ES2301162T3 - Vectores de cribado y/o de expresion funcional en micobacterias. - Google Patents

Abstract

LA INVENCION SE REFIERE A UN VECTOR RECOMBINANTE DE CRIBADO Y/O DE CLONAGE Y/O DE EXPRESION, CARACTERIZADO EN LO QUE SE REPLICA EN LAS MICOBACTERIAS, 2) UN MARCADOR DE SELECCION; 3) UNA CINTA TRANSPORTADORA QUE CONTIENE A) UN SITIO DE CLONAGE MULTIPLE (POLYLINKER), B) UN TERMINADOR DE TRANSCRIPCION ACTIVO EN LAS MICOBACTERIAS, SITUADAS MAS ARRIBA DEL POLYLINKER, Y C) UNA SECUENCIA NUCLEOTICA CODIFICANTE USADA DE UN GEN CODIFICANTE POR UN MARCADOR DE EXPRESION Y/O DE EXPORTACION Y/O DE SECRECION DE PROTEINAS, LA DICHA SECUENCIA NUCLEOTICA QUE ESTA DESPROVISTA DE SU CODON DE INICIACION T DE SUS SECUENCIAS DE REGULACION. ESTE VECTOR ES USADO PARA LA IDENTIFICACION Y LA EXPRESION DE LOS POLIPEPTIDOS EXPORTADOS, TAL COMO EL ANTIGEN P28 DE MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS

Description

Vectores de cribado y/o de expresión funcional en micobacterias.

El género Mycobacterium incluye patógenos humanos importantes como M. leprae y M. tuberculosis, los agentes responsables de la lepra y de la tuberculosis, que siguen siendo problemas graves de salud pública en todo el mundo.

M. bovis y M. tuberculosis, los agentes causales de la tuberculosis, son bacterias facultativas intracelulares. A pesar de los problemas importantes de salud vinculados a estos organismos patógenos, se saben pocas cosas de sus proteínas exportadas y/o secretadas. Los análisis en SDS-PAGE de filtrado de cultivo de M. tuberculosis muestran al menos 30 proteínas secretadas (1, 19, 38). Algunas de ellas han sido caracterizadas, y sus genes clonados y secuenciados (7, 35, 37).

Otras, aunque se trate de antígenos inmunodominantes de importancia mayor para inducir una inmunidad protectora (2, 21), no están totalmente identificadas. Además, es probable que numerosas proteínas exportadas sigan quedando fijadas en la membrana celular y en consecuencia no estén presentes en los sobrenadantes de cultivo. Sé ha demostrado que las proteínas localizadas en la superficie externa de diversas bacterias patógenas, como la invasina de 103 kDa de Yersina pseudotuberculosis (14) o la internalina de 80 kDa de Listeria monocytogenes (10) desempeñan un papel importante en las interacciones con las células huésped y en consecuencia, tanto en la patogenia como en la inducción de respuestas protectoras. Así, una proteína ligada a la membrana podría ser importante tanto para la infección por M. tuberculosis como para la inducción de respuesta protectora contra esta infección. Estas proteínas podrían revestir un interés cierto para la preparación de vacunas.

El BCG (Bacilo de Calmette y Guérin), una cepa avirulenta derivada de M. bovis, ha sido muy usada como vacuna contra la tuberculosis. Es asimismo un vector muy interesante para la construcción de vacunas recombinantes vivas, en particular por motivo de su poder inmunogénico fuerte. En consecuencia, el estudio de la biología molecular de las micobacterias suscita actualmente mucho interés.

El desarrollo de nuevas vacunas contra las micobacterias patógenas o la mejora de las vacunas disponibles necesitaban la puesta a punto de herramientas específicas que permitan aislar u obtener secuencias de polipéptidos inmunogénicos.

Los autores de la invención han definido y realizado con este fin nuevos vectores que permiten el cribado de secuencias de ADN de micobacterias con el fin de identificar entre estas secuencias ácidos nucleicos que codifiquen proteínas de interés.

Se han definido vectores para evaluar la eficacia de secuencias de regulación de la expresión dentro de micobacterias.

La invención se refiere también a nuevos polipéptidos de micobacterias que hayan podido aislarse por medio de los vectores precedentes y susceptibles de entrar en la realización de composiciones para la detección de una infección por micobacterias, o para la protección contra una infección debida a micobacterias.

La solicitud describe un vector recombinante de cribado y/o de clonación y/o de expresión, caracterizado porque se replica en micobacterias, porque contiene

- 1) un replicón funcional en las micobacterias;

- 2) un marcador de selección;

- 3) un casete indicador que comprende

a)

un sitio de clonación múltiple (poliligador),

b)

un terminador de transcripción activo en las micobacterias, en sentido directo del poliligador, y

c)

una secuencia nucleotídica de codificación obtenida de un gen que codifica un marcador de expresión, y/o de exportación y/o de secreción de proteína, estando dicha secuencia nucleotídica desprovista de su codón de inicio y de sus secuencias de regulación.

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El marcador de exportación y/o de secreción es una secuencia de nucleótidos cuya expresión seguida de la exportación y/o de la secreción depende de los elementos de regulación que controlan su expresión.

Por "secuencias o elementos de regulación de la expresión", se entiende una secuencia promotora de la transcripción, una secuencia que comprende el sitio de unión al ribosoma (RBS), las secuencias responsables de la exportación y/o la secreción tal como la secuencia denominada secuencia señal.

Un primer marcador interesante de exportación y/o de expresión es una secuencia de codificación obtenida del gen phoA. En su caso, está truncada de tal manera que la actividad de la fosfatasa alcalina, sin embargo, es susceptible de ser restaurada cuando la secuencia de codificación truncada se coloca bajo el control de un promotor y de elementos de regulación apropiados.

Pueden usarse otros marcadores de exposición y/o de exportación y/o de secreción. Se citará a modo de ejemplo una secuencia del gen de la \beta-agarasa o de la nucleasa de un estafilococo o de la \beta-lactamasa de una micobacteria.

El terminador de transcripción debe ser funcional en las micobacterias. Un terminador ventajoso a este respecto es el terminador del colifago T4 (tT4). Pueden aislarse otros terminadores apropiados para la realización de la invención usando la técnica presentada en los ejemplos, por ejemplo por medio del vector pJN3.

Un vector concreto descrito es el plásmido pJEM11 depositado el 3 de noviembre de 1993 en la CNCM (Colección Nacional de Cultivos de Microorganismos de París - Francia) con el n° I-1375.

Para la selección o identificación de secuencias de ácidos nucleicos de micobacterias que codifican productos susceptibles de ser incorporados a composiciones inmunogénicas o antigénicas para la detección de una infección por micobacterias, el vector descrito comprenderá, en uno de los sitios del poliligador, una secuencia de nucleótidos de una micobacteria en la que se busca la presencia de secuencias reguladoras asociadas en todo o en parte a un gen de interés que permitan, cuando el vector que transporta estas secuencias (vector recombinante) se integra o se replica en un huésped celular tipo micobacteria, obtener la exposición en la membrana o la pared celular del hospedador y/o la exportación y/o la secreción del producto de expresión de dicha secuencia de nucleótidos.

La secuencia en cuestión de micobacterias puede ser toda secuencia en la que se busque detectar si contiene elementos de regulación de la expresión asociados a todo o parte de un gen de interés y susceptibles de permitir o favorecer la exposición en la membrana celular de un hospedador en la cual se expresará y/o la exportación y/o la secreción de un producto de expresión de una secuencia de codificación dada y a modo de ensayo del marcador de exportación y/o de secreción.

Preferentemente, esta secuencia se obtiene por digestión enzimática del ADN genómico o del ADN complementario de un ARN de una micobacteria y preferentemente de una micobacteria patógena.

Según una primera forma de realización del vector descrito, la digestión enzimática del ADN genómico o del ADN complementario se efectúa a partir de M. tuberculosis.

Preferentemente este ADN se digiere con un enzima como sau3A.

Naturalmente, pueden implementarse otros enzimas de digestión como ScaI, ApaI, ScaII, KpnI o incluso exonucleasas o polimerasas, siempre que permitan la obtención de fragmentos cuyas extremidades puedan insertarse en uno de los sitios de clonación del poliligador del vector de la invención.

En su caso, se efectuarán simultáneamente digestiones con diferentes enzimas.

Los vectores recombinantes descritos se eligen entre los vectores recombinantes siguientes depositados en la CNCM el 8 de agosto de 1994:

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pExp53 depositado en la CNCM como n° I-1464

pExp59 depositado en la CNCM como n° I-1465

pExp410 depositado en la CNCM como n° I-1466

pExp421 depositado en la CNCM como n° I-1467.

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Los vectores de la invención pueden usarse igualmente para determinar la presencia de secuencias de interés, según lo que se ha expuesto anteriormente, en micobacterias como M. africanum, M. bovis, M. avium o M. leprae para las que se habrá tratado el ADN o el ADNc con enzimas determinados.

La solicitud describe también un procedimiento de cribado de secuencias de nucleótidos obtenidas de micobacterias para determinar la presencia dentro de estas secuencias de elementos de regulación que controlan la expresión en un huésped celular de secuencias de ácido nucleico que las contienen, y/o la exposición en la superficie del huésped celular, y/o la exportación y/o la secreción de secuencias polipeptídicas que proceden de la expresión de dichas secuencias de nucleótidos, caracterizado porque comprende las etapas siguientes:

a)

la digestión de secuencias de ADN de micobacterias por al menos un enzima determinado y la recuperación de los fragmentos de digestión obtenidos,

b)

la inserción de los fragmentos de digestión en un sitio de clonación compatible con el enzima de la etapa a) del poliligador de un vector anterior,

c)

en caso necesario, la amplificación del fragmento de digestión contenido en el vector, por ejemplo por replicación de este último después de inserción del vector así modificado en una célula determinada, por ejemplo E. coli,

d)

la transformación de huéspedes celulares con el vector amplificado en la etapa c), o en ausencia amplificación, por el vector de la etapa b),

e)

el cultivo de huéspedes celulares transformados en un medio que permite la puesta en evidencia del marcador de exportación y/o de secreción contenido en el vector,

f)

la detección de huéspedes celulares positivos (colonias positivas) para la expresión del marcador de exposición y/o de exportación y/o de secreción,

g)

el aislamiento del ADN de colonias positivas y la inserción de este ADN en una célula idéntica a la de la etapa c),

h)

la selección de las inserciones contenidas en el vector que permitan la obtención de clones positivos para el marcador de exportación y/o de secreción,

i)

el aislamiento y la caracterización de fragmentos de ADN de micobacterias contenidas en estos insertos.

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La puesta en marcha de este procedimiento permite la construcción de bancos de ADN que comportan secuencias susceptibles de ser exportadas y/o secretadas, cuando se producen dentro de micobacterias recombinantes.

La etapa i) del procedimiento puede comprender una etapa de secuenciación de las inserciones seleccionadas.

Preferentemente, el vector usado es el plásmido pJEM11 (CNCM I-1375) y la digestión se efectúa por medio del enzima sau3A.

El procedimiento de cribado se caracteriza, por ejemplo, porque las secuencias de micobacterias se obtienen de una micobacteria patógena, por ejemplo de M. tuberculosis, M. bovis, M. avium, M. africanum o M. leprae.

La solicitud describe también las secuencias nucleotídicas de micobacterias seleccionadas después de la realización del procedimiento descrito anteriormente.

Las secuencias seleccionadas son, por ejemplo, los fragmentos de ADN de micobacterias contenidos en los vectores pIPX412 (CNCM 1-1463 depositado el 8/08/94), pExp53, pExp59, pExp410 o pExp421.

Cuando la secuencia de codificación obtenida del gen marcador de exportación y/o de secreción es una secuencia obtenida del gen phoA, la exportación y/o la secreción del producto del gen phoA, en su caso truncado, sólo se obtiene cuando esta secuencia se inserta en fase con la secuencia colocada en sentido directo, que contiene los elementos que controlan la expresión y/o la exportación y/o de secreción obtenidos de la secuencia de micobacterias.

La solicitud describe también micobacterias recombinantes que contienen un vector recombinante descrito anteriormente. Una micobacteria preferida es una micobacteria del tipo M. smegmatis.

M. smegmatis permite probar ventajosamente la eficacia de secuencias de micobacterias, para el control de la expresión y/o de la exportación y/o de la secreción de una secuencia dada, por ejemplo de una secuencia que codifica un marcador como la fosfatasa alcalina.

Otra micobacteria interesante es una micobacteria del tipo M. bovis, por ejemplo la cepa BCG usada actualmente para la vacunación contra la tuberculosis.

La solicitud describe además una micobacteria recombinante, caracterizada porque contiene un vector recombinante definido anteriormente.

La invención tiene por objeto una secuencia de nucleótidos obtenida de un gen que codifica una proteína exportada de M. tuberculosis, caracterizada porque se selecciona entre las secuencias siguientes:

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-

una secuencia IA que responde a la cadena de nucleótidos descrita en la fig. 6A, o una secuencia IB que responde a la cadena de nucleótidos descrita en la fig. 6B, o una secuencia que codifica una proteína exportada de M. tuberculosis y que se hibrida en condiciones de restricción elevada con estas cadenas,

-

una secuencia que comprende la cadena de nucleótidos IA o IB y que codifica una proteína P28 de M. tuberculosis que tiene un peso molecular teórico de aproximadamente 28 kDa y un peso molecular observado de 36 kDa, determinado por electroforesis en gel de acrilamida desnaturalizante (PAGE-SDS)

-

una secuencia comprendida en la secuencia IA o IB y que codifica un polipéptido reconocido por anticuerpos dirigidos contra la proteína P28 de M. tuberculosis, que responde a la cadena de aminoácidos VIIIA representada en la fig. 6A o a la cadena de aminoácidos VIIIB representada en la fig. 6B,

-

una secuencia IV que comprende las secuencias reguladoras del gen que comprenden la secuencia de codificación IA o IB, estando dichas secuencias contenidas en las secuencias nucleotídicas en sentido directo y sentido inverso representadas en la fig. 7A y en la fig. 7B,

-

una secuencia V que responde a la cadena comprendida entre los nucleótidos 1 y 72 de la secuencia IA o IB y que corresponde a la secuencia señal,

-

una secuencia VI que responde a la cadena comprendida entre los nucleótidos 62 a 687 de la secuencia IA o IB,

-

una secuencia VII que responde a la cadena comprendida entre los nucleótidos 688 y 855 de la secuencia IA o IB.

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Entra igualmente en el ámbito de la invención un polipéptido de M. tuberculosis, caracterizado porque responde a la cadena de aminoácidos VIIIA o a la cadena VIIIB representadas en la fig. 6A y 6B respectivamente o porque comprende una de estas cadenas.

Un polipéptido preferido se caracteriza porque tiene un peso molecular teórico de aproximadamente 28 kDa, determinado según la técnica descrita en los ejemplos.

La proteína p28 de M. tuberculosis se ha caracterizado por su capacidad de ser exportada y, así, potencialmente localizada a través de la membrana bacteriana plasmática o la pared celular. Además, como muestran las secuencias presentadas en la fig. 6, algunos motivos peptídicos de la secuencia se repiten. Por estas razones, la proteína p28 de M. tuberculosis se designa ahora de forma más frecuente como proteína ERP y el gen que contiene la secuencia de codificación de esta proteína se denomina gen irsa o bien gen erp.

El peso molecular teórico de la proteína ERP, evaluado en 28 kDa, corresponde a un peso molecular observado experimentalmente de aproximadamente 36 kDa (migración electroforética en gel de poliacrilamida desnaturalizante (PAGE-DOS)).

Otro polipéptido interesante en el ámbito de la invención comprende una parte de la cadena VIII o VIIIB de aminoácidos descrita anteriormente y reacciona inmunológicamente con anticuerpos dirigidos contra la proteína p28 de M. tuberculosis.

Son secuencias de aminoácidos en particular interesantes en el ámbito de la invención las secuencias que comprenden una de las cadenas siguientes en una o varias copias:

PGLTS, PGLTD, PGLTP, PALTN, PALTS, PALGG, PTGAT, PTGLD, PVGLD.

Otras secuencias interesantes son, por ejemplo, la secuencia señal comprendida entre las posiciones de nucleótidos 1 y 72 de la secuencia de la fig. 6A o 6B o incluso la secuencia comprendida entre los nucleótidos 688 y 855 susceptible de comportarse como una secuencia transmembrana.

Estas secuencias polipeptídicas pueden expresarse en forma de polipéptidos recombinantes. En estos polipéptidos recombinantes, pueden ser sustituidas en la parte sobre todo que concierne a las secuencias de 5 aminoácidos descritas anteriormente, por secuencias de interés que provienen de micobacterias o de otros organismos patógenos, pudiendo esta sustitución llevar a incluir, dentro de los polipéptidos recombinantes, epítopos o determinantes antigénicos de un organismo patógeno o de una proteína de interés contra el cual (la cual) se pretendería obtener anticuerpos.

Así, los polipéptidos de la invención, aún presentando ellos mismos propiedades antigénicas, es decir inmunogénicas, pueden usarse como moléculas portadoras interesantes para preparar, en su caso, vacunas que tienen propiedades variadas.

La invención tiene igualmente por objeto anticuerpos monoclonales o sueros policlonales dirigidos contra un polipéptido según se ha definido anteriormente.

Tratándose de anticuerpos monoclonales, se dirigen preferentemente específicamente contra un polipéptido de la invención y no reconocen, por ejemplo, la proteína p28 de M. leprae.

La invención tiene también por objeto una composición para la detección in vitro de una infección por M. tuberculosis, caracterizada porque comprende un polipéptido definido anteriormente, capaz de reaccionar inmunológicamente con anticuerpos formados en un paciente infectado por M. tuberculosis.

Otra composición para la detección in vitro de una infección por M. tuberculosis se caracteriza por una secuencia de nucleótidos que contiene al menos 9 nucleótidos obtenida de una secuencia definida anteriormente, o una secuencia de nucleótidos que contiene al menos 9 nucleótidos y que se hibrida en condiciones restrictivas con el ADN de M. tuberculosis y que no se hibrida en las mismas condiciones con el ADN de M. leprae, siendo esta secuencia una secuencia de ADN o de ARN, en su caso marcada.

La invención tiene también por objeto un huésped celular procariota o eucariota caracterizado porque se transforma con una secuencia de nucleótidos como la descrita en las páginas precedentes, en condiciones que permiten la expresión de esta secuencia y/o su exposición en la membrana del huésped celular y/o su exportación y/o su secreción a partir de dicha membrana.

De modo preferido, los huéspedes celulares son micobacterias tales como M. smegmatis o M. bovis BCG.

Otros huéspedes celulares son, por ejemplo, E. coli, células CHO, BHK, Spf9/Baculovirus, levaduras como Saccharomyces cerevisiae, el virus de la vacuna.

La invención tiene también por objeto una composición inmunogénica que comprende un polipéptido según se describe más arriba o un huésped celular según se define anteriormente.

La solicitud describe además un vector para cribado y/o clonación y/o expresión de secuencias de nucleótidos funcionales en micobacterias, derivado de un vector descrito anteriormente y caracterizado porque la secuencia de codificación obtenida de un gen que codifica un marcador de exportación y/o de secreción se sustituye por un gen indicador o una secuencia indicadora.

El gen o la secuencia indicadores pueden estar desprovistos de sus secuencias reguladoras, en particular de sus secuencias de unión al ribosoma y/o de sus secuencias que permiten la exportación y/o la secreción del marcador producido cuando el vector se incorpora a un huésped celular recombinante.

El gen o la secuencia indicadores contienen la secuencia codificante del gen lacZ o una parte de esta secuencia suficiente para que el polipéptido presente una actividad \beta-galactosidasa.

Un vector concreto se caracteriza porque comprende en uno de los sitios de clonación del poliligador, una cadena de nucleótidos que comprende un promotor y en su caso secuencias de regulación, por ejemplo para el anclaje en la superficie, la exportación o la secreción de un polipéptido que sería producido bajo el control del promotor, del que se desea evaluar la capacidad para promover o regular la expresión de una secuencia nucleotídica indicadora en micobacterias.

Los vectores concretos son plásmidos elegidos entre los plásmidos pJEM12, pJEM13, pJEM14 o pJEM15 como los presentados en la fig. 12.

Dicho vector semejante se puede usar para evaluar el interés de las secuencias de regulación de expresión o de los promotores, por ejemplo las secuencias de promotores pAN, pblaF*, psul3, pgroES/ELI.

La solicitud describe igualmente un procedimiento para determinar la actividad de una secuencia que contiene en uno de los sitios de clonación del poliligador una cadena de nucleótidos que comprende un promotor y en su caso secuencias de regulación, por ejemplo para la exposición, exportación o secreción de un polipéptido que se produciría bajo el control del promotor en micobacterias, caracterizado porque comprende las etapas de:

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-

transformación de una cepa de micobacteria, por ejemplo M. smegmatis o M. tuberculosis con un vector descrito anteriormente,

-

detección de la actividad normalmente asociada a la presencia del gen indicador o de la secuencia indicadora.

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Otras características y ventajas de la invención aparecen con la lectura de los ejemplos que siguen, así como en las figuras.

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Leyenda de las figuras

Fig. 1

Construcción de pJEM11

Ver Material y Procedimientos. pJEM11 tiene orígenes de replicación (ori) de E. coli y de micobacterias. Se trata así de un plásmido transportador. El marcador de selección es el gen de resistencia a la canamicina (Km). El gen PhoA truncado de pPH07 (22) está desprovisto de promotor, de codón de inicio y de secuencia señal, así la expresión y la exportación de PhoA dependen de la fusión traduccional con los extremos amino-terminales de otras proteínas. El terminador transcripcional (T) del casete omega evita la transcripción por "translectura" a partir de secuencias plasmídicas.

Fig. 2

Construcción de los plásmidos pLA71, pLA72 y pLA73

La inserción en el sitio Barn H1 de pJEM11 de fragmentos BlaF* (34) de 3 longitudes diferentes lleva a la expresión de proteínas de fusión con actividad phoA. Se han realizado dosificaciones colorimétricas según la técnica de Brockman y Heppel (8), con el p-nitrofenil-fosfato como sustrato. Los contenidos en proteínas se han medido con ayuda de la dosificación Bio-Rad. Las unidades arbitrarias de fosfatasa alcalina (aU) se han calculado según se describe en Material y Procedimientos.

Fig. 3

Análisis de transferencia Western de proteínas de fusión PhoA

Se han cultivado cepas de M. smegmatis transformadas en medio Beck conteniendo canamicina (20 \mug/ml). Se han solubilizado extractos totales de bacterias sonicadas mediante SDS, resueltos por SDS-PAGE y sometidos a inmunotransferencia. La preparación del suero de conejo anti-PhoA se ha descrito anteriormente (34). Se han usado anticuerpos de conejo acoplados a PhoA (Promega) y, como sustrato, una mezcla de X-P y de nitroazul de tetrazolio (BCIP-NBT, Promega) para revelar las fusiones PhoA. Columna 1: PhoA bacteriana purificada, M. smegmatis transformada por plásmidos pJEM11: columna 2, pLA71: columna 3, pLA72: columna 4, pLA73: columna 5, pExp410: columna 6, pExp53: columna 7, pExp59: columna 8, pExp421: columna 9.

Fig. 4

Secuencias nucleotídicas y de aminoácidos deducidas de los segmentos de insertos seleccionados de los plásmidos pExp410, pExp53, pExp59 y pExp421

Los clones de M. smegmatis con la actividad de la fosfatasa alcalina se han seleccionado en cajas XP/canamicina. Sus plásmidos se han amplificado en E. coli XL-1 B, y la secuencia nucleotídica de los insertos se ha determinado según se describe en Material y Procedimientos. A: pExp410 incluye una parte de la lipoproteína de 19 kDa. El marco de lectura se mantiene en la unión con phoA (Bam H1/Sau 3A). B: pExp53 incluye una parte de un gen que muestra similitudes con el antígeno de 28 kDa de M. leprae. Los aminoácidos divergentes están en caracteres gruesos. El codón de inicio de traducción es GTG. Los sitios de escisión posibles por la peptidasa señal están indicados por flechas. C: pExp59 codifica una secuencia señal característica. Un sitio de unión a los ribosomas posible (RBS) está subrayado. El sitio posible de escisión por la peptidasa señal está indicado por una flecha. D: pExp421 codifica motivos de aminoácidos conservados con proteínas de la familia de las estearoil-proteína-portadora-de acilo (ACP) desaturasas. R. com: R. communis (ricino).

Fig. 5

El gen similar al gen del antígeno de 28 kDa de M. leprae está presente en una única copia en el genoma de M. tuberculosis

El ADN genómico de M. tuberculosis se ha extraído siguiendo protocolos estándar (27), digerido por las endonucleasas Pst I, Sma I, Bst EII, Sph I, Bam HI y sometido a una migración sobre gel de agarosa al 1%. La hibridación de transferencia Southern se ha efectuado según protocolos estándar (27). La sonda marcada en 32P era un fragmento de PCR de 180 pb del inserto de pExp53.

Fig. 6

Secuencia de nucleótidos (IA y IB) y de aminoácidos (VIIIA y VIIIB) del producto del gen IRSA que codifica la proteína P28 de M. tuberculosis (se presentan dos variantes). Este gen se designa ahora por la abreviación "erp" que corresponde a la expresión proteína repetitiva exportada ("exported repetitive protein").

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Fig. 7

Secuencias de nucleótidos preliminares que flanquean el gen IRSA de M. tuberculosis

Fig. 8

Genes de bacterias para la regulación del hierro (IRG)

Fig. 9

Perfil de hidrofilia de la proteínas P28 de M. leprae y M. tuberculosis

Fig. 10

A)

Alineación de las secuencias de nucleótidos del gen que codifica las proteínas p28 de M. tuberculosis y de M. leprae.

B)

Alineación de las secuencias de aminoácidos de las proteínas p28 de M. tuberculosis y de M. leprae.

Fig. 11

Construcción de los plásmidos pJN3 y pJN11

Se muestran únicamente los sitios de restricción y elementos genéticos pertinentes. Los plásmidos pRR3 y pJN1 se han descrito en la técnica anterior (60) (58). El casete omega se ha obtenido por digestión con SmaI de pHP45X (59), seguido de la purificación de un fragmento de 2 kb en gel de agarosa usando el kit Geneclean (Bio 101 Inc.). Las técnicas estándar de ADN recombinante se han usado conforme a la descripción dada en la técnica anterior (61). En pJN3 y pJN11 se ha interrumpido el gen de la \beta-lactamasa (bla). oriE y oriM designan los orígenes de replicación de pUC (E. coli) y de pAL5000 (micobacterias), respectivamente.

Fig. 12

Estructura de los plásmidos de la serie pJEM

(A) En la representación esquemática de los plásmidos, sólo se indican los elementos genéticos pertinentes. pJEM15 es el resultado de la clonación, en el sitio ScaI de pRR3, i) de un fragmento obtenido por amplificación mediante PCR (usando OJN1:5'-AAGCTTCCGATTCGTAGAGCC-3' y OJN2:5'-GGGCTCGAGCTGCAG TGGAT
GACCTTTTGA-3' como cebadores; y pJN11 como matriz) y conteniendo tT4 y el extremo N-terminal de cII; ii) oligonucleótidos de síntesis que corresponden a MCS1; y iii) el fragmento lacZ' de HindIII-DraI de pNM480. Los pJEM12-13-14 se han obtenido por clonación del fragmento amplificado mediante PCR descrito anteriormente en el sitio ScaI de pRR3. Los oligonucleótidos de síntesis que corresponden a MCS2 se han insertado a continuación. Finalmente, cada una de las tres formas de la serie pNM480 se ha introducido en el sitio HindIII en MCS2. (B) Secuencias nucleotídicas de regiones entre el cebador OJN1 y el 8° codón de lacZ' (marcado como ****). Estas secuencias se han verificado experimentalmente. La región tT4 está subrayada y el RBS de síntesis está en negrita. La secuencia de aminoácidos del extremo N-terminal de cII se proporciona a continuación de la secuencia de ADN. Los sitios HindIII están marcados con un asterisco ya que no son únicos. Para descripciones complementarias, véase la leyenda de la fig. 11.

Ejemplos I) Identificación de penes que codifican proteínas exportadas de M. tuberculosis

Los resultados aquí comunicados describen la definición de un procedimiento genético para micobacterias para la identificación de proteínas exportadas. Esta metodología se basa en la fusión traduccional con la fosfatasa alcalina bacteriana (Phoa). Tales proteínas de fusión deben ser exportadas para que tengan actividad PhoA (6, 13, 16). Se ha usado un gen PhoA después de deleción de la región promotora, del sitio de unión a los ribosomas y del conjunto de la región que codifica la secuencia señal cuyo codón de inicio de traducción se ha usado. Así, la actividad fosfatasa alcalina es dependiente de la fusión traduccional realizada en la fase correcta de lectura con una parte de una proteína exportada. En primer lugar se describe la construcción de un vector plasmídico phoA para micobacterias y después se ha demostrado que la introducción en este vector del gen de la \beta-lactamasa exportada de M. fortuitum (blaF*) (34) conduce a la producción en M. smegmatis de proteínas de fusión que muestran actividad enzimática PhoA. A continuación se ha construido un banco de secuencias de fusión entre el ADN genómico de M. tuberculosis y el gen phoA. Se han aislado doce clones independientes que exportaban proteínas de fusión. Entre ellos, se ha podido identificar la lipoproteína exportada de 19 kDa ya descrita en M. tuberculosis, una nueva secuencia de M. tuberculosis que presenta similitudes con la proteína de 28 kDa de M. leprae, una proteína que comporta residuos de aminoácidos conservados con estearoíl-proteína-portadora de acilo (ACP) desaturasas, y otras secuencias nuevas.

Material y procedimientos Cepas bacterianas, plásmidos y condiciones de cultivo

Las cepas bacterianas y los plásmidos usados en este estudio se presentan en la tabla 1. El crecimiento de cepas de E. coli y de M. smegmatis, la electroporación, el cribado sobre gelosa que contiene 20 \mug/ml de canamicina y 20 \mug/ml de fosfato de 5-bromo-4-cloro-3-indolilo (X-P) se han realizado según se describe anteriormente (14).

M. tuberculosis, aislada de un paciente (cepa 103), se ha cultivado sobre medio sólido de Lowënstein-Jensen.

Manipulación y secuenciación de ADN

La manipulación de ADN y los análisis de transferencia Southern se han efectuado con ayuda de técnicas estándar (27). Para las determinaciones de las secuencias, los oligonucleótidos (5-GGCCCGACGAGTCCCGC-3' y 5'-TTGGGGACCCTAGAGGT-3') se han puesto en el punto de vista de la secuenciación a través de las uniones de fusión de los insertos de M. tuberculosis en pJEM11 (ver más adelante). Las secuencias de ADN plasmídico bicatenario se han determinado por el procedimiento de terminación de cadenas por didesoxi (28) usando el kit de secuenciación T7 (Pharmacia) según las instrucciones del fabricante, o con el kit de secuenciación Terminador de Ciclo Taq Dyc Desoxi (Applied Biosystems), con un sistema de PCR GeneAmp 9600 (Perkin Elmer), y se han pasado con un sistema de análisis de ADN - Modelo 373 (Applied Biosystems).

Análisis de bancos de datos

Las secuencias nucleotídicas se han comparado con las de los bancos de datos EMBL y GenBank usando el algoritmo FASTA (23) y se han analizado las secuencias de proteínas derivadas para determinar una posible similitud con las secuencias contenidas en los bancos de datos de proteínas PIR y SwissProt usando el algoritmo BLAST (1).

Construcciones de los plásmidos

pJEM11: La construcción de pJEM11 se resume en la fig. 1. Brevemente, pJEM2 se ha construido a partir del plásmido transportador pRR3 de E. coli-micobacterias (26), por inserción del fragmento lacZ truncado de pNM480 (18), de un sitio múltiple de clonación o poliligador (MCS), y del terminador transcripcional del casete omega (24). El fragmento N-terminal Eco-RV-KpnI de lacZ se sustituye por el fragmento phoA truncado de pPHO7 (11), sin codón de inicio o de secuencia señal para dar pJEM10. Finalmente, se ha eliminado un codón de inicio potencial en el MCS para dar pJEM11.

pLA71, pLA72, y pLA73: Fragmentos de longitud diferente de blaF*(34) obtenidos por amplificación mediante PCR se han insertado en el sitio Bam H1 de pJEM11 para dar pLA71, pLA72, y pLA73 (fig. 2). Los oligonucleótidos (Genset, Paris) usados para la amplificación mediante PCR fueron. directo 5'-CGGGATCCTGCTCGGCG
GACTCCGGG-3' e inverso 5'-CGGGATCCGGTCATCGATCGGTGCCGCGAA-3',5'- CGGGATCCCGCCGTGC
TCGG CCATCTGCAG 3' y 5'-CGGGATCCAGAGTAAG GACGGCAGCACCAG-3', para pLA71, pLA72 y pLA73 respectivamente. Las amplificaciones mediante PCR se han efectuado en un Ciclador Térmico de ADN (Perkin Elmer), usando la Taq polimerasa (Cetus), según las recomendaciones del fabricante.

Construcción de bancos genómicos de M. tuberculosis

Se ha extraído ADN genómico de M. tuberculosis según protocolos estándar (27). Este ADN ha sido digerido parcialmente con Sau3A (con 1U por 2 \mug) a 37°C durante 2 min 30 seg. La digestión se ha detenido por la adición de fenol. Se ha hecho entonces migrar este ADN sobre agarosa de bajo punto de fusión (Gibco, BRL). La fracción que contiene los fragmentos que tienen de 400 a 2.000 pb se ha extraído mediante agarasa (GELase, Epicentre Technologies) y se ha ligado al sitio Bam HI compatible de pJEM11 con la T4 DNA ligasa (Boehringer Mannheim), a 16°C durante una noche.

Dosificación de la fosfatasa alcalina

Para las dosificaciones de la fosfatasa alcalina, se ha cultivado M. smegmatis en caldo L con adición de tilaxopol al 0,05% (Sigma) a 37°C durante 48 h. La actividad de la fosfatasa alcalina se ha dosificado según el procedimiento de Brockman y Heppel (8), en extractos sonicados según se describe anteriormente (34), usando el fosfato de p-nitrofenilo como sustrato de la reacción. Los contenidos en proteínas se han medido con ayuda de la dosificación Bio-Rad (Bio-Rad). La actividad de la fosfatasa alcalina se expresa en Unidades arbitrarias (aU)=DO_{420} x 10^{5} x 1 g de proteína^{-1} x min^{-1}.

Preparaciones de anticuerpos, electroforesis sobre gel de SDS-poliacrilamida e inmunotransferencias

La preparación de suero de conejo anti-PhoA se ha descrito anteriormente (34). Se han preparado extractos celulares de M. smegmatis por sonicación, la SDS-PAGE y la inmunotransferencia se han realizado según se describe anteriormente (36).

Resultados Construcción de un vector transportador plasmídico (pJEH11) para la producción de proteínas de fusión con PhoA en M. smegmatis

pJEM11 posee un gen phoA truncado de E. coli sin codón de inicio o elementos de regulación cualesquiera (fig. 1). El sitio múltiple de clonación permite la inserción de fragmentos procedentes de genes que codifican proteínas exportadas posibles al mismo tiempo que sus elementos de regulación. Así, se han podido producir proteínas de fusión que expresaban la actividad de la fosfatasa alcalina cuando se había exportado la fusión. pJEM11 es un plásmido transportador E. coli/micobacterias que incluye el gen de resistencia al antibiótico canamicina de tn903 como marcador de selección.

La inserción de elementos genéticos responsables de la expresión y de la exportación de \beta-lactamasa en pJEM11 conduce a la producción de proteínas de fusión PhoA enzimáticamente activas en M. smegmatis

Los tres plásmidos se han construido por inserción de fragmentos de diferente longitud provenientes del gen de la \beta-lactamasa de la cepa sobreproductora M. fortuitum D316 (blaF*) (34) en el sitio Bam HI de pJEM11 (fig. 2). En pLA71, el fragmento de 1.384 pb incluye el promotor, el segmento que codifica para los 32 aminoácidos de la secuencia señal, y los 5 primeros aminoácidos de la proteína madura (no hay secuencia Shine-Dalgarno para la fijación ribosómica en la secuencia de origen de blaF*). pLA72 porta un fragmento de 1.550 pb que incluye los elementos que codifican la secuencia señal y los 61 primeros aminoácidos de la proteína madura. En pLA73, el fragmento de 2.155 pb contiene la blaF* entera. Estos plásmidos se han usado para transformar M. smegmatis y los transformantes se han cribado respecto de las fusiones PhoA enzimáticamente activas por exposición sobre medios de gelosa que contienen canamicina y X-P. El X-P es soluble e incoloro, pero después de escisión del fosfato por la fosfatasa alcalina, se produce un precipitado azul. Así, los clones que producen la fosfatasa alcalina podían ser identificados fácilmente por su coloración azul. La expresión de pLA71, 72 y 73 en M. smegmatis conduce a colonias azules, mientras que las colonias con pJEM11 se mantienen blancas. Los análisis de transferencia Western han demostrado la producción de proteínas de fusión phoA con un peso molecular aparente de aproximadamente 47,5 kDa, 54 kDa y 76 kDa, para pLA71, pLA72 y pLA73 respectivamente (fig. 3, columna 3, 4, 5). Estos pesos moleculares están de acuerdo con la longitud de la proteína madura fusionada a la fosfatasa alcalina (P.M. aparente de 46 kDa, fig. 3, columna 1). En pJEM11, no hay expresión de PhoA, como estaba previsto (fig. 3, columna 2). La dosificación de la actividad de la fosfatasa alcalina (ver la fig. 2) de estas bacterias confirma la expresión de una actividad enzimática con las 3 construcciones pLA. Sin embargo, M. smegmatis con pLA73 expresa aproximadamente dos veces más de actividad en comparación con pLA73 y 72. En experiencias distintas, los autores han confirmado que la producción intracelular de phoA bajo el control de un promotor micobacteriano, sin fusión con una proteína exportada, no se asociaba a la expresión de la actividad de la fosfatasa alcalina. El conjunto de estos resultados indica que en este sistema, la actividad de la fosfatasa alcalina depende de la fusión traduccional y de la exportación propiamente dicha del producto. En consecuencia, pJEM11 conviene a la identificación genética de las proteínas exportadas por las micobacterias.

Construcción en M. smegmatis de un banco de fusiones phoA con fragmentos de ADN genómico de M. tuberculosis

El ADN genómico de un aislado clínico de M. tuberculosis se ha purificado y parcialmente digerido por Sau3A. La fracción de 400/2.000 pb se ha insertado en el sitio Bam HI compatible de pJEM11. Los productos de ligadura se han transferido en E. coli XL-1 azul por electroporación para obtener una etapa de amplificación. Se han impulsado aproximadamente 2.500 clones que contienen plásmidos con inserciones sobre un medio de gelosa que contiene canamicina. Los plásmidos purificados a partir de los transformantes se han reunido y transferido por electroporación en M. smegmatis MC2155. Las bacterias transformadas se han expuesto sobre gelosa L-canamicina-X-P. Se han obtenido aproximadamente 14.000 clones. Después de 4 días de incubación, se han observado las primeras colonias azules, que son de PhoA+. Cada día, se han verificado las cajas, y se han aislado nuevas colonias PhoA+. Las colonias clonadas se han lisado, y se ha introducido su ADN por electroporación en E. coli XL-1 azul, para las preparaciones de plásmidos. En total, se han aislado 12 insertos diferentes que permiten la expresión de phoA y secuencias. Tres secuencias presentaban similitudes con secuencias conocidas.

Fusión de PhoA con el gen de la lipoproteína de 19 kDa de M. tuberculosis

Uno de los plásmidos (pExp410) posee una inserción que corresponde a una parte del gen de la proteína de 19 kDa ya conocida. Este gen codifica para una lipoproteína exportada (5, 31). La fig. 4 A muestra la secuencia de ADN que corresponde a la fusión entre este gen y phoA. Según lo previsto, se mantiene la misma fase de lectura entre las dos proteínas. El peso molecular esperado de la proteína de fusión, según la secuencia, estaría cerca de 57 kDa. Sin embargo, el peso molecular verdadero observado mediante análisis de transferencia Western es idéntico al de la proteína PhoA purificada (fig. 3, columna 1 y 6), lo que sugiere que la proteína de fusión se escinde cerca de la unión PhoA.

Fusión con una secuencia similar al gen de la proteína de 28 kDa de M. leprae

La proteína de 28 kDa de M. leprae es un antígeno mayor reconocido muy a menudo por los sueros de pacientes afectados por la forma lepromatosa de la lepra (9). En el banco de inserción de M. tuberculosis preparado se ha identificado una secuencia portada por un vector recombinante (pExP53) que presenta una similitud del 77% con la secuencia nucleotídica de este gen, y del 68% con la secuencia de aminoácidos deducida (fig. 4B). En el análisis por transferencia Western, el peso molecular de la proteína de fusión es de aproximadamente 52 kDa (fig. 3, columna 7), lo que estima aproximadamente 45 aminoácidos de la proteína micobacteriana en la proteína de fusión, después de la escisión del péptido señal. Esto está conforme con la longitud del fragmento del gen de M. tuberculosis fusionado con phoA (fig. 4B).

Se han realizado análisis de transferencia Southern del ADN genómico de M. tuberculosis. Se ha demostrado que un fragmento de 180 pb de la inserción de 2 kb del plásmido pExp53 no contiene ningún sitio de restricción para las endonucleasas PstI, SmaI, BamHI, BstEII y SphI. Este fragmento se ha amplificado mediante PCR. El ADN genómico de M. tuberculosis se ha digerido con ayuda de estas enzimas, y se ha sondeado con el fragmento de PCR marcado con 32P. Como puede verse en la fig. 5, solamente se ha observado una banda cuando el ADN genómico se ha digerido con cada una de las cinco enzimas, lo que sugiere que el gen está presente en una única copia en el genoma de M. tuberculosis.

Otras fusiones PhoA que portan las secuencias de señal posibles

La fig. 4C muestra la secuencia de una inserción transportada por un vector recombinante (pExp59) fusionado con phoA. Presenta una secuencia señal típica que permite la exportación de proteínas. La secuencia presentada está conforme con las reglas habituales, como las establecidas en las bacterias gram-negativas (25). Contiene dos aminoácidos cargados positivamente (Arg, Asn) después del codón de inicio, seguidos de un péptido hidrófobo, con un Gly, que corresponde probablemente a un bucle en la estructura tridimensional del péptido. Un sitio potencial de escisión por la señal peptidasa se indica con una flecha, lo que da una proteína de fusión con un peso molecular próximo al de phoA, como muestra la fig. 3, columna 8, de modo conforme.

Proteínas de fusión PhoA con motivos de aminoácidos conservados con de estearoíl-proteína-portadora de acilo (ACP) desaturasas

Las ACP-desaturasas son enzimas implicadas en las vías de la biosíntesis de ácidos grasos. En general, estas enzimas son proteínas de membrana integrales (29). Los análisis del plásmido pExp421 del banco preparado han revelado dos motivos de aminoácidos conservados con ACP-desaturasas, uno de 9 aminoácidos y el segundo de 14 aminoácidos (fig. 4D). El resto de la secuencia no ha revelado ninguna similitud significativa con proteínas conocidas.

Discusión

Se han encontrado más de 30 proteínas secretadas en filtrados del BCG o de M. tuberculosis a corto plazo, con un mínimo de Tisis de la bacteria (1, 19, 38). Estas proteínas se han clasificado según su peso molecular y sus reactividades inmunológicas. Algunas se han caracterizado de manera más extendida. Por ejemplo, las proteínas secretadas del complejo del antígeno 85 (los antígenos 85 A, B y C) son proteínas de 32 kDa que presentan reacciones serológicas cruzadas (7, 35). Los antígenos 85 A y 85 B muestran afinidad con respecto a la fibronectina y estarían implicados en la internalización de M. tuberculosis en los macrófagos. Los genes de estas proteínas inmunogénicas (7), y de proteínas de 23 kDa (MPB64) (37) y de 19 kDa (5) se han clonado y secuenciado y se han encontrado secuencias de péptidos de señal características de proteínas exportadas. Las proteínas recombinantes producidas a partir de estos genes serían herramientas interesantes para el diagnóstico serológico de la tuberculosis. La superóxidodismutasa (SOD) de 23/28 kDa es abundante en los filtrados de cultivo a corto plazo, y estaría implicada en la supervivencia de las micobacterias en el fagolisosoma. Se ha clonado y secuenciado el gen que codifica la SOD en M. tuberculosis (39). De manera interesante, no se ha encontrado ninguna secuencia de péptido señal característica. Esto sugiere una vía específica de secreción de este enzima por las micobacterias. Las proteínas secretadas en dos gamas estrechas de peso molecular (6-10 kDa y 26-34 kDa) son antígenos mayores de células T (3) e inducen en el ratón respuestas inmunitarias en células T protectoras con respecto a una prueba por micobacterias vivas del complejo de M. tuberculosis (4). Se ha sugerido que las diferencias en las respuestas inmunitarias observadas entre las bacterias vivas y muertas se deben a estas proteínas exportadas/secretadas (20). Estos diversos resultados preliminares sugieren que una mejor caracterización de proteínas exportadas/secretadas de las bacterias patógenas del complejo de M. tuberculosis sería de gran utilidad a la vez para la comprensión de su poder patógeno y para la puesta a punto de nuevas vacunas.

Si las proteínas secretadas se han estudiado por procedimientos bioquímicos, se revelan necesarias otras metodologías genéticas. Usando un gen phoA truncado, se han puesto a punto sistemas de fusión que permiten la fijación de los extremos amino de otras proteínas sobre PhoA. Este enfoque se basa en la fosfatasa alcalina bacteriana periplásmica de E. coli. Este enzima debe localizarse de manera extracitoplásmica para que sea activo. Así, puede usarse la fosfatasa alcalina como sonda de localización subcelular.

Se ha elaborado una metodología PhoA y se ha descrito aquí para la identificación de proteínas exportadas por las micobacterias. La inserción de blaF* en pJEM11 conduce a la producción en M. smegmatis de proteínas de fusión con la actividad fosfatasa alcalina. Además, fusiones PhoA con 3 fragmentos diferentes de BlaF* serían enzimáticamente activas, lo que sugiere que la mayor parte de las fusiones en fase con proteínas exportadas tendrían una actividad PhoA.

Se ha construido un banco de inserciones de M. tuberculosis en pJEM11 y se ha expresado en M. smegmatis. En este banco, se ha aislado una parte del gen que codifica la lipoproteína exportada conocida de 19 kDa (pExp410). Esta proteína de M. tuberculosis es uno de los antígenos serológicamente inmunodominantes encontrados en este bacilo. Los análisis de la secuencia de ADN del gen que codifica para este antígeno indican que la región NH2-terminal hidrófoba es un péptido señal de lipoproteína (5). Una parte de esta lipoproteína se ha fusionado con la proteína A de superficie externa de Borrelia burgdorferi para construir una vacuna BCG recombinante capaz de inducir una fuerte respuesta inmunitaria (31).

Se han identificado igualmente otras secuencias que comparten similitudes con las proteínas exportadas o de membrana:

Se ha revelado que pExp53 presenta similitudes con el gen del antígeno de 28 kDa de M. leprae. Este antígeno de M. leprae se ha encontrado por cribado de un banco de \lambdagt 11 con el suero de pacientes afectados por la forma lepromatosa de la lepra. Es un antígeno mayor implicado en la respuesta inmunitaria humoral a M. leprae (9). De manera interesante, se ha demostrado que un péptido de 20 aminoácidos de esta proteína presenta una similitud considerable con un péptido del antígeno de 19 kDa de M. tuberculosis, y es un epítopo de células T que presentan reacciones cruzadas (12). La secuencia de ADN del gen que codifica para el antígeno de 28 kDa de M. leprae sugiere que "la secuencia de aminoácidos predicha de la proteína contiene un péptido señal potencial en su extremo amino-terminal y dos largos dominios hidrófobos, lo que sugiere que es diana para la localización en la membrana plasmática bacteriana o la pared celular" (9).

Una proteína de fusión codificada por un plásmido del banco de los autores (pExp421) compartía motivos de aminoácidos con las desaturasas. Las ACP-desaturasas son enzimas implicadas en las rutas de biosíntesis de los ácidos grasos. En general, estas enzimas son proteínas de membrana integrales (39). Este resultado sugiere que se puede haber aislado una parte de un gen importante en el metabolismo de los lípidos en M. tuberculosis, tal vez implicado en la ruta de biosíntesis de la pared celular lipídica.

Se ha encontrado otro plásmido (pExp59) con una secuencia señal posible característica.

En conclusión, los resultados presentados demuestran que la tecnología de PhoA para la identificación genética de proteínas exportadas puede adaptarse con éxito para M. tuberculosis. Cribados preliminares de un banco de inserciones que dan proteínas de fusión PhoA han puesto en evidencia secuencias que presentan similitudes con proteínas exportadas conocidas.

II) Expresión de la proteína P28 de M. tuberculosis

La BCG es una vacuna viva. Es la única vacuna usada para proteger contra la tuberculosis. Su eficacia se ha revelado variable según las poblaciones vacunadas, yendo de aproximadamente el 80% en Gran Bretaña al 0% en la India. Parecía así indispensable buscar una vacuna más eficaz. Por otra parte, el hecho de usar una vacuna viva plantea hoy problemas por motivo de la extensión de la epidemia del SIDA.

Varios trabajos han demostrado que los antígenos exportados por Mycobacterium tuberculosis, el agente de la tuberculosis, tenían un efecto protector contra una prueba con la cepa virulenta. Los trabajos aquí comunicados han consistido en usar un procedimiento genético para aislar y estudiar los genes de M. tuberculosis que codifican proteínas exportadas. Describimos aquí el aislamiento y la caracterización de un gen que codifica una proteína que posee homologías con la proteína de 28 kDa de Mycobacterium leprae ya descrita.

Metodología para la clonación de genes que codifican proteínas exportadas

La metodología expuesta en detalle en la parte I se basa en el uso de fusiones traduccionales con el gen que codifica la fosfatasa alcalina de Escherichia coli, PhoA. Dichas proteínas de fusión no tienen una actividad fosfatasa alcalina detectable más que si se exportan. Se ha construido un vector plasmídico que porta un gen phoA desprovisto de su promotor, de su sitio de unión al ARN ribosómico y de su secuencia señal. A partir de este vector no puede observarse una actividad PhoA más que después de fusión traduccional en el marco de lectura correcto con una proteína exportada. El vector, denominado pJEM11, posee un origen de replicación para E. coli y otro para las micobacterias. Posee igualmente un marcador de selección, el gen de resistencia a la canamicina del trasposón Tn905. Un sitio múltiple de clonación precede al gen phoA truncado.

Se ha construido un banco de ADN genómico proveniente de una cepa de M. tuberculosis (Mt103) aislada de un paciente tuberculoso en pJEM11 insertando fragmentos de ADN obtenidos de una hidrólisis parcial por el enzima Sau3a. Los clones seleccionados han permitido identificar un fragmento de nucleótido del gen de 28 kDa de M. tuberculosis homólogo al gen que codifica la proteína de 28 kDa de M. leprae.

En los enfermos lepromatosos se observan anticuerpos dirigidos contra esta proteína de 28 kDa, dejando suponer que esta proteína es un antígeno inmunodominante. Se ha hecho la hipótesis de que en M. tuberculosis, la proteína de 28 kDa que posee homologías con la proteína de 28 kDa de M. leprae podría ser también un antígeno inmunodominante y que podría servir para la construcción de pruebas inmunológicas específicas que permitan la detección de la infección tuberculosa o de la enfermedad de la tuberculosis. Tal vez podría usarse para la construcción de vacunas subunitarias en diferentes preparaciones vacunales. Además, podría ser útil como vector para la expresión de antígenos en las micobacterias para la construcción de vacunas recombinantes.

Clonación y secuenciación del gen que codifica una proteína de 28 kDa de M. tuberculosis

Usando la inserción contenida en el plásmido pExp53 como sonda, el gen entero que codifica la proteína de 28 kDa de M. tuberculosis se ha clonado por hibridación sobre colonia de un banco de ADN de M. tuberculosis construido insertando fragmentos de ADN de M. tuberculosis de tamaño comprendido entre 2 y 6 kb obtenidos por hidrólisis total con el enzima PstI en el vector pBluescript KS-. El fragmento PstI de M. tuberculosis que corresponde al clon positivo y que comprende una inserción de 4,1 kb se ha secuenciado. La fig. 10 muestra la secuencia nucleotídica del fragmento y las semejanzas con el gen que codifica la proteína de 28 kDa de M. leprae. La secuencia del gen de 28 kDa de M. tuberculosis es como la de M. leprae precedida por una secuencia que posee semejanzas con las cajas de "hierro" encontradas en sentido directo de los genes expresados durante una carencia en hierro. Aparece una situación de carencia en hierro durante el crecimiento in vivo. Se hace la hipótesis de que la expresión de este gen se induce durante el crecimiento en los macrófagos de las micobacterias que alojan este gen. Además, la proteína de 28 kDa de M. tuberculosis posee en su parte central dos regiones que contienen motivos de 5 aminoácidos repetidos en tándem, que están ausentes de la proteína homóloga de M. leprae. Se han identificado estructuras repetidas análogas anteriormente en antígenos mayores presentes en la superficie de otros agentes patógenos bacterianos o parasitarios como la proteína M (40) de Streptococcacea y la proteína CS de Plasmodiae (41).

La totalidad o parte de la proteína de 28 kDa de M. tuberculosis cuya secuencia del gen se presenta aquí podría ser un antígeno protector potencial para la construcción de una vacuna antituberculosa. Puede obtenerse dicho antígeno por purificación de extractos celulares de M. tuberculosis o a partir de extractos celulares de organismos heterólogos recombinados genéticamente. Además, la proteína de 28 kDa de M. tuberculosis o de péptidos de derivación podría ser un antígeno utilizable en pruebas ELISA para la detección de enfermos tuberculosos.

Usando el gen de 28 kDa de M. tuberculosis, como sonda, sólo se ha observado una hibridación con el ADN genómico de cepas pertenecientes al complejo M. tuberculosis en condiciones de restricción elevada. En consecuencia, la secuencia que corresponde al gen de 28 kDa de M. tuberculosis es una secuencia específica que puede usarse para pruebas de detección de bacilos de la tuberculosis, usando sondas ADN o ARN y procedimientos de amplificación génica in vitro.

La región reguladora y el gen de la 28 kDa de M. tuberculosis pueden usarse como moléculas portadoras para expresar antígenos heterólogos en el BCG o cualquier otro vector micobacteriano útil para la construcción de vacunas.

III) Expresión de tienes de micobacterias; evaluación de diferentes promotores de expresión

Un aspecto importante de los resultados obtenidos se refiere a la construcción de herramientas genéticas para el estudio de la expresión de genes en las micobacterias. En la técnica anterior se han usado vectores secuencia de regulación-sonda para aislar y analizar secuencias de regulación en un gran número de bacterias (54). La definición por los autores de la invención de dichas herramientas propias de las micobacterias facilita el estudio de los mecanismos genéticos que regulan la virulencia en las especies patógenas, y el aislamiento de nuevas secuencias de regulación que serían útiles para la puesta a punto de vacunas BCG recombinantes mejoradas.

Inicialmente, la expresión de genes micobacterianos se ha estudiado en sistemas heterólogos, Escherichia coli y Streptomyces lividans (46) (51) (60). Estos análisis sugieren que la mayor parte de los genes micobacterianos se expresan más eficazmente en S. lividans que en E. coli. Ulteriormente, se han construido vectores a base de plásmidos micobacterianos que podrían usarse para estudios en sistemas homólogos. Los vectores pYUB75 y pYUB76 se han concebido para seleccionar fusiones de genes a un gen lacZ truncado de Escherichia coli (42). El plásmido pSD7 permite la construcción de fusiones de operones a un gen de la cloramfenicol-acetiltransferasa (CAT) sin promotor (47). Usando estos vectores, se ha aislado un cierto número de secuencias de regulación micobacterianas y se han evaluado a la vez en E. coli y en Mycobacterium smegmatis.

Los autores de la invención han descrito otras construcciones de vectores de la serie pJEM que tienen varias ventajas: portan un terminador de transcripción de sitios múltiples de clonaciones adaptadas, y permiten fusiones a la vez de operones y de genes en lacZ. lacZ se ha elegido como gen indicador, ya que el enzima codificada, la \delta-galactosidasa, se mantiene activa cuando se fusionan secuencias heterólogas en su extremo amino-terminal (45) (64). Su actividad puede medirse fácilmente in vitro, incluso a niveles muy bajos con ayuda de compuestos fluorescentes (48). La \beta-galactosidasa es asimismo altamente inmunogénica. Induce respuestas inmunitarias a la vez humorales y celulares después de su presentación al sistema inmunitario de ratones con bacterias recombinantes (44) (56). Así, la \beta-galactosidasa puede usarse igualmente como indicador del poder inmunogénico de una vacuna recombinante. Usando vectores pJEM, podrían aislarse nuevas secuencias de regulación activas en BCG y probarse fácilmente en las cepas BCG recombinantes su capacidad para inducir respuestas inmunitarias en el ratón.

Se ha realizado igualmente un estudio comparativo de las actividades de diversos promotores en M. smegmatis y BCG. Los resultados sugieren que las ARN polimerasas de M. smegmatis y de BCG no comparten la misma especificidad.

Construcción de vectores pJEM. Idealmente, un vector plasmídico promotor-sonda debe contener cinco elementos: i) un replicón, ii) un marcador de selección, y un casete indicador que contenga iii) un terminador de transcripción seguido de iv) sitios múltiples de clonación (MCS) y de v) un gen indicador desprovisto de sus secuencias de regulación.

Para construir un vector de clonación promotor de las micobacterias, hemos usado el replicón derivado del plásmido pAL5000 de Mycobacterium fortuitum y se ha usado el gen de la resistencia a la canamicina (aph) de Tn903 (58). Estos elementos genéticos son los componentes de base de la mayor parte de los plásmidos usados actualmente para la transformación de micobacterias. Parecen conferir una alta estabilidad a los clones transformados de M. smegmatis y M. bovis BCG a la vez in vitro e in vivo (en ratones) incluso en ausencia de selección por los antibióticos (56). Para facilitar la preparación y la manipulación de ADN episomal, la mayor parte de estos plásmidos contienen igualmente un replicón de E. coli. Así, hemos elegido el plásmido pRR3, un vector transportador E. coli-micobacterias que contiene estos tres elementos genéticos como vector de base (58).

No se ha caracterizado todavía ningún terminador de transcripción micobacteriano. Para examinar si el terminador de transcripción del colifago T4 (tT4) estaba activo como sitio de terminación para las ARN polimerasas de micobacterias, se ha clonado el interposón omega (57) en el plásmido pJN3, en sentido directo desde el elemento sRBS-cII-lacZ, generando pJN11 (fig. 11). El fragmento omega está compuesto por un gen de resistencia a la estreptomicina/espectinomicina encuadrado por cortas repeticiones inversas que contienen tT4. La inserción de omega en un fragmento de ADN conduce a la terminación de la síntesis de ARN en E. coli (57). pJN3 se ha construido clonando, en el sitio ScaI de pRR3, un casete compuesto por un lacZ truncado asociado a un RBS de síntesis (sRBS) y el extremo 5' del gen de regulación cII del fago lambda y el promotor pL (fig. 11). M. smegmatis mc2155 (61) se ha transformado con pJN3 (pL-sRBS-cII-lacZ) o pJN11 (pL-XsRBS cII-lacZ) por electroporación y los clones transformantes se han recuperado después de crecimiento en cajas LB-Xgal. Los clones transformantes que portan pJN3 han dado colonias azules y los clones transformantes que portan pJN11 han dado colonias blancas. Siendo la actividad de la \delta-galactosidasa en M. smegmatis (pJN11) 50 veces inferior a la de M. smegmatis (pJN3) (tabla 2). Así, tT4 contenido en el inserto X actúa como terminador de transcripción eficaz en M. smegmatis.

Un fragmento de ADN que contiene el segmento tT4 seguido del elemento sRBS-cII-lacZ de pJN11 se ha sintetizado in vitro por amplificación mediante PCR y se ha añadido un MCS (MCS1), que contiene 6 sitios de restricción únicos. A continuación se ha clonado el casete resultante en el sitio ScaI de pRR3, dando el vector de fusión de operones pJEM15 (fig. 12). La electroporación de M. smegmatis MC2155 y del BCG con este plásmido ha conducido a colonias blancas en cajas de LB-Xgal con una actividad muy débil de la \beta-galactosidasa (tabla 2). Por el contrario, en E. coli pJEM15 ha expresado una actividad de la \beta-galactosidasa más elevada, y en consecuencia una coloración azul en cajas de LBXgal. Esto se debe probablemente a su número elevado de copias. En E. coli, están presentes vectores pUC con un número de copias elevado (superior a 500), mientras que en las micobacterias, los plásmidos derivados de replicones pAL5000 tienen un número de copias de aproximadamente 3 a 10 (50). La prueba de fragmentos de ADN para la actividad promotora, con ayuda de pJEM15, por cribado azul-blanco debe así efectuarse directamente en las micobacterias.

Para obtener vectores que permiten fusiones de genes en lacZ, hemos seguido una estrategia similar. Las tres formas de lacZ truncado de la serie pNM480 (55), aunque diferentes unas de otras por la "puesta en fase traduccional" de un sitio HindIII localizado en su extremo 5', se han clonado, en sentido inverso de tT4 y de un MCS (MCS2) que contiene 7 sitios de restricción únicos, en el sitio ScaI de pRR3. Los plásmidos resultantes pJEM12-13-14 (fig. 12) permiten así la clonación de una gran gama de fragmentos de restricción en fase con lacZ.

Evaluación de diversos promotores en M. smegmatis y BCG. Se han construido fusiones de operones entre el casete indicadora cII-lacZ de pJEM15 y los promotores pAN (56), pblaF* (63), psul3 (52), y pgroES/EL1 (49). La actividad de estos promotores se ha evaluado en M. smegmatis y en M. bovis BCG. Los tres primeros promotores se han aislado a partir de especies micobacterianas: pblaF* es un mutante de expresión elevada de pblaF, que dirige la expresión del gen de la p-lactamasa de M. fortuitum; pAN es un promotor de M. paratuberculosis y psul3 un componente de elemento genético móvil de M. fortuitum Tn610. Estos promotores se han localizado por cartografía de sitios de inicio de transcripción (pblaF* y pAN) o por análisis de deleción (psul3) (62). PgroES/EL1 es un promotor de Streptomyces albus que regula la expresión del operón groES/EL1, y es activo a la vez en M. smegmatis y el BCG (65).

Las experiencias de clonación se han efectuado directamente en M. smegmatis. Se han aislado fragmentos de ADN que contienen cada uno promotores y se han insertado en MCS1 de pJEM15 digerido por las enzimas de restricción apropiadas. Las mezclas de ligadura resultantes se han usado para transformar M. smegmatis mc2155 por electroporación y se han seleccionado colonias azules para electroinducir E. coli MC1061 (45) según se describe anteriormente (43). Los plásmidos se han aislado de estos clones de E. coli y se han analizado. Los que corresponden a las construcciones buscadas pJN29 a pJN32 (tabla 2) se han usado para la electroporación de BCG (cepa Pasteur).

La actividad de la \beta-galactosidasa se ha dosificado sobre extractos sonicados de M. smegmatis y de BCG (tabla 2). La actividad de los promotores ha variado también considerablemente tanto entre los promotores de un hospedador micobacteriano como entre los hospedadores de cada promotor. La fuerza relativa de estos promotores no era la misma en M. smegmatis y BCG. Aunque pblaF* haya sido el promotor más potente a la vez en M. smegmatis y en el BCG, la situación es diferente para los otros promotores: pAN y pgroES/EL1 eran más activos que psu13 en el BCG, pero en M. smegmatis, psu13 era más activo que pAN o pgroES/EII.

Das Gupta y col. (47) han cribado bancos de ADN de M. smegmatis y de M. tuberculosis para la actividad promotora en M. smegmatis. Han señalado una frecuencia de promotores de 10 a 20 veces más elevada en el ADN de M. smegmatis. Además, los promotores muy activos eran más raros en los bancos de ADN de M. tuberculosis que en los de M. smegmatis. Estos autores han sugerido que los promotores de M. tuberculosis pueden haber divergido considerablemente de los de M. smegmatis. Los resultados presentados aquí sugieren que la maquinaria transcripcional de M. smegmatis y de M. bovis BCG, especie muy parecida a M. tuberculosis, puede ser diferente.

En conclusión, la familia de vectores construidos facilita el estudio de la expresión de genes en lep micobacterias. Puede clonarse fácilmente una gran gama de fragmentos en fase a lacZ' (fusión de genes) o en sentido directo de cIIlacZ (fusión de operones) y evaluarse su actividad de promotor por cribado azul-blanco de transformantes micobacterianos en cajas LB-Xgal. La actividad de estos promotores puede medirse también (mediante dosificación de la actividad de la \beta-galactosidasa), determinarse sus secuencias, y cartografiarse su sitio de inicio de transcripción (mediante análisis de extensión de cebador) usando "el cebador universal" o secuencias equivalentes (53) como cebador.

IV) Expresión de la proteína ERP en forma recombinante en E. coli

La proteína ERP se ha expresado en forma recombinante en E. coli y se ha purificado por cromatografía de afinidad. Se han realizado dos tipos de fusiones entre ERP y fragmentos peptídicos que tienen una fuerte afinidad por soportes cromatográficos específicos (Amilosa, sistema MaIE; níquel (Ni^{2+}) quelado, para el sistema Histidina). Se trata de:

-

ERP desprovisto de su secuencia señal fusionada en C-ter con la proteína que une la maltosa (MaIE) de E. coli (MaIEERP);

-

ERP desprovisto de su secuencia señal (ERP(His)_{6} ss) o en su totalidad (ERP(His)_{6}), y que posee 6 aminoácidos Histidina en C-ter.

Después de purificación, el análisis de estas tres proteínas de fusión en electroforesis PAGE-SDS indica que el polipéptido ERP posee un peso molecular (PM) relativo de 36 kDa. Existe una diferencia importante entre el PM calculado a partir de la secuencia (28 kDa) y el PM observado experimentalmente (36 kDa). Este retardo en la migración electroforética podría provenir del alto contenido en residuos de prolina, o de modificaciones post-traduccionales.

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62. Timm, J. et al. Unpublished ta.

TABLA 1

1

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Referencias citadas en la descripción

Esta lista de referencias citadas por el solicitante es sólo para la conveniencia del lector. No forma parte del documento de patente europea. Aunque se ha puesto el máximo cuidado al compilar las referencias, no pueden excluirse posibles errores u omisiones y la OPE niega cualquier responsabilidad al respecto.

Documentos no patentes citados en la descripción

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Claims (14)

1. Secuencia de nucleótidos obtenida de un gen que codifica una proteína exportada de M. tuberculosis, caracterizada porque se selecciona entre las secuencias siguientes:

- una secuencia IA que responde a la cadena de nucleótidos representada en la fig. 6A, o una secuencia IB que responde a la cadena de nucleótidos representada en la fig. 6B, o una secuencia que codifica una proteína exportada de M. tuberculosis y que se hibrida en condiciones de restricción elevada con una secuencia IA o IB,

- una secuencia que comprende la cadena de nucleótidos IA o que comprende la cadena de nucleótidos IB y que codifica una proteína P28 de M. tuberculosis que tiene un peso molecular teórico de aproximadamente 28 kDa,

- una secuencia comprendida en la secuencia IA o en la secuencia IB y que codifica un polipéptido reconocido por los anticuerpos dirigidos contra la proteína P28 de M. tuberculosis que responde a la cadena de aminoácidos VIIIA representada en la fig. 6A o a la cadena de aminoácidos VIIIB representada en la fig. 6B.

- una secuencia IV que comprende las secuencias reguladoras del gen que comprende la secuencia de codificación IA o la secuencia de codificación IB, estando dichas secuencias contenidas en las secuencias nucleotídicas en sentido directo e inverso representadas en la fig. 7A y en la fig. 7B,

- una secuencia V que responde a la cadena comprendida entre los nucleótidos 1 a 72 de la secuencia IA o la secuencia IB y que corresponde a la secuencia señal,

- una secuencia VI que responde a la cadena comprendida entre los nucleótidos 62 a 687 de la secuencia IA o la secuencia IB,

- una secuencia VII que responde a la cadena comprendida entre los nucleótidos 688 y 855 de la secuencia IA o la secuencia IB.

\vskip1.000000\baselineskip

2. Polipéptido de M. tuberculosis, caracterizado porque responde a la cadena de aminoácidos VIIIA o a la cadena de aminoácidos VIIIB representadas respectivamente en la fig. 6A y en la fig. 6B o porque comprende esta cadena.

3. Polipéptido según la reivindicación 2, caracterizado porque tiene un peso molecular teórico de aproximadamente 28 kDa.

4. Polipéptido según la reivindicación 2 ó 3, caracterizado porque tiene un peso molecular observado de aproximadamente 36 kDa, determinado por migración electroforética en gel de poliacrilamida desnaturalizante (PAGE-DOS).

5. Polipéptido caracterizado porque comprende una parte de la cadena VIIIA o de la cadena VIIIB de aminoácidos según la reivindicación 2, y porque reacciona inmunológicamente con anticuerpos dirigidos contra la proteína P28 de M. tuberculosis que responde a la cadena VIIIA o a la cadena VIIIB de aminoácidos.

6. Polipéptido según la reivindicación 2, 3 ó 4, caracterizado porque comprende una o varias de las cadenas siguientes: PGLTS, PGLTD, PGLTP, PALTN, PALTS, PALGG, PTGAT, PTGLD, PVGLD.

7. Polipéptido según una de las reivindicaciones 2 a 4, caracterizado porque una o varias de las cadenas siguientes: PGLTS, PGLTD, PGLTP, PALTN, PALTS, PALGG, PTGAT, PTGLD, PVGLD está sustituida por una secuencia de aminoácidos de un epítopo o de un determinante antigénico de un organismo patógeno determinado.

8. Anticuerpos monoclonales o suero policlonal dirigidos contra un polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 7.

9. Composición para la detección in vitro o in vivo de una infección por M. tuberculosis, caracterizada porque comprende un polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 7 capaz de reaccionar inmunológicamente con anticuerpos formados en un paciente infectado por M. tuberculosis.

10. Composición para la detección in vitro de una infección por M. tuberculosis, caracterizada porque comprende una secuencia de nucleótidos que contiene al menos 9 nucleótidos, obtenida de una secuencia según la reivindicación 1, o una secuencia de nucleótidos que contiene al menos 9 nucleótidos y que se hibrida en condiciones restrictivas con el ADN de M. tuberculosis, y que no se hibrida en las mismas condiciones con el ADN de M. leprae, siendo esta secuencia una secuencia de ADN o de ARN, en su caso marcada.

11. Uso de un polipéptido o de una secuencia de aminoácidos según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 7, como molécula portadora.

12. Huésped celular procariota o eucariota, caracterizado porque es transformado por una secuencia de nucleótidos según la reivindicación 1 en condiciones que permiten la expresión de esta secuencia y/o su exposición en la membrana del huésped celular y/o su exportación y/o su secreción a partir de dicha membrana.

13. Huésped celular según la reivindicación 12, caracterizado porque se trata de una micobacteria, por ejemplo de una cepa de M. smegmatis, M. tuberculosis o M. bovis.

14. Composición inmunogénica caracterizada porque comprende un polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 7 o un huésped celular según una cualquiera de las reivindicaciones 12 ó 13.