HU201116B - Process for producing plasmids having uncontrolled replication conduct under given circumstances - Google Patents

Description

(54) ELJÁRÁS MEGFELELŐ Ε E LT ÉTELEK KÖZÖTT

SZABÁLYOZATLAN REPLIKÁCIÓS VISELKEDÉSŰ RLAZMIDOK ELŐÁLLÍTÁSÁRA (57) KIVONAT

A találmány tárgya eljárás alacsony hőmérsékleten, illetve gátolt körülmények között konstans, kis kópiaszámot mutató, magasabb hőmérsékleten, illetve nem gátolt körülmények között jelentősen megnővekedett vagy szabályozatlan kópiaszámot mutató plazmidok előállítására. A találmány szerint Rl típusú plazmidok ba hőérzékeny represszor gént tartalmazó fág-DNS-t vagy kémiailag szabályozható promotor szekvenciát építenek be megfelelő restrikciós enzimes emésztéssel és ligálással, majd a kapott plazmidot E. coliba transzformálják, transzformánsokat izolálnak antibiotikum-rezisztencia és/vagy λ-fertőzés és/vagy metabolit-gátlás alapján, és a transzformánsokból a plazmidot kivánt esetben kinyerik.

A leírás tér jedelme: 24 oldal, 9 rajz, 23 ábra

HU 201116 Β

A találmány tárgya eljárás megfelelő feltételek között szabályozatlan replikációs viselkedésű plazmidok előállítására. A találmány közelebbről olyan plazmidok előállítására vonatkozik, amelyek alacsony hőmérsékleten, illetve gátolt körülmények között konstans, kis kópiaszámot, magasabb hőmérsékleten, illetve nem gátolt körülmények között jelentősen megnővekedett vagy szabályozatlan kópiaszámot mutatnak.

Szabályozott gén-kifejezés céljára szolgáló két plazmidból álló rendszert ismertetnek Sninsky és munkatársai a Gene 16, 275-286 (1981) irodalmi helyen. A plazmid-rendszer a lac Z promotort és hőmérsékletfüggő replikonokat tartalmaz. Az egyik plazmid egy, a lac represszort kódoló gént tartalmaz, de 42 °C-on nem replikálódik; a másik plazmid, amely magasabb hőmérsékleten .megvaduló* replikációs viselkedést mutat, egy, a lac Z gén operátor-promotor rendszere által szabályozott, szerzett gént tartalmaz. Magasabb hőmérsékleten a lac promotor funkció depressziója és a lac által szabályozott gén kópiaszám-sokszorozódása együttesen következik be.

Nackman és munkatársai a Cell 13, 65-78 (1978) helyen in vitro rekombinációs módszert ismertetnek a lac promotornak a lambda-fág Cl represszorától különböző távolságokba történő helyezésére a pMB9 plazmidban azért, hogy E. coliban bármilyen gén magas szinten történő kifejeződését érjék el, a gén eredetétől függetlenül.

Feltételesen nem-szabályozott replikációs viselkedésű plazmidok (úgynevezett .megvaduló* plazmidok) ismeretesek pl. a publikált 78101877. 5. számú Európa szabadalmi bejelentésből. Ezeknek a plazmidoknak a replikációja hőmérsékletfüggő, ami azt jelenti, hogy a plazmidok szabályozott, állandó, kis kópiaszámot mutatnak, amikor egy bizonyos hőmérsékleten, pl. 30 °C hőmérsékleten növekednek, és kópiaszámuk szabályozatlanná válik, amikor a gazda-baktérium ettől eltérő hőmérsékleten, pl. 36 °C hőmérsékleten növekszik.

A fentebb említett szabadalmi bejelentésben foglalt plazmidokat az Rl plazmid kémiai mutagénnel történő kezelésével izolálták/ az Rl plazmid olyan vad-tipusu plazmid, amelyről ismeretes, hogy autonóm módon replikálódik Escherichia coli-ban. A mutagén kezelést két szakaszban hajtották végre, az első szakasz egy olyan plazmid hordozó bakteriális klón izolálásából állt, amelyben a plazmid kópiaszáma 30 °C hőmérsékleten 1-2 volt, és 40 °C hőmérsékleten 4-5-ször több, mig a második szakasz egy olyan bakteriális klón izolálásából állt, amelyben a plazmid nem-sza-’ bályozott kópiaszámot mutatott a nagyobb hőmérsékleten. A .megvaduló* viselkedést mutató plazmidok tehát a szülöplazmid kettős mutánsai voltak.

A fentebb említett szabadalmi bejelentés ismerteti az olyan miniplazmidokat is, amelyek klónozó vektorként használhatók, mivel viszonylag könnyen transzformálhatok a gazda-baktériumba kis méretük következtében. Ezek a miniplazmidok megőrzik a hőmérsékletfüggő .megvaduló* replikációs viselkedésért felelős géneket.

A fentebb említett szabadalmi bejelentésben foglalt plazmidok klónozó és termelő vektorként használhatók, hogy egy idegen DNS beiktatott fragmenseinek gén-termékét lehessen nyerni. A plazmidok hőmérsékletfüggő replikációjót hasznosítani lehet pl. eukarióta eredetű DNS-fragmensböl eredő gén-termékek megnövekedett mennyiségű termeléséhez. A géntermékek ilyen növelése nem lehetséges a hagyományos plazmid DNS mennyiség-növelő technikákkal, amelyek lehetnek pl. a klóramfenikol hozzáadása a tápközeghez, mivel a klóramfenikol jelenléte a fehérje-szintézis megállítását eredményezi.

A fentebb említett szabadalmi bejelentésben foglalt plazmidokat előnyösen lehet alkalmazni mint klónozó és termelő vektorokat olyan esetekben, ahol egy beiktatott idegen gén egy olyan terméket kódol, amely káros arra a baktériumra, amelybe a plazmidot transzformálták; alacsony hőmérsékleten a plazmidok kópiaszáma kicsi, és ennek következtében kevés a gén-kifejeződés. Ez azt jelenti, hogy a tenyészet sokszorozódási szakasza sorén, amelyet kis hőmérsékleten hajtanak végre, a baktérium nem valószínű, hogy károsodik.

A jelen találmány tárgya tehát olyan új plazmidok előállítása, amelyek legalább egy szabályozható promotort hordoznak, amely olyan módon van beiktatva, hogy az ebből eredő átírás szabályozza a plazmid-replikációt. Nevezetesen a találmány olyan plazmidokra vonatkozik, amelyekben a szabályozható promotor jelentősen megnövekedett vagy nem-szabályozott replikádét idéz elő, amikor a plazmidokat tartalmazó gazda-mikroorganizmusokat olyan körülmények között tenyésztjük, amelyek megnővekedett átírást biztosítanak a promotorból. A találmány tárgya továbbá az a módszer, amellyel ezeket a plazmidokat előállítjuk. A plazmidok klónozó és termelő vektorként használhatók.

Az már ismert, hogy egy szabályozható promotort iktatnak be a plazmidba beiktatott és a kívánt gén-terméket kódoló struktúráén kifejeződésének szabályozására. Azt azonban újnak véljük, hogy olyan szabályozható promotort iktatunk be a plazmidokba, amelynek segítségével lehetővé válik a képződött plazmid-kópiák számának szabályozása.

A találmány tehát egyrészt egy olyan plazmidra vonatkozik, amelybe egy szabályozható promotor olyan módon van beépítve, hogy az ebből a promotorból eredő átírás szabályozza a replikációt, és különösen olyan módon, hogy a megnövekedett átírás egy lé3

HU 201116 Β nyegesen megnövekedett vagy szabályozatlan kópiaszámhoz vezet. A jelen leírásban és igénypontokban a .szabályozható promotor* kifejezés egy olyan promotorra vonatkozik, amelynek aktivitását, az átírás beindításának sebességére tekintettel, szabályozni lehet azoknak a feltételeknek a megválasztása segítségével, amelyek közt a promotor-hordozó plazmidokat tartalmazó gazda-mikroorganizmusok növekszenek. Egy ilyen szabályozható promotor lehet egy idegen promotor, amely természet szerint nem rokon azzal a plazmiddal, amelybe beiktatják. A promotor lehet vele születetten szabályozható egy ide illő DNS szerkezet következtében a promotor területén belül. Egy ilyen promotorra példa az egyik olyan promotor, amelyet az ismert .megvaduló* plazmidban találtak (lásd később a leírást). Egy másik változat szerint a promotor lehet szabályozható egy szabályozó faktor segítségével, amely vagy pozitív ellenőrzéssel hat, vagyis a plazmid nem lép be a szabályozatlan replikációba, hacsak a promotort pozitívan nem indukálják, pl. egy indukáló vegyület hozzáadásával a tépközeghez, amelyben a gazdasejtek növekednek; vagy a szabályozó faktor negatív ellenőrzéssel hat. Az utóbbi típusú szabályozó faktor is ismert, mint egy represszor, amelynek aktivitása is lehet szabályozható a gazdasejt növesztési feltételeinek beállítása segítségével. A represszor gén elhelyezkedhet a plazmidon magán a promotorral együtt, vagy egy külön plazmidon ugyanabban a gazda-mikroorganizmusban vagy a gazda-mikroorganizmus kromoszómájában. A represszor gén olyan terméket kódol, amely gátolja az átírást a beiktatott promotorból úgy, hogy a replikációt alacsony, állandó szinten tartja. Amikor valamilyen okból a represszor inaktívvá vélik, az ilyen szabályozás nem áll fenn, és az átírás növekszik.

Hacsak másképpen nem jelezzük, a .promotor* kifejezés, amelyet a jelen leírásban és igénypontokban használunk, általában jelenthet egy olyan promotort, amelynek aktivitása öröklött módon válaszol a gazdasejt növekedési feltételeinek változásaira, de jelent egy olyan promotort is, amelyet egy szabályozó faktor szabályoz. Az a kifejezés, hogy .egy plazmid, amelybe szabályozható promotor van beiktatva* azt kívánja jelenteni, hogy olyan találmány szerinti plazmidról van szó, amelyben a promotor és a promotor által szabályozott replikon be van iktatva ugyanabba a DNS fragmensbe, a promotor és a replikon végül is különböző forrásokból származik; ez azt jelenti, hogy a kívánt végleges plazmid megalkotásának során az egyik szakaszban a promotort beiktatják abba a plazmidba, amelyből a replikon származott. Azt a kifejezést, hogy .lényegesen megnövekedett vagy szabályozatlan plazmid kópiaszám* úgy lehet érteni, hogy ez arra a tényre utal, hogy amikor a gazda-mikroorga4 nizmus növesztéséhez alkalmazott feltételek változnak abból a célból, hogy a promotorból megnövekedett átírás legyen biztosítható olyan módon, hogy a plazmid elveszti replikációs szabályozását, a plazmid kópiaszám exponenciálisan növekszik a mikrobiológiai populáció mintegy 40-50%-os vagy még kisebb generációs idejével. A kópiaszámban növekedés addig folytatódik, amíg a gazdasejt abbahagyja a növekedést, általában 4-5 sejt-kettözödés vagy ennél kevesebb után, ennél a pontnál a plazmid DNS tartalom a sejtben mintegy 40-70%-a a teljes DNS menynyiségnek, vagyis a plazmid kópiaszáma egy 25-1000 közti vagy még nagyobb faktorral növekszik. Más szavakkal a plazmid kópiaszáma nem ér el állandósult állapotot. A szabályozatlan replikációs viselkedésnek azt a típusát .megvaduló* viselkedésnek is nevezzük.

Az Rl típusú plazmidok replikációs szabályozásának alapelveire vonatkozó ismereteinket hasznosítjuk a találmány szerinti plazmidok megalkotásában (ennek az alapelvnek további magyarázatát lásd a találmány részletes leírásánál). Amikor a találmány alapelvével összhangban egy szabályozható promotort iktatunk a plazmidba, a promotorból eredő megnövekedett átírást, amely egy jelentősen megnövekedett vagy szabályozatlan plazmid kópiaszámhoz vezet, okozhatja pl. a promotor depressziója. Ez azt jelenti, hogy a promotorral együtt beiktatott represszor gén, amely a bizonyos körülmények között szabályozó gént kódolja, inaktívvá válik bizonyos más körülmények között, úgy, hogy az átírást a promotor tovább nem gátolja, ez végül is egy szabályozatlan plazmid kópiaszámot eredményez.

Ez jelentős javítás az ismert .megvaduló* plazmidokhoz hasonlítva, amelyek változó körülmények között különbségeket mutathatnak replikációs tulajdonságaikban. Nincs jele annak, hogy a találmány szerinti plazmidokkal is ez lenne a helyzet, mivel a beiktatott idegen promotorok általában olyanok, amelyek olyan erősek (vagyis az átírás beindításának frekvenciája olyan nagy), hogy ilyen körülmény-változások hatástalanok.

A tenyésztés körülményeinek egyike, amelynek segítségével a szabályozható promotor aktivitását szabályozni lehet, az a hőmérséklet, amelynél a gazda-mikroorganizmust növesztjük. A promotor aktivitása lehet hőmérsékletfüggő önmagában, azaz a tenyésztés során reagál a hőmérséklet-változásokra, vagy a szabályozó faktor lehet hőmérséklet-érzékeny represszor.

A szabályozható promotor lehet egy A- bakteriofág ból származó promotor, amely promotort egy olyan DNS fragmens részeként lehet beiktatni, amely még a promotorból történő átírást szabályozó zcl hőmérsékletérzékeny represszor génjét is hordozza. A a promotor lehet vagy zPe vagy aPl, elsösor-35

HU 201116 Β bán λΡκ. Más, a jelen találmány alapelveivel összhangban levő plazmidba beiktatott és a hőmérséklettől eltérő, más külső tényezők által befolyásolt promotor-rendszerek is alkalmazhatók, mint pl. olyan promotorok, amelyek 5 vegyszerekkel indukálhatok vagy amelyek metabolitok segítségével szabályozhatók, mint pl. a lac, trp vagy deo promotorok.

A találmány szerinti plazmid egy kedvező kiviteli formája az, amelyben a promotor- io -szabályozó rendszer a plazmid hőmérsékletfüggő replikációs viselkedését idézi elő. Pontosabban, az a hőmérséklet, amelynél a plazmid lényegesen megnövekedett vagy szabályozatlan plazmid kópiaszámot mutat, na- 15 gyobb, mint az a hőmérséklet, amelynél a kópiaszám kicsi. A találmány szerinti plazmidok, amelyek egy olyan szabályozható promotort hordoznak, amelynek átírási sablonja hőmérsékletfüggő, pl. egy hómérsékletérzékeny 20 represszor miatt, egyik hőmérsékletnél konstans, kis kópiaszámot mutatnak, mint pl. kb.

°C hőmérsékletnél, mivel ennél a hőmérsékletnél a promotor represszálva van és az átírás ebből következésképpen alacsony szín- 25 ten marad, míg egy nagyobb hőmérsékletnél, pl. 36-42 °C hőmérsékletek között, jelentősen megnövekedett vagy szabályozatlan kópiaszámot mutatnak, mivel a szabályozó rendszer ennél a hőmérséklet-tartománynál inaktiváló- 30 dik a promotor depresszálődását és következésképpen a promotorböl megnövekedett átírást okozva. Előnyös, ha a .megvaduló' replikáció 39 “C hőmérséklet fölött történik.

A továbbiakban a leírásban csupán 35 olyan plazmidokra hivatkozunk, amelyek replikációját olyan szabályozó rendszer szabályozza, amely hőmérséklet-érzékeny, elsősorban egy hőmérséklet-érzékeny represszor, bár megérthető, hogy más típusú feltételek, 40 amelyek segítségével a plazmid replikációja szabályozható, szintén hasznosíthatók analóg módon, amint ezt a korábbiakban megmagyaráztuk.

A találmány szerinti plazmidok egyik ti- 45 pusa egy olyan plazmid, amelyben egy szabályozható promotor van beiktatva a plazmid egyik természetes replikációs szabályozó génje helyébe. A jelen leírás és igénypontok céljaira az ilyen plazmidokat A típusú plaz- 50 midnak nevezzük. Amikor a plazmid egy Rl plazmid származéka, a plazmidból kiiktatott regulótor-gén a cop B gén, ez kódolja a plazmid természetes replikációs inhibitorainak egyikét. A cop B gén kiiktatása 20-40, elő- 55 nyösen 20-30, még előnyösebben 20-25 kópia/sejt kópiaszámot eredményez, kb. 30 °C hőmérsékleten. Amikor azonban a hőmérséklet mintegy 40 °C-ra emelkedik, a szabályozható promotor represszor-funkciója inaktiválódik θο és a replikáció szabályozatlanná válik, egy legalább 500-1000 kópia/sejt tartományban levő plazmid-kópiaszámot eredményezve, többek között a plazmidba beiktatott bármilyen idegen DNS méretétől (minél nagyobb a DNS ¢5 fragmens, annál kisebb a képződött plazmid-kópiák száma), az ilyen idegen gén-termékek hatásától és/vagy a mikroorganizmus törzstől függően, amelybe a plazmidot transzformáljuk. Bizonyos esetekben azonban a plazmid több ezer kópiát is képezhet sejtenként magasabb hőmérsékleten. Mindenesetre a plazmid DNS-tartalom nagy hőmérsékleten a teljes DNS tartalomhoz viszonyítva mintegy 40-75%, általában 50-60%.

A találmány szerinti plazmidok egy másik típusa egy olyan plazmid, amelynek kópiaszáma 3-5/sejt az egyik hőmérsékleten, pl. 30 °C hőmérsékleten, és kópiaszáraa szabályozatlan, legalább 500-1000 kópia/sejt tartományban van a fentebb körvonalazott tényezőktől függően, és bizonyos esetekben a több ezer kópia/sejt értéket is eléri nagyobb hőmérsékleten, pl. 42 °C hőmérsékleten. Ilyen plazmidokat lehet nyerni úgy, hogy a szabályozható promotert a plazmid természetes replikációt szabályozó génje(i)vel ellentétes irányban iktatjuk be. A jelen leírás és igénypontok céljaira az ilyen plazmidot B típusú plazmidnak jelöljük. Rl plazmid származék esetében a szabályozható promotort mind a cop B, mind a cop A génekkel ellenkező irányban iktatjuk be, ügy mindezek a természetes replikációs inhibitorok megőrződnek, amely azt eredményezi, hogy a plazmidok a fentebb említett kópiaszám sablont mutatják. Ha azonban a plazmid olyan, amelyből a pár terület hiányzik (ennek a megosztásért felelős területnek a jelenléte a plazmidban olyan hatást okoz, hogy a plazmid stabilan öröklődik; ez a hatás a pár területen levő egy vagy több génnek tudható be), a plazmid kb. 1%/generáció gyakorisággal elvész az alacsony hőmérsékleten az alacsony hőmérsékletnél levő kis kópiaszám miatt. Következésképpen előnyös lenne a pár területet beiktatni egy ilyen plazmidba, ilyen módon biztosítani, hogy a plazmid .megvaduló replikációja ezt követően végbe tudjon menni a populáció minden sejtjében.

A B típusú plazmidnak a nagy kópiaszámú tartománnyal szemben további előnyei vannak. Mivel a kópiaszám alacsony hőmérsékleten nagyon kicsi, lehetséges olyan idegen géneket beiktatni a plazmidba, amelynek termékei részben toxikusak (csökkentve a növekedési sebességet) vagy akár letálisak is lehetnek arra a mikroorganizmusra, amelybe a plazmidot transzformáljuk. Ez néha előfordul az eukarióta génekből származó termékek esetében, amelyek általában a legérdekesebbek, pl. a gyógyszeripar területén. Az alacsony hőmérsékleten levő kis replikációs sebesség miatt az idegen gének vagy egyáltalán nem fejeződnek ki, vagy csupán igen kis mennyiségben, úgy, hogy a sejtek ezáltal nem károsodnak és kis hőmérsékleten normális feltételek mellett növekedhetnek. Ez nagymértékben növeli vagy megkönnyíti bizonyos polipeptidek előállításának folyama-47

HU 201116 Β tét, amelyeket egyébként nem vagy csak nagy nehézségek árán lehet előállítani.

A találmány szerinti plazmidok egy harmadik típusa egy olyan plazmid, amelynek kópiaszáma 0,5-1 kópia/sejt tartományban van (a 0,5 számot úgy kell érteni, hogy a replikáció frekvenciája kevesebb, mint egy sejt/ciklus) az egyik hőmérsékleten, pl. 30 °C hőmérsékleten, és szabályozatlan a kópiaszáma, vagyis legalább 500-1000 kópia/sejt tartományban van, a korábban körvonalazott tényezőktől függően, és bizonyos esetekben elérheti a több ezer kópia/sejt értéket, magasabb hőmérsékleten, pl. 42 °C hőmérsékleten. Ilyen plazmid lehet egy olyan plazmid, amely a replikációs területen azt a szabályozható promotort hordozza, amelyből az egyik természetes replikációs szabályozó gén egy része ki lett iktatva, amely azután be lett iktatva a replikációs területen kívül, azaz egy olyan helyen, ahol természet szerint nem helyezkedne el. A jelen leírás és igénypontok céljára ezt a plazmidot C típusú plazmidnak nevezzük. Rl plazmidszármazékok esetében, amelyből a cop B gén ki lett iktatva, a cop B gént újból beiktatjuk, nem eredeti helyére, hanem az EcoRI helynél, a replikációs területen kívül.

A cop B inhibitor fehérje ugyan befolyásolja a plazmid replikációját, de olyan- módon, hogy a plazmid a fentebb említett kópiaszám-sablont mutatja. Ha azonban a plazmid olyan plazmid, amelyben a pár terület hiányzik, a plazmid kb. 5%) generáció gyakorisággal elvész alacsony hőmérsékleten a rendkívül kicsiny kópiaszám miatt. Következésképpen ennél a plazmidnál még előnyösebb, mint a B típusú plazmidok esetében, pár területet iktatni a plazmidba, hogy biztosítani tudjuk, hogy a plazmid „megvaduló replikációja ez után megtörténhessen a populáció .minden sejtjében. A replikációs viselkedés a kis illetve nagy hőmérsékleten, emiatt ennek a plazmidnak az előnyös alkalmazása egyébként hasonló a B típusú plazmid tulajdonságaihoz.

A találmány egy második megjelenési formája egy olyan plazmid ra vonatkozik, amelyben a replikációs területből történő átírást szabályozó első szabályozható promotoron kívül egy második promotor is be van iktatva olyan módon, hogy ez lehetővé teszi egy olyan strukturgén beiktatását, amelynek kifejeződését a második promotor szabályozza. Ez a második promotor szabályozható, vagyis lehetséges szabályozni a funkcióját azoknak a körülményeknek a beállításával, amelyek között a gazdasejt növekszik, hasonló módon, mint ahogyan az első szabályozható promotor szabályozásánál történt. Egy sor promotort lehet jelenleg használhatónak ítélni erre a célra, mint pl. a lac promotort, trp promotort, deo promotort, rec A promotort, aPl promotort, stb. A aPl promotor bizonyulhat különösen előnyösnek máso6 dik promotorként a strukturgén kifejeződésének szabályozására, mivel ezt is a hőmérsékletérzékeny cl represszor szabályozza és ezért a mennyiség-növelési feltételek azonosak, úgy, hogy a gazdasejt tenyésztése egyszerűsödik és a termék-mennyiség-növelés párhuzamosan történik a plazmid DNS menyny iség-növelésé vei.

A második promotort be lehet iktatni az A, B és C típusú plazmidokba egyaránt. Egy ilyen plazmid konstans, kis kópiaszámmal rendelkezik, és nagyon kevés a gén-kifejeződés 30 °C hőmérsékleten, vagy egyáltalán nincs, és az ezt követő megnövekedett vagy szabályozatlan plazmid kópiaszám és génkifejeződés van jelen a 36-42 °C hömérséklet-tartományban. Előnyösen a plazmidnak 39 °C fölötti hőmérsékleten van szabályozatlan kópiaszáma és nagyon nagy gén-kifejeződése.

A találmány szerinti plazmidokat fel lehet használni klónozó és termelő vektorként, vagyis a plazmidokat fel lehet használni a rekombináns DNS technológia területén technikai és orvosi célú termékek széles választéka nyerésének céljából; közülük a polipeptidek és fehérjék vagy ezek fragmensei, enzimek és az enzimek reakcióinak nem fehérje-szerű termékei a tápközegben levő vegyületből, kis molekulatömegű termékek, mint pl. hormonok és nukleinsavak; eukarióta, főként emlős gének termékei a különösen érdekesek. Klónozó vagy termelő vektorként történő felhasználáshoz előnyös, de nem kötelező, ha a plazmid, legalább egy restrikciós endonukleáznál, egy ezzel az endonukleázzal hasítható egyedi hellyel rendelkezik. Ez a hely legyen olyan hely, amely az idegen DNS fragmens beiktatásánál engedje meg a keletkezett rekombinéns plazmid autonóm replikálódását, és engedje meg a plazmidba beiktatott szabályozható promotornak, hogy szabályozza a replikációs terület átírását, ilyen módon - amikor az átírás ebből a promotorból növekszik - egy lényegesen megnövekedett vagy szabályozatlan plazmid-kópiaszámhoz vezetve. A replikációs területen elhelyezkedő restrikciós helyek igy nem fogadhatók el klónozó helyekként, mivel ez a plazmidban a replikációs tulajdonságok elvesztését okozná.

A találmány szerinti plazmidot olyan módszerrel hozzuk létre, amely magában foglalja egy szabályozható promotor beiktatását egy plazmidba oly módon, hogy az ebből a promotorból történő átírás szabályozza a replikációt, valamint az így kezelt plazmid azonosítását olyan módon, hogy kiválogatjuk (screeneléssel) azokat a plazmidokat, amelyek lényegesen megnövekedett vagy szabályozatlan plazmid-kópiaszámot mutatnak, amikor a promotorból történő átírás növekszik. Amikor a szabályozható promotor aPb, ezt be lehet iktatni a megfelelő endonukleázzal hasított plazmid és a fág DNS összekeverésével, hőinaktiválásával, és a keverék kötésével (liga—

HU 201116 Β ció jával), és a kötött keverék transzformálásával egy mikroorganizmusba.

Az ilyen plazmidok létrehozását végre lehet hajtani a promotor véletlenszerűen végzett beiktatásával a plazmid különböző helyeire. A korrekt beiktatás azonosítható a szabályozatlan replikációs viselkedésű plazmidok válogatásával (screenelésével) a szabályozható promotorból történő megnövekedett átírást biztosító körülmények között. Az ilyen plazmidok egyszerű válogatása a plazmid- hordozó sejtek különböző körülmények közötti növekedési tulajdonságainak elemzéséből áll. A plazmid DNS mennyiségét a gazdasejtben különböző módon lehet mérni, elsősorban agaróz gél elektroforézis segítségével, ismert módon. A kiválogatási módszer könnyen és gyorsan elvégezhető.

A találmány egyik speciális megvalósítási módja szerint, amely az A típusú plazmidok megalkotására vonatkozik, a konstrukciós módszer magában foglalja egy természetes szabályozó gén egy részének és promotorának kiiktatását, Rl plazmidböl eredő cop B gén esetében Bgl II restrikciós enzimmel hasítva, és ennél a helynél egy DNS fragmens, például egy Bgl II fragmens beiktatását, beleértve a szabályozható promotort is.

A találmány egy másik megvalósítási módja szerint, amely a B típusú plazmidok megalkotására vonatkozik, a konstrukciós módszer magában foglalja a szabályozható promotor beiktatását a plazmidba a természetes replikációs szabályozó rendszerrel ellenkező irányban, az Rl plazmid-szérmazékok esetében a Bgl II helynél a cop B génnel ellentétes irányban egy részleges hasítás útján Bgl Π-vei, majd az összekötést (ligációt) és a transzformációt a szóban forgó mikroorganizmusba, mint pl. E. coliba. Egy más módszer szerint a plazmidot úgy is megalkothatjuk, hogy a részlegesen kiiktatott természetes szabályozó génnel rendelkező A típusú plazmidot használjuk kiindulási anyagként, és a természetes szabályozó gént visszaiktatjuk eredeti helyére, Rl típusú plazmidok esetében a cop B gént iktatjuk vissza a Bgl II helynél.

A találmány egy harmadik megvalósítási módja, amely C típusú plazmidok megalkotására vonatkozik, magában foglalja, A típusú plazmidot használva kiindulási anyagként, egy természetes szabályozó gén beiktatását a plazmidnak egy olyan területébe, ahol ez a vad-típusú szülőtörzsben nem helyezkedik el; Rl típusú plazmidok esetében a cop B gén beiktatását EcoRI fragmensként az EcoRI helynél a plazmid replikációs területén kívül EcoRl-vel történő hasitás segítségével, majd összekötést és transzformációt.

A találmány egy negyedik megvalósítási módja magában foglalja a szabályozható promotor beiktatásán kívül egy második promotor beiktatását is a megfelelő restrikciós helynél, igy lehetővé téve egy strukturgén beiktatását, amelynek kifejeződése a második promotorból szabályozható. Amint fentebb már említettük, ez a hely nem lehet a plazmid replikációs területén belül elhelyezve.

A találmány szerinti plazmidok miniplazmidok, azaz észrevehetően kisebbek, mint a vad-típusú szülő-plazmidok. Általában méretük kb. 2,5-15,0.10® dalton tartományban, gyakran 2,5-10,0.10® dalton tartományban, szokásosan 4,0-12,5.10® dalton tartományban, különösen 4,0-5,0.10® dalton tartományban van.

Az ismert . megvaduló plazmidok szabályozatlan replikációs viselkedése, ügy tűnik, függ a szóban forgó baktériumtörzstől, amelybe azokat transzformálják, és a tápközegtől, amelyben a baktérium növekszik, valamint a beiktatott DNS-től. Ez a függőség valószínűleg annak a ténynek tulajdonítható, hogy az ismert plazmidok .megvaduló replikációs viselkedését részben egy egyedi nukleotid helyettesítése okozza a cop B promotorban, enyhe növekedést idézve elő az átírási sebességben, amelyet a környezeti változások, figyelemmel az érintett baktérium fajra és törzsre és/vagy a tenyészet tápközegére, valamint a plazmidba beiktatott idegen plazmidok befolyásolnak. A találmány szerinti plazmidok nem tűnnek hasonlóképpen korlátozottnak, mint az erős idegen promotorok, és amikor aktiváltak vagy derepresszáltak, növelik az átírási sebességet olyan mértékig, hogy az ilyen változásoknak nincs jelentőségük. Következésképpen ezeket a plazmidokat a törzsek széles választékába lehet transzformálni és ezek sokkal megbízhatóbban kezelhetők, mint az ismert .megvaduló plazmidok.

A jelen találmány kiterjed azokra a plazmidokra is, amelyek Rl-től eltérő vad-típusú plazmidokból származnak, és/vagy más plazmid-befogadó mikroorganizmusban találhatók, mint az E. coli. Lehet olyan fentebb leírt típusú plazmid megalkotását kitűzni célul, amelyet olyan mikroorganizmusban lehet fenntartani, amely természet szerint nem fogad be plazmidokat. Több különböző mikrobiális plazmid replikációs rendszeréről mutatták ki, hogy több szempontból hasonlók. így pl. az összes ismert plazmid átírást igényel, ha replikációt kell végrehajtani. A találmány alapelvének hasznosításával lehetővé válik a szabályozatlan replikádé fenotipusát másik plazmidokba átvinni, úgy, hogy azok a plazmidok, amelyek klónozó faktorként mór használatban vannak és ismertek abból a szempontból, hogy jól műkődnek a kívánt mikroorganizmusban, .megvaduló viselkedést szerezhetnek. így egy szabályozható promotor, pl. λΡη beiktatásával a megfelelő helynél ilyen plazmidba - olyan módon, hogy az átírás ebből a promotorból szabályozza a replikációt - szabályozatlan replikáció megy végbe olyan körülmények között, amelyek a promotorból megnövekedett átírást biztosítanak.

-611

HU 201116 Β

Rl-típusú plazmidok replikációs szabályozó rendszere.

Az alap-replikon

A legutóbbi időkig az Rl típusú plazmidok replikációs szabályozó rendszere nem volt ismeretes. Azt találtuk, hogy az Rl plazmid replikációjához és a replikáció szabályozásához szükséges genetikai információt egy 2500 bázispár hosszúságú terület hordozza, amely három, a rezisztencia-átviteli faktoron belül elhelyezkedő Pst I fragmenst tartalmaz (Molin és munkatársai, J. Bact. 138, 1979, 70-79).

Ezt a területet alap-replikonként definiáljuk, ez négy fontos elemet tartalmaz, három gént (cop A, cop B és rep A) és a replikációs beindítást (Molin és munkatársai: Microbiology, 1981, 408-11). Az alap-replikon fizikai, genetikai és működési térképét az 1. ábrában mutatjuk be. A rep A gén kódolja azt a funkciót, amely pozitívan szükséges a replikációhoz. A gén-termék (a DNS-szekvencia alapján) egy 278 aminosavból álló fehérje, amelynek molekulatömege kb. 33000 dalton (Rosen és munkatársai: Mól. Gén. Génét. 179, 1980, 927-37). Ezt a fehérjét egyértelműen még nem azonosították, de az a képesség, hogy fehérjét képezzen a rep A génből, világosan demonstrálva van az átíró gén lac Z génnel történő fúziójának alkalmazásával (Light és Molin: Mól. Gén. Génét. 184, 1981, 56-61). A Rep A fehérje biokémiai funkciója még nincs teljesen feltárva, de úgy vélhető, hogy a Rep A fehérje egy replikációt beindító faktor.

A cop A gén egy kis (80-90 nukleotid hosszúságú) nem stabil RNS molekulát kódol, amelynek nagy méretű szekunder szerkezete van (azaz hajtű-hurkokat képez) (Stougaard és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78, 1981, 6008-6012). A Cop A-RNS a replikáció inhibitora; a Cop A-RNS nukleotid-szekvenciájára ható mutációk egy megnövekedett kópiaszámhoz vezethetnek (cop-mutánsok). A cop A mutánsok DNS-szekvencia-analízise azt mutatja, hogy minden mutáció meglepően a hurok-területen csoportosul 5 bázison belül. Ezek a mutációk a vad-tipusú plazmid elleni inhibitor-aktivitás drasztikus csökkentését vagy teljes elvesztését eredményezik. Ezért arra a következtetésre jutottunk, hogy az inhibitor-fajlagosság a hurokban foglal helyet. Az is meglepő, hogy az összes cop A mutánsban, amelynek nukleotid-szekvenciája ismert, a Cop A-RNS-ben levő citozin uracillal van helyettesítve (vagy, egyetlen esetben, adeninnel). Ez erősen sugallja, hogy a Cop A-RNS nukleinsav/nukleinsav interakcióval működik. Ezt a következtetést tovább erősíti az a tény, hogy még azok a cop A mutánsok, amelyek az összes Cop A aktivitást elvesztették a vad-típusú plazmidok ellen, megőriznek bizonyos Cop A aktivitást egymás ellen. Sőt, a vad-típusú Cop A-RNS a leggyakrabban csökkenti az inhibitor-hatást a cop A mutáns plazmidok ellen. Ennél fogva egy cop A mutáns nem csupán az inhibitorban változik, hanem a cél-tárgyban, a cop T-ben is; egy egyedi bázis-helyettesítés így egy olyan végeredményhez vezet, amely fenotípusosan kettős mutáns.

A cop B gén egy 86 aminosavból álló, 11000 dalton molekulatömegü alap-fehérjét kódol. Ezt a fehérjét jelentős mennyiségben képezi. A cop B gén kiiktatása a promotorjából nyolcszoros növekedéshez vezet a kópia-számban; ennél fogva arra a következtetésre lehet jutni, hogy a cop B fehérje replikációs inhibitorként hat, azaz az Rl plazmid replikációjának szabályozásában negatívan működő szabályozó elemként (Molin és munkatársai: Mól. Gén. Génét. 181, 1981, 123-30).

Egy kettős mutáns (cop A cop B) feltétlenül letális hatású a gazda-mikroorganizmusra az úgynevezett .megvaduló’ replikáció következtében. Ennél fogva a két szabályozó gén-termék szinergetikusan működik.

Átírási aktivitás az alap-replikonban

Három átírást beindító hely van az alap-replikonon belül: cop B promotor, a rep A promotor (Light és Molin: Mól. Gén. Génét. 184, 1981, 56-61) és a cop A génhez tartozó promotor (Stougaard és munkatársai, korábban idézett közlemény). Az utóbbi a kezdő (origin) területtől távol ir át, mig a két előbbi a kezdő terület felé ír át. Következésképpen mindkét szál a cop A területen íródik át. A Cop B átírás folytatódik a cop B génen túl, és ez az átirat, valamint az az átirat, amely a rep A promotornál indul, mindketten átírják a rep A gént.

A Bgl Π-vel történő hasítással létrehozott cop B génkiiktatás 8-10-szeresen megnövekedett Rl plazmid kópiaszámot eredményez. Ez meglepő, mivel a cop B gén promotort és a cop B strukturgén központi részét kiiktatjuk, amely azt eredményezi, hogy 1.) a cop B aktivitás és a rep A promotor derepresszió elvész, és 2.) a cop B promotor részesedése a teljes rep A kifejeződésre elvesz úgy, hogy a derepresszált rep A promotor eredményesen átvállalja a teljes rep A átírást a cop B promotorból. A teljes hatás csupán kétszeres növekedés lehetne a rep A gén átírásának sebességében, mivel a rep A promotornak olyan az erőssége, amely kétszeresen niegnövekedett a cop B promotor erősségéhez viszonyítva.

Ezt a nyilvánvaló ellentmondást a cop A gén aktivitása magyarázza. A Cop A-RNS egy normál befejező szerkezetben végződik egy nyél-végződéssel az U-k sorozatában. A Rep A fehérje képződésének Cop A-RNS eredetű szabályozása az ilyen megfelelő végződéstől függ. Ha az ellentétes szál átírása erős (konvergens átírás), a végződés hatékonysága csökken. A rep A promotorból származó megnövekedett átírás a Cop A átirat kiterjesztését eredményezi kb. 150-200 nukleotiddal. A kiterjesztett Cop A átirat nem funkcionál

-713

HU 201116 Β replikációs inhibitorként, azaz jelentősen inaktiválódott, megnóvekedett mennyiségű Rep A fehérjéhez és esetleg megnövekedett plazmid kópiaszámhoz vezetve (Stougaard és munkatársai: EMBO Journal 1, 1982, 323-328).

A replikáció szabályozása

A két gén, a cop A és cop B termékei negatívan szabályozzák az Rl plazmid replikációját, azaz replikációs inhibitorként funkcionálnak. A rep A-lac fúziók megalkotása és analízise során az volt demonstrálható, hogy a két cop géntermék a rep A gén kifejeződésének negatív szabályozásával működik (Light és Molin: Mól. Gén. Génét. 184, 1981, 56-61). Ennél fogva az Rl plazmid replikációját, úgy tűnik, egy olyan fehérje képződésének szabályozásával lehet szabályozni, amely pozitívan szükséges - valószínűleg a plazmid replikációjának beindításához.

A lac gén fúziók segítségével az is demonstrálható volt, hogy a cop A és cop B termékeknek más a célpontjuk. A Cop B fehérjéhez tartozó célpont a rep A promotor, ahol ez az átírás beindításának gátlásával működik. A Cop B fehérje azonban képtelen kölcsönhatásba lépni a rep A promotorral ellenkező irányban megkezdett átírással. A Cop A-RNS nem hat az átírásra, hanem az átírás utáni szinten működik, azaz a Rep A-mRNS fordítás gátlásával.

A .megvaduló mutánsok replikációja

A 78.101 877.5 számú, publikált Európa Szabadalom bejelentésben foglalt plazmidok replikációs rendszere lényegileg azonos a fentebb leírtakkal a vad-tipusú Rl plazmidokra való tekintettel. A jelen feltalálók mostani kutatásai részben megállapították az okét a .megvaduló replikációs viselkedésű, hőmérséklet-függő plazmid-mutánsok létezésének. Amint korábban magyaráztuk, a megnövekedett átírás a rep A gén felé a Cop A RNS molekula inaktiválódásához vezethet. A fentebb említett szabadalmi bejelentésben foglalt .megvaduló mutáns plazmidokban a cop B promotor mutációt szenved, a szekvenciában egy egyedi nukleotid helyettesítésével, amint ez a következőkben látható:

a. ) vad típusú plazmid: 5’-...... TTC TCA

AGT (Cj GCT ...-3'

b. ) .megvaduló plazmid: 5’-...... TTC TCA

AGT B GCT ...-3’.

A bekeretezett jelek mutatják a nukleotidhelyettesítést. A fent ábrázolt terület az RNS polimeráz kötő-hely.

Úgy találtuk, hogy a mutáció okozza a cop B promotor megnóvekedett átírását, elsősorban magasabb hőmérsékleteken.

Szabályozható promotort hordozó plazmidok replikációja.

A jelen találmány szerinti plazmidok megalkotásában a feltalálók nemrégiben a vad-típusú Rl plazmid replikációs rendszeréről megszerzett ismereteiket hasznosították. A jelen találmány szerinti plazmidok replikációja azonban nem a plazmid bán történó mutációra támaszkodik, mint a publikált 78.101 877.5 Európa Szabadalom bejelentésben foglalt .megvaduló* plazmid esetében. E helyett egy idegen promotor van beiktatva úgy, hogy a replikációs terület átírását legalábbis részben ebből a promotorból szabályozzák. A promotor szabályozható lehet azoknak a körülményeknek a beállításával, amelyek között a gazda mikroorganizmus növekszik, és a promotor aktivitás szabályozására különböző módokon lehet hatni, mint pl. a tenyésztési hőmérséklet vagy a nővesztő tápközeg-összetétel változtatásával.

Amikor a szabályozható promotor olyan, amelyet a hőmérsékletfüggő promotorok csoportjából választottunk ki, előnyös egy olyan promotor, amely a Λ bakteriofágból származik, mint pl. a aPb vagy aPl, előnyösen a aPb. A λ fágban a Pb promotor a cl represzszorral szabályozható, amely a találmány alapelveivel összhangban a λ fágböl származik a APu-rel együtt, és amely egy plazmidba van beiktatva egy Bgl II fragmens formájában (lásd a mellékelt plazmid-térképeket a 4-11. ábrákban). A vad-tipusú cl represszor önmagában nem hőmérséklet-érzékeny, igy abból a célból, hogy a replikációs rendszert a tenyésztési hőmérséklet beállításának segítségével szabályozhatóvá tegyük, a fajlagos cl represszort (lásd a következő példát), amelyet a cl857 mutáns alléi kódol, alkalmazzuk (Sussnian és Jacob: Compt. Rend. Acad. Sci. 254, 1962, 1517). A represszor aktív, azaz represszálja a aPr promotort, alacsony hőmérsékleten, pl. 30 °C hőmérsékleten, míg magasabb hőmérsékleten, pl. 39 °C hőmérséklet fölött ez denaturálódik és a represszor funkció inaktiválódását és a aPb derepreszszióját idézi eló. Mivel a beiktatott promotor igen erős, ez drasztikusan megnövekedett átírást eredményez a rep A irányában, amely viszont a szabályozatlan plazmid-replikációhoz vezet.

Egy másik változat szerint a promotor szabályozására kémiai úton lehet hatni, azaz vagy azon tápközegnek összetételének a beállításával, amelyben a gazda-mikroorganizmus nő, vagy a promotort indukáló kémiai anyag hozzáadásával, pl. a promotor aktivitását és következésképpen a promotor derepresszióját szabályozó represszor inaktiválását idézve eló vagy egy, a promotor aktiválásához vezető promotor-indukáló metabolit képződését biztosítva. A kémiailag indukálható promotorokra jellemző példa az E. coli-ból származó deo promotor, amely két kromoszómáiig represszor-fehérjével, a deo R és cyt R gének termékeivel történő negatív szabályozás tárgya. A deo promotort a citidinnek a növesztő tápközeghez történő hozzáadásával lehet derepresszálni, mivel a citidin affinitást mutat a represszorhoz, konformációs változásokat okozva azon úgy, hogy a represszorként való működését beszünteti. Ezen felül pozitív szabályozást is ki lehet

-815

III) 201116 Β fejteni a deo promotorból származó kifejeződésre a katabolit represszió hatásán keresztül. A crp (katabolit represszor fehérje) aktiválása ciklikus AMP-vel (cAMP) a deo promotor aktivitás stimulálását eredményezi; a cAMP nagy celluláris szintjéről ismeretes, hogy korrelációban van a glükóz alacsony szintjével vagy hiányával a növekedési tápközegben, ezt úgy lehet elérni, hogy csak korlátozott mennyiségű glükózt adunk a tápközeghez, azaz mintegy 0,01% mennyiségét, más szénforrásokkal, pl. glicerinnel vagy szukcináttal együtt. Amikor a glükózt elfogyasztotta a sejt, ez a cAMP sejten belüli szintjének emelkedését eredményezi, amely viszont aktiválja a deo promotort, a promotort hordozó plazmid megnövekedett replikációs sebességéhez vezetve. így ha a deo promotort beiktatjuk a cop B génnel ellenkező irányban az Rl plazmid származékba, a promotor indukciója megnövekedett vagy teljesen szabályozatlan replikációhoz vezet. A szabályozatlan replikációs viselkedést vissza lehet fordítani glükóz hozzáadásával a nővesztő tápközeghez úgy, hogy a plazmid kópiaszáma lassan lecsökken az indukció előtti szintre. A kémiailag szabályozható promotorra egy másik példa a lac promotor, ' amelyet a laktóz jelenléte indukál a tápkőzegben, és amely megnövekedett vagy szabályozatlan replikációhoz vezet. Ebben az esetben is visszafordítható a folyamat a tápközeghez tett laktóz mennyiségének olyan mértékű adagolásával, hogy azt a sejt minden esetben elfogyassza.

A szabályozható promotort hordozó DNS megfelelő helyzetben és irányban történő beiktatása egy természetes replikációs szabályozó gén egy részének helyébe, pl. az Rl plazmid cop B génjének egy részét fedő Bgl II fragmens helyébe, egy olyan plazmid-szérmazékot eredményez, amelynek replikációs sebességét legalább részben a beiktatott promotor szabályozza (A típusú plazmid).

Egy, a természetes replikációs szabályozó génnel, Rl plazmid származékok esetében a cop B génnel, közvetlenül ellenkező irányú szabályozható promotort hordozó DNS fragmens beiktatása egy olyan plazmidot eredményez, amelynek replikációs tulajdonságai kissé különbözőek (B típusú plazmid).

Amint fentebb említettük, a B típusú plazmidok, amelyek nem tartalmaznak pár területet, mintegy 1%/generáció gyakorisággal elvesznek. A plazmid jelenlétére történő szelekció nélkül a tenyészetben a plazmid végül el is tűnik a kb. 30 “C hőmérsékleten nőtt sejtekből. Abból a célból, hogy a plazmidot stabilizáljuk, lehetséges egy pár területet hordozó DNS fragmens beiktatása pl. egy vad-típusú Rl plazmidból egy B típusú plazmidba, amely a hasonló körülmények között növesztett sejtekből eredé plazmid teljes (veszteség nélküli) stabilitásához vezet. A plazmid stabilitását úgy lehet meghatároz10 ni, hogy olyan B típusú plazmidot tartalmazó sejteket, amely plazmidba lac gént, valamint pár területet iktattunk be, és kontrollként lac gént hordozó, de pár területet nem hordozó B típusú plazmidot tartalmazó sejteket szelektíven növesztünk antibiotikumot (amelyre a plazmid rezisztenciát közvetít) tartalmazó lemezeken, hogy mindkét fajta plazmid jelenlétét biztosítsuk a kiindulási telepek közt. Mindkét telep mintáit semmiféle antibiotikumot sem tartalmazó lemezekre szélesztjük úgy, hogy a sejteket hagyjuk nőni generációk (sejt-kettózódések) során, pl. 25 generáción keresztül. Végül az így keletkezett telepek mindkét fajtájából származó sejteket McConkey laktóz indikátor lemezekre szélesztjük, ahol azok a sejtek, amelyek eredetileg is tartalmaztak pár területet hordozó plazmidokat, vörös telepeket képeznek, ez azt mutatja, hogy a plazmid megőrződött, míg a kontroll sejtek, amelyek eredetileg pár terület nélküli plazmidokat tartalmaztak, mind vörös, mind színtelen telepeket képeztek, amely azt jelenti, hogy a szelekció-mentes periódus során a plazmid jónéhány sejtből eltűnt, igy azt lehet demonstrálni, hogy azok a plazmidok, amelyekbe pár terület volt beiktatva, tökéletesen stabillá váltak (lásd 11. példa). Ez a stabilizáló hatás különösen fontos, ha egy beiktatott DNS fragmens csökkenést okoz a plazmid-hordozó sejt növekedési sebességében a plazmid-mentes sejtekhez viszonyítva.

Végül a természetes replikációs szabályozó gént, pl. az Rl plazmid cop B génjét hordozó DNS fragmens beiktatása egy, az A típusú plazmid replikációs területein kívüli helyre egy különleges replikációs tulajdonságú plazmidot eredményez (C típusú plazmid).

A fentebb leírt B plazmidokra vonatkozó plazmid-stabilitási szükségesség még sokkal hangsúlyozottabb ott, ahol C típusú plazmidokról van szó, mivel ezek, mint korábban említettük, még kisebb kópia-számmal rendelkeznek alacsony hőmérsékleten, és ezért nagyobb gyakorisággal tűnnek el, mint a B típusú plazmidok, ha a par-területük hiányzik. A C típusú plazmidokat hasonló módon lehet stabilizálni, vagyis a pár terület beiktatásával a plazmidok ba olyan plazmidok esetében, ahol az még nincs jelen.

A találmány egy sajátos megvalósítási módja szerint a plazmid az első szabályozható promotoron kívül egy második promotort is hordoz, amely a replikációs területen kívül helyezkedik el, ez a második promotor egy beiktatott strukturgén kifejeződését szabályozza, amely pl. egy kívánt polipeptidet kódol. Ez a második promotor lehet pl. a cl promotor, amely a λΡβ promotort ée a £l gént is hordozó fragmensen helyezkedik el, amely cl promotort a cl gén terméke szabályozza, és amely cl promotor a APg-rel ellenkező irányban ir át. A cl promotorral egy

-917

HU 201116 Β irányban lehetséges beiktatni egy olyan strukturgént, amelynek kifejeződése ezzel a promotorral szabályozható. Példaként: egy lac promotor nélküli lac gént (amely lac operonként ismeretes) beiktatunk a cl génnel azonos irányban, és a nyert gén termék menynyiségnövekedés azt sugallja, hogy a lac gének átírását, legalábbis részben, a ci promotor szabályozza (lásd 8. példa). Így az volt demonstrálható, hogy a találmány szerinti plazmidokat lehet klónozó vektorként használni egy idegen gén beiktatásánál. A cl promotornak az az előnye, hogy a cl represszorral is szabályozható, így a gén-termék mennyiségi növekedése párhuzamosan megy végbe a plazmid DNS mennyiség-növekedésével.

A második promotor szintén lehet a promotor, mint pl. APl, vagy lehet rec A promotor. Amikor a második promotor aPl, ezt be lehet iktatni egy plazmidba pl. a fágból származó Bam Hl- Bgl II fragmensbe, így egy kellemes klónozó helyet alakítva ki (Bam Hl) számos restrikciós enzimmel, pl. Bam Η 1-gyel, Bgl II-vel, Sau 3 A-val és Bel I-gyel kialakított DNS fragmensek beiktatásához. A APL-et szintén be lehet iktatni egy promotort hordozó plazmádból eredő megfelelő DNS fragmensbe. aPl előnyős második promotorként, mivel ez is szabályozható hőérzékeny cl represszorral úgy, hogy a mennyiség-növelési feltételek azonosak.

Másrészt ha a promotor rec A, azt be lehet iktatni a találmány szerinti plazmidba mint pl. pBEU14-ből (Uhlin és Clark: J. Bact. 148, 1981, 386-90) származó Bam Hl fragmenst. Ez a promotor különböző módokon funkcionál, a mikrobiológiai törzstől függően, amelybe a rec A promotor-hordozó plazmidot transzformáljuk. Egy rec A törzsben a rec A-t a lex A represszor szabályozza, amely a mikroorganizmus kromoszómáján helyezkedik el. Egy szabályozatlan replikáció hőmérséklet-indukciójánál pl. a plazmid kópiaszáma és ezáltal a rec A promotorok száma fokozatosan növekszik. Mivel a lex A represszor csak kis mennyiségben termelődik, és szorosan a rec A promotor területhez kapcsolódva funkcionál, a lex A represszor rendelkezésre álló mennyiségét fokozatosan kell titrálni, amikor a kópiaszem növekszik, igy a rec A fokozatos derepressziója lép fel, és amikor a plazmid kópiaszáma nagyobbá válik, a rec A-ból történő átírás ennek megfelelően növekszik.

A találmány szerinti plazmidok, mint klónozó és termelő vektorok.

A klónozó és termelő vektor-képességükben a találmány szerinti plazmidok számos jellemző tulajdonsággal bírnak:

1. ) A plazmidok kis molekulatömegűek (4,0-12,5.10® dalton). A kis méret megkönnyíti a kezelést és javítja a transzformáció hatásosságát.

2. ) A plazmidok több egyedi hellyel rendelkeznek restrikciós endonukleázokhoz. Az .egyedi kifejezést úgy kell érteni, hogy egy fajlagos restrikciós endonukleázhoz a plazmid egy és csak egy, az enzimmel hasítható hellyel rendelkezik.

3. ) Amint korábban említettük, a replikációs területen belül elhelyezett restrikciós területek nem engedhetők meg, mint klónozó helyek. így a következő példákban leirt plazmidokban a Sal I és Pst I restrikciós helyek nem felelnek meg klónozó helyekként, mivel ezek a plazmid replikonjában helyezkednek el, mig az EcoRI és BamHI restrikciós helyek nem ezen a kritikus területen belül helyezkednek el és igy hasznos helyeket képeznek az idegen DNS bevezetéséhez. Ha nem található megfelelő restrikciós hely magában a plazmidban, azt egy kis, ilyen helyet tartalmazó DNS fragmens (amely .összekötő-ként, vagy .linker-ként ismeretes) plazmidba történő beiktatásával ki lehet alakítani, ahogy ezt a 4. példában leírjuk. Abból a célból, hogy a beiktatott strukturgén kifejeződését biztosítsuk, szükséges egy megfelelő átírási indító (start) jellel (riboszomális kötőhely, rendelkezni, amely magával a strukturgénnel ellenkező irányban, de a második promotorral azonos irányban helyezkedik el. A riboszomális kötőhely jelenléte biztosításának egyik útja DNS-fragmensek választékának (pl. kötőhelyenként történő) beiktatása, amely DNS fragmenseket el lehet készíteni szintetikusan, és amelyek mind hordoznak egy eltérő strukturgénhez tartozó átírási start-jelet. Egy más módszer szerint egy olyan gént hordozó DNS fragmenst, amely génről már ismeretes, hogy mikroorganizmusokban kifejeződik, beiktathatunk a .megvaduló klórozó vektorba, teljes egészében, így biztosítva a korrekt átírási start-jel jelenlétét.

4. ) Bár, amint fentebb említettük, előnyös, ha a klónozó vektor olyan kicsi, amilyen csak lehet, gyakorlati célokra az a célszerű, ha a klónozó vektor egy olyan gént is hordoz, amely a plazmidot hordozó sejtek azonosításához és/vagy szelekciójához használható úgynevezett .marker kifejeződésére szolgál. A leghasználhatóbb marker az antibiotikum-rezisztencia, pl. az ampicillin-rezisztencia, mivel ez lehetővé teszi, egy rekombináns piazmidnak a mikrobiális gazdasejtbe transzformálásához szükséges kezelés után, azoknak a mikroorganizmusoknak a könnyű kontraszelekcióját, amelyek nem fogadták be a rekombináns plazmidot. Egy másik marker, amely a következő példákban leirt plazmidok mindegyikében jelen van, a A immunitás, amelyet a cl gén kódol. A találmány szerinti plazmidokban egy további hasznos tulajdonság lehet egy olyan gén jelenléte, amely egy olyan szelektálható fenotípust közvetít, amelyen belül egy egyedi restrikciós hely helyezkedik el. Egy DNS fragmens beiktatása ennél a helynél a gén beiktatási inaktiválását eredményezi. Erre

-1019 HU írunk le példát a 9. példában, egy olyan génre vonatkozót, amely Lac* fenotipust közvetít, és a 12. példában egy olyan génre vonatkozót, amely klóramfenikol rezisztenciát kódol. Ha kívánatos egy marker, pl. antibiotikum-rezisztencia bevitele egy olyan találmány szerinti plazmidba, amelyet klónozó vektorként kívánunk használni, ezt egy idegen DNS fragniens áthelyezésével (transzponálásával, vagy beiktatásával lehet végrehajtani ismert módon. Ilyen transzponálásra a 4. példában található példa.

A tenyésztés módszerei A jelent találmány tárgya továbbá eljárás a plazmid DNS géntermékeinek előállítására, amely magában foglalja 1.) egy plazmidot hordozó mikroorganizmus tenyésztését - amely plazmidba egy szabályozható promotor van beiktatva olyan módon, hogy az átírás szabályozza a replikációt, előnyösen olyan módon, hogy ebből a promotorból eredő megnövekedett átírás egy jelentősen megnövekedett vagy szabályozatlan plazmid kópiaszámhoz vezet -, a módszer a tenyésztésnek legalább egy olyan periódusát tartalmazza, amely olyan körülmények között megy végbe, amely biztosítja a megnövekedett átírást a szabályozható promotorból jelentősen megnövekedett vagy szabályozatlan kópiaszámot eredményezve, és 2.) a mikrobiológiai tenyészetből a plazmid egy gén-termékének kinyerését. A tenyésztés önmagában megfelelően kivitelezhető hagyományos technikákat alkalmazva, beleértve a hagyományos tápközegeket is, amelyek optimálisak a szóban forgó faj esetén. A gén-termék kinyerését hasonlóképpen végre lehet hajtani a jól ismert módszerekkel, amelyeket hozzá lehet illeszteni a szóban forgó elkészített gén-termék tulajdonságaihoz, a gazda-mikroorganizmus tulajdonságaihoz, stb. A jelen találmány továbbá olyan módszerre vonatkozik, amely szerint a gazda-mikroorganizmust, amelybe a találmány szerinti plazmidot transzformáltuk, olyan körülmények között növesztjük, amely állandó, kis kópiaszámot eredményez az inokulálási és sokszorozódási szakaszban, amig a kivánt sejtszámot el nem érjük, majd a gazda-mikroorganizmust olyan körülmények között tenyésztjük, amely egy jelentősen raegnövekedett vagy szabályozatlan kópiaszámhoz vezet.

igy a tenyésztést először olyan körülmények között végezzük, ahol a promotorból eredő bármiféle átírás jelentősen nem befolyásolja a plazmid kópiaszámát, ez után egy olyan anyagot adunk a tápközegbe, amely indukálja a promotor-aktivitást, olyan menynyiségben, amely egy jelentősen megnövekedett vagy szabályozatlan replikációhoz vezet.

Ha kívánatos, ezeket a tenyésztési körülményeket vissza lehet fordítani egy olyan időtartam után, amely elegendő a plazmid jelentős mennyiség-növeléséhez, de elegendően rövid a mikrobiológiai tenéyszet bármiféle károsodásának elkerüléséhez, olyan módon, 12

B 20 hogy a vegyületet eltávolítjuk a tápközegből; ez a plazmid-kópiaszám lassú csökkenéséhez vezet egészen addig, amíg az ténylegesen eléri az indukció előtti szintet. Ebben a szövegösszefüggésben az .eltávolítjuk' kifejezés nem szükségszerűen jelenti a szóban forgó vegyület teljes távollétét a tápkőzegból, hanem csak csökkenést a vegyület koncetrációjában olyan mértékig, ahol ennek tovább mér nincs hatása.

Egy másik módszerben, amely bizonyos vegyületek által inkább gátolt, mint indukált promotort alkalmaz, a mikrobiológiai tenyészetet kezdetben a szóbanforgó alkalmazott promotor aktivitását gátló vegyület jelenlétében tenyésztjük, ez után a vegyület koncentrációját csökkentjük, pl. a tápközeg hígításával vagy a sejtek által történő fokozatos elfogyasztással olyan mértékig, amely a promotor aktiválásához vezet, így idézve elő egy jelentősen megnövekedett vagy szabályozatlan plazmid kópiaszámot. Ha kívánatos, a tenyésztési körülményeket vissza lehet fordítani egy olyan időtartam után, amely elegendő a plazmid jelentős mennyiségnöveléséhez, de elegendően rövid a mikrobiológiai tenyészet bármiféle károsodásának elkerüléséhez, olyan módon, hogy promotor aktivitást gátló vegyületet adunk hozzá olyan mennyiségben, amely a plazmid kópiaszám lassú csökkenéséhez vezet egészen addig, amig el nem éri az indukció előtti szintet.

Azok a körülmények, amelyek közt a mikroorganizmusok növekednek, magukba foglalhatják a tenyésztésnek legalább egy periódusát, amely olyan vagy közel olyan hőmérsékleten megy végbe, amelynél a plazmid kópiaszáma lényegesen megnövekedett vagy szabályozatlanná vált.

Ha a szabályozható promotor hőmérsékletfüggő vagy egy hőmérséklet-érzékeny faktorral szabályozott, előnyös a találmány szerinti plazmiddal transzformált mikroorganizmus szaporítását egészen a termelő méretű tenyészetig olyan vagy közel olyan hőmérsékleten végezni, amelynél a plazmid konstans, kis kópiaszámot mutat, abból a célból, hogy elkerüljük a mikrobiológiai növekedés bármiféle gátlását egy megnövekedett plazmid- és gén-termék koncentrációval. Ez után a hőmérsékletet feljebb visszük arra a hőmérsékletre, amelynél a plazmid jelentősen megnövekedett vagy szabályozatlan kópiaszámot mutat. Egy megfelelő termelő periódus után, gyakran addig, amíg a mikroorganizmus növekedését a plazmidból eredő plazmid DNS és/vagy gén-termékek termelése nem gátolja, elvégezzük a gén-termék kinyerését. A szóban forgó körülményektől függően kívánatos a termelő tenyésztést folyamatosan azon a hőmérsékleten végrehajtani, amely csupán megközelíti azt a hőmérsékletet, amelynél a plazmid kópiaszáma lényegesen megnövekedett vagy szabályozatlan, így lehetséges a gazda-mikroorganizmus túlélése és folytonos

-1121

HU 201116 Β növesztése a plazmid gén-termékének meg növekedett mennyiségű képződésével együtt (amely terméket azután folyamatosan vagy szakaszosan ki lehet nyerni a tenyészetből ismert módon).

Egy másik módszer szerint a mikroorganizmust szaporíthatjuk egészen egy termelő szintű tenyészetig olyan hőmérsékleten, amelynél a plazmid kópiaszám konstans, ez után a hőmérsékletet felemeljük olyan vagy közel olyan hőmérsékletre, amelynél a plazmid kópiaszám jelentősen növekedett vagy szabályozatlan, és ezt a hőmérsékletet fenntartjuk olyan időtartamon keresztül, amely alkalmas a plazmid lényeges mennyiségi növelésének eléréséhez, de megfelelően rövid a mikrobiológiai tenyészet bármiféle károsodásának elkerüléséhez, ez után a hőmérsékletet még egyszer visszaigazitjuk olyan hőmérsékletre amely egy kis, konstans plazmid kópiaszámot biztosít, és a termelő tenyésztést ezen az utóbbi hőmérsékleten folytatjuk, lassú csökkenést idézve elő a plazmid kópiaszámban egészen addig, amig az el nem éri a kiindulási szintjét. Ez a tenyésztési módszer különösen fontos, amikor a plazmidba beiktatott idegen gén egy olyan organizmusból származik, amely nem életképes kb. 30 °C fölötti hőmérsékleten úgy, hogy az ilyen gén termékei magasabb hőmérsékleten denaturálhatnak. Sót, a gén-termékek hozama általában nagyobb, amikor ezt a tenyésztési módszert alkalmazzuk, (lásd a 16. példát, hasonlítsd össze Uhlin és munkatársainak közleményével /Gene 6, 1979, 91-106/).

A hőmérséklet, amelynél a plazmid kópiaszáma lényegesen megnövekedett vagy szabályozatlan, magasabb lehet, mint az a hőmérséklet, amelynél a plazmid konstans, kis kópiaszámmal rendelkezik. Ez a nagyobb hőmérséklet lehet pl. a 36-42 °C tartományban.

Az ábrák leírása

A rajzokra teszünk itt utalásokat, amelyekben az 1. ábra a vad tipusú Rl plazmid replikációs területének sematikus vázlata, a 2. ábra a következő ábrákban használt jelzésekhez szolgáló kulcs, a 3-14. ábrák mutatják be a példákban leirt plazmidok restrikciós térképeit.

Az 1. ábrában az Rl alap-replikonjának sematikus képét mutatjuk be, amelyben a vonalkázott területek az átültetett területeket, míg az üres területek az átiratokat (transzkriptumokat), és a szaggatott vonalak a lehetséges transzkriptumokat jelzik. A körön belül a hajtű-hurok felnagyított képe a Cop-A-RNS nagymértékű szekunder szerkezetének illusztrálását kívánja megvalósítani. Az Őri a replikáció beindítását jelzi. A vízszintesen elhelyezett nyilak az átírás irányát jelzik.

A 2. ábra a további ábrákban használt jelzéseket mutatja: az A jelenti az Rl-tipusú plazmidokból származó DNS-t; B jelenti a λ bakteriofágból (EDa4) származó DNS-t; C jelenti a (EDATn 3-ból származó) Tn 3 transzpozont; D jelenti a pBR 322 plazmidból származó DNS-t; E jelenti a pMC 871 plazmidból származó DNS-t; F jelenti a pVH 1424 plazmidból származó UNS-t; G jelenti a pSKS 104 plazmidból származó RNS-t; H jelzi a strukturgéneket és fontos helyeket; I egy promotort jelent az átírás irányénak jelzésével; ée J a plazmidok dimenzió-skáláját jelenti. Az üres terület a pBEU 14-ből származó DNS-t jelenti.

A 3-14. ábrákban a példákban leírt plazmidok lineáris restrikciós tárképeit mutatjuk be, amelyekben az ábrázolt Rl tipusú plazmidok genotípusai a vízszintes vonal felett vannak jelezve, igy a cop B egy olyan gént képvisel, amely egy olyan polipeptidet kódol, amely represszálja a rep A promotorból származó átírást a cop B és a cop A gének között; a cop A egy olyan gént képvisel, amely olyan RNS molekulát kódol, amely gátolja a Rep A-mRNS transzlációt, a rep A olyan gént képvisel, amely egy olyan fehérjét kódol, amely az Rl fehérje replikációjához szükséges; az őri a replikáció vegetatív eredőjét (origin) jelenti; aph A egy olyan gént képvisel, amely a kanamicinre történő rezisztenciát kódolja; bla egy olyan gént képvisel, amely az ampicillinre történő rezisztenciát kódolja; lac A, lac Y és lac Z a beiktatott lac operont képviselik, amelyek közül lac A kódolja a transz-acetilázt, a lac Y kódolja a permeázt és lac Z kódolja a β-galaktozidázt; clssi egy olyan gént képvisel, amely a aPr promotor hőmérséklet-érzékeny represszort kódolja; tnpR és tnpA olyan géneket képviselnek, amelyek Tn3 transzponáló funkciókat kódolnak; pár azt a területet képviseli, amely felelős a plazmid megosztásáért; rec A egy olyan gént képvisel, amely egy rekombinációs fehérjét kódol; és Prec A képviseli a rec A promotort. A vízszintes vonal alatt a restrikciós enzimek helyeit mutatjuk be, amelyekben P jelenti a Pst I-et; B2 jelenti Bgl II-1; Sí jelenti Sál I-et; E jelenti EcoRl-et, H3 jelenti Hind III— -ot; Bi jelenti Bam ΗΙ-et; S jelenti Sma I-et; BzBi egy fúziót jelent egy Bgl II hely és egy Bam Hl hely között; és C jelenti Cla 1-et. A 11. ábrában az ábrázolt plazmidok ugyanolyan méretarányban vannak lerajzolva, mint a többi ábrában ievó plazmidok, és a zárójelben levő beiktatás képviseli a beiktatott lac géneket.

Anyagok és módszerek

Az alkalmazott Escherichia coli K 12 törzs CSH 50 volt (δ pro-lac, rpsL; lásd: J. Miller: Experiments in Molecular Genetics /Kísérletek a molekuláris genetikában/, Cold

-1223

HU 201116 Β

Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1972). Többféle plazmidot (lásd 1. Táblázat) és bakteriofágot (lásd

2. Táblázat) használtunk.

Az alkalmazott technikák a mikrobiológiai genetika területén alkalmazott standard technikák (J. Miller: Experiments in Molecular Genetics) Kísérletek a molekuláris genetikában), Cold Spring Harbor, New York, 1972) és genetikai manipulációk (Davis, Botstein és Roth: A Manual fór Genetic Engineering (A gén-technikák kézikönyve); Advanced Bacterial Genetics, Cold Spring Harbor, New York, 1980).

Az összes sejtet LB tápközegben (Bertoni: J. Bact. 62, 1951, 293, vagy A*B minimál tápközegben (Clark és Maal0e: J. Mól. Bioi. 23, 1967, 99) növesztettük, és az alkalmazott lemezek LB tápközeget és 1,5% agart tartalmazó LA lemezek voltak. A plazmid DNS preparálását és analízisét boyant festék sűrűség-gradiens centrifugálással végeztük a Stougaard és Molin által leirt (Anal. Biochem. 118, 1981, 191) módszer szerint. A DNS és a lizátumok preparátumainak jelzése a plazmid-tartalom meghatározásához Molin és munkatársai szerint (J. Bact. 138, 1979, 70) történt. A plazmid DNS relatív mennyiségét mint a plazmid-kötésben jelenlevő jelzett timidin mennyiségét mértük, a kromoszomális kötésben levő mennyiséghez viszonyítva a gradiensben.

A példákban alkalmazott restrikciós endonukleázokat a gyártó által szolgáltatott előírásokkal összhangban használtuk. A részleges hasítást az enzimek tízszeres hígításával hajtottuk végre.

Ezen kívül a következő kiválogatási (screenelési) módszereket alkalmaztuk:

1. ) Kiválogatás Λ immunitásra (immA*)

Az összes leírt példában a clss7 mutáns alléit használjuk. Az ezt a gént hordozó plazmidoktól az E. coli gazdasejt ellenállóvá válik a lizáló λ fágok fertőzésére 30 C hőmérsékleten. Hogy kiválasszuk a rezisztens sejteket, több, mint 10⁶ Ab2 fág részecskét adunk a lemezhez, mielőtt a baktériumot elszélesztjük. A túlélő telepeket tovább vizsgáljuk plazmid-tartalomra.

2. ) Kiválogatás cop B*-re

Genetikai fúziót hajtunk végre a rep A promotor és olyan lac operon között, amelyből a lac promotor ki van iktatva, és a fúziós terméket egy pl5 plazmidba iktatjuk be (pGA46). A létrejött hibrid-plazmidok egyike, a pJL217 felelős a Lac* fenotípusért, amikor egy Δ lac E. coli gazdasejt befogadja ezt.

A Lac* fenotipus könnyen kimutatható McConkey laktóz indikátor lemezeken (vörös telepek). A cop B* gének jelenléte a pJL217-et befogadó sejtekben egy Lac^- fenotipust eredményez, amely fehér telepekként jelenik meg az indikátor lemezeken, igy a cop B* hibridek könnyen jelezhetók Lac* telepekként, amikor a plazmid DNS-t olyan E. coli δ lac sejtekbe transzformáljuk, amelyek befogadják a pJL217 plazmidot.

1. TÁBLÁZAT

Az alkalmazott plazmidok

Plazmid Forrás

PKN1562 S. Molin és munkatársai: J. Bact. 138, 1979, 70-79. oldal

PBR322 F. Bolivár és munkatársai: Gene 2, 1977, 95. oldal pJL217 Egy rep A promotort hordozó pKN1562-böl származó Sau 3 A fragmens beiktatásával készült a pJL207 Bgl II helyére, lac promotor nélküli lac gént hordozó hibrid plazmid pOU16 Light és Molin: Mól. Gén. Génét. 184, 1981, 57. oldal pGA46 An és Friesen: J. Bact. 140, 1979, 400-407. oldal pMC903 Casadaban és munkatársai: J. Bact. 143, 1980, 971. oldal pVH1424 P. Valentin-Hansen által készítve, a pVH17 plazmidból (Valentin-Hansen és munkatársai, EMBO J. 1982, 317) származó deo promotort hordozó Sau 3 A fragmens beiktatásával a pMC1403 plazmid (Casadaban és munkatársai, fentebb idézett munka) Bam Hl helyére.

pSKS104 M. Casadaban által konstruálva egy lac promotort és egy pMl3mp 7-bői (Messing és munkatársai: Nucleic Acids Rés. 9, 1981, 309) származó transzláció-beindító (iniciációs) helyet tartalmazó Pvu II fragmens beiktatásával a pMC 1403 Sma I helyére majd ezt követően a lac Z szegmensek közötti homológ rekombinációval

PKN184 Nordstrom és munkatársai: Plazmid 4, 1980, 322 pJL3 Molin és munkatársai: Mól. gén.

Génét. 181, 1981, 123-130.

pVH1451 Valentin-Hansen és munkatársai:

fentebb idézett közlemény pBEU14 Uhlin és Clark: J. Bact. 148, 1981, 386-90 pMC1403 Casadaban és munkatársai: J. Bact. 143, 1980, 971

2. TÁBLÁZAT

Az alkalmazott bakteriofágok

Fág Forrás

EDa4 Dempsey és Willets: J. Bact. 126,

1976, 166. oldal

EDATn3 Nordstrom, Molin, Aagaard-Hansen:

Plasmid, 4, 1980, 215-27. oldal

-1325

HU 201116 Β . Szülő plazmidok

A pKN1562 plazmid az Rl plazmid származéka, minden lényeges részben a Molin és munkatársai által leirt módszerrel konstruálva (.Clustering of Genes Involved in Replication, Copy Number Control, Incompatibilily, and Stable Maintenance on the Resistance Plasmid Rldrd-19) Az Rldrd-19 rezisztencia-plazmid replikációjában, kópiaszám szabályozásában, összeférhetetlenségében és stabil fenntartásában érdekelt gének csoportosítása), J. Bact. 138, 1979, 70-79. oldal), azzal a néhány módosítással, amelyet a későbbi kutatás hozzáadott. A pKN1562 molekulatömege 6,9.10« dalton és genotípusa a következő: cop A⁴, cop B⁴, rep A⁴, aph A⁴, Apar (lásd 3. ábra). Ez kanamicin-rezisztenciát hordoz. A plazmid a vad-típusú plazmid replikációs tulajdonságaival bir, kópiaszáma 3-5/gyorsan növő sejt és 1%/generáció gyakorisággal vész el a pár gén (a megosztás génje, hiánya miatt.

A pKN1562 Bgl Π-vel végzett hasításával a cop B gén egy részének kiiktatása érdekében és a vágott végek összekötésével egy másik plazmidot, a pJL20-at alkotjuk meg. Ennek a plazmidnak a molekulatömege 6,7.10« dalton és genotípusa a következő: cop A⁴, úcop B, rep A⁴, aph A⁴, apar. A plazmid kópiaszáma 25-40/gyorsan növő sejt, és nincs vezteség a plazmidból. Ez a plazmid szintén közvetít kanamicin-rezisztenciát.

Plazmid-jelölés

Meg kell jegyezni, hogy a pJEL...-lel jelölt plazmidokat, amelyek az alap-bejelentés példáiban és rajzaiban szerepeltek, átneveztük a jelen bejelentésben pOU...-ra.

1, példa pOU51 megalkotása és jellemzése

A pJL20 plazmidból és ΕΙ)λ4 tágból DNS-t készítünk standard módszerek szerint. A plazmid- és a fág DNS-t összekeverjük mindkettőre nézve 20 Mg/ml végső koncentrációban és 100 m1 végső térfogatban, 30 percig emésztjük Bgl Π-vel, 70 °C hőmérsékleten 10 percen át hővel inaktiváljuk, majd T4 ligázzal összekötjük 15 °C hőmérsékleten egy éjszakán át. Az összekötő (li— gációs) keverék alikvotjait E. coli CSH 50 törzsbe transzformáljuk. A transzformánsokat 50 Mg/ml kanamicint tartalmazó lemezeken szelektáljuk, amelyre kb. 10® Ab2 szuszpenziót szélesztettünk. A lemezeket 20 órán át 30 °C hőmérsékleten inkubáljuk.

A túlélő telepeket újra izoláljuk és Ab2 rezisztenciára vizsgáljuk 30 °C hőmérsékleten történő kereszt-szélesztéssel, 42 °C hőmérsékleten történő növekedésre Km lemezekre 42 °C hőmérsékleten történő szélesztéssel, és a plazmid molekulatömegére a plazmid DNS kipreparálásával és agaróz gélen történő elemzésével.

Ilyen módon egy olyan plazmidot találtunk, amely Km-re és A-fertőzésre való rezisztenciát közvetít, a gazdasejtnek hőmérséklet-érzékenységet nyújt a növekedéshez, és fág DNS beiktatással rendelkezik pJL.20-ban, amely kb. 1,6.10« daltonnak felel meg. A plazmid teljes molekulatömege 8,4.10« dalton. Ezeket a tulajdonságokat mind a plazmid hordozza, mivel az új E. coli befogadó törzs az összes plazmid-eredetü fenotipusos tulajdonságot csak akkor szerezte meg, amikor transzformáltuk pOU51 DNS-el.

A pOU51-ből a DNS-t kipreparáljuk, és a plazmidot restrikciós enzimekkel feltérképezzük a plazmid DNS tisztításával, restrikciós enzimmel vagy enzimekkel történő hasítással és a nyert fragmens elemzésével agaróz-gél elektroforézis segítségével (lásd 4. ábra). Ezen a módon a beiktatott 1,6.10« dalton méretű fragmenst mint aPb promotert és cl represszor gént (amely a A immunitásért felelős 30 °C hőmérsékleten) hordozó a fágból eredő Bgl 11 fragmenst azonosítjuk, és a beiktatott fragmens orientációját a 4. ábrában bemutatott módon azonosítjuk. A restrikciós térképből továbbá kiderül, hogy a pOU51-nek van egy egyedi helye EcoRI restrikciós endonukleázhoz, amely lehetővé teszi a plazmid alkalmazását klónozó vektorként.

A plazmidnak a sejtek növekedésére gyakorolt hatását 30 “C hőmérsékleten egy tenyészetet egy tápközegben növesztve vizsgáljuk meg. Abban az időszakban, amikor a növekedés exponenciális, a hőmérsékletet 42 °C-ra változtatjuk és a sejt növekedését követjük (spektrofotometriásán meghatározva). 1,5-2 órán belül a tenyészetet 42 °C hőmérsékleten megszűnik növekedni.

A plazmid DNS-tartalmat azzal a módszerrel mérjük, amelyet az Anyagok és módszerek fejezetben leirtunk, 10 ml olyan A⁴B minimál tápközegben növő tenyészetből, amelyet kiegészítünk 0,2% glükózzal és 1% kazamino-savval. Egyik 10 ml-es tenyészetet 50 mCí ³H timidinnel jelezzük 30 °C hőmérsékleten, a másikhoz az izotópot éppen az után adjuk, miután a hőmérsékletet 42 °C-ra változtatjuk, egészen addig, amíg a sejt növekedése meg nem szűnik. A relatív plazmid DNS tartalom 2% 30 °C hőmérsékleten, amely 25-40 plazmid-kópiának felel meg sejtenként. 42 °C hőmérsékleten a relatív tartalom több, mint 50%, amely több, mint 1000 plazmid-köpiának felel meg sejtenként.

A plazmid tulajdonságait az 5. Táblázat mutatja be.

Az E. coli CSH 50/pOU51 törzset a Német Mikroorganizmusok Gyűjteményében (Deutsche Sammlunk von Mikroorganismen, Griesbach-stasse 8, D-3400, Göttingen, Német Szövetségi Köztársaság), (a továbbiakban ezt DSM-el rövidítjük), helyeztük el 2467 letéti számon.

-1427

HU 201116 Β

2. példa pOU53 megalkotása és jellemzése

Az 1. példában leirt plazmidot használva kiindulási anyagként, és ezt a pOU51-et részlegesen emésztve Hind ΠΙ-mal hozzuk létre a cím szerinti plazmidot, amelyből a kanamicin rezisztenciát hordozó gén ki van iktatva, de amely megőrzi a λ immunitást hordozó gént. A törzset E. coli CHS 50 törzsbe transzformáljuk. A nyert pOU53 molekulatömege 3,2.10® dalton és genotípusa a következő: cop A·, Acop B, rep A*, Apar, immA*, aaph A.

A plazmidot restrikciós enzimekkel feltérképezzük az 1. példában leírtak szerint (lásd 5. ábra). A restrikciós térképből kitűnik, hogy a pOU53-nak van egy egyedi helye EcoRI restrikciós endonukleázhoz, amely lehetővé teszi a plazmidnak mint klónozó vektornak a használatát.

Hogy a kívánt plazmid jelenlétét a gazdasejtben demonstráljuk, sejt-tenyészeteket növesztünk Ab2 fág-részecskéket tartalmazó lemezeken, amint ezt korábban leírtuk a a-infekcióra való rezisztencia vizsgálatához. A sejteket tovább vizsgáljuk kanamicin-érzékenységre replika-lemez telep-átviteli módszerrel olyan lemezeken, amelyek 50 pg/ml Km-t is tartalmaznak. Hogy megvizsgáljuk a hőmérséklet-érzékeny növekedést, a sejteket 42 °C hőmérsékleten lemezekre szélesztjük, és az 1. példában leirt módon növesztjük.

Amikor a plazmid DNS tartalmat mérjük az 1. példában leírt módszerrel, a sejtekről úgy találjuk, hogy 20-40 plazmid-kópiát tartalmaznak 30 °C hőmérsékleten és több, mint 1000 plazmid-kópiát 42 °C hőmérsékleten. Plazraid-elvesztés nem volt.

Ennek a plazmidnak a tulajdonságait az 5. táblázat mutatja be.

Az E. coli CSH 50/pOU53 törzset a DSM törzsgyüjteményben 2468 letéti számon helyeztük el.

3. példa pOU56 megalkotása és jellemzése A transzponálásért és az ampicillin rezisztenciáért (/3-laktamáz) (Nordstrom, Molin és Aagaard-Hansen, Plasmid 4, 1980, 215-27) felelős géneket magában foglaló λ: : Tn 3-ból származó Tn3 transzpozon in vivő beiktatásával pOU53-ba alkotjuk meg a cím szerinti plazmidot. A plazmid DNS-t a ΛΤη 3 fágot a kromoszómákban hordozó és a pOU53 plazmidot is hordozó törzsből izoláljuk. A plazmid DNS-t E. coli CSH 50 törzsbe transzformáljuk, ampicillin rezisztenciára és a immunitásra szelektálva. A pOU56 molekulatömege 6,5.10® dalton, és genotípusa a kővetkező: cop A’, acop B, rep A*, Aaph A, immA*, bla* (: : Tn3).

A plazmidot az 1. példában leirt módszer szerint restrikciós enzimekkel feltérképezzük (lásd 6. ábra). A restrikciós térképek azt mutatják, hol van a Tn3 transzpozon beiktatva a pOU56-ba, és azt is megmutatják, hogy a plazmidnak van egy egyedi helye mind az EcoRI, mind a Bam Hl restrikciós endonukleázokhoz. Miközben a plazmid használható kiindulási anyagként a pOU57 készítéséhez (lásd később a 4. példát), nem ajánlható ugyanez klónozó vektorként, mivel a transzponáló gén jelenléte következtében az antibiotikum-rezisztenciát át lehet vinni más baktériumba.

A kivánt plazmid jelenlétének demonstrálására a gazdasejtben, sejt-tenyészeteket növesztünk Ab2 fág részecskéket tartalmazó lemezeken a fentebb leirt módon a a infekcióra való rezisztencia vizsgálatához. A sejteket továbbá ampicillin rezisztenciára is megvizsgáljuk 50 pg/ml ampicillint tartalmazó lemezeken. A hőmérséklet-érzékeny növekedés vizsgálatát a fentebb leírt módszerrel hajtjuk végre.

A pOU56 replikációs tulajdonságait azonosnak találtuk a pOU53 replikációs tulajdonságaival.

Az E. coli CSH 50/pOU56 törzset 2469. letéti számon helyeztük el a DSM törzsgyüjteményben.

4. példa pOU57 (egy A tipusú plazmid) megalkotása és jellemzése

Abból a célból, hogy a Tn3 transzponálásának lehetőségét megszüntessük pOU56 plazmidból, amely a teljes transzpozon hordozásának következménye lehet, a plazmidot a Bam Hl és EcoRI helyeknél elhasítjuk, hogy kiiktassuk a transzponáló gént, míg a β-laktamázt kódoló gén megmarad. Abból a célból, hogy hatást gyakoroljunk a .ragadós’ vég összeforrasztására (annealing), egy kis, pBR322-ból származó Bam Hl - EcoRi fragmenst iktatunk be, igy alkotjuk meg a pOU57 plazmidot. A plazmidot E. coli CSH 50 törzsbe transzformáljuk. A pOU57 molekulatömege 4,2.10® dalton, és genotípusa a következő: cop A*, acop B, rep A’, apar, Aaph A, immA*, bla* (δΤπ3).

A plazmidot restrikciós enzimekkel feltérképezzük az 1. példában leirt módszerrel (lásd 7. ábra). A restrikciós térképekből kitűnik, hogy a pOU57-nek egyedi helyei vannak mind a Bam Hl, mind az EcoRi restrikciós endonukleázokhoz, amely ezeket alkalmassá teszi klónozó vektorként történő felhasználásra.

A kivánt plazmid jelenlétének demonstrálására a gazdasejtben, sejt-tenyészeteket növesztünk Ab2 fág részecskéket tartalmazó lemezeken a fentebb leírt módon a A infekcióra való rezisztencia vizsgálatához. A sej-1529

HU 201116 Β teket továbbra ampicillin-rezisztenciára is megvizsgáljuk a fentebb leírt módon. A plazmid molekulatömegét agaróz-gél elektroforézissel határozzuk meg. A hőmérséklet-érzékeny növekedés vizsgálatát a fentebb leírt 5 módszerrel hajtjuk végre.

A pOU57 replikációs tulajdonságait azonosnak találtuk a pOU53 replikációs tulajdonságaival.

Ennek a plazmidnak a tulajdonságait az 10 5. Táblázat mutatja be.

Az E. coli CSH 50/pOU57 törzset 2470. letéti számon helyeztük el a DSM törzsgyűjteményben.

5. példa pOU71 (egy B-tlpusú plazmid) megalkotása és jellemzése 20

A 4. példában leirt plazmidot alkalmazva kiindulási anyagként és beiktatva egy pKN1562-ből eredő Bgl II fragmenst, amely tartalmazza a pOU57 Bgl II helyén levő cop B gén egy részét, megalkotjuk a cim szerinti 25 plazmidot, amely hordozza mind a cI-λΡβ represszor-promotor rendszert, mind az Rl-tipusú plazmidok cop B inhibitorát kódoló vad-típusú gént. A plazmidot E. coli CSH 50 törzsbe transzformáljuk. A pOU71 molekulatö- 30 mege 4,3.10® dalton és genotípusa a következő: cop A·, cop B‘, rep A·, δ pár, aaph A, immA‘, bla·.

A plazmidot az 1. példában leirt módszer szerint restrikciós enzimekkel feltérképezzük 35 (lásd 8. ábra). A restrikciós térképekből kitűnik, hogy a pOU71-nek az egyedi restrikciós helyei ugyanazok, mint a pOU57-é.

Hogy a kívánt plazmid jelenlétét a gazdasejtben demonstráljuk, a sejt-tenyészete- 40 két megvizsgáljuk A-infekcióra való rezisztenciára és ampicillin rezisztenciára a fentebb leirt módon. A plazmidokat azután cop B gén jelenléte alapján kiválogatjuk (screeneljük) a korábban .Kiválogatás (screenelés) 45 cop B*-re című szakaszban leirt módszer szerint. A hómérsékletérzékeny növekedés vizsgálatát a fentebb leírt módon hajtjuk végre. Végül a plazmid-kópiák számét 30 °C hőmérsékleten meghatározzuk radioaktív jel- 50 zés és gradiens-centrifugálás segítségével.

Amikor a plazmid DNS-tartalmat mérjük az 1. példában leirt módon, a sejtekről úgy találjuk, hogy 3-5 plazmidkópiát tartalmaznak 30 °C hőmérsékleten, és több, mint 1000 55 plazmid-kópiét 42 °C hőmérsékleten. 30 °C hőmérsékleten a plazmid 1%/generáció gyakorisággal vész el.

A plazmid tulajdonságait az 5. Táblázat mutatja be. 60

Az E. coli CSH 50/pOU71 törzset 2471.

letéti számmal helyeztük el a DSM törzsgyüjteményben.

6. példa pOU73 (egy C típusú plazmid) megalkotása és jellemzése

A 4. példában leírt plazmidot alkalmazva kiindulási anyagként, és a pOU57 EcoRi helyébe cop B gént hordozó, pOU16-ból származó EcoRi fraginens beiktatásával a cim szerinti plazmidot megalkotjuk, amely plazmid rendelkezik a cop B inhibitor génjével, valamint a cI-aPr represszor-promotor rendszerrel. A plazmidot E. coli CSH 50 törzsbe transzformáljuk. A pOU73 molekulatömege 4,4.10® dalton és genotípusa a következő: cop A·, cop B·, rep A’, apar, aaph A, immA·, bla·.

A plazmidot az 1. példában leirtak szerint restrikciós enzimekkel feltérképezzük (lásd 9. ábra). A restrikciós térképekből kitűnik, hogy a cop B gén a plazmidnak egy olyan helyén van beiktatva, ahol az természetes módon nem szokott elhelyezkedni. Az tűnik ki továbbá, hogy a plazmidnak van egy egyedi helye a Bam Hl restrikciós endonukleázhoz úgy, hogy ezt lehet klónozó vektorként is használni.

Ugyanazokat a kiválogatási módszereket használjuk, mint amelyeket a pOU71-nél alkalmaztunk.

Amikor a plazmid DNS tartalmat mérjük az 1. példában leírt módon, a sejtekről úgy találjuk, hogy 0,5-1 plazmidkópiát tartalmaznak 30 °C hőmérsékleten és több, mint 1000 plazmid-kópiát 42 °C hőmérsékleten. 30 °C hőmérsékleten a plazmid több, mint 5%/generáció gyakorisággal vész el.

A plazmid tulajdonságait az 5. Táblázat mutatja be.

Az E. coli CSH 50/pOU73 törzset 2472. letéti számon helyeztük el a DSM törzsgyüjteményben.

7. példa pOU75 (egy B típusú plazmid) megalkotása és jellemzése

Az 5. példában leirt plazmidot alkalmazva kiindulási anyagként és a pOU71 Hind IU-al történő részleges emésztésével a cim szerinti plazmidot alkotjuk meg, amelyből az EcoRi hely ki van iktatva. A plazmidot E. coli CSH 50 törzsbe transzformáljuk. A pOU75 molekulatömege 4,2.10® dalton és genotípusa a következő: cop A·, cop B·, rep A·, apar, aaph A, immA·, bla·.

A plazmidot az 1. példában leírt módszer szerint restrikciós enzimekkel feltérképezzük (lásd 10. ábra). A restrikciós enzimekkel feltérképezzük (lásd 10. ábra). A restrikciós térképekből kitűnik, hogy a Hind III fragmens kiiktatása a pOU71 EcoRi helyének eltávolítását eredményezi.

Hogy demonstráljuk a kivánt plazmid jelenlétét a gazdasejtben, a sejt-tenyészetet

-1631

HU 201116 Β

Λ-infekció elleni rezisztenciára és ampicillin rezisztenciára vizsgáljuk, valamint hőmérséklet-érzékeny növekedésre olyan módon, ahogyan ezt korábban leírtuk. A plazmidot vizsgáljuk még az EcoRI hely elvesztésére is az enzimmel emésztve.

A pOU75-ről úgy találtuk, hogy replikációs tulajdonságai azonosak a pOU71-ével.

A plazmid tulajdonságait az 5. Táblázat mutatja be.

Az E. coli CSH 50/pOU75 törzset 2473. letéti számmal helyeztük el a DSM törzsgyűjteményben.

8. példa

A gén-termék mennyiség-növelése pMC903 plazmidot (Casadaban és munkatársai: J. Bact. 143, 1980, 971) hasítjuk Bam Hl és Bgl II restrikciós enzimekkel, egy

3.

A gén-termék

BamHI-Bgl II fragmensét alakítva ki, amely lac géneket hordoz. pOU71 plazmidot BamHI-val hasítunk, és a fentebb nyert BamHI-Bgl II fragmenst beiktatjuk erre a helyre, amint ezt a 11. ábra mutatja, ezt követi az összekötés (ligáció) T4 DNS ligázzal, igy állítva eló a pOU106 plazmidot, amelyet transzformálunk E. coli CSH 50 törzsbe. A sejteket McConkey laktóz indikátor lemezekre szélesztjük (lásd:

J. Miller: Experiments in Molecular genetics, Cold Spring Harbor, 1972), amely lemezek 50 pg/ml ampicillint tartalmaznak, és 30 °C hőmérsékleten inkubáljuk, hogy kiválaszthassuk a vörös telepeket (Lac*). A hómérsékle15 tét ez után 42 °C-ra változtatjuk, és a gén-termék (β-galaktozidáz) mennyiségi növekedését mérjük, amint ezt a 3. Táblázat bemutatja. A mérést a J. Miller (lásd fentebb idézett munka) által leírt módszer szerint hajt20 juk végre.

Táblázat mennyiség-növelése

A találmány szerinti plazmid	A korábban ismert plazmid (pKN410)
Percek a 42 °C hőmérsékletre átállítás után	A gén-termék akkumulált viszonylagos fajlagos aktivitása1	Percek 42 °C hőmérsékletre átállítás után	A gén-termék akkumulált viszonylagos fajlagos aktivitása3
0	10	0	10
10	21
25	34
55	62	60	20
83	107	90	47

¹Enzim aktivitás/teljes fehérje-mennyiség, vagyis a β-galaktozidás nóvekedése/sejt ²pOU106 által közvetített β-galaktozidáz ³pKN410 által közvetített β-laktamáz (Uhlin és munkatársai: Gene, 6, 1979, II. Táblázat, 100 oldal)

A táblázatból kitűnik, hogy a gén-termék mennyiségnövelési szintje összehasonlítható azzal, amelyet mások .megvaduló vektorokkal nyertek (pl. Uhlin és munkatársai: Gene 6, 1979, 91-106).

A promotor, amelyből a β-galaktozidáz gén ki van fejezve, a cl promotor és/vagy a tetraciklin-promotor, amely a pBR322-ból származó DNS fragmensen helyezkedik el, amely, bár viszonylag gyenge, nem mellőzhető, mint befolyásoló tényező és amely ugyanabban az irányban ir át, mint a cl promotor.

A pOU106-ot az 1. példában leírtak szerint restrikciós enzimekkel feltérképezzük (lásd 11. ábra). A restrikciós térképekből kitűnik, hogy a plazmidnak van egy egyedi helye a BamHI restrikciós endonukleáz számára közvetlenül egyező irányban a beiktatott lac génekkel, amelyek a plazmidot alkalmassá teszik klónozó vektornak.

A plazmid tulajdonságait az 5. Táblázat mutatja be.

Az E. coli CSH 50/pOU106-ot 2474. letéti számmal helyeztük el a DSM törzsgyűjteményben.

9. példa pOU79 (egy B-tipusú plazmid) megalko55 tása és jellemzése

A pOU71 plazmidot BamHI-val teljesen és Pst I-el részlegesen elhasitjuk, és összekötjük egy, a pMC871 plazmidból (Casadaban és munkatársai: J. Bact. 143, 1980, 971) - ame60 lyet korábban BamHI-val és Pstl-el teljesen elhasítottunk - származó, lac operont hordozó DNS fragmenssel.

Az összekötő (ligációs) keveréket E. coli CSH 50 törzsbe transzformáljuk, ampicillin rezisztenciára szelektálva McConkey laktóz

-1733

HU 201116 Β indikátor lemezeken, amelyek 50 pg/ml ampicillint tartalmaznak, 30 “C hőmérsékleten inkubálva. 20 órás, 30 °C hőmérsékleten történő inkubálás után a lemezeket egy rövid időtartamon át (1-2 óra) 42 °C hőmérsékleten 5 inkubáljuk, és azokat a telepeket, amelyek eltolódnak Lac* (fehér)-ből Lac* (vörös) fenotipusba, tovább analizáljuk. A cim szerinti plazmidot azonosítjuk egy ilyen telepből.

A pOU79 molekulatömege 8,8.10® dalton és 10 genotípusa a következő: cop A·, cop B’, rep A·, úpar, immA‘, bla‘, lac·.

A plazmidot az 1. példában leirtak szerint restrikciós enzimekkel feltérképezzük (lásd 12. ábra). A restrikciós térképekből 15 kitűnik, hogy a plazmidnak van egy egyedi helye a BamHI restrikciós endonukleáz számára közvetlenül egyező irányban a beiktatott lac génekkel. Promotor-hordozó DNS fragmens beépítése erre a helyre a megfelelő 20 orientációban a lac gének átírását eredményezi, így hozva létre az ilyen hibrid plazmidot hordozó sejtek Lac· fenotipusát 30 °C hőmérsékleten. A Lac· sejtek könnyen azonosíthatók McConkey laktóz indikátor lemeze- 25 ken.

A plazmidnak az EcoRI restrikciós endonukleáz számára is van egy egyedi helye, amely a lac Z gén egyik végén helyezkedik el. EcoRI fragmens beiktatása erre a helyre 30 eltünteti a lac Z gén-termék, a β-galaktozidáz aktivitását, ez pedig Lac* fenotípust eredményez, amelyet könnyű észlelni, mint színtelen telepek képződését McConkey laktóz indikátor lemezeken, miután a hőmérsékletet 35 30 °C-ról 42 °C-ra változtattuk (lásd a korábbi leírást). A plazmid klónozó vektorként használható.

A pOU79-ről úgy találtuk, hogy replikációs tulajdonságai a pOU71-ével azonosak. 40

A plazmid tulajdonságait az 5. Táblázatban mutatjuk be.

Az E. coli CSH 50/püU79 törzset a 2481. letéti számon helyeztük el a DSM törzsgyűjteményben. 45

10. példa pOU82 (egy B típusú plazmid) megalko- 50 tása és jellemzése

A pOU79 plazmidot BamHI-el teljesen és Sál I-el részlegesen elhasitjuk, és egy pSKS104-ből - amely olyan lac operont hordoz, amelyből a lac promotor ki van iktatva 55 - eredő BamHI-Sall fragmenst és a lac Z gén első négy kodonját iktatjuk bele, igy alkotjuk meg a pOU80-at (ábrában nem mutatjuk be).

A pOU80 Lac* plazmid és rendelkezik 60 BamHI hellyel is, EcoRI hellyel is éppen a lac génekkel egyező irányban. Ezen kívül az az EcoRI hely, amely normálisan megtalálható a lac Z génben, hiányzik, mivel a pSKS104-ben levő lac gének a pMC1403-ból származnak (Casadaban és munkatársai: J. Bact. 143, 1980, 971).

A cim szerinti plazmidot úgy alkotjuk meg, hogy a pOU80 lac Z génjében (lásd a pOU79 térképét, 12. ábra) egy EcoRI-Clal fragmenst helyettesítünk egy deo promotort és a lac Z gén amino terminális végét hordozó pVH1424-böl származó EcoRI-Clal fragmenssel. A helyettesítés a lac Z gén rekonstrukcióját eredményezi a deo promotor jelenléte következtében, az így nyert pOU82 hibrid plazmid Lac· fenotípust közvetít, amikor E. coli CSH 50 törzsbe transzformáljuk. A pOU82 molekulatömege 8,1.10® dalton és genotípusa a következő: cop A·, cop B·, rep A', Apar, immA», bla*, lac·.

A plazmid végső fokon elvész a sejtekből 30 °C hőmérsékleten a pár terület hiánya miatt, amely könnyen megfigyelhető nem szelektív McConkey laktóz indikátor lemezeken (lásd 11. példa).

A plazmidot az 1. példában leirtak szerint restrikciós enzimekkel feltérképezzük (lásd 13. ábra). A restrikciós térképekből kitűnik, hogy a plazmidnak egyedi helyei vannak mind az EcoRI, mind a BamHI restrikciós endonukleázokhoz, amely lehetővé teszi, hogy a plazmidokat klónozó vektorként használjuk.

A pOU82-ről úgy találtuk, hogy replikációs tulajdonságai a pOU71-ével azonosak.

A plazmid tulajdonságait az 5. Táblázatban mutatjuk be.

Az E. coli CSH 50/pOU82-t 2482. letéti számon helyeztük el a DSM törzsgyűjteményben.

11. példa pOU91 (egy B típusú plazmid) megalkotása és jellemzése

Annak érdekében, hogy olyan plazmidot használjunk, amely stabil a megosztás tekintetében, a pOU82-t EcoRI-vel elhasitjuk, és egy Rl származék, a pKN184 (Nordstrom és munkatársai: Plasmid 4, 1980, 322) vad-típusú pár területét magában foglaló EcoRI-Α fragmenst iktatunk bele ezen a helyen, ezt a műveletet összekötés (ligáció) követi. Az így nyert plazmidot (pOU90, ábrában nem mutatjuk be) E, coli CSH 50 törzsbe transzformáljuk, és a sejteket szelektíven növesztjük 50 ug/ml ampicillint tartalmazó lemezeken 30 °C hőmérsékleten. Kontrollként pOU82-t tartalmazó sejteket növesztünk hasonló módon, hogy biztosítsuk a plazmid jelenlétét mindkét índitó telepben.

Ezt követően mindkét telepből származó mintákat szélesztünk olyan lemezeken, amelyek semmiféle antibiotikumot nem tartalmaznak, és a sejteket nőni hagyjuk 25 sejtgeneráción át. Hogy a Lac^T fenotipus stabil öröklődését kiválogassuk (screeneljük), mindkét

-1835

HU 201116 Β fajta képződött telep sejtjeit McConkey laktóz indikátor lemezekre szélesztjük 30 °C hőmérsékleten, ahol a sejtek, amelyekbe pOU90 transzformálódott, vörös telepeket képeznek jelezve, hogy a plazmid megőrződött, míg a kontroll sejtek, amelyekbe a pOU82 transzformálódott, mind vörös, mind színtelen telepeket alkotnak, amely azt jelenti, hogy a szelekció nélküli periódus során a pOU82 elveszett a sejtek egy részéből.

A köztes plazmidot, a pOU90-et ez után BamHI-val teljesen és Sau3A-val részlegesen elhasitjuk, hogy csökkentsük a plazmid méretét, igy hozva létre a cim szerinti plazmidot. Az E. coli CSH 50 transzformációja után a plazmid stabilitását olyan módon határozzuk meg, ahogyan azt már korábban leírtuk. A pOU91 molekulatömege 12,5.10® dalton és genotípusa a következő: cop A·, cop B·, rep A‘, pár·, imrnA¹, bla‘, lac‘.

A plazmidot az 1. példában leirt módon restrikciós enzimekkel feltérképezzük (lásd

14. ábra). A restrikciós térképekből kitűnik, hogy a pOU91-nek egyedi helye van mind az EcoRI, mind a BamHI számára, amely lehetővé teszi a plazmid alkalmazását klónozó vektorként.

A pOU91-röl úgy találtuk, hogy replikációs tulajdonságai a pOU71-ével azonosak, de a pOU71-gyel ellentétben, ez a plazmid 30 °C hőmérsékleten teljesen stabil.

A plazmid tulajdonságait az 5. táblázat mutatja be.

Az E. coli CSH 50/pOU91 törzset 2483. letéti számon helyeztük el a DSM tórzsgyűjteményben.

12. példa pOUlOl (egy B típusú plazmid) megalkotása és jellemzése

A 7. példában leírt plazmidot alkalmazva kiindulási anyagként, és a klóramfenikol-acetil-transzferázt (cat·) kódoló gént hordozó Sau3A beiktatásával a pOU75 BamHI helyére, megalkotjuk a cím szerinti plazmidot, amely klóramfenikol rezisztenciát visz át a gazdasejtbe. A plazmidot E. coli CSH 50-be transzformáljuk. A pOUlOl molekulatömege 4,7.10® dalton és genotípusa a következő: cop A·,

cop B‘, rep A·,	apar, Aaph A, immA·,	bla*,
cat·.
A plazmidot	az 1. példában leírtak	sze-
rint restrikciós	enzimekkel feltérképezzük

(lásd 15. ábra). A restrikciós térképekből kitűnik, hogy a pOU 101-nek van egy egyedi helye EcoRI endonukleáz számára, amely lehetővé teszi a plazmid alkalmazását klónozó vektorként. Az EcoRI fragmens beiktatása inaktiválja a cat· gént, ez pedig lehetővé teszi az EcoRI hibridek kiválogatását.

A kívánt plazmid jelenlétének demonstrálására a gazdasejtben, a sejt-tenyészeteket Λ-infekció-rezísztenciára és ampicillin-rezisz20 tenciára vizsgáljuk a korábban már leirt módon. Ezen kívül a sejteket klóramfenikol rezisztenciára is megvizsgáljuk, tenyészeteket növesztve olyan lemezeken, amelyek 20 pg/ml klóramfenikolt tartalmaznak. A pOU 101-ről úgy találtuk, hogy replikációs tulajdonságai azonosak a pOU71-ével.

A plazmid tulajdonságait az 5. Táblázatban mutatjuk be.

Az E. coli CSH 50/pOU101 törzset 2757. letéti számon helyeztük el a DSM törzsgyüjteményben.

13. példa pOUllO megalkotása és jellemzése pOU80 plazmidból (amelyet a 10. példában jellemeztünk, lásd a pOU79 térképét is a

12. ábrában) a lac Z gén egy részét tartalmazó EcoRI - Cla I fragmenst kiiktatjuk, és helyettesítjük a deo promotort és a lac Z gén amino-terminális végét hordozó pVH1451 plazmidból (Valentin-Hansen és munkatársai: EMBO Journal 1, 1982) származó EcoRI - Cla I fragmenssel. Az igy nyert plazmidot pOU83-mal jelöljük (lásd 16. ábra).

A pOU83 plazmidot Bam ΗΙ-val és Bgl II-vel részlegesen emésztjük abból a célból, hogy a lac géneket, valamint a cl represszor gént és a aPr promotort hordozó DNS fragmenst kiiktassuk, összekötés (ligáció) és a CSH 50-be történő transzformálás után egy, a kívánt tulajdonságokkal rendelkező plazmidot izolálunk, amely egy szoros fúziót eredményez a deo promotor és a cop B gén között. A pOUllO-zel jelzett plazmid molekulatömege 3,2-10® dalton és genotípusa a következő: cop A·, cop B·, rep A*, Apar, bla·.

A plazmidot az 1. példában leírtak szerint restrikciós enzimekkel feltérképezzük (lásd 17. ábra). A restrikciós térképből kitűnik, hogy a plazmidnak egyedi restrikciós helye van mind az EcoRI, mind a Bam Hl restrikciós enzimek számára, ez alkalmassá teszi a plazmidot, hogy klónozó vektorként használják.

Amikor E. coli S ¢( 929 (cyt R, lac, deo; rec A) törzset, amelybe pOUllO-et transzformáltunk, növesztünk egy éjszakán át LB tápközegben glükóz nélkül, szabályozatlan plazmid replikáció jön létre 2.10® sejt/ml sejtsürűség fölött.

Az E. coli CSH 50/pOU110 törzset 2758. letéti számon helyeztük el a DSM törzsgyűjteményben.

14. példa

PŰU130 megalkotása és jellemzése

A pOU91 plazmidot Bam ΗΙ-val elhasítjuk és a Bam Hl helyet Bal 31 exonukleáz segítségével kiiktatjuk, így nyerjük a pOU92 plazmidot (ábrában nem mutatjuk be).

-1937

HU 201116 Β

A plazmidot EcoRI-vel és Cla 1-el emésztjük és egy pMC1403 plazmidból (Casadaban és munkatársai: J. Bact. 143, 1980, 971) származó megfelelő EcoRI - Cla I fragmenst iktatunk bele, így nyerve a pOU93 plazmidot, amely a lac operont a deo promotor nélkül tartalmazza. Az így létrehozott Bam Hl helynél egy cop B gént hordozó Bgl II fragmenst iktatunk bele, igy nyerjük a pOU130 plazmidot (lásd 18. ábra), ezt követi az összekötés (ligáció) és a transzformáció E. coli CSH 50 törzsbe. A sejteket McConkey laktóz indikátor lemezeken, amelyek 50 pg/ml ampicillint tartalmaznak, szélesztjük és 30 °C hőmérsékleten inkubáljuk, hogy a vörös telepeket (Lac*) szelektálhassuk. A hőmérsékletet ez után 42 °C-ra visszük át, és a β-gálák tozidáz mennyiségi növekedését a 4. Táblázatban mutatjuk be.

°C hőmérsékleten, 45 percen át végzett inkubálás után a hőmérsékletet 38 °C alá visszük. A β-galaktozidáz mért sokszorozódását ez után a hőmérséklet-eltolás után a

4. táblázatban mutatjuk be.

4. Táblázat β-galaktozidáz kifejeződése pOU130-ban a plazmid DNS amplifikációja után

Nővesztési feltételek	β-galaktozidáz fajlagos aktivitása·1	Amplifikációs faktor
30 °C, egyenletes állapot*	0,03	1
30 °C, 42 °Cb	0,7	23
30 °C, 42 °CC, 37 °CC	2,5	83

Megjegyzések:

^a pOU130-t tartalmazó CSH 50 sejtek, LB tápközegben 30 °C-on exponenciálisan növekszenek. ^b 30 °C-on exponenciális növekedés után a hőmérsékletet 42 °C-ra toljuk el, ahol a növesztést 2 óra hosszat folytatjuk.

^c 30 °C-on exponenciális növekedés után a hőmérsékletet 45 percig 42 °C-ra, majd 90 percig 37 “C-ra toljuk.

^d Lásd .Anyagok és módszerek. A β-galaktozidáz fajlagos aktivitását Light és Molin, Mól. Gén. Génét. 1981, 56-61. oldalon ismertetett módon fejezzük ki.

A táblázatból látható, hogy a gén-termék sokszorozódása jelentősen fokozódik, ha a hőmérsékletet alacsonyabb hófokra visszaállítjuk. Ez mutatja, hogy ez a módszer különösen alkalmas arra, hogy a kérdéses gén-termék maximális kifejeződését érjük el.

Mivel a β-galaktozidázt az ilyen gén-fúzió konstruktívan fejezi ki (Light and Molin,

J. Bact. 151, 1982, 1129-1135), az enzim-aktivitás szintje pontosan mutatja a találmány szerinti plazmidok gén-termék sokszorozó kapacitását.

Az E. coli CHS 50/pOU130 törzset 2759. letéti számon helyeztük el a DSM törzsgyüjteményben. ¹⁵

15. példa pLC31 megalkotása és jellemzése pOU75-öt Bam ΗΙ-val elhasitunk, és egy rec A promotort és gént hordozó pBE U 14 plazmidból (Uhlin és Clark: J. Bact. 148, 1981, 386-90) származó Bam Hl fragmenst iktatunk bele, ezt transzformáció követi E. coli CSH 50 törzsbe. A cím szerinti plazmid molekulatömege 6,3.10⁶ dalton és genotípusa a következő: rec A, bla*, cop A*, cop B*, rep A*, immA*.

A plazmidot restrikciós enzimekkel feltérképezzük az 1. példában leírt módszer szerint (lásd 19. ábra). A restrikciós térké40 pékből kitűnik, hogy a pLC31 tartalmaz egy egyedi helyet az EcoRI restrikciós enzim számára a rec A promotorral egyező irányban, amely alkalmas idegen gének beiktatásához.

A pLC31-ről azt találtuk, hogy replikációs tulajdonságai azonosak a pOU71-ével.

Amikor pLC31-et tartalmazó sejteket növesztünk 30 °C hőmérsékleten, a promotor teljesen represszált marad, mig a hőmérsók50 let átállítás után 42 °C hőmérsékletre, a lex A represszor fokozatosan titrálódik és a rec A-ból eredő átírás megkezdődik, a rec A gén-termék megnövekedett mennyiségű termeléséhez vezetve, amelyet poliakrilamid gél elektroforézissel ki lehet mutatni.

A plazmid tulajdonságait az 5. Táblázat mutatja be.

Az E. coli CSH 50/pLC31 törzset 2718. letéti számon helyeztük el a DSM törzsgyűj60 teményben.

-2039

HU 201116 Β

16. példa

A pLC33 megalkotása és jellemzése pLC28 plazmidot (Remaut és munkatársai: Gene 15, 1981, 81-93. oldal), amely a λΡι promotort és a bla gént hordozza és az EcoRI, Sma I, Bam Hl, Sál I, Pst I és Hind III restrikciós helyeket tartalmazó összekötővel (linkerrel) van ellátva, EcoRI-vel elhasítunk és a pOU51 (lásd 1. példa) EcoRI helyére iktatjuk, ezt követi az összekötés (ligáció, és a transzformálás E. coli CSH 50 törzsbe. Ezt a plazmidot, a pLC 32’-t, amelynek molekulatömege 10,6.10® dalton, Bam HI-val és a Bal 31 exonukleázzal emésztjük, hogy az összekötőt (linkért) kiiktassuk olyan körülmények között, amelyet T. Maniatis és munkatársai leírtak (Molecular Cloning. A Laborotory Manual, Cold Spring, Harbor, New York, 1982, 135-139. oldal) ezt követi egy vissza-kötés (religáció) és a transzformálás az E. coli C 600 törzsbe (R. K. Appleyard, Genetics 39, 1954, 440-452. oldal), olyan plazmidokra szelektálva, amelyek kanamicin és ampicillin rezisztensek. A nyert plazmidot pLC33-nak jelöljük, és molekulatömege 10,3.10® dalton, genotípusa pedig a következő: cop A‘, cop B, rep A*, aph A*, immA*, bla*.

A plazmidot az 1. példában leírtak szerint restrikciós enzimekkel feltérképezzük (lásd 22. ábra). A restrikciós térképből kitűnik, hogy a aPi promotor közvetlenül az egyedi EcoRI hellyel azonos irányban helyezkedik el, a plazmidot kényelmes klónozó vektorrá teszi.

A pLC33-ról azt találtuk, hogy replikációs tulajdonságai azonosak a pOU51-ével.

Ennek a plazmidnak a tulajdonságait az

5. Táblázat mutatja be.

Az E. coli CSH 50/pLC33 törzset 2945. letéti számon helyeztük el a DSM törzsgyüjteményben.

17. példa

A pLC34 megalkotása és jellemzése pLC28 plazmidot (Remaut és munkatársai: Gene 15, 1981, 81-93. oldal), amely a aPl promotort és a bla gént hordozza és az EcoRI, Sma I, Bam Hl, Sál 1, Pst I és Hind III restrikciós helyeket tartalmazó összekötővel (linkerrel) van ellátva, EcoRI-vel elhasítunk és a pOU51 (lásd 1. példa) EcoRI helyére iktatjuk, ezt követi az összekötés (ligáció) és a transzformálás E. coli CSH 50 törzsbe. Ezt a plazmidot, a pLC 32'-t, amelynek molekulatömege 10,6.10® dalton, Bam Hl-vel és Bal 31 exonukleázzal emésztjük, hogy kiiktassuk a bla gént olyan körülmények között, amelyet T. Maniatis és munkatársai leírtak (Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York, 1982, 135-139.

oldal), ezt követi egy visszakötés (ligáció) és transzformálás E. coli C 600 törzsbe (R. K. Appleyard, Genetics 39, 1954, 440-452. oldal), olyan plazmidokra szelektálva, amelyek kanamic.in-rezisztensek és ampicillin-érzékenyek. Az igy nyert plazmidot pLC34-nek jelöljük, ennek molekulatömege 8,4.10® dalton és genotípusa a következő: cop A*, cop B', rep A*, aph A’, iinmA*.

A plazmidot az 1. példában leírt módon restrikciós enzimekkel feltérképezzük (lásd 23. ábra). A restrikciós térképekből kitűnik, hogy a aPl promotor közvetlenül az egyedi EcoRI hellyel azonos irányban helyezkedik el, amely ezt a plazmidot kellemes klónozó vektorrá teszi.

A pLC34-ről úgy találtuk, hogy replikációs tulajdonságai a pOU51-ével azonosak.

A plazmid tulajdonságait az 5. Táblázatban mutatjuk be.

Az E. coli C 600/pLC 34 törzset a 2946. letéti szómon helyeztük el a DSM törzsgyűjteményben.

-2141

HU 201116 Β

5. Táblázat

A mini Rl-λΡκ plazmidok, mint klónozó vektorok tulajdonságai

Plazmid	Releváns fenotipus	Egyedi restrikciós hely	Kiválogatás (screening) (beiktatási inaktiválás)	Kópiaszám sejtenként 30 °C, 42 °C	Stabil öröklődés
POU51	Km, Λ	EcoRl	Nincs	25 >1000	igen
pOU53	Λ	EcoRI	Nincs	25 >1000	igen
pOU56	Ap, Λ	EcoRl, Bam Hl	Nincs	25 >1000	igen
POU57	Ap, Λ	EcoRI, Bam Hl	Nincs	25 >1000	igen
POU71	Ap, A	EcoRl, Bam Hl	Nincs	3 >1000	nem
pOU73	Ap, A	Bam Hl	Nincs	1 >1000	nem
pOU75	Ap, A	Bam Hl	Nincs	3 >1000	nem
POU106	Ap, A	Bam Hl	Nincs	3 >1000	nem
pOU79	Ap, a, Lac<*>	EcoRI, Bam Hl	Lac (EcoRl)	3 >1000	nem
pOU82	Ap, A, Lac*	EcoRI, Bam Hl	Nincs	3 >1000	igen
p0U91	Ap, A, Lac’, Pár'	EcoRI, Bam Hl	Nincs	3 >1000	igen
pOUlOl	Ap, Cm, A	EcoRl	Cms (EcoRI)	3 >1000	nem
pOU130	Ap, A, Lac*	EcoRI	Nincs	3 >1000	igen
pLC31	Ap, Rec A*	EcoRI	Rec A	3 >1000	nem
pLC33	Km, a, Ap	EcoRI	Nincs	25 >1000	igen
pLC34	Km, A	EcoRI	Nincs	25 >1000	igen
pOUHO	Ap	EcoRI, Bam Hl	Nincs	a.) >1000	nem

a.) A kópiaszám nem hőmérséklet-függő

-2243

HU 201116 Β

Claims (4)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1. Eljárás alacsony hőmérsékleten, illetve gátolt körülmények között konstans, kis kópiaszámot mutató, magasabb hőmérsékleten, illetve nem gátolt körülmények között jelentősen megnővekedett vagy szabályozatlan kópiaszámot mutató plazmidok előállítására, azzal jellemezve, hogy Rl típusú plazmidokba hőérzékeny represszor gént tartalmazó fág-DNS-t vagy kémiailag szabályozható promotor szekvenciát építünk be megfelelő restrikciós enzimes emésztéssel és ligálással, majd a kapott plazmidot E. coliban transzformáljuk, transzforménsokat izolálunk antibiotikum-rezisztencia és/vagy λ-fertőzés és/vagy metabolit-gátlás alapján, és a transzformánsokból a plazmidot kivánt esetben kinyerjük. (Elsőbbsége: 1982.09.24.)
2. 2. Eljárás alacsony hőmérsékleten konstans, kis kópiaszámot mutató, magasabb hőmérsékleten jelentősen megnövekedett vagy szabályozatlan kópiaszámot mutató plazmidok előállítására, azzal jellemezve, hogy Rl típusú plazmidokba hőérzékeny represszor gént tartalmazó fág-DNS-t építünk be megfelelő restrikciós enzimes kezeléssel és ligálással, majd a kapott plazmidot E. coliban transzformáljuk, transzforménsokat izolálunk antibiotikum-rezisztencia és/vagy λ-fertőzés alapján, és a transzformánsokból a plazmidot kivánt esetben kinyerjük. (Elsőbbsége: 1982.09.16.)
3. 3. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy

   a) E. coli CSH50 törzsben, DSM2467 számon deponált pOU51 plazmid előállítására pJL20 plazmid DNS-t és Εϋλ4 fág DNS-t Bglll-vel hasítunk, a hasítási terméket T4 ligázzal összekötjük, a ligáit keveréket E. coliba transzformáljuk, kanamicin-rezisztencia és λ-fertőzés alapján transzforménsokat izolálunk, és ezekből kívánt esetben kinyerjük a plazmidot;

   b) E. coli CSH50 törzsben, DSM 2468 számon deponált pOU53 plazmid előállítására az a) lépés szerinti módon kapott plazmidot HindlII-mal részlegesen emésztve a kanamicin-rezisztenciagént kiiktatjuk, a kapott plazmidokat E. coliba transzformáljuk, kanalaiéin érzékenység és λ fertőzés alapján transzforménsokat izolálunk, és ezekből a plazmidot kívánt esetben kinyerjük;

   c) E. coli CSH50 törzsben, DSM 2469 számon deponált pOU56 plazmid előállítására a b) lépés szerinti módon kapott plazmidba λ : : Tn3 fég DNS-t iktatunk be, a kapott plazmidokat E. coliba transzformáljuk, az ampícillin-rezisztencia és λ-immunitás alapján transzforménsokat izolálunk, és ezekből a plazmidot kívánt esetben kinyerjük;

   d) E. coli CSH50 törzsben, DSM 2470 számon deponált pOU57 plazmid előállítására a c) lépés szerinti módon kapott plazmidból BamHI-EcoRI emésztéssel a transzpozíció-gént kiiktatjuk, a kapott tapadós végeket pBR32224

   -bői származó kis BamHI-EcoRI fragmenssel kapcsoljuk, a kapott plazmidot E. coliba transzformáljuk, ampicillin-rezisztencia és λ-fertőzés alapján transzforménsokat izolálunk, és ezekből a plazmidot kívánt esetben kinyerjük;

   e) E. coli CSH50 törzsben, DSM 2471 számon deponált pOU71 plazmid előállítására a d) lépés szerinti módon kapott plazmid BglII helyére pKN1562 plazmidból származó, copB gént tartalmazó BglII fragmenst iktatunk, a kapott plazmidot E. coliba transzformáljuk, ampicillin-rezisztencia és λ-fertőzés, majd copB gén jelenléte alapján transzformánsokat izolálunk, és ezekből a plazmidot kívánt esetben kinyerjük;

   f) E. coli CSH50 törzsben, DSM 2472 számon deponált pOU73 plazmid előállítására a d) lépés szerinti módon kapott plazmid EcoRI helyére pOU16 plazmidból származó, copB gént tartalmazó EcoRI fragmenst iktatunk, a kapott plazmidot E. coliba transzformáljuk, ampicillin-rezisztencia, λ-fertözés és copB gén jelenléte alapján transzformánsokat izolálunk, és ezekből a plazmidot kívánt esetben kinyerjük;

   g) E. coli CSH50 törzsben, DSM 2473 számon deponált pOU75 plazmid előállítására az e) lépés szerinti módon kapott plazmidból HindlII enzimmel végzett részleges emésztéssel az EcoRI helyet kiiktatjuk, a kapott plazmidot E. coliba transzformáljuk, ampicillin-rezisztencia és λ-fertőzés alapján transzformánsokat izolálunk, és ezekből a plazmidot kívánt esetben kinyerjük;

   h) E. coli CSH50 törzsben, DSM 2474 számon deponált pOU106 plazmid előállítására az e) lépés szerinti módon kapott plazmid BamHI-Bgll helyére pMC903 plazmidból származó, lac-gént tartalmazó BamHI-Bgll fragmenst iktatunk, a kapott plazmidot E. coliba transzformáljuk, ampicillin-rezisztencia és β-galaktozidáz képzés alapján transzformánsokat izolálunk, és ezekből a plazmidot kívánt esetben kinyerjük;

   ί) E. coli CSH50 törzsben, DSM 2481 számon deponált pOU79 plazmid előállítására az e) lépés szerinti módon kapott plazmidot BamHI enzimmel teljesen és PstI enzimmel részlegesen emésztjük, és pMC871 BamHI és PstI enzimmel végzett teljes emésztése útján kapott DNS fragmenssel ligáljuk, a ligációs keveréket E. coliba transzformáljuk, ampicillin-rezisztencia alapján laktóz-indikátor lemezeken transzforménsokat izolálunk, és ezekből a plazmidot kivánt esetben kinyerjük;

   j) E. coli CSH50 törzsben, DSM 2482 számon deponált pŰU82 plazmid előállítására az I) lépés szerinti módon kapott plazmidot BamHI enzimmel teljesen és Sáli enzimmel részlegesen emésztjük, és pSKS104 plazmid BamHl-SalI fragmensével ligáljuk, a kapott plazmid lac Z génjében található EcoRI-Clal fragmenst pVH1424 plazmid EcoRI-Clal frag-2345

   HU 201116 Β mensére cseréljük, a kapott plazmidot E. coliba transzformáljuk, és a transzformánsokból a plazmidot kívánt esetben kinyerjük;

   k) E. coli CSH50 törzsben, DSM2483 számon deponált pOU91 plazmid előállítására a j) lépés szerinti módon kapott plazmidot EcoRI enzimmel emésztjük, ennek helyére pKN184 plazmid EcoRI-A fragmensét iktatjuk, a kapott plazmid méretét BamHI enzimmel teljesen és Sau3A enzimmel részlegesen emésztve csökkentjük, a kapott plazmidot E. coliba transzformáljuk, és a transzformánsokból a plazmidot kívánt esetben kinyerjük;

   l) E. coli CSH50 törzsben, DSM2757 számon deponált pOUlOl plazmid előállítására a g) lépés szerinti módon kapott plazmid BamHI helyére Sau3A fragmenst iktatunk, a kapott plazmidot E. coliba transzformáljuk, ampicillin-rezisztencia és λ-fertőzés alapján transzformánsokat izolálunk, és ezekből a plazmidot kívánt esetben kinyerjük;

   ni) E. coli CSH50 törzsben DSM2759 számon letétbe helyezett pOU130 plazmid előállítására a k) lépés szerinti módon kapott plazmidot BamHI enzimmel emésztjük, a BamHI helyet Bal31 exonukleázzal eltávolítjuk, a kapott plazmidot EcoRI és Clal enzimmel emésztjük, pMC1403 plazniidból származó EcoRI-Clal fragmenssel ligáljuk, a kapott plazmid BamHI helyére copB gént tartalmazó BglII fragmenst iktatunk a kapott plazmidot E. coliba transzformáljuk, ampicillin-rezisztencia alapján laktóz indikátor lemezeken transzformánsokat izolálunk, és ezekből a plazmidot kívánt esetben kinyerjük;

   η) E. coli CSH50 törzsben, DSM2718 számon letétbe helyezett pLC31 plazmid előállítására a g) lépés szerinti módon kapott plazmidot BamHI enzimmel emésztjük, pBEU14 plazmidból származó BamHI fragmenssel ligáljuk a kapott plazmidot E. coliba transzformáljuk, és a transzformánsokból kívánt esetben a plazmidot kinyerjük;

   ο) E. coli C600 törzsben, DSM2945 számon letétbe helyezett pLC33 plazmid előállítására az a, lépés szerinti módon kapott plazmid EcoRI helyére EcoRI enzimmel emésztett pLC28 plazmidot iktatunk, a kapott plazmidot BamHI és Bal31 enzimmel emésztjük, ligáljuk, és E. coliba transzformáljuk, transzformánsokat izolálunk kanamicin- és ampicillin-rezisztencia alapján, és a transzformánsokból kívánt esetben a plazmidot kinyerjük;

   p) E. coli C600 törzsben, DSM 2946 számon letétbe helyezett pLC34 plazmid előállítására az a) lépés szerinti módon kapott plazmid EcoRI helyére EcoRI enzimmel emésztett pLC28 plazmidot iktatunk, a kapott plazmidot BamHI és Bal31 enzimmel emésztjük, ligáljuk,

   E. coliba transzformáljuk, traszformánsokat izolálunk kanamicin-rezisztencia és ampicillin-érzékenység alapján, és a transzformánsokból a plazmidot kívánt esetben kinyerjük.

   5 (Elsőbbsége: 1982. 09. 16.)
4. 4. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy E. coli CSH50 törzsben, DSM2758 számon letétbe helyezett pOUllO plazmid előállítására a 3. igénypont i) lépés

   10 szerinti módon kapott plazmidot BamHI enzimmel teljesen és Sall enzimmel részlegesen emésztjük, és pVH1451 plazmid EcoRI-Clal fragmensével ligáljuk, a kapott plazmidot BainHl és BglII enzimmel részlegesen emészt15 jük, ligáljuk, és E. coliba transzformáljuk, transzformánsokból a plazmidot kívánt esetben kinyerjük. (Elsőbbsége: 1982. 09. 24.)

   Kiadja az Országos Találmányi Hivatal, Budapest A kiadásért felel: dr. Szvoboda Gabriella osztályvezető R 4962 - KJK

   90.3348.66-13-2 Alföldi Nyomda Debrecen - Felelős vezető: Szabó Viktor vezérigazgató

   -24HU 201116 B

   Int Cl⁵ C 12 N 15/70

   9/1

   X)

   -a

   CM

   C o

   4—»

   Π3 ' -to

   LO

   O

   -a ró

   1. ábra cao