JP3037698B2 - ストレプトマイセスのｇａｌオペロンＰ１プロモーター - Google Patents
ストレプトマイセスのｇａｌオペロンＰ１プロモーターInfo
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Description
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は、ストレプトマイセス（Streptomyces）gal
オペロンP1プロモーター調節領域またはストレプトマイ
セスgalオペロンP1プロモーターからなる組換型DNA分子
に関する。 発明の背景 ホッジソン、ジャーナル・オブ・ジェネラル・マイク
ロバイオロジー（Hodgson,J.Gen.Micro.）128,2417〜24
30（1982）はストレプトマイセス・コエリカラー（S.co
elicolor）A3（２）が、野性型株におけるグリセロール
摂取系の１つであるアラビノース摂取系の転写レベルに
おける抑制と、ガラクトース摂取系の抑制をもさせるグ
ルコース抑制系を有することを報告している。しかし、
ホッジソンにはストレプトマイセス・コエリカラーA3
（２）による実際のガラクトース代謝の報告は全くな
い。 オケダら、モレキュラー・アンド・ジェネラル・ジェ
ネティックス（Okeda et al.,Mol.Gen.Genet.）196,501
〜507（1984）は、グルコース・キナーゼ活性、２−デ
オキシグルコース感受性、グルコース利用性およびグル
コース抑制が、ストレプトマイセス・コエリカラーから
ファージ・ベクターにクローンされた当該glk遺伝子を
含有する3.5KbDNAフラグメントによって形質転換された
ストレプトマイセス・コエリカラーA3（２）glk（グル
コース・キナーゼ）変異株に全て復元されたことを報告
している。 セノら、モレキュラー・アンド・ジェネラル・ジェネ
ティックス（Seno et al.,Mol.Gen.Genet.）193,119〜1
28（1984）はストレプトマイセス・コエリカラーのゼリ
セロール（gyl）オペロンを報告し、かかるオペロンが
基質誘発性で、カタボライト抑制性であると述べてい
る。 デボウクら、ヌークレイック・アシッズ・リサーチ
（Debouck et al.,Nuc.Acids.Res.）13（６）,1841〜18
53（1985）はイー・コリ（E.coli）のgalオペロンが、
ガラクトースの代謝に必要な酵素、すなわち、galE（ウ
リジン・ジホスホガラクトース−４−エピメラーゼ）、
galT（ガラクトース−１−ホスフェート・ウリジルトラ
ンスフェラーゼ）およびgalK（ガラクトキナーゼ）を特
定する３つの構造的に近似した遺伝子からなること、こ
れらの遺伝子がポリシストロニックmRNAからＥ、Ｔ、Ｋ
の順序で発現されること、オペロンのプロモーター遠位
遺伝子galKの発現がその直前のgalT遺伝子に翻訳的にカ
ップルされることが公知であること、このような翻訳的
カップリングが、galTコード付け配列の端と、galKのリ
ボソーム結合域の間の構造的オーバーラップから生じる
こと、およびgalTおよびgalKの翻訳的カップリングが、
ガラクトースの代謝の間のこれらの遺伝子の一律発現を
保証することを報告している。 発明の概要 本発明はストレプトマイセスgalオペロンgalK遺伝
子、galE遺伝子、galT遺伝子、P2プロモーター発現単位
またはP2プロモーターまたはそのいずれかの官能性誘導
体からなる組換型DNA分子ならびにストレプトマイセスg
alオペロンP1プロモーター、P1プロモーター調節領域ま
たは全galオペロンまたはそのいずれかの調節可能な官
能性誘導体からなる組換型DNA分子に関する。 本発明はまた、ストレプトマイセスgalオペロンまた
はそのいずれかの調節可能な官能性誘導体およびかかる
オペロンに作動的に結合した官能性DNA分子からなる組
換型DNA分子、かかるDNA分子、所望により、さらにレプ
リコンからなる組換型DNAベクター、かかるベクターで
形質転換された宿主細胞の調製法、そのような方法で調
製された形質転換宿主、当該官能性DNA配列が発現され
るような適当な条件下、そのような形質転換宿主を培養
することからなる該官能性DNA配列の発現方法およびそ
のような発現を調節する条件下、そのような形質転換宿
主を培養することからなるそのような官能性DNA配列の
発現を調節する方法に関する。 また、本発明はストレプトマイセスgalオペロンP2プ
ロモーター発現単位またはそのいずれかの官能性誘導体
およびその単位に作動的に結合した官能性DNA分子から
なる組換型DNA分子、そのようなDNA分子および、所望に
より、さらにレプリコンからなる組換型DNAベクター、
そのようなベクターで形質転換された宿主細胞の調製
法、そのような方法で調製された形質転換宿主および当
該官能性DNA配列が発現されるような適当な条件下、そ
のような形質転換宿主を培養することからなるそのよう
な官能性DNA配列の発現方法に関する。 また、本発明はストレプトマイセスgalオペロンP1プ
ロモーター調節領域またはそのいずれかの調節可能な官
能性誘導体およびそのような領域に作動的に結合した官
能性DNA分子からなる組換型DNA分子、そのようなDNA分
子および、所望により、さらにレプリコンからなる組換
型DNAベクター、そのようなベクターで形質転換された
宿主細胞の調製法、そのような方法で調製された形質転
換宿主、当該官能性DNA配列が発現されるような適当な
条件下、そのような形質転換宿主を培養することからな
るそのような官能性DNA配列の発現方法およびそのよう
な発現を調節する条件下、そのような形質転換宿主を培
養することからなるそのような官能性DNA配列の発現を
調節する方法に関する。 また、本発明はストレプトマイセスgalオペロンP1プ
ロモーターまたはそのいずれかの調節可能な官能性誘導
体およびそのような領域に作動的に結合した異種官能性
DNA分子からなる組換型DNA分子、そのようなDNA分子お
よび、所望により、さらにレプリコンからなる組換型DN
Aベクター、そのようなベクターで形質転換された宿主
細胞の調製法、そのような方法で調製された形質転換宿
主、当該官能性DNA配列が発現されるような適当な条件
下、そのような形質転換宿主を培養することからなるそ
のような官能性DNA配列の発現方法およびそのような発
現を調節する条件下、そのような形質転換宿主を培養す
ることからなるそのような官能性DNA配列の発現調節方
法に関する。 また、本発明はストレプトマイセスgalオペロンP2プ
ロモーターまたはそのいずれかの官能性誘導体およびそ
のような領域に作動的に結合した異種官能性DNA分子か
らなる組換型DNA分子、そのようなDNA分子および、所望
により、さらにレプリコンからなる組換型DNAベクタ
ー、そのようなベクターで形質転換された宿主細胞の調
製法、そのような方法により調製された形質転換宿主お
よび当該官能性DNA配列が発現されるような適当な条件
下、そのような形質転換宿主を培養することからなるそ
のような官能性DNA配列の発現方法に関する。 また、本発明は、当該宿主を、ストレプトマイセスga
lオペロンまたはそのいずれかの部分あるいはそのいず
れかの官能性誘導体からなり、そのような宿主をガラク
トースを利用できるようにするに十分な組換型DNA分子
で形質転換することからなる非ガラクトース利用性宿主
微生物または細胞をガラクトースを利用できるようにす
る方法に関する。また、本発明はそのような方法におい
て用いる組換型ベクターおよびそのような方法で調製さ
れた宿主に関する。 図面の説明 第１図はストレプトマイセス・リビダンス（S.livida
ns）1326ガラクトース（gal）オペロンの制限エンドヌ
クレアーゼ地図、オペロン中の構造遺伝子およびプロモ
ーターの概略の位置を示す。 第２図はプラスミドpK21の制限エンドヌクレアーゼ地
図である。 第３図はストレプトマイセス・リビダンスgalオペロ
ンと、ストレプトマイセス・コエリカラーgalK遺伝子を
含有する制限フラグメントを比較する制限エンドヌクレ
アーゼ地図である。 発明の詳説 ストレプトマイセスのゲノムが、３つの構造遺伝子
（galT、galEおよびgalK）および２つのプロモーター
（P1およびP2）からなるガラクトース代謝用のオペロン
（すなわち、galオペロン）を含むことを見出した。gal
T遺伝子の生成物はガラクトース−１−ホスフェート・
ウリジルトランスフェラーゼ（トランスフェラーゼ）と
して知られ、galE遺伝子の生成物はウリジン・ジホスホ
ガラクトース−４−エピメラーゼ（エピメラーゼ）とし
て知られ、galK遺伝子の生成物はガラクトース−１−キ
ナーゼ（ガラクトキナーゼ）として知られている。スト
レプトマイセスのガラクトース代謝におけるgalT、galE
およびgalTの遺伝子生成物の機能はつぎの式で示され
る。 本明細書において用いられる「プロモーター」なる語
はRNAポリメラーゼの結合および転写を可能とする構造
遺伝子の上流のいずれかの領域を意味する。 「構造遺伝子」なる語はmRNAの合成のための鋳型とし
て働く、ペプチド用のコード付け配列を意味する。 「オペロン」なる語は１つの酵素系の構成員として機
能的に関連した１つまたは１群の酵素の合成に関与する
１群の密接に結合した遺伝子を意味する。オペロンはオ
ペレーター遺伝子、いくつかの構造遺伝子（系中の酵素
数に等しい）および調節遺伝子からなる。「オペレータ
ー」または「オペレーター遺伝子」なる語はオペロン内
の隣接する構造遺伝子の生合成を制御するDNA配列を意
味する。「調節遺伝子」なる語は、活性（酵素誘導）ま
たは不活性（酵素抑制）のいずれかにできるレプレッサ
ーの生成を通してオペロン内のオペレーター遺伝子を制
御する遺伝子を意味する。オペロンにおける構造遺伝子
の転写は、それ自体が以下の３径路の１つ以上で制御さ
れるオペレーター遺伝子によりスイッチが入ったり、切
れたりする。（１）誘導酵素系において、調節遺伝子に
より生成され、細胞内または細胞外のどこかから由来す
るある代謝産物またはシグナル物質（誘発物質）によ
り、該誘発物質の存在によりオペロンが活性になるよう
に不活性化できるレプレッサーによりオペロンがスイッ
チを切られる。または、（２）抑制酵素系において、調
節遺伝子によって生成された不活性レプレッサーと、い
ずれかからのコンプレッサーの組合せであり、コンプレ
ッサーの存在がオペロンを不活性にするようなレプレッ
サー−コンプレッサー複合体によりオペロンがスイッチ
を切られる。または、（３）活性遺伝子系において、あ
る代謝産物またはシグナル物質によって活性化できる調
節遺伝子によりプロモーターがスイッチを入れられる。 ストレプトマイセスgalオペロンはストレプトマイセ
スのゲノム中に天然に存在する。 「ストレプトマイセスgalオペロン」なる語はP1プロ
モーター、P2プロモーター、galT、galEおよびgalK構造
遺伝子およびそのような構造遺伝子の転写および翻訳に
必要な他のいずれかの調節領域からなるストレプトマイ
セスのゲノムの領域を意味する。 「調節領域」なる語はプロモーターまたはオペレータ
ーのようなDNA配列を意味し、構造遺伝子の転写を調節
する。 つぎのモデルはストレプトマイセスgalオペロン内の
遺伝子発現について示す。P1プロモーターはガラクトー
ス誘導プロモーターである（すなわち、ガラクトースの
存在外に誘導され、グルコースの存在下に抑制され
る）。S1データによれば、P2プロモーターは構成性であ
り、すなわち、ガラクトースまたはいずれかの他の炭素
源の存在または非存在にかかわりなく、スイッチが入っ
ている。 コスミッドpJW357（ストレプトマイセスおよびイー・
コリの両方において複製する能力をコード付けする）を
用いてストレプトマイセス・リビダンス1326DNAについ
てのコスミッド・ライブラリーを組み立てた。ついで、
このライブラリーを、バクテリオファージP1形質導入ガ
ラクトキナーゼ（galK）変異を含むイー・コリ株MM294
の誘導体であるイー・コリK21にトランスフェクション
した。トランスフェクションした細胞を、コスミッドの
存在および活性galK遺伝子の存在の両方用に選択した培
地条件下で平板培養した。弱い陽性コロニーを単離し、
これらのコロニーから由来するコスミッドDNAをK21株に
形質転換させる。これらの形質転換は、ガラクトースを
唯一の炭素源として一貫した陽性増殖を生じる２つのコ
スミッドを生じた。これらのgalK+コスミッドを、つい
で、本発明者らにより、２−デオキシ−ガラクトース選
択［ブラウナーら、ジーン（Brawner et al.,Gene）、4
0,191（1985）参照］を用い、ガラクトースを唯一の炭
素源とする培地上で増殖しないとして単離されたストレ
プトマイセス宿主（すなわち、ストレプトマイセス・リ
ビダンス1326−12K）に形質転換した。ガラクトキナー
ゼを産生できるか、できないかで株を区別する条件下、
コスミッドのただ１つがストレプトマイセス・リビダン
ス1326−12K宿主をgalK+とした。さらに研究した結果、
このコスミッドがガラクトキナーゼ活性を有する遺伝子
をコード付けすることが示された。DNA配列分析および
蛋白質研究を含むその後の研究はこのストレプトマイセ
ス遺伝子はイー・コリおよび酵母ガラクトキナーゼ遺伝
子と相同性を有することが示された。調節研究はガラク
トキナーゼ遺伝子をコード付けするコスミッドが染色体
コード遺伝子と同様な方法で調節することを示した。 ストレプトマイセス・リビダンスgalオペロンは当
初、ストレプトマイセス・リビダンス1326の約９キロベ
ース（Kb）域から単離された。該ストレプトマイセスga
lオペロンを含有するストレプトマイセス・リビダンス1
326の約9Kb域は実質的に表Ａのような地図位置で示され
る。「実質的」なる語は、（１）制限部位の相対位置が
概略であること、（２）他に有意な影響をオペロンに及
ぼさずに変異により１つ以上の制限部位が失なわれ、ま
たは得られうること、および（３）示した酵素、特に、
テストしなかった酵素に対する追加の部位が存在してい
てもよいことを意味する。本明細書で用いる制限酵素は
商業的に入手できる。全て、ロバーツ、ヌークレイック
・アシッズ・リサーチ（Nuc.Acids.Res.）,10（５）:p1
17（1982）に記載されている。 表 Ａ 地図位置 制限酵素 位置（Kb） 1 Hind III −.40 1a Nru I 0 2 Bgl II .75 3 EcoR I 1.05 4 Pvu II 1.15 5 Mlu I 2.30 6 Pvu II 2.80 7 EcoR I 4.00 8 Pvu II 4.10 8a Sac I 4.25 9 Pvu II 5.00 10 Xho I 5.50 11 BamH I 5.80 12 BamH I 6.50 13 Mlu I 6.90 13a Pvu II 7.20 14 Mlu I 7.80 15 BamH I 8.00 16 Sph I 8.30 第１図はストレプトマイセス・リビダンス1326galオ
ペロンの制限エンドヌクレアーゼ地図を示し、オペロン
内の構造遺伝子（galT、galEおよびgalK）およびプロモ
ーター（P1およびP2）の位置を示す。 表Ａおよび第１図から明らかなごとく、ストレプトマ
イセス・リビダンス1326galオペロンのプロモーターお
よび構造遺伝子の位置は実質的に表Ｂのとおりである。 表 Ｂ 位置（Kb） P1転写出発部位 .10 galT翻訳開始コドン .15 P2転写出発部位 1.25 galE翻訳開始コドン 1.50 galK翻訳開始コドン 2.40 galKの３′端メッセージ 3.60 ストレプトマイセス属の微生物は歴史的に製薬工業用
の抗生物質源として用いられてきた。その結果、そのよ
うな生成物産生用のビヒクルとしてストレプトマイセス
を用いる生物学的生成物の製造のスケール・アップに必
要な技術が現在利用できる。しかし、ストレプトマイセ
スが該新規組換型DNA技術を用いる生活性分子の生産用
のビヒクルとして使用できる前に、イー・コリで有用で
あることが示されたものと同様なストレプトマイセスに
おける調節エレメントを規定する必要がある。これらの
調節エレメントにはリボソーム結合部位および調節転写
エレメントが含まれる。 ストレプトマイセスにおけるgalE、galT、またはgalK
遺伝子または遺伝子生成物あるいはgalオペロンの存在
は従来報告されていない。本発明、すなわち、ストレプ
トマイセスgalオペロンのクローニングはストレプトマ
イセス、他のアクチノマイセス類および他の宿主生物に
おける調節可能な発現／クローニングベクターの組み立
てを可能にする。さらに、本発明はストレプトマイセス
galオペロンがポリシストロニックであるとの発明を導
いた。多分、ストレプトマイセスgalオペロンのクロー
ニングの最も重要な特徴は、ストレプトマイセスgalK遺
伝子の調節に必須な配列の存在の観察である。発現系と
してのイー・コリからのlacプロモーターの最初の使用
と直接相似させることができる。事実、ブロシウスら、
プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・
オブ・サイエンス・ユー・エス・エイ（Brosius et a
l.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.）81,6929〜6933（198
4）はイー・コリlacプロモーターの調節エレメントを利
用して極端に強いイー・コリ・リボソーム・プロモータ
ーを調節している。ストレプトマイセスgalオペロン・
リボソーム・プロモーターも極端に強いようなので、そ
のようなプロモーターはストレプトマイセス、他のアク
チノマイセス類および他の宿主生物において非常に有用
な調節可能な発現ベクターの組み立を可能にする。本発
明はまた、イー・コリにおいてgalK変異株の選択に用い
られていた２−デオキシガラクトース選択がストレプト
マイセスにおけるgalK変異株の選択にも作動するという
予期せぬ発見を可能にした［ブラウナーら、ジーン［Br
awner et al.,Gene）40,191（1985）参照］。この観察
は、以下に記載するごとく、ストレプトマイセスgalK遺
伝子およびそのコスミッド上への転写、翻訳に必要な調
節領域のクローン能力と組み合わさって、相同組換によ
り、ストレプトマイセスの染色体に位置したgalK遺伝子
への構造遺伝子の直接挿入を可能にする。この操作は分
子生物学者が興味のあるDNAフラグメントをストレプト
マイセスの染色体に安定して挿入することを可能にす
る。このアプローチは研究者が、現在、大部分のストレ
プトマイセス発現ベクターにより要求されているような
抗生物質選択を続ける必要なしに、興味あるストレプト
マイセス株にタッグ付けもしくはマーク付けをしたり、
該生物に発現カセットを挿入することを可能にする。 本発明はストレプトマイセスgalオペロンまたはその
いずれかの調節可能な官能性誘導体からなる組換型DNA
分子に関する。 「調節可能な官能性誘導体」なる語はgalT、galEおよ
びgalK遺伝子生成物の調節可能な生成について天然のス
トレプトマイセスgalオペロンと実質的に同じに機能す
るストレプトマイセスgalオペロンのいずれかの誘導体
を意味する。このような誘導体にはgalオペロンの部分
的配列およびgalオペロン・コード付け配列の修飾によ
って生成された誘導体が包含される。公知のgalオペロ
ン修飾技術には、例えば、化学的変異誘発剤での処理、
照射または、酵素または組換技術を用いる挿入、欠失ま
たは核酸置換のような直接遺伝子操作が包含される。天
然に生じるストレプトマイセスgalオペロンは本明細書
に記載する技術を用いていずれかのガラクトース利用ス
トレプトマイセス株から単離できる。種々のストレプト
マイセス種の多くの株が多くの源から公に入手可能であ
る。例えば、米国、メリーランド州、ロックビルのアメ
リカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ATCC）は
公衆が入手可能な約400種のストレプトマイセスを有し
ている。ストレプトマイセスの個々の株のグルコースを
利用する能力は、その株を、ガラクトースを唯一の炭素
源として含有する培地上で増殖させるような通常の技術
によって容易に測定できる。galオペロンを単離するの
に好ましいストレプトマイセス種には、ストレプトマイ
セス・リビダンス、ストレプトマイセス・コエリカラ
ー、ストレプトマイセス・アズラエウス（S.azuraeu
s）、ストレプトマイセス・アルブス（S.albus）、スト
レプトマイセス・カルチノスタティクス（S.carzinosta
ticus）、ストレプトマイセス・アンチフェブリノリチ
クス（S.antifibrinolyticus）およびストレプトマイセ
ス・ロンギスポルス（S.longisporus）が包含される。
ストレプトマイセス・リビダンスが最も好ましい。スト
レプトマイセスgalオペロンおよびそのより小さい部分
は他の細胞および生物から相同な配列を得るための核酸
プローブとして有用である。ストレプトマイセスgalオ
ペロンはまた、適当な宿主変異株における選択マーカー
として、また、調節エレメントの提供に有用である。
「適当な宿主変異株」なる語は、（ａ）galオペロンを
含まないか、（ｂ）非官能性galオペロンを含有する
か、（ｃ）欠損P1プロモーター、P2プロモーター、galT
遺伝子、galK遺伝子および／またはgalE遺伝子のよう
な、ストレプトマイセスgalからなる相同構造遺伝子ま
たは調節領域内に欠損を含むためにガラクトースを利用
しない宿主を意味する。かくして、通常の技術で調製で
きる組換型DNA分子（ストレプトマイセスgalオペロンお
よびそれに作動的に結合した異種官能性DNA配列からな
る）は、相同組換によって宿主ゲノムに取り込むための
通常の技術によって適当な宿主へ形質転換でき、高価な
抗生物質選択を続ける必要なしに該異種官能性DNA配列
の調節可能な発現を可能にする。したがって、そのよう
なオペロンはまた、高価な抗生物質選択を続ける必要な
く、当該ベクターで形質転換した適当な宿主変異株にお
いて該オペロンに作動的に結合する異種官能性DNA配列
の調節可能な発現用の組換型DNA発現ベクター上に取り
込まれうる。そのようなオペロンはまた、ガラクトース
を利用しないストレプトマイセス、他のアクチノマイセ
スおよびgal-イー・コリ株のような他の原核生物のよう
な細胞、ウイルスおよび微生物をガラクトース利用性株
に形質転換するのに有用である。この形質転換は形質転
換宿主に対して多面的効果を有しうる。「官能性DNA配
列」なる語はそれによって形質転換された宿主生物にお
いて遺伝子発現単位、構造遺伝子、プロモーターまたは
調節領域として機能するストレプトマイセスまたは他の
いずれかの源から直接または間接に誘導されるDNAのい
ずれかの分離領域を意味する。好ましい官能性DNA配列
には、限定するものではないが、インシュリン、生長ホ
ルモン、組織プラスミノーゲン・アクチベータ、α−１
−抗トリプシンまたはワクチン製造に用いる抗原のよう
な医薬上重要なポリペプチドをコード付けするものが包
含される。「異種官能性DNA配列」なる語はストレプト
マイセスgalオペロン・コード付け領域から誘導されな
い官能性DNA配列を意味する。 本発明はまた、ストレプトマイセスgalオペロンP2プ
ロモーター発現単位またはそのいずれかの官能性誘導体
からなる組換型DNA分子に関する。「P2プロモーター発
現単位」なる語はストレプトマイセスgalオペロンP2プ
ロモーター、galEおよびgalK構造遺伝子およびそのよう
な構造遺伝子の転写および翻訳に必要な他のいずれかの
調節領域からなるストレプトマイセスgalオペロンの領
域を意味する。「官能性誘導体」なる語は、ストレプト
マイセスgalオペロンgalEおよびgalK遺伝子生成物の生
成について天然に生じる領域と実質的に同じに機能する
ストレプトマイセスgalオペロンP2プロモーター発現単
位のいずれかの誘導体を意味する。このような誘導体に
はストレプトマイセスgalオペロンP2プロモーター発現
単位の部分配列およびストレプトマイセスgalオペロンP
2プロモーター発現単位・コード付け配列の修飾によっ
て得られる誘導体が包含される。そのような修飾を行な
う技術は公知であり、いくつかは前記した。天然に生じ
るストレプトマイセスgalオペロンP2プロモーター発現
単位は通常の技術により天然のストレプトマイセスgal
オペロンから単離できる。ストレプトマイセスgalオペ
ロンP2発現単位は適当な宿主変異株における選択マーカ
ーとして、また、調節エレメントの提供に有用である。
「適当な宿主変異株」なる語は、欠損P2プロモーター、
galE遺伝子および／またはgalK遺伝子のような、ストレ
プトマイセスP2プロモーター発現単位からなる相同構造
遺伝子または調節領域内に欠失を含むためガラクトース
を利用できない宿主を意味する。かくして、通常の技術
で調整できる組換型DNA分子（ストレプトマイセスgalオ
ペロンP2プロモーター発現単位およびそれに作動的に結
合した異質官能性DNA配列からなる）は相同組換による
宿主ゲノムへの取り組み用の通常の技術により適当な宿
主変異株へ形質転換でき、高価な抗生物質選択を続ける
ことなく、該異種官能性DNA配列の構成的発現を可能に
する。そのような発現単位は異種官能性DNA配列の構成
的発現用の組換型DNA発現ベクター上に取り込まれう
る。ストレプトマイセスgalオペロンP2プロモーター発
現単位はまた、適当な宿主変異株の相補に有用であり、
ついで、高価な抗生物質選択を続ける必要のない、当該
ベクターで形質転換された適当な宿主変異株においてそ
のような発現単位に作動的に結合した異種官能性DNA配
列の構成的発現に使用される。 本発明はストレプトマイセスgalオペロンP1プロモー
ター調節領域またはそのいずれかの調節可能な官能性誘
導体からなる組換型DNA分子にも関する。「P1プロモー
ター調節領域」なる語はストレプトマイセスgalオペロ
ンP1プロモーター、galT、galEおよびgalK構造遺伝子な
らびにそのような構造遺伝子の転写および翻訳に必要な
他のいずれかの調節領域からなるストレプトマイセスga
lオペロンの領域を意味する。「調節可能な官能的誘導
体」なる語は、ストレプトマイセスgalオペロンgalT、g
alE、およびgalK遺伝子生成物の調節可能な生成に関
し、天然に生じる領域と実質的に同じに機能するストレ
プトマイセスgalオペロンP1プロモーター調節領域のい
ずれかの誘導体を意味する。このような誘導体にはスト
レプトマイセスgalオペロンP1プロモーター調節領域の
部分配列およびストレプトマイセスgalオペロンP1プロ
モーター調節領域コード付け配列の修飾により生成され
る誘導体が包含される。そのような修飾を行なう技術は
公知であり、いくつかは前記した、天然に生じるストレ
プトマイセスgalオペロンP1プロモーター調節領域は、
天然に生じるストレプトマイセスgalオペロンからのP2
プロモーターの切除、点突然変異によるP2プロモーター
の不活化またはプロモーター内への異種DNA配列の挿入
のような通常の技術により、天然に生じるストレプトマ
イセスgalオペロンから単離できる。ストレプトマイセ
スgalオペロンP1プロモーター調節領域はストレプトマ
イセスgalオペロンについて前記した用途に有用であ
る。 また、本発明はストレプトマイセスgalオペロンP2プ
ロモーターまたはそのいずれかの官能性誘導体からなる
組換型DNA分子に関する。「官能性誘導体」なる語は、R
NAポリメラーゼの結合および当該プロモーターに作動的
に結合した官能性DNA配列の転写を可能するについて天
然に生じるP2プロモーターと実質的に同じに機能するス
トレプトマイセスgalオペロンP2プロモーターのいずれ
かの誘導体を意味する。このような誘導体にはストレプ
トマイセスgalオペロンP2プロモーターの部分配列およ
びgalオペロンP2プロモーター・コード付け配列の修飾
によって生じた誘導体が包含される。そのような修飾を
行なう技術は公知であり、いくつかは前記した。天然に
生じるストレプトマイセスgalオペロンP2プロモーター
は通常の技術により、天然に生じたストレプトマイセス
galオペロンから単離できる。通常の技術で調製できる
組換型DNA分子（ストレプトマイセスgalオペロンP2プロ
モーターおよびそれに作動的に結合した異種官能性DNA
配列からなる）は相同組換によって宿主ゲノムへ取り込
むための通常の技術によって適当な宿主へ形質転換で
き、異種官能性DNA配列の構成的発現を可能にする。ス
トレプトマイセスgalオペロンP2プロモーターはまた、
当該ベクターで形質転換したウイルスおよび有核または
原核細胞または生物、特にストレプトマイセスまたは他
のアクチノマイセス類において作動的に結合した異種官
能性DNA配列の構成的発現用の組換型DNA発現ベクターへ
の取り込みに有用である。 本発明はまた、ストレプトマイセスgalオペロンP1プ
ロモーターまたはそのいずれかの調節可能な官能性誘導
体からなる組換型DNA分子からなる。「調節可能な官能
性誘導体」なる語は、RNAポリメラーゼの結合を可能に
し、そのようなプロモーターに作動的に結合した官能性
DNA配列の転写を調節するについて天然に生じるP1プロ
モーターと実質的に同じに機能するストレプトマイセス
galオペロンP1プロモーターのいずれかの誘導体を意味
する。このような誘導体にはストレプトマイセスgalオ
ペロンP1プロモーターの部分配列と、galオペロンP1プ
ロモーター・コード付け配列の修飾により生成する誘導
体が包含される。このような修飾を行なう技術は公知で
あり、いくつかは前記した。天然に生じるストレプトマ
イセスgalオペロンP1プロモーターは通常の技術により
天然に生じるストレプトマイセスgalオペロンから単離
できる。通常の技術で調製できる組換型DNA分子（スト
レプトマイセスgalオペロンP1プロモーターおよびそれ
に作動的に結合した異種官能性DNA配列からなる）は、
相同組換による宿主ゲノムに取り込む通常の技術によっ
て適当な宿主変異株へ形質転換でき、異種官能性DNA配
列の調節可能な発現を可能にする。また、ストレプトマ
イセスgalオペロンP1プロモーターは、当該ベクターで
形質転換されたウイルスおよび有核または原核細胞また
は生物、特に、ストレプトマイセスまたは他のアクチノ
マイセス類において作動的に結合した異種官能性DNA配
列の調節可能な発現用組換型DNA発現ベクターへの取り
込みにも有用である。 また、本発明はストレプトマイセスgalオペロンgal
E、galTまたはgalE遺伝子またはそのいずれかの官能性
誘導体からなる組換型DNA分子にも関する。「官能性誘
導体」なる語は活性galE、galTまたはgalK型還元子生成
物の生成について天然に生じる遺伝子と実質的に同じに
機能するストレプトマイセスgalオペロンgalE、galTま
たはgalK遺伝子のいずれかの誘導体を意味する。このよ
うな誘導体にはストレプトマイセスgalオペロンgalE、g
alTまたはgalK遺伝子の部分配列およびgalオペロン配列
の修飾によって得られる誘導体が包含される。このよう
な修飾を行なう技術は公知であり、いくつかは前記し
た。天然に生じるストレプトマイセスgalオペロンgal
E、galTおよび／またはgalK遺伝子は通常の技術により
天然に生じるストレプトマイセスgalオペロンから単離
できる。ストレプトマイセスgalオペロンgalE、galTお
よび／またはgalK遺伝子は適当な宿主変異株における選
択マーカーとして使用できる。「適当な宿主変異株」な
る語は相同galE、galTおよび／またはgalK遺伝子内に欠
失を含むため、ガラクトースを利用できない宿主を意味
する。かくして、通常の技術で調製できる組換型DNA分
子（共に適当な調節領域に作動的に結合したストレプト
マイセスgalオペロンgalE、galTおよび／またはgalK遺
伝子および異種官能性DNA配列からなる）は相同組換に
よって宿主ゲノムへ取り込むための通常の技術によって
適当な宿主変異株へ形質転換でき、高価な抗生物質選択
を続ける必要なしに形質転換体の検出を可能にする。同
様に、共に適当な調節領域に作動的に結合したストレプ
トマイセスgalオペロンgalE、galTおよび／またはgalK
および異種官能性DNA配列ならびにレプリコンからなる
組換型DNAベクターは通常の技術で適当な宿主変異株に
形質転換でき、高価な抗生物質選択を続ける必要なしに
形質転換体の検出を可能にする。ストレプトマイセスga
lオペロンgalE、galKおよび／またはgalT遺伝子はまた
適当な宿主変異株の相補に有用である。 また、ストレプトマイセスgalオペロンgalE遺伝子は
異種DNA配列に融合できるリボソーム結合部位と開始コ
ドンを提供するのに有用であり、適当な発現ベクターに
取り込まれ、適当な宿主に形質転換された場合に、その
ようなコード付け配列を可能とする。そのような異種官
能性DNA配列が、ストレプトマイセスgalオペロンP2プロ
モーター発現単位からなる組換型DNA発現ベクターまた
は全galオペロン中のgalE遺伝子リボソーム結合部位お
よび開始コドンと融合すると、そのようなDNA配列は、
ベクターが適当な宿主生物に形質転換される場合、構成
的に発現される。そのようなDNA配列が、ストレプトマ
イセスgalオペロンP2プロモーター調節領域からなる組
換型DNA発現ベクター中のgalE遺伝子リボソーム結合部
位および開始コドンに融合すると、そのようなベクター
が適当な宿主生物に形質転換される場合、ガラクトース
またはグルコースの存在、非存在を制御することによ
り、そのようなDNA配列の発現を調節できる。 ストレプトマイセスgalオペロンgalT遺伝子はまた、
異種官能性DNA配列に融合できるリボソーム結合部位お
よび開始コドンを提供するのに有用で、適当な発現ベク
ターに取り込まれ、適当な宿主に形質転換されると、そ
のようなコード付け配列の発現を可能にする。そのよう
なDNA配列が、ストレプトマイセスgalオペロンP1プロモ
ーター調節領域からなる組換型DNA発現ベクターまたは
全galオペロン中でgalT遺伝子リボソーム結合部位およ
び開始コドンに融合すると、前記のように、そのような
ベクターで形質転換された宿主におけるそのようなコー
ド付け配列の発現を調節できる。 また、本発明は、レプリコン、ストレプトマイセスga
lオペロンまたその官能性の、調節可能な誘導体および
そのようなオペロンに作動的に結合した異種官能性DNA
配列からなる組換型DNAベクターに関する。そのような
ベクターは通常の技術で調製できる。用いるレプリコン
は当該ベクターにより形質転換されるベクターとなるべ
き宿主生物中にベクターを安定に、染色体外的に維持す
る能力を有することが公知のものとすべきである。 本発明はまた、組換型DNAベクターからなる形質転換
宿主微生物に関し、該ベクターはレプリコン、ストレプ
トマイセスgalオペロンまたはその官能性、調節可能な
誘導体および該オペロンに作動的に結合した異種官能性
DNA配列を含有する。また、本発明は適当な宿主微生物
をそのようなベクターで形質転換することからなるその
ような宿主の調製法に関する。本発明はこの方法に用い
ることのできる適当な宿主にはウイルスおよび有核およ
び原核細胞または生物、特に、ストレプトマイセス属の
ようなアクチノマイセス類が包含される。最も好ましい
宿主微生物はストレプトマイセス属に属する。ストレプ
トマイセスの好ましい種には、ストレプトマイセス・リ
ビダンス、ストレプトマイセス・コエリカラー、ストレ
プトマイセス・アズラエウスおよびストレプトマイセス
・アルブスが包含される。そのような宿主微生物のその
ようなベクターによる形質転換はチャーターから、カレ
ント・トピックス・イン・マイクロバイオロジー・アン
ド・イムノロジー（Chater et al.,Curr.Top.Micro.Im
m.）96,69〜95（1982）の方法のような通常の技術を用
いて行なうことができる。本発明はまた、官能性DNA配
列が発現される適当な条件下、本発明の形質転換宿主を
培養することからなる本発明の形質転換宿主に含有され
る官能性DNA配列の発現方法に関する。「適当な条件」
なる語は宿主の増殖を可能にし、官能性DNA配列の発現
を可能にする条件を意味する。この適当な条件は当業者
が通常の技術を用いて決定でき、用いる宿主生物および
発現させるべき官能性DNA配列のような種々の因子に依
存する。本発明はまた、発現を調節するに適当な条件
下、官能性DNA配列を含有する形質転換宿主を培養する
ことからなる該形質転換宿主に含有される官能性DNA配
列の発現を調節する方法に関する。「適当な条件」なる
語は、ストレプトマイセスgalオペロン（および異種官
能性DNA配列）を調節することの可能な条件を意味す
る。「調節可能」なる語は形質転換宿主細胞の増殖培地
におけるガラクトースまたはその代謝産物の存在および
グルコースまたはその代謝産物の存在に対する応答性で
あることを意味する。このような調節は形質転換宿主の
培地へのガラクトースまたはグルコースの添加または削
除により行なうことができる。本発明の形質転換宿主に
よる異種官能性DNAコード付け配列の発現の上昇または
下降調節についてのガラクトースおよび／またはグルコ
ースの至適レベルは通常の技術を用い、当業者が容易に
決定できる。 また、本発明はレプリコン、ストレプトマイセスgal
オペロンP2プロモーター発現単位またはその官能性誘導
体およびそのような単位に作動的に結合した異種官能性
DNA配列からなる組換DNAベクターに関する。そのような
ベクターは通常の技術で調製できる。用いるレプリコン
は該ベクターで形質転換すべき宿主生物において、安定
に、染色体外的にベクターを維持する能力の知られてい
るものとすべきである。 また、本発明は、レプリコン、ストレプトマイセスga
lオペロンP2プロモーター発現単位またはその官能性誘
導体および該単位に作動的に結合した異種官能性DNA配
列を含有する組換型DNAベクターからなる形質転換宿主
微生物ならびに、そのようなベクターで適当な宿主微生
物を形質転換することからなるそのような宿主の調製法
に関する。「作動的に結合した」なる語は官能性DNA配
列が、その発現が発現制御配列の制御下にあるように発
現制御配列（すなわち、ストレプトマイセスgalオペロ
ン、P2プロモーター発現単位、P1プロモーター調節領
域、P1プロモーターまたはP2プロモーター）に転写的に
または翻訳的に結合することを意味する。すなわち、例
えば、異種官能性DNA配列は、当該オペロンをストレプ
トマイセスgalオペロンP1またはP2プロモーター転写体
に挿入することにより、転写的にまたは翻訳的にストレ
プトマイセスgalオペロンに結合できる。「レプリコ
ン」なる語は、それによって形質転換された宿主微生物
または細胞にプラスミドを染色体外的に維持する機能を
有するプラスミド上のDNAの領域を意味する。また、ス
トレプトマイセスgalオペロンおよびそのより小さい部
分が他の細胞および生物から相同配列を得る核酸プロー
ブとして有用なことが判明した。本発明の方法で用いる
ことのできる適当な宿主微生物には、いずれものウイル
スまたは有核もしくは原核細胞もしくは微生物、特に、
ストレプトマイセス属のもののような、いずれかのアク
チノマイセス属が包含される。最も好ましい宿主微生物
はストレプトマイセス属のものである。ストレプトマイ
セス属の好ましい種にはストレプトマイセス・リビダン
ス、ストレプトマイセス・コエリカラー、ストレプトマ
イセス・アゼラエウスおよびストレプトマイセス・アル
ブスが包含される。ベクターによるこのような宿主微生
物の形質転換は前記チャーターらの方法のような通常の
技術を用いて行なうことができる。本発明はまた、官能
性DNA配列が発現されるような適当な条件下、形質転換
宿主を培養することからなる本発明の形質転換宿主によ
り含有される官能性DNA配列の発現方法に関する。「適
当な条件」なる語は宿主の増殖を可能にし、官能性DNA
配列の発現を可能にする条件を意味する。この適当な条
件は当業者が通常の技術を用いて決定でき、用いる宿主
生物および発現させるべき官能性DNA配列のような種々
の因子に依存する。 また、本発明はレプリコン、ストレプトマイセスgal
オペロンP1プロモーター調節領域またはその官能性、調
節可能な誘導体およびそのような領域に作動的に結合し
た異種官能性DNA配列からなる組換DNAベクターに関す
る。そのようなベクターは通常の技術で調製できる。用
いるレプリコンは該ベクターで形質転換すべき宿主生物
において、安定に、染色体外的にベクターを維持する能
力の知られているものとすべきである。 また、本発明は、レプリコン、ストレプトマイセスga
lオペロンP1プロモーター調節領域またはその官能性、
調節可能な誘導体および該領域に作動的に結合した異種
官能性DNA配列を含有する組換型DNAベクターからなる形
質転換宿主微生物ならびに、そのようなベクターで適当
な宿主微生物を形質転換することからなるそのような宿
主の調製法に関する。用いることのできる適当な宿主微
生物には、いずれものウイルスまたは有核もしくは原核
細胞もしくは微生物、特に、ストレプトマイセス属のも
ののような、いずれかのアクチノマイセス属が包含され
る。最も好ましい宿主微生物はストレプトマイセス属の
ものである。ストレプトマイセス属の好ましい種にはス
トレプトマイセス・リビダンス、ストレプトマイセス・
コエリカラー、ストレプトマイセス・アゼラエウスおよ
びストレプトマイセス・アルブスが包含される。ベクタ
ーによるこのような宿主微生物の形質転換は前記チャー
ターらの方法のような通常の技術を用いて行なうことが
できる。本発明はまた、官能性DNA配列が発現されるよ
うな適当な条件下、形質転換宿主を培養することからな
る本発明の形質転換宿主により含有される異種官能性DN
A配列の発現方法に関する。「適当な条件」なる語は宿
主の増殖を可能にし、官能性DNA配列の発現を可能にす
る条件を意味する。この適当な条件は当業者が通常の技
術を用いて決定でき、用いる宿主生物および発現させる
べき官能性DNA配列のような種々の因子に依存する。本
発明はまた、発現を調節するに適当な条件下、官能性DN
A配列を含有する形質転換宿主を培養することからなる
該形質転換宿主に含有される官能性DNA配列の発現を調
節する方法に関する。「適当な条件」なる語はストレプ
トマイセスgalオペロンP1プロモーター調節領域（およ
び異種官能性DNA配列）を調節可能にする条件でを意味
する。「調節可能」なる語は形質転換宿主細胞の増殖培
地中のガラクトースまたはその代謝産物の存在または非
存在およびグルコースまたはその代謝産物の存在または
非存在に応答性であることを意味する。そのような調節
は形質転換宿主の培地へのガラクトースまたはグルコー
スの添加または削除により行なうことができる。 また、本発明はレプリコン、ストレプトマイセスgal
オペロンP2プロモーターまたはその官能性誘導体および
そのようなプロモーターに作動的に結合した異種官能性
DNA配列からなる組換DNAベクターに関する。そのような
ベクターは通常の技術で調製できる。用いるレプリコン
は該ベクターで形質転換すべき宿主生物において、安定
に、染色体外的にベクターを維持する能力の知られてい
るものとすべきである。 また、本発明は、レプリコン、ストレプトマイセスga
lオペロンP2プロモーターまたはその官能性誘導体およ
び該領域に作動的に結合した異種官能性DNA配列を含有
する組換型DNAベクターからなる形質転換宿主微生物な
らびに、そのようなベクターで適当な宿主微生物を形質
転換することからなるそのような宿主の調製法に関す
る。用いることのできる適当な宿主微生物には、ストレ
プトマイセス属のもののような、いずれかのアクチノマ
イセス属が包含される。最も好ましい宿主微生物はスト
レプトマイセス属のものである。ストレプトマイセス属
の好ましい種にはストレプトマイセス・リビダンス、ス
トレプトマイセス・コエリカラー、ストレプトマイセス
・アゼラエウスおよびストレプトマイセス・アルブスが
包含される。ベクターによるこのような宿主微生物の形
質転換は前記チャーターらの方法のような通常の技術を
用いて行なうことができる。本発明はまた、官能性DNA
配列が発現されるような適当な条件下、形質転換宿主を
培養することからなる該形質転換宿主に含有される異種
官能性DNA配列の発現方法に関する。「適当な条件」な
る語は宿主の増殖を可能にし、官能性DNA配列の発現を
可能にする条件を意味する。この適当な条件は当業者が
通常の技術を用いて決定でき、用いる宿主生物および発
現させるべき官能性DNA配列のような種々の因子に依存
する。 また、本発明はレプリコン、ストレプトマイセスgal
オペロンP1プロモーターまたはそのいずれかの官能性、
調節可能な誘導体およびそのような領域に作動的に結合
した異種官能性DNA配列からなる組換DNAベクターに関す
る。そのようなベクターは通常の技術で調製できる。用
いるレプリコンは該ベクターで形質転換すべき宿主生物
において、安定に、染色体外的にベクターを維持する能
力の知られているものとすべきである。 また、本発明は、レプリコン、ストレプトマイセスga
lオペロンP1プロモーターまたはそのいずれかの官能
性、調節可能な誘導体および該領域に作動的に結合した
異種官能性DNA配列を含有する組換型DNAベクターからな
る形質転換宿主微生物ならびに、そのようなベクターで
適当な宿主微生物を形質転換することからなるそのよう
な宿主の調製法に関する。用いることのできる適当な宿
主微生物には、ウイルスまたは有核もしくは原核細胞も
しくは微生物、特に、ストレプトマイセス属のもののよ
うな、いずれかのアクチノマイセス属が包含される。最
も好ましい宿主微生物はストレプトマイセス属のもので
ある。ストレプトマイセス属の好ましい種にはストレプ
トマイセス・リビダンス、ストレプトマイセス・コエリ
カラー、ストレプトマイセス・アゼラエウスおよびスト
レプトマイセス・アルブスが包含される。ベクターによ
るこのような宿主微生物の形質転換は前記チャーターら
の方法のような通常の技術を用いて行なうことができ
る。本発明はまた、官能性DNA配列が発現されるような
適当な条件下、形質転換宿主を培養することからなる本
発明の形質転換宿主により含有される異種官能性DNA配
列の発現方法に関する。「適当な条件」なる語は宿主の
増殖を可能にし、官能性DNA配列の発現を可能にする条
件を意味する。そのような適当な条件は当業者が通常の
技術を用いて決定でき、用いる宿主生物および発現させ
るべき異種官能性DNA配列のような種々の因子に依存す
る。本発明はまた、発現が調節可能な適当な条件下、異
種官能性DNA配列を含む形質転換宿主を培養することか
らなる該形質転換宿主に含まれる官能性DNA配列の発現
を調節する方法に関する。「適当な条件」なる語は該ga
lオペロンP1プロモーター（および官能性DNA配列）を調
節可能にする条件を意味する。「調節可能」なる語は、
形質転換宿主細胞の増殖培地中のガラクトースまたはそ
の代謝物の存在または非存在およびグルコースまたはそ
の代謝物の存在に応答性であることを意味する。そのよ
うな調節は形質転換宿主の培地へのガラクトースまたは
グルコースの添加または削除によって行なうことができ
る。 実施例 つぎに実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説明する
が、これに限定されるものではない。 以下の実施例に示すような、通常の技術を用いること
により、当業者はストレプトマイセスのいずれかのガラ
クトース利用性株からgalオペロンを単離できる。さら
に、本明細書においてストレプトマイセスgalオペロン
の単離に用いたと同様な技術を利用することにより、当
業者は該ストレプトマイセスgalオペロンをストレプト
マイセスの他のガラクトース利用性株、特に、ストレプ
トマイセス・コエリカラー、ストレプトマイセス・アズ
ラエウス、ストレプトマイセス・アルブスおよび他のス
トレプトマイセス・リビダンス株からのgalオペロンの
単離に用いることができる。 以下の実施例で用いる分子遺伝子操作および他の技術
は、英国、ノールウィッチ、ジョン・インズ・ファウン
デーションのホップウッドら、ジェネティック・マニュ
ピレーション・オブ・ストレプトマイセス：ア・ラボラ
トリー・マニュアル（Hopwood et al.,Genetic Manipul
ation of Streptomyces:A Laborotory Manual）に記載
されている。 略号 以下の実施例中、つぎの略号を使用する。 LB:10gトリプトン、5g酵母エキス、5gNaCl MBSM（修飾MBSM）：ブラウナーら、ジーン（Brawner
et al.,Gene）40,191（1985）参照 MOPS:（３）−Ｎ−モルホリノ−（プロパン−スルホ
ン酸） YEME＋MgCl2＋グリシン：（当り）3g酵母エキス、5
gペプトン、3g麦芽エキス、10gグルコース、10gMgCl2・
6H2O、340gショ糖 Sl:（NH4）2SO4（1g/）、Ｌ−アスパラギン（2g/
）、K2HPO4（9g/）、NaH2PO4（1g/）を0.2％寒天
に対して一緒に混合し、オートクレーブする。ついで、
酵母エキス（20g/）、MgCl2（5g/）、CuCl2（0.1g/
）、微量元素［20ml/−ZnCl2（40mg/）、FeCl3・
6H2O（200mg/）、CuCl2・2H2O（10mg/）、NaB4O7・
10H2O（10mg/）、（NH4）6Mo7O24・4H2O（10mg/）
含有］と混合、濾過、滅菌 YEME（Ymベース）：（当り）酵母エキス（3g）、ペ
プトン（5g）、麦芽エキス（3g）、MgCl2・6H2O（2g） Ym glu:YEME＋グルコース（10g） Ym gal:YEME＋ガラクトース（10g） 細菌株 以下の実施例中、イー・コリのつぎの株を用いる。 CGSC株名称 性 染色体マーカー 株＃(a) 4473（galE-）W3109 F- galE9(b)g-;IN（rrnD−rrn
E）１ 4467（galT-）W3101 F- galT22(b)g-;IN（rrnD−rrn
E）１ 4498（galE-）PL−２ Hfr thi−l,relA1,921E28,g-,sp
oT1 （ａ）CGSC株＃は、米国コネチカット州、ニュー・ヘブ
ン、ピー・オー・ボックス3333、チェダー・ストリート
333（333Ceder Street,P.O.Box3333,New Haven,Connect
icut,06510,U.S.A.）のエール・ユニバーシティ・スク
ール・オブ・メディシン、イー・コリ・ジェネティック
・ストック・センター・オブ・ザ・デパートメント・オ
ブ・ヒューマン・ジェネティックス（E.coli Genetic S
tock Center of the Department of Human Genetics,Ya
le University School of Medicine）により該株に付さ
れた在庫番号である。 （ｂ）galE9は旧レダーベルグ（Lederberg）gal9、galT
22は旧レダーベルグgal1である。 S1分析 RNAの５′端および興味あるRNAの長さを同定するため
にS1分析を用いる。以下の実施例において、S1分析はウ
ェーバーら、ヌークレイック・アシッズ・リサーチ（We
aver et al.,Nucl.Asids Res.）7,1175（1979）および
バークら、プロシーディングス・オブ・ナショナル・ア
カデミー・オブ・サイエンス・ユー・エス・エイ（Berk
et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA）75,1214（1978）の
方法に従って行なったS1実験を示す。 実施例１ A.ストレプトマイセス・リビダンス・ガラクトキナーゼ
遺伝子 ストレプトマイセス・リビダンス株1326はビッブら、
モレキュラー・アンド・ジェネラル・ジェネティックス
（Bibb et al.,Mol.Gen.Genetics）184,230〜240（198
1）によって記載されており、英国、ノーウィッチ、ジ
ョン・インズ・ファンデーションのディ・エイ・ホップ
ウッド（D.A.Hopwood,John Innes Foundation,Norwich
Eugland）より得た。ストレプトマイセス・リビダンス
株1326およびpIJ6プラスミドを含有するストレプトマイ
セス・リビダンス株1326は、1982年６月１日に、米国イ
リノイ州、ペオリアのアグリカルチュラル・リサーチ・
カルチャー・コレクションに、各々、寄託番号NRRL1509
1および15092で寄託した。 高分子量染色体DNAはマニアチスら（Maniatis et a
l）、「モレキユラー・クローニング・ア・ラボラトリ
ー・マニュアル」、コールド・スプリング・ハーバー・
ラボラトリー（1982）の方法に従って、ストレプトマイ
セス・リビダンス株1326から単離し、10〜40％ショ糖グ
ラジエント上でサイズ分別した（前記アニアチスら、28
4〜285頁）。18〜24Kb対のフラクションを合し、10mMト
リス−HCl/1mMEDTA（pH8）に対して充分に透析した。コ
スミッド・シャトル・ベクターpJW357を用いて分別した
染色体DNAを全体としてクローンした。pJW357はPst Iで
切断したpDPT6をPst 1で切断したpIJ350に融合して作製
した。pIJ350はキーゼルら、モレキュラー・アンド・ジ
ェネラル・ジェネティックス（Kieser et al.,Mol.Gen.
Genet.）185,223〜238（1982）に記載されている。pDPT
6はテイラーら（Taylor et al.）の米国特許第4476227
号に記載されているテトラサイクリンおよびクロラムフ
ェニコール耐性、pBR322ベース・イーコリ・コスミッド
・クローニング・ベクターである。pJW357は該クロラム
フェニコール耐性遺伝子中に独特なEcoR I部位およびテ
トラサイクリン耐性遺伝子に独特なBamH I部位を有す
る。pJW357をBamH Iで消化し、アルカリ性ホスファター
ゼで脱ホスホリレート化し、前記の分別した染色体DNA
に連結した。 連結生成物をバクテリオファージ頭部につつみ込み
（前記マニアチスら、264〜265頁に記載されたin vitro
パッケージング系を用い）、イー・コリMM294のgalK-誘
導体であるイー・コリ株K21にトランスフェクションし
た。この形質転換培養をLB中で２時間、25μg/mlクロラ
ムフェニコール添加LB中でさらに２時間増殖させ、等容
量の炭素源のないM9培地［ミラー、「エクスペリメンツ
・イン・モレキュラー・ジェネティックス」、コールド
・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（1972）参照］
で３回洗浄し、クロラムフェニコール30mg/mlを添加し
たM9寒天［プロリン、ヒスチジン、アルギニン、イソロ
イシン、ロイシン、食塩水および0.5％ガラクトース補
足、アグムスら、バイオケミカル・アンド・バイオフィ
ジカル・リサーチ・コミュニケーション（Adams et a
l.,Biochem.Biophys.Res.Comm.）89（２）,650〜658（1
979）］上で平板培養した。平板当り約200形質転換体を
平板20枚に塗抹した。37℃で３日間インキュベーション
後、形質転換体は検出されなかった。この最少平板にニ
コチン酸を５μg/mlでスプレーし、イー・コリ株K21の
ニコチン酸要求を補足し、さらに37℃で３日間、ついで
室温で２日間インキュベーションを続けた。インキュベ
ーション後、生存コロニーをクロラムフェニコール30μ
g/mlを添加したマッコンキー・ガラクトース寒天（MAC
−GAL）（前記ミラーら参照）および0.5％ガラクトー
ス、５μg/mlニコチン酸、５μg/mlチアミンおよび30μ
g/mlクロラムフェニコールで補足したM63最少寒天（前
記ミラーら参照）の両方にパッチした。２つのコロニー
のみが、イー・コリK21をgalK+表現型に形質転換するコ
スミッドDNAを含有していた。これらのコスミッドをpSL
IVGAL−１およびpSLIVGAL−２と命名した。両コロニー
共、MAC−GAL上で薄赤色で（すなわち、これらはgal
K+）、M63培地上で増殖した。 プラスミドpSLIVGAL−１およびpSLIVGAL−２を前記２
つのgalK+コロニーから単離し、前記チャーターらの方
法に従って、ストレプトマイセス・リビダンス株1326−
12K［ストレプトマイセス・リビダンス株1326のUV変異
誘発後、galK欠損株を単離、ブラウナーら、ジーン（Br
awner et al.,Gene）40,191（1985）参照］に形質転換
した。該ストレプトマイセス・リビダンス1326−12K（g
alK-）宿主のプラスミド・コード付け相補を前記ブラウ
ナーらの方法に従って、MBSM−gal−チオストレプトン
平板上で胞子の増殖を観察してテストした。pSLIVGAL−
２はストレプトマイセス1326−12K宿主の検知しうる相
補を示さなかった。 細胞抽出物を、１％グルコースまたはガラクトースお
よび10μg/mlチオストレプトンで補足したSL培地中で増
殖させた培養から調製した。イムノブロット（immunobl
ot）分析（前記ブラウナーら参照）により、イー・コリ
・ガラクトキナーゼに対するウサギ抗血清を用いて抽出
物のガラクトキナーゼ産生を分析した。イムノブロット
分析で検出された蛋白質はほぼイー・コリgalKのサイズ
であった。この蛋白質はストレプトマイセスのガラクト
ース補足培養において、グルコース培養におけるよりも
数倍高いレベルで出現した。 B.コスミッド内のストレプトマイセス・リビダンスgalK
領域の地図 前記のように調製したpSLIVGAL1およびpSLIVGAL2のga
lK領域を、コスミッドからのランダム・フラグメントの
pUC18誘導体へのクローニング［ノーランダーら、ジー
ン（Norrander et al.,Gene）26,101〜106（1983）］お
よびMAC−GAL培地上でのイー・コリ株MM294（galK-）の
相補スコアにより同定した。コスミッド・クローンを部
分的にSau3A Iで消化して（２〜4Kbフラグメントの収率
が最大となる条件下）、この反応生成物を、つぎの合成
DNA配列： をpUC18のBamH I部位に挿入して作製したpUC18の誘導体
であるpUC18−TT6のBgl II部位に連結する。12個のgalK
+クローン（MAC−GAL上、赤）のサイズをスクリーニン
グする。プラスミドpSAU10と命名した１つのクローンは
最も小さく、約1.4Kbのインサート・サイズを有してい
た。 pSLIVGAL1含有コロニーと異なり、pUCクローンはMAC
−GAL培地上で非常に赤く、ガラクトキナーゼの産生増
加を示した。この酵素レベルの増加の最も可能性の高い
説明は、ストレプトマイセス・リビダンスgalK遺伝子
が、コスミッドの上流プロモーターより強いイー・コリ
・プロモーターに転写されていることである。 pSAU10のインサートをEcoR I〜Hind IIIフラグメント
として単離し（これらの部位はpUC18−TT6のインサート
領域をフランキングする）、ストレプトマイセス・リビ
ダンスgalK遺伝子のプローブとして用いる。クローニン
グに用いた染色体DNAをEcoR I＋Mlu IおよびBamH I＋Bg
l IIで制限し、サザーン、ジャーナル・オブ・モレキュ
ラー・バイオロジー（Southern,J.Mol.Biol.）98,503
（1975）の方法に従ってプロットする。pSAU10フラグメ
ントをニック・トランスレーションし、該ブロットに雑
種形成させる。プローブは染色体消化物における1.3KbE
coR I−Mlu Iフラグメントおよび5KbBamH I−Bgl IIフ
ラグメントを同定した。このデータをコスミッド・イン
サートの地図と比較して、galK遺伝子の位置（地図位置
５と７の間、表Ａ参照）を確認した。 C.ストレプトマイセス・リビダンスgalオペロンのDNA配
列 ストレプトマイセス・リビダンスgalオペロンを鎖終
止［サンガーら、プロシーディングス・オブ・ナショナ
ル・アカデミー・オブ・サイエンス・ユー・エス・エイ
（Sanger et al.,Proc.Nat'l.Acad.Sci.U.S.A.）74,546
3（1977）参照］および化学的開裂［マキサムおよびギ
ルバート、メソッズ・イン・エンザイモロジー（Maxam
and Gilbert,Methods in Enzymology）65,499（198
0）］により配列づけした。galKの初めの配列はM13mp10
のBamH IおよびSal I部位の各々にショットガン・クロ
ーンされたpSAU6のインサート（pSAU10の2.3Kb同胞）の
Sau3A IおよびSal Iフラグメントから由来した［メッシ
ング（Messing］、メソッズ・イン・エンザイモロジ
ー、101、20（1983）参照］。ストレプトマイセス・リ
ビダンスgalT、galEおよびgalK遺伝子のアミノ酸配列は
コンピュータによって予測され、イー・コリおよび／ま
たはサッカロマイセス・セレビシエ（S.cevevisiae）ガ
ラクトキナーゼ、gal−１−ホスフェート・ウリジル・
トランスフェラーゼおよびUDP−４−エピメラーゼ酵素
のアミノ酸配列との比較によって分析した。これらの蛋
白質の配列は、gal酵素をコード付ける遺伝子の総また
は部分DNA配列を用いるコンピュータ分析により予測さ
れた［デボウクら、ヌークレイック・アシッズ・リサー
チ（Debouck et al.,Nuc.Acids Res.）13（６）,1841〜
1853（1985）およびシトロンおよびドネルソン、ジャー
ナル・オブ・バクテリオロジー（Citron and Donelson,
J.Bacteriology）158,269（1984）参照］。ストレプト
マイセス・リビダンスgalK、galT、galE遺伝子生成物に
ついての推定蛋白質配列と、それらの各イー・コリおよ
び／またはサツカロミセス・セレビシエ遺伝子生成物の
間にいくらかの相同が見出された。 ストレプトマイセス・リビダンスgalオペロンの完全D
NA配列を表１に示す。表１に包含されているものはオペ
ロンのプロモーターについての転写開始部位およびgal
T、galEおよびgalK遺伝子生成物の予測アミノ酸配列で
ある。 実施例２ ストレプトマイセス・リビダンスgalオペロンのプロモ
ーター ａ）P1プロモーター （ｉ）概要 このプロモーターはガラクトース誘導性、グルコース
抑制性で、全ストレプトマイセスgalオペロン用の調節
可能プロモーターである。S1データはストレプトマイセ
ス・リビダンスgalオペロンが約3.4Kbのポリシストロニ
ック転写体をコード付けすることを示している。転写体
はgalTについての約1Kb、ついで、各galEおよびgalKに
ついての約1Kbからなる。（第１図参照） P1のガラクトース誘導は、少なくとも部分的に、５′
端が転写開始部位の上流31bpに位置するオペレーター配
列および該オペレーターを認識するレプレッサ蛋白によ
り介在される。 （ii）実験:P1プロモーターの単離、位置決め、特性づ
け ストレプトマイセス・リビダンスgalK ATGの上流配列
を、前記ブラウナーのイー・コリgalKプロモーター・プ
ローブ系を用い、プロモーターについてスクリーニング
する。Hind III−Mlu Iフラグメント（表Ａ、地図位置
１〜５参照）をSau3A Iで制限し、pK21の特有のBamH I
部位に連結し（第２図）、実施例１の方法に従ってイー
・コリK21（galK-）中に形質転換する。pK21はpSKO3の
誘導体で、イー・コリgalK遺伝子を含有するイー・コリ
−ストレプトマイセス・シャトル・ベクターである。pS
KO3の構成はローゼンベルグら（Rosenberg et a
l.）、ジェネティック・エンジニアリング、８（1986）
に記載されている。galKを発現するクローン、すなわ
ち、プロモーター活性を有するクローンをマッコンキー
−ガラクトース平板上で同定した。２つのgalK+クロー
ン（pK21MH1および２と命名）をストレプトマイセス132
6−12K（galK-）に形質転換した。形質転換体の抽出物
をYmgluおよびYmgal中で培養し、抗イー・コリ・ガラク
トキナーゼ抗血清を用い、ウエスターン・ブロット分析
で分析した。このブロットはガラクトース誘導培養から
の抽出物において著しく高いガラクトキナーゼのレベル
を示した。 pK21MH1および２は制限分析により410bpのSau3A Iイ
ンサートを含有することが示され、これは、サザーン、
ジャーナル・オブ・モレキュラー、バイオロジー98、50
3（1975）の方法によるサザーン・ブロット分析によ
り、Hind IIIおよびBgl II部位内に含有される（表Ａ、
地図位置１〜２）。クローンしたフラグメントを、スト
レプトマイセス・リビダンス1326−12Kおよびイー・コ
リK12培養から単離したRNAを用いるS1分析により分析し
た。S1消化後得られたフラグメントは290ヌクレオチド
保護フラグメントである（Sau3A I部位のmRNA290のbp上
流の５′端を示す）。雑種形成実験（この領域の単スト
ランドM13クローンを用いる）は転写の方向が第２図に
示すごとく、左から右であること（すなわち、転写はga
lKの方へ進向する）を示している。 通常のDNA配列分析および追加のS1地図作製分析を用
いてmRNAの５′端を規定した。 P1のガラクトース誘導調節に関与する配列を、ヌクレ
アーゼBal31により転写開始部位の上流配列を除去する
ことにより位置づけした。これらの配列除去によるプロ
モーター機能またはガラクトース誘導におけるいずれも
の変化をP1同定に用いたイー・コリgalKプロモーター・
プローブ・プラスミドを用いて評価した。 （iii）galプロモーター欠失の構成 P1転写開始から下流100bpおよびP1転写開始から上流2
16bpの配列を含むDNAフラグメントをプラスミドpUC19TT
1にクローンしてプラスミドpHL5を構成する。プラスミ
ドpUC19TT1はノーランダーら、ジーン26、101〜106（19
83）に記載されており、pUC18−TT6としてのアンカー
（Unker）を有している。実施例1B参照。P1の前の上流
配列中に延長する欠失はpHL5をHind IIIで線状化し、ヌ
クレアーゼBal31で端部を処理することにより発生させ
ることができる。不均一端をDNAポリメラーゼＩのクレ
ノウ・フラグメントで修復する。ついで、Bal31処理pHL
5をBamH Iで消化し、５％アクリルアミド・ゲル上を泳
動させる。分子量100〜300bpのDNAフラグメントをゲル
から溶出し、Hind IIおよびBamH Iで消化したM13mp10に
サブクローンする。（メッシング（Messing）、メソッ
ズ・イン・エンザイモロジイ、101、20（1983）参
照）。個々の欠失を、前記サンガーらのジデオキシ鎖終
止法により、単ストランド・ファージDNAから配列づけ
する。 （iv）P1プロモーター欠失のイー・コリgalK遺伝子への
結合 種々のmp10クローンをBamH IおよびHind IIIで消化し
た。個々の欠失を有するDNAフラグメントを低融点アガ
ロース・ゲルから単離し、BamH IおよびHind IIIで消化
したpK21に連結した（第２図参照）。イー・コリMM294
への形質転換後、プラスミドDNAを、各欠失誘導体につ
いて単離し、ストレプトマイセス・リビダンス12Kに形
質転換した。 （ｖ）ストレプトマイセス・リビダンスにおけるBal31
−発生欠失の機能的評価 各々のプロモーター欠失について、１つのチオストレ
プトン耐性形質転換体をYMベース（YEME）＋10μg/mlチ
オストレプトン中で後記logまで増殖させた。細胞をペ
レット化し、M56培地中で１回洗浄し、M56培地に再懸濁
した（前記ミラーら参照）。洗浄した細胞を、１％ガラ
クトースまたは１％グルコース補足YM＋0.1M MOPS（pH
7.2）＋10μg/mlチオストレプトンへの接種に用いた。
細胞を16時間増殖させ、ついで、ガラクトースキナーゼ
活性を検定した。 P1転写用開始部位の上流120、67、55、34、31、24、2
0、18、10または8bp配列のいずれかを含有する各pK21誘
導体をガラクトースキナーゼの発現について分析した。
結果は、P1のガラクトース誘導に必要な全ての情報（す
なわち、ガラクトース増殖細胞において産生されたガラ
クトキナーゼのレベルがグルコース増殖細胞におけるレ
ベルより10〜20倍大きい）がP1の上流の31bp配列に含ま
れることを示した。P1の上流34bp配列を残した欠失は、
ガラクトースが６倍量のガラクトキナーゼを誘導するの
で、ガラクトースによって部分的に誘導性である。すな
わち、オペレーターの一端は、−24および−31倍の間の
配列内に位置しなければならない。上流配列の20、18、
10または8bpのいずれかを残した残りの欠失は構成性P1
プロモーター、すなわち、産生したガラクトキナーゼの
レベルが、細胞をガラクトースまたはグルコースの存在
下で増殖させた場合、同等である。P1の８および10bpを
有するプロモーター欠失は構成性ではあるが、ガラクト
キナーゼの量は、18〜120bpの上流配列を有するプロモ
ーター欠失に比べ、10倍減少した。この結果はP1の−10
および−18位間の配列がプロモーター機能に必須である
ことを示している。 このデータは、P1のガラクトース誘導が、少なくとも
部分的にオペレーター配列に介在されるモデルを支持し
ている。この配列の一端はP1転写開始部位の上流24〜31
bpである。オペレーターの一部または全部の除去は部分
的または全体的に脱抑制されたプロモーターをもたら
す。この配列の他端はこれらの実験によって規定されな
いが、ほぼP1転写開始部位の上流24〜31bp配列内に含ま
れると考えられる。さらに、これらの配列がガラクトー
ス誘導を達成するに必要な最小領域内に含まれているの
で、本発明者らはオペレーターの３′端も転写開始部位
の上流100bp内にある可能性を排除できない。これらの
データは、オペレーター配列と相互作用する因子がレプ
レッサー蛋白質であることを示唆している。最後に、本
発明者らは、P1がレプレッサー以外の因子（すなわち、
ラムダファージc II蛋白質のような陽性アクチベータ
ー）によって制御されてガラクトース誘発プロモーター
転写体を調節しうるという可能性を排除する証拠を有し
ない。 ｂ）P2プロモーター （ｉ）概要 ストレプトマイセスgalオペロンのP2プロモーターはg
alE遺伝子の上流で、galEおよびgalK遺伝子の両方を転
写する。 P2プロモーター発現はS1分析によって示されるように
構成的（すなわち、グルコース抑制／ガラクトース誘導
でない）である。 （ii）実験:P2プロモーターの単離、位置決め、特性づ
け ストレプトマイセスgalオペロンP2の存在は、ストレ
プトマイセス・リビダンス1326DNAのBal II−Mlu Iフラ
グメントをプラスミドpK21に挿入し（第２図参照）、そ
れによって形質転換されたストレプトマイセス・リビダ
ンス1326−12K中でガラクトキナーゼ発現が観察される
場合に明らかとなった。 DNA配列分析およびS1分析を用いてストレプトマイセ
ス・リビダンスgalオペロンP2の５′端を同定した。P2
プロモーター転写体の５′端は予測したgalE ATGの上
流100bp内にある。 実施例３ ストレプトマイセスgalオペロン内のポリシストロニッ
ク・メッセージの証拠 S1分析を用いてストレプトマイセス・リビダンスgal
オペロンgalK遺伝子の転写体上流および下流の地図を作
製した。一般に、１〜2Kbのオーバー・ラップDNAフラグ
メントをクローンから単離し、さらに制限し、末端をラ
ベルした。メッセージはgalKの３′端からP1の上流端ま
で続く。 ストレプトマイセス・リビダンスgalオペロン転写体
の３′端は多分、galKの最初の100塩基下流内に生じ
る。galK配列内の部位で３′ラベルしたフラグメント
は、下流領域に伸長する場合、その全長までは保護され
ない。１つの実験は、galK翻訳終止の下流50〜100bpで
終止する領域で保護されうることを示している。転写タ
ーミネーターの存在はターミネーター・プローブを用い
る通常の技術によって確認できる。galオペロン転写体
は、当該部位から５′ラベルPvu IIフラグメントの非全
長保護が生じるので、明らかにPvu II部位まで伸長しな
い（表Ａ、地図位置８参照）。 ２つのPvu IIからの５′端ラベルフラグメント、フラ
グメントＩ（表Ａ、地図位置４〜６参照）およびフラグ
メントII（表Ａ、地図位置６〜８参照）ならびにpSau10
インサートを、メッセージの３′から５′端へのS1ウォ
ーキング（warking）のプローブ源として用いた。この
領域の全てのフラグメントは、部分および完全保護を示
すP2プロモーター含有フラグメントを除き、保護され
た。S1消化からの完全保護は、P1の上流で開始し、galK
の約100bp下流まで続くポリシストロニック・メッセー
ジを示す。 前記のデータはストレプトマイセスgalオペロンのポ
リシストロニックmRNAの間接的証拠である。長い隣接す
るDNAフラグメント（例えば、4.5Kb Hind III−Sac I
フラグメント、表Ａ、地図位置７参照）を用いるS1分析
を転写体サイズの確認に用いた。 実施例４ ストレプトマイセス・リビダンスgalオペロンgalEおよ
びgalT遺伝子の位置決め （ｉ）概要 ストレプトマイセス・リビダンスgalオペロンgalE遺
伝子はpSLIVGAL1の1.5Kb Pvu IIフラグメント（表Ａの
地図位置４〜６）に位置する（第１図）。 ストレプトマイセス・リビダンスgalオペロンgalEコ
ード付け配列はMlu I部位を通して伸長する（表Ａの地
図位置５）。 ストレプトマイセス・リビダンスgalオペロンgal遺伝
子はpSLIVGAL1の1.15KbNru−Pvu II領域に位置する（表
Ａの地図位置1a〜４参照）。 ストレプトマイセス・リビダンスgalオペロンgalEお
よびgalT転写方向はgalK遺伝子と同じである。 （ii）実験 pSLIVGAL1に含有される他の機能特に、酵素ガラクト
ース・エピメラーゼ（galE）または酵素ガラクトース・
トランスフェラーゼ（galT）をコード付けするプラスミ
ドを同定する必要がある。ストレプトマイセスgalオペ
ロンgalK遺伝子はそのイー・コリgalK宿主を相補する能
力で同定した。かくして、ストレプトマイセスgalTおよ
びgalE遺伝子の同定は、各々、イー・コリgalE-またはg
alT-宿主の相補によりテストした。イー・コリgalT-株
（CGSC株＃4467、W3101）および２つのgalE-株（CGSC株
＃4473、W3109およびCGSC株＃4498、PL−２）を得、pSL
IVGAL1クローンによる相補のテストをした。 ストレプトマイセス・リビダンスgalオペロンgalK遺
伝子を含有する約9KbのHind III−Sph Iフラグメント
（表Ａ、地図位置１〜16をpUC19に挿入した。このフラ
グメントはpUC19内で、pUC19のPlacプロモーターからの
転写がストレプトマイセスgalK遺伝子と同じ方向になる
ように位置させる。pUC19はヤニッシュ−ペローら、ジ
ーン（Yanisch−Perrou et al,Gene）33,103（1983）
に記載されている。相補はマッコンキー−ガラクトース
平板上での増殖により検定した。ガラクトースを利用で
きる細胞（galE+、galT+、galK+）はこの培地上で赤〜
桃色となる。Hind III−Sph Iインサートを有するpUC19
含有イー・コリ株PL−２（実施例２参照）はこの指示薬
平板上で桃色になり、Hind III−Sph Iフラグメントが
ストレプトマイセス・リビダンスgalE遺伝子を含有する
ことを示した。galE遺伝子は4.5Kb Hind III−Sac I
（Sac I部位は表Ａの地図位置７〜８近辺の領域に近
い）フラグメント内に地図作製した。Mlu I部位（表
Ａ、地図位置５）からSac I部位までの配列を除くと、
イー・コリPL−２のgalE相補は検出されなかった。galK
遺伝子の５′端はMlu I部位から70bpにある。したがっ
て、Mlu I部位はgalE遺伝子の５′または３′端内に含
まれるようである。galE転写方向を決定するため、Hind
III−Sac IフラグメントをpUC18に挿入した。この配置
において、ストレプトマイセス・リビダンスgalK遺伝子
はPlacに関して反対の方向にある。pUC18Hind III−Sph
Iクローンはイー・コリPL−２を相補せず、galEはgalK
と同じ方向で転写されることを示している。さらにMlu
I部位はgalE遺伝子の３′端内に含まれると結論され
た。Pvu II−Mlu Iフラグメント（表Ａ、地図位置４−
５）のDNA配列分析は予測分子量33000ダルトンのポリペ
プチドをコード付けするオープン・リーディング・フレ
ームを決定した。このリーディング・フレームの５′端
はPvu II部位から約176bpに位置する（表Ａ、地図位置
４参照）。かくして、この配列づけの結果はgalEの３′
端がMlu I部位を横切るという結論を指示している（表
Ａ、地図位置５参照）。 pSLIVGAL1上のgalT遺伝子を位置づけする同様な実験
をgalT宿主で試みた。 P1およびgalEの５′端間の領域を配列づけしてgalT遺
伝子を同定した。DNA配列のアミノ酸配列への翻訳は酵
母トランスフェラーゼに相同な領域を示す蛋白質をコー
ド付けするリーディング・フレームを規定する。 実施例５ ストレプトマイセス・リビダンスgalオペロンgalK遺伝
子のガラクトース誘導 （ｉ）概要 ガラクトースを培地に添加後１時間以内にガラクトキ
ナーゼ発現が誘導される。 グルコースの存在下または該糖添加後６時間以内に追
加の炭素源を加えない場合に対し、ガラクトースの存在
下ではガラクトキナーゼの発現は10倍も高い。 （ii）実験 ストレプトマイセス・リビダンスgalK遺伝子のガラク
トース誘導を、ガラクトースの添加後、１、３、６およ
び24時間におけるガラクトキナーゼ活性の検定により試
験した。YM＋0.1MMOPS（pH7.2）２にストレプトマイ
セス・リビダンス1326の胞子２×107個を接種した。21
時間増殖後、最終濃度１％でガラクトースまたはグルコ
ースを加えた。糖添加１、３、６および24時間後、細胞
を単離し、ガラクトキナーゼ活性を検定した。全RNAは
前記ホップウッドらに記載の方法で調製した。 ガラクトキナーゼ合成の増加はガラクトース添加１時
間後に観察された。この増加は持続した（１〜24時
間）。誘導培養から単離したRNAのS1分析からgalK活性
の増加がP1プロモーター転写体のレベル増加によること
を確認した。 S1データおよび誘導研究はストレプトマイセスgalオ
ペロンにおける遺伝子発現についての以下のモデルを示
唆した。P1プロモーターはガラクトース誘導プロモータ
ーである。P1転写体はgalT、galEおよびgalKを包含す
る。P2プロモーターは構成性で、その転写体はgalEおよ
びgalKを包含する。 イー・コリgalオペロンも２つのプロモーターP1およ
びP2を有することは興味深い［ナッソら、セル（Nusso
et al,Ce11）12,847（1977）］。P1はcAMP−CRP結合
によって活性化されるが、P2はcAMP−CRPによって抑制
される。イー・コリgalオペロンgalEコード付け配列翻
訳は、ガラクトースの非存在下またはグルコースの存在
下でもエピメラーゼの一定の源を供給する役割をするP2
において転写が開始される場合、より効率的である［ク
イーンら、セル（Queen et al,Cell）25,241（1981）
参照］。エピメラーゼはガラクトース利用の間、ガラク
トースをグルコース−１−ホスフェートに変え、UDP−
グルコースをイー・コリの細胞壁生合成に必要なUDP−
ガラクトースに変える機能を有する。ストレプトマイセ
スgalKオペロンのP2プロモーターも、ガラクトースの非
存在下または二次代謝の間にエピメラーゼおよびガラク
トキナーゼを供給する役割をする可能性がある。 実施例６ ストレプトマイセス・コエリカラーgalオペロン （ｉ）概要 ストレプトマイセス・コエリカラーgalK遺伝子含有フ
ラグメントの制限地図はストレプトマイセス・リビダン
スgalオペロンの制限地図と同じである（第３図参
照）。 ストレプトマイセス・コエリカラーはガラクトースを
唯一の炭素源とする最少培地上で増殖できる。 ストレプトマイセス・コエリカラーにおけるガラクト
キナーゼ発現は増殖培地にガラクトースを添加すること
により誘導される。 P1と類似で、ほぼ同一と考えられるプロモーターがス
トレプトマイセス・コエリカラーgalオペロンのガラク
トース誘導に関与する。 （ii）実験 ストレプトマイセス・コエリカラーgalK遺伝子含有の
約14Kb部分Sau3Aフラグメントは英国マンチェスター
の、ユニバーシティ・オブ・マンチェスター・インステ
ィテュート・オブ・サイエンス・アンド・テクノロジー
においてケイ・ケンダルおよびジェイ・クラム（K.Kend
allおよびJ.Cullum）によって単離された（未公開、私
信）。彼等は、ストレプトマイセス・コエリカラーgalK
変異株の相補により3Kb EcoR Iフラグメント内にストレ
プトマイセス・コエリカラーgalK遺伝子を位置づけする
ことができた。ストレプトマイセス・リビダンスgalオ
ペロン内の多くの制限部位の位置はストレプトマイセス
・コエリカラーgalK遺伝子を含むEcoR Iフラグメントの
上流および下流内に見られるものと同じである（第３
図）。すなわち、ストレプトマイセス・コエリカラーga
lオペロンの遺伝子構成はストレプトマイセス・リビダ
ンスgalオペロンと同じであるように考えられる。 ストレプトマイセス・コエリカラーgalK遺伝子のガラ
クトース誘導をイムノブロッティングで試験した。スト
レプトマイセス・コエリカラーをYM＋１％ガラクトース
または１％グルコース（YmgluまたはYmgal）中、28℃で
20時間増殖させた。ガラクトキナーゼ発現は、精製イー
・コリ・ガラクトキナーゼに対して調製したウサギ抗血
清を用いて検出した。検出した蛋白質はイー・コリおよ
びストレプトマイセス・リビダンスgalK遺伝子生成物の
近似部位であった。ガラクトキナーゼ発現は、ストレプ
トマイセス・コエリカラーがYm＋ガラクトース（Ymga
l）中で増殖した場合のみ検出されるので、ガラクトー
ス誘導である。 ストレプトマイセス・コエリカラーgalオペロンのガ
ラクトース誘導がストレプトマイセス・リビダンスP1プ
ロモーターに類似するプロモーターによって指示されて
いるか否かを決定するためにS1ヌクレアーゼ保護研究を
行なった。RNAを、Ym＋１％ガラクトースまたは１％グ
ルコース（YmgalまたはYmglu）中で増殖させたストレプ
トマイセス・コエリカラーから単離した。このRNAのS1
分析に用いた雑種形成プローブは、ストレプトマイセス
・リビダンスP1プロモーター、その転写開始部位および
galT遺伝子の５′端を含む410bpSau3Aであった。この分
析により検出されたS1保護フラグメントは、ガラクトー
ス存在Ｔで増殖したストレプトマイセス・リビダンスか
ら単離したRNAとプローブを雑種形成させた場合、検出
した保護フラグメントと共に泳動した。すなわち、この
結果は、ストレプトマイセス・コエリカラーgalオペロ
ンのガラクトース誘導がストレプトマイセス・リビダン
スP1プロモーターと区別できない配列によって指示され
ていることを示している。 以下のストレプトマイセス株は唯一の炭素源としてガ
ラクトースを含有する培地上で増殖できることが観察さ
れた。 ストレプトマイセス・アルブスJ1074（前記英国ノー
ウィッチのチャーター氏より入手） ストレプトマイセス・カルジノスタティクス（S.carz
inostaticus）ATCC No.15944 ストレプトマイセス・カルジノスタティクスATCC No.
15945 ストレプトマイセス・アンチフィブリノリチクス（S.
antifibrinolyticus）ATCC No.21869 ストレプトマイセス・アンチフィブリノリチクスATCC
No.21870 ストレプトマイセス・アンチフィブリノリチクスATCC
No.21871 ストレプトマイセス・ロンギスポルス（S.longisporu
s）ATCC No.23931 以上、本発明の好ましい具体例を実施例として記載し
たが、本発明はこれらに限定されるものではない。
オペロンP1プロモーター調節領域またはストレプトマイ
セスgalオペロンP1プロモーターからなる組換型DNA分子
に関する。 発明の背景 ホッジソン、ジャーナル・オブ・ジェネラル・マイク
ロバイオロジー（Hodgson,J.Gen.Micro.）128,2417〜24
30（1982）はストレプトマイセス・コエリカラー（S.co
elicolor）A3（２）が、野性型株におけるグリセロール
摂取系の１つであるアラビノース摂取系の転写レベルに
おける抑制と、ガラクトース摂取系の抑制をもさせるグ
ルコース抑制系を有することを報告している。しかし、
ホッジソンにはストレプトマイセス・コエリカラーA3
（２）による実際のガラクトース代謝の報告は全くな
い。 オケダら、モレキュラー・アンド・ジェネラル・ジェ
ネティックス（Okeda et al.,Mol.Gen.Genet.）196,501
〜507（1984）は、グルコース・キナーゼ活性、２−デ
オキシグルコース感受性、グルコース利用性およびグル
コース抑制が、ストレプトマイセス・コエリカラーから
ファージ・ベクターにクローンされた当該glk遺伝子を
含有する3.5KbDNAフラグメントによって形質転換された
ストレプトマイセス・コエリカラーA3（２）glk（グル
コース・キナーゼ）変異株に全て復元されたことを報告
している。 セノら、モレキュラー・アンド・ジェネラル・ジェネ
ティックス（Seno et al.,Mol.Gen.Genet.）193,119〜1
28（1984）はストレプトマイセス・コエリカラーのゼリ
セロール（gyl）オペロンを報告し、かかるオペロンが
基質誘発性で、カタボライト抑制性であると述べてい
る。 デボウクら、ヌークレイック・アシッズ・リサーチ
（Debouck et al.,Nuc.Acids.Res.）13（６）,1841〜18
53（1985）はイー・コリ（E.coli）のgalオペロンが、
ガラクトースの代謝に必要な酵素、すなわち、galE（ウ
リジン・ジホスホガラクトース−４−エピメラーゼ）、
galT（ガラクトース−１−ホスフェート・ウリジルトラ
ンスフェラーゼ）およびgalK（ガラクトキナーゼ）を特
定する３つの構造的に近似した遺伝子からなること、こ
れらの遺伝子がポリシストロニックmRNAからＥ、Ｔ、Ｋ
の順序で発現されること、オペロンのプロモーター遠位
遺伝子galKの発現がその直前のgalT遺伝子に翻訳的にカ
ップルされることが公知であること、このような翻訳的
カップリングが、galTコード付け配列の端と、galKのリ
ボソーム結合域の間の構造的オーバーラップから生じる
こと、およびgalTおよびgalKの翻訳的カップリングが、
ガラクトースの代謝の間のこれらの遺伝子の一律発現を
保証することを報告している。 発明の概要 本発明はストレプトマイセスgalオペロンgalK遺伝
子、galE遺伝子、galT遺伝子、P2プロモーター発現単位
またはP2プロモーターまたはそのいずれかの官能性誘導
体からなる組換型DNA分子ならびにストレプトマイセスg
alオペロンP1プロモーター、P1プロモーター調節領域ま
たは全galオペロンまたはそのいずれかの調節可能な官
能性誘導体からなる組換型DNA分子に関する。 本発明はまた、ストレプトマイセスgalオペロンまた
はそのいずれかの調節可能な官能性誘導体およびかかる
オペロンに作動的に結合した官能性DNA分子からなる組
換型DNA分子、かかるDNA分子、所望により、さらにレプ
リコンからなる組換型DNAベクター、かかるベクターで
形質転換された宿主細胞の調製法、そのような方法で調
製された形質転換宿主、当該官能性DNA配列が発現され
るような適当な条件下、そのような形質転換宿主を培養
することからなる該官能性DNA配列の発現方法およびそ
のような発現を調節する条件下、そのような形質転換宿
主を培養することからなるそのような官能性DNA配列の
発現を調節する方法に関する。 また、本発明はストレプトマイセスgalオペロンP2プ
ロモーター発現単位またはそのいずれかの官能性誘導体
およびその単位に作動的に結合した官能性DNA分子から
なる組換型DNA分子、そのようなDNA分子および、所望に
より、さらにレプリコンからなる組換型DNAベクター、
そのようなベクターで形質転換された宿主細胞の調製
法、そのような方法で調製された形質転換宿主および当
該官能性DNA配列が発現されるような適当な条件下、そ
のような形質転換宿主を培養することからなるそのよう
な官能性DNA配列の発現方法に関する。 また、本発明はストレプトマイセスgalオペロンP1プ
ロモーター調節領域またはそのいずれかの調節可能な官
能性誘導体およびそのような領域に作動的に結合した官
能性DNA分子からなる組換型DNA分子、そのようなDNA分
子および、所望により、さらにレプリコンからなる組換
型DNAベクター、そのようなベクターで形質転換された
宿主細胞の調製法、そのような方法で調製された形質転
換宿主、当該官能性DNA配列が発現されるような適当な
条件下、そのような形質転換宿主を培養することからな
るそのような官能性DNA配列の発現方法およびそのよう
な発現を調節する条件下、そのような形質転換宿主を培
養することからなるそのような官能性DNA配列の発現を
調節する方法に関する。 また、本発明はストレプトマイセスgalオペロンP1プ
ロモーターまたはそのいずれかの調節可能な官能性誘導
体およびそのような領域に作動的に結合した異種官能性
DNA分子からなる組換型DNA分子、そのようなDNA分子お
よび、所望により、さらにレプリコンからなる組換型DN
Aベクター、そのようなベクターで形質転換された宿主
細胞の調製法、そのような方法で調製された形質転換宿
主、当該官能性DNA配列が発現されるような適当な条件
下、そのような形質転換宿主を培養することからなるそ
のような官能性DNA配列の発現方法およびそのような発
現を調節する条件下、そのような形質転換宿主を培養す
ることからなるそのような官能性DNA配列の発現調節方
法に関する。 また、本発明はストレプトマイセスgalオペロンP2プ
ロモーターまたはそのいずれかの官能性誘導体およびそ
のような領域に作動的に結合した異種官能性DNA分子か
らなる組換型DNA分子、そのようなDNA分子および、所望
により、さらにレプリコンからなる組換型DNAベクタ
ー、そのようなベクターで形質転換された宿主細胞の調
製法、そのような方法により調製された形質転換宿主お
よび当該官能性DNA配列が発現されるような適当な条件
下、そのような形質転換宿主を培養することからなるそ
のような官能性DNA配列の発現方法に関する。 また、本発明は、当該宿主を、ストレプトマイセスga
lオペロンまたはそのいずれかの部分あるいはそのいず
れかの官能性誘導体からなり、そのような宿主をガラク
トースを利用できるようにするに十分な組換型DNA分子
で形質転換することからなる非ガラクトース利用性宿主
微生物または細胞をガラクトースを利用できるようにす
る方法に関する。また、本発明はそのような方法におい
て用いる組換型ベクターおよびそのような方法で調製さ
れた宿主に関する。 図面の説明 第１図はストレプトマイセス・リビダンス（S.livida
ns）1326ガラクトース（gal）オペロンの制限エンドヌ
クレアーゼ地図、オペロン中の構造遺伝子およびプロモ
ーターの概略の位置を示す。 第２図はプラスミドpK21の制限エンドヌクレアーゼ地
図である。 第３図はストレプトマイセス・リビダンスgalオペロ
ンと、ストレプトマイセス・コエリカラーgalK遺伝子を
含有する制限フラグメントを比較する制限エンドヌクレ
アーゼ地図である。 発明の詳説 ストレプトマイセスのゲノムが、３つの構造遺伝子
（galT、galEおよびgalK）および２つのプロモーター
（P1およびP2）からなるガラクトース代謝用のオペロン
（すなわち、galオペロン）を含むことを見出した。gal
T遺伝子の生成物はガラクトース−１−ホスフェート・
ウリジルトランスフェラーゼ（トランスフェラーゼ）と
して知られ、galE遺伝子の生成物はウリジン・ジホスホ
ガラクトース−４−エピメラーゼ（エピメラーゼ）とし
て知られ、galK遺伝子の生成物はガラクトース−１−キ
ナーゼ（ガラクトキナーゼ）として知られている。スト
レプトマイセスのガラクトース代謝におけるgalT、galE
およびgalTの遺伝子生成物の機能はつぎの式で示され
る。 本明細書において用いられる「プロモーター」なる語
はRNAポリメラーゼの結合および転写を可能とする構造
遺伝子の上流のいずれかの領域を意味する。 「構造遺伝子」なる語はmRNAの合成のための鋳型とし
て働く、ペプチド用のコード付け配列を意味する。 「オペロン」なる語は１つの酵素系の構成員として機
能的に関連した１つまたは１群の酵素の合成に関与する
１群の密接に結合した遺伝子を意味する。オペロンはオ
ペレーター遺伝子、いくつかの構造遺伝子（系中の酵素
数に等しい）および調節遺伝子からなる。「オペレータ
ー」または「オペレーター遺伝子」なる語はオペロン内
の隣接する構造遺伝子の生合成を制御するDNA配列を意
味する。「調節遺伝子」なる語は、活性（酵素誘導）ま
たは不活性（酵素抑制）のいずれかにできるレプレッサ
ーの生成を通してオペロン内のオペレーター遺伝子を制
御する遺伝子を意味する。オペロンにおける構造遺伝子
の転写は、それ自体が以下の３径路の１つ以上で制御さ
れるオペレーター遺伝子によりスイッチが入ったり、切
れたりする。（１）誘導酵素系において、調節遺伝子に
より生成され、細胞内または細胞外のどこかから由来す
るある代謝産物またはシグナル物質（誘発物質）によ
り、該誘発物質の存在によりオペロンが活性になるよう
に不活性化できるレプレッサーによりオペロンがスイッ
チを切られる。または、（２）抑制酵素系において、調
節遺伝子によって生成された不活性レプレッサーと、い
ずれかからのコンプレッサーの組合せであり、コンプレ
ッサーの存在がオペロンを不活性にするようなレプレッ
サー−コンプレッサー複合体によりオペロンがスイッチ
を切られる。または、（３）活性遺伝子系において、あ
る代謝産物またはシグナル物質によって活性化できる調
節遺伝子によりプロモーターがスイッチを入れられる。 ストレプトマイセスgalオペロンはストレプトマイセ
スのゲノム中に天然に存在する。 「ストレプトマイセスgalオペロン」なる語はP1プロ
モーター、P2プロモーター、galT、galEおよびgalK構造
遺伝子およびそのような構造遺伝子の転写および翻訳に
必要な他のいずれかの調節領域からなるストレプトマイ
セスのゲノムの領域を意味する。 「調節領域」なる語はプロモーターまたはオペレータ
ーのようなDNA配列を意味し、構造遺伝子の転写を調節
する。 つぎのモデルはストレプトマイセスgalオペロン内の
遺伝子発現について示す。P1プロモーターはガラクトー
ス誘導プロモーターである（すなわち、ガラクトースの
存在外に誘導され、グルコースの存在下に抑制され
る）。S1データによれば、P2プロモーターは構成性であ
り、すなわち、ガラクトースまたはいずれかの他の炭素
源の存在または非存在にかかわりなく、スイッチが入っ
ている。 コスミッドpJW357（ストレプトマイセスおよびイー・
コリの両方において複製する能力をコード付けする）を
用いてストレプトマイセス・リビダンス1326DNAについ
てのコスミッド・ライブラリーを組み立てた。ついで、
このライブラリーを、バクテリオファージP1形質導入ガ
ラクトキナーゼ（galK）変異を含むイー・コリ株MM294
の誘導体であるイー・コリK21にトランスフェクション
した。トランスフェクションした細胞を、コスミッドの
存在および活性galK遺伝子の存在の両方用に選択した培
地条件下で平板培養した。弱い陽性コロニーを単離し、
これらのコロニーから由来するコスミッドDNAをK21株に
形質転換させる。これらの形質転換は、ガラクトースを
唯一の炭素源として一貫した陽性増殖を生じる２つのコ
スミッドを生じた。これらのgalK+コスミッドを、つい
で、本発明者らにより、２−デオキシ−ガラクトース選
択［ブラウナーら、ジーン（Brawner et al.,Gene）、4
0,191（1985）参照］を用い、ガラクトースを唯一の炭
素源とする培地上で増殖しないとして単離されたストレ
プトマイセス宿主（すなわち、ストレプトマイセス・リ
ビダンス1326−12K）に形質転換した。ガラクトキナー
ゼを産生できるか、できないかで株を区別する条件下、
コスミッドのただ１つがストレプトマイセス・リビダン
ス1326−12K宿主をgalK+とした。さらに研究した結果、
このコスミッドがガラクトキナーゼ活性を有する遺伝子
をコード付けすることが示された。DNA配列分析および
蛋白質研究を含むその後の研究はこのストレプトマイセ
ス遺伝子はイー・コリおよび酵母ガラクトキナーゼ遺伝
子と相同性を有することが示された。調節研究はガラク
トキナーゼ遺伝子をコード付けするコスミッドが染色体
コード遺伝子と同様な方法で調節することを示した。 ストレプトマイセス・リビダンスgalオペロンは当
初、ストレプトマイセス・リビダンス1326の約９キロベ
ース（Kb）域から単離された。該ストレプトマイセスga
lオペロンを含有するストレプトマイセス・リビダンス1
326の約9Kb域は実質的に表Ａのような地図位置で示され
る。「実質的」なる語は、（１）制限部位の相対位置が
概略であること、（２）他に有意な影響をオペロンに及
ぼさずに変異により１つ以上の制限部位が失なわれ、ま
たは得られうること、および（３）示した酵素、特に、
テストしなかった酵素に対する追加の部位が存在してい
てもよいことを意味する。本明細書で用いる制限酵素は
商業的に入手できる。全て、ロバーツ、ヌークレイック
・アシッズ・リサーチ（Nuc.Acids.Res.）,10（５）:p1
17（1982）に記載されている。 表 Ａ 地図位置 制限酵素 位置（Kb） 1 Hind III −.40 1a Nru I 0 2 Bgl II .75 3 EcoR I 1.05 4 Pvu II 1.15 5 Mlu I 2.30 6 Pvu II 2.80 7 EcoR I 4.00 8 Pvu II 4.10 8a Sac I 4.25 9 Pvu II 5.00 10 Xho I 5.50 11 BamH I 5.80 12 BamH I 6.50 13 Mlu I 6.90 13a Pvu II 7.20 14 Mlu I 7.80 15 BamH I 8.00 16 Sph I 8.30 第１図はストレプトマイセス・リビダンス1326galオ
ペロンの制限エンドヌクレアーゼ地図を示し、オペロン
内の構造遺伝子（galT、galEおよびgalK）およびプロモ
ーター（P1およびP2）の位置を示す。 表Ａおよび第１図から明らかなごとく、ストレプトマ
イセス・リビダンス1326galオペロンのプロモーターお
よび構造遺伝子の位置は実質的に表Ｂのとおりである。 表 Ｂ 位置（Kb） P1転写出発部位 .10 galT翻訳開始コドン .15 P2転写出発部位 1.25 galE翻訳開始コドン 1.50 galK翻訳開始コドン 2.40 galKの３′端メッセージ 3.60 ストレプトマイセス属の微生物は歴史的に製薬工業用
の抗生物質源として用いられてきた。その結果、そのよ
うな生成物産生用のビヒクルとしてストレプトマイセス
を用いる生物学的生成物の製造のスケール・アップに必
要な技術が現在利用できる。しかし、ストレプトマイセ
スが該新規組換型DNA技術を用いる生活性分子の生産用
のビヒクルとして使用できる前に、イー・コリで有用で
あることが示されたものと同様なストレプトマイセスに
おける調節エレメントを規定する必要がある。これらの
調節エレメントにはリボソーム結合部位および調節転写
エレメントが含まれる。 ストレプトマイセスにおけるgalE、galT、またはgalK
遺伝子または遺伝子生成物あるいはgalオペロンの存在
は従来報告されていない。本発明、すなわち、ストレプ
トマイセスgalオペロンのクローニングはストレプトマ
イセス、他のアクチノマイセス類および他の宿主生物に
おける調節可能な発現／クローニングベクターの組み立
てを可能にする。さらに、本発明はストレプトマイセス
galオペロンがポリシストロニックであるとの発明を導
いた。多分、ストレプトマイセスgalオペロンのクロー
ニングの最も重要な特徴は、ストレプトマイセスgalK遺
伝子の調節に必須な配列の存在の観察である。発現系と
してのイー・コリからのlacプロモーターの最初の使用
と直接相似させることができる。事実、ブロシウスら、
プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・
オブ・サイエンス・ユー・エス・エイ（Brosius et a
l.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.）81,6929〜6933（198
4）はイー・コリlacプロモーターの調節エレメントを利
用して極端に強いイー・コリ・リボソーム・プロモータ
ーを調節している。ストレプトマイセスgalオペロン・
リボソーム・プロモーターも極端に強いようなので、そ
のようなプロモーターはストレプトマイセス、他のアク
チノマイセス類および他の宿主生物において非常に有用
な調節可能な発現ベクターの組み立を可能にする。本発
明はまた、イー・コリにおいてgalK変異株の選択に用い
られていた２−デオキシガラクトース選択がストレプト
マイセスにおけるgalK変異株の選択にも作動するという
予期せぬ発見を可能にした［ブラウナーら、ジーン［Br
awner et al.,Gene）40,191（1985）参照］。この観察
は、以下に記載するごとく、ストレプトマイセスgalK遺
伝子およびそのコスミッド上への転写、翻訳に必要な調
節領域のクローン能力と組み合わさって、相同組換によ
り、ストレプトマイセスの染色体に位置したgalK遺伝子
への構造遺伝子の直接挿入を可能にする。この操作は分
子生物学者が興味のあるDNAフラグメントをストレプト
マイセスの染色体に安定して挿入することを可能にす
る。このアプローチは研究者が、現在、大部分のストレ
プトマイセス発現ベクターにより要求されているような
抗生物質選択を続ける必要なしに、興味あるストレプト
マイセス株にタッグ付けもしくはマーク付けをしたり、
該生物に発現カセットを挿入することを可能にする。 本発明はストレプトマイセスgalオペロンまたはその
いずれかの調節可能な官能性誘導体からなる組換型DNA
分子に関する。 「調節可能な官能性誘導体」なる語はgalT、galEおよ
びgalK遺伝子生成物の調節可能な生成について天然のス
トレプトマイセスgalオペロンと実質的に同じに機能す
るストレプトマイセスgalオペロンのいずれかの誘導体
を意味する。このような誘導体にはgalオペロンの部分
的配列およびgalオペロン・コード付け配列の修飾によ
って生成された誘導体が包含される。公知のgalオペロ
ン修飾技術には、例えば、化学的変異誘発剤での処理、
照射または、酵素または組換技術を用いる挿入、欠失ま
たは核酸置換のような直接遺伝子操作が包含される。天
然に生じるストレプトマイセスgalオペロンは本明細書
に記載する技術を用いていずれかのガラクトース利用ス
トレプトマイセス株から単離できる。種々のストレプト
マイセス種の多くの株が多くの源から公に入手可能であ
る。例えば、米国、メリーランド州、ロックビルのアメ
リカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ATCC）は
公衆が入手可能な約400種のストレプトマイセスを有し
ている。ストレプトマイセスの個々の株のグルコースを
利用する能力は、その株を、ガラクトースを唯一の炭素
源として含有する培地上で増殖させるような通常の技術
によって容易に測定できる。galオペロンを単離するの
に好ましいストレプトマイセス種には、ストレプトマイ
セス・リビダンス、ストレプトマイセス・コエリカラ
ー、ストレプトマイセス・アズラエウス（S.azuraeu
s）、ストレプトマイセス・アルブス（S.albus）、スト
レプトマイセス・カルチノスタティクス（S.carzinosta
ticus）、ストレプトマイセス・アンチフェブリノリチ
クス（S.antifibrinolyticus）およびストレプトマイセ
ス・ロンギスポルス（S.longisporus）が包含される。
ストレプトマイセス・リビダンスが最も好ましい。スト
レプトマイセスgalオペロンおよびそのより小さい部分
は他の細胞および生物から相同な配列を得るための核酸
プローブとして有用である。ストレプトマイセスgalオ
ペロンはまた、適当な宿主変異株における選択マーカー
として、また、調節エレメントの提供に有用である。
「適当な宿主変異株」なる語は、（ａ）galオペロンを
含まないか、（ｂ）非官能性galオペロンを含有する
か、（ｃ）欠損P1プロモーター、P2プロモーター、galT
遺伝子、galK遺伝子および／またはgalE遺伝子のよう
な、ストレプトマイセスgalからなる相同構造遺伝子ま
たは調節領域内に欠損を含むためにガラクトースを利用
しない宿主を意味する。かくして、通常の技術で調製で
きる組換型DNA分子（ストレプトマイセスgalオペロンお
よびそれに作動的に結合した異種官能性DNA配列からな
る）は、相同組換によって宿主ゲノムに取り込むための
通常の技術によって適当な宿主へ形質転換でき、高価な
抗生物質選択を続ける必要なしに該異種官能性DNA配列
の調節可能な発現を可能にする。したがって、そのよう
なオペロンはまた、高価な抗生物質選択を続ける必要な
く、当該ベクターで形質転換した適当な宿主変異株にお
いて該オペロンに作動的に結合する異種官能性DNA配列
の調節可能な発現用の組換型DNA発現ベクター上に取り
込まれうる。そのようなオペロンはまた、ガラクトース
を利用しないストレプトマイセス、他のアクチノマイセ
スおよびgal-イー・コリ株のような他の原核生物のよう
な細胞、ウイルスおよび微生物をガラクトース利用性株
に形質転換するのに有用である。この形質転換は形質転
換宿主に対して多面的効果を有しうる。「官能性DNA配
列」なる語はそれによって形質転換された宿主生物にお
いて遺伝子発現単位、構造遺伝子、プロモーターまたは
調節領域として機能するストレプトマイセスまたは他の
いずれかの源から直接または間接に誘導されるDNAのい
ずれかの分離領域を意味する。好ましい官能性DNA配列
には、限定するものではないが、インシュリン、生長ホ
ルモン、組織プラスミノーゲン・アクチベータ、α−１
−抗トリプシンまたはワクチン製造に用いる抗原のよう
な医薬上重要なポリペプチドをコード付けするものが包
含される。「異種官能性DNA配列」なる語はストレプト
マイセスgalオペロン・コード付け領域から誘導されな
い官能性DNA配列を意味する。 本発明はまた、ストレプトマイセスgalオペロンP2プ
ロモーター発現単位またはそのいずれかの官能性誘導体
からなる組換型DNA分子に関する。「P2プロモーター発
現単位」なる語はストレプトマイセスgalオペロンP2プ
ロモーター、galEおよびgalK構造遺伝子およびそのよう
な構造遺伝子の転写および翻訳に必要な他のいずれかの
調節領域からなるストレプトマイセスgalオペロンの領
域を意味する。「官能性誘導体」なる語は、ストレプト
マイセスgalオペロンgalEおよびgalK遺伝子生成物の生
成について天然に生じる領域と実質的に同じに機能する
ストレプトマイセスgalオペロンP2プロモーター発現単
位のいずれかの誘導体を意味する。このような誘導体に
はストレプトマイセスgalオペロンP2プロモーター発現
単位の部分配列およびストレプトマイセスgalオペロンP
2プロモーター発現単位・コード付け配列の修飾によっ
て得られる誘導体が包含される。そのような修飾を行な
う技術は公知であり、いくつかは前記した。天然に生じ
るストレプトマイセスgalオペロンP2プロモーター発現
単位は通常の技術により天然のストレプトマイセスgal
オペロンから単離できる。ストレプトマイセスgalオペ
ロンP2発現単位は適当な宿主変異株における選択マーカ
ーとして、また、調節エレメントの提供に有用である。
「適当な宿主変異株」なる語は、欠損P2プロモーター、
galE遺伝子および／またはgalK遺伝子のような、ストレ
プトマイセスP2プロモーター発現単位からなる相同構造
遺伝子または調節領域内に欠失を含むためガラクトース
を利用できない宿主を意味する。かくして、通常の技術
で調整できる組換型DNA分子（ストレプトマイセスgalオ
ペロンP2プロモーター発現単位およびそれに作動的に結
合した異質官能性DNA配列からなる）は相同組換による
宿主ゲノムへの取り組み用の通常の技術により適当な宿
主変異株へ形質転換でき、高価な抗生物質選択を続ける
ことなく、該異種官能性DNA配列の構成的発現を可能に
する。そのような発現単位は異種官能性DNA配列の構成
的発現用の組換型DNA発現ベクター上に取り込まれう
る。ストレプトマイセスgalオペロンP2プロモーター発
現単位はまた、適当な宿主変異株の相補に有用であり、
ついで、高価な抗生物質選択を続ける必要のない、当該
ベクターで形質転換された適当な宿主変異株においてそ
のような発現単位に作動的に結合した異種官能性DNA配
列の構成的発現に使用される。 本発明はストレプトマイセスgalオペロンP1プロモー
ター調節領域またはそのいずれかの調節可能な官能性誘
導体からなる組換型DNA分子にも関する。「P1プロモー
ター調節領域」なる語はストレプトマイセスgalオペロ
ンP1プロモーター、galT、galEおよびgalK構造遺伝子な
らびにそのような構造遺伝子の転写および翻訳に必要な
他のいずれかの調節領域からなるストレプトマイセスga
lオペロンの領域を意味する。「調節可能な官能的誘導
体」なる語は、ストレプトマイセスgalオペロンgalT、g
alE、およびgalK遺伝子生成物の調節可能な生成に関
し、天然に生じる領域と実質的に同じに機能するストレ
プトマイセスgalオペロンP1プロモーター調節領域のい
ずれかの誘導体を意味する。このような誘導体にはスト
レプトマイセスgalオペロンP1プロモーター調節領域の
部分配列およびストレプトマイセスgalオペロンP1プロ
モーター調節領域コード付け配列の修飾により生成され
る誘導体が包含される。そのような修飾を行なう技術は
公知であり、いくつかは前記した、天然に生じるストレ
プトマイセスgalオペロンP1プロモーター調節領域は、
天然に生じるストレプトマイセスgalオペロンからのP2
プロモーターの切除、点突然変異によるP2プロモーター
の不活化またはプロモーター内への異種DNA配列の挿入
のような通常の技術により、天然に生じるストレプトマ
イセスgalオペロンから単離できる。ストレプトマイセ
スgalオペロンP1プロモーター調節領域はストレプトマ
イセスgalオペロンについて前記した用途に有用であ
る。 また、本発明はストレプトマイセスgalオペロンP2プ
ロモーターまたはそのいずれかの官能性誘導体からなる
組換型DNA分子に関する。「官能性誘導体」なる語は、R
NAポリメラーゼの結合および当該プロモーターに作動的
に結合した官能性DNA配列の転写を可能するについて天
然に生じるP2プロモーターと実質的に同じに機能するス
トレプトマイセスgalオペロンP2プロモーターのいずれ
かの誘導体を意味する。このような誘導体にはストレプ
トマイセスgalオペロンP2プロモーターの部分配列およ
びgalオペロンP2プロモーター・コード付け配列の修飾
によって生じた誘導体が包含される。そのような修飾を
行なう技術は公知であり、いくつかは前記した。天然に
生じるストレプトマイセスgalオペロンP2プロモーター
は通常の技術により、天然に生じたストレプトマイセス
galオペロンから単離できる。通常の技術で調製できる
組換型DNA分子（ストレプトマイセスgalオペロンP2プロ
モーターおよびそれに作動的に結合した異種官能性DNA
配列からなる）は相同組換によって宿主ゲノムへ取り込
むための通常の技術によって適当な宿主へ形質転換で
き、異種官能性DNA配列の構成的発現を可能にする。ス
トレプトマイセスgalオペロンP2プロモーターはまた、
当該ベクターで形質転換したウイルスおよび有核または
原核細胞または生物、特にストレプトマイセスまたは他
のアクチノマイセス類において作動的に結合した異種官
能性DNA配列の構成的発現用の組換型DNA発現ベクターへ
の取り込みに有用である。 本発明はまた、ストレプトマイセスgalオペロンP1プ
ロモーターまたはそのいずれかの調節可能な官能性誘導
体からなる組換型DNA分子からなる。「調節可能な官能
性誘導体」なる語は、RNAポリメラーゼの結合を可能に
し、そのようなプロモーターに作動的に結合した官能性
DNA配列の転写を調節するについて天然に生じるP1プロ
モーターと実質的に同じに機能するストレプトマイセス
galオペロンP1プロモーターのいずれかの誘導体を意味
する。このような誘導体にはストレプトマイセスgalオ
ペロンP1プロモーターの部分配列と、galオペロンP1プ
ロモーター・コード付け配列の修飾により生成する誘導
体が包含される。このような修飾を行なう技術は公知で
あり、いくつかは前記した。天然に生じるストレプトマ
イセスgalオペロンP1プロモーターは通常の技術により
天然に生じるストレプトマイセスgalオペロンから単離
できる。通常の技術で調製できる組換型DNA分子（スト
レプトマイセスgalオペロンP1プロモーターおよびそれ
に作動的に結合した異種官能性DNA配列からなる）は、
相同組換による宿主ゲノムに取り込む通常の技術によっ
て適当な宿主変異株へ形質転換でき、異種官能性DNA配
列の調節可能な発現を可能にする。また、ストレプトマ
イセスgalオペロンP1プロモーターは、当該ベクターで
形質転換されたウイルスおよび有核または原核細胞また
は生物、特に、ストレプトマイセスまたは他のアクチノ
マイセス類において作動的に結合した異種官能性DNA配
列の調節可能な発現用組換型DNA発現ベクターへの取り
込みにも有用である。 また、本発明はストレプトマイセスgalオペロンgal
E、galTまたはgalE遺伝子またはそのいずれかの官能性
誘導体からなる組換型DNA分子にも関する。「官能性誘
導体」なる語は活性galE、galTまたはgalK型還元子生成
物の生成について天然に生じる遺伝子と実質的に同じに
機能するストレプトマイセスgalオペロンgalE、galTま
たはgalK遺伝子のいずれかの誘導体を意味する。このよ
うな誘導体にはストレプトマイセスgalオペロンgalE、g
alTまたはgalK遺伝子の部分配列およびgalオペロン配列
の修飾によって得られる誘導体が包含される。このよう
な修飾を行なう技術は公知であり、いくつかは前記し
た。天然に生じるストレプトマイセスgalオペロンgal
E、galTおよび／またはgalK遺伝子は通常の技術により
天然に生じるストレプトマイセスgalオペロンから単離
できる。ストレプトマイセスgalオペロンgalE、galTお
よび／またはgalK遺伝子は適当な宿主変異株における選
択マーカーとして使用できる。「適当な宿主変異株」な
る語は相同galE、galTおよび／またはgalK遺伝子内に欠
失を含むため、ガラクトースを利用できない宿主を意味
する。かくして、通常の技術で調製できる組換型DNA分
子（共に適当な調節領域に作動的に結合したストレプト
マイセスgalオペロンgalE、galTおよび／またはgalK遺
伝子および異種官能性DNA配列からなる）は相同組換に
よって宿主ゲノムへ取り込むための通常の技術によって
適当な宿主変異株へ形質転換でき、高価な抗生物質選択
を続ける必要なしに形質転換体の検出を可能にする。同
様に、共に適当な調節領域に作動的に結合したストレプ
トマイセスgalオペロンgalE、galTおよび／またはgalK
および異種官能性DNA配列ならびにレプリコンからなる
組換型DNAベクターは通常の技術で適当な宿主変異株に
形質転換でき、高価な抗生物質選択を続ける必要なしに
形質転換体の検出を可能にする。ストレプトマイセスga
lオペロンgalE、galKおよび／またはgalT遺伝子はまた
適当な宿主変異株の相補に有用である。 また、ストレプトマイセスgalオペロンgalE遺伝子は
異種DNA配列に融合できるリボソーム結合部位と開始コ
ドンを提供するのに有用であり、適当な発現ベクターに
取り込まれ、適当な宿主に形質転換された場合に、その
ようなコード付け配列を可能とする。そのような異種官
能性DNA配列が、ストレプトマイセスgalオペロンP2プロ
モーター発現単位からなる組換型DNA発現ベクターまた
は全galオペロン中のgalE遺伝子リボソーム結合部位お
よび開始コドンと融合すると、そのようなDNA配列は、
ベクターが適当な宿主生物に形質転換される場合、構成
的に発現される。そのようなDNA配列が、ストレプトマ
イセスgalオペロンP2プロモーター調節領域からなる組
換型DNA発現ベクター中のgalE遺伝子リボソーム結合部
位および開始コドンに融合すると、そのようなベクター
が適当な宿主生物に形質転換される場合、ガラクトース
またはグルコースの存在、非存在を制御することによ
り、そのようなDNA配列の発現を調節できる。 ストレプトマイセスgalオペロンgalT遺伝子はまた、
異種官能性DNA配列に融合できるリボソーム結合部位お
よび開始コドンを提供するのに有用で、適当な発現ベク
ターに取り込まれ、適当な宿主に形質転換されると、そ
のようなコード付け配列の発現を可能にする。そのよう
なDNA配列が、ストレプトマイセスgalオペロンP1プロモ
ーター調節領域からなる組換型DNA発現ベクターまたは
全galオペロン中でgalT遺伝子リボソーム結合部位およ
び開始コドンに融合すると、前記のように、そのような
ベクターで形質転換された宿主におけるそのようなコー
ド付け配列の発現を調節できる。 また、本発明は、レプリコン、ストレプトマイセスga
lオペロンまたその官能性の、調節可能な誘導体および
そのようなオペロンに作動的に結合した異種官能性DNA
配列からなる組換型DNAベクターに関する。そのような
ベクターは通常の技術で調製できる。用いるレプリコン
は当該ベクターにより形質転換されるベクターとなるべ
き宿主生物中にベクターを安定に、染色体外的に維持す
る能力を有することが公知のものとすべきである。 本発明はまた、組換型DNAベクターからなる形質転換
宿主微生物に関し、該ベクターはレプリコン、ストレプ
トマイセスgalオペロンまたはその官能性、調節可能な
誘導体および該オペロンに作動的に結合した異種官能性
DNA配列を含有する。また、本発明は適当な宿主微生物
をそのようなベクターで形質転換することからなるその
ような宿主の調製法に関する。本発明はこの方法に用い
ることのできる適当な宿主にはウイルスおよび有核およ
び原核細胞または生物、特に、ストレプトマイセス属の
ようなアクチノマイセス類が包含される。最も好ましい
宿主微生物はストレプトマイセス属に属する。ストレプ
トマイセスの好ましい種には、ストレプトマイセス・リ
ビダンス、ストレプトマイセス・コエリカラー、ストレ
プトマイセス・アズラエウスおよびストレプトマイセス
・アルブスが包含される。そのような宿主微生物のその
ようなベクターによる形質転換はチャーターから、カレ
ント・トピックス・イン・マイクロバイオロジー・アン
ド・イムノロジー（Chater et al.,Curr.Top.Micro.Im
m.）96,69〜95（1982）の方法のような通常の技術を用
いて行なうことができる。本発明はまた、官能性DNA配
列が発現される適当な条件下、本発明の形質転換宿主を
培養することからなる本発明の形質転換宿主に含有され
る官能性DNA配列の発現方法に関する。「適当な条件」
なる語は宿主の増殖を可能にし、官能性DNA配列の発現
を可能にする条件を意味する。この適当な条件は当業者
が通常の技術を用いて決定でき、用いる宿主生物および
発現させるべき官能性DNA配列のような種々の因子に依
存する。本発明はまた、発現を調節するに適当な条件
下、官能性DNA配列を含有する形質転換宿主を培養する
ことからなる該形質転換宿主に含有される官能性DNA配
列の発現を調節する方法に関する。「適当な条件」なる
語は、ストレプトマイセスgalオペロン（および異種官
能性DNA配列）を調節することの可能な条件を意味す
る。「調節可能」なる語は形質転換宿主細胞の増殖培地
におけるガラクトースまたはその代謝産物の存在および
グルコースまたはその代謝産物の存在に対する応答性で
あることを意味する。このような調節は形質転換宿主の
培地へのガラクトースまたはグルコースの添加または削
除により行なうことができる。本発明の形質転換宿主に
よる異種官能性DNAコード付け配列の発現の上昇または
下降調節についてのガラクトースおよび／またはグルコ
ースの至適レベルは通常の技術を用い、当業者が容易に
決定できる。 また、本発明はレプリコン、ストレプトマイセスgal
オペロンP2プロモーター発現単位またはその官能性誘導
体およびそのような単位に作動的に結合した異種官能性
DNA配列からなる組換DNAベクターに関する。そのような
ベクターは通常の技術で調製できる。用いるレプリコン
は該ベクターで形質転換すべき宿主生物において、安定
に、染色体外的にベクターを維持する能力の知られてい
るものとすべきである。 また、本発明は、レプリコン、ストレプトマイセスga
lオペロンP2プロモーター発現単位またはその官能性誘
導体および該単位に作動的に結合した異種官能性DNA配
列を含有する組換型DNAベクターからなる形質転換宿主
微生物ならびに、そのようなベクターで適当な宿主微生
物を形質転換することからなるそのような宿主の調製法
に関する。「作動的に結合した」なる語は官能性DNA配
列が、その発現が発現制御配列の制御下にあるように発
現制御配列（すなわち、ストレプトマイセスgalオペロ
ン、P2プロモーター発現単位、P1プロモーター調節領
域、P1プロモーターまたはP2プロモーター）に転写的に
または翻訳的に結合することを意味する。すなわち、例
えば、異種官能性DNA配列は、当該オペロンをストレプ
トマイセスgalオペロンP1またはP2プロモーター転写体
に挿入することにより、転写的にまたは翻訳的にストレ
プトマイセスgalオペロンに結合できる。「レプリコ
ン」なる語は、それによって形質転換された宿主微生物
または細胞にプラスミドを染色体外的に維持する機能を
有するプラスミド上のDNAの領域を意味する。また、ス
トレプトマイセスgalオペロンおよびそのより小さい部
分が他の細胞および生物から相同配列を得る核酸プロー
ブとして有用なことが判明した。本発明の方法で用いる
ことのできる適当な宿主微生物には、いずれものウイル
スまたは有核もしくは原核細胞もしくは微生物、特に、
ストレプトマイセス属のもののような、いずれかのアク
チノマイセス属が包含される。最も好ましい宿主微生物
はストレプトマイセス属のものである。ストレプトマイ
セス属の好ましい種にはストレプトマイセス・リビダン
ス、ストレプトマイセス・コエリカラー、ストレプトマ
イセス・アゼラエウスおよびストレプトマイセス・アル
ブスが包含される。ベクターによるこのような宿主微生
物の形質転換は前記チャーターらの方法のような通常の
技術を用いて行なうことができる。本発明はまた、官能
性DNA配列が発現されるような適当な条件下、形質転換
宿主を培養することからなる本発明の形質転換宿主によ
り含有される官能性DNA配列の発現方法に関する。「適
当な条件」なる語は宿主の増殖を可能にし、官能性DNA
配列の発現を可能にする条件を意味する。この適当な条
件は当業者が通常の技術を用いて決定でき、用いる宿主
生物および発現させるべき官能性DNA配列のような種々
の因子に依存する。 また、本発明はレプリコン、ストレプトマイセスgal
オペロンP1プロモーター調節領域またはその官能性、調
節可能な誘導体およびそのような領域に作動的に結合し
た異種官能性DNA配列からなる組換DNAベクターに関す
る。そのようなベクターは通常の技術で調製できる。用
いるレプリコンは該ベクターで形質転換すべき宿主生物
において、安定に、染色体外的にベクターを維持する能
力の知られているものとすべきである。 また、本発明は、レプリコン、ストレプトマイセスga
lオペロンP1プロモーター調節領域またはその官能性、
調節可能な誘導体および該領域に作動的に結合した異種
官能性DNA配列を含有する組換型DNAベクターからなる形
質転換宿主微生物ならびに、そのようなベクターで適当
な宿主微生物を形質転換することからなるそのような宿
主の調製法に関する。用いることのできる適当な宿主微
生物には、いずれものウイルスまたは有核もしくは原核
細胞もしくは微生物、特に、ストレプトマイセス属のも
ののような、いずれかのアクチノマイセス属が包含され
る。最も好ましい宿主微生物はストレプトマイセス属の
ものである。ストレプトマイセス属の好ましい種にはス
トレプトマイセス・リビダンス、ストレプトマイセス・
コエリカラー、ストレプトマイセス・アゼラエウスおよ
びストレプトマイセス・アルブスが包含される。ベクタ
ーによるこのような宿主微生物の形質転換は前記チャー
ターらの方法のような通常の技術を用いて行なうことが
できる。本発明はまた、官能性DNA配列が発現されるよ
うな適当な条件下、形質転換宿主を培養することからな
る本発明の形質転換宿主により含有される異種官能性DN
A配列の発現方法に関する。「適当な条件」なる語は宿
主の増殖を可能にし、官能性DNA配列の発現を可能にす
る条件を意味する。この適当な条件は当業者が通常の技
術を用いて決定でき、用いる宿主生物および発現させる
べき官能性DNA配列のような種々の因子に依存する。本
発明はまた、発現を調節するに適当な条件下、官能性DN
A配列を含有する形質転換宿主を培養することからなる
該形質転換宿主に含有される官能性DNA配列の発現を調
節する方法に関する。「適当な条件」なる語はストレプ
トマイセスgalオペロンP1プロモーター調節領域（およ
び異種官能性DNA配列）を調節可能にする条件でを意味
する。「調節可能」なる語は形質転換宿主細胞の増殖培
地中のガラクトースまたはその代謝産物の存在または非
存在およびグルコースまたはその代謝産物の存在または
非存在に応答性であることを意味する。そのような調節
は形質転換宿主の培地へのガラクトースまたはグルコー
スの添加または削除により行なうことができる。 また、本発明はレプリコン、ストレプトマイセスgal
オペロンP2プロモーターまたはその官能性誘導体および
そのようなプロモーターに作動的に結合した異種官能性
DNA配列からなる組換DNAベクターに関する。そのような
ベクターは通常の技術で調製できる。用いるレプリコン
は該ベクターで形質転換すべき宿主生物において、安定
に、染色体外的にベクターを維持する能力の知られてい
るものとすべきである。 また、本発明は、レプリコン、ストレプトマイセスga
lオペロンP2プロモーターまたはその官能性誘導体およ
び該領域に作動的に結合した異種官能性DNA配列を含有
する組換型DNAベクターからなる形質転換宿主微生物な
らびに、そのようなベクターで適当な宿主微生物を形質
転換することからなるそのような宿主の調製法に関す
る。用いることのできる適当な宿主微生物には、ストレ
プトマイセス属のもののような、いずれかのアクチノマ
イセス属が包含される。最も好ましい宿主微生物はスト
レプトマイセス属のものである。ストレプトマイセス属
の好ましい種にはストレプトマイセス・リビダンス、ス
トレプトマイセス・コエリカラー、ストレプトマイセス
・アゼラエウスおよびストレプトマイセス・アルブスが
包含される。ベクターによるこのような宿主微生物の形
質転換は前記チャーターらの方法のような通常の技術を
用いて行なうことができる。本発明はまた、官能性DNA
配列が発現されるような適当な条件下、形質転換宿主を
培養することからなる該形質転換宿主に含有される異種
官能性DNA配列の発現方法に関する。「適当な条件」な
る語は宿主の増殖を可能にし、官能性DNA配列の発現を
可能にする条件を意味する。この適当な条件は当業者が
通常の技術を用いて決定でき、用いる宿主生物および発
現させるべき官能性DNA配列のような種々の因子に依存
する。 また、本発明はレプリコン、ストレプトマイセスgal
オペロンP1プロモーターまたはそのいずれかの官能性、
調節可能な誘導体およびそのような領域に作動的に結合
した異種官能性DNA配列からなる組換DNAベクターに関す
る。そのようなベクターは通常の技術で調製できる。用
いるレプリコンは該ベクターで形質転換すべき宿主生物
において、安定に、染色体外的にベクターを維持する能
力の知られているものとすべきである。 また、本発明は、レプリコン、ストレプトマイセスga
lオペロンP1プロモーターまたはそのいずれかの官能
性、調節可能な誘導体および該領域に作動的に結合した
異種官能性DNA配列を含有する組換型DNAベクターからな
る形質転換宿主微生物ならびに、そのようなベクターで
適当な宿主微生物を形質転換することからなるそのよう
な宿主の調製法に関する。用いることのできる適当な宿
主微生物には、ウイルスまたは有核もしくは原核細胞も
しくは微生物、特に、ストレプトマイセス属のもののよ
うな、いずれかのアクチノマイセス属が包含される。最
も好ましい宿主微生物はストレプトマイセス属のもので
ある。ストレプトマイセス属の好ましい種にはストレプ
トマイセス・リビダンス、ストレプトマイセス・コエリ
カラー、ストレプトマイセス・アゼラエウスおよびスト
レプトマイセス・アルブスが包含される。ベクターによ
るこのような宿主微生物の形質転換は前記チャーターら
の方法のような通常の技術を用いて行なうことができ
る。本発明はまた、官能性DNA配列が発現されるような
適当な条件下、形質転換宿主を培養することからなる本
発明の形質転換宿主により含有される異種官能性DNA配
列の発現方法に関する。「適当な条件」なる語は宿主の
増殖を可能にし、官能性DNA配列の発現を可能にする条
件を意味する。そのような適当な条件は当業者が通常の
技術を用いて決定でき、用いる宿主生物および発現させ
るべき異種官能性DNA配列のような種々の因子に依存す
る。本発明はまた、発現が調節可能な適当な条件下、異
種官能性DNA配列を含む形質転換宿主を培養することか
らなる該形質転換宿主に含まれる官能性DNA配列の発現
を調節する方法に関する。「適当な条件」なる語は該ga
lオペロンP1プロモーター（および官能性DNA配列）を調
節可能にする条件を意味する。「調節可能」なる語は、
形質転換宿主細胞の増殖培地中のガラクトースまたはそ
の代謝物の存在または非存在およびグルコースまたはそ
の代謝物の存在に応答性であることを意味する。そのよ
うな調節は形質転換宿主の培地へのガラクトースまたは
グルコースの添加または削除によって行なうことができ
る。 実施例 つぎに実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説明する
が、これに限定されるものではない。 以下の実施例に示すような、通常の技術を用いること
により、当業者はストレプトマイセスのいずれかのガラ
クトース利用性株からgalオペロンを単離できる。さら
に、本明細書においてストレプトマイセスgalオペロン
の単離に用いたと同様な技術を利用することにより、当
業者は該ストレプトマイセスgalオペロンをストレプト
マイセスの他のガラクトース利用性株、特に、ストレプ
トマイセス・コエリカラー、ストレプトマイセス・アズ
ラエウス、ストレプトマイセス・アルブスおよび他のス
トレプトマイセス・リビダンス株からのgalオペロンの
単離に用いることができる。 以下の実施例で用いる分子遺伝子操作および他の技術
は、英国、ノールウィッチ、ジョン・インズ・ファウン
デーションのホップウッドら、ジェネティック・マニュ
ピレーション・オブ・ストレプトマイセス：ア・ラボラ
トリー・マニュアル（Hopwood et al.,Genetic Manipul
ation of Streptomyces:A Laborotory Manual）に記載
されている。 略号 以下の実施例中、つぎの略号を使用する。 LB:10gトリプトン、5g酵母エキス、5gNaCl MBSM（修飾MBSM）：ブラウナーら、ジーン（Brawner
et al.,Gene）40,191（1985）参照 MOPS:（３）−Ｎ−モルホリノ−（プロパン−スルホ
ン酸） YEME＋MgCl2＋グリシン：（当り）3g酵母エキス、5
gペプトン、3g麦芽エキス、10gグルコース、10gMgCl2・
6H2O、340gショ糖 Sl:（NH4）2SO4（1g/）、Ｌ−アスパラギン（2g/
）、K2HPO4（9g/）、NaH2PO4（1g/）を0.2％寒天
に対して一緒に混合し、オートクレーブする。ついで、
酵母エキス（20g/）、MgCl2（5g/）、CuCl2（0.1g/
）、微量元素［20ml/−ZnCl2（40mg/）、FeCl3・
6H2O（200mg/）、CuCl2・2H2O（10mg/）、NaB4O7・
10H2O（10mg/）、（NH4）6Mo7O24・4H2O（10mg/）
含有］と混合、濾過、滅菌 YEME（Ymベース）：（当り）酵母エキス（3g）、ペ
プトン（5g）、麦芽エキス（3g）、MgCl2・6H2O（2g） Ym glu:YEME＋グルコース（10g） Ym gal:YEME＋ガラクトース（10g） 細菌株 以下の実施例中、イー・コリのつぎの株を用いる。 CGSC株名称 性 染色体マーカー 株＃(a) 4473（galE-）W3109 F- galE9(b)g-;IN（rrnD−rrn
E）１ 4467（galT-）W3101 F- galT22(b)g-;IN（rrnD−rrn
E）１ 4498（galE-）PL−２ Hfr thi−l,relA1,921E28,g-,sp
oT1 （ａ）CGSC株＃は、米国コネチカット州、ニュー・ヘブ
ン、ピー・オー・ボックス3333、チェダー・ストリート
333（333Ceder Street,P.O.Box3333,New Haven,Connect
icut,06510,U.S.A.）のエール・ユニバーシティ・スク
ール・オブ・メディシン、イー・コリ・ジェネティック
・ストック・センター・オブ・ザ・デパートメント・オ
ブ・ヒューマン・ジェネティックス（E.coli Genetic S
tock Center of the Department of Human Genetics,Ya
le University School of Medicine）により該株に付さ
れた在庫番号である。 （ｂ）galE9は旧レダーベルグ（Lederberg）gal9、galT
22は旧レダーベルグgal1である。 S1分析 RNAの５′端および興味あるRNAの長さを同定するため
にS1分析を用いる。以下の実施例において、S1分析はウ
ェーバーら、ヌークレイック・アシッズ・リサーチ（We
aver et al.,Nucl.Asids Res.）7,1175（1979）および
バークら、プロシーディングス・オブ・ナショナル・ア
カデミー・オブ・サイエンス・ユー・エス・エイ（Berk
et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA）75,1214（1978）の
方法に従って行なったS1実験を示す。 実施例１ A.ストレプトマイセス・リビダンス・ガラクトキナーゼ
遺伝子 ストレプトマイセス・リビダンス株1326はビッブら、
モレキュラー・アンド・ジェネラル・ジェネティックス
（Bibb et al.,Mol.Gen.Genetics）184,230〜240（198
1）によって記載されており、英国、ノーウィッチ、ジ
ョン・インズ・ファンデーションのディ・エイ・ホップ
ウッド（D.A.Hopwood,John Innes Foundation,Norwich
Eugland）より得た。ストレプトマイセス・リビダンス
株1326およびpIJ6プラスミドを含有するストレプトマイ
セス・リビダンス株1326は、1982年６月１日に、米国イ
リノイ州、ペオリアのアグリカルチュラル・リサーチ・
カルチャー・コレクションに、各々、寄託番号NRRL1509
1および15092で寄託した。 高分子量染色体DNAはマニアチスら（Maniatis et a
l）、「モレキユラー・クローニング・ア・ラボラトリ
ー・マニュアル」、コールド・スプリング・ハーバー・
ラボラトリー（1982）の方法に従って、ストレプトマイ
セス・リビダンス株1326から単離し、10〜40％ショ糖グ
ラジエント上でサイズ分別した（前記アニアチスら、28
4〜285頁）。18〜24Kb対のフラクションを合し、10mMト
リス−HCl/1mMEDTA（pH8）に対して充分に透析した。コ
スミッド・シャトル・ベクターpJW357を用いて分別した
染色体DNAを全体としてクローンした。pJW357はPst Iで
切断したpDPT6をPst 1で切断したpIJ350に融合して作製
した。pIJ350はキーゼルら、モレキュラー・アンド・ジ
ェネラル・ジェネティックス（Kieser et al.,Mol.Gen.
Genet.）185,223〜238（1982）に記載されている。pDPT
6はテイラーら（Taylor et al.）の米国特許第4476227
号に記載されているテトラサイクリンおよびクロラムフ
ェニコール耐性、pBR322ベース・イーコリ・コスミッド
・クローニング・ベクターである。pJW357は該クロラム
フェニコール耐性遺伝子中に独特なEcoR I部位およびテ
トラサイクリン耐性遺伝子に独特なBamH I部位を有す
る。pJW357をBamH Iで消化し、アルカリ性ホスファター
ゼで脱ホスホリレート化し、前記の分別した染色体DNA
に連結した。 連結生成物をバクテリオファージ頭部につつみ込み
（前記マニアチスら、264〜265頁に記載されたin vitro
パッケージング系を用い）、イー・コリMM294のgalK-誘
導体であるイー・コリ株K21にトランスフェクションし
た。この形質転換培養をLB中で２時間、25μg/mlクロラ
ムフェニコール添加LB中でさらに２時間増殖させ、等容
量の炭素源のないM9培地［ミラー、「エクスペリメンツ
・イン・モレキュラー・ジェネティックス」、コールド
・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（1972）参照］
で３回洗浄し、クロラムフェニコール30mg/mlを添加し
たM9寒天［プロリン、ヒスチジン、アルギニン、イソロ
イシン、ロイシン、食塩水および0.5％ガラクトース補
足、アグムスら、バイオケミカル・アンド・バイオフィ
ジカル・リサーチ・コミュニケーション（Adams et a
l.,Biochem.Biophys.Res.Comm.）89（２）,650〜658（1
979）］上で平板培養した。平板当り約200形質転換体を
平板20枚に塗抹した。37℃で３日間インキュベーション
後、形質転換体は検出されなかった。この最少平板にニ
コチン酸を５μg/mlでスプレーし、イー・コリ株K21の
ニコチン酸要求を補足し、さらに37℃で３日間、ついで
室温で２日間インキュベーションを続けた。インキュベ
ーション後、生存コロニーをクロラムフェニコール30μ
g/mlを添加したマッコンキー・ガラクトース寒天（MAC
−GAL）（前記ミラーら参照）および0.5％ガラクトー
ス、５μg/mlニコチン酸、５μg/mlチアミンおよび30μ
g/mlクロラムフェニコールで補足したM63最少寒天（前
記ミラーら参照）の両方にパッチした。２つのコロニー
のみが、イー・コリK21をgalK+表現型に形質転換するコ
スミッドDNAを含有していた。これらのコスミッドをpSL
IVGAL−１およびpSLIVGAL−２と命名した。両コロニー
共、MAC−GAL上で薄赤色で（すなわち、これらはgal
K+）、M63培地上で増殖した。 プラスミドpSLIVGAL−１およびpSLIVGAL−２を前記２
つのgalK+コロニーから単離し、前記チャーターらの方
法に従って、ストレプトマイセス・リビダンス株1326−
12K［ストレプトマイセス・リビダンス株1326のUV変異
誘発後、galK欠損株を単離、ブラウナーら、ジーン（Br
awner et al.,Gene）40,191（1985）参照］に形質転換
した。該ストレプトマイセス・リビダンス1326−12K（g
alK-）宿主のプラスミド・コード付け相補を前記ブラウ
ナーらの方法に従って、MBSM−gal−チオストレプトン
平板上で胞子の増殖を観察してテストした。pSLIVGAL−
２はストレプトマイセス1326−12K宿主の検知しうる相
補を示さなかった。 細胞抽出物を、１％グルコースまたはガラクトースお
よび10μg/mlチオストレプトンで補足したSL培地中で増
殖させた培養から調製した。イムノブロット（immunobl
ot）分析（前記ブラウナーら参照）により、イー・コリ
・ガラクトキナーゼに対するウサギ抗血清を用いて抽出
物のガラクトキナーゼ産生を分析した。イムノブロット
分析で検出された蛋白質はほぼイー・コリgalKのサイズ
であった。この蛋白質はストレプトマイセスのガラクト
ース補足培養において、グルコース培養におけるよりも
数倍高いレベルで出現した。 B.コスミッド内のストレプトマイセス・リビダンスgalK
領域の地図 前記のように調製したpSLIVGAL1およびpSLIVGAL2のga
lK領域を、コスミッドからのランダム・フラグメントの
pUC18誘導体へのクローニング［ノーランダーら、ジー
ン（Norrander et al.,Gene）26,101〜106（1983）］お
よびMAC−GAL培地上でのイー・コリ株MM294（galK-）の
相補スコアにより同定した。コスミッド・クローンを部
分的にSau3A Iで消化して（２〜4Kbフラグメントの収率
が最大となる条件下）、この反応生成物を、つぎの合成
DNA配列： をpUC18のBamH I部位に挿入して作製したpUC18の誘導体
であるpUC18−TT6のBgl II部位に連結する。12個のgalK
+クローン（MAC−GAL上、赤）のサイズをスクリーニン
グする。プラスミドpSAU10と命名した１つのクローンは
最も小さく、約1.4Kbのインサート・サイズを有してい
た。 pSLIVGAL1含有コロニーと異なり、pUCクローンはMAC
−GAL培地上で非常に赤く、ガラクトキナーゼの産生増
加を示した。この酵素レベルの増加の最も可能性の高い
説明は、ストレプトマイセス・リビダンスgalK遺伝子
が、コスミッドの上流プロモーターより強いイー・コリ
・プロモーターに転写されていることである。 pSAU10のインサートをEcoR I〜Hind IIIフラグメント
として単離し（これらの部位はpUC18−TT6のインサート
領域をフランキングする）、ストレプトマイセス・リビ
ダンスgalK遺伝子のプローブとして用いる。クローニン
グに用いた染色体DNAをEcoR I＋Mlu IおよびBamH I＋Bg
l IIで制限し、サザーン、ジャーナル・オブ・モレキュ
ラー・バイオロジー（Southern,J.Mol.Biol.）98,503
（1975）の方法に従ってプロットする。pSAU10フラグメ
ントをニック・トランスレーションし、該ブロットに雑
種形成させる。プローブは染色体消化物における1.3KbE
coR I−Mlu Iフラグメントおよび5KbBamH I−Bgl IIフ
ラグメントを同定した。このデータをコスミッド・イン
サートの地図と比較して、galK遺伝子の位置（地図位置
５と７の間、表Ａ参照）を確認した。 C.ストレプトマイセス・リビダンスgalオペロンのDNA配
列 ストレプトマイセス・リビダンスgalオペロンを鎖終
止［サンガーら、プロシーディングス・オブ・ナショナ
ル・アカデミー・オブ・サイエンス・ユー・エス・エイ
（Sanger et al.,Proc.Nat'l.Acad.Sci.U.S.A.）74,546
3（1977）参照］および化学的開裂［マキサムおよびギ
ルバート、メソッズ・イン・エンザイモロジー（Maxam
and Gilbert,Methods in Enzymology）65,499（198
0）］により配列づけした。galKの初めの配列はM13mp10
のBamH IおよびSal I部位の各々にショットガン・クロ
ーンされたpSAU6のインサート（pSAU10の2.3Kb同胞）の
Sau3A IおよびSal Iフラグメントから由来した［メッシ
ング（Messing］、メソッズ・イン・エンザイモロジ
ー、101、20（1983）参照］。ストレプトマイセス・リ
ビダンスgalT、galEおよびgalK遺伝子のアミノ酸配列は
コンピュータによって予測され、イー・コリおよび／ま
たはサッカロマイセス・セレビシエ（S.cevevisiae）ガ
ラクトキナーゼ、gal−１−ホスフェート・ウリジル・
トランスフェラーゼおよびUDP−４−エピメラーゼ酵素
のアミノ酸配列との比較によって分析した。これらの蛋
白質の配列は、gal酵素をコード付ける遺伝子の総また
は部分DNA配列を用いるコンピュータ分析により予測さ
れた［デボウクら、ヌークレイック・アシッズ・リサー
チ（Debouck et al.,Nuc.Acids Res.）13（６）,1841〜
1853（1985）およびシトロンおよびドネルソン、ジャー
ナル・オブ・バクテリオロジー（Citron and Donelson,
J.Bacteriology）158,269（1984）参照］。ストレプト
マイセス・リビダンスgalK、galT、galE遺伝子生成物に
ついての推定蛋白質配列と、それらの各イー・コリおよ
び／またはサツカロミセス・セレビシエ遺伝子生成物の
間にいくらかの相同が見出された。 ストレプトマイセス・リビダンスgalオペロンの完全D
NA配列を表１に示す。表１に包含されているものはオペ
ロンのプロモーターについての転写開始部位およびgal
T、galEおよびgalK遺伝子生成物の予測アミノ酸配列で
ある。 実施例２ ストレプトマイセス・リビダンスgalオペロンのプロモ
ーター ａ）P1プロモーター （ｉ）概要 このプロモーターはガラクトース誘導性、グルコース
抑制性で、全ストレプトマイセスgalオペロン用の調節
可能プロモーターである。S1データはストレプトマイセ
ス・リビダンスgalオペロンが約3.4Kbのポリシストロニ
ック転写体をコード付けすることを示している。転写体
はgalTについての約1Kb、ついで、各galEおよびgalKに
ついての約1Kbからなる。（第１図参照） P1のガラクトース誘導は、少なくとも部分的に、５′
端が転写開始部位の上流31bpに位置するオペレーター配
列および該オペレーターを認識するレプレッサ蛋白によ
り介在される。 （ii）実験:P1プロモーターの単離、位置決め、特性づ
け ストレプトマイセス・リビダンスgalK ATGの上流配列
を、前記ブラウナーのイー・コリgalKプロモーター・プ
ローブ系を用い、プロモーターについてスクリーニング
する。Hind III−Mlu Iフラグメント（表Ａ、地図位置
１〜５参照）をSau3A Iで制限し、pK21の特有のBamH I
部位に連結し（第２図）、実施例１の方法に従ってイー
・コリK21（galK-）中に形質転換する。pK21はpSKO3の
誘導体で、イー・コリgalK遺伝子を含有するイー・コリ
−ストレプトマイセス・シャトル・ベクターである。pS
KO3の構成はローゼンベルグら（Rosenberg et a
l.）、ジェネティック・エンジニアリング、８（1986）
に記載されている。galKを発現するクローン、すなわ
ち、プロモーター活性を有するクローンをマッコンキー
−ガラクトース平板上で同定した。２つのgalK+クロー
ン（pK21MH1および２と命名）をストレプトマイセス132
6−12K（galK-）に形質転換した。形質転換体の抽出物
をYmgluおよびYmgal中で培養し、抗イー・コリ・ガラク
トキナーゼ抗血清を用い、ウエスターン・ブロット分析
で分析した。このブロットはガラクトース誘導培養から
の抽出物において著しく高いガラクトキナーゼのレベル
を示した。 pK21MH1および２は制限分析により410bpのSau3A Iイ
ンサートを含有することが示され、これは、サザーン、
ジャーナル・オブ・モレキュラー、バイオロジー98、50
3（1975）の方法によるサザーン・ブロット分析によ
り、Hind IIIおよびBgl II部位内に含有される（表Ａ、
地図位置１〜２）。クローンしたフラグメントを、スト
レプトマイセス・リビダンス1326−12Kおよびイー・コ
リK12培養から単離したRNAを用いるS1分析により分析し
た。S1消化後得られたフラグメントは290ヌクレオチド
保護フラグメントである（Sau3A I部位のmRNA290のbp上
流の５′端を示す）。雑種形成実験（この領域の単スト
ランドM13クローンを用いる）は転写の方向が第２図に
示すごとく、左から右であること（すなわち、転写はga
lKの方へ進向する）を示している。 通常のDNA配列分析および追加のS1地図作製分析を用
いてmRNAの５′端を規定した。 P1のガラクトース誘導調節に関与する配列を、ヌクレ
アーゼBal31により転写開始部位の上流配列を除去する
ことにより位置づけした。これらの配列除去によるプロ
モーター機能またはガラクトース誘導におけるいずれも
の変化をP1同定に用いたイー・コリgalKプロモーター・
プローブ・プラスミドを用いて評価した。 （iii）galプロモーター欠失の構成 P1転写開始から下流100bpおよびP1転写開始から上流2
16bpの配列を含むDNAフラグメントをプラスミドpUC19TT
1にクローンしてプラスミドpHL5を構成する。プラスミ
ドpUC19TT1はノーランダーら、ジーン26、101〜106（19
83）に記載されており、pUC18−TT6としてのアンカー
（Unker）を有している。実施例1B参照。P1の前の上流
配列中に延長する欠失はpHL5をHind IIIで線状化し、ヌ
クレアーゼBal31で端部を処理することにより発生させ
ることができる。不均一端をDNAポリメラーゼＩのクレ
ノウ・フラグメントで修復する。ついで、Bal31処理pHL
5をBamH Iで消化し、５％アクリルアミド・ゲル上を泳
動させる。分子量100〜300bpのDNAフラグメントをゲル
から溶出し、Hind IIおよびBamH Iで消化したM13mp10に
サブクローンする。（メッシング（Messing）、メソッ
ズ・イン・エンザイモロジイ、101、20（1983）参
照）。個々の欠失を、前記サンガーらのジデオキシ鎖終
止法により、単ストランド・ファージDNAから配列づけ
する。 （iv）P1プロモーター欠失のイー・コリgalK遺伝子への
結合 種々のmp10クローンをBamH IおよびHind IIIで消化し
た。個々の欠失を有するDNAフラグメントを低融点アガ
ロース・ゲルから単離し、BamH IおよびHind IIIで消化
したpK21に連結した（第２図参照）。イー・コリMM294
への形質転換後、プラスミドDNAを、各欠失誘導体につ
いて単離し、ストレプトマイセス・リビダンス12Kに形
質転換した。 （ｖ）ストレプトマイセス・リビダンスにおけるBal31
−発生欠失の機能的評価 各々のプロモーター欠失について、１つのチオストレ
プトン耐性形質転換体をYMベース（YEME）＋10μg/mlチ
オストレプトン中で後記logまで増殖させた。細胞をペ
レット化し、M56培地中で１回洗浄し、M56培地に再懸濁
した（前記ミラーら参照）。洗浄した細胞を、１％ガラ
クトースまたは１％グルコース補足YM＋0.1M MOPS（pH
7.2）＋10μg/mlチオストレプトンへの接種に用いた。
細胞を16時間増殖させ、ついで、ガラクトースキナーゼ
活性を検定した。 P1転写用開始部位の上流120、67、55、34、31、24、2
0、18、10または8bp配列のいずれかを含有する各pK21誘
導体をガラクトースキナーゼの発現について分析した。
結果は、P1のガラクトース誘導に必要な全ての情報（す
なわち、ガラクトース増殖細胞において産生されたガラ
クトキナーゼのレベルがグルコース増殖細胞におけるレ
ベルより10〜20倍大きい）がP1の上流の31bp配列に含ま
れることを示した。P1の上流34bp配列を残した欠失は、
ガラクトースが６倍量のガラクトキナーゼを誘導するの
で、ガラクトースによって部分的に誘導性である。すな
わち、オペレーターの一端は、−24および−31倍の間の
配列内に位置しなければならない。上流配列の20、18、
10または8bpのいずれかを残した残りの欠失は構成性P1
プロモーター、すなわち、産生したガラクトキナーゼの
レベルが、細胞をガラクトースまたはグルコースの存在
下で増殖させた場合、同等である。P1の８および10bpを
有するプロモーター欠失は構成性ではあるが、ガラクト
キナーゼの量は、18〜120bpの上流配列を有するプロモ
ーター欠失に比べ、10倍減少した。この結果はP1の−10
および−18位間の配列がプロモーター機能に必須である
ことを示している。 このデータは、P1のガラクトース誘導が、少なくとも
部分的にオペレーター配列に介在されるモデルを支持し
ている。この配列の一端はP1転写開始部位の上流24〜31
bpである。オペレーターの一部または全部の除去は部分
的または全体的に脱抑制されたプロモーターをもたら
す。この配列の他端はこれらの実験によって規定されな
いが、ほぼP1転写開始部位の上流24〜31bp配列内に含ま
れると考えられる。さらに、これらの配列がガラクトー
ス誘導を達成するに必要な最小領域内に含まれているの
で、本発明者らはオペレーターの３′端も転写開始部位
の上流100bp内にある可能性を排除できない。これらの
データは、オペレーター配列と相互作用する因子がレプ
レッサー蛋白質であることを示唆している。最後に、本
発明者らは、P1がレプレッサー以外の因子（すなわち、
ラムダファージc II蛋白質のような陽性アクチベータ
ー）によって制御されてガラクトース誘発プロモーター
転写体を調節しうるという可能性を排除する証拠を有し
ない。 ｂ）P2プロモーター （ｉ）概要 ストレプトマイセスgalオペロンのP2プロモーターはg
alE遺伝子の上流で、galEおよびgalK遺伝子の両方を転
写する。 P2プロモーター発現はS1分析によって示されるように
構成的（すなわち、グルコース抑制／ガラクトース誘導
でない）である。 （ii）実験:P2プロモーターの単離、位置決め、特性づ
け ストレプトマイセスgalオペロンP2の存在は、ストレ
プトマイセス・リビダンス1326DNAのBal II−Mlu Iフラ
グメントをプラスミドpK21に挿入し（第２図参照）、そ
れによって形質転換されたストレプトマイセス・リビダ
ンス1326−12K中でガラクトキナーゼ発現が観察される
場合に明らかとなった。 DNA配列分析およびS1分析を用いてストレプトマイセ
ス・リビダンスgalオペロンP2の５′端を同定した。P2
プロモーター転写体の５′端は予測したgalE ATGの上
流100bp内にある。 実施例３ ストレプトマイセスgalオペロン内のポリシストロニッ
ク・メッセージの証拠 S1分析を用いてストレプトマイセス・リビダンスgal
オペロンgalK遺伝子の転写体上流および下流の地図を作
製した。一般に、１〜2Kbのオーバー・ラップDNAフラグ
メントをクローンから単離し、さらに制限し、末端をラ
ベルした。メッセージはgalKの３′端からP1の上流端ま
で続く。 ストレプトマイセス・リビダンスgalオペロン転写体
の３′端は多分、galKの最初の100塩基下流内に生じ
る。galK配列内の部位で３′ラベルしたフラグメント
は、下流領域に伸長する場合、その全長までは保護され
ない。１つの実験は、galK翻訳終止の下流50〜100bpで
終止する領域で保護されうることを示している。転写タ
ーミネーターの存在はターミネーター・プローブを用い
る通常の技術によって確認できる。galオペロン転写体
は、当該部位から５′ラベルPvu IIフラグメントの非全
長保護が生じるので、明らかにPvu II部位まで伸長しな
い（表Ａ、地図位置８参照）。 ２つのPvu IIからの５′端ラベルフラグメント、フラ
グメントＩ（表Ａ、地図位置４〜６参照）およびフラグ
メントII（表Ａ、地図位置６〜８参照）ならびにpSau10
インサートを、メッセージの３′から５′端へのS1ウォ
ーキング（warking）のプローブ源として用いた。この
領域の全てのフラグメントは、部分および完全保護を示
すP2プロモーター含有フラグメントを除き、保護され
た。S1消化からの完全保護は、P1の上流で開始し、galK
の約100bp下流まで続くポリシストロニック・メッセー
ジを示す。 前記のデータはストレプトマイセスgalオペロンのポ
リシストロニックmRNAの間接的証拠である。長い隣接す
るDNAフラグメント（例えば、4.5Kb Hind III−Sac I
フラグメント、表Ａ、地図位置７参照）を用いるS1分析
を転写体サイズの確認に用いた。 実施例４ ストレプトマイセス・リビダンスgalオペロンgalEおよ
びgalT遺伝子の位置決め （ｉ）概要 ストレプトマイセス・リビダンスgalオペロンgalE遺
伝子はpSLIVGAL1の1.5Kb Pvu IIフラグメント（表Ａの
地図位置４〜６）に位置する（第１図）。 ストレプトマイセス・リビダンスgalオペロンgalEコ
ード付け配列はMlu I部位を通して伸長する（表Ａの地
図位置５）。 ストレプトマイセス・リビダンスgalオペロンgal遺伝
子はpSLIVGAL1の1.15KbNru−Pvu II領域に位置する（表
Ａの地図位置1a〜４参照）。 ストレプトマイセス・リビダンスgalオペロンgalEお
よびgalT転写方向はgalK遺伝子と同じである。 （ii）実験 pSLIVGAL1に含有される他の機能特に、酵素ガラクト
ース・エピメラーゼ（galE）または酵素ガラクトース・
トランスフェラーゼ（galT）をコード付けするプラスミ
ドを同定する必要がある。ストレプトマイセスgalオペ
ロンgalK遺伝子はそのイー・コリgalK宿主を相補する能
力で同定した。かくして、ストレプトマイセスgalTおよ
びgalE遺伝子の同定は、各々、イー・コリgalE-またはg
alT-宿主の相補によりテストした。イー・コリgalT-株
（CGSC株＃4467、W3101）および２つのgalE-株（CGSC株
＃4473、W3109およびCGSC株＃4498、PL−２）を得、pSL
IVGAL1クローンによる相補のテストをした。 ストレプトマイセス・リビダンスgalオペロンgalK遺
伝子を含有する約9KbのHind III−Sph Iフラグメント
（表Ａ、地図位置１〜16をpUC19に挿入した。このフラ
グメントはpUC19内で、pUC19のPlacプロモーターからの
転写がストレプトマイセスgalK遺伝子と同じ方向になる
ように位置させる。pUC19はヤニッシュ−ペローら、ジ
ーン（Yanisch−Perrou et al,Gene）33,103（1983）
に記載されている。相補はマッコンキー−ガラクトース
平板上での増殖により検定した。ガラクトースを利用で
きる細胞（galE+、galT+、galK+）はこの培地上で赤〜
桃色となる。Hind III−Sph Iインサートを有するpUC19
含有イー・コリ株PL−２（実施例２参照）はこの指示薬
平板上で桃色になり、Hind III−Sph Iフラグメントが
ストレプトマイセス・リビダンスgalE遺伝子を含有する
ことを示した。galE遺伝子は4.5Kb Hind III−Sac I
（Sac I部位は表Ａの地図位置７〜８近辺の領域に近
い）フラグメント内に地図作製した。Mlu I部位（表
Ａ、地図位置５）からSac I部位までの配列を除くと、
イー・コリPL−２のgalE相補は検出されなかった。galK
遺伝子の５′端はMlu I部位から70bpにある。したがっ
て、Mlu I部位はgalE遺伝子の５′または３′端内に含
まれるようである。galE転写方向を決定するため、Hind
III−Sac IフラグメントをpUC18に挿入した。この配置
において、ストレプトマイセス・リビダンスgalK遺伝子
はPlacに関して反対の方向にある。pUC18Hind III−Sph
Iクローンはイー・コリPL−２を相補せず、galEはgalK
と同じ方向で転写されることを示している。さらにMlu
I部位はgalE遺伝子の３′端内に含まれると結論され
た。Pvu II−Mlu Iフラグメント（表Ａ、地図位置４−
５）のDNA配列分析は予測分子量33000ダルトンのポリペ
プチドをコード付けするオープン・リーディング・フレ
ームを決定した。このリーディング・フレームの５′端
はPvu II部位から約176bpに位置する（表Ａ、地図位置
４参照）。かくして、この配列づけの結果はgalEの３′
端がMlu I部位を横切るという結論を指示している（表
Ａ、地図位置５参照）。 pSLIVGAL1上のgalT遺伝子を位置づけする同様な実験
をgalT宿主で試みた。 P1およびgalEの５′端間の領域を配列づけしてgalT遺
伝子を同定した。DNA配列のアミノ酸配列への翻訳は酵
母トランスフェラーゼに相同な領域を示す蛋白質をコー
ド付けするリーディング・フレームを規定する。 実施例５ ストレプトマイセス・リビダンスgalオペロンgalK遺伝
子のガラクトース誘導 （ｉ）概要 ガラクトースを培地に添加後１時間以内にガラクトキ
ナーゼ発現が誘導される。 グルコースの存在下または該糖添加後６時間以内に追
加の炭素源を加えない場合に対し、ガラクトースの存在
下ではガラクトキナーゼの発現は10倍も高い。 （ii）実験 ストレプトマイセス・リビダンスgalK遺伝子のガラク
トース誘導を、ガラクトースの添加後、１、３、６およ
び24時間におけるガラクトキナーゼ活性の検定により試
験した。YM＋0.1MMOPS（pH7.2）２にストレプトマイ
セス・リビダンス1326の胞子２×107個を接種した。21
時間増殖後、最終濃度１％でガラクトースまたはグルコ
ースを加えた。糖添加１、３、６および24時間後、細胞
を単離し、ガラクトキナーゼ活性を検定した。全RNAは
前記ホップウッドらに記載の方法で調製した。 ガラクトキナーゼ合成の増加はガラクトース添加１時
間後に観察された。この増加は持続した（１〜24時
間）。誘導培養から単離したRNAのS1分析からgalK活性
の増加がP1プロモーター転写体のレベル増加によること
を確認した。 S1データおよび誘導研究はストレプトマイセスgalオ
ペロンにおける遺伝子発現についての以下のモデルを示
唆した。P1プロモーターはガラクトース誘導プロモータ
ーである。P1転写体はgalT、galEおよびgalKを包含す
る。P2プロモーターは構成性で、その転写体はgalEおよ
びgalKを包含する。 イー・コリgalオペロンも２つのプロモーターP1およ
びP2を有することは興味深い［ナッソら、セル（Nusso
et al,Ce11）12,847（1977）］。P1はcAMP−CRP結合
によって活性化されるが、P2はcAMP−CRPによって抑制
される。イー・コリgalオペロンgalEコード付け配列翻
訳は、ガラクトースの非存在下またはグルコースの存在
下でもエピメラーゼの一定の源を供給する役割をするP2
において転写が開始される場合、より効率的である［ク
イーンら、セル（Queen et al,Cell）25,241（1981）
参照］。エピメラーゼはガラクトース利用の間、ガラク
トースをグルコース−１−ホスフェートに変え、UDP−
グルコースをイー・コリの細胞壁生合成に必要なUDP−
ガラクトースに変える機能を有する。ストレプトマイセ
スgalKオペロンのP2プロモーターも、ガラクトースの非
存在下または二次代謝の間にエピメラーゼおよびガラク
トキナーゼを供給する役割をする可能性がある。 実施例６ ストレプトマイセス・コエリカラーgalオペロン （ｉ）概要 ストレプトマイセス・コエリカラーgalK遺伝子含有フ
ラグメントの制限地図はストレプトマイセス・リビダン
スgalオペロンの制限地図と同じである（第３図参
照）。 ストレプトマイセス・コエリカラーはガラクトースを
唯一の炭素源とする最少培地上で増殖できる。 ストレプトマイセス・コエリカラーにおけるガラクト
キナーゼ発現は増殖培地にガラクトースを添加すること
により誘導される。 P1と類似で、ほぼ同一と考えられるプロモーターがス
トレプトマイセス・コエリカラーgalオペロンのガラク
トース誘導に関与する。 （ii）実験 ストレプトマイセス・コエリカラーgalK遺伝子含有の
約14Kb部分Sau3Aフラグメントは英国マンチェスター
の、ユニバーシティ・オブ・マンチェスター・インステ
ィテュート・オブ・サイエンス・アンド・テクノロジー
においてケイ・ケンダルおよびジェイ・クラム（K.Kend
allおよびJ.Cullum）によって単離された（未公開、私
信）。彼等は、ストレプトマイセス・コエリカラーgalK
変異株の相補により3Kb EcoR Iフラグメント内にストレ
プトマイセス・コエリカラーgalK遺伝子を位置づけする
ことができた。ストレプトマイセス・リビダンスgalオ
ペロン内の多くの制限部位の位置はストレプトマイセス
・コエリカラーgalK遺伝子を含むEcoR Iフラグメントの
上流および下流内に見られるものと同じである（第３
図）。すなわち、ストレプトマイセス・コエリカラーga
lオペロンの遺伝子構成はストレプトマイセス・リビダ
ンスgalオペロンと同じであるように考えられる。 ストレプトマイセス・コエリカラーgalK遺伝子のガラ
クトース誘導をイムノブロッティングで試験した。スト
レプトマイセス・コエリカラーをYM＋１％ガラクトース
または１％グルコース（YmgluまたはYmgal）中、28℃で
20時間増殖させた。ガラクトキナーゼ発現は、精製イー
・コリ・ガラクトキナーゼに対して調製したウサギ抗血
清を用いて検出した。検出した蛋白質はイー・コリおよ
びストレプトマイセス・リビダンスgalK遺伝子生成物の
近似部位であった。ガラクトキナーゼ発現は、ストレプ
トマイセス・コエリカラーがYm＋ガラクトース（Ymga
l）中で増殖した場合のみ検出されるので、ガラクトー
ス誘導である。 ストレプトマイセス・コエリカラーgalオペロンのガ
ラクトース誘導がストレプトマイセス・リビダンスP1プ
ロモーターに類似するプロモーターによって指示されて
いるか否かを決定するためにS1ヌクレアーゼ保護研究を
行なった。RNAを、Ym＋１％ガラクトースまたは１％グ
ルコース（YmgalまたはYmglu）中で増殖させたストレプ
トマイセス・コエリカラーから単離した。このRNAのS1
分析に用いた雑種形成プローブは、ストレプトマイセス
・リビダンスP1プロモーター、その転写開始部位および
galT遺伝子の５′端を含む410bpSau3Aであった。この分
析により検出されたS1保護フラグメントは、ガラクトー
ス存在Ｔで増殖したストレプトマイセス・リビダンスか
ら単離したRNAとプローブを雑種形成させた場合、検出
した保護フラグメントと共に泳動した。すなわち、この
結果は、ストレプトマイセス・コエリカラーgalオペロ
ンのガラクトース誘導がストレプトマイセス・リビダン
スP1プロモーターと区別できない配列によって指示され
ていることを示している。 以下のストレプトマイセス株は唯一の炭素源としてガ
ラクトースを含有する培地上で増殖できることが観察さ
れた。 ストレプトマイセス・アルブスJ1074（前記英国ノー
ウィッチのチャーター氏より入手） ストレプトマイセス・カルジノスタティクス（S.carz
inostaticus）ATCC No.15944 ストレプトマイセス・カルジノスタティクスATCC No.
15945 ストレプトマイセス・アンチフィブリノリチクス（S.
antifibrinolyticus）ATCC No.21869 ストレプトマイセス・アンチフィブリノリチクスATCC
No.21870 ストレプトマイセス・アンチフィブリノリチクスATCC
No.21871 ストレプトマイセス・ロンギスポルス（S.longisporu
s）ATCC No.23931 以上、本発明の好ましい具体例を実施例として記載し
たが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【図面の簡単な説明】
第１図はストレプトマイセス・リビダンス1326galオペ
ロンの制限地図、第２図はプラスミドpK21の制限地図お
よび第３図はストレプトマイセス・リビダンスgalオペ
ロンと、ストレプトマイセス・コエリカラーgalK遺伝子
を含有する制限フラグメントを比較する制限地図であ
る。
ロンの制限地図、第２図はプラスミドpK21の制限地図お
よび第３図はストレプトマイセス・リビダンスgalオペ
ロンと、ストレプトマイセス・コエリカラーgalK遺伝子
を含有する制限フラグメントを比較する制限地図であ
る。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ
Ｃ１２Ｒ 1:465）
(72)発明者 ジェイムズ・アラン・フォーンワルド
アメリカ合衆国ペンシルベニア州19403、
ノーリスタウン、バーンサイド・アベニ
ュー104番
(72)発明者 フランシス・ジョン・シュミット
アメリカ合衆国ミズーリ州65201、コロ
ンビア、ドリス・ドライブ1404番
Claims (1)
- (57)【特許請求の範囲】 １．調節領域に作動的に結合した異種官能性DNA配列を
含む、最後の位置が転写開始部位である以下の配列にお
ける該転写開始部位の−18および−10位間のP1プロモー
ターとして機能する配列を有するストレプトマイセスga
lオペロンP1プロモーター調節領域またはgalT、galEお
よびgalK遺伝子産物の調節可能な生成について該オペロ
ンと実質的に同じ機能を有するそのいずれかの調節可能
な官能性誘導体を含む組換型DNA分子を含む形質転換宿
主微生物または細胞： ２．調節領域に作動的に結合した異種官能性DNA配列を
含む、最後の位置が転写開始部位である以下の配列にお
ける該転写開始部位の−18および−10位間のP1プロモー
ターとして機能する配列を有するストレプトマイセスga
lオペロンP1プロモーター調節領域またはgalT、galEお
よびgalK遺伝子産物の調節可能な生成について該オペロ
ンと実質的に同じ機能を有するそのいずれかの調節可能
な官能性誘導体を含む組換型DNA分子を有し、さらにレ
プリコンを有していてもよい組換型DNAベクター：３．調節領域に作動的に結合した異種官能性DNA配列を
含む、最後の位置が転写開始部位である以下の配列にお
ける該転写開始部位の−18および−10位間のP1プロモー
ターとして機能する配列を有するストレプトマイセスga
lオペロンP1プロモーター調節領域またはgalT、galEお
よびgalK遺伝子産物の調節可能な生成について該オペロ
ンと実質的に同じ機能を有するそのいずれかの調節可能
な官能性誘導体を含む組換型DNA分子を有し、さらにレ
プリコンを有していてもよい組換型DNAベクターを含む
形質転換宿主微生物または細胞： ４．P1プロモーターに作動的に結合した異種官能性DNA
配列を含む、最後の位置が転写開始部位である以下の配
列における該転写開始部位の−18および−10位間のスト
レプトマイセスgalオペロンP1プロモーターまたはgal
T、galEおよびgalK遺伝子産物の調節可能な生成につい
て該オペロンと実質的に同じ機能を有するそのいずれか
の調節可能な官能性誘導体を含む組換型DNA分子を含む
形質転換宿主微生物または細胞： ５．P1プロモーターに作動的に結合した異種官能性DNA
配列を含む、最後の位置が転写開始部位である以下の配
列における該転写開始部位の−18および−10位間のスト
レプトマイセスgalオペロンP1プロモーターまたはgal
T、galEおよびgalK遺伝子産物の調節可能な生成につい
て該オペロンと実質的に同じ機能を有するそのいずれか
の調節可能な官能性誘導体を含む組換型DNA分子を有
し、さらにレプリコンを有していてもよい組換型DNAベ
クター： ６．P1プロモーターに作動的に結合した異種官能性DNA
配列を含む、最後の位置が転写開始部位である以下の配
列における該転写開始部位の−18および−10位間のスト
レプトマイセスgalオペロンP1プロモーターまたはgal
T、galEおよびgalK遺伝子産物の調節可能な生成につい
て該オペロンと実質的に同じ機能を有するそのいずれか
の調節可能な官能性誘導体を含む組換型DNA分子を有
し、さらにレプリコンを有していてもよい組換型DNAベ
クターを含む形質転換宿主微生物または細胞：
Applications Claiming Priority (4)
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|---|---|---|---|
| US83470686A | 1986-02-28 | 1986-02-28 | |
| US941987A | 1987-01-30 | 1987-01-30 | |
| US9419 | 1987-01-30 | ||
| US834706 | 1987-01-30 |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP9207701A Division JP2984239B2 (ja) | 1986-02-28 | 1997-08-01 | ストレプトマイセスｇａｌオペロン |
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|---|---|
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| JP3037698B2 true JP3037698B2 (ja) | 2000-04-24 |
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|---|---|---|---|
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|---|---|---|---|
| JP9207701A Expired - Lifetime JP2984239B2 (ja) | 1986-02-28 | 1997-08-01 | ストレプトマイセスｇａｌオペロン |
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| EP1780283A1 (en) * | 2000-04-21 | 2007-05-02 | Martek Biosciences Corporation | Trophic conversion of obligate photographic algae through metabolic engineering |
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-
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- 1987-02-26 PT PT84375A patent/PT84375B/pt not_active IP Right Cessation
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- 1987-02-26 ES ES87870026T patent/ES2080719T3/es not_active Expired - Lifetime
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- 1987-02-27 CA CA000530769A patent/CA1307481C/en not_active Expired - Lifetime
- 1987-02-27 DK DK105287A patent/DK105287A/da not_active Application Discontinuation
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-
1996
- 1996-01-09 GR GR960400046T patent/GR3018626T3/el unknown
-
1997
- 1997-08-01 JP JP9207701A patent/JP2984239B2/ja not_active Expired - Lifetime
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