JPS62265987A - ストレプトマイセスのｇａｌオペロンＰ１プロモーター - Google Patents
ストレプトマイセスのｇａｌオペロンＰ１プロモーターInfo
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は、ストレプトマイセス（Ｓ ｔ ｒｅｐｔｏｍ
ｙｃｅｓ）ｇａｌオペロンからなる組換型Ｄ Ｎ Ａ分
子に関する。
ｙｃｅｓ）ｇａｌオペロンからなる組換型Ｄ Ｎ Ａ分
子に関する。
発明の背景
ホソノソン、ジャーナル・オブ・フェネテル・マイクロ
バイオロノー（ｔｌｏｄｇｓｏｎ、 Ｊ、Ｇｅ＊〜ｌ１
ｃｒｏ、）１２８．２４１７〜２４３０（＋９８２）は
ストレプトマイセス・コエリカラー（Ｓ 、 ｃｏｅｌ
ｉｃｏｌｏｒ）Ａ３（２）が、野性型株におけるグリセ
ロール摂取系の１つであるアラビノース摂取系の転写レ
ベルにおける抑制と、ガラクトース摂取系の抑制をらさ
せるグルコース抑制系を有することを報告している。し
かし、ホッジソンにはストレプトマイセス・コエリカラ
ーＡ３（２）による実際のガラクトース代謝の報告は全
くない。
バイオロノー（ｔｌｏｄｇｓｏｎ、 Ｊ、Ｇｅ＊〜ｌ１
ｃｒｏ、）１２８．２４１７〜２４３０（＋９８２）は
ストレプトマイセス・コエリカラー（Ｓ 、 ｃｏｅｌ
ｉｃｏｌｏｒ）Ａ３（２）が、野性型株におけるグリセ
ロール摂取系の１つであるアラビノース摂取系の転写レ
ベルにおける抑制と、ガラクトース摂取系の抑制をらさ
せるグルコース抑制系を有することを報告している。し
かし、ホッジソンにはストレプトマイセス・コエリカラ
ーＡ３（２）による実際のガラクトース代謝の報告は全
くない。
オケダら、モレキュラー・アンド・ジェネラル・ジエネ
テイツクス（Ｏｋｅｄａ ｅｔ ａｌ、 、Ｍｏ１．
Ｇｅｎ。
テイツクス（Ｏｋｅｄａ ｅｔ ａｌ、 、Ｍｏ１．
Ｇｅｎ。
Ｇｅｎｅｔ、）１９６．５０１〜５０７（１９８４）は
、グルコース・キナーゼ活性、２−デオキシグルコース
感受性、グルコース利用性およびグルコース抑制が、ス
トレプトマイセス・コエリカラーからファージ・ベクタ
ーにクローンされた当該ｇｌｋ遺伝子を含有する３、５
ＫｂＤＮＡフラグメントによって形質転換されたストレ
プトマイセス・コエリカラ−Ａ３（２）ｇｌｋ（グルコ
ース・キナーゼ）変異株に全て復元されたことを報告し
ている。
、グルコース・キナーゼ活性、２−デオキシグルコース
感受性、グルコース利用性およびグルコース抑制が、ス
トレプトマイセス・コエリカラーからファージ・ベクタ
ーにクローンされた当該ｇｌｋ遺伝子を含有する３、５
ＫｂＤＮＡフラグメントによって形質転換されたストレ
プトマイセス・コエリカラ−Ａ３（２）ｇｌｋ（グルコ
ース・キナーゼ）変異株に全て復元されたことを報告し
ている。
セノら、モレキュラー・アンド・ジェネラル・ノエネテ
ィックス（Ｓｅｎｏ ｅｔ ａｌ、、 Ｍｏ１． Ｇｅ
ｎ。
ィックス（Ｓｅｎｏ ｅｔ ａｌ、、 Ｍｏ１． Ｇｅ
ｎ。
ＧｅｎｅＬ、）１９３．１１９〜１２８（１９８４）は
ストレプトマイセス・コエリカラーのゼリセロール（ｇ
ｙｌ）オペロンを報告し、かかるオペロンが基質誘発性
で、カタボライト抑制性であると述べている。
ストレプトマイセス・コエリカラーのゼリセロール（ｇ
ｙｌ）オペロンを報告し、かかるオペロンが基質誘発性
で、カタボライト抑制性であると述べている。
デボラフら、ヌークレイック・アンッズ・リザーヂ（Ｄ
ｅｂｏｕｃｋ ｅｔ ａｌ、 、Ｎｕｃ、Ａｃ１ｄｓ、
Ｒｅｓ、）Ｉ ３（６）、１８４１−１８５３（１９８
５）はイー・コリ（Ｅ、ｃｏｌｉ）のｇａｌオペロンが
、ガラクトースの代謝に必要な酵素、すなわち、ｇａｌ
Ｅ（ウリジン・ジホスポガラクトースー４−エピメラー
ゼ）、ｇａｌＴ（ガラクトース−１−ホスフェート・ウ
リジルトランスフェラーゼ）およびｇａｌＫ（ガラクト
キナーゼ）を特定する３つの構造的に近似した遺伝子か
らなること、これらの遺伝子がポリジストロニックｍ
ＲＮ ＡからＥ、Ｔ、にの順序で発現されること、オペ
ロンのプロモーター遠位遺伝子ｇａｌＫの発現がその直
前のｇａｌＴ遺伝子に翻訳的にカップルされることが公
知であること、このような翻訳的カップリングが、ｇａ
ｌＴコード付け配列の端と、ｇａｌＫのリポソーム結合
域の間の構造的オーバーラツプから生じること、および
ｇａｌＴおよびｇａｌＫの翻訳的カップリングが、ガラ
クトースの代謝の間のこれらの遺伝子の一律発現を保証
することを報告している。
ｅｂｏｕｃｋ ｅｔ ａｌ、 、Ｎｕｃ、Ａｃ１ｄｓ、
Ｒｅｓ、）Ｉ ３（６）、１８４１−１８５３（１９８
５）はイー・コリ（Ｅ、ｃｏｌｉ）のｇａｌオペロンが
、ガラクトースの代謝に必要な酵素、すなわち、ｇａｌ
Ｅ（ウリジン・ジホスポガラクトースー４−エピメラー
ゼ）、ｇａｌＴ（ガラクトース−１−ホスフェート・ウ
リジルトランスフェラーゼ）およびｇａｌＫ（ガラクト
キナーゼ）を特定する３つの構造的に近似した遺伝子か
らなること、これらの遺伝子がポリジストロニックｍ
ＲＮ ＡからＥ、Ｔ、にの順序で発現されること、オペ
ロンのプロモーター遠位遺伝子ｇａｌＫの発現がその直
前のｇａｌＴ遺伝子に翻訳的にカップルされることが公
知であること、このような翻訳的カップリングが、ｇａ
ｌＴコード付け配列の端と、ｇａｌＫのリポソーム結合
域の間の構造的オーバーラツプから生じること、および
ｇａｌＴおよびｇａｌＫの翻訳的カップリングが、ガラ
クトースの代謝の間のこれらの遺伝子の一律発現を保証
することを報告している。
発明の概要
本発明はストレプトマイセスｇａｌオペロンｇａｌＫ遺
伝子、ｇａｌＦ遺伝子、ｇａｌＴ遺伝子、Ｐ２２プロモ
ーター現ユニットまたはＰ２プロモーターまたはそのい
ずれかの官能性誘導体からなる組換型ＤＮＡ分子ならび
にストレプトマイセスｇａｌオペロンＰＩプロモーター
、Ｐ１プロモーター調節域または全ｇａｌオペロンまた
はそのいずれかの調節可能な官能性誘導体からなる組換
型Ｄ Ｎ Ａ分子に関する。
伝子、ｇａｌＦ遺伝子、ｇａｌＴ遺伝子、Ｐ２２プロモ
ーター現ユニットまたはＰ２プロモーターまたはそのい
ずれかの官能性誘導体からなる組換型ＤＮＡ分子ならび
にストレプトマイセスｇａｌオペロンＰＩプロモーター
、Ｐ１プロモーター調節域または全ｇａｌオペロンまた
はそのいずれかの調節可能な官能性誘導体からなる組換
型Ｄ Ｎ Ａ分子に関する。
本発明はまた、ストレプトマイセスｇａｌオペロンまた
はそのいずれかの調節可能な官能性誘導体およびかかる
オペロンに作動的に結合した官能性ＤＮＡ分子からなる
組換型ＤＮＡ分子、かかるＤＮＡ分子、所望により、さ
らにレプリコンからする組換型ＤＮＡベクター、かかる
ベクターで形質転換された宿主細胞の調製法、そのよう
な方法で調製された形質転換宿主、当該官能性ＤＮＡ配
列が発現されるような適当な条件下、そのような形質転
換宿主を培養することからなる該官能性ＤＮＡ配列の発
現方法およびそのような発現を調節する条件下、そのよ
うな形質転換宿主を培養することからなるそのような官
能性ＤＮＡ配列の発現を調節する方法に関する。
はそのいずれかの調節可能な官能性誘導体およびかかる
オペロンに作動的に結合した官能性ＤＮＡ分子からなる
組換型ＤＮＡ分子、かかるＤＮＡ分子、所望により、さ
らにレプリコンからする組換型ＤＮＡベクター、かかる
ベクターで形質転換された宿主細胞の調製法、そのよう
な方法で調製された形質転換宿主、当該官能性ＤＮＡ配
列が発現されるような適当な条件下、そのような形質転
換宿主を培養することからなる該官能性ＤＮＡ配列の発
現方法およびそのような発現を調節する条件下、そのよ
うな形質転換宿主を培養することからなるそのような官
能性ＤＮＡ配列の発現を調節する方法に関する。
また、本発明はストレプトマイセスｇａｌオペロンＰ２
発現ユニットまたはそのいずれかの官能性誘導体および
そのユニットに作動的に結合した官能性ＤＮＡ分子から
なる組換型ＤＮＡ分子、そのようなりＮＡ分子および、
所望により、さらにレプリコンからなる組換型ＤＮＡベ
クター、そのようなベクターて形質転換された宿主細胞
の調製法、そのような方法で調製された形質転換宿主お
よび当該官能性ＤＮＡ配列が発現されるような適当な条
件下、そのような形質転換宿主を培養することからなる
そのような官能性ＤＮＡ配列の発現方法に関する。
発現ユニットまたはそのいずれかの官能性誘導体および
そのユニットに作動的に結合した官能性ＤＮＡ分子から
なる組換型ＤＮＡ分子、そのようなりＮＡ分子および、
所望により、さらにレプリコンからなる組換型ＤＮＡベ
クター、そのようなベクターて形質転換された宿主細胞
の調製法、そのような方法で調製された形質転換宿主お
よび当該官能性ＤＮＡ配列が発現されるような適当な条
件下、そのような形質転換宿主を培養することからなる
そのような官能性ＤＮＡ配列の発現方法に関する。
また、本発明はストレプトマイセスｇａｌオペロンＰＩ
プロモーター調節域またはそのいずれかの調節可能な官
能性誘導体およびそのような領域に作動的に結合した官
能性ＤＮＡ分子からなる組換型ＤＮＡ分子、そのような
りＮＡ分子および、所望により、さらにレプリコンから
なる組換型ＤＮＡベクター、そのようなベクターで形質
転換された宿主細胞の調製法、そのような方法で調製さ
れた形質転換宿主、当該官能性ＤＮＡ配列が発現される
ような適当な条件下、そのような形質転換宿主を培養す
ることからなるそのような官能性ＤＮＡ配列の発現方法
およびそのような発現を調節する条件下、そのような形
質転換宿主を培養することからなるそのような官能性Ｄ
ＮＡ配列の発現を調節する方法に関する。
プロモーター調節域またはそのいずれかの調節可能な官
能性誘導体およびそのような領域に作動的に結合した官
能性ＤＮＡ分子からなる組換型ＤＮＡ分子、そのような
りＮＡ分子および、所望により、さらにレプリコンから
なる組換型ＤＮＡベクター、そのようなベクターで形質
転換された宿主細胞の調製法、そのような方法で調製さ
れた形質転換宿主、当該官能性ＤＮＡ配列が発現される
ような適当な条件下、そのような形質転換宿主を培養す
ることからなるそのような官能性ＤＮＡ配列の発現方法
およびそのような発現を調節する条件下、そのような形
質転換宿主を培養することからなるそのような官能性Ｄ
ＮＡ配列の発現を調節する方法に関する。
また、本発明はストレプトマイセスｇａｌオペロンＰ１
プロモーターまたはそのいずれかの調節可能な官能性誘
導体およびそのような領域に作動的に結合した異種官能
性ＤＮＡ分子からなる組換型Ｄ Ｎ Ａ分子、そのよう
なりＮＡ分子および、所望により、さらにレプリコンか
らなる組換型ＤＮＡベクター、そのようなベクターで形
質転換された宿主細胞の調製法、そのような方法で調製
された形質転換宿主、当該官能性ＤＮＡ配列が発現され
るような適当な条件下、そのような形質転換宿主を培養
することからなるそのような官能性ＤＮＡ配列の発現方
法およびそのような発現を調節する条件下、そのような
形質転換宿主を培養することからなるそのような官能性
ＤＮＡ配列の発現調節方法に関する。
プロモーターまたはそのいずれかの調節可能な官能性誘
導体およびそのような領域に作動的に結合した異種官能
性ＤＮＡ分子からなる組換型Ｄ Ｎ Ａ分子、そのよう
なりＮＡ分子および、所望により、さらにレプリコンか
らなる組換型ＤＮＡベクター、そのようなベクターで形
質転換された宿主細胞の調製法、そのような方法で調製
された形質転換宿主、当該官能性ＤＮＡ配列が発現され
るような適当な条件下、そのような形質転換宿主を培養
することからなるそのような官能性ＤＮＡ配列の発現方
法およびそのような発現を調節する条件下、そのような
形質転換宿主を培養することからなるそのような官能性
ＤＮＡ配列の発現調節方法に関する。
また、本発明はストレプトマイセスｇａｌオペロンＰ２
プロモーターまたはそのいずれかの官能性誘導体および
そのような領域に作動的に結合した異種官能性ＤＮＡ分
子からなる組換型ＤＮＡ分子、そのようなりＮＡ分子お
よび、所望により、さらにレプリコンからなる組換型Ｄ
ＮＡベクター、そのようなベクターで形質転換された宿
主細胞の調製法、そのような方法により調製された形質
転換宿主および当該官能性ＤＮＡ配列が発現されるよう
な適当な条件下、そのような形質転換宿主を培養するこ
とからなるそのような官能性ＤＮＡ配列の発現方法に関
する。
プロモーターまたはそのいずれかの官能性誘導体および
そのような領域に作動的に結合した異種官能性ＤＮＡ分
子からなる組換型ＤＮＡ分子、そのようなりＮＡ分子お
よび、所望により、さらにレプリコンからなる組換型Ｄ
ＮＡベクター、そのようなベクターで形質転換された宿
主細胞の調製法、そのような方法により調製された形質
転換宿主および当該官能性ＤＮＡ配列が発現されるよう
な適当な条件下、そのような形質転換宿主を培養するこ
とからなるそのような官能性ＤＮＡ配列の発現方法に関
する。
また、本発明は、当該宿主を、ストレプトマイセスｇａ
ｌオペロンまたはそのいずれかの部分あるいはそのいず
れかの官能性誘導体からなり、そのような宿主をガラク
トースを利用できるようにするに十分な組換型ＤＮＡ分
子で形質転換することからなる非ガラクトース利用性宿
主微生物または細胞をガラクトースを利用できるように
する方法に関する。また、本発明はそのような方法にお
いて用いる組換型ベクターおよびそのような方法で調製
された宿主に関する。
ｌオペロンまたはそのいずれかの部分あるいはそのいず
れかの官能性誘導体からなり、そのような宿主をガラク
トースを利用できるようにするに十分な組換型ＤＮＡ分
子で形質転換することからなる非ガラクトース利用性宿
主微生物または細胞をガラクトースを利用できるように
する方法に関する。また、本発明はそのような方法にお
いて用いる組換型ベクターおよびそのような方法で調製
された宿主に関する。
図面の説明
第１図はストレプトマイセス・リビダンス（Ｓ、１ｉｖ
ｉｄａｎｓ） ｌ ３２６ガラクトース（ｇａｌ）オペ
ロンの制限エンドヌクレアーゼ地図、オペロン中の構造
遺伝子およびプロモーターの概略の位置を示す。
ｉｄａｎｓ） ｌ ３２６ガラクトース（ｇａｌ）オペ
ロンの制限エンドヌクレアーゼ地図、オペロン中の構造
遺伝子およびプロモーターの概略の位置を示す。
第２図はプラスミドｐＫ２１の制限エンドヌクレアーゼ
地図である。
地図である。
第３図はストレプトマイセス・リビダンスｇａｌオペロ
ンと、ストレプトマイセス・コエリカラーｇａｌＫ遺゛
転子を含有する制限フラグメントを比較する制限エンド
ヌクレアーゼ地図である。
ンと、ストレプトマイセス・コエリカラーｇａｌＫ遺゛
転子を含有する制限フラグメントを比較する制限エンド
ヌクレアーゼ地図である。
発明の詳説
ストレプトマイセスのゲノムが、３つの構造遺伝子（ｇ
ａｌＴ、 ｇａｌＥおよびｇａｌＫ）および２つのプロ
モーター（ＰＩおよびＰ２）からなるガラクトース代謝
用のオペロン（すなわち、ｇａｌオペロン）を含むこと
を見出した。ｇａｌＴ遺伝子の生成物はガラクトース−
１−ホスフェート・ウリジルトランスフェラーゼ（トラ
ンスフェラーゼ）として知られ、ｇａｌＥａ伝子の生転
子はウリジン・シフ１；スホガラクトースー４−エピメ
ラーゼ（エピメラーゼ）として知られ、ｇａｌＫ遺伝子
の生成物はガラクトース−１−キナーゼ（ガラクトキナ
ーゼ）として知られている。ストレプトマイセスのガラ
クトース代謝におけろｇａｌＴ、 ｇａｌＥおよびｇａ
ｌＴの遺伝子生成物の機能はっぎの式で示される。
ａｌＴ、 ｇａｌＥおよびｇａｌＫ）および２つのプロ
モーター（ＰＩおよびＰ２）からなるガラクトース代謝
用のオペロン（すなわち、ｇａｌオペロン）を含むこと
を見出した。ｇａｌＴ遺伝子の生成物はガラクトース−
１−ホスフェート・ウリジルトランスフェラーゼ（トラ
ンスフェラーゼ）として知られ、ｇａｌＥａ伝子の生転
子はウリジン・シフ１；スホガラクトースー４−エピメ
ラーゼ（エピメラーゼ）として知られ、ｇａｌＫ遺伝子
の生成物はガラクトース−１−キナーゼ（ガラクトキナ
ーゼ）として知られている。ストレプトマイセスのガラ
クトース代謝におけろｇａｌＴ、 ｇａｌＥおよびｇａ
ｌＴの遺伝子生成物の機能はっぎの式で示される。
１．ガラクトース＋ＡＴＰ ｊｆ’ｙ９Σ二五→ガラ
クトース−１−ボスフェート＋ＡＤＰ２ ガラクトース
−１−ホスフェート十〇ＤＰ−ＵＤＰ−ガラクトース＋
グルコース−１−ホスフェート ３、ＵＤＰ−ガラクト−７−五ｙノｊを”−＞ＵＤＰ−
グルコース 本明細書において用いられる「プロモーターＪなる語は
ＲＮＡポリメラーゼの結合および転写を可能とする構造
遺伝子の上流のいずれかの領域を意味する。
クトース−１−ボスフェート＋ＡＤＰ２ ガラクトース
−１−ホスフェート十〇ＤＰ−ＵＤＰ−ガラクトース＋
グルコース−１−ホスフェート ３、ＵＤＰ−ガラクト−７−五ｙノｊを”−＞ＵＤＰ−
グルコース 本明細書において用いられる「プロモーターＪなる語は
ＲＮＡポリメラーゼの結合および転写を可能とする構造
遺伝子の上流のいずれかの領域を意味する。
「構造遺伝子」なる語はｍＲＮＡの合成のための鋳型と
して働く、ペプチド用のコード付け配列を意味する。
して働く、ペプチド用のコード付け配列を意味する。
「オペロン」なる語は１つの酵素系の構成員として機能
的に関連した１つまたはｌ昨の酵素の合成に関与する１
群の密接に結合した遺伝子を意味する。オペロンはオペ
レーター遺伝子、いくつかの構造遺伝子（系中の酵素数
に等しい）および調節遺（云子からなる。「オペレータ
ー」または「オペレーター遺伝子」なる語はオペロン内
の隣接する構造遺伝子の生合成を制御するＤＮＡ配列を
意味する。
的に関連した１つまたはｌ昨の酵素の合成に関与する１
群の密接に結合した遺伝子を意味する。オペロンはオペ
レーター遺伝子、いくつかの構造遺伝子（系中の酵素数
に等しい）および調節遺（云子からなる。「オペレータ
ー」または「オペレーター遺伝子」なる語はオペロン内
の隣接する構造遺伝子の生合成を制御するＤＮＡ配列を
意味する。
「調節遺伝子」なる語は、活性（酵素誘導）または不活
性（酵素抑制）のいずれかにできるレプレッサーの生成
を通してオペロン内のオペレーター遺伝子を制御する遺
伝子を意味する。オペロンにおける構造遺伝子の転写は
、それ自体が以下の３径路の１つ以上で制御されるオペ
レーター遺伝子によりスイッチが入ったり、切れたりす
る。（１）誘導酵素系において、調節遺伝子により生成
され、細胞内または細胞外のどこかから由来するある代
謝産物またはシグナル物質（誘発物質）により、該誘発
物質の存在によりオペロンが活性になるように不活性化
できるレプレッサーによりオペロンがスイッチを切られ
る。または、（２）抑制酵素系において、調節遺伝子に
よって生成された不活性レプレッサーと、いずれかから
のコンプレッサーの組合せであり、コンプレッサーの存
在がオペロンを不活性にするようなレプレッサー−コン
プレッサー複合体によりオペロンがスイッチを切られる
。または、（３）活性遺伝子系において、ある代謝産物
またはシグナル物質によって活性化できる調節遺伝子に
よりプロモーターがスイッチを入れられる。
性（酵素抑制）のいずれかにできるレプレッサーの生成
を通してオペロン内のオペレーター遺伝子を制御する遺
伝子を意味する。オペロンにおける構造遺伝子の転写は
、それ自体が以下の３径路の１つ以上で制御されるオペ
レーター遺伝子によりスイッチが入ったり、切れたりす
る。（１）誘導酵素系において、調節遺伝子により生成
され、細胞内または細胞外のどこかから由来するある代
謝産物またはシグナル物質（誘発物質）により、該誘発
物質の存在によりオペロンが活性になるように不活性化
できるレプレッサーによりオペロンがスイッチを切られ
る。または、（２）抑制酵素系において、調節遺伝子に
よって生成された不活性レプレッサーと、いずれかから
のコンプレッサーの組合せであり、コンプレッサーの存
在がオペロンを不活性にするようなレプレッサー−コン
プレッサー複合体によりオペロンがスイッチを切られる
。または、（３）活性遺伝子系において、ある代謝産物
またはシグナル物質によって活性化できる調節遺伝子に
よりプロモーターがスイッチを入れられる。
ストレプトマイセスｇａｌオペロンはスト１／ブトマイ
セスのゲノム中に天然に存在する。
セスのゲノム中に天然に存在する。
「ストレプトマイセスｇａｌオペロン」なる語はＰｌプ
ロモーター、Ｐ２プロモーター、ｇａｌＴＳｇａｌＥお
よびｇａｌＫ構造遺伝子およびそのような構造遺伝子の
転写および翻訳に必要な池のいずれかの、調節領域から
なるストレプトマイセスのゲノムの領域を意味する。
ロモーター、Ｐ２プロモーター、ｇａｌＴＳｇａｌＥお
よびｇａｌＫ構造遺伝子およびそのような構造遺伝子の
転写および翻訳に必要な池のいずれかの、調節領域から
なるストレプトマイセスのゲノムの領域を意味する。
「調節領域」なる語はプロモーターまたはオペレーター
のようなり Ｎ Ａ配列を意味し、構造遺伝子の転写を
調節する。
のようなり Ｎ Ａ配列を意味し、構造遺伝子の転写を
調節する。
つぎのモデルはストレプトマイセスｇａｌオペロン内の
遺伝子発現について示す。Ｐｌプロモーターはガラクト
ース誘導プロモーターである（ずなわち、ガラクトース
の存在外に誘導され、グルコースの存在下に抑制されろ
）。Ｓｔデータによれば、Ｐ２プロモーターは構成性で
あり、すなわち、ガラクトースまたはいずれかの他の炭
素源の存在または非存在にかかわりなく、スイッチが入
っている。
遺伝子発現について示す。Ｐｌプロモーターはガラクト
ース誘導プロモーターである（ずなわち、ガラクトース
の存在外に誘導され、グルコースの存在下に抑制されろ
）。Ｓｔデータによれば、Ｐ２プロモーターは構成性で
あり、すなわち、ガラクトースまたはいずれかの他の炭
素源の存在または非存在にかかわりなく、スイッチが入
っている。
コスミソドｐＪＷ３５７（ストレプトマイセスおよびイ
ー・コリの両方において複製する能力をコード付けする
）を用いてストレプトマイセス・リビダンス１３２６Ｄ
ＮＡについてのコスミソド・ライブラリーを組み立てた
。ついで、このライブラリーを、バクテリオファージＰ
Ｉ形質導入ガラクトキナーゼ（ｇａｌＫ）変異を含むイ
ー・コリ株ＭＭ２９４の誘導体であろイー・コリに２＋
にトランスフェクションした。トランスフェクションし
た細胞を、コスミッドの存在および活性ｇａｌＫ遺伝子
の存在の両方用に選択した培地条件下て平板培養した。
ー・コリの両方において複製する能力をコード付けする
）を用いてストレプトマイセス・リビダンス１３２６Ｄ
ＮＡについてのコスミソド・ライブラリーを組み立てた
。ついで、このライブラリーを、バクテリオファージＰ
Ｉ形質導入ガラクトキナーゼ（ｇａｌＫ）変異を含むイ
ー・コリ株ＭＭ２９４の誘導体であろイー・コリに２＋
にトランスフェクションした。トランスフェクションし
た細胞を、コスミッドの存在および活性ｇａｌＫ遺伝子
の存在の両方用に選択した培地条件下て平板培養した。
弱い陽性コロニーを単離し、これらのコロニーから由来
するコスミッドＤＮＡをに２＋株に形質転換させる。こ
れらの形質転換は、ガラクトースを唯一の炭素源として
一貫した陽性増殖を生じる２つのコスミッドを生じた。
するコスミッドＤＮＡをに２＋株に形質転換させる。こ
れらの形質転換は、ガラクトースを唯一の炭素源として
一貫した陽性増殖を生じる２つのコスミッドを生じた。
これらのｇａｌＫ＝コスミッドを、ついで、本発明者
らにより、２−デオキンーガラクトース選択［ブラウナ
ーら、ノーン（Ｂｒａｗｎｅｒ ｅｔ ａｌ、 、Ｇｅ
ｎｅ）、４０゜１９１（１９８５）参照コを用い、ガラ
クトースを唯一の炭素源とする培地上で増殖しないとし
て単離されたストレプトマイセス宿主（すなわち、スト
レプトマイセス・リビダンス１３２６−１２Ｋ）に形質
転換した。ガラクトキナーゼを産生できるか、できない
かて株を区別する条件下、コスミッドのただ１つがスト
レプトマイセス・リビダンス＋３２６−１２に宿主をｇ
ａｌＫ＋とじた。さらに研究した結果、このコスミッド
がガラクトキナーゼ活性を有する遺伝子をコード付けす
ることが示された。Ｄ Ｎ Ａ配列分析および蛋白質研
究を含むその後の研究はこのストレプトマイセス遺伝子
はイー・コリおよび酵母ガラクトキナーゼ遺伝子と相同
性を有することが示された。調節研究はガラクトキナー
ゼ遺伝子をコード付けするコスミッドが染色体コード遺
伝子と同様な方法で調節することを示した。
らにより、２−デオキンーガラクトース選択［ブラウナ
ーら、ノーン（Ｂｒａｗｎｅｒ ｅｔ ａｌ、 、Ｇｅ
ｎｅ）、４０゜１９１（１９８５）参照コを用い、ガラ
クトースを唯一の炭素源とする培地上で増殖しないとし
て単離されたストレプトマイセス宿主（すなわち、スト
レプトマイセス・リビダンス１３２６−１２Ｋ）に形質
転換した。ガラクトキナーゼを産生できるか、できない
かて株を区別する条件下、コスミッドのただ１つがスト
レプトマイセス・リビダンス＋３２６−１２に宿主をｇ
ａｌＫ＋とじた。さらに研究した結果、このコスミッド
がガラクトキナーゼ活性を有する遺伝子をコード付けす
ることが示された。Ｄ Ｎ Ａ配列分析および蛋白質研
究を含むその後の研究はこのストレプトマイセス遺伝子
はイー・コリおよび酵母ガラクトキナーゼ遺伝子と相同
性を有することが示された。調節研究はガラクトキナー
ゼ遺伝子をコード付けするコスミッドが染色体コード遺
伝子と同様な方法で調節することを示した。
ストレプトマイセス・リビダンスｇａｌオペロンは当初
、ストレプトマイセス・リビダンス１３２６の約９キロ
ベース（Ｋ ｂ）域から単離された。該ストレプトマイ
セスｇａｌオペロンを含有するストレプトマイセス・リ
ビダンス１３２６の約９Ｋｂ域は実質的に表Ａのような
地図位置で示される。
、ストレプトマイセス・リビダンス１３２６の約９キロ
ベース（Ｋ ｂ）域から単離された。該ストレプトマイ
セスｇａｌオペロンを含有するストレプトマイセス・リ
ビダンス１３２６の約９Ｋｂ域は実質的に表Ａのような
地図位置で示される。
「実質的」なる後は、（１）制限部位の…対位置が概略
であること、（２）他に有色な影響をオペロンに及ぼさ
ずに変異により１つ以上の制限部位が失なわれ、または
得られうろこと、および（３）示した酵素、特に、テス
トしなかった酵素に対する追加の部位が存在していても
よいことを色味する。本明細書で用いる制限酵素は商業
的に入手できろ。
であること、（２）他に有色な影響をオペロンに及ぼさ
ずに変異により１つ以上の制限部位が失なわれ、または
得られうろこと、および（３）示した酵素、特に、テス
トしなかった酵素に対する追加の部位が存在していても
よいことを色味する。本明細書で用いる制限酵素は商業
的に入手できろ。
全て、ロバーツ、ヌクレアーゼ・アシツズ・リサーチ（
Ｎｕｃ、Ａｃ１ｄｓ、Ｒｅｓ、）、 １０ （５）：ｐ
ｌ Ｉ ７ （１９８２］こ８己載されている。
Ｎｕｃ、Ａｃ１ｄｓ、Ｒｅｓ、）、 １０ （５）：ｐ
ｌ Ｉ ７ （１９８２］こ８己載されている。
表 Ａ
地図位置 制限酵素 位置（Ｋ ｂ）Ｉ
ＨｉｎｄＩＩ［−，４０１ａ
ＮｒｕＩ ０２ Ｂｇ
ｌ［Ｉ 、７５３ ＥｃｏＲｌ
１．０５４ ＰｖｕＩＩ
１．１５５ Ｍｌｕｌ ２．
３０６ Ｐｖｕｌｌ ２．８０７
ＥｃｏｎＩ ４．００８
Ｐｖｕｌｌ ４．１０８ａ Ｓ
ａｃ！ ４．２５９ ＰｖｕｒＩ
５．００１０ ＸｈｏＩ
５．５０１１ Ｂａｍ１（１５，８０
１２Ｂａｍ１−１１ ６．５０ １３ Ｍｌｕ［６，９０ １３ａ ＰｖｕＩＩ ７．２０１４
Ｍｌｕｌ ７．８０１５
Ｂａｍ［−Ｉ Ｉ ８．００Ｉｆ３
５ｐｈｌ ８．３０第１図はストレプ
トマイセス・リビダンス１３２６ｇａｌオペロンの制限
エンドヌクレアーゼ地図を示し、オペロン内の構造遺伝
子（ｇａｌＴ、 ｇａｌＥおよびｇａｌＫ）およびブロ
モ−クー（ＰｌおよびＰ２）の位置を示す。
ＨｉｎｄＩＩ［−，４０１ａ
ＮｒｕＩ ０２ Ｂｇ
ｌ［Ｉ 、７５３ ＥｃｏＲｌ
１．０５４ ＰｖｕＩＩ
１．１５５ Ｍｌｕｌ ２．
３０６ Ｐｖｕｌｌ ２．８０７
ＥｃｏｎＩ ４．００８
Ｐｖｕｌｌ ４．１０８ａ Ｓ
ａｃ！ ４．２５９ ＰｖｕｒＩ
５．００１０ ＸｈｏＩ
５．５０１１ Ｂａｍ１（１５，８０
１２Ｂａｍ１−１１ ６．５０ １３ Ｍｌｕ［６，９０ １３ａ ＰｖｕＩＩ ７．２０１４
Ｍｌｕｌ ７．８０１５
Ｂａｍ［−Ｉ Ｉ ８．００Ｉｆ３
５ｐｈｌ ８．３０第１図はストレプ
トマイセス・リビダンス１３２６ｇａｌオペロンの制限
エンドヌクレアーゼ地図を示し、オペロン内の構造遺伝
子（ｇａｌＴ、 ｇａｌＥおよびｇａｌＫ）およびブロ
モ−クー（ＰｌおよびＰ２）の位置を示す。
表Ａおよび第１図から明らかなごとく、ストレプトマイ
セス・リビダンス１３２６ｇａｌオペロンのプロモータ
ーおよび構造遺伝子の位置は実質的に表Ｂのとおりであ
る。
セス・リビダンス１３２６ｇａｌオペロンのプロモータ
ーおよび構造遺伝子の位置は実質的に表Ｂのとおりであ
る。
表 Ｂ
位置（Ｋ ｂ）
ｐ ＋転写出発部位 、１０ｇａ
ｌ’ｒ翻訳開姶コドン 、１５Ｐ２
転写出発部位 １２５ｇａｌＥｖＡ
訳開始コドン １．５０ｇａｌＫ翻訳
開姶コドン ２４０ｇａｌＫの３′端
メツセージ ３．６０ストレプトマイセス属
の微生物は歴史的に製薬工業用の抗生物質源として用い
られてきた。その結果、そのような生成物産生用のヒヒ
クルとじてストレプトマイセスを用いる生物学的生成物
の製造のスケール・アップに必要な技術が現在利用でき
ろ。しかし、ストレプトマイセスが該新規組換型ＤＮＡ
技術を用いる生活性分子の生産用のビヒクルとして使用
できる前に、イー・コリで有用であることが示されたも
のと同様なストレプトマイセスにおける調節エレメント
を規定ずろ必要がある。これらの調節エレメントにはリ
ポソーム結合部位および調節転写エレメントが含まれる
。
ｌ’ｒ翻訳開姶コドン 、１５Ｐ２
転写出発部位 １２５ｇａｌＥｖＡ
訳開始コドン １．５０ｇａｌＫ翻訳
開姶コドン ２４０ｇａｌＫの３′端
メツセージ ３．６０ストレプトマイセス属
の微生物は歴史的に製薬工業用の抗生物質源として用い
られてきた。その結果、そのような生成物産生用のヒヒ
クルとじてストレプトマイセスを用いる生物学的生成物
の製造のスケール・アップに必要な技術が現在利用でき
ろ。しかし、ストレプトマイセスが該新規組換型ＤＮＡ
技術を用いる生活性分子の生産用のビヒクルとして使用
できる前に、イー・コリで有用であることが示されたも
のと同様なストレプトマイセスにおける調節エレメント
を規定ずろ必要がある。これらの調節エレメントにはリ
ポソーム結合部位および調節転写エレメントが含まれる
。
ストレプトマイセスにおけるｇａｌＥｌｇａｌＴ、また
はｇａｌＫ遺伝子または遺伝子生成物あるいはｇａｌオ
ペロンの存在は従来報告されていない。本発明、すなわ
ち、ストレプトマイセスｇａｌオペロンのクローニング
はストレプトマイセス、他のアクナノマイセス類および
他の宿主生物におけろ調節可能な発現／クローニングベ
クターの組み立てを可能にする。 さらに、本発明はス
トレプトマイセスｇａｌオペロンがポリジストロニック
であるとの発明を導いた。多分、ストレプトマイセスｇ
ａｌオペロンのクローニングの最も重要な特徴は、スト
レプトマイセスｇａｌＫ遺伝子の調節に必須な配列の存
在の観察である。発現系としてのイー・コリからのｌａ
ｃプロモーターの最初の使用と直接相似させることがで
きる。事実、ブロシウスら、プロシーディンゲス・オブ
・ナショナル・アカデミ−・才ブ・サイエンス・ニー・
ニス・エイ（Ｂｒｏｓｉｕｓｅｔ ａｌ、 、Ｐｒｏｃ
、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ、 Ｓ、 Ａ、）８
１．６９２９〜６９３３（＋９８４）はイー・コリｌａ
ｃプロモーターの調節エレメントを利用して極端に強い
イー・コリ・リポソーム・プロモーターを調節している
。ストレプトマイセスｇａｌオペロン・リポソーム・プ
ロモーターも極端に強いようなので、そのようなプロモ
ーターはストレプトマイセス、他のアクナノマイセス類
および他の宿主生物において非常に有用な調節可能な発
現ベクターの組み立を可能にする。本発明はまた、イー
・コリにおいてｇａｌＫ変異株の選択に用いられていた
２−デオキシガラクトース選択がストレプトマイセスに
おけるｇａｌＫ変異株の選択にも作動するという予期せ
ぬ発見を可能にした［ブラウナーら・ジーン［Ｂｒａｗ
ｎｅｒ ｅｔ ａｌ、 、Ｇｅｎｅ）４０ 、１９１（
１９８５）参照］。この観察は、以下に記載するごとく
、ストレプトマイセスｇａｌＫ遺伝子およびそのニスミ
ツド上への転写、翻訳に必要な調節領域のクローン能力
と組み合わさって、相同組換により、ストレプトマイセ
スの染色体に位置したｇａｌＫ遺伝子への構造遺伝子の
直接挿入を可能にする。この操作は分子生物学者が興味
のあるＤＮＡフラグメントをストレプトマイセスの染色
体に安定して挿入することを可能にする。このアプロー
チは研究者が、現在、大部分のストレプトマイセス発現
ベクターにより要求されているような抗生物質選択を続
ける必要なしに、興味あるストレプトマイセス株にタッ
グ付けらしくはマーク付けをしたり、該生物に発現カセ
ットを挿入することを可能にする。
はｇａｌＫ遺伝子または遺伝子生成物あるいはｇａｌオ
ペロンの存在は従来報告されていない。本発明、すなわ
ち、ストレプトマイセスｇａｌオペロンのクローニング
はストレプトマイセス、他のアクナノマイセス類および
他の宿主生物におけろ調節可能な発現／クローニングベ
クターの組み立てを可能にする。 さらに、本発明はス
トレプトマイセスｇａｌオペロンがポリジストロニック
であるとの発明を導いた。多分、ストレプトマイセスｇ
ａｌオペロンのクローニングの最も重要な特徴は、スト
レプトマイセスｇａｌＫ遺伝子の調節に必須な配列の存
在の観察である。発現系としてのイー・コリからのｌａ
ｃプロモーターの最初の使用と直接相似させることがで
きる。事実、ブロシウスら、プロシーディンゲス・オブ
・ナショナル・アカデミ−・才ブ・サイエンス・ニー・
ニス・エイ（Ｂｒｏｓｉｕｓｅｔ ａｌ、 、Ｐｒｏｃ
、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ、 Ｓ、 Ａ、）８
１．６９２９〜６９３３（＋９８４）はイー・コリｌａ
ｃプロモーターの調節エレメントを利用して極端に強い
イー・コリ・リポソーム・プロモーターを調節している
。ストレプトマイセスｇａｌオペロン・リポソーム・プ
ロモーターも極端に強いようなので、そのようなプロモ
ーターはストレプトマイセス、他のアクナノマイセス類
および他の宿主生物において非常に有用な調節可能な発
現ベクターの組み立を可能にする。本発明はまた、イー
・コリにおいてｇａｌＫ変異株の選択に用いられていた
２−デオキシガラクトース選択がストレプトマイセスに
おけるｇａｌＫ変異株の選択にも作動するという予期せ
ぬ発見を可能にした［ブラウナーら・ジーン［Ｂｒａｗ
ｎｅｒ ｅｔ ａｌ、 、Ｇｅｎｅ）４０ 、１９１（
１９８５）参照］。この観察は、以下に記載するごとく
、ストレプトマイセスｇａｌＫ遺伝子およびそのニスミ
ツド上への転写、翻訳に必要な調節領域のクローン能力
と組み合わさって、相同組換により、ストレプトマイセ
スの染色体に位置したｇａｌＫ遺伝子への構造遺伝子の
直接挿入を可能にする。この操作は分子生物学者が興味
のあるＤＮＡフラグメントをストレプトマイセスの染色
体に安定して挿入することを可能にする。このアプロー
チは研究者が、現在、大部分のストレプトマイセス発現
ベクターにより要求されているような抗生物質選択を続
ける必要なしに、興味あるストレプトマイセス株にタッ
グ付けらしくはマーク付けをしたり、該生物に発現カセ
ットを挿入することを可能にする。
本発明はストレプトマイセスｇａｌオペロンまたはその
いずれかの調節可能な、官能性誘導体からなる組換型Ｄ
ＮＡ分子に関する。
いずれかの調節可能な、官能性誘導体からなる組換型Ｄ
ＮＡ分子に関する。
「調節可能な、官能性誘導体」なる語はｇａｌＴ、ｇａ
ｌＥおよびｇａｌＫ遺伝子生成物の調節可能な生成につ
いて天然のストレプトマイセスｇａｌオペロンと実質的
に同じに機能するストレプトマイセスｇａｌオペロンの
いずれかの誘導体を意味する。このような誘導体にはｇ
ａｌオペロンの部分的配列およびｇａｌオペロン・コー
ド付け配列の修飾によって生成された誘導体が包含され
る。公知のｇａｌオペロン修飾技術には、例えば、化学
的変異誘発剤での処理、照射または、酵素または組換技
術を用いる挿入、欠失または核酸置換のような直接遺伝
子操作が包含される。天然に生じるストレプトマイセス
ｇａｌオペロンは本明細書に記載する技術を用いていず
れかのガラクトース利用ストレプトマイセス株から単離
てきる。種々のストレプトマイセス種の多くの株が多く
の源から公に入手可能である。例えば、米国、メリーラ
ンド州、ロックビルのアメリカン・タイプ・カルチャー
・コレクション（ＡＴＣＣ）は公家が人手可能な約４０
０種のストレプトマイセスを有している。ストレプトマ
イセスの個々の株のグルコースを利用する能力は、その
株を、ガラクトースを唯一の炭素源として含有する培地
上で増殖させるような通常の技術によって容易に測定で
きる。ｇａｌオペロンを単離するのに好ましいストレプ
トマイセス種には、ストレプトマイセス・リビダンス、
ストレプトマイセス・コエリカラー、ストレプトマイセ
ス・アズラエウス（Ｓ 、ａｚｕｒａｅｕｓ）、ストレ
プトマイセス・アルブス（Ｓ 、ａｌｂｕｓ：）、スト
レプトマイセス・カルヂノスタティクス（Ｓ 、ｃａｒ
ｚｉｎｏｓｔａｔｉｃｕｓ）、ストレプトマイセス・ア
ンチフィブリノリチクス（Ｓ、ａｎｔｉ−ｆｉｂｒｉｎ
ｏｌｙｔｉｃｕｓ）およびストレプトマイセス−ａンギ
スボルス（Ｓ 、 ｌｏｎｇｉｓｐｏｒｕｓ）が包含さ
れる。ストレプトマイセス・リビダンスが最も好ましい
。
ｌＥおよびｇａｌＫ遺伝子生成物の調節可能な生成につ
いて天然のストレプトマイセスｇａｌオペロンと実質的
に同じに機能するストレプトマイセスｇａｌオペロンの
いずれかの誘導体を意味する。このような誘導体にはｇ
ａｌオペロンの部分的配列およびｇａｌオペロン・コー
ド付け配列の修飾によって生成された誘導体が包含され
る。公知のｇａｌオペロン修飾技術には、例えば、化学
的変異誘発剤での処理、照射または、酵素または組換技
術を用いる挿入、欠失または核酸置換のような直接遺伝
子操作が包含される。天然に生じるストレプトマイセス
ｇａｌオペロンは本明細書に記載する技術を用いていず
れかのガラクトース利用ストレプトマイセス株から単離
てきる。種々のストレプトマイセス種の多くの株が多く
の源から公に入手可能である。例えば、米国、メリーラ
ンド州、ロックビルのアメリカン・タイプ・カルチャー
・コレクション（ＡＴＣＣ）は公家が人手可能な約４０
０種のストレプトマイセスを有している。ストレプトマ
イセスの個々の株のグルコースを利用する能力は、その
株を、ガラクトースを唯一の炭素源として含有する培地
上で増殖させるような通常の技術によって容易に測定で
きる。ｇａｌオペロンを単離するのに好ましいストレプ
トマイセス種には、ストレプトマイセス・リビダンス、
ストレプトマイセス・コエリカラー、ストレプトマイセ
ス・アズラエウス（Ｓ 、ａｚｕｒａｅｕｓ）、ストレ
プトマイセス・アルブス（Ｓ 、ａｌｂｕｓ：）、スト
レプトマイセス・カルヂノスタティクス（Ｓ 、ｃａｒ
ｚｉｎｏｓｔａｔｉｃｕｓ）、ストレプトマイセス・ア
ンチフィブリノリチクス（Ｓ、ａｎｔｉ−ｆｉｂｒｉｎ
ｏｌｙｔｉｃｕｓ）およびストレプトマイセス−ａンギ
スボルス（Ｓ 、 ｌｏｎｇｉｓｐｏｒｕｓ）が包含さ
れる。ストレプトマイセス・リビダンスが最も好ましい
。
ストレプトマイセスｇａｌオペロンおよびそのより小さ
い部分は他の細胞および生物から相同な配列を得るため
の核酸プローブとして有用である。ストレプトマイセス
ｇａｌオペロンはまた、適当な宿主変異株における選択
マーカーとして、また、調節エレメントの提供に有用で
ある。「適当な宿主変異株」なる語は、（ａ）ｇａｌオ
ペロンを含まないか、（ｂ）非官能性ｇａｌオペロンを
含有するか、（ｃ）欠損ＰＩプロモーター、Ｐ２プロモ
ーター、ｇａｌＴ遺伝子、ｇａｌＫ遺伝子および／また
はｇａｌＥ遺伝子のような、ストレプトマイセスｇａｌ
からなる相同構造遺伝子または調節領域内に欠損を含む
ためにガラクトースを利用しない宿主を意味する。かく
して、通常の技術で調製てきる組換型Ｄ Ｎ Ａ分子（
ストレプトマイセスｇａｌオペロノおよびそれに作動的
に結合した異種官能性ＤＮＡ配列からなる）は、相同組
換によって宿主ゲノムに取り込むための通常の技術によ
って適当な宿主へ形質転換てき、高価な抗生物質選択を
続ける必要なしに該異種官能性Ｄ Ｎ Ａ配列の調節可
能な発現を可能にする。したがって、そのようなオペロ
ンはまた、高価な抗生物質選択を続ける必要なく、当該
ベクターで形質転換した適当な宿主変異株において該オ
ペロンに作動的に結合する異種官能性ＤＮＡ配列の調節
可能な発現用の組換型ＤＮ八へ現ベクター上に取り込ま
れうる。そのようなオペロンはまた、ガラクトースを利
用しないストレプトマイセス、他のアクチノマイセスお
よびｇａｌ−イー・コリ味のような他の原核生物のよう
な細胞、ウィルスおよび微生物をガラクトース利用性株
に形質転換するのに有用である。この形質転換は形質転
換宿主に対して多面的効果を有しうる。「官能性ＤＮＡ
配列」なる語はそれによって形質転換された宿主生物に
おいて遺伝子発現ユニット、構造遺伝子、プロモーター
または調節領域として機能するストレプトマイセスまた
は他のいずれかの源から直接または間接に誘導されるＤ
ＮＡのいずれかの分離領域を意味する。好ましい官能性
Ｄ Ｎ Ａ配列には、限定するものてはないが、インシ
ュリン、生長ホルモン、組織プラスミノーゲン・アクチ
ベータ、α−１−抗トリプシンまたはワクヂン製造に用
いる抗原のような医薬上重要なポリペプチドをコード付
けするものが包含される。「異種官能性ＤＮＡ配列」な
る語はストレプトマイセスｇａｌオペロン・コード付け
領域から誘導されない官能性Ｄ Ｎ Ａ配列を意味する
。
い部分は他の細胞および生物から相同な配列を得るため
の核酸プローブとして有用である。ストレプトマイセス
ｇａｌオペロンはまた、適当な宿主変異株における選択
マーカーとして、また、調節エレメントの提供に有用で
ある。「適当な宿主変異株」なる語は、（ａ）ｇａｌオ
ペロンを含まないか、（ｂ）非官能性ｇａｌオペロンを
含有するか、（ｃ）欠損ＰＩプロモーター、Ｐ２プロモ
ーター、ｇａｌＴ遺伝子、ｇａｌＫ遺伝子および／また
はｇａｌＥ遺伝子のような、ストレプトマイセスｇａｌ
からなる相同構造遺伝子または調節領域内に欠損を含む
ためにガラクトースを利用しない宿主を意味する。かく
して、通常の技術で調製てきる組換型Ｄ Ｎ Ａ分子（
ストレプトマイセスｇａｌオペロノおよびそれに作動的
に結合した異種官能性ＤＮＡ配列からなる）は、相同組
換によって宿主ゲノムに取り込むための通常の技術によ
って適当な宿主へ形質転換てき、高価な抗生物質選択を
続ける必要なしに該異種官能性Ｄ Ｎ Ａ配列の調節可
能な発現を可能にする。したがって、そのようなオペロ
ンはまた、高価な抗生物質選択を続ける必要なく、当該
ベクターで形質転換した適当な宿主変異株において該オ
ペロンに作動的に結合する異種官能性ＤＮＡ配列の調節
可能な発現用の組換型ＤＮ八へ現ベクター上に取り込ま
れうる。そのようなオペロンはまた、ガラクトースを利
用しないストレプトマイセス、他のアクチノマイセスお
よびｇａｌ−イー・コリ味のような他の原核生物のよう
な細胞、ウィルスおよび微生物をガラクトース利用性株
に形質転換するのに有用である。この形質転換は形質転
換宿主に対して多面的効果を有しうる。「官能性ＤＮＡ
配列」なる語はそれによって形質転換された宿主生物に
おいて遺伝子発現ユニット、構造遺伝子、プロモーター
または調節領域として機能するストレプトマイセスまた
は他のいずれかの源から直接または間接に誘導されるＤ
ＮＡのいずれかの分離領域を意味する。好ましい官能性
Ｄ Ｎ Ａ配列には、限定するものてはないが、インシ
ュリン、生長ホルモン、組織プラスミノーゲン・アクチ
ベータ、α−１−抗トリプシンまたはワクヂン製造に用
いる抗原のような医薬上重要なポリペプチドをコード付
けするものが包含される。「異種官能性ＤＮＡ配列」な
る語はストレプトマイセスｇａｌオペロン・コード付け
領域から誘導されない官能性Ｄ Ｎ Ａ配列を意味する
。
本発明はまた、ストレプトマイセスｇａｌオペロンＰ２
プロモーター発現ユニットまたはそのいずれかの官能性
誘導体からなる組換型ＤＮＡ分子に関する。ｒＰ２プロ
モーター発現ユニット」なる語はストレプトマイセスｇ
ａｌオペロンＰ２プロモーター、ｇａｌＥおよびｇａｌ
Ｋ構造遺伝子およびそのような構造遺伝子の転写および
翻訳に必要な曲のいずれかの調節領域からなるストレプ
トマイセスｇａｌオペロンの領域を意味する。［官能性
誘導体ｊなる語は、ストレプトマイセスｇａｌオペロン
ｇａｌＥおよびｇａｌＫ遺伝子生成物の生成について天
然に生じる領域と実質的に同じに機能するストレプトマ
イセスｇａｌオペロンＰ２プロモーター発現ユニットの
いずれかの誘導体を意味する。このような誘導体にはス
トレプトマイセスｇａｌオペロンＰ２プロモーター発現
ユニットの部分配列およびストレプトマイセスｇａｌオ
ペロンＰ２プロモーター発現ユニット・コード付け配列
の修飾によって得られろ誘導体が包含される。そのよう
な修飾を行なう技術は公知であり、いくつかは前記した
。天然に生じろストレプトマイセスｇａｌオペロンＰ２
ブロモーター発現ユニットは通常の技術により天然のス
トレプトマイセスｇａｌオペロンから単離できる。
プロモーター発現ユニットまたはそのいずれかの官能性
誘導体からなる組換型ＤＮＡ分子に関する。ｒＰ２プロ
モーター発現ユニット」なる語はストレプトマイセスｇ
ａｌオペロンＰ２プロモーター、ｇａｌＥおよびｇａｌ
Ｋ構造遺伝子およびそのような構造遺伝子の転写および
翻訳に必要な曲のいずれかの調節領域からなるストレプ
トマイセスｇａｌオペロンの領域を意味する。［官能性
誘導体ｊなる語は、ストレプトマイセスｇａｌオペロン
ｇａｌＥおよびｇａｌＫ遺伝子生成物の生成について天
然に生じる領域と実質的に同じに機能するストレプトマ
イセスｇａｌオペロンＰ２プロモーター発現ユニットの
いずれかの誘導体を意味する。このような誘導体にはス
トレプトマイセスｇａｌオペロンＰ２プロモーター発現
ユニットの部分配列およびストレプトマイセスｇａｌオ
ペロンＰ２プロモーター発現ユニット・コード付け配列
の修飾によって得られろ誘導体が包含される。そのよう
な修飾を行なう技術は公知であり、いくつかは前記した
。天然に生じろストレプトマイセスｇａｌオペロンＰ２
ブロモーター発現ユニットは通常の技術により天然のス
トレプトマイセスｇａｌオペロンから単離できる。
ストレプトマイセスｇａｌオペロンＰ２発現ユニットは
適当な宿主変異株における選択マーカーとして、また、
調節エレメントの提供に有用である。
適当な宿主変異株における選択マーカーとして、また、
調節エレメントの提供に有用である。
「適当な宿主変異株」なる語は、欠損Ｐ２プロモーター
、ｇａｌＥ遺伝子および／またはｇａｌＫ遺伝子のよう
な、ストレプトマイセスＰ２プロモーター発現ユニット
からなる相同構造遺伝子または調節領域内に欠失を含む
ためガラクトースを利用できない店主を意味する。かく
して、通常の技術で調整てきろ組換型ＤＮＡ分子（スト
レプトマイセスｇａｌオペロンＩ） ２プロモ一ター発
現ユニットおよびそれに作動的に結合した異質官能性Ｄ
ＮＡ配列からなる）は相同組換による宿主ゲノムへの取
り込み用の通常の技術により適当な宿主変異株へ形質転
換でき、高価な抗生物質選択を続けることなく、該異種
官能性ＤＮＡ配列の構成的発現を可能にする。そのよう
な発現ユニットは異種官能性ＤＮＡ配列の構成的発現用
の組換型ＤＮＡ発現ベクター上に取り込まれうる。スト
レプトマイセスｇａｌオペロンＰ２プロモーター発現ユ
ニシトはまた、適当な宿主変冗株の相捕に有用であり、
ついで、高価な抗生物質選択を続けろ必要のない、当該
ベクターで形質転換された適当な宿主変異株においてそ
のような発現ユニットに作動的に結合した異種官能性Ｄ
ＮＡ配列の構成的発現に使用される。
、ｇａｌＥ遺伝子および／またはｇａｌＫ遺伝子のよう
な、ストレプトマイセスＰ２プロモーター発現ユニット
からなる相同構造遺伝子または調節領域内に欠失を含む
ためガラクトースを利用できない店主を意味する。かく
して、通常の技術で調整てきろ組換型ＤＮＡ分子（スト
レプトマイセスｇａｌオペロンＩ） ２プロモ一ター発
現ユニットおよびそれに作動的に結合した異質官能性Ｄ
ＮＡ配列からなる）は相同組換による宿主ゲノムへの取
り込み用の通常の技術により適当な宿主変異株へ形質転
換でき、高価な抗生物質選択を続けることなく、該異種
官能性ＤＮＡ配列の構成的発現を可能にする。そのよう
な発現ユニットは異種官能性ＤＮＡ配列の構成的発現用
の組換型ＤＮＡ発現ベクター上に取り込まれうる。スト
レプトマイセスｇａｌオペロンＰ２プロモーター発現ユ
ニシトはまた、適当な宿主変冗株の相捕に有用であり、
ついで、高価な抗生物質選択を続けろ必要のない、当該
ベクターで形質転換された適当な宿主変異株においてそ
のような発現ユニットに作動的に結合した異種官能性Ｄ
ＮＡ配列の構成的発現に使用される。
本発明はストレプトマイセスｇａｌオペロンＰｌプロモ
ーター調節領域またはそのいずれかの調節可能な官能性
誘導体からなる組換型ＤＮＡ分子にも関する。ｒＰｌプ
ロモーター調節領域」なる語はストレプトマイセスｇａ
ｌオペロンＰＩプロモーター、ｇａｌＴ、 ｇａｌＥお
よびｇａｌＫ構造遺伝子ならびにそのような構造遺伝子
の転写および翻訳に必要な池のいずれかの調節領域から
なるストレプトマイセスｇａｌオペロンの領域を意味す
る。「調節可能な、官能的誘導体」なる語は、ストレプ
トマイセスｇａｌオペロンｇａｌＴ１８ａｌＥ、および
ｇａｌＫａ伝子生成物子生成物能な生成に関し、天然に
生じる領域と実質的に同じに機能するストレプトマイセ
スｇａｌオペロンＰＩプロモーター調節領域のいずれか
の誘導体を意味する。このような誘導体にはストレプト
マイセスｇａｌオペロンＰ１プロモーター調節領域の部
分配列およびストレプトマイセスｇａｌオペロンＰＩプ
ロモーター調節領域コード付け配列の修飾により生成さ
れる誘導体が包含される。そのような修飾を行なう技術
は公知であり、いくつかは前記した、天然に生じるスト
レプトマイセスｇａｌオペロンＰ１プロモーター調節領
域は、天然に生じるストレプトマイセスｇａｌオペロン
からのＰ２プロモーターの切除、点突然変異によるＰ２
プロモーターの不活化またはプロモーター内への異種Ｄ
Ｎ Ａ配列の挿入のような通常の技術により、天然に
生じろストレプトマイセスｇａｌオペロンから単離でき
る。ストレプトマイセスｇａｌオペロンＩ） ］プロモ
ーター調調節域はストレプトマイセスｇａｌオペロンに
ついて前記した用途に有用である。
ーター調節領域またはそのいずれかの調節可能な官能性
誘導体からなる組換型ＤＮＡ分子にも関する。ｒＰｌプ
ロモーター調節領域」なる語はストレプトマイセスｇａ
ｌオペロンＰＩプロモーター、ｇａｌＴ、 ｇａｌＥお
よびｇａｌＫ構造遺伝子ならびにそのような構造遺伝子
の転写および翻訳に必要な池のいずれかの調節領域から
なるストレプトマイセスｇａｌオペロンの領域を意味す
る。「調節可能な、官能的誘導体」なる語は、ストレプ
トマイセスｇａｌオペロンｇａｌＴ１８ａｌＥ、および
ｇａｌＫａ伝子生成物子生成物能な生成に関し、天然に
生じる領域と実質的に同じに機能するストレプトマイセ
スｇａｌオペロンＰＩプロモーター調節領域のいずれか
の誘導体を意味する。このような誘導体にはストレプト
マイセスｇａｌオペロンＰ１プロモーター調節領域の部
分配列およびストレプトマイセスｇａｌオペロンＰＩプ
ロモーター調節領域コード付け配列の修飾により生成さ
れる誘導体が包含される。そのような修飾を行なう技術
は公知であり、いくつかは前記した、天然に生じるスト
レプトマイセスｇａｌオペロンＰ１プロモーター調節領
域は、天然に生じるストレプトマイセスｇａｌオペロン
からのＰ２プロモーターの切除、点突然変異によるＰ２
プロモーターの不活化またはプロモーター内への異種Ｄ
Ｎ Ａ配列の挿入のような通常の技術により、天然に
生じろストレプトマイセスｇａｌオペロンから単離でき
る。ストレプトマイセスｇａｌオペロンＩ） ］プロモ
ーター調調節域はストレプトマイセスｇａｌオペロンに
ついて前記した用途に有用である。
また、本発明はストレプトマイセスｇａｌオペロンＰ２
プロモーターまたはそのいずれかの官能性誘導体からな
る組換型ＤＮＡ分子に関する。「官能性誘導体」なる語
は、ＲＮＡポリメラーゼの結合および当該プロモーター
に作動的に結合した官能性ＤＮＡ配列の転写を可能する
について天然に生じるＰ２プロモーターと実質的に同じ
に機能するストレプトマイセスｇａｌオペロンＰ２プロ
モーターのいずれかの誘導体を意味する。このような誘
導体にはストレプトマイセスｇａｌオペロンＰ２プロモ
ーターの部分配列およびｇａｌオペロンＰ２プロモータ
ー・コード付け配列の修飾によって生じた誘導体が包含
される。そのような修飾を行なう技術は公知であり、い
くつかは前記した。天然に生じるストレプトマイセスｇ
ａｌオペロンＰ２プロモーターは通常の技術により、天
然に生じたストレプトマイセスｇａｌオペロンから単離
できる。
プロモーターまたはそのいずれかの官能性誘導体からな
る組換型ＤＮＡ分子に関する。「官能性誘導体」なる語
は、ＲＮＡポリメラーゼの結合および当該プロモーター
に作動的に結合した官能性ＤＮＡ配列の転写を可能する
について天然に生じるＰ２プロモーターと実質的に同じ
に機能するストレプトマイセスｇａｌオペロンＰ２プロ
モーターのいずれかの誘導体を意味する。このような誘
導体にはストレプトマイセスｇａｌオペロンＰ２プロモ
ーターの部分配列およびｇａｌオペロンＰ２プロモータ
ー・コード付け配列の修飾によって生じた誘導体が包含
される。そのような修飾を行なう技術は公知であり、い
くつかは前記した。天然に生じるストレプトマイセスｇ
ａｌオペロンＰ２プロモーターは通常の技術により、天
然に生じたストレプトマイセスｇａｌオペロンから単離
できる。
通常の技術で調製できる組換型Ｄ Ｎ Ａ分子（ストレ
プトマイセスｇａｌオペロンＰ２プロモーターよ３よび
それに作動的に結合した異種官能性Ｄ Ｎ Ａ配列から
なる）は相同組換によって宿主ゲノムへ取り込むための
通常の技術によって適当な宿主へ形質転換でき、異種官
能性Ｄ Ｎ Ａ配列の構成的発現を可能にする。ストレ
プトマイセスｇａｌオペロンＰ２プロモーターはまた、
当該ベクターで形質転換したウィルスおよび有核または
原核細胞または生物、特にストレプトマイセスまたは他
のアクナノマイセス類において作動的に結合した異種官
能性ＤＮＡ配列の構成的発現用の組換型ＤＮＡ発現ベク
ターへの取り込みに有用である。
プトマイセスｇａｌオペロンＰ２プロモーターよ３よび
それに作動的に結合した異種官能性Ｄ Ｎ Ａ配列から
なる）は相同組換によって宿主ゲノムへ取り込むための
通常の技術によって適当な宿主へ形質転換でき、異種官
能性Ｄ Ｎ Ａ配列の構成的発現を可能にする。ストレ
プトマイセスｇａｌオペロンＰ２プロモーターはまた、
当該ベクターで形質転換したウィルスおよび有核または
原核細胞または生物、特にストレプトマイセスまたは他
のアクナノマイセス類において作動的に結合した異種官
能性ＤＮＡ配列の構成的発現用の組換型ＤＮＡ発現ベク
ターへの取り込みに有用である。
本発明はまた、ストレプトマイセスｇａｌオペロンＰｌ
プロモーターまたはそのいずれかの調節可能な官能性誘
導体からなる組換型ＤＮＡ分子からなる。「調節可能な
官能性誘導体」なる語は、ＲＮＡポリメラーゼの結合を
可能にし、そのようなプロモーターに作動的に結合した
官能性ＤＮＡ配列の転写を調節するについて天然に生じ
るＰ１プロモーターと実質的に同じに機能するストレプ
トマイセスｇａｌオペロンＰ１プロモーターのいずれか
の誘導体を意味する。このような誘導体にはストレプト
マイセスｇａｌオペロンＰ１プロモーターの部分配列と
、ｇａｌオペロンＰｉプロモーター・コード付け配列の
修飾により生成する誘導体が包含される。このような修
飾を行なう技術は公知であり、いくつかは前記した。天
然に生じるストレプトマイセスｇａｌオペロンＰ１プロ
モーターは通常の技術により天然に生じるストレプトマ
イセスｇａｌオペロンから単離できる。通常の技術て調
製てきる組換型ＤＮＡ分子（ストレプトマイセスｇａｌ
オペロンＰ１プロモーターおよびそれに作動的に結合し
た異種官能性ＤＮＡ配列からなる）は、相同組換による
宿主ゲノムに取り込む通常の技術によって適当な宿主変
異株へ形質転換でき、異種官能性ＤＮＡ配列の調節可能
な発現を可能にする。
プロモーターまたはそのいずれかの調節可能な官能性誘
導体からなる組換型ＤＮＡ分子からなる。「調節可能な
官能性誘導体」なる語は、ＲＮＡポリメラーゼの結合を
可能にし、そのようなプロモーターに作動的に結合した
官能性ＤＮＡ配列の転写を調節するについて天然に生じ
るＰ１プロモーターと実質的に同じに機能するストレプ
トマイセスｇａｌオペロンＰ１プロモーターのいずれか
の誘導体を意味する。このような誘導体にはストレプト
マイセスｇａｌオペロンＰ１プロモーターの部分配列と
、ｇａｌオペロンＰｉプロモーター・コード付け配列の
修飾により生成する誘導体が包含される。このような修
飾を行なう技術は公知であり、いくつかは前記した。天
然に生じるストレプトマイセスｇａｌオペロンＰ１プロ
モーターは通常の技術により天然に生じるストレプトマ
イセスｇａｌオペロンから単離できる。通常の技術て調
製てきる組換型ＤＮＡ分子（ストレプトマイセスｇａｌ
オペロンＰ１プロモーターおよびそれに作動的に結合し
た異種官能性ＤＮＡ配列からなる）は、相同組換による
宿主ゲノムに取り込む通常の技術によって適当な宿主変
異株へ形質転換でき、異種官能性ＤＮＡ配列の調節可能
な発現を可能にする。
また、ストレプトマイセスｇａｌオペロンＰｌプロモー
ターは、当該ベクターで形質転換されたウィルスおよび
有核または原核細胞または生物、特に、ストレプトマイ
セスまたは池のアクナノマイセス類において作動的に結
合した異種官能性ＤＮＡ配列の調節可能な発現用組換型
ＤＮＡ発現ベクターへの取り込みにも有用である。
ターは、当該ベクターで形質転換されたウィルスおよび
有核または原核細胞または生物、特に、ストレプトマイ
セスまたは池のアクナノマイセス類において作動的に結
合した異種官能性ＤＮＡ配列の調節可能な発現用組換型
ＤＮＡ発現ベクターへの取り込みにも有用である。
また、本発明はストレプトマイセスｇａｌオペロンｇａ
ｌＥ、 ｇａｌＴまたはｇａｌＥ遺伝子またはそのいず
れかの官能性誘導体からなる組換型ＤＮＡ分子にら関す
る。「官能性誘導体」なる語は活性ｇａｌＥ、ｇａｌＴ
またはｇａｌＫ型還元子生成物の生成について天然に生
じろ遺伝子と実質的に同じに機能するストレプトマイセ
スｇａｌオペロンｇａｌＥ、 ｇａｌＴまたはｇａｌＫ
遺伝子のいずれかの誘導体を意味する。
ｌＥ、 ｇａｌＴまたはｇａｌＥ遺伝子またはそのいず
れかの官能性誘導体からなる組換型ＤＮＡ分子にら関す
る。「官能性誘導体」なる語は活性ｇａｌＥ、ｇａｌＴ
またはｇａｌＫ型還元子生成物の生成について天然に生
じろ遺伝子と実質的に同じに機能するストレプトマイセ
スｇａｌオペロンｇａｌＥ、 ｇａｌＴまたはｇａｌＫ
遺伝子のいずれかの誘導体を意味する。
このような誘導体にはストレプトマイセスｇａｌオペロ
ンｇａｌＥＳｇａｌＴまたはｇａｌＫ遺伝子の部分配列
およびｇａｌオペロン配列の修飾によって得られる誘導
体が包含される。このような修飾を行なう技術は公知で
あり、いくつかは前記した。天然に生じるストレプトマ
イセスｇａｌオペロンｇａｌＥ。
ンｇａｌＥＳｇａｌＴまたはｇａｌＫ遺伝子の部分配列
およびｇａｌオペロン配列の修飾によって得られる誘導
体が包含される。このような修飾を行なう技術は公知で
あり、いくつかは前記した。天然に生じるストレプトマ
イセスｇａｌオペロンｇａｌＥ。
ｇａｌＴおよび／またはｇａｌＫ遺伝子は通常の技術に
より天然に生じるストレプトマイセスｇａｌオペロンか
ら単離できる。ストレプトマイセスｇａｌオペロンｇａ
ｌＥ、 ｇａｌＴおよび／またはｇａｌＫ遺伝子は適当
な宿主変異株における選択マーカーとして使用できろ。
より天然に生じるストレプトマイセスｇａｌオペロンか
ら単離できる。ストレプトマイセスｇａｌオペロンｇａ
ｌＥ、 ｇａｌＴおよび／またはｇａｌＫ遺伝子は適当
な宿主変異株における選択マーカーとして使用できろ。
「適当な宿主変異株」なる語は相同ｇａｌＥ、ｇａｌＴ
および／またはｇａｌＫ遺伝子内に欠失を含むため、ガ
ラクトースを利用できない宿主を意味する。かくして、
通常の技術で調製てきる組換型ＤＮＡ分子（共に適当な
調節領域に作動的に結合したストレプトマイセスｇａｌ
オペロンｇａｌＥ１８ａｌＴおよび／またはｇａｌＫ遺
伝子およびＦＡ種官能性ＤＮＡ配列からなる）は用向組
換によって宿主ゲノムへ取り込むための通常の技術によ
って適当な宿主変異株へ形質転換でき、高価な抗生物質
選択を続ける必要なしに形質転換体の検出を可能にする
。同様に、共に適当な調節領域に作動的に結合したスト
レプトマイセスｇａｌオペロンｇａｌＥ。
および／またはｇａｌＫ遺伝子内に欠失を含むため、ガ
ラクトースを利用できない宿主を意味する。かくして、
通常の技術で調製てきる組換型ＤＮＡ分子（共に適当な
調節領域に作動的に結合したストレプトマイセスｇａｌ
オペロンｇａｌＥ１８ａｌＴおよび／またはｇａｌＫ遺
伝子およびＦＡ種官能性ＤＮＡ配列からなる）は用向組
換によって宿主ゲノムへ取り込むための通常の技術によ
って適当な宿主変異株へ形質転換でき、高価な抗生物質
選択を続ける必要なしに形質転換体の検出を可能にする
。同様に、共に適当な調節領域に作動的に結合したスト
レプトマイセスｇａｌオペロンｇａｌＥ。
ｇａｌＴおよび／まｆこはｇａｌＫおよび異種官能性Ｄ
ＮＡ配列ならびにレプリコンからなる組換型Ｄ Ｎ Ａ
ベクターは通常の技術で適当な宿主変異株に形質転換で
き、高価な抗生物質選択を続ける必要なしに形質転換体
の検出を可能にする。ストレプトマイセスｇａｌオペロ
ンｇａｌＥ、 ｇａｌＫおよび／またはｇａｌＴ逍伝子
は転子適当な宿主変異株の相Ｍｌｉに有用である。
ＮＡ配列ならびにレプリコンからなる組換型Ｄ Ｎ Ａ
ベクターは通常の技術で適当な宿主変異株に形質転換で
き、高価な抗生物質選択を続ける必要なしに形質転換体
の検出を可能にする。ストレプトマイセスｇａｌオペロ
ンｇａｌＥ、 ｇａｌＫおよび／またはｇａｌＴ逍伝子
は転子適当な宿主変異株の相Ｍｌｉに有用である。
また、ストレプトマイセスｇａｌオペロンｇａｌＥ遺伝
子は異種ＤＮＡ配列に融合できるリポソーム結合部位と
開始コドンを提供するのに有用であり、適当な発現ベク
ターに取り込まれ、適当な宿主に形質転換された場合に
、そのようなコード付け配列を可能とする。そのような
異種官能性ＤＮＡ配列が、ストレプトマイセスｇａｌオ
ペロンＰ２プロモーター発現ユニットからなる組換型Ｄ
ＮＡ発現ベクターまたは全ｇａｌオペロン中のｇａｌＥ
ｉｎ伝子リポソ転子結合部位および開始コドンと融合す
ると、そのようなりＮＡ配列は、ベクターが適当な宿主
生物に形質転換される場合、構成的に発現されろ。
子は異種ＤＮＡ配列に融合できるリポソーム結合部位と
開始コドンを提供するのに有用であり、適当な発現ベク
ターに取り込まれ、適当な宿主に形質転換された場合に
、そのようなコード付け配列を可能とする。そのような
異種官能性ＤＮＡ配列が、ストレプトマイセスｇａｌオ
ペロンＰ２プロモーター発現ユニットからなる組換型Ｄ
ＮＡ発現ベクターまたは全ｇａｌオペロン中のｇａｌＥ
ｉｎ伝子リポソ転子結合部位および開始コドンと融合す
ると、そのようなりＮＡ配列は、ベクターが適当な宿主
生物に形質転換される場合、構成的に発現されろ。
そのようなりＮＡ配列が、ストレプトマイセスｇａｌオ
ペロンＰ２プロモーター調節領域からなる組換型ＤＮＡ
発現ベクター中のｇａｌＥ遺伝子リポソーム結合部位お
よび開始コドンに融合すると、そのようなベクターが適
当な宿主生物に形質転換される場合、ガラクトースまた
はグルコースの存在、非存在を制御することにより、そ
のようなりＮＡ配列の発現を調節できる。
ペロンＰ２プロモーター調節領域からなる組換型ＤＮＡ
発現ベクター中のｇａｌＥ遺伝子リポソーム結合部位お
よび開始コドンに融合すると、そのようなベクターが適
当な宿主生物に形質転換される場合、ガラクトースまた
はグルコースの存在、非存在を制御することにより、そ
のようなりＮＡ配列の発現を調節できる。
ストレプトマイセスｇａｌオペロンｇａｌＴ遺伝子はま
た、元種官能性ＤＮＡ配列に融合できるリポソーム結合
部位および開始コドンを提供するのに有用で、適当な発
現ベクターに取り込まれ、適当な宿主に形質転換される
と、そのようなコード付け配列の発現を可能にする。そ
のようなりＮＡ配列が、ストレプトマイセスｇａｌオペ
ロンＰｉプロモーター調節領域からなる組換型ＤＮＡ発
現ベクターまたは全ｇａｌオペロン中でｇａｌ’ｌ’遺
伝子リポソーム結合部位および開始コドンに融合すると
、前記のように、そのようなベクターで形質転換された
宿主におけるそのようなコード付け配列の発現を調節で
きる。
た、元種官能性ＤＮＡ配列に融合できるリポソーム結合
部位および開始コドンを提供するのに有用で、適当な発
現ベクターに取り込まれ、適当な宿主に形質転換される
と、そのようなコード付け配列の発現を可能にする。そ
のようなりＮＡ配列が、ストレプトマイセスｇａｌオペ
ロンＰｉプロモーター調節領域からなる組換型ＤＮＡ発
現ベクターまたは全ｇａｌオペロン中でｇａｌ’ｌ’遺
伝子リポソーム結合部位および開始コドンに融合すると
、前記のように、そのようなベクターで形質転換された
宿主におけるそのようなコード付け配列の発現を調節で
きる。
また、本発明は、レプリコン、ストレプトマイセスｇａ
ｌオペロンまたその官能性の、調節可能な誘導体および
そのようなオペロンに作動的に結合した異種官能性ＤＮ
Ａ配列からなる組換型ＤＮＡベクターに関する。そのよ
うなベクターは通常の技術で調製できる。用いるレプリ
コンは当該ベクターにより形質転換されるベクターとな
るべき宿主生物中にベクターを安定に、染色体外的に維
持する能力を有することが公知のものとすべきである。
ｌオペロンまたその官能性の、調節可能な誘導体および
そのようなオペロンに作動的に結合した異種官能性ＤＮ
Ａ配列からなる組換型ＤＮＡベクターに関する。そのよ
うなベクターは通常の技術で調製できる。用いるレプリ
コンは当該ベクターにより形質転換されるベクターとな
るべき宿主生物中にベクターを安定に、染色体外的に維
持する能力を有することが公知のものとすべきである。
本発明はまた、組換型ＤＮＡベクターからなる形質転換
宿主微生物に関し、該ベクターはレプリコン、ストレプ
トマイセスｇａｌオペロンまたはその官能性、調節可能
な誘導体および該オペロンに作動的に結合した異種官能
性ＤＮＡ配列を含有する。また、本発明は適当な宿主微
生物をそのようなベクターで形質転換することからなる
そのような宿主の調製法に関する。本発明はこの方法に
用いることのできる適当な宿主にはウィルスおよび有核
および原核細胞または生物、特に、ストレプトマイセス
属のようなアクナノマイセス類が包含されろ。最も好ま
しい宿主微生物はストレプトマイセス属に属する。スト
レプトマイセスの好ましい種には、ストレプトマイセス
・リビダンス、ストレプトマイセス・コエリカラー、ス
トレプトマイセス・アズラエウスおよびストレプトマイ
セス・アルブスが包含される。そのような宿主微生物の
そのようなベクターによる形質転換はヂャーターら、カ
レント・トピソクス・イン・マイクロバイオロジー・ア
ンド・イムノロジー（Ｃｈａｔｅｒ ｅｔａｌ、 、Ｃ
ｕｒｒ、Ｔｏｐ、Ｍｉｃｒｏ、 Ｉｍｍ、）９ Ｇ 、
６９〜９５（１９８２）の方法のような通常の技術を
用いて行なうことができる。本発明はまた、官能性ＤＮ
Ａ配列が発現されろ適当な条件下、本発明の形質転換宿
主を培養することからなる本発明の形質転換宿主に含有
される官能性ＤＮＡ配列の発現方法に関する。「適当な
条件」なる語は宿主の増殖を可能にし、官能性ＤＮＡ配
列の発現を可能にする条件をき味する。この適当な条件
は当業者が通常の技術を用いて決定でき、用いる宿主生
物および発現させるべき官能性ＤＮＡ配列のような種々
の因子に依存する。本発明はまた、発現を調節するに適
当な条件下、官能性ＤＮＡ配列を含有する形質転換宿主
を培養することからなる該形質転換宿主に含有される官
能性ＤＮＡ配列の発現を工１節する方法に関する。「適
当な条件」なる語は、ストレプトマイセスｇａｌオペロ
ン（および異種官能性Ｄ Ｎ Ａ配列）を調節すること
の可能な条件を意味する。「調節可能」なる語は形質転
換宿主細胞の増殖培地におけるガラクトースまたはその
代謝産物の存在およびグルコースまたはその代謝産物の
存在に対する応答性であることを意味する。このような
調節は形質転換宿主の培地へのガラクトースまたはグル
コースの添加または削除により行なうことができる。本
発明の形質転換宿主による異種官能性ＤＮＡコード付け
配列の発現の上昇または下降調節についてのガラクトー
スおよび／またはグルコースの至適レベルは通常の技術
を用い、当業者が容易に決定できる。
宿主微生物に関し、該ベクターはレプリコン、ストレプ
トマイセスｇａｌオペロンまたはその官能性、調節可能
な誘導体および該オペロンに作動的に結合した異種官能
性ＤＮＡ配列を含有する。また、本発明は適当な宿主微
生物をそのようなベクターで形質転換することからなる
そのような宿主の調製法に関する。本発明はこの方法に
用いることのできる適当な宿主にはウィルスおよび有核
および原核細胞または生物、特に、ストレプトマイセス
属のようなアクナノマイセス類が包含されろ。最も好ま
しい宿主微生物はストレプトマイセス属に属する。スト
レプトマイセスの好ましい種には、ストレプトマイセス
・リビダンス、ストレプトマイセス・コエリカラー、ス
トレプトマイセス・アズラエウスおよびストレプトマイ
セス・アルブスが包含される。そのような宿主微生物の
そのようなベクターによる形質転換はヂャーターら、カ
レント・トピソクス・イン・マイクロバイオロジー・ア
ンド・イムノロジー（Ｃｈａｔｅｒ ｅｔａｌ、 、Ｃ
ｕｒｒ、Ｔｏｐ、Ｍｉｃｒｏ、 Ｉｍｍ、）９ Ｇ 、
６９〜９５（１９８２）の方法のような通常の技術を
用いて行なうことができる。本発明はまた、官能性ＤＮ
Ａ配列が発現されろ適当な条件下、本発明の形質転換宿
主を培養することからなる本発明の形質転換宿主に含有
される官能性ＤＮＡ配列の発現方法に関する。「適当な
条件」なる語は宿主の増殖を可能にし、官能性ＤＮＡ配
列の発現を可能にする条件をき味する。この適当な条件
は当業者が通常の技術を用いて決定でき、用いる宿主生
物および発現させるべき官能性ＤＮＡ配列のような種々
の因子に依存する。本発明はまた、発現を調節するに適
当な条件下、官能性ＤＮＡ配列を含有する形質転換宿主
を培養することからなる該形質転換宿主に含有される官
能性ＤＮＡ配列の発現を工１節する方法に関する。「適
当な条件」なる語は、ストレプトマイセスｇａｌオペロ
ン（および異種官能性Ｄ Ｎ Ａ配列）を調節すること
の可能な条件を意味する。「調節可能」なる語は形質転
換宿主細胞の増殖培地におけるガラクトースまたはその
代謝産物の存在およびグルコースまたはその代謝産物の
存在に対する応答性であることを意味する。このような
調節は形質転換宿主の培地へのガラクトースまたはグル
コースの添加または削除により行なうことができる。本
発明の形質転換宿主による異種官能性ＤＮＡコード付け
配列の発現の上昇または下降調節についてのガラクトー
スおよび／またはグルコースの至適レベルは通常の技術
を用い、当業者が容易に決定できる。
また、本発明はレプリコン、ストレプトマイセスｇａｌ
オペロンＰ２プロモーター発現ユニットまたはその官能
性誘導体およびそのようなユニット１９作動的に結合し
た異種官能性ＤＮＡ配列からなる組換ＤＮＡベクターに
関する。そのようなベクターは通常の技術で調製できる
。用いるレプリコンは該ベクターで形質転換すべき宿主
生物において、安定に、染色体外的にベクターを維持す
る能力の知られているものとすべきである。
オペロンＰ２プロモーター発現ユニットまたはその官能
性誘導体およびそのようなユニット１９作動的に結合し
た異種官能性ＤＮＡ配列からなる組換ＤＮＡベクターに
関する。そのようなベクターは通常の技術で調製できる
。用いるレプリコンは該ベクターで形質転換すべき宿主
生物において、安定に、染色体外的にベクターを維持す
る能力の知られているものとすべきである。
また、本発明は、レプリコン、ストレプトマイセスｇａ
ｌオペロンＰ２プロモーター発現ユニットまたはその官
能性誘導体および該ユニットに作動的に結合した異種官
能性ＤＮＡ配列を含有する組換型ＤＮＡベクターからな
る形質転換宿主微生物ならびに、そのようなベクターで
適当な宿主微生物を形質転換することからなるそのよう
な宿主の調製法に関する。「作動的に結合した」なる語
は官能性ＤＮＡ配列が、その発現が発現制御配列の制御
下にあるように発現制御配列（ずなわら、ストレプトマ
イセスｇａｌオペロン、Ｐ２２プロモーター現ユニット
、ｐｔプロモーター調節領域、ＰＩプロモーターまたは
Ｐ２プロモーター）に転写的にまたは翻訳的に結合する
ことを色味する。すなわち、例えば、異種官能性ＤＮＡ
配列は、当該オペロンをストレプトマイセスｇａｌオペ
ロンＰ１またはＰ２プロモーター転写体に挿入すること
により、転写的にまたは翻訳的にストレプトマイセスｇ
ａｌオペロンに結合できる。「レプリコン」なる語は、
それによって形質転換された宿主微生物または細胞にプ
ラスミドを染色体外的に維持する機能を有するプラスミ
ド上のＤＮＡの領域を意味する。
ｌオペロンＰ２プロモーター発現ユニットまたはその官
能性誘導体および該ユニットに作動的に結合した異種官
能性ＤＮＡ配列を含有する組換型ＤＮＡベクターからな
る形質転換宿主微生物ならびに、そのようなベクターで
適当な宿主微生物を形質転換することからなるそのよう
な宿主の調製法に関する。「作動的に結合した」なる語
は官能性ＤＮＡ配列が、その発現が発現制御配列の制御
下にあるように発現制御配列（ずなわら、ストレプトマ
イセスｇａｌオペロン、Ｐ２２プロモーター現ユニット
、ｐｔプロモーター調節領域、ＰＩプロモーターまたは
Ｐ２プロモーター）に転写的にまたは翻訳的に結合する
ことを色味する。すなわち、例えば、異種官能性ＤＮＡ
配列は、当該オペロンをストレプトマイセスｇａｌオペ
ロンＰ１またはＰ２プロモーター転写体に挿入すること
により、転写的にまたは翻訳的にストレプトマイセスｇ
ａｌオペロンに結合できる。「レプリコン」なる語は、
それによって形質転換された宿主微生物または細胞にプ
ラスミドを染色体外的に維持する機能を有するプラスミ
ド上のＤＮＡの領域を意味する。
また、ストレプトマイセスｇａｌオペロンおよびそのよ
り小さい部分が他の細胞および生物から相同配列を得る
核酸プローブとして有用なことが判明した。本発明の方
法で用いることのできる適当な宿主微生物には、いずれ
ものウィルスまたは有核もしくは原核細胞もしくは微生
物、特に、ストレプトマイセス属のもののような、いず
れかのアクチノマイセス属が包含される。最も好ましい
宿主微生物はストレプトマイセス属のものである。スト
レプトマイセス属の好ましい種にはストレプトマイセス
・リビダンス、ストレプトマイセス・コエリカラー、ス
トレプトマイセス・アゼラエウスおよびストレプトマイ
セス・アルブスが包含される。ベクターによるこのよう
な宿主微生物の形質転換は前記チャーターらの方法のよ
うな通常の技術を用いて行なうことができる。本発明は
また、官能性ＤｆｆｌＪＡ配列が発現されるような適当
な条件下、形質転換宿主を培養することからなる本発明
の形質転換宿主により含有される官能性ＤＮＡ配列の発
現方法に関する。「適当な条件」なる語は宿主の増殖を
可能にし、官能性ＤＮＡ配列の発現を可能にする条件を
意味する。この適当な条件は当業者が通常の技術を用い
て決定でき、用いる宿主生物および発現させるべき官能
性ＤＮＡ配列のような種々の因子に依存する。
り小さい部分が他の細胞および生物から相同配列を得る
核酸プローブとして有用なことが判明した。本発明の方
法で用いることのできる適当な宿主微生物には、いずれ
ものウィルスまたは有核もしくは原核細胞もしくは微生
物、特に、ストレプトマイセス属のもののような、いず
れかのアクチノマイセス属が包含される。最も好ましい
宿主微生物はストレプトマイセス属のものである。スト
レプトマイセス属の好ましい種にはストレプトマイセス
・リビダンス、ストレプトマイセス・コエリカラー、ス
トレプトマイセス・アゼラエウスおよびストレプトマイ
セス・アルブスが包含される。ベクターによるこのよう
な宿主微生物の形質転換は前記チャーターらの方法のよ
うな通常の技術を用いて行なうことができる。本発明は
また、官能性ＤｆｆｌＪＡ配列が発現されるような適当
な条件下、形質転換宿主を培養することからなる本発明
の形質転換宿主により含有される官能性ＤＮＡ配列の発
現方法に関する。「適当な条件」なる語は宿主の増殖を
可能にし、官能性ＤＮＡ配列の発現を可能にする条件を
意味する。この適当な条件は当業者が通常の技術を用い
て決定でき、用いる宿主生物および発現させるべき官能
性ＤＮＡ配列のような種々の因子に依存する。
また、本発明はレプリコン、ストレプトマイセスｇａｌ
オペロンＰ１プロモーター調節領域またはその官能性、
調節可能な誘導体およびそのような領域に作動的に結合
した異種官能性ＤＮＡ配列からなる組換ＤＮＡベクター
に関する。そのようなベクターは通常の技術で調製でき
る。用いろレプリコンは該ベクターで形質転換すべき宿
主生物において、安定に、染色体外的にベクターを推持
する能力の知られているものとすべきである。
オペロンＰ１プロモーター調節領域またはその官能性、
調節可能な誘導体およびそのような領域に作動的に結合
した異種官能性ＤＮＡ配列からなる組換ＤＮＡベクター
に関する。そのようなベクターは通常の技術で調製でき
る。用いろレプリコンは該ベクターで形質転換すべき宿
主生物において、安定に、染色体外的にベクターを推持
する能力の知られているものとすべきである。
また、本発明は、レプリコン、ストレプトマイセスｇａ
ｌオペロンＰＩブロモ−クー調節領域またはその官能性
、調節可能な誘導体および該領域に作動的に結合した異
種官能性ＤＮＡ配列を含有する組換型ＤＮＡベクターか
らなる形質転換宿主微生物ならびに、そのようなベクタ
ーで適当な宿主微生物を形質転換することからなるその
ような宿主の調製法に関する。用いることのできる適当
な宿主微生物には、いずれらのウィルスまたは有核らし
くは原核細胞らしくは微生物、特に、ストレプトマイセ
ス属のもののような、いずれかのアクチノマイセス属が
包含される。最も好ましい宿主微生物はストレプトマイ
セス属のものである。ストレプトマイセス属の好ましい
種にはストレプトマイセス・リビダンス、ストレプトマ
イセス・コエリカラー、ストレプトマイセス・アゼラエ
ウスおよびストレプトマイセス・アルブスが包含される
。ベクターによるこのような宿主微生物の形質転換は面
記チャーターらの方法のような通常の技術を用いて行な
うことができる。本発明はまた、官能性ＤＮＡ配列が発
現されるような適当な条件下、形質転換宿主を培養する
こ七からなる本発明の形質転換宿主により含有される異
種官能性ＤＮＡ配列の発現方法に関する。「適当な条件
」なる語は宿主の増殖を可能にし、官能性ＤＮＡ配列の
発現を可能にする条件を意味する。この適当な条件は当
業者が通常の技術を用いて決定でき、用いる宿主生物お
よび発現させるべき官能性ＤＮＡ配列のような種々の因
子に依存する。本発明はまた、発現を調節するに適当な
条件下、官能性Ｄ Ｎ Ａ配列を含有する形質転換宿主
を培養することからなる該形質転換宿主に含有される官
能性ＤＮＡ配列の発現を調節する方法に関する。「適当
な条件Ｊなる語はストレプトマイセスｇａｌオペロンＰ
１プロモーター調節域（および異種官能性ＤＮＡ配列）
を調節可能にする条件でを意味する。「調節可能」なる
語は形質転換宿主細胞の増殖培地中のガラクトースまた
はその代謝産物の存在または非存在およびグルコースま
たはその代謝産物の存在または非存在に応答性であるこ
とを色味する。そのような調節は形質転換宿主の培地へ
のガラクトースまたはグルコースの添加または削除によ
り行なうことができろ。
ｌオペロンＰＩブロモ−クー調節領域またはその官能性
、調節可能な誘導体および該領域に作動的に結合した異
種官能性ＤＮＡ配列を含有する組換型ＤＮＡベクターか
らなる形質転換宿主微生物ならびに、そのようなベクタ
ーで適当な宿主微生物を形質転換することからなるその
ような宿主の調製法に関する。用いることのできる適当
な宿主微生物には、いずれらのウィルスまたは有核らし
くは原核細胞らしくは微生物、特に、ストレプトマイセ
ス属のもののような、いずれかのアクチノマイセス属が
包含される。最も好ましい宿主微生物はストレプトマイ
セス属のものである。ストレプトマイセス属の好ましい
種にはストレプトマイセス・リビダンス、ストレプトマ
イセス・コエリカラー、ストレプトマイセス・アゼラエ
ウスおよびストレプトマイセス・アルブスが包含される
。ベクターによるこのような宿主微生物の形質転換は面
記チャーターらの方法のような通常の技術を用いて行な
うことができる。本発明はまた、官能性ＤＮＡ配列が発
現されるような適当な条件下、形質転換宿主を培養する
こ七からなる本発明の形質転換宿主により含有される異
種官能性ＤＮＡ配列の発現方法に関する。「適当な条件
」なる語は宿主の増殖を可能にし、官能性ＤＮＡ配列の
発現を可能にする条件を意味する。この適当な条件は当
業者が通常の技術を用いて決定でき、用いる宿主生物お
よび発現させるべき官能性ＤＮＡ配列のような種々の因
子に依存する。本発明はまた、発現を調節するに適当な
条件下、官能性Ｄ Ｎ Ａ配列を含有する形質転換宿主
を培養することからなる該形質転換宿主に含有される官
能性ＤＮＡ配列の発現を調節する方法に関する。「適当
な条件Ｊなる語はストレプトマイセスｇａｌオペロンＰ
１プロモーター調節域（および異種官能性ＤＮＡ配列）
を調節可能にする条件でを意味する。「調節可能」なる
語は形質転換宿主細胞の増殖培地中のガラクトースまた
はその代謝産物の存在または非存在およびグルコースま
たはその代謝産物の存在または非存在に応答性であるこ
とを色味する。そのような調節は形質転換宿主の培地へ
のガラクトースまたはグルコースの添加または削除によ
り行なうことができろ。
また、本発明はレプリコン、ストレプトマイセスｇａｌ
オペロンＰ２プロモーターまたはその官能性誘導体およ
びそのようなプロモーターに作動的に結合した異種官能
性ＤＮＡ配列からなる組換ＤＮＡベクターに関する。そ
のようなベクターは通常の技術で調製できる。用いるレ
プリコンは該ベクターで形質転換すべき宿主生物におい
て、安定に、染色体外的にベクターを維持する能力の知
られているものとすべきである。
オペロンＰ２プロモーターまたはその官能性誘導体およ
びそのようなプロモーターに作動的に結合した異種官能
性ＤＮＡ配列からなる組換ＤＮＡベクターに関する。そ
のようなベクターは通常の技術で調製できる。用いるレ
プリコンは該ベクターで形質転換すべき宿主生物におい
て、安定に、染色体外的にベクターを維持する能力の知
られているものとすべきである。
また、本発明は、レプリコン、ストレプトマイセスｇａ
ｌオペロンＰ２プロモーターまたはその官能性誘導体お
よび該領域に作動的に結合した異種官能性ＤＮＡ配列を
含有する組換型ＤＮＡベクターからなる形質転換宿主微
生物ならびに、そのようなベクターて適当な宿主微生物
を形質転換することからなるそのような宿主の調製法に
関する。
ｌオペロンＰ２プロモーターまたはその官能性誘導体お
よび該領域に作動的に結合した異種官能性ＤＮＡ配列を
含有する組換型ＤＮＡベクターからなる形質転換宿主微
生物ならびに、そのようなベクターて適当な宿主微生物
を形質転換することからなるそのような宿主の調製法に
関する。
用いろことのできる適当な宿主微生物には、ストレプト
マイセス属のもののような、いずれかのアクチノマイセ
ス属が包含される。最ら好ましい宿主微生物はストレプ
トマイセス届のｔｌのである一ストレプトマイセス属の
好ましい種にはストレプトマイセス・リビダンス、スト
レプトマイセス・コエリカラー、ストレプトマイセス・
アゼラエウスおよびストレプトマイセス・アルブスが包
含される。ベクターによるこのような宿主微生物の形質
転換は前記チャーターらの方法のような通常の技術を用
いて行なうことができる。本発明はまた、官能性ＤＮＡ
配列が発現されるような適当な条件下、形質転換宿主を
培養することからなる該形質転換宿主に含有される異種
官能性ＤＮＡ配列の発現方法に関する。「ａ当な条件」
なる語は宿主の増殖を可能にし、官能性ＤＮＡ配列の発
現を可能にする条件を意味する。この適当な条件は当業
者が通常の技術を用いて決定でき、用いる宿主生物およ
び発現させるべき官能性ＤＮＡ配列のような種々の因子
に依存する。
マイセス属のもののような、いずれかのアクチノマイセ
ス属が包含される。最ら好ましい宿主微生物はストレプ
トマイセス届のｔｌのである一ストレプトマイセス属の
好ましい種にはストレプトマイセス・リビダンス、スト
レプトマイセス・コエリカラー、ストレプトマイセス・
アゼラエウスおよびストレプトマイセス・アルブスが包
含される。ベクターによるこのような宿主微生物の形質
転換は前記チャーターらの方法のような通常の技術を用
いて行なうことができる。本発明はまた、官能性ＤＮＡ
配列が発現されるような適当な条件下、形質転換宿主を
培養することからなる該形質転換宿主に含有される異種
官能性ＤＮＡ配列の発現方法に関する。「ａ当な条件」
なる語は宿主の増殖を可能にし、官能性ＤＮＡ配列の発
現を可能にする条件を意味する。この適当な条件は当業
者が通常の技術を用いて決定でき、用いる宿主生物およ
び発現させるべき官能性ＤＮＡ配列のような種々の因子
に依存する。
また、本発明はレプリコン、ストレプトマイセスｇａｌ
オペロンＰＩプロモーターまたはそのいずれかの官能性
、調節可能な誘導体およびそのような領域に作動的に結
合した異種官能性Ｄ Ｎ Ａ配列からなる組換ＤＮＡベ
クターに関する。そのようなベクターは通常の技術で調
製できる。用いるレプリコンは該ベクターで形質転換す
べき宿主生物において、安定に、染色体外的にベクター
を維持する能力の知られているものとすべきである。
オペロンＰＩプロモーターまたはそのいずれかの官能性
、調節可能な誘導体およびそのような領域に作動的に結
合した異種官能性Ｄ Ｎ Ａ配列からなる組換ＤＮＡベ
クターに関する。そのようなベクターは通常の技術で調
製できる。用いるレプリコンは該ベクターで形質転換す
べき宿主生物において、安定に、染色体外的にベクター
を維持する能力の知られているものとすべきである。
また、本発明は、レプリコン、ストレプトマイセスｇａ
ｌオペロンＰＩプロモーターまたはそのいずれかの官能
性、調節可能な誘導体および該領域に作動的に結合した
異種官能性ＤＮＡ配列を含有する組換型ＤＮＡベクター
からなる形質転換宿主微生物ならびに、そのようなベク
ターで適当な宿主微生物を形質転換することからなるそ
のような宿主の調製法に関する。用いることのできる適
当な宿主微生物には、ウィルスまたは有核もしくは原核
細胞らしくは微生物、特に、ストレプトマイセス属のも
ののような、いずれかのアクチノマイセス属が包含され
る。最も好ましい宿主微生物はストレプトマイセス属の
ものである。ストレプトマイセス属の好ましい種にはス
トレプトマイセス・リビダンス、ストレプトマイセス・
コエリカラー、ストレプトマイセス・アゼラエウスおよ
びストレプトマイセス・アルブスが包含される。ベクタ
ーによるこのような宿主微生物の形質転換は面記ヂャー
ターらの方法のような通常の技術を用いて行なうことが
できる。本発明はまた、官能性ＤＮＡ配列が発現されろ
ような適当な条件下、形質転換宿主を培養することから
なる本発明の形質転換宿主により含有される異種官能性
ＤＮＡ配列の発現方法に関する。「適当な条件」なる語
は宿主の増殖を可能にし、官能性ＤＮＡ配列の発現を可
能にする条件を意味する。そのような適当な条件は当業
者が通常の技術を用いて決定でき、用いろ宿主生物およ
び発現させるべき異種官能性Ｄ Ｎ Ａ配列のような種
々の因子に依存する。本発明はまｌこ、発現が調節可能
な適当な条件下、異種官能性ＤＮＡ配列を含む形質転換
宿主を培養することからなる該形質転換宿主に含まれる
官能性ＤＮＡ配列の発現を調節する方法に関する。「適
当な条件」なる語は該ｇａｌオペロンＰｉプロモーター
（および官能性ＤＮＡ配ｒ！１）を調節可能にする条件
を色味する。
ｌオペロンＰＩプロモーターまたはそのいずれかの官能
性、調節可能な誘導体および該領域に作動的に結合した
異種官能性ＤＮＡ配列を含有する組換型ＤＮＡベクター
からなる形質転換宿主微生物ならびに、そのようなベク
ターで適当な宿主微生物を形質転換することからなるそ
のような宿主の調製法に関する。用いることのできる適
当な宿主微生物には、ウィルスまたは有核もしくは原核
細胞らしくは微生物、特に、ストレプトマイセス属のも
ののような、いずれかのアクチノマイセス属が包含され
る。最も好ましい宿主微生物はストレプトマイセス属の
ものである。ストレプトマイセス属の好ましい種にはス
トレプトマイセス・リビダンス、ストレプトマイセス・
コエリカラー、ストレプトマイセス・アゼラエウスおよ
びストレプトマイセス・アルブスが包含される。ベクタ
ーによるこのような宿主微生物の形質転換は面記ヂャー
ターらの方法のような通常の技術を用いて行なうことが
できる。本発明はまた、官能性ＤＮＡ配列が発現されろ
ような適当な条件下、形質転換宿主を培養することから
なる本発明の形質転換宿主により含有される異種官能性
ＤＮＡ配列の発現方法に関する。「適当な条件」なる語
は宿主の増殖を可能にし、官能性ＤＮＡ配列の発現を可
能にする条件を意味する。そのような適当な条件は当業
者が通常の技術を用いて決定でき、用いろ宿主生物およ
び発現させるべき異種官能性Ｄ Ｎ Ａ配列のような種
々の因子に依存する。本発明はまｌこ、発現が調節可能
な適当な条件下、異種官能性ＤＮＡ配列を含む形質転換
宿主を培養することからなる該形質転換宿主に含まれる
官能性ＤＮＡ配列の発現を調節する方法に関する。「適
当な条件」なる語は該ｇａｌオペロンＰｉプロモーター
（および官能性ＤＮＡ配ｒ！１）を調節可能にする条件
を色味する。
「調節可能−：なる語は、形質転換宿主細胞の増殖培地
中のガラクトースまたはその代謝物の存在または非存在
およびグルコースまたはその代謝物の存在に応答性であ
ることを意味する。そのような調節は形質転換宿主の培
地へのガラクトースまたはグルコースの添加または削除
によって行なうことができろ。
中のガラクトースまたはその代謝物の存在または非存在
およびグルコースまたはその代謝物の存在に応答性であ
ることを意味する。そのような調節は形質転換宿主の培
地へのガラクトースまたはグルコースの添加または削除
によって行なうことができろ。
及乳外
つぎ７こ実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説明する
が、これに限定されろものではない。
が、これに限定されろものではない。
以下の実施例に示すような、通常の技術を用いることに
より、当業者はストレプトマイセスのいずれかのガラク
トース利用性株からｇａｌオペロンを単離できる。さら
に、本明細書においてストレプトマイセスｇａｌオペロ
ンの単離に用いたと同様な技術を利用することにより、
当業者は該ストレプトマイセスｇａｌオペロンをストレ
プトマイセスの他のカラクトース利用性株、特に、スト
レプトマイセス・コエリカラー、ストレプトマイセス・
アズラエウス、ストレプトマイセス・アルブスおよび他
のストレプトマイセス・リビダンス味からのｇａｌオペ
ロンの単離に用いることかできる。
より、当業者はストレプトマイセスのいずれかのガラク
トース利用性株からｇａｌオペロンを単離できる。さら
に、本明細書においてストレプトマイセスｇａｌオペロ
ンの単離に用いたと同様な技術を利用することにより、
当業者は該ストレプトマイセスｇａｌオペロンをストレ
プトマイセスの他のカラクトース利用性株、特に、スト
レプトマイセス・コエリカラー、ストレプトマイセス・
アズラエウス、ストレプトマイセス・アルブスおよび他
のストレプトマイセス・リビダンス味からのｇａｌオペ
ロンの単離に用いることかできる。
以下の実施例で用いる分子遺伝子操作および他の技術は
、英国、ノールウィソヂ、ノヨン・インズ・ファウンデ
ーションのホップウッドら、ノエネティック・マニュピ
レーノヨン・才ブ・ストレプトマイセスニア・ラボラト
リ−・マニュアル（Ｈｏｐｗｏｏｄ ｅｔ ａｌ
、Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ
ｏ「Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒｏ
ｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）に記載されている。
、英国、ノールウィソヂ、ノヨン・インズ・ファウンデ
ーションのホップウッドら、ノエネティック・マニュピ
レーノヨン・才ブ・ストレプトマイセスニア・ラボラト
リ−・マニュアル（Ｈｏｐｗｏｏｄ ｅｔ ａｌ
、Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ
ｏ「Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒｏ
ｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）に記載されている。
略号
以下の実施例中、つぎの略号を使用する。
ＬＢ：１０ｇ）−リプトン、５ｇ酵母エキス、５ｇａＣ
ｆｆ ！ｖｌ ［３Ｓ Ｍ （修飾ＭＢＳＭ）：ブラウナーら
、ノーン（Ｉ３ｒａｗｎｅｒ ｅＬ ａｌ、 、Ｇｅ
ｎｅ）−１０，１９１（１９８５）参照 １ｖｌｏ Ｐ Ｓ ：（３）−Ｎ−モルホリノ−（プロ
パン−スルホン酸） ＹＥＭＥ＋ＭｇＣｌ２２＋グリノン（Ｑ当り）３ｇ酵［
１エキス、５ｇペプトン、３ｇ麦芽エキス、１０ｇグル
コース、ｌ ０ｇＭｇＣｌ２２・６Ｈ，０，３４０ｇシ
ョ糖 Ｓｌ：（ＮＨ４）２ＳＯ，（Ｉｇ／ρ）、Ｌ−アスパラ
ギン（２ｇ／Ｑ）、 Ｋ ２ＨＰ Ｏ，（９ｇ／ｆ
２）、 Ｎ ａ Ｈ２Ｐ Ｏ４（ｌ ｇ／Ｑ、）を
０２％寒天に対して一緒に混合し、オートクレーブする
。ついで、酵母エキス（２０ｇ、り、ＭｇＣｌ２．（５
ｇ／ １２）、ＣｕＣＱ２ＣＯ、１８／（２）、微量元
素［２０ｍＱ／Ｑ −ＺｎＣＬ（４（Ｊｔｒ９／Ｑ）、
ＦｅＣＱ３・６ｒ４２０（２００ｒｒｔ９／Ｑ）、 Ｃ
ｕＣＱ２・２ Ｉ（２０（Ｉ Ｏｚ９／＆）、
ＮａＢ、０７− １ ０ＨｔＯ（１０ｆｆ９／ｆ２）
、（Ｎｌ−［４）０ＭＯ７０２４−４ｌ−１ｔＯ（ｌ
ＯＲ９／Ｑ）含有］と混合、濾過、滅菌 ＹＥＭＥ（Ｙｍベース）：（１２当り）酵母エキス（３
ｇ）、ペプトン（５ｇ）、麦芽エキス（３ｇ）、ＭｇＣ
＋２．・６Ｉ（２ｏ（２ｇ） Ｙｍ ｇｌｕ：ＹＥＭＥ＋グルコース（ｌｏｇ）Ｙｍ
ｇａｌ：ＹＥＭＥ＋ガラクトース（１０ｇ）梱閑株 以下の実施例中、イー・コリのつぎの株を用いＣＧＳＣ
昧名称 性 染色体マーカー株＃（・） （ａ）ｃｃｓｃ株＃は、米国コネチカット州、ニュー・
ヘブン、ピー・オー・ボックス３３３３、チェダー・ス
トリート３３３ （３３３Ｃｅｄｅｒ Ｓ ｔｒｅｅｔ
。
ｆｆ ！ｖｌ ［３Ｓ Ｍ （修飾ＭＢＳＭ）：ブラウナーら
、ノーン（Ｉ３ｒａｗｎｅｒ ｅＬ ａｌ、 、Ｇｅ
ｎｅ）−１０，１９１（１９８５）参照 １ｖｌｏ Ｐ Ｓ ：（３）−Ｎ−モルホリノ−（プロ
パン−スルホン酸） ＹＥＭＥ＋ＭｇＣｌ２２＋グリノン（Ｑ当り）３ｇ酵［
１エキス、５ｇペプトン、３ｇ麦芽エキス、１０ｇグル
コース、ｌ ０ｇＭｇＣｌ２２・６Ｈ，０，３４０ｇシ
ョ糖 Ｓｌ：（ＮＨ４）２ＳＯ，（Ｉｇ／ρ）、Ｌ−アスパラ
ギン（２ｇ／Ｑ）、 Ｋ ２ＨＰ Ｏ，（９ｇ／ｆ
２）、 Ｎ ａ Ｈ２Ｐ Ｏ４（ｌ ｇ／Ｑ、）を
０２％寒天に対して一緒に混合し、オートクレーブする
。ついで、酵母エキス（２０ｇ、り、ＭｇＣｌ２．（５
ｇ／ １２）、ＣｕＣＱ２ＣＯ、１８／（２）、微量元
素［２０ｍＱ／Ｑ −ＺｎＣＬ（４（Ｊｔｒ９／Ｑ）、
ＦｅＣＱ３・６ｒ４２０（２００ｒｒｔ９／Ｑ）、 Ｃ
ｕＣＱ２・２ Ｉ（２０（Ｉ Ｏｚ９／＆）、
ＮａＢ、０７− １ ０ＨｔＯ（１０ｆｆ９／ｆ２）
、（Ｎｌ−［４）０ＭＯ７０２４−４ｌ−１ｔＯ（ｌ
ＯＲ９／Ｑ）含有］と混合、濾過、滅菌 ＹＥＭＥ（Ｙｍベース）：（１２当り）酵母エキス（３
ｇ）、ペプトン（５ｇ）、麦芽エキス（３ｇ）、ＭｇＣ
＋２．・６Ｉ（２ｏ（２ｇ） Ｙｍ ｇｌｕ：ＹＥＭＥ＋グルコース（ｌｏｇ）Ｙｍ
ｇａｌ：ＹＥＭＥ＋ガラクトース（１０ｇ）梱閑株 以下の実施例中、イー・コリのつぎの株を用いＣＧＳＣ
昧名称 性 染色体マーカー株＃（・） （ａ）ｃｃｓｃ株＃は、米国コネチカット州、ニュー・
ヘブン、ピー・オー・ボックス３３３３、チェダー・ス
トリート３３３ （３３３Ｃｅｄｅｒ Ｓ ｔｒｅｅｔ
。
Ｐ 、Ｏ、ＢＯＸ３ ３ ３ ３ 、Ｎｅｗ Ｉ
−［ａｖｅｎ、Ｃｏｎｎｅｃｔｉｃｕｔ。
−［ａｖｅｎ、Ｃｏｎｎｅｃｔｉｃｕｔ。
０６５１０ 、Ｕ、Ｓ、Ａ、）のエール・ユニパーツテ
ィ・スクール・オブ・メディシン、イー・コリ・ジエネ
ティック・ストック・センター・才ブ・ザ・デハートメ
ント・才ブ・ヒユーマン・ノエネティックス（Ｅ、ｃｏ
ｌｉ Ｇｅｎｅｔｉｃ ５ｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｅｒ ｏ
ｆｔｈｅＤｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｕｍａｎ
Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、 ＹａｌｅＵｎｉｖｅｒｓｉｔ
ｙ ５ｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）により該
殊に付された在庫番号である。
ィ・スクール・オブ・メディシン、イー・コリ・ジエネ
ティック・ストック・センター・才ブ・ザ・デハートメ
ント・才ブ・ヒユーマン・ノエネティックス（Ｅ、ｃｏ
ｌｉ Ｇｅｎｅｔｉｃ ５ｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｅｒ ｏ
ｆｔｈｅＤｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｕｍａｎ
Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、 ＹａｌｅＵｎｉｖｅｒｓｉｔ
ｙ ５ｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）により該
殊に付された在庫番号である。
（ｂ）ｇａｌＥ ９は旧しダーベルグ（Ｌ ｅｄｅｒｂ
ｅｒｇ）ｇａｌ９、ｇａｌＴ ２２は旧しダーベルグｇ
ａｌ Ｉである。
ｅｒｇ）ｇａｌ９、ｇａｌＴ ２２は旧しダーベルグｇ
ａｌ Ｉである。
Ｓ１分析
ＲＮ Ａの５′端および興味あるＲ Ｎ Ａの長さを同
定するために８１分析を用いる。以下の実施例において
、８１分析はウェーバ−ら、ヌークレイック・アシソズ
・リサーチ（Ｗｅａｖｅｒ ｅｔ ａｌ、 、Ｎｕｃｌ
。
定するために８１分析を用いる。以下の実施例において
、８１分析はウェーバ−ら、ヌークレイック・アシソズ
・リサーチ（Ｗｅａｖｅｒ ｅｔ ａｌ、 、Ｎｕｃｌ
。
Ａｓ１ｄｓ Ｒｅｓ、）７ 、 Ｉ ｌ ７５（１９７
９）およびパークら、プロン−ディンゲス・オブ・ナシ
ョナル・アカデミ−・オブ・ザイエンス・ニー・ニス・
エイ（Ｂｅｒｋ ｅｔ ａｌ、 、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ
、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ）７５．１２１４（＋９７
８）の方法に従って行なったＳ１実験を示す。
９）およびパークら、プロン−ディンゲス・オブ・ナシ
ョナル・アカデミ−・オブ・ザイエンス・ニー・ニス・
エイ（Ｂｅｒｋ ｅｔ ａｌ、 、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ
、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ）７５．１２１４（＋９７
８）の方法に従って行なったＳ１実験を示す。
実施例１
Ａ、ストレプトマイセス・リビダンス・ガラクトキナー
ゼ遺伝子 ストレプトマイセス・リビダンス１１３２６はピップら
、モレキュラー・アンド・ジェネラル・ノエネティック
ス（Ｂｉｂｂ ｅｔ ａｌ、 、Ｍｏ１．Ｇｅｎ、Ｇｅ
ｎｅｔｉｃｓ）１８４．２３０〜２４０（１９８１）に
よって記載されており、英国、ノーウィッチ、ジョン・
インズ・ファンデーションのディ・エイ・ポンプウッド
（Ｄ、 Ａ、 ｒ−Ｉｏｐｗｏｏｄ、 Ｊｏｈｎ
ＩｎｎｅｓＦｏｕｎｄａｔｉｏｎ、 Ｎｏｒｗｉｃｈ
Ｅｕｇｌａｎｄ）より得た。ストレプトマイセス・リビ
ダンス味１３２６およびｐ［Ｊ６ブラスミドを含有する
ストレプトマイセス・リビダンス味１３２６は、１９８
２年６月１０に、米国イリノイ州、ペオリアのアグリカ
ルチュラル・リサーチ・カルチャー・コレクションに、
各々、寄託番号ＮＲＲＬ １５０９１および１５０９２
で寄託した。
ゼ遺伝子 ストレプトマイセス・リビダンス１１３２６はピップら
、モレキュラー・アンド・ジェネラル・ノエネティック
ス（Ｂｉｂｂ ｅｔ ａｌ、 、Ｍｏ１．Ｇｅｎ、Ｇｅ
ｎｅｔｉｃｓ）１８４．２３０〜２４０（１９８１）に
よって記載されており、英国、ノーウィッチ、ジョン・
インズ・ファンデーションのディ・エイ・ポンプウッド
（Ｄ、 Ａ、 ｒ−Ｉｏｐｗｏｏｄ、 Ｊｏｈｎ
ＩｎｎｅｓＦｏｕｎｄａｔｉｏｎ、 Ｎｏｒｗｉｃｈ
Ｅｕｇｌａｎｄ）より得た。ストレプトマイセス・リビ
ダンス味１３２６およびｐ［Ｊ６ブラスミドを含有する
ストレプトマイセス・リビダンス味１３２６は、１９８
２年６月１０に、米国イリノイ州、ペオリアのアグリカ
ルチュラル・リサーチ・カルチャー・コレクションに、
各々、寄託番号ＮＲＲＬ １５０９１および１５０９２
で寄託した。
高分子量染色体ＤＮＡはマニアチスら
（Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ）、「モレキュラー・
クローニング・ア・ラボラトリ−・マニュアル」、コー
ルド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−（１９８２
）の方法に従って、ストレプトマイセス・リビダンス味
ｌ３２６から単離し、１０〜４０％ショ糖グラジェント
上てサイズ分別した（前記アニアヂスら、２８４〜２８
５頁）。１８〜２４．Ｋｂ対のフラクションを合し、１
０ｍＭトリスートＩＣＱ／１ｍＭＥ Ｄ Ｔ Ａ（ｐｌ
−Ｉ ８ ）に対して充分に透析した。ニスミッド・ツ
ヤトル・ベクターｐＪＷ３５７を用いて分別した染色体
ＤＮＡを全体としてクローンした。ｐＪＷ３５７はＰｓ
ｔＩて切断したｐＤＰＴ６をＰｓｔｌて切断したｐｉＪ
３５０に融合して作製した。ｐＩＪ３５０はキーゼルら
、モレキュラー・アンド・ジェネラル・ジエネティック
ス（Ｋｉｅｓｅｒ ｅｔ ａｌ、 、Ｍｏ１．Ｇｅｎ、
Ｇｅｎｅｔ、） １８５ 。
クローニング・ア・ラボラトリ−・マニュアル」、コー
ルド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−（１９８２
）の方法に従って、ストレプトマイセス・リビダンス味
ｌ３２６から単離し、１０〜４０％ショ糖グラジェント
上てサイズ分別した（前記アニアヂスら、２８４〜２８
５頁）。１８〜２４．Ｋｂ対のフラクションを合し、１
０ｍＭトリスートＩＣＱ／１ｍＭＥ Ｄ Ｔ Ａ（ｐｌ
−Ｉ ８ ）に対して充分に透析した。ニスミッド・ツ
ヤトル・ベクターｐＪＷ３５７を用いて分別した染色体
ＤＮＡを全体としてクローンした。ｐＪＷ３５７はＰｓ
ｔＩて切断したｐＤＰＴ６をＰｓｔｌて切断したｐｉＪ
３５０に融合して作製した。ｐＩＪ３５０はキーゼルら
、モレキュラー・アンド・ジェネラル・ジエネティック
ス（Ｋｉｅｓｅｒ ｅｔ ａｌ、 、Ｍｏ１．Ｇｅｎ、
Ｇｅｎｅｔ、） １８５ 。
２２３〜２３８（１９８２）に記載されている。ｐＤＰ
Ｔ６はティラーら（Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ、 ）の
米国特許第４４７６２２７号に記載されているテトラサ
イクリンおよびクロラムフェニコール耐性、ｐＢＲ３２
２ベース・イーコリ・ニスミッド・クローニング・ベク
ターである。ｐＪＷ３５７は該クロラムフェニコール耐
性遺伝子中に独特なＥｃｏＲ■部位およびテトラサイク
リン耐性遺伝子に独特なりａｍＨ（部位を有する。ｐＪ
Ｗ３５７をＢａｍｔＩ■で消化し、アルカリ性ホスファ
ターゼで脱ホスホリレート化し、前記の分別した染色体
ＤＮＡに連結した。
Ｔ６はティラーら（Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ、 ）の
米国特許第４４７６２２７号に記載されているテトラサ
イクリンおよびクロラムフェニコール耐性、ｐＢＲ３２
２ベース・イーコリ・ニスミッド・クローニング・ベク
ターである。ｐＪＷ３５７は該クロラムフェニコール耐
性遺伝子中に独特なＥｃｏＲ■部位およびテトラサイク
リン耐性遺伝子に独特なりａｍＨ（部位を有する。ｐＪ
Ｗ３５７をＢａｍｔＩ■で消化し、アルカリ性ホスファ
ターゼで脱ホスホリレート化し、前記の分別した染色体
ＤＮＡに連結した。
連結生成物をバタテリオファージ頭部につつみ込み（前
記マニアチスら、２６４〜２６５頁に記載されたｉｎ
ｖｉｔｒｏパッケーノング系を用い）、イー・コリＭＭ
２９４のｇａｌＫ−誘導体であるイー・コリＩｔＫ２＋
にトランスフェクションした。この形質転換培養をＬＩ
ｌ中で２時間、２５μｇ／ｍσクロラムフェニコール添
加ＬＩ３中でさらに２時間増殖させ、等容量の炭素源の
ないＭ９培地［ミラー、「エクスペリメンツ・イン・モ
レキュラー・ノエネティックス」、コールド・スプリン
グ・ハーバ−・ラボラトリ−（１９７２）参照］で３回
洗浄し、クロラムフェニコール３０Ｉｌ！９／ｍ１２を
添加したＭ９寒天［プロリン、ヒスデシン、アルギニン
、イソロイシン、ロイシン、食塩水および０．５％ガラ
クトース補足、アグムスら、バイオケミカル・アンド・
パイオフイノカル・リサーチ・コミュニケーソヨン（Ａ
ｄａｍｓ ｅｔ ａｌ、、 Ｂｉｏｃｈｅｍ、 Ｂｉｏ
ｐｈｙｓ、 Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍ、）８９（２）、６５０
〜６５８（＋ ９７９）］上で平板培養した。平板当り
約２００形質転換体を平板２０枚に塗抹した。３７℃で
３日間インキュベーション後、形質転換体は検出されな
かった。この最少平板にニコチン酸を５μｇ／ｍＱでス
プレーし、イー・コリ株に２１のニコチン酸要求を補足
し、さらに３７°Ｃで３日間、ついで室温で２日間イン
キュベーションを続けた。インキュベーションＬ生存コ
ロニーをクロラムフェニコール３０μｇ／ｍｇを添加し
たマツコンキー・ガラクトース寒天（ＭＡＣ−ＧＡＬＸ
前記ミラーら参照）および０．５％ガラクトース、５μ
ｇ／ｍ０．ニコヂン酸、５μｇ／ｍｆ２チアミンおよび
３０μｇ／ｍＱクロラムフェニコールで補足したＭ６３
最少寒天（前記ミラーら参照）の両方にバッチした。２
つのコロニーのみが、イー・コリに２１をｇａｌＫ”表
現型に形質転換するニスミッドＤ Ｎ Ａを含有してい
た。これらのニスミッドをｐＳＬＩＶＧＡＬ−１および
ｐｓＬ［ＶＧＡＬ−２と命名した。両コロニー共、ＭＡ
Ｃ−ＧＡＬ上で薄赤色で（すなわち、これらはｇａｌＫ
’″）、Ｍ６３培地上で増殖した。
記マニアチスら、２６４〜２６５頁に記載されたｉｎ
ｖｉｔｒｏパッケーノング系を用い）、イー・コリＭＭ
２９４のｇａｌＫ−誘導体であるイー・コリＩｔＫ２＋
にトランスフェクションした。この形質転換培養をＬＩ
ｌ中で２時間、２５μｇ／ｍσクロラムフェニコール添
加ＬＩ３中でさらに２時間増殖させ、等容量の炭素源の
ないＭ９培地［ミラー、「エクスペリメンツ・イン・モ
レキュラー・ノエネティックス」、コールド・スプリン
グ・ハーバ−・ラボラトリ−（１９７２）参照］で３回
洗浄し、クロラムフェニコール３０Ｉｌ！９／ｍ１２を
添加したＭ９寒天［プロリン、ヒスデシン、アルギニン
、イソロイシン、ロイシン、食塩水および０．５％ガラ
クトース補足、アグムスら、バイオケミカル・アンド・
パイオフイノカル・リサーチ・コミュニケーソヨン（Ａ
ｄａｍｓ ｅｔ ａｌ、、 Ｂｉｏｃｈｅｍ、 Ｂｉｏ
ｐｈｙｓ、 Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍ、）８９（２）、６５０
〜６５８（＋ ９７９）］上で平板培養した。平板当り
約２００形質転換体を平板２０枚に塗抹した。３７℃で
３日間インキュベーション後、形質転換体は検出されな
かった。この最少平板にニコチン酸を５μｇ／ｍＱでス
プレーし、イー・コリ株に２１のニコチン酸要求を補足
し、さらに３７°Ｃで３日間、ついで室温で２日間イン
キュベーションを続けた。インキュベーションＬ生存コ
ロニーをクロラムフェニコール３０μｇ／ｍｇを添加し
たマツコンキー・ガラクトース寒天（ＭＡＣ−ＧＡＬＸ
前記ミラーら参照）および０．５％ガラクトース、５μ
ｇ／ｍ０．ニコヂン酸、５μｇ／ｍｆ２チアミンおよび
３０μｇ／ｍＱクロラムフェニコールで補足したＭ６３
最少寒天（前記ミラーら参照）の両方にバッチした。２
つのコロニーのみが、イー・コリに２１をｇａｌＫ”表
現型に形質転換するニスミッドＤ Ｎ Ａを含有してい
た。これらのニスミッドをｐＳＬＩＶＧＡＬ−１および
ｐｓＬ［ＶＧＡＬ−２と命名した。両コロニー共、ＭＡ
Ｃ−ＧＡＬ上で薄赤色で（すなわち、これらはｇａｌＫ
’″）、Ｍ６３培地上で増殖した。
プラスミドｐｓＬｒＶＧＡＬ−１およびｐＳＬＩＶＧＡ
Ｌ−２を前記２つのｇａｌＫ”コロニーから単離し、前
記ヂャーターらの方法に従って、ストレプトマイセス・
リビダンス性＋３２６−１２Ｋ［ストレプトマイセス・
リビダンス株１３２６のＵＶ変異誘発後、ｇａｌＫ欠旧
昧を単離、ブラウナーら、ジーン（Ｂｒａｗｎｅｒ ｅ
ｔ ａｌ、 、Ｇｅｎｅ）４０ 、１９１（１９８５）
参照］に形質転換した。該ストレプトマイセス・リビダ
ンス１３２６−１２Ｋ（ｇａｌＫｌ宿主のプラスミド・
コート付け相補を前記ブラウナーらの方法に従って、Ｍ
ＢＳＭ−ｇａｌ−チオストレプトン平板上で胞子の増殖
を観察してテストした。ｐＳＬ Ｉ ＶＧＡＬ−２はス
トレプトマイセス＋３２６−１２に宿主の検知しうる相
補を示さなかった。
Ｌ−２を前記２つのｇａｌＫ”コロニーから単離し、前
記ヂャーターらの方法に従って、ストレプトマイセス・
リビダンス性＋３２６−１２Ｋ［ストレプトマイセス・
リビダンス株１３２６のＵＶ変異誘発後、ｇａｌＫ欠旧
昧を単離、ブラウナーら、ジーン（Ｂｒａｗｎｅｒ ｅ
ｔ ａｌ、 、Ｇｅｎｅ）４０ 、１９１（１９８５）
参照］に形質転換した。該ストレプトマイセス・リビダ
ンス１３２６−１２Ｋ（ｇａｌＫｌ宿主のプラスミド・
コート付け相補を前記ブラウナーらの方法に従って、Ｍ
ＢＳＭ−ｇａｌ−チオストレプトン平板上で胞子の増殖
を観察してテストした。ｐＳＬ Ｉ ＶＧＡＬ−２はス
トレプトマイセス＋３２６−１２に宿主の検知しうる相
補を示さなかった。
細胞抽出物を、１％グルコースまたはガラクトースおよ
びｌＯμｇ／ｍＱチオストレプトンで補足したＳＬ培地
中で増殖させた培養から調製した。
びｌＯμｇ／ｍＱチオストレプトンで補足したＳＬ培地
中で増殖させた培養から調製した。
イムノプロット（ｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔ）分析（前記ブ
ラウナーら参照）により、イー・コリ・ガラクトキナー
ゼに対するウザギ抗血ｔｎを用いて抽出物のガラクトキ
ナーゼ産生を分析した。イムノプロット分析で検出され
た蛋白質はほぼイー・コリｇａｌＫのサイズであった。
ラウナーら参照）により、イー・コリ・ガラクトキナー
ゼに対するウザギ抗血ｔｎを用いて抽出物のガラクトキ
ナーゼ産生を分析した。イムノプロット分析で検出され
た蛋白質はほぼイー・コリｇａｌＫのサイズであった。
この蛋白質はストレプトマイセスのガラクトース補足培
養において、グルコース培養におけるよりも数倍高いレ
ベルで出現した。
養において、グルコース培養におけるよりも数倍高いレ
ベルで出現した。
Ｂ、ニスミッド内のストレプトマイセス・リビダンスｇ
ａｌＫ領域の地図 前記のように調製したｐｓＬＩＶＧＡＬｌおよびｐｓＬ
ＩＶＧＡＬ２のｇａｌＫ領域を、ニスミッドからのラン
ダム・フラグメントのｐｕｃｔｓ誘導体へのクローニン
グ［ノーランダーら、ジーン（Ｎｏｒｒａｎｄｅｒ ｅ
ｔ ａｌｌ、Ｇｅｎｅ）２６，１０１−１０６（１９８
３）］およびＭＡＣ−ＣＡＬ培地上でのイー・コリ株Ｍ
Ｍ ２９４ （ｇａｌＫ−）の相補スコアにより同定し
た。ニスミッド・クローンを部分的に５ａｕ３ＡＩで消
化して（２〜４Ｋｂフラグメントの収率が最大となる条
件下）、この反応生成物を、つぎの合成りＮＡ配列： ５’ ＧＡＴＣ八ＧへへＣＴＴＧＡＴＣＡＣＴＡＧＣ
ＴＡＧＣＴＡＧ３’３’ ＴＣＴＡＧＡＡＣＴＡＧ
ＴＧＡＴＣＧＡＴＣＧＡＴＣＣＴＡＧ５’をｐＵｃ１８
のＢａｍＨ１部位に挿入して作製したｐＵｃ１８の誘導
体であるｐＵＣｌ ８−ＴＴ ６のＢｇ１１１部位に連
結する。１２個のｇａｌＫ＝クローン（ＭＡＣ−ＧＡＬ
上、赤）のサイズをスクリーニングする。プラスミドｐ
ｓＡＵｌｏと命名した１つのクローンは最ら小さく、約
１．４Ｋｂのインサート・サイズを有していた。
ａｌＫ領域の地図 前記のように調製したｐｓＬＩＶＧＡＬｌおよびｐｓＬ
ＩＶＧＡＬ２のｇａｌＫ領域を、ニスミッドからのラン
ダム・フラグメントのｐｕｃｔｓ誘導体へのクローニン
グ［ノーランダーら、ジーン（Ｎｏｒｒａｎｄｅｒ ｅ
ｔ ａｌｌ、Ｇｅｎｅ）２６，１０１−１０６（１９８
３）］およびＭＡＣ−ＣＡＬ培地上でのイー・コリ株Ｍ
Ｍ ２９４ （ｇａｌＫ−）の相補スコアにより同定し
た。ニスミッド・クローンを部分的に５ａｕ３ＡＩで消
化して（２〜４Ｋｂフラグメントの収率が最大となる条
件下）、この反応生成物を、つぎの合成りＮＡ配列： ５’ ＧＡＴＣ八ＧへへＣＴＴＧＡＴＣＡＣＴＡＧＣ
ＴＡＧＣＴＡＧ３’３’ ＴＣＴＡＧＡＡＣＴＡＧ
ＴＧＡＴＣＧＡＴＣＧＡＴＣＣＴＡＧ５’をｐＵｃ１８
のＢａｍＨ１部位に挿入して作製したｐＵｃ１８の誘導
体であるｐＵＣｌ ８−ＴＴ ６のＢｇ１１１部位に連
結する。１２個のｇａｌＫ＝クローン（ＭＡＣ−ＧＡＬ
上、赤）のサイズをスクリーニングする。プラスミドｐ
ｓＡＵｌｏと命名した１つのクローンは最ら小さく、約
１．４Ｋｂのインサート・サイズを有していた。
ｐｓＬＩＶＧＡＬ１含有コロニーと異なり、ｐＵＣクロ
ーンはＭＡＣ−ＧＡＬ培地上て非常に赤く、ガラクトキ
ナーゼの産生増加を示した。この酵素レベルの増加の最
も可能性の高い説明は、ストレプトマイセス・リビダン
スｇ ａ Ｉ Ｋ遺伝子が、ニスミッドの上流プロモー
ターより強いイー・コリ・プロモーターに転写されてい
ることである。
ーンはＭＡＣ−ＧＡＬ培地上て非常に赤く、ガラクトキ
ナーゼの産生増加を示した。この酵素レベルの増加の最
も可能性の高い説明は、ストレプトマイセス・リビダン
スｇ ａ Ｉ Ｋ遺伝子が、ニスミッドの上流プロモー
ターより強いイー・コリ・プロモーターに転写されてい
ることである。
ｐｓＡＵＩｏのインサートをＥｃｏＲｌ−Ｈ１ｎｄｌＩ
Ｉフラグメントとして単離しくこれらの部位はｐＵＣ＋
８−ＴＴ６のインザート領域をフランキングする）、ス
トレプトマイセス・リビダンスｇａｌＫ遺伝子のプロー
ブとして用いる。クローニングに用いた染色体ＤＮＡを
ＥｃｏＲＩ ＋Ｍ１ｕ ＩおよびＢａｍ１−ＩＩ＋Ｂｇ
ｌＩ［で制限し、サザーン、ジャーナル・オブ、モレキ
ュラーりくイオロジ−（Ｓ ｏｕｊｈｅｒｎ、 Ｊ 。
Ｉフラグメントとして単離しくこれらの部位はｐＵＣ＋
８−ＴＴ６のインザート領域をフランキングする）、ス
トレプトマイセス・リビダンスｇａｌＫ遺伝子のプロー
ブとして用いる。クローニングに用いた染色体ＤＮＡを
ＥｃｏＲＩ ＋Ｍ１ｕ ＩおよびＢａｍ１−ＩＩ＋Ｂｇ
ｌＩ［で制限し、サザーン、ジャーナル・オブ、モレキ
ュラーりくイオロジ−（Ｓ ｏｕｊｈｅｒｎ、 Ｊ 。
Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、）９８．５０３（１９７５）の方法
に従つてプロットする。Ｉ）ＳＡＵＩＯフラグメントを
ニック・トランスレーションし、該プロ・シトに雑種形
成させる。プローブは染色体消化物における１゜３ Ｋ
ｂＥｃｏＲＩ −Ｍｌｕ Ｉフラグメントおよび５Ｋｂ
ＢａｍＨ（−ＢｇｌｌＩフラグメントを同定した。この
データをニスミッド・インサートの地図と比較して、ｇ
ａｌＫ遺伝子の位置（地図位置５と７の間、表Ａ参照）
を確認した。
に従つてプロットする。Ｉ）ＳＡＵＩＯフラグメントを
ニック・トランスレーションし、該プロ・シトに雑種形
成させる。プローブは染色体消化物における１゜３ Ｋ
ｂＥｃｏＲＩ −Ｍｌｕ Ｉフラグメントおよび５Ｋｂ
ＢａｍＨ（−ＢｇｌｌＩフラグメントを同定した。この
データをニスミッド・インサートの地図と比較して、ｇ
ａｌＫ遺伝子の位置（地図位置５と７の間、表Ａ参照）
を確認した。
Ｃ，ストレプトマイセス・リビダンスｇａｌオペロンの
ＤＮＡ配列 ストレプトマイセス・リビダンスｇａｌオペロンを！１
終止［サンガーら、プロシーディンゲス・才ブ・ナショ
ナル・アカデミ−・オブ・サイエンス・ニー−ニス−エ
イ（Ｓａｎｇｅｒ ａｔ ａｌ、、 Ｐｒｏｃ。
ＤＮＡ配列 ストレプトマイセス・リビダンスｇａｌオペロンを！１
終止［サンガーら、プロシーディンゲス・才ブ・ナショ
ナル・アカデミ−・オブ・サイエンス・ニー−ニス−エ
イ（Ｓａｎｇｅｒ ａｔ ａｌ、、 Ｐｒｏｃ。
Ｎａｔ’ １．Ａｃａｄ、ｓｃｉ、Ｕ、ｓ 、Ａ、）７
４ 、５４６３ （１９７７）参照］および化学的開裂
［マキサムおよびギルバート、メソツズ・イン・エンザ
イモロジ−（Ｍａｘａｍ ａｎｄ Ｇ １ｌｂｅｒｔ、
Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）６５．
４９９ （１９８０）］により配列づけした。
４ 、５４６３ （１９７７）参照］および化学的開裂
［マキサムおよびギルバート、メソツズ・イン・エンザ
イモロジ−（Ｍａｘａｍ ａｎｄ Ｇ １ｌｂｅｒｔ、
Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）６５．
４９９ （１９８０）］により配列づけした。
よび５ａｉ１部位の各々にンヨットガン・クローンされ
たｐｓ Ａ Ｕ ６のインサー）（ｐＳＡｕｌＯの２．
３Ｋｂ同胞）の５ａｕ３ＡＩおよび５ａｌＩフラグメン
トから由来したしメッシング（Ｍｅｓｓｉｎｇｌ、メソ
ッズ・イン・エンザイモロジー、＋０１．２０（１９８
３）参照］。ストレプトマイセス・リビダンスｇａｌＴ
、 ｇａｌＥおよびｇａｌＫ遺伝子のアミノ酸配列はコ
ンピュータによって予測され、イー・コリおよび／また
はサツカロマイセス・セレビシェ（Ｓ。
たｐｓ Ａ Ｕ ６のインサー）（ｐＳＡｕｌＯの２．
３Ｋｂ同胞）の５ａｕ３ＡＩおよび５ａｌＩフラグメン
トから由来したしメッシング（Ｍｅｓｓｉｎｇｌ、メソ
ッズ・イン・エンザイモロジー、＋０１．２０（１９８
３）参照］。ストレプトマイセス・リビダンスｇａｌＴ
、 ｇａｌＥおよびｇａｌＫ遺伝子のアミノ酸配列はコ
ンピュータによって予測され、イー・コリおよび／また
はサツカロマイセス・セレビシェ（Ｓ。
ｃｅｖｅｖ ｉｓ １ａｅ）ガラクトキナーゼ、ｇａｌ
−１−ホスフェート・ウリノル・トランスフェラーゼお
よびＵＤＰ−４−エピメラーゼ酵素のアミノ酸配列との
比較によって分析しｆこ。これらの蛋白質の配列は、ｇ
ａｌ酵素をコード付ける遺伝子の総または部分ＤＮＡ配
列を用いるコンピュータ分析により予測された［デボラ
フら、ヌークレイック・アシゾズ・リサーチ（Ｄｅｂｏ
ｕｃｋ ｅｔ ａｌ、 、Ｎｕｃ、Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ
、）＋３（６）、１８４１”１８５３（１９８５）およ
びシトロンおよびドネルソン、ジャーナル・才ブ・ｌｅ
ｈ ＋−＋ｌ −Ｊ−ｍ ：ｊ （（’ 、＋
ｒ八へ 、ｎＡ ｎへｎａｌｃｎｎ ＋Ｂａｃ
ｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）１５ ｇ 、２６９（１９８４）
参照］。
−１−ホスフェート・ウリノル・トランスフェラーゼお
よびＵＤＰ−４−エピメラーゼ酵素のアミノ酸配列との
比較によって分析しｆこ。これらの蛋白質の配列は、ｇ
ａｌ酵素をコード付ける遺伝子の総または部分ＤＮＡ配
列を用いるコンピュータ分析により予測された［デボラ
フら、ヌークレイック・アシゾズ・リサーチ（Ｄｅｂｏ
ｕｃｋ ｅｔ ａｌ、 、Ｎｕｃ、Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ
、）＋３（６）、１８４１”１８５３（１９８５）およ
びシトロンおよびドネルソン、ジャーナル・才ブ・ｌｅ
ｈ ＋−＋ｌ −Ｊ−ｍ ：ｊ （（’ 、＋
ｒ八へ 、ｎＡ ｎへｎａｌｃｎｎ ＋Ｂａｃ
ｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）１５ ｇ 、２６９（１９８４）
参照］。
ストレプトマイセス・リビダンスｇａｌＫ、 ｇａｌＴ
。
。
ｇａｌＥ遺伝子生成物についての推定蛋白質配列と、そ
れらの各イー・コリおよび／またはサツカロミセス・セ
レビシェ遺伝子生成物の間にいくらかの相同が見出され
た。
れらの各イー・コリおよび／またはサツカロミセス・セ
レビシェ遺伝子生成物の間にいくらかの相同が見出され
た。
ストレプトマイセス・リビダンスｇａｌオペロンの完全
Ｄ Ｎ Ａ配列を表１に示す。表１に包含されているも
のはオペロンのプロモーターについての転写開始部位お
よびｇａｌＴＳｇａｌＥおよびｇａｌＫ遺伝子生成物の
予測アミノ酸配列である。
Ｄ Ｎ Ａ配列を表１に示す。表１に包含されているも
のはオペロンのプロモーターについての転写開始部位お
よびｇａｌＴＳｇａｌＥおよびｇａｌＫ遺伝子生成物の
予測アミノ酸配列である。
１”−１１Ｊ （ｊ Ｏｌ＋ ○
Ｉ＋〇−１← ← ○＋
： ０ ■工 ← ぺ０
← ＜１−０ 嗜 ベト
ロント ＜ ０１Ｚ
ｌ Ｏへ ロ コ← ビ
♀＊′５！； Ｃ）よ 。。
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＜切 く−
ペ
Ｏｕ ｕ ロク Ｑ−ロ ０
ロ ← ←Ｑ 〇−〇
の−ａＯロ ロー ０＜Ｑ （ｊ
Ｃ） ＣｊｈＱ Ｑ ０１ｏ ［−Ｔ ＜
← ＣｊＬｍ −書くｌ（ト）・Ｑ ○
Ｃｊ Ｃ）＜ −ｑ Ｑ（蓑゛ｉ缶 ←−
く← ト・じ〉 ←←−ン − 〇−二 〇 −に ｍ−・ 葺ａ 牙ち・χ； 〜−ロく ロー −Ｑ− 一 ロ ←−詐Ｉ Ｈｏ ←ｒ６ 〇−ｐ−＊
ｌ−ｒ マ ロ〉 Ｑ−マｅ Ｃｊ ＞
Ｃｊ ＜○Ｉ＋ ←
ｈ８、 葺佃＄゛葺＜ ３ ＜ ａ （ＪＱ
ｌ、＋ ○ｈ８ｏ 旧１
裟・旨さ −一 −・口ｃｊ ロ〉 ロク ロａｌＯＣ：＋＝ ０１１１
ｖ←υ ←； ■・（−＜、−ロ Ｑ−←−ω Ｑり ｇ＝ ａｃｏ”００（Ｊ
ＯＣ５：ｌ １−ｅ４ＯＬ＋ ロＬ＋ ロ＊
ＣＪ Ｌ−＜−じ−Ｑｌ＋ ｏａ、
ｃｏ ｕ＝ ａｃｂ
ωく○Ｌ＋０Ｑａｌ ｔ、）コ ωυ
（−く菖 ０−←＝ イー ←＋＝０ ←ｄ
←← ００１＋ロー Ｃｊ ＣＪ
）−％ ｒ−−−Ｕ ＞（Ｎ・○Ｉ−（
ｊＯ０１−，００−Ｑコマ ００ ０ ｌ＋
ロー： Ｏｌ ４ｃｊ−’ ←
０− Ｉ−い 〇−＜［−＋Ｑ じ（
〇−ＱＡ ■ｅ、＋ ＝ ｐ＝ Ｑ＋＋
’Ｊ＋−＋く← ←り − く← Ｑ
○ ロ０ｃ
。
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（］）］噛０コＯ嗜ロ０セーコ
ａｌ ← ロ − 〇
Ｉ＋ ロ Ｉ＋ ← 釦−Ｑ−（ト）
■−ロく くゴ。
Ｉ＋ ロ Ｉ＋ ← 釦−Ｑ−（ト）
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ト て２ 共 よ°＄ボッ
１０ｏ、 Ｃ）１１１＋
０ｕΦ＜ （ｊ（Ｊ −。。 。。 ２ Ｅふ訃ｇ５０′５ ｃ
５コ ロ （：り６０す１ト嘩【：〉１−ζ）Ｌ嗜（：り００−
Ｑ＞ ロ ｌ＋）＠Ｊ 口υ ローロく
←Ｑ （へ） ←の くの Ｑ−Ｃｊ
Ｌ−（−＋ Ｏ・＜ｌ／１ つ−〇−〇＜
Ｃｊ（ｊ ｃＩ ロ＜ Ｃ，＋＜
Ｕ＜実施例２ ストレプトマイセス・リビダンスｇａｌオペロンのプロ
モーター ａ）Ｉ’ｌプロモーター （ｉ）概要 このプロモーターはガラクトース誘導性、グルコース抑
制性で、全ストレプトマイセスｇａｌオペロン用の調節
可能プロモーターである。Ｓｔデータはストレプトマイ
セス・リビダンスｇａｌオペロンが約３．４Ｋｂのポリ
ジストロニック転写体をコード付けすることを示してい
る。転写体はｇａｌＴについての約ＩＫｂ、ついで、各
ｇａｌＥおよびｇａｌＫについての約ＩＫｂからなる。
０ｕΦ＜ （ｊ（Ｊ −。。 。。 ２ Ｅふ訃ｇ５０′５ ｃ
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Ｑ＞ ロ ｌ＋）＠Ｊ 口υ ローロく
←Ｑ （へ） ←の くの Ｑ−Ｃｊ
Ｌ−（−＋ Ｏ・＜ｌ／１ つ−〇−〇＜
Ｃｊ（ｊ ｃＩ ロ＜ Ｃ，＋＜
Ｕ＜実施例２ ストレプトマイセス・リビダンスｇａｌオペロンのプロ
モーター ａ）Ｉ’ｌプロモーター （ｉ）概要 このプロモーターはガラクトース誘導性、グルコース抑
制性で、全ストレプトマイセスｇａｌオペロン用の調節
可能プロモーターである。Ｓｔデータはストレプトマイ
セス・リビダンスｇａｌオペロンが約３．４Ｋｂのポリ
ジストロニック転写体をコード付けすることを示してい
る。転写体はｇａｌＴについての約ＩＫｂ、ついで、各
ｇａｌＥおよびｇａｌＫについての約ＩＫｂからなる。
（第１図参照）ＰＩのガラクトース誘導は、少なくと乙
部公的に、５′端が転写開始部位の上流３１ｂｐに位置
するオペレーター配列および該オペレーターを認識する
レプレッサ蛋白により介在される。
部公的に、５′端が転写開始部位の上流３１ｂｐに位置
するオペレーター配列および該オペレーターを認識する
レプレッサ蛋白により介在される。
（ｉｉ）実験：Ｐ１プロモーターの単離、位置決め、特
性づけ ストレプトマイセス・リビダンスｇａｌＫ Ａ Ｔ Ｇ
の上流配列を、前記ブラウナーのイー・コリｇａｌＫプ
ロモーター・プローブ系を用い、プロモーターについて
スクリーニングする。Ｈｉｎｄ ［ｌＩ −Ｍ ｌｕＩ
フラグメント（表Ａ、地図位置１〜５参照）を５ａａ３
ＡＩで制限し、ｐＫ２＋の特有のＩ３ａｍＨＩ部位に連
結しく第２図）、実施例１の方法に従ってイー・コリＫ
２ ＋ （ｇａｌＫ−）中に形質転換する。
性づけ ストレプトマイセス・リビダンスｇａｌＫ Ａ Ｔ Ｇ
の上流配列を、前記ブラウナーのイー・コリｇａｌＫプ
ロモーター・プローブ系を用い、プロモーターについて
スクリーニングする。Ｈｉｎｄ ［ｌＩ −Ｍ ｌｕＩ
フラグメント（表Ａ、地図位置１〜５参照）を５ａａ３
ＡＩで制限し、ｐＫ２＋の特有のＩ３ａｍＨＩ部位に連
結しく第２図）、実施例１の方法に従ってイー・コリＫ
２ ＋ （ｇａｌＫ−）中に形質転換する。
ｐＫ２＋はｐｓＫＯ３の誘導体で、イー・コリｇａｌＫ
遺伝子を倉荷するイー・コリーストレプトマイセス・ツ
ヤトル・ベクターである。ｐｓＫＯ３の構成はローゼン
ヘルグら（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ、 ）
、ノエネティック・エンジニアリング、８（１９８６）
に記載されている。ｇａｌＫを発現するクローン、すな
わち、プロモーター活性を有するクローンをマツコンキ
ー−ガラクトース平板上で同定した。
遺伝子を倉荷するイー・コリーストレプトマイセス・ツ
ヤトル・ベクターである。ｐｓＫＯ３の構成はローゼン
ヘルグら（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ、 ）
、ノエネティック・エンジニアリング、８（１９８６）
に記載されている。ｇａｌＫを発現するクローン、すな
わち、プロモーター活性を有するクローンをマツコンキ
ー−ガラクトース平板上で同定した。
２つのｇａｌＫ＋クローン（ｐＫ ２１ Ｍ Ｉ（ｌお
よび２と命名）をストレプトマイセス１３２６−１２Ｋ
（ｇａｌＫ−）に形質転換し１こ。形質転換体の抽出物
をＹｌＴｌｇｌｕおよびＹｍｇａｌ中で培養し、抗イー
・コリ・ゴノラケトふ＋−ゼ片Ｉｔｎ’ｔｎ杢…い−ウ
エスクーソ・プロット分析で分析した。このプロットは
ガラクトース誘導培養からの抽出物において著しく高い
ガラクトキナーゼのレベルを示した。
よび２と命名）をストレプトマイセス１３２６−１２Ｋ
（ｇａｌＫ−）に形質転換し１こ。形質転換体の抽出物
をＹｌＴｌｇｌｕおよびＹｍｇａｌ中で培養し、抗イー
・コリ・ゴノラケトふ＋−ゼ片Ｉｔｎ’ｔｎ杢…い−ウ
エスクーソ・プロット分析で分析した。このプロットは
ガラクトース誘導培養からの抽出物において著しく高い
ガラクトキナーゼのレベルを示した。
ｐＫ２１ＭＨＩおよび２は制限分析により・１１０ｂｐ
の５ａｕ３ΔＩインザートを含有することが示され、こ
れは、ザザーン、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バ
イオロジー９８．５０３（＋９７５）の方法によるサザ
ーン・プロット分析により、［（ｉｎｄｌＩ［およびＢ
ｇｌ１１部位内に倉荷される（表Ａ、地図位置１〜２）
。クローンしたフラグメントを、ストレプトマイセス・
リビダンス！３２６−＋２Ｉ（およびイー・コリＫ１２
培養から単離しｆ二ＦｔＮＡを用いるＳｔ分析により分
析した。８１消化後得られたフラグメントは２９０ヌク
レオチド保護フラグメントである（Ｓａｕ３Ａ１部位の
＋ｎＲＮＡ２９０のｂｐ上流の５°端を示す）。雑種形
成実験（この領域の単ストランドＭ Ｉ ３クローンを
用いる）は転写の方向が第２図に示すごとく、左から右
であること（オなイつち、転写はｇａｌＫの方へ進向す
る）を示している。
の５ａｕ３ΔＩインザートを含有することが示され、こ
れは、ザザーン、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バ
イオロジー９８．５０３（＋９７５）の方法によるサザ
ーン・プロット分析により、［（ｉｎｄｌＩ［およびＢ
ｇｌ１１部位内に倉荷される（表Ａ、地図位置１〜２）
。クローンしたフラグメントを、ストレプトマイセス・
リビダンス！３２６−＋２Ｉ（およびイー・コリＫ１２
培養から単離しｆ二ＦｔＮＡを用いるＳｔ分析により分
析した。８１消化後得られたフラグメントは２９０ヌク
レオチド保護フラグメントである（Ｓａｕ３Ａ１部位の
＋ｎＲＮＡ２９０のｂｐ上流の５°端を示す）。雑種形
成実験（この領域の単ストランドＭ Ｉ ３クローンを
用いる）は転写の方向が第２図に示すごとく、左から右
であること（オなイつち、転写はｇａｌＫの方へ進向す
る）を示している。
通常のＤ Ｎ Ａ配列分析および追加の８１地図作製分
析を用いてｍ１ｌＮＡの５°端を規定した。
析を用いてｍ１ｌＮＡの５°端を規定した。
ＰＩのガラクトース誘導調節に関与する配列を、ヌクレ
アーゼＢａ１３１により転写開始部位の上流配列を除去
することにより位置づけした。これらの配列除去による
プロモーター機能またはガラクトース誘導におけるいず
れもの変化をＰｌ同定に用いたイー・コリｇａｌＫプロ
モーター・プローブ・プラスミドを用いて評価した。
アーゼＢａ１３１により転写開始部位の上流配列を除去
することにより位置づけした。これらの配列除去による
プロモーター機能またはガラクトース誘導におけるいず
れもの変化をＰｌ同定に用いたイー・コリｇａｌＫプロ
モーター・プローブ・プラスミドを用いて評価した。
（ｉｉｉ）ｇａｌプロモーター欠失の構成Ｐ１転写開始
から下ｉｉ？Ｅ１００ｂｐおよびＰ１転写開始から上流
２＋６ｂｐの配列を含むＤＮＡフラグメントをプラスミ
ドｐＵｃ１９ＴＴｌにクローンしてプラスミドｐＨＬ５
を構成する。プラスミドｐＵＣＩ ９ＴＴ １はノーラ
ンダーら、ジーン２６．１ｏｔ−１０６（１９８３）に
記載されており、ｐＵＣ１８−ＴＴ Ｓとしてのアンカ
ー（Ｕ ｎｋｅｒ）を有している。実施例ＩＢ参照。ｐ
ｔの前の上流配列中に延長する欠失はｐＨＬ５をＨ４ｎ
ｄＩＩｌで線状化し、ヌクレアーゼＢａ１３１で端部を
処理することにより発生させることがてきる。不均一端
をＤＮＡポリメラーゼＩのフレノウ・フラグメントて修
復する。マイて、Ｂａ１３１処理ｐＨＬ５をＢａｍＨＩ
て消化し、５％アクリルアミド・ゲル上を泳動すｄ７．
、。分子ｆｉｋｌ ＯＯ〜３００ｂｐノＤＮＡ７ラグメ
ントをゲルから溶出し、ＨｉｎｄｌＩおよびＢａｍＨＩ
てｉ白化した！ｖｌ１３ｍｐｌｏｌこザブクローンする
。
から下ｉｉ？Ｅ１００ｂｐおよびＰ１転写開始から上流
２＋６ｂｐの配列を含むＤＮＡフラグメントをプラスミ
ドｐＵｃ１９ＴＴｌにクローンしてプラスミドｐＨＬ５
を構成する。プラスミドｐＵＣＩ ９ＴＴ １はノーラ
ンダーら、ジーン２６．１ｏｔ−１０６（１９８３）に
記載されており、ｐＵＣ１８−ＴＴ Ｓとしてのアンカ
ー（Ｕ ｎｋｅｒ）を有している。実施例ＩＢ参照。ｐ
ｔの前の上流配列中に延長する欠失はｐＨＬ５をＨ４ｎ
ｄＩＩｌで線状化し、ヌクレアーゼＢａ１３１で端部を
処理することにより発生させることがてきる。不均一端
をＤＮＡポリメラーゼＩのフレノウ・フラグメントて修
復する。マイて、Ｂａ１３１処理ｐＨＬ５をＢａｍＨＩ
て消化し、５％アクリルアミド・ゲル上を泳動すｄ７．
、。分子ｆｉｋｌ ＯＯ〜３００ｂｐノＤＮＡ７ラグメ
ントをゲルから溶出し、ＨｉｎｄｌＩおよびＢａｍＨＩ
てｉ白化した！ｖｌ１３ｍｐｌｏｌこザブクローンする
。
（メッシング（Ｍｅｓｓｉｎｇ）、メソソズ・イン・エ
ンザイモロジイ、１０１．２０（１９８３）参照）。
ンザイモロジイ、１０１．２０（１９８３）参照）。
個々の欠失を、前記サンガーらのノデオキノ鎖終止法に
より、単ストランド・ファージＤＮＡから配列づけする
。
より、単ストランド・ファージＤＮＡから配列づけする
。
（ｉｖ）ＰＩプロモーター欠失のイー・コリｇａｌＫ遺
伝子への結合 種々のｍｐｌｏクローンをＢａｍＨＩおよびＩ−ｆｉｎ
ｄ旧て消化した。個々の欠失を有するＤＮＡフラグメン
トを低融点アガロース・ゲルから単離し、Ｂａｍｔ（Ｉ
および）［１ｎｄｌＩ［で消化したｐＫ２１に連結した
（第２図参照）。イー・コリＭＭ２９＝１への形質転換
後、ブうスミドＤＮＡを、各欠失誘導体について単離し
、ストレプトマイセス・リビダンス１２Ｋに形質転換し
た。
伝子への結合 種々のｍｐｌｏクローンをＢａｍＨＩおよびＩ−ｆｉｎ
ｄ旧て消化した。個々の欠失を有するＤＮＡフラグメン
トを低融点アガロース・ゲルから単離し、Ｂａｍｔ（Ｉ
および）［１ｎｄｌＩ［で消化したｐＫ２１に連結した
（第２図参照）。イー・コリＭＭ２９＝１への形質転換
後、ブうスミドＤＮＡを、各欠失誘導体について単離し
、ストレプトマイセス・リビダンス１２Ｋに形質転換し
た。
（ｖ）ストレプトマイセス・リビダンスにおけるＢａ１
３１−発生欠失の機能的評価 各々のプロモーター欠失について、１つのチオストレプ
トン耐性形質転換体をＹＭベース（ＹＥＭＥ）＋ｌＯμ
９７ＭＱ、チオストレプトン中で後記ｌｏｇまで増殖さ
せた。細胞をペレット化し、Ｍ５６培地中で１回洗浄し
、Ｍ５６培地に再懸濁した（前記ミラーら参照）。洗浄
した細胞を、１％ガラクトースまたはＩ％グルコース補
足ＹＭ＋０．１〜ｉ ＭＯＰＳ（叶１７．２）＋ＩＯ
μｇ／祿チオストレプトンへの接種に用いた。細胞を１
６時間増殖さ仕、ついで、ガラクトースキナーゼ活性を
検定した。
３１−発生欠失の機能的評価 各々のプロモーター欠失について、１つのチオストレプ
トン耐性形質転換体をＹＭベース（ＹＥＭＥ）＋ｌＯμ
９７ＭＱ、チオストレプトン中で後記ｌｏｇまで増殖さ
せた。細胞をペレット化し、Ｍ５６培地中で１回洗浄し
、Ｍ５６培地に再懸濁した（前記ミラーら参照）。洗浄
した細胞を、１％ガラクトースまたはＩ％グルコース補
足ＹＭ＋０．１〜ｉ ＭＯＰＳ（叶１７．２）＋ＩＯ
μｇ／祿チオストレプトンへの接種に用いた。細胞を１
６時間増殖さ仕、ついで、ガラクトースキナーゼ活性を
検定した。
Ｐ１転写用開始部位の上流１２０．６７．５５．３４．
３１，２４．２０．１８．１０または８ｂｐ配列のいず
れかを含有する各ｐＫ２１誘導体をガラクト−スキナー
セの発現について分析した。結果は、ＰＩのガラクトー
ス誘導に必要な全ての情報（すなわち、ガラクトース増
殖細胞において産生されたガラクトキナーゼのレベルか
グルコース増殖細胞におけるレベルより１０〜２０倍大
きい）が２１の上流の３１ｂｐ配列に含まれろことを示
した。Ｉ） ｌの上流３４ｂｐ配列を残した欠失ば、ガ
ラクトースが６倍量のガラクトキナーゼを誘導するので
、ガラクトースによって部分的に誘導性である。すなわ
ち、オペレーターの一端は、−２４および一３１倍の間
の配列内に位置しなければならない。上流配列の２０．
１８、ｌＯまたは８．、ｂｌ）のいずれかを残した残り
の欠失は構成性Ｐ１プロモーター、すなわち、産生じた
ガラクトキナーゼのレベルが、細胞をガラクトースまた
はグルコースの存在下で増殖さＵ゛た場合、同等である
。Ｐｌの８および１Ｏｂｐを有する°プロモーター欠失
は構成性ではあるが、ガラクトキナーゼの量は、１８〜
１２０ｂｐの上流配列を有するプロモーター欠失に比べ
、１０倍減少した。この結果はＰｌの−ｌＯおよび−１
８位間の配列がプロモーター機能に必須であることを示
している。
３１，２４．２０．１８．１０または８ｂｐ配列のいず
れかを含有する各ｐＫ２１誘導体をガラクト−スキナー
セの発現について分析した。結果は、ＰＩのガラクトー
ス誘導に必要な全ての情報（すなわち、ガラクトース増
殖細胞において産生されたガラクトキナーゼのレベルか
グルコース増殖細胞におけるレベルより１０〜２０倍大
きい）が２１の上流の３１ｂｐ配列に含まれろことを示
した。Ｉ） ｌの上流３４ｂｐ配列を残した欠失ば、ガ
ラクトースが６倍量のガラクトキナーゼを誘導するので
、ガラクトースによって部分的に誘導性である。すなわ
ち、オペレーターの一端は、−２４および一３１倍の間
の配列内に位置しなければならない。上流配列の２０．
１８、ｌＯまたは８．、ｂｌ）のいずれかを残した残り
の欠失は構成性Ｐ１プロモーター、すなわち、産生じた
ガラクトキナーゼのレベルが、細胞をガラクトースまた
はグルコースの存在下で増殖さＵ゛た場合、同等である
。Ｐｌの８および１Ｏｂｐを有する°プロモーター欠失
は構成性ではあるが、ガラクトキナーゼの量は、１８〜
１２０ｂｐの上流配列を有するプロモーター欠失に比べ
、１０倍減少した。この結果はＰｌの−ｌＯおよび−１
８位間の配列がプロモーター機能に必須であることを示
している。
このデータは、ＰＩのガラクトース誘導が、少なくとも
部分的にオペレーター配列に介在されるモデルを支持し
ている。この配列の一端はＰ１転写開始部位の上流２４
〜３１ｂｐである。オペレーターの一部または全部の除
去は部分的または全体的に脱抑制されたプロモーターを
もたらす。この配列の曲端はこれらの実験によって規定
されないが、はぼｐｔ転写開始部位の上流２４〜３１ｂ
ｐ配列内に含まれると考えられる。さらに、これらの配
列がガラクトース誘導を達成するに必要な最小領域内に
含まれているので、本発明者らはオペレーターの３°端
ら転写開始部位の上流ｔｏｏｂｐ内にある可能性を排除
できない。これらのデータは、オペレーター配列と相互
作用する因子がレプレッサー蛋白質であることを示唆し
ている。最後に、本発明者らは、ＰＩがレプレッサー以
外の因子（すなわち、ラムダファージｃＩ［蛋白質のよ
うな陽性アクチヘーター）によって制御されてガラクト
ース誘発プロモーター転写体を調節しうるという可能性
を排除する証拠を有しない。
部分的にオペレーター配列に介在されるモデルを支持し
ている。この配列の一端はＰ１転写開始部位の上流２４
〜３１ｂｐである。オペレーターの一部または全部の除
去は部分的または全体的に脱抑制されたプロモーターを
もたらす。この配列の曲端はこれらの実験によって規定
されないが、はぼｐｔ転写開始部位の上流２４〜３１ｂ
ｐ配列内に含まれると考えられる。さらに、これらの配
列がガラクトース誘導を達成するに必要な最小領域内に
含まれているので、本発明者らはオペレーターの３°端
ら転写開始部位の上流ｔｏｏｂｐ内にある可能性を排除
できない。これらのデータは、オペレーター配列と相互
作用する因子がレプレッサー蛋白質であることを示唆し
ている。最後に、本発明者らは、ＰＩがレプレッサー以
外の因子（すなわち、ラムダファージｃＩ［蛋白質のよ
うな陽性アクチヘーター）によって制御されてガラクト
ース誘発プロモーター転写体を調節しうるという可能性
を排除する証拠を有しない。
ｂ）Ｐ２プロモーター
（１）概要
ストレプトマイセスｇａｌオペロンのＰ２プロモーター
はｇａｌ Ｅ遺伝子の上流で、ｇａｌＥおよびｇａｌＫ
遺伝子の両方を転写する。
はｇａｌ Ｅ遺伝子の上流で、ｇａｌＥおよびｇａｌＫ
遺伝子の両方を転写する。
Ｐ２２プロモーター現はＳ１分升によって示されろよう
に構成的（すなわち、グルコース抑制／ガラクトース誘
導でない）である。
に構成的（すなわち、グルコース抑制／ガラクトース誘
導でない）である。
（ｉｉ）実験：Ｐ２プロモーターの単離、位置決め、特
性づけ ストレプトマイセスｇａｌオペロンＰ２の存在は、スト
レプトマイセス・リビダンスｌ ３２６ＤＮＡのＢａ１
Ｉ［−ＭｌｕｌフラグメントをプラスミドｐＫ２１に挿
入しく第２図参照）、それによって形質転換されたスト
レプトマイセス・リビダンス１３２６−１２に中でガラ
クトキナーゼ発現が観察されろ場合に明らかとなった。
性づけ ストレプトマイセスｇａｌオペロンＰ２の存在は、スト
レプトマイセス・リビダンスｌ ３２６ＤＮＡのＢａ１
Ｉ［−ＭｌｕｌフラグメントをプラスミドｐＫ２１に挿
入しく第２図参照）、それによって形質転換されたスト
レプトマイセス・リビダンス１３２６−１２に中でガラ
クトキナーゼ発現が観察されろ場合に明らかとなった。
ＤＮＡ配列分析およびＳ１分升を用いてストレプトマイ
セス・リビダンスｇａｌオペロンＰ２の５゜端を同定し
た。Ｐ２プロモーター転写体の５″端は予測したｇａｌ
Ｅ ＡＴＧの上流１００ｂｐ内にある。
セス・リビダンスｇａｌオペロンＰ２の５゜端を同定し
た。Ｐ２プロモーター転写体の５″端は予測したｇａｌ
Ｅ ＡＴＧの上流１００ｂｐ内にある。
実施例３
ストレプトマイセスｇａｌオペロン内のポリジストロニ
ック・メソセージの証拠 Ｓ１分升を用いてストレプトマイセス・リビダンスｇａ
ｌオペロンｇａｌＫ遺伝子の転写体上流および下流の地
図を作製した。一般に、１〜２Ｋｂのオーバー・ラップ
ＤＮＡフ゛ラグメントをクローンから単離し、 さらに
制限し、末端をラベルした。
ック・メソセージの証拠 Ｓ１分升を用いてストレプトマイセス・リビダンスｇａ
ｌオペロンｇａｌＫ遺伝子の転写体上流および下流の地
図を作製した。一般に、１〜２Ｋｂのオーバー・ラップ
ＤＮＡフ゛ラグメントをクローンから単離し、 さらに
制限し、末端をラベルした。
メツセージはｇａｌＫの３°端からＰｌの上流端まで続
く。
く。
ストレプトマイセス・リビダンスｇａｌオペロン転写体
の３゛端は多分、ｇａｌＫの最初の１００塩基下流内に
生じろ。ｇａｌＫ配列内の部位で３′ラベルしたフラグ
メントは、下流領域に伸長する場合、その全長までは保
護されない。 １つの実験は、ｇａ！に翻訳終止の下流
５０〜１ｏｏｂｐて終止する領域で保護されうろことを
示している。転写ターミネータ−の存在はターミネータ
−・プローブを用いる通常の技術によって確認できる。
の３゛端は多分、ｇａｌＫの最初の１００塩基下流内に
生じろ。ｇａｌＫ配列内の部位で３′ラベルしたフラグ
メントは、下流領域に伸長する場合、その全長までは保
護されない。 １つの実験は、ｇａ！に翻訳終止の下流
５０〜１ｏｏｂｐて終止する領域で保護されうろことを
示している。転写ターミネータ−の存在はターミネータ
−・プローブを用いる通常の技術によって確認できる。
ｇａｌオペロン転写体は、当該部位から５°ラベルＰｖ
ｕ［Ｉフラグメントの非全長保護が生じるので、明らか
にＰｖｕ１１部位まで伸長しない（表Ａ、地図位置８参
照）。
ｕ［Ｉフラグメントの非全長保護が生じるので、明らか
にＰｖｕ１１部位まで伸長しない（表Ａ、地図位置８参
照）。
２つのＰｖｕｌＩからの５°端ラベルフラグメント、フ
ラグメントＩ（表Ａ、地図位置４〜６参照）およびフラ
グメント■（表Ａ、地図位置６〜８参照）ならびにｐｓ
ａｕｌＯインサートを、メツセージの３゜から５′端へ
のＳｌウオーキング（ｗａｒｋｉｎｇ）のプローブ源と
して用いた。この領域の全てのフラグメントは、部分お
よび完全保護を示すＰ２プロモーター含有フラグメント
を除き、保護された。Ｓ１消化からの完全保護は、 ｐ
ｔの上流で開始し、ｇａｌＫの約ｔｏｏｂｐ下流まで続
くポリンストロニック・メツセージを示す。
ラグメントＩ（表Ａ、地図位置４〜６参照）およびフラ
グメント■（表Ａ、地図位置６〜８参照）ならびにｐｓ
ａｕｌＯインサートを、メツセージの３゜から５′端へ
のＳｌウオーキング（ｗａｒｋｉｎｇ）のプローブ源と
して用いた。この領域の全てのフラグメントは、部分お
よび完全保護を示すＰ２プロモーター含有フラグメント
を除き、保護された。Ｓ１消化からの完全保護は、 ｐ
ｔの上流で開始し、ｇａｌＫの約ｔｏｏｂｐ下流まで続
くポリンストロニック・メツセージを示す。
前記のデータはストレプトマイセスｇａｌオペロンのポ
リジストロニックｍ ＲＮ Ａの間接的証拠である。長
い隣接するＤＮＡフラグメント（例えば１．１．５Ｋｂ
Ｈｉｎｄ［ｌ−９ａｃＩフラグメント、表Ａ１地図
位置７参照）を用いるＳ１分析を転写体サイズの確認に
用いた。
リジストロニックｍ ＲＮ Ａの間接的証拠である。長
い隣接するＤＮＡフラグメント（例えば１．１．５Ｋｂ
Ｈｉｎｄ［ｌ−９ａｃＩフラグメント、表Ａ１地図
位置７参照）を用いるＳ１分析を転写体サイズの確認に
用いた。
実施例４
ストレプトマイセス・リビダンスｇａｌオペロンｇａｌ
ＥおよびｇａｌＴ遺伝子の位置決め（１）概要 ストレプトマイセス・リビダンスｇａｌオペロンｇａｌ
Ｅ遺伝子はｐｓＬＩＶＧＡＬＩの１．５ＫｂＰｖｕ［ｌ
フラグメント（表Ａの地図位置４〜６）に位置ずろ（第
１図）。
ＥおよびｇａｌＴ遺伝子の位置決め（１）概要 ストレプトマイセス・リビダンスｇａｌオペロンｇａｌ
Ｅ遺伝子はｐｓＬＩＶＧＡＬＩの１．５ＫｂＰｖｕ［ｌ
フラグメント（表Ａの地図位置４〜６）に位置ずろ（第
１図）。
ストレプトマイセス・リビダンスｇａｌオペロンｇａｌ
Ｅコード付け配列はＭｌｕｒ部位を通して伸長する（表
Ａの地図位置５）。
Ｅコード付け配列はＭｌｕｒ部位を通して伸長する（表
Ａの地図位置５）。
ストレプトマイセス・リビダンスｇａｌオペロンｇａｌ
遺伝子はｐｓＬＩＶＧＡＬｌの１．＋５ＫｂＮｒｕ−Ｐ
ｖｕＩＩ領域に位置する（表Ａの地図位置１ａ〜４参照
）。
遺伝子はｐｓＬＩＶＧＡＬｌの１．＋５ＫｂＮｒｕ−Ｐ
ｖｕＩＩ領域に位置する（表Ａの地図位置１ａ〜４参照
）。
ストレプトマイセス・リビダンスｇａｌオペロンｇａｌ
ＥおよびｇａｌＴ転写方向はｇａｌＫ遺伝子と同じであ
る。
ＥおよびｇａｌＴ転写方向はｇａｌＫ遺伝子と同じであ
る。
（１１）実験
ｐｓＬＩＶＧＡｌｌに含有される他の機能特に、酵素ガ
ラクト−ス・エビメラーセ（ｇａ Ｉ Ｅ ）または酵
素ガラクトース・トランスフェラーゼ（ｇａｌＴ）をコ
ード付けするプラスミドを同定する必要がある。ストレ
プトマイセスｇａｌオペロンｇａｌＫ遺伝子はそのイー
・コリｇａｌＫ宿主を相補する能力で同定しｆこ。かく
して、ストレプトマイセスｇａｌＴおよびｇａｌＥ遺伝
子の同定は、各々、イー・コリｇａｌＥ−またはｇａｌ
Ｔ−宿主の相補によりテストした。
ラクト−ス・エビメラーセ（ｇａ Ｉ Ｅ ）または酵
素ガラクトース・トランスフェラーゼ（ｇａｌＴ）をコ
ード付けするプラスミドを同定する必要がある。ストレ
プトマイセスｇａｌオペロンｇａｌＫ遺伝子はそのイー
・コリｇａｌＫ宿主を相補する能力で同定しｆこ。かく
して、ストレプトマイセスｇａｌＴおよびｇａｌＥ遺伝
子の同定は、各々、イー・コリｇａｌＥ−またはｇａｌ
Ｔ−宿主の相補によりテストした。
イー・コリｇａｌＴ−株（ＣＧＳＣ味＃４４６７、Ｗ３
１０１）および２つのｇａｌＥ−昧（ＣＧＳＣ妹＃４４
７３、Ｗ３１０９およびＣＧＳＣ株＃４４９８、ｒ’Ｌ
−２）を得、ｐｓＬＩＶＧＡＬｌクローンによる相補の
テストをした。
１０１）および２つのｇａｌＥ−昧（ＣＧＳＣ妹＃４４
７３、Ｗ３１０９およびＣＧＳＣ株＃４４９８、ｒ’Ｌ
−２）を得、ｐｓＬＩＶＧＡＬｌクローンによる相補の
テストをした。
ストレプトマイセス・リビダンスｇａｌオペロンｇａｌ
Ｋ遺伝子を含有する約９ＫｂのＨ１ｎｄｌｌｌｌ −Ｓ
ｐｈＩフラグメント（表Ａ１地図位置１−１６をｐＵ
Ｃｊ９に挿入した。このフラグメントはＰＩＪＣＩ９内
で、ｌ）［ＪＣ１９のＰｌａｃプロモーターからの転写
がストレプトマイセスｇａｌＫ遺伝子と同じ方向になる
ように位置させる。ｐＵｃ１９はヤニソンユーペローら
、ノーン（Ｙ ａｎｉｓｃｈ−Ｐ ｅｒｒｏｕ ｅｔ
ａｌ 。
Ｋ遺伝子を含有する約９ＫｂのＨ１ｎｄｌｌｌｌ −Ｓ
ｐｈＩフラグメント（表Ａ１地図位置１−１６をｐＵ
Ｃｊ９に挿入した。このフラグメントはＰＩＪＣＩ９内
で、ｌ）［ＪＣ１９のＰｌａｃプロモーターからの転写
がストレプトマイセスｇａｌＫ遺伝子と同じ方向になる
ように位置させる。ｐＵｃ１９はヤニソンユーペローら
、ノーン（Ｙ ａｎｉｓｃｈ−Ｐ ｅｒｒｏｕ ｅｔ
ａｌ 。
Ｇｅｎｅ）３３．１０３（１９８３）に記載されている
。相捕はマツコンキー−ガラクトース平板上での増殖に
より検定した。ガラクトースを利用できろ細胞（ｇａｌ
Ｅ” 、ｇａｌＴ＝ 、ｇａｌＫ″″）はこの培地上で
赤〜桃色となる。Ｉｆ １ｎｄＩ［ｌ −Ｓ ｐｈ Ｉ
インサートを有するｐＵｃＩ９含有イー・コリ株ＰＬ−
２（実施例２参照）はこの指示薬平板上で桃色になり、
［−１ｉｎｄ［［−Ｓ ｐｈ ｌフラグメントがストレ
プトマイセス・リビダンスｇａｌＥ遺伝子を含有するこ
とを示した。ｇａｌＥ遺伝子は４．５Ｋｂ ｌ−１ｉ
ｎｄｌＩ［−９ａｃ１（Ｓａｃ１部位は表への地図位置
７〜８近辺の領域に近い）フラグメント内に地図作製し
た。Ｍｌｕ１部位（表Ａ、地図位置５）から５ａｃ１部
位までの配列を除くと、イー・コリＰＬ−２のｇａｌＥ
相浦は相補されなかった。ｇａｌＫ遺伝子の５°端はＭ
ｌｕ１部位から７ｏｂｐにある。したがって、Ｍｌｕ１
部イでｆ！ＦＣｌ２１Ｒ＋Ｆ’ｌヒイｒ二ＸのＦ＋’−
ｔｌ−１＋’（’ン：＋；ｒ）＝１１、−今市り、７゜
よってある。ｇａｌＥ 転写方向を決定するため、！−
Ｉ ｉｎｄ［−Ｓ ａｃ ｌフラグメントをｐＵｃ１８
に挿入した。この配置において、ストレプトマイセス・
リヒダンスｇａｌＫ遺伝子はＰｌａｃに関して反対の方
向にある。ｐｕｃ Ｉ ８Ｉ（ｉｎｄｌＩＩ−３ｐｈｌ
クローンはイー・コリＰＬ−２を相補せず、ｇａｌＥは
ｇａｌＫと同じ方向で転写されることを示している。さ
らにＭｌｕ１部位はｇａｌＥ遺伝子の３゛瑞内に含まれ
ると結論された。Ｐｖｕｌｌ−Ｍｌｕｌフラグメント（
表Ａ、地図位置４−５）のＤＮＡ配列分析は予測分子量
３３０００ダルトンのポリペプチドをコード付けするオ
ープン・リーディング・フレームを決定した。このリー
ディング・フレームの５°端はＰｖｕ■部位から約１７
６ｂｐに位置する（表Ａ、地図位置４参照）。かくして
、この配列づけの結果はｇａｌＥの３゛端がＭｌｕ１部
位を１１′へ切るという結論を指示している（表Ａ、地
図位置５参照）。
。相捕はマツコンキー−ガラクトース平板上での増殖に
より検定した。ガラクトースを利用できろ細胞（ｇａｌ
Ｅ” 、ｇａｌＴ＝ 、ｇａｌＫ″″）はこの培地上で
赤〜桃色となる。Ｉｆ １ｎｄＩ［ｌ −Ｓ ｐｈ Ｉ
インサートを有するｐＵｃＩ９含有イー・コリ株ＰＬ−
２（実施例２参照）はこの指示薬平板上で桃色になり、
［−１ｉｎｄ［［−Ｓ ｐｈ ｌフラグメントがストレ
プトマイセス・リビダンスｇａｌＥ遺伝子を含有するこ
とを示した。ｇａｌＥ遺伝子は４．５Ｋｂ ｌ−１ｉ
ｎｄｌＩ［−９ａｃ１（Ｓａｃ１部位は表への地図位置
７〜８近辺の領域に近い）フラグメント内に地図作製し
た。Ｍｌｕ１部位（表Ａ、地図位置５）から５ａｃ１部
位までの配列を除くと、イー・コリＰＬ−２のｇａｌＥ
相浦は相補されなかった。ｇａｌＫ遺伝子の５°端はＭ
ｌｕ１部位から７ｏｂｐにある。したがって、Ｍｌｕ１
部イでｆ！ＦＣｌ２１Ｒ＋Ｆ’ｌヒイｒ二ＸのＦ＋’−
ｔｌ−１＋’（’ン：＋；ｒ）＝１１、−今市り、７゜
よってある。ｇａｌＥ 転写方向を決定するため、！−
Ｉ ｉｎｄ［−Ｓ ａｃ ｌフラグメントをｐＵｃ１８
に挿入した。この配置において、ストレプトマイセス・
リヒダンスｇａｌＫ遺伝子はＰｌａｃに関して反対の方
向にある。ｐｕｃ Ｉ ８Ｉ（ｉｎｄｌＩＩ−３ｐｈｌ
クローンはイー・コリＰＬ−２を相補せず、ｇａｌＥは
ｇａｌＫと同じ方向で転写されることを示している。さ
らにＭｌｕ１部位はｇａｌＥ遺伝子の３゛瑞内に含まれ
ると結論された。Ｐｖｕｌｌ−Ｍｌｕｌフラグメント（
表Ａ、地図位置４−５）のＤＮＡ配列分析は予測分子量
３３０００ダルトンのポリペプチドをコード付けするオ
ープン・リーディング・フレームを決定した。このリー
ディング・フレームの５°端はＰｖｕ■部位から約１７
６ｂｐに位置する（表Ａ、地図位置４参照）。かくして
、この配列づけの結果はｇａｌＥの３゛端がＭｌｕ１部
位を１１′へ切るという結論を指示している（表Ａ、地
図位置５参照）。
ｐｓＬＩＶＧＡＬｌ上のｇａｌＴＩｆｊ伝子を位置づ転
子る同１ゑな実験をｇａｌＴ宿主で試みた。
子る同１ゑな実験をｇａｌＴ宿主で試みた。
１） ＩおよびｇａｌＥの５゛端間の領域を配列づけし
てｇａｌＴ遺伝子を同定した。ＤＮＡ配列のアミノ酸配
列への翻訳は酵母トランスフェラーゼに相同な領域を示
す蛋白質をコード付けするリーディング・フレームを規
定する。
てｇａｌＴ遺伝子を同定した。ＤＮＡ配列のアミノ酸配
列への翻訳は酵母トランスフェラーゼに相同な領域を示
す蛋白質をコード付けするリーディング・フレームを規
定する。
実施例５
ストレプトマイセス・リビダンスｇａｌオペロンｇａｌ
Ｋ遺伝子のガラクトース誘導 （ｉ）概要 ガラクトースを培地に添加後１時間以内にガラクトキナ
ーゼ発現が誘導される。
Ｋ遺伝子のガラクトース誘導 （ｉ）概要 ガラクトースを培地に添加後１時間以内にガラクトキナ
ーゼ発現が誘導される。
グルコースの存在下または該糖添加後６時間以内に追加
の炭素源を加えない場合に対し、ガラクトースの存在下
ではガラクトキナーゼの発現は１０倍ら高い。
の炭素源を加えない場合に対し、ガラクトースの存在下
ではガラクトキナーゼの発現は１０倍ら高い。
（１１）実験
ストレプトマイセス・リビダンスｇａｌＫ遺伝子のガラ
クトース誘導を、ガラクトースの添加後、ｌ、３．６お
よび２４時間におけるガラクトキナーゼ活性の検定によ
り試験した。ＹＭ＋Ｏ，１ＭＭ０ＰＳ（ｐｉ−ｒ７．２
）２Ｑにストレプトマイセス・リビダンス１３２６の胞
子２ＸＩ０７個を接種した。２１時間増殖後、最終濃度
１％でガラクトースまｆこはグルコースを加えた。塘添
加１，３．６および２４時間後、細胞を単離し、ガラク
トキナーゼ活性を検定した。全ＲＮＡは前記ホップウッ
ドらに記載の方法で調製した。
クトース誘導を、ガラクトースの添加後、ｌ、３．６お
よび２４時間におけるガラクトキナーゼ活性の検定によ
り試験した。ＹＭ＋Ｏ，１ＭＭ０ＰＳ（ｐｉ−ｒ７．２
）２Ｑにストレプトマイセス・リビダンス１３２６の胞
子２ＸＩ０７個を接種した。２１時間増殖後、最終濃度
１％でガラクトースまｆこはグルコースを加えた。塘添
加１，３．６および２４時間後、細胞を単離し、ガラク
トキナーゼ活性を検定した。全ＲＮＡは前記ホップウッ
ドらに記載の方法で調製した。
ガラクトキナーゼ合成の増加はガラクトース添加１時間
後に観察された。この増加は持続した（１〜２４時間）
。誘導培養から単離したＲ Ｎ ＡのＳ１分析からｇａ
ｌＫ活性の増加がＰｉプロモーター転写体のレベル増加
によることを確認した。
後に観察された。この増加は持続した（１〜２４時間）
。誘導培養から単離したＲ Ｎ ＡのＳ１分析からｇａ
ｌＫ活性の増加がＰｉプロモーター転写体のレベル増加
によることを確認した。
Ｓｌデータおよび誘導研究はストレプトマイセスｇａｌ
オペロンにおける遺伝子発現についての以下のモデルを
示唆した。ＰＩプロモーターはガラクトース誘導プロモ
ーターである。Ｐ１転写体はｇａｌＴ、 ｇａｌＥおよ
びｇａｌＫを包含する。Ｐ２プロモーターは構成性で、
その転写体はｇａｌＩＥおよびｇａｌＫを包含する。
オペロンにおける遺伝子発現についての以下のモデルを
示唆した。ＰＩプロモーターはガラクトース誘導プロモ
ーターである。Ｐ１転写体はｇａｌＴ、 ｇａｌＥおよ
びｇａｌＫを包含する。Ｐ２プロモーターは構成性で、
その転写体はｇａｌＩＥおよびｇａｌＫを包含する。
イー・コリｇａｌオペロンら２つのプロモーターＰｌお
よびＰ２を有することは興味栗い［ナツツら、セル（Ｎ
ｕｓｓｏ ｅｔ ａｌ、 Ｃｅ１ｌ）１２．８４７
（１９７７）］。Ｐ ＩｉｉｃＡＭＰ−ＣＲＰ結合によ
って活性化されるが、Ｐ２はｃＡＭＰ−（、ＲＰによっ
て抑制される。イー・コリｇａｌオペロンｇａｌＥコー
ド付け配列翻訳は、ガラクトースの非存在下またはグル
コースの存在下でもエピメラーゼの一定の源を供給する
役割をするＰ２において転写が開始される場合、より効
率的である［クイーンら、セル（Ｑｕｅｅｎ ｅｔ
ａｌ、 Ｃｅ１ｌ）２５．２４１（１９８１）参照］
。エピメラーゼはガラクトース誘導用の間、ガラクトー
スをグルコース−１−ホスフェートに変え、ＵＤＰ−グ
ルコースをイー・コリの細胞壁生合成に必要なＵＤＰ−
ガラクトースに変える機能を有する。ストレプトマイセ
スｇａｌＫオペロンのＰ２プロモーターも、ガラクトー
スの非存在下または二次代謝の間にエピメラーゼおよび
ガラクトキナーゼを供給する役割をずろ可能性がある。
よびＰ２を有することは興味栗い［ナツツら、セル（Ｎ
ｕｓｓｏ ｅｔ ａｌ、 Ｃｅ１ｌ）１２．８４７
（１９７７）］。Ｐ ＩｉｉｃＡＭＰ−ＣＲＰ結合によ
って活性化されるが、Ｐ２はｃＡＭＰ−（、ＲＰによっ
て抑制される。イー・コリｇａｌオペロンｇａｌＥコー
ド付け配列翻訳は、ガラクトースの非存在下またはグル
コースの存在下でもエピメラーゼの一定の源を供給する
役割をするＰ２において転写が開始される場合、より効
率的である［クイーンら、セル（Ｑｕｅｅｎ ｅｔ
ａｌ、 Ｃｅ１ｌ）２５．２４１（１９８１）参照］
。エピメラーゼはガラクトース誘導用の間、ガラクトー
スをグルコース−１−ホスフェートに変え、ＵＤＰ−グ
ルコースをイー・コリの細胞壁生合成に必要なＵＤＰ−
ガラクトースに変える機能を有する。ストレプトマイセ
スｇａｌＫオペロンのＰ２プロモーターも、ガラクトー
スの非存在下または二次代謝の間にエピメラーゼおよび
ガラクトキナーゼを供給する役割をずろ可能性がある。
実施例６
ストレプトマイセス・コエリカラーｇａｌオペロン
（ｉ）概要
ストレプトマイセス・コエリカラーｇａｌＫ遺転子含宵
フラグメントの制限地図はストレプトマイセス・リビダ
ンスｇａｌオペロンの制限地図と同じである（第３図参
照）。
フラグメントの制限地図はストレプトマイセス・リビダ
ンスｇａｌオペロンの制限地図と同じである（第３図参
照）。
ストレプトマイセス・コエリカラーはガラクトースを０
１（−の炭素源とする最少培地上で増殖できろ。
１（−の炭素源とする最少培地上で増殖できろ。
ストレプトマイセス・コエリカラーにおけるガラクトキ
ナーゼ発現は増殖培地にガラクトースを添加することに
より誘導される。
ナーゼ発現は増殖培地にガラクトースを添加することに
より誘導される。
ｆ） ｌと類似で、はぼ同一と考えられるプロモーター
かストレプトマイセス・コエリカラーｇａｌオペロンの
ガラクトース誘導に関与する。
かストレプトマイセス・コエリカラーｇａｌオペロンの
ガラクトース誘導に関与する。
（１１）実験
ストレプトマイセス・コエリカラーｇａｌＫ逍転子含有
の約１４ＫＩ＋部分５ａｕ３Ａフラグメントは英ＩＮマ
ンヂエスターの、ユニバーンティ・オフ・マンチェスタ
ー・インスティテユート・才ブ・ザイエンス・アンド・
テクノロジーにおいてケイ・ケンダルおよびノエイ・ク
ラム（Ｋ、 ＫｅｎｄａｌｌおよびＪ、 Ｃｕｌｌｕｍ
）によって単離された（未公開、私信）。彼等は、スト
レプトマイセス・コエリカラーｇａｌＫ変異株の相補に
より３Ｋｂ ＥｃｏＲＩフラグメント内にストレプト
マイセス・コエリカラーｇａｌＫ遺伝子を位置づけする
ことかできた。ストレプトマイセス・リビダンスｇａｌ
オペロン内の多くの制限部位の位置はストレプトマイセ
ス・コエリカラーｇａｌＫ遺伝子を含むＥｃｏＲＩフラ
グメントの」二点および下流内に見られる乙のと同しで
ある（第３図）。すなわち、ストレプトマイセス・コエ
リカラーｇａｌオペロンの遺伝子構成はストレプトマイ
セス・リビダンスｇａｌオペロンと同しであるように考
えられろ。
の約１４ＫＩ＋部分５ａｕ３Ａフラグメントは英ＩＮマ
ンヂエスターの、ユニバーンティ・オフ・マンチェスタ
ー・インスティテユート・才ブ・ザイエンス・アンド・
テクノロジーにおいてケイ・ケンダルおよびノエイ・ク
ラム（Ｋ、 ＫｅｎｄａｌｌおよびＪ、 Ｃｕｌｌｕｍ
）によって単離された（未公開、私信）。彼等は、スト
レプトマイセス・コエリカラーｇａｌＫ変異株の相補に
より３Ｋｂ ＥｃｏＲＩフラグメント内にストレプト
マイセス・コエリカラーｇａｌＫ遺伝子を位置づけする
ことかできた。ストレプトマイセス・リビダンスｇａｌ
オペロン内の多くの制限部位の位置はストレプトマイセ
ス・コエリカラーｇａｌＫ遺伝子を含むＥｃｏＲＩフラ
グメントの」二点および下流内に見られる乙のと同しで
ある（第３図）。すなわち、ストレプトマイセス・コエ
リカラーｇａｌオペロンの遺伝子構成はストレプトマイ
セス・リビダンスｇａｌオペロンと同しであるように考
えられろ。
ストレプトマイセス・コエリカラーｇａｌＫ遺伝子のガ
ラクトース誘導をイムノブロッティングで試験した。ス
トレプトマイセス・コエリカラーをＹＭ＋１％ガラクト
ースまたは１％グルコース（ＹｍｇｌｕまたはＹｍｇａ
ｌ）中、２８°Ｃで２０時間増殖させた。ガラクトキナ
ーゼ発現は、精製イー・コリ・カラクトキナーゼに対し
て調製したウサギ抗＋Ｉ＋を清を用いて検出した。検出
した蛋白質はイー・コリおよびストレプトマイセス・リ
ビダンスｇａｌＫ遺伝子生成物の近似部位であった。ガ
ラクトキナーゼ発現は、ストレプトマイセス・コエリカ
ラーがＹｍ＋ガラクトース（Ｙｍｇａｌ）中で増殖した
場合のみ検出されるので、ガラクトース誘導である。
ラクトース誘導をイムノブロッティングで試験した。ス
トレプトマイセス・コエリカラーをＹＭ＋１％ガラクト
ースまたは１％グルコース（ＹｍｇｌｕまたはＹｍｇａ
ｌ）中、２８°Ｃで２０時間増殖させた。ガラクトキナ
ーゼ発現は、精製イー・コリ・カラクトキナーゼに対し
て調製したウサギ抗＋Ｉ＋を清を用いて検出した。検出
した蛋白質はイー・コリおよびストレプトマイセス・リ
ビダンスｇａｌＫ遺伝子生成物の近似部位であった。ガ
ラクトキナーゼ発現は、ストレプトマイセス・コエリカ
ラーがＹｍ＋ガラクトース（Ｙｍｇａｌ）中で増殖した
場合のみ検出されるので、ガラクトース誘導である。
ストレプトマイセス・コエリカラーｇａｌオペロノのガ
ラクトース誘導がストレプトマイセス・リビダンスＰＩ
プロモーターに類似するプロモーターによって指示され
ているか否かを決定するために８１ヌクレアーゼ保護研
究を行なった。ＲＮＡを、Ｙｍ’−，１％ガラクトース
または１％グルコース（ＹｍｇａｌまたはＹｍｇｌｕ）
中て増殖させたストレプトマイセス・コエリカラーから
単離した。このＲＮＡの８１分析に用いた雑種形成プロ
ーブは、ストレプトマイセス・リビダンスＰ１プロモー
ター、その転写開始部位およびｇａｌＴ遺伝子の５”端
を含む・１１０ｂｐＳａｕ３ Ａであった。この分析に
より検出されたＳ１保護フラグメントは、ガラクトース
存在Ｔで増殖したストレプトマイセス・リビダンスから
単離したＲＮＡとプローブを雑種形成させた場合、検出
した保護フラグメントと共に泳動しｆこ。すなわち、こ
の結果は、ストレプトマイセス・コエリカラーｇａｌオ
ペロンのガラクトース誘導がストレプトマイセス・リビ
ダンスＰＩプロモーターと区別できない配列によって指
示されていることを示している。
ラクトース誘導がストレプトマイセス・リビダンスＰＩ
プロモーターに類似するプロモーターによって指示され
ているか否かを決定するために８１ヌクレアーゼ保護研
究を行なった。ＲＮＡを、Ｙｍ’−，１％ガラクトース
または１％グルコース（ＹｍｇａｌまたはＹｍｇｌｕ）
中て増殖させたストレプトマイセス・コエリカラーから
単離した。このＲＮＡの８１分析に用いた雑種形成プロ
ーブは、ストレプトマイセス・リビダンスＰ１プロモー
ター、その転写開始部位およびｇａｌＴ遺伝子の５”端
を含む・１１０ｂｐＳａｕ３ Ａであった。この分析に
より検出されたＳ１保護フラグメントは、ガラクトース
存在Ｔで増殖したストレプトマイセス・リビダンスから
単離したＲＮＡとプローブを雑種形成させた場合、検出
した保護フラグメントと共に泳動しｆこ。すなわち、こ
の結果は、ストレプトマイセス・コエリカラーｇａｌオ
ペロンのガラクトース誘導がストレプトマイセス・リビ
ダンスＰＩプロモーターと区別できない配列によって指
示されていることを示している。
以下のストレプトマイセス味は唯一の炭素源としてガラ
クトースを含有する培地上で増殖できろことが観察され
た。
クトースを含有する培地上で増殖できろことが観察され
た。
ストレプトマイセス・アルブスＪ１０７４（前記英国ノ
ーウィッチのチャーター氏より人手）ストレプトマイセ
ス・カルノノスタティクス（Ｓ 、 ｃａｒｚｉｎｏｓ
ｔａｔｉｃｕｓ）ＡＴ ＣＣＮｏ、 ｌ ５９４４スト
レプトマイセス・カルジノスタティクスＡＴＣＣＮｏ、
ｌ ５９４５ ストレプトマイセス・アンチフィブリノリヂクス（”：
＊ｎ＋１ｆｉｈｒｉｎｎｌｖ＋ｉＣＩ：ｑ）ＡＴＣ
（′、Ｎｎ ２１ Ｒストレプトマイセス・アンヂフィ
ブリノリチクスＩ＼ＴＣＣＮｏ、２１８７０ ストレプトマイセス・アンヂフィブリノリチクスＡｉ’
ＣＣＮｏ、２１８７１ ストレプトマイセス・ロンギスポルス（Ｓｌｏｎｇｉｓ
ｐｏｒｕｓ）Ａ Ｔ ＣＣＮｏ、 ２３９３１以上、本
発明の好ましい具体例を実施例として記載したが、本発
明はこれらに限定されるものではない。
ーウィッチのチャーター氏より人手）ストレプトマイセ
ス・カルノノスタティクス（Ｓ 、 ｃａｒｚｉｎｏｓ
ｔａｔｉｃｕｓ）ＡＴ ＣＣＮｏ、 ｌ ５９４４スト
レプトマイセス・カルジノスタティクスＡＴＣＣＮｏ、
ｌ ５９４５ ストレプトマイセス・アンチフィブリノリヂクス（”：
＊ｎ＋１ｆｉｈｒｉｎｎｌｖ＋ｉＣＩ：ｑ）ＡＴＣ
（′、Ｎｎ ２１ Ｒストレプトマイセス・アンヂフィ
ブリノリチクスＩ＼ＴＣＣＮｏ、２１８７０ ストレプトマイセス・アンヂフィブリノリチクスＡｉ’
ＣＣＮｏ、２１８７１ ストレプトマイセス・ロンギスポルス（Ｓｌｏｎｇｉｓ
ｐｏｒｕｓ）Ａ Ｔ ＣＣＮｏ、 ２３９３１以上、本
発明の好ましい具体例を実施例として記載したが、本発
明はこれらに限定されるものではない。
第１図はストレプトマイセス・リビダンス１３２６ｇａ
ｌオペロンの制限地図、第２図はプラスミドｐＫ２＋の
制限地図および第３図はストレプトマイセス・リビダン
スｇａｌオペロンと、ストーブＩ・マイセス・コエリカ
ラーｇａｌＫ遺伝子を含有する制限フラグメントを比較
する制限地図である。 特ａ’Ｆ出願人 スミスクライン・ヘソクマン・コーポ
レイノヨン 代 理 人 弁理士青 山 葆ほか２名第１図 ３図 ζ σ １勺 〉
ｌオペロンの制限地図、第２図はプラスミドｐＫ２＋の
制限地図および第３図はストレプトマイセス・リビダン
スｇａｌオペロンと、ストーブＩ・マイセス・コエリカ
ラーｇａｌＫ遺伝子を含有する制限フラグメントを比較
する制限地図である。 特ａ’Ｆ出願人 スミスクライン・ヘソクマン・コーポ
レイノヨン 代 理 人 弁理士青 山 葆ほか２名第１図 ３図 ζ σ １勺 〉
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 （１）ストレプトマイセスｇａｌオペロンまたはそのい
ずれかの調節可能な官能性誘導体からなることを特徴と
する組換型ＤＮＡ分子。 （２）該オペロンが、ストレプトマイセス・リビダンス
、ストレプトマイセス・コエリカラー、ストレプトマイ
セス・アズラエウス、ストレプトマイセス・アルブス、
ストレプトマイセス・カルジノスタティクス、ストレプ
トマイセス・アンチフィブリノリチクスまたはストレプ
トマイセス・ロンギスポルスのｇａｌオペロンである前
記第（１）項の分子。 （３）該オペロンがストレプトマイセス・リビダンスｇ
ａｌオペロンである前記第（２）項の分子。 （４）つぎのコード付け配列を有する前記第（３）項の
分子； 【遺伝子配列があります】 【遺伝子配列があります】 【遺伝子配列があります】 【遺伝子配列があります】 （５）該オペロンに作動的に結合した異種官能性ＤＮＡ
配列を含む前記第（１）項の分子。 （６）前記第（５）項の分子からなる形質転換宿主微生
物または細胞。 （７）適当な宿主微生物または細胞を前記第（５）項の
分子で形質転換することを特徴とする該分子を含有する
形質転換宿主微生物または細胞の調製法。 （８）前記第（５）項の分子および、所望により、さら
にレプリコンからなる組換型ＤＮＡベクター。 （９）前記第（８）項の組換型ＤＮＡベクターからなる
形質転換宿主微生物または細胞。 （１０）適当な宿主微生物または細胞を前記第（８）方
法。 （１２）異種官能性ＤＮＡ配列の発現が調節可能な適当
な条件下、前記第（８）項の組換型ＤＮＡベクターを含
有する形質転換宿主微生物または細胞を培養することを
特徴とする該官能性ＤＮＡ配列の発現調節方法。 （１３）ストレプトマイセスｇａｌオペロンＰ２プロモ
ーター発現単位またはそのいずれかの官能性誘導体から
なることを特徴とする組換型ＤＮＡ分子。 （１４）該発現単位が、ストレプトマイセス・リビダン
ス、ストレプトマイセス・コエリカラー、ストレプトマ
イセス・アズラエウス、ストレプトマイセス・アルブス
、ストレプトマイセス・カルジノスタティクス、ストレ
プトマイセス・アンチフィブリノリチクスまたはストレ
プトマイセス・ロンギスポルスのｇａｌオペロンＰ２プ
ロモーター発現単位である前記第（１３）項の分子。 （１５）該発現単位がストレプトマイセス・リビダンス
ｇａｌオペロンＰ２プロモーター発現単位である前記第
（１４）項の分子。 （１６）該発現単位に作動的に結合した異種官能性ＤＮ
Ａ配列を含む前記第（１３）項の分子。 （１７）前記第（１６）項の分子からなる組換型ＤＮＡ
分子含有形質転換宿主微生物または細胞。 （１８）適当な宿主微生物または細胞を前記第（１６）
項の分子で形質転換することを特徴とする該分子を含有
する形質転換宿主微生物または細胞の調製法。 （１９）前記第（１６）項の分子および、所望により、
さらにレプリコンからなる組換型ＤＮＡベクター。 （２０）前記第（１９）項の組換型ＤＮＡベクターから
なる形質転換宿主微生物または細胞。 （２１）適当な宿主微生物または細胞を前記第（１９）
項の組換型ベクターで形質転換することを特徴とする該
ベクターを含有する形質転換宿主微生物または細胞の調
製法。 （２２）異種官能性ＤＮＡ配列が発現されるに適当な条
件下、前記第（１９）項の組換型ＤＮＡベクターを含有
する形質転換宿主微生物または細胞を培養することを特
徴とする該官能性ＤＮＡ配列の発現方法。 （２３）ストレプトマイセスｇａｌオペロンＰ１プロモ
ーター調節領域またはそのいずれかの調節可能な官能性
誘導体からなることを特徴とする組換型ＤＮＡ分子。 （２４）該領域が、ストレプトマイセス・リビダンス、
ストレプトマイセス・コエリカラー、ストレプトマイセ
ス・アズラエウス、ストレプトマイセス・アルブス、ス
トレプトマイセス・カルジノスタティクス、ストレプト
マイセス・アンチフィブリノリチクスまたはストレプト
マイセス・ロンギスポルスのｇａｌオペロンＰ１プロモ
ーター調節領域である前記第（２３）項の分子。 （２５）該領域がストレプトマイセス・リビダンスｇａ
ｌオペロンＰ１プロモーター調節領域である前記第（２
４）項の分子。 （２６）該調節領域に作動的に結合した異種官能性ＤＮ
Ａ配列を含む前記第（２３）項の分子。 （２７）前記第（２６）項の分子からなる形質転換宿主
微生物または細胞。 （２８）適当な宿主微生物または細胞を前記第（２６）
項の分子で形質転換することを特徴とする該分子を含有
する形質転換宿主微生物または細胞の調製法。 （２９）前記第（２６）項の分子および、所望により、
さらにレプリコンがらなる組換型ＤＮＡベクター。 （３０）前記第（２９）項の組換型ＤＮＡベクターから
なる形質転換宿主微生物または細胞。 （３１）適当な宿主微生物または細胞を前記第（２９）
項の組換型ベクターで形質転換することを特徴とする該
ベクターを含有する形質転換宿主微生物または細胞の調
製法。 （３２）異種官能性ＤＮＡ配列が発現されるに適当な条
件下、前記第（２９）項の組換型ＤＮＡベクターを含有
する形質転換宿主微生物または細胞を培養することを特
徴とする該官能性ＤＮＡ配列の発現方法。 （３３）異種官能性ＤＮＡ配列の発現が調節可能な適当
な条件下、前記第（２９）項の組換型ＤＮＡベクターを
含有する形質転換宿主微生物または細胞を培養すること
を特徴とする該官能性ＤＮＡ配列の発現調節方法。 （３４）ストレプトマイセスｇａｌオペロンＰ２プロモ
ーターまたはそのいずれかの官能性誘導体からなること
を特徴とする組換型ＤＮＡ分子。 （３５）該プロモーターが、ストレプトマイセス・リビ
ダンス、ストレプトマイセス・コエリカラー、ストレプ
トマイセス・アズラエウス、ストレプトマイセス・アル
ブス、ストレプトマイセス・カルジノスタティクス、ス
トレプトマイセス・アンチフィブリノリチクスまたはス
トレプトマイセス・ロンギスポルスのｇａｌオペロンＰ
２プロモーターである前記第（３４）項の分子。 （３６）該プロモーターがストレプトマイセス・リビダ
ンスｇａｌオペロンＰ２プロモーターである前記第（３
５）項の分子。 （３７）該Ｐ２プロモーターに作動的に結合した異種官
能性ＤＮＡ配列を含む前記第（３４）項の分子。 （３８）前記第（３７）項の分子からなる形質転換宿主
微生物または細胞。 （３９）適当な宿主微生物または細胞を前記第（３７）
項の分子で形質転換することを特徴とする該分子を含有
する形質転換宿主微生物または細胞の調製法。 （４０）前記第（３７）項の分子および、所望により、
さらにレプリコンからなる組換型ＤＮＡベクター。 （４１）前記第（４０）項の組換型ＤＮＡベクターから
なる形質転換宿主微生物または細胞。 （４２）適当な宿主微生物または細胞を前記第（４０）
項の組換型ベクターで形質転換することを特徴とする該
ベクターを含有する形質転換宿主微生物または細胞の調
製法。 （４３）異種官能性ＤＮＡ配列が発現されるに適当な条
件下、前記第（４０）項の組換型ＤＮＡベクターを含有
する形質転換宿主微生物または細胞を培養することを特
徴とする該官能性ＤＮＡ配列の発現方法。 （４４）ストレプトマイセスｇａｌオペロンＰ１プロモ
ーターまたはそのいずれかの調節可能な官能性誘導体か
らなることを特徴とする組換型ＤＮＡ分子。 （４５）該プロモーターが、ストレプトマイセス・リビ
ダンス、ストレプトマイセス・コエリカラー、ストレプ
トマイセス・アズラエウス、ストレプトマイセス・アル
ブス、ストレプトマイセス・カルジノスタティクス、ス
トレプトマイセス・アンチフィブリノリチクスまたはス
トレプトマイセス・ロンギスポルスのｇａｌオペロンＰ
１プロモーターである前記第（４４）項の分子。 （４６）該プロモーターがストレプトマイセス・リビダ
ンスｇａｌオペロンＰ１プロモーターである前記第（４
５）項の分子。 （４７）該Ｐ１プロモーターに作動的に結合した異種官
能性ＤＮＡ配列を含む前記第（４４）項の分子。 （４８）前記第（４７）項の分子からなる形質転換宿主
微生物または細胞。 （４９）適当な宿主微生物または細胞を前記第（４７）
項の分子で形質転換することを特徴とする該分子を含有
する形質転換宿主微生物または細胞の調製法。 （５０）前記第（４７）項の分子および、所望により、
さらにレプリコンからなる組換型ＤＮＡベクター。 （５１）前記第（５０）項の組換型ＤＮＡベクターから
なる形質転換宿主微生物または細胞。 （５２）適当な宿主微生物または細胞を前記第（５０）
項の組換型ベクターで形質転換することを特徴とする該
ベクターを含有する形質転換宿主微生物または細胞の調
製法。 （５３）異種官能性ＤＮＡ配列が発現されるに適当な条
件下、前記第（５０）項の組換型ＤＮＡベクターを含有
する形質転換宿主微生物または細胞を培養することを特
徴とする該官能性ＤＮＡ配列の発現方法。 （５４）異種官能性ＤＮＡ配列の発現が調節可能な適当
な条件下、前記第（５０）項の組換型ＤＮＡベクターを
含有する形質転換宿主微生物または細胞を培養すること
を特徴とする該官能性ＤＮＡ配列の発現調節方法。 （５５）ストレプトマイセスｇａｌオペロンｇａｌＥ遺
伝子またはそのいずれかの官能性誘導体からなることを
特徴とする組換型ＤＮＡ分子。 （５６）該遺伝子が、ストレプトマイセス・リビダンス
、ストレプトマイセス・コエリカラー、ストレプトマイ
セス・アズラエウス、ストレプトマイセス・アルブス、
ストレプトマイセス・カルジノスタティクス、ストレプ
トマイセス・アンチフィブリノリチクスまたはストレプ
トマイセス・ロンギスポルスのｇａｌオペロンｇａｌＥ
遺伝子である前記第（５５）項の分子。 （５７）該遺伝子がストレプトマイセス・リビダンスｇ
ａｌオペロンｇａｌＥ遺伝子である前記第（５６）項の
分子。 （５８）該ｇａｌＥ遺伝子に作動的に結合した異種官能
性ＤＮＡ配列を含む前記第（５５）項の分子。 （５９）前記第（５８）項の分子からなる形質転換宿主
微生物または細胞。 （６０）適当な宿主微生物または細胞を前記第（５８）
項の分子で形質転換することを特徴とする該分子を含有
する形質転換宿主微生物または細胞の調製法。 （６１）ストレプトマイセスｇａｌオペロンｇａｌＴ遺
伝子またはそのいずれかの官能性誘導体からなることを
特徴とする組換型ＤＮＡ分子。 （６２）該遺伝子が、ストレプトマイセス・リビダンス
、ストレプトマイセス・コエリカラー、ストレプトマイ
セス・アズラエウス、ストレプトマイセス・アルブス、
ストレプトマイセス・カルジノスタティクス、ストレプ
トマイセス・アンチフィブリノリチクスまたはストレプ
トマイセス・ロンギスポルスのｇａｌオペロンｇａｌＴ
遺伝子である前記第（６１）項の分子。 （６３）該オペロンがストレプトマイセス・リビダンス
ｇａｌオペロンｇａｌＴ遺伝子である前記第（６２）項
の分子。 （６４）該ｇａｌＴ遺伝子に作動的に結合した異種官能
性ＤＮＡ配列を含む前記第（６１）項の分子。 （６５）前記第（６４）項の分子からなる形質転換宿主
微生物または細胞。 （６６）適当な宿主微生物または細胞を前記第（６４）
項の分子で形質転換することを特徴とする該分子を含有
する形質転換宿主微生物または細胞の調製法。 （６７）ストレプトマイセスｇａｌオペロンｇａｌＫ遺
伝子またはそのいずれかの官能性誘導体からなることを
特徴とする組換型ＤＮＡ分子。 （６８）該遺伝子が、ストレプトマイセス・リビダンス
、ストレプトマイセス・コエリカラー、ストレプトマイ
セス・アズラエウス、ストレプトマイセス・アルブス、
ストレプトマイセス・カルジノスタティクス、ストレプ
トマイセス・アンチフィブリノリチクスまたはストレプ
トマイセス・ロンギスポルスのｇａｌオペロンｇａｌＫ
遺伝子である前記第（６７）項の分子。 （６９）該遺伝子がストレプトマイセス・リビダンスｇ
ａｌオペロンｇａｌＫ遺伝子である前記第（６８）項の
分子。 （７０）該ｇａｌＫ遺伝子に作動的に結合した異種官能
性ＤＮＡ配列を含む前記第（６７）項の分子。 （７１）前記第（７０）項の分子からなる形質転換宿主
微生物または細胞。 （７２）適当な宿主微生物または細胞を前記第（７０）
項の分子で形質転換することを特徴とする該分子を含有
する形質転換宿主微生物または細胞の調製法。 （７３）ストレプトマイセスｇａｌオペロン、当該形質
転換宿主をガラクトース利用性にするに適した該ストレ
プトマイセスｇａｌオペロンのいずれかの部分またはそ
のいずれかの誘導体からなる組換型ＤＮＡベクターまた
は分子で宿主を形質転換することを特徴とする非ガラク
トース利用性宿主微生物または細胞をガラクトース利用
性にする方法。 （７４）前記第（７３）項の方法により調製した形質転
換宿主。
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