DE69535705T2

DE69535705T2 - Funktionelles aufspüren und/oder expressionsvektoren bei mycobakterien

Info

Publication number: DE69535705T2
Application number: DE69535705T
Authority: DE
Inventors: Brigitte Gicquel; Eng Mong Lim; Denis Portnoi; Francois-Xavier Berthet; Juliano Timm
Original assignee: Institut Pasteur de Lille
Current assignee: Institut Pasteur de Lille
Priority date: 1994-09-02
Filing date: 1995-08-30
Publication date: 2009-04-16
Anticipated expiration: 2015-08-31
Also published as: EP1396546A3; US6565855B1; ES2301162T3; JPH10504966A; US6248581B1; EP0770138B1; EP0770138A2; US20060127959A1; FR2724183A1; DK0770138T3; CA2197717A1; PT770138E; EP1396546A2; FR2724183B1; CA2197717C; WO1996007745A3; ATE386125T1; US7601350B2; DE69535705D1; WO1996007745A2

Description

Die Gattung Mycobacterium umfasst gefährliche, sich auf den Menschen auswirkende Krankheitserreger wie M. leprae und M. tuberculosis, die für Lepra und Tuberkulose verantwortlichen Erreger, die immer noch schwerwiegende öffentliche Gesundheitsprobleme auf der ganzen Welt sind.
M. bovis und M. tuberculosis, die ursächlichen Erreger von Tuberkulose, sind fakultative intrazelluläre Bakterien. Trotz der enormen Gesundheitsprobleme, die mit diesen pathogenen Organismen verbunden sind, weiß man wenig über ihre exportierten und/oder sezernierten Proteine. Analysen von Kulturfiltrat von M. tuberculosis in SDS-PAGE weisen mindestens 30 sezernierte Proteine nach (1, 19, 38). Manche von ihnen wurden charakterisiert, ihre Gene kloniert und sequenziert (7, 35, 37). Andere sind noch nicht ganz identifiziert, obwohl es sich um immundominante Antigene von größerer Bedeutung handelt, um einen Immunschutz zu induzieren. Außerdem ist es wahrscheinlich, dass zahlreiche exportierte Proteine an der Zellmembran fixiert bleiben und folglich nicht in den Kulturüberständen vorhanden sind. Es wurde nachgewiesen, dass die auf der Außenfläche verschiedener pathogener Bakterien wie dem 103 kDa Invasin von Yersina pseudotuberculosis (14) oder dem 80 kDa Internalin von Listeria monocytogenes (10) lokalisierten Proteine eine wichtige Rolle bei den Interaktionen mit Wirtszellen und infolgedessen bei der Pathogenität wie bei der Induzierung von Schutzreaktionen spielen. Somit könnte ein an die Membran gebundenes Protein für die Infektion mit M. tuberculosis wie auch für die Induzierung einer Schutzreaktionen gegen diese Infektion von Bedeutung sein. Diese Proteine könnten für die Herstellung von Impfstoffen ein gewisses Interesse auf sich ziehen.
Der BCG (Bacillus Calmette-Guérin), ein von M. bovis abgeleiteter avirulenter Stamm, wurde besonders als Impfstoff gegen Tuberkulose verwendet. Er ist aufgrund seines starken immunogenen Vermögens ebenfalls ein sehr interessanter Vektor für den Aufbau rekombinanter Lebendimpfstoffe. Infolgedessen erweckt das molekularbiologische Studium von Mykobakterien gegenwärtig starkes Interesse.
Die Entwicklung neuer Impfstoffe gegen pathogene Mykobakterien oder die Verbesserung verfügbarer Impfstoffe machte den Einsatz spezifischer Hilfsmittel erforderlich, die es ermöglichen, immunogene Polypeptidsequenzen zu isolieren oder zu gewinnen.
Die Erfinder haben dazu neue Vektoren definiert und hergestellt, welche die Separierung der DNA-Sequenz von Mykobakterien ermöglichen, um unter diesen Sequenzen die Nukleinsäuren zu identifizieren, die für die betreffenden Proteine codieren.
Es wurden Vektoren definiert, um die Wirksamkeit von Regulationssequenzen für die Expression in den Mykobakterien zu bestimmen.
Die Erfindung bezieht sich auch auf neue Polypeptide von Mykobakterien, die mittels der vorstehend genannten Vektoren isoliert werden konnten und in der Herstellung von Zusammensetzungen zum Entdecken einer Infektion durch Mykobakterien oder zum Schutz gegen eine von Mykobakterien herrührende Infektion Eingang finden können.
Die Anmeldung beschreibt einen rekombinanten Screening- und/oder Klonierungs- und/oder Expressionsvektor, der sich dadurch auszeichnet, dass er sich bei Mykobakterien repliziert, und dass er enthält

– 1) ein bei den Mykobakterien funktionales Replikon;
– 2) einen Selektionsmarker;
– 3) eine Reporter-Kassette mit a) einer multiplen Klonierungsstelle (Polylinker), b) einen bei den Mykobakterien aktiven Transkriptionsterminator vor dem Polylinker, und c) eine codierende Nukleotidsequenz, die von einem Gen stammt, das für einen Expressionsmarker und/oder einen Ausschleusungsmarker und/oder einen Proteinsezernierungsmarker codiert, wobei die Nukleotidsequenz frei von ihren Start-Codon und seinen Regulationssequenzen ist.

Der Ausschleusungsmarker und/oder Sezernierungsmarker ist eine Nukleotidsequenz, deren Expression, gefolgt von der Ausschleusung und/oder Sezernierung, von den Regulationselementen abhängt, die seine Expression steuern.
Unter "Expressionsregulationssequenzen oder -elementen" versteht man eine Promotersequenz für die Transkription, eine Sequenz, die die Bindungsstelle mit dem Ribosom (RBS) umfasst, die verantwortlichen Ausschleusungs- und/oder Sezernierungssequenzen, wie etwa die Sequenz, die Signalsequenz genannt wird.
Ein erster interessanter Ausschleusungs- und/oder Expressionsmarker ist eine codierende Sequenz, die vom phoA-Gen stammt. Gegebenenfalls ist sie so verkürzt, dass die alkalische Phosphataseaktivität dennoch wiederhergestellt werden kann, wenn die verkürzte codierende Sequenz der Steuerung eines Promoters und geeigneter Regulationselemente unterliegt.
Andere Expositions- und/oder Ausschleusungs- und/oder Sezernierungsmarker können verwendet werden. Beispielhaft ist eine Sequenz des Gens der β-Agarase oder der Nuklease eines Staphylokokken oder der β-Lactamase einer Mykobakterie zu nennen.
Der Transkriptionsterminator muss bei Mykobakterien funktional sein. Ein in dieser Hinsicht vorteilhafter Terminator ist der Terminator des Coli-Phage T4 (tT4). Andere zur Umsetzung der Erfindung geeignete Terminatoren können unter Nutzung der in den Beispielen dargestellten Verfahren zum Beispiel mittels des Vektors pJN3 isoliert werden.
Ein besonderer beschriebener Vektor ist das Plasmid pJEM11, das in der CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes in Paris, Frankreich) unter der Nummer I-1375 am 3. November 1993 eingereicht wurde.
Für die Selektion oder Identifikation der Nukleinsäuresequenzen von Mykobakterien, die für Produkte codieren, die in die Immunogen- oder Antigenzusammensetzungen zum Erfassen einer Infektion durch Mykobakterien eingebracht werden können, umfasst der beschriebene Vektor an einer seiner Polylinker-Stellen eine Nukleotidsequenz einer Mykobakterie, bei der das Vorhandensein von Regulatorsequenzen untersucht wird, die ganz oder teilweise mit einem Gen von Interesse zusammenhängen, wodurch es möglich wird, wenn der diese Sequenzen tragende Vektor (rekombinanter Vektor) in einen Zellwirt der Art Mykobakterie integriert wird oder sich darin repliziert, die Exposition im Bereich der Membran oder der Zellwand des Wirts und/oder die Ausschleusung und/oder die Sezernierung des Expressionsprodukts dieser oben genannten Nukleotidsequenz zu erreichen.
Die in Frage kommende Mykobakteriensequenz kann jede Sequenz sein, von der man zu erfassen sucht, ob sie Regulationselemente für die Expression enthält, die ganz oder teilweise mit einem Gen von Interesse zusammenhängen, und in der Lage sind, die Exposition im Bereich der Zellmembran eines Wirts, bei dem sie sich exprimieren würde, und/oder die Ausschleusung und/oder die Sezernierung eines Expressionsprodukts einer bestimmten codierenden Sequenz und versuchsweise des Ausschleusungs- und/oder Sezernierungsmarkers zuzulassen oder zu begünstigen.
Vorzugsweise wird diese Sequenz durch enzymatischen Verdau der genomischen DNA oder der komplementären DNA einer RNA einer Mykobakterie, und vorzugsweise einer pathogenen Mykobakterie erhalten.
Nach einer ersten Ausführungsform des beschriebenen Vektors erfolgt der enzymatische Verdau der genomischen DNA oder der komplementären DNA ausgehend von M. tuberculosis.
Vorzugsweise wird diese DNA mit einem Enzym wie sau3A verdaut.
Andere Restriktionsenzyme wie ScaI, ApaI, ScaII, KpnI oder aber auch Exonucleasen oder Polymerasen können natürlich eingesetzt werden, sobald sie die Gewinnung von Fragmenten zulassen, deren Enden in eine der Klonierungsstellen des Polylinkers des Vektors der Erfindung eingefügt werden können.
Gegebenenfalls erfolgen die Verdauungsvorgänge gleichzeitig mit verschiedenen Enzymen.
Die beschriebenen rekombinanten Vektoren sind aus den folgenden rekombinanten Vektoren ausgewählt, die am 8. August 1994 bei der CNCM eingereicht wurden:

pExp53, eingereicht bei der CNCM unter der Nummer I-1464
pExp59, eingereicht bei der CNCM unter der Nummer I-1465
pExp410, eingereicht bei der CNCM unter der Nummer I-1466
pExp421, eingereicht bei der CNCM unter der Nummer I-1467.

Die Vektoren der Erfindung können auch dazu verwendete werden, das Vorhandensein von Sequenzen von Interesse entsprechend dem vorstehend Dargelegten bei Mykobakterien zu bestimmen, wie etwa M. africanum, M. bovis, M. avium oder M. Leprae, deren DNA oder cDNA mit bestimmten Enzymen behandelt wurde.
Die Anmeldung beschreibt auch ein Verfahren zum Screening von Nukleotidsequenzen, die von Mykobakterien stammen, um in diesen Sequenzen das Vorhandensein von Regulationselementen zu bestimmen, die die Expression in einem Zellwirt von diese enthaltenden Nukleinsäuresequenzen und/oder die Exposition an der Oberfläche des Zellwirts und/oder die Ausschleusung und/oder die Sezernierung dieser Polypeptidsequenzen steuern, die sich aus der Expression der vorgenannten Nukleotidsequenzen ergeben, dadurch gekennzeichnet, dass es die folgenden Schritte umfasst:

a) Verdau der DNA-Sequenzen von Mykobakterien mittels mindestens eines bestimmten Enzyms und Wiederverwenden der erhaltenen verdauten Fragmente,
b) Einfügen der verdauten Fragmente in eine Klonierungsstelle, die mit dem Enzym von Schritt a) des Polylinkers eines vorstehenden Vektors kompatibel ist,
c) falls nötig, Amplifikation des im Vektor enthaltenen verdauten Fragments, beispielsweise durch seine Replikation nach Einfügen des so modifizierten Vektors in eine bestimmte Zelle, zum Beispiel E. coli,
d) Transformation von Zellwirten durch den im Schritt c) amplifizierten Vektor, oder in Abwesenheit einer Amplifikation, durch den Vektor von Schritt b),
e) Kultur der transformierten Zellwirte in einem Medium, das den Nachweis des im Vektor enthaltenen Ausschleusungs- und/oder Sezernierungsmarkers zulässt,
f) Erfassung positiver Zellwirte (positiver Kolonien) durch die Expression des Expositions- und/oder Ausschleusungs- und/oder Sezernierungsmarkers,
g) Isolierung der DNA der positiven Kolonien und Einfügen dieser DNA in eine Zelle, die zu der von Schritt c) identisch ist,
h) Selektion der im Vektor enthaltenen Insertionen, wodurch der Erhalt von für den Ausschleusungs- und/oder Sezernierungsmarker positiven Klonen ermöglicht wird,
i) Isolierung und Charakterisierung von DNA-Fragmenten von Mykobakterien, die in diesen Insertionen enthalten sind.

Die Umsetzung dieses Verfahrens ermöglicht den Aufbau von DNA-Banken, die Sequenzen umfassen, die ausgeschleust und/oder sezerniert werden können, wenn sie in rekombinanten Mykobakterien produziert werden.
Der Schritt i) des Verfahrens kann einen Schritt der Sequenzierung der selektionierten Insertionen umfassen.
Vorzugsweise ist der verwendete Vektor das Plasmid pJEM11 (CNCM I-1375) und der Verdau erfolgt mittels des Enzyms sau3A.
Das Screening-Verfahren ist zum Beispiel dadurch gekennzeichnet, dass die Mykobakteriensequenzen von einem pathogenen Mykobakterium, zum Beispiel von M. tuberculosis, M. bovis, M. avium, M. africanum oder M. leprae stammen.
Die Anmeldung beschreibt auch die Nukleotidsequenzen von Mykobakterien, die nach der Ausführung des vorstehend beschriebenen Verfahrens ausgewählt werden.
Ausgewählte Sequenzen sind beispielsweise die DNA-Fragmente von Mykobakterien, die in den Vektoren pIPX412 (CNCMI-1463, eingereicht am 08.08.1994), pExp53, pExp59, pExp410 oder pExp421 enthalten sind.
Wenn die codierende Sequenz, die vom Ausschleusungs- und/oder Sezernierungsmarker stammt, eine vom phoA-Gen stammende Sequenz ist, wird die Ausschleusung und/oder Sezernierung des Produkts des gegebenenfalls verkürzten phoA-Gens nur dann erhalten, wenn diese Sequenz phasengleich mit der Vorläufersequenz eingesetzt wird, welche die von der Mykobakteriensequenz stammenden Elemente enthält, die die Expression und/oder Ausschleusung und/oder Sezernierung steuern.
Die Anmeldung beschreibt auch rekombinante Mykobakterien, die einen zuvor beschriebenen rekombinanten Vektor enthalten. Eine bevorzugte Mykobakterie ist eine Mykobakterie von der Art M. smegmatis.
M. smegmatis ermöglicht es vorteilhafter Weise, die Wirksamkeit von Mykobakteriensequenzen zur Steuerung der Expression und/oder Ausschleusung und/oder Sezernierung einer bestimmten Sequenz zu testen, beispielsweise einer Sequenz, die für einen Marker wie die alkalische Phosphatase codiert.
Eine andere interessante Mykobakterie ist eine Mykobakterie von der Art M. bovis, zum Beispiel der Stamm BCG, der gegenwärtig zur Impfung gegen Tuberkulose genutzt wird.
Die Erfindung beschreibt im Übrigen eine rekombinante Mykobakterie, die sich dadurch auszeichnet, dass sie einen vorstehend definierten rekombinanten Vektor enthält.
Die Erfindung hat eine Nukleotidsequenz zum Gegenstand, die von einem Gen stammt, das für ein aus M. tuberculosis ausgeschleustes Protein codiert, und die sich dadurch auszeichnet, dass sie aus den folgenden Sequenzen ausgewählt ist:

– einer Sequenz IA, die der in 6A dargestellten Nukleotidkette entspricht, oder einer Sequenz IB, die einer in 6B dargestellten Nukleotidkette entspricht, oder einer Sequenz, die für ein aus M. tuberculosis isoliertes Protein codiert und unter erhöhten Härtebedingungen mit einer Sequenz IA oder IB hybridisiert,
– einer Sequenz, welche die Nukleotidketten IA oder IB umfasst, und für ein Protein P28 von M. tuberculosis codiert, das ein theoretisches Molekulargewicht von ca. 28 kDa und ein beobachtetes Molekurgewicht von 36 kDa hat, bestimmt durch Elektrophorese in denaturierendem Acrylamidgel (SDS-PAGE),
– einer Sequenz, die in der Sequenz IA oder IB enthalten ist und für ein Polypeptid codiert, das durch die gegen das Protein P28 von M. tuberculosis gerichteten Antikörper erkannt wird, das der in 6A dargestellten Aminosäurekette VIIIA oder der in 6B dargestellten Aminosäurekette VIIIB entspricht,
– einer Sequenz IV, welche die Regulatorsequenzen des Gens umfasst, das die codierende Sequenz IA oder IB umfasst, wobei diese Sequenzen in den in 7A und 7B dargestellten Vorläufer- und Nachläufernukleotidsequenzen enthalten sind,
– einer Sequenz V, die der Kette entspricht, die unter den Nukleotiden 1 bis 72 der Sequenz IA oder der Sequenz IB enthalten ist und der Signalsequenz entspricht,
– einer Sequenz VI, die der Kette entspricht oder auf diese anspricht, die unter den Nukleotiden 62 bis 687 der Sequenz IA oder der Sequenz IB enthalten ist,
– einer Sequenz VII, die der Kette entspricht, die unter den Nukleotiden 688 bis 855 der Sequenz IA oder der Sequenz IB enthalten ist.

In den Rahmen der Erfindung fällt auch ein Polypeptid von M. tuberculosis, das sich dadurch auszeichnet, dass es der Aminosäurekette VIIIA oder der Aminosäurekette VIIIB entspricht, die in 6A bzw. 6B dargestellt sind, und dass es eine dieser Ketten enthält.
Ein bevorzugtes Polypeptid zeichnet sich dadurch aus, dass es ein nach dem in den Beispielen beschriebenen Verfahren bestimmtes theoretisches Molekulargewicht von ca. 28 kDa hat.
Das Protein p28 von M. tuberculosis wurde durch seine Fähigkeit charakterisiert, durch die bakterielle Plasmamembran oder die Zellwand exportiert und somit potentiell lokalisiert werden zu können. Außerdem wiederholen sich manche Peptideinheiten der Sequenz, wie es die in 6 dargestellten Sequenzen zeigen. Aus diesen Gründen wird das Protein p28 von M. tuberculosis nun meistens als ERP-Protein bezeichnet, und das Gen, das die codierende Sequenz dieses Proteins enthält, wird entweder irsa-Gen oder erp-Gen genannt.
Das theoretische Molekulargewicht des ERP-Proteins, das mit 28 kDA bewertet wurde, entspricht einem experimentell beobachteten Molekulargewicht von ca. 36 kDA (elektrophoretische Auftrennung in denaturierendem Polyacrylamidgel (DOS-PAGE)).
Ein anderes, im Rahmen der vorliegenden Erfindung interessantes Polypeptid umfasst einen Teil der vorstehend beschriebenen Aminosäurekette VIIIA oder VIIIB und reagiert immunologisch mit den Antikörpern, die gegen das Protein P28 von M. tuberculosis gerichtet sind.
Im Rahmen der Erfindung besonders interessante Aminosäuren sind die Sequenzen, die die folgenden Ketten in einer oder mehreren Kopie/n umfassen: PGLTS, PGLTD, PGLTP, PALTN, PALTS, PALGG, PTGAT, PTGLD, PVGLD.
Andere interessante Sequenzen sind beispielsweise die Signalsequenz, die zwischen den Nukleotidstellen 1 und 72 der Sequenzen von 6A oder 6B liegt, oder aber auch die Sequenz, die zwischen den Nukleotiden 688 und 855 liegt und sich wie eine Transmembransequenz verhalten kann.
Diese Polypeptidsequenzen können in Form von rekombinanten Polypeptiden exprimiert werden. Bei diesen rekombinanten Polypeptiden können, vor allem was die Sequenzen der 5 vorstehend beschriebenen Aminosäuren anbelangt, diese zum Teil durch betreffende Sequenzen ersetzt werden, die von Mykobakterien oder anderen pathogenen Organismen stammen, wobei dieses Ersetzen dazu führen kann, in die rekombinanten Polypeptide Epitope oder Antigendeterminanten eines pathogenen Organismus oder eines Proteins von Interesse einzuschließen, gegen den (das) man Antikörper erhalten möchte.
Somit können die Polypeptide der Erfindung, wobei sie eventuell selbst Antigeneigenschaften oder sogar immunogene Eigenschaften aufweisen, als berücksichtigenswerte Trägermoleküle verwendet werden, um gegebenenfalls Impfstoffe mit verschiedenen Eigenschaften herzustellen.
Die Erfindung hat auch monoklonale oder polyklonale Seren zum Gegenstand, die sich gegen ein wie vorstehend definiertes Polypeptid richten.
Wenn es sich um monoklonale Antikörper handelt, so richten sich diese spezifisch gegen ein Polypeptid der Erfindung und erkennen zum Beispiel das Protein p28 von M. leprae nicht.
Die Erfindung hat auch eine Zusammensetzung zur in vitro-Erfassung einer Infektion durch M. tuberculosis zum Gegenstand, die sich dadurch auszeichnet, dass sie ein vorstehend definiertes Polypeptid umfasst, das in der Lage ist, immunologisch mit Antikörpern zu reagieren, die sich bei einem durch M. tuberculosis infizierten Patienten gebildet haben.
Eine andere Zusammensetzung zur in vitro-Erfassung einer Infektion durch M. tuberculosis zeichnet sich durch eine Nukleotidsequenz aus, die mindestens 9 Nukleotide enthält, die aus einer vorstehend definierten Sequenz stammen, oder eine Nukleotidsequenz, die mindestens 9 Nukleotide enthält und unter Härtebedingungen mit der DNA von M. tuberculosis hybridisiert und unter denselben Bedingungen mit der DNA von M. leprae nicht hybridisiert, wobei diese Sequenz eine gegebenenfalls markierte DNA- oder RNA-Sequenz ist.
Die Erfindung hat auch einen prokaryotischen oder eukaryotischen Zellwirt zum Gegenstand, der sich dadurch auszeichnet, dass er durch eine wie auf den vorherigen Seiten beschriebene Nukleotidsequenz unter Bedingungen transformiert wird, welche die Expression dieser Sequenz und/oder ihre Exposition im Bereich der Membran des Zellwirts und/oder ihre Ausschleusung und/oder ihre Sezernierung aus der vorgenannten Membran zulässt.
Vorzugsweise sind die Zellwirte Mykobakterien wie M. smegmatis oder M. bovis BCG.
Andere Zellwirte sind zum Beispiel E. coli, CHO-, BHK-, Spf9/Baculovirus-Zellen, Hefen wie Saccharomyces cerevisiae, der Vaccinia-Virus.
Die Erfindung hat auch eine immunogene Zusammensetzung zum Gegenstand, die ein wie vorstehend dargestelltes Polypeptid oder einen wie oben definierten Zellwirt umfasst.
Die Anmeldung beschreibt im Übrigen einen Vektor zum Screening und/oder zum Klonieren und/oder zur Expression von in den Mykobakterien funktionalen Nukleotidsequenzen, der von einem vorstehend beschriebenen Vektor abgeleitet ist und sich dadurch auszeichnet, dass die codierende Sequenz, die von einem für einen Ausschleusungs- und/oder Sezernierungsmarker codierende Gen stammt, durch ein Reportergen oder eine Reportersequenz ersetzt ist.
Das Reportergen oder die Reportersequenz kann frei von Regulatorsequenzen sein, insbesondere seiner Ribosom-Bindungssequenzen und/oder seiner Sequenzen, die die Ausschleusung und/oder die Sezernierung des Markers zulassen, der entsteht, wenn der Vektor in einen rekombinanten Zellwirt eingebracht wird.
Das Reportergen oder die Reportersequenz enthält die codierende Sequenz des Gens lacZ oder einen Teil dieser Sequenz, der ausreicht, damit das Polypeptid eine β-Galactosidase-Aktivität aufweist.
Ein besonderer Vektor zeichnet sich dadurch aus, dass er an einer der Klonierungsstellen des Polylinkers eine Nukleotidkette mit einem Promoter und gegebenenfalls Regulatorsequenzen, beispielsweise für die Verankerung an der Oberfläche, die Ausschleusung oder sogar Sezernierung eines Polypeptids umfasst, das unter der Steuerung des Promoters entstehen würde, von dem man die Fähigkeit auswerten möchte, die Expression einer Reporternukleotidsequenz bei den Mykobakterien zu fördern oder zu regulieren.
Besondere Vektoren sind Plasmide, die aus den Plasmiden pJEM12, pJEM13, pJEM14 oder pJEM15 ausgewählt sind, wie sie in 12 dargestellt sind.
Ein solcher Vektor kann zur Auswertung von Expressionsregulator- oder Promotersequenzen, beispielsweise den Promotersequenzen pAN, pblaF*, psu13, pgroES/EL1 verwendet werden.
Die Anmeldung beschreibt ebenfalls ein Verfahren zur Bestimmung der Aktivität einer Sequenz, die an einer der Klonierungsstellen des Polylinkers eine Nukleotidkette mit einem Promoter und gegebenenfalls Regulatorsequenzen, beispielsweise für die Exposition, die Ausschleusung oder sogar Sezernierung eines Polypeptids umfasst, das unter der Steuerung des Promoters in den Mykobakterien entstehen würde, das sich dadurch auszeichnet, dass es die Schritte umfasst:

– Transformation eines Mykobakterienstamms, beispielsweise M. smegmatis oder M. tuberculosis mit einem vorstehend beschriebenen Vektor,
– Erfassung der Aktivität, die normalerweise mit dem Vorhandensein des Reportergens oder der Reportersequenz verbunden ist.

Weitere Merkmale und Vorteile der Erfindung gehen bei der Lektüre der folgenden Beispiele sowie aus den Figuren hervor.
LEGENDE DER FIGUREN
1
Aufbau von pJEM11.
Siehe Material und Methoden. pJEM11 hat Replikationsursprünge (ori) von E. coli und Mykobakterien. Es handelt sich also um ein Shuttle-Plasmid. Der Selektionsmarker ist das Resistenzgen gegen Kanamycin (Km). Das verkürzte phoA-Gen von pPH07 (22) ist frei von Promoter, Start-Codon und Signalsequenz, somit hängen die Expression und Ausschleusung von PhoA von der translationellen Fusion mit den amino-terminalen Enden anderer Proteine ab. Der Transkiptionsterminator (T) der Omega-Kassette verhindert die Transkription durch "read-through" anhand von Plasmidsequenzen.
2
Aufbau der Plasmide pLA71, pLA72 und pLA73.
Das Einfügen von blaF*-Fragmenten (34) mit drei verschiedenen Längen in die Stelle BamH1 von pJEM11 führt zur Expression von Fusionsproteinen mit phoA-Aktivität. Die quantitativen kolorimetrischen Bestimmungen erfolgten nach dem Verfahren von Brockman und Heppel (8) mit p-Nitrophenylphosphat als Substrat. Der Gehalt an Proteinen wurde mit Hilfe der Bio-Rad-Analyse gemessen. Die arbiträren alkalischen Einheiten von alkalischer Phosphatase (aU) wurden wie in Material und Methoden beschrieben berechnet.
3
Western-Blot-Analysen von phoA-Fusionsproteinen
Transformierte Stämme von M. smegmatis wurden in Beck-Medium, das Kanamycin (20 μg/ml) enthielt, als Kultur angesetzt. Die gesamten Extrakte von sonifizierten Bakterien wurden durch SDS solubilisiert, durch SDS-PAGE aufgelöst und einer Immunprägung unterzogen. Die Herstellung des anti-phoA-Kaninchenserums wurde zuvor beschrieben (34). An phoA (Promega) gekoppelte Kaninchenantikörper und als Substrat eine Mischung aus X-P und Nitroblau-Tetrazolium (BCIP-NBT, Promega) wurden verwendet, um die phoA-Fusionen nachzuweisen. Spalte 1: gereinigtes Bakterien-PhoA, M. smegmatis, tranformiert durch Plasmide pJEM11: Spalte 2, pLA71: Spalte 3, pLA72: Spalte 4, pLA73: Spalte 5, pExp410: Spalte 6, pExp53: Spalte 7, pExp59: Spalte 8, pExp421: Spalte 9.
4
Nukleotidsequenzen und Aminosäuren, die von selektionierten Insertsegmenten der Plasmide pExp410, pExp53, pExp59 und pExp421 abgeleitet waren.
Die Klone von M. smegmatis mit der Aktivität der alkalischen Phosphatase wurden in X-P/Kanamycin-Behältern selektioniert. Ihre Plasmide wurden bei E. coli XL-1 B amplifiziert, und die Nukleotidsequenz der Inserts wurde wie in Material und Methoden beschrieben bestimmt. A: pExp410 enthält einen Teil des 19 kDA-Lipoproteins. Der Leserahmen wird am Übergang mit phoA (BamH1/Sau3A) gehalten. B: pExp53 enthält einen Teil eines Gens, das Ähnlichkeiten mit den 28 kDa-Antigen von M. leprae aufweist. Die divergierenden Aminosäuren sind in Fettbuchstaben dargestellt. Das Translationsstart-Codon ist GTG. Die mutmaßlichen Stellen einer Spaltung durch Signalpeptidase sind durch Pfeile angegeben. C: pExp59 codiert für eine charakteristische Signalsequenz. Eine mutmaßliche Bindungsstelle an Ribosome (RBS) ist unterstrichen. Die mutmaßliche Stelle einer Spaltung durch Signalpeptidase ist durch einen Pfeil angegeben. D: pExp421 codiert für Aminosäureeinheiten, die mit Proteinen der Familie der ACP-Desaturasen (ACP – Stearoyl-Acyl-Carrier-Protein) konserviert sind. R. comm: R. communis (Ricin).
5
Das Gen, das dem 28 kDa-Antigen von M. leprae ähnlich ist, ist in einer einzigen Kopie im Genom von M. tuberculosis vorhanden.
Die genomische DNA von M. tuberculosis wurde unter Befolgung von Standardprotokollen (27) extrahiert, durch Endonucleasen PstI, SmaI, BstEII, SphI, BamHI verdaut und einer Auftrennung in 1%-igem Agarosegel unterzogen. Die Southern-Blot-Hybridisierung erfolgt durch Standardprotokolle (27). Die an 32P markierte Sonde war ein 180 bp-Fragment von PCR des Inserts von pExp53.
6
Nukleotidsequenzen (IA und IB) und Aminosäuresequenzen (VIIIA und VIIIB) des Produkts des IRSA-Gens, das für das Protein P28 von M. tuberculosis codiert (zwei Varianten sind dargestellt). Dieses Gen wird nun mit der Abkürzung "erp" bezeichnet, die denn Ausdruck "exported repetitive Protein" entspricht.
7
Vorläufernukleotidsequenzen, die das IRSA-Gen von M. tuberculosis flankieren.
8
Bakteriengene zur Regulierung des Eisens (IRG's).
9
Hydrophilieprofil der Proteine P28 von M. leprae und M. tuberculosis.
10

A) Alignment der Nukleotidsequenzen des Gens, das für die Proteine P28 von M. leprae und M. tuberculosis codiert.
B) Alignment der Aminosäuresequenzen der Proteine P28 von M. tuberculosis und M. leprae.

11
Aufbau der Plasmide pJN3 und pJN11.
Es sind nur die einschlägigen Restriktionsstellen und genetischen Elemente gezeigt. Die Plasmide pRR3 und pJN1 wurden im Stand der Technik beschrieben (60), (58). Die Omegakassette wurde durch Verdau mittels SmaI von pHP45X erreicht (59), gefolgt von der Aufreinigung eines 2 kb-Fragments eines Agarosegels unter Verwendung des Geneclean-Kits (Bio 101 Inc.). Die Standardtechniken rekombinanter DNA wurden in Übereinstimmung mit der im Stand der Technik gegebenen Beschreibung (61) eingesetzt. In pJN3 und pJN11 war das Gen der β-Lactamase (bla) unterbrochen. oriE und oriM bezeichnen die Replikationsursprünge von pUC (E. coli) bzw. von pAL5000 (Mykobakterien).
12
Struktur der Plasmide der Reihe pJEM.
(A) In der schematischen Darstellung der Plasmide sind nur die einschlägigen genetischen Elemente angegeben. pJEM15 ergab sich aus der Klonierung an der ScaI-Stelle von pRR3 i) aus einem Fragment, das durch Amplifikation durch PCR erhalten wurde (indem OJN1:5'AAGCTTCCGATTCGTAGAGCC3' und OJN2:5'-GGGCTCGAGCTGCAGTGGATGACCTTTTGA-3' als Initiatoren und pJN11 als Matrix verwendet wurden) und tT4 und das N-terminale Ende von cII enthielt; ii) Synthese-Oligonukleotiden entsprechend MCS1; und iii) dem Fragment lacZ' von HinIII-DraI von pNM480. pJEM12-13-14 wurden durch Klonierung des vorstehend beschriebenen, durch PCR amplifizierten Fragments an der ScaI-Stelle von pRR3 erhalten. Die MCS2 entsprechenden Synthese-Oligonukleotide wurden dann eingesetzt. Schließlich wurde jede der drei Formen der Reihe pNM480 in die HindIII-Stelle in MCS2 eingebracht. (B) Nukleotidsequenzen der Bereiche zwischen dem Initiator OJN1 und dem B. Codon von lacZ (markiert mit ****). Diese Sequenzen wurden experimentell verifiziert. Der Bereich tT4 ist unterstrichen, und die Synthese-RBS ist in Fettbuchstaben dargestellt. Die Aminosäuresequenz des N-terminalen Endes von CII ist unter der DNA-Sequenz wiedergegeben. Die HindIII-Stellen sind mit einem Stern markiert, weil sie nicht eindeutig sind. Was die ergänzenden Beschreibungen angeht, siehe die Legende zu 11.
BEISPIELE
I) Identifizierung des Gens, das für die aus M. tuberculosis isolierten Proteine codiert.
Die hier wiedergegebenen Ergebnisse beschreiben die Definition für Mykobakterien eines genetischen Identifizierungsverfahrens für ausgeschleuste Proteine. Diese Methodologie basiert auf der translationellen Fusion mit der alkalischen Bakterienphosphatase (PhoA).
Solche Fusionsproteine müssen isoliert oder exportiert werden, um zur PhoA-Aktivität zu gelangen (6, 13, 16). Ein phoA-Gen wurde nach Deletion des Promoterbereichs aus der Bindungsstelle an die Ribosomen und des gesamten Bereichs, der für die Signalsequenz codiert, dessen Translationsstart-Codon verwendet worden war, verwendet. Somit hängt die alkalische Phosphataseaktivität von der translationellen Fusion, die in der richtigen Lesephase erfolgt, mit einem Teil eines isolierten Proteins ab. Der Aufbau eines phoA-Plasmidvektors für die Mykobakterien wird in erster Linie beschrieben, dabei wurde nachgewiesen, dass das Einschleusen in dieses Gen des β-Lactamase-Gens, das aus M. fortuitum (blaF*) (34) ausgeschleust worden war, bei M. smegmatis zur Produktion von Fusionsproteinen führt, die enzymatische PhoA-Aktivität aufweisen. Eine Fusionssequenzbank zwischen der genomischen DNA von M. tuberculosis und dem phoA-Gen wurde dann aufgebaut. Zwölf unabhängige Klone wurden isoliert, welche die Fusionsproteine ausschleusten. Darunter konnte man das bereits bei M. tuberculosis beschriebene ausgeschleuste 19 kDA-Lipoprotein, eine neue Sequenz von M. tuberculosis, die Ähnlichkeiten mit dem 28 kDa-Protein von M. leprae aufweist, ein Protein mit Aminosäureresten, die mit ACP-Desaturasen (ACP – Stearoyl-Acyl-Carrier-Protein) konserviert waren, und andere neue Sequenzen identifizieren.
MATERIAL UND METHODEN
Bakterienstämme, Plasmide und Kulturbedingungen
Die Bakterienstämme und die Plasmide, die in dieser Studie verwendet wurden, sind in Tabelle 1 dargestellt. Das Wachstum der Stämme von E. coli und M. smegmatis, die Elektroporation, das Screening auf Gelose, die 20 μg/ml Kanamycin und 20 μg/ml 5-Brom-4-Chlor-3-Indolyl-Phosphat (X-P) enthielt, wurde wie vorher schon beschrieben (14) durchgeführt.
M. tuberculosis, ein Isolat von einem Patienten (Stamm 103) wurde auf festem Löwenstein-Jensen-Medium kultiviert.
Handhabung und Sequenzierung von DNA
Die DNA-Handhabung und die Southern Blot-Analysen wurden mit Hilfe von Standardverfahren durchgeführt (27). Für die Bestimmungen der Sequenzen wurden die Oligonukleotide (5'-GGCCCGACGAGTCCCGC-3' und 5'-TTGGGGCCCTAGAGGT-3') im Hinblick auf die Sequenzierung über die Fusionsübergänge der Inserts von M. tuberculosis in pJEM11 eingestellt (siehe unten). Die doppelsträngigen DNA-Plasmasequenzen wurden mit der Didesoxy-Kettenabbruchmethode (28), indem das Sequenzierungskit T7 (Pharmacia) nach Anweisungen des Herstellers verwendet wurde, oder mit dem Sequenzierungskit Cycle Terminateur Taq Dyc Désoxy (Applied Biosystems) in einem PCR-System GeneAmp 9600 (Perkin Elmer), und die ein DNA-Analysesystem – Modell 373 (Applied Biosystems) durchlaufen hatten, bestimmt.
Analysen der Datenbanken
Die Nukleotidsequenzen wurden mit denjenigen der Datenbanken EMBL und GenBank verglichen, wobei der FASIA-Algorithmus (23) verwendet wurde, und die abgeleiteten Proteinsequenzen wurden analysiert, um eine eventuelle Ähnlichkeit mit den Sequenzen zu bestimmen, die in den Proteindatenbanken PIR und SwissProt enthalten sind, wobei der BLAST-Algorithmus (1) verwendet wurde.
Aufbau der Plasmide
pJEM11: der Aufbau von pJEM11 ist in 1 zusammengefasst. Kurz ausgedrückt wurde pJEM2 aus dem Shuttle-Plasmid pRR3 von E. coli-Mykobakterien (26) aufgebaut, indem das verkürzte Fragment lacZ von pNM480 (18) einer multiplen Klonierungsstelle oder eines Polylinkers (MCS) und der Transkriptionsterminator der Omega-Kassette (24) eingefügt wurde. Das N-terminale Fragment EcoRV-KpnI von lacZ wurde durch das verkürzte phoA-Fragment von pPHO7 (11) ohne Start-Codon oder Signalsequenz ersetzt, um pJEM10 zu ergeben. Schließlich wurde ein potentielles Start-Codon im MCS eliminiert, um pJEM11 zu ergeben.
pLA71, pLA72 und pLA73: unterschiedlich lange Fragmente von blaF* (34), die durch Amplifikation mit PCR erhalten worden waren, wurden an die BamH1-Stelle von pJEM11 eingesetzt, um pLA71, pLA72 und pLA73 zu ergeben (2). Die Oligonukleotide (Genset, Paris), die zur Amplifikation mit PCR verwendet wurden, waren für pLA71, pLA72 und pLA73 nach vorn hin 5'-CGGGATCCTGCTCGGCGGACTCCGGG-3' und nach hinten hin 5'-CGGGATCCGGTCATCGATCGGTGCCGCGAA-3', 5'-CGGGATCCCGCCGTGCTCGGCCATCTGCAG-3' bzw. 5'-CGGGATCCAGAGTAAGGACGGCAGCACCAG-3'. Die Amplifikationen durch PCR wurden in einem DNA-Thermocycler (Perkin Elmer) durchgeführt, wobei die Taq-Polymerase (Cetus) nach den Empfehlungen des Herstellers verwendet wurde.
Aufbau der Genom-Banken von M. tuberculosis
Genomische DNA vom M. tuberculosis wurde nach Standardprotokollen extrahiert (27). Diese DNA wurde teilweise durch Sau3A (mit 1U pro 2 μg) bei 37°C 2 Min, 30 Sekunden lang verdaut. Der Verdau wurde durch Zugabe von Phenol gestoppt. Dann ließ man diese DNA sich auf Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt (Gibco, BRL) auftrennen. Die Fraktion, die Fragmente mit 400 bis 2000 bp enthielt, wurde mittels Agarase (GELase, Epicentre Technologies) extrahiert und bei 16°C eine Nacht lang an die pJEM11-kompatible BamHI-Stelle mit der T4-DNA-Ligase (Boehringer Mannheim) ligiert.
Dosierung der alkalischen Phosphatase
Für die Dosierungen der alkalischen Phosphatase wurde M. smegmatis 48 Stunden lang bei 37° in Nährlösung L kultiviert, der 0,05% Tylaxopol zugesetzt war. Die Aktivität der alkalischen Phosphatase wurde mit der Methode von Brockman und Heppel (8) in sonifizierten Extrakten wie vorher bereits beschrieben (34) quantitativ bestimmt, wobei p-Nitrophenylphoshat als Reaktionssubstrat verwendet wurde. Der Proteingehalt wurde mit Hilfe der Bio-Rad-Analyse (Bio-Rad) gemessen. Die Aktivität der alkalischen Phosphatase wird in arbiträren Einheiten (aU) = DO₄₂₀ × 105 × 1 g an Protein^–1 × min^–1 ausgedrückt.
Antikörperherstellung, Elektrophorese auf SDS-Polyacrylamidgel und Immunabdrücke
Die Herstellung eines anti-PhoA-Kaninchenserums wurde vorher bereits beschrieben (34). Zellextrakte von M. smegmatis wurden durch Sonifizierung vorbereitet, SDS-PAGE und der Immunabdruck wurden wie vorher bereits beschrieben (36) durchgeführt.
ERGEBNISSE
Aufbau eines Shuttle-Plasmidvektors (pJEM11) zur Herstellung von Fusionsproteinen mit PhoA bei M. smegmatis
pJEM11 besitzt ein verkürztes phoA-Gen von E. coli ohne Start-Codon oder irgendwelche Regulationselemente (1). Die multiple Klonierungsstelle ermöglicht die gleichzeitige Insertion von Fragmenten, die von Genen stammen, die für die ausgeschleusten mutmaßlichen Proteine codieren, und ihrer Regulationselemente. Somit würden die Fusionsproteine, die hergestellt werden konnten, die Aktivität der alkalischen Phosphatase bei der Ausschleusung der Fusion besitzen. pJEM11 ist ein Shuttle-Plasmid für E. coli/Mykobakterien, das das Resistenzgen gegen das Antibiotikum Kanamycin tn903 als Selektionsmarker enthält.
Das Einfügen von genetischen Elementen, die für die Expression und die Ausschleusung von β-Lactamase bei pJEM11 verantwortlich sind, führt zur Produktion von PhoA-Fusiosproteinen, die bei M. smegmatis enzymatisch aktiv sind
Die drei Plasmide wurden durch Einfügen von unterschiedlich langen Fragmenten an die BamHI-Stelle von pJEM11 (2) gebildet, die vom β-Lactamase-Gen des überexprimierenden Stamms M. fortuitum D316 (blaF*) (34) stammen. Im pLA71 umfasst das 1384 bp-Fragment den Promoter, das für die 32 Aminosäuren der Signalsequenz codierende Segment, und die ersten 5 Aminosäuren des reifen Proteins (es gibt keine Shine-Dalgarno-Sequenz zur Ribosomenbefestigung in der Ursprungssequenz von blaF*). pLA72 enthält ein 1550 bp-Fragment, das die für die Signalsequenz codierenden Elemente und die ersten 61 Aminosäuren des reifen Proteins umfasst. Im pLA73 enthält das 2155 bp-Fragment die ganze blaF*. Diese Plasmide wurden dazu verwendet, M. smegmatis zu transformieren, und die Transformanten wurden einem Screening auf die enzymatisch aktiven PhoA-Fusionen durch Ausstreichen auf Gelose- Medium unterzogen, das Kanamycin und X-P enthielt. X-P ist löslich und farblos, aber nach Spaltung des Phosphats durch die alkalische Phosphatase entsteht ein blaues Präzipitat. Somit konnten die Klone, die die alkalische Phosphatase erzeugen, leicht durch ihre blaue Färbung identifiziert werden. Die Expression von pLA71, 72 und 73 bei M. smegmatis führt zu blauen Kolonien, wohingegen die Kolonien mit pJEM11 weiß geblieben sind. Western Blot-Analysen wiesen die Entstehung von phoA-Fusionsproteinen mit einem scheinbaren Molekulargewicht von ca. 47,5 kDa, 54 kDa und 76 kDa für pLA71, pLA72 bzw. pLA73 nach (3, Spalte 3, 4, 5). Diese Molekulargewichte stimmen mit der Länge des reifen Proteins überein, das mit der alkalischen Phosphatase fusioniert hat (scheinbares Molekulargewicht von 46 kDa, 3, Spalte 1). Im pJEM11 gibt es, wie vorhergesehen, keine phoA-Expression (3, Spalte 2). Die quantitative Bestimmung der Aktivität der alkalischen Phosphatase (siehe 2) dieser Bakterien bestätigt eine enzymatische Aktivität mit den 3 pLA-Typen. Jedoch exprimiert M. smegmatis mit pLA73 im Vergleich zu_pLA73 und 72 ca. zweimal mehr Aktivität. In den verschiedenen Versuchen haben wir bestätigt, dass die intrazelluläre Produktion von phoA unter der Steuerung eines mykobakeriellen Promoters ohne Fusion mit einem ausgeschleusten Protein nicht mit der Expression der Aktivität der alkalischen Phosphatase zusammenhing. Alle diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass in diesem System die Aktivität der alkalischen Phosphatase von der translationellen Fusion und der eigentlichen Ausschleusung des Produkts abhängt. Infolgedessen ist pJEM11 zur genetischen Identifizierung der Proteine geeignet, die durch die Mykobakterien ausgeschleust werden.
Aufbau einer phoA-Fusionsbank mit genomischen DNA-Fragmenten von M. tuberculosis bei M. smegmatis
Die genomische DNA eines klinischen Isolats von M. tuberculosis wurde gereinigt und teilweise mit Sau3A verdaut. Die 400/2000 bp-Fraktion wurde in die kompatible BamHI-Stelle von pJEM11 eingebracht. Die Bindungsprodukte wurden durch Elektroporation in E. coli XL-1 blau transferiert, um eine Amplifikationsstufe zu erhalten. Ungefähr 2500 Klone, welche die Plasmide mit den Inserten enthielten, wuchsen auf einem Gelose-Medium, das Kanamycin enthielt. Die gereinigten Plasmide aus den Transformanten wurden wieder zusammengeführt und durch Elektroporation in M. smegmatis MC²155 transferiert. Die transformierten Bakterien wurden auf L-Kanamycin-X-P-Gelose ausgestrichen. Ungefähr 14000 Klone wurden erhalten. Nach 4-tägiger Inkubation wurden die ersten blauen Kolonien, als PhoA⁺-Kolonien beobachtet. Jeden Tag wurden die Platten überprüft und neue PhoA⁺-Kolonien isoliert. Die klonierten Kolonien wurden lysiert und ihre DNA zur Herstellung von Plasmiden durch Elektroporation in E. coli XL-1 blau eingebracht. Insgesamt wurden 12 verschiedene Inserts isoliert und sequenziert, welche die Expression von phoA ermöglichten. Drei Sequenzen wiesen Ähnlichkeiten mit bekannten Sequenzen auf.
Fusion von PhoA mit dem Gen des 19 kDa-Lipoproteins von M. tuberculosis
Eines der Plasmide (pEXP410) besitzt ein Insert, das einem Teil des bereits bekannten Gens des 19 kDa-Proteins entspricht. Dieses Gen codiert für ein ausgeschleustes Lipoprotein (5, 13). 4A zeigt die DNA-Sequenz, die der Fusion zwischen diesem Gen und phoA entspricht. Wie vorhergesehen, ist dasselbe Leseraster zwischen den beiden Proteinen aufrechterhalten. Das erwartete Molekulargewicht des Fusionsproteins läge sequenzmäßig um 57 kDa. Jedoch ist das wirkliche, durch eine Western Blot-Analyse festgestellte Molekulargewicht gleich demjenigen des aufgereinigten PhoA-Proteins (3, Spalte 1 und 6), was nahe legt, dass das Fusionsprotein nahe der PhoA-Verbindungsstelle gespalten ist.
Fusion mit einer dem Gen des 28 kDa-Proteins von M. leprae ähnlichen Sequenz
Das 28 kDa-Protein von M. leprae ist ein bedeutendes Antigen, das sehr oft in Patientenseren erkannt wird, die von der lepromatösen Form der Lepra erhalten werden (9). In der vorbereiteten Insert-Bank von M. tuberculosis wurde eine Sequenz identifiziert, die von einem rekombinanten Vektor (pExp53) getragen wird, der eine Ähnlichkeit von 77% mit der Nukleotidsequenz dieses Gens und von 68% bei der abgeleiteten Aminosäuresequenz aufweist (4B). In der Western Blot-Analyse betrug das Molekulargewicht des Fusionsproteins ca. 52 kDa (3, Spalte 7), was ca. 45 Aminosäuren des Mykobakterienproteins im Fusionsprotein nach Spaltung des Signalpeptids vorhersehen lässt. Dies stimmt mit der Länge des mit phoA fusionierten Fragments des Gens von M. tuberculosis überein (4B).
Es erfolgten Southern Blot-Analysen der genomischen DNA von M. tuberculosis. Es wurde nachgewiesen, dass ein 180 bp-Fragment des 2 kb-Inserts des Plasmids pExp53 keinerlei Restriktionsstelle für die Endonucleasen PstI, SmaI, BamHI, BstEII und SphI enthielt. Dieses Fragment wurde durch PCR amplifiziert. Die genomische DNA von M. tuberculosis wurde mittels dieser Enzyme verdaut und mit dem mit 32P markierten PCR-Fragment sondiert. Wie in 5 zu sehen ist, wurde nur ein Streifen beobachtet, als die genomische DNA jeweils mit den fünf Enzymen verdaut wurde, was nahe legt, dass das Gen in einer einzigen Kopie im Genom von M. tuberculosis vorhanden ist.
Weitere PhoA-Fusionen, die die mutmaßlichen Signalsequenzen tragen
4C zeigt die Sequenz eines Inserts, das von einem mit phoA fusionierten rekombinanten Vektor (pExp59) getragen wird. Sie weist eine typische Signalsequenz auf, welche die Ausschleusung von Proteinen ermöglicht. Die dargestellte Sequenz stimmt mit den gewöhnlichen Regeln überein, wie sie bei gram-negativen Bakterien aufgestellt sind (25). Sie enthält zwei positiv geladene Aminosäuren (Arg, Asn) nach dem Start-Codon, auf die ein hydrophobes Peptid mit einem Gly folgt, das wahrscheinlich einer Schleife in der dreidimensionalen Struktur des Peptids entspricht. Eine potentielle Stelle zur Spaltung durch die Signalpeptidase ist durch einen Pfeil angegeben, wodurch sich ein Fusionsprotein mit einem Molekulargewicht ergibt, das dem von phoA nahe kommt, wie entsprechend in 3, Spalte 8 gezeigt ist.
PhoA-Fusionsproteine mit Aminosäureeinheiten, die mit ACP-Desaturasen (ACP – Stearoyl-Acyl-Carrier-Protein) konserviert wurden
Die ACP-Desaturasen sind Enzyme, die in die Abläufe der Biosynthese von Fettsäuren verwickelt sind. Im Allgemeinen sind diese Proteine membranintegrierte Proteine (29). Analysen des Plasmids pExp421 der vorbereiteten Bank brachten zwei mit ACP-Desaturasen konservierte Aminosäureeinheiten an den Tag, eine mit 9 Aminosäuren und die zweite mit 14 Aminosäuren (4D). Der Rest der Sequenz wies keinerlei signifikante Ähnlichkeit mit bekannten Proteinen auf.
DISKUSSION
Mehr als 30 sezernierte Proteine wurden kurzfristig in den Filtraten von BCG oder M. tuberculosis mit einer minimalen Lyse der Bakterie gefunden (1, 19, 38). Diese Proteine wurden je nach ihrem Molekulargewicht und ihren immunologische Reaktivitäten klassifiziert. Manche wurden nachdrücklicher charakterisiert. Zum Beispiel sind die aus dem Komplex des Antigens 85 (die Antigene 85 A, B und C) sezernierten Proteine Proteine mit 32 kDa, die serologische Kreuzreaktionen aufweisen (7, 35). Die Antigene 85 A und 85 B weisen eine Affinität gegenüber dem Fibronectin auf und wären in die Internalisierung von M. tuberculosis in die Makrophagen verwickelt. Die Gene dieser Immunogen- Proteine (7) und von Proteinen mit 23 kDa (MBP64) (37) und mit 19 kDa (5) wurden kloniert und sequenziert, und es wurden Sequenzen von Signalpeptiden gefunden, die charakteristisch für ausgeschleuste Proteine sind. Die rekombinanten Proteine, die aus diesen Genen hergestellt wurden, wären interessante Hilfsmittel für die serologische Diagnostik der Tuberkulose. Die Superoxiddismutase (SOD) mit 23/28 kDa ist kurzfristig in den Filtraten im Übermaß vorhanden und wäre in das Überleben von Mykobakterien im Phagolysosom verwickelt. Das bei M. tuberculosis für SOD codierende Gen wurde kloniert und sequenziert (39). Interessanterweise wurde keine charakteristische Signalpeptidsequenz gefunden. Dies lässt einen spezifischen Sezernierungsweg dieses Enzyms durch die Mykobakterien vermuten. Proteine, die in zwei engen Molekulargewichtsbereichen (6–10 kDa und 26–34 kDa) sezerniert wurden, sind bedeutende Antigene von T-Zellen (3) und induzieren bei der Maus Immunantworten in T-Helferzellen gegenüber einer Probe mit lebenden Mykobakterien des Komplexes von M. tuberculosis (4). Es wurde angeregt, dass die Unterschiede in den Immunantworten, die zwischen lebenden und toten Bakterien beobachtet wurden, von diesen ausgeschleusten/sezernierten Proteinen herrühren (20). Diese verschiedenen vorläufigen Ergebnisse legen nahe, dass eine bessere Charakterisierung von ausgeschleusten/sezernierten Proteinen von pathogenen Bakterien des Komplexes von M. tuberculosis zugleich für das Verständnis ihrer pathogenen Wirkung wie auch für die Herstellung neuer Impfstoffe von großem Nutzen wäre.
Als die sezernierten Proteine mit biochemischen Methoden untersucht wurden, erwiesen sich andere genetische Methodologien als notwendig. Als ein gekürztes phoA-Gen verwendet wurde, wurden Fusionssysteme eingesetzt, welche die Bindung von Aminoenden anderer Proteine an PhoA ermöglichten. Dieser Lösungsansatz basiert auf der periplasmatischen bakteriellen alkalischen Phosphatase von E. coli. Dieses Enzym muss extrazytoplasmatisch lokalisiert werden, um aktiv zu sein. Auf diese Weise kann die alkalische Phosphatase als subzelluläre Lokalisierungssonde verwendet werden.
Hier wurde eine PhoA-Methodologie zur Identifizierung von Proteinen ausgearbeitet und beschrieben, die von den Mykobakterien ausgeschleust werden. Das Einbringen von blaF* in pJEM11 führt bei M. smegmatis zur Produktion von Fusionsproteinen mit alkalischer Phosphataseaktivität. Überdies waren PhoA-Fusionen mit drei verschiedenen BlaF*-Fragmenten enzymatisch aktiv, was nahe legt, dass die meisten phasengleichen Fusionen mit den ausgeschleusten Proteinen eine PhoA-Aktivität haben.
Eine Insert-Bank von M. tuberculosis in pJEM11 wurde bei M. smegmatis aufgebaut und exprimiert. In dieser Bank wurde ein Teil des Gens isoliert, das für das bekannte ausgeschleuste Lipoprotein mit 19 kDa (pEXP410) codiert. Dieses Protein von M. tuberculosis ist eines der serologisch immundominanten Antigene, die bei dieser Bazille gefunden wurden. Analysen der DNA-Sequenz des Gens, das für dieses Antigen codiert, zeigen, dass der hydrophobe NH2-terminale Bereich ein Lipoproteinsignalpeptid ist (5). Ein Teil dieses Lipoproteins wurde mit dem Protein A der Außenoberfläche von Borrelia burgdorferi fusioniert, um einen rekombinanten BCG-Impfstoff aufzubauen, der in der Lage ist, eine starke Immunantwort hervorzurufen (31).
Zwei andere Sequenzen, die Ähnlichkeiten mit den ausgeschleusten Proteinen oder Membranproteinen gemeinsam haben, wurden ebenfalls identifiziert:
Es stellte sich heraus, dass pExp53 Ähnlichkeiten mit denn Gen des 28 kDa-Antigen von M. leprae aufweist. Dieses Antigen von M. leprae wurden durch Screening einer λgt11-Bank mit dem Serum von Patienten gefunden, das aus der lepromatösen Form der Lepra gewonnen worden war. Es ist ein bedeutendes Antigen, das in die humarole Immunantwort auf M. leprae verwickelt ist (9). Interessanterweise wurde nachgewiesen, dass ein Peptid dieses Proteins mit 20 Aminosäuren eine erhebliche Ähnlichkeit mit einem Peptid des 19 kDa-Antigens von M. tuberculosis aufweist und ein Epitop von T- Zellen ist, die Kreuzreaktionen aufweisen (12). Die DNA-Sequenz des Gens, das für das 28 kDa-Antigen von M. leprae codiert, legt nahe "dass die vorgenannte Aminosäurensequenz des Proteins an seinem amino-terminalen Ende ein potentielles Signalpeptid und zwei lange hydrophobe Bereiche enthält, was nahe legt, dass sie gezielt auf die Lokalisierung an der bakteriellen Plasmamembran oder der Zellwand gerichtet ist" (9).
Ein Fusionsprotein, das durch ein Plasmid unserer Bank (pExp421) codiert war, teilte sich die Aminosäureeinheiten mit den Desaturasen. Die ACP-Desaturasen sind Enzyme, die in die Abläufe der Biosynthese von Fettsäuren verwickelt sind. Im Allgemeinen sind diese Proteine membranintegrierte Proteine (39). Dieses Ergebnis legt nahe, dass man einen Teil eines im Metabolismus von Lipiden bei M. tuberculosis wichtigen Gens isolieren konnte, das vielleicht in den Verlauf der Biosynthese der Lipidzellwand verwickelt ist.
Es wurde ein anderes Plasmid (pExp59) mit einer mutmaßlichen charakteristischen Signalsequenz gefunden.
Zusammenfassend und abschließend zeigen die dargestellten Ergebnisse, dass die PhoA-Technologie zur genetischen Identifizierung ausgeschleuster Proteine erfolgreich für M. tuberculosis übernommen werden kann. Vorläufige Screenings einer Insert-Bank, die PhoA-Fusionsproteine ergaben, bewiesen, dass die Sequenzen Ähnlichkeiten mit bekannten ausgeschleusten Proteinen aufwiesen.
II) Expression des Proteins P28 von M. tuberculosis
Der BCG ist ein Lebendimpfstoff. Es ist der einzige Impfstoff, der zum Schutz gegen Tuberkulose eingesetzt wird. Seine Wirksamkeit stellte sich je nach den geimpften Bevölkerungsanteilen, die von ca. 80% in Großbritannien bis zu 0% in Indien gingen, als variabel heraus. Es erscheint somit unerlässlich, nach einem wirksameren Impfstoff zu suchen. Andererseits wirft die Tatsache, einen Lebendimpfstoff zu verwenden, heute aufgrund der Ausbreitung der Seuche AIDS Probleme auf.
Mehrere Arbeiten haben gezeigt, dass die aus Mycobacterium tuberculosis, dem Erreger der Tuberkulose, ausgeschleusten Antigene eine Schutzwirkung gegen eine Probe mit denn virulenten Stamm hatten. Die hier angeführten Arbeiten bestanden darin, eine genetische Methode zu nutzen, um die Gene von M. tuberculosis zu isolieren und zu untersuchen, die für die ausgeschleusten Proteine codieren. Wir beschreiben hier die Isolierung und Charakterisierung eines Gens, das für ein Protein codiert, das Homologien mit dem bereits beschriebenen 28 kDa-Protein von Mycobacterium leprae besitzt.
Methodologie für die Klonierung von Genen, die für die ausgeschleusten Proteine codieren.
Die im Teil I im Detail dargelegte Methodologie beruht auf der Nutzung translationeller Fusionen mit dem Gen, das für die alkalische Phosphatase von Escherichia coli, PhoA, codiert. Derartige Fusionsproteine haben nur dann eine erfassbare alkalische Phosphataseaktivität, wenn sie ausgeschleust sind. Es wurde ein Plasmidvektor konstruiert, der ein phoA-Gen trägt, das von seinem Promoter, seiner Bindungsstelle an die ribosomale RNA und seiner Signalsequenz befreit war. Anhand dieses Vektors kann eine PhoA-Aktivität nur durch eine translationelle Fusion im richtigen Leseraster mit einem ausgeschleusten Protein beobachtet werden. Der pJEM11 genannte Vektor besitzt einen Replikationsursprung für E. coli und einen anderen für die Mykobakterien. Er besitzt auch einen Selektionsmarker, das Resistenzgen gegen das Kanamycin des Transposons Tn905. Eine multiple Klonierungsstelle geht dem verkürzten phoA-Gen voraus.
Eine Genom-DNA-Bank, die von einem aus einem Tuberkulosepatienten isolierten Stamm von M. tuberculosis (Mt103) stammte, wurde im pJEM11 konstruiert, indem DNA-Fragmente eingebracht wurden, die aus einer Teilhydrolyse mit dem Enzym Sau3A hervorgegangen waren. Die selektionierten Klone ermöglichten es, ein Nukleotidfragment des 28 kDa-Gens von M. tuberculosis zu identifizieren, das homolog zu dem Gen ist, das für das 28 kDa-Protein von M. leprae codiert.
Bei den Leprakranken werden Antikörper beobachtet, die sich gegen dieses 28 kDa-Protein richten, was die Vermutung nahe legt, dass dieses Protein ein immundominantes Antigen ist. Es wurde die Hypothese aufgestellt, dass bei M. tuberculosis das 28 kDa-Protein, das Homologien mit dem 28 kDa-Protein von M. leprae besitzt, auch ein immundominantes Antigen sein könnte, und es zum Aufbau von spezifischen immunologischen Tests dienen könnte, welche die Erfassung der tuberkulösen Infektion oder der Krankheit Tuberkulose ermöglichen. Es könnte vielleicht zum Aufbau von Impfstoffteileinheiten ohne verschiedene Impfpräparate verwendet werden. Außerdem könnte es beim Aufbau rekombinanter Impfstoffe als Vektor zur Antigenexpression bei Mykobakterien nützlich sein.
Klonierung und Sequenzierung des Gens, das für ein 28 kDa-Protein von M. tuberculosis codiert
Unter Verwendung des im Plasmid pExp53 enthaltenen Inserts als Sonde, wurde das ganze Gen, das für das 28 kDa-Protein von M. tuberculosis codiert, durch Hybridisierung auf einer Kolonie einer DNA-Bank von M. tuberculosis kloniert, die dadurch gebildet worden war, dass DNA-Fragmente von M. tuberculosis mit einer Größe zwischen 2 und 6 kb, die durch Gesamthydrolyse mit dem Enzym PstI gewonnen worden waren, in den pBluescript KS-Vektor eingebracht wurden. Das PstI-Fragment von M. tuberculosis, das dem positiven Klon entspricht und ein Insert von 4,1 kb umfasst, wurde sequenziert. 10 zeigt die Nukleotidsequenz des Fragments und die Ähnlichkeiten mit dem Gen, das für das 28 kDa-Protein von M. leprae codiert. Der Sequenz des 28 kDa-Gens von M. tuberculosis geht wie derjenigen von M. leprae eine Sequenz voraus, die Ähnlichkeiten mit den "Eisen"-Kammern besitzt, die sich vor den bei einem Eisenmangel exprimierten Genen befinden. Eine Eisenmangelsituation ist beim in vivo-Wachstum anzutreffen. Es wird die Hypothese aufgestellt, dass die Expression dieses Gens beim Wachstum in den Makrophagen der Bakterien induziert wird, die dieses Gen in sich haben. Darüber hinaus besitzt das 28 kDa-Protein von M. tuberculosis in seinem mittleren Teil zwei Bereiche, die Einheiten von 5 sich wiederholenden Aminosäuren im Doppel enthalten, die beim homologen Protein von M. leprae nicht vorhanden sind. Analoge Wiederholungsstrukturen wurden zuvor in wichtigen Antikörpern identifiziert, die an der Oberfläche anderer pathogener bakterieller oder parasitärer Erreger vorhanden sind, wie etwa das Protein M (40) der Streptococcacea oder das Protein CS der Plasmodiae (41).
Das ganze 28 kDa-Protein oder ein Teil des 28 kDa-Proteins von M. tuberculosis, dessen Sequenz des Gens hier dargestellt ist, könnte ein potentielles Schutz-Antigen zum Aufbau eines Antituberkuloseimpfstoffs sein. Ein solches Antigen könnte durch Aufreinigung aus Zellextrakten von M. tuberculosis oder aus Zellextrakten heterologer, genetisch rekombinierter Organismen gewonnen werden. Darüber hinaus könnte das 28 kDa-Protein von M. tuberculosis oder davon derivierter Peptide ein Antigen sein, das sich in ELISA-Tests zur Erkennung Tuberkulosekranker einsetzen lässt.
Als das 28 kDa-Gen von M. tuberculosis als Sonde verwendet wurde, wurde eine Hybridisierung unter erhöhten Härtebedingungen nur mit genomischer DNA der Stämme beobachtet, die dem Komplex M. tuberculosis angehörten. Infolgedessen ist die Sequenz, die dem 28 kDa-Gen von M. tuberculosis entspricht, eine spezifische Sequenz, die für Erfassungstests der Bazillen der Tuberkulose verwendet werden kann, indem DNA- oder RNA-Sonden und Genamplifikationsmethoden in vitro eingesetzt werden.
Der Regulatorbereich und das 28 kDa-Gen von M. tuberculosis können als Trägermoleküle verwendet werden, um heterologe Antigene im BCG oder irgendeinem anderen zum Aufbau von Impfstoffen nützlichem Mykobakterienvektor zu exprimieren.
III) Expression von Mykobakteriengenen; Auswertung verschiedener Expressionspromoter
Ein wichtiger Gesichtspunkt der erhaltenen Resultate betrifft den Aufbau von genetischen Hilfsmitteln zum Studium der Expression von Genen bei den Mykobakterien. Im Stand der Technik wurden Regulator-/Sonden-Sequenzvektoren verwendet, um die Regulatorsequenzen bei einer großen Anzahl von Bakterien zu isolieren und zu analysieren. Die durch die Erfinder vorgenommene Definition solcher für Mykobakterien spezifische Hilfsmittel erleichtert das Studium der genetischen, die Virulenz bei den pathogenen Spezies regulierenden Mechanismen und die Isolierung neuer Regulatorsequenzen, die für die Einstellung verbesserter rekombinanter BCG-Impfstoffe nützlich wären.
Zu Beginn wurde die Expression von Mykobakteriengenen in heterologen. Systemen von Escherichia coli und Streptomyces lividans untersucht (46), (51), (60). Diese Analysen legen nahe, dass die meisten mykobakteriellen Gene bei S. lividans wirksamer exprimiert sind als bei E. coli. Später wurden Vektoren auf Grundlage von Mykobakterienplasmiden konstruiert, die für Studien in homologen Systemen verwendet werden könnten. Die Vektoren pYUB75 und pYUB76 wurden konzipiert, um Genfusionen mit einem verkürzten lacZ-Gen von Escherichia coli zu selektionieren (42). Das Plasmid pSD7 ermöglicht den Aufbau von Operonen-Fusionen mit einem Gen der Chloramphenicol-Acetyltransferase (CAT) ohne Promoter (47). Indem diese Vektoren verwendet wurden, wurde eine bestimmte Anzahl mykobakterieller Regulatorsequenzen gleichzeitig bei E. coli und Mycobacterium smegmatis isoliert und ausgewertet.
Die Erfinder haben weitere Vektorkonstruktionen der Reihe pJEM beschrieben, die mehrere Vorteile haben: sie enthalten einen Transkriptionsterminator, geeignete multiple Klonierungsstellen, und sie ermöglichen zugleich Fusionen von Operonen und Genen mit lacZ. lacZ wurde als Reportergen gewählt, weil das codierte Enzym, die β-Galactosidase, aktiv bleibt, wenn die heterologen Sequenzen mit seinem amino-terminalen Ende fusioniert sind (45), (64). Seine Aktivität kann selbst bei sehr niedrigen Pegeln mittels fluoreszierender Verbindungen leicht in vitro gemessen werden (48). Die β-Galactosidase ist ebenfalls stark immunogen. Nachdem sie dem Immunsystem von Mäusen präsentiert wird, induziert sie gleichzeitig humorale und zelluläre Immunantworten durch rekombinante Bakterien (44), (56). Somit kann die β-Galactosidase auch als Reporter für das Immunogenvermögen eines rekombinanten Impfstoffs verwendet werden. Wenn die pJEM-Vektoren verwendet werden, könnten neue bei BCG aktive Regulatorsequenzen isoliert und die rekombinanten BCG-Stämme leicht auf ihrer Fähigkeit hin getestet werden, Immunantworten bei der Maus zu induzieren.
Es wurde auch eine Vergleichsstudie über die Aktivitäten verschiedener Promoter bei M. smegmatis und BCG durchgeführt. Die Resultate lassen den Schluss zu, dass die RNA-Polymerasen von M. smegmatis und BCG nicht über dieselbe Spezifität verfügen.
Aufbau von pJEM-Vektoren. Idealerweise sollte ein Promoter-/Sonden-Plasmidvektor fünf Elemente enthalten: i) ein Replikon, ii) einen Selektionsmarker und eine Reporter- Kassette, die Folgendes enthält: iii) einen Transkriptionsterminator, gefolgt von iv) multiplen Klonierungsstellen (MCS – multicloning sites), und v) ein Reportergen, das frei von seinen Regulationssequenzen ist.
Um einen Promoter-Klonierungsvektor der Mykobakterien zu konstruieren, haben wir das Replikon, das vom Plasmid pAL5000 von Mycobacterium fortuitum abgeleitet ist, und das Resistenzgen gegen Kanamycin (aph) von Tn903 (58) verwendet. Diese genetischen Elemente sind Grundbestandteile der meisten Plasmide, die gegenwärtig für die Transformation von Mykobakterien verwendet werden. Sie scheinen den transformierten Klonen von M. smegmatis und M. bovis BCG zugleich in vitro als auch in vivo (bei der Maus) selbst ohne Selektion durch Antibiotika eine hohe Stabilität zu verleihen (56). Um die Herstellung und Handhabung von episomaler DNA zu erleichtern, enthalten die meisten dieser Plasmide auch ein Replikon von E. coli. Also haben wird das Plasmid pRR3 gewählt, einen Shuttle-Vektor von E. coli-Mykobakterien, der diese drei genetischen Elemente als Basisvektor enthält (58).
Es wurde noch kein mykobakterieller Transktiptionsterminator charakterisiert. Um zu untersuchen, ob der Transkriptionsterminator des Coliphage T4 (tT4) als Abbruchstelle für die RNA-Polymerasen von Mykobakterien aktiv ist, wurde das Omega-Interposon (57) im gJN3-Plasmid vor dem Element sRBS-cII-lacZ kloniert, wodurch pJN11 entstand (11). Das Omega-Fragment setzt sich aus einem Resistenzgen gegen Streptomycin/Spectinomycin zusammen, das von kurzen inversen Repetitionen eingerahmt ist, die tT4 enthalten. Das Einfügen von Omega in ein DNA-Fragment führt zum Abbruch der RNA-Synthese bei E. coli (57). pJN3 wurde konstruiert, indem in die ScaI-Stelle von pRR3 eine Kassette, die aus einem verkürzten lacZ bestand, das mit einem Synthese-RBS (sRBS) assoziiert war, und das 5'-Ende des Regulatorgens cII des Lambda-Phage und der Promoter pL kloniert wurden. M. smegmatis mc2155 (61) wurde mit pJN3 (pL-sRBS-cII-lacZ) oder pJN11 (pL-X-sRBS-cII-lacZ) durch Elektroporation transformiert, und die Trans formationsklone wurden nach Wachstum auf LB-Xgal-Platten markiert. Die pJN3 enthaltenden Transformationsklone ergaben blaue Kolonien, und die pJN11 enthaltenden Transformationsklone ergaben weiße Kolonien. Die Aktivität der β-Galactosidase bei M. smegmatis (pJN11) war 50 Mal niedriger als die bei M. smegmatis (pJN3) (Tabelle 2). Somit wirkt tT4, das im X-Insert enthalten ist, als wirksamer Transkriptionsterminator bei M. smegmatis.
Ein DNA-Fragment, welches das Segment tT4 enthielt, gefolgt vom Element sRBS-cII-lacZ von pJN11, wurde in vitro mittels Amplifikation durch PCR synthetisiert, und es wurde eine MCS (MCS1) hinzugefügt, die 6 einmalige Restriktionsstellen enthielt. Die sich ergebende Kassette wurde dann in die ScaI-Stelle von pRR3 kloniert, was den Operonen-Fusionsvektor pJEM15 ergab (12). Die Elektroporation von M. smegmatis MC²155 und des BCG mit diesen Plasmid führte zu weißen Kolonien auf den LB-Xgal-Platten mit einer sehr schwachen Aktivität der β-Galactosidase (Tabelle 2). Bei E. coli hingegen exprimierte pJEM15 eine höhere Aktivität der β-Galactosidase und infolgedessen eine Blaufärbung auf den LB-Xgal-Platten. Dies ist wahrscheinlich auf seine hohe Kopienanzahl zurückzuführen. Bei E. coli sind pUC-Vektoren in einer hohen Kopienanzahl (über 500) vorhanden, während bei den Mykobakterien die von pAL5000 abgeleiteten Replikationseinheiten eine Kopienanzahl von ungefähr 3 bis 10 haben (50). Der Test von DNA-Fragmenten auf die Promoter-Aktivität mit Hilfe von pJEM15 durch Blau-Weiß-Screening muss direkt an den Mykobakterien durchgeführt werden.
Um Vektoren zu erhalten, die Fusionen von Genen mit lacZ ermöglichen, haben wir eine ähnliche Strategie verfolgt. Die drei Formen von verkürztem lacZ der Reihe pNM480 (55), die sich voneinander durch die "Translationsphaseneinstellung" einer HindIII-Stelle unterscheiden, die sich an ihrem 5'-Ende ansiedelt, wurden vor dem tT4 und einer MCS (MCS2), die 7 einmalige Restriktionsstellen enthielt, in die ScaI-Stelle von pRR3 kloniert. Die sich ergebenden Plasmide pJEM12-13-14 (12) erlauben somit die Klonierung eines großen Bereichs von mit lacZ phasengleichen Restriktionsfragmenten.
Auswertung verschiedener Promoter bei M. smegmatis und BCG. Operonenfusionen zwischen der Reporterkassette cII-lacZ von pJEM15 und den Promotern pAN (56), pblaF* (63), psul3 (52) und pgroES/EL1 (49) wurden gebildet. Die Aktivität dieser Promoter wurde bei M. smegmatis und bei M. bovis BCG ausgewertet. Die ersten drei Promoter wurden aus mykobakteriellen Spezies isoliert: pblaF* ist ein Mutant erhöhter Expression von pblaF, der die Expression des Gens der β-Lactamase von M. fortuitum leitet; pAN ist ein Promoter von M. paratuberculosis, und psul3 ist ein Bestandteil des beweglichen genetischen Elements von M. fortuitum, Tn610. Diese Promoter wurden auf Grundlage der Kartografie von Transkriptionsstartstellen (pblaF* und pAN) oder durch Deletionsanalyse (psul3) lokalisiert (62). pgroES/EL1 ist ein Promoter von Streptomyces albus, der die Expression des Operons groES/EL1 reguliert und gleichzeitig bei M. smegmatis und dem BCG aktiv ist (65).
Die Klonierungsversuche wurden direkt an M. smegmatis durchgeführt. DNA-Fragmente, die jeweils Promoter enthielten, wurden – verdaut durch die geeigneten Restriktionsenzyme – isoliert und in MCS1 von pJEM15 eingesetzt. Die sich ergebenden Ligationen wurden verwendet, um M. smegmatis mc2155 durch Elektroporation zu transformieren, und weiße Kolonien wurden selektioniert, um E. coli MC1061 (45) wie zuvor schon beschrieben (43) durch Elektroporation permeabel zu machen. Die Plasmide wurden aus diesen Klonen von E. coli isoliert und analysiert. Diejenigen, die den angestrebten Bauformen pJN29 bis pJN32 entsprachen (Tabelle 2) wurden für die Elektroporation von BCG (Pasteur-Stamm) verwendet.
Die Aktivität der β-Galactosidase wurde quantitativ an sonifizierten Extrakten von M. smegmatis und BCG bestimmt (Tabelle 2). Die Aktivität der Promoter variierte sowohl zwischen den Promotern bei einem mykobakteriellen Wirt als auch zwischen den Wirten für jeden Promoter erheblich. Die relative Stärke dieser Promoter war bei M. smegmatis und BCG nicht dieselbe. Obwohl pblaF* zugleich bei M. smegmatis und BCG der stärkste Promoter war, ist die Situation bei den anderen Promotern anders: pAN und pgroES/EL1 waren bei BCG aktiver als psul3, aber bei M. smegmatis war psul3 aktiver als pAN oder pgroES/EL1.
Das Gupta und seine Mitarbeiter (47) haben DNA-Banken von M. smegmatis und M. tuberculosis auf die Promoteraktivität bei M. smegmatis hin durchsucht. Sie wiesen auf eine in der DNA von M. smegmatis 10 bis 20 mal höhere Prornoterfrequenz hin. Außerdem waren sehr aktive Promoter in den DNA-Banken von M. tuberculosis seltener als in denjenigen von M. smegmatis. Diese Autoren deuteten an, dass die Promoter von M. tuberculosis erheblich von denjenigen von M. smegmatis divergiert haben könnten. Die hier dargelegten Ergebnisse legen nahe, dass der Transkriptionsmechanismus von M smegmatis und M. bovis BCG, einer eng verwandten Spezies von M. tuberculosis, verschieden sein kann.
Letzten Endes erleichtert die Familie der konstruierten Vektoren das Studium der Expression von Gegen bei den Mykobakterien. Eine große Skala an Fragmenten kann ohne Weiteres phasengleich mit lacZ (Fusion von Genen) oder vor cII-lacZ (Fusion von Operonen) kloniert und auf die Promoteraktivität durch Blau-Weiß-Screening von mykobakteriellen Transformanten auf LB-Xgal-Platten hin ausgewertet werden. Die Aktivität dieser Promoter kann auch (durch quantitative Bestimmung der Aktivität der β-Galactosidase) gemessen, ihre Sequenzen bestimmt, und ihre Transkriptionsstartstelle (durch Analyse der Initiatorausdehnung) kartografiert werden, indem "der Universalinitiator" verwendet wird oder verwandte Sequenzen (53) als Initiator verwendet werden.
IV) Expression des Proteins ERP in rekombinanter Form bei E. coli
Das Protein ERP wurde bei E. coli in rekombinanter Form exprimiert und durch Affinitätschromatographie aufgereinigt. Zwei Arten von Fusionen zwischen ERP und den Peptidfragmenten, die eine starke Affinität zu bestimmten chromatografischen Unterlagen (Amylose, MalE-System; Nickel (Ni²⁺)-Chelat für das Histidin-System) haben, wurden hergestellt. Es handelt sich um:

– ERP ohne seine Signalsequenz, am C-terminus mit dem Maltosebindeprotein (MalE) von E. coli fusioniert (MalE-ERP);
– ERP ohne seine Signalsequenz (ERP(His)₆ ss) oder in seiner Gänze (ERP(His)₆), mit 6 Histidin-Aminosäuren am C-terminus.

Nach der Aufreinigung ergab die Analyse dieser drei Fusionsproteine in PAGE-SDS-Elektrophorese, dass das ERP-Polypeptid ein relatives Molekulargewicht (MG) von 36 kDa besaß. Es besteht ein großer Unterschied zwischen dem Molekulargewicht (MG), das anhand der Sequenz berechnet wurde (28 kDa), und dem experimentell festgestellten MG (36 kDA). Diese Verzögerung in der elektrophoretischen Auftrennung könnte vom starken Gehalt an Prolinresten oder von posttranslationellen Modifizierungen herrühren.
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62. Timm, J. et al. Unpublished data.

Tabelle 1

Stamm/Plasmid	Relevante Merkmale Referenz
E. coli XL1-Blue	supE44 hsdR17 recA1 gyrA46 thi relA1 lac F'
	27
M. smegmatis mc²155	hochtransformante Mutante von M. smegmatis ATCC607
	30
pRR3	E. coli-Mykobakterien-Shuttle-Vektor
	26
pPHO7	pUC-Derivat mit einem verkürzten phoA-Gen
	11
pNM480	pUC-Derivat mit einem verkürzten lacZ-Gen
	18
pJEM11	E. coli-Mykobakterien-Shuttle-Vektor mit einem verkürzten
phoA-Gen	diese Arbeit
pLA71	pJEM11, in das ein 1,384 bp-Fragment von blaF* geklont war
	34, diese Arbeit
pLA72	pJEM11, in das ein 1,550 bp-Fragment von blaF* geklont war
	34, diese Arbeit
pLA73	pJEM11, in welches das komplette blaF* geklont war
	34, diese Arbeit
pExp410	pJEM11, in welches ein Teil des 19 kDa-Antigen-Gens von
M. tuberculosis	diese Arbeit
	geklont war
pExp53	pJEM11, in welches ein Teil eines Gens von M. tuberculosis
geklont war,	diese Arbeit
	das dem 28 kDa-Antigen des Gens von M. leprae ähnlich ist
pExp59	pJEM11, in welches die Signalsequenz eines unidentifizierten
Gens von	diese Arbeit
	M. tuberculosis geklont war
PExp421	pJEM11, in welches ein Gen von M. tuberculosis geklont war,
das für ein Protein	diese Arbeit
	mit Desaturasen ähnlichen Aminosäureeinheiten codiert

Claims

Nucleotidsequenz, die aus einem Gen stammt, das für ein aus M. tuberculosis isoliertes Protein codiert, dadurch gekennzeichnet, dass sie aus den folgenden Sequenzen ausgewählt ist: • einer Sequenz IA, die der in 6A dargestellten Nucleotidkette entspricht, oder einer Sequenz UB, die einer in 6B dargestellten Nucleotidkette entspricht, oder einer Sequenz, die für ein aus M. tuberculosis isoliertes Protein codiert und unter erhöhten Härtebedingungen mit einer Sequenz IA oder IB hybridisiert, • einer Sequenz, welche die Nucleotidkette IA umfasst, oder die Nucleotidkette IB umfasst, und für ein Protein P28 von M. tuberculosis codiert, das ein theoretisches Molekulargewicht von ca. 28 kDa hat, • einer Sequenz, die in der Sequenz IA oder in der Sequenz IB enthalten ist und für ein Polypeptid codiert, das durch die gegen das Protein P28 von M. tuberculosis gerichteten Antikörper erkannt wird, das der in 6A dargestellten Aminosäurekette VIIIA oder der in 6B dargestellten Aminosäurekette VIIIB entspricht, • einer Sequenz IV, welche die Regulatorsequenzen des Gens umfasst, das die codierende Sequenz IA oder die codierende Sequenz IB umfasst, wobei diese Sequenzen in den in 7A und 7B dargestellten Vorläufer- und Nachläufernucleotidsequenzen enthalten sind, • einer Sequenz V, die der Kette entspricht, die unter den Nucleotiden 1 bis 72 der Sequenz IA oder der Sequenz IB enthalten ist und der Signalsequenz entspricht, • einer Sequenz VI, die der Kette entspricht, die unter den Nucleotiden 62 bis 687 der Sequenz IA oder der Sequenz IB enthalten ist, • einer Sequenz VII, die der Kette entspricht, die unter den Nucleotiden 688 bis 855 der Sequenz IA oder der Sequenz IB enthalten ist.
Polypeptid von M. tuberculosis, dadurch gekennzeichnet, dass es der Aminosäurekette VIIIA oder der Aminosäurekette VIIIB entspricht, die in 6A bzw. 6B dargestellt sind, und dass es diese Kette enthält.
Polypeptid nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass es ein theoretisches Molekulargewicht von ca. 28 kDa hat.
Polypeptid nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass es ein beobachtetes Molekulargewicht von ca. 36 kDa hat, das durch elektrophoretische Auftrennung in denaturierendem Polyacrylamidgel (PAGE-DOS) bestimmt wird.
Polypeptid, dadurch gekennzeichnet, dass es einen Teil der Aminosäurekette VIIIA oder der Aminosäurekette VIIIB nach dem Anspruch 2 umfasst, und dass es immunologisch mit den Antikörpern reagiert, die gegen das Protein P28 von M. tuberculosis gerichtet sind, das der Aminosäurekette VIIIA oder der Aminosäurekette VIIIB entspricht.
Polypeptid nach Anspruch 2, 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, dass es eine oder mehrere der folgenden Ketten umfasst: PGLTS, PGLTD, PGLTP, PALTN, PALTS, PALGG, PTGAT, PTGLD, PVGLD.
Polypeptid nach einem der Ansprüche 2 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass eine oder mehrere der folgenden Ketten: PGLTS, PGLTD, PGLTP, PALTN, PALTS, PALGG, PTGAT, PTGLD, PVGLD durch eine Aminosäuresequenz eines Epitops oder eine Antigendeterminante eines bestimmten pathogenen Organismus ersetzt wird.
Monoklonale Antikörper oder polyklonales Serum, die/das sich gegen ein Polypeptid nach einem der Ansprüche 2 bis 7 richten/richtet.
Zusammensetzung für die in vitro- oder in vivo-Erfassung einer Infektion durch M. tuberculosis, dadurch gekennzeichnet, dass sie ein Polypeptid nach einem der Ansprüche 2 bis 7 umfasst, das in der Lage ist, immunologisch mit den Antikörpern zu reagieren, die sich bei einem durch M. tuberculosis infizierten Patienten gebildet haben.
Zusammensetzung zur in vitro-Erfassung einer Infektion durch M. tuberculosis, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Nucleotidsequenz umfasst, die mindestens 9 Nucleotide enthält, die aus einer Sequenz nach Anspruch 1 stammen, oder eine Nucleotidsequenz, die mindestens 9 Nucleotide enthält und unter Härtebedingungen mit der DNA von M. tuberculosis hybridisiert und unter denselben Bedingungen mit der DNA von M. leprae nicht hybridisiert, wobei diese Sequenz eine gegebenenfalls markierte DNA oder RNA ist.
Verwendung eines Polypeptids oder einer Aminosäuresequenz nach einem der Ansprüche 2 bis 7 als Trägermolekül.
Prokaryotischer oder eukaryotischer Zellwirt, dadurch gekennzeichnet, dass er durch eine Nucleotidsequenz nach Anspruch 1 unter Bedingungen transformiert wird, welche die Expression dieser Sequenz und/oder ihre Exposition im Bereich der Membran des Zellwirts und/oder ihren Transfer und/oder ihre Sezernierung aus der vorgenannten Membran zulässt.
Zellwirt nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um ein Mycobakterium, beispielsweise eines Stamms von M. smegmatis, M. tuberculosis oder M. bovis handelt.
Immungenetische Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, dass sie ein Polypeptid nach einem der Ansprüche 2 bis 7 oder einen Zellwirt nach einer der Ansprüche 12 oder 13 umfasst.