DE3750125T2

DE3750125T2 - Biologische eindämmung.

Info

Publication number: DE3750125T2
Application number: DE3750125T
Authority: DE
Inventors: Poul Andersson; Kenn Gerdes; Per Klemm; So Ren Molin
Original assignee: Genexpress ApS
Current assignee: Apovia Ag 82152 Planegg De
Priority date: 1986-03-26
Filing date: 1987-03-25
Publication date: 1994-10-27
Anticipated expiration: 2007-03-26
Also published as: ATE107697T1; CA1315224C; US5853718A; DE3750125D1; JP3090270B2; WO1987005932A1; EP0273040B1; US5670370A; JPH01500002A; AU7232087A; EP0273040A1

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur biologischen Einschließung eines Organismus oder eines Replikons unter bestimmten Bedingungen und ein in dem Verfahren verwendetes Replikon, sowie eine das Replikon enthaltende Zelle.
Techniken, die von der in vitro-Rekombination von DNA-Molekülen Gebrauch machen und die üblicherweise als "Gentechnik" bezeichnet werden, haben die Isolierung
spezifischer Gene und die Expression solcher Gene in einer Vielzahl von Wirtszellen, einschließlich solcher, in denen die in Frage kommenden Gene in der Natur nicht gefunden oder exprimiert werden, ermöglicht. Ein rekombinantes DNA-Molekül besteht typischerweise aus einem Vektor, welcher zur autonomen Replikation in den ihn enthaltendenden Wirtszellen in der Lage ist, oder der in das Wirtszellgenom integriert ist, einem oder mehreren Genen, die für ein oder mehrere erwünschte biosynthetische Produkte kodieren, und für die Expression des Gens oder Gene in der Wirtszelle erforderlichen DNA-Sequenzen. Die rekombinanten DNA-Techniken sind für industrielle Anwendungen, wie die großmaßstäbliche Fermentation gentechnisch veränderter Organismen, wie Bakterienhefen oder Tierzellen, zur Herstellung von einem oder mehreren erwünschten biosynthetischen Produkten, wie Peptidhormone, z. B. Insulin und Wachstumshormon, oder Enzyme, wie Plasminogenaktivatoren bedeutsam geworden. Ein anderer wichtiger Anwendungsbereich ist die kontrollierte Freisetzung von gentechnisch veränderten Mikroorganismen oder Viren in die Umgebung, z. B. Bakterien oder Viren, die zur Abtötung von Insektenlarven in der Lage sind, die für bestimmte Pflanzen schädlich sind, von Bakterien, die bestimmte umweltschädlichliche Stoffe, wie Öl, abbauen, oder von Bakterien, die die Kälteempfindlichkeit bestimmter Getreidearten verringern.
Seit dem frühesten Stadium der rekombinanten DNA-Techniken in den 70iger Jahren war sich die wissenschaftliche Welt in hohem Maße der möglichen biologischen Gefahren bewußt, die mit der Gentechnik einhergehen. Als Ergebnis schlugen die National Institutes of Health, Bethesda, USA, eine Katalog von Richtlinien für die rekombinante DNA-Forschung "Guidelines for Recombinant DNA Research" vor, welcher den Standard für die meisten anderen Länder bildete. Seit 1978 sind die Richtlinien regelmäßig auf Grundlage gesammelter experimenteller Daten, die mögliche biologische Risiken, welche mit rekombinanter DNA-Tätigkeit einhergehen, betreffen, revidiert worden.
Trotz einer Tendenz zur Lockerung der NIH-Regelungen ist die öffentliche Meinung nach wie vor in hohem Maße über die möglichen biologischen Risiken, die mit der Gentechnik einhergehen, besorgt. Die öffentliche Sorge richtet sich hauptsächlich auf die möglichen Wirkungen von Experimenten, bei denen eine kontrollierte Freisetzung gentechnisch veränderter Organismen in die Umgebung beteiligt ist. In vielen Ländern jedoch wurde auch die großmaßstäbliche Produktion von biosynthetischen Substanzen zur Verwendung bei der Therapie und ähnlichem, hinsichtlich ihrer Sicherheit, insbesondere hinsichtlich der Wirkung einer zufälligen Freisetzung der solche Substanzen produzierenden Organismen aus den Fermentoren in die Umgebung in Frage gestellt. Daher ist es nicht möglich, das industrielle Potential der Gentechnik voll auszuschöpfen, bevor die Sicherheitsfragen gelöst sind.
Zur Vermeidung oder mindestens zur Verringerung der Risiken, die mit Experimenten oder großmaßstäblichen Anwendungen der Gentechnik einhergehen, wie z. B. die Freisetzung von rekombinanten Organismen in die Umgebung, müssen Maßnahmen getroffen werden, um die Anzahl solcher unter üblichen Arbeitsbedingungen, wie auch im Falle bestimmter Unfälle, mittels einer geeigneten physikalischen Ausstattung der Laboratorien oder Produktionsstätten zu begrenzen.
Solche Maßnahmen werden als "physikalische Einschließung" bezeichnet, welche jedes Ausstattungsmerkmal von Laboratorien oder Produktionsstätten meint, welche die rekombinanten Organismen auf einen spezifischen, bestimmten und eingeschränkten Bereich eingrenzen soll. Verschiedene Stufen der physikalischen Einschließung sind für verschiedene Typen rekombinanter DNA-Arbeit gemäß den NIH-Regelungen erforderlich. Daher erfordert die Arbeit mit potentiellen Pathogenen höhere physikalische Bedingungen in einem Labor oder in einer Herstellungsstätte, wo diese Arbeit durchgeführt wird.
Physikalische Einschließungsmaßnahmen sind innerhalb eines Labors oder einer Produktionsstätte durchführbar, wohingegen solche Maßnahmen bei Anwendungen, die eine kontrollierte Freisetzung gentechnisch veränderter Mikroorganismen in die Umgebung erfordern, nicht möglich sind.
Alternativ oder gleichzeitig kann das Überleben zufällig freigesetzter rekombinanter Organismen oder die Ausbreitung rekombinanter DNA-Moleküle in die Umgebung durch "biologische Einschließung" begrenzt werden. Dieser Begriff soll jedes Merkmal in der Wirtszelle oder eines für die Produktion eines spezifischen biosynthetischen Produkts oder wegen seiner Fähigkeit zur Hervorbringung eines erwünschten Ereignisses eingesetzten Replikons bedeuten, wobei das Merkmal dazu dient, das Wachstumspotential der Wirtszelle außerhalb einer spezifischen eingeschränkten Umgebung, wo spezifische Bedingungen vorherrschen (im Folgenden als "definierte Umgebung" bezeichnet) einzugrenzen, und/oder es soll jedes Merkmal des in der Wirtszelle enthaltenen Replikons bedeuten, wobei das Merkmal dazu dient, die Ausbreitung des Replikons (wie auch jeder eingefügter eingefügter Fremdnukleotidsequenz, z. B. einer Nukleotidsequenz, die nicht in der Natur mit dem in Frage kommenden Replikon verwandt ist) auf andere Organismen, als auf welche die Ausbreitung beabsichtigt war, einzugrenzen. Die biologische Einschließung kann auch durch eine Kombination spezifischer Merkmale sowohl der Wirtszelle und des Replikons erreicht werden, wobei die Merkmale das Überleben der Zellen einschränken. In diesem Zusammenhang werden solche Organismen, die mit der spezifischen genetischen Information in der Form eines diese Information tragenden Replikons zur Ausformung spezifischer phenotypischer Merkmale ausgerüstet sind, als "primäre Wirtszellen" bezeichnet.
Ein üblicher Weg zur Sicherstellung der biologischen Einschließung eines spezifischen Organismus, der ein rekombinantes DNA-Molekül enthält, ist die Einschränkung seiner Fähigkeit zur Verbreitung außerhalb einer definierten Umgebung. Typischerweise werden Wirtsorganismen verwendet, die durch Einführung einer Anzahl unabhängiger Mutationen abgeschwächt wurden, was zu wohl definierten Anforderungen nach einem oder mehreren Wachstumsfaktoren führt, die üblicherweise nicht in der natürlichen Umgebung gefunden werden (bezeichnet als die Umgebung außerhalb der definierten Umgebung z. B. eines Labors oder einer Herstellungsstätte [im Folgenden gelegentlich als die "Außenumgebung" bezeichnet]; der Begriff "natürliche Umgebung" soll den Darmtrakt miteinschließen) und/oder die eine allgemein herabgesetzte Konkurrenzfähigkeit relativ zu den Wildtyporganismen der gleichen Art haben. Zum Beispiel ist E. coli K-12 ein abgeschwächter Bakterienstamm, der üblicherweise in Experimenten und Produktionen mit gentechnischen Anwendungen verwendet wird, da dieser abgeschwächte Stamm nicht zur Vermehrung und zur Etablierung außerhalb der definierten Bedingungen im Labor oder der Herstellungsstätte, in welcher er eingesetzt wird, in der Lage ist. Ferner ist dieser E. coli-Stamm nicht in der Lage, sich an die Epithelzellen des Darmtraktes von Säugern anzuheften, welches die natürliche Umgebung von E. coli ist, was bedeutet, daß die Kolonisierung des natürlichen Habitats von E. coli durch gentechnisch veränderten E. coli K-12 äußerst unwahrscheinlich vorkommen wird.
Man sollte jedoch beachten, daß, obwohl E. coli K-12 nicht mit natürlichen Organismen konkurrieren kann, er doch für einen gewissen Zeitraum in einer natürlichen Umgebung überlebt.
Wenn ein Experiment oder eine tatsächliche Produktion die kontrollierte Freisetzung eines gentechnisch veränderten Organismus in die natürliche Umgebung (wie oben definiert) erfordert, ist es nicht möglich, eine biologische Einschließung unter Verwendung einer wie oben beschrieben abgeschwächten Wirtszelle zu erreichen. Es ist offensichtlich, daß in die Umgebung entlassene Mikroorganismen, die dort eine Funktion ausüben sollen, in der Lage sein müssen, zu ihrem Vorteil mit den Wildtyporganismen in der gleichen Umgebung, entweder von derselben Art oder anderen Arten, zu konkurrieren, um sich selbst, zumindestens vorübergehend, in einer geeigneten ökologischen Nische zu etablieren.
Ein weiterer Bereich der biologischen Einschließung betrifft die Eingrenzung der Ausbreitung von auf einem Replikon vorhandener genetischer Information (wahlweise einschließlich eingefügter Fremd-DNA), wobei das Replikon z. B. ein bakterielles Plasmid sein kann, ausgehend von einer primären Wirtszelle, die für experimentelle Zwecke oder zur industriellen Produktion verwendet wurde, auf andere Zellen, entweder von derselben Art, denen jedoch die abschwächenden Mutationen der primären Wirtszellen fehlen, wobei die Mutationen den Wirtszellen als Teil eines biologischen Einschließungssystems eingebaut wurden, oder auf Zellen einer verschiedenen Art, die zur Vermehrung außerhalb der definierten Umgebung, welche für das Wachstum der primären Wirtszellen erforderlich ist, in der Lage sind, wobei die definierte Umgebung Teil eines biologischen Einschließungssystems ist.
Genetische Information kann von Organismus zu Organismus auf verschiedene Weisen übermittelt werden. Bei Bakterien und Bakterienplasmiden können diese durch bakterielle Konjugation übertragen werden, wobei eine physische Brücke zwischen zwei sich paarenden Bakterien gebildet wird, so daß das Plasmid von einem Bakterium auf das andere durch diese Brücke übertritt. Bakterien verschiedener Arten können Plasmide durch Konjugation austauschen, und bestimmte Plasmide sind in der Tat zwischen solch entfernt verwandten gram-negativen Bakterien, wie E. coli und Pseudomonas spp., übertragbar. Da die Fähigkeit von Bakterien zur Konjugation und die Fähigkeit von Plasmiden zur Übertragung Eigenschaften sind, die mit von Plasmiden stammenden DNA-Sequenzen verbunden sind, ist es erforderlich, daß, wenn gentechnisch veränderte Bakterien beteiligt sind, die bei der industriellen Produktion verwendeten Vektoren keine DNA-Sequenzen aufweisen, die für die bakterielle Konjugation und Plasmidtransfer verantwortlich sind. Dieses Erfordernis bildet die Hauptmaßnahme einer biologischen Einschließung hinsichtlich Bakterienplasmide.
Genetische Information, die z. B. auf einem Bakterienplasmid vorhanden sein kann, kann jedoch auch auf anderen Wegen verbreitet werden, der nicht durch Entfernung der genetischen Information, welche für die bakterielle Konjugation und Plasmidtransfer kodiert, begegnet werden kann.
Primäre Wirtszellen (durch geeignete Mutationen zur Sicherstellung eines Langzeitüberlebens nur unter definierten Umgebungsbedingungen abgeschwächt), welche ein rekombinantes DNA-Plasmid enthalten, können gelegentlich durch einen oder mehrere natürlich vorkommende Bakteriophagen infiziert werden. Man kennt einige Bakteriophagen, die die Fähigkeit zur zufälligen Aufnahme von Plasmiden oder anderen DNA-Molekülen besitzen, und sie auf sekundäre Wirtszellen übertragen (Zellen, die nicht für die Produktion der biosynthetischen Produkte oder anderen Zwecken beabsichtigt sind, z. B. typischerweise Wildtypstämme, wie sie in der natürlichen Umgebung gefunden werden), die nicht abgeschwächt sind und die daher in der Lage sind, sich außerhalb der definierten Umgebung, die für das Wachstum der primären Wirtszellen eingerichtet wurde, zu vermehren.
Eine ähnliche Situation kann auftreten, falls ein Bakterium, das eines der natürlich vorkommenden Plasmide, welches für die bakterielle Konjugation kodiert, enthält und in der Lage ist, bei einer Konjugation übertragen zu werden, mit einer primären Wirtszelle, die bereits ein rekombinantes Plasmid enthält, konjugiert. Es kann dann homologe Rekombination zwischen den beiden Plasmiden auftreten, was zum Transfer des rekombinanten Plasmids auf eine weitere Wirtszelle führt.
Ein weiterer Weg der Ausbreitung genetischer Information auf Zellen, denen die abschwächenden Mutationen, welche auf den primären Wirtszellen eingeführt wurden, fehlen, ist die passive Aufnahme freier DNA durch die Zellen, die sogenannte Transformation. Viele natürlich vorkommende Mikroorganismen sind zur Aufnahme freier DNA in der Lage. Die DNA kann dann in das Chromosom der neuen sekundären Wirtszelle integriert werden, oder kann sich autonom in den Wirtszellen, welche sich aufgrund des Fehlens von abschwächenden Mutationen vermehren und sich außerhalb der definierten Umgebung des Laboratoriums oder der Produktionsstätte etablieren können, replizieren. Es besteht einige Sicherheit für die Vermutung, daß bedeutende Mengen bakterieller Plasmid-DNA in biologisch aktiver Form aus, z. B. E. coli-Zellen, während ihres Wachstums in einem Fermentor freigesetzt werden. Dies würde bedeuten, daß das Fermentationsmedium, aus dem die Zellen geerntet wurden, eine Hauptquelle von Plasmid-DNA darstellt, die möglicherweise von einer sekundären Wirtszelle durch Transformation, wenn auch mit geringer Häufigkeit, aufgenommen werden könnte, falls das Fermentationsmedium in die Umgebung freigesetzt wird. Die gegenwärtig eingesetzten Verfahren zur biologischen Einschließung bieten keine Lösung für dieses Problem.
Bei Experimenten oder praktischen Anwendungen, bei denen die kontrollierte Freisetzung gentechnisch veränderter Mikroorganismen in die natürliche Umgebung (wie oben definiert) beteiligt ist, kann die Ausbreitung des Replikons [wahlweise einschließlich eingefügter fremder Nukleotidsequenzen]) durch Konjugation eingegrenzt werden, falls die Gene oder Nukleotidsequenzen, die für die Konjugation verantwortlich sind, nicht auf dem Vektor lokalisiert sind, siehe die obige Diskussion. Dieses Verfahren zur biologischen Einschließung enthält jedoch keine Maßnahmen gegen die Ausbreitung von z. B. einem Bakterienplasmid auf neue sekundäre Wirtszellen durch Transduktion, durch Rekombination mit übertragbaren Plasmiden oder durch Transformation rekombinanter DNA, welche aus lysierten rekombinanten Organismen freigesetzt wurde.
Obwohl Versuche unternommen wurden, Stämme mit erhöhten biologischen Einschließungseigenschaften hervorzubringen, zeigen die meisten, wenn nicht alle, den Nachteil, daß sie deutlich die Wachstumseigenschaften der Zellen auch unter den bevorzugten Bedingungen im Laboratorium oder der Herstellungsstatte beeinträchtigen, und meistens wird eine Wachstumsinhibierung anstelle einer Zelltötung außerhalb der definierten Umgebung erreicht.
Die obige Aufzählung der Probleme hinsichtlich der Einschließung rekombinanter Organismen betrifft hauptsächlich Bakterien. Es sollte jedoch betont werden, daß ähnliche Argumente auch auf eukaryontische Organismen und Viren zutreffen.
Die Erfindung zeigt einen neuen Weg für das Konzept einer biologischen Einschließung auf, wobei sie von einem aktiven Einschließungsfaktor Gebrauch macht, nämlich einer zelltötenden Funktion, welche exprimiert wird, falls primäre Wirtszellen, welche ein rekombinantes DNA-Molekül enthalten, neuen Umgebungsbedingungen ausgesetzt sind, oder als Ergebnis eines zufälligen Vorgangs, oder falls eine sekundäre Wirtszelle das rekombinante DNA-Molekül, welches ursprünglich in der primären Wirtszelle enthalten war, empfängt. In einigen Fällen wird die sekundäre Wirtszelle nur unter Bedingungen getötet, welche die Expression der zelltötenden Funktion induzieren.
Daher betrifft die Erfindung ein Replikon, bei dem eine für eine zelltötende Funktion kodierende Nukleotidsequenz regulierbar exprimiert wird, wenn das Replikon in einem Typus einer Wirtszelle (primärer Wirtszelle) enthalten ist, so daß Zellen, welche das Replikon enthalten, unter Bedingungen, bei denen die zelltötende Funktion exprimiert wird, abgetötet werden, und die die zelltötende Funktion kodierende Nukleotidsequenz regulierbar ist oder konstitutiv exprimiert wird, wenn das Replikon in einem anderen Typus von Wirtszelle (sekundärer Wirtszelle) enthalten ist, so daß diese das Replikon enthaltende Zellen einheitlich abgetötet werden, oder unter Bedingungen abgetötet werden, bei denen die zelltötende Funktion exprimiert wird.
In diesem Zusammenhang bedeutet der Begriff "Replikon" ein Segment einer Nukleinsäure, z. B. ein bakterielles Plasmid, ein bakterielles Chromosom, ein prokaryontisches Virus, ein eukaryontisches Plasmid, ein eukaryontisches Virus, ein eukaryontisches Chromosom, eukaryontische Mitochondrien oder eukaryontische Chloroplasten.
In diesem Zusammenhang soll der Begriff "Zelle" Bakterien und eukaryontische Organismen, wie einzellige Organismen, z. B. Hefen oder Pilze, wie auch vielzellige Organismen, wie Pflanzen, Tiere oder Pilze, und Zellen, die aus Geweben vielzelliger eukaryontischer Organismen, wie Pflanzen, Tiere oder Pilzen stammen, bedeuten.
Es ist zu betonen, daß das Replikon so aufgebaut sein kann, daß es in der Lage ist, die Einschließung von primären Wirtszellen innerhalb einer definierten Umgebung wie auch des Replikons selbst zu bewirken. Wenn das Replikon in einem Typus einer Wirtszelle, nämlich den primären Wirtszellen, enthalten ist, sollte die für die zelltötende Funktion kodierende Nukleotidsequenz regulierbar exprimiert sein. Dies bedeutet, daß, wenn die primäre Wirtszelle bestimmten Bedingungen unterworfen wird, wie sie z. B. innerhalb einer definierten Umgebung vorherrschen, wo ihre Gegenwart entweder aus Gründen für die Produktion eines spezifischen Produkts erforderlich ist, oder weil sie andere Funktionen, wie den Abbau eines schädlichen Produkts, erfüllt, erwünscht ist, wird die die zelltötende Funktion kodierende Nukleotidsequenz nicht exprimiert, und die Wirtszellen bleiben lebensfähig und in der Lage, ihre Funktion auszuüben. Wenn jedoch die primären Wirtszellen einer spezifischen Veränderung in ihren Umgebungsbedingungen unterworfen werden, wird die zelltötende Funktion exprimiert, wobei die primären Wirtszellen, die das Replikon enthalten, abgetötet werden.
Es ist auch möglich, als Teil eines Herstellungsverfahrens für ein spezifisches Produkt, willkürlich primäre Wirtszellen, die z. B. in einem Fermentationsgefäß vorhanden sind, abzutöten, indem Bedingungen geschaffen werden, unter denen die zelltötende Funktion exprimiert wird. Dieses Verfahren wäre in Übereinstimmung mit den Erfordernissen, die von bestimmten Gesundheitsbehörden auferlegt werden, nämlich daß gentechnisch veränderte Organismen abgetötet werden müssen, bevor sie das Fermentationsgefäß verlassen.
Das Prinzip der Erfindung zur Erreichung einer biologischen Einschließung durch Einführung eines Replikons, welches eine für eine zelltötende Funktion kodierende Nukleotidsequenz in einer Primärzelle trägt, kann es ermöglichen, einen Wildtypstamm als primäre Wirtszelle zu verwenden, z. B. Zellen, die in der industriellen Produktion eines biosynthetischen Produkts eingesetzt werden. Dies bietet einen wichtigen Vorteil gegenüber der Verwendung mutierter abgeschwächter Stämme, die bislang als Sicherheitsmaßnahme, wie oben angedeutet, eingesetzt wurden, so daß es nicht notwendig ist, spezifische Wachstumsbedingungen, wie spezifische Medien, die einen oder mehrere besondere Wachstumsfaktoren, die für das Wachstum der mutierten Organismen erforderlich sind, zu verwenden, wodurch die Kosten für die eingesetzten Medien verringert werden, und man einen weiteren Bereich von Mediumsbestandteilen einsetzen kann. Ferner können Wildtyporganismen besser für genetische Manipulationen geeignet sein, oder verbesserte Fermentationseigenschaften zeigen, oder sie können von der Art sein, so daß sie ein spezifisches erwünschtes biosynthetisches Produkt herstellen, man sie aber für die Verwendung zur großmaßstäblichen Produktion noch nicht zugelassen hat.
Sollte das Replikon durch einen anderen Typus einer Wirtszelle, der sekundären Wirtszelle, aufgenommen werden, welche üblicherweise ein Wildtyporganismus ist, wie er in der natürlichen Umgebung gefunden wird, in welche die primären Wirtszellen freigesetzt wurden oder wahlweise ein Medium, in welchem die primären Wirtszellen kultiviert wurden, kann die für die zelltötende Funktion kodierende Nukleotidsequenz regulierbar oder konstitutiv exprimiert werden. In beiden Fällen wird die sekundäre Wirtszelle abgetötet, wenn die Expression der zelltötenden Funktion nicht länger unterdrückt oder inhibiert ist.
In einigen Fällen ist die Größe des DNA-Fragments, welches die für die zelltötende Funktion kodierende Nukleotidsequenz enthält, nicht bedeutsam für seine erfindungsgemäße Verwendung. Es ist jedoch oft bevorzugt, daß die für die zelltötende Funktion kodierende Nukleotidsequenz auf einem kleinen DNA-Fragment vorliegt, was hinsichtlich der Tatsache vorteilhaft ist, daß die Kopienanzahl des Replikons im allgemeinen kleiner wird, wenn die Gesamtgröße des Replikons ansteigt. Folglich führt die Insertion des für die zelltötende Funktion kodierenden DNA-Fragments mit dem Zweck der Erreichung einer biologischen Einschließung nicht zu einer wesentlichen Abnahme in der Ausbeute eines erwünschten biosynthetischen Produkts, das ebenfalls durch das Replikon kodiert wird, wenn das die zelltötende Funktion kodierende DNA-Fragment nur eine kurze Sequenz enthält. Vorteilhafte Nukleotidsequenzen, die für eine zelltötende Funktion kodieren, haben eine Größe von 1500 Nukleotiden oder weniger, vorzugsweise 1000 Nukleotiden oder weniger, wie z. B. 500 bis 200 Nukleotiden oder weniger.
Ein erfindungsgemäßer Weg, durch den die Expression der zelltötenden Funktion reguliert werden kann, ist die zur Verfügungstellung eines Replikons, bei dem die Expression der zelltötenden Funktion auf der Ebene der Transkription reguliert wird. Die Regulation auf der Ebene der Transkription kann auf verschiedene Arten ausgeführt werden, jedoch findet die Regulation vorzugsweise mittels eines Promotors, der durch einen oder mehrere Faktoren reguliert wird, statt. Diese Faktoren können entweder solche sein, die durch ihre Gegenwart die Expression der für die zelltötende Funktion kodierenden Nukleotidsequenz sicherstellen oder können, gegebenenfalls, solche sein, welche die Expression dieser Nukleotidsequenz unterdrücken, so daß ihr Fehlen die Expression der zelltötenden Funktion auslöst. Wenn daher eine primäre Wirtszelle in die Umgebung freigesetzt wird, oder wenn ein rekombinantes DNA-Molekül von einer sekundären Wirtszelle, d. h. außerhalb der definierten Umgebung des Experiments oder der Produktion oder einer spezifisch eingeschränkten Umgebung, in welche ein Organismus für einen spezifischen Zweck freigesetzt wurde, aufgenommen wird, wird der Promotor und gegebenenfalls seine damit verbundene regulatorische Sequenz durch Gegenwart oder Fehlen von einem oder mehreren dieser Faktoren unter Einflußnahme auf die Transkription der für die zelltötende Funktion kodierenden Nukleotidsequenz aktiviert, wodurch ein zelltötendes Produkt produziert wird und die Wirtszellen abgetötet werden.
Faktoren für die Regulation der Promotoraktivität können ausgewählt werden aus einer Vielzahl von Faktoren. Im Prinzip kann die Expression des für die zelltötende Funktion kodierenden Gens durch die Umgebungsbedingungen oder den physiologischen Zustand der Zellen, oder durch ein zyklisches oder stochastisches Vorkommnis festgelegt werden. In diesem Zusammenhang bedeutet der Begriff "zyklischer Vorgangs" ein sich zyklisch wiederholender Vorgang, der Veränderungen bei bestimmten Faktoren auslöst, die als für die Beeinflussung der Expression der zelltötenden Funktion geeignet bekannt sind, wie Temperaturbedingungen, Veränderungen in der Lichtintensität oder hormonelle Veränderungen. Der Begriff "physiologischer Zustand der Zellen" bedeutet Faktoren, wie die Zelldichte oder Wachstumsphase der Zellen.
Vorteilhafte erfindungsgemäße Faktoren sind, da diese am leichtesten regulierbar sind, das Vorliegen oder Fehlen einer bestimmten chemikalischen Substanz in der Umgebung oder die physikalischen Bedingungen in der Umgebung, wie die in der Umgebung herrschende Temperatur, oder andere physikalische Eigenschaften (z. B. die Lichtintensität in der Umgebung). Es ist daher möglich, sich Einschließungssysteme vorzustellen, bei denen die für die zelltötende Funktion kodierende Nukleotidsequenz exprimiert wird, wenn eine bestimmte chemische Substanz, die im Fermentationsmedium des primären Wirtsorganismus vorhanden ist, in der Umgebung, in welche die primäre Wirtszelle freigesetzt wird, nicht vorhanden ist, d. h. wenn die primären Wirtszellen zufällig z. B. aus Fermentationstanks in die Umgebung freigesetzt werden, ein Faktor, der für das Wachstum oder Überleben der Zellen erforderlich ist, nicht länger vorhanden ist, oder der Faktor aus dem Medium mit der gleichen Wirkung verbraucht ist. Der Promotor, der die Transkription der für die zelltötende Funktion kodierenden Nukleotidsequenz reguliert, kann auch durch eine chemische Substanz aktiviert werden, die nicht im Fermentationsmedium des primären Wirtsorganismus vorliegt, aber in der Umgebung in ausreichenden Mengen vorkommt, um den Promotor zu aktivieren. In gleicher Weise kann der Promotor so gestaltet sein, daß er durch eine Veränderung der Temperatur, was bei dem Einschließungsprinzip, welches die erfindungsgemäßen Replikons verwendet, im allgemeinen eine Veränderung bedeutet von einer höheren Temperatur in einem Fermentationsgefäß oder dem Darmtrakt auf eine niedrigere Temperatur, die in der äußeren Umgebung herrscht, oder durch Veränderung der Lichtintensität, bei der der Promotor als Promotor wirksam sein kann, welcher in Gegenwart von Licht mit einer ausreichenden Intensität aktiviert wird, jedoch inaktiv in der Dunkelheit ist, welche im Fermentationsgefäß vorherrscht, welches die definierte Umgebung für den primären Wirt ist.
Sind die primären Wirtsorganismen solche, die in die natürliche Umgebung auf eine kontrollierte Weise freigesetzt werden, z. B. in einen abgesperrten Bereich oder in den Darmtrakt eines Tieres, kann der regulierbare Promotor so gestaltet sein, daß er durch chemische Mittel reguliert wird, d. h. durch Vorkommen oder Fehlen einer bestimmten chemischen Substanz in der Umgebung der Zellen; er ist jedoch besonders vorteilhat ein Promotor, welcher zyklisch aktiviert wird, z. B. durch Temperaturveränderungen, oder durch ein stochastisches Ereignis. Der Begriff "stochastisches Ereignis" soll ein Ereignis bedeuten, welches zufällig mit einer bestimmten Häufigkeit pro Zelle pro Generation oder Sequenz pro Zeiteinheit auftritt, was erfindungsgemäß zur Abtötung der Zellen führt, bei denen die Aktivierung der Expression der zelltötenden Funktion auftritt. Das stochastische Ereignis kann durch periodische Inversionen der Region, welche den Promotor trägt, oder durch Herausschneiden einer Sequenz, welche ein negativ regulatorisches Element trägt, ausgelöst werden. Die Wirkung des Eintretens einer Zellabtötung durch stochastische Ereignisse ist die, daß die Population von Wirtszellen nicht so konkurrenzfähig ist im Vergleich zu Populationen natürlich vorkommender Organismen.
Es ist zu bemerken, daß der zur Initiierung der Transkription der für die zelltötende Funktion kodierende Nukleotidsequenz verwendete Promotor vorzugsweise ein Promotor ist, der zur Auslösung der Expression der die zelltötende Funktion kodierenden Nukleotidsequenz in einer Vielzahl von Wirtsorganismen in der Lage ist, um die allgemeine Anwendbarkeit des Erfindungsprinzip sicherzustellen.
Im Falle einer regulierbaren Transkription der zelltötenden Funktion können die zelltötenden Sequenzen z. B. aus bakteriellen Operons isoliert werden, die an der Biosynthese von Aminosäuren beteiligt sind, oder aus bakteriellen Genen, bei denen die Transkription spät in der stationären Wachstumsphase aktiviert wird, oder aus bakteriellen Genen, die an der Synthese von Oberflächenstrukturen (fimbriae) beteiligt sind. Beispiele geeigneter Promotoren sind der E. coli trp-Promotor, der durch Fehlen von Tryptophan aktiviert wird, die Bakteriophage-lambda PR- und PL-Promotorendie durch temperaturempfindliche Regulationsfaktoren kontrolliert werden, die Promotoren aus dem B. subtilis -Sporulationsgen,
die während der Sporulation aktiviert werden, und die E. coli- und Salmonella fimbriae-Genpromotoren, die stochastisch aktiviert werden.
Bei chemisch regulierbaren Promotoren kann die chemische Substanz, deren Vorliegen oder Fehlen die Aktivierung des Promotors kontrolliert, in geeigneter Weise aus Kohlen- oder Stickstoffquellen, Metaboliten, Aminosäuren, Nukleosiden, Purin- oder Pyrimidin-Basen oder Metallionen ausgewählt sein. Ist die chemische Substanz eine solche, die bei Vorhandensein die Promotoraktivität unterdrückt, sollte sie vorzugsweise selten in der natürlichen Umgebung in solchen Konzentrationen auftreten, daß der Promotor nicht aktiviert wird, wenn die Wirtsorganismen in die natürliche Umgebung freigesetzt werden. Zum Beispiel für einen geeigneten Promotor in z. B. einem Organismus, wie E. coli, ist der trp- Promotor, der in Gegenwart einer ausreichenden Konzentration von Tryptophan in der Zellumgebung unterdrückt wird, der jedoch freigesetzt wird bei Fehlen geeigneter Mengen von Tryptophan in der Umgebung. Ein Einschließungssystem unter Verwendung des trp-Promotors kann daher eine Menge an Tryptophan in z. B. einem Fermentationsgefäß zur Unterdrückung des Promotors umfassen, der reaktiviert wird, wenn der Wirtsorganismus aus dem Fermentationsgefäß in die Umgebung freigesetzt wird, welche üblicherweise sehr geringe Konzentrationen oder überhaupt kein Tryptophan enthält.
Promotoren, die stochastisch aktiviert werden, durch periodische Inversionen der Promotorregion (in diesem Zusammenhang wird dieser ebenfalls als ein "invertierbarer Promotor" und "inversioneller "Switch"-Promotor" bezeichnet) und die für die erfindungsgemäßen Zwecke geeignet sind, umfassen auch die hin-, cin- und gin-Promotoren (R.H.A. Plasterk et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 1983, Seiten 5355-5358; G. Mertens et al, EMBO J. 3, 1984, Seiten 2415-2421; J. Zieg und M.I. Simon, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 1980, Seiten 4196-4200). Ein invertierbarer Promotor, der als praktisch geeignet aufgrund seiner relativ geringen Größe gefunden wurde, ist der fimA-Promotor, welcher einer der E. coli fimbriae-Genepromotoren ist, mit der folgenden Sequenz,
worin die Richtung der Transkription von links nach rechts und die vorgeschlagenen Promotorkonsensus-Sequenzen bei -35 und -10 angegeben sind (P.Klemm, EMBO J. 5, 1986, Seiten 1389-1393).
Die Aktivierung ("inversionaler Switch") dieses Promotors wird durch die Genprodukte zweier Gene reguliert, die für den vorliegenden Zweck als das "an"-Gen und das "aus"-Gen bezeichnet wurden, wobei das Produkt des an-Gens einen Switch von aus (inaktiv) nach an (aktiv), und das Produkt des aus-Gens einen Switch von an nach aus induziert. In einer E. coli-Zelle vom Wildtyp, wo das fimA-Gen und sein verbundener Promotor in einer Kopie auf dem Chromosom vorliegt, kommt ein inversionale Switch mit einer Häufigkeit von einer Zelle zu 1000 Zellen pro Generation vor. Es ist jedoch möglich, die Häufigkeit des inversionalen Switches (im wesentlichen) nach Notwendigkeit/wie erforderlich durch Regulierung der Dosis der Expression der an- und aus-Gene zu steuern. Dies kann z. B. mittels eines geeigneten Promotors erfolgen, der in die an- und aus-Gene zur Transkription eingefügt wird. Die Häufigkeit der Transkriptionsinitiierung durch diese Promotoren bestimmt dann die relativen Dosisspiegel der gebildeten an- und aus-Gene. Daher ist die Frequenz des inversionalen Switches auf die "an"-Position niedriger, wenn relativ große Mengen des aus-Genprodukts gebildet werden, als wenn relativ größere Mengen des an-Genproduktes gebildet werden.
Ein Alternativweg, um eine erfindungsgemäße Wirtszelleinschließung zu erreichen, ist die Regulierung der Expression der für die zelltötende Funktion kodierenden Nukleotidsequenz auf der Translationsebene. Dies kann erreicht werden durch Zur-Verfügung-Stellen einer Antisense-RNA, welche die Translation der Messenger RNA (mRNA), welche die zelltötende Funktion in der primären Wirtszelle spezifiziert, inhibiert. Die Expression der für die Antisense-RNA kodierenden Nukleotidsequenz kann entweder konstitutiv sein oder reguliert werden, um z. B. einen Anstieg in der Kopienzahl des Replikons, welches die zelltötende Funktion trägt, zu erlauben, wobei das einzige Erfordernis ist, daß die Stärke des Promotors so ist, daß ausreichende Menge an Antisense-RNA pro Zeiteinheit gebildet werden, um die Translation in den primären Wirtszellen der die zelltötende Funktion spezifizierenden mRNA komplett zu inhibieren. Wenn ein solches Replikon auf einen anderen Typus einer sekundären Wirtszelle übertragen wird, in der die für die zelltötende Funktion kodierende Nukleotidsequenz transkribiert wird und in der das Produkt dieser Nukleotidsequenz eine zelltötende Funktion ausübt, führt das Fehlen der für die inhibierende Antisense-RNA kodierenden Nukleotidsequenz in der sekundären Wirtszelle zu einer Translation der für die zelltötende Funktion spezifizierenden mRNA, welche ihrerseits das Absterben der sekundären Wirtszellen verursacht. Für die praktische Anwendung bedeutet dies, daß die Expression der für die zelltötende Funktion kodierenden Nukleotidsequenz durch die Gegenwart der Antisense-RNA reguliert wird, der Gensequenz, die in geeigneter Weise auf einem weiteren Replikon in der primären Wirtszelle vorliegt.
Erfindungsgemäß kann die Expression der Antisense-RNA wie oben für den Promotor beschrieben, welcher die Transkription der für die zelltötende Funktion kodierenden Nukleotidsequenz initiiert, durch eine definierten Umgebungsfaktor reguliert werden, der die Aktivität des Promotors, von dem die für die Antisense-RNA kodierende Nukleotidsequenz transkribiert wird, beeinflußt. Diese Umgebungsfaktoren können dieselben sein wie oben erwähnt, und umfassen die Gegenwart oder das Fehlen einer bestimmten chemischen Verbindung in der Umgebung, die Temperatur der Umgebung oder die Lichtintensität in der Umgebung der primären Wirtszelle. Geeignete Promotoren können z. B. von bakteriellen Operons isoliert werden, die in verschiedenen katabolischen Abbauwegen, bei der Osmoregulation oder der Schwermetallresistenz beteiligt sind. Geeignete, durch chemische Substanzen aktivierte Promotoren sind die lac-, ara- und deo-Promotoren, die durch Gegenwart von Laktose-, Arabinose- und Pyrimidin-Nukleosiden aktiviert werden, und osrA, welcher in Gegenwart hoher K&spplus; -Konzentrationen induziert wird, und der Promotor für das Quecksilberresistenzgen von Tn501, welcher durch Schwermetallionen induziert wird. Wenn die Antisense-RNA in der primären Wirtszelle vorhanden ist, ist die Translation der für die zelltötende funktionsspezifizierenden mRNA durch Wechselwirkung zwischen den beiden RNA-Spezies inhibiert. Falls jedoch die primäre Wirtszelle aus ihrer beabsichtigten Umgebung freigesetzt wird, verändern sich die Umgebungsbedingungen, welche die Promotoraktivität regulieren, so daß die für die Antisense-RNA kodierende Nukleotidsequenz, welche so aufgebaut ist, daß sie in einer bestimmten Umgebung exprimiert wird, nicht länger exprimiert wird, und die primären Wirtszellen sterben ab. In gleicher Weise ist keine Antisense-RNA vorhanden, die Produktion des zelltötenden Produktes zu verhindern, wenn das rekombinante DNA-Molekül, das die für die zelltötende Funktion kodierende Nukleotidsequenz trägt, von einem sekundären Wirtsmechanismus aufgenommen wird, und die sekundären Wirtszellen werden ebenfalls absterben.
Falls die Nukleotidsequenz, welche die gesamte oder einen Teil der Antisense-DNA kodiert, zwischen sich direkt wiederholenden Nukleotidsequenzen von ausreichender Größe eingefügt wird, tritt die Rekombination zwischen den Repeats in rekombinant-profizienten Zellen mit einer Häufigkeit auf, die in einem bestimmten Ausmaß experimentell durch Variation der Länge der Repeats und/oder des Abstands zwischen den Repeats festgelegt werden kann, was zum Absterben der Zellen führt, wenn rekombinantes Herausschneiden des negativ wirkenden regulativen Elements stattfindet. Abgesehen davon kann die Expression der Antisense-RNA auch stochastisch reguliert werden, z. B. von einem invertiblen Promotor, welcher einen inversionalen Switch hervorbringt, so daß die Antisense-RNA nicht länger exprimiert wird. Dieser Promotor kann vorzugsweise dem E. coli fimA-Promotor sein.
Die für eine zelltötende Funktion kodierenden Nukleotidsequenzen zur Einfügung in ein erfindungsgemäßes Replikon können von einer Vielzahl von Quellen stammen, wie bakteriellen Plasmiden, bakteriellen Chromosomen, prokaryontischen Viren, eukaryontischen Plasmiden, eukaryontischen Chromosomen, eukaryontischen Viren, eukaryontischen Mitochondrien oder eukaryontischen Chloroplasten; sie können auch synthetisch nach Standardverfahren hergestellt werden. Ein Beispiel für eine Nukleotidsequenz, die eine zelltötende Funktion exprimiert, ist das hok-Gen aus der parB-Region des Plasmids R1, einer Region, von der zuvor gezeigt wurde, daß sie an der stabilen Aufrechterhaltung von R1 innerhalb einer Bakterienpopulation beteiligt ist, siehe die Offenbarung der Internationalen Patentanmeldung PCT/DK83/00086, Veröffentlichungs-Nr. WO 84/01172. Es wurde gefunden, daß ein wichtiges Merkmal für die Plasmidstabilisierung von parB der toxische Effekt des hok-Genprodukts ist, welcher eintritt, wenn die Translation der hok-mRNA, die von der parB-Region von R1 transkribiert wird, nicht länger durch eine mit hok-mRNA hybridisierenden Antisense-RNA, sok, suprimiert wird, die auch von der parB-Region transkribiert wird. Der Verlust des R1-Plasmids aus einer Bakterienzelle führt vermutlich zu einer Veränderung des Verhältnisses zwischen hok mRNA und sok RNA in der plasmidfreien Zelle, vermutlich aufgrund von Unterschieden in der Halbwertszeit der beiden RNA-Spezies, und schließlich zur Translation von hok mRNA, wenn ungenügenden Konzentrationen der inhibitorischen sok RNA in der Zelle vorliegen, was zum Absterben der plasmidfreien Zellen führt.
Die für eine zelltötende Funktion kodierende Nukleotidsequenz kann mit Promotorsequenzen kombiniert werden, wie solchen, die oben beschrieben sind, oder innerhalb der primären Wirtszelle mit einer Sequenz, die für eine wie oben beschriebene Antisense-RNA kodiert, kombiniert werden. Diese Sequenzen können aus natürlichen Quellen stammen, wie solche, die oben für die zelltötende Funktion erwähnt wurden, oder können synthetisch hergestellt werden.
Dieses natürliche System wird erfindungsgemäß verwendet, um ein System einer biologischen Einschließung zu entwerfen, welches das hok-Gen aus R1 zur Eingrenzung rekombinanter Organismen auf eine definierte Umgebung, wie z. B. ein Fermentationsgefäß, zur Eingrenzung rekombinanter DNA-Moleküle oder Viren auf spezifische Wirtszellen, oder Wirtszellen auf eine definierte Umgebung und schließlich zur Eingrenzung, räumlich und zeitlich, in die Umgebung freigesetzter rekombinanter Organismen oder Vektoren, die rekombinante genetische Information tragen, verwendet.
Erfindungsgemäß kann die Wirtszelleinschließung, z. B. die Einschließung eines E. coli-Wirts, der ein rekombinantes DNA-Molekül, wie ein bakterielles Plasmid, enthält, erreicht werden, wenn das hok-Gen nach rekombinanten Standard-DNA-Techniken zusammen mit DNA-Sequenzen, die eine geeignete Promotor/Regulator-Region tragen, in einer solchen Weise eingefügt wird, daß die Transkription des hok-Genes zumindestens teilweise durch die Promotor/Regulator-Sequenzen kontrolliert wird. Falls die spezifischen Umgebungsbedingungen, die durch die Natur der verwendeten Promotor/Regulator-Sequenzen vorgegeben sind, nicht eingehalten werden, wird die Unterdrückung der Promotor/Regulator-Region beendet, was zu einer Transkription des hok-Gens führt, welches seinerseits den Zelltod auslöst. Gegebenenfalls kann es möglich sein, eine weitere Form der Regulation anzuwenden, z. B. translationale Kontrolle, wie oben beschrieben, unter Einsatz einer Antisense-RNA-Inhibierung der hok-mRNA-Translation. Ein solches System kann derart ausgestaltet sein, daß das hok-Gen konstitutiv von dem aus dem Plasmid stammenden Gen exprimiert wird, wogegen der Translation der hok-mRNA durch Synthese einer geeignet aufgebauten Antisense-RNA entgegengewirkt wird, wobei das Gen hierzu von einem, wie oben beschriebenen, regulierten Promotor exprimiert wird, dessen Aktivität vom Vorliegen eines oder mehrerer spezifischer Umgebungsfaktoren abhängt. Wenn diese Faktoren nicht länger vorliegen, ist der Promotor nicht länger aktiv, und daher wird die Antisense-RNA nicht länger exprimiert und inhibiert nicht länger die Translation der hok-mRNA, so daß ein toxisches Produkt gebildet wird, und die Wirtszellen abgetötet werden.
Wie oben beschrieben, stabilisiert das Vorliegen der parB-Region (welche hok- und sok-Gene enthält) auf einem Plasmid die Plasmidvererbbarkeit. Dieses grundlegende Stabilisierungsprinzip kann erfindungsgemäß ausgenutzt werden unter Einfügung eines regulierbaren, vorzugsweise starken Promotors stromaufwärts der hok- und sok-Gene auf eine solche Weise, daß die Transkription von dem Promotor zu einer Synthese des hok-Proteins führt, da die hok-mRNA im Überschuß relativ zur inhibitorischen sok-Antisense-RNA exprimiert wird. Daher bleiben die Plasmide unter Bedingungen, bei denen keine Transkription vom eingefügten Promotor stattfindet, beim Wachstum der Population von Zellen stabil, wogegen unter unterschiedlichen Bedingungen, z. B. in der äußeren Umgebung oder in einer sekundären Wirtszelle, die Transkription des eingefügten Promotors stattfindet, und die Zellen abgetötet werden.
Es ist ein erfindungsgemäßes Merkmal, in Wirtsorganismen, bei denen das R1-hok-Genprodukt nicht toxisch ist, Sequenzen einzusetzen, die homolog oder mit dem R1-hok-Gen aus anderen Organismen verwandt sind, welche in diesen Organismen nach denselben Prizipien, wie für das R1-hok-Genprodukt aufgestellt, aktiv sind. Der Begriff "Homologie" wird hier verwendet, um das Vorliegen eines Ausmaßes an Komplementarität zwischen einer gegebenen Sonde und der zu analysierenden Nukleinsäurespezies anzugeben. Das "Homologiemaß" wird ausgedrückt als Bruchteil der komplementären Basen in einem Duplex-Nukleinsäuremolekül, das zwischen einer gegebenen Sonde und der zu analysierenden Nukleinsäurespezies gebildet wird. Das minimale Homologiemaß, welches nachweisbar ist, ist eine Funktion der experimentellen Bedingungen, die während der Hybridisierung eingesetzt werden, und der charakteristischen Eigenschaften der Sonde und der zu analysierenden Nukleinsäurespezies. Solche homologen Sequenzen wurden innerhalb der chromosomalen DNA einer großen Anzahl von bakteriellen Spezies gefunden (einschließlich gram-positiver Bakterien), innerhalb der mitochondrialen DNA von Hefe, Tetrahymena pyriformis und innerhalb menschlicher Zellen, wie auch innerhalb Erbsen-Chloroplasten-DNA, von denen alle DNA-Sequenzen aufweisen, die mit der R1-parB-Sequenz, wie mit DNA/DNA-Hybridisierung bestimmt, verwandt sind. Daher betrifft die Erfindung auch Replikons, die eine Nukleotidsequenz tragen, welche homolog zum hok-Gen ist.
Die Erfindung betrifft auch eine primäre Wirtszelle, welche ein wie oben beschriebenes Replikon enthält. Die Zelle kann auch eine für eine Antisense-RNA kodierende Nukleotidsequenz enthalten, die wie oben beschrieben in das Zellgenom eingeführt ist. Die primäre Wirtszelle kann ausgewählt sein aus einer Vielzahl von Zellen, wie Bakterien oder eukaryontischen Organismen, wie einzelligen Organismen, z. B. Hefen oder Pilzen, Zellen aus Geweben oder vielzelligen Organismen, wie Pflanzen, Tiere oder Pilze.
In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung eine Nukleotidsequenz, die eine zelltötende Funktion kodiert. Die Nukleotidsequenz kann ferner eine Sequenz zur Regulation der Transkription einer die zelltötende Funktion kodierenden Sequenz enthalten. Die Regulationssequenz kann ein Promotor mit den oben beschriebenen Merkmalen und Funktionen sein.
Die Erfindung betrifft ferner eine Nukleotidsequenz, die eine Antisense-RNA kodiert, welche die Translation einer mRNA, welche eine zelltötende Funktion spezifiziert, inhibieren kann. Wie oben beschrieben, wird diese Nukleotidsequenz vorzugsweise in die Zelle auf einem anderen Replikon eingeführt. Die für die Antisense-RNA kodierende Nukleotidsequenz kann entweder konstitutiv exprimiert werden, oder ihre Transkription kann von einer anderen Nukleotidsequenz reguliert werden, die z. B. ein Promotor, reguliert durch einen oder mehrere der oben beschriebenen Faktoren, sein kann.
In einem wichtigen Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Einschließung eines biologischen Systems, welches umfaßt das Einführen einer für eine zelltötende Funktion kodierenden Nukleotidsequenz in ein biologisches System, wobei die Sequenz regulierbar unter gewissen Bedingungen exprimiert wird, und welche regulierbar oder konstitutiv unter unterschiedlichen Bedingungen exprimiert wird, unter denen das biologische System aufrechterhalten wird.
In diesem Zusammenhang bedeutet der Begriff "biologisches System" ein beliebig strukturiertes biologisches Material, das zur Reproduktion in der Lage ist, wie Nukleinsäure (DNA oder RNA)-Sequenzen, infektiöse Agenzien, wie Viren, Bakterien oder einzellige eukaryontische Organismen, z. B. Hefen oder Pilze, oder vielzellige Organismen, wie Pflanzen, Insekten usw., wie auch Zellen aus Kulturen vielzelliger Organismen. Der Begriff "Einschließung" bedeutet, daß die Ausbreitung des biologischen Systems aus einer spezifisch eingeschränkten Umgebung, worin spezifische Bedingungen vorherrschen, und wo seine Gegenwart erwünscht ist, eingeschränkt ist, oder daß die Existenz des biologischen Systems auf einen bestimmten Zeitraum beschränkt ist.
Die Einschließung erfolgt durch Aufrechterhalten des biologischen Systems unter bestimmten Bedingungen, die sicherstellen, daß die zelltötende Funktion nicht exprimiert wird. Diese Bedingungen können intra- oder extrazellulär sein, und können den Phenotyp und den physiologischen Zustand des Wirtsorganismus, Wirt-Vektor-Beziehungen, die Umgebungsbedingungen, die für das biologische System vorherrschen, oder einen zyklischen Vorgang umfassen. Wenn eine dieser Bedingungen sich ändert, kann die zelltötende Funktion regulierbar oder konstitutiv exprimiert werden, und so den Wirtsorganismus, der die für die zelltötende Funktion kodierende Nukleotidsequenz trägt, abtöten. Zusätzlich können die Bedingungen stochastische Vorgänge umfassen.
Wenn das biologische System Zellen enthält, können diese unter definierten Umgebungsbedingungen eingeschlossen werden, indem man in die Zellen eine Nukleotidsequenz einfügt, die eine für eine zelltötende Funktion kodierende Sequenz enthält, und eine Sequenz zur Regulation der Transkription der für die zelltötende Funktion kodierenden Sequenz, oder davon getrennt, eine für eine zelltötende Funktion kodierende Nukleotidsequenz und eine für eine Antisense-RNA kodierende Nukleotidsequenz, die, wenn exprimiert, die Translation der die zelltötende Funktion spezifizierenden mRNA, wie oben beschrieben, hemmt.
In Übereinstimmung mit dem Erfindungsprinzip wird die für die zelltötende Funktion kodierende Nukleotidsequenz vorzugsweise von einem Replikon getragen. Die für die Antisense-RNA kodierende Nukleotidsequenz kann in die Zelle auf einem anderen Replikon eingeführt werden. Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren eingeschlossenen Zellen können aus Bakterien oder eukaryontischen Organismen ausgewählt sein.
Abgesehen von der Bereitstellung einer Einschließung für Wirtsorganismen, die so nur unter definierten Bedingungen existieren, stellt das erfindungsgemäße Einschließungsverfahren auch eine Einschließung für ein Replikon auf eine primäre Wirtszelle durch Einfügung einer für eine zelltötende Funktion kodierenden Nukleotidsequenz in das Replikon zur Verfügung, wobei die Nukleotidsequenz regulierbar von einer Regulationssequenz transkripiert wird, die von einem oder mehreren Faktoren reguliert wird, von denen mindestens einer durch eine Nukleotidsequenz kodiert wird, die ausschließlich auf dem Genom der primären Wirtszelle vorhanden ist.
Wahlweise kann das Replikon auf die primäre Wirtszelle durch Einfügen eines DNA-Fragments in das Replikon eingeschlossen werden, von dem eine für die zelltötende Funktion kodierende mRNA konstitutiv exprimiert wird, wobei deren Translation durch eine Antisense-RNA, die von einer anderen Nukleotidsequenz, eingefügt in die primäre Wirtszelle, transkripiert wird, inhibiert wird, wobei die für die Antisense-RNA kodierende Nukleotidsequenz konstitutiv exprimiert wird, oder von einem Promotor exprimiert wird, der von einem oder mehreren Faktoren, wie einem der oben beschriebenen Faktoren, reguliert wird. Das Replikon kann auch so ausgebildet sein, daß abgesehen von der Einschließung auf eine primäre Wirtszelle, es ebenfalls auf Zellen derselben Spezies und einen definierbaren Bereich sekundärer Wirtszellen eingeschlossen wird, d. h. Zellen, bei denen die Faktoren, die für die Regulation der Expression der zelltötenden Funktion verantwortlich sind, ebenfalls vorhanden sind.
Wie aus der vorstehenden Offenbarung offensichtlich, ist das biologische Einschließungsverfahren der vorliegenden Erfindung ein hochflexibles Verfahren, welches auf einen weiten Bereich von Wirtszellen und Replikons anwendbar ist, um eine aktive biologische Einschließung nicht nur auf abgeschwächte Organismen, sondern auch auf Wildtypstämme zu erlauben, die entweder zur Produktion eines spezifischen biosynthetischen Produkts oder zur Freisetzung in die natürliche Umgebung vorgesehen sind (die äußere Umgebung oder der Darmtrakt eines Tieres); ferner wird nach dem erfindungsgemäßen Verfahren eine aktive Einschließung eines gegebenen Replikons auf einen spezifischen Wirt erreicht.
Es ist ferner zu beachten, daß das erfindungsgemäße Prinzip, welches ein Replikon umfaßt, das eine für eine zelltötende Funktion kodierende Nukleotidsequenz trägt, welche unter bestimmten vordefinierten Bedingungen exprimiert wird, bei der Herstellung von Lebendvakzinen eingesetzt werden kann. Solche Vakzine, basierend auf nicht-pathogene (z. B. abgeschwächte) Stämme von sonst pathogenen Mikroorganismen oder Viren, sind seit einer langen Zeit bekannt. Prominente Beispiele von Agenzien, die als Lebendvakzine verwendet werden, sind das Vaccinia Virus, das abgeschwächte Poliovirus (isoliert von Jonas Salk) und das Calmette-Guerin Bazillus (abgeschwächtes Mycobacterium tuberculosis). Lebendvakzine sind dahingehend vorteilhaft, daß sie eine verlängerte, wenn nicht lebenslange Immunität gegen das in Frage kommende pathogene Agens verleihen. Ferner sind sie im allgemeinen billiger und einfacher zu verabreichen als Vakzine auf Grundlage inaktivierter (abgetöteter) Pathogene oder gereinigter Proteine.
Die Verwendung von Lebendvakzinen ist jedoch limitiert, da es oft schwierig ist, die richtige Kombination von Abschwächung, Lebensfähigkeit und relevanter Immunantwort zu erzielen. Ferner ist die willkürliche Freisetzung von gentechnisch veränderten Bakterien in die Umgebung, entweder extern oder intern zur Zeit in keinem Land aufgrund öffentlicher Sorge hinsichtlich eines möglichen Langzeiteinflusses auf die Umwelt erlaubt, insbesondere hinsichtlich des Risikos einer permanenten Ansiedelung der gentechnisch veränderten Bakterien in der Umwelt.
Die Erfindung hat es ermöglicht, diese Probleme, die mit der Verwendung von Lebendvakzinen einhergehen, zu umgehen, indem in einen geeigneten Wirtsorganismus (eine primäre Wirtszelle, wie oben definiert) eine für eine zelltötende Funktion kodierende Nukleotidsequenz eingefügt wird, wobei die Expression dieser Sequenz durch einen stochastischen Vorgang determiniert ist, eine Nukleotidsequenz, die für ein erwünschtes Epitop zur Immunisierung (antigene Determinante) von einem pathogenen Agens kodiert, wie auch Mittel zum Transport des Epitops, wenn es exprimiert wird, an die äußere Oberfläche der Zelle, d. h. seine Translokation über die Zellmembransysteme. Die für die zelltötende Funktion kodierende Nukleotidsequenz und die für das Epitop kodierende Nukleotidsequenz können auf demselben Replikon oder auf getrennten Replikons vorhanden sein. In diesem Zusammenhang kann die zelltötende Funktion jede der oben angegebenen sein. Eine gegenwärtig bevorzugte zelltötende Funktion ist diejenige, welche durch das R1-hok-Gen kodiert wird.
Die Wirtszelle kann jeder beliebige Organismus sein, der für die Verabreichung an einen Säuger, z. B. einen Menschen, zur Immunisierung durch das Vakzin geeignet ist. Üblicherweise wird die Wirtszelle mit der genetischen Information zur Expression von Adhesinen, wie z. B. einem Bakterium, welches in der Natur Adhesine exprimiert, durch welche sie sich an die Oberfläche von Epithelialgewebe anheften, ausgerüstet. Dies ist eine wichtige Eigenschaft der Wirtszelle, da sie es ihr ermöglicht, sich in einer spezifischen Umgebung besonders vorteilhaft für Immunisationszwecke zu etablieren, z. B. wo der Typ der Immunantwort optimal ist, d. h. sekretorische IgG und IgA, wobei auf diese Weise ein überlegener Schutz für die epitheliale Oberflächen erlangt wird. Es ist anzumerken, daß in diesem Zusammenhang der Begriff "Umgebung", wie oben als spezifische eingegrenzte Umgebung definiert, worin spezifische Bedingungen vorherrschen, so verstanden werden sollte, daß er Gewebe und epitheliale Oberflächen im Körper, wie auch Hohlräume, die durch solche Oberflächen definiert werden, wie den gastrointestinalen Trakt, Mund- und Nasenhöhlen, den Atmungsweg, den Harnweg und reproduktive Organe umfaßt. Es ist interessant anzumerken, daß diese Bereiche mit denen zusammenfallen, die als erste infektiösen (pathogenen) Agenzien ausgesetzt sind. Man nimmt zur Zeit an, daß das Vakzin besonders vorteilhaft als orales Vakzin verabreicht werden kann, und daß, konsequenterweise, die Wirtszelle in diesem Fall eine sein sollte, die in der Lage ist, sich selbst innerhalb des Darms zu etablieren und erfolgreich mit den zahllosen Organismen, die dort bereits präsent sind, in Konkurrenz treten kann.
Auf diese Weise können Beispiele geeigneter primärer Wirtszellen ausgewählt sein aus Enterobacteriaceae, z. B. E. coli, oder Milchsäurebakterien, z. B. Lactobacillus acidophilus, Vibrionaceae und Pseudomonaden. Der Organismus muß jedoch nicht notwendigerweise einer sein, der inhärent in der Lage ist, sich selbst im Darmtrakt zu etablieren. Man kann ebenfalls einen Wirtsorganismus nach anderen Kriterien auswählen, so nach seiner Eignung für die Durchführung von Rekombinationstechniken oder Fermentationsverfahren und ihn nach Standard DNA-Kombinationstechniken mit Genen ausrüsten, die Adhesine exprimieren, sollte der so ausgewählte Organismus keine solche Funktionen aufweisen, die ihm das Anhaften an epitheliales Gewebe erlauben.
Das Epitop für die Immunisierung kann in die primären Wirtszellen durch Einfügen einer Nukleotidsequenz, die für ein Epitop kodiert, in ein Replikon gemäß Standard-Rekombinationstechniken, die im Stand der Technik bekannt sind, eingefügt werden (wie beschrieben, z. B. bei Maniatis et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, 1982). Daher sollte das Replikon, welches die für das Epitop kodierende Nukleotidsequenz trägt, ferner mit einem geeigneten Promotor, einer ribosomalen Bindungsstelle, einem Translations-Initiationskodon (ATG) ausgerüstet sein, um die Expression des Epitops auf der Oberfläche der Wirtszelle sicherzustellen. Ein wesentliches Merkmal des erfindungsgemäßen Vakzins ist, daß das Epitop auf der Oberfläche der Wirtszelle präsentiert werden sollte, um eine geeignete Immunantwort in dem zu immunisierenden Säuger hervorzurufen. Falls das Epitop nicht natürlicherweise an die Oberfläche der Wirtszelle transportiert wird, kann die das Epitop kodierende Nukleotid-Sequenz in ein für ein natürlich vorkommendes Zelloberflächenprotein kodierendes Gen eingefügt werden, wie z. B. ein Fimbrillin (die strukturelle Untereinheit der Fimbriae), um ein Fusionsprotein zu exprimieren, welches an die Zelloberfläche transportiert wird.
Wie oben angegeben, ist die Expression der zelltötenden Funktion im Falle eines erfindungsgemäßen Vakzins bestimmt durch ein stochastisches Ereignis, welches wie oben erwähnt, typischerweise durch einen periodischen invesionalen Switch eines Promotors unter Transkription in die für die zelltötende Funktion kodierenden Nukleotid-Sequenz ausgelöst wird, d. h. ein Promotor, der einem inversionalen Switch von inaktiv in aktiv unterworfen wird, mit einer Frequenz, die z. B. durch die entsprechenden Spiegel der Expression eines An- und Aus-Gens, wie oben unter Bezugnahme auf den fimA-Promotor erklärt, reguliert wird. Es ist zu erwarten, daß ähnliche Promotoren durch ähnliche Mechanismen reguliert werden. Dies ermöglicht die Einstellung der Häufigkeit eines inversionalen Switches, um so einen ausreichenden Dosisspiegel des fraglichen Epitops für den Zeitraum, der zur Auslösung einer ausreichenden Immunisierung des Tieres, an welches das Vakzin verabreicht wird, ausreicht, einzuhalten. Wahlweise kann das stochastische Ereignis ausgelöst werden durch einen periodisch inversionalen Switch eines Promotors, der eine für eine Antisense-RNA, die die Translation der die zelltötende Funktion spezifizierenden mRNA inhibiert, kodierenden Nukleotid-Sequenz, wie oben beschrieben, transkribiert. Ein gegenwärtig bevorzugter Promotor ist der E. coli fimA-Promotor. Daneben kann die Expression der zelltötenden Funktion durch rekombinantes Heraus schneiden der Antisense-RNA, wie oben erklärt, erreicht werden. Der stochastische Transkriptionsmechanismus (z. B. der Promotor und wahlweise die An- und Aus-Gene) der zelltötenden Funktion werden vorteilhaft in das Wirtszellchromosom, anstelle eines Plasmids, eingefügt, z. B. mittels Bakteriophagen, um den Verlust der Gene als Ergebnis des Plasmidverlustes aus den Zellen zu vermeiden. Durch Regulationshäufigkeit des inversionalen Switches wird ein bestimmter Prozentsatz der Wirtszellen in jeder Generation abgetötet. Dies stellt sicher, daß die Zellpopulation nicht mit der natürlichen bakteriellen Flora, z. B. im Darmtrakt, über einen längeren Zeitraum konkurrieren kann.
Indem man den Organismus sich in der Darmumgebung für einen bestimmten Zeitraum etablieren läßt, bevor die zelltötende Funktion exprimiert wird, ist es möglich sicherzustellen, daß die Dosis des Epitops, welcher der zu immunisierende Körper ausgesetzt ist, ausreichend groß ist, und für einen ausreichenden Zeitraum andauert, um eine adequate Immunisierung zu erreichen. Man schätzt, daß eine ausreichende Immunisierung erhalten werden kann, wenn die Wirtszellen in ausreichenden Mengen in der definierten Umgebung für einen Zeitraum im Bereich von 15 bis 30 Tagen, abhängig von der Natur und Aktivität des von den Wirtszellen exprimierten Epitops, vorhanden sind.
Im Prinzip kann das durch die primäre Wirtszelle exprimierte Epitop ein Epitop von jedem pathogenen Agens sein, gegen welches man eine Immunität erreichen will. Solche pathogene Agenzien umfassen Viren, Bakterien oder eukaryonthische Organismen, wie Pilze oder Protozoen. Beispiele von Viren, von denen Epitope in Verbindung mit dem erfindungsgemäßen Lebendvakzin erhalten werden können, sind Viren, die zur Familie der Adenoviren, Herpetoviren, Papovaviren, Myxoviren, Orthomyxoviren, Paramyxoviren, Pockenviren, Rhabdoviren, Arboviren oder Reoviren gehören. Andere in diesem Zusammenhang in Frage kommenden Virenfamilien sind die Picornaviren und Retroviren. Spezifische Beispiele von Viren sind der Influenzavirus, Parainfluenzavirus, Masernvirus, Mumpsvirus, Rubellavirus, Rhinovirus, Tollwutvirus, HTLV I- und II-Virus, HIV-Viren, Hepatitis-B-Virus und andere Viren, die Hepatitis verursachen, Poliovirus, Rotavirus, Reovirus, Epstein-Barr-Virus, Herpes simplex I- und II-Virus, Cytomegalovirus, menschlicher Papillomavirus verschiedener Typen usw.
Beispiele von Bakterien, von denen Epitope im Zusammenhang mit dem erfindungsgemäßen Lebendvakzin gewonnen werden können, sind Enterobakterien, z. B. pathogene Stämme von Escherichia coli, Salmonella spp., wie S. typhimurium, S. typhi, S. schottmülleri und S. choleraesuis, Vibrio cholerae, Shigella dysenteriae; Corynebacterium diphteriae; Mycobacterium tuberculosis; Neisseria ssp., wie N. gonorrhoeae, N. meningiditis und N. catarrhalis; Pseudomonas spp., wie P. aeruginosa; Yersinia spp., wie Y. pestis; Moraxella spp., wie M. bovis; Staphylococcus spp., wie S. aureus; Streptococcus spp., wie S. pneumoniae und S. pyogenes; Bordetella spp., wie B. pertussis und B. bronchiseptica; Hemophilus influenzae; Treponema pallidum; und Clostridium spp., wie C. botulinum und C. tetani.
Beispiele pathogener eukaryontischer Organismen, von denen Epitope im Zusammenhang mit dem erfindungsgemäßen Lebendvakzin verwendet werden können, sind Pilze, z. B. Blastomyces dermatitidis, Histoplasma capsulatum, Coccidiodes immitis, Cryptococcus neoformans und Candida albicans; Protozoen, z. B. Giardia lamblia; Trypanosoma spp., wie T. gambiense, T. rhodesiense und T. cruzi; Leishmania spp. L. donovani und L. tropica; Entamoeba histolytica; Naegleria spp.; Plasmodium spp., wie P. falciparum, P. vivax, P. malariae und P. ovale; und Isospora spp., wie I. belli und I. huminis.
Es ist ferner denkbar, daß es möglich sein wird, ein Kombinationsvakzin gegen eine Vielzahl pathogener Agenzien durch Einführen von zwei oder mehr Nukleotidsequenzen, die Epitope von verschiedenen pathogenen Agenzien kodieren, in die Wirtszelle in einer Weise, daß die Epitope als Fusionsproteine zusammen mit einem Fimbrillin exprimiert werden, im wesentlichen wie oben beschrieben, oder an die Zelloberfläche auf andere Weise transportiert werden, z. B. aufgrund der Anwesenheit eines Signalpeptids, unter Erhalt eines Kombinationsvakzins herzustellen. Auch in diesem Fall werden die Epitope auf der Oberfläche der Wirtszelle als Teil verschiedener Fimbriae exponiert werden. Ein wichtiger Vorteil dieser erfindungsgemäßen Ausführungsform ist, daß eine Immunisierung gleichzeitig gegen eine Vielzahl von Pathogenen erreicht werden kann, wobei nur eine Einzelverabreichung des Vakzins erforderlich ist.
Um jedes Risiko einer Kontamination der äußeren Umgebung (d. h. der Umgebung außerhalb des mit dem erfindungsgemäßen Vakzins zu immunisierenden Tieres) mit den lebenden primären Wirtszellen, die von der definierten Umgebung von dem infragekommenden Tier, wo ihre Anwesenheit erwünscht ist, in die äußere Umgebung, z. B. mit dem Kot, bei einem oralen Vakzin zu vermeiden, sollte es möglich sein, die Wirtszellen zu töten, sobald sie in die äußere Umgebung ausgetreten sind. Dies kann durch Einfügen eines zusätzlichen Promotors (neben dem stochastischen Promotor) in die Wirtszelle geschehen, wobei der Promotor bei Aktivierung in eine für eine zelltötende Funktion kodierende Nukleotidsequenz transkribiert, wodurch er das Absterben der Wirtszellen, oder irgendwelcher anderer Zellen (sekundärer Wirtszellen), welche das Replikon mit der für die zelltötende Funktion kodierenden Nukleotidsequenz enthalten, verursachen. In einer Ausführungsform transkribiert der zusätzliche Promotor bei Aktivierung in dieselbe für eine zelltötende Funktion kodierende Nukleotidsequenz, wie der, dessen Expression durch ein stochastisches Ereignis bestimmt ist. Es würde auch möglich sein, diesen zusätzlichen Promotor zur Transkription bei Aktivierung in eine andere für eine zelltötende Funktion kodierende Nukleotidsequenz einzufügen (welche mit der ersten identisch sein kann), die auf demselben oder einem anderen Replikon, als die für die erste zelltötende Funktion kodierende Nukleotidsequenz eingefügt ist. Die Aktivierung dieses zusätzlichen Promotors geschieht vorteilhaft als Ergebnis z. B. einer Temperaturabnahme unterhalb der Körpertemperatur (ca. 37ºC) oder, wie oben erklärt, durch chemische Induktion.
Auf diese Weise wird die mangelnde Lebensfähigkeit der gentechnisch veränderten Bakterien, die als erfindungsgemäßes Lebendvakzin verwendet werden, in der äußeren Umgebung sichergestellt. In Fällen, wo die für die zelltötende Funktion kodierende Nukleotidsequenz und das für das Epitop kodierende Gen auf dem gleichen Replikon vorliegen, wird die zufällige Ausbreitung des rekombinanten Replikons auf sekundäre Wirtszellen, in diesem Fall üblicherweise Organismen vom Wildtyp, die in der äußeren Umgebung gefunden werden, im wesentlichen verhindert. Das Vorliegen einer für die zelltötende Funktion kodierenden Nukleotidsequenz und das für das Epitop kodierende Gen auf demselben Replikon bildet daher eine bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Vakzins.
Neben seiner Eignung bei der Herstellung von Lebendvakzinen wie oben beschrieben, wird das erfindungsgemäße Prinzip ferner als anwendbar für die Entwicklung von Vakzinen auf Grundlage abgetöteter Pathogene angesehen. Bis heute sind solche Vakzine (im folgenden auch als "abgetötete Vakzine" bezeichnet) als weniger wirksam als Lebendvakzine bekannt. Ohne sich auf eine bestimmte Theorie beschränken zu wollen, glauben die Erfinder, daß die verringerte Wirksamkeit von abgetöteten Vakzinen der Weise zugeschrieben werden kann, auf welche die pathogenen Agenzien, die in den Vakzinen benutzt werden, inaktiviert werden, was üblicherweise durch Hitzebehandlung oder chemische Inaktivierung mit Formaldehyd geschieht. Man glaubt, daß dies die Antisenstruktur des in Frage kommenden Pathogens denaturiert, wodurch eine geringere Immunantwort ausgelöst wird, als wenn das Vakzin verabreicht wird, und daher auch eine geringere Immunisierung.
Dieses Problem kann durch Anwendung der erfindungsgemäßen Maßnahmen umgangen werden. Es kann demzufolge möglich werden, ein abgetötetes Vakzin herzustellen, welches ein pathogenes Agens umfaßt, das eine oder mehrere für eine zelltötende Funktion kodierende Nukleotidsequenzen enthält, wobei das pathogene Agens durch Expression einer oder mehrerer der Nukleotidsequenzen abgetötet wurde. Auf diese Weise bleiben die Antisenstrukturen auf dem Pathogen intakt, so daß, theoretisch, eine wirksamere Immunisierung des Säugers, an welchen das abgetötete Vakzin verabreicht wird, erreicht wird. Das im abgetöteten Vakzin eingesetzte Pathogen kann eines (oder eine Kombination) derer, wie oben aufgeführt, sein, welches die für Epitope kodierende Gene zur Einführung in lebende nichtpathogene Wirtszellen zur Verwendung als Lebensvakzine zur Verfügung stellt.
Aufgrund des niedrigen, aber vorhandenen Risikos von Mutationen, welche die tötende Funktion beeinflussen können, ist dieses Vakzin nur von praktischer Relevanz im Bereich der Veterinärmedizin.
Die Expression der zelltötenden Funktion kann auf Transkriptionsebene reguliert werden, z. B. durch einen regulierbaren Promotor. Jeder der oben diskutierten Promotoren kann eingesetzt werden. Wahlweise kann die Expression der zelltötenden Funktion auf Ebene der Translation, wie oben erläutert, z. B. mittels Antisense-RNA, die die Translation der die zelltötende Funktion spezifizierenden mRNA inhibiert.
In einer spezifischen Ausführungsform des erfindungsgemäß abgetöteten Vakzins umfaßt das Vakzin bei Verabreichung lebende pathogene Agenzien, in welche eine zelltötende Funktion eingeschleust wurde, die im Körper als Ergebnis der Umgebungsveränderungen, denen die Pathogene unterworfen sind, z. B. Veränderungen in der Temperatur, pH-Wert oder der Anwesenheit bestimmter Chemikalien, aktiviert wird.
Diese erfindungsgemäßen Vakzine (lebende oder abgetötete) können für eine oral oder parenterale Verabreichung gemäß üblicher Praxis im Bereich der Human- und Veterinärmedizin, zusammen mit pharmazeutisch oder veterinärmedizinisch annehmbaren Trägern oder Vehikeln formuliert werden.
Für die orale Verabreichung eines Lebendvakzins ist es bevorzugt, die Wirtszellen gegen die Umgebung im Darmtrakt zu schützen, welche dazu neigt, für die Lebensfähigkeit von z. B. vielen Bakterien, die als geeignet für die vorliegenden Zweck angesehen werden, schädlich zu sein. Dieser Schutz kann z. B. in Form eines enterischen Überzugs zur Verfügung gestellt werden.

1. Gram-negative und gram-positive Bakterien

Geeignete Replikons für die Gentechnik in bakteriellen Wirtszellen können z. B. Plasmide sein, die zur Replikation in Enterobacteriaceae, z. B. pBR322 oder R1-Ablauf-Replikonplasmide, in der Lage sind (europäische Patentanmeldung Nr. 83 305 438.0, Veröffentlichungsnr. 0 109 150), oder zur Replikation in gram-negativen Bakterien im allgemeinen, z. B. Plasmide von RSF1010 (Bagdasarian et al, Gene 16, 1981, Seiten 237-242) in der Lage sind, oder Plasmide, die zur Replikation in gram-positiven Bakterien, wie z. B. B. subtilis, z. B. pC194 und pUB110 (Lovett und Keggins, Meth. in Enzymol. 68, 1979, Seiten 342-357) in der Lage sind. Um solche bakteriellen Plasmide oder Zellen, die solche Plasmide enthalten, erfindungsgemäß einzuschließen, kann das DNA-Fragment oder die DNA-Fragmente, welche die R1-hok-Region enthalten, in das Replikon in einer solchen Weise eingefügt werden, daß die R1-hok-Expression durch einen regulierbaren (regulierbare) Promotor (Promotoren) gesteuert werden kann, von denen man weiß, daß sie die in Frage kommende Wirtszelle erkennen, wobei solche Promotoren entweder natürliche Promotoren oder synthetische Promotoren sind, wie z. B. der E. coli-trp-Promotor oder die B. subtilis-Promotoren, die die Expression bestimmter Gene in der stationären Zellphase steuern. Wie in den Beispielen gezeigt, ist das R1-hok-Genprodukt in einem großen Bereich gram-negativer Bakterien wie auch bei B. subtilis (s. Beispiel 16) toxisch und daher wahrscheinlich auch in allen gram-positiven Bakterien. Falls das R1-hok-Genprodukt nicht für die in Frage kommende Wirtszelle tödlich ist - ein notwendiges Erfordernis, um das biologische Einschließungssystem zu etablieren - kann eine R1-hok homologe Sequenz entweder aus dem Genom der in Frage kommenden Wirtszelle (oder einer nahen verwandten bakteriellen Art), aus einem in der Frage kommenden Wirtszelle natürlich vorkommenden Plasmid (oder einer nahen verwandten bakteriellen Art), oder aus einem bakteriellen Virus isoliert werden, und anschließend auf hok-ähnliche Aktivität auf eine Weise, ähnlich der, wie in den Beispielen für das E. coli chromosomale Homolog von R1-hok beschrieben, getestet werden.
Die Etablierung eines biologischen Einschließungssystems z. B. für Fermentationszwecke, an welchen die Verwendung von R1-hok oder eine Nukleotidsequenz homolog zum hok in Bakterien beteiligt ist, umfaßt daher: Selektion von Replikon und Wirtszelle; Insertion der geeigneten Sequenz, welche das R1-hok oder eine Nukleotidsequenz homolog zum hok enthält, die nicht in der ausgewählten Wirtszelle unter definierten Bedingungen exprimiert werden, in das Replikon; Insertion eines Gens oder Gene, die ein geeignetes Produkt (Produkte) zur Produktion in großen Mengen kodieren, in das Replikon; Einführung des rekombinanten Replikons in die bakterielle Wirtszelle nach Standardverfahren der bakteriellen Transformation; Kultur der replikonhaltigen Wirtszellen in einem Kulturmedium, das mit den notwendigen Nährstoffen einschließlich der für das in Frage kommende Einschließungssystem für eine Anzahl von Faktoren, die zur Erreichung der erwünschten Zellkonzentration notwendig ist, ergänzt wurde, und schließlich Ernten der Zellen oder des Mediums, aus dem das in Frage kommende Produkt isoliert werden kann. Falls die Zellen zufällig in die äußere Umgebung freigesetzt werden, wird der Promotor, welcher die Transkription der hok- oder hok-ähnlichen Sequenz reguliert, aktiviert, und die Zellen werden als Ergebnis der Expression des hok- oder hok-ähnlichen Produkts abgetötet, oder der Promotor, welcher die Transkription der Antisense-RNA reguliert, wird inaktiviert. Falls die DNA von Zellen auf andere Zellen (sekundäre Wirte) transferiert wird, wird in ähnlicher Weise der Promotor, der die Transkription der hok- oder hok-ähnlichen Sequenz reguliert, aktiviert, und die Zellen werden abgetötet, was ebenfalls der Fall ist, wenn die hok- oder hok-ähnliche Sequenz durch eine Antisense reguliert wird, in Zellen, denen die für die Antisense-RNA kodierende Nukleotidsequenz fehlt.

2. Hefezellen

Die technische Ausübung rekombinanter DNA-Techniken in eukaryontischen Systemen kann erwünscht sein, um solche posttranslationale Modifikationen (spezifische proteolytische Spaltungen, Glykosylierung, usw.) primärer (eukaryontischer) Genprodukte zu erhalten, die nicht in Bakterien erfolgen, oder bestenfalls in nichtoptimaler Weise erfolgen. Ein oft eingesetzter eukaryontischer Organismus ist die Hefe Saccharomyces cerevisiae, in der ein natürlich vorkommendes Plasmid, das 2 u-Replikon, als Vektor zur Expression von Genen angepaßt wurde, die nicht mit dem 2 u-Replikon in S. cerevisiae natürlich verwandt sind. Wie oben beschrieben ist es möglich, eine Sequenz zur Einfügung in ein Hefereplikon, z. B. dem 2 u-Replikon, zu isolieren oder zu konstruieren, wobei man das Prinzip des biologischen Einschließungsmechanismus unter Verwendung von R1-hok zur Einschließung von Hefezellen und Plasmiden einsetzt.
Obwohl es nicht wahrscheinlich ist, daß die nativen Promotoren von R1-hok in S. cerevisiae-Zellen verwendet werden können, läßt die Konservierung von hok-ähnlichen Sequenzen in Organismen, die nur entfernt miteinander verwandt sind, und die Toxizität von R1-hok gegenüber gram-positiven wie auch gram-negativen Bakterien die Vermutung vernünftig erscheinen, daß das Produkt des R1-hok-Gens und der mit dem R1-hok verwandten Gene (z. B. relB-orf3 oder part1 oder andere Gene, die aus bakteriellen Genomen stammen, welche eine Homologie auf der Sequenz- und Funktionsebene von R1-hok oder ähnlichen Genen, die aus bakteriellen Plasmiden isoliert wurden, zeigen, stammen) auf ihre Fähigkeit, Hefezellen, wie S. cerevisieae, abzutöten, getestet werden sollen. In der Praxis erfordert dies die Isolierung der kodierenden Region des hok-Gens oder des hok-ähnlichen Gens, und die Verbindung der kodierenden Region mit einem geeignet regulierbaren Hefezellen-Promotor, wobei das erhaltene Replikon schließlich nach Standardverfahren in die Hefezellen eingeschleust wird, und die Wirkung der Expression des hok- oder des hok-ähnlichen Gens wird untersucht. Falls ein Zelltod auftritt, wurde eine geeignetes hok- oder hok-ähnliches Gen identifiziert.
Wahlweise können in DNA aus Hefezellen identifizierte Sequenzen mit Homologie zu parB oder relB-orf3 isoliert werden, an einen geeigneten Hefezellpromotor verknüpft werden, in das 2 u-Replikon eingefügt werden, worauf die Einschleusung des rekombinanten Replikons in S. cerevisiae folgt, und auf ihre Fähigkeit zum Abtöten der Zelle untersucht werden. Aus einem hok-Gen oder einen hok-ähnlichen Gen, das sich als toxisch nach Expression für S. cerevisiae erwies, kann ein identisches oder mit dem R1-hok-System analoges biologisches Einschließungssystem durch Einführung einer Rekombinationsschleife (ein regulierbarer Promotor oder ein Gen, das für eine Antisense-RNA kodiert, die durch einen geeigneten Hefepromotor reguliert wird) wie zuvor bei der Beschreibung der Allgemeinstrategie erläutert, erzeugt werden. Die erhaltene regulierbare Hefe-hok-Sequenz oder hok-ähnliche Sequenz kann in jedes Hefereplikon eingefügt werden, z. B. in das 2 u-Replikon oder Derivaten davon, in welches Gene, die nicht natürlich mit dem 2 u verwandt sind, mit der Absicht eingefügt wurden, die Expression der eingefügten Gene zu erhalten, mit dem Zweck zur biologischen Einschließung von Zellen und/oder rekombinanten Replikons. Das Replikon kann in Hefezellen, z. B. S. cerevisiae-Zellen, durch Transformation oder Protoplastfusion, eingefügt werden, worauf sich die Selektion der das Replikon tragenden Zellen anschließt, diese können weiter in einer Kultur im großen Maßstab in dem geeigneten Kulturmedium, das mit den notwendigen Nährstoffen wie auch einem exogenen Faktor (Faktoren), die zur Einschließung des fraglichen Systems erforderlich sind, ergänzt wurde, gezüchtet werden. Die Kultur der Zellen, die das fragliche Replikon enthalten, wird anschließend geerntet, und das geeignete Produkt, das vom Replikon exprimiert wird, kann entweder aus den Hefezellen oder dem Kulturmedium, je nach Gen und in Frage kommendem Genprodukt isoliert werden. Falls die Zellen zufällig in die äußere Umgebung freigesetzt werden, wird der die Transkription des hok- oder der hok-ähnlichen Sequenz regulierende Promotor aktiviert werden, und die Zellen werden als Ergebnis der Expression des hok- oder hok-ähnlichen Produkts abgetötet, oder der die Transkription der Antisense-RNA regulierende Promotor wird inaktiviert. Falls in ähnlicher Weise DNA von Zellen auf andere Zellen (sekundäre Wirte) transferiert wird, wird der die Transkription der hok- oder hok-ähnlichen Sequenz regulierende Promotor inaktiviert, und die Zellen werden abgetötet, was auch der Fall ist, wenn die hok- oder hok-ähnliche Sequenz durch eine Antisense-RNA reguliert wird, in Zellen, denen die für die Antisense-RNA kodierende Nukleotidsequenz fehlt.

3. Säugerzellen

Die Forderung nach spezifischen post-translationalen Modifikationen kann die Expression bestimmter eukaryontischer Gene in Säugerzellen, z. B. von menschlichem oder tierischen Ursprung, anstelle von Bakterien oder Hefezellen erforderlich machen. Replikons, die als Klonierungsvektoren in eukaryontischen Zellen eingesetzt werden können, werden von Chromosomen (ars Replikons) von DNA-Viren, z. B. SV40-Virus und dem Rinder-Papilloma-Virus, oder von RNA-Viren, z. B. Retroviren, abgeleitet. Die beiden erwähnten DNA-Viren können in einem Plasmidstadium in infizierten Zellen erhalten werden, wogegen die meisten Retroviren (RNA-haltige Viren) genetisch modifiziert werden müssen, um als freireplizierende DNA-Moleküle anstelle von chromosomal integrierte Kopien des viralen DNA-Genoms zu existieren. Man kann vorhersehen, daß Kulturen von Zellen in großem Maßstab, die die obigen Replikons enthalten, in welche ein Gen oder Gene, die nicht natürlich mit dem Replikon verwandt sind, mit dem Ziel eingefügt wurden, die Expression eines nützlichen Produktes zu erhalten, eingeschlossen werden müssen, wie im Abschnitt über prokaryontische Vektoren diskutiert.
In einer Weise, ähnlich zu der wie unter dem Hefezellsystem beschrieben, kann eine Sequenz, die ein regulierbar exprimiertes R1-hok-Gen oder eine zum hok homologe Nukleotidsequenz enthält, konstruiert werden, sobald ein Gen identifiziert worden ist, das einen hok- oder hok-ähnlichen Effekt in den fraglichen Wirtszellen auslöst. Ein erster Schritt würde daher sein, die von bekannten hok- oder hok-ähnlichen Genen kodierende Sequenz einzufügen, unabhängig von ihrem Ursprung aus bakteriellen Plasmiden, bakteriellen Genomen oder Hefezellgenomen, in ein Replikon, das zur Replikation in der fraglichen Wirtszelle in der Lage ist, auf eine solche Weise, daß die Expression des hok-Gens nach Induktion der Expression erreicht wird, d. h. mit all den notwendigen Regulationssequenzen ausgestattet ist, die zur Expression eines Gens in der fraglichen Wirtszelle erforderlich sind. Eine für die Insertion stromaufwärts des hok- oder des hok-ähnlichen Gens geeignete Promotorsequenz könnte die LTR (lange terminale, sich wiederholende Sequenz) des Maus-Gebärmutter-Tumors sein, welche mit Steroidhormonen induzierbar ist, oder die Region, die die Expression des Metallothioningens kontrolliert, welches mit Metallionen induzierbar ist. Falls Zelltod nach Induktion der Transkription auftritt, wurde ein hok-Gen oder ein hok-ähnliches Gen für die fragliche Wirtszelle identifiziert, und von diesem hok- oder hok-ähnlichen Gen kann ein biologisches Einschließungssystem für ein Replikon durch eine Regulationsschleife auf der transkriptionalen/translationalen Ebene, wie oben beschrieben, konstruiert werden.
Falls keines der zugänglichen hok- oder hok-ähnlichen Gene vom bakteriellen oder Hefeursprung einen toxischen Effekt in den fraglichen Säugerwirtszellen ausübt, kann eine neue hok-ähnliche Sequenz aus einem Säugergenom isoliert werden (z. B. die in Tetrahymena-mitochondrialer DNA entdeckten Sequenzen und in menschlicher zellulärer DNA) und anschließend auf hok-ähnliche Aktivität bei geeigneter Expression getestet werden. Die empfohlene Strategie zum Nachweis von neuen hok-ähnlichen Sequenzen wurde oben aufgezeigt.
Die Verwendung eines hok-ähnlichen Einschließungsmechanismus in Säugerzellen umfaßt das Folgende: Selektion eines Replikons, z. B. eines retroviralen Vektors und Selektion der Wirtszellen, welches von den tatsächlichen Sequenzen, die die Expression der eingefügten hok-ähnlichen Nukleotidsequenzen steuern, abhängt; Einfügen in das Replikon solcher Fremdgene, welche für das nützliche Produkt (Produkte) kodieren, welches hergestellt werden soll, in das Replikon; Einfügen des rekombinanten Replikons in den fraglichen Säugerzelltyp nach Standardverfahren der DNA-Transfektion oder Mikroinjektion;-Selektion der Zellen, die das fragliche Replikon enthalten; Wachstum der Zellen in einen Kulturmedium, das für den fraglichen Zelltyp durch Addition der notwendigen Nährstoffe, Wachstumsfaktoren wie auch der exogenen Faktoren, die für das fragliche Einschließungssystem erforderlich sind, mit der Absicht angepaßt wurde, eine großmaßstäbliche Kultur von Zellen zu erhalten, die das Gen, welches für das nützliche Produkt kodiert, exprimieren; und schließlich kann die Kultur geerntet werden und das nützliche Produkt isoliert werden. Falls die Zellen zufällig in die äußere Umgebung freigesetzt werden, wird der die Transkription der hok- oder hok-ähnlichen Sequenz regulierende Promotor aktiviert werden, und die Zellen werden als Ergebnis der Expression des hok- oder hok-ähnlichen Produkts abgetötet, oder der Promotor, der die Transkription der Antisense-RNA reguliert, wird inaktiviert. Falls die DNA aus Zellen in andere Zellen (sekundäre Wirtszellen) transferiert wird, wird in ähnlicher Weise der Promotor, welcher die Transkription der hok- oder hok-ähnlichen Sequenz reguliert, aktiviert, und die Zellen werden abgetötet, was auch der Fall ist, wenn die hok- oder hok-ähnliche Sequenz durch eine Antisense-RNA reguliert wird, in Zellen, denen eine für die Antisense-RNA kodierende Nukleotidsequenz fehlt.
Während bestimmte Typen von Replikons, die für bestimmte Zelltypen angepaßt wurden, in den obigen Abschnitten ausführlich diskutiert wurden, bleibt das allgemeine Prinzip des Einsatzes des erfindungsgemäßen Einschließungssystem dasselbe, unabhängig vom Typ des Replikons und der Zelle, die das Replikon enthält: Die Etablierung einer zelltötenden Funktion und einer regulierenden Funktion, die angepaßt wurde, um die Expression der zelltötenden Funktion in Zellen, die das Replikon enthalten, zu regulieren, so daß unter Bedingungen, wo die zelltötende Funktion exprimiert wird, die Zelle abgetötet wird.
Es wird Bezug genommen auf die Zeichnungen, wo
Fig. 1 eine Deletionskarte der parB&spplus;-Region zeigt. Die Lokalisierung der parA&spplus;-Region und der parB&spplus;-Region innerhalb des EcorR1-A-Fragments des Plasmid R1 sind in den schwarzen Kästen gezeigt. Restriktionsenzym-Schnittstellen im EcoR1-A-Fragment sind wie in der Internationalen Patentanmeldung PCT/DK83/00086, Veröffentlichungsnr. WO 84/01172 beschrieben. Die parB&spplus;-Region ist innerhalb des 1,9 kb PstI-Fragments lokalisiert, was durch die Koordinaten 15,0 bis 16,9 eingegrenzt ist. Die parB&spplus;-Region wurde zusätzlich 580 bp rechts eines 880 bp RsalI-Fragments kartiert. Die schraffierte Region zeigt die minimale parB&spplus;-Region an. Die Position der hok- und sok-Gene innerhalb der 580 bp parB&spplus;-Region ist ebenfalls gezeigt. Ein BlgII-SalI-Fragment, das den lambda-pR-Promotor und das cI857-Allel des lambda-Repressor-Gens enthält, wurde in pBR322-Derivate eingefügt, die verschiedene Teile des parB-Fragments tragen. Die Position der eingefügten Fragmente und die Transkriptionsrichtung vom lambda-pR sind im unteren Teil der Karte der parB&spplus;-Region (Pfeile) gezeigt. Die lambda-pR-Promotoren in pKG633, pKG634 und pKG341 werden von links nach rechts in die parB&spplus;-Region abgelesen, wogegen der lambda-pR-Promotor in pKG171 von rechts nach links abliest. Restriktionsenzym-Schnittstellen sind als E (EcoRI), B (BalI), B&sub2; (BglII), S (SalI), R (RsaI) und P (PstI) gezeigt.
Fig. 2 zeigt eine Karte des Plasmids pPR95 (13 kb). copA, copB entspricht Replikationskontrollgenen des Plasmids R1; repA bedeutet ein Gen, das für die R1-Replikation erforderlich ist; ori ist der Ursprung der Replikation; bla bedeutet ein Gen, welches Ampicillin-Resistenz für plasmidtragende Zellen vermittelt; parB entspricht der R1 abgeleiteten Erhaltungsfunktion, welche die hok- und sok-Gene kultiviert; deo-lacZ bedeutet eine translationale Fusion zwischen dem deoC-Gen und dem lacZ-Gen. LacZ, Y, A entsprechen dem lac-Operon; cI857 bedeutet ein Gen, das für einen temperaturempfindlichen lambda-Repressor kodiert, der die lambda-pR-Promotoraktivität kontrolliert. Die Pfeile bedeuten die Richtungen der Transkription. Die schwarzen Balken zeigen die Ausdehnung der verschiedenen Gene an. Restriktionsenzym-Schnittstellen sind als SalI (S), BglII (B&sub2;), BamHI (B) und EcoRI (E) gezeigt.
Fig. 3a und 3b zeigen die Nukleotidsequenz der parB&spplus;-Region. Das 5'-Ende des oberen DNA-Strangs ist rechts angeordnet. Die Numerierung der Basen ist in Übereinstimmung mit den Koordinaten der parB&spplus;-Region in Fig. 1. Ter bedeutet die Stopkodons von nur drei offenen Leserahmen, die auf der Nukleotidsequenz vorliegen, und aus mehr als 50 Kodons bestehen. fMet entspricht den Startkodons für die selben drei offenen Leserahmen. Die Aminosäuresequenz des hok-Genprodukts, beginnend von der Position +304, ist unter der DNA-Sequenz gezeigt, die Aminosäureabkürzungen entsprechen der Standardnomenklatur. Die unterstrichenen Sequenzen, bezeichnet mit "-10" und "-35", entsprechen der Promotorstruktur für das sok-Gen.
Fig. 4 zeigt das Absterben von Zellen nach lambda-pR-induzierter Aktivierung des hok-Gens. Der Stamm JC411, der entweder pKG634 (geschlossene Symbole) oder pKG171 (offene Symbole) enthält, wurde exponentiell in A+B-Minimalmedium, welches mit Casaminsäuren ergänzt wurde, bei 30ºC exponentiell kultiviert. Zum Zeitpunkt Null wurde die Temperatur auf 42ºC erhöht und das Wachstum der Kulturen als OD&sub4;&sub5;&sub0; und überlebensfähigkeit-Zählungen auf selektierendem Medium (50 ug/ml Ampicillin-haltige LB-Platten) verfolgt.
Fig. 5 ist eine Fotografie von Zellen, die eine Stunde nach Temperaturerhöhung des Stammes JC411 (pKG634) auf 42ºC gesammelt wurden. Die Pfeile zeigen auf Zellen, die sich klar in der Morphologie verändert haben. Zellen mit einer normalen Morphologie sind auch zu sehen. Die Vergrößerung ist zweitausendfach.
Fig. 6 zeigt die Suppression der Wirtszellabtötung. Der Stamm JC411, der entweder pF634 allein (geschlossene Symbole) oder pF634 plus pPR633 (offene Symbole) enthielt, wurde exponentiell in A+B-Minimalmedium, das mit Casaminsäuren ergänzt wurde, bei 30ºC kultiviert. Zum Zeitpunkt Null wurde die Temperatur auf 42ºC erhöht, und das Wachstum der Kulturen durch Messung der optischen Dichte (OD&sub4;&sub5;&sub0;) und durch Lebensfähigkeitszählungen auf Selektionsmedium (100 ug/ml Kanamyzin-haltige LB-Platten) verfolgt.
Fig. 7a zeigt einen Vergleich der Aminosäuresequenzen des hok-Genprodukts mit dem relB-orf3-Gen-Produkt. Konservierte Aminosäuren sind in Fett angegeben; Aminosäuren, die konservierte Veränderungen darstellen, sind unterstrichen.
Fig. 7b zeigt die Anordnung der Nukleotidsequenzen von parB und orf3 des E. coli-relB-Operons (Bech et al, The EMBO Journal 4, 1985, Seiten 1059-1066). Die parB-Sequenz ist der obere Strang, die relB-orf3 der untere, die Koordinaten sind wie in Fig. 3. Die vertikalen Balken zeigen die konservierten Nukleotide an. Die Zahlen in Klammern sind die Koordinaten der relB-Nukleotidsequenz, wie von Bech et al angegeben. Die beiden Sequenzen sind so angeordnet, daß die Startkodons der beiden Leserahmen dieselbe Position einnehmen - dies wird mit dem Met an Position +304 angedeutet. Die Abbruchkodons der beiden Leserahmen sind mit Ter an Position +460 angegeben.
Fig. 8a zeigt 0,75 ug EcoRI-verdaute Gesamt-DNA aus Stämmen von E. coli, die durch Filterhybridisierung mit der R1-parB-Sonde analysiert wurden. Bahn 1: R1drd-19; Bahn 2: R100; Bahn 3: R386. Diese Bahnen wurden 30 Minuten exponiert. Bahn 4: RP1; Bahn 5: R6-K; Bahn 6: Plasmid-freies E. coli. Diese Bahnen wurden 5 Stunden exponiert. Die Größen der relevanten Fragmente sind in Kilobasen angegeben.
Fig. 8b zeigt 0,75 ug EcoRI-verdaute Gesamt-DNA aus Stämmen von E. coli, die durch Filterhybridisierung mit der relB-orf3-Sonde analysiert wurden. Bahn 1: R100; Bahn 2: R386; Bahn 3: Plasmid-freies E. coli. Expositionszeit: 3,5 Stunden. Die Größen der relevanten Fragmente sind in Kilobasen angegeben.
Fig. 9 zeigt 0,5 bis 0,75 ug EcoRI-verdaute Gesamt-DNA aus verschiedenen Bakterien, die mit Filterhybridisierung mit der R1-parB-Sonde analysiert wurden. Das Autoradiogramm wurde 17 Stunden exponiert. Zwei verschiedene fotografische Expositionen desselben Autogramms werden gezeigt: Bahn 1: Salmonella typhimurium (nicht im Text angegeben); Bahn 2: Serratia marcescens; Bahn 3: Pseudomonas fluorescens; Bahn 4: Pseudomonas putida; Bahn 5: Proteus vulgaris (nicht im Text angegeben); Bahn 6: Escherichia coli; Bahn 7: Bacillus subtilis; Bahn 8: Bacillus circulans PL236. Die Größen der radioaktiv markierten Marker (lambda, geschnitten mit HindIII) sind in Kilobasen angegeben.
Fig. 10 zeigt 0,5 bis 0,75 ug EcoRI-verdaute Gesamt-DNA aus verschiedenen Bakterien, die durch Filterhybridisierung mit der relB-orf3-Sonde hybridisiert wurden. Das Autoradiogramm wurde 17 Stunden (Bahn 19) und 72 Stunden (Bahnen 2 bis 7) exponiert. Bahn 1: Serratia marcescens; Bahn 2: Pseudomonas fluorescens; Bahn 3: Pseudomonas putida; Bahn 4: Bacillus subtilis; Bahn 5: Bacillus circulans PL236; Bahnen 6, 7: Lactobacillus. Die Größen der radioaktiv markierten Marker (lambda, mit HindIII verdaut) sind in Kilobasen angegeben.
Fig. 11 zeigt Filterhybridisierungs-Analysen von DNA aus eukaryontischen Zellen unter Verwendung der relB-orf3-Sonde (Bahnen 1 bis 4) wie auch mit der R1-parB-Sonde (Bahnen 5 bis 6). Die DNA wurde mit EcoRI gespalten (Bahnen 1 bis 3 und 5 bis 6) oder mit PstI (Bahn 4). Bahn 1 : 5 ug makronukleare DNA aus Tetrahymena thermophila; Bahn 2: 5 ug Gesamt DNA aus Tetrahymena thermophila; Bahn 3: 0,25 ug Chloroplasten-DNA aus Pisum sativum; Bahn 5: 5 ug Gesamt-zelluläre DNA aus Neuroblastoma; Bahn 6: 10 ug Gesamt-zelluläre DNA aus embryonaler Leber. Die Größen der Fragmente sind in Kilobasen angegeben.
Fig. 12 zeigt eine Teilkarte des Plasmids p341-1. Die hier gezeigte Region ist die Fusion zwischen dem hok-Gen und der Promotorregion aus dem trp-Operon von E. coli K-12 (erhalten aus dem Plasmid pSGS8). Zusätzlich zum trp-Promotor (durch den Pfeil angegeben) ist ebenfalls das NH&sub2;-terminale Ende des trpE-Gens vorhanden (als trpE angegeben). Die unterbrochenen Linien representieren pBR322-Sequenzen, bei denen das ApR-Gen und der Ursprung der Replikation angegeben sind. Restriktionsenzym-Schnittstellen sind als E&sub1; (EcoRI), B&sub1;-E&sub5; (Fusion von BamHI (aufgefüllt durch DNA-Polymerase I) mit EcoRV) und X-S (Fusion von XhoI und SalI) gezeigt.
Fig. 13 zeigt Wachstumskurven für MC1000 (p341-1) (Kreise) und MC1000 (Dreiecke), kultiviert ind A+B-Minimalmedium, das mit 0,2% Glukose und 1% Casaminsäuren ergänzt wurde, bei 37ºC. Die Zelldichte ist spektralfotometrisch als OD&sub4;&sub5;&sub0;gemessen.
Fig. 14 ist ein Graph, der Lebensfähigkeitszählungen (OC&sub6;&sub0;&sub0;) von E. coli HB101, welches pNL7 (Kreise) oder pBR322 (Dreiecke) enthält, als Funktion der Zeit zeigt. Es wurde kein exogenes Tryptophan zum MA+B-Kulturmedium zugegeben.
Fig. 15 ist ein Graph, der Lebensfähigkeitszählungen (OD&sub6;&sub0;&sub0;) von E. coli HB101, das pNL7 (Kreise) und pBR322 (Quadrate) enthält, als Funktion der Zeit. 5 ug/ml Tryptophan wurden zum MA+B-Kulturmedium zugegeben.
Fig. 16a zeigt eine Deletionskarte der minimalen parB&spplus;-Region. Die Numerierung stimmt mit den Koordinaten der parB&spplus;-Region, wie in Fig. 1 gezeigt, überein. Die hok- und sok-Gene innerhalb der Region sind als aufgefüllte und offene Flächen angegeben. Der vermutliche sok-Promotor ist als ← angezeigt, und die vermutliche hok-Shine-Dalgarno-Sequenz ist als * gezeigt. Die Plasmide pPR341 und pPR345 sind pBR322-Derivate, die die parB-Region von +268 bis +580 und von +303 bis +580 enthalten. Das Plasmid pPR341 trägt die hok-Shine-Dalgano-Sequenz und den hok-Leserahmen, wogegen pPR345 nur den hok-Leserahmen trägt. Beiden Plasmiden fehlt das sok-Gen. Die Restriktionsenzymstellen sind als B&sub1; (BamHI) und E (EcoRI) gezeigt.
Fig. 16b zeigt die physikalische und genetische Karte des Plasmids pKG345, welches zur Induktion der cro-hok-Genfusion verwendet wird. Plasmid pKG345 ist ein pPR345-Derivat, in dem ein BglII-SalI-Fragment, das den lambda-pR-Promotor und das c1857-Allel des lambda-Repressorgens enthielt, in das mit BamHI und SalI geschnittenes pPR345 eingefügt wurde. Diese Konstruktion stellte die Transkription und Translation des hok-Gens unter die Kontrolle des lambda-pR-Promotors und der cro-Shine-Dalgarno-Sequenz. Die Genfunktion ist als offener Bereich für das cro-Gen und als schraffierter Bereich für das hok angegeben. bla-Gene, der lambda-Repressor (aufgefüllte Bereiche) und der Ursprung der Replikation sind ebenfalls angegeben. Der lambda-pR-Promotor ist als ← gezeigt, und die cro-Shine-Dalgarno-Sequenz als *. Restriktionsenzym-Schnittstellen sind als R (RsaI), S (SalI), E (EcoRI), B (BamHI) und B&sub2; (BglII) gezeigt.
Fig. 17 zeigt das Abtöten von Wirtszellen nach lambda-pR-induzierter Expression des hok-Gens und der cro-hok&spplus;-Genfusion. E. coli-Stamm MC1000 wurde exponentiell in A+B-Minimalmedium, das mit 0,2% Glukose und 1% Casaminsäuren ergänzt wurde, bei 30ºC kultiviert, wobei es entweder pKG341 (offene Symbole) oder pKG345 (gefüllte Symbole) enthielt. Zum Zeitpunkt Null wurde die Temperatur auf 42ºC erhöht, und das Wachstum der Kulturen als OD&sub4;&sub5;&sub0; und Lebensfähigkeitszählungen auf Selektionsmedium (100 ug/ml Ampicillin-haltige LB-Platten) verfolgt.
Fig. 18 ist eine Karte des Plasmids pLK26. Die aufgefüllten Bereiche bedeuten Strukturgene; die Einfügung zeigt den spacI-Promptor, an den sich eine synthetische ribosomale Bindungsstelle und ein Polylinker anschließt; ori bedeutet den Ursprung der Replikation vom pBR322 und pUB110; Lac o bedeutet den Lac-Operator.
Fig. 19 ist eine graphische Darstellung der Lebensfähigkeitszählungen (OD&sub6;&sub0;&sub0;) von B. subtilis BD170, welches pSI-1 (Kreise) oder pLK26 (Quadrate) enthält, als Funktion der Zeit. Die Zellen wurden exponentiell in LB-Medium mit 5 ug/ml Chloramphenicol bei 37ºC gezüchtet.
Fig. 20 ist eine graphische Darstellung, die die Kinetik der Abtötung nach Induktion von hok mit 2 mM IPTG zeigt. B.
subtilis BD170, das pSI-1 (Kreise) oder pLK26 (Quadrate) enthielt, wurde in LB-Medium mit 5 ug/ml Chloramphinikol gezüchtet. Lebensfähigkeitszählungen wurden auf LB-Platten mit 5 ug/ml Chloramphenicol verfolgt.
Fig. 21 zeigt eine Karte des Plasmids pPKL8 (5,5 kb). Die Position des fimB-, fimE- und des geschnittenen fimA-Gens ist angegeben. Die Box mit den Doppelpfeilen bedeutet die invertierbare 300 bp-Region, die dem Promotor des pimA-Gens enthält. Der schraffierte Bereich bedeutet pBR322 DNA.
Fig. 22 zeigt eine Karte des Plasmids pPR341 (4,3 kb). Der schraffierte Bereich bedeutet pBR322 DNA.
Fig. 23 zeigt eine Karte des Plasmids pPKL100 (7,5 kb). Siehe Fig. 14 und 15 für Einzelheiten.
Fig. 24a und 24b zeigen Mikroskopaufnahmen von Zellen des E. coli K12-Stammes MC1000, die das Plasmid pPK100 enthalten. Die Pfeile zeigen auf abgetötete Geisterzellen.
Fig. 25 zeigt Verdaus mit SacII und SnaBI der Plasmide pPKL100 (Bahn A) und pPKL8 (Bahn 13). Bahn C ist ein HindIII-Verdau des Bakteriophagen lambda, der als Molekulargewichtsmarker verwendet wurde mit den folgenden Größen: 23,1 kb, 9,4 kb, 6,6 kb, 4,4 kb, 2,3 kb, 2,0 kb und 0,56 kb. Die Pfeile zeigen auf Fragmente, die durch die Inversion des 300 bp-Segments beeinflußt wurden.
Fig. 26 zeigt Karten der Plasmide pLP4 (=A), pLP5 (=B) und pLP6 (=C). Die schraffierten Boxen bedeuten pACYC184- DNA. Die relevanten Restriktionsschnittstellen, wie auch die Positionen der fimB- und fimE-Gene sind gezeigt.

MATERIAL UND METHODEN

Bakterienstämme und Plasmide

Die Bakterien und Plasmide sind in Tabelle 1 aufgeführt.
Die verwendeten experimentellen Techniken waren Standardtechniken, die im Bereich der mikrobiellen Genetik (J. Miller: Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor, New York, 1972) und der genetischen Manipulation eingesetzt werden (Davis, Bothstein und Roth: A Manual for Genetic Engineering; Advanced Baterial Genetics, Cold Spring Harbor, New York, 1980 und Maniatis, Fritsch und Sambrook: Molecular Cloning, Cold Spring Harbor, New York 1982).
Alle Zellen wurden in LB-Medium gezüchtet (Bertani, J. Bact 62, 1951, Seite 293) mit 0,2% Glukose und 1 ug/ml Thiamin, oder A+B-Minimalmedium (Clark und Maaloe, J. Mol. Biol. 23, 1967, Seite 99), das mit 0,2% Glukose und 1% Casaminsäuren ergänzt wurde. Die Platten wurden als LA-Platten verwendet, die LB-Medium und 1,5% Agar enthielten.
Klare Lysate wurden nach den von Clewell und Helinski, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 62, 1969, Seiten 1159-66, hergestellt.
Eine Herstellung von Plasmid-DNA in kleinem Maßstab wurde nach dem Verfahren von Birnboim eta al, Nucl. Acids Res. 7, 1979, Seiten 1513-23, durchgeführt.
Herstellungen in großem Maßstab und Analyse der Plasmid-DNA erfolgte unter Verwendung einer Farbstofflutations-Dichte-Gradientenzentrifugation nach Stougaard und Molin, Anal. Biochem. 118, 1981, Seite 181.
Die Restriktions-Endonukleasen wurden gemäß den Herstellerangaben bei 37ºC verwendet (Boehringer, Mannheim oder Biolabs, New England). Doppel- und Dreifach-Verdaus wurden durchgeführt, wobei zunächst mit dem Enzym, welches die niedrigste Salzkonzentration benötigte, begonnen wurde, und anschließend mit zusätzlichem Puffer eingestellt, bevor das nächste Enzym zugegeben wurde.
Behandlung mit der Exonuklease Ba131 wurde wie folgt durchgeführt: 0,1 Einheiten von Ba131 wurden zu 50 ug linearer DNA gegeben und Proben wurden nach 1 Min., 2 Min., 4 Min., 8 Min., 16 Min., 32 Min. und 60 Min. in 60 mM EDTA überführt, mit Phenol extrahiert, mit Ethanol präzipitiert und in 20 ul TE-Puffer resuspendiert. Die Hälfte der 20 ul wurde mit dem geeigneten Restriktionsenzym verdaut, einer Agarose-Gel-Elektrophorese zur Bestimmung der mittleren Größe der deletierten DNA-Deletionen unterworfen. Zur anderen Hälfte wurde der geeignete Linker zugegeben, und die Mischung 48 Stunden mit einem Überschuß an T4-DNA-Ligase ligatisiert.
Die Ligatisierung der geschnittenen Plasmid-DNA wurde nach den Herstellerempfehlungen durchgeführt, mit Ausnahme der glattendigen Ligatisierung, wo ein Überschuß an T4-DNA-Ligase und ATP zugegeben wurde.
pKG633: Das SalI-BglII-Fragment von pOU82, das das cI857-temperaturempfindliche Allel des lampda-Repressorgens und den lambda-pR-Promotor enthielt, wurde in das pPR633 vor der parB&spplus;-Region eingefügt, so daß der lambda-pR-Promotor in die Region von links nach rechts abliest (Fig. 1). Auf analoge Weise wurde das SalI-BglII-Fragment von pOU82 in pPR634 und pPR341 eingeführt, welches Ba131-Deletionsderivate von pPR633 sind, was zu pKG634 und pKG341 führte. pKG171: In pPR171 wurde das SalI-BglII-Fragment von pOU82 in der umgekehrten Orientierung eingeführt, was zum pKG171 führte. Die Positionen und Orientierung der eingefügten lambda-pR-Promotoren relativ zu den hok- und sok-Genen sind in Fig. 1 gezeigt. pF634: Das EcoRI-SalI-Fragment von pKG634, welches die rechten 390 bp der parB&spplus;-Region und das lambda-cI857-pR-induzierbare Promotorsystem enthielt, wurde in die einzelne SalI-Schnittstelle auf dem Kanamycin-Resistenz (aphA&spplus;)-Fragment von pML31 durch glattendige Ligatisierung eingefügt (es wurde S1-Nuklease verwendet, um die verdauten DNA-Fragmente glattendig zu machen).
Die DNA wurde mit den geeigneten Restriktions-Endonukleasen entsprechend den Herstellerempfehlungen geschnitten. Für zelluläre DNA wurden 10 Einheiten pro Mikrogramm DNA verwendet. Die Inkubationszeit war 3 Stunden bei 37ºC. Die erzeugten DNA-Fragmente wurden durch Elektrophorese über 0,7%igen oder 1%igen Agarosegelen in einem Tris-acetatpuffer bei 0,8 Volt pro cm über 18 Stunden aufgetrennt und durch Ethidiumbromidfärbung sichtbar gemacht.

Mobilisierung der Plasmide

E. coli S 17,1 ist zur Mobilisierung von Plasmiden, wie RSF1010 aufgrund eines eingefügten konjugativen Plasmids (RP1-Derivat) im Chromosom in der Lage. Die fraglichen Plasmide wurden in S 17,1 transformiert, welches dann die Donatoren darstellte.
Ein Tropfen der Donatorzellen und der Empfängerzellen wurden auf einer LB-Platte (keine Selektion) vermischt und über Nacht inkubiert. Aus der erhaltenen Zellmasse wurde eine flüssige Suspension hergestellt, aus welcher Verdünnungen auf Doppelselektionsplatten ausgebreitet wurden. Tabelle 1 Bakterien und Plasmide Bakterium Relevanter Phenotyp Serratia marcescens Pseudomonas putida Bacillus subtilis Plasmid Relevanter Phenotyp Koordinaten des parB-Inserts (s. Fig. 1)
1) M.J. Casbadan, S.N. Cohen, J. Molec. Biol. 138, 1980, Seite 179.
2) R. Simon, Biotechnology, November 1983.
3) J. Grinsted, J.R. Saunders, L.C. Ingram, R.B. Sykes, M.N.
Richsmond, J. Bacteriol. 110, 1972, Seite 529.
4) Dubnan & Cirigliano, J. Bacteriol. 117, 1974, Seite 488.
5) G. Skogman, J. Nilsson, P. Gustafsson, Gene 23, 1983, Seite 105.
6) Kreft et al, in Molecular Cloning and Gene Regulation in Bacilli, Herausgeber A.T. Ganesan et al, Academic Press. 1982, Seite 145.
7) Eine leichte Modifizierung von pAIQ25, beschrieben in Yansura und Henner, Proc. Natl. Acad. Sci. 81, 1984, Seite 439; erhalten von Henner.

Reinigung der chromosomalen DNA

Die gesamte DNA wurde aus den Bakterien wie folgt extrahiert. Die Zellen wurden durch Zentrifugation geerntet, zweimal in einmal TEN-Puffer (TEN = 10 mM TRIS (pH 7,5), 1 mM EDTA, 0,1 M NaCl) gewaschen und in 1/10 Volumen von TEN, welches 1 mg/ml Lysozym enthielt, resuspendiert. Nach Inkubation bei 37ºC für 30 Minuten wurden die Protoplasten durch Zugabe von Natriumdodecylsulfat in einer Endkonzentration von 1% lysiert, und Proteinase K wurde bis zu 0,25 mg/ml zugegeben. Das Lysat wurde bei 37ºC 2 Stunden inkubiert und anschließend zweimal mit gepuffertem Phenol und dreimal mit Chloroform extrahiert. Natriumacetat wurde bis zu 0,3 M zugegeben, und die DNA wurde durch Zugabe von 1 Volumen Isopropanol präzipitiert. Das Präzipitat wurde mehrere Male in 96%igem und 80%igem Ethanol gewaschen. Schließlich wurde die DNA in 1 mM TRIS, 1 mM EDTA gelöst.
Gesamt-DNA aus Tetrahymena thermophila BVII wurde nach Nielson, H. und Engberg, J. hergestellt: Biochim. Biophys. Acta 825, 1985, Seiten 30-38. Makronuklei aus Tetrahymena thermophila BVII wurden isoliert (Cech, T.R. et al, Cell 27, 1981, Seiten 487-496) und die DNA extrahiert (Maniatis et al, 1982, op.cit., Seiten 280-281). rDNA aus Tetrahymena thermophila BVII wurde wie von Engberg, J. et al beschrieben, hergestellt: J. Mol. Biol. 104, 1976, Seiten 455-470.
Chloroplasten-DNA aus Pisum sativum wurde nach Bookjans, G. et al isoliert: Analyt. Biochem. 141, 1984, Seiten 244-247.
Embryonales Lebergewebe aus einem 7 Wochen alten legal abgetriebenen Fötus wurde in physiologischer Kochsalzlösung zerkleinert, und die DNA wurde nach Maniatis et al, 1982, op. cit., Seiten 280-281, hergestellt. In ähnlicher Weise wurde DNA aus einer Tumorbiopsie eines Neuroblastoma-Falls isoliert; man fand, daß die isolierte DNA eine mehrere hundertfach amplifizierte chromosomale Region enthielt, und entsprechend durch Mikroskopie der mitotischen Zellen, daß die Tumorzellen zahlreiche extrachromosomale Minichromosome enthielten.

Isolierung von DNA-Fragmenten zur radioaktiven Markierung

100 Mikrogramm pPR95 und pBD2724-DNA wurden mit EcoRI und EcoRI und HindIII verdaut. Die Fragmente wurden durch Elektrophorese auf einem 1%igen Agarosegel in Tris-Boratpuffer bei 5 Volt pro cm für 3 Stunden aufgetrennt. Die erwünschten Fragmente wurden durch Elektroelution auf einer NA45-Membran (Schleicher & Schüll) nach den Herstellerangaben isoliert. Nach Gewinnung der Fragmente durch Elution des Filters in 1,5M NaCl bei 65ºC wurden die Fragmente noch einmal einer Reinigung durch Agarosegel-Elektrophorese und NA45-Membrangewinnung vom Gel unterworfen.

Agarosegel-Elektrophorese

Die DNA wurde mit geeigneten Restriktions-Endonukleasen entsprechend den Herstellerangaben gespalten. Für die zelluläre DNA wurden 10 Einheiten pro Mikrogramm DNA verwendet. Die Inkubationszeit war 3 Stunden bei 37ºC. Die erzeugten DNA-Fragmente wurden durch Elektrophorese auf 0, 7%igem oder 1%igem Agarosegel in einem Tris-acetatpuffer bei 0,8 Volt pro cm für 18 Stunden aufgetrennt und durch Ethidiumbromidfärbung sichtbar gemacht.
Ein Molekulargewichtsmarker wurde wie folgt hergestellt: wt-lambda-DNA wurde mit HindIII verdaut und mittels der Klenow-Polymerase von Boehringer Mannheim entsprechend den Herstellerangaben in Gegenwart von alpha-32P-dCTP plus nichtradioaktivem dATP und dGTP endmarkiert. Bei Verwendung als Molekulargewichtsmarker wurde eine Menge von makronuklearer DNA aus Tetrahymena entsprechend der DNA-Menge der Testbahnen zugegeben.

Transfer der DNA-Fragmente vom Gel auf Nitrocellulosefilter

Nach der teilweisen Depurination in 0,25 N HCl für 15 Minuten bei Raumtemperatur wurde Denaturation der DNA im Gel, Neutralisation und anschließender Transfer der DNA aus dem Gel auf einen BA85-Nitrocellulosefilter (Schleicher & Schüll) durchgeführt, wie bei Maniatis et al, 1982, op. cit., Seiten 280-281, beschrieben. Die Vollständigkeit des Transfers wurde durch Ethidiumbromidfärbung des Gels nach dem Transfer überprüft.

Herstellung einer radioaktivmarkierten Sonde

0,3 Mikrogramm des 900 bp parB-Fragments und 0,3 Mikrogramm des 300 bp-relB-orf3-Fragments wurden radioaktiv durch Nick-Translation markiert (Maniatis et al, 1982, op. cit.) unter Verwendung von 0,25 mikromolarem alpha-32P-deoxycytidin-triphosphat (3000 Ci pro mMol). Der nichteingebaute radioaktive Vorläufer wurde mittels wiederholten Ethanolfällungen entfernt. Zu jeder Präparation wurden 100 Mikrogramm E. coli tRNA als Träger zugegeben.
Die spezifischen Aktivitäten der Sonden waren 2 - 2 · 10&sup8; und 4 - 5 · 10&sup7; dpm pro Mikrogramm des parB- und relB-orf3-Fragments.

Hybridisierung

Filter, die von Agarosegelen transferierte DNA enthielten, wurden in Plastikbeutel mit der Hybridisierungslösung (10 ml pro 120 cm²) 18 Stunden bei 37ºC unter konstantem Schütteln vorinkubiert. Die Hybridisierungslösung von Wahl et al, Proc. Natl. Acad. Sci. 76, 1979, Seiten 3683-3687, wurde modifiziert und enthielt 38% entionisiertes Formamid, 0,75M NaCl, 50 mM Natriumphosphat und 10 x Denhardt-Lösung (50 · Denhardt-Lösung entspricht 0,2% Rinderserumalbumin, 0,2% Polyvinylpyrrolidon und 0,2% Ficoll).
Nach der Vorinkubation wurden die denaturierten radioaktivmarkierten Sonden auf geeignete Filter gegeben. In Experimenten, in denen die parB-Sonde eingesetzt wurde, war die Konzentration des Fragments während der Hybridisierung 3 ng/ml während die relB-orf3-Sonde in einer Konzentration von 1,3 ng/ml unter Erhalt von äquimolarer Konzentrationen der Komplementärsequenzen in den beiden Fällen verwendet wurde.
Die Hybridisierung wurde bei 37ºC unter leichtem Schütteln für 19 Stunden durchgeführt.
Die hybridisierten Filter wurden einmal 20 Minuten bei Raumtemperatur in 0,4 · Waschpuffer und zweimal 30 Minuten bei 60ºC in 4 · Waschpuffer gewaschen. Der Waschpuffer enthielt 0,6M NaCl, 0,1% SDS, 0,1% Natriumpyrophosphat, 50 mM Natriumphosphat, pH 6,5. Autoradiographie wurde unter Verwendung von Röntgenfilmen und Verstärkerschirmen durchgeführt. Die Expositionszeiten sind in der Beschreibung zu den Figuren angegeben.
Der Begriff "Filterhybridisierungs-Analyse" wird in den Beispielen verwendet, um die folgende Abfolge von Schritten zu beschreiben: Agarosegel-Elektrophorese der DNA-Fragmente, Transfer der Fragmente auf Nitrocellulosefilter, Hybridisierung mit der geeigneten radioaktivmarkierten Sonde, Filterwaschen und Autoradiographie des Filters nach dem Waschen. Die in den Beispielen gezeigten Ergebnisse entsprechen den Autoradiogrammen, die nach der Filterhybridisierungs-Analyse erhalten werden.
Der Begriff Homologie wird hier verwendet, um das Vorliegen eines Ausmaßes an Komplementarität zwischen einer gegebenen Sonde und der zu analysierenden Nukleinsäurespezies zu beschreiben.
Das Maß der Hämologie ist ausgedrückt als Bruchteil der Komplementärphasen in einem Duplexnukleinsäuremolekül, das zwischen einer gegebenen Sonde und der zu analysierenden Nukleinsäurespezies gebildet wird.
Das Minimalmaß der Homologie, welches nachweisbar ist, ist eine Funktion der während der Hybridisierung herrschenden experimentellen Bedingungen und der Eigenschaften der Sonde und der zu analysierenden Nukleinsäurespezies.
Das Maß der Homologie zwischen der Sonden-DNA und der filtergebundenen DNA wurde aus der Intensität des tatsächlichen Hybridisierungssignals verglichen zur Signalintensität für eine 100% homologe filtergebundene Sequenz unter den gleichen Bedingungen abgeschätzt.
Die Intensität des Hybridisierungssignals hängt hauptsächlich von der Hybridisierungsgeschwindigkeit und der Anzahl der filtergebundenen DNA-Moleküle auf dem spezifischen Hybridisierungsband ab. Die Geschwindigkeit der Hybridisierung wird hauptsächlich durch die Konzentration der Komplementärsequenzen während der Hybridisierung, den ionischen Bedingungen, der Temperatur und dem Maß der Homologie zwischen der Sonden-DNA und den filtergebundenen Molekülen ab. Die Geschwindigkeit der Hybridisierung nimmt in Gegenwart nichtkomplementärer Sequenzen ab (Bonner, T. I. et al, J. Mol. Biol. 81, 1973, Seite 123), was die thermale Stabilität der Duplex-DNA vermindert; 1% Fehlpaarung zwischen Sonde und filtergebundener DNA führt zu einer Abnahme der thermischen Stabilität von 1 Grad (Maniatis et al, 1982, op. cit., Seite 388). Die Hybridisierungsbedingungen bestimmen daher welches Maß der Fehlpaarung immer noch ein detektierbares Signal liefert. Es ist daraufhinzuweisen, daß die in der vorliegenden Arbeit eingesetzten Bedingungen zu keiner Sättigung der filtergebundenen DNA mit der Sonde führten.
Der vorliegende Satz von Bedingungen für die Hybridisierung und Filter setzt die DNA-Duplexes einer Temperatur aus, die 40ºC unterhalb der mittleren Schmelztemperatur einer perfekt gepaarten Duplex-DNA in derselben ionischen Umgebung ist, d. h. die Bedingungen erlauben den Nachweis von Duplex-Signalen, die ein hohes Maß an ungepaarten Basen besitzen. Die in diesen Berechnungen verwendete Formel wird von Beltz, G.A. et al, Meth. Enzymol. 100, 1983, Seiten 266-285, diskutiert.
Man schätzt, daß die eingesetzten Bedingungen 100% des maximalen Hybridisierungssignals nachweisen, welches aus einem Duplex mit einer Homologie von 100% bis hinab zu 80% erhalten wird, wogegen das Signal eines 60% homologen Duplex 50% der obigen maximalen Intensität ist, s. oben. Duplexe mit einer niederigeren Homologie als 60% werden immer noch schwächere Signale liefern.
Für Duplexe mit intensiver Fehlpaarung kann ein Signal detektierbar sein, falls die Expositionszeit des Autoradiogramms verlängert werden kann, oder falls die Anzahl der Kopien der filtergebundenen komplementären Moleküle erhöht werden kann.

BEISPIEL 1

Deletionskartierung der parB-Region (s. Fig. 1) Konstruktion von pPR95 (Fig. 2)

Die Konstruktion von pPR95 erfolgte auf die folgende Weise: Das Plasmid pOU93 (Gerdes et al, J. Bacteriol, 161, 1985, Seiten 292-98) ist ein pBR322-Derivat, das das parB-Pst1-Fragment aus dem EcoRI-A-Fragment des Plasmids R1 (Fig. 1) enthält. Das PstI-Fragment wird vorteilhaft in kleinere Fragmente durch des Restriktionsenzym RsaI, wie in Fig. 1 gezeigt, geteilt. Mit konventionellen Klonierungsverfahren wurde das größte RsaI-Fragment (880 bp) in die SmaI-Schnittstelle des aus dem Klonierungsvektor pHP34 (Prentki et al, Gene 17, 1982, Seiten 189-96) erhaltenem pPR322 eingefügt, was zum pPR13 führte. Die SmaI-Schnittstelle von pHP34 wird von zwei EcoRI-Schnittstellen flankiert, und daher wurde das eingefügte 880 bp-RsaI-Fragment in ein 900 bp-EcoRI-Fragment umgewandelt. Das so erzeugte 900 bp-EcoRI-Fragment von pPR13 wurde in die einzelne EcoRI-Schnittstelle auf dem MiniR1-Derivat pOU82 kloniert (Internationale Patentanmeldung Nr. PCT/DK83/00086, Veröffentlichungsnr. WO 84/01172), was zum pPR95 führte. Eine Zeichnung von pPR95 ist in Fig. 2 angegeben.
Das Plasmid pOU82 wird instabil vererbt aufgrund des Fehlens einer partitionierenden Funktion (Internationale Patentanmeldung Nr. PCT/DK83/00086, Veröffentlichungsnr. WO 84/01172) und weist eine Verlusthäufigkeit in der Größenordnung von 10&supmin;² pro Zelle pro Generation auf.
Andererseits wird pPR95 sehr selten verloren und ist durch eine Verlusthäufigkeit von weniger als 10&supmin;&sup4; pro Zelle pro Generation charakterisiert (gemessen wie in der Internationalen Patentanmeldung Nr. PCT/DK83/00086, Veröffentlichungsnr. WO 84/01172 beschrieben), was die charakteristische Verlusthäufigkeit von paRB&spplus;-MiniR1-Derivaten ist. Daher kann man schließen, daß die komplette parB-Region auf dem 880 RsalI-Fragment lokalisiert ist, wie aus der Fähigkeit des Fragments zur Stabilisierung von MiniR1-Replikons hervorgeht.
Die Feinkartierung der parB-Region wurde wie folgt durchgeführt: pPR95 wurde mit BamHI verdaut, mit Exonuklease Bal31 behandelt und ligatisiert. Vor der Ligatisierung wurden BamHI-Oligonukleotidlinker zugegeben. Diese Behandlung führte zu einer Reihe von Deletionsderivaten, die den linken Teil der parB-Region umfaßten. Die Ausdehnung der Deletionen wurde durch Größenfraktionierung der DNA-Fragmente auf Agarosegelen bestimmt, nachdem die DNA mit den Restriktionsenzymen EcoRI und BamHI behandelt worden war. Anschließend wurde die genaue Insertion der BamHI-Oligonukleotidlinker durch Nukleotidsequenzierung wie von Maxam und Gilbert beschrieben, bestimmt (Meth. Enzymol. 65, 1980, Seiten 499-566). Auf diese Weise wurde eine sehr detaillierte Kartierung der Region erhalten. Ferner wurde der ParB-Phenotyp (bestimmt wie unter "Material und Methoden" beschrieben) für jedes Plasmiderivat analysiert. Die Deletion der Sequenz, die sich von -320 bis 0 ausdehnte (s. Fig. 1) vom pPR95, was zum pPR311 führte, veränderte den ParB&spplus;-Phenotyp nicht. Daher muß das übrige 580 bp-BamHI-EcoRI-Fragment in pPR311 die komplette parB-Region enthalten. Deletion von links weiter in die Region zerstört vollständig die stabilisierende Aktivität.
Deletionen in den rechten Teil des 580 bp-parB&spplus;-Fragments von pPR311 (s. Fig. 1) führte zu einem Verlust des ParB&spplus;-Phenotyps, so daß die parB-Region sich bis zu einer Position nahe diesem Ende des Fragments ausdehnt.

BEISPIEL 2

Nukleotidsequenz der parB-Region (s. Fig. 3)

Die Nukleotidsequenz der minimalen parB-Region, die in Fig. 3 dargestellt ist, wurde unter Einsatz des chemischen Abbauverfahrens, wie von Maxam und Gilbert beschrieben (Meth. enzymol. 65, 1980, Seiten 499-566) erhalten. Im Folgenden wird eine detaillierte Beschreibung der wesentlichen biologischen Information in der Nukleotidsequenz der parB-Region angegeben.
Die Sequenz der minimalen parB-Region von 580 bp wie in Beispiel 1 definiert (s. Fig. 1) ist in Fig. 3 angegeben. Die zentralen und linken Teile der Region sind sehr reich an dyaden Symmetrien. Das 580 bp enthält drei offene Leserahmen, die aus mehr als 50 Kodons bestehen. Die Start- und Stopp-Kodons dieser Leserahmen sind in Fig. 3 angegeben. Den Leserahmen beginnend bei Position +304 und endend bei +460 geht eine DNA-Frequenz (5'-AGGA-3') voran, die der E. coli-Ribosombindungsstelle (Shine und Dalgarno, Nature (London) 254, 1975, Seiten 34-38) ähnelt, von der man weiß, daß sie als Erkennungsstelle für die Ribosomen, welche die Translation der mRNA initiieren, dient. Das Polypeptidprodukt dieses Leserahmens ist in der folgenden DNA-Sequenz in Fig. 3 gezeigt.

BEISPIEL 3

Funktionen, die von der parB-Region exprimiert werden (s. Fig. 4 und 5)

Eine Reihe von Plasmiden wurden konstruiert, von denen eine konditionale Expression der vermuteten Gene (wie aus der Sequenz angegeben) in der parB-Region durch Insertion eines Fragments erhalten wurde, das den lambda-pR-Promotor und das lambda-cI857-Gene trug. Die Positionen dieser Insertionen sind in Fig. 1 angegeben. Das Temperatur-induzierbare lambda-pR-Promotorsystem wurde ausgewählt, da sowohl das Regulatorgen für den lambdapR-Promotor (das cI857-Gen), wie auch das lambda-pR auf einem einzelnen BglII-SalI-Restriktionsfragment lokalisiert sind; ferner machen das cI857-Allel des lambda-Repressorgens den eingefügten Promotor bei einer hohen Temperatur (42ºC) induzierbar, jedoch machen sie ihn inaktiv oder beinahe inaktiv bei niederigen Temperaturen (30ºC). Das BglII-SalI-Fragment von pOU82 wurde in die Plasmide pPR634 und pPR341 nach üblichen Klonierungsverfahren eingefügt, was zu den Plasmiden pKG634 und pKG341 führte (s. Material und Methoden).
Bei 30ºC wuchsen die Zellen, die pKG634 und pKG341 enthielten, normal, die Induktion von lambda-pR (bei 42ºC) führte zu einer raschen Abtötung der Wirtszellen.

Fig. 4 zeigt die Abtötungskinetik

(Lebensfähigkeitszählungen) und das Wachstum, gemessen als OD450 nach einer Temperaturerhöhung auf 42ºC, des Stammes JC411(pKG634). Die Lebensfähigkeitszählungen nehmen rasch ab (Halbwertszeit 2,5 Min.), und der Anstieg der OD450 hört auf. Das Vorliegen eines lambda-pR-Promotors, welcher die parB-Region in die entgegengesetzte Richtung (pKG171) transkribiert, hat keinen Effekt auf das Zellwachstum und die Lebensfähigkeit (Fig. 4, Kontrolle).
Mikroskopische Überprüfung (Phasenkontrast) der Zellen (JC411/pKG634) nach Hitzeinduktion des lambda-pR-Promotors zeigte, daß die Zellen ihre Morphologie veränderten: Der größte Teil des Materials kondensierte scheinbar in Zonen, wobei er den Rest der Zellen transparent ließ. Eine Abbildung davon ist in Fig. 5 gezeigt, in der sowohl normale und veränderte Zellen vorliegen. Die Zellen mit dem charakteristischen parB-induzierten Aussehen werden als "Geister"-Zellen im Folgenden bezeichnet.
Da das lambda-pR-Promotor-Fragment unmittelbar stromaufwärts des Starts eines 52 Aminosäuren langen offenen Leserahmens (s. Fig. 2) eingefügt wurde, liegt dies in hohem Maße nahe, daß das durch den offenen Leserahmen, beginnend bei der Position +304 (Fig. 3) kodierte 52 Aminosäuren-Polypeptid verantwortlich ist für die Zellabtötung, und folglich wird dieses Gen im folgenden als hok ("host killing") bezeichnet.

BEISPIEL 4

Unterdrückung des durch hok exprimierten wirtstötenden Effekt (s. Fig. 6)

Ein Gen, von dem ein hochtoxisches Produkt exprimiert wird, muß offensichtlich reguliert sein. Man nahm daher an, daß der Regulator des hok ebenfalls durch die parB&spplus;-Region kodiert wurde. In einem ersten Versuch, diese Regulationsschleife zu charakterisieren, wurde das Fragment von pKG634, welches lambda-cI857 stromaufwärts des hok-Gens enthielt, in ein Mini-F-Plasmid eingefüllt, was zum pF634 führte. Fig. 6 zeigt die Induktion der Abtötung von JC411 (pF634), welches zeigt, daß das Abtöten etwas langsamer und weniger wirksam als im Falle von pKG634 in Übereinstimmung mit der niedrigen Kopienanzahl von F im Vergleich zu pBR322 auftritt.
Ein zweites parB&spplus;-Plasmid (pPR633) wurde anschließend in den Stamm JC411 (pF634) transformiert, und das Induktionsexperiment mit diesem Doppelplasmidstamm wiederholt. Wie man in Fig. 6 sehen kann, unterdrückt die in trans vorhandene parB&spplus;-Region vollständig die transkriptionale Aktivierung des hok-Gens. Daher kodiert die parB&spplus;-Region einen Suppressor für die Zellabtötung (das sok-Gen).
Unter Einsatz dieses experimentellen Aufbaus in einem Test wurde das sok-Gen auf die folgende Weise kartiert. Doppelplasmidstämme, die pF634 und eines der Deletionsderivate pPR634, pPR341, pPR154 oder pPR171 enthielten, wurden konstruiert, und durch Verfolgung des Wachstumsmusters dieser Stämme bei 42ºC, wurde der Sok-Phenotyp der Deletionsderivate durch Wachstumsmessung nach Temperaturveränderung bestimmt. Die Analyse dieser Deletionsderivate zeigte, daß die Plasmide pPR634 und pPR154 Sok-Aktivität exprimieren, wogegen die Plasmide pPR341 und pPR171 keine nachweisbaren Mengen an Sok-Aktivität exprimieren.
Die Plasmide wurden auch auf inkompatible Phenotypcharakteristik für parB&spplus; getestet (s. Internationale Patentanmeldung Nr. PCT/DK83/00086, Veröffentlichungsnr. WO 84/01172), und es wurde gefunden, daß die Plasmide, die Sok-Aktivität exprimierten, auch eine parB-spezifische Inkompatibilität ausübten, wogegen Plasmide, welche sok&supmin; sind, wie oben beschrieben, keine Inkompatibilität ausüben. Daher stellt die parB-Inkompatibilitätsreaktion einen Test für Sok-Aktivität dar.
In ähnlicher Weise wie für das hok-Gen beschrieben, wurde die Region, welche für die sok-Gen-Aktivität erforderlich ist, weiter eingegrenzt. Eines der in dem Kartierungsverfahren verwendeten sok&supmin;-Derivate, pPR171, enthält die parB&spplus;-Region, die sich von Koordinate -300 bis +288 ausdehnt (Fig. 1 und 3). Ein Restriktionsfragment, das lambda-cI857 und lambda-pR enthielt, wurde in pPR171 auf eine solche Weise eingefügt, daß der lambda-pR-Promotor in die sok-Region des Plasmids einliest, was zum pKG171 führte (s. Materialien und Methoden).
Das Plasmid pKG171 wurde in den Stamm CSH50, das pOU94 enthielt, transformiert. Plasmid pOU94 ist ein lac&spplus;-parB&spplus;-p15-Derivat, welches vollständig stabil wegen des Vorliegens der parB&spplus;-Region auf dem Plasmid weitergegeben wird. Einführung anderer parB&spplus;-Plasmide in diesen Stamm führt zur Destabilisierung des pOU94 aufgrund der durch parB&spplus; exprimierten Inkompatibilität. Bei 30ºC führte das Vorliegen von pKG171 zu keiner Destabilisierung von pOU94 in einem bedeutsamen Ausmaß, wogegen eine klare Destabilisierung bei 42ºC beobachtet wurde. Daher führt die Transkription von rechts nach links in die parB&spplus;-Region des pKG171 zu einer Aktivierung der incB-Region (d. h. dem sok-Gen).
Die hier beschriebenen Ergebnisse grenzen das sok-Gen naher ein, welches daher zwischen +194 (pPR634) und +288 (pPR171) lokalisiert sein muß. Ebenfalls wird darauf hingewiesen, daß der sok-Gen-Promotor von rechts nach links abliest (im Gegensatz zur hok-Gen-Transkription) und mindestens teilweise in der Region zwischen +288 (pPR171) und +336 (pPR154) lokalisiert ist. Eine vermutliche -10 Sequenz (TATCCT) ist an Position +262 lokalisiert, und eine -35 Sequenz (TTGCGC) ist bei Position +285 (Fig. 3) lokalisiert (Hawley and McClure, Nucleic Acids Res. 11, 1983, Seiten 2237-2255). Man nimmt an, daß diese Sequenzen den Promotor des sok-Gens bilden.

BEISPIEL 5

Entdeckung eines E. coli -chromosomalen Homologs von R1-parB (s. Fig. 8a)

Da an der Plasmidevolution ein intensiver Austausch genetischer Information zwischen bakteriellen Chromosomen und frei replizierenden DNA-Molekülen beteiligt ist, wurde die chromosomale DNA von E. coli auf mögliche Vorläufersequenzen für die für die R1-parB-Sequenzen analysiert.
In Bahn 6 in Fig. 8a wurde die gesamte EcoRI-verdaute DNA aus dem plasmidfreien E. coli JC411 durch Filterhybritisierung an eine parB-Sonde analysiert, s. Materialien und Methoden. Man kann ein Fragment von 20 kb sehen, welches ein ziemlich schwaches aber eindeutiges Signal liefert, welches auch in den anderen Bahnen, die E. coli DNA enthalten, beobachtet werden kann, wenn man für die gleiche Zeit exponiert (Bahnen 4, 5). Man schätzt, daß die chromosomale Sequenz ca. 55% homolog zum parB ist. Die chromosomale Sequenz wird als parl im Folgenden bezeichnet.
Die Hauptfrage ist natürlich, in welchem Ausmaß das Auffinden einer Homologie auf der Nukleotid-Sequenzebene Ähnlichkeiten in der Funktion der durch die homologe Regionen kodierten Produkte reflektiert, ein Aspekt, welcher im Folgenden in Beispiel 6 behandelt werden wird.

BEISPIEL 6

Genetische Organisation eines E. coli-chromosomalen Homologs von R1-parB und seine funktionelle Beziehung zu R1-parB (s. Fig. 7).
Das hok-Gen des Plasmid R1, wie in Beispiel 3 definiert, kodiert für ein Polypeptid von 52 Aminosäuren. Die Aminosäure-Sequenz des hok-Genprodukts wurde mit einer großen Anzahl bekannter Proteinsequenzen verglichen. Überraschend zeigte ein Polypeptid von 51 Aminosäuren, kodiert durch das relB-orf3-Gens des E. coli relB-Operons (Bech et al, The EMBO Journal 4, 1985, Seiten 1059-1066) eine deutliche Homologie mit dem hok-Produkt. Die Aminosäure-Sequenzen der beiden homologen Proteine sind in Fig. 7 angegeben, welche zeigt, daß 42% (22) der Aminosäuren in beiden Proteinen identisch sind. Für 17% (9) der Aminosäuren sind die Veränderungen konservativ, das bedeutet, daß eine Aminosäure mit einer anderen Aminosäure mit ähnlichen chemischen Eigenschaften (z. B. Hydrophobizität, Ladung usw.) ersetzt wurde, was zu einer Gesamthomologie von 61% führte. Insbesondere die geladenen Aminosäuren waren gut konserviert, wie auch die Cysteinreste an den Positionen 16 und 31 (Fig. 7).
Die DNA-Sequenzen des hok-Gens und von relB-orf3 wurden auch wie in Fig. 7 gezeigt, verglichen. Die im Folgenden verwendeten Koordinaten sind die parB&spplus;-Sequenz-Koordinaten wie in Fig. 3. Zwischen den Koordinaten +290 bis +460 besteht eine 55%-ige Homologie zwischen den beiden Sequenzen. Es erscheint aus Fig. 7, daß die konservierte Region Nukleotide stromaufwärts und stromabwärts der proteinkodierenden Sequenz, die von +304 bis +460 lokalisiert ist, umfaßt. Die Konservierung der Basen außerhalb der kodierenden Region weist daraufhin, daß regulative Merkmale der beiden Gene ebenfalls zumindest teilweise konserviert sind.
Um zu zeigen, daß die Sequenzhomologie eine Ähnlichkeit in der Funktion reflektiert, wurde ein Plasmid mit einem lambda-pR-Promotor-Fragment stromaufwärts des relB-orf3-Gens konstruiert (s. Beschreibung einer analogen Konstruktion, die zur Kartierung des hok-Gens in Beispiel 3 verwendet wurde).
Wurde die lambda-pR-vermittelte Transkription in relB-orf3 induziert, wurde ein rasches Absterben der Zellen mit einer Kinetik beobachtet, die ähnlich derjenigen war, die für Bakterien, die das Plasmid bpKG341, wie in Beispiel 3 beschrieben, enthielten, beobachtet. Simultan wurden alle Zellen in der Kultur in die hok-charakteristischen Geisterzellen überführt (s. Fig. 5).
Es besteht daher eine deutliche Homologie zwischen dem hok-Gen des Plasmids R1 und der relB-orf3 des E. coli relB-Operons sowohl auf der strukturellen wie auf der funktionalen Ebene.

BEISPIEL 7

parB-homologe Sequenzen auf verschiedenen Plasmiden (s. Fig. 8a)

Filterhybridisierungs-Analyse von gesamter EcoRI-verdauter DNA aus einer Anzahl von E. coli-Stämmen, die verschiedene Plasmide enthielten, wurde unter Verwendung der parB-Sonde (Bahnen 1 bis 5 in Fig. 8a) durchgeführt.
Das Plasmid R1drd-19 ist ein Mitglied der R1-Plasmidfamilie, von der die parB-Sonde ursprünglich kloniert wurde. R1drd-19 liegt in zwei Kopien pro bakteriellem Genom vor. EcoRI-verdaute Gesamt-DNA aus E. coli 1005/R1drd-19 wird in Bahn 1 analysiert. Ein stark hybridisierendes Fragment von 19,5 kb wird beobachtet, dessen Größe mit der genetischen Kartierung der parB-Funktion auf dem 19,5 kb R1-Plasmid übereinstimmt (Internationale Patentanmeldung Nr. PCT/DK83/00086, Veröffentlichungsnr. WO 844/01172).
Das Plasmid R100 ist mit dem R1 nahe verwandt, welches ein transponierbares Element, Tn10, innerhalb der Region, die dem 19,5 kb EcoRI-A-Fragment von R1 äquivalent ist, trägt. Das Transposon enthält die Erkennungssequenz für EcoRI und, konsequenterweise, wird eine weitere EcoRI-Schnittstelle in das R1-ähnliche EcoRI-A-Fragment eingeführt, durch Teilen dieses Fragments in zwei EcoRI-A- und EcoRI-D-Fragmente von R100 (Miki et al, J. Bacteriol. 144, 1980, Seiten 87-99). Diese beiden EcoRI-Fragmente von R100 enthalten beide Sequenzen, die durch Heteroduplex-Kartierung als homolog zu den Sequenzen, die auf dem F-Faktor vorkommen, (Sharp et al, J. Mol. Biol. 75, 1973, Seite 235) gefunden wurden. Ein starkes Hybridisierungsfragment von 12,8 kb wird in Bahn 2, Fig. 8a, beobachtet, wodurch die parB-Region von R100 in das EcoRI-D-Fragment von R100, innerhalb des Zentrums der Homologieregion zwischen R1 und R100 und F kartiert wird.
Diese Lokalisierung von parB innerhalb der F-homologen Region von R100 löste die Suche nach parB-ähnlichen Sequenzen auf Plasmiden, die zur Inkompatibilitätsgruppe IncFI gehörten, aus.
EcoRI-verdautete Gesamt-DNA aus B210/R386, ein E. coli-Stamm, der das IncFI-Plasmid R386 enthielt, wurde durch Filter-Hybridisierung unter Verwendung der parB-Sonde (Bahn 3, Fig. 8a) analysiert.
Man fand, daß das Plasmid R386, das zur selben Inkompatibilitätsgruppe wie F gehört, ein parB-Hybridisierungssignal entsprechend einem EcoRI-Fragment von 19,5 kb ergibt. Da dieses Plasmid in 0,5 bis 1 Kopien pro Genom vorliegt, legt das Auffinden eines Signals von ca. einem Drittel des R100-Signals (Bahn 2, Fig. 8a) nahe, daß das Maß der Homologie zwischen R1-parB und R386 parB-ähnlichen Sequenzen 55 bis 60% ist.
Die Suche nach parB-verwandten Sequenzen wurde aufandere Inkompatibilitätsgruppen ausgedehnt. Das Plasmid RP1, welches zur Inkompatibilitätsgruppe IncP gehört, wurde analysiert.
Mit der parB-Sonde liefert die gesamte EcoRI-verdaute DNA von 1005 (RP1) ein Hybridisierungs-Signal, das dem EcoR1-linearisierten Plasmid entspricht (Bahn 4, Fig. 8a).
Zusätzlich wird eine Hybridisierungsbande von 20 kb entsprechend dem parl beobachtet, was in Beispiel 5 diskutiert wurde.
Da RP1 in eine stabile Form innerhalb eines weiten Feldes gram-negativer bakterieller Wirte adaptiert wird, öffnet das Auffinden von parB-verwandten Sequenzen auf RP1 die Möglichkeit, daß Erhaltungssysteme analog dem R1-parB-System, welches ein operatives Agens in E. coli wie auch in Pseudomonas putida (Beispiel 11) ist, in einer Vielzahl von bakteriellen Wirten funktionieren können.
Es wurde noch ein weiteres Plasmid, R6-K (Inkompatibilitätsgruppe IncX) gefunden, welches Sequenzen mit ungefähr derselben Hybridisierungscharakteristik wie RP1 trägt, das durch die Anwesenheit eines 25 kb EcoR1-Fragments von R6-K, das mit der parB-Sonde hybridisierte (Bahn 5, Fig. 8a) belegt wurde.
Das in niederiger Kopienanzahl vorliegende Plasmid F wurde im Einzelnen analysiert, um zu bestimmen, ob das Vorliegen von R1-parB-hybridisierenden Sequenzen die Existenz eines stabilisierenden Mechanismus, der mit dem von R1-parB verwandt ist, reflektiert.
Zwei Plasmid-Stabilisierungsfunktionen wurden innerhalb des Genoms von F identifiziert, und die entsprechenden Gene [sop (Ogura und Hiraga, Cell 32, 1983, Seiten 351-360) und ccd (Ogura und Hiraga, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 1983, Seiten 4784-4788)] wurden auf dem EcoRI-Fragment, das sich von den Kartenpositionen 40,3 bis 49,5 ausdehnte, lokalisiert.
Filterhybridisierungs-Analyse der gesamten DNA aus E. coli 1005, welches F enthielt, zeigte, daß R1-parB-verwandte Sequenzen auf einem 10,7 kb EcoR1-Fragment von F vorlagen (Kartenposition 49,5 bis 60,2) und weitere Hybridisierungsanalysen von 1005(F)-DNA, verdaut mit EcoRI und/oder BamHI, grenzten diese Sequenzen auf ein 4,5 kb BamHI-EcoRI-Fragment ein, welches sich von der Kartenposition 55,7 bis 60,2 ausdehnte. Dies weist auf die Existenz einer dritten Plasmid-stabilisierenden Funktion innerhalb von F hin.
Die Region von F, die mit der R1-parB-Sonde hybridisierte, wurde anschließend in einen Bakteriophage-lambda-Vektor kloniert. EcoRI-verdaute DNA von 1005(F) wurde durch präparative Agarosegel-Elektrophorese in der Größe fraktioniert, und die Fragmente von 9,5 bis 12 kb wurden durch Elektroelution aus dem Gel wieder gewonnen. Die Fragmente wurden in die EcoRI-Stellen der linken und rechten Arme von lambda-L147 legatisiert und in vitro unter Erhalt infektiöser Phagen verpackt (s. Maniatis et al, Molecular Cloning, Gold Spring Harbor, New York, 1982, Seite 256), welche anschließend zur Infektion von E. coli LE392 verwendet wurde. Rekombinante Phagen mit den R1-parB-verwandten Sequenzen wurden durch Plaque-Hybridisierung identifiziert.
Von einem rekombinanten Phagen, der das 10,7 kb EcoRI-Fragment trug, welches die R1-parB-verwandten Sequenzen umfaßt, wurde das Fragment isoliert und in pUC8 in die EcoRI-Schnittstelle eingefügt. In einem erhaltenen Plasmid, pNL1, ist das Insert so orientiert, daß die Spaltung von pNL1 DNA mit BamHI zu einem Herausschneiden eines 4,5 kb-Fragments führt, das die R1-parB-hybridisierende Sequenz trägt.
Das 4,5 kb BamHI-Fragment von pNL1 wurde isoliert, und die mit der R1-parB-Sonde hybridisierende Region wurde auf ein RsaI-Fragment von 870 bp durch Filter-Hybridisierungsanalyse kartiert. Das 870 bp RsaI-Fragment wurde isoliert und in eine SmaI-Stelle von M13mp9 eingefügt. Eine Anzahl von rekombinanten Phagen, die die R1-parB-verwandte Sequenzen auf dem 870 bp-Insert trugen, wurden durch Plaque-Hybridisierung identifiziert. Die Nukleotid-Sequenz der eingefügten DNA wurde nach Sanger et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, Seiten 5463-5467, analysiert.
Die Nukleotid-Sequenz eines Teils der rekombinanten Phagen, mpNL12, enthält 402 Basen, die sich von der RsaI-Stelle ausdehnen, und diese Sequenz ist 90% homolog zur Region von +178 bis +580 der R1-parB-Sequenz (Fig. 3). Alle wesentlichen Merkmale der R1-parB-Region werden auch in der F-abgeleiteten Sequenz gefunden: (1) ein offener Leserahmen, der ein Protein von 50 Aminosäuren kodiert, ist entsprechend dem R1-hok-Gen vorhanden, (2) die Ribosom-Bindungsstelle des R1-hok ist konserviert, (3) die Region entsprechend dem 3'-nichttranslatierten Teil der R1-parB-mRNA, von der man glaubt, daß sie wesentlich für die hok-mRNA-Stabilität ist, ist hochkonserviert (90%ige Homologie), und (4) die vermutlichen -10- und -35-Regionen von R1 sok sind ebenfalls konserviert.
Der offene Leserahmen innerhalb der F-abgeleiteten Sequenz kodiert für ein Protein von 50 Aminosäuren, welches sich nur leicht vom R1-spezifizierten hok-Protein unterscheidet. Zunächst wurden die zwei Kodons im R1-hok deletiert, nämlich val-15 und ser-29. Zweitens traten zwei konservative Untersubstitutionen auf, nämlich leu 16 in val und his-39 in tyr.
Offensichtlich stammen das R1-hok-Gen und die verwandten Sequenzen auf dem F-Derivat von einer gemeinsamen Vorläufersequenz ab, und ferner legt der Erhalt der der R1-hok-entsprechenden kodierenden Region sehr nahe, daß das kodierte Protein bei der Stabilisierung von F beteiligt ist.
Um die Plasmid-stabilisierenden Eigenschaften der F-abgeleiteten Sequenz zu testen, wurde das 4,5 kb BamHI-Fragment aus pNL1, welches die F hok-ähnlichen Sequenzen trägt, in pJEL82 eingefügt, einem Plasmid mit niederiger Kopienzahl, mit einer Verlusthäufigkeit von 10&supmin;² pro Generation (s. PCT/DK83/00084, Veröffentlichungs-Nr. WO 84/01171). Das erhaltene Plasmid, pJEL82/F, wie auch pJEL82, wurden in E. coli HB101 transformiert. Kulturen der beiden Stämme wurden 16 Stunden ohne Selektionsdruck gezüchtet und der Anteil der plasmidhaltigen Zellen (ApR) wurde bestimmt. Das Ergebnis war wie folgt:
Plasmid %APR-Zellen
pJEL82 36,5
pJEL82/F 98,4
Man schloß daraus, daß das 4,5 kb BamHI-Fragment, das R1-parB-verwandte Sequenzen trug, einen Plasmid-stabilisierenden Effekt ausübt. Falls die Stabilisierung aufgrund des Vorliegens des hok-Gens innerhalb des F-Fragments erfolgt, sollte man ein Auftreten von Geisterzellen in Kulturen und Zellen beobachten, die pJEL82/F enthalten und ohne Selektionsdruck gezüchtet werden, s. Beispiel 3. Man fand, daß eine Über-Nacht-Kultur von Zellen, die pJEL82/F enthielten, ca. 5% Geisterzellen enthielten, die von R1-hok-induzierten Geisterzellen nicht unterscheidbar waren.
Im Fall von F zeigt daher die Demonstration von Sequenzen, die mit R1-parB verwandt sind, durch Filter-Hybridisierung die Existenz eines ähnlich funktionierenden Plasmid-Stabilisierungsmechanismusses auf.

BEISPIEL 8

Schrittweise Hybridisierung als Strategie zum Nachweis eines Replikons, das Sequenzen homolog zu parB-verwandten Sequenzen stabilisiert (s. Fig. 8b)

Die Hybridisierungsbedingungen bestimmen das Ausmaß der Homologie zwischen einer Sonde und einer filtergebundenen DNA-Spezies, die für ein selektierbares Signal erforderlich sind, s. die Diskussion in Materialien und Methoden. Folglich können filtergebundene Sequenzen vorkommen, welche in der gegebenen Probe unter einer gegebenen Reihe von Hybridisierungsbedingungen nicht nachweisbar sind, jedoch trotzdem eine hok-ähnliche Aktivität kodieren können, s. die Diskussion der Homologie gegenüber Funktion in Materialien und Methoden. Dies wird im folgenden Experiment erläutert.
Wie in Beispiel 6 beschrieben, stellt relB-orf3 ein chromosomales Homolog von R1-parB aufgrund der Daten des Sequenzvergleichs und der funktionalen Ähnlichkeit von hok und relB-orf3 dar. Die relB-orf3- und flankierenden Sequenzen, wie sie im Plasmid pBD2724 vorliegen, wurden als Sonde in einer Filter-Hybridisierungsanalyse von E. coli chromosomaler DNA verwendet.
Plasmid pBD2724 ist ein pBR322-Derivat, das ein HincII-Mlul-Fragment aus dem relB-Operon von E. coli umfaßt, das die relB-orf3-kodierende Sequenz enthält (Koordinaten 1070-1350 entsprechend Bech et al, op.cit.).
In Bahn 3, Fig. 8b, wird die gesamte EcoR1-verdaute DNA aus plasmidfreiem E. coli durch Filter-Hybridisierung unter Verwendung der relB-orf3-Sonde analysiert. Zusätzlich zum 20 kb hybridisierenden Fragment, welches wahrscheinlich die oben erwähnte parl-Sequenz darstellt (Beispiel 6) wurde noch ein weiteres hybridisierendes Fragment von 16 kb entdeckt. Da die Intensität des letzteren größer als die Intensität des 20 kb-Signals ist, muß das 16 kb-EcoR1-Fragment, das E. coli relB-orf3-Gen, welches als Hybridisierungssonde verwendet wird, überspannen, d. h. die Intensität des 16 kb-Signals liefert eine Referenz, aus der das Maß der Homologie geschätzt werden kann. Die Intensität des parl-Hybridisierungs-Signals, welches ca. 3/4 des relB-orf3-Signals ist, legt nahe, daß parl ca. zu 65 bis 70 % homolog zu relB-orf3 ist. Da das 16 kb-relB-orf3-tragende Fragment nicht mit der parB-Sonde nachzuweisen ist (Bahn 6, Fig. 8a) ist R1-parB 50% oder weniger homolog zu relB-orf3.
In Beispiel 5 wurde gefunden, daß die parB-Sonde das 20 kbp-chromosomale Homolog aber jedoch nicht das 16 kbp-Homolog, welches nach den obigen Werten relB-orf3 repräsentiert, entdeckt. Da, wie in Beispiel 6 beschrieben, das letztere bei Expression eine hok-ähnliche Aktivität ausübt, kann man annehmen, daß das parl ebenfalls eine hok-ähnliche Aktivität oder sok-ähnliche Aktivität und/oder beide Aktivitäten exprimiert, wenn es geeignet exprimiert wird. Das relB-orf3-Fragment wurde als Sonde in der Filterhybridisierungs-Analyse von E. coli, welches Plasmid R100 und R386 enthielt, von denen beide R1-parB-ähnliche Sequenzen umfassen (Fig. 8a, Bahnen 1 und 2). Unter der vorliegenden Reihe von Hybridisierungsbedingungen entdeckte die relB-orf3-Sonde diese Sequenzen nicht (Fig. 8b, Bahnen 1 und 2), da nur von den 20 kb-parl- und das 16 kb-relB-orf3-tragende Fragment beobachtet werden konnte, mit der Sonde zu hybridisieren, was darauf hinwies, daß das Fehlen einer Hybridisierung zwischen einer Sonde aus einer eine hok- oder hok-ähnliche Aktivität kodierenden Region und einer gegebenen DNA-Spezies nicht auschloß, daß die fragliche DNA-Spezies hok-ähnliche Aktivität bei geeigneter Expression ausüben kann. Folglich legt das Auffinden einer Homologie zwischen der fraglichen DNA-Spezies und einer Region, die eine hok- oder hok-ähnliche Aktivität exprimiert, in hohem Maße nahe, daß die fragliche DNA-Spezies hok- oder hok-ähnliche Aktivität bei geeigneter Expression ausübt.
Die obigen Daten zeigen daher eine geeignete Strategie zur Suche nach Regionen auf, die hok/sok-ähnliche Aktivitäten ausüben: eine Sonde, die einer Region einer Nukleinsäure mit hok- oder hok-ähnlichen Genen entspricht (s.B. R1-parB), wird zur Detektion homologer Sequenzen (z. B. parl) innerhalb des fraglichen Genoms (z. B. chromosomaler oder Plasmid-DNA) verwendet, welche anschließend auf hok- oder hok-ähnliche Aktivität (wie für die relB-orf3-Region erfolgt) unter geeigneten experimentellen Bedingungen getestet wird, und falls man zeigen kann, daß sie eine solche Aktivität oder Aktivitäten kodieren, werden sie als nächstes selbst als Sonden in einem zweiten Hybridisierungs-Zyklus eingesetzt, um die neuen homologen Sequenzen zu definieren, die mit den im ersten Hybridisierungs-Zyklus verwendeten Sonden verwandt oder nicht verwandt sein können (z. B. R1-parB). Dieses schrittweise Verfahren unter Kombination von Nukleinsäure-Hybridisierung und funktionalen Tests der isolierten Nukleinsäure-Sequenzen kann als allgemeine Strategie der Suche nach Genen angepaßt werden, die hok- oder hok-ähnliche Aktivitäten in Genomen exprimieren, die sich in steigendem Maße von E. coli auf dem evolutionären Maßstab entfernt haben.

BEISPIEL 9

Detektion von parB-verwanten Sequenzen in Bakterien (s. Fig. 9 und 10)

In den vorhergehenden Beispielen wurde gezeigt, 1) daß mit R1-parB-verwandte Sequenzen unter bakteriellen Plasmiden, die aus gram-negativen Bakterien isoliert werden, weit verbreitet sind, und 2) daß mit R1-parB-verwandte Sequenzen in der chromosomalen DNA von E. coli vorliegen. Diese Erkenntnisse lösten eine Suche nach entweder mit R1-parB oder einem der chromosomalen Gegenstücke (E. coli relB-orf3) in der DNA aus einer Vielzahl von Bakterien, entweder als Teil ihrer chromosomalen DNA oder der in diesen Organismen natürlich vorkommenden Plasmide, aus.
Filterhybridisierungs-Analyse von EcoRI-geschnittener DNA aus Serratia marcescens mit der R1-parB-Sonde zeigt eine intensive Hybridisierung an drei Fragmente von 4,1, 2,9 und 2,5 kb (Bahn 2, Fig. 9). Nur das 4,1 kb-Fragment hybridisiert auch mit der relB-orf3-Sonde (Bahn 1, Fig. 10). Die parB-Sonde hybridisiert an zusätzlichen 6 Fragmenten. Zwei dieser Signale sind stärker als das parB-Signal von dem relB-orf3-tragenden 16 kb-Fragment E. coli DNA (Bahn 6, Fig. 9). Hybridisierung von Serratia marcescens DNA mit der E. coli relB-orf3-Sonde liefert eine Anzahl schwacher Hybridisierungssignale. Es ist möglich, daß die stark hybridisierende Bande von 2,5, 2,9 und 4,1 kb von einem Plasmid (Plasmiden) stammen, obwohl die Agarosegel-Elektrophorese keine Plasmide mit hoher Kopienzahl zeigte.
Pseudomonas fluorescens wurde als plasmidfreies Mitglied dieser Spezies analysiert. Hybridisierung von DNA aus Pseudomonas fluorescens mit R1-parB (Bahn 3, Fig. 9) zeigt 8 bis 10 hybridisierende Fragmente, wovon 4 Signale mit Intensitäten von ca. 33% des chromosomalen Gegenstücks von R1-parB zeigen (Bahn 6, Fig. 9). Ein einzelnes dieser Fragmente von ca. 13 kb hybridisiert wahrscheinlich auch mit der E. coli relB-orf3-Sonde (Bahn 2, Fig. 10). Zusätzlich identifiziert die relB-orf3-Sonde 5 Fragmente spezifisch, wenn auch mit niedriger Signalintensität; 2 davon, 5,5 und 6,5 kb, können auch in der DNA aus Pseudomonas putida beobachtet werden, wenn diese DNA mit der relB-orf3-Sonde analysiert wird (Bahn 3, Fig. 10). Die relB-orf3-Sonde hybridisiert an zusätzliche 5 Fragmente in Pseudomonas putida-DNA, jedoch keines dieser Fragmente wird durch die R1-parB-Sonde erkannt (Bahn 4, Fig. 9). In der Pseudomonas putida-DNA entdeckt die parB-Sonde ca. 10 Fragmente mit niedriger Signalintensität und ein einzelnes, ziemlich stark hybridisierendes Fragment von ca. 7,3 kb.
Von gram-positiven Bakterien wurden B. subtilis, B. circulans PL236 und zwei Stämme von Lactobacillus auf das Vorliegen von Sequenzen, die entweder mit R1-parB oder E. coli relB-orf3 verwandt waren, analysiert.
Im Falle der parB-Sonde wurde ein einzelnes, ziemlich stark hybridisierendes Fragment von 2,5 kb in der DNA von B. circulans gefunden (Bahn 8, Fig. 9). Sehr schwache Signale wurden von ein paar zusätzlichen Fragmenten von B. circulans DNA erhalten. Mit der relB-orf3-Sonde wurde eine begrenzte Anzahl von Hybridisierungsfragmenten in der DNA von B. subtilis gesehen (Bahn 4, Fig. 10), B. circulans (Bahn 5, Fig. 10) und Lactobacillus (Bahnen 6 und 7, Fig. 10). Die Anzahl der relB-orf3-hybridisierenden Fragmente lag im Bereich von 6 bis 11, und alle hatten ca. die gleiche Signalintensität. Bei den Lactobacilli zeigte die Agarosegel-Elektrophorese das Vorliegen von Plasmiden, was zur Vermutung führte, daß mindestens einige dieser hybridisierenden Sequenzen ihren Ursprung auf einem Plasmid haben. Eine Suche nach Plasmiden in B. circulans PL 236 war negativ, was darauf hindeutete, daß die Sequenz von B. circulans DNA, die mit der R1-parB-Sonde hybridisiert (Bahn 8, Fig. 9) von chromosomalem Ursprung sein kann.
Die obigen Experimente zeigen, daß mit R1-parB und/oder E. coli relB-orf3 verwandte Sequenzen weit unter bakteriellen Spezies verbreitet sind, nicht nur bei den Enterobacteriaceen, aus denen die Sonden stammen, sondern auch bei den gram-positiven Bakterien.

BEISPIEL 10

Nachweis von parB-verwandten Sequenzen in eukaryontischen Zellen (s. Fig. 11)

Es wurde ein einzelliger Organismus untersucht, nämlich die Ciliat-Protozoe Tetrahymena thermophilia, Fig. 11. Dieser Organismus ist charakterisiert durch 1) eine hohe Anzahl mitochondrialer DNA-Moleküle pro Zelle und 2) durch ca. 12.000 Kopien ribosomaler RNA-Gene, die auf selbst replizierenden rDNA-Molekülen lokalisiert sind. Weder die R1-parB-Sonde noch die E. coli-relB-orf3-Sonde entdeckte Fragmente in der aus den isolierten Makronuklei hergestellten DNA (Bahn 1, Fig. 11). Auch hybridisierten diese Sonden mit den EcoRI-Fragmenten von isolierter rDNA (Bahn 3, Fig. 11). Gesamt EcoRI-verdaute DNA von Tetrahymena thermophila, welche mitochondriale DNA umfaßt, zeigte 2 hybridisierende Fragmente von 6,6 kb und 3,3, kb (Bahn 2, Fig. 11) mit der relB-orf3-Sonde, wogegen die parB-Sonde überhaupt keine Signale lieferte. Die hybridisierenden Fragmente wanderten mit den beiden EcoRI-Fragmenten der mitochondrialen DNA, die leicht durch Ethidiumbromid-Färbung auf dem Gel vor dem DNA-Transfer nachweisbar waren, mit.
Chloroplasten-DNA aus der Erbse (Pisum sativum) wurde mit der Restriktions-Endonuklease PstI gespalten, und 0,125 Mikrogramm davon wurde durch Filterhybridisierung mit der parB- und der relB-orf3-Sonde analysiert (Bahn 4, Fig. 11). Die letztere Sonde hybridisiert an ein Fragment von ca. 16 kb.
Abschließend wurden zwei Proben menschlicher zellulärer DNA durch Filterhybridisierung nach EcoRI-Verdau analysiert. Die R1-parB-Sonde lieferte ein (schwaches) Hybridisierungssignal mit der Neuroblastoma-DNA (Bahn 5, Fig. 11), wie auch embryonaler Leber-DNA (Bahn 6, Fig. 11). Der hohe mitochondriale Anteil an Lebergewebe kann darauf hindeuten, daß das beobachtete Signal in Bahn 6, Fig. 11, von menschlichen Mitochondrien stammt. Die Neublastoma-DNA wurde analysiert, da andere Hybridisierungsanalysen auf eine selektive Amplifizierung eines kleinen chromosomalen Bereichs, welches zum Vorliegen extrachromosomaler Mini-Chromosome ("double minutes") führte, hingewiesen hatten; der Ursprung des Hybridisierungssignals in Bahn 5, Fig. 11, ist unbekannt.
Gleichzeitig wurden alle Zellen in der Kultur in die hok-charakteristischen Geisterzellen transformiert (s. Fig. 5).
Es besteht daher eine deutliche Homologie zwischen dem hok-Gen von Plasmid-R1 und dem relB-orf3 des E. coli relB-Operons sowohl auf struktureller wie funktionaler Ebene.

BEISPIEL 11

Konstruktion einer trp-hok-Fusion

Das Plasmid pPR341 trägt das hok&spplus;-Gen aus der parB-Region ohne seinen natürlichen Promotor (s. Tabelle 1 und Fig. 3). Das Plasmid pSGS8 trägt das trp-Operon auf einem in pBR322 eingefügten EcoRI-Fragment. Ein XhoI-EcoRV-Fragment (ca. 700 bp) von pSGS8, welches den trp-Promotor trug, wurde durch Ligatisierung in zunächst mit BamHI verdautem (diese Stelle wurde durch Auffüllen mit Klenow-Polymerase glatt gemacht) eingefügt und anschließend mit SaII verdautem pPR341 ligatisiert. Diese Insertion plazierte das trp-Promotor-Fragment in eine solche Orientierung, daß die Transkription in das hok-Gen eintreten würde. Nach Transformation in MC1000 wurden Kolonien auf Ampicillin-haltigen LB-Platten selektiert, und anschließend wurden die Kolonien auf Wachstum auf A+B-Minimalplatten, die Leucin und Amplicillin enthielten, getestet. In Abwesenheit von Tryptophan wird der trp-Promotor induziert, und die Transkription in das hok-Gen sollte tödlich sein. Daher wurde nach Klonen gescreened, die nicht auf Minimalplatten wuchsen. Eines dieser Klone, welches ein Plasmid, P341-1, enthielt, das, wie durch Restriktions-Enzymkartierung gezeigt wurde, die korrekte Insertion enthielt, wurde für die weitere Analyse ausgewählt (s. Fig. 12).

BEISPIEL 12

Wachstum von Zellen, die p341-1 enthalten

MC1000 (p341-1) wurde in A+B-Minimalmedium gezüchtet, das mit 0,2% Glukose und 1% Casaminsäuren ergänzt war. Casaminsäuren enthalten sehr wenig Tryptophan, und man erwartete, daß bei einer gewissen Zelldichte das Medium Tryptophan frei sein würde. Diese Situation simuliert das Wachstum in einer natürlichen Umgebung mit einem begrenzten Nachschub an Tryptophan, welches eine seltene Aminosäure ist. Wie man in Fig. 13 sieht, ist die ursprüngliche Wachstumsrate des plasmidtragenden Stamms (hok&spplus;) identisch zu dem plasmidfreien MC1000-Stamm. Jedoch bei einer Zelldichte von ca. OD&sub4;&sub5;&sub0;= 0,8 hört das Wachstum von MC1000 (p341-1) abrupt auf, was auf eine Induktion des hok-Gens hinweist (nachgewiesen durch mikroskopische Prüfung der Zellen, s. Fig. 5), wogegen der plasmidfreie Stamm weiter wächst. Lebensfähigkeitszählungen von MC1000 (p341-1) zu diesem Punkt und eine Stunde später zeigen eine dramatische Verminderung der Lebensfähigkeit (weniger als 10&supmin;&sup4;). Als Folge macht die Anwesenheit von p341-1 in einem E. coli K-12-Stamm das Wachstum und die Lebensfähigkeit von dem Vorliegen von Tryptophan im Wachstumsmedium abhängig. Wenn diese Aminosäure aus der Umgebung verschwunden ist, hört das Wachstum sofort auf, und die Zellen werden abgetötet.

BEISPIEL 13

Verwendung eines R1-hok-Homologs in der Konstruktion eines biologischen Einschließungssystems

Das F-hok-Gen (s. Beispiel 7) und der trp-Promotor wurden zur Erzeugung eines biologischen Einschließungssystems kombiniert. Aus pNL1, beschrieben in Beispiel 7, wurde das 850 bp-Rsal-Fragment, welches mit der R1-parB-Sonde hybridisierte, in SmaI-geschnittenes M13mp11 kloniert. Eine Rekombinante, mpNL4, wurde identifiziert, in der die ribosomale Bindungsstelle von F-hok wie auch die für die F-hok kodierende Region als ein ca. 300 bp FspI-EcoR1-Fragment ausgeschnitten werden konnte. Dieses ca. 300 bp-Fragment, das 550 bp-EcoRV-XhoI-Fragment von pSGS8, welches den trp-Promotor wie auch den initiierenden Teil von trpE enthielt, und das 3,7 kb-SaII-EcoRI-Fragment von pBR322, das das bla-Gen trug, wurden unter Erhalt von pNL7 legatisiert. In diesem Konstrukt transkribiert der trp-Promotor auch in F-hok. Das Plasmid pNL7 hat das korrekte Restriktionsenzym-Muster, und mit pNL7 transformierte E. coli HB101-Zellen zeigen eine Wachstumshemmung auf Platten ohne Tryptophan, wie für p341-1-Transformanten in Beispiel 12 beschrieben.
Der maximale induzierbare Zelltod, der durch Expression des F-hok-Gens auf pNL7 verursacht wurde, wurde für mit pNL7 transformierten E. coli HB101, HB101(pNL7) bestimmt. Die Zellen wurden in modifiziertem A+B (MA+B) gezüchtet, welches A+B-Medium enthielt, das mit Thiamin, Leucin, Prolin, 0,4% Glukose, 1% Casaminsäuren und Ampicillin (50 ug/ml) ergänzt war, und mit weiteren Zugaben von Tryptophan in verschiedenen Konzentrationen (0 bis 200 ug/ml) Die Zellen wurden in die frühe exponentiale Phase gezüchtet, zu der 100 ug/ml Indolylacrylsäure (IAA) zugegeben wurde, welches mit Tryptophan um die Bindung an den Repressor konkurriert, was zu einer Inaktivierung des Repressors führt. Die Anzahl der lebensfähigen Zellen pro ml wurde durch Plattieren von Proben der IAA-behandelten Kulturen auf LB-Platten mit 50 ug/ml Ampicillin für 30 Minuten nach der IAA-Induktion bestimmt. E. coli HB101(pBR322) diente in diesen Experimenten als Kontrolle. Der maximale abtötende Effekt nach IAA-Zusatz wurde bei 5 bis 10 ug/ml Tryptophan beobachtet, der lebende Anteil von HB101(pNL7) war dabei 1,4·10&supmin;&sup4;. Die Kontrollzellen blieben durch IAA-Zusatz unbeeinflußt.
Die Kinetik der IAA-induzierten Abtötung von HB101(pNL7), welches in dem obigen Medium mit 5 ug/ml Tryptophan gezüchtet wurde, ist biphasisch mit einer exponentiellen Komponente von 0 bis 15 Minuten, bei der die über lebende Fraktion weniger als 10&supmin;³ enthält, und einer zweiten linearen Phase, die bis zu 90 Minuten dauert, welche weiter die über lebende Fraktion um einen Faktor von 10 oder mehr verringert.
Simulierte Freisetzungsexperimente wurden durch Züchten von E. coli HB101(pNL7) unter Bedingungen durchgeführt, die zur Erschöpfung von Tryptophan, und daher zur Aktivierung des trp-Promotors führten. Die Zellen wurden in MA+B-Medium gezüchtet, wobei entweder kein Tryptophan zugegeben wurde, oder das mit 5 ug/ml Tryptophan ergänzt wurde. OD&sub6;&sub0;&sub0;und die lebensfähigen Zellen pro ml schloß sich an. Die Kontrolle war HB101(pBR322).
In einem Experiment war kein Tryptophan im Wachstumsmedium vorhanden, und wie in Fig. 14 gezeigt, stieg die OD&sub6;&sub0;&sub0;von HB101(pNL7) exponentiell mehrere Stunden an, wenn auch mit einer niedrigeren Geschwindigkeit als die Kontrollkultur, jedoch wurde kein entsprechender Anstieg in der Zellenanzahl gesehen. Unter mikroskopischer Beobachtung erhöhte sich die Zellengröße der pNL7-transformierten Zellen während dieser Phase. Da die Lebensfähigkeitszählungen nicht abnahmen, nimmt man an, daß eine niedrige, jedoch tolerierbare Expression von F-hok stattfand. Nach Erschöpfung von Tryptophan wurde Abtötung von HB101(pNL7) beobachtet, wobei der überlebende Anteil 2·10³ war.
In einem zweiten Experiment wurden HB101(pNL7) und HB101(pBR322) in mit 5 ug/ml Tryptophan ergänztem MA+B gezüchtet. Wie aus Fig. 15 hervorgeht, scheinen die beiden Stamme identische Generationszeiten während der ersten Experimentphase, wie durch UD&sub6;&sub0;&sub0;bestimmt, zu haben, und in diesem Experiment erhöhte sich die UD&sub6;&sub0;&sub0;in der HB101(pNL7)-Kultur, was durch einen exponentiellen Anstieg der Zellenanzahl zum Ausdruck kam. Daher beeinflußt das bloße Vorliegen des F-hok-Systems innerhalb von E. coli nicht das Zellwachstum, solange Pryptophan im Wachstumsmedium vorhanden ist. Zur Zeit eines Tryptophanmangels wird F-hok aufgrund der Abschaltung der Repression des trp-Promotors exprimiert, was zu einem Abtöten der Zellen führt, so daß der überlebende Teil auf 10&supmin;³ innerhalb einer Stunde vermindert wird.
Unter Verwendung der obigen Konstrukte mit F-hok überlebt ein wesentlicher Teil der Zellen die Induktion der Expression der abtötenden Funktion. Dies könnte im Prinzip auf einen oder eine Kombination mehrerer Faktoren zurückzuführen sein: Die strukturelle Instabilität von pNL7, die Adaption von HB101(pNL7) an den toxischen Effekt des hok-Proteins, die Selektion plasmidfreier Zellen in der Population, oder ungenügende Expression von F-hok in individuellen Zellen aufgrund des kombinierten Effekts oder einer relativ niedrigen Transkription, auch wenn im induzierten Stadium der trp-Abschwächer vorliegt, und Selektion von Zellen mit einer niedrigen Anzahl von Kopien.
Zur Klärung dieser Frage wurden E. coli HB101(pNL7), die entweder 90 Minuten nach IAA-induzierter F-hok-Expression oder Induktion von hok-Expression aufgrund von Tryptophanmangel nach Wachstum mit oder ohne exogen zugesetztem Tryptophan analysiert. Die überlebenden Zellen aus den Mangelexperimenten wurden eine Stunde gesammelt nach Abnahme der OD&sub6;&sub0;&sub0;-Kurven in Fig. 14 und 15 gesammelt. In diesen drei Fällen waren alle über lebenden Kolonien gegenüber 50 ug/ml Ampicillin resistent, die überlebenden Zellen aus den Mangelexperimenten, in denen kein exogenes Tryptophan zugesetzt worden war (Fig. 14) zeigten eine 50%ige Abnahme von Zellen, die resistent zu 500 ug/ml Ampicillin waren. Daher kann eine fortgesetzte Expression eines hok-Proteins mit einem niedrigen Spiegel zur Selektion der Zellen mit einer niedrigen Plasmid-Kopienanzahl führen. 12 Ampicillin-resistente Kolonien aus jedem der 3 Induktionsexperimente wurden in LB-Medium mit 50 ug/ml Ampicillin bis zur frühen exponentiellen Phase gezüchtet, wobei IAA bis zu 100 ug/ml zugegeben wurde. Die Anzahl der lebensfähigen Zellen pro ml wurde 90 Minuten nach IAA-Zugabe bestimmt. In allen 36 Experimenten wurde die erwartete Abtötung beobachtet, der überlebende Anteil variierte zwischen 10&supmin;³ und 10&supmin;&sup4;. Man schließt daher, daß das Überleben von HB101(pNL7) nach Induktion des F-hok-Systems auf der Selektion von Zellen beruht, in denen die Expressionsschwelle des hok-Proteins nicht einen Schwellenwert übersteigt, z. B. aufgrund der Selektion von Zellen mit einer niedrigen Plasmid-Gen-Anzahl. Die Effizienz eines biologischen Einschließungssystems auf hok-Basis kann daher zusätzlich durch Substitution eines stärkeren Promotors und/oder Erhöhung der translationalen Effizienz der hok-mRNA gesteigert werden.

BEISPIEL 14

Die Wirkung eines lambda-PR-Promotors auf die Expression des hok-Gens

Behandlung von pPR633 mit der Exonuklease Bal31 führte zu einer Reihe von Deletionen im 5'-Ende des kodierenden Stranges der parB-Region, von denen zwei in Fig. 16a gezeigt sind. Das Plasmid pPR341 wird in Beispiel 3 beschrieben. Das Plasmid pPR345 umfaßt die +303 - +580-Region von parB, die nur den Leserahmen des hok-Gens enthält (s. Fig. 3). Die Deletion bietet weder einen Promotor noch eine Shine-Dalgarno-Sequenz zur Expression des hok-Gens. Klonieren des BgIII-SalI-Fragments, das den lambda-PR-Promotor und den lambda-Repressor (cI857) enthält, in mit SalI und BamHI-verdautes pPR345 führte zum Plasmid pKG345 (Fig. 16b). Induktion von lambda-PR (bei 42ºC) führte zu einer raschen Abtötung der Wirtszellen, was zeigte, daß pKG345 den hok&spplus;-Phenotypus bei Induktion aufwies, und daß der Effekt im Vergleich zu den vorhergehenden Konstrukten erhöht war.
Bei nähere Analyse zeigte das Konstrukt, daß das cro-Gen des lambda-Fragments an das hok-Gen fusioniert hatte. Dies führte zu einer Fusion, in der das hok-Gen vom lambda-PR-Promotor und der cro-Shine-Dalgarno-Sequenz exprimiert wurde. Die erhöhte Wirtszellenabtötung ist daher auf eine effizientere Translation durch die cro-Shine-Dalgarno-Sequenz im Vergleich zur natürlichen ribosomalen Bindungsstelle des hoks zurückzuführen.
Fig. 17 zeigt einen erhöhten abtötenden Effekt, der durch cro'-hok-Fusion exprimiert wird. Die Abtötungskinetik (Lebensfähigkeitszählungen) und Wachstum (OD&sub4;&sub5;&sub0;) wird nach einer Temperaturerhöhung auf 42ºC des E. coli-Stammes MC1000 gezeigt, der entweder pKG341 oder pKG345 enthielt. Der Anstieg von OD&sub4;&sub5;&sub0;hört auf, und die Lebensfähigkeitszählungen nehmen rasch in beiden Kulturen ab, jedoch ist der wirtszellen-tötende Effekt der cro-hok-Fusion deutlicher ausgeprägt als im Vergleich mit dem hok allein (Halbwertszeit für pKH345 1 Minute).

BEISPIEL 15

Biologische Einschließung eines Plasmids, das das trp-hok-Einschließungssystem trägt

Plasmid-Transfer in natürlichen Umgebungen ist ein äußerst unbestimmter Risikofaktor im Zusammenhang mit rekombinanten DNA-Applikationen. Plasmide wären daher sicherer in der Verwendung, wenn sie Funktionen tragen würden, die nach einem Transfer ein Abtöten der neuen Wirtszellen auslösen würden. Bei einem Versuch, das Potential des hok-Gen-Produkts als abtötenden Faktor für andere Bakterienspezies zu untersuchen, wurde ein Fusionsplasmid von p341-1 und dem Kanamycin-resistenten Derivat des mobilisierbaren Plasmids RSF1010 mit breitem Wirtsspektrum, pBOE93, konstruiert. Dieses Hybrid (EcoRI-EcoRI-Fusion) wurde in E. coli S. 17.1 transformiert, welches ein konjugatives Plasmid RP1-Derivat eingefügt in das Chromosom enthält. In einer Reihe von Mobilisierungsexperimenten wurde p341-1-RSF1010 von S. 17.1 auf E. coli 1005, Serratia marcescens und Pseudomonas putida übertragen. Transfer von pBOE93 und pBEO93, fusioniert mit pBR322, wurden als Kontrollen durchgeführt.
Die in Tabelle 2 angegebenen Ergebnisse zeigten, daß alle Plasmide mit gleicher Häufigkeit von S 17.1 auf 1005 übertragen wurden (es wurde gezeigt, daß die 1005 (p341-1-RSF1010) Transkonjuganten in Abwesenheit von Tryptophan abgetötet wurden).
Die Vektor-Plasmide wurden nach S. marcescens und P. putida mit hoher Häufigkeit transferiert, wogegen P341-1-RSFI010 mit einer um 10&sup4;-fach geringeren Frequenz auf diese beiden Bakterien transferiert wurde, auch wenn Tryptophan jederzeit anwesend war. Daher ist das hok-Gen-Produkt tödlich, auch für sehr entfernt verwandte P. putida-Spezies, und in beiden Organismen fehlt das E. coli-Regulationssystem für den trp-Promotor, obwohl S. marcescens sehr nahe mit E. coli verwandt ist. Dies erhöht die Wahrscheinlichkeit, daß eine große Vielzahl von Bakterien in der natürlichen Umgebung, welche eine Möglichkeit zur Aufnahme von E. coli-Plasmiden haben, unabhängig von den äußeren Konzentrationen von Tryptophan abgetötet werden, wenn das trp-hok-Fusionsprodukt anwesend ist. Tabelle 1 Transfer von p341-trp-RSF1010 Spender Empfänger Selektion Transferhäufigkeit (Kontrolle) S. marcescens P. putida

BEISPIEL 16

Konstruktion eines biologischen Einschließungssystems für gram-positive Bakterien: Identifikation von hok als geeignete abtötende Funktion

In den vorhergehenden Beispielen wurde die Verwendung von R1-hok wie auch homologe Gene zur Konstruktion eines Einschließungssystems für einen weiten Bereich gram-negativer Bakterien beschrieben. Jedoch die verbreitete Verwendung von gram-positiven Bakterien bei der Fermentation und die Hinweise, daß gram-positive Bakterien eine potentielle Verwendung bei Produktionen mit einer willkürlichen Freisetzung darstellen, erfordern die Entwicklung eines biologischen Einschließungssystems für gram-positive Bakterien. Eine Voraussetzung zur Konstruktion eines Einschließungssystems ähnlich zu dem für gram-negative Bakterien beschriebenen System ist, daß eine zelltötende Funktion, welche die gram-positiven Bakterien beeinflußt, identifiziert werden kann. Da das R1-hok-Protein in einem weiten Bereich von gram-negativen Bakterien toxisch ist, wurden mögliche toxischen Effekte des hok-Proteins in gram-positiven Bakterien untersucht.
Vorangehende Experimente zeigten, daß der native Promotor und die ribosomale Bindungsstelle vom R1-hok-Gen nicht die Expression von hok in B. subtilis fördert.
Um eine Expression von hok in B. subtilis zu erhalten, wurde die für hok kodierende Sequenz in einen Expressionsvektor eingefügt, der einen Promotor wie auch eine ribosomale Bindungsstelle enthielt, von der man wußte, daß sie in B. subtilis funktional waren. Das Plasmid pSI-1 ist eine Modifikation von pAIQ25 (Yanzura und Henner, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, Januar 1984, Seiten 439-443), in denen der Ppac-I-Promotor und das Penicillasegen durch einen spac-I-Promotor ersetzt wurden, an den sich eine synthetische ribosomale Bindungsstelle (AAGGAGGTGATC) und ein Polylinker anschlossen. Ein in den Polylinker von pSI-1 eingefügtes Gen wird exprimiert, falls IPTG dem Wachstumsmedium zugefügt wird, aufgrund des Vorliegens des lac-Operators und des lacI-Gens auf dem Plasmid (Yanzura und Henner, op. cit.). Vor Klonierung von R1-hok in den pSI-1-Vektor wurde das hok-Gen wie folgt modifiziert. Ein doppelsträngiges Oligonukleotid, das der N-terminalen hok-kodierenden Region entspricht, und welches überhängende Enden entsprechend den XhaI (5')- und SauIIIA (3')- Schnitten hat, wurde mittels eines Cyclone® -DNA-Synthesizers (erhältlich von Biosearch Inc., New Brunswick, USA) unter Verwendung des beta-LINK-Cyanoethylphopshoramidit-Syntheseverfahrens synthetisiert. Das Oligonukleotid unterschied sich von den R1-hok-Sequenzen in drei Positionen, ein Effekt aufgrund der Bildung einer HindIII-Erkennungsstelle.
Ein Ligatisierungsansatz aus dem Oligonukleotid, einem 250 bp-SauIIIA-PstI-Fragment, entsprechend dem C-terminalen Anteil der Hok-kodierenden Sequenz (abgeleitet von einer pUC9-Rekombinante, aus der das hok-Gen mit verschiedenen Restriktionsenzymen ausgeschnitten werden kann) und pUC18, verdaut mit XbaI und PstI, wurde verwendet, um E. coli DH5a (erhältlich von Bethesda Research Laboratories, USA) zu transformieren, wobei auf LB-Platten, die 50 ug/ml Ampicillin, 0,004% X-Gal und 1 mM IPTG enthielten, zu selektionieren. Aus einer dieser weißen Kolonien wurde das Plasmid pLK24 isoliert. Dieses Plasmid hat die erwartete physikalische Struktur, wie durch Restriktionsenzym-Analyse bestimmt. Die von dem synthetischen Oligonukleotid abgeleitete Region von pLK24 wurde sequenziert, um die Wiederherstellung der kodierenden Region des hok-Gens nachzuweisen.
Um das modifizierte hok-Gen in pSI-1 einzufügen, wurde das 300 bp-hok-tragende Xbal-PstI-Fragment aus pLK24 isoliert und in XbaI und PstI verdautem pSI-1 ligatisiert, und der Legatisierungsansatz wurde zur Transformation kompetenter B. subtilis BD170-Zellen nach dem von Sadaie und Kada beschriebenen Verfahren, J. Bact. 153, Februar 1983, Seiten 813-821, verwendet, mit anschließender Selektion auf LB-Platten, die Chloramphenicol (5 ug/ml) enthielten. Da dieses Konstrukt das ATG-Startkodon des hok in einer Entfernung von 11 bp von der synthetischen ribosomalen Bindungsstelle von pSI-1 positioniert, wurden die Chloramphenicol-resistenten Kolonien ferner auf Wachstumsinhibierung analysiert, den erwarteten Phenotypus, falls hok in B. subtilis aktiv ist, durch Plattieren der Transformanten auf 1 mM IPTG-haltigen LB-Platten. Wachstumsinhibierung wurde bei ca. der Hälfte der getesteten Transformanten beobachtet. Eine solche Transformante, BD170(pLK26), wurde weiter analysiert.
Die aus BD170(pLK26) isolierte Plasmid-DNA zeigte die erwartete physikalische Struktur (Fig. 18) und erschien daher als strukturell stabil.
Um die Toxizität des R1-hok-Gen-Produkts in B. subtilis zu testen, wurden BD170(pLK26) und BD170(pSI-1) in LB-Medium bis zur frühen exponentiellen Phase (OD&sub6;&sub0;&sub0;) gezüchtet, zu diesem Zeitpunkt wurde IPTG bis zu 2 mM zugegeben. Dieses induziert den spac-I-Promotor von pSI-1. Die OD&sub6;&sub0;&sub0;und die lebensfähigen Zellen pro 100 ml wurden während des Experiments bestimmt. Wie man aus Fig. 19 sehen kann, waren die Wachstumsgeschwindigkeiten für die beiden Kulturen vor der Zugabe von IPTG identisch, d. h. die bloße Anwesenheit des hok-Gens innerhalb von B. subtilis beeinflußt das Zellwachstum nicht. Nach Zugabe von IPTG verdoppelte sich die OD&sub6;&sub0;&sub0;der BD170(pLK26)-Kultur während der ersten Stunde der IPTB-Behandlung nach einer Zeit ohne Anstieg der UD&sub6;&sub0;&sub0;. Dies entspricht dem für den hok-Effekt in E. coli beobachteten Muster. Lebensfähigkeitszählungen nahmen unmittelbar nach Zugabe von IPTG zur BD170(pLK26)-Kultur (Fig. 20) ab, der überlebende Anteil war 0,25. Kein Effekt der IPTG-Zugabe konnte in der Kontrollkultur gesehen werden. Phasenkontrast-Mikroskopie von BD170(plK26), eine Stunde nach Zugabe von IPTG, zeigte das Auftreten von ca. 5% Geisterzellen.
Zellen, die 1,5 Stunden nach IPTG-Induktion der hok-Expression überlebten, wurden auf ihre Empfindlichkeit gegenüber Reinduktion mit IPTG getestet. Alle 25 Kolonien aus über lebenden Zellen zeigten eine Wachstumsinhibierung auf 1 mM IPTG-haltigen LB-Platten.
Man kann aus diesen Ergebnissen schließen, daß das hok-Gen-Produkt für gram-positive Bakterien toxisch ist und es daher zur Entwicklung von biologischen Einschließungssystemen entsprechend den in der vorliegenden Beschreibung angegebenen Prinzipien eingesetzt werden kann. Die Erkenntnis, daß der überlebende Anteil 0,25 bildet, entkräftet diese Aussage nicht, da das Überleben seine Grundlage hauptsächlich auf einer ungenügenden Expression des hok-Gens zu beruhen scheint, ein Merkmal, welches z. B. unter Verwendung eines stärkeren Promotors oder nach Standard-Verfahren modifiziert werden kann.

BEISPIEL 17

Ein stochastischer Abtötungseffekt, erhalten durch Kombination der fim- und hok-Systeme

Ein stochastischer Abtötungseffekt in E. coli K-12 wurde durch ein rekombinantes Plasmid erhalten, welches das hok-Gen in Verbindung mit einem Teil des fim-Gen-Klusters trug, welche die periodische Expression vom Typ-1-fimbriae in E. coli spezifiziert.
Das Plasmid pPKL8 (Fig. 21) trägt das 300 bp-invertierbare DNA-Fragment, welches den Promotor für das fimA-Gen enthält.
Das Plasmid enthält ferner zwei regulatorische Gene fimB und fimE, die ("an-" und "aus-"Gene, s. Klemm et al, Mol. Gen. Genet. 199, 1985, Seiten 410-414; Klemm, Embo J. 5, 1986, Seiten 1389-1393). Das Plasmid pPR341 (Fig. 22) wurde zuvor beschrieben (Gerdes et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 1986, Seiten 3116-3120).
pPKL8 wurde mit BgIII und BcII geschnitten. Das 3,3 kb-BglII-BclI-Fragment, welches die fimB- und fimE-Gene und die invertierbare Promotorregion enthielt, wurde in die BamHI-Schnittstelle von pPR341 eingefügt, was zum Plasmid pPKL100 führte (Fig. 23), welches in den E. coli K-12-Stamm MC1000 transformiert wurde. E. coli K-12-Zellen, die dieses Konstrukt enthielten, wuchsen in LB-Medium normal. Jedoch zeigten die Kulturen dieser Zellen das Vorliegen von 1 bis 2% an Geisterzellen, von denen viele anormal lang (Fig. 24a und b) waren. Dies weist auf eine periodische Transkription des hok-Gens hin, welches zu einer Abtötung des Wirts führt.
Um die Orientierung des invertierbaren Promotorsegments zu bestimmen, wurde Plasmid pPKL100 mit den Restriktionsenzymen SnaBI und SacII verdaut. Das invertierbare Promotorsegment enthält eine einzelne Schnittstelle für SnaBI, und durch Studium der Größen der erhaltenen Fragmente wurde die Konfiguration des Promotor-haltigen Segments bestimmt: Ein 650 bp-SacII-SnaBI-Fragment wird aus der "An"-Konfiguration und ein 350 bp-Fragment weist auf die "Aus"-Konfiguration hin (s. Fig. 23). Bei Fehlen eines Selektionsdrucks erwartet man eine 50/50 Verteilung von Plasmiden, die das Segment in der "Aus"- und der "An"-Konfiguration enthalten, wie durch pPKL8 exemplifiziert (Bahn B in Fig. 25). Dieses selbe Muster wurde jedoch nicht gesehen, wenn das Plasmid pPKL100, wo nur die "Aus"-Konfiguration sichtbar war (Bahn A in Fig. 25). Dies weist daraufhin, daß Zellen, die das Plasmid pPKL100 enthalten, in denen der inversionale Switch in der "An"-Konfiguration vorliegt, nicht lebensfähig sind.

BEISPIEL 18

Biologische Einschließung, basierend auf einer Konkurrenz zwischen Zellen mit und ohne fimA-hok-Einschließungssystem

Um weiter zu ermitteln, ob das invertierbare DNA-Fragment im Plasmid pPKL100 (s. Beispiel 17) in trans durch die Gendosis von fimB und fimE beeinflußt werden konnte, wurden die folgenden Konstrukte hergestellt, um dieses Plasmid in trans zu vervollständigen. Da Plasmid pPKL100 auf dem pBR322-Replikon aufbaute, wurden 3 Plasmide, die auf dem kompatiblen Vektor pACYC184 basierten, konstruiert, wobei pLP5 die fimbB- und fimE-Gene trug, pLP4 enthielt nur das fimB-Gen und pLP6 enthielt nur das fimE-Gen.
Plasmid pLP4 wurde durch Einfügen eines 2300 bp-BglII-StuI-Fragments aus pPKL10 (Klemm, 1986, op. cit) in das BamHI und EcoRV verdaute Plasmid pACYC184 (s. Fig. 26) konstruiert. Das Plasmid pLP5 wurde durch Einfügen eines 2650 bp-BglII-SnabI-Fragments in das BamHI und EcoRV verdaute Plasmid pACYC184 kontruiert. Plasmid pLP6 war ein HincII-Deletionsderivat von pLP5 (s. Fig. 26).
Die Plasmide pLP4, pLP5 und pLP6 wurden in E. coli MC1000 Wirtszellen, die bereits pPKL100 enthielten, transformiert, die in einem 0,2%igen Glycerol-A+B-Medium, das mit 10 ug/ml Prolin, Threonin, Isoleucin und Leucin, 20 ug/ml Chloramphenicol und 100 ug/ml Ampicillin ergänzt war, gezüchtet. Die Wachstumsgeschwindigkeit, gemessen durch Anstieg der optischen Dichte für die drei Kombinationen, war wie in Tabelle 3 gezeigt. Das Kopienanzahlverhältnis von pBR322 zu pACYC184 ist grob 4 : 1, und folglich haben Wirtszellen, die die Plasmidkombination pLP4 + pPKL100 enthalten, einen entsprechend 25%igen Anstieg in der Gendosis von fimE, welches eine "Aus"- zu "An"-Konfiguration des invertierbaren DNA-Fragments, das den fimA-Promotor in pPKL100 enthält, vermittelt, im Vergleich zu Zellen, die nur pPKL100 enthalten. Andererseits zeigen Zellen, die die Plasmidkombination pLP6 + pPKL100 enthalten, einen ungefähr 25%igen Anstieg in der Menge des fimE-Gens (welches eine "An"- nach "Aus"-Konfiguration des invertierbaren DNA-Fragments vermittelt).
Ein klarer Hinweis auf eine häufige Aktivierung des fimA-Promotors und darauffolgende Abtötung des Wirts im Falle der pPL4 + pPKL100-Kombination trat nach einer Zeit für eine Generation von 140 Minuten für den entsprechenden Wirt, im Vergleich zu 110 Minuten für Wirte, die die pLP6 + pPKL100-Kombination (Tabelle 3) enthielten, auf. Ferner zeigten die ersteren das Vorliegen von ca. 12% Geisterzellen, während die letzteren praktisch keine hatten, wenn die Zellen mikroskopisch untersucht wurden.

Tabelle 3

Plasmide Generationszeit (Populationsverdopplungszeit)
pPKL100 + pLP4 140 Min.
pPKL100 + pLP5 120 Min.
pPKL100 + pLP6 110 Min.

Hinterlegung der Mikroorganismen

Gemäß den Vorschriften des Budapester Vertrages über die internationale Anerkennung von Mikroorganismen für den Zweck von Patentverfahren wurden Proben der folgenden Mikroorganismen am 25. März 1987 bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen, Grisebachstrasse 8, 3400 Göttingen, Bundesrepublik Deutschland hinterlegt:
Stamm Hinterlegungsnummer
B. subtiiis BD170 (pLK26) DSM 4037
E. coli HB101 (pNL7) DSM 4034
E. coli K-12 MC1000 (pKG345) DSM 4036
E. coli K-12 MC1000 (pPKL100) DSM 4035
E. coli K-12 MC1000 (pPKL100 + pLP4) DSM 4031
E. coli K.12 MC1000 (pPKL100 + pLP5) DSM 4032
E. coli K-12 MC1000 (pPKL100 + pLP6) DSM 4033

Claims

1. Verfahren zur Einschließung eines biologischen Systems, das Bakterienzellen enthält, wobei die Einschließung die Schritte umfaßt:

(a) Begrenzen von Bakterienzellen auf eine bestimmte Umgebung, oder

(b) Begrenzen rekombinanter DNA-Moleküle oder Viren auf spezifische bakterielle Wirtszellen, oder

(c) zeitliches und räumliches Begrenzen von in die Umgebung freigesetzten rekombinanten Bakterienzellen, wobei das Verfahren das Einschleusen eines konditionierten lethalen Gens in die Bakterienzellen, in die rekombinanten DNA-Moleküle oder in die Viren, umfaßt, das ein bakterienzelltötendes Genprodukt kodiert, welches regulierbar exprimiert wird, wobei die Regulation angepaßt ist, das zelltötende Produkt zu exprimieren,

(i) unter Umgebungsbedingungen, die verschieden von den Bedingungen in der bestimmten Umgebung sind, auf die die rekombinanten Bakterienzellen begrenzt sind, wobei bei Verwendung eines Plasmids Plasmide, wie definiert, ausgenommen sind, bei denen die Expression des lethalen Gens im Falle des hok-Gens aus der parB-Region des Plasmids R1 oder des relB-orf3-Gens aus E. coli durch einen lambda-PR-Promotor unter der Kontrolle des lambda-cI857-Repressors steht, und bei dem Plasmid pSI-1, mit einem eingefügten hok-Gen, das durch den SP01-Promotor unter der Kontrolle des lac-Operators dieses Plasmids reguliert wird, oder

(ii) wenn die rekombinanten DNA-Moleküle oder Viren in andere sekundäre bakterielle Wirtszellen als die spezifischen primären bakteriellen Wirtszellen, auf die die DNA-Moleküle oder Viren begrenzt sind, eindringen, oder

(iii) stochastisch in einer solchen Weise, daß die in die Umgebung freigesetzten rekombinanten Bakterienzellen mit einer vorbestimmten Geschwindigkeit als Ergebnis eines zufällig auftretenden expressionsauslösenden Vorgangs eliminiert werden, wobei der Vorgang durch periodische Inversionen der Region, die einen Promotor, welcher die Expression reguliert, trägt, oder durch rekombinantes Herausschneiden einer Sequenz, die ein negatives regulatorisches Element trägt, ausgelöst wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die Bakterienzellen auf eine bestimmte Umgebung durch Einführen in die Zellen eines lethalen Gens, das ein bakterienzelltötendes Genprodukt kodiert, begrenzt werden, wobei die Expression davon durch die Umgebungsbedingungen für diese Zellen oder den physiologischen Zustand der Zellen bestimmt ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem ein rekombinantes DNA-Molekül oder Virus auf eine primäre Wirtszelle durch Einfügen eines lethalen Gens, von dem ein bakterielles zelltötendes Genprodukt regulierbar transkribiert wird, in das DNA-Molekül oder den Virus begrenzt wird, wobei die Transkription durch einen oder mehrere Faktoren reguliert wird, wobei mindestens einer davon durch ein Gen, welches ausschließlich im Genom der primären Wirtszelle vorhanden ist, kodiert wird, oder durch Einfügen eines lethalen Gens, das ein bakterienzelltötendes Genprodukt kodiert, von dem konstitutiv eine mRNA exprimiert wird, die das zelltötende Genprodukt kodiert, in das rekombinante DNA-Molekül oder das Virus, wobei die Translation davon durch eine Antisense-RNA, transkribiert von einer Nukleotidsequenz, die in die primäre Wirtszelle eingefügt ist, inhibiert wird, und die Nukleotidsequenz für die Antisense-RNA konstitutiv expremiert wird oder durch einen Promotor, der von einem oder mehreren Faktoren reguliert wird, exprimiert wird.

4. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem ein rekombinantes DNA-Molekül oder Virus auf eine primäre bakterielle Wirtszelle, bakterielle Wirtszellen derselben Spezies und einen definierbaren Bereich von sekundären bakteriellen Wirtszellen durch Einfügen eines lethalen Gens, von dem ein bakterienzelltötendes Genprodukt regulierbar transkribiert wird, in das rekombinante DNA-Molekül oder das Virus, wobei die Transkription durch einen oder mehrere Faktoren reguliert wird, von denen mindestens einer durch das Gen, was im Genom der primären bakteriellen Wirtszelle, den bakteriellen Zellen aus derselben Spezies und einem definierbaren Bereich von sekundären bakteriellen Wirtszellen vorkommt, reguliert wird, oder durch Einfügen einer Nukleotidsequenz, enthaltend ein lethales Gen, das ein bakterienzelltötendes Genprodukt kodiert, von dem das Gen eine mRNA, die ein zelltötendes Genprodukt kodiert, konstitutiv exprimiert wird, in das rekombinante DNA-Molekül oder das Virus, wobei die Translation der mRNA durch eine Antisense-RNA, die von einer Nukleotidsequenz, welche eine Antisense-RNA, die auf einem anderen Replikon als das rekombinante DNA-Molekül oder das Virus kodiert wird, in das rekombinante DNA-Molekül oder das Virus, wobei die für die Antisense-RNA kodierende Nukleotidsequenz konstitutiv exprimiert wird, oder durch einen Promotor, der durch einen oder mehrere Faktoren in der primären bakteriellen Wirtszelle reguliert wird, exprimiert wird, wobei mindestens einer davon durch ein Gen kodiert wird, welches im Genom der primären bakteriellen Wirtszelle, den bakteriellen Zellen der gleichen Spezies und einem definierbaren Bereich von sekundären bakteriellen Wirtszellen vorliegt.

5. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem in die Umgebung freigesetzte Bakterienzellen, die ein rekombinantes DNA-Molekül oder ein Virus enthalten, zeitlich und räumlich begrenzt werden durch Einfügen eines lethalen Gens, das ein bakterienzelltötendes Genprodukt kodiert, in das rekombinante DNA-Molekül oder das Virus, wobei die Expression des zelltötendes Genprodukts stochastisch reguliert ist, d. h. ein stochastischer Vorgang, ausgelöst durch einen Inversions-Switch eines Promotors, wie des E. coli fimA-Promotors, oder von dem Gen, bei dem die Expression des zelltötenden Genprodukts ein zyklischer Vorgang ist.

6. Rekombinantes Plasmid zur Verwendung in einem Verfahren zur Einschließung eines biologischen Systems, das Bakterienzellen enthält wie in Anspruch 1 definiert, wobei das Plasmid ein lethales Gen enthält, das ein bakterienzelltötendes Genprodukt kodiert, das regulierbar exprimiert wird, wobei die Regulation angepaßt ist, um das zelltötende Genprodukt in den rekombinanten Bakterienzellen zu exprimieren

(a) unter Umgebungsbedingungen, die verschieden von den Bedingungen in der bestimmten Umgebung sind, auf die die rekombinanten Bakterienzellen begrenzt sind, oder

(b) wenn das rekombinante Plasmid in andere sekundäre bakterielle Wirtszellen als die spezifischen primären bakteriellen Wirtszellen, auf die das rekombinante Plasmid begrenzt sind, eindringt, oder

(c) stochastisch in einer solchen Weise, daß die in die Umgebung freigesetzten rekombinanten Bakterienzellen mit einer vorbestimmten Geschwindigkeit als Ergebnis eines zufällig auftretenden expressionsauslösenden Vorgangs eliminiert werden, wobei der Vorgang durch periodische Inversionen der Region, die einen Promotor, welcher die Expression reguliert, trägt, oder durch rekombinantes Herausschneiden einer Sequenz, die ein negatives regulatorisches Element trägt, ausgelöst wird, wobei bei Verwendung eines Plasmids Plasmide, wie unter a) definiert, ausgenommen sind, bei denen die Expression des lethalen Gens im Falle des hok-Gens aus der parB-Region des Plasmids R1 oder des relB-orf3-Gens aus E. coli durch einen lambda-PR-Promotor unter der Kontrolle des lambda-cI857-Repressors steht, und bei dem Plasmid pSI-1, mit einem eingefügten hok-Gen, das durch den SP01-Promotor unter der Kontrolle des lac-Operators dieses Plasmids reguliert wird.

7. Plasmid nach Anspruch 6, bei dem die Expression des bakterienzelltötenden Genprodukts auf der Transkriptionsebene reguliert wird.

8. Plasmid nach Anspruch 7, bei dem die Expression des lethalen Gens, das das bakterienzelltötende Genprodukt kodiert, durch die Umgebungsbedingungen der Wirtszellen bestimmt ist, so durch die physikalischen Bedingungen in der Umgebung, einschließlich der in der Umgebung vorherrschenden Temperatur, oder durch die Gegenwart oder Abwesenheit einer bestimmten chemischen Verbindung in der Umgebung, z. B. einer chemischen Substanz ausgewählt aus Kohlenstoff- oder Stickstoffquellen, Metaboliten, Aminosäuren, vorzugsweise Tryptophan, Nukleosiden, Purin- oder Pyrimidinbasen oder Metallionen; durch den physiologischen Zustand der Zellen oder durch ein zyklisches oder stochastisches Vorkommnis, d. h. ein stochastisches Vorkommnis, das durch einen periodischen Inversions-Switch eines Promotors, wie z. B. des E. coli fimA-Promotors, ausgelöst wird.

9. Plasmid nach Anspruch 6, bei dem die Expression des lethalen Gens, das für ein bakterienzelltötendes Genprodukt kodiert, auf der Translationsebene reguliert wird.

10. Plasmid nach Anspruch 9, bei dem die Translation der mRNA, die die zelltötende Funktion spezifiziert, durch eine Antisense-RNA inhibiert ist.

11. Plasmid nach einem der Ansprüche 6 bis 10, bei dem das lethale Gen, das das zelltötende Genprodukt kodiert, von einem bakteriellen Plasmid, einem bakteriellen Chromosom, einem prokaryontischen Virus, einem eukaryontischen Plasmid, einem eukaryontischen Virus, einem eukaryontischen Chromosom, eukaryontischen Mitochondrien oder eukaryontischen Chloroplasten abgeleitet ist, wobei das Gen z. B. das hok-Gen aus der parB-Region des Plasmid R1 oder eine DNA-Sequenz ist, die homolog zum R1 hok-Gen ist.

12. Plasmid nach einem der Ansprüche 6 bis 11, bei dem die Nukleotidsequenz, welche die Transkription des Gens, das das zelltötende Genprodukt kodiert, reguliert, von einem bakteriellen Plasmid, einem bakteriellen Chromosom, einem prokaryontischen Virus, einem eukaryontischen Plasmid, einem eukaryontischen Virus, einem eukaryontischen Chromosom, eukaryontischen Mitochondrien oder eukaryontischen Chloroplasten abgeleitet ist.

13. Plasmid nach einem der Ansprüche 6 bis 12, das zusätzlich eine DNA-Sequenz enthält, die natürlicherweise keinen Bezug zum Replikon hat.

14. Rekombinante Bakterienzelle, die ein Plasmid nach einem der Ansprüche 6 bis 13 enthält.

15. Bakterienzelle nach Anspruch 14, die ein Plasmid nach Anspruch 9 oder 10 und ferner eine Nukleotidsequenz enthält, die für eine Antisense-RNA kodiert, die auf demselben oder einem anderen Replikon in der Zelle vorkommt, wobei die die Antisense-RNA kodierende Nukleotidsequenz konstitutiv exprimiert wird oder von einem durch einen oder mehrere Faktoren regulierten Promotor exprimiert wird.

16. Bakterienzelle nach Anspruch 15, bei der die Expression der Nukleotidsequenz, die für die Antisense-RNA kodiert, durch die Umgebungsbedingungen der Wirtszellen bestimmt ist, z. B. durch die physikalischen Bedingungen in der Umgebung, einschließlich der in der Umgebung vorherrschenden Temperatur oder der Abwesenheit oder Anwesenheit einer bestimmten chemischen Substanz in der Umgebung, z. B. einer Substanz ausgewählt von Kohlenstoff- oder Stickstoffquellen, Metaboliten, Aminosäuren, Nukleosiden, Pur in- oder Pyrimidinbasen oder Metallionen; durch den physiologischen Zustand der Zellen, oder ein stochastisches Vorkommnis, z. B. ein stochastisches Vorkommnis, das durch einen periodischen Inversions-Switch eines Promotors ausgelöst wird, wie z. B. des E. coli fimA-Promotors, oder durch rekombinantes Heraus schneiden der Antisense-RNA.

17. Bakterienzelle nach Anspruch 16, bei der die Nukleotidsequenz, die für die Antisense-RNA kodiert, vom lac-Promotor transkribiert wird.

18. Bakterienzelle nach einem der Ansprüche 14 bis 16, bei der die Nukleotidsequenz, die die Antisense-RNA kodiert, von einem Bakterienplasmid, einem Bakterienchromosom, einem prokaryontischen Virus, einem eukaryontischen Plasmid, einem eukaryontischen Virus, einem eukaryontischen Chromosom, eukaryontischen Mitochondrien oder eukaryontischen Chloroplasten abgeleitet ist.

19. Bakterienzelle nach einem der Ansprüche 14 bis 16, bei der die Nukleotidsequenz, die die Transkription der Antisense-RNA reguliert, von einem Bakterienplasmid, einem Bakterienchromosom, einem prokaryontischen Virus, einem eukaryontischen Plasmid, einem eukaryontischen Virus, einem eukaryontischen Chromosom, eukaryontischen Mitochondrien oder eukaryontischen Chloroplasten abgeleitet ist.

20. Population rekombinanter Bakterienzellen wie in Anspruch 14 definiert zur Verwendung als Impfstoff, wobei die rekombinanten Bakterien auf eine tierische oder menschliche Körperumgebung, in der sie freigesetzt werden, eingrenzbar sind, wobei die Bakterienzellen ein lethales Gen tragen, das ein bakterienzelltötendes Genprodukt kodiert, wobei seine Expression stochastisch in einer solchen Weise reguliert wird, daß die in die Umgebung freigesetzten rekombinanten Bakterienzellen in einem bestimmten Maße als Ergebnis der Expression eines zufällig ausgelösten Aktivierungsvorgangs eliminiert werden, wobei der Vorgang durch periodische Inversionen einer Region ausgelöst wird, die einen die Expression regulierenden Promotor trägt, oder durch Herausschneiden eines Sequenz, die eine negativ regulatorisches Element trägt, wobei die Bakterienzellen zusätzlich eine Nukleotidsequenz enthalten, die ein Epitop für eine Immunisierung kodiert, das von einem pathogenen Mittel stammt, und Mittel zum Transport des Epitops bei Expression zur äußeren Oberfläche der Wirtszelle, wobei die Geschwindigkeit der Eliminierung der Bakterienzellen aus dem tierischen oder menschlichen Körper so eingestellt ist, um eine Immunisierung gegen den pathogenen Wirkstoff, von dem das Epitop stammt, zur Verfügung zu stellen.

21. Zellpopulation nach Anspruch 20, bei der die rekombinanten Bakterienzellen mit genetischer Information für die Expression von Adhesins bereitgestellt werden, wobei die Bakterienzellen vorzugsweise ausgewählt sind aus Enterobacteriaceae, Milchsäurebakterien, Vibrionaceae und Pseudomonaden.

22. Zellpopulation nach Anspruch 21, bei der die Nukleotidsequenz, die das Epitop kodiert, in das Gen, welches für ein natürlich auftretendes Zelloberflächenprotein, z. B. ein Fimbrillin, eingefügt wird, um ein Fusionsprotein zu exprimieren, das an die Zelloberfläche transportiert wird.

23. Zellpopulation nach Anspruch 20, bei der das stochastische Vorkommnis, welches die Expression des zelltötenden Genprodukts bestimmt, ausgelöst wird durch einen periodischen Inversions-Switch eines Promotors, z. B. des E. coli fimA-Promotors, unter Transkription in die Nukleotidsequenz, die das Gen enthält, welches das bakterienzelltötende Genprodukt kodiert, oder durch periodischen inversions-Switch eines Promotors, z. B. des E. coli fimA-Promotors, unter Transkription einer Nukleotidsequenz, die eine Antisense-Sequenz kodiert, welche die Translation des das zelltötende Genprodukt spezifizierende mRNA inhibiert, oder durch rekombinantes Herausschneiden dieser Antisense-RNA.

24. Zellpopulation nach Anspruch 23, bei der die Häufigkeit des Inversions-Switches so ausgewählt ist, so daß sie die Aufrechterhaltung eines ausreichenden Dosis-Spiegels des Epitops für den Zeitraum, der erforderlich ist, um eine Immunisierung bei dem Tier oder dem Menschen, an welches das Vaccin verabreicht wird, d. h. einen Zeitraum im Bereich von 15 bis 30 Tagen, bewirkt.

25. Zellpopulation nach Anspruch 20, bei der das pathogene Agens, aus welchem das Epitop stammt, ausgewählt ist aus einem Virus, Bakterium oder eukaryontischem Organismus, wie einem Pilz oder einer Protozoe.

26. Zellpopulation nach Anspruch 22, bei der die rekombinante Bakterienzelle zwei oder mehr Nukleotidsequenzen trägt, die für Epitope von unterschiedlichen pathogenen Agenzien kodieren, wobei jedes der Epitope als Fusionsprotein exprimiert wird.

27. Zellpopulation nach Anspruch 20, bei der die rekombinante Bakterienzelle einen zusätzlichen Promotor trägt, der bei Aktivierung in eine Nukleotidsequenz transkribiert, die ein lethales Gen enthält, welches ein bakterienzelltötendes Genprodukt kodiert, wobei die das bakterienzelltötende Genprodukt kodierende Nukleotidsequenz dieselbe ist wie diejenige, deren Expression durch ein stochastisches Vorkommnis bestimmt ist, oder verschieden davon.