TWI221847B

TWI221847B - Clostridium perfringens vaccine

Info

Publication number: TWI221847B
Application number: TW087119292A
Authority: TW
Inventors: Ruud Philip Antoon Mari Segers; Nicolas Robin Waterfield; Peer Lyng Frandsen; Jeremy Mark Wells
Original assignee: Akzo Nobel Nv
Priority date: 1997-06-20
Filing date: 1998-11-20
Publication date: 2004-10-11
Also published as: HU9801384D0; DE69836520T2; CN1215729A; AU743498B2; NZ330749A; CN101914145A; ES2276448T3; JP4234232B2; CA2235445A1; JPH11103872A; DE69836520D1; US6610300B1; DK0892054T3; BR9802361A; EP0892054A1; KR19990007306A; ATE346931T1; PT892054E; ZA985393B; EP0892054B1

Description

經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1221847 A7 _ B7 五、發明説明（1 ) 本發明提及產氣莢膜梭菌Θ -毒素去毒性免疫原衍生物、此衍生物的去氧核糖核酸（D N A )編碼、含有此衍生物DNA編碼的產氣莢膜梭菌、含有此衍生物DNA編碼的革蘭氏陽性細菌表現系統、表現野生型一毒素的非產氣莢膜梭菌爲基礎的革蘭氏陽性細菌表現系統、以對抗產氣莢膜梭菌爲基礎的疫苗、製備天然產氣莢膜梭菌石一毒素的方法、製備產氣莢膜梭菌/5 -毒素去毒性免疫原衍生物的方法以及製備用以對抗產氣莢膜梭菌疫苗的方法。產氣莢膜梭菌（亦名韋耳煦氏梭菌（C. whlchii )是廣泛的梭菌屬的一種類。屬於此屬的全部細菌是可形成孢子的厭氧革蘭氏陽性桿菌。產氣莢膜梭菌可再分成亞種，目前已有5個亞種被描述，通常稱爲A - E型。全部的亞種能製造數種毒素，包括主要及次要毒素。4個主要毒素爲 α，/5，£和^毒素。全部的產氣莢膜梭菌亞種皆會製造 α —毒素。Θ -毒素是由產氣莢膜梭菌Β型和C型所製造。此外，產氣莢膜梭菌的全部亞種可製造一連串的次要毒素。由於5個產氣莢膜梭菌亞種呈現一種或更多種這些不同的毒素，所以全部的產氣莢膜梭菌亞種皆爲致病性的。已知Α型對人和豬是致病性的，Β型主要對小羊、綿羊和山羊是致病性的，及引起 ''小羊痢疾〃和出血性腸炎，（：型對人、綿羊、小牛、小羊、豬和鳥是致病性的，可引起 ''羊胃腸病〃、出血性腸炎、壞死性腸炎和羊傳染性腸毒病。如上所述，已知產氣莢膜梭型B和C型能製造点-毒本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐1 Γ4Τ (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

1221847 A7 B7 五、發明説明（2) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 素。Θ -毒素在人和動物壞死性腸炎的致病上扮演重要角色。在人類，此病被稱爲壞死性腸炎（Johnson et al, :Lancet ii ·· 496 — 500 (1987))。在動物中，壞死性腸炎已被描述於小牛、小羊和豬（H a u s c h i 1 d, A. H. W. in S. Kadis, T. C. Montie (ed.)Microbial toxins, P · 1 5 9 — 1 8 8 ，Academic press, Inc.

New York (19 7 1) and Willis, T. A. Anaerobic bacteriology : clincial and laboratory practice, 3 r d ed. Butterworths, hondon ( 1 9 7 7 ):從產氣莢膜梭菌已分離出純型的冷一毒素（Sakurai et al., Infect. &

Irnnuin. 18:741-745(1977)，Sakurai et al·，Toxicon 25: 1301 - 131 0(1987) )。關於此毒素的生物物理特性和作用模式很多仍未知。然而，事實上已能獲得純化型式的-毒素毒性的動物實驗明確證實。從老鼠和天竺鼠中所純化的/3 -毒素致命性毒性已由 Sakurai 等證明（Infect. & Immun. 21:6 7 8 — 6 8. 0(1 9 7 8 ) ，Sakurai et al，Toxicon 2 5 :1301-1310 (1987))° 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製產氣莢膜梭菌的々一毒素核脊酸序列最近已由Hunter 等人闡明（Infect.&Immun.6 1:3 9 5 8-3965 (1993))。此核苔酸序列反應出々一毒素蛋白質大小約3 5仟道耳頓。由於產氣莢膜梭菌B型和C型的f -毒素在致病上所扮演的角色是最重要的事情，因此許多努力皆放在發展對本紙張尺度適用中國國家標準（ CNS ) A4規格（210X 297公楚) ~ 1221847 A7 _____B7 五、發明説明（3) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 付此毒素上面。對抗Θ -毒素的免疫力就足夠保護對付產氣莢膜梭菌B型和C型的感染。要引起對抗θ —毒素免疫力的唯一方法就是給予毒素到動物體內引起保護。因此很明顯的此毒素必需要以去毒性型式給予，否則將因施打疫苗而引起動物嚴重疾病或死亡。以去毒性/3 —毒素爲基礎的疫苗稱爲Θ 一類毒素，已從1 9 6 0年就可取得（譬如G. P. Pat No. 901， 433 和 U.S.Pat.No· 3，288，680) ο 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製然而目BU以去活性產氣莢膜梭菌yg 一毒素爲基礎的疫苗有許多重大的缺點。第一點，全部以石一毒素爲基礎的疫苗含化學性去毒性，主要是福馬林去毒性Θ 一毒素，這些年顯示要標準化這些去毒性作用過程是非常困難的。蛋白質去毒性作用的傳統化學方法的缺點是會相當隨機的改變蛋白質全部結構。因此，在化學去毒性作用過程中，冷一毒素的免疫原特性也被快速減少，如曲線圖示1和2所示，在標準狀況下去毒性化々一毒素，使用至少1 %的福馬林是必要且非常普遍使用的去活性化合物。然而如曲線 1和2所見：隨著福馬林量增加，抗原性力價則明顯減少冬本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） 1221847 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 Α7 Β7 五、發明説明（4) 無論如何無法得到一完全的力價，因爲即使是使用去毒性作用的最低福馬林需求量（曲線2 )，也已給了一減少的力價。此即要兼具去毒性及合理力價所得之免疫原性只存在於非常有限的範圍。事實上這個非常有限的範圍不外乎至少3個可變數；去毒性作用的時間、溫度和精確的福馬林濃度，因此要再現性的製造去毒性々-毒素是非常困難的。因此其它用以去毒性化々-毒素的方法是高度被需求的。到目前爲止仍未發現其它可選擇且能接受的方法，理由如下：去毒性作用之足夠程度和保留免疫原性間的微妙平衡，隱含蛋白質結構和生物物理特性間的密切關連。因此可預期的是在蛋白質去毒性作用時可能改變蛋白質結構，同時也有意義的破壞了蛋白質的免疫原特性。. 本發明的優點之一就是第一次揭示避免上述問題的方法：使用基因操作技術意外的發現相當大且專一性的胺基酸區域，此區域突變後可提供所要的Θ -毒素非毒性衍生物且不會破壞所必需的免疫原特性。如此，在一實施例中，本發明是敘述產氣莢膜梭菌冷一毒素的去毒性免疫原衍生物或其中的免疫原片斷帶有至少一個突變在其胺基酸序列中，而此突變未在野生型石-毒素內發現。雖然已了解的免疫原片斷不包含完整長度的石一毒素衍生物胺基酸序列，但仍包含可引發宿主動物保護性免疫反應的衍生物區域。比較Θ —毒素衍生物與野生型/3 -毒素胺基酸序列，本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210Χ297公釐） ~ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

1221847 A7 ______ _B7 五、發明説明（5 ) 已了解突變在於；S 一毒素衍生物的胺基酸改變。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 突_包括取代、刪除、插入或倒轉或其中之相互結合。备如可用其它不同特性的胺基酸取代一個或更多個石一毒素的胺.基酸。以正電荷胺基酸取代負電荷胺基酸，譬如以離胺酸取代天冬胺酸。另一合適的取代作用爲以脂肪性胺基酸取代方香環胺基酸，譬如以甘胺酸取代色胺酸。也可以親水性的取代厭水性胺基酸，譬如以天冬胺酸取代異白胺酸。因此依據本發明之Θ 一毒素衍生物的最佳型式，其中至少一個突變是取代突變。很明顯的’取代作用之外，突變包括插入及/或刪除一個或更多的胺基酸以提供一毒素去毒性衍生物，仍能引發免疫原性反應也是本發明的一部分。因此依據本發明之冷一毒素衍生物之相同最佳型式，其中至少一個突變是刪除或插入。當製造兩個或更多突變時，結合取代和刪除/插入突變的可能性是相等的。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製如果一毒素衍生在老鼠中的LD 5 0 (在一實驗中能殺死全部動物之5 0 %的致死劑量）至少高於1 0倍的天然万一毒素L D 5 0，則可視爲非毒性；而天然々一毒素的LD50約0·15微克/老鼠。如前所提，本發明的優點之一是與以往文獻的假定相違背，也就是發現/3 -毒素經基因改變其胺基酸成非毒性後’仍能得到具免疫原性之類毒素的可能性。並非所有的本紙張尺度適用中.國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -8 - 1221847 A7 _ B7 五、發明説明（6) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 突變皆能達到所要的非毒性且仍是$ 一毒素免疫原衍生物。因此就發展快速篩選及選擇仍具免疫原的Θ 一毒素非毒生衍生物突變體之檢測方法。此檢測能篩選大量會製造仍具免疫原的f 一毒素非毒性衍生物突變體。此檢測將揭示如下。另外也發現介於Θ -毒素中性和親水性部分的那些區域所形成的轉變範圍，適合作爲導入突變的目標區域以形成具有所要特性的Θ -毒素非毒性衍生物。這些區域可藉由霍普一伍德演算式（Hopp-Woods algorithm )輕易找出此冷一毒素的序列（Hopp and Woods; Proc. Natl.

Acad· Sci 78:38248- 3828 (1981 )) 0 因此’本發明所敘述具有突變的/3 —毒素衍生物在此貫施例中的更好型式爲，其突變位在介於Θ -毒素中性和親水性部分的轉變範圍內。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製非常適合做突變的標的區域位於相對於領導者胜肽甲硫胺酸位置6 2、位置1 8 2、位置1 9 7、介於胺基酸號碼 80 - 103、 145 — 147、281 — 291、 295 — 299 ，以及胺基酸位置292獨一之半胱胺酸下游區域。因此本發明所敘述具有突變的Θ -毒素衍生物更好的型式爲其突變位於柑對於領導者胜肽甲硫胺酸位置6 2、 18 2、 1 9 7和介於胺基酸號碼8〇一 1 0 3、 1 4 5 —147、281 — 291、295 — 299 及/或胺基本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210Χ 297公釐） ~" 1221847 A7 B7 五、發明説明（7) 酸位置9 2 9下游區域間至少一個位置。另一更好型式爲突變位於位置62、 80—82、 95 — 97、 1 0 1 - 1 0 3. 145 — 147、 182 、197、 287-291以及295-299。依據本發明的/5 -毒素非毒性免疫原衍生物能經由化學性取代或改變蛋白質中的胺基酸來製造。亦可經由導入突變在Θ —毒素的基因編碼內來製造。在DNA片斷內導入突變的方法敘述如下。被突變的 D N A片斷可選殖到一合適的表現質體核苷酸序列中，並可接著用於表現。因此在另一實施例中，本發明所敘述包含一突變 DNA片斷的核苷酸序列，是具有依據本發明之產氣莢膜梭菌/3 —毒素或其中之免疫原片斷的去毒性免疫原基因編碼特性。如上所述，本發明所敘述具有突變的/3 —毒素衍生物在此實施例中的較好型式爲其突變位在介於/3 —毒素中性和親水性部分的轉變範圍內。此—毒素衍生物能藉由表現編碼此/9 -毒素衍生物的D N A片斷來製造。因此編碼此Θ -毒素衍生物的突變D N A片斷的較好型式，是其突變至少一個位在介於/5 -毒素衍生物中性和親水性部分的轉變範圍內之D N A編碼區域。依據本發明之產氣莢膜梭菌々一毒素去毒性免疫原衍生物’可藉由隨機突變万-毒素基因編碼的方法來取得。文獻中已知有許多方法可引發隨機突變，譬如：使用化學 ^纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐) :1〇 - ~ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 • __ 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1221847 . A7 B7 五、發明説明（8) 性突變劑的突變作用、U · V照射或7 一射線的突變作用或使用D N A重組技術的突變作用。在D N A階段的突變可在特殊位置上突變，亦即定位突變，可藉由已知的基因工程技術協助達成。可能使用限制酶切斷目標區域內或周圍的D N A片斷，並以含有突變序列的合成片斷將之置換。定位突變也是一個非常方便的技術用於導入突變到標的區域內。如果所使用的突變是取代突變，則編閱區當然未改變。結合刪除及/或插入突變以及取代突變也是有可能的。以上所描述的D N A突變技術已熟知且已被敘述於 Molecular Cloning，Cold Spring Harbor haboratory

Press，ISBN 0 — 87969-309-6(1 989)。爲表現出依據本發明的—毒素衍生物，產氣莢膜梭菌本身就是一個合適的細菌表現系統。利用同源重組作用可以很容易的將yS -毒素衍生物編碼的突變D N A片斷取代天然々-毒素基因。同源重組作用是一已熟知的技術。如此所得的重組產氣莢膜梭菌可以製造依據本發明中的產氣莢膜梭菌Θ -毒素基因去毒性免疫原衍生物。因此仍在另一實施例中，本發明所敘述的產氣莢膜梭菌包含上述突變之D N A片斷的核苷酸序列。然而在分離產氣莢膜梭菌Θ —毒素，包括有毒性及基因改變非毒性々-毒素衍生物時，皆遇到數個額外的問題。第一，以從業員工健康觀點而言。梭菌是具危險性的細菌。爲製造Θ —毒素而培養梭菌屬必需在高度安全性環境 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

本紙張尺度適用中國國家標準（CMS ) A4規格（210X297公釐） -11 - 1221847 A7 B7 五、發明説明（9) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁} 下執行’因此要大·規模製造有困難性。第二點如前所述，許多其他主要/次要毒素與/3 一毒素一起被製造，因此要從這些毒素中分離並純化Θ 一毒素以製造疫苗是相當困難且耗時。第三，梭菌屬是孢子形成細菌，因此在製備石一母素時必需除去孢子且要保留$ 一毒素的免疫原特性是困難的，因爲這些孢子是高耐熱及抗化學劑的。因此，很明顯需要一個方法來提供/3 -毒素從其它梭菌毒素和梭菌孢子中游離出來。以往已描述以革蘭氏陰性菌大腸桿菌爲基礎用來表現梭囷冷一毒素的非梭菌表現系統。Hunter et al. Infect. & 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製

Immun 61 : 3958 — 3965 (1993))已使用大腸桿菌系統來表現々-毒素基因。很明顯的大部分的石一毒素蛋白質是在大的1 1 8仟道頓多聚形中發現，只有一小部分對照到所預期的3 4仟道耳頓蛋白質。 Steinporsdottir et al. ( FEMS Microbiology Letters 130 : 273-278 (1995))試著將石一毒素基因與麩氨基硫轉移酶基因結合後在大腸桿菌內表現出一結合蛋白。他們也與 Hunter —樣只發現非天然的/3 -毒素高分子重量。本文中的結論是在大腸桿菌內製造的蛋白質與天然々-毒素具不同的構形。因此可能其它的梭菌蛋白在天然yS -毒素構形形成與分泌扮演額外的角色。在其它很多細菌的分泌蛋白質已有此實例.。基於這個理由，如上所提的結構與免疫原性之間存在微妙平衡，因此不管所使用的表現系統爲何，除了產氣莢膜梭菌外其它可獲得的本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -12 - 1221847 A7 _ B7 五、發明説明（1〇) 冷一毒素是非天然型式的，因此不能期望用來做爲疫苗的有效基礎。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 現今很驚訝的發現，在產氣莢膜梭菌之外的其它革蘭氏陽性細菌內表現天然的/5 -毒素基因，提供有如在產氣莢膜梭菌內所製造天然的；5 —毒素，具有天然点一毒素的全部生物及生物物理特性和活性，但比在產氣莢膜梭菌或大腸桿菌內所製造的Θ-毒素擁有數個更合意的優點：a )不會污染到產氣莢膜梭菌的孢子，b )不會製造污染性的脂多醣，c)不會製造其它的產氣莢膜梭菌主要/次要毒素以及d )製造的—毒素具天然構形。因爲不用考慮孢子、脂多醣和其它主要/次要的梭菌毒素，因此所得的0 -毒素以福馬林去活化時比從梭菌所得的Θ —毒素更具優點，因爲只要考慮/3 -毒素本身即可〇因此仍在另一實施例中，本發明敘述的革蘭氏陽性細菌表現系統是指非產氣莢膜梭菌的革蘭氏陽性細菌，且該表現系統包含編碼野生型產氣莢膜梭菌々-毒素的基因。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 /5 —毒素基因能在它的天然啓動子下被控制，也能在異質性啓動子下受控制，譬如乳糖啓動子（La c - p r 〇 m 〇 t ο Γ )(Chang et al·，Nature 275:615 (1978) )或色胺酸啓子動（Trp-promotor ) ( Goeddel et al.5 N. A. R. 8 : 4 0 5 7 ( 1 9 8 0 ))。如此的啓動子可能是一強力啓動子引導過度表現/3 —毒素，或是一可被引發的啓動子。這兩種啓動子已知於文獻中。本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） -13 : 經濟部智慧財產局員工涓費合作社印製 1221847 A7 B7 五、發明説明（數種革蘭氏陽性細菌的表現系統已被描述，且使用於數科革蘭氏陽性細菌內可移動的質體也已知於文獻中。如一範例可做爲表現系統的，是以腸球菌的廣泛革蘭氏陽性宿主範圍爲基礎的p A Μ /3 1複製子（replicon )如 Simon and Chopin ( Biochimie 7 0 : 5 5 9 -567 (1988))所述。此質體的衍生物能使用於在鏈球菌、乳酸桿菌和桿菌屬內表現外來基因。這非梭菌的革蘭氏陽性細菌中，以其基因組具有相對較高A 丁含量的細菌最適合選殖及表現梭菌屬的基因。因此較適合用來製備本發明中的天然石一毒素或一毒素衍生物的革蘭氏陽性細菌，最好選自乳酸球菌屬、乳酸桿菌屬、白色念珠菌屬、稚球菌屬、鏈球菌屬、腸球菌屬、葡萄球菌屬、桿菌屬、瘤胃球菌屬或李斯特氏菌屬。在革蘭氏陽性細菌內表現依據本發明的突變Θ 一毒素基因當然比在梭菌內有更多的優點··在此情況中以福馬林做去毒化處理可被完全忽略。所得到Θ 一毒素非毒性衍生物不含孢子、脂多醣、其它的主要/次要梭菌毒素且爲天然型式，額外的優點是它是非毒性的。因此本發明所敘述的革蘭氏陽性細菌表現系統中的革蘭氏陽性細菌不是產氣莢膜梭菌，且含有依據本發明的卢 -毒素衍生物基因或其中之免疫原片斷的核苷酸序列。本發明的另一實施例所敘述用來對抗產氣莢膜梭菌感染的疫苗’是以產氣莢膜梭菌/5 -毒素去毒性免疫原衍生物基因爲基礎。此種疫苗的製造可經由將免疫原性足夠量本紙張尺度顧巾關緖準（CNS ) A4祕（210X297公釐) 7^ '~ (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

1221847 A7 B7 五、發明説明（ (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 的產氣莢膜梭菌Θ —毒素去毒性免疫原衍生物與生理上可接受的攜帶者混合而成。免疫原性足夠量是指能引起宿主動物保護性免疫反應的產氣莢膜梭菌yS —毒素去毒性免疫原的量。如此本發明另一實施例中所敘述用來對抗產氣莢膜梭菌感染的疫苗，包含依據本發明的產氣莢膜梭菌Θ -類毒素之衍生物或其中之免疫原片斷，以及一生理上可接受的攜帶者。生理上可接受的攜帶者譬如水或生理食鹽溶液。通常，此疫苗會額外的與穩定劑混合，譬如：用以保護多胜鏈分解、提高疫苗的儲存壽命、或促進冷凍乾燥之效率。有用的穩定劑如S P G A ( Bovarnik et al., J. Bacteriology 5 9 : 5 0 9 ( 1 9 5 0))，山梨糖醇、甘露醇、海藻糖，澱粉，蔗糖、聚葡萄糖或葡萄糖等碳水化合物，白蛋白或酪蛋白或其分解產物等蛋白質，以及鹼金屬磷酸鹽緩衝液。其它能穩定此疫苗而加入的化合物當然也包括於本發明中。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製可能選擇性的加入一個或更多個具有佐藥活性的化合物到疫苗中。佐藥是免疫系統的非專一性刺激物，它們對宿主被給與的免疫原提高免疫反應。因此，依據本發明之疫苗以一較佳之型式是包含佐藥的。文獻中已知的佐藥例子包括 Freunds氏完全和不完全佐藥、維生素E、非離子性阻塞聚合物、胞壁醯二肽、 I S C〇M s (免疫刺激複合物，歐洲專利European Patent EP 1 〇 9 9 4 2 )、皂角苷、礦物油、植物油和本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） :1 5: 1221847 A7 __ 五、發明説明（13) 聚羧乙烯（同質聚合物）。 (諳先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 特別適合於黏膜施用的佐藥是大腸桿菌熱不穩定毒素 (L. T )或霍亂毒素（C T )。其它適合的佐藥，舉例而言如三水合氧化鋁、磷酸鹽或氧化物、油乳劑（譬如 Bayol F (11)或 Marcol 5 2 ( R > )、皂角苷或維生素E溶解鹽。依據本發明之疫苗能使用文獻中已知用來貯存活疫苗的方法來保存。能於零下溫度貯存。冷凍乾燥是一已知且適合保存疫苗的方法，它具有穩定疫苗的優點，所以能在溫度中維持於庫存內比那些維持於非冷凍乾燥的庫存好。依據本發明之疫苗能非常有效率的冷凍乾燥，特別在冷凍乾燥前與上述所提的穩定劑混合時。此疫苗能給與所有對產氣莢膜梭菌B或C型感染敏感的宿主，譬如人、山羊、綿羊、山羊、豬、鳥和牛。此疫苗能於一出生就給與，也能於往後任何階段給與〇經濟部智慧財產局員工消費合作社印製部份依照動物大小給與每隻動物最好的疫苗劑量介於 1和1 0 0微克的衍生物，譬如豬的較適合劑量範圍介於 2 0和8 0微克。雖然原則上全部常用的給藥途徑皆能使用，但此疫苗以腹膜內、鼻內、肌肉內、皮下、口服或皮內等方式給藥〇本發明另一實施例敘述製造對抗產氣莢膜梭菌感染之 ^ 16- 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 1221847 A7 B7 五、發明説明（11 -- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 疫苗的另一改變方法。將含有對人類或動物宿主致敏感性的產氣莢膜梭菌之減毒或非致病性活細菌和病毒，做爲上述本發明之突變Θ -毒素基因的攜帶者。這些所謂的活重組攜帶者疫苗能與生理上可接受的攜帶者一起安全的給與動物宿主：它們的作用是非致病性且能表現Θ -毒素非毒性衍生物。這個以活重組攜帶者爲基礎的疫苗具有直接在宿主內製造或呈現產氣莢膜梭菌-毒素衍生物之優點。以此種重組細菌或病毒疫苗來接種動物所製造的免疫反應不僅能對抗載體內的免疫原，也能對抗額外選殖到重組攜帶者內具有免疫原性的部分多胜肽基因。因此給與此種重組攜帶者擁有保護對抗兩種或更多疾病的優點。目前的文獻中已知很多活重組攜帶者病毒或細菌。經濟部智慧財產局員工涓費合作社印製合適的活重組攜帶者細菌例如：沙門氏菌屬和大腸桿菌屬。文獻中常用的活重組攜帶者病毒有腺病毒、反轉錄病毒、牛痘病毒和疱疹病毒。豬的小D N A病毒（ Parvovirus )也適合用於口服專用的攜帶者病毒。另一做爲活重組攜帶者病毒以攜帶編碼yS -類毒素基因的病毒是疱疼假性狂犬病病毒（P RV )(描述於 European Pat. No. 6 0 6 ，4 3 7 )。此種攜帶/9 一類毒素基因的 P RV能保護豬對抗P RV和產氣莢膜梭菌C型的感染。如此，用於對抗產氣莢膜梭菌感染的疫苗包括一攜帶依據本發明之突變Θ -毒素基因的活重組攜帶者生物，也是本發明的一部分。很明顯的天然Θ -毒素如果不是產氣莢膜梭菌最重要本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2】0X297公釐） -17 - 1221847 A7 B7 立、發明説明（的毒性因子，也會是很重要的一個毒性因子。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 因此，一梭菌屬菌株的天然Θ -毒素基因被上述本發明的突變Θ —毒素基因置換後，將因此失去一重要的毒性因子，像此種菌株便能做爲一活減毒疫苗，因爲它的万-毒素已無法製造其毒性型式，但仍呈一非毒性衍生物型式。此種活減毒疫苗的優點是它能製造一非毒性但仍具免疫原型式的Θ —毒素，且具有產氣莢膜梭菌菌株全部的其它天然免疫性抗原。因此本發明也包括以本發明之突變yg —毒素基因置換天然毒素基因所形成的活減毒產氣莢膜梭菌疫苗。本發明之疫苗除了包括依據本發明之^ -毒素衍生物外，也包含其它致病原之免疫原。如此能接種一次疫苗就可對抗數種疾病。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製在此較佳實施例中’依據本發明之疫苗包括額外的免疫原，可選自胸膜肺炎放線桿菌、假性狂犬病病毒、豬流行性感冒病毒、豬小D N A病毒、傳染性胃腸炎病毒：輪狀病毒、大腸桿菌、丹毒桿菌、多死性巴斯德氏菌、支氣管敗血性鮑台氏菌、沙門氏菌屬、呼吸不全肺炎黴漿菌、假自殺性嗜血桿菌和類螺旋菌屬。本發明也敘述製備天然產氣莢膜梭菌Θ 一毒素的方法 ’此方法是在產氣莢膜梭菌以外的革蘭氏陽性細菌內表現編碼該/5 —毒素D N A片斷的核苷酸序列。再者’本發明呈現依據本發明之產氣莢膜梭菌万一毒素非毒性衍生物的製備方法。這些方法是在革蘭氏陽性細 -18- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) 規格（2丨〇>< 297公釐）經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1221847 A7 B7 五、發明説明（叫菌內表現編碼yS -毒素衍生物D N A片斷的核苷酸序列。本發明也提供製備疫苗的方法，此疫苗能對抗產氣莢膜梭菌感染。這些方法包括將產氣莢膜梭菌^-毒素衍生物與生理上可接受的攜帶者混合。範例1 : 表現質體PKS90、 pTREXIA、 pTREX7和 PTREX14的構築。 P K S 9 0質體是以P TREX 1質體爲基礎的高複本數（每個細胞4 0 — 8 0 )、0 -複製的革蘭氏陽性質體；而pTREXl是先前已發表的P I L253質體的衍生物。p I L 2 5 3倂入具有廣泛革蘭氏陽性宿主範圍複製子的 p A M b 1 ( Simon, D., and A. Chopin. 1 9 8 8，構築一載體的質體家族並使用於乳酸鏈球菌的分子選殖。Biochimie 7 0 ·· 5 9 — 5 6 7)，且無法由乳酸乳酸球菌的性因子移動。P I L 2 5 3也缺乏轉移或接合之親代質體有效移動所必需的t r a功能，可經由 P I L 5 0 1證實。腸球菌屬PAMb 1複製子先前已轉移到許多不同細菌中，包括鏈球菌、乳酸桿菌和桿菌屬，以及醋酸酪酸梭菌（Gibson，Ε. Μ. N. M. Chace, S. B. London and J. .London, 1 9 7 9 ，J. Bacteriol.l 3 7 : 6 14 — 619，LeBlanc，D. J.，R. J. Hawley，L. N. Lee and E. J. St. Martin, 1 9 7 8 J Proc. Natl. Acad. Sci. USA 7 5 : 3 4 8 4 — 3 4 8 7 ? Oultram, J. D.? andM. 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐) -19 - ^ .(請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

84 1Χ 2 2 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 . A7 _______B7 五、發明説明（

Young, 1 9 8 5 ^ FEMS Micro. Lett. 2 7-1 2 9 -134)，顯示具有廣泛宿主範圍實用之潛力。然而 pTREXl (和PTREX1A)是一基本的轉錄載體，其衍生物P K S 9 0利用轉譯上連接到乳酸乳酸球菌轉譯起始區域，以求增加表現程度。p K S 9 0及其直接親代p T R E X 1之詳細構築如下所述。 pTREXl: 一個人造的DNA片斷包括：一假定性的RNA穩定序列、轉譯起始區域（T I R )、給標的基因插入的多選殖位置、以及接連兩互補寡核苷酸並以Τ ί 1 D Ν Α聚核酶延長得到一個轉錄終結者。此正股和反股的寡核苷酸分別在它們的5 ’末端含有N h e 1及B a m Η I限制酶辨認位置以利選殖。將此片斷選殖到ρ U C 1 9 N 丁 7 的Xbal及63茁：《1之間，而？1]〇 19NT7是含有來自 pLETl T7 表現匣（Wells, W.

Wilson and R. W. F. Le Page. 1 9 9 3 J. Appl. Bact. 74:629 — 636)選殖到？11(：19 EcoRI 和H i n d HI位置間的P U C 1 9衍生物。所得之構築命名爲PUCLEX。然後將PUCLEX完整的表現匣以 H i n dn切開並補平，再以E c oR I切除移去，之後再選殖入PIL253的EcoRI和SacI (平頭）位置，以產生p T R E X載體。假定性的R Ν A穩定序列和丁 I R是衍生自大腸桿菌T 7噬菌體序列，並改變一個本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21〇Χ 297公釐） :20 - " (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

1221847 . _B7___ 五、發明説明（1今 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製核苷酸位置以提高 Shine Dalgarno ( S D )序列對乳酸乳酸球菌1 6 S核醣體R N A的互補性將乳酸乳酸球菌 M G 1 3 6 3染色體啓動子.命名爲P 1的選殖到表現匣的 EcoRI和BamHI位置而形成pTREXl。此啓動子先前已使用啓動子探針載體p S Β 2 9 2分離，並以引子延伸法和D Ν Α序列分析（Nick. R. Waterfield.，R. W. F. Le Page., P. W. Wilson, and J. M. Wells. Gene 165 ，1995 ，9 一 15)。此啓動子片斷，使用 Vent DNA聚核酶以聚合酶連鎖反應（P C R )增幅，所得的P C R片斷包括所選殖的啓動子上游全部D Ν A序列 ’以及到轉譯起始位置3 ’端1 5個鹽基。位於此啓動子轉譯起始位置下游的S D序列刻意排除於P C R所增幅的啓動子片斷中，以避免轉錄起始位置不在表現匣所指的起始密碼。兩個類似的載體名爲p T R E X 7和 P TR EX 1 4也被製造出來，它們是分別使用較弱的 P 7和P 1 4啓動子在E c oR I和Bg 1 Π位置間將 p 1取代。使用於產生這些啓動子片斷的P C R引子例舉於圖1 · d。pTREXIA質體是pTREXl的改變體’將PTREX1 Xbal範圍內的表現匣以來自 PET3A的Xbal— Spel 丁 7 -表現匣取代。因此其S D序列對乳酸乳酸球菌就不能發揮效用。完整的 P T R E X 1 A序列與表現匣的圖解舉例於圖1中。 P K S 9 〇：質體pKS 9 0是pTREX 1的衍生物，本紙張尺度適用^~^操準（(：奶）六4規格（2】0/ 297公釐） :21 - " 1221847 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（， p K S 9 0使用相當好轉譯啓動子P 1 ，具有包括S D經改變的T I R，以及一個乳酸乳酸球菌染色體解結酶基因 P 1 1 衍生物（Nick. R. Waterfield，R. W. F. Le Page, P· W. Wilson, and J. M. Wells. Gene. 165，1995 ’9 -15)。經由選殖一包含此新T I R的人造D N A序列到p 丁 R E X 1的B g 1 Π和B a m Η I位置間而完成質體p K S 9 0，此過程所使用的寡核苷酸呈現於圖2。透過慎選一 P C R引子序列，其p C R衍生標的基因的轉錄作用能與此T I R連合，且與其親代質體pTREX 1所得之結果比較後，顯示增加表現的程度。完整的 • P K S 9 0序列和表現匣的圖解舉例於圖2中。能分泌活性Θ -毒素之乳酸乳酸球菌基因重組菌株之構築將含有/3 —毒素基因如 Hunter et al發表（Infect. & Immun. 61:3958 — 3965(1993))的 PJF 2 0 0 0 DNA (由 J. Frey, Institute for veterinary bacteriology, University of Berne, C H — 3 0 12 Berne, Switzerland提供）以電穿透作用進入 E. Coli SURE 。從6個獨立的轉形子中分離出質體 D N A，以限制酶檢驗後合倂在一起。將這些菌株保存於一 7〇°C、 15% 甘油中。使用 Xbal/BamHI 或 S m a I / B a m Η I分解所製備合倂在一起的質體 D N A，以切除常與轉錄起始區域（以及上游R Ν Α穩定本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） -22 - (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1221847 ΑΊ * 五、發明説明（2G) 幹環）連接的C p b基因。將此純化的c p b基因片斷連接到分別代表高、中、低持續表現程度的P T R E X 1 A 、pTREX14和PTREX7表現載體的多選殖位置。具X b a I / B a m Η I末端的c p b片斷連接到以 Xba I/BamHI 分解的 pTREXIANEW，而具S m a I / B a m Η I末端的c p b片斷連接到以 BamHI/Bg 1 Π (平頭）消化的 pTREX14 和 p 丁 R E X 7 D N A中。這些構築物能很成功的用電穿透作用進入特殊的乳酸乳酸球菌P e p 5 - a c m A _菌株中，此菌株缺乏編碼胜肽酶p e p 5的染色體基因及缺乏細胞壁結合自溶素基因a c m A ;而p e p 5基因能使生物體利用從酪蛋白所釋放出的胜肽，然而其它任何的乳酸乳酸球菌都能適應此目的。每種型式的菌株分離出1 0 個正確的分離株，並使用限制酶分解分析鑑定後保存於一 7 0 °C、 1 5 %甘油中。這些菌株型式命名爲乳酸乳酸

球菌 pep5_ a cmA~ [pTREX7 cpb〕、乳酸乳酸球菌P e p 5 一 a c m A ' [ p T R E X 1 4 c p b〕和乳酸乳酸球菌p e p 5 _ a c m A -[ p T R E X 7 cpb〕。此外，使用 Vent D N A 聚合酶經PCR從質體p J F2000增幅c pb基因並用B a m Η I分解，將所得具B a m Η I末端寡核苷酸 PCR產物選殖到與T I R連合的載體p k s 9 0的 B a m Η I位置。全部的蛋白質從指數中期細胞中萃取出’以及懸浮物本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） -23 - (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1221847 Α7 Β7 五、發明説明（21) 於轉移到硝基-纖維素濾紙前先使用S D S -聚丙烯醯胺膠凝體電泳（S D S - P A G E )分析。這些濾紙使用對抗C. p b的單株和多株抗體探測，以純化的々一毒素 M A B (單株抗體）爲對照組。經由西方點墨法和考馬斯藍染色的S D S凝膠，從全部4個菌株的培養懸浮物中偵測到一個正確大小（接近3 0仟道耳頓）的單一蛋白質。每株菌所分泌的/5 -毒素量與所使用的表現載體啓動子相對強度相符合。沒有偵測到細胞內毒素，因而推測在乳酸球菌屬中能有效率的執行梭菌排出功能。從P T R E X 1 A 表現者，乳酸乳酸球菌M G 1 3 6 3 p e ρ 5 ~ a citiA 一〔p3 - 1/5〕及 PKS90 表現者，乳酸乳酸球菌 MG 1 3 6 3 p e ρ 5 " a cmA~ [ρ5 - 1 2 3〕所過濾的懸浮物顯現含有活性毒素，提供做爲基因重組Θ —毒素的正對照組。 c p b突變基因突變的c p b基因的產生是在活體外，以V e n t DNA聚合酶經PCR從質體pJF2000 (由 J.

Frey提供）中的原始c p b基因模板（選殖自產氣莢膜梭菌C型）所增幅的P C R片斷經基因構築而成。此構築所使用的引子及程序舉例於圖3中。在c p b F 2和 c p b R P C R引子終端的5 ’末端包括B a m Η I位置，能使這些突變株選殖到ρ K S 9 0表現質體的 B a ηι Η I位置（如上所示）。所選擇合倂B a m Η I位本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21〇Χ 297公楚Ί -24 - " (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

1221847 A7 B7 五、發明説明（θ 置的P C R引子與C p b A T G起始密碼結合，能使此突變的c p b基因能在pKS 9 0內轉錄連合到p 1 1 T I R。這個方法被使用來產生一連串的突變表現菌株。這些突變基因（選殖到p K S 9 0之後）的正確序列，以自動化序列分析3 - 4倍長之基因決定之，.以確認在表現質體中的基因序列和位置。這些載體所選殖的突變基因能利用天然c p b N -端輸出領導者的優點將此基因產物分泌到培養懸浮液中。此培養懸浮液以過濾滅菌並直接使用於動物生物分析中。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -25- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 1221847 A7 B7 五、發明説明（23) 表1 :突變基因的構築築構變突

4I r—IM PI 0 IX1 1±Mp γ

Ki D

A A

A A o 8 At K D

H 2Mp 3I 3Mp

K T FGl

E Al K

D

D D

A A 9 6I 3Mp

3 I 4 M PI 8 r—II 4Mp

Mp p 5 \)y I—I I T I 6 - 6mm 6 T±I 6Mp

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N K

V

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A c 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 △

A G N w N 5 1±I 7Mp

E

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Q Q Q (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） -26 - 1221847 A7 B7 五、發明説明（24) 突變表現菌株： (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁} 以p K S 9 0爲基礎的類毒素表現質體在特殊缺失的乳酸球菌宿主菌株乳酸乳酸球菌M G 1 3 6 3 p e ρ 5 一 a c m A _內增殖，但也能使用其它的乳酸球菌屬菌株。此種菌株呈現繁殖和質體痊癒，是高自營性且不能存活於天然的牛奶環境中。此外它比其它乳酸球菌屬菌株生長得慢。非毒性表現菌株之構築如上表1所示，在此表中指出那些胺基酸被突變及其所在位置。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製此類毒素表現菌株能生長於補充〇 · 5 %重量/體積葡萄糖和5克/毫升紅黴素的Ml 7培養基中（Difco cat. number 1 8 5 6 — 1 7 )。不需充氧，而厭氧環境較好但並非必要，適合的生長溫度是3 0 °C。全部這些菌株所製造的不同類毒素蛋白質顯示聚積於培養液中的濃度小於5克/毫升。使用單株和多株抗體做西方點墨法分析，確認此正確大小的單體蛋白質是由以上所列的全部表現菌株分泌到懸浮液中的。其中一例之突變蛋白質Μ 4 ( 4 一 3 )的Ν —端序列已確認其領導胜肽從乳酸球菌的細胞質運送出去之過程中的分裂是正確的。 c p b基因隨機突變作用之內容：典型P C R反應混合設定如下： 10毫莫耳濃度三鹽基鹽酸（pH8 · 7在25°C) 5 0毫莫耳濃度氯化鉀，5微克/毫升牛血淸白蛋白本紙張尺度適用中國國家榇準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） -27 - 1221847 A7 —_B7_—_· 五、發明説明（25) 〇 · 5微莫耳濃度的個別P C R引子 < (cpbg2: 5,-ggaggatccaaatgaagaaaaaatttatttcattagttatag-3,) (cpbR: 5,-atggatccgtctaaatagctgttactttgtgag-3,) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 4毫莫耳濃度氯化鎂 0.5毫莫耳濃度氯化錳

3 · 4毫莫耳濃度促成dNTP和0 . 2毫莫耳濃度其它 3dNTPs (dNTP濃度在〇 · 1和1.0毫莫耳濃度之間）6 0 0微微莫耳濃度的模板D N A ( p J F 2 0 0 0 c p b選殖株或其它c p b衍生物）2單位 T a q DNA聚合酶熱循環狀況如下： (9 4 °C 3 0 秒，5 0 °C 6 0 秒，7 2 °C 1 8 0 秒） 3 0個循環，之後於7 2 °C置6 0 0秒。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製此反應是利用4 d N T P s各做爲促成核苷酸後再聚集一起，如此能造成一合適隨機混合的取代作用。將所聚集的P CR片斷以B amH I分解並連接到pKS 9 0的 B a m Η I位置，再將此連接好之混合物轉形到乳酸乳酸球菌M G 1 3 6 3內。轉形體於液體培養液內生長，並過濾其懸浮液測驗如範例3中的活體外/3 -毒素分析。範例2 : 乳酸乳酸球菌的培養：製造改變過的/3 -毒素之乳酸乳酸球菌能生長於補充本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） -28 - 1221847 A7 Β7 五、發明説明（ 0 · 5%重量/體積葡萄糖和5克/毫升紅黴素的M1 7 培養基中（譬如 Difco cat number 1 8 5 6 - 1 7) 〇 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 不需充氧，而厭氧環境較好但並非必要，適合的生長溫度是3 0 °C。指數期生長期間加入葡萄糖是必須的。抗原之製備：經由離心將培養懸浮液與細胞分開，將懸浮液過濾滅菌後之衍生物以硫酸銨（〇 . 3克/克）沈澱，再將此沈澱物以P B S打散。另一方面可使用小於1 0，0 0 0道耳頓濾紙濃縮培養懸浮液。老鼠致死率：在乳酸乳酸球菌所製造的/3 -毒素衍生物最初測試，是以腹膜內注射0 . 5毫升的無菌已過濾之培養懸浮液到約20克重的NRMI老鼠。衍生物pM6—1、 6—5 和6 — 7的致死程度類似天然的毒素。衍生物p Μ 6 - 1 、6—5和6-7已改變其胺基酸位置半胱胺酸292—丙胺酸2 9 2。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -29- 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X 297公釐） 1221847 A7 B7 五、發明説明（27) 表2 :老鼠致死率測試衍生物死亡數/全部（接近微克/毫升）無菌已過濾之懸浮液懸浮液之硫酸銨濃度 PM 1 -4 0/5(5微克/毫升） 2/2(20微克/毫升） pMl-io 0/5(5微克/毫升） 2/2(20微克/毫升） pM 2 0/5(5微克/毫升） 1/2(〜4微克/毫升） PM3-3 0/5(5微克/毫升） 1/2(30微克/毫升） PM3-64 0/5(5微克/毫升） 2/2(30微克/毫升） PM4-3 0/5(5微克/毫升） 1/2(30微克/毫升） P M 4 -1 8 0/5(1.5微克/毫升） 0/2(30微克/毫升） pM6-1 5/5(0.5微克/毫升） 2/2(50微克7毫升） PM6-5 5/5(0.5微克/毫升） 2/2(50微克/毫升） PM6-7 5/5(5微克/毫升） 2/2(50微克/毫升） pM6-1 6 0/5(5微克/毫升） 0/2(50微克/毫升） PM7-15 0/5(5微克/毫升） 2/2(40微克/毫升） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

經濟部智慧財產局員工消費合作社印製在接下來的實驗中，以硫酸銨沈澱含有衍生物的懸浮液。以小於1 0倍體積的P B s將每個含有衍生物的沈澱物打散再懸浮，將衍生物腹膜內注射到老鼠。野生型毒素是致死性的，而衍生物PM4— 18、pMl - 1〇、 P Μ 3 — 6 9和p Μ 7 - 5全是無毒性程度，除非濃度高達2 0 - 4 0微克/毫升才變成有毒性。衍生物ρΜ4 — I紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ 297公釐） -30 - ^ ~ " 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1221847 .Α7 Β7 五、發明説明（2今 1 8和p Μ 6 - 1 6也是無毒性程度，而其野生型毒素是致死性的，但他們即使濃度高達3 0 - 5 0微克/毫升也無毒性的。剩餘3個衍生物Ρ Μ 2、ρ Μ 3 - 3和ρ Μ 4 一 3是輕微毒性的。（野生型毒素的5 0 %致死劑量 LD5。是0 . 1 5微克/老鼠）。參見表2。天竺鼠的皮膚壞死：取3 0 0公克純種白化症的天竺鼠，將其身體兩邊刹除4x8公分大小的毛，在每邊的4個位置皮內注射 0 · 2毫升萃取物。2 4、4 8和7 2小時後檢查動物並評分注射位置的損害程度，在注射位置很明顯的損害（ + + + + )，嚴重紅斑（+ + + )，紅斑（+ + )，發紅 (+ )，沒反應（〇）。衍生物 PM1 - 4、1 一 10、3-3、4-3、6 一 1 9和7 - 1 5即使在非常高的濃度也是非皮膚壞死的〇衍生物PM6 - 1、6 - 5和6 - 7在濃度5微克/ 毫升即是皮膚瓌死的，而於0 · 5微克/毫升則不是皮膚壞死的。衍生物ρ Μ 3 - 6 9濃縮後在劑量6微克/毫升時轉爲皮膚壞死的，至少濃縮6 0倍後比其天然毒素有較低的皮膚壞死性。衍生物Ρ Μ 2分別以濃度1微克/毫升和2微克/毫升測試皆無顯示任何皮膚壞死反應，因此 Ρ Μ 2至少濃縮2 0倍且比其天然毒素有較的皮膚壞死性。參見表3。本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ 297公釐1 :31 - (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

1221847 A7 B7 五、發明説明（29) 疫苗之製備：抗原的製備分別加入福蘭德氏不完全佐藥（5 0 % )( 或 Alhydrogen ( 2 0 % 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製

Freund’s incomplete adjuvant )佐藥。衍生物無菌已過濾之懸浮液懸浮液之硫酸銨濃度 1-4 0 (5微克/毫升） 0 (10微克/毫升） 0 (4微克/毫升） 1-10 0 (5微克/毫升） 0 (10微克/毫升） 0 (4微克/毫升） 2 0 (1微克/毫升） 0 (2微克/毫升） ⑴ (1微克/毫升） 3-3 0 (5微克/毫升） 0 (15微克/毫升） 0 (6微克/毫升） 3-69 0 (5微克/毫升） + + + (15微克/毫升） + + (6微克/毫升） 4-3 0 (5微克/毫升） 0 (5微克/毫升） 0 (5微克/毫升） 4-18 0 (1.5微克/毫升） (+) (15微克/毫升） 0 (6微克/毫升） 6-1 + + + + (5微克/毫升） 0 (5微克/毫升） 0 (0.5微克/毫升） 6-5 + + + + (5微克/毫升） n. d 微克/毫升 0 (0.5微克/毫升） 6-7 + + + + (5微克/毫升） η. d . 6-16 0 (0.5微克/毫升） + + + + (10微克/毫升） + + (2.5微克/毫升） 7-15 0 (5微克/毫升） 0 (25微克/毫升） 0 (5微克/毫升） 0 (20微克/毫升） 0 (20微克/毫升） 0 (8微克/毫升） CpC β + + + 沒反應本紙張尺度適用中.國國家標準（CNS ) A4規格（21〇Χ：297公釐） -32- ——--- 請先閱讀背面 ϊ 事項頁 1221847 A7 B7 五、發明説明（ + 發炎 + + 紅斑 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) +++ 嚴重紅斑 ++++ 注射位置明顯損害

CpC β 產氣莢膜梭菌C型/3 —毒素表3 :天竺鼠的皮膚壞死情形天竺鼠的免疫作用：將衍生物3 - 6 9以近4 0微克/毫升製備，並加入佐藥至最後濃度爲2 0微克/毫升，以2週之間隔給予天竺鼠肌肉內注射2毫升。第一次接種疫苗前、第2次之前和第2次接種疫苗後2星期採集血液樣品。第1次接種疫苗後2 4小時觀察天竺鼠的副作用，結果無副作用被觀察到。

範例3 : 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製偵測從隨機突變形成Θ -毒素基因所得到之Θ —毒素非毒性衍生物的快速篩選測試。 Β T細胞測試之程序：以胰蛋白酶處理培養於含有5 %牛血淸的伊格式培養基內（Eaglesmedium ) 1 · 5x1 〇5 細胞 / 毫升的 Β T (牛鼻甲細胞）細胞，然後轉移到9 6孔微力價平板內’ 100微升/孔。將平板置37°C和3%C〇2下作本紙張尺度適用中國國家標準（CNS )八4規格（210X297公釐） -33 - 1221847 A7 _B7__ 五、發明説明（31) 用2 4小時。所要測試的石-毒素樣品在稀釋平板內以 2 0 °C，P Η 7 · 0的P B S稀釋。從細胞中小心丟棄培養液，然後於每孔加入1 0 0微升的/9 一毒素稀釋液，將細胞於3 7 °C，3 % C〇2下作用3 0分鐘。小心丟棄樣品並加入含5 %牛血淸的新鮮伊格式培養液至3 7 °C。如上述所提的相同環境下培養細胞，從微力價平板內丟棄培養液並加入5微升/孔金氏染色溶液（Giemsa Staiming Sdution ) 。1 0分鐘後丟棄染色劑，並以水淸洗平板3 次且靜置至少2 0分鐘待乾。全部的孔檢查是否出現多核細胞及不規則細胞單層。缺乏這些徵兆的特殊孔即表示在此孔內出現的是/3 -毒素非毒性衍生物。那些被證明是非毒性的Θ -毒素衍生物以下面所述的半定量酵素連接性免疫吸收分柝法（ E L I S A )測試它們的免疫原性。半定量E L I S A : 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製在兔子體內所產生對抗天然產氣莢膜梭菌yg -毒素的高專一性抗體，以蛋白質A管柱純化後，並將這些專一性抗體以近2微克/毫升塗層於E L I S A平板上。將含有冷一毒素衍生物的懸浮液3倍稀釋後加到平板內，作用1 小時後’加入已接合蘀菜過氧化酶抗產氣莢膜梭菌C型/3 -毒素的兔子多株抗體偵測。在EL I SA反應中力價大於1 〇〇〇倍且低於天然沒-毒素的那些/3 —毒素衍生物，視爲依據本發明所要的本紙張尺度適用中.國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） · 34 - 1221847 A7 B7 五、發明説明（32) 非毒性且仍具有免疫原性的Θ -毒素衍物。範例4 : 天竺鼠的疫苗接種實驗：疫苗的製備：衍生物ρ Μ 1 - 4是由乳酸乳酸球菌菌株Ρ Μ 1 - 4 所製造（乳酸乳酸球菌（Lactococcus lactis ) MG1363 pM 1-4已於民國87年11月19日寄存於食品工業發展硏究所，寄存編號爲 CCRC 9101 12)。細胞發酵後以離心作用（1 0 0 0 0 0 X g 3 5分鐘）移除，然後每克懸浮液加入0 . 3 1 g硫酸銨。將此混合物置4 °C沈澱3小時，以1 OOOOOxg離心45分鐘，以原體積 1 / 3 0的Ρ B S溶解沈澱物並以Ρ B S透析。最後將衍生物溶液與 Diluvac Forte@以1 : 1比例混合成含ρ Μ 1 -4 8 0微克/毫升的疫苗。疫苗接種使用5隻5週大的天竺鼠，以2毫升肌肉內注射方式於第0及第2 1天對天竺鼠接種疫苗。結果觀察接種疫苗後的最初3小時，依據下列等級記錄動物的一般狀況：〇 =無症狀本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Μ規格（210X297公釐） :35 -" (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂

經濟部智慈財產局員工消費合作社印製 1221847 A7 ______ B7 五、發明説明（9 1 =輕微抑鬱、外毛粗糙（少於1小時） 2 =抑鬱、發抖（少於丨小時） 3 =抑鬱、發抖、躺臥並有限的攝取水分（少於1小時） 4 =嘔吐、嚴重抑鬱（少於1小時） 5 ==超過1小時的抑鬱且之後的餵食不再吃東西 •血液採樣和力價之決定

第1次接種疫苗前（第〇天）、第2次接種疫苗前（第2 1天）和第2次接種疫苗後（第3 5天）所採取的血液樣品，以競爭性E L I S A分析其抗Θ -毒素抗體。簡而言之，將對抗天然/3毒素的單株抗體塗層在E L I SA 平板內。另外將連續稀釋的血淸在另一分開的平板內與固定濃度的Θ毒素作用。把含有毒素和抗體血淸轉移到已塗層單株抗體的平板內；決定剩餘的；3 -毒素量。力價計算是以未抑制的々-毒素的5 0 %抑制力，相對於國際衛生組織W Η 0抗毒素標準1 9 5 9。結果：經濟部智慧財產局員工消費合作社印製結果觀察：沒有任何天竺鼠顯現任何因接種疫苗之臨床反應。參見表4。血淸學 1隻天竺鼠（5 2號）第一次接種疫苗後有反應。第 36- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210'〆297公釐） 1221847 A7 B7 五、發明説明（34) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 二次接種疫苗後全部4隻天竺鼠皆有血淸變化且其平均抗冷毒素的力價以E L I S A測量是6 6國際單位（ i · u ·)。個別力價如表4。表4 :天竺鼠/5毒素的抗體反應天竺鼠抗沒毒素的抗體反應以EL I S A用國際單位測量，且測試其非專一性毒性評分。天二數號碼免疫前血淸 (國際單位）第一次接種苗疫之後 (國際單位）第二次接種疫苗之後 (國際單位）非專一性毒性評分 51 0 0 159 . 6 0 52 0 2 . 4 55 . 1 0 54 0 0 32 . 2 0 55 0 〇 17 . 3 0 結論經濟部智慧財產局員工消費合作社印製全部的天竺鼠對含有一般改變過的Θ -毒素疫苗接種可製造抑制Θ毒素之抗Θ毒素抗體的反應。圖例之說明：圖la :質體pTREXIANEW的結構。抗MLS抗生素記號的編碼序列以暗方塊表示。〇ri PAMB1 :質體 p A Μ B 1的複製源頭，M L S :抗大環內酯、林可斯麥本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） -37 - 1221847 A7 ____B7 五、發明説明（35) 素（linco samides )、鏈大麥鹼素B抗生素基因。選殖到 P I L 2 5 3 EcoRI和平頭Sacl位置間的表現匣結構表示於下面。表現匣的不同功能區域以影線方塊表示。獨一的限制酶位置指示出來。S D ··互補於乳酸乳酸球菌 lbs rRNA 的 Shine Palgarno 序列，A T G :經S D提供的轉譯起始密碼。圖1 b :完整的p 丁 R E X 1 A序列，包括限制酶位置。圖1 c :高類似性p T R E X 1表現匣之特徵。圖 Id ··以 pTREX7 ，— 14 和一A (以 5，— 3’ 表示）來製造P C R衍生性啓動子所使用的寡核苷酸。圖2a : TIR結合載體pKS90，圖示PKS90表現匣。可用獨一的BamHI選殖，能使標的基因選殖後有自己的ATG，提供一重疊的ATG/TGA開始和結束密碼，以維持確定性的轉譯結合。圖2 b :完整的p K S 9 0序列，包括限制酶位置。圖2c :使用來製造一人爲DNA序列以形成pKS90 TIR區域的寡核苷酸。圖3 a :用來構築C p万突變株的引子。圖3 b :構築C p /3 Μ 1的程序範例。圖4 :產氣莢膜梭菌/3毒素的胺基酸序列。圖5和6 :曲線1和2說明因福馬林量增加，抗原性力價減少。圖 3 · b : 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

-38- 1221847 A7 B7 五、發明説明（3今 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1·以 pJF2000 cpb 爲板，〔cpbF2〕和〔抗m 1〕爲引子P C R反應造m 1 — 5 ’半P C R產物。而〔抗m 1〕引子包括所要的定位突變。 2 ·以P】F 2 0 0 〇 c p b爲模板，〔對m 1〕和〔 cpbR〕爲引子PCR反應製造ml — 3，半PCR產物。 3 ·連接1和2之PCR產物，產生一模板代表完整mi 的基因。此完整基因使用〔cpbF2〕和〔cpbR〕引子增幅產生一具有B a m Η I末端的產物。 4 ·將此P C R產物選殖到以B a m Η I分解的表現質體 p K S 9 0 — 1 ，並轉型到乳酸乳酸球菌p e ρ 5 a c m A 內。微生物寄存：乳酸乳酸球菌（Lactococcus lactis ) MG1363 pM 1-4已於民國87年1 1月19日寄存於食品工業發展硏究所，寄存編號爲CCRC 9101 12。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） -39 ·

Claims

1221847 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍項之產氣莢膜梭菌Θ毒素之去毒性免疫原性衍生物及生理上可接受之載體。 |裝------訂 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 了項再填於 4 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） -41 -