ES2276448T3 - Vacuna contra clostridium perfringens. - Google Patents
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Abstract
LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A DERIVADOS INMUNOGENICOS DESTOXIFICADOS DE LA BE - TOXINA DEL CLOSTRIDIUM PERFRINGENS O DE UN FRAGMENTO INMUNOGENICO DEL MISMO QUE TIENEN, COMO CARACTERISTICA, EL DE CONTENER UNA MUTACION EN LA SECUENCIA DE AMINOACIDOS DE LA BE - TOXINA, QUE NO SE ENCUENTRA EN LA SECUE NCIA DE AMINOACIDOS DE LA BE - TOXINA DE TIPO NATURAL. LA INVENCION SE REFIERE IGUALMENTE A GENES QUE CODIFICAN DICHAS BE - TOXINAS, ASI COMO A SISTEMAS DE EXPRESION QUE PERMITEN EXPRESAR TALES BE - TOXINAS. ADEMAS, LA INVENCION SE REFIERE A S ISTEMAS DE EXPRESION BACTERIANA QUE EXPRESAN UNA BE - TOXINA NATIVA. POR ULTIMO, LA INVENCION SE REFIERE A VACUNAS BASADAS EN DERIVADOS INMUNOGENICOS DESTOXIFICADOS DE LA BE - TOXINA DEL CLOSTRIDIUM PERFRINGENS Y A LOS PROCEDIMIENTOS PARA LA PREPARACION DE DICHAS VACUNAS.
Description
Vacuna contra Clostridium
perfringens.
La presente invención se refiere a derivados
inmunogénicos destoxificados de la toxina \beta de Clostridium
perfringens, alADN que codifica tales derivados, a la bacteria
Clostridium perfringens que comprende el ADN que codifica
tales derivados, a sistemas de expresión bacterianos Gram positivos
que comprenden el ADN que codifica tales derivados, a sistemas de
expresión bacterianos Gram positivos que no están basados en
Clostridium perfringens que expresan la toxina \beta de
tipo salvaje, a las vacunas para combatir Clostridium
perfringens basadas en ellos, a los métodos para la preparación
de la toxina \beta de Clostridium perfringens natural, a
los métodos para la preparación de derivados inmunogénicos
destoxificados de la toxina \beta de Clostridium
perfringens y a los métodos para la preparación de vacunas para
combatir Clostridium perfringens. El Clostridium
perfringens (también conocido como C. welchii) es una
especie del gran género Clostridium. Todas las bacterias
pertenecientes a este género son bacilos Gram positivos anaerobios
formadores de esporas. La especie C. perfringens puede ser
subdividida en subespecies. Se han descrito cinco subespecies. Estas
subespecies son conocidas generalmente como "tipos"
A-E. Todas las subespecies producen numerosas
toxinas, tanto principales como secundarias. Las cuatro toxinas
principales son las toxinas \alpha, \beta, \varepsilon y
\tau. Todos los tipos de C. perfringens producen la toxina
\alpha. La toxina \beta es producida por C. perfringens
de los tipos B y C. Además, una gama de toxinas secundarias es
producida por todos los tipos de C. perfringens. Esto se
debe principalmente a la presencia de una o más de estas diversas
toxinas en los cinco tipos de C. perfringens, ya que todas
las especies de C. perfringens son patogénicas.
Se sabe que el tipo A es patogénico tanto para
hombres como para cerdos. El tipo B es principalmente patogénico
para corderos, ovejas y cabras, y ocasiona la "disentería de los
corderos" y la enteritis hemorrágica. El tipo C es patogénico
para el hombre, las ovejas, los terneros, los corderos, los cerdos,
y las aves. Es la causa de la "enterotoxemia de los lanares",
la enteritis hemorrágica, la enteritis necrótica y la
enterotoxemia.
Como se ha mencionado antes, se sabe que tanto
el tipo B como el tipo C de C. perfringens producen la
toxina \beta. Se sabe que la toxina \beta juega un papel
principal en la patogénesis de la enteritis necrótica tanto en
hombres como en animales. En el hombre, esta enfermedad de se ha
denominado pigbel (Johnson y col.: Lancet ii:
496-500, (1987)). En animales, se ha descrito la
enteritis necrótica en terneros, corderos y cerdos (Hauschild,
A.H.W. in S. Kadis, T.C. Montie, (ed.) Microbial toxins, p.
159-188. Academic press, Inc, New York (1971) y
Willis, T.A. Anaerobic bacteriology: clinical and laboratory
practice, 3^{rd} ed. Butterworths, London (1977).
La toxina \beta de Clostridium
perfringens ha sido aislada en forma pura (Sakurai y col.,
infect. & Immun. 18: 741-745 (1977), Sakurai y
col., Toxicon 25: 1301-1310 (1987)). Todavía queda
mucho por saber acerca de las propiedades biofísicas de la toxina y
por tanto acerca de su modo de acción. No obstante debido al hecho
de que podía ser obtenida en una forma purificada se podía demostrar
claramente la toxicidad de la toxina \beta en animales. La
toxicidad letal de la toxina \beta purificada v.g. para ratones y
cobayas fue demostrada por Sakurai y col. (infect. & Immun. 21:
678-680 (1978), Sakurai y col., Toxicon 25:
1301-1310 (1987)).
Recientemente, ha sido elucidada la secuencia de
ácido nucleico de la toxina \beta de Clostridium perfringens
por Hunter y col. (Infect. & Immun. 61:
3958-3965 (1993)). La secuencia de ácido nucleico
reveló que el tamaño de la proteína toxina \beta era de
aproximadamente 35 kD.
Debido al hecho de que el papel de la toxina
\beta de Clostridium perfringens del tipo B y C en la
patogénesis es de suprema importancia, se ha realizado un gran
esfuerzo en el desarrollo de inmunidad contra esta toxina. La
inmunidad contra la toxina \beta es suficiente para proteger
contra la infección por Clostridium perfringens de tipo B y
de tipo C. El único modo de inducir inmunidad contra la toxina
\beta consiste en administrar la toxina al animal que va a ser
protegido. No obstante resulta obvio que la toxina debe ser
administrada en una forma destoxificada, puesto que la
administración de otro modo conduciría a una grave enfermedad o a la
muerte del animal que se va a vacunar.
Las vacunas basadas en la toxina \beta
destoxificada, también denominada toxoide \beta, ya estaban
disponibles alrededor de 1960 (v.g. Patente Británica Núm. 901.433.
y Patente de los Estados Unidos Núm. 3.288.680). Todas las vacunas
disponibles en la actualidad basadas en la toxina \beta de
Clostridium perfringens inactivada tienen sin embargo
diversas desventajas importantes. En primer lugar, todas las vacunas
basadas en la toxina \beta comprenden principalmente toxina
\beta químicamente destoxificada, principalmente destoxificada
con formalina, y se ha demostrado con el paso de los años que es muy
difícil normalizar estos procedimientos de destoxificación
química.
Un ejemplo de semejante vacuna de
anti-Clostridium basada en la destoxificación con formalina
se da en la Solicitud de Patente Británica GB 2 020 51. Los métodos
químicos clásicos para la destoxificación de proteínas tienen la
desventaja de que alteran la estructura global de la proteína de una
manera bastante al azar. Como resultado, durante el procedimiento
de destoxificación química las propiedades inmunogénicas de la
toxina \beta también disminuyen rápidamente. Esto se puede
observar v.g., en el gráfico 1 y 2: en el gráfico 2 se muestra, que
se necesita formalina al menos al 1%, un compuesto de inactivación
utilizado muy comúnmente, para destoxificar la toxina \beta en
ciertas condiciones normalizadas. A partir de los gráficos 1 y 2, se
puede observar, no obstante, que el título de antigenicidad
disminuye espectacularmente con una
cantidad creciente de formalina. En
cualquier caso no se puede obtener un título completo, puesto que
incluso la cantidad más baja de formalina necesaria para la
destoxificación (gráfico 2) ya produce un descenso del título. Esto
implica que solamente hay una banda muy estrecha, en la cual se
puede obtener tanto de destoxificación como un título razonable y
por tanto inmunogenicidad. Dada esta banda muy estrecha, y el hecho
de que existen al menos tres variables; tiempo de destoxificación,
temperatura y concentración de formalina precisa, está claro que es
muy difícil producir toxina \beta destoxificada reproduciblemente.
Por lo tanto se desea fervientemente otro enfoque para la
destoxificación de la toxina \beta. Hasta ahora no se ha
encontrado una alternativa aceptable, por la siguiente razón: el
delicado equilibrio entre un nivel suficiente de destoxificación y
la inmunogenicidad remanente implica una íntima conexión entre, por
una parte, la estructura de la proteína y, por otra parte, las
propiedades biológicas de la proteína. No se debería esperar por lo
tanto que fuera posible cambiar la estructura de la proteína
destoxificando de ese modo la proteína, sin deteriorar al mismo
tiempo significativamente las características inmunogénicas de la
proteína.
Uno de los méritos de la presente invención es
que describe por primera vez un modo de evitar el problema
mencionado antes: utilizando mecanismos de manipulación genética, se
encontraron sorprendentemente regiones de aminoácidos específicas y
relativamente grandes, que se pueden mutar para proporcionar los
derivados no tóxicos deseados de la toxina \beta sin deteriorar
significativamente sus propiedades inmunogénicas necesarias.
De este modo, en una realización, la invención
hace referencia a derivados inmunogénicos destoxificados de la
toxina \beta de Clostridium perfringens o un fragmento
imunogénico de la misma, llevando a cabo al menos una mutación en
su secuencia de aminoácidos, no encontrada en la toxina \beta de
tipo salvaje definida en las reivindicaciones. Se entiende que un
fragmento inmunogénico de la misma, aunque no comprende la secuencia
de aminoácidos completa del derivado de la toxina \beta, todavía
comprende aquellas regiones del derivado que son capaces de inducir
una respuesta inmunitaria protectora en el animal huésped y
comprende la mutación definida en las reivindicaciones. Se entiende
que una mutación es un cambio en la secuencia de aminoácidos del
derivado de la toxina \beta en comparación con la secuencia de
aminoácidos de la toxina \beta de tipo salvaje.
La mutación es una sustitución, deleción,
inserción o inversión, o una combinación de las mismas. Una mutación
puede ser v.g. de tal manera que uno o más aminoácidos de la toxina
\beta sean remplazados por otros aminoácidos, con diferentes
características. Una reposición adecuada es v.g. la reposición de un
aminoácido cargado negativamente con uno cargado positivamente, tal
como la reposición de Aspartato con Lisina. Otra reposición adecuada
es la de un aminoácido aromático con uno alifático: v.g. Triptófano
\Rightarrow Glicina. También es adecuada la reposición de un
aminoácido hidrófobo con uno hidrófilo, tal como v.g. Isoleucina con
Aspartato.
Por lo tanto la invención en una forma preferida
hace referencia a derivados de toxina \beta según la invención,
donde al menos una mutación es una mutación de reposición. Esta
claro que después de la reposición, las mutaciones que implican la
inserción y/o deleción de uno o más aminoácidos que proporcionan
derivados de toxina \beta no tóxicos, capaces todavía de inducir
una respuesta inmunológica también son parte de la invención. Por lo
tanto en una forma igualmente preferida, la invención hace
referencia a derivados de toxina \beta según la invención, donde
al menos una mutación es una deleción o inserción. Cuando se
realizan dos o más mutaciones, son igualmente posibles
combinaciones de mutaciones por reposición y/o
deleción/inserción.
Se considera que un derivado de la toxina
\beta es no tóxico si su DL50 (dosis letal que acaba con un 50%
de todos los animales en un experimento) en ratones es al menos diez
veces superior que la DL50 de la toxina \beta natural. La DL50 de
la toxina \beta natural es de aproximadamente 0,15
\mug/ratón.
Como se ha mencionado antes, uno de los méritos
de esta invención es que, al contrario de lo que se suponía en la
técnica, se encontró que era posible alterar genéticamente la
secuencia de aminoácidos de la toxina \beta de manera que se
obtuviera un toxoide no tóxico y todavía inmunogénico. No todas las
mutaciones conducirán no obstante a los derivados de toxina \beta
no tóxicos y todavía inmunogénicos deseados. Por lo tanto, se ha
desarrollado un ensayo para el rápido rastreo y la selección de
mutantes que produzcan un derivado no tóxico de toxina \beta que
todavía es inmunogénico. Este ensayo permite rastrear grandes
números de mutantes que producen derivados de toxina \beta no
tóxicos y todavía inmunogénicos. Este ensayo se describirá más
abajo.
También se ha descubierto que aquellas regiones
que forman un dominio de transición entre las partes neutra e
hidrófila de la toxina \beta son adecuadas como regiones diana
para introducir mutaciones que proporcionan derivados no tóxicos de
la toxina \beta con las características deseadas. Estas regiones
pueden ser fácilmente localizadas aplicando el algoritmo de
Hopp-Woods para la secuencia de la toxina \beta
(Hopp y Woods; Proc. Natl. Acad. Sci. 78:
38248-3828 (1981)). Por lo tanto, en una forma más
preferida de esta realización, la invención hace referencia a
derivados de toxina \beta que
tienen una mutación que está localizada en un dominio de transición entre las partes neutra e hidrófila de la toxina \beta.
tienen una mutación que está localizada en un dominio de transición entre las partes neutra e hidrófila de la toxina \beta.
Las regiones que son muy adecuadas como regiones
diana para las mutaciones se localizan en la posición 62, en la
posición 182, en la posición 197, entre el aminoácido número
80-103, 145-147,
281-291, 295-299 en relación con el
péptido líder metionina y la región aguas abajo de la cisteína única
en la posición del aminoácido 292.
Por lo tanto en una forma aún más preferida, la
invención hace referencia a derivados de toxina \beta que tienen
una mutación que está localizada al menos en una de las regiones de
la posición 62, 182, 197 y entre los aminoácidos número
80-103, 145-147,
281-291, 295-299 y/o la región aguas
abajo de la posición del aminoácido 292 en relación con el péptido
líder metionina. En una forma aún más preferida, las mutaciones se
localizan en la posición 62, en las posiciones
80-82, en las posiciones 95-97, en
las posiciones 101-103, en las posiciones
145-147, en la posición 182, en la posición 197, en
la posición 287-291, en la posición
295-299.
Los derivados inmunogénicos no tóxicos de la
toxina \beta según la invención pueden ser elaborados remplazando
o modificando químicamente aminoácidos de la proteína. También
pueden ser elaborados introduciendo mutaciones en fragmentos de ADN
del gen que codifica la toxina \beta. Los métodos para introducir
mutaciones en fragmentos de ADN se describen más abajo. Los
fragmentos de ADN mutados se pueden clonar después v.g. en una
secuencia de nucleótidos tal como un plásmido de expresión adecuado
y se pueden expresar con posterioridad.
Por lo tanto, en otra realización, la invención
hace referencia a secuencias de nucleótidos que comprenden un
fragmento de ADN mutado que tiene la característica de que codifica
un derivado inmunogénico genéticamente destoxificado de la toxina
\beta de Clostridium perfringens según la invención o un
fragmento inmunogénico del mismo.
Como se ha mencionado antes, en una forma
preferida de esta realización la invención hace referencia a
derivados de toxina \beta que tienen una mutación que está
localizada en un dominio de transición entre las porciones neutra e
hidrófila de la toxina \beta. Semejante derivado de toxina \beta
puede ser elaborado expresando un fragmento de ADN que codifica
semejante derivado de toxina \beta.
Por lo tanto en una forma preferida el fragmento
de ADN mutado que codifica los derivados de la toxina \beta tiene
una mutación en al menos una región de ADN que codifica un dominio
de transición entre las porciones neutra e hidrófila de los
derivados de la toxina \beta.
Los derivados inmunogénicos destoxificados de la
toxina \beta de Clostridium perfringens según la invención
pueden ser obtenidos v.g. por medio de mutagénesis al azar del gen
que codifica la toxina \beta. Se conocen en la técnica muchos
modos de inducir la mutagénesis al azar, tal como v.g., la
mutagénesis inducida químicamente utilizando agentes químicos
mutagenizantes, la mutagénesis por radiación U.V. o radiación
\gamma o la mutagénesis al azar utilizando la tecnología del ADN
recombinante.
Las mutaciones a nivel de ADN también pueden ser
realizadas en sitios específicos: mutagénesis dirigida al sitio.
Esta se realiza con la ayuda de mecanismos de ingeniería genética
conocidos. Es posible, v.g., utilizar enzimas de restricción para
cortar fragmentos de ADN de o que abarcan regiones diana, y
remplazar estos fragmentos por fragmentos sintéticos que tienen una
secuencia mutada. La mutagénesis dirigida al sitio también es una
técnica muy conveniente para introducir mutaciones en las regiones
diana. Si la mutación tiene que ver con una mutación por
reposición, el marco de lectura quedará por supuesto inalterado.
También es posible una combinación de mutaciones por deleción y/o
inserción y mutaciones por reposición.
Los mecanismos de mutación de ADN descritos
antes son bien conocidos en la técnica y han sido descritos, i.a.
en Maniatis, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press,
ISBN 0-87969-309-6
(1989).
Un sistema de expresión bacteriano adecuado para
expresar los derivados de toxina \beta según la invención es la
propia bacteria Clostridium perfringens. El gen de la toxina
\beta natural puede ser remplazado fácilmente por el fragmento de
ADN mutado que codifica los derivados de la toxina \beta según la
invención utilizando la recombinación homóloga. La recombinación
homóloga es un mecanismo bien conocido en la técnica.
La bacteria Clostridium perfringens
recombinante obtenida de este modo produce después el derivado
inmunogénico destoxificado genéticamente de la toxina \beta de
Clostridium perfringens según la invención.
Por lo tanto, en otra realización más, la
invención hace referencia a una bacteria Clostridium
perfringens que comprende una secuencia de nucleótidos con un
fragmento de ADN mutado como se ha descrito antes.
No obstante se han encontrado varios problemas
adicionales durante el aislamiento de los derivados de la toxina
\beta de Clostridium perfringens tanto tóxicos como no
tóxicos alterados genéticamente a partir de Clostridium
perfringens. En primer lugar, el Clostridium es una bacteria
peligrosa de desarrollar, visto desde el punto de vista de la salud
de los trabajadores. El crecimiento de las especies de
Clostridium para la producción de toxina \beta debe tener
lugar en condiciones muy seguras que dificultan la producción a gran
escala. En segundo lugar como se ha mencionado antes, junto con la
toxina \beta se elaboran otras toxinas principales/secundarias.
El aislamiento y la purificación de la toxina \beta entre estas
otras toxinas, que son necesarios v.g. para la producción de
vacunas, son difíciles y llevan tiempo. En tercer lugar, las
especies de Clostridium son formadoras de esporas. Es
necesario pero difícil eliminar todas las esporas de la preparación
de la toxina \beta y al mismo tiempo conservar las
características inmunogénicas de la toxina \beta, puesto que estas
esporas son muy resistentes al calor y a los agentes químicos.
Por lo tanto, existe claramente la necesidad de
métodos para proporcionar toxina \beta libre de otras toxinas de
Clostridium y libre de esporas de Clostridium.
Los sistemas de expresión distintos de
Clostridium basados en la bacteria Gram negativa E.
coli para la expresión de la toxina \beta de
Clostridium han sido descritos con anterioridad. Los sistemas
de E. coli han sido utilizados por Hunter et al.
(Infect. & Immun. 61: 3958-3965 (1993)) para la
expresión del gen de la toxina \beta. Solamente se encontró una
pequeña banda correspondiente a la proteína de 34 kD esperada a la
vez que se encontró con mucho la mayoría de la proteína toxina
\beta en formas multiméricas de 118 kD grandes. Steinporsdottir
et al. (FEMS Microbiology Letters 130:
273-278 (1995)) intentaron expresar el gen de la
toxina \beta en E. coli como una proteína de fusión
fusionada a la
glutation-S-transferasa. Asimismo,
como Hunter, encontraron solamente toxina \beta no natural de
elevado peso molecular. Se concluyó en esta publicación, que la
proteína producida en E. coli tenía una conformación
diferente de la de la toxina \beta natural. Por lo tanto parece
probable que otras proteínas codificadas por Clostridium
jueguen un papel adicional en el plegamiento conformacional y la
excreción de la toxina \beta natural. Se sabe que este es el caso
para muchas otras proteínas bacterianas excretadas. Por esta razón,
puesto que como se ha mencionado antes existe un delicado
equilibrio entre estructura e inmunogenicidad, no se puede esperar
que la toxina \beta obtenida a partir de fuentes distintas de
Clostridium perfringens y por tanto en una forma no natural
sea una base eficaz para una vacuna, con independencia del sistema
de expresión utilizado.
Flaxman, D. T. et al., (Medical
Microbiology and Immunology 185:113/33 (1996)) mencionaron que ellos
habían expresado la toxina \beta monomérica en Bacillus
subtilis. No obstante, no estudiaron las herramientas de
expresión que utilizaron, sin tomar en cuenta que mencionaron el
plegamiento conformacional, y por lo tanto la inmunogenicidad de la
toxina \beta expresada de este modo.
Se ha encontrado ahora sorprendentemente, que la
expresión del gen de la toxina \beta natural en bacterias Gram
positivas distintas de Clostridium perfringens proporciona
una toxina \beta natural con todas las características y
actividades biológicas y biofísicas de la toxina \beta natural
producida en Clostridium perfringens, pero que tiene
numerosas ventajas muy deseables sobre la toxina \beta producida
en Clostridium perfringens o E. coli: a) no es
contaminada con esporas de Clostridium perfringens, b) es
producida libre de lipopolisacáridos contaminantes, c) es producida
libre de otras toxinas de Clostridium principales/secundarias
y d) se encuentra en su conformación natural.
La toxina \beta obtenida de este modo puede
ser inactivada con formalina más ventajosamente que la toxina
\beta obtenida a partir de Clostridium, puesto que el único
material biológico a tener en consideración durante la inactivación
es la propia toxina \beta: no es necesario tener precaución con
las esporas, lipopolisacáridos y otras toxinas de
Clostridium principales/secundarias, puesto que están
ausentes per se.
Por lo tanto, en otra realización más, la
invención se refiere a sistemas de expresión bacterianos Gram
positivos en los que la bacteria Gram positiva no es Clostridium
perfringens, comprendiendo dicho sistema de expresión el gen
que codifica la toxina \beta de Clostridium perfringens de
tipo salvaje.
El gen de la toxina \beta puede estar bajo el
control de su promotor natural. También se puede poner bajo el
control de un promotor heterólogo. Semejante promotor puede ser v.g.
el promotor Lac (Chang et al., Nature 275: 615 (1978)) o el
promotor Trp (Goeddel et al., N.A.R. 8: 4057 (1980)).
Semejante promotor puede ser un promotor fuerte,
que conduzca a la sobreexpresión de la toxina \beta, o puede ser
un promotor inducible. Ambas clases de promotores son conocidas en
la técnica.
Se han descrito diversos sistemas de expresión
para bacterias Gram positivas, y los plásmidos de expresión
versátiles para su uso en diversas familias de bacterias Gram
positivas son conocidos en la técnica. Pueden servir como ejemplo
los sistemas de expresión basados en el replicón de amplia gama de
huésped Gram positivos Enterocócicos de pAM\beta1 descrito por
Simon y Chopin (Biochimie 70: 559-567 (1988)). Se
pueden utilizar derivados de este plásmido para la expresión de
genes foráneos v.g., en especies de Streptococcus, Lactobacillus, y
Bacillus.
En el grupo de las bacterias Gram positivas
distintas de Clostridium, aquellas bacterias cuyo genoma
tiene un contenido en AT relativamente elevado son las más
adecuadas para la clonación y la expresión de genes del género
Clostridium. Por lo tanto, en una forma más preferida, la bacteria
Gram positiva utilizada para la preparación de la toxina \beta
natural o el derivado de la toxina \beta según la presente
invención se selecciona del grupo formado por Lactococcus,
Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus, Streptococcus,
Enterococcus, Staphylococcus, Bacillus, Sarcina, Ruminococcus o
Listeria.
Por supuesto resulta incluso más ventajoso
expresar un gen de toxina \beta mutado según la invención en una
bacteria Gram positiva distinta de Clostridium: es ese caso
el tratamiento de destoxificación con formalina puede ser
completamente omitido. El derivado no tóxico así obtenido, además de
estar libre de esporas, libre de lipopolisacáricos, libre de otras
toxinas de Clostridium principales/secundarias y de estar en
forma natural, tiene la ventaja adicional de que no es tóxico per
se.
Por lo tanto, en una forma más preferida, la
invención hace referencia a un sistema de expresión bacteriano Gram
positivo, no siendo dicha bacteria Gram positiva Clostridium
perfringens, que comprende una secuencia de nucleótidos que
codifica un gen de toxina \beta derivado según la invención o un
fragmento inmunogénico del mismo.
Otra realización más de la presente invención
hace referencia a vacunas para combatir las infecciones por
Clostridium perfringens, basadas en derivados inmunogénicos
destoxificados genéticamente de la toxina \beta de Clostridium
perfringens. Tales vacunas pueden ser elaboradas v.g. mezclando
una cantidad inmunológicamente suficiente de derivados
inmunogénicos destoxificados de la toxina \beta de Clostridium
perfringens según la invención y un portador fisiológicamente
aceptable. Se entiende que una cantidad inmunológicamente suficiente
es la cantidad de toxina \beta de Clostridium perfringens
inmunogénica destoxificada que es capaz de inducir una respuesta
inmunitaria protectora en un animal huésped. De este modo otra
realización de la invención hace referencia a vacunas para combatir
la infección por Clostridium perfringens que comprenden un
derivado del toxoide \beta de Clostridium perfringens según
la invención o un fragmento inmunogénico del mismo, y un portador
fisiológicamente aceptable.
Un portador fisiológicamente aceptable es v.g.
agua o una solución salina fisiológica. A menudo, la vacuna se
mezcla adicionalmente con estabilizadores, v.g., para proteger los
polipéptidos propensos a la degradación de ser degradados, para
aumentar la vida útil o para mejorar la eficacia de liofilización.
Los estabilizadores útiles son i.a. SPGA (Bovamik et al; J.
Bacteriology 59: 509 (1950)), carbohidratos v.g. sorbitol, manitol,
trehalosa, almidón, sacarosa, dextrano o glucosa, proteínas tales
como albúmina o caseína o los productos de la degradación de los
mismos, y tampones, tales como los fosfatos de metales alcalinos. Ni
que decir tiene, que se pueden utilizar otros modos de estabilizar
la vacuna añadiendo compuestos que también se incorporan a la
presente invención.
\newpage
Opcionalmente, se pueden añadir a la vacuna, uno
o más compuestos que tengan actividad coadyuvante. Los coadyuvantes
son estimuladores no específicos del sistema inmunitario.
Intensifican la respuesta inmunitaria del huésped al que se
administran inmunógenos. Por lo tanto, en una forma más preferida,
las vacunas según la presente invención comprenden un
coadyuvante.
Los ejemplos de coadyuvantes conocidos en la
técnica son el coadyuvante Completo e Incompleto de Freund, la
vitamina E, los polímeros de bloques no iónicos, los
muramildipéptidos, los ISCOM (complejos inmunoestimuladores, véase
por ejemplo la Patente Europea EP 109942), las Saponinas, el aceite
mineral, el aceite vegetal, y Carbopol (un homopolímero).
Los coadyuvantes, especialmente adecuados para
la aplicación a las mucosas son v.g. la toxina
termo-lábil de E. coli (LT) o la toxina del
Cólera (CT).
Otros coadyuvantes adecuados son por ejemplo el
hidróxido, fosfato u óxido de aluminio, las emulsiones en aceite
(v.g. de Bayol F (R) o Marcol 52 (R), las saponinas o el producto
solubilizado de vitamina E.
La vacuna según la presente invención puede ser
mantenida almacenada utilizando métodos conocidos en la técnica
para almacenar vacunas vivas. El almacenamiento se puede realizar
v.g. a temperaturas por debajo de cero.
La liofilización también es un método conocido y
adecuado para la conservación de vacunas. La liofilización tiene la
ventaja, de que estabiliza la vacuna de manera que puede mantenerla
en reserva a temperaturas bastante por encima de las necesarias
para mantener las reservas no liofilizadas. La vacuna según la
presente invención puede ser liofilizada muy eficazmente,
especialmente cuando se mezcla con estabilizadores tales como los
mencionados más arriba antes de la liofilización.
La vacuna puede ser administrada a todos los
huéspedes sensibles a la infección por Clostridium
perfringens tipo B o C, tales como el ser humano, los corderos,
las ovejas, las cabras, los cerdos, las aves y los terneros.
La vacuna puede ser administrada tan pronto como
el día del nacimiento, pero también puede ser administrada en
cualquier fase más tardía.
Las dosis de la vacuna están preferiblemente
entre 1 y 100 \mug del derivado por animal, dependiendo
parcialmente del tamaño del animal. Para cerdos, v.g. una dosis muy
adecuada oscila entre 20 y 80 \mug.
Aunque en principio se pueden utilizar todas las
rutas comunes de administración, la vacuna se administra
preferiblemente intraperitonealmente, intranasalmente,
intramuscularmente, subcutáneamente, oralmente o
intradérmicamente.
Otra realización más de la invención hace
referencia a un modo alternativo de elaborar una vacuna para
combatir las infecciones por Clostridium perfringens. Se
pueden utilizar bacterias y virus vivos atenuados o no patogénicos
que tengan un animal o humano sensible a Clostridium
perfringens tipo B o C como huésped, como portadores del gen de
la toxina \beta mutado según la invención como se ha descrito
antes. Estas denominadas vacunas portadoras recombinantes vivas se
pueden administrar de un modo seguro al
animal-huésped junto con un portador
fisiológicamente aceptable: se comportan no patogénicamente y
expresan un derivado de la toxina \beta no tóxico. Las vacunas
basadas en portadores recombinantes vivos tienen la ventaja de que
producen y o presentan derivados de la toxina \beta de
Clostridium perfringens directamente en el huésped.
Los animales vacunados con semejante bacteria o
virus recombinante producirán una respuesta inmunogénica no
solamente contra los inmunógenos del vector, sino también contra las
porciones inmunogénicas del polipéptido o los polipéptidos para los
cuales el código genético es clonado adicionalmente en el portador
recombinante. Esto tiene la ventaja de que administrando semejante
portador recombinante se puede obtener protección contra dos o más
enfermedades.
Muchos virus y bacterias portadores
recombinantes vivos son conocidos actualmente en la técnica.
Las bacterias portadoras recombinantes vivas
adecuadas son v.g. las especies de Salmonella y las especies de
E. coli. Los virus utilizados frecuentemente en la técnica
como portadores recombinantes vivos son los adenovirus, retrovirus,
virus vaccinia y herpesvirus. También es adecuado como portador
aplicable oralmente específico el Parvovirus Porcino. Otro virus
que es útil como virus portador recombinante vivo para llevar el
gen que codifica el \beta-toxoide es el
herpesvirus virus de la Pseudorrabia (PRV) (v.g. como se describe
en la Patente Europea Núm. 606.437). Semejante PRV que porta el gen
del toxoide \beta protegería a los cerdos de la infección por PRV
y por Clostridium perfringens
tipo C.
tipo C.
De este modo, las vacunas para combatir la
infección por Clostridium perfringens que comprenden un
organismo portador recombinante vivo que porta el gen de la toxina
\beta mutado según la invención también son por lo tanto parte de
la invención.
\newpage
Esta claro que la toxina \beta natural es un
importante factor, si no el más importante factor de virulencia en
Clostridium perfringens. Por lo tanto, una cepa de
Clostridium en la cual el gen de la toxina \beta natural
es remplazado por un gen de toxina \beta mutante según la
invención como se ha descrito antes ha perdido por consiguiente un
importante factor de virulencia. Semejante cepa puede ser utilizada
como vacuna atenuada viva, puesto que la toxina \beta no es
elaborada en su forma tóxica sino en forma de un derivado no
tóxico. La ventaja de semejante vacuna atenuada viva es que produce
una forma no tóxica pero todavía inmunogénica de la toxina \beta,
a la vez que tiene además todos los demás antígenos inmunogénicos de
la cepa de Clostridium perfringens natural.
Por lo tanto, las vacunas que comprenden una
cepa de Clostridium perfringens viva atenuada en la cual el
gen de la toxina \beta natural es remplazado por un gen de la
toxina \beta mutada según la invención también están incluidas en
esta invención.
También son abarcadas por la invención las
vacunas que comprenden, además de un derivado de la toxina \beta
según la invención, inmunógenos de otros patógenos. Esto permite
vacunar contra diversas enfermedades en una única etapa de
administración de la vacuna.
En una forma más preferida de esta realización,
la vacuna según la presente invención comprende inmunógenos
adicionales, seleccionados del grupo formado por Actinobacillus
pleuropneumoniae, virus de la Pseudorrabia, Virus de la
Influenza Porcina, Parvovirus Porcino, virus de la Gastroenteritis
Transmisible, rotavirus, Escherichia coli, Erysipelothrix
rhusiopathiae, Pasteurella multocida, Bordetella bronchiseptica,
Salmonella species, Mycoplasma hyopneumoniae, Haemophilus
parasuis y bacterias de tipo Helicobacter.
La presente invención también hace referencia a
los métodos para la preparación de la toxina \beta de
Clostridium perfringens natural, cuyos métodos están basados
en la expresión de una secuencia de nucleótidos que comprende un
fragmento de ADN que codifica dicha toxina \beta en bacterias Gram
positivas diferentes de Clostridium perfringens.
Además, la invención presenta métodos para la
preparación de derivados no tóxicos de toxina \beta de
Clostridium perfringens según la invención. Estos métodos
están basados en la expresión de secuencias de nucleótidos que
comprenden un fragmento de ADN que codifica un derivado de la toxina
\beta, en una bacteria Gram positiva.
Asimismo, la invención proporciona métodos para
la preparación de una vacuna para combatir la infección por
Clostridium perfringens. Tales métodos comprenden v.g.
mezclar un derivado de la toxina \beta de Clostridium
perfringens según la invención y un portador fisiológicamente
aceptable.
El plásmido pKS90 es un plásmido gram positivo
con replicación theta con un elevado número de copias
(40-80 por célula) basado en el plásmido pTREX1, que
es a su vez un derivado del plásmido pIL253 publicado previamente.
pIL253 incorpora el replicón de amplia gama de huésped Gram positivo
de pAMb1 (Simon, D., and A. Chopin. 1988. Construction of a vector
plasmid family and its use for molecular cloning in Streptococcus
lactis. Biochimie. 70: 59-567.) y no es
movilizable por el factor sexual de L. lactis. pIL253 también
carece de la función tra que es necesaria para la transferencia o
movilización eficaz por los plásmidos parentales conjugativos
ejemplificados por pIL501. El replicón pAMb1 Enterocócico ha sido
transferido previamente a diversas especies incluyendo especies de
Streptococcus, Lactobacillus y Bacillus así como a Clostridium
acetobutylicum, (Gibson, E.M., N.M. Chace, S.B. London and J.
London. 1979. J. Bacteriol. 137: 614-619. LeBlanc,
D.J., R.J. Hawley, L.N. Lee and E.J. St. Martin. 1978. Proc. Natl.
Acad. Sci. USA. 75:3484-3487. Oultram, J.D., and M.
Young. 1985. FEMS Micro. Lett. 27: 129-134.)
indicando la potencial utilidad de la amplia gama de huésped. Si
bien pTREX1(y pTREX1A) representan un vector de transcripción
constitutivo básico, el derivado pKS90 utiliza el acoplamiento
traduccional a una región de iniciación de la traducción lactocócica
con el fin de incrementar el nivel de expresión. Los detalles de la
construcción de pKS90 y su pTREX12 parental inmediato se dan más
abajo.
Se creó un fragmento de ADN artificial que
contenía una supuesta secuencia estabilizadora de ARN, una región
de inicio de la traducción TIR), un sitio de clonación múltiple para
la inserción de los genes diana y un terminador de la transcripción
mediante apareamiento de 2 oligonucleótidos complementarios y
prolongación con ADN polimerasa de Tfl. Los oligonucléotidos
efectores y antisentido contenían los sitios de reconocimiento para
NheI y BamHI en sus extremos 5' respectivamente para facilitar la
clonación. Este fragmento fue clonado entre los sitios XbaI y BamHI
en pUC19NT7, un derivado de pUC19 que contiene la casete de
expresión T7 de pLET1 (Wells, J.M., P.W. Wilson and R.W.F. Le Page.
1993. J. Appl. Bact. 74:629-636.) clonada entre los
sitios EcoRI y HindIII. El constructo resultante fue denominado
pUCLEX. La casete de expresión completa de pUCLEX fue separada
después cortando con HindIII y volviendo romos los extremos seguido
de corte con EcoRI antes de la clonación en los sitios EcoRI y SacI
(romos) de pIL253 para generar el vector pTREX. La supuesta
secuencia estabilizadora de ARN y la TIR están derivadas de la
secuencia del bacteriófago T7 de E. coli y modificadas en
una posición de nucleótidos para intensificar la complementariedad
del motivo de Shine Dalgarno (SD) con el ARN ribosómico 16s de
Lactococcus lactis. Un promotor cromosómico de Lactococcus
lactis MG1363 denominado P1 fue clonado entre los sitios EcoRI
y BglII presentes en la casete de expresión, creando pTREX1. Este
promotor había sido aislado previamente utilizando el vector sonda
del promotor pSB292 y caracterizado por la prolongación del cebador
y el análisis de secuenciación del ADN (Nick. R. Waterfield, R. W.
F. Le Page, P.W. Wilson, and J.M. Wells. Gene. 165. 1995.
9-15.). El fragmento promotor fue amplificado
mediante PCR utilizando la ADN polimerasa Vent. El fragmento de la
PCR incluía toda la secuencia de ADN aguas arriba del promotor
clonado y hasta 15 bases 3' con respecto al sitio de inicio de la
transcripción. La secuencia de Shine-Dalgarno (SD)
presente aguas abajo del sitio de inicio de la transcripción de este
promotor fue excluida deliberadamente del fragmento promotor
amplificado mediante PCR para evitar el inicio de la traducción en
sitios diferentes del codón de iniciación indicado en la casete de
expresión. Asimismo se han creado dos vectores similares
denominados pTREX7 y pTREX14 utilizando los promotores P7 y P14 más
débiles, clonados entre los sitios EcoRI y BglII en lugar de P1.
Los cebadores de la PCR utilizados para crear estos fragmentos
promotores se ilustran en la figura 1.d. El plásmido pTREX1A
representa una alternativa a pTREX1, en el cual la casete de
expresión unida a XbaI es remplazada por el fragmento de la casete
de expresión de T7 XbaI-SpeI de pET3A. Por lo tanto
la secuencia SD no está optimizada para Lactococcus. La secuencia de
pTREX1A completa y los esquemas que ilustran la casete de expresión
se ilustran en la figura 1.
El plásmido pKS90 es un derivado de pTREX1, que
si bien utiliza el mismo promotor de la transcripción P1, tiene una
TIR modificada que contiene la SD y los 20 primeros codones de un
gen de la resolvasa derivado cromosómicamente de Lactococcus, p11,
(Nick. R. Waterfield, R. W. F. Le Page, P.W. Wilson, and J.M. Wells.
Gene. 165. 1995. 9-15.). Esto se logró clonando una
secuencia de ADN artificial, que contenía la nueva TIR, entre los
sitios BglII y BamHI de pTREX1. Las secuencias de oligonucleótidos
utilizadas en este procedimiento se presentan en la figura 2. Por
medio de una selección cuidadosa de la secuencia del cebador de la
PCR, se puede acoplar traduccionalmente un gen diana derivado de la
PCR a esta TIR, que se ha demostrado que incrementa el nivel de
expresión cuando se compara con el obtenido del plásmido parental
pTREX1. La secuencia de pSK90 completa y un esquema que ilustra la
casete de expresión se ilustran en la figura 2.
El ADN de pJF2000 (suministrado por J. Frey,
Institute for veterinary bacteriology, University of Berne,
CH-3012 Beme, Switzerland) que comprende un gen que
codifica la toxina\beta publicado por Hunter et al.
(Infect. & Immun. 61: 3958-3965 (1993)) fue
sometido a electroporación en E. coli SURE. El ADN plasmídico
de seis transformantes independientes fue aislado, examinado
mediante digestión con enzimas de restricción y reunido. Estas cepas
fueron almacenadas a -70ºC en glicerol al 15%. El gen cpb con la
región de inicio de la traducción asociada (y el bucle
estabilizador de ARN aguas arriba) fue separado por corte de esta
preparación reunida de ADN plasmídico mediante digestión con
XbaI/BamHI o SmaI/BamHI. Los fragmentos del gen cpb purificados
fueron ligados en sitios de clonación múltiples de los vectores de
expresión pTREX1A, pTREX14 y pTREX7, que dirigen los niveles
elevado, medio y bajo de expresión constitutiva respectivamente.
Los fragmentos de cpb terminados en XbaI/BamHI fueron ligados en
pTREX1ANEW digerido con XbaI/BamHI mientras el fragmento de cpb
terminado en SmaI/BamHI fue ligado en el ADN de pTREX4 y pTREX7 con
BamHI/BglII (con extremos romos). Estos constructos fueron sometidos
a electroporación con éxito en la cepa especialmente inhabilitada de
Lactococcus lactis pep5- acmA-, que carece de una peptidasa
codificada cromosómicamente, pep5, que permite que el organismo
utilice los péptidos liberados de la caseína. Además, también
carece de una autolisina asociada a la pared celular, acmA.
Cualquier otra cepa de Lactococcus lactis es adecuada no
obstante para este fin. Se identificaron diez productos aislados
correctos de cada tipo utilizando el análisis de digestión con
enzimas de restricción y almacenaron a -70ºC en glicerol al 15%.
Estos tipos de cepas se designaron L. lactis pep5- acmA-
[pTREX1Acpb], L. lactis pep5- acmA- [pTREX14cpb] y L.
lactis pep5-acmA- [pTREX7cpb]. Además, el gen
cpb fue amplificado mediante PCR utilizando ADN polimerasa Vent y
oligonucleótidos terminados en BamHI del plásmido pJF2000. Este
producto de la PCR fue clonado en el sitio BamHI del vector de
acoplamiento con TIR pKS90.
La proteína total extraída de las células
semi-log y el sobrenadante fueron resueltos
utilizando SDS-PAGE antes de transferirlos a
filtros de nitrocelulosa. Estos filtros fueron sondeados con
anticuerpos tanto monoclonales como policlonales para Cpb,
utilizando toxina beta purificada con MAB (anticuerpo monoclonal)
como control. Se detectó un único producto proteico del tamaño
correcto (aproximadamente 30 kDA) en los sobrenadantes de cultivo
de las cuatro cepas, mediante transferencia western y tinción con
Azul de Coomasie de los geles SDS. La cantidad de toxina beta
secretada por cada cepa coincidía con las fuerzas relativas de los
promotores en los vectores de expresión utilizados. No se pudo
detectar toxina intracelular, sugiriendo que la secuencia
exportadora de Clostridium funciona eficazmente en Lactococcus. Se
demostró que los sobrenadantes filtrados del expresante de pTREX1A,
L. lactis MG1363 pep5- acmA- [p3-1/5], y del
expresante de pKS90 L. lactis MG1363 pep5- acmA-
[p5-123], contenían toxina activa, proporcionando un
control positivo para la toxina beta recombinante.
Los genes cpb mutantes fueron creados mediante
construcción génica in vitro utilizando fragmentos de PCR
amplificados por la ADN polimerasa Vent a partir del gen cpb molde
original (clonado a partir de C. perfringens tipo C)
presente en el plásmiodo pJF2000 (suministrado por J. Frey). Los
cebadores utilizados en esta construcción, y un ejemplo del
procedimiento de construcción empleado, se dan en la figura 3. La
inclusión de sitios BamHI en los extremos 5' de los cebadores de la
PCR cpbF2 y cpbR terminales permitía clonar estos mutantes en el
sitio BamHI del plásmido de expresión pKS90 (ver arriba). La
elección de cebadores de la PCR que incorporaban un sitio BamHI
adecuadamente distanciado con respecto al codón de iniciación ATG de
cpb, permitía acoplar traduccionalmente los genes de cpb mutantes
con la TIR P11 en pKS90. Se utilizó este método para generar una
serie de cepas de expresión mutante. Las secuencias exactas de estos
genes mutantes (tras la clonación en pKS90) fueron determinadas
secuenciando automáticamente con una redundancia de
3-4 veces, que confirmaba tanto las secuencias
génicas como la localización en los plásmidos de expresión. La
clonación de los genes mutantes en estos vectores permitía la
secreción del producto génico al sobrenadante de cultivo en virtud
del líder de exportación N-terminal de cpb natural.
El sobrenadante de cultivo fue esterilizado por filtración y
utilizado directamente en bioanálisis con animales.
Los plásmidos de expresión del toxoide basados
en pKS90 se propagan en la cepa huésped Lactocócica especialmente
deshabilitada, L. lactis MG1363 pep5- acmA-, pero también se
pueden utilizar otras cepas de Lactococcus. Esta cepa representa un
profago y una cepa curada de plásmido que es muy auxotrófica e
incapaz de sobrevivir en el entorno lácteo natural. Además crece a
una velocidad menor que otras cepas lactocócicas. Las cepas de
expresión no tóxicas construidas como se ha indicado antes se
representan en la tabla 1. En esta tabla, se indica qué aminoácidos
están mutados y dónde están localizadas las mutaciones. Las cepas
de expresión del toxoide se pueden hacer crecer en medio M17 (Difco
número de cat. 1856-17) suplementado con glucosa al
0,5% p/v y 5 g/ml de eritromicina. No se requiere aireación, por
supuesto se prefieren condiciones anóxicas aunque no es esencial. La
temperatura de crecimiento óptimo es de 30ºC. Se ha demostrado que
las diferentes proteínas toxoides producidas por todas estas cepas
se acumulan en el medio de cultivo a niveles de menos de 5 g/ml. El
análisis de transferencia Western utilizando anticuerpos tanto
monoclonales como policlonales confirmó que el monómero de la
proteína de tamaño correcto es secretado al sobrenadante por todas
las cepas denominadas expresantes enumeradas antes. La secuenciación
N-terminal de una proteína mutante ejemplo,
M4(4-3), confirmaba que el péptido líder es
correctamente escindido durante la exportación desde el citoplasma
lactocócico.
La mezcla de reacción de PCR típica se ajusta
como sigue:
- Tris-HCl 10 mM (pH 8,7 a 25ºC)
- KCI 50 mM, 5 \mug/ml seralbúmina bovina
- 0,5 \muM de cada uno de los cebadores de la PCR
- (cpbf2: 5'-ggaggatccaaatgaagaaaaaatttatttcattagttatag-3') (SEC ID NO : 3)
- (cpbR: 5'-atggatccgtctaaatagctgttactttgtgag-3') (SEC ID NO : 4)
- MgCl_{2} 4 mM
- 0,5 mM MnCl_{2}
- dNTP forzado, otros 3 dNTP 3,4 mM y 0,2 mM (la concentración de dNTP puede oscilar entre 0,1 y 10 mM)
- ADN molde 600 pM (clon de cpb pJF2000 u otro derivado de cpb)
- 2U de ADN polimerasa Taq
Las condiciones del ciclo térmico fueron las
siguientes:
(94ºC durante 30 segundos, 50ºC durante 60
segundos, 72ºC durante 180 segundos) 30 ciclos, seguido de
incubación a 72ºC durante 600 segundos.
Esta reacción se realizó utilizando cada uno de
los 4 dNTP como nucleótido forzado y después reuniéndolos. Esto
produce una mezcla de sustituciones adecuadamente al azar. Los
fragmentos de PCR reunidos fueron digeridos con BamHI y ligados en
pKS90 digerido con BamHI. Esta mezcla de ligadura fue transformada
en Lactococus lactis MG1363. Los transformantes se hicieron
crecer en cultivo líquido y los sobrenadantes filtrados se
sometieron a ensayo en el análisis de la toxina beta in
vitro descrito en el Ejemplo 3.
Se hizo crecer L. lactis que producía el
gen de la toxina \beta modificada en medio M17 (v.g. Difco cat.
1856-17), suplementado con glucosa al 0,5% p/v y 5
\mug/ml de eritromicina. No se requería aireación, eran
preferibles condiciones anóxicas aunque no esenciales. La
temperatura de crecimiento óptima es de 30ºC. La adición de glucosa
es necesaria durante el crecimiento exponencial.
El sobrenadante de cultivo se separó de las
células por medio de centrifugación. Después de la filtración
estéril del sobrenadante los derivados fueron precipitados con
sulfato de amonio (0,3 g/g). El producto precipitado se resuspendió
en PBS. Como alternativa se puede concentrar el sobrenadante de
cultivo en un filtro < 10.000 Da.
Los derivados de la toxina \beta producida en
L. lactis fueron sometidos a ensayo inicialmente mediante
inyección de sobrenadante de cultivo filtrado estéril,
intraperitonealmente, 0,5 ml en ratones NRMI que pesaban
aproximadamente 20 g. Los derivados pM 6-1,
6-5, y 6-7 eran letales a un nivel
similar al de la toxina natural. Los derivados pM
6-1, 6-5, y 6-7 han
sido modificados en las posiciones de aminoácidos Cys_{292}
\rightarrow Ala_{292}.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
En experimentos posteriores los sobrenadantes
que contenían los derivados fueron precipitados con sulfato de
amonio. Cada sedimento que contenía el derivado fue resuspendido en
PBS en un volumen 10x más pequeño. Cada derivado fue inyectado
intraperitonealmente en ratones. Los derivados pM
1-4, pM 1-10, pM
3-69 y pM 7-15 son todos no tóxicos
a niveles a los cuales la toxina de tipo natural es letal. Solamente
se vuelven tóxicos a concentraciones muy elevadas:
20-40 \mug/ml. Los derivados pM
4-18 y pM 6-16 tampoco son tóxicos a
niveles a los cuales la toxina de tipo salvaje es letal. Ni
siquiera son tóxicos a concentraciones superiores:
30-50 \mug/ml. Los 3 derivados restantes pM 2, pM
3-3 y pM 4-3 eran ligeramente
tóxicos. (La DL_{50} de la toxina de tipo salvaje es de 0,15
\mug/ratón). Ver también Tabla 2.
Se depilaron cobayas albinas de cría propia, 300
g, en un área de 4 x 8 cm en ambos lados. Se inyectaron 0,2 ml de
extracto intradérmicamente en 4 sitios de cada lado del animal. Los
animales fueron examinados al cabo de 24, 48 y 72 horas y la lesión
en los sitios de las inyecciones fueron puntuados. Necrosis obvia en
el sitio de la inyección (++++), eritema grave (+++), eritema
(+++), enrojecimiento (+), sin reacción (0).
Los derivados pM 1-4,
1-10, 3-3, 4-3,
6-16 y 7-15 no son
dermo-necróticos ni siquiera a concentraciones muy
elevadas.
Los derivados pM 6-1,
6-5, y 6-7 eran
dermo-necróticos a un nivel de 5 \mug/ml. No eran
dermo-necróticos a 0,5 \mug/ml. Tras la
concentración el derivado pM 3-69 se volvía
dermo-necrótico a dosis de 6 \mug/ml, lo que
corresponde al menos a 60x menos dermo-necrótico
que la toxina natural. El derivado pM 4-18 tiene un
potencial 15x menos dermo-necrótico que la toxina
natural. El derivado pM 2 no ha mostrado acción
dermo-necrótica alguna por las concentraciones
sometidas a ensayo de 1 \mug/ml y 2 \mug/ml respectivamente. Por
lo tanto pM2 es al menos 20x menos tóxico que la toxina natural.
Ver también la Tabla 3.
Las preparaciones de antígeno fueron coadyuvadas
con coadyuvante incompleto de Freund (50%), o Alhydrogen (20%),
respectivamente.
\vskip1.000000\baselineskip
El derivado 3-69 fue preparado a
una concentración de aproximadamente 40 \mug/ml y coadyuvado a una
concentración final de 20 \mug/ml. Se administraron 2 ml
intramuscularmente a los cerdos a intervalos de 2 semanas. Se
tomaron muestras de sangre antes de la 1ª vacunación, 2ª vacunación
y 2 semanas después de la 2ª vacunación. Se observaron los cerdos
en cuanto a efectos secundarios 24 horas después de la 1ª
vacunación. No se observaron efectos secundarios.
Se transfirió un cultivo de células BT (Células
de Cornete Nasal Bovino) tratadas con tripsina, 1,5 x 10^{5}
células/ml, en medio de Eagle con suero de ternera al 5% a una placa
de microtitulación de 96 pocillos, 100 \mul/pocillo. Las placas
fueron incubadas durante 24 horas a 37ºC y CO_{2} al 3%. Las
muestras de toxina \beta que se iban a someter a ensayo fueron
diluidas en PBS al 20ºC pH 7,0 en placas de dilución. El medio fue
descartado cuidadosamente de las células y se aplicaron 100 \mul
de diluciones de toxina \beta por pocillo. Las células fueron
incubadas después durante 30 minutos a 37ºC y CO_{2} al 3%. Las
muestras fueron cuidadosamente descartadas y se añadió medio de
Eagle de nueva aportación con suero de ternera al 5% a una
temperatura de 37ºC. Las células se incubaron durante tres días en
las mismas condiciones mencionadas antes. Después se descartó el
medio de las placas de microtitulación y se añadió solución de
tinción Giemsa de 5 \mul/pocillo. Al cabo de 10 minutos el agente
de tinción fue descartado y la placa fue lavada 3x con agua y se
dejó estar durante al menos 20 minutos para que se secara.
Todos los pocillos se verificaron en cuanto a la
presencia de células multinucleadas e irregularidades en la
monocapa. La carencia de estos signos en un pocillo específico es
indicativa de la presencia en ese pocillo de un derivado de toxina
\beta no tóxico. Aquellos derivados de toxina \beta que
demostraron ser no tóxicos fueron sometidos a ensayo en cuanto a su
inmunogenicidad en el ensayo ELISA semicuantitativo descrito más
abajo.
Se purificaron anticuerpos altamente específicos
originados contra la toxina \beta de Clostridium
perfringens natural en conejos sobre una columna de proteína A
y las placas del ELISA se recubrieron con aproximadamente 2
\mug/ml de estos anticuerpos específicos. Los sobrenadantes que
contenían los derivados de la toxina \beta fueron añadidos a las
placas diluyendo tres veces. Después de la incubación durante 1
hora, se utilizaron anticuerpos anti-toxina \beta
de C.p. de conejo policlonales conjugados con peroxidasa de rábano
picante para la detección.
Se consideraba que aquellos derivados de toxina
\beta que reaccionaban en el ELISA a un título no más bajo de
1.000 veces menor que la toxina \beta natural eran los derivados
no tóxicos y todavía inmunogénicos deseados de la toxina \beta
según la invención.
El derivado pM 1-4 fue producido
por la cepa pM 1-4 de Lactococcus lactis.
Tras la fermentación las células fueron separadas por
centrifugación (100.000 x g durante 35 minutos). Después, se
añadieron 0,31 g de sulfato de amonio a cada g de sobrenadante. La
mezcla se colocó a 4ºC durante 3 horas para la precipitación.
Después de la centrifugación a 100.000 x g durante 45 minutos el
producto precipitado se disolvió en 1/30 del volumen original y se
sometió a diálisis frente a PBS. El contenido final del derivado pM
1-4 fue cuantificado mediante
SDS-PAGE en relación con patrones de BSA. Finalmente
la solución de derivado se mezcló con Diluvac Forte® a una razón
1:1. La concentración final de pM 1-4 en la vacuna
era de 80 \mug/ml.
Se utilizaron cinco cerdos de 5 semanas de edad.
Los cerdos fueron vacunados con 2 ml intramuscularmente los días 0 y
21.
Se registraron las condiciones generales de los
animales durante la fase inicial tres horas después de la vacunación
conforme a la siguiente escala:
0 = sin síntomas
1 = levemente deprimido, piel rugosa (durante
menos de 1 hora)
2 = deprimido, con temblores (menos de 1
hora)
3 = deprimido, con temblores, tumbado y toma de
agua limitada (menos de 1 hora)
4 = vómitos, gravemente deprimido (menos de 1
hora)
5 = deprimido durante más de una hora y no
realiza la siguiente comida.
\vskip1.000000\baselineskip
Se tomaron muestras de sangre antes de la 1ª
vacunación (día 0), antes de la 2ª vacunación (día 21) y dos
semanas después de la 2ª vacunación (día 35) y se analizaron en
cuanto a los anticuerpos anti-toxina \beta
mediante ELISA competitivo. Descrito brevemente, el anticuerpo
monoclonal originado contra la toxina \beta natural se aplicó
como recubrimiento sobre la placa de ELISA. Se permitió que una
dilución seriada de suero reaccionara con una concentración fija de
la toxina \beta en una placa separada. Las mezclas de toxina y
sueros que contenían anticuerpos fueron transferidas a la placa
recubierta con Mab y se determinaron los contenidos en toxina
\beta natural restantes. Los títulos fueron calculados como la
inhibición del 50% de la toxina \beta no inhibida, en relación
con el patrón antitoxina WHO 1959.
Los cerdos no mostraban ninguna reacción clínica
debida a cualquiera de las vacunaciones: Ver tabla 4.
Un cerdo (Núm. 52) respondía a la 1ª vacunación.
Después de la segunda vacunación los cuatro cerdos se seroconvertían
y la media de título anti-toxina \beta era de 66
u.i. medido mediante ELISA. Los títulos individuales aparecen en la
Tabla 4
Todos los cerdos respondían a la vacunación con
toxina \beta modificada genéticamente produciendo anticuerpos
anti-toxina \beta que inhibían la toxina
\beta
Figura 1.a: estructura del plásmido pTREX1ANEW.
La secuencia codificadora del marcador de resistencia a antibióticos
MLS se muestra en la caja sombreada. Ori pAMB1: origen de
replicación del plásmido pAMB1, MLS: macrólidos, lincosamidas, gen
de resistencia al antibiótico estreptogramina B. La estructura de la
casete de expresión clonada entre los sitios EcoRI y SacI romo de
pIL253 se muestra más abajo. Las diferentes regiones funcionales de
la casete se muestran como cajas rayadas. Se indican los sitios de
restricción únicos. SD: secuencia de Shine-Dalgarno
complementaria al ARNr 16S de L. lactis, ATG: codón de inicio
de la traducción servido por SD.
Figura 1.b: la secuencia de pTREX1A completa,
incluyendo las posiciones de las enzimas de restricción. (SEC ID NO:
27).
Figura 1.c: rasgos de la casete de expresión
pTREX1 muy similar. (SEC ID NO: 26).
Figura 1.d: oligonucleótidos utilizados para
crear los fragmentos promotores derivados de la PCR en pTREX7, -14 y
-1A (mostrados 5'-3') (SEC ID NO: 19, 20, 23, 24,
21, 22).
Figura 2.a: el vector de acoplamiento a TIR
pKS90, representación esquemática de la casete de expresión
pKS90.
Figura 2.b: la secuencia pKS90, incluyendo
posiciones de las enzimas de restricción. (SEC ID NO: 25).
Figura 2.c: oligonucleótidos utilizados para
crear la secuencia de ADN artificial formadora de la región TIR de
pKS90. (SEC ID NO: 28, 1).
Figura 3.a: cebadores utilizados en la
construcción de los mutantes de Cp\beta. (SEC ID NO: 7, 6, 9, 8,
11, 10, 13, 12, 14, 16, 15, 18, 17, 2, 4, 3).
Figura 3.b: ejemplo del procedimiento de
construcción utilizado para Cp\beta M1.
Figura 4: Secuencia de aminoácidos de la toxina
\beta de Clostridium perfringens. (SEC ID NO: 5).
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Akzo Nobel N.V.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: Velperweg 76
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Amhem
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: Holanda
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL (ZIP): 6824 BM
\vskip0.500000\baselineskip
- (G)
- TELÉFONO: 0412 666379
\vskip0.500000\baselineskip
- (H)
- TELEFAX: 0412 650592
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Vacuna de Clostridium Perfringens
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 28
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- FORMA LEGIBLE CON ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO MEDIO: Disco Flexible
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: PC compatible con IBM
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOPORTE LÓGICO: PatentIn Release Núm. 1.0, Versión Núm. 1.30 (EPO)
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 86 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CUALIDAD DE LA HEBRA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA EL SEC ID NO: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 38 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CUALIDAD DE LA HEBRA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGAGGATCCA AATGAATGAT ATAGGTAAAA CTACTACT
\hfill38
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA EL SEC ID NO: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 42 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CUALIDAD DE LA HEBRA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGAGGATCCA AATGAAGAAA AAATTTATTT CATTAGTTAT AG
\hfill42
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA EL SEC ID NO: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 33 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CUALIDAD DE LA HEBRA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipATGGATCCGT CTAAATAGCT GTTACTTTGT GAG
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA EL SEC ID NO: 5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 64 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CUALIDAD DE LA HEBRA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA EL SEC ID NO: 6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 27 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CUALIDAD DE LA HEBRA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAGATGAATAT GCAGCAGCGA TAAATCT
\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA EL SEC ID NO: 7:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 24 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CUALIDAD DE LA HEBRA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGAAATGACAA CTTTAATAAA CTTA
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA EL SEQ ID NO. 8:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 27 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CUALIDAD DE LA HEBRA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTGAAGACATA TCATCATCTA AGTTTAT
\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA EL SEC ID NO: 9:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 27 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CUALIDAD DE LA HEBRA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 9:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAAAAAAGAAG ATGTTATAAA AAAATAC
\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA EL SEC ID NO: 10:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 27 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CUALIDAD DE LA HEBRA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 10:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipATCTGCTGCT GCTGAAGACA TAAATCC
\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA EL SEC ID NO: 11:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 24 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CUALIDAD DE LA HEBRA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 11:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGTTATAAAAA AATACAATTT GCAT
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA EL SEC ID NO: 12:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 27 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CUALIDAD DE LA HEBRA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 12:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAGAAATTGTA TCTTCATCAA TACTATC
\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA EL SEC ID NO: 13:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 24 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CUALIDAD DE LA HEBRA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 13:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCAAAAAACTG TATCCAATAC AATG
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA EL SEC ID NO: 14:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 24 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CUALIDAD DE LA HEBRA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 14:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTTATACATTT GGGGTATCAA AAGC
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA EL SEC ID NO: 15:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CUALIDAD DE LA HEBRA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 15:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipATAATAAGCG TTTCTTTCAC G
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA EL SEC ID NO: 16:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 24 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CUALIDAD DE LA HEBRA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 16:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCTTAATTGGA ATGGTGCTAA CTGG
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA EL SEC ID NO: 17:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 27 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CUALIDAD DE LA HEBRA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 17:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipACAGTTTTGT TGCTGCTGCA TTTTAAC
\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA EL SEC ID NO: 18:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 24 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CUALIDAD DE LA HEBRA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 18:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTATTATCTTA ATTGGAATGG TGCT
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA EL SEC ID NO: 19:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 29 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CUALIDAD DE LA HEBRA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 19:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGAAGATCTCT AGCTTTGAGC TGTAATAGA
\hfill29
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA EL SEC ID NO: 20:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 33 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CUALIDAD DE LA HEBRA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 20:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCGGAATTCAG TTGAACTACT TTTTTTAGTT TTA
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA EL SEC ID NO: 21:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 33 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CUALIDAD DE LA HEBRA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 21:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGAAGATCTGA TACTTGTATT ATAACATATC TAC
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA EL SEC ID NO: 22:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CUALIDAD DE LA HEBRA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 22:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCGGAATTCGA TTAAGTCATC TTACCTCTTT
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA EL SEC ID NO: 23:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 31 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CUALIDAD DE LA HEBRA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 23:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGAAGATCTGT AATGTTTCGC AACTCTACTA T
\hfill31
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA EL SEC ID NO: 24:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 32 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CUALIDAD DE LA HEBRA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 24:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCGGAATTCAG GACTAATTGA TGAAACTTTT CT
\hfill32
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA EL SEC ID NO: 25:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 5217 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CUALIDAD DE LA HEBRA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 25:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA EL SEC ID NO: 26:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 5230 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CUALIDAD DE LA HEBRA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 26:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA EL SEC ID NO: 27:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 5231 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CUALIDAD DE LA HEBRA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 27:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA EL SEC ID NO: 28:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 86 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CUALIDAD DE LA HEBRA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 28:
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (14)
1. Un derivado inmunogénico destoxificado de la
toxina \beta de Clostridium perfringens o un fragmento
inmunogénico del mismo, caracterizado porque porta una
mutación localizada en un dominio de transición entre las porciones
neutra e hidrófila de la toxina \beta.
2. El derivado inmunogénico destoxificado de la
toxina \beta de Clostridium perfringens o un fragmento
inmunogénico del mismo según la reivindicación 1,
caracterizado porque porta una mutación localizada en la
posición 62, 182, 197 o en una de las regiones entre el aminoácido
número 80-103, 145-147,
281-291, 295-299 o aguas abajo de
la posición del aminoácido 292 con respecto al péptido líder
metionina.
3. El derivado de la toxina \beta de
Clostridium perfringens o un fragmento inmunogénico del mismo
según la reivindicación 1 o 2, caracterizado porque la
mutación se localiza en una de las regiones entre el aminoácido
número 80-82, 95-97,
101-103 o 287-291.
4. Una secuencia de nucleótidos que comprende un
fragmento de ADN mutado codificando dicho fragmento de ADN mutado
una toxina \beta de Clostridium perfringens inmunogénica
destoxificada o un fragmento inmunogénico de la misma según las
reivindicaciones 1-3.
5. La bacteria Clostridium perfringens
que comprende una secuencia de nucleótidos según la reivindicación
4.
6. Un sistema de expresión basado en una
bacteria Gram positiva, siendo dicha bacteria Gram positiva una
especie de Lactococcus que comprende una secuencia de nucleótidos
según la reivindicación 4.
7. Una vacuna para combatir la infección por
Clostridium perfringens, caracterizada porque
comprende un derivado de la toxina \beta de Clostridium
perfringens o un fragmento inmunogénico del mismo según las
reivindicaciones 1-3, y un portador fisiológicamente
aceptable.
8. Una vacuna según la reivindicación 7,
caracterizada porque comprende un coadyuvante.
9. Una vacuna para combatir la infección por
Clostridium perfringens, caracterizada porque
comprende un organismo portador vivo, portando dicho organismo un
fragmento de ADN según la reivindicación 4.
10. Una vacuna para combatir la infección por
Clostridium perfringens, caracterizada porque
comprende una cepa de Clostridium perfringens atenuada viva
en la cual el gen de la toxina \beta natural está remplazado por
un nucleótido según la reivindicación 4.
11. Una vacuna según las reivindicaciones
7-10, caracterizada porque comprende
adicionalmente inmunógenos de otros patógenos.
12. Una vacuna según la reivindicación 11,
caracterizada porque los otros inmunógenos mencionados de
otros patógenos se seleccionan del grupo formado por
Actinobacillus pleuropneumoniae, virus de la Pseudorrabia,
virus de la Influenza Porcina, Parvovirus Porcino, virus de la
Gastroenteritis Transmisible, rotavirus, Escherichia coli,
Erysipelothrix rhusiopathiae, Pasteurella multocida, Bordetella
bronchiseptica, Salmonella sp., Mycoplasma hyopneumoniae,
Haemophilus parasuis y bacterias de tipo
Helicobacter.
13. Un método para la preparación de derivados
de la toxina \beta de Clostridium perfringens según las
reivindicaciones 1-3, caracterizado porque
una secuencia de nucleótidos que comprende un fragmento de ADN que
codifica un derivado de la toxina \beta según la reivindicación 4
es expresado en una bacteria de la especie Lactococcus.
14. Un método para la preparación de una vacuna
para combatir la infección por Clostridium perfringens,
caracterizado porque dicho método comprende mezclar un
derivado de la toxina \beta de Clostridium perfringens
según las reivindicaciones 1-3 y un portador
fisiológicamente aceptable.
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