクターによる形質転換はチャ
ーターら、カレント・トピックス・イン・マイクロバイ
オロジー・アンド・イムノロジー(Ｃhater et al．,
Ｃurr．Ｔop．Ｍicro．Ｉmm．)９６,６９〜９５(１９８
２)の方法のような通常の技術を用いて行なうことがで
きる。本発明はまた、官能性ＤＮＡ配列が発現される適
当な条件下、本発明の形質転換宿主を培養することから
なる本発明の形質転換宿主に含有される官能性ＤＮＡ配
列の発現方法に関する。「適当な条件」なる語は宿主の増
殖を可能にし、官能性ＤＮＡ配列の発現を可能にする条
件を意味する。この適当な条件は当業者が通常の技術を
用いて決定でき、用いる宿主生物および発現させるべき
官能性ＤＮＡ配列のような種々の因子に依存する。本発
明はまた、発現を調節するに適当な条件下、官能性ＤＮ
Ａ配列を含有する形質転換宿主を培養することからなる
該形質転換宿主に含有される官能性ＤＮＡ配列の発現を
調節する方法に関する。「適当な条件」なる語は、ストレ
プトマイセスgalオペロン(および異種官能性ＤＮＡ配
列)を調節することの可能な条件を意味する。「調節可
能」なる語は形質転換宿主細胞の増殖培地におけるガラ
クトースまたはその代謝産物の存在およびグルコースま
たはその代謝産物の存在に対する応答性であることを意
味する。このような調節は形質転換宿主の培地へのガラ
クトースまたはグルコースの添加または削除により行な
うことができる。本発明の形質転換宿主による異種官能
性ＤＮＡコード付け配列の発現の上昇または下降調節に
ついてのガラクトースおよび／またはグルコースの至適
レベルは通常の技術を用い、当業者が容易に決定でき
る。 【００３６】また、本発明はレプリコン、ストレプトマ
イセスgalオペロンＰ２プロモーター発現単位またはそ
の官能性誘導体およびそのような単位に作動的に結合し
た異種官能性ＤＮＡ配列からなる組換ＤＮＡベクターに
関する。そのようなベクターは通常の技術で調製でき
る。用いるレプリコンは該ベクターで形質転換すべき宿
主生物において、安定に、染色体外的にベクターを維持
する能力の知られているものとすべきである。 【００３７】また、本発明は、レプリコン、ストレプト
マイセスgalオペロンＰ２プロモーター発現単位または
その官能性誘導体および該単位に作動的に結合した異種
官能性ＤＮＡ配列を含有する組換型ＤＮＡベクターから
なる形質転換宿主微生物ならびに、そのようなベクター
で適当な宿主微生物を形質転換することからなるそのよ
うな宿主の調製法に関する。「作動的に結合した」なる語
は官能性ＤＮＡ配列が、その発現が発現制御配列の制御
下にあるように発現制御配列(すなわち、ストレプトマ
イセスgalオペロン、Ｐ２プロモーター発現単位、Ｐ１
プロモーター調節領域、Ｐ１プロモーターまたはＰ２プ
ロモーター)に転写的にまたは翻訳的に結合することを
意味する。すなわち、例えば、異種官能性ＤＮＡ配列
は、当該オペロンをストレプトマイセスgalオペロンＰ
１またはＰ２プロモーター転写体に挿入することによ
り、転写的にまたは翻訳的にストレプトマイセスgalオ
ペロンに結合できる。「レプリコン」なる語は、それによ
って形質転換された宿主微生物または細胞にプラスミド
を染色体外的に維持する機能を有するプラスミド上のＤ
ＮＡの領域を意味する。また、ストレプトマイセスgal
オペロンおよびそのより小さい部分が他の細胞および生
物から相同配列を得る核酸プローブとして有用なことが
判明した。本発明の方法で用いることのできる適当な宿
主微生物には、いずれものウイルスまたは有核もしくは
原核細胞もしくは微生物、特に、ストレプトマイセス属
のもののような、いずれかのアクチノマイセス属が包含
される。最も好ましい宿主微生物はストレプトマイセス
属のものである。ストレプトマイセス属の好ましい種に
はストレプトマイセス・リビダンス、ストレプトマイセ
ス・コエリカラー、ストレプトマイセス・アゼラエウス
およびストレプトマイセス・アルブスが包含される。ベ
クターによるこのような宿主微生物の形質転換は前記チ
ャーターらの方法のような通常の技術を用いて行なうこ
とができる。本発明はまた、官能性ＤＮＡ配列が発現さ
れるような適当な条件下、形質転換宿主を培養すること
からなる本発明の形質転換宿主により含有される異種官
能性ＤＮＡ配列の発現方法に関する。「適当な条件」なる
語は宿主の増殖を可能にし、官能性ＤＮＡ配列の発現を
可能にする条件を意味する。この適当な条件は当業者が
通常の技術を用いて決定でき、用いる宿主生物および発
現させるべき官能性ＤＮＡ配列のような種々の因子に依
存する。 【００３８】また、本発明はレプリコン、ストレプトマ
イセスgalオペロンＰ１プロモーター調節領域またはそ
の官能性、調節可能な誘導体およびそのような領域に作
動的に結合した異種官能性ＤＮＡ配列からなる組換ＤＮ
Ａベクターに関する。そのようなベクターは通常の技術
で調製できる。用いるレプリコンは該ベクターで形質転
換すべき宿主生物において、安定に、染色体外的にベク
ターを維持する能力の知られているものとすべきであ
る。 【００３９】また、本発明は、レプリコン、ストレプト
マイセスgalオペロンＰ１プロモーター調節領域または
その官能性、調節可能な誘導体および該領域に作動的に
結合した異種官能性ＤＮＡ配列を含有する組換型ＤＮＡ
ベクターからなる形質転換宿主微生物ならびに、そのよ
うなベクターで適当な宿主微生物を形質転換することか
らなるそのような宿主の調製法に関する。用いることの
できる適当な宿主微生物には、いずれものウイルスまた
は有核もしくは原核細胞もしくは微生物、特に、ストレ
プトマイセス属のもののような、いずれかのアクチノマ
イセス属が包含される。最も好ましい宿主微生物はスト
レプトマイセス属のものである。ストレプトマイセス属
の好ましい種にはストレプトマイセス・リビダンス、ス
トレプトマイセス・コエリカラー、ストレプトマイセス
・アゼラエウスおよびストレプトマイセス・アルブスが
包含される。ベクターによるこのような宿主微生物の形
質転換は前記チャーターらの方法のような通常の技術を
用いて行なうことができる。本発明はまた、官能性ＤＮ
Ａ配列が発現されるような適当な条件下、形質転換宿主
を培養することからなる本発明の形質転換宿主により含
有される異種官能性ＤＮＡ配列の発現方法に関する。
「適当な条件」なる語は宿主の増殖を可能にし、官能性Ｄ
ＮＡ配列の発現を可能にする条件を意味する。この適当
な条件は当業者が通常の技術を用いて決定でき、用いる
宿主生物および発現させるべき官能性ＤＮＡ配列のよう
な種々の因子に依存する。本発明はまた、発現を調節す
るに適当な条件下、官能性ＤＮＡ配列を含有する形質転
換宿主を培養することからなる該形質転換宿主に含有さ
れる官能性ＤＮＡ配列の発現を調節する方法に関する。
「適当な条件」なる語はストレプトマイセスgalオペロン
Ｐ１プロモーター調節領域(および異種官能性ＤＮＡ配
列)を調節可能にする条件でを意味する。「調節可能」な
る語は形質転換宿主細胞の増殖培地中のガラクトースま
たはその代謝産物の存在または非存在およびグルコース
またはその代謝産物の存在または非存在に応答性である
ことを意味する。そのような調節は形質転換宿主の培地
へのガラクトースまたはグルコースの添加または削除に
より行なうことができる。 【００４０】また、本発明はレプリコン、ストレプトマ
イセスgalオペロンＰ２プロモーターまたはその官能性
誘導体およびそのようなプロモーターに作動的に結合し
た異種官能性ＤＮＡ配列からなる組換ＤＮＡベクターに
関する。そのようなベクターは通常の技術で調製でき
る。用いるレプリコンは該ベクターで形質転換すべき宿
主生物において、安定に、染色体外的にベクターを維持
する能力の知られているものとすべきである。 【００４１】また、本発明は、レプリコン、ストレプト
マイセスgalオペロンＰ２プロモーターまたはその官能
性誘導体および該領域に作動的に結合した異種官能性Ｄ
ＮＡ配列を含有する組換型ＤＮＡベクターからなる形質
転換宿主微生物ならびに、そのようなベクターで適当な
宿主微生物を形質転換することからなるそのような宿主
の調製法に関する。用いることのできる適当な宿主微生
物には、ストレプトマイセス属のもののような、いずれ
かのアクチノマイセス属が包含される。最も好ましい宿
主微生物はストレプトマイセス属のものである。ストレ
プトマイセス属の好ましい種にはストレプトマイセス・
リビダンス、ストレプトマイセス・コエリカラー、スト
レプトマイセス・アゼラエウスおよびストレプトマイセ
ス・アルブスが包含される。ベクターによるこのような
宿主微生物の形質転換は前記チャーターらの方法のよう
な通常の技術を用いて行なうことができる。本発明はま
た、官能性ＤＮＡ配列が発現されるような適当な条件
下、形質転換宿主を培養することからなる該形質転換宿
主に含有される異種官能性ＤＮＡ配列の発現方法に関す
る。「適当な条件」なる語は宿主の増殖を可能にし、官能
性ＤＮＡ配列の発現を可能にする条件を意味する。この
適当な条件は当業者が通常の技術を用いて決定でき、用
いる宿主生物および発現させるべき官能性ＤＮＡ配列の
ような種々の因子に依存する。 【００４２】また、本発明はレプリコン、ストレプトマ
イセスgalオペロンＰ１プロモーターまたはそのいずれ
かの官能性、調節可能な誘導体およびそのような領域に
作動的に結合した異種官能性ＤＮＡ配列からなる組換Ｄ
ＮＡベクターに関する。そのようなベクターは通常の技
術で調製できる。用いるレプリコンは該ベクターで形質
転換すべき宿主生物において、安定に、染色体外的にベ
クターを維持する能力の知られているものとすべきであ
る。 【００４３】また、本発明は、レプリコン、ストレプト
マイセスgalオペロンＰ１プロモーターまたはそのいず
れかの官能性、調節可能な誘導体および該領域に作動的
に結合した異種官能性ＤＮＡ配列を含有する組換型ＤＮ
Ａベクターからなる形質転換宿主微生物ならびに、その
ようなベクターで適当な宿主微生物を形質転換すること
からなるそのような宿主の調製法に関する。用いること
のできる適当な宿主微生物には、ウイルスまたは有核も
しくは原核細胞もしくは微生物、特に、ストレプトマイ
セス属のもののような、いずれかのアクチノマイセス属
が包含される。最も好ましい宿主微生物はストレプトマ
イセス属のものである。ストレプトマイセス属の好まし
い種にはストレプトマイセス・リビダンス、ストレプト
マイセス・コエリカラー、ストレプトマイセス・アゼラ
エウスおよびストレプトマイセス・アルブスが包含され
る。ベクターによるこのような宿主微生物の形質転換は
前記チャーターらの方法のような通常の技術を用いて行
なうことができる。本発明はまた、官能性ＤＮＡ配列が
発現されるような適当な条件下、形質転換宿主を培養す
ることからなる本発明の形質転換宿主により含有される
異種官能性ＤＮＡ配列の発現方法に関する。「適当な条
件」なる語は宿主の増殖を可能にし、官能性ＤＮＡ配列
の発現を可能にする条件を意味する。そのような適当な
条件は当業者が通常の技術を用いて決定でき、用いる宿
主生物および発現させるべき異種官能性ＤＮＡ配列のよ
うな種々の因子に依存する。本発明はまた、発現が調節
可能な適当な条件下、異種官能性ＤＮＡ配列を含む形質
転換宿主を培養することからなる該形質転換宿主に含ま
れる官能性ＤＮＡ配列の発現を調節する方法に関する。
「適当な条件」なる語は該galオペロンＰ１プロモーター
(および官能性ＤＮＡ配列)を調節可能にする条件を意味
する。「調節可能」なる語は、形質転換宿主細胞の増殖培
地中のガラクトースまたはその代謝物の存在または非存
在およびグルコースまたはその代謝物の存在に応答性で
あることを意味する。そのような調節は形質転換宿主の
培地へのガラクトースまたはグルコースの添加または削
除によって行なうことができる。 【００４４】 【実施例】つぎに実施例を挙げて本発明をさらに詳しく
説明するが、これに限定されるものではない。以下の実
施例に示すような、通常の技術を用いることにより、当
業者はストレプトマイセスのいずれかのガラクトース利
用性株からgalオペロンを単離できる。さらに、本明細
書においてストレプトマイセスgalオペロンの単離に用
いたと同様な技術を利用することにより、当業者は該ス
トレプトマイセスgalオペロンをストレプトマイセスの
他のガラクトース利用性株、特に、ストレプトマイセス
・コエリカラー、ストレプトマイセス・アズラエウス、
ストレプトマイセス・アルブスおよび他のストレプトマ
イセス・リビダンス株からのgalオペロンの単離に用い
ることができる。 【００４５】以下の実施例で用いる分子遺伝子操作およ
び他の技術は、英国、ノールウィッチ、ジョン・インズ
・ファウンデーションのホップウッドら、ジェネティッ
ク・マニュピレーション・オブ・ストレプトマイセス:
ア・ラボラトリー・マニュアル(Ｈopwood et al．,Ｇ
enetic Ｍanipulation of Ｓtreptomyces:Ａ Ｌabo
rotory Ｍanual)に記載されている。 【００４６】略号 以下の実施例中、つぎの略号を使用する。 ＬＢ:１０gトリプトン、５g酵母エキス、５gＮaＣl ＭＢＳＭ(修飾ＭＢＳＭ):ブラウナーら、ジーン(Ｂrawn
er et al．,Ｇene)４０,１９１(１９８５)参照 ＭＯＰＳ:(３)−Ｎ−モルホリノ−(プロパン−スルホン
酸) ＹＥＭＥ＋ＭgＣl2＋グリシン:(l当り)３g酵母エキス、
５gペプトン、３g麦芽エキス、１０gグルコース、１０g
ＭgＣl2・６Ｈ2Ｏ、３４０gショ糖 Ｓ１:(ＮＨ4)2ＳＯ4(１g／l)、Ｌ−アスパラギン(２g／
l)、Ｋ2ＨＰＯ4(９g／l)、ＮaＨ2ＰＯ4(１g／l)を０．
２％寒天に対して一緒に混合し、オートクレーブする。
ついで、酵母エキス(２０g／l)、ＭgＣl2(５g／l)、Ｃu
Ｃl2(０．１g／l)。微量元素[２０ml／l−ＺnＣl2(４０
mg／l)、ＦeＣl3・６Ｈ2Ｏ(２００mg／l)、ＣuＣl2・２
Ｈ2Ｏ(１０mg／l)、ＮaＢ4Ｏ7・１０Ｈ2Ｏ(１０mg／
l)、(ＮＨ4)6Ｍo7Ｏ24・４Ｈ2Ｏ(１０mg／l)含有]と混
合、濾過、滅菌 ＹＥＭＥ(Ｙmベース):(l当り)酵母エキス(３g)、ペプト
ン(５g)、麦芽エキス(３g)、ＭgＣl2・６Ｈ2Ｏ(２g) Ｙm glu:ＹＥＭＥ＋グルコース(１０g) Ｙm gal:ＹＥＭＥ＋ガラクトース(１０g) 【００４７】細菌株 以下の実施例中、イー・コリのつぎの株を用いる。 ＣＧＳＣ株＃(a) 株名称 性 染色体マーカー ４４７３(galＥ-) Ｗ３１０９ Ｆ- galＥ９(b)g-;ＩＮ(rrnＤ−rrnＥ)１ ４４６７(galＴ-) Ｗ３１０１ Ｆ- galＴ２２(b)g-;ＩＮ(rrnＤ−rrnＥ)１ ４４９８(galＥ-) ＰＬ-２ Ｈfr thi-１,relＡl,９２１Ｅ２８,g-,spoＴ１ 【００４８】（ａ）ＣＧＳＣ株＃は、米国コネチカット
州、ニュー・ヘブン、ピー・オー・ボックス３３３３、
チェダー・ストリート３３３(３３３Ｃeder Ｓtreet,
Ｐ．Ｏ．Ｂox３３３３,Ｎew Ｈaven,Ｃonnecticut,０
６５１０,Ｕ．Ｓ．Ａ．)のエール・ユニバーシティ・ス
クール・オブ・メディシン、イー・コリ・ジェネティッ
ク・ストック・センター・オブ・ザ・デパートメント・
オブ・ヒューマン・ジェネティックス(Ｅ．coli Ｇene
tic Ｓtock Ｃenter of the Ｄepartmentof Ｈum
an Ｇenetics,Ｙale Ｕniversity Ｓchool of Ｍe
dicine)により該株に付された在庫番号である。 (b)galＥ９は旧レダーベルグ(Ｌederberg)gal９、galＴ
２２は旧レダーベルグgal１である。 【００４９】Ｓ１分析 ＲＮＡの５'端および興味あるＲＮＡの長さを同定する
ためにＳ１分析を用いる。以下の実施例において、Ｓ１
分析はウェーバーら、ヌークレイック・アシッズ・リサ
ーチ(Ｗeaver et al．,Ｎucl．Ａsids Ｒes．)７,１
１７５(１９７９)およびバークら、プロシーディングス
・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・
ユー・エス・エイ(Ｂerk et al．,Ｐroc．Ｎatl．Ａc
ad．Ｓci．ＵＳＡ)７５,１２１４(１９７８)の方法に従
って行なったＳ１実験を示す。 【００５０】実施例１ Ａ．ストレプトマイセス・リビダンス・ガラクトキナー
ゼ遺伝子 ストレプトマイセス・リビダンス株１３２６はビッブ
ら、モレキュラー・アンド・ジェネラル・ジェネティッ
クス(Ｂibb et al．,Ｍol．Ｇen．Ｇenetics)１８４,
２３０〜２４０(１９８１)によって記載されており、英
国、ノーウィッチ、ジョン・インズ・ファンデーション
のディ・エイ・ホップウッド(Ｄ．Ａ．Ｈopwood,Ｊohn
Ｉnnes Ｆoundation,Ｎorwich Ｅugland)より得た。
ストレプトマイセス・リビダンス株１３２６およびpＩ
Ｊ６プラスミドを含有するストレプトマイセス・リビダ
ンス株１３２６は、１９８２年６月１日に、米国イリノ
イ州、ペオリアのアグリカルチュラル・リサーチ・カル
チャー・コレクションに、各々、寄託番号ＮＲＲＬ１５
０９１および１５０９２で寄託した。 【００５１】高分子量染色体ＤＮＡはマニアチスら(Ｍa
niatis et al)、「モレキュラー・クローニング・ア・
ラボラトリー・マニュアル」、コールド・スプリング・
ハーバー・ラボラトリー(１９８２)の方法に従って、ス
トレプトマイセス・リビダンス株１３２６から単離し、
１０〜４０％ショ糖グラジエント上でサイズ分別した
(前記アニアチスら、２８４〜２８５頁)。１８〜２４Ｋ
b対のフラクションを合し、１０mＭトリス−ＨＣl／１m
ＭＥＤＴＡ(pＨ８)に対して充分に透析した。コスミッ
ド・シャトル・ベクターpＪＷ３５７を用いて分別した
染色体ＤＮＡを全体としてクローンした。pＪＷ３５７
はＰstＩで切断したpＤＰＴ６をＰst１で切断したpＩＪ
３５０に融合して作製した。pＩＪ３５０はキーゼル
ら、モレキュラー・アンド・ジェネラル・ジェネティッ
クス(Ｋieser et al．,Ｍol．Ｇen．Ｇenet．)１８
５,２２３〜２３８(１９８２)に記載されている。pＤＰ
Ｔ６はテイラーら(Ｔaylor et al．)の米国特許第４
４７６２２７号に記載されているテトラサイクリンおよ
びクロラムフェニコール耐性、pＢＲ３２２ベース・イ
ーコリ・コスミッド・クローニング・ベクターである。
pＪＷ３５７は該クロラムフェニコール耐性遺伝子中に
独特なＥcoＲＩ部位およびテトラサイクリン耐性遺伝子
に独特なＢamＨＩ部位を有する。pＪＷ３５７をＢamＨ
Ｉで消化し、アルカリ性ホスファターゼで脱ホスホリレ
ート化し、前記の分別した染色体ＤＮＡに連結した。 【００５２】連結生成物をバクテリオファージ頭部につ
つみ込み(前記マニアチスら、２６４〜２６５頁に記載
されたin vitroパッケージング系を用い)、イー・コリ
ＭＭ２９４のgalＫ-誘導体であるイー・コリ株Ｋ２１に
トランスフェクションした。この形質転換培養をＬＢ中
で２時間、２５μg／mlクロラムフェニコール添加ＬＢ
中でさらに２時間増殖させ、等容量の炭素源のないＭ９
培地[ミラー、「エクスペリメンツ・イン・モレキュラー
・ジェネティックス」、コールド・スプリング・ハーバ
ー・ラボラトリー(１９７２)参照]で３回洗浄し、クロ
ラムフェニコール３０mg／mlを添加したＭ９寒天[プロ
リン、ヒスチジン、アルギニン、イソロイシン、ロイシ
ン、食塩水および０．５％ガラクトース補足、アグムス
ら、バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサ
ーチ・コミュニケーション(Ａdams et al．,Ｂioche
m．Ｂiophys．Ｒes．Ｃomm．)８９(２),６５０〜６５８
(１９７９)]上で平板培養した。平板当り約２００形質
転換体を平板２０枚に塗抹した。３７℃で３日間インキ
ュベーション後、形質転換体は検出されなかった。この
最少平板にニコチン酸を５μg／mlでスプレーし、イー
・コリ株Ｋ２１のニコチン酸要求を補足し、さらに３７
℃で３日間、ついで室温で２日間インキュベーションを
続けた。インキュベーション後、生存コロニーをクロラ
ムフェニコール３０μg／mlを添加したマッコンキー・
ガラクトース寒天(ＭＡＣ−ＧＡＬ)(前記ミラーら参照)
および０．５％ガラクトース、５μg／mlニコチン酸、
５μg／mlチアミンおよび３０μg／mlクロラムフェニコ
ールで補足したＭ６３最少寒天(前記ミラーら参照)の両
方にパッチした。２つのコロニーのみが、イー・コリＫ
２１をgalＫ+表現型に形質転換するコスミッドＤＮＡを
含有していた。これらのコスミッドをpＳＬＩＶＧＡＬ
−１およびpＳＬＩＶＧＡＬ−２と命名した。両コロニ
ー共、ＭＡＣ−ＧＡＬ上で薄赤色で(すなわち、これら
はgalＫ+)、Ｍ６３培地上で増殖した。 【００５３】プラスミドpＳＬＩＶＧＡＬ−１およびpＳ
ＬＩＶＧＡＬ−２を前記２つのgalＫ+コロニーから単離
し、前記チャーターらの方法に従って、ストレプトマイ
セス・リビダンス株１３２６−１２Ｋ[ストレプトマイ
セス・リビダンス株１３２６のＵＶ変異誘発後、galＫ
欠損株を単離、ブラウナーら、ジーン(Ｂrawner eta
l．,Ｇene)４０,１９１(１９８５)参照]に形質転換し
た。該ストレプトマイセス・リビダンス１３２６−１２
Ｋ(galＫ-)宿主のプラスミド・コード付け相補を前記ブ
ラウナーらの方法に従って、ＭＢＳＭ−gal−チオスト
レプトン平板上で胞子の増殖を観察してテストした。p
ＳＬＩＶＧＡＬ−２はストレプトマイセス１３２６−１
２Ｋ宿主の検知しうる相補を示さなかった。 【００５４】細胞抽出物を、１％グルコースまたはガラ
クトースおよび１０μg／mlチオストレプトンで補足し
たＳＬ培地中で増殖させた培養から調製した。イムノブ
ロット(immunoblot)分析(前記ブラウナーら参照)によ
り、イー・コリ・ガラクトキナーゼに対するウサギ抗血
清を用いて抽出物のガラクトキナーゼ産生を分析した。
イムノブロット分析で検出された蛋白質はほぼイー・コ
リgalＫのサイズであった。この蛋白質はストレプトマ
イセスのガラクトース補足培養において、グルコース培
養におけるよりも数倍高いレベルで出現した。 【００５５】Ｂ．コスミッド内のストレプトマイセス・
リビダンスgalＫ領域の地図 前記のように調製したpＳＬＩＶＧＡＬ１およびpＳＬＩ
ＶＧＡＬ２のgalＫ領域を、コスミッドからのランダム
・フラグメントのpＵＣ１８誘導体へのクローニング[ノ
ーランダーら、ジーン(Ｎorrander et al．,Ｇene)２
６,１０１〜１０６(１９８３)]およびＭＡＣ−ＧＡＬ培
地上でのイー・コリ株ＭＭ２９４(galＫ-)の相補スコア
により同定した。コスミッド・クローンを部分的にＳau
３ＡＩで消化して(２〜４Ｋbフラグメントの収率が最大
となる条件下)、この反応生成物を、つぎの合成ＤＮＡ
配列： 【００５６】 ５' ＧＡＴＣＡＧＡＴＣＴＴＧＡＴＣＡＣＴＡＧＣＴＡＧＣＴＡＧ３' ３' ＴＣＴＡＧＡＡＣＴＡＧＴＧＡＴＣＧＡＴＣＧＡＴＣＣＴＡＧ５' をpＵＣ１８のＢamＨＩ部位に挿入して作製したpＵＣ１
８の誘導体であるpＵＣ１８−ＴＴ６のＢglＩＩ部位に
連結する。１２個のgalＫ+クローン(ＭＡＣ−ＧＡＬ
上、赤)のサイズをスクリーニングする。プラスミドpＳ
ＡＵ１０と命名した１つのクローンは最も小さく、約
１.４Ｋbのインサート・サイズを有していた。 【００５７】pＳＬＩＶＧＡＬ１含有コロニーと異な
り、pＵＣクローンはＭＡＣ−ＧＡＬ培地上で非常に赤
く、ガラクトキナーゼの産生増加を示した。この酵素レ
ベルの増加の最も可能性の高い説明は、ストレプトマイ
セス・リビダンスgalＫ遺伝子が、コスミッドの上流プ
ロモーターより強いイー・コリ・プロモーターに転写さ
れていることである。 【００５８】pＳＡＵ１０のインサートをＥcoＲＩ〜Ｈi
ndＩＩＩフラグメントとして単離し(これらの部位はpＵ
Ｃ１８−ＴＴ６のインサート領域をフランキングす
る)、ストレプトマイセス・リビダンスgalＫ遺伝子のプ
ローブとして用いる。クローニングに用いた染色体ＤＮ
ＡをＥcoＲＩ＋ＭluＩおよびＢamＨＩ＋ＢgｌＩＩで制
限し、サザーン、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バ
イオロジー(Ｓouthern,Ｊ．Ｍol．Ｂiol．)９８,５０３
(１９７５)の方法に従ってプロットする。pＳＡＵ１０
フラグメントをニック・トランスレーションし、該ブロ
ットに雑種形成させる。プローブは染色体消化物におけ
る１．３ＫbＥcoＲＩ−ＭluＩフラグメントおよび５Ｋb
ＢamＨＩ−ＢglＩＩフラグメントを同定した。このデー
タをコスミッド・インサートの地図と比較して、galＫ
遺伝子の位置(地図位置５と７の間、表１参照)を確認し
た。 【００５９】Ｃ．ストレプトマイセス・リビダンスgal
オペロンのＤＮＡ配列 ストレプトマイセス・リビダンスgalオペロンを鎖終止
[サンガーら、プロシーディングス・オブ・ナショナル
・アカデミー・オブ・サイエンス・ユー・エス・エイ
(Ｓanger et al．,Ｐroc．Ｎat'l．Ａcad．Ｓci．
Ｕ．Ｓ．Ａ．)７４,５４６３(１９７７)参照]および化
学的開裂[マキサムおよびギルバート、メソッズ・イン
・エンザイモロジー(Ｍaxam and Ｇilbert,Ｍethods
in Ｅnzymology)６５,４９９(１９８０)]により配列
づけした。galＫの初めの配列はＭ１３mp１０のＢamＨ
ＩおよびＳalＩ部位の各々にショットガン・クローンさ
れたpＳＡＵ６のインサート(pＳＡＵ１０の２．３Ｋb同
胞)のＳau３ＡＩおよびＳalＩフラグメントから由来し
た[メッシング(Ｍessing)]、メソッズ・イン・エンザイ
モロジー、１０１、２０(１９８３)参照]。ストレプト
マイセス・リビダンスgalＴ、galＥおよびgalＫ遺伝子
のアミノ酸配列はコンピュータによって予測され、イー
・コリおよび／またはサッカロマイセス・セレビシエ
(Ｓ．cevevisiae)ガラクトキナーゼ、gal−１−ホスフ
ェート・ウリジル・トランスフェラーゼおよびＵＤＰ−
４−エピメラーゼ酵素のアミノ酸配列との比較によって
分析した。これらの蛋白質の配列は、gal酵素をコード
付ける遺伝子の総または部分ＤＮＡ配列を用いるコンピ
ュータ分析により予測された[デボウクら、ヌークレイ
ック・アシッズ・リサーチ(Ｄebouck et al．,Ｎuc．
Ａcids Ｒes．)１３(６),１８４１〜１８５３(１９８
５)およびシトロンおよびドネルソン、ジャーナル・オ
ブ・バクテリオロジー(Ｃitron and Ｄonelson,Ｊ．
Ｂacteriology)１５８,２６９(１９８４)参照]。ストレ
プトマイセス・リビダンスgalＫ、galＴ、galＥ遺伝子
生成物についての推定蛋白質配列と、それらの各イー・
コリおよび／またはサッカロミセス・セレビシエ遺伝子
生成物の間にいくらかの相同が見出された。 【００６０】ストレプトマイセス・リビダンスgalオペ
ロンの完全ＤＮＡ配列を表３に示す。表３に包含されて
いるものはオペロンのプロモーターについての転写開始
部位およびgalＴ、galＥおよびgalＫ遺伝子生成物の予
測アミノ酸配列である。 【００６１】 【表３】 【表４】 【表５】【表６】 【表７】【表８】 【表９】【表１０】 【表１１】【表１２】 【表１３】【表１４】 【００６２】実施例２ ストレプトマイセス・リビダンスgalオペロンのプロモ
ーター a)Ｐ１プロモーター (i)概要 このプロモーターはガラクトース誘導性、グルコース抑
制性で、全ストレプトマイセスgalオペロン用の調節可
能プロモーターである。Ｓ１データはストレプトマイセ
ス・リビダンスgalオペロンが約３．４Ｋbのポリシスト
ロニック転写体をコード付けすることを示している。転
写体はgalＴについての約１Ｋb、次いで、各galＥおよ
びgalＫについての約１Ｋbからなる(図１参照)。Ｐ１の
ガラクトース誘導は、少なくとも部分的に、５'端が転
写開始部位の上流３１bpに位置するオペレーター配列お
よび該オペレーターを認識するレプレッサ蛋白により介
在される。 【００６３】(ii)実験:Ｐ１プロモーターの単離、位置
決め、特性づけ ストレプトマイセス・リビダンスgalＫ ＡＴＧの上流
配列を、前記ブラウナーのイー・コリgalＫプロモータ
ー・プローブ系を用い、プロモーターについてスクリー
ニングする。ＨindＩＩＩ−ＭluＩフラグメント(表１、
地図位置１〜５参照)をＳau３ＡＩで制限し、pＫ２１の
特有のＢamＨＩ部位に連結し(図２)、実施例１の方法に
従ってイー・コリＫ２１(galＫ-)中に形質転換する。p
Ｋ２１はpＳＫＯ３の誘導体で、イー・コリgalＫ遺伝子
を含有するイー・コリ−ストレプトマイセス・シャトル
・ベクターである。pＳＫＯ３の構成はローゼンベルグ
ら(Ｒosenberg et al．)、ジェネティック・エンジニ
アリング、８(１９８６)に記載されている。galＫを発
現するクローン、すなわち、プロモーター活性を有する
クローンをマッコンキー−ガラクトース平板上で同定し
た。２つのgalＫ＋クローン(pＫ２１ＭＨ１および２と
命名)をストレプトマイセス１３２６−１２Ｋ(galＫ-)
に形質転換した。形質転換体の抽出物をＹmgluおよびＹ
mgal中で培養し、抗イー・コリ・ガラクトキナーゼ抗血
清を用い、ウエスターン・ブロット分析で分析した。こ
のブロットはガラクトース誘導培養からの抽出物におい
て著しく高いガラクトキナーゼのレベルを示した。 【００６４】pＫ２１ＭＨ１および２は制限分析により
４１０bpのＳau３ＡＩインサートを含有することが示さ
れ、これは、サザーン、ジャーナル・オブ・モレキュラ
ー・バイオロジー９８、５０３(１９７５)の方法による
サザーン・ブロット分析により、ＨindＩＩＩおよびＢg
lＩＩ部位内に含有される(表１、地図位置１〜２)。ク
ローンしたフラグメントを、ストレプトマイセス・リビ
ダンス１３２６−１２Ｋおよびイー・コリＫ１２培養か
ら単離したＲＮＡを用いるＳ１分析により分析した。Ｓ
１消化後得られたフラグメントは２９０ヌクレオチド保
護フラグメントである(Ｓau３ＡＩ部位のmＲＮＡ２９０
のbp上流の５'端を示す)。雑種形成実験(この領域の単
ストランドＭ１３クローンを用いる)は転写の方向が図
２に示すごとく、左から右であること(すなわち、転写
はgalＫの方へ進向する)を示している。 【００６５】通常のＤＮＡ配列分析および追加のＳ１地
図作製分析を用いてmＲＮＡの５'端を規定した。Ｐ１の
ガラクトース誘導調節に関与する配列を、ヌクレアーゼ
Ｂal３１により転写開始部位の上流配列を除去すること
により位置づけした。これらの配列除去によるプロモー
ター機能またはガラクトース誘導におけるいずれもの変
化をＰ１同定に用いたイー・コリgalＫプロモーター・
プローブ・プラスミドを用いて評価した。 【００６６】(iii)galプロモーター欠失の構成 Ｐ１転写開始から下流１００bpおよびＰ１転写開始から
上流２１６bpの配列を含むＤＮＡフラグメントをプラス
ミドpＵＣ１９ＴＴ１にクローンしてプラスミドpＨＬ５
を構成する。プラスミドpＵＣ１９ＴＴ１はノーランダ
ーら、ジーン２６、１０１〜１０６(１９８３)に記載さ
れており、pＵＣ１８−ＴＴ６としてのアンカー(Ｕnke
r)を有している。実施例１Ｂ参照。Ｐ１の前の上流配列
中に延長する欠失はpＨＬ５をＨindＩＩＩで線状化し、
ヌクレアーゼＢal３１で端部を処理することにより発生
させることができる。不均一端をＤＮＡポリメラーゼＩ
のクレノウ・フラグメントで修復する。次いで、Ｂal３
１処理pＨＬ５をＢamＨＩで消化し、５％アクリルアミ
ド・ゲル上を泳動させる。分子量１００〜３００ｂｐの
ＤＮＡフラグメントをゲルから溶出し、ＨｉｎｄＩＩお
よびＢamＨＩで消化したＭ１３mp１０にサブクローンす
る。(メッシング(Ｍessing)、メソッズ・イン・エンザ
イモロジイ、１０１、２０(１９８３)参照)。個々の欠
失を、前記サンガーらのジデオキシ鎖終止法により、単
ストランド・ファージＤＮＡから配列づけする。 【００６７】(iv)Ｐ１プロモーター欠失のイー・コリga
lＫ遺伝子への結合 種々のmp１０クローンをＢamＨＩおよびＨindＩＩＩで
消化した。個々の欠失を有するＤＮＡフラグメントを低
融点アガロース・ゲルから単離し、ＢamＨＩおよびＨin
dＩＩＩで消化したpＫ２１に連結した(図２参照)。イー
・コリＭＭ２９４への形質転換後、プラスミドＤＮＡ
を、各欠失誘導体について単離し、ストレプトマイセス
・リビダンス１２Ｋに形質転換した。 【００６８】(v)ストレプトマイセス・リビダンスにお
けるＢal３１−発生欠失の機能的評価 各々のプロモーター欠失について、１つのチオストレプ
トン耐性形質転換体をＹＭベース(ＹＥＭＥ)＋１０μg
／mlチオストレプトン中で後記logまで増殖させた。細
胞をペレット化し、Ｍ５６を培地中で１回洗浄し、Ｍ５
６培地に再懸濁した(前記ミラーら参照)。洗浄した細胞
を、１％ガラクトースまたは１％グルコース補足ＹＭ＋
０．１Ｍ ＭＯＰＳ(pＨ７．２)＋１０μg／mlチオスト
レプトンへの接種に用いた。細胞を１６時間増殖させ、
次いで、ガラクトースキナーゼ活性を検定した。 【００６９】Ｐ１転写用開始部位の上流１２０、６７、
５５、３４、３１、２４、２０、１８、１０または８bp
配列のいずれかを含有する各pＫ２１誘導体をガラクト
ースキナーゼの発現について分析した。結果は、Ｐ１の
ガラクトース誘導に必要な全ての情報(すなわち、ガラ
クトース増殖細胞において産生されたガラクトキナーゼ
のレベルがグルコース増殖細胞におけるレベルより１０
〜２０倍大きい)がＰ１の上流の３１bp配列に含まれる
ことを示した。Ｐ１の上流３４bp配列を残した欠失は、
ガラクトースが６倍量のガラクトキナーゼを誘導するの
で、ガラクトースによって部分的に誘導性である。すな
わち、オペレーターの一端は、−２４および−３１倍の
間の配列内に位置しなければならない。上流配列の２
０、１８、１０または８bpのいずれかを残した残りの欠
失は構成性Ｐ１プロモーター、すなわち、産生したガラ
クトキナーゼのレベルが、細胞をガラクトースまたはグ
ルコースの存在下で増殖させた場合、同等である。Ｐ１
の８および１０bpを有するプロモーター欠失は構成性で
はあるが、ガラクトキナーゼの量は、１８〜１２０bpの
上流配列を有するプロモーター欠失に比べ、１０倍減少
した。この結果はＰ１の−１０および−１８位間の配列
がプロモーター機能に必須であることを示している。 【００７０】このデータは、Ｐ１のガラクトース誘導
が、少なくとも部分的にオペレーター配列に介在される
モデルを支持している。この配列の一端はＰ１転写開始
部位の上流２４〜３１bpである。オペレーターの一部ま
たは全部の除去は部分的または全体的に脱抑制されたプ
ロモーターをもたらす。この配列の他端はこれらの実験
によって規定されないが、ほぼＰ１転写開始部位の上流
２４〜３１bp配列内に含まれると考えられる。さらに、
これらの配列がガラクトース誘導を達成するに必要な最
小領域内に含まれているので、本発明者らはオペレータ
ーの３'端も転写開始部位の上流１００bp内にある可能
性を排除できない。これらのデータは、オペレーター配
列と相互作用する因子がレプレッサー蛋白質であること
を示唆している。最後に、本発明者らは、Ｐ１がレプレ
ッサー以外の因子(すなわち、ラムダファージcＩＩ蛋白
質のような陽性アクチベーター)によって制御されてガ
ラクトース誘発プロモーター転写体を調節しうるという
可能性を排除する証拠を有しない。 【００７１】b)Ｐ２プロモーター (i)概要 ストレプトマイセスgalオペロンのＰ２プロモーターはg
alＥ遺伝子の上流で、galＥおよびgalＫ遺伝子の両方を
転写する。Ｐ２プロモーター発現はＳ１分析によって示
されるように構成的(すなわち、グルコース抑制／ガラ
クトース誘導でない)である。 【００７２】(ii)実験: Ｐ２プロモーターの単離、位置
決め、特性づけ ストレプトマイセスgalオペロンＰ２の存在は、ストレ
プトマイセス・リビダンス１３２６ＤＮＡのＢalＩＩ−
ＭluＩフラグメントをプラスミドpＫ２１に挿入し(図２
参照)、それによって形質転換されたストレプトマイセ
ス・リビダンス１３２６−１２Ｋ中でガラクトキナーゼ
発現が観察される場合に明らかとなった。 【００７３】ＤＮＡ配列分析およびＳ１分析を用いてス
トレプトマイセス・リビダンスgalオペロンＰ２の５'端
を同定した。Ｐ２プロモーター転写体の５'端は予測し
たgalＥ ＡＴＧの上流１００bp内にある。 【００７４】実施例３ ストレプトマイセスgalオペロン内のポリシストロニッ
ク・メッセージの証拠Ｓ１分析を用いてストレプトマイ
セス・リビダンスgalオペロンgalＫ遺伝子の転写体上流
および下流の地図を作製した。一般に、１〜２Ｋbのオ
ーバー・ラップＤＮＡフラグメントをクローンから単離
し、さらに制限し、末端をラベルした。メッセージはga
lＫの３'端からＰ１の上流端まで続く。 【００７５】ストレプトマイセス・リビダンスgalオペ
ロン転写体の３'端は多分、galＫの最初の１００塩基下
流内に生じる。galＫ配列内の部位で３'ラベルしたフラ
グメントは、下流領域に伸長する場合、その全長までは
保護されない。１つの実験は、galＫ翻訳終止の下流５
０〜１００bpで終止する領域で保護されうることを示し
ている。転写ターミネーターの存在はターミネーター・
プローブを用いる通常の技術によって確認できる。gal
オペロン転写体は、当該部位から５'ラベルＰvuＩＩフ
ラグメントの非全長保護が生じるので、明らかにＰvuＩ
Ｉ部位まで伸長しない(表１、地図位置８参照)。 【００７６】２つのＰvuＩＩからの５'端ラベルフラグ
メント、フラグメントＩ(表１、地図位置４〜６参照)お
よびフラグメントＩＩ(表１、地図位置６〜８参照)並び
にpＳau１０インサートを、メッセージの３'から５'端
へのＳ１ウォーキング(warking)のプローブ源として用
いた。この領域の全てのフラグメントは、部分および完
全保護を示すＰ２プロモーター含有フラグメントを除
き、保護された。Ｓ１消化からの完全保護は、Ｐ１の上
流で開始し、galＫの約１００bp下流まで続くポリシス
トロニック・メッセージを示す。 【００７７】前記のデータはストレプトマイセスgalオ
ペロンのポリシストロニックmＲＮＡの間接的証拠であ
る。長い隣接するＤＮＡフラグメント(例えば、４．５
Ｋb ＨindＩＩＩ−ＳacＩフラグメント、表１、地図位
置７参照)を用いるＳ１分析を転写体サイズの確認に用
いた。 【００７８】実施例４ ストレプトマイセス・リビダンスgalオペロンgalＥおよ
びgalＴ遺伝子の位置決め (i)概要 ストレプトマイセス・リビダンスgalオペロンgalＥ遺伝
子はpＳＬＩＶＧＬ１の１．５Ｋb ＰvuＩＩフラグメン
ト(表１の地図位置４〜６)に位置する(図１)。 【００７９】ストレプトマイセス・リビダンスgalオペ
ロンgalＥコード付け配列はＭluＩ部位を通して伸長す
る(表１の地図位置５)。ストレプトマイセス・リビダン
スgalオペロンgal遺伝子はpＳＬＩＶＧＡＬ１の１．１
５ＫbＮru−ＰvuＩＩ領域に位置する(表１の地図位置１
a〜４参照)。ストレプトマイセス・リビダンスgalオペ
ロンgalＥおよびgalＴ転写方向はgalＫ遺伝子と同じで
ある。 【００８０】(ii)実験 pＳＬＩＶＧＡＬ１に含有される他の機能、特に、酵素
ガラクトース・エピメラーゼ(galＥ)または酵素ガラク
トース・トランスフェラーゼ(galＴ)をコード付けする
プラスミドを同定する必要がある。ストレプトマイセス
galオペロンgalＫ遺伝子はそのイー・コリgalＫ宿主を
相補する能力で同定した。かくして、ストレプトマイセ
スgalＴおよびgalＥ遺伝子の同定は、各々、イー・コリ
galＥ-またはgalＴ-宿主の相補によりテストした。イー
・コリgalＴ-株(ＣＧＳＣ株＃４４６７、Ｗ３１０１)お
よび２つのgalＥ-株(ＣＧＳＣ株＃４４７３、Ｗ３１０
９およびＣＧＳＣ株＃４４９８、ＰＬ−２)を得、pＳＬ
ＩＶＧＡＬ１クローンによる相補のテストをした。 【００８１】ストレプトマイセス・リビダンスgalオペ
ロンgalＫ遺伝子を含有する約９ＫbのＨindＩＩＩ−Ｓp
hＩフラグメント(表１、地図位置１〜１６をpＵＣ１９
に挿入した。このフラグメントはpＵＣ１９内で、pＵＣ
１９のＰｌacプロモーターからの転写がストレプトマイ
セスgalＫ遺伝子と同じ方向になるように位置させる。p
ＵＣ１９はヤニッシューペローら、ジーン(Ｙanisch−
Ｐerrou et al．Ｇene)３３, １０３(１９８３)に記
載されている。相補はマッコンキー−ガラクトース平板
上での増殖により検定した。ガラクトースを利用できる
細胞(galＥ+、galＴ+、galＫ+)はこの培地上で赤〜桃色
となる。ＨindＩＩＩ−ＳphＩインサートを有するpＵＣ
１９含有イー・コリ株ＰＬ−２(実施例２参照)はこの指
示薬平板上で桃色になり、ＨindＩＩＩ−ＳphＩフラグ
メントがストレプトマイセス・リビダンスgalＥ遺伝子
を含有することを示した。galＥ遺伝子は４．５Ｋb Ｈ
indＩＩＩ−ＳacＩ(ＳacＩ部位は表１の地図位置７〜８
近辺の領域に近い)フラグメント内に地図作製した。Ｍl
uＩ部位(表１、地図位置５)からＳacＩ部位までの配列
を除くと、イー・コリＰＬ−２のgalＥ相補は検出され
なかった。galＫ遺伝子の５'端はＭluＩ部位から７０bp
にある。したがって、ＭluＩ部位はgalＥ遺伝子の５'ま
たは３'端内に含まれるようである。galＥ転写方向を決
定するため、ＨindＩＩＩ−ＳacＩフラグメントをpＵＣ
１８に挿入した。この配置において、ストレプトマイセ
ス・リビダンスgalＫ遺伝子はＰlacに関して反対の方向
にある。pＵＣ１８ＨindＩＩＩ−ＳphＩクローンはイー
・コリＰＬ−２を相補せず、galＥはgalＫと同じ方向で
転写されることを示している。さらに、ＭluＩ部位はga
lＥ遺伝子の３'端内に含まれると結論された。ＰvuＩＩ
−ＭluＩフラグメント(表１、地図位置４−５)のＤＮＡ
配列分析は予測分子量３３０００ダルトンのポリペプチ
ドをコード付けするオープン・リーディング・フレーム
を決定した。このリーディング・フレームの５'端はＰv
uＩＩ部位から約１７６bpに位置する(表１、地図位置４
参照)。かくして、この配列づけの結果はgalＥの３'端
がＭluＩ部位を横切るという結論を指示している(表
１、地図位置５参照)。 【００８２】pＳＬＩＶＧＡＬ１上のgalＴ遺伝子を位置
づけする同様な実験をgalＴ宿主で試みた。Ｐ１およびg
alＥの５'端間の領域を配列づけしてgalＴ遺伝子を同定
した。ＤＮＡ配列のアミノ酸配列への翻訳は酵母トラン
スフェラーゼに相同な領域を示す蛋白質をコード付けす
るリーディング・フレームを規定する。 【００８３】実施例５ ストレプトマイセス・リビダンスgalオペロンgalＫ遺伝
子のガラクトース誘導 (i)概要 ガラクトースを培地に添加後１時間以内にガラクトキナ
ーゼ発現が誘導される。グルコースの存在下または該糖
添加後６時間以内に追加の炭素源を加えない場合に対
し、ガラクトースの存在下ではガラクトキナーゼの発現
は１０倍も高い。 【００８４】(ii)実験 ストレプトマイセス・リビダンスgalＫ遺伝子のガラク
トース誘導を、ガラクトースの添加後、１、３、６およ
び２４時間におけるガラクトキナーゼ活性の検定により
試験した。ＹＭ＋０．１Ｍ ＭＯＰＳ(pＨ７．２)２リ
ットルにストレプトマイセス・リビダンス１３２６の胞
子２×１０7個を接種した。２１時間増殖後、最終濃度
１％でガラクトースまたはグルコースを加えた。糖添加
１、３、６および２４時間後、細胞を単離し、ガラクト
キナーゼ活性を検定した。全ＲＮＡは前記ホップウッド
らに記載の方法で調製した。 【００８５】ガラクトキナーゼ合成の増加はガラクトー
ス添加１時間後に観察された。この増加は持続した(１
〜２４時間)。誘導培養から単離したＲＮＡのＳ１分析
からgalＫ活性の増加がＰ１プロモーター転写体のレベ
ル増加によることを確認した。Ｓ１データおよび誘導研
究はストレプトマイセスgalオペロンにおける遺伝子発
現についての以下のモデルを示唆した。Ｐ１プロモータ
ーはガラクトース誘導プロモーターである。Ｐ１転写体
はgalＴ、galＥおよびgalＫを包含する。Ｐ２プロモー
ターは構成性で、その転写体はgalＥおよびgalＫを包含
する。 【００８６】イー・コリgalオペロンも２つのプロモー
ターＰ１およびＰ２を有することは興味深い[ナッソ
ら、セル(Ｎusso et al．Ｃell)１２, ８４７(１９７
７)]。Ｐ１はcＡＭＰ−ＣＲＰ結合によって活性化され
るが、Ｐ２はcＡＭＰ−ＣＲＰによって抑制される。イ
ー・コリgalオペロンgalＥコード付け配列翻訳は、ガラ
クトースの非存在下またはグルコースの存在下でもエピ
メラーゼの一定の源を供給する役割をするＰ２において
転写が開始される場合、より効率的である[クイーン
ら、セル(Ｑueen et al．Ｃell)２５, ２４１(１９８
１)参照]。エピメラーゼはガラクトース利用の間、ガラ
クトースをグルコース−１−ホスフェートに変え、ＵＤ
Ｐ−グルコースをイー・コリの細胞壁生合成に必要なＵ
ＤＰ−ガラクトースに変える機能を有する。ストレプト
マイセスgalＫオペロンのＰ２プロモーターも、ガラク
トースの非存在下または二次代謝の間にエピメラーゼお
よびガラクトキナーゼを供給する役割をする可能性があ
る。 【００８７】実施例６ ストレプトマイセス・コエリカラーgalオペロン (i)概要 ストレプトマイセス・コエリカラーgalＫ遺伝子含有フ
ラグメントの制限地図はストレプトマイセス・リビダン
スgalオペロンの制限地図と同じである(図３参照)。 【００８８】ストレプトマイセス・コエリカラーはガラ
クトースを唯一の炭素源とする最少培地上で増殖でき
る。ストレプトマイセス・コエリカラーにおけるガラク
トキナーゼ発現は増殖培地にガラクトースを添加するこ
とにより誘導される。Ｐ１と類似で、ほぼ同一と考えら
れるプロモーターがストレプトマイセス・コエリカラー
galオペロンのガラクトース誘導に関与する。 【００８９】(ii)実験 ストレプトマイセス・コエリカラーgalＫ遺伝子含有の
約１４Ｋb部分Ｓau３Ａフラグメントは英国マンチェス
ターの、ユニバーシティ・オブ・マンチェスター・イン
スティテュート・オブ・サイエンス・アンド・テクノロ
ジーにおいてケイ・ケンダルおよびジェイ・クラム
(Ｋ．ＫendallおよびＪ．Ｃullum)によって単離された
(未公開、私信)。彼等は、ストレプトマイセス・コエリ
カラーgalＫ変異株の相補により３Ｋb ＥcoＲＩフラグ
メント内にストレプトマイセス・コエリカラーgalＫ遺
伝子を位置づけすることができた。ストレプトマイセス
・リビダンスgalオペロン内の多くの制限部位の位置は
ストレプトマイセス・コエリカラーgalＫ遺伝子を含む
ＥcoＲＩフラグメントの上流および下流内に見られるも
のと同じである(図３)。すなわち、ストレプトマイセス
・コエリカラーgalオペロンの遺伝子構成はストレプト
マイセス・リビダンスgalオペロンと同じであるように
考えられる。 【００９０】ストレプトマイセス・コエリカラーgalＫ
遺伝子のガラクトース誘導をイムノブロッティングで試
験した。ストレプトマイセス・コエリカラーをＹＭ＋１
％ガラクトースまたは１％グルコース(ＹmgluまたはＹm
gal)中、２８℃で２０時間増殖させた。ガラクトキナー
ゼ発現は、精製イー・コリ・ガラクトキナーゼに対して
調製したウサギ坑血清を用いて検出した。検出した蛋白
質はイー・コリおよびストレプトマイセス・リビダンス
ｇａｌＫ遺伝子生成物の近似部位であった。ガラクトキ
ナーゼ発現は、ストレプトマイセス・コエリカラーがＹ
ｍ＋ガラクト（Ｙｍｇａｌ）中で増殖した場合のみ検出
されるので、ガラクトース誘導である。 【００９１】ストレプトマイセス・コエリカラーｇａｌ
オペロンのガラクトース誘導がストテプトマイセス・リ
ビダンスＰ１プロモーターに類似するプロモーターによ
って指示されているか否かを決定するためにＳ１ヌクレ
アーゼ保護研究を行った。ＲＮＡを、Ｙｍ＋１％ガラク
トースまたは１％グルコース（ＹｍｇａｌまたはＹｍｇ
ｌｕ）中で増殖させたストレプトマイセス・コエリカラ
ーから単離した。このＲＮＡのＳ１分析に用いた雑種形
成プローブは、ストレプトマイセス・リビダンスＰ１プ
ロモーター、その転写開始部位およびｇａｌＴ遺伝子の
５′端を含む４１０ｂｐＳａｕ３Ａであった。この分析
により検出されたＳ１保護フラグメントは、ガラクトー
ス存在Ｔで増殖したストレプトマイセス・リビダンスか
ら単離したＲＮＡとプローブを雑種形成させた場合、検
出した保護フラグメントと共に泳動した。すなわち、こ
の結果は、ストレプトマイセス・コエリカラーgalオペ
ロンのガラクトース誘導がストレプトマイセス・リビダ
ンスＰ１プロモーターと区別できない配列によって指示
されていることを示している。 【００９２】以下のストレプトマイセス株は唯一の炭素
源としてガラクトースを含有する培地上で増殖できるこ
とが観察された。 ストレプトマイセス・アルブスＪ１０７４(前記英国ノ
ーウィッチのチャーター氏より入手) ストレプトマイセス・カルジノスタティクス(Ｓ．carzi
nostaticus)ＡＴＣＣＮo．１５９４４ ストレプトマイセス・カルジノスタティクスＡＴＣＣ
Ｎo．１５９４５ 【００９３】ストレプトマイセス・アンチフィブリノリ
チクス(Ｓ．antifibrinolyticus)ＡＴＣＣ Ｎo．２１
８６９ ストレプトマイセス・アンチフィブリノリチクスＡＴＣ
Ｃ Ｎo．２１８７０ ストレプトマイセス・アンチフィブリノリチクスＡＴＣ
Ｃ Ｎo．２１８７１ ストレプトマイセス・ロンギスポルス(Ｓ．longisporu
s)ＡＴＣＣ Ｎo．２３９３１ 以上、本発明の好ましい具体例を実施例として記載した
が、本発明はこれらに限定されるものではない。
【図面の簡単な説明】
【図１】 ストレプトマイセス・リビダンス１３２６ga
lオペロンの制限地図。 【図２】 プラスミドpＫ２１の制限地図。 【図３】 ストレプトマイセス・リビダンスgalオペロ
ンと、ストレプトマイセス・コエリカラーgalＫ遺伝子
を含有する制限フラグメントを比較する制限地図。
lオペロンの制限地図。 【図２】 プラスミドpＫ２１の制限地図。 【図３】 ストレプトマイセス・リビダンスgalオペロ
ンと、ストレプトマイセス・コエリカラーgalＫ遺伝子
を含有する制限フラグメントを比較する制限地図。
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フロントページの続き
(51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ
(Ｃ１２Ｎ 9/12
Ｃ１２Ｒ 1:19）
(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ
Ｃ１２Ｒ 1:465）
(72)発明者 マリイ・エレン・ブラウナー
アメリカ合衆国ペンシルベニア州19087、
ウエイン、バレイ・ストリーム・サーク
ル126番
(72)発明者 ジェイムズ・アラン・フォーンワルド
アメリカ合衆国ペンシルベニア州19403、
ノーリスタウン、バーンサイド・アベニ
ュー104番
(72)発明者 フランシス・ジョン・シュミット
アメリカ合衆国ミズーリ州65201、コロ
ンビア、ドリス・ドライブ1404番
Claims (1)
- (57)【特許請求の範囲】 １．つぎのコード付け配列を有するストレプトマイセス
ｇａｌオペロンまたはｇａｌＴ、ｇａｌＥおよびｇａｌ
Ｋ遺伝子産物の調節可能な生成について該オペロンと実
質的に同じ機能を有するそのいずれかの調節可能な官能
性誘導体を含むことを特徴とする組換型ＤＮＡ分子： 【化１】【化２】【化３】【化４】【化５】【化６】２．該オペロンが、ストレプトマイセス・リビダンス、
ストレプトマイセス・コエリカラー、ストレプトマイセ
ス・アズラエウス、ストレプトマイセス・アルブス、ス
トレプトマイセス・カルジノスタティクス、ストレプト
マイセス・アンチフィブリノリチクスまたはストレプト
マイセス・ロンギスポルスのｇａｌオペロンである請求
項１記載の分子。 ３．該オペロンがストレプトマイセス・リビダンスｇａ
ｌオペロンである請求項２記載の分子。 ４．該オペロンに作動的に結合した異種官能性ＤＮＡ配
列を含む請求項１記載の分子。 ５．つぎのコード付け配列を有するストレプトマイセス
ｇａｌオペロンまたはｇａｌＴ、ｇａｌＥおよびｇａｌ
Ｋ遺伝子産物の調節可能な生成について該オペロンと実
質的に同じ機能を有するそのいずれかの調節可能な官能
性誘導体ならびに該オペロンに作動的に結合した異種官
能性ＤＮＡ配列を含む組換型ＤＮＡ分子を含む形質転換
宿主微生物または細胞： 【化８】 【化９】【化１０】【化１１】【化１２】【化１３】６．つぎのコード付け配列を有するストレプトマイセス
ｇａｌオペロンまたはｇａｌＴ、ｇａｌＥおよびｇａｌ
Ｋ遺伝子産物の調節可能な生成について該オペロンと実
質的に同じ機能を有するそのいずれかの調節可能な官能
性誘導体ならびに該オペロンに作動的に結合した異種官
能性ＤＮＡ配列を含む組換型ＤＮＡ分子および、所望に
より、さらにレプリコンを含む組換型ＤＮＡベクター： 【化１４】【化１５】【化１６】【化１７】【化１８】【化１９】７．つぎのコード付け配列を有するストレプトマイセス
ｇａｌオペロンまたはｇａｌＴ、ｇａｌＥおよびｇａｌ
Ｋ遺伝子産物の調節可能な生成について該オペロンと実
質的に同じ機能を有するそのいずれかの調節可能な官能
性誘導体ならびに該オペロンに作動的に結合した異種官
能性ＤＮＡ配列を含む組換型ＤＮＡ分子および、所望に
より、さらにレプリコンを含む組換型ＤＮＡベクターを
含む形質転換宿主微生物または細胞： 【化２０】【化２１】【化２２】【化２３】【化２４】【化２５】
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