JPH01500002A

JPH01500002A - 生物学的封じ込め

Info

Publication number: JPH01500002A
Application number: JP62502242A
Authority: JP
Inventors: モーリン，セーレン; アンデルソン，ポール　キルケテルプ; ゲルデス，ケン　アクセー; クレム，ペル
Original assignee: ジーエックス　バイオシステムズ　アクティーゼルスカブ
Priority date: 1986-03-26
Filing date: 1987-03-25
Publication date: 1989-01-12
Anticipated expiration: 2015-09-18
Also published as: JP3090270B2; WO1987005932A1; AU7232087A; ATE107697T1; DE3750125D1; EP0273040B1; CA1315224C; EP0273040A1; DE3750125T2; US5853718A; US5670370A

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】２０、前記アンチセンスＲＮＡが１又はそれよシも多くの要因によって調節されるプロモーターから発現される請求の範囲第１８項記載の細胞。

２１、前記アンチセンスＲＮＡをコードスルヌクレオチド配列の発現が、宿主細胞の環境条件、細胞の生理学的状態又は推計学的出来事によって決定される請求の範囲第２０項記載の細胞。

２ｚ　前記推計学的出来事が、周期的な逆位性スイッチのプロモーターによって、又は前記アンチセンスＲＮＡ０組換え切断によってもたらされる請求の範囲第２１項記載の細胞。

お、　前記逆位性スイッチプロモーターがＥ、コリｆｉｍＡグロモーターである請求の範囲第２２項記載の細胞。

２４、前記アンチセンスＲＮＡをコードするヌクレオチド配列の発現が、環境における物理的条件又は環境におけるある化学物質の不在又は存在によって決定される請求の範囲第２１項記載の細胞。

５、　前記アンチセンスＲＮＡをコードするヌクレオチド配列の発現が、炭素又は窒素源、代謝物、アミノ酸、ヌクレオチド、プリン又はピリミジン塩基、又は金属イオンから選択された化学物質によって決定される請求の範囲第２４項記載の細胞。

２６、前記アンチセンスＲＮＡをコードするヌクレオチド配列がｌａｃプロモーターから転写される請求の範囲第２４項記載の細胞。

２７、前記物理的条件が環境中において支配する温度を含んで成る請求の範囲第２４項記載の細胞。

あ、　前記アンチセンスＲＮＡをコードするヌクレオチド配列が細菌性プラスミド、細菌性染色体、原核性ウィルス、真核性プラスミド、真核性ウィルス。

真核性染色体、真核性ミトコンドリア又は真核性クロロシラストに由来し、又は合成配列である請求の範囲第１８〜２７項のいづれか１項記載の細胞。

２９、前記アンチセンスＲＮＡの転写を調節するヌクレオチド配列が、細菌性プラスミド、細菌性染色体。

原核性ウィルス、真核性プラスミド、真核性ウィルス、真核性染色体、真核性ミトコンドリア又は真核性クロロプラストに由来し、又は合成配列である請求の範囲第１８〜２８項のいづれか１項記載の細胞。

３０、細菌又は真核生物から選択される請求の範囲第１７〜２９項のいづれか１項記載の細胞。

３１、細胞殺害機能をコードする配列及び該コード配列の転写を調節する配列を含有するヌクレオチド配列。

３２　前記転写を調節する配列が、１又はそれよシも多くの要因によって調節されるプロモーターである請求の範囲第３１項記載のヌクレオチド配列。

３３、細胞殺害機能をコードする配列が、細菌性プラスミド、細菌性染色体、原核性ウィルス、真核性プラスミド、真核性ウィルス、真核性染色体、真核性ミトコンドリア又は真核性クロロプラストに由来し、又は合成配列である請求の範囲第３１又は３２項記載のヌクレオチド配列。

３４　前記配列が、プラスミドＲ１のｐａｒＢ領域からのｈｏｋ遺伝子又は核ｈｏｋ遺伝子に相同であるＤＮＡ配列を含有する請求の範囲第３３項記載のヌクレオチド配列。

３５、細胞殺害機能をコードするヌクレオチド配列。

３６、細菌性シラスミド、細菌性染色体、原核性ウィルス、真核性プラスミド、真核性ウィルス、真核性染色体、真核性ミトコンドリア又は真核性りΩログラストに由来し、又は合成配列である請求の範囲第３５項記載のヌクレオチド配列。

３７、シラスミドＲ１のｐａｒＢ領域からのｈｏｋ遺伝子又は該ｈｏｋ遺伝子に相同であるＤＮＡ配列を含有する請求の範囲第３６項記載のヌクレオチド配列。

あ、　細胞殺害機能を特定するｍＲＮＡの翻訳を阻害することができるアンチセンスＲＮＡをコードするヌクレオチド配列。

３９、前記アンチセンスＲＮＡ配列の転写を調節する配列をさらに含んで成る請求の範囲第３８項記載のヌクレオチド配列。

４０、前記転写を調節する配列が、ｌ又はそれよシも多くの要因によって調節されたプロモーターである請求の範囲第３９項記載のヌクレオチド配列。

４１、細菌性シラスミド、細菌性染色体、原核性ウィルス、真核性プラスミド、真核性ウィルス、真核性染色体、真核性ミトコンドリア又は真核性クロロプラストに由来し、又は合成配列である請求の範囲第３８〜４０項のいづれか１項記載のヌクレオチド配列。

４ｚ　生物学的システムを含む方法であって、ある条件下で規則的に発現し、そして異なった条件下で規則的又は構成的に発現する。細胞殺害機能をコードするヌクレオチド配列を生物学的システム中に導入することを含んで成る方法。

４３、前記生物学的システムが、請求の範囲第３１〜３４項のいづれか１項記載のヌクレオチド配列又は請求の範囲第３５〜３７及び３８〜４１項のいづれか１項記載のヌクレオチド配列を細胞中に導入することによって、定義された環境下に含まれる細胞を含んで成シ、これから細胞殺害機能の発現が、該細胞のだめの環境条件又は該細胞の生理学的状態によって決定される請求の範囲第４２項記載の方法。

４４、前記細胞を、細菌又は真核生物から選択する請求の範囲第４２又は４３項記載の方法。

４５、レプリコンが、請求の範囲第３１〜３４項のいづれか１項記載のヌクレオ配列を該レプリコン中に挿入することによりて、第一次宿主細胞に含まれ、これから細胞殺害機能が規則的に転写され、該転写が１又はそれよシも多くの要因によって調節され、この少なくとも１つが第一次宿主細胞のゲノム中に独占的に存在する遺伝子によりてコードされている請求の範囲第４２項記載の方法。

４６、レプリコンが、請求の範囲第３５〜３７項のいづれか１項記載のヌクレオ配列を該レプリコン中に挿入することによって第一次宿主細胞に含まれ、これから、細胞殺害機能をコードするｍＲＮＡが構成的に発現され、とのｍＲＮＡの翻訳が、第一次宿主中に挿入されたヌクレオ配列から転写されたアンチセンスＲＮＡによって阻害され、該アンチセンスＲＮＡをコードするヌクレオチドが、構成的に発現され、又はｌ又はそれよシも多くの要因によって調節されるプロモーターから発現される請求の範囲第４２項記載の方法。

４７、レプリコンが、請求の範囲第３１〜３４項のいづれか１項記載のヌクレオチド配列を該レプレッサー中に挿入することによって、第一次宿主細胞、同種の細胞及び定義できる範囲の第二次宿主細胞に含まれ、これから細胞殺害機能が規則的に転写され、該転写が１又はそれよシも多くの要因によって調節され、この少なくとも１つが、第一次宿主細胞、同種の細胞及び定義できる範囲の第二次宿主細胞のゲノム中に存在する遺伝子によってコードされている請求の範囲第４２項記載の方法。

４８、レプリコンが、請求の範囲第３５〜３７項のいづれか１項記載のヌクレオチド配列を該レプリコン中に挿入することによって、第一次宿主細胞、同種の細胞及び定義できる範囲の第二次宿主細胞に含まれ、これから細胞殺害機能をコードするｍＲＮＡが構成的に発現され、前記ｍＲＮＡの翻訳が、レプリコン上にも存在するアンチセンスＲＮＡをコードするヌクレオチド配列から転写されたアンチセンスＲＮＡによって阻害され、前記アンチセンスＲＮＡをコードするヌクレオチド配列が第一次宿主細胞中において、構成的に発現され又は１又はそれよシも多くの要因によって調節されるプロモーターから発現され、この少なくとも１つが第一次宿主細胞、同種の細胞及び定義できる範囲の第二次宿主細胞のゲノム中に存在する遺伝子によってコードされている請求の範囲第４２項記載の方法。

４９、レプリコンを含む細胞が、請求の範囲第３１〜３４項のいづれか１項記載のヌクレオチド配列を該レプリコン中に挿入することによって含まれ、これからの細胞殺害機能の発現は推計学的出来事である請求の範囲第４２項記載の方法。

５０、前記推計学的出来事が逆位性スイッチのプロモーターによって仲介されている請求の範囲第４９項記載の方法。

５１、前記逆位性スイッチのブロモｉターカＥ、＝ｒ　リｆｉｍＡプロモーターである請求の範囲第５０項記載の方法。　°″ ５ｚ　レプリコンを含む細胞が、請求の範囲第３１〜３４項のいづれか１項記載のヌクレオチド配列を該レプリコン中に挿入することによって含まれ、これからの細胞殺害機能の発現は周期的な出来事である請求の範囲第４２項記載の方法。

５３、細胞殺害機能をコードするヌクレオチド配列（この発現は推計学的出来事によって決定される）；病原物質からの、免疫化のための１又はそれよシも多くのエピトープをコードするヌクレオチド配列；及び発現される場合、宿主細胞の外表面に前記エピドーグを輸送するだめの手段を担持する第一次宿主細胞を含有するワクチン。

８、　前記宿主細胞が、アトへシンの発現のための遺伝情報を付与されている請求の範囲第５３項記載のワクチン。

５５、前記エピドーグをコードするヌクレオチド配列が、天然に存在する細胞表面タンパク質をコードする遺伝子中に挿入され、該細胞表面に転位される融合タンパク質を発現する請求の範囲第５４項記載のワクチン。

５６、前記天然に存在する細胞表面タンパク質をコードする遺伝子がフィンプリンをコードする遺伝子である請求の範囲第５５項記載のワクチン。

５７、前記宿主細胞を、工ンテロバクテリアセアエ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）　、ラフ酸細菌、ビブリオナセアエ（Ｖｉｂｒｉｏｎａｃｅａｅ）及びプスードモナデス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄｅｓ　）から選択する請求の範囲第５３項記載のワクチン。

凪　前記細胞殺害機能の発現を決定する推計学的出来事が、前記細胞殺害機能をコードするヌクレオチド配列中に転写する周期的な逆位性スイッチのプロモーターによってもたらされる請求の範囲第５３項記載のワクチン。

５９、前記細胞殺害機能の発現を決定する推計学的出来事が、前記細胞殺害機能を特定するｍＲＮＡの翻訳を阻害するアンチセンスＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を転写する周期的な逆位性スイッチのプロモーターによって、又は前記アンチセンスＲＮＡの組換え切断によってもたらされる請求の範囲第５３項記載のワクチン。

６０、前記逆位性スイッチのプロモーターがＥ・コリｆｉｍＡ７’ロモーターである請求の範囲第５８又は５９項記載のワクテ／。

６１・　前記逆位性スイッチの頻度が、ワクチンが投与される補乳類の満足する免疫化を得るために必要とされる時間、エピトープの十分な投与レベルを維持するために、選択される請求の範囲第５８項記載のワクチン。

６ｚ　前記宿主細胞を、１５〜３０日間維持する請求の範囲第６１項記載のワクチン。

６３、前記病原物質（これからエピトープが由来する）を、ウィルス、細菌又は真核生物、たとえば菌類又は原生動物から選択する請求の範囲第５３項記載のワクチン。

６４　前記宿主細胞が、異なった病原物質からのエピドーグをコードする複数のヌクレオチド配列を担持し、そして前記エピトープのそれぞれが融合タンパク質として発現される請求の範囲第５６項記載のワクチン。

６５、前記宿主細胞が、活性化される場合、細胞殺害機能をコードするヌクレオチド配列中に転写する追加のプロモーターを担持する請求の範囲第５３項記載のワクチン。

６６、前記細胞殺害機能をコードするヌクレオチド配列が、推計学的出来事によって決定される発現の配列と同じである請求の範囲第６５項記載のワクチン。

６７、前記細胞殺害機能をコードするヌクレオチド配列が、推計学的出来事によって決定される発現の配列から分離される請求の範囲第６５項記載のワクチン。

餓　細胞殺害機能をコードする１又はそれよシも多くのヌクレオチド配列を担持する病原物質（該物質は、ｌ又はそれよりも多くのヌクレオチド配列の発現によって殺されている）を含有するワクチン。

以１１明　細　書本発明は、ある条件下で生物体又はレプリコンを生物学的に含む方法及びその方法に使用されるレプリコン並びに前記レプリコンを含む細胞に関する。

技術背景ＤＮＡ分子のインビトロでの組換えを用いる技法（該技法は゛遺伝子工学”として知られている）は、特定の遺伝子を単離し、そして種々の宿主細胞中にそのような遺伝子を発現（この宿主細胞中の問題の遺伝子は天然に見られず又は発現されない）することを可能にして来た。組換えＤＮＡ分子は、それを含む宿主細胞中で自主的に複製することができ、又は宿主細胞ゲノム中に組込まれるベクター、所望とする１又はそれよりも多くの生合成生成物をコードする１又はそれよシも多くの遺伝子及び宿主細胞中への該遺伝子（又は遺伝子類）の発現のために必要とされるＤＮＡ配列から典型的には成る。組換ＤＮＡ技法は、１又はそれよシも多くの所望とする生合成生成物、たとえばペプチドホルモン、たとえばインシュリン及び成長ホルモン、酵素、たとえばプラスミノーゲン活性化因子を生成するために、産業上の適用、たとえば遺伝学的に製造された生物体、たとえば細菌、酵母又は動物細胞の大規模な発酵のために重要に成って来た。もう１つの重要な分と適用は、環境中に遺伝手酌に製造された微生物又はウィルス、たとえばある植物に有害である昆虫の幼虫を殺すことができる細菌又は細菌類、ある汚染物、たとえば油を分解する細菌又は収穫に対する低温感受性を減じる細菌の制御された開放である。

１９７０年代における組換えＤＮＡ技法の開発の初期段階から、化学者達は、遺伝子工学に関連する可能性ある生物学的危険性にひじょうに敏感に気づいていた。結果として、Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ　ｏｆＨｅａｌｔｈ　、　Ｂｅｔｈｅｓｄａ　１ＵＳＡは、はとんど他の国のための基準を与える６組換えＤＮＡ研究のための指針（Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ　ｆｏｒ　Ｒｅｃｏｎｂｉｎａｎ”　ＤＮＡ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）　”のセットを提案した。１９７８年以来、その指針は、組換えＤＮＡ研究に関連する可能性ある生物学的危険性に関する多くの実験証拠を基礎にして、規則的に改正されて来た。

ＮＩＨの規制が緩和される傾向にあるにもかかわらず、公衆の意見は、遺伝子工学に関連する可能性ある生物学的危険性にひじょうに関心を示し続けている。公衆の関心は、遺伝学的製造された生物体の環境への制御された放出に関与する実験の可能性ある影響に主に向けられて来た。しかしながら、多くの国においては、治療及び同様のものに関連して使用される生物合成物質の大規模な製造がまた、その安全性に関して、特に発酵器から環境へのそのような物質を製造する組換え生物の偶然の放出の影響に関して疑かわれて来た。従って、安全性が解決されるまで、遺伝子工学の産業上の可能性を十分に開発することは不可能である◎ 実験又は遺伝子工学の大規模な適用に関連する危険、たとえば環境への組換え生物の放出を避は又は最少に減じるために、通常の操作条件下で放出されるそのような生物体の数を制限し、そしであるタイプの事故の場合、実験室及び製造施設の適切な物理的設計によって制限する処置が取られて来た。

そのような処置は“物理的封じ込め″と呼ばれ、そしてこれは、組換え生物体を特定の、前もって決レベルは、ＮＩＨ規制に従って組換えＤＮＡ研究の異なったタイプを必要とされる。従って、可能性ある病原図に関する研究は、該研究が行なわれる実験室又は製造施設においてよシ厳密な物理的条件を必要とする。

物理的封じ込め処置は、実験室又は製造施設内では実行可能であるが、ところがそのような処置は、遺伝学的に製造された微生物の環境への制御された放出に関与する適用の場合、不可能である。

他方又は同時に、偶然に放出された組換え生物体のひき続く生存又は環境中への組換えＤＮＡ分子の拡散は、“生物学的封じ込め”によって制限され得る。

この用語は、特定の生物合成生成物の製造に使用され、又は所望するでき事を担持するその能力のために使用される宿主細胞又はレプリコンの特徴を示唆し、そしてこの特徴とは、特定の条件が支配する（“定義された環境”と呼ばれる）特定の制限された環境の外で宿主細胞の増殖の可能性を制限するように作用することであり、そして／又は、宿主細胞中に含まれるレプリコンの特徴とは、それが向けられた生物体よりも他の生物体にレプリコン（及びいづれかの挿入された外来性ヌクレオチド配列、すなわち問題のレプリコンに本来、関係されないヌクレオチド配列）の拡散を制限するように作用することである。生物学的封じ込めはまた、宿主細胞及びレプリコンの両者の特定の特徴の組合せを通しても観察され、そしてこの特徴とは、細胞の生存を制限することである。これに関連して、特定の表現型の特性を現わすために、この情報を担持するレプリコンの形で特定の遺伝情報を付与される生物体は、“−次宿主細胞”と呼ばれる。

組換えＤＮＡ分子を含む特定の生物体の生物学的封じ込めを確保する１つの従来の方法は、定義された環境外で増殖するその能力を制限することである。

典型的には、天然の環境〔たとえば実験室又は製造施設の定義された環境の外の環境として定義される（時々“外部環境″とも呼ばれる）；用語“天然の環境” とは消化管も含む〕下に通常見出されない１又はそれよシも多くの増殖因子のための十分に定義された必要条件及び／又は同じ種の野生型生物に関する一般的に減じられた競争性をもたらす多くの独立した突然変異を導びくことによって弱められた宿主生物が使用される。たとえば、Ｅ、コリ（Ｅ、ｃｏｌｉ）Ｋ−１２は、弱められた細菌株であり、ここでその菌株は、この弱められた菌株が実験室又は製造施設の定義された条件の外部でそれ自体を増殖し、そして確立することができないように、遺伝子工学に関する実験及び製造に通常、使用される。さらに、このＥ、コリ株は、Ｅ、コリの通常の環境である哺乳類の消化管の上皮細胞上に付着することができず、すなわち、遺伝子工学により製造されたＥ、コリに− １２による、Ｅ、コリの天然の生息地でのコロニイー形成は起こらないことを意味する。

しかしながら、たとえＥ、コリに−１２が天然の生物と競争することができなくても、それは天然の環境下である期間なお生存するであろうことは注目されるべきである。

実験又は実際の製造が、天然の環境（上記に定義された）への遺伝子的製造された生物体の制御された放出に関与する場合、上記のように弱められた宿主細胞を用いることによって生物学的封じ込めを得ることは可能ではない。明らかに、機能するために環境に放される微生物は、適切な生態的地位に少なくとも一時的にそれらを確立するために、同じ種又は他の種のいづれかの野生型生物と同じ環境下で競争することができる。

生物学的封じ込めのもう１つの分野は、実験又は産業上の製造のために使用される第一次宿主細胞から、同じ種の他の細胞（但し、生物学的封じ込めシステムの一部として課された第一次宿主細胞のアテニュエーティング突然変異を欠く）又は第一次宿主細胞の増殖のために必要とされる定義された環境（これは生物学的封じ込めの一部である）の外で増殖することができる異なった種の細胞のいづれかに、レプリコン（該レプリコンは、たとえば細菌性プラスミドであることもできるし、場合によっては挿入された外来性ＤＮＡを含む）上に存在する遺伝情報の拡散を制限することに関する。

遺伝情報はいくつかの手段によって生物間に伝達され得る。細菌及び細菌性シラスミドの場合、これらは細菌性接合によってトランスファーされ、ここで物理的な橋が２種の接合細菌の間に形成され、その結果、そのプラスミドは１つの細菌から他の細菌にこの橋を通して通過する◎異なった種の細菌は接合によってプラスミドを交換することができ、そしであるプラスミドは、Ｅ、コリ及びプスードモナスｓｐｐ、　（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｓｐｐ、　）のようなグラム陰性細菌の間で事実伝導可能である。接合するための細菌の能力及びトランスファーされるだめのプラスミドの能力は、グラスミド産性ＤＮＡ配列に関連する特性であシ、遺伝学的に製造される細菌に関与する産業的製造に使用されるベクターは、細菌性接合及びシラスミドのトランスファーを担当するＤＮＡ配列を欠くことが必要とされる。この必要条件は、細菌性プラスミドに関して取られた主な生物学的封じ込め処置を構成する。

しかしながら、たとえば、細菌性プラスミド上に存在することができる遺伝情報はまた、細菌性接合及びプラスミドのトランスファーをコードする前記遺伝情報の除去によって妨げられない他の手段によって拡散され得る。

組換えＤＮＡ　７’ラスミドを有する第一次宿主細胞（定義された環境条件下でのみ長期生存を確保するために適切な突然変異によって弱められた）は、１又はそれよシも多くの天然に存在するバクテリオファージによって時々感染され得る。いくつかのバクために使用される定義された環境の外で増殖することができる第二次宿主細胞（生合成生成物又は他の目的物の産生のために向けられていない細胞、すなわち天然の環境に見出される典型的な野生型株）にそれらを伝達することが知られている。

細菌性接合をコードし、そして接合に基づいてトランスファーされ得る、天然に存在するプラスミドの１つを有する細菌が組換えグラスミドをすでに有する第一次宿主細胞と接合する場合に、類似する情況が生じるかも知れない。次に、相同組換えが、他の宿主細胞への組換えプラスミドのトランスファーをもたらす２種のプラスミドの間で起こる。

第−次宿主細胞上で行なわれるアテニュエーティング突然変異を欠く細胞に遺伝情報を拡散するもう１つの方法は、細胞による遊離ＤＮＡの受身的な取り込み、いわゆる形質転換である。多くの天然に存在する微生物は、遊離ＤＮＡを取シ込むことができる。

次に、そのＤＮＡは新規の第二次宿主細胞の染色体中に組込まれ、又は宿主細胞中において独立的に複製することができ、そして該宿主細胞は、アテニュエーティング突然変異を欠くために、実験室又は製造施設の定義された環境の外でそれらを増殖し、そして確立することができる。細菌性プラスミドＤＮＡの実質的な量が、発酵話中での増殖の間、たとえばＥ・コリ細胞から生物学的に活性な形で開放されることを示唆するある証拠が存在する。これは、発酵培地が環境に放される場合、細胞が収穫された発酵培地が、低頻度ではあるが、形質転換による第二次宿主細胞によりて取シ込まれ得るプラスミドＤＮＡの主な源を示すことを指摘するであろう。現在使用されている生物学的封じ込め法は、この問題の解決法を提案しない。

天然の環境（上記に定義されたような）への遺伝学的に製造された微生物の制御された放出に関与する実験又は実際の適用の場合、接合によるレプリコン（場合によっては挿入された外来性ヌクレオチド配列を含む）の広がりが、接合を担当するヌクレオチド配列の遺伝子がベクター中に位置されていない場合、制限される（上記を参照のこと）。しかしながら、この生物学的封じ込め法は、トランスダクシヲン、伝達可能なグラスミドによる組換え又は分解された組換え生物体から放される組換えＤＮＡの形質転換による、たとえば新規の第二次宿主細胞への細菌性プラスミドの拡散に対するいかなる処置をも示唆しない。

生物学的封じ込め特性を有する菌株を生成するために多くの試みがなされて来たが、すべてではないがこれらのほとんどは、それらが、実験室又は製造施設における好ましい条件下でさえ細胞の増殖性質に和尚影響を及ぼし、そして細胞殺害よりもむしろ増殖阻害が定義された環境の外で得られるという欠点を有する。

組換え生物体の封じ込めに関する問題の上記概要は、主に細菌に関係されて来た。類似する論議が真核生物及びウィルスに適用されることが強調されるべきである。

（発明の開示）本発明は、組換えＤＮＡ分子を有する第一次宿主細胞が新規環境条件に又はランダムなでき事の結果としてゆだねられる場合、又は第二次宿主細胞が第一次宿主細胞に元来存在する組換えＤＮＡ分子を受ける場合、活性封じ込め因子、すなわち細胞殺害機能を使用することによる生物学的封じ込めの概念への新しいアグローチを示す。いくつかの場合、その第二次宿主細胞は、細胞殺害機能の発現を誘導する条件下でのみ殺される。

従って、本発明は、レプリコンに関し、ここで細胞殺害機能を＝−ドするヌクレオ配列は、前記レプリコンが１つのタイプの宿主細胞（第一次宿主細胞）中に含まれる場合、規則正しく発現され、その結果そのレプリコンを有する細胞は、その細胞殺害機能が発現される条件下で殺害され、そして細胞殺害機能をコードするヌクレオ配列は、前記レプリコンがもう１つのタイプの宿主細胞（第二次宿主細胞）中に含まれる場合、規則正しく又は構成的に発現され、その結果そのレプリコンを有するこれらの細胞は、その細胞殺害機能が発現される条件下で一定に殺害される。

本発明において、“レプリコン“とは、核酸のセグメント、たとえば細菌性プラスミド、細菌性染色体、原核性ウィルス、真核性プラスミド、真核性ウィルス、真核性染色体、真核性ミトコンドリア又は真核性クロロプラストを表わす。

本発明において、“細胞”とは、細菌性及び真核性生物体、たとえば単細胞生物、たとえば酵母又は菌類、及び多細胞生物体、たとえば植物、動物又は菌類並びに多細胞真核生物、たとえば植物、動物又は菌類の組織に由来する細胞を示す。

レプリコンは、定義された環境の内に第−次宿主細胞及びそのレプリコン自体の封じ込めを行なうことができるように設計され得ることが示されるべきである。

レプリコンが１つのタイプの宿主細胞、すなわち第一次宿主細胞に含まれる場合、細胞殺害機能をコードするヌクレオ配列は、規則正しく発現されるべきであシ；この事は、第一次宿主細胞が、たとえば定義された環境内に存在するようなある条件にゆだねられる場合（ここで、その存在は、特定の生成物の産生に関与する理由のために又はそれが他の機能、たとえば汚染物の分解を有するために所望される）、細胞殺害機能をコードするヌクレオチド配列は発現されず、そしてその宿主細胞は生存し続け、そしてそれらの機能を実現することができることを含んで成る。しかしながら、第一次宿主細胞が環境条件で特定の変化にゆだねられる場合、その細胞殺害機能は、レプリコンを有する第一次宿主細胞を殺害するために発現される。

細胞殺害機能が発現される条件を提供することによって、たとえば発酵容器中に存在する第一次宿主細胞を殺害することは、特定の生成物を製造する過程の一部としても可能であろう。この方法は、遺伝学的に製造された生物体が酵母容器から取られる前、殺害されるべきである、おる健康に関する権威者によって規定された必要条件に従ってである。

細胞殺害機能をコードするヌクレオチド配列を担持するレプリコンを第一次宿主細胞中に導入することによシ生物学的封じ込めを得るための本発明の原理は、第一次宿主細胞、たとえば生合成生成物の産業的製造に使用される細胞として野生型様の使用を可能にすることができる。これは、特定の増殖条件、たとえば増殖のために突然変異化された生物によって必要とされる１又はそれよりも多くの特定の増殖因子を含む特定の培地を使用する必要がないことを上記で指摘されたように、安全な予防策としてこれまで使用して来た、突然変異化され、アテニュエートされた菌株の使用に関して重要な利点を有し、従って使用される培地の費用を減じ、そして広い範囲の培地成分が使用され得る。さらに、その野生型生物体は、遺伝子操作のためにより適切であシ又は改良された発酵特性を示し、又はそれらは、所望とする特定の生成物を産生ずるが、しかし大規模な製造での使用のためにはこれまで可能でなかった生物体である。

レプリコンは、もう１つのタイプの宿主細胞、すなわち第二次宿主細胞（これは普通、第−次宿主細胞又は場合によりては第一次宿主細胞が増殖せしめられた培地が放される天然の環境において見出される野生型生物であり、そしてその細胞中で、細胞殺害機能をコードするヌクレオチド配列が規則正しく又は構成的に発現される）によって取り込まれるべきでオシ：いづれかの場合、その第二次宿主細胞は、細胞殺害機能の発現がもはや抑制されず又は阻害されない場合、殺されるであろう。

ある場合、細胞殺害機能をコードするヌクレオチド配列を含んで成るＤＮＡフラグメントのサイズは、本発明のその使用のためには有意でない。しかしながら、細胞殺害機能をコードするヌクレオチド配列は、レプリコンのコピー数が普通、そのレプリコンの合計サイズが大きくなる場合、少なくなるという事実から好都合である小さなりＮＡフラグメント上に存在することがしばしば好ましい。従って、生物学的封じ込めを得るために、細胞殺害機能をコードするＤＮＡ　７ラグメントの挿入は、細胞殺害機能をコードするＤＮＡフラグメントが単に短い配列を含んで成る場合、レプリコンによってもまたコードされている目的の生合成生成物の収量に何の実質的な減少をも導びかない。細胞殺害機能をコードする好都合なヌクレオチド配列は、１５００個又はそれ以下のヌクレオチド、好ましくは１０００個又はそれ以下のヌクレオチド、たとえば５００〜２００個又はそれ以下のヌクレオチドのサイズを有する。

細胞殺害機能の発現が調節され得る本発明の１つの方法は、細胞殺害機能の発現が転写のレベルで調節されるレプリコンを提供することである。転写のレベルでの調節は種々の方法で行なわれ得るが、しかしその調節は好ましくは、１又はそれよシも多くの因子によって調節されたプロモーターによって行なわれる。これらの因子は、それらの存在によって、細胞殺害機能をコードするヌクレオチド配列の発現を確保する因子であり、又は他方、それらの因子の不在が細胞殺害機能の発現を引き起こす、前記ヌクレオ配列の発現を制御する因子である。従りて、第一次宿主細胞がまわシの環境に放される場合、又は組換えＤＮＡ分子が第二次宿主細胞によって取り込まれる場合、すなわち、実験又は製造の定義された環境又は生物体が特定の目的のために放された特定の制限された環境の外に放される場合、プロそ一ター及び場合によってはその関連する調節配列が、細胞殺害機能をコードするヌクレオチド配列の転写に影響を及ぼすために、１又はそれよシも多くのこれらの因子の存在又は不在によって活性化され、それによって細胞殺害生成物が製造され、そしてその宿主細胞が殺される。

プロモーター活性を調節する因子は、広範囲の種類の因子から選択され得る。主に、細胞殺害機能をコードする遺伝子の発現は、細胞の環境条件又は生理学的状態によって、又は周期的又は推計学的出来事によって決定され得る。本発明において、６周期的出来事”とは、細胞殺害機能の発現に影響を及ぼすことに有用な因子、たとえば温度条件、光の強さの変化又はホルモンの変化によって引き起こされる周期的に再現する出来事を意味することが理解される。“細胞の生理学的状態”とは、細胞密度又は細胞の増殖相のような因子を表わす。

本発明の有用な因子（これらは最も容易に調節できるので）は、環境におけるおる化学物質又は環境における物理的条件、たとえば環境において有力な温度又は他の物理的な特性（たとえば、環境における光の強さ）の存在又は不在である。

従って、第一次宿主生物体の発酵培地中に存在するある化学物質が、その第一次宿主細胞が放される環境下に存在せず、すなわち第一次宿主細胞が、たとえば発酵タンクからまわりの環境に偶然放出され、細胞の増殖又は生存のために必要とされる因子がもはや存在せず、又は該因子が同じ効果を有する培地から消耗される場合、細胞殺害機能をコードするヌクレオチド配列が発現される封じ込めシステムを予想することが可能でおる。細胞殺害機能をコードするヌクレオチド配列の転写を調節するプロモーターはまた、第一次宿主生物体の発酵培地中に存在しないが、しかしプロモーターを活性化するために十分な量で環境に存在する化学物質によっても活性化され得る。同様に、プロモーターは、温度の移動によシ活性化されるものでｓｂ、すなわち本発明のレプリコンに関与する封じ込め原理において、それは、普通、発酵容器又は消化管における高い温度から外部環境において支配的である低い温度への移動を含んで成シ、又は光の強さに関しては、プロモーターは、十分な強さの光の存在下で活性化されるが、しかし第一次宿主の定義された環境である発酵容器において支配的である暗やみでは不活性であるプロモーターであり得る。

第一次宿主生物体が、調整された様式で天然の環境、たとえば制限された領域の土地又は動物の消化管に開放される場合、その調節可能なプロモーターは、化学的手段によって、すなわち細胞の環境におけるおる化学物質の存在又は不在によって調節されるものであるが、しかしたとえば温度の変化によって、又は推計学的出来事によって周期的に活性化されるプロモーターでもある。７推計学的出来事”とは、本発明に従って、殺害機能の発現の活性化が起こる細胞の殺害をもたらす、細胞、世代当シの頻度又は時間単位当りの頻度によりランダムに生じる出来事を表わす。その推計学的出来事は、プロモーターを担持する領域の周期的な逆位又は陰性調節要素を担持する配列の切シ出しによって引き起こされ得る。推計学的出来事による、細胞殺害の確立した結果は、宿主細胞の人口が、天然に存在する生物体の人口に比べて低められた競争性を有するであろう。

細胞殺害機能をコードするヌクレオチド配列の転写の開始に使用されるプロモーターは、好ましくは、本発明の原理の一般的な適用性の確保をするために、広範囲の宿主生物体中に、細胞殺害機能をコードするヌクレオチド配列の発現を可能にすることができるプロモーターである。

細胞殺害機能の調節可能な転写の場合、たとえばその調節配列は、アミノ酸の生合成に関与する細菌性オペロンから又は細菌性遺伝子から単離され得、そしてこの転写は、定常増殖期の後期で又は表面構造体（線毛）の合成に関与する細菌性遺伝子から活性化される。適切なプロモーターの例は、トリプトファンの不在下で活性化されるＥ、コリｔｒｐ、温度感受性調節因子によって調整されるバクテリオファージλＰＩ及びＰＬ、胞子形成の間、活性化されるＢ。

サブチリス（Ｂ　、　５ｕｂｔｉｌｉｓ　）の胞子形成遺伝子プロモーター及び推計学的に活性化されるＥ、コリ及びサルモネラ線毛遺伝子プロモーターである。

化学的に調節可能なプロモーターの場合、化学物質（この存在又は不在がプロモーターの活性化を決定する）は、適切には、炭素又は窒素源、代謝物、アミノ酸、ヌクレオシド、プリン又はピリミジン塩基又は金属イオンから選択され得る。

存在する場合、化学物質がプロモーター活性を抑圧するものである場合、それは好ましくは、宿主生物体が天然の環境に開放される場合にプロモーターが活性化されないような濃度で天然の環境にめったに存在し表いものであるべきである。

たとえばＥ、コリのような生物体における適切なプロモーターの１つの例は、その細胞環境においてトリプトファンの十分な濃度の存ロモーターである。従って、このｔｒｐプロモーターを用いての封じ込めシステムは、宿主生物が発酵器から通常ひじょうに低濃度のトリプトファンを含むに多量のトリプトファンを含むことができる。

プロモーター領域の周期的な逆位によって推計学的に活性化されるプロモーター（本発明において、これはまた、′逆位可能なプロモーター”及び“逆位性スイッチプロそ一ター”と呼ばれる）及び本発明の目的のために有用であるプロモーターはまた、ｈｉｎ　、　ｃｉｎ及びｇｉｎ　７’ロモーター（Ｒ，Ｈ，Ａ、Ｐｌａｓｔｅｒｋなど−ａ　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃ１ｄ、　Ｓｅｔ、　ＵＳＡ　８０＃１９８３＃５３５５〜５３ｓｓ−２−ジ：　Ｇ　、　Ｍｅｒｔｅｎｓなど、　、　ＥＭＢＯＪ。

３．１９８４．２４１５〜２４２１ページ：Ｊ、Ｚｉｅｇ及びＭ。

Ｉ　、Ｓｉｍｏｎ　＋Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ　、Ａｃａｄ−８ｅｉ、ＵＳＡ　７７　＋　１９８０　ｒ４１９６〜４２００ページ）を含む。その比較的小さなサイズのために特に有用であることが見出された１つの逆位可能なプロモーターは、下記の配列を有する１つのＥ、コリ線毛遺伝子プロモーターであるｆｉｍＡプロモーターであシ：ＲＬＡＧＡＴＧＴＴＴＡＴＡＴＴＧＣＡＴＧＡＧＧＴＧＧＴＴＴＴＧＧＡＧＡＧＡＡＧＡＡＴＧＡＧＧＡＡＧＡＴＧＣＧＴＣＧＡＧＣＣＡＣＡＧＡＡＡＣＧＴＴＡＧＣＴＴＴＡＣＡＴＡＴＡＧＣＧＧＡＧＧＴＧＡＴＧＴＧＡＡＡＴＴＡＡＴＴＴＡＣＡＡＴＡＧＡＡＡＴＡＡＴＴＴＡＣＡＴＡＴＣＡＡＡＣＡＧＴＴＡＧＡＴＧＣＴＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴＴＴＴＴＡＡＴＡＴＴＴＴＴＡＴＧＣＴＴＧＡＧＡＡＡここで転写の方向は、左から右であり、そして提案されたプロモーターのコンセンサス配列は−３５及び−１０で指摘される（　Ｐ、Ｋｌｅｍｍ、ＥＭＢＯＪ、５　、１９８６　。

１３８９〜１３９３ページ）。

このプロモーターの活性化（逆位性スイッチ）は、本発明の目的のために“オン ”遺伝子及び“オフ”遺伝子と命名された２種の遺伝子の遺伝子生成物によって調節され、前記オン遺伝子生成物はオフ（不活性）からオン（活性）にスイッチを誘導し、そして前記オフ遺伝子生成物は、オンからオフにスイッチを誘導する。ｆｉｍＡ遺伝子及びその関連遺伝子が染色体上の１つのコピーに存在する野生型Ｅ、コリ細胞において、逆位性スイッチは、１個の細胞／１０００個の細胞／世代のスイッチ頻度で生じる。

しかし々から、オン及びオフ遺伝子の発現の用量を調節することによって、必要とされる逆位性スイッチ（実質的に）の頻度を調節することが可能である。

たとえば、これは、オン及びオフ遺伝子中に転写するために挿入される適切なプロモーターによって影響され得る。次に、これらのプロモーターによる転写開始の頻度は、形成されるオン及びオフ遺伝子の相対的用量レベルを決定するであろう。従って、比較的多量のオフ遺伝子生成物が形成される場合、“オン″位置への逆位性スイッチの頻度は、比較的多量のオン遺伝子生成物が形成される場合よシも低い。

本発明の宿主細胞封じ込めを含むもう１つの方法は、翻訳のレベルで細胞殺害機能をコードするヌクレオチド配列の発現を調節することである。これは、第−次宿主細胞中に細胞殺害機能を特定化するメツセンジャーＲＮＡ　（ｍＲＮＡ　）の翻訳を阻害するアンチセンスＲＮＡを提供することによって行なわれ得る。このアンチセンスＲＮＡをコードするヌクレオチド配列の発現は、構成的であり又は、たとえば細胞殺害機能を担持するレプリコンのコピー数の増大を可能にするために調節され得、単にその必要条件は、細胞殺害機能を特定化するｍＲＮＡの第一次宿主細胞において翻訳を完全に阻害するために、アンチセンスＲＮＡの十分な量が、単位時間当りに生成されるようなプロモーターの強さであることである。そのようなレプリコンが、細胞殺害機能をコードするヌクレオ配列が転写され、そしてそのヌクレオチド配列の生成物が細胞殺害機能に影響を及ぼすいづれかのタイプの第二次宿主細胞にトランスファーされる場合、阻害性アンチセンスＲＮＡをコードするヌクレオチド配列の、第二次宿主細胞における不在が、その第二次宿主細胞の死を引き起こす細胞殺害機能を特定するｒｎＲＮＡの翻訳をもたらす。すべての実施目的のためには、これは、細胞殺害機能をコードするヌクレオチド配列の発現がアンチセンスＲＮＡの存在によって調節され、そしてこの遺伝子配列は、第一次宿主細胞におけるもう１つのレゾリコン上に都合良く存在する。

本発明によれば、アンチセンスＲＮＡの発現ハ、細胞殺害機能をコードするヌクレオチド配列の転写を開始するゾロモーターについて上記に記載されたようにして、プロモーター（これから、アンチセンスＲＮＡをコードするヌクレオチド配列が転写される）の活性に影響を及ぼす定義された環境因子によって調節され得る。これらの環境因子は上記と同じものであり、そして環境におけるある化学物質の存在又は不在、環境の温度又は第一次宿主細胞の環境における光の強さを含んで成る。たとえば、適切なプロモーターは、種々の異化経路、浸透調節又は重金属耐性に関与する細菌性オペロンから単離され得る。

化学物質によシ活性化される適切なプロモーターは、それぞれラクトース、アラビノース及びピリミジンヌクレオシドによって活性化されるｌａｃ・ａｒａ及びｄｅｏプロモーター、及び高濃度のに＋の存在下で誘導されるｏｓｒＡ、並びに重金属イオンによって誘導されるＴｎ　５０１の水銀耐性遺伝子のためのプロモーターである。アンチセンスＲＮＡが第一次宿主細胞中に存在する場合、細胞殺害機能を特定化するｍＲＮＡの翻訳が、２種のＲＮＡ０間の相互作用によシ阻害される。

しかしながら、第一次宿主細胞がその意図された環境から放される場合、ブロモ −ター活性を決定する環境条件が、変化せしめられ、その結果、ある環境に発現されるように計画されたアンチセンスＲＮＡをコードするヌクレオチド配列は、もはや発現されず、そしてその−次宿主細胞は死滅するであろう。同様に、細胞殺害機能をコードするヌクレオチド配列を担持する組換えＤＮＡ分子が第二次宿主機構によって取シ込まれる場合、アンチセンスＲＮＡは、細胞殺害生成物の産生を妨げるために存在しないであろうし、そしてその第二次宿主細胞はまた死滅するでおろう。

アンチセンスＲＮＡのすべて又は一部をコードするヌクレオチド配列が、直接的に反復された十分な大きさのヌクレオチド配列の間に挿入される場合、それらの反復の間の組換えは、反復の長さ及び／又は反復の間の距離を変えることによって実験的にある程度決定され得る頻度により、組換え的に成熟した細胞に起こるであろうし、そして否定的に作用する調節要素の組換えによる切断が起こる場合、細胞の死を導びくであろう。これとは別に、アンチセンスＲＮＡの発現はまた、たとえば逆位性スイッチを引き起こすために逆位可能なプロモーターから推計学的に調節され得、その結果、アンチセンスＲＮＡはもはや発現されない。このプロモーターは好ましくは、Ｅ、コｌＪｆｉｍＡ７’ロモーターであり得る。

本発明のレプリコンに挿入されるべき、細胞殺害機能をコードするヌクレオチド配列は、広範囲の種類の源、たとえば細菌性プラスミド、細菌性染色体、原核性ウィルス、真核性プラスミド、真核性染色体、真核性ウィルス、真核性ミドフンドリア又は真核性クロロプラストに由来し；それらはまた、標準方法によって合成的に生成され得る。細胞殺害機能を発現するヌクレオチド配列の１つの例は、プラスミドＲＩのｐａｒ　Ｂ領域からのｈｏｋ遺伝子であシ、その領域は、細菌集団内でＲ１の安定した維持に関与することが前もって示されている、国際特許出願番号ＰＣＴ／ＤＫ８３１０００８６、出願番号ＷＯ３４１０１１７２Ｏ開示を参照のこと。ｐａｒ　Ｂによるグラスミド安定化の重要な特徴は、ＲＩのｐａｒ　Ｂ領域からの転写されたｈ　ｏ　ｋ　ｍＲＮＡの翻訳がｈｏｋ　ｍＲＮＡ　ハイゾリダイズ性アンチセンスＲＮＡ　。

すなわちｓｏｋ　（これはまた、ｐａｒ　Ｂ領域から転写される）によってもはや抑圧されない場合、影響を及ぼされるｈｏｋ遺伝子生成物の毒性効果であることが見出された。細菌性細胞からのＲＩシラスミドの欠失は、たぶん２種のＲＮＡの半減期の相違によって、プラスミドを含まない細胞におけるｈｏｋ　ｍＲＮＡと５ｏｋＲＮＡとの間の割合の変化、及び最終的には、不十分な濃度の抑制ａｏｋ　ＲＮＡがその細胞中に存在する場合（これはグラスミドを含まない細胞の死を引き起こす）、ｈｏｋ　ｍＲＮＡの翻訳を導く。

細胞殺害機能をコードするヌクレオチド配列は、プロモーター配列、たとえば上記のものと組合され、又は上記のようにしてアンチセンスＲＮＡ　ヲコートスる配列と第一次宿主細胞内で組合わされ得る。これらの配列は、天然源、たとえば細胞殺害機能について上記で言及されたものに由来し、又は合成的に産生され得る。

この天然のシステムを、本発明の原理に従って用い、組換え生物体を、定義された環境、たとえば発酵器に閉じ込め、組換えＤＮＡ分子又はウィルスを、定義された環境内で特定の宿主細胞に閉じ込め、最終的に、環境に放された生物体又は組換え遺伝情報を担持するベクターを閉じ込めるために、Ｒ工からのｈｏｋ遺伝子を用いて生物学的封じ込めのシステムを計画する。

本発明によれば、宿主細胞封じ込め、たとえば組換ＤＮＡ分子、たとえばプラスミドを含むＥ、コリ宿主の封じ込めは、標準組換えＤＮＡ技法にょシ、ｈｏｋ遺伝子の転写が少なくとも部分的にプロモーター／調節配列によって制御されるような態様で適切なプロモーター／調節領域を含むＤＮＡ配列と共にｈｏｋ遺伝子が、挿入される場合に得られ；使用されるプロモーター／調節配列の性質によって決定された特定の環境条件が合わない場合、そのプロモーター／調節領域は脱抑制され、その結果、ｈｏｋ遺伝子の転写が細胞の死を導びく。他方、調節のもう１つの形、たとえばｈ　ｏ　ｋ　ｍＲＮＡ翻訳のアンチセンスＲＮＡ阻害を用いることによる上記のような翻訳制御を用いることは可能である。そのようなシステムは次のように構成され得る；　ｈｏｋ遺伝子はプラスミド産生遺伝子から構成的に発現され、そしてｈ　ｏ　ｋ　ｍＲＮＡの翻訳は適切に計画されたアンチセンスＲＮＡの合成によって逆反応され、これをコードする遺伝子は、上記のようにして調節されたプロモーターから発現され、そしてこのプロモーター−活性は１又はそれよりも多くの特定の環境因子の存在に依存する。これらの因子がもはや存在しない場合、プロモーターはもはや活性的でないであろうし、そして従ってアンチセンスＲＮＡはもはや発現されず、そしてｈｏｋｍＲＮＡの翻訳をもはや阻害せず、その結果毒性生成物が形成され、そして宿主細胞が殺される。

上記のように、シラスミド上でのｐａｒ　Ｂ領域（ｈｏｋ及びｓｏｋ遺伝子を含む）の存在は、シラスミド遺伝を安定化する。この基本的な安定化原理は、ｈ　ｏｋ　ｍＲＮＡは抑制ａｏｋアンチセンスＲＮＡに対して過剰に発現されるので、プロモーターからの転写がｈｏｋタンパク質の合成をもたらすような態様で、ｈｏｋ及びｓｏｋ遺伝子の上流に調節できる、好ましくは強いプロモーターを挿入することによって、利用され得る。従りて、挿入されたプロモーターからの転写が起こらない条件下で、シラスミドは細胞の増殖集団中に安定して維持されるが、ところが異なった条件下で、たとえば外部の環境又は第二次宿主細胞中において、その挿入されたプロモーターの転写が起こり、そして細胞は殺される。

本発明によれば、Ｒ１ｈｏｋ遺伝子生成物のために確立された原理と同じ原理に従って、他の生物体からのＲＩｈｏｋ遺伝子（これはこれらの生物体中で活性的であろう）に相同の又は関連する配列を、ＲＩｈｏｋ遺伝子生成物が毒性でないであろう宿主生物体に使用することが企画されている。“相同”とは、与えられたプローブと分析される核酸種との間にある程度の相補性の存在を示すために本発明においては用いられる。“相同の程度”は、与えられたプローブと分析される核酸種との間に形成される二重核酸分子における相補的塩基の部分として表わされる。検出できる最少程度の相同体は、ハイブリダイゼーションの間、用いられる実験条件並びにプローブ及び分析される核酸種の特徴の関数である。そのような相同配列は、多くの細菌種（たとえばグラム陽性細菌）の染色体ＤＮＡ内に、酵母、テトラヒメナビリホルミス（Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ　ｐｙｒｉｆｏｒｍｉｓ）のミトコンドリアＤＮＡ内に及びヒト細胞並びにエントウのクロロプラス）　ＤＮＡ内に見出され、そしてこれらのすべては、ＤＮＡ／１）ＮＡハイブリダイゼーションによって決定される場合、ＲＩｐａｒＢ配列に関連するＤＮＡ配列を有する。

従って、この逆位はまた、ｈｏｋ遺伝子に相同であるヌクレオチド配列を担持するレプリコンにも関連する。

本発明はまた、上記のようなレプリコンを有する第一次宿主細胞にも関する。その細胞はまた、上記のように、細胞ゲノム中に挿入されたアンチセンスＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含有することができる。その第一次宿主細胞は、広範囲の種類の細胞、たとえば細菌又は真核性生物、たとえば単細胞生物、たとえば酵母又は菌類、多細胞生物、たとえば植物、動物又は菌類の組繊に由来された細胞から選択され得る。

もう１つの観点において、本発明は、細胞殺害機能をコードするヌクレオチド配列に関する。このヌクレオチド配列は、さらに、その細胞殺害機能をコードする配列の転写を調節する配列を含んで成る。

その調節配列は、上記のような特徴及び機能を有するプロモーターであシ得る。

本発明はさらに、細胞殺害機能を特定化するｍＲＮＡの翻訳を阻害することができるアンチセンスＲＮＡをコードするヌクレオチド配列に関する。上記のように、このヌクレオチド配列は、好ましくは他のレプリコン上で細胞中に挿入される。そのアンチセンスＲＮＡをコードするヌクレオチド配列は、構成的に発現され、又はその転写は、たとえば上記のように１又はそれよシも多くの因子によって調節されるブロモ−ターであシ得る他のヌクレオチド配列から調節され得る。

重要な観点において、本発明は、生物学的システムを含む方法に関し、この方法とは、細胞殺害機能をコードするヌクレオチド配列を生物学的システムに導入することを含んで成シ、前記配列はある条件下で規則的に発現され、そしてまた、生物学的システムが維持される異なった条件下で規則的に又は構成的に発現される。

本発明において、１生物学的システム”とは、再生できる、いづれかの組織化された生物学的物質、たとえば核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ　）配列、感染物質、たとえばウィルス、細菌又は単細胞真核生物、たとえば酵母又は菌類、又は多細胞生物、たとえば植物、昆虫、等、並びに多細胞生物の組織に由来の細胞に関する。

“封じ込め”とは、特定の制限された環境（ここで特定の条件が支配し、そしてその存在が所望される）からの生物学的システムの広がシが制限され、又は生物学的システムの存在がある期間制限されることを示す。

封じ込めは、細胞殺害機能が発現されないことを確保するある条件下で生物学的システムを維持することによって行なわれる。これらの条件は、細胞内又は細胞外であってもよく、そして宿主生物、宿主−ベクター関係の表現型及び生理学的状態、生物掌合、細胞殺害機能は、細胞殺害機能をコードするヌクレオチド配列を担持する宿主生物を殺すために、規則的に又は構成的に発現され得る。さらに、その条件は推計学的出来事も含む◎ 生物学的システムが細胞を含んで成る場合、これらは、細胞殺害機能をコードする配列及び細胞殺害機能をコードする配列の転写を調節する配列を含むヌクレオチド配列、又は別に、細胞殺害機能をコードするヌクレオチド配列及び上記のように、発現される場合、細胞殺害機能を特定するｍＲＮＡの翻訳を阻害するアンチセンスＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を、前記細胞中に挿入することによって、定義された環境条件下で含まれる。

本発明の原理によれば、細胞殺害機能をコードするヌクレオチド配列は、好ましくはレプリコン上に担持される。アンチセンスｍＲＮＡをコードするヌクレオチド配列は、細胞中のもう１つのレプリコン上に挿入され得る。本発明の方法に従りて含まれる細胞は、細菌又は真核生物から選択され得る。

定義された条件下でのみ存在するように宿主生物の封じ込めを提供することの他に、本発明の封じ込め方法はまた、細胞殺害機能をコードするヌクレオチド配列（該ヌクレオチド配列は、１又はそれよりも多くの因子によって調節される調節配列から規則的に転写され、この因子の少なくとも１つは、第一次宿主細胞のゲノム中に独占的に存在するヌクレオチド配列によってコードされている）をレプリコン中に挿入することによって、第一次宿主細胞にレプリコンの封じ込めを提供する。

他方、レプリコンは、細胞殺害機能をコードするｍＲＮＡを構造的に発現するＤＮＡフラグメントをレプリコン中に挿入することによって第一次宿主細胞に含まれ、この翻訳は、前記第一次宿主細胞中に挿入されたもう１つのヌクレオチド配列から転写されたアンチセンスＲＮＡによシ阻害され、前記アンチセンスＲＮＡをコードするヌクレオチド配列は、１又はそれよりも多くの因子、たとえば上記のような因子の１つによって調節されているブロモ−ターから構造的に発現される。レプリコンはまた、第一次宿主細胞に含まれる他に、それはまた、同じ種類の細胞及び限定できる範囲の第二次宿主細胞、すなわち細胞殺害機能の発現の調節を担幽する因子がまた存在する細胞にも含まれるように企画され得る。

上記開示から明らかであるように、本発明の生物学的封じ込め法は、特定の生合成生成物の産生又は天然の環境（外部環境又は動物の消化管）への開放のいづれかのために、予定された弱められた生物のみ々らずまた野生製株をまた、活性的な生物学的封じ込めるために、広範囲の宿主細胞及びレプリコンに適用できるひじょうに多角的な方法であり；さらにこの方法によって、特定の宿主への与えられたレプリコンの活性封じ込めが得られる。

ある前もって定義された条件下で発現される細胞殺害機能をコードするヌクレオ配列を担持するレプリコンに関する本発明の原理は、生ワクチンの調製に利用され得ることがさらに企画されている。病原性微生物又はウィルスの非病原性（たとえば弱毒化された）株に基づくワクチンは、これまで長い間、知られて来た。

生ワクチンに使用される薬物の主な例として、ワクシニアウィルス、弱毒化されたポリオウィルス（Ｊａｎａｓ　５ａｌｋによって得られた）及びパシリカルメティーグエリン（ＢＣＧ　）　Ｃ弱毒化されたマイコバクテリアムラベルコロシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）　）を挙げることができる。生ワクチンは、−生ではないが、それらが問題の病原体に対する長期の免疫性を与える利点を有する。さらに、それらは一般的に、不活性化された（殺された）病原菌又は精製されたタン・ぐり質に基づくよシもよシ安く且つより容易に管理することができる。

しかしながら、生ワクチンの使用は、これまで制限されて来た。なぜならばアテニュエーション（弱毒化）、生存度及び適切な免疫応答の正しい組合せを得ることがしばしば困難であるからである。さらに、遺伝学的に製造された細菌の環境（外部又は内部のいづれか）への計画的な放出は、可能性ある長期の環境への影響、特に遺伝学的に製造された細菌の環境における永久的な確立の危険性に関しての公衆の関心のために、多くの国で現在許されていない。

本発明は、適切な宿主生物（上記のような第一次宿主細胞）中に、細胞殺害機能をコードするヌクレオチド配列（この発現は推計学的出来事によって決定される）；病原体からの免疫化（抗原決定基）のための所望のエピトープをコードする配列；及び発現される場合、細胞の外部表面へのエピトープの輸送、すなわち細胞膜システムを通してのそれのトランスロケーションのための手段を導入することによって生ワクチンの使用に関する問題を避けることを可能にした。細胞殺害機能をコードするヌクレオチド配列及びそのエピトープをコードするヌクレオチド配列は、同じレプリコン又は別のレプリコン上に存在することができる。この関係において、細胞殺害機能は、上記に示されたもののいづれか１つであシ得る。現在、好ましい細胞殺害機能は、ＲＩ　ｈｏｋ遺伝子によってコードされるものである。

宿主細胞は、ワクチンによって免疫化される動物、たとえばヒトに投与されるために適切であるいづれ細菌は天然でアトへシンを発現し、これによってそれらは上皮組織の表面に付着する。（アトへシンは、上皮表面上に存在するレセプターへの細菌の付着を担当する構造体として定義され得る。）これは宿主細胞の重要な特性である。なぜならば、免疫応答のタイプ、すなわち分泌ＩｇＧ及びＩｇＡが最適である場合、それは免疫目的のために特に好都合な特定の環境においてそれ自体を確立することができ、従って上皮表面の卓越した保護を提供するからである。本発明において、特定の条件が支配する特定の、制限された環境として前記に定義された”環境″とは、体の組織及び上皮表面及びそのような表面によって定義される体腔、たとえば消化管、口及び鼻腔、呼吸器管、泌尿管及び生殖器管を含むことが理解されるべきであることが注目されるべきである。これらの領域は、感染性（病原性）物質に最初に暴露されるものと一致することを示すことが興味の対象である。ワクチンは、経口ワクチンとして最っとも便利に投与され得、そして結果的に、宿主細胞はこの場合、腸内にそれ自体を確保することができ、そしてその中にすでに存在する多くの生物と好結果をもたらして競争することができるものであるべきであることが現在予期される。

従って、適切な第一次宿主細胞の例として、エンテロバクテリアセアエ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ　）　、たとえばＥ、コリ又は乳酸菌、たとえばラクトパシラスアシドフイラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｔｌｕｓ　ａｅｉｄｏｐｈｉｌｕｓ　）、ビブリオナセアエ（Ｖｉｂｒｉｏｎａｃｅａｅ　）及びゾスードモナデス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄｅｓ　）を挙げることができる。

しかしながら、それらの生物が、腸内にそれら自体を確立することができるものであることは必ずしも必要でない。他の基準、たとえば組換え技法又は酵母方法にゆだねられるためのその適性に従って宿主生物をまた選択することができ、そして標準のＤＮＡ組換え技法によって細胞にアトへシンを発現する遺伝子を付与することができ、そしてそのようにして選択された生物は、上皮組織にそれを付着することができるような機能を欠失するに違いない。

免疫化のためのエピトープは、当業界でよく知られている標準組換え技法（たとえばＭａｎｉａｔｉｓなど、。

Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　＋　１９８２　）に従ってレプリコン中に、エピトープをコーＹするヌクレオチド配列を挿入することによって第一次宿主細胞に導入され得る。従って、エピトープをコードするヌクレオチド配列を担持するレプリコンは、宿主細胞の表蘭上にエピトープの発現を確保するために、適切なプロモーター、リゲゾーム結合部位、翻訳開始コドン（ＡＴＧ　）をさらに付与されるべきである。本発明のワクチンの本質的な特徴は、エピドーグが免疫化されるべき哺乳類中に適切な免疫応答を誘発するために宿主細胞上に現わされるべきであることである。エピトープが宿主細胞の表面に自然に移される場合、そのエピトープをコードするヌクレオチド配列は、細胞表面にトランスロケーションされる融合タンＡ’り質を発現するために、天然に存在する細胞表面タンパク質、たとえばフィンプリリン（繊毛の構造サブユニ、ト）をコードする遺伝子中に挿入され得る。

上記のように、本発明のワクチンの場合、細胞殺害機能の発現は推計学的出来事によって決定される。

この出来事は、上記に説明されたように、典型的には、細胞殺害機能をコードするヌクレオ配列中に転写するためのプロモーター、すなわちｆｉｍＡプロモーターに関して上記で説明されたように、オン及びオフ遺伝子の発現のそれぞれのレベルによって調節され得る頻度で不活性から活性的な逆位性スイッチにゆだねらへシロモーターの周期的な逆位性スイッチによって、引き起こされるであろう。

類似するプロモーターは、類似する機構によって調節されることが推定される・これは、ワクチンが投与される動物の満足した免疫化を得るのに必要な時間、エピトープの十分な投与量レベルを維持するために、逆位性スイッチの頻度の調製を可能にする。他方、推計学的出来事は、上記に説明されたように、細胞殺害機能を特定するｍ１ｆｆｌＡの翻訳を阻害するアンチセンスＲＮＡをコート９するヌクレオチド配列を転写するプロモーターの周期的な逆位性スイッチによって引き起こされ得る。これとは別に、細胞殺害機能の発現は、上記に説明されたように、アンチセンスＲＮＡの組換え的切断によシ達成され得る。細胞殺害機能の推計学的転写機構をコードする遺伝子（すなわちプロモーター及び場合によってはオン及びオフ遺伝子）は、便利には、細胞からのプラスミドの損失の結果として前記遺伝子の損失を避けるために、たとえばバクテリオファージによって、プラスミド上よシもむしろ宿主細胞染色体中に挿入される。逆位性スイッチの頻度を調節することによって、ある予定されたチの宿主細胞が、それぞれの世代で殺されるであろう。

これは、細胞人口が、長期間にゎたりて、たとえば腸の天然の細菌相と競争することができないことを確かにする。

細胞殺害機能が発現される前、そのような予定された期間、生物体を腸の環境下で確立することによって、エピトープ（これに、免疫化される体が暴露される）の聞量が十分に多量であり、そして十分な期間続き、適切な免疫化を付与するであろうことを確保することが可能である。宿主細胞が宿主細胞から発現されたエピトープの性質及び活性に依存して、１５〜３０日の間、定義された環境下で十分な量存在する場合、満足する免疫化が得られることが推定される。

原理的に、第一次細胞によって発現されたエピトープは、いづれかの病原性物質（これに対する免疫性を得ることが所望される）からのエピドーグであることができる。そのような病原性物質として、ウィルス、細菌又は真核生物、たとえば菌類又は原生動物を挙げることができる。ウィルス（これから、本発明の生ワクチンに関連して使用されるエピトープが得られる）の例として、アプリウィルス、ヘル４ウィルス、ハホバウィルス、ミクソウィルス、オルトミクンウィルス、ノやラミクツウィルス、ポックスウィルス、ラブドウィルス、アルボウィルス又はレオウィルスの種類に属するウィルスを挙げることができる。これに関する他のウィルスの種類はピコルナウィルス及びレトロウィルスである。ウィルスの特定の例ハ、インフルエンザウィルス、パラインフルエンザウィルス、はしかウィルス、おたふくがぜウィルス、ルベラウィルス、ライノウィルス、狂犬病ウィルス、ＨＴＬＶＩ　及ヒＩＦ　ウィルス、ＨＩｖウィルス、Ｂ型肝炎ウィルス及び肝炎を引き起こす他のウィルス、ポリオウィルス、ロタウィルス、レオウィルス、ニブスティン−バールウィルス、単純ヘルイス■及び■ウィルス、サイトメガロウィルス、種々のタイプのヒト乳頭腫ウィルス、等である。

コリ、サルモネラ■ｐ、たとえばＳ、チゾヒムリアウ（Ｓ、ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）　ｅ　Ｓ、チビ（Ｓ、ｔｙｐｈｉ）、Ｓ。

ｃｈｏｌｅｒａｅｓｕｉｓ）　ｅビプロコレラエ（Ｖｉｂｒｏ　ｅｈｏｌｅｒａｅ）ｅシグラ　ソセンテリアエ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ　ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）；コリネパクテリアム　ジフテリアエ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｄｉｐｈｔｅｒｉａｅ）　：マイコパクテリアム　トベルクロシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）；ネイセリアｓｐｐ。

（Ｎｅｉｓｓａｒｉａ　ａｓｐ、）＊たとえばＮ、ゴノルホエアｘ　（Ｎ。

ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）ｓ　Ｎ、メニンジジチス（Ｎ、　ｍｅｎｉｎｇｉｄｉｔｉｓ）及びＮ、カタルハリス（Ｎ、　ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ）ニブスートモナスｓｓｐ、（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｓｓｐ、）＋たとえばＰ、アエルギノサ（Ｐ、　ａｓｒｕｇｉｎｏｓａ）　；エルシニアｓ　ｓ　ｐ　、　（Ｙｅ　ｒ　ｓ　ｉ　ｎ　ｉ　ａｓｓｐ、）　＊たとえばＹ、ペスティス（Ｙ、　ｐｅｓｔｉｓ）　；モラキセラｓｓｐ、（Ｍｏｒａｘｓｌｌａ　ｓｅｐ、）＊たとえばＭ、ｙ３？ビス（Ｍ、　ｂｏｖｉｓ）ニスタフ４０コーカスｓａｐ、（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｅｃｕｓ”ｐ、）　ｒたとえばＳ、アウレウス（Ｓ、　ａｅｒｅｕｓ）　；ストレゾトコ−カスｓｅｐ、（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｓａｐ＋）、たとえばＳ、プネウモニアエ（Ｓ、ｐｎｅｕｍｏｎｉａｓ）及びＳ、ピオゲネス（Ｓ、　ｐｙｏｇｅｎｅｓ）　；　Ｎルデテラｓｓｐ、（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａｓｓｐ、）　、たとえばＢ、ベルツシス（Ｂ、ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）及びＢ、ブロンキセプチカ（Ｂ、　ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ）　：ヘモフィラス　インフルエンザエ（Ｈｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　１ｎｆｌｕｅｎｚａｓ）；トレポネマ　パリダム（Ｔｒｅｐｏｎａｍａ　ｐａｌｌｉｄｕｍ）：及びクロストリジアムｓａｐ、（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｓｓｐ、）、たとえばＣ，＆ツリナム（Ｃ，ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）及びＣ，テタニ（Ｃ０ｔｅｔａｎｉ）の病原性菌株である。

病原性真核生物（このエピトープは、本発明の生ワクチンに関連して使用され得る）の例は、菌類。

たとえばプラストマイセス　デルマチチジス（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ　ｄｅｒｍａｔｔｔｔａｔｓ）＊ヒストプラズマ　カプルラタム（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｒｎａ　ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ）＋コシジオイデス　イミイチス（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ　ｉｍｍｉｔｉｓ）ｍクリプトコーカス　ネオホルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）及びカンジダ　アルピカン（Ｃａｎｄｉｄａａｌｂｉｃａｎｓ）　：原生動物たとえばギアルジア　ランプリア（Ｇｉａｒｄｉａ　ｌａｍｂｌｉａ）　；　）リパノソマｓｓｐ。

（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ　ｓａｐ、）ｅたとえばＴ、ガンピエンセ（Ｔ。

ｇａｍｂｉ＠ｎ５ｅ）＋　Ｔ、ロデシエンセ（Ｔ、　ｒｈｏｄｅ＠１ｓｎｓｓ）及びＴ、クルジ（Ｔ、　ｅｒｕｚｉ）；レイシニアｓｓｐ、（ＬｓｉｓｈｍａｎｉａＳａｐ、）　ｅたとえばり、ドノパ＝　（Ｌ、　ｄｏｎｏｖａｎｉ）及びり。

トロピカ（Ｌ、　ｔｒｏｐｉｃａ）；エントマエパ　ヒストライチカ（Ｅｎｔａｍｏｅｂａ　ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ）　；ナネグレリアｓａｐ。

（Ｎａｅｇｌｅｒｉａ　ｓｓｐ、）：プラスモジウＡ　ａｓｐ、（ＰｌａｓｍｏｄｉｕｍＳａｐ、）　＃たとえばＰ、ファルシバリウム（Ｐ、ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）＋Ｐ、ビペック／Ｃ（Ｐ、　ｖｉｖａｘ）、　Ｐ、マラリア（Ｐｏｍａｌａｒｉａｓ）及びＰ、オバレ（Ｐ、　ｏｖａｌｓ）’、及びイソスポラｓｓｐ。

（Ｉａｏｓｐｏｒａ　ｓｓｐ、）　ｅたとえば１．ペリ（Ｉ、　ｂｅｌｌｉ）及び１、ヒウミニス（Ｉ、　ｈｕｍｉｎｉｓ）である。

手段によって、たとえば組合せワクチンを得るためにシグナルペプチドの存在によって、細胞表面に輸送されるような方法により、異なった病原物質からのエピトープをコードする複数のヌクレオチド配列を宿主細胞中に導入することによって、種々の病原物質に対する組合せワクチンを得ることが可能であろうことがさらに企画されている。この場合もまた、エピトープは、異なった繊毛の一部として宿主細胞の表面上に暴露されるであろう。本発明のこの態様の重要な利点は、免疫化が種々の病原菌に対して同時にもたらされ、すなわちワクチンの１回の投与のみが必要とされることである。

問題の動物において定義された環境から伝わる生きている第一次宿主細胞（ここでそれらの存在は外の環境に所望される）により、たとえば経口ワクチンの場合、沈殿物により、外の環境（すなわち、本発明のワクチンにより免疫化されるべき動物の外部の環境）を汚染するいずれの危険をも避けるために、それらが外の環境に伝わった後、宿主細胞を殺すことが可能であるべきである。これは、宿主細胞中に追加のプロモーター（推計学的なプロモーターとは別の〕を挿入することによって達成され、ここでこのプロモーターは、活性化される場合、細胞殺害機能をコードするヌクレオチド配列中に転写し、それによって細胞殺害機能をコードするヌクレオチド配列を担持するレプリコンを有するようになる宿主細胞又はいづれかの他の細胞（第二次宿主細胞）の死を引き起こす。１つの態様において、その追加のプロモーターは、活性化される場合、推計学的出来事によって決定される発現の１つと同じ細胞殺害機能をコードするヌクレオ配列中に転写する。活性化される場合、転写する追加のプロモーターを、第一細胞殺害機能をコードするヌクレオチド配列と同じか又は別のレプリコン上に挿入される第二細胞殺害機能（これは第一細胞殺害機能と同一である）をコードするもう１つのヌクレオ配列中に挿入することもまた可能であろう。この追加のプロモーターの活性化は、上記のように、体温（約３７℃）以下への温度の低下の結果として又は化学的誘導によって好都合に起こる。

この方法において、本発明の生ワクチンに使用される、遺伝学的に製造された細菌の外部環境における非生存性が確保される。細胞殺害機能をコードするヌクレオチド配列及びエピトープをコードする遺伝子が同じレプリコン上に存在する場合、第二次宿主細胞への組換えレプリコンの突然の拡散が（この場合、外部環境に見出される通常、野生型の生物）、実質的に阻害される。従って、細胞殺害機能をコードするヌクレオチド配列及びエピトープをコードする遺伝子の同じレプリコン上での存在が、本発明のワクチンの好ましい態様を構成する。

上記のように生ワクチンの調製において有用であることの他に、本発明の原理は、殺害性病原菌に基づがれるワクチンの開発に適用できることがさらに企画される。現在まで、そのようなワクチン（以下“殺されたワクチン”とする）は、生ワクチンよりもよシ効果的でないことが知られている。特定の理論に限定されないなら、本発明は、殺されたワクチンの減じられた効率が、ワクチンに使用される病原性物質が不活性化される（これは通常、熱処理又はホルムアルデヒドによる化学的な不活性化によってである）方法に起因することができると思われる。

これは、問題の病原菌の抗原構造を変性し、ワクチンが投与される場合、不適切な免疫応答及びこのために不十分な免疫化を引き起こすと思われる。

この問題は、本発明の処置を利用することによって避けられ得る。従って、細胞殺害機能をコードする１又はそれよりも多くのヌクレオチド配列を担持する病原性物質（該物質は、１又はそれよりも多くの前記ヌクレオチド配列の発現によって殺されている）を含んで成る、殺されたワクチンを産生ずることが可能になって来た。この方法においては、病原菌の構造は生来のまま残り、その結果、理論的には、殺害性ワクチンが投与される哺乳類のより有効な免疫化が得られるであろう。その殺害されたワクチンに使用される病原菌は、生ワクチンとしての使用のために生存する非病原性宿主細胞に導入されるべきエピトープをコードする遺伝子を提供するような上記に挙げられたもののいづれか１つ（又は組合せ）であり得る。

低いが、しかし明らかな危険性の突然変異（殺害機能をもたらす）のために、この型のワクチンは、単に獣医学の分野に適切に使用されるものであり得る。

細胞殺害機能の発現は、たとえば調節可能なプロモーターによって転写のレベルで調節され得る。上記のプロモーターのいずれか１つが使用され得る。

他方、細胞殺害機能の発現は、たとえば細胞殺害機能を特定するｍＲＮＡの翻訳を阻害するアンチセンスＲＮＡによって、上記のように翻訳のレベルで調節され得る。

本発明の殺されたワクチンの特定の態様において、投与される場合、ワクチンは、病原菌が支配される環境の変化、たとえば温度、−又はある化学物質の存在の変化の結果として、体の中でも活性化される、細胞殺害機能を挿入している生病原性物質を含んで成る。

本発明のワクチン〔生又は殺された〕は、医薬的に又は獣医学的に許容される担体又はビークルと共にヒト及び獣医学の分野における普通の実施に従って経口又は非経口的投与のために配合され得る。

生ワクチンの経口投与に関しては、たとえば本発明のために有用であるように企画された多くの細菌の生存性に有害である傾向がある胃の環境に対して宿主細胞を保護することが好ましい。たとえば、この保護は、腸被覆の形で提供され得る。

１、グラム陰性及びグラム陽性細菌細菌性宿主細胞における遺伝子工学のための適切なレプリコンは、たとえばｐＢＲ３２２又は８１ランナウエイ複製プラスミド（ヨーロッノや特許出願第８３３０５４３８．０号、出願番号第０１０９１５０号）をエンテロバクテリアセアエ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃａａｅ）中で複製することができる、又は一般的に、たとえばＲ８ＦＩＯＩＯに由来するシラスミド（Ｂａｇｄａｓａｒｉａｎなど、。

Ｇｅｎａ　１６．１９８１．２３７〜２４２ページ）をグラム陰性細菌中で複製することができるプラスミド、又はたとえばｐｃ１９４及びｐＵＢｌｌｏ（Ｌ、ｏｖｓｔｔ及びＫｅｇｇｉｎｓ、　Ｍｅｔｈ。

ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　６８＃　１９７Ｌ　３４２〜３５７ページ）をグラム陽性細菌中に複製することができるプラスミドである。そのような細菌性プラスミド又は本発明のそのようなプラスミドを含む細胞を生物学的に含むために、Ｒ１ｈｏｋ領域を含むＤＮＡフラグメント（又はＤＮＡフラグメント類）は、Ｒ１ｈａｋ発現が問題の宿主細胞中に認識されることが知られている調節可能なプロモーターによって支配されているような態様で、レプリコン中に挿入され得、そしてそのようなプロモーターは、天然の又は合成のプロモーターのいづれか、たとえば定常期細胞におけるある遺伝子の発現を支配するＥ、コリｔｒｐプロモーター又はＢ、サブティリス（Ｂ、　５ｕｂｔｉｌｉｓ）プロモーターである。この例に示されるように、Ｒ１ｈｏｋ遺伝子生成物は、広範囲のグラム陰性細菌及びＢ、サブティリス（例１６を参照のこと）において及び従りてたぶんすべてのグラム陽性細菌において毒性である。Ｒ１ｈａｋ遺伝子生成物が問題の宿主細胞に対して致死的でない場合（生物学的封じ込めシステムを確立するための明確な必要条件）、Ｒ１ｈｏｋ相同配列相同間題の宿主細胞（又はひじょうに関連した細菌種）のダノムがら、問題の宿主細胞（又はひじょうに関連した細菌種）において天然に存在するプラスミドから又は細菌性ウィルスのいづれかから単離され、そして続いてｈｏｋ様活性についてＲ１ｈｏｋの１つのＥ、コリ染色体相同体についての例に記載されている例に類似する態様により試験され得る。

Ｒ１ｈａｋ又は細菌中におけるｈｏｋに相同のヌクレオチド配列の使用に関与する、たとえば発酵目的のための生物学的封じ込めの確立は、次のものを含むニレシリコン及び宿主細胞の選択：定義された環境下で選択された細胞中に発現されないＲ１ｈｏｋ又はｈｏｋに相同のヌクレオチド配列中への挿入；多量産生されるべく有用な生成物をコードする遺伝子（複数の遺伝子）のレプリコン中への挿入；細菌の形質転換の標準技法によって細菌性宿主細胞中への組換えレプリコンの導入；目的の細胞濃度を達成するのに必要な世代数のために、問題の封じ込めシステムのために必要とされるいづれかの外来性因子を含む必要な栄養物により補足された培養培地中におけるレプリコン含有性宿主細胞の培養；及び最後に、細胞及び培地（このいづれかから、問題の生成物が単離され得る）の収穫。細胞が外部環境に偶然に放出される場合、ｈｏｋ又はｈｏｋ様配列の転写を調節するプロモーターが活性化され、そして細胞は、ｈｏｋ又はｈｏｋ様生酸生成物現の結果として殺害されるであろうし、又はアンチセンスＲＮＡの転写を調節するプロモーターが不活性化される。同様に、それらの細胞からのＤＮＡが他の細胞（第二次宿主）に転移される場合、ｈｏｋ又はｈｏｋ様配列の転写を調節するプロモーターが活性化され、そして細胞は殺害され、そしてこれはまた、　ｈｏｋ又はｈｏｋ様配列がアンチセンスＲＮＡによって調節される場合、そのアンチセンスＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を欠く細胞においても存在する。

２、酵母細胞真核系における組換ＤＮＡ技法の技術的研究は、細菌中で実施されない又は半最適な態様でせいぜい実施される第一次（真核性）遺伝子生成物の翻訳後変性（特定のタンパク質分解切断、グリコジル化２等）を得ることが所望される。広く使用される真核生物ハ、酵母サツカロミセス、セレビシアエ（Ｓａｅｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｅａｒｅｖｉｓｉａｅ）でらり１　ここで天然に存在するプラスミド、すなわち２μレプリコンは、Ｓ、セレビシアエ中の２μレプリコンに本来関係しない遺伝子の発現のためのベクターとして適合せしめられて来た。上記のように、酵母細胞及びプラスミドを封じ込めるためのＲ１ｈａｋ生物学的封じ込め機構の原理を利用して、酵母レプリコン、たトエハ２μレプリコン中に挿入きれるべき配列を単離し又は構成することが可能である。

Ｒ１ｈｏｋの本来のプロモーターは、Ｓ、セレビシア工細胞中に利用されそうもないけれども、単に関連する生物中におけるｈｏｋ様配列の保護及びダラム陽性及びグラム陰性細菌に対するＲ　１　ｈａｋの毒性は、Ｒ１ｈｏｋ遺伝子及びＲ１ｈｏｋに関連する遺伝子（たとえば、細菌プラスミドから単離されたＲ　１　ｈａｋ又は相同遺伝子に対してその配列及び機能レベルで相同性を示す細菌ｒツム起源のｒｅＬＢ−ｏｒｆ３又はｐａｒｌもしくは他の遺伝子）の生成物が、酵母細胞、たとえばＳ、セレピシアエを殺害するためのそれらの能力について試験されるべきであることを仮定することを合理的にする。実際問題として、これはｈｏｋ遺伝子又はｈｏｋ様遺伝子のコード領域を単離し、そして該コード領域を適切な調節可能な酵母細胞プロセーターに連結することを伴い、その得られたレプリコンは最終的に標準方法によって酵母細胞中に導入され、そしてｈｏｋ又はｈｏｋ様遺伝子の発現の結果が調べられる。細胞の死が確実になる場合、有用なｈｏｋ又はｈｏｋ様遺伝子が同定された。

他方、ｐａｒＥ又はｒｅｌＢ−ｏｒｆ３に対する相同性により酵母細胞からのＤＮＡ中に同定された配列が単離され、適切な酵母細胞プロモーターに連結され、２μレグリコン中に導入され、そしてＳ、セレビシアエ中にその組換えレプリコンを導入した後、細胞を殺害するそれらの能力について試験され得る。たとえばＳ、セレビシアエについての発現に基づいて毒性であることを示されたｈｏｋ遺伝子又はｈｏｋ様遺伝子から、Ｒ１ｈｏｔ系と同一の又は相同の生物学的封じ込め系が、一般的な方法の説明で前に論議されたように、調節ループ（調節可能なプロモーター又は適切な酵母プロモーターによって調節されたアンチセンスＲＮＡをコードする遺伝子）を課することによって生成され得る。その得られた調節可能な酵母ｈｏｋ配列又はｈｏｋ様配列は、いづれかの酵母レプリコン、たとえば２μレプリコン又はその誘導体に挿入され、そして該レプリコン中には、天然で２μに関連しない遺伝子が、生物学的封じ込め細胞及び／又は組換えレプリコンのために、その挿入された遺伝子の発現を得る目的ですでに挿入されている。

そのレプリコンは、形質転換又は原形質体融合によって酵母細胞、たとえばＳ、セレビシアエ細胞中に導入され得、そしてしｆリコンを担持する細胞の選択の後、これらはさらに、必要な栄養物及び問題の封じ込めシステムのために必要とされるいづれかの外来性因子により補足された適切な培養培地中で大規模培養により増殖され得る。次に、問題のレプリコンを有する細胞の培養物を収穫し、そしてそのレプリコンから発現されたいづれか有用な生成物が、問題の遺伝子及び遺伝子生成物に依存して、酵母細胞又は培養培地のいづれかから単離され得る。その細胞が外部環境に偶然に放出される場合、ｈｏｋ又はｈｏｋ様配列の転写を調節するプロモーターが活性化され、そして細胞は、ｈｏｋ又はｈｏｋ様生酸生成物現の結果として殺害され又はアンチセンスＲＮＡの転写を調節するプロモーターが不活性化される。同様に、その細胞からのＤＮＡが他の細胞（第二次宿主）に転移される場合、ｈｏｋ又はｈｏｋ様配列の転写を調節するプロモーターが活性化され、そして細胞は殺害され、そしてこれはまた、ｈｏｋ又はｈｏｋ様配列がアンチセンスＲＮＡによって調節される場合、そのアンチセンスＲＮＡ　ヲコードするヌクレオチド配列を欠く細胞においても存在する。

３、哺乳類細胞特定の翻訳後変性のための必要条件は、細菌又は酵母細胞におけるよりもむしろ、哺乳類細胞におけるある真核性遺伝子、すなわちヒト又は動物起源の発現を必要とする。真核細胞中においてクローニングベクターとして使用され得るレプリコンは、ＤＮＡウィルス、たとえばＳＶ４０及びウシ乳頭腫ウィルスからの、又はＲＮＡウィルス、たとえばレトロウィルスからの染色体（ａｒｍレプリコン）に由来する。これらの２種のウィルスは、感染された細胞中においてプラスミド状態で維持されるが、ところがほとんどのレトロウィルス（ＲＮＡ含有性ウィルス）は、ウィルス性ＤＮＡゲノムの染色体組込みコピーとしてよりもむしろ自由に複製するＤＮＡ分子として存在するために遺伝子学的に変性される必要がある。前記レプリコン（この中に、該レプリコンに本来関係しない遺伝子又は遺伝子類が、有用な生成物の発現を得るためにすでに挿入されている）を含む大規模な培養が、前記セクションで論議したように原核ベクター上に含まれる必要があろうことが推定され得る。

酵母細胞系下で記載された態様と同じ態様において、問題の宿主細胞中においてｈｏｋ又はｈｏｋ様効果を及ぼす遺伝子が同定された後、規則的に発現されたＲ　１　ｈａｋ遺伝子を含むヌクレオチド配列又はｈｏｋに相同のヌクレオチド配列が構成され得る。従って、第１段階は、ｈｏｋ遺伝子の発現が、発現の誘導に基づいて得られ、すなわち、問題の宿主細胞中において遺伝子の発現のために必要とされるような、すべての必要な調節配列により補われるような方法により、問題の宿主細胞において覆髄することができるレプリコン中に、細菌性シラスミド、細菌性ゲノム又は酵母細胞ｒツムから（それらの起源には関係ない）の既知のｈｏｋ又はｈｏｋ様遺伝子のコード配列を挿入することであろう。ｈｏｋ又はｈｏｋ様遺伝子の上流の、挿入のために適切なプロモーター配列は、ステロイドホルモンにより誘導可能であるマウス乳癌ウィルスＬＴＲ（長い末端の反復配列）又は金属イオンにより誘導可能であるメタロチオネイン遺伝子の発現を制御する領域であろう。細胞の死が転写の誘導に基づいて確保される場合、ｈｏｋ遺伝子又はｈｏｋ様遺伝子は、問題の宿主細胞のために同定され、そしてとのｈｏｋ又はｈｏｋ様遺伝子から、レプリコンによる生物学的封じ込めシステムが、上記のような転写／翻訳レベルの調節ループによって構成され得る。

細菌又は酵母起源の利用できるｈｏｋ様遺伝子が問題の哺乳類宿主細胞中において何の毒性効果をも及ぼさない場合、新規のｈｏｋ様配列が哺乳類ゲノム〔たとえば、テトラヒメナ（Ｔｅｔｒａｈｙｍａｎａ）のミトコンドリアＤＮＡ及びヒト細胞ＤＮＡ中に発見される配列〕から単離され、そして続いて、正しく発現される場合、ｈｏｋ様活性について試験され得る。新規ｈｏｋ様配列の検出のための推薦される方法は、上記に概略された。

従って、哺乳類細胞におけるｈｏｋ様封じ込め機構の使用は次のものを含んで成るニレプリコン、たと、ｔばレトロウィルスベクターの選択及び挿入されたｈｏｋ様ヌジヌクレオチド配列現を支配する実際の配列に依存するであろう宿主細胞の選択；レプリコン中に産生されるべき有用な生成物をコードするそのような外来性遺伝子のレプリコン中への挿入：　ＤＮＡトランスフェクション又はミクロ −インジェクションの標準方法による問題の哺乳類細胞型への組換レプリコンの導入；問題のレプリコンを含む細胞の選択；有用な生成物をコードする遺伝子を発現する細胞の大規模培養を得るつもりで、必要な栄養物及び増殖因子並びに問題の封じ込めシステムのために必要とされる外来性因子の添加により問題の細胞型のために適合される培養培地中での細胞の増殖；及び最終的に、培養物の収穫及び有用な生成物の単離。

細胞が外部環境に偶然に放出される場合、ｈｏｋ又はｈｏｋ様配列の転写を調節するプロモーターが活性化され、そして細胞は、ｈｏｋ又はｈｏｋ様生酸生成物現の結果として殺害されるであろうし、又はアンチセンスＲＮＡの転写を調節するプロモーターが不活性化される。同様に、それらの細胞からのＤＮＡが他の細胞（第二次宿主）に転移される場合、ｈｏｋ又はｈｏｋ様配列の転写を調節するプロモーターが活性化され、そして細胞は殺害され、そしてこれはまた、ｈｏｋ又はｈｏｋ様配列がアンチセンスＲＮＡによって調節される場合、そのアンチセンスＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を欠く細胞においても存在する。

特定の型の細胞のために適合された特定の型のレプリコンが上記のセクションに詳細に論議されて来たが、本発明の封じ込め機構を用いる一般的な原理は、レプリコンの型及びレプリコンを有する細胞：すなわちレプリコンを有する細胞中において細胞殺害機能の発現を調節するように適合された調節機能及び宿主殺害機能の確立に関係なく同じであり、その結果、細胞殺害機能が発現される条件下で、宿主細胞は殺される。

図面の説明第１図は、ｐａｒＢ＋領域の欠失地図作成を示す。プラスミドＲ１のＥｃｏＲｌ −Ａフラグメント内のｐａｒＡ＋領域及びｐａｒＢ＋領域の配置が黒色のボックスとして示される。ｇｃ　ｏＲＩ−Ａフラグメントの制限酵素部位は、国際特許出願番号ＰＣＴ／１）Ｋ８３１０００８６号、出願番号Ｗｏ　８４１０１１７２に記載されている。ｐａｒＢ　領域は、座標１５．０及び１６．９により縁どられた１、　９　ｋｂのＰｓｔＩフラグメント内に位置される。ｐａｒＢ＋領域はさらに、８８０ｂｐのＲｓａｌフラグメントの右側５ｓｏｂｐに示された。斜めの線の領域は、最小のｐａｒＢ＋領域を示す。

５８ｂｐのｐａｒＢ＋領域内のｈｏｋ及びｓｏｋ遺伝子の位置もまた示されている。λｐＲプロモーター及びλレプレッサー遺伝子のｄ８５７対立遺伝子を含むＢｇｔ■−３ａｔＩフラグメントが、ｐａｒＢフラグメントの種々の部分を担持するｐＢＲ３２２誘導体中に挿入された。その挿入されたフラグメントの位置及びλｐＲからの転写の方向がｐａｒＢ＋領域の地図の下に示される（矢印）。

ｐＫＧ６３３　、　ｐＫＧ６３４及びｐＫＧ３４１におけるλｐＲプロモーターは、ｐａｒＢ＋領域中を左から右に読み、ところがｐＫＧ１７１におけるλｐＲプロモーターは右から左に読む。

制限酵素部位は、Ｅ（ＥｃｏＲＩ）、　Ｂ（Ｂａ！Ｉ）　、Ｂｚ（Ｂｇ／−１１）。

５（ＳａＬＩ）　、　Ｒ（Ｒｓａｌ）及びＰ（Ｐｓｔｌ）として示される。

第２図は、プラスミドｐＰＲ９５（１３ｋｂ）の地図を示す。

ｃｏｐＡ　ｒ　ｃｏｐＢは、シラスミドＲ１の複製制御遺伝子を示し：ｒｅｐＡはＲ１複製のために必要とされる遺伝子を示し：　ｏｒｉは複製の起点であり；　ｂｔａはプラスミド担持細胞上で耐アンピシリン性を付与する遺伝子を表わし：　ｐａｒＢはｈｏｋ及びｓｏｋ遺伝子をコードするＲ１由来の維持機能を表わし：　ｄａｏ−ムｃＺ’はｄｅｏｃ遺伝子とｔａｅ２７ｉ１１伝子の間の翻訳融合を示す。ｔａｃＺ　ｔＹｊＡはＬｔｈｃオペロンを表わし；　ｃＩ８５７はλ ｐＲ７ｏ。

モーター活性を制御する温感性λレプレッサーをコードする遺伝子を示す。矢印は、転写の方向を示す。

黒色のパーは、種々の遺伝の延長を示す。制限酵母部位は５ａｔＩ（Ｓ）　、Ｂｇｔ■（Ｉｈ）、　ＢａｍＨＩ（Ｂ）及びＥｅｏＲＩ（Ｅ）として示される。

第３８及び３ｂ図は、ｐａｒＢ＋領域のヌクレオチド配列を示す。上のＤＮＡ鎖の５′末端は、右に位置する。

塩基の数は、第１図におけるｐａｒＢ＋領域の座標に従って存在する。Ｔｓｒは、５０個以上のコドンから成るヌクレオチド配列中に存在するたった３個の読み取り枠の停止コドンを示す。＋３０４位で始まる、ｈｏｋ遺伝子生成物のアミノ酸配列がＤＮＡ配列の下に示され−アミノ酸略語は標準の命名法である。′−１０１及び”−３５”と命名された下線を引かれている配列は、ｓｏｋ遺伝子のためのプロモーター構造体である。

第４図は、λｐＲがｈｏｋ遺伝子の活性化を誘発した後の宿主細胞の死を示す。

ｐＫＧ６３４（黒くぬられた記号）又はｐＫＧ１７１（黒くぬられていない記号）のいづれかを含むＪＣ４１１株が、３０℃でカサミノ酸により補われたＡ＋Ｂ最少培地中で指数的に増殖された。

時間０で、温度が４２℃に変えられ、そして培養物の増殖は、選択培地（５０μ ルぜのアンピシリンを含むＬＢプレート）上での０Ｄ４５０及び生存細胞数測定として表わされた。

第５図は、ＪＣ４１１（ｐＫＧ６３４　）株が４２℃に変えられた後、１時間後、サンプリングされた細胞の写真である。矢印は、明らかに変えられた形態を有する細胞を示す。正常な形態を有する細胞もまた見られる。

倍率ｘ２０００゜第６図は、宿主細胞殺害の抑制を示す。ｐＦ６３４のみ（黒くぬられた記号）又はｐＦ６３４　＋　ｐＰＲ６３３（黒くぬられていない記号）のいづれかを含むＪＣ４１１株が、３０℃でカサミノ酸により補われたＡ＋Ｂ最少培地中で指数的に増殖された。時間０で、その温度が４２℃に変えられ、そして培養物の増殖は、選択培地（１００μ’ｉｔ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢプレート）上での光学密度Ｃ０Ｄ４５０　）及び生存細胞数を測定することによって示された。

第７ａ図は、ｈｏｋ遺伝子生成物及びｒｅｔＢ−ｏｒｆ３遺伝子生成物のアミノ酸配列の比較である。保護されたアミノ酸は、太字のタイプで示され；保存性変化を示すアミノ酸は下線を引かれている。

第７ｂ図は、Ｅ、コリのｒｅｔＢオペロンのｐａｒＢ及びｏｒｆ３Ｃ）ヌクレオチド配列の配置を示す（Ｂｅｃｈなど、。

Ｔｈｅ　ＥＭＢＯＪｏｕｒｎａｌ　４　、１９８５　、１０５ト１０６６ページ）。

ｐａｒＢ配列は上の鎖であり、ｒｅｔＢは下部の鎖である。

垂直のバーは、保護されたヌクレオチドを示す。かっこ内の数字は、Ｂｅｃｈなどによって与えられたような、ｒ＊ＬＢヌクレオチド配列の相関体である。これらの２種読み枠の出発コドンが同じ位置に存在するように、これらの２種の配列が整列され、これは＋３０４位でＭｅｔにより指運される。２種の読み枠の終結コドンは＋４６０位でＴｓｒにより指摘される。

第８８図は、Ｒ１ｐａｒＢプローブを用いるフィルターハイプリ〆イゼーションによって分析された、Ｅ。

コリ株からのＥｃｏＲＩ−１１Ｊ限性合計ＤＮＡ　０．７５ａｇを示す。

レーン１　：　Ｒｌｄｒｄ−１９；レーン２　；　Ｒ１００：レーン３二Ｒ３８６゜これらのレーンは３０分間、感光された。レーン４　：　ＲＰＩ　：レーン５　：　Ｒ６−に：レーン６：プラスミドを含まないＥ、コリ。これらのレーンは５時間感光された。適切なフラグメントのサイズは、ｋｂで与えられている。

第８ｂ図は、ｒｅｔＢ−ｏｒｆ３プローブを用いるフィルター・・イブリダイゼーシ、ンによって分析された、Ｅ、コリ株からのＥｃｏＲＩ−制限性合計ＤＮＡ　０．７５　ｔｔ９を示す。レーン１　：　Ｒ１００；レーン２　：　Ｒ３８６；レーン３ニブラスミドを含まないＥ、コリ。感光の時間：３．５時間。適切なフラグメントのサイズは、ｋｂで与えられている。

第９図は、Ｒ１ｐａｒＢ７’ロープを用いるフィルターハイツリダイゼーシ、ンによって分析された、種々の細菌からのＥｃｏＲＩ−制限性合計ＤＮＡ０．５〜０．７５μｙを示す。オートラジオダラムは、１７時間感光された。同じオートラジオダラムの２種の異なった写真感光は、次の通りである：レーン１：サルモレラチフィムリアム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）（このテキストには論議されていない）；レーン２：セラチア　マルセスセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）：レーン３ニブスートモナス　フルオレスセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｆｌ、ｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）：レーン４ニブスートモナス　プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｕｔｉｄａ）；レーン５ニブロチウス　ｚＺルガリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ　ｖｕｌｇａｒｉｓ）（このテキストには論議されていない）；レーン６：Ｅ、コリ；レーン７：パシラス　サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　＠ｕｂｔｉｌｉｓ）　：レーン８：バシラス　サーキュランＰＬ２３６　（Ｂａｃｉｌｌｕｓｅｉｒｃｕｌａｎｓ　ＰＬ２３６　）　ｏ放射性ラベルされたマーカー（ＨｉｎｄＩ［ｌにより制限されたλ）のサイズは、ｋｂで与えられる。

第１０図は、ｒｅｔＢ−ｏｒｆ３プローブを用いるフィルターハイプリダイゼーシ、ンによって分析された、種々の細菌からのＥｃｏＲＩ−制限性合計ＤＮＡ　０．５〜０．７５μ夕を示す。オートラジオダラムは、１７時間（レーン１）及び７２時間（レーン２〜７）、感光サレタ。レーン１：セラチア　ツルセスセンス；レーン２：ゾスードモナス　フルオレスセンス；レーン３ニブスートモナス　ゾチタ；レーン４：パシラス　サブチリス；レーン５；バシラス　サーキュランＰＬ２３６　：レーン６，７：ラクトバシラス（Ｌａｃｔｏｂａｅｉｌｌｕｓ）　。放射性ラベルされたマーカー（Ｈｉｎｄｌｌｌにより制限されたλ）のサイズは、ｋｂで与えられる。

第１１図は、ｒｅｔＢ−ｏｒｆ３プローブ（レーン１−４）及びＲ１ｐａｒＢ　７’　ｏ−ブ（レーン５−６）を用いて、真核細胞からのＤＮＡのフィルターノーイブリダイゼーシ、ン分析を示す。ＤＮＡは、ＥｃｏＲＩ　（レーン１−３及び５−６）又はＰｓｔＩ（レーン４）により切断された。レーン１：テトラヒメナ　サーモフィラ（Ｔｓｔｒａｈｙｍａｎａ　ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｍ）からの大核ＤＮＡ　１．５μ９；レーン２：テトラヒメラ　サーモフィラからの合計ＤＮＡ　２．５　ＡＬＥ！　：レーン３：ピスム　サチバム（Ｐｉｓｕｍｓａｔｉｖｕｍ）からのクロロプラストＤＮＡ　０．２５μｇ：レーン５：神経芽細胞からの合計の細胞性ＤＮＡ　５μｙ；レーン６：胎児の肝臓からの合計の細胞性ＤＮＡ　１０μｓ。

フラグメントのサイズＱ、ｋｂで与えられる。

第１２図は、プラスミドｐ３４１−１の部分的な地図を示す。ここに表わされている領域は、ｈｏｋ遺伝子とＥ、コＩＪＫ−１２（プラスミドｐｓＧｓ８７５” ら得られた）のｔｒｐオペロンからのプロモーター領域との融合である。ｔｒｐ　ニア’ロモーター（矢印によって示される）の他に、ｔｒｐＥ遺伝子のＮＨ，終結端がまた表わされている（　ｔｒｐＥとして示される）。点線は、ｐＢＲ３２２配列を表わし、そしてこれからのＡＰＲ遺伝子及び複製の起点が示されている。制限酵素部位は、Ｅｌ（ＥｃｏＲＩ）　＊Ｂ１−Ｅ５（ＢａｍＨＩ　（ＤＮＡポリマラーゼＩによってフィルインされた）及びＥｃｏＲＶの融合〕及びＸ− ５（Ｘｈｏｌ及び５ａｔｌの融合）として示される。

第１３図は、３７℃で０．２％グルコース及び１チカサミノ酸により補足されたＡ＋Ｂ最少培地中で増殖されたＭＣ１００Ｏ（Ｐ３４１−１８円）及びＭＣ１００Ｏ（三角）のための増殖曲線を示す。細胞密度は０Ｄ４５Ｇとして分光光度的に測定される。

第１４図は、時間の関数としての、ｐＮＬ７　（円）又はＰＢＲ３２２（三角）を含むＥ、コリ１（ＢＩＯＩの生存細胞数Ｃ０Ｄｓｏωを示すグラフである。外来性トリプトファンは、ＭＡ＋Ｂ培養培地に添加されなかった。

第１５図は、時間の関数としての、ｐＮＬ７（円）及びｐＢＲ３２２（四角）を含むＥ、コリＨＢＩＯＩの生存細胞数（ＯＤ６００　）を示すグラフである。５ μに舅のトリプトファンがＨＡ　＋　Ｂ培養培地に添加された。

第１６１Ｌ図は、最小のｐａｒＢ＋領域の欠失地図作成を示す。数字は、第１図に示されるｐａｒＢ＋領域の座標に従って存在する。その領域内のｈｏｋ及びｓｏｋ遺伝子は、それぞれ黒くぬられた部分及び開放部分により示されている。推定のｍｏｋプロモーターは←として示され、そして推定のｈｏｋ　Ｓｈｉｎｅ− Ｄａ１ｇａｒｎｏ配列は＊として示される。プラスミドｐｐＲ３４１及びｐＰＲ３４５は、ｐＢＲ３２２の誘導体であり、これは、それぞれ＋２６８〜＋５８０及び＋３０３〜＋５８０のｐａｒＢ領域を含む。プラスミドｐＰＲ３４１は、ｈｏｋ　５ｈｉｎｅ　−Ｄａ１ｇａｒｎｏ配列及びｈｏｋ読み枠を担持し、ところがｐＰＲ３４５は、ｈｏｋ読み枠のみを担持する。両プラスミドは、ｓｏｋ遺伝子を欠いている。制限酵素部位はＪ（ＢａｍＨＩ）及びＥ（ＥｃｏＲＩ）として示される。

第１６ｂ図は、ｃｒｏ’−ｈａｋ遺伝子融合の誘導のために使用されるプラスミドｐＫＧ３４５の物理的且つ遺伝子的な地図を示す。プラスミドｐＫＧ３４５はｐＰＲ３４５誘導体であり、ここでλｐＲプロモーター及びλリプレッサー遺伝子のｃＩ８５７対立遺伝子を含むＢｇｔ■−８ａｔＩフラグメントが、ＢａｍＨＩ及び５ａｔｌにより制限されたｐＰＲ３４５中に挿入された。この構成は、それぞれλｐＲプロモーター及びｃｒｏ　Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｔｇａｒｎｏ配列の制御下でｈｏｋ遺伝子の転写及び翻訳を決定した。遺伝子融合は、ｅｒｏ’のために開放部分として及びｈｏｋのために胴線部分として示される。ｂｔａ遺伝子、 λレプレッサー（黒くぬられた部分〕及び複製の起点がまた示される。λｐＲプロモーターは←として示されそしてｃｒｏ　Ｓｈｉｎｓ−Ｄａ１ｇａｒｎｏ配列は＊とじて示される。制限酵素部位は、Ｒ（Ｒｓａｌ）　、　５（Ｓａｔｌ）　、　Ｅ（ＥｃｏＲＩ）　−Ｂ（ＢａｍＨＩ）及びＢ２（ＢａｔＩ［）として示される。

第１７図は、ｂｏｋ遺伝子とｃｒｏ’−ｈｏｋ“遺伝子との融合体のλｐＲ誘発性発現の後の宿主細胞殺害を示す。

Ｅ、コリ株ＭＣ１００Ｏ（：　ｐＫＧ３４１　（開放の記号）又はｐＫＧ３４５（黒くぬられた記号）のいずれかを含む〕は、３０℃で、０．２％グルコース及び１％カサミノ酸により補足されたＡ＋Ｂ最少培地中で指数的に増殖された。

時間Ｏで、温度が４２℃に変えられ、そしてその培養物の増殖は、選択培地（１００μＦ１７ｍｌのアンピシリンを含むＬＰ７’レート）上で０Ｄ４５０及び生存細胞数測定として表わされた。

第１８図は、プラスミドｐＬＫ２６の地図である。黒くぬられた部分は構造遺伝子を示し；挿入体は、５ｐａｃＩプロモーター続いて合成リポゾーム結合部位及びポリリンカーを示し：　ａｒｔは、それぞれｐＢＲ３２２及びｐＵＢ　１１０からの複製の起点を示し；　ｌ＊ｃ　ｏはｔａｃオペレーターを示す。

第１９図は、時間の関数としての、ｐｓｉ−１Ｃ円）又はｐＬＫ２６　（四角）を含むＢ、サブチリスＢＤ１７０の生存細胞数Ｃ０Ｄ６００　）を示すグラフである。その細胞は、３７℃で、５μＥｌ／ｍｌのクロラムフェニコールを含むＬＢ培地中で指数的に増殖した。

第２０図は、２ｍＭのＩＰＴＧによるｈｏｋの誘発の後の殺害運動を示すグラフである。ｐＳＩ−１Ｃ円）又はｐＬＫ２６　（四角）を含むＢ、サブチリスＢＤ１７０は、５μｇ〜のクロラムフェニコールを含むＬＢ培地中で増殖された。生存細胞数測定は、５μ９／ｋｔｌのクロラムフェニコールを含むＬＢプレート上でモニターサれた。

第２１図は、シラスミドｐＰＫＬ８（５，５ｋｂ　）の地図を示す。ｆｉｍＢ　＃　ｆｉｍＥ及び切断されたｆｉｍＡ遺伝の位置が示されている。二重矢印を含むボックスは、ｆｉｍＡ遺伝子のプロモーターを含む逆位可能な３００ｂｐ領域を示す。斜線部分はｐＢＲ３２２のＤＮＡを示す。

第２２図は、プラスミドｐＰＲ３４１（４，３ｋｂ　）の地図を示す。胴線部分はｐＢＲ３２２のＤＮＡを示す。

第２３図は、シラスミドｐＰＫＬ１００　（７，５ｋｂ　）の地図を示す。詳しくは第１４及び第１５図を参照のこと。

第２４ｍ及び第２４ｂ図は、プラスミドｐＰＫＬ１００を含むＥ、コＩＪＫ−１２株ＭＣ１００Ｏ細胞の顕微鏡写真を示す。矢印は殺害されたゴースト細胞を示す。

第２５図は、プラスミドｐＰＫＬ１００　（レーンＡ）及びｐＰＫＬ８　（レーンＢ）のＳｍｅｌｌ及びＳｎ　ａＢ　■による消化ヲ示す。レーンＣは、次のサイズを示す分子量マーカーとして使用されたバクテリオファージλのＨｊｎｄＩ［Ｉ消化物である：　２３．１ｋｂ、　９．４ｋｂ　、　６．６ｋｂ。

４．４ｋｂ＃　２．３ｋｂ、　２．０ｋｂ及び０．５６ｋｂ、矢印は、３００ｂｐセグメントの逆位によって影響されたフラグメントを示す。

第２６図は、プラスミドｐＬＰ４（Ａ）　ｅ　ｐＬＰ（覇Ｂ）及びｐＬＰ６　（＝Ｃ）の地図を示す。胴線部は、ｐＡｃＹ０１８４のＤＮＡを表わす。関連する制限部位及びｆｉｍＢ及びｆｉｍＥ遺伝子の位置が示されている。

材料及び方法細菌株及びプラスミド細菌及びプラスミドは、第１表に挙げられている。

使用される実験技法は、微生物遺伝学（ＪｏＭｉｌｌｅｒ：Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　＊　Ｃｏ１ｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ　＊　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　ｚ　１９７２）及び遺伝子操作（Ｄａｖ　ｉ　ｓ　＊Ｂｏｔｈｓｔｅｉｎ及びＲｏｔｈ：　Ａ　Ｍａｎｕａｌ　ｆｏｒ　Ｇｅｎ５＋ｔｉｃＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　：　Ａｄｖａｎｃｅｄ　Ｂａｃｔｅｒｉａｌ　Ｇｅｎ５ｔｉｅｓ　ｙＣｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　ｒ　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　ｈ　１９８０及びＭａｎｉａｔｉａ、　Ｆｉｒｉｔｓｃｈ及びＳａｍｂｒｏｏｋ　：　ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｎｉｇ　ｒ　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　ｒ　Ｎｅｔｖ　Ｙｏｒｋ　ｒ　１９８２）の分野に使用される標準技法であった。

すべての細胞は、グルコース０．２％及び１μ９７ｍ１のチアミンを含むＬＢ培地（Ｂｅｒｔａｎｉ　ａ　Ｊ、　Ｂａｅｔ６２ｅ１９５１．２９３ページ）又はグルコース０．２％及び１％カサミノ酸により充たされたＡ＋Ｂ最少培地（Ｃ１ａｒｋ及びＭａａｌｅ　、　ＪｏＭｏｌ、　Ｂｉｏｌ、　２３　ｘ　１９６７　＋９９ページ）中で増殖された。使用されるプレートは、ＬＢ培地及び寒天１．５チを含むＬＡ７’レートであった。

透明な分解物が、Ｃｌｅｗ＠ｌｌ及びＨ＠１ｉｎｓｋｉ＊　Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、Ａｅａｄ、Ｓｅｔ、　ＵＳＡ６２　、１９６９　、１１５９〜１１６６ページによって記載された方法に従って調製された。

プラスミドＤＮＡの小規模な調製が、Ｂｉｒｎｂｏｉｍなど、。

Ｎｕｅｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、？’＋　１９７９ｙ　１５１３〜２３ページの方法によりて行なわれた。

プラスミドＤＮＡの大規模な調製及び分析がＳｔｏｕｇａａｒｄ及びＭｏ１ｉｎ　＊　Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１１８　ｍ１９８１　、１８１ページに従って、色素浮遊密度勾配遠心法を用いて行なわれた。

制限エンドヌクレアーゼが、製造者によって提供され次規定（Ｂｏ＊ｈｒｉｎｇｅｒ　ｓ　Ｍａｎｎｈｓｉｍ又はＢｉｏｌｍｂｓ。

Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　）に従って、３７℃で使用された。二重及び三重の消化が、最っとも低い塩濃度を要する酵素により開始し、そして次に次の酵素を添加する前、追加の緩衝液により調整することによって行なわれた。

エキソヌクレアーゼＢａｔ３１による処理は、次のよぅにして行なわれた二０．１単位のＢａｔ３１を、線状ＤＮＡ　５０μｓに添加し、そしてサンプルを、１１．ｔ２１゜４’　、　８’　、　１６’　、　３２’及び６０’　テロ　０　ｍＭ＋７）ＥＤＴＡ中に取り、フェノ盛により抽出し、エタノールにより沈殿せしめ、そしてＴＥ緩衝液２０μ！中に再懸濁した。その２０μｌ溶液の半分を、適切な制限酵素により消化し、アガロースゲル電気泳動にかけ、欠失されたＤＮＡ欠失体の平均サイズを決定した。他の半分に、適切なリンカ−を添加し、そしてその混合物を、４８時間、過剰のＴ　４　ＤＮＡ　Ｕガーゼによシ連結した。

制限されたプラスミドＤＮＡの連結は、製造業者によって推薦されるようにして行ない（但し、プラント末端の連結を除く）、ここで過剰のＴ　４　ＤＮＡリガーゼ及びＡＴＰが添加された。

ＰＫＧ６３３：λレゾレッサー遺伝子のｅＩ８５７温度感受性対立遺伝子及びλ ｐＲプロモーターを含むｐＯＵ８２のＳａｔＩ−Ｂｇｔ■フラグメントを、ｐａｒＢ＋領域の前のｐＰＲ６３３中に挿入し、その結果、λｐＲｆロモーターは、左から右に領域中を読む（第１図）。類似する方法において、ｐＯＵ８２のＳａｉｌ−ＢｇＬｎフラグメントを、ｐＰＲ６３４及びｐＰＲ３４１中に挿入し、これらは、ｐＫＧ６３４及びｐＫＧ３４１をもたらす、ｐＰＲ６３３のＢａｔ３１欠失誘導体である。ｐＫＧ１７１　：　ｐＰＲ１７１において、ｐＯＵ８２のＳａｔＩ−Ｂｇｔｎフラグメントを、反応の方向に挿入し、ｐＫＧ１７１を得た。

ｈｏｋ及びｓｏｋ遺伝子に対するその挿入されたλｐＲプロモーターの位置及び方向は第１図に示される。ｐＦ６３４　：　ｐａｒＢ＋領域の右側３９０ｂｐ及びλｄ８５７−ｐＲ誘発性プロモーター系を含むｐＫＧ６３４のＥｃｏＲＩ−８ａｔＩフラグメントを、プラント末端の連結（Ｓｌヌクレアーゼを用いて、制限され、プラント末端化されたＤＮＡフラグメントを製造した）によって、ｐＭＬ３１の耐カナマイシン性（ａｐｈＡ”）フラグメント中のユニーク５ａｉ１部位に挿入した。

ＤＮＡを、製造業者によって与えられる方法に従って、適切な制限エンドヌクレアーゼにより切断した。

細胞ＤＮＡのためには、ＤＮＡμＳ当り１０単位が使用された。インキュベーション時間は、３７℃で３時間であった。その生成されたＤＮＡフラグメントを、０．８ボルト／ｃ！ｎで１８時間、Ｔｒｉｍ−酢酸緩衝液中、０．７％又は１チアガロースダルを通しての電気泳動により分離し、そしてエチジウムプロミドによる染色により可視化した。

シラスミドの移動化Ｅ、コリＳ　１７．１は、染色体中における、挿入された接合性プラスミド（ＲＰＩ誘導体）によって、ＲＳＦＩＯＩＯのようなシラスミドを移動することができる。問題のプラスミドは、供与体を表わす８１７．１に形質転換された。

供与体細胞及び受容細胞の１滴を、ＬＢプレート（選択されない）上で混合し、そして−晩インキュベートした。この得られた細胞マスから、液体懇濁液を生成し、この希釈液を、二重選択グレート上に分散した。

第１表細菌及びプラスミド細菌　適切な表現型Ｅ、コリに−１２ｔ　ＭＣ１００Ｏ１）　Ｌａｕ−＋　Ｌａｅ−，５ｔｒＲＥ、コ　リに−１２ｓ　Ｓ１７．１２）　Ｐｒｏ−，５ｔｒＲｔ　Ｍｏｂ”Ｅ、コ　リ　Ｋ−１２、１００５”　Ｍ＠ｔ−、ＮａＬ”セラチア　マルセスセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｍａｒｃｅ＋５ｃｅｎｓ）　ＴｅＲシス−トモナス　プチダ　ＲｉｆＲバシラス　サブチリス　ＢＤ１７０リ　ｔｒｐＣ２、ｔｈｒ−５プラスミド　適切な表現型　ｐａｒＢ挿入体の座標（第１図を参照のこと）Ｒｌｄｒｄ−１９ｐＳＧＳ８　ｐＢＲ３２２−、Ｔｒｐ”、　ＡｐＲｐＢＯＥ９３　ＲＳＦＩＯＩＯ，ＫａｎＲｐＰＲ９５Ｒ１，＋（ｈｏｋ”、　ｓｏｋ”）　−３００−＋５８０ｐＰＲ３１１Ｒ１ｅ＋（ｈｏｋ”、　ｓｏｋ”）　＋１−＋５８０ｐＰＲ６３３ｐＢＲ３２２，＋（ｈｏｋ”、　ｓｏｋ”）　＋１−＋５８０ｐＰＲ６３４ｐＢＲ３２２，−（ｈｏｋ”）　＋１９４−＋５８０ｐＰＲ３４１ｐＢＲ３２２， −（ｈｏｋ”）　＋２６８−＋５８０ｐＰＲ１７１ｐＢＲ３２２，−−３００− ＋２８８ｐＰＲ１５４ｐＢＲ３２２，−（ｓｏｋ”）　３００−＋３３０ｐＫＧ６３４　ｐＢＲ３２２，（ｈｏｋ”）　＋１９４−＋５８０ｐＫＧ３４１　ｐＢＲ３２２，−（ｈｏｋ”）　＋２６８−＋５８０ｐＫＧ１７１　ｐＢＲ３２２， −３００−＋２８８ｐＰＫＬ１００　ｐＢＲ３２２，Ａｐ　、Ｔｅｔ　＋２６８ −＋５８０ｐＰＫＬ８　ｐＢＲ３２２，ＡｐＲｐＪＫ３−１６）ｐＢｃ１６．ｐＢＲ３２２，ＴｅｔｐＳＩ−１７）ｐＵＢｌｌｏ、　ｐＢＲ３２２，Ｃａｔｌ）　Ｍ、Ｊ、　Ｃａ５ａｂａｄａｎ＋　Ｓ、Ｎ、　Ｃｏｈｅｎ＋　Ｊ、　Ｍｏ１ｅｃ、　Ｂｉｏｌ。

１３８、１９８０．１７９ページ。

２）　Ｒ３Ｓｉｍｏｎ＋　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｙ　Ｎｏｖｅｍｂｅｒ　１９８３＋３）　Ｊ、Ｇｒｉｎｓｔｅｄ＋　Ｊ、Ｒ，５ａｕｎｄｅｒｓ＋　Ｌ、Ｃ，Ｉｎｇｒａｍ＋Ｒ，Ｂ、５ｙｋｅｒｔ＋　Ｍ、Ｎ、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ。

１１０．１９７２．５２９ページ。

４）Ｄｕｂｎａｎ　＆　Ｃｉｒｔｇｌｉａｎｏ＋　Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１１’Ｌ１９７４、４８８ページ。

５）　Ｇ、Ｓｋｏｇｍａｎ＋　Ｊ、　Ｎｉ１ｓｓｏｎ＋　Ｐ、　Ｇｕ８ｔａｆ＋５ｓｏｎ＋　Ｇｅｎｅ２３、１９８３．１０５ページ。

６）Ｋｒｅｆｔ　ｓｔ　ａｌ＋＊　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇａｎｄ　Ｇａｎｇ　Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ　ｉｎ　Ｂａｃｉｌｌｉ　＠ｄｓ、Ａ、Ｔ。

Ｇａｎｅｓａｎ　ｅｔ　ａｌ、＋　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ＋　１９８２ｓ　１４５ページ。

７）　Ａ　ｓｌｉｇｈｔ　ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐＡＩＱ２５　ｄｅｓｃｒｉｂｅｄｉｎ　Ｙａｎｓｕｒａ　ａｎｄ　Ｈｅｎｎｅｒ＋　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、　Ａｃ１ｄ。

Ｓｃｉ、　８１．１９８４．４３９ベージ；　Ｈｅｎｎｅｒ　から得られた。

染色体ＤＮＡの精製全ＤＮＡを次のようにして細菌から抽出した。細胞を遠心分離により収穫し、ＩＸＴＥＮ緩衝液（ＴＥＮ　＝　１　０　ｍＭのＴｒｉｓ（ｐ８７．５　）　、１ｍＭのＥＤＴＡ　。

０．１ＭのＮａＣ４）により２度洗浄し、そして１４礪のリゾチームを含むＴＥＮの１／１０体積中に再懸濁した。３７℃で３０分間のインキュベーションの後、プロトプラストを、ドデシル硫酸ナトリウムの添加により分解し、１％の最終濃度にし、そしてプロテイナーゼＫを添加し、０．２５　ｍ９／ｍＡ’にした。

その分解物を３７℃で２時間インキュベージシ、そして緩衝フェノールにより２度及びクロロホルムにより３度、連続的に抽出した。酢酸ナトリウムを添加し、０．３Ｍにし、そして１体積のインプロパツールの添加によってＤＮＡを沈殿せしめた。その沈殿物を、９６チ及び８０ｑｂエタノールにより数置洗浄した。

最後に、ＤＮＡを、１！ｎＭのＴｒｉｓ　、　１　ｍＭのＥＤＴＡ中に溶解した。

テトラヒメナ　サーモフィリアＢｖ■からの全ＤＮＡを、Ｎ１ｅｌｓｅｎ、　Ｈｏ及びＥｎｇｂｅｒｇ＋　Ｊ、　：　Ｂｉｏｃｈｉｍ。

Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ａｃｔａ　８２５　、１９８５　＃　３０〜３８ページの方法に従って調製した。テトラヒメナサーモフィリアＢＶ［からの大枝を単離しく　Ｃｅｃｈ＋Ｔ、Ｒ８など、　：　Ｃｅ１ｌ　２７　、１９８１　、４８７〜４９６ページ）そしてＤＮＡを抽出した（　Ｍａｎｉａｔｉａ　など、、　１９８２　、ｏｐ、ｅｆｔ、、　２８０〜２８１ページ）。

テトラヒメナ　サーモフィリアＢＶ■からのｒＤＮＡを、Ｅｎｇｂｅｒｇ　ｅ　Ｊ、など、：　Ｊ、　Ｍｏｌ、　Ｂｉｏｌ、　１０４　、１９７６゜４５５〜４７０ページによって記載されているようにして調製した。

ピサム　サチパム（Ｐｉａｕｍ　ｓａｔｉｖｕｍ）からのクロロプラストＤＮＡを、Ｂｏｏｋ　ｊａｎｓ＊　Ｇ、など＠　：　Ａｎａｌｙｔ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１４１　＊　１９８４　ｅ　２４４〜２４７ページの方法に従って単離した。

７週の法的な中絶からの胎児の肝朦組織を、生理食塩水中で細かく切り刻み、そしてそのＤＮＡを、Ｍａｎｉａｔｉｓなど、ｓ　１９８２　ｒ　ｏｐ、　ｅｆｔ、、　２８０〜２８１ページの方法に従って調製した。類似する方法によシ、ＤＮＡを、神経芽細胞腫の患者からの腫瘍組織検査法によシ単離し；その単離されたＤＮＡは、数百倍の拡大された染色体領域を含むことが見出され、そして同様に、腫瘍細胞は、分裂細胞の鏡検法により、多くの染色体外ミニクロモソームを含むことが見出された。

放射性ラベリングのためのＤＮＡフラグメントの単離１００ミクロンのｐＰＲ９５及びｐＢＤ２７２４　ＤＮＡを、それぞれＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄｌｌにより消化した。そのフラグメントを、５ボルト／、で３時間、Ｔｒｉｇ−プレート緩衝液中、１チアガロースグルを通して電気泳動により分離した。所望のフラグメントを、製造業者の方法に従って、ＮＡ４５膜（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　＆　５ｃｈｕｌｌ）上で電気溶離することによって単離した。６５℃で１．５ＭのＮａＣｔによりそのフィルターを溶離することによってフラグメントを回収した後、そのフラグメントを再びアガロースゲル電気泳動による精製にゆだねた。

アガロースゲル電気泳動ＤＮＡを、製造業者によって与えられた方法に従つて、適切な制限エンドヌクレアーゼにより切断した。

細胞ＤＮＡのためには、ＤＮＡ、！１ｇ当り１０単位が使用された。インキュベージ、ン時間は、３７℃で３時間であった。生成されたＤＮＡフラグメントを、ｏ、　Ｂ　ｚルト／ｃｒｎで１８時間、Ｔｒｉｓ−酢酸緩衝液中、０．７％又は１％アガロースゲルを通して電気泳動にかけることによって分離し、そしてエチジウム　プロミド染色により可視化した。

分子量マーカーを次のようにして調製した：ｗｔλＤＮＡを、ＨｉｎｄＩ［Ｉにょシ制限し、そしてα−３２Ｐ−ｄＣＴＰ＋非放射性ｄＡＴＰ及びｄＧＴＰの存在下で、製造業者によって推薦されるようにして、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　＊Ｍａｎｎｈ＠ｉｍからのフレノウポリマラーゼにより末端ラベル化した。分子量マーカーとして使用される場合、テトラヒメナの多くの大枝ＤＮＡが、試験レーンのＤＮＡ負荷に対応して添加される。

グルカラニトロセルロースフィルターへのＤＮＡフラグメントのトランスファー室温で１５分間、０．２５ＨのＨＣｌ中で一部脱プリンした後、グル中のＤＮＡの変性、中和及びグルがらＢｉ１２（Ｓｅｈｌｅｉｃｈｅｒ　＆　Ｓｃｈ”ｕｌｌ）　二）ロセルロースフィルターへの続くトランスファーが、Ｍａｎｉａｔｉｓなど、。

１９８２　、　ｏｐ、ｃｉｔ、、　２８０〜２８１　ペー７に記載のようにして行なわれた。トランスファーの完結は、トランスファーの後、ダルのエチジウムプロミド染色により確められた。

以下余白放射性ラベルされたグローブの調製９００　ｂｐのｐａｒ　Ｂフラグメント０．３μｇ及び３００ｂｐのｒｅｌ　Ｂ　−ｏｒｆ　３フラグメントＱ、３μｇ？、０．２５μＭのα−３２ｐ−デオキシシチジン三リン酸（ｍモル尚！１１３０００Ｃｉ）を用いてニックトランスレージ。

ン（Ｍａｎｉａｔｉｓなど・、１９８２．Ｏｐ、Ｃｉｔ、）によって放射性ラベルした。取込まれなかった放射性前駆体を、くシ返しこのエタノール沈殿法によって除去した。それぞれの調製物に、担体としてＥ・コリの＋　ＲＮＡ　１００ μｇを添加した。

プローブの比活性は、それぞれｐａｒ　Ｂ及びｒｅｌＢ−ｏｒｆ３フラグメントのμｇ当クシ２〜３Ｘ１０び４〜５Ｘ１０ｄｐｍであった◎ ハイブリダイゼーションアガロースグルからトランスファーされたＤＮＡを含むフィルターを、一定に振盪しながら、３７℃で１８時間、ハイブリダイゼーション溶液を有するプラスチックバッグ（１２０ｍ２当、９１０ｍ／）中でブレインキュベートした。そのハイブリダイゼーション溶液は、Ｗａ　ｈ　１など、ｒ　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ　、　７６　ｔ　１９７９　＋３６８３〜３６８７−（−ジから変性され、そして３８％脱イオン化ホルムアミド、０．７５ＭのＮａＣｔ、　５０　ｍＭのリン酸ナトリウム及び１０　Ｘ　Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液（５ＱＸ　Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液は、０．２％ウシ血清アルプミ／、０．２％ポリビニルピロリドン及び０．２％フィコールを含む）を含有した。

ブレインキュベーションの後、変性された。放射性ラベルされたプローブを、適切なフィルターに添加した。ｐａｒＢグローブを用いる実験においては、ハイブリダイゼーション中のフラグメントの濃度は３ｎｇ／ｆｎｌであシ、ところがｒｅｌＢ−ｏｒｆ３プローブは１．３ｎ　ｇ／ｍｌの濃度で使用され、これらの２つの場合、等モル濃度の相補的配列が得られた。

ハイブリダイゼーションは、静かに振盪しながら１９時間、３７℃で行なわれた。

ハイブリダイズされたフィルターを、０．４×洗浄緩衝液によシ室温で２０分間、１度洗浄し、そして最後に、４×洗浄緩衝液によシロ０℃で３０分間、２度洗浄した。その洗浄緩衝液は、０．６ＭのＮａＣ２，０，１％　ＳＤＳ、０．１％ビロリン酸ナトリウム、５０　ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ６，５）ｔ−含んだ。オートラジオグラフ法がＸ線フィルムを用い、そしてスクリーンを増強することで行なわれた。照射時間は、図面の説明のセクションに示されている。

“フィルターハイブリダイゼーション分析”は、次の操作の順序を示す例に使用される：　ＤＮＡフラグメントのアガロースゲル電気泳動、ニトロセルロースフィルターへのフラグメントのトランスファー、適切な放射性ラベルされたグローブとのハイブリダイゼーシ、ン、フィルター洗浄、及び洗浄に続くフィルターのオートラジオグラフ法。これらの例に示されるデータは、フィルターハイブリダイゼーション分析によって得られたオートラジオダラムを表わすＯ用語“相同性”は与えられたグローブと分析される核酸種との間の相補性の程度の存在を示すために本明細書中に使用される。

相同性の程度は、与えられたプローブと分析される核酸種との間に形成される二重核酸分子中における相補的な塩基の部分とに表わされる。

検出できる相同性の最少度は、ハイブリダイゼーション中に使用される実験条件及びグローブと分析される核酸種との特徴の関数である。

グローブＤｔ’ＪＡとフィルターに結合されたＤＮＡ種との間の相同性の程度は、同じ条件下で１００％相同の、フィルターに結合された配列に観察されたシグナル強度に対する実際のハイブリダイゼーションシグナルの強度から推定された。

ハイブリダイゼーションシグナルの強度は、主に、ハイブリダイゼーションの速度及び特異的にハイブリダイズするバンドに存在する、フィルターに結合されたＤＮＡ分子の数に依存する。ノ・イブリダイゼ−ジョンの速度は主に、ハイブリダイゼーションの間の相補的配列の濃度、イオン条件、温度及びプローブＤＮＡとフィルターに結合された分子との間の相同程度によって決定される。ハイブリダイゼーションの速度は、二重ＤＮＡの熱安定性を低下せしめる非相補的配列（Ｂｏｎｎｅｔ　、　Ｔ、！、など−ｒ　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　８１　ｐｌ　９７３．１２３ページ）の存在により遅められ；グローブとフィルターに結合されたＤＮＡとの１％ミスマツチは、熱安定性において１度の減少をもたらす（Ｍａｎｉａｔｉｓなど、ｙ１９８２＋ｏｐ、ｃｉｔ、＋３８８ページ）。従って、ハイブリダイゼーション条件は、ミスマツチのレベルが検出できるシグナルをなお生産するであろうことを決定する。本発明に使用される条件は、フィルターに結合されｆｃＤＮＡとグローブとの飽和を誘導しなかつたことが注目されるべきである。

ハイブリダイゼーション及びフィルターのための本発明の条件は、同じイオン環境下で対合された二重ＤＮＡの平均溶融温度以下の４０℃である温度に、ＤＮＡ二重体をさらすことであシ、すなわちその条件は、高度の非対合性塩基を含む二重体の検出を可能にする。この計算に使用される公式は、Ｂｅ１ｔｚ　＊Ｇ、Ａ、など、　、Ｍｅｔｈ、Ｅｎｚｙｎｏｌ、１００　＋　１９８３　ｔ２６６〜２８５ページに論議されている。

使用される条件は、１００％〜８０％の相同性有する二重体から得られた最大のハイツリダイゼーシヲンシグナルの１００％ｔ−検出し、ところが６０％相同性の二重体からのシグナルは、上記最大の強度（上記を参照のこと）の５０Ｊであることが推定される。６０％よシも低い相同性を有する二重体は、さらに弱いシグナル金生成するであろう。

多くのミスマツチを有する二重体に関しては、オートラジオダラムの照射時間が延長され又はフィルターに結合された相補的分子のコピー数が増加され得る場合、シグナルは検出できるであろう。

例ＩＰａｒＢ　領域の欠失マツピング（第１図参照）ｐＰＲ９５の構成（第２図）ｐ　ＰＨ１５の構成は次のように行なわれた。グラスミドｐＯＵ９３　（Ｇａｒｄｅｓら、Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ　−１６１ｙ　１９８５　＊ｐＰ２９２−９８）はプラスミドＲ１（第１図）のＥｃｏＲＩ　−Ａフラグメントから導かれたｐａｒＢ　ｐｇｔｌフラグメン）ｔ−含むｐＢＲ３２２誘導体である。そのｐｓｔＩフラグメントは第１図に示すように制限酵素Ｒａａ　Ｉによシ便利に小さな数フラグメントに分けられる。通常のクローニング法によシその最も大きいＲ＠ａｌフラグメン）（８８０ｂｐ）はｐＢＲ３２２由来のクローニングベクターｐＨＰ　３４　（ＰｒｅｎｔｋｉらＧｅｎｅ１７．１９８２．ｐｐ１８９−９６）のＳｍａ　１部位に挿入しｐＰＲ１３とした。ｐＨＰ　３４のＳｍａＩ部位は２つのＥｃｏＲＩ部位の両端に代えられ、それによって挿入された８８０塩基対（ｂｐ　）のＲｓａｌフラグメントは９００塩基対のＥｃｏＲＩフラグメントに変換された。そのようにして作られたｐＰＲ１３の９００塩基対のＥｃｏＲＩフラグメントはｍ１ｎｉＲ１由来のＰＯＵ　８２　（国際特許出願筒ＰＣＴ／１）Ｋ　８３　／　０００８６号、同公開第ＷＯ３４１０１１７２号）のＥｃ　ｏＲ１部位にクローニングされｐＰＲ９５を得た。ｐＰＲ９５を第２図に示した。グラスミドｐＯＵ　８２は分配機能を欠いているために不安定に植え継がれている（国際特許出願筒ＰＣＴ／Ｉ）　Ｋ　８３１００８６号同公開第ＷＯ３４１０１１７２号）。そして１世代１細胞につき１０−２の頻度で脱落する。

他方ｐＰＲ９５は非常にまれに脱落し１世代１細胞当シ１０−４をこえない頻度で脱落する特徴を有する（国際特許出願筒ＰＣＴ／Ｄ　Ｋ　８３１００８６号、同公開第ＷＯ３４１０１１７２号中に述べられたように測定された）。

それはｐａｒＢ＋ｍｊｎｉ　Ｒ１誘導体の特徴的々脱落頻度である。このようにして完全なｐａｒ　Ｂ領域はｍ１ｎｉＲ１レゾリコンを安定化させるフラグメントの能力によって判断されるように８８０塩基対のＲ８ａｌフラグメント上に位置する。

ｐａｒ　Ｂ領域の詳細な制限酵素マツピングは次のように行なわれた。ｐＰＲ９５はＢａｍＨＩによりて切断され、エキソヌクレアーゼＢａｌ　３１によって処理され、次いで結合された。その結合の前にＢａｍＨＩオリゴヌクレオチドリンカーが付加された。この処理によってｐａｒ　Ｂ領域の左側を含む一連の欠失誘導体が得られる。その欠失の大きさはそのＤＮＡ　’ｉ制限酵素）ｉ：ｃｏＲＩとＢａｍＷｌで処理した後、アガロースゲル上でＤＮＡフラグメントの大きさを分画することによシ決定された。次１７ＣＢａｍＨＩオリゴヌクレオチドリンカーの正確な挿入部はＭａｘａｍとＧ１１ｂｅｒｔによって述べられたヌクレオチド配列決定法によって決められた（Ｍｅｔｈ。

Ｅｎｚｙｍｏｌ、６５．１９８０．　ｐｐ４９９−５６６）。このような方法でその領域の非常に詳細な地図が得られた。さらに各々のシラスミド誘導体に対するｐａｒＢ表現型（材料と方法の項に述べられたようにして決められた）は解析された。ｐＰＲ９５の−３２０から００間の配列の欠失（第１図参照）によって得たｐＰＲ３１１はｐａｒ　Ｂ＋の表現型を変化させなかった。

よってｐＰＲ３１１の中の残る５８０塩基対のＢａｍＨｉ−ＥｃｏＲｌ　フラグメントは完全なｐａｒ　Ｂ領域を含んでいるにちがいない。その領域の中をさらに左から欠失させると完全に安定化活性を消失する。

ｐＰＲ３１１の５８０塩基対のｐａｒ　Ｂフラグメントの右の部分の欠失（第１図参照）はｐａｒＢ＋表現型の消失となる。そのようにｐａｒ　Ｂ領域はこのフラグメント端に近い位置に存在する。

例２ｐａｒ　Ｂ領域のヌクレオチド配列（第３図参照）第３図に示されたミニマルｐａｒＢのヌクレオチド配列はＭａｘａｍ及びＧ１１ｂｅｒｔによシ述ぺられた化学分解法（Ｍｅｔｈ、　Ｅｎｚｙｍｏｌ、６５　、１９８０　、　ｐｐ４９９〜５６６　）を用いて決められた。次のようにｐａｒＢ領域の塩基配列内の必須の生物学的情報は詳細に記載される。

実施例１で定義されたように５８０塩基対のミニマルｐａｒＢ領域の塩基配列（第１図参照）は第３図に描かれる。その領域の中央と左側部分は２回対称性に富んでいる。その５８０塩基対は５０コドン以上からなる３つのオープンリーディングフレームから成る。これらのリーディングフレームの開始及び終止のコドンは第３図に示される。その＋３’０４位から始ま！＋＋４６０で終わるリーディングフレームの前にはイー、コリのリポソーム結合部位（５ｈｉｎｅ及びＤａｌｇａｒｎｏ　＋　Ｎａｔｕｒｅ　（ｏンドン）２５４，１９７５゜ｐｐ３４−３８）に似たＤＮＡ配列（５’−ＡＧＧＡ−３’）が存在する。その部位はｍＲＮＡの翻訳を開始するリポソームに対する認識部位として作用することが知られている。このリーディングフレームのポリペプチド産物は第３図のＤＮＡ配列の下に示される。

例３ｐａｒ　Ｂ領域から発現される機能（第４図及び第５図参照）一連のプラスミドが構築され、それからｐａｒ　Ｂ領域内の推定遺伝子（配列から示されるような）の条λ 作付の発現は　ｐＢ７’ロモーター及びλｅＩ　８５７遺伝子をもったフラグメントの挿入によって得られる。

これらの挿入部は第１図に示される。λ、Ｒ温度誘発グロモーター系が選ばれた理由は、２ｐＲプロモーターの調節遺伝子（ｃＩ８５７遺伝子）と２ｐＲは共に単一のＢｇｌＩＩ−８ａｉｌフラグメント上に位置しているためである。さらに λリグレッサー遺伝子のｃ１８５７対立遺伝子は高温（４２℃）で挿入ブロモ− ターを誘発出来るようにする。しかし低温（３０℃）で静止又は静止に近い状態にする。ｐＯＵ　８２のＢｇｌＩＩ−８ａｌｌフラグメントがグラスミドｐＰＲ６３４とｐＰＲ３４１に常法のクローニング法によシ挿入され、それぞれプラスミドｐＫＧ　６３４及びｐＫＧ　３４１を得た（材料と方法の項参照）。

ｐＫＧ　６３４とｐＫＧ　３４１をもつ細胞は３０℃で正常に増殖する。しかしながら４２℃でλｐＲの誘発は宿主細胞の急速な死を招く。

第４図は、致死速度（生存細胞数測定）とＪＣ４４１（ｐＫＧ　６３４　）株の４２℃へ温度上昇後の０Ｄ４５ｏで測定される増殖曲線とを示す。生存細胞数は急速に減少しく半減期２．５分）　ｏＤ４５０の増加は止まる。反対方向（ｐＫＧ　１７１　）にｐａｒ　Ｂ領域を転写するλｐＲプロモーターの存在は細胞増殖と生存性に影響を与え々い（第４図、コントロール）。

λｐＲプロモーターの熱誘発後の細胞（ＪＣ４１１／ｐＫＧ　６３４　）の顕微鏡検索（位相差）は細胞の変形した形態を示した。はとんどの物質は帯状に明らかに凝集しておシ、細胞の残シの部分は透明のままである。この実例は第５図に示される。その図には正常と変化した細胞を示した。特徴的なｐａｒ　Ｂ誘発現象をもった細胞は次のようにゴースト細胞と名づけλｐＲプロモーターフラグメントは５２アミノ酸のオープンリーディングフレームの開始点のすぐ上流に挿入されたので（例２参照）、＋３０４位に開始されるオープンリーディングフレームによってコードされる５２アミノ酸のポリペプチドは細胞を死に散らせることを強く示唆する。したがってこの遺伝子は次のようにｈｏｋ　（宿主致死）と呼ばれる。

例４ｈｏｋによって発現される宿主致死効果の抑圧（第６図参照）ひじように毒性のある生産物が発現される遺伝子は明らかに調節されているにちがいない。それ故ｈｏｋの調節因子も又ｐａｒ　Ｂ領域によってコードされたと仮定された。この調節ループの性質を調べる最初の試みとしてｈｏｋ遺伝子の上流にλｃ１８５７ｅ含むｐＫＧ　６３４のフラグメントがミニＦ７’ラスミドに挿入されｐＦ６３４ｔ−作製した。第６図はＪＣ４１１（ｐＦ６３４）の致死の誘発を表わす。その図は、ｐＢＲ３２２に比してＦは低コピー数であるのでｐＫＧ６３４の場合よシ致死は幾分ゆりく如し、効果的でないことを示す。

第２のｐａｒＢ　プラスミド（ｐＰＲ６３３）は次にＪＣ４１１（ｐＦ６３４　）株に導入され、この２重のプラスミド株によって誘発実験がくシ返された。第６図に示されるようにトランスに存在するｐａｒ　Ｂ領域はｈｏｋ遺伝子の転写活性を充分抑圧する。よってそのｐａｒ　Ｂ領域は宿主致死の抑制因子（ａｏｋ遺伝子）をコードする。この実験企画を１つの検出法として用いながら、ａｏｋ遺伝子の地図は次のような方法で作製された。ｐＦ　６３４を含む二重プラスミド株と欠失誘導体のひとつのｐＰＲ６３４、ｐＰＲ３４１、ｐＰＲ１５４又はｐＰＲ１７１がそれぞれ作製された。そして４２℃におけるこれらの株の増殖様式を追跡することによシ、その欠失誘導体のｓｏｋ表現型は温度上昇後の増殖を測定することによシ決定された。これらの欠失誘導体の解析によって、プラスミドｐＰＲ６３４とｐＰＲ１５４はｓｏｋ活性を発現していることが分かった。それに対しプラスミドｐＰＲ３４１とｐＰＲ１７１はｓｏｋ活性を検出出来る程度には発現していない。

そのプラスミドは又ｐａｒＢ　に対して特徴的な不和合性表現型について試験されｆｃ（国際特許出願第ＰＣＴ／ＤＫ８３１０００８６号、同公開第ＷＯ３４１０１１７２号参照）。そしてｓｏｋ活性を発現するプラスミドは又ｐａｒ　Ｂ特異的な不和合性を示すことが見出された。

一方、上述のようにｓｏｋ″″であるプラスミドは不和合性を示さない。よってｐａｒ　Ｂ不和合性反応はａｏｋ活性の検出法を表わす。

ｈｏｋ遺伝子に対して述べられたと同様にｓｏｋ遺伝子活性に必要な領域はさらに縮められた。マツピングに用いられた５ｏｋ−の誘導体のひとつｐＰＲ１７１は−３００から＋２８８までに及ぶｐａｒ　Ｂ領域を含む（第１図及び第３図）。λｃＩ　８５７とλｐＲを含む制限酵素フラグメントは、ｐＰＲ１７１に、λ ｐＲプロモーターがそのグラスミドのｓｏｋ領域の中を読むように挿入されｐＫＧ　１７１　’に作製し７’ｃ（材料と方法の項参照）。

プラスミドｐＫＧ　１７１はｐＯＵ　９４を含むＣ３ｌ（５０株に導入された。

プラスミドｐＯＵ　９４はグラスミド上にｐａｒＢ領域を有するために完全に安定に植え継がれるｌａｃ＋ｐａｒＢ＋ｐ　１５誘導体である。その株の中に他のｐａｒＢ＋プラスミドの導入はｐａｒ　Ｂから発現される不和合性のためにｐＯＵ　９４の不安定化を招く・３０℃においてｐＧＫ　１７１の存在は、それほどｐＯＵ９４の不安定化を起さないが４２℃では明らかに不安定性が検出された。

それ故ｐＫＧ　１７１のｐａｒ　Ｂ領域内の右から左への転写は１ｎｃＢ領域（すなわちｓｏｋ遺伝子）の活性化を起こす。

ここで述べられた結果はｓｏｋ遺伝子の領域をさらに狭め、＋１９４（ｐＰＲ６３４）と＋２８８　（ｐＰＲ１７１）の間に位置しているに違いない。又ｓｏｋ遺伝子プロモーターは右から左へ（ｈｏｋ遺伝子転写とは逆に）読み、少くとも部分的に＋２８８　（ｐＰＲ１７１）と＋３３６　（ｐＰＲ１５４）の間の領域に位置づけられる。推定の一１０配列（ＴＡＴＣＣＴ　）は＋２６２位に位置し一３５配列（ＴＴＧＣＧＣ）は＋２８５位に位置する（第３図）　（ＨａｗｌｅｙとＭｃＣｌｕｒｅ　ｐＮｕｃｌｅｉｅ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、１１　ｐ　１９８３　＊　ｐｐ２２３７−２２５５）、これらの配列はｓｏｋ遺伝子のプロモーターを構成すると仮定される。

例５イー、コリ染色体上のＲ１ｐａｒ　Ｂ相同体の発見（第８ａ図参照）プラスミド進化は、バクテリア染色体と自由に複製するＤＮＡ分子との間の遺伝情報の広はんな交換を伴なうので、イー・コリ染色体ＤＮＡはＲ１ｐａｒＢ配列に可能な祖先の配列に関して解析された。

図８ａの６列目にプラスミドをもたないイー、コリＪＣ４１１からの全Ｅｃ　ｏＲＩ開裂ＤＮＡがｐａｒＢ７’Ｏ−プに対するフィルターハイブリダイゼーションによって解析された（材料と方法の項参照）。２０キロ塩基（ｋｂ　）のフラグメントはむしろ弱いが明確なシグナルが見られる。このシグナルは同時間露出した場合イ、コ！Ｊ　ＤＮＡ　’ｔ”含む他の列（４列、５列）にも又検出出来る。染色体配列は、ｐａｒＨにおよそ５５チの相同性があると見られる。その染色体配列は次のようにｐａｒ　１　と名づけられる。

重要な問題はもちろん、塩基配列のレベルでの相同性の知見が、その相同の領域によってコードされる産物の機能の類似性に、どの程度反映するのかということである。１つの見方が実施例７でさらに扱われる。

例６ＲｌｐａｒＢ　のイ・コリ染色体相同体の遺伝的構成及びＲ１ｐａｒ　Ｂ　に対するその機能的関係（第７図参照）実施例３で定義されたプラスミドＲ１のｈｏｋ遺伝子は５２アミノ酸のポリペプチドをコードする。そのｈｏｋ遺伝子産物のアミノ酸配列を多数の既知の蛋白配列と比較した。驚くことにイー・コリｒｅｌ　Ｂオペロン（ＢｅｃｈらＴｈｅ　ＥＭＢＯＪｏｕｒｎａｌ　４　ｐ　１９８５　ｙ　ｐｐ１０５９−１０６６　）のｒａｌＢ−ｏｒｆ　３遺伝子によりてコードされる５１アミノ酸のポリペプチドはｈｏｋ産物に顕著な相同性を示した。２つの相同な蛋白のアミノ酸配列は第７図に表わされる。第７図は、そのアミノ酸の４２％（２２個）が前記２つの蛋白において同一であることを示す。アミノ酸の１７％（９個）に関しては、１つのアミノ酸が同じ化学的性状（すなわち、疎水性、荷電等）のアミノ酸によって置換されていることによシ、その変化が保存されておシ、したがって全体の相同性は６１％になる。特に荷電アミノ酸は１６位と３１位のシスティン残基のようによく保存されている（第７図）。

ｈｏｋ遺伝子及びｒｅｌ　Ｂ　−ｏｒｆ　３のＤＮＡ配列も又第７図に示されるように比較された。次のように用いられた塩基配列位置番号は第３図で示されたｐａｒＢ＋配列の通シである。＋２９０位から＋４６０まで、２つの配列の間に５５％の相同性がある。保存された領域は、＋３０４から＋４６０に位置する、蛋白をコードする配列の上流及び下流の塩基を含むと第７図から思われる。そのコード領域の外側の塩基の保存性は２つの遺伝子の調節様式もまた少くとも部分的に保存されていることを示す。

その配列相同性が機能に類似性を反映していることを示すために、ｒｅｌ　Ｂ　 −ｏｒｆ　３遺伝子の上流λｐＲプロモーターフラグメントをもったグラスミドが構築された（構築の同様な様式の記載は実施例３のｈｏｋ遺伝子のマツピングで行なった）。

ｒｅｌ　Ｂ　−ｏｒｆ　３の中にλｐＲが仲介する転写が誘発されたとき、急速な細胞死が実施例３に述べられたプラスミドｐＫＧ　３４１　ｅ含むバクテリアに対し観察されたと同様の速度で見られる。同時に培養液中のすべての細胞はｈｏｋ性をもった６ゴースト”細胞に形質転換される（第５図参照）。

よってプラスミドＲ１のｈｏｋ遺伝子とイ・コリｒｅｌＢオペロンのｒｅｌ　Ｂ　−ｏｒｆ　３との間に構造及び機能上に顕著な相同性がある。

例７種々のシラスミド上のｐａｒＢ相同配列（第８ａ図参照）種々のプラスミドをもったイ・コリの多数の株かうＥｃｏＲＩ　開裂全ＤＮＡのフィルターハイブリダイゼーション解析はｐａｒ　Ｂグローブを用いて行なわれた（第８ａ図における１〜５列）。

プラスミドＲ１ｄｒａ１９は、ｐａｒＢグローブが初めからクローニングされたＲ１ｆラスミド群の１員である。Ｒ１ｄｒａ１９は細菌ゲノムにつき２コピー存在する。イ・コリ１００５／Ｒ１−ｄｒａ　１９からのＥｃｏＲＩ切断全ＤＮＡは第１列に解析されている。１９．５キロ塩基の強くハイブリダイズするフラグメントがみられる。その大きさは１９．５キロ塩基Ｒ１プラスミドのｐａｒ　Ｂ機能の遺伝子地図と一致する（国際特許出願筒ＰＣＴ／ＤＫ８３１０００８６号、同公開第ＷＯ８４１０１１７２号）。

プラスミドＲ１００はＲ１の１９．５キロ塩基のＥｃｏＲＩ−Ａフラグメントに等しい領域内に転移因子ＴｎｌＯｅもつＲ１に近い関係にある。そのトランスポゾンはＥｃ　ｏＲｌの認識配列を含む、そして結果としてさらにＥｃｏＲ１部位がＲ１様ＥｃｏＲＩ　Ａフラグメントの中に導入され、これｔ−Ｒ１００の２つのＥｃｏＲＩ　Ａ及びＥｃｏＲｌ−Ｄフラグメントに分割する（　ＭｉｋｉらＪ。

Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１４４　、１９８０ｐｐ８７〜８９　）。Ｒ１００のこれらの２つのＥｃ　ｏＲＩフラグメントはへテロデュプレックスマツピングによってＦ因子に存在する配列に相同することが見出された（　５ｈａｒｐらＪ、Ｍｏｌ。

Ｂｉｏ１７５．１９７３．ｐ２３５）。１２．８キロ塩基の強くハイブリダイズするフラグメントが第８ａ図２列に見られる。それによってＲ１とＲ１００、及びＦとの間の相同性領域の中心となるＲ１００のｐａｒ　Ｂ領域からＲ１００のＥｃｏＲＩ　−Ｄフラグメントまで地図化される。

Ｒ１００のＦ相同性領域内のｐａｒ　Ｈの位置づけは、不和合性群ＩｎｃＦＩに属するプラスミド上のｐａｒＢ　様配列についての検索をうながした。

ＩｎｃＦＩグラスミドＲ３８６ｔ−もったイ・コリ株Ｂ２１０／Ｒ３８６からのＥｃｏＲＩ開裂全ＤＮＡは、ｐａｒ　Ｂグローブを用いたフィルターハイブリダイゼーション法によって解析された（第８ａ図、３列）。

Ｆと同じ不和合性群に属するシラスミドＲ３８６は１９．５キロ塩基のＥｃｏＲＩフラグメントに対応するｐａｒ　Ｂハイブリダイゼーションシグナルを与えることが見出された。このプラスミドはゲノム当たシ０．５〜１コピー存在するので、Ｒ１００シグナルの約３分の１のシグナルが見られるということは（第８ａ図、２列）、ＲｌｐａｒＢとＲ３８６ｐａｒＢ様配列との間の相同性の程度は５５〜６０％であることを示唆している。

ｐａｒ　Ｂ関連配列検索は他の不和合性群へ広げられた。不和合性群ＩｎｃＰに属するプラスミドＲＰＩが解析された。

ｐａｒ　Ｂグローブによって１００５　（ＲＰＩ）からの全ＥｃｏＲＩ開裂フラグメントはＥｃｏＲＩで直線化されたプラスミドに対応するハイブリダイゼーションシグナルを与える（第８ａ図、４列）。その他にｐａｒ　１に対応する２０キロ塩基のハイプリダイゼーシ、ンパンドが見られる。それは実施例５で論述された。

ＲＰＩはグラム陰性バクテリア宿主の広い範囲に安定に維持されているので、ＲＰＩ上のｐａｒ　Ｂ関連配列の発見はイー・コリ及びプソイドモナス・プチダ（例１１）に働いているＲｌｐａｒＢ系に似たグラスミド維持系が多数の細菌宿主に機能している可能性を示す。

さらに他のシラスミドＲ６−Ｋ（ＩｎｃＫ不和合性群）は、ｐａｒＢグローブにハイブリダイズするＲ６にの２５キロ塩基のＥｅｏＲ１フラグメントが存在することによって証拠づけられるように、およそＲＰＩと同じハイツリダイゼーション性をもった配列を有することが見出された（第８ａ図、５列）。

Ｒ１ｐａｒＢハイブリダイズ配列の存在はＲｌｐａｒＢに関連する安定化機構の存在を反映しているかどうかを決めるために低コピー数プラスミドＦはいくらか詳細に解析された。

２つのプラスミドの安定化機能はＦのゲノム内に同定されそしてそれに対応する遺伝子（５ＯＰ（ＯｇｕｒａとＨｊｒａｇａ、Ｃｅ１１３２，１９８３．ｐｐ３５１〜３６０）とｃｃｄ　（ＯｇｕｒａとＨｉｒａｇａ　ｒ　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｅｔ、　ＵＳＡ８０．１９８０．ｐｐ４７８４〜４７８８）　：ｌは４０．３から４９．５の地図位にわたるＥｃ　ｏＲＩフラグメントに位置づけられた。

Ｆｔもつイ・コリ１００５からの全ＤＮＡのフィルターハイツリダイゼーション解析は、Ｒ１ｐａｒＢ関連配列はＦの１０．７キロ塩基のＥｃｏＲＩフラグメント（４９，５〜６０．２位にマッシされる）上に存在することがわかった。ＥｅｏＲ［及び／又はＢａｍＨＩによって消化された１　００５　（Ｆ）　ＤＮＡのハイブリダイゼーション解析によって、５５．７〜６０．２位にわたる４．５キロ塩基のＢａｍＨｉ　−ＥｃｏＲ１フラグメントにこれらの配列をマツプすることが出来る。このことはＦ内に第３のグラスミド安定化機能が存在することを示す。

Ｒ１ｐａｒＢプローブをハイブリダイズするＦの領域は次にバクテリオファージスベクター内にクローニングされた。１００５　（Ｆ）からのＥｃｏＲＩ消化ＤＮＡは分取アガロースゲル電気泳動法によってサイズ分画され、９．５から１２キロ塩基のフラグメントは電気泳動溶出によシグルから回収された。そのフラグメントはλＬ１４７の左右のアームのＥｃｏＲ１部位に結合され、そして試験管内パッケイジングによシ感染ファージを作った（　ＭａｎｉａｔｉｓらＭｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ＋Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　＋　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　、１９８２　ｒ　ｐ２５６参照）。それは次にイ・コリＬＥ３９２　ｔ−感染させるのに用いられた。Ｒ１ｐａｒＢ関連の配列を有する組換え体ファージをブランクハイブリダイゼーション法で同定した。

Ｒ１ｐａｒＢ関連配列を含む１０．７キロ塩基のＥｃｏＲＩフラグメントをもった組換えファージかラソのフラグメントは単離され、ｐＵＣ８のＥｅｏＲ１部位に挿入された。１つの得られたプラスミドｐＮＬ　１において、その挿入遺伝子は、ｐＮＬ　Ｉ　ＤＮＡ　ｆ）　ＢａｍＨＩ　による切断がＲ１ｐａｒ　Ｂハイブリダイズ配列をもった４、５キロ塩基のフラグメントを切断するように配置された。

ｐＮＬＩからの４．５キロ塩基のＢ　ａｍＨＩフラグメントは単離されＲ１ｐａｒＢグローブをノ・イブリダイズする領域はフィルターノ・イブリダイゼーション解析によって８７０塩基対のＲａａｌフラグメントにマツプされた。

その８７０塩基対のＲｓａＩフラグメントは単離されＭ１３ｍｐ９のＳｍａ１部位に挿入された。８７０塩基対の挿入遺°伝子上にＲ１ｐａｒＢ関連配列をもった多数の組換え体ファージはブラックノ・イブリダイゼーション法によって同定された。挿入ＤＮＡのヌクレオチド配列はＳａｎｇｅｒらの方法Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ　、　ＵＳＡ？　４　、ｐｐ５４６３−５４６７によシ解析された。

組換え体ファージｍｐＮＬ１２の１つの一部のヌクレオチド配列はＲｓａＩ部位から広がる４０２塩基対からなシ、この配列はＲ１ｐａｒＢ配列（第３図）の＋１７８〜＋５８０の領域に９０％相同する。またすべてのＲ１ｐａｒＢ領域の必須の性質は、Ｆ誘導配列の中に見出サレる。（１）５０アミノ酸の蛋白をコードするオープンリーディングフレームはＲ１ｈｏｋ遺伝子に対応して存在する、（２）Ｒｌｈｏｋのリポソーム結合部位は保存されている、（３）　ｈｏｋｍＲＮＡ安定化に必須であると信じられているＲ１　ｐ　ａ　ｒ　ＢｍＲＮＡの３′非翻訳部に対応する領域は高度に保存されている（９０チ相同性）、および（４）　Ｒ１−ｉｏｋの推定の−１０及び−３５領域も又保存されている。

Ｆ由来の配列内のオープンリーディングフレーム（オープン読取υ枠）は、Ｒ１％異的ｈｏｋ蛋白とはわずかにのみ異なる５０アミノ酸の蛋白の遺伝情報を指定する。第１に、Ｒｌｈｏｋ内の２つのコドンすなわちバリン１５セリン２９が欠失された。第２に、２つの保存的な置換が生じ、すなわちロイシン１６がバリンに、ヒスチジン３９がチロシンに置き換えられている。

明らかに、Ｆ上の、Ｒ１ｈ　ｏｋ遺伝子及びその関連配列は共通の祖先の配列から派生し、そしてさらにＲｌｈｏｋに対応するコード領域の保存性はコードされた蛋白がＦの安定化に関係するということを強く示唆する。

Ｆ由来配列のグラスミド安定化性能を試験するために、Ｆｈｏｋ様配列全配列たｐＮＬ　１からの４．５キロ塩基のＢａｍＨｌフラグメントが１世代につき１０　の頻度で脱落する低コピー数グラスミドであるｐ　ＪＥＬ８２に導入された（国際特許願第ＰＣＴ／ＤＫ８３１０００８４号、同公開第１ＷＯ８４１０１１７１号）。得られたプラスミドｐＪＥＬ　８２／ＦはｐＪＥＬ８２と同様、イ・コリＨＢＩＯＩに形質転換された。２つの株は選択圧なしに１６時間の間培養増殖された。そしてプラスミド含有細胞（アンピシリン耐性、　ＡｐＲ）の画分が測定された。結果は次の通シであった。

プラスミド　アンピシリン耐性細胞のチｐＪＥＬ　８２　３６．５ｐＪＥＬ８２／Ｆ　９８．４それ故Ｒ１ｐａｒ　Ｂ関連配列をもった４、５キロ塩基のＢａｍＨＩフラグメントがプラスミド安定化効果を及ぼすことが結論された。もしその安定化がＦフラグメント内のｈｏｋ様遺伝子の存在によるならば、ゴースト細胞の出現が、選択圧なしにｐＪＥＬ８２／Ｆ’にもった細胞を培養増殖させた場合に予想される（例３参照）。

ｐＪＥＬ８２／Ｆ　を含む細胞の一夜培養液中にはＲ１ｈ　ｏｋ誘発ゴースト細胞とは区別できないゴースト細胞を約５％含むことが見出された。

フィルターハイブリダイゼーション法によるＲ１ｐａｒＢ関連配列の証明は、Ｆの場合にも、機能的に同様のプラスミド安定化機構が存在することを示している。

例８ｐａｒ１３関連配列に相同するレプリコン安定化配列の検出のための方法としての段階的ハイブリダイゼーション法（第８ｂ図参照）ハイブリダイゼーションの条件は検出できるシグナルを生ずるのに必要なプローブとフィルター結合ＤＮＡ様の間の相同性の程度を決定する（材料と方法の項における論述参照）。したがって与えられた一連のハイブリダイゼーション条件下で与えられたグローブによって検出できないでいて、しかしそれにもかかわらずｈｏｋ様活性をコードしているフィルター結合配列が存在するかも知れない。材料と方法の中の相同性と機能に関する論述参照。これは次の実験によって例証される。

例６に述べられたように、ｒｅｌＢ−ｏｒｆ３は、ｈｏｋとｒｅｌＢｏｒｆ　３の配列比較データと機能類似性にもとづいてＲｌｐａｒＢの染色体相同性を表わす。プラスミドｐＢＤ２７２４に存在するようなｒｅｌＢ−ｏｒｆ　３及びフランキング配列は、イ・コリ染色体ＤＮＡのフィルターハイブリダイゼーション解析におけるプローブとして用いられた。

シラスミドｐＢＤ２７２４は、ｒｅｌＢ−ｏｒｆ　３コ一ド配列（Ｂｅｃｈらによって１０７０−１３５０と位置づけられた前記文献）を含むイ・コリのｒｅｌＢオペロンからのＨｉｎｃｌ［−Ｍｌｕ　！フラグメントを含むｐＢＲ３２２誘導体である。第８ｂ図３列に、プラスミドを持たないイ・コリからのＥｃｏＲＩ開裂全ＤＮＡが、ｒｅｌＢ−ｏｒｆ３７Ｄ。

−プ１１いたフィルターハイブリダイゼーション法によって解析される・さきに同定されたｐａｒ　１配列（例６）に表わされそうな２０キロ塩基のハイブリダイゼーションフラグメントの他にさらに別の１６キロ塩基のフラグメントが検出される。後者の強度は２０キロ塩基のシグナルの強度よシ大きいので、１６キロ塩基のＥｃｏＲＩフラグメントはハイブリダイゼーシヨンプローブとして用いられたイ・コリｒｅｌ　Ｂ　−ｏｒｆ　３遺伝子をおおっているにちがいない。

すなわち１６キロ塩基のシグナルの強度から相同性の程度を見積ることができる。ｒｅｌ　Ｂ　−ｏｒｆ　３シグナルの約３分の４であるｐａｒｌハイツリダイゼーションのシグナル強度は、ｐａｒ　１がｒｅｌ　Ｂ　−ｏｒｆ　３に約６５〜７０％の相同性のあることを示唆する。１６キロ塩基のｒｅｌ　Ｂ−０ｒｆ３をもったフラグメントはｐａｒＢプローブで検出されない（第８ａ図、６列）ので、ＲｌｐａｒＢはｒｅｌ　Ｂ　−ｏｒｆ　３に対し５０％又はそれ以下の相同性がある。

例５において、ｐａｒ　Ｂプローブは、２０キロ塩基染色体相同体を検出するが前記データに従ってｒｅｌ　Ｂ　−ｏｒｆ　３を表わす１６キロ塩基の相同性を検出しないことがわかった。実施例６に述べられたように後者は発現された時ｈｏｋ様活性を与えるので、ｐａｒ　１　も又ｈｏｋ様活性かｓｏｋ様活性及び／もしくは正しく発現されたとき両者の活性を発現すると考えられる。

Ｒ１ｐａｒＢ様配列をも９たプラスミドＲ１００及びＲ３８６’ｉ含むイ・コリのフィルターハイブリダイゼーション解析において、グローブとしてｒｅｌＢ− ｏｒｆ　３フラグメントが用いられた（第８ａ図、１列及び２列）。現在のハイブリダイゼーション条件下では、ｒｅｌ　Ｂ　−ｏｒｆ　３プローブは、２０キロ塩基ｐａｒｌおよび１６キロ塩基ｒｅｌ　Ｂ　−ｏｒｆ　３をもったフラグメントだけがプローブとハイブリダイズすることが見られるので、これらの配列を検出しなかった（第８ｂ図、１列及び２列）。このことは、ｈｏｋ又はｈｏｋ様活性を発現する領域からのグローブと与えられたＤＮＡ種とのハイブリダイゼーションが存在しないことは、問題のＤＮＡ種が、正しく発現されればｈｏｋ様活性を与えることを除外しないことを示す。したがって問題のＤＮＡ種とｈｏｋ又はｈｏｋ様活性を発現する領域との間の相同性を見出したことは、問題のＤＮＡが正しく発現されればｈｏｋ又はｈｏｋ様活性を示すだろうことを強く示唆する。

それ故上のデータはｈ　ｏ　ｋ／ｓ　ｏ　ｋ様活性を与える領域を探索する有用な戦略であることを示す。ｈｏｋ又はｈｏｋ様遺伝子（例えばＲｌｐａｒＢ）から成る核酸の領域を表わすプローブは、問題のゲノム（例えば染色体ＤＮＡ又はプラスミドＤＮＡ　）内の相同配列（例えばｐａｒｌ　）を検出するのに用いられる。そのゲノムは次に正しい実験組立ての中でｈｏｋ又はｈｏｋ様活性に対し試験される（　ｒｅｌＢ−ｏｒｆ３領域に対してなされたように）。そしてもしそのような単一もしくは複数の活性がコードされることが示されるならば、次にそれ自身をグローブとして新規の相同配列を見つけるために第２回目のハイブリダイゼーションに用いられる。その新規の配列は第１回目のハイブリダイゼーションで用いられたプローブに対しては関係するかも知れないし関係しないかもしれない（例えばＲｌｐａｒＢ）。核酸ハイブリダイゼーションと単離された核酸配列の機能検定を結びつけるこの段階法は、イ・コリからどんどん分離されるゲノム中のｈｏｋ又はｈｏｋ様活性を発現する遺伝子の探索に一般的な戦術として採用されることができる。

例９細菌におけるｐａｒ　Ｂ関連配列の検出（第９および１０図参照）前記実施例において１　）Ｒ１−ｐａｒＢに関連する配列は、グラム陰性菌から単離された細菌プラスミドの中に広く分布する、および２）Ｒ１ｐａｒＢ関連配列はイ・コリの染色体ＤＮＡの中に存在することが証明された・これらの発見は、これらの生物に自然に存在する染色体ＤＮＡ又はプラスミドの部分として、Ｒ１ｐａｒ　Ｂ又は種々の細菌からのＤＮＡ中の染色体の片割れの１つ（イ・コリｒｅｌ　Ｂ　−ｏｒｆ　３　）に関連する配列の検索をうながした。

セラチア・マルセセンスからのＥｃｏＲＩ開裂ＤＮＡについてのＲ１ｐａｒＢゾロープを用いたフィルターハイプリダイゼーシ、ン解析は、４．１．２．９及び２，５キロ塩基の３つのフラグメントに強いハイブリダイゼーシ、ンを示す（第９図、２列）。４．１キロ塩基のフラグメントだけはｒｅｌＢ−ｏｒｆ３７’ローブにもハイブリッド形成する（第１０図、１列）。ｐａｒ　Ｂプローブはさらに６つのフラグメントとハイブリダイズする。これらのシグナルの２つは、イ・コリＤＮＡにおけるｒｅｌ　Ｂ　−ｏｒｆ　３をもった１６キロ塩基フラグメントから由来するｐａｒ　Ｂシグナルよシ強い（第９図。

６　列）。セラチア・マルセセンスＤＮＡのイ・コリｒｅｌ　Ｂ−ｏｒｆ　３グローブとのハイブリダイゼーションは多数の弱いハイツリダイゼーションシグナルを生じる＠アガロースゲル電気泳動ではどれも高コピー数プラスミドであることを示さなかったけれども、２．５．２．９及び４．１キロ塩基の強くハイブリダイズするバンドはプラスミド由来である可能性がある。

プソイドモナス・フルオレセンスはこの種のシラスミドをもたない一員として解析された。プソイドモナス・フルオレセンスからのＤＮＡのＲｌｐａｒＢとのハイブリダイゼーション（第９図、３列）は８〜１０個のハイブリダイズするフラグメン）ｔ−示す。

そのうち４つはＲｌｐａｒＢの染色体片割れの約３３％の強度のシグナルを表わす（第９図、６列）。また約１３キロ塩基のこれらのフラグメントの１つのシグナルはおそらくイ・コリｒｅｌ　Ｂ　−ｏｒｆ　３プローゾとハイブリダイズする（第１０図、２列）。さらにｒｅｌＢ−ｏｒｆ３のグローブは低いシグナル強度だけど５つのフラグメン）を明確に同定する。５．５及び５．６キロ塩基のこれらの２つは、このＤＮＡがｒｅｌＢ−ｏｒｆ　３プローブを用いて解析された時（第１０図。

３列）プソイドモナス・プチダからのＤＮＡ中にも見られる。そのｒｅｌ　Ｂ　 −ｏｒｆ　３グローブはノンイドモナス・プチダＤＮＡの中の他の５フラグメントにハイブリダイズするが、これらのフラグメントのどれもＲ１ｐａｒＢグローブによっては認識されない（第９図。

４列）。グツイドモナス・プチダＤＮＡにおいてｐａｒＢプローブは低いシグナル強度の約１０個のフラグメントと約７．３キロ塩基の１個の全く強くハイブリダイズするフラグメントとを検出する。

グラム陽性菌中でビイ・サブチリス、ビイ・シルクランス（Ｂ、　ｃｉｒｃｕｌａｎａ　）　ＰＬ２３６及びラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕａ　）の２株は、Ｒ１−ｐａｒＢ又はイー・コＩＪ　ｒｅｌ　Ｂ　−ｏｒｆ　３に関連する配列の存在に関して解析された。

ｐａｒＢプローブの場合に、５，２キロ塩基の１個の全く強くハイブリダイズするフラグメントは、ビイ・シルクランスからのＤＮＡの中に見出された（第９図。

８列）。ビイ・シルクランスＤＮＡのいくつかの他のフラグメントからひじょうに弱いシグナルが得られた。ｒａｔ　Ｂ　−ｏｒｆ　３プローブによって、限られた数のハイツリダイゼーションフラグメントがビイ・サブチリス（第１Ｏ図、４列）、ビイ・シルクランス（第１０図、５列）及びラクトバチルス（第１０図。

６と７列）からのＤＮＡの中にみとめられた。ｒｅｌＢ−ｏｒｆ３ハイブリダイズフラグメントの数は６から１１の範囲にあシ、すべてほとんど同じシグナル強度２有する。ラクトバチリス属の細菌においてアガロースゲル電気泳動は、少くともいくらかのハイブリダイズ配列がグラスミド由来である可能性を示唆するプラスミドの存在を証明した。ビイ・シルクランスＰＬ２３６においてグラスミドの探索は、Ｒ１−ｐａｒ　Ｂプローブとハイブリダイズするビイ・シルクランスＤＮＡ配列が（第９図、８列）染色体由来であるということについては否定的な示唆を与えた。

上記実験は、ＲｌｐａｒＢ及び又はイ・フリｒｅｌＢｏｒｆ　３に関連する配列が、細菌種の中に、そのグローブが導かれたエンテロ、バクテリウム属の細菌だけでなくダラム陽性菌にも広く分布していることを示す。

例１０真核細胞内におけるｐａｒ　Ｂ関連配列の検出（第１１図番照）単細胞真核生物すなわち繊毛のある原生動物テトラヒメナ・テルモフィラが研究された（第１１図）。

この生物は、１）細胞当シのミトコンドリアＤＮＡ分子数が多いこと、および２）リボソームＲＮＡ　遺伝子の約１２０００コピーが自己複製するりがソームＤＮＡ分子上に存在することを特徴とする。Ｒ１ｐａｒＢグローブもイ・コリｒｅｌ　Ｂ　−ｏｒｆ　３ゾロープも、単離された大根から作られたＤＮＡ中のいかなるフラグメントも検出しない（第１１図、１列）。またそれらグローブは、単離されたｒ　ＤＮＡの２つのＥｃｏＲｌにもハイブリダイズしない（第１１図、３列）。ミトコンドリアＤＮＡを含むテトラヒメナ・テルモフィラからのＥｃｏＲＩ切断全ＤＮＡは、ｒｅｌ　Ｂ　−ｏｒｆ　３プローブとハイブリダイズする、６．６及び３．３キロ塩基（第１１図。

２列）の２つのフラグメントを示す。一方ｐａｒＢプローブはいかなるシグナルも生じなかった。そのハイブリダイズするフラグメントはミトコンドリアＤＮＡの２つのフラグメントと共に移される。そのことはＤＮＡトランスファーの前にグルをエチジウムブロマイドで染色することによシたやすく検出される。

えんどう〔ピスム・サチブム（Ｐｉｓｕｍ　ｓａｔｉｖｕｍ　）　：］からの葉緑体ＤＮＡは制限酵素Ｐｓｔｌで開裂され、０．１２μｇがｐａｒ　Ｂ及びｒｅｌＢ−ｏｒｆ３７’ロープを用いるフィルターハイブリダイゼーション法によって解析された（第１１図、４列）。後者のプローブは約１６キロ塩基のフラグメントにハイブリダイズする。

最後にヒト細胞ＤＮＡの２検体が、ＥｃｏＲ４開裂後フィルターハイツリダイゼーション法によって解析された。Ｒ１ｐａｒＢプローブは、神経芽細胞ＤＮＡ　（第１１図、５列）及び胎児肝ＤＮＡ　（第１１図、６列）に弱いハイブリダイゼーションシグナルヲ得た。肝組織の高いミトコンドリア含量は、第１１図、６列に観察されるシグナルがヒトミトコンドリアから由来していることを示すものである。他のハイブリダイゼーション解析が染色体外ミニ染色体（ｄｏｕｂｌｅｍｉｎｕｔｅｓ”）の存在に導く小さな染色体領域の選択的な増幅を示したので、神経芽細胞ＤＮＡが解析された。第１１図、５列のハイブリダイゼーションシグナルの起源はわからない。

同時に、培養中の細胞のすべては、ｈｏｋ特性の―ゴースト”細胞中に形質転換される（第５図を参照のこと）。

従って、構造及び機能の両レベルで、シラスミドＲ１のｈｏｋ遺伝子とＥ・コリｒｅｌＢオ滅ロンのｒｅｌＢ−ｏｒｆ３との間で著しい相同性が存在する。

例１１ｔｒｐ−ｈｏｋ融合体の構成プラスミドｐＰＲ３４１は、天然のブロモ−ターを含まないｐａｒ　Ｂ領域からのｈｏｋ遺伝子を担持する（第１表及び第３図を参照のこと）。プラスミドｐｓＧｓ８は、ｐＢＲ３２２中に挿入されたＥｃ　ｏＲｌフラグメント上にｔｒｐオペロンを担持する。ｔｒｐプロモーターヲ担持スルｐＳＧＳ８から（７）　Ｘｈｏ　Ｉ　−ＥｃｏＲＶ　７ラクメント（約７００　ｂｐ　）　ｔ、まずＢａｍＨＩ　（この部位は、フレノウポリマラーゼによるフィル−イン反応を通して平滑末端化され＊）によ）、そして次に５ａｌｌによシ消化されたｐＰＲ３４１中に、連結することによって挿入した。この挿入は、転写がｈｏｋ遺伝子に入るであろう方向にｔｒｐプロモーターを配置した。

ＭＣ１００Ｏへの形質転換の後、アンピシリン含有のＬＢゾシ・−ト上でコロニーを選択し、そして続いて、そのコロニーを、ロイシン及びアンピシリンを含むＡ＋Ｂ最少プレート上での増殖について試験した。

トリプトファンの不在下で、ｔｒｐプロモーターが誘発され、そしてｈｏｋ遺伝子中への転写は、致死的であるように思われた。従って、最少グレート上で増殖しなかったクローンについてスクリーニングシタ。

シラスミド、ｐ３４１−１を含むそのようなりローン（正しい挿入を有することが制限酵素地図によって示された）の１つを、さらに分析するために選択した（第１２図を参照のこと）。

例１２ｐ３４１−１を含む細胞の増殖ＭＣ１００Ｏ（ｐ３４１−１　）を、０．２％グルコース及び１チカサミノ酸を供給され７’ｃＡ十Ｂ最少培地中で増殖した。カサミノ酸はひじょうに少量のトリットファンを含み、その結果、ある細胞密度で、その培地はトリプトファンを欠失するであろうことが推定される。この状況は、希少アミノ酸であるトリットファンの制限された供給による、自然環境下での増殖によく似ている。第１３図に見られるように、プラスミド担持の株（ｈｏｋ）の初期増殖速度は、グラスミドを含まないＭＣ１００Ｏ株の速度と同一である。

しかしながら、約ＵＤ４５ｏ＝　０．８の細胞密度で、ＭＣ１０００（ｐ３４１ −１）の増殖は突然停止し、ｈｏｋ遺伝子の誘発を示しく細胞の顕微鏡試験によって確認されｆｃ）、ところがプラスミドを含まない株は増殖し続ける。この点及び１時間後でのＭＣ１００Ｏ（ｐ３４１−１）からの生菌数計測は、生存性において劇的な減少を示す（１０−’以下）。結論として、Ｅ・コリに一１２株におけるｐ３４１−１の存在は、増殖培地中におけるトリプトファンの存在に依存する増殖及び生存性を導びく。アミノ酸が環境から使い尽くされる場合、増殖はすぐに停止し、そして細胞は殺される。

以下余白例１３生物学的封じ込めシステムの構成におけるＲ１ｂｏｋ相同体の使用Ｆ　ｈｏｋ遺伝子（例７を参照のこと）及びｔｒｐグロモーターを組合せ、生物学的封じ込めシステムを生成した。例７に記載されたｐＮＬｌからの、Ｒｌ　ｐａｒＢグローブをハイブリダイズする８　５０　ｂｐ　（Ｄ　ＲｓａＩ　７ラグメントを、ＳｍａＩによシ制限されたＭ１３ｍＰ１１中にクローン化した。組換え体、ｍＰＮＬ４を同定し、ここでＦ　ｈｏｋのリボゾーム結合部位及びＦ　ｈｏｋのコード領域を、約３００　ｂｐのＦｓｐＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントとして切シ出すことができた。この約３００　ｂｐの７ラグメンＦ　、ｔｒｐ　７’ ロモーター及びｔｒｐＥの初めの部分を含むｐｓｃｓｓの５５０　ｂＰのＥｃ　ｏＲＶ−Ｘｈ　ｏ　Ｉフラグメント及びｂｌａ遺伝子を担持するｐＢＲ３２２の３．７　ｋｂの５ａｌＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントを連結し、ｐＮＬ７を生成した。この構成体において、ｔｒｐプロモーターはＦｈｏｋ中に転写するであろう。そのグラスミドｐＮＬ７は、正しい制限酸素パターンを有し、そしてｐＮＬ７によシ形質転換されたＥ、コ’）　ＨＢＩ　０１ば、例１２においてｐ３４１− １形質転換体について記載したように、トリプトファンを含まないプレート上で増殖阻害を示す。

ｐＮＬ７上でのＦ　ｈｏｋ遺伝子の発現によって引き起こされる最大の誘発性細胞死が、　ｐＮＬ？　、　ＨＢＩＯＩ（ｐＮＬ７）によシ形質転換されたＥ、　コリＨＢ１ｏＩＶｃツいて決定された。細胞を変性されたＡ十Ｂ（ＭＡ＋Ｂ）中で増殖した０該培地は、チアミン、ロイシン、プロリン、０．４％グルコース、１％カサミノ酸及びアンピシリン（５０μｇ／ｆｎｌ　）にょシそしてさらに種々の濃度（０〜２００μｖｆｎｌ）でのトリシト７アンの添加によシ補充されたＡ＋Ｂ培地を含んで成る。細胞は、初期に指数増殖され、この時点で１００μＷのインドールイルアクリル酸（ＩＡＡ　）が添加され、そしてこの物質はレゾレッサーに結合するためにトリットファンと競争し、従ってレグレッサーの不活性化を導びく。ｄ当シの生存細胞の数を、ＩＡＡによる誘発の後、３０分で、５０ μｇ／ｌｎｌのアンピシリンを含むＬＢプレート上にＩＡＡによシ処理された培養物のサンプルをプレートすることによって決定した。Ｅ、コリＨＢ　１０１　（ｐＢＲ３２２）は、これらの実験で対照として働く。ＩＡＡ添加に基く最大の殺害効果が、５〜１０μ！Ａｌｌのトリプトファンで観察され、ＨＢ　１０１（ｐＮＬ７）の生存フラクションは、１．４ｘｌ□−４でめった。対照の細胞は、　ＩＡＡ添加によって影響されなかった。

５μｇＡＬｔのトリシトファンを含む上記培地中において増殖されたＨＢ　１０１　（Ｐａ７）のＩＡＡ誘発性殺害の運動学は、０〜１５分間（この時点で生存７ラクシヨンｉｄ　、　１０−３　よシも少ない）指数増殖を有する二段階増殖であシ、そして第二直線増殖が９０分続き、この段階は、１０倍又はそれ以上生存フラクションをさらに減じる。

トリプトファンの消耗及び従ってｔｒｐプロモーターの活性化を導ひく条件下でＥ、コリＨＢ　１０１　（ｐＮＬ７　）を増殖することによって刺激性間゛放実験を、行なった。細胞を、トリプトファンが添加されていないか又は５μｇＡ１１のトリットファンによシ補充された凧十Ｂ培地中で増殖した。ｍｌ当シの０Ｄ６００及び生存細胞が得られた。対照はＨＢＩＯＩ（ｐＢＲ３２２）でありた。

１つの実験においては、トリプトファンが増殖培地中に存在せず、そして第１４図に示されるように、ＨＢｌｏｌ（ｐＮＬ７）の０Ｄ６００は、対照培養物よりもゆりくシした速度でわあるが、数時間、指数的に増大するが、しかし細胞数における対応する増大は見られなかった。顕微鏡観察によれば、ｐＮＬ７によシ形質転換された細胞の細胞サイズはこの期間大きくなった。

生存細胞数は低くならなかったので、低いが、しかしまずまずのＦ　ｈｏｋの発現が生じたことが推定される。トリシトファンの消耗の後、ＨＢ　１０１　（ｐＮＬ７　）の殺害が観察され、そしてその生存フラクションは２×１０４であった。

２番目の実験において、ＨＢＩＯＩ（ｐＮＬ７）及びＨＢｌｏｌ（ｐＢＲ３２２）を、５μｌＡｌ１のトリプトファンによシ補充されたＭＡ＋Ｂ培地中で増殖した。第１５図から明らかなように、この２種の株は、ｏＤ６ｏｏによって決定される場合、この実験の第１段階の間、全く同じの世代時間を有し、そしてこの実験において、ＨＢｌｏｌ（ｐＮＬ７）培養における０Ｄ６００の上昇は、細胞数における指数的上昇をもたらした。従って、Ｅ、コリ内でのＦ　ｈｏｋ系のほんの少しの存在は、トリシトファンが増殖培地に存在するかぎシ、細胞増殖に影響を及ぼさない。トリシトファンの消耗の段階で、Ｆ　ｈｏｋが、細胞の殺害をもたらすｔｒｐプロモーターの抑制解除によって発現され、その結果、生存７ラクシヨンは、１時間内で１０”−’に減じられる。

Ｆ　ｈｏｋに関する上記構成法を用いる場合、実質的なフラクションの細胞が、殺害機能の発現の誘発にもかかわらず残存している。これは、原理的には、次のようないくつかの要因の組合せによるかも知れない：　ｐＮＬ７の構造的な不安定性＋　ｂｏｋタン・ぐり質の毒性効果へのＨＢＩＯＩ（ｐＮＬ７）の適合性、集団中でのプラスミドを含まない細胞の選択＋　ｔｒｐアテニュエーターが存在するような誘発性状態及び低コピー数の細胞の選択においてさえ、比較的低レベルの転写の組合された効果による、個々の細胞におけるＦｈｏｋの不十分な発現。

この問題に近づくために、９０分間のＩＡＡ誘発性Ｆ　ｈｏｋ発現又は外部から添加されたトリプトファンによる又はそれによらない増殖後、トリプトファンの消耗によるｈｏｋ発現の誘発のいづれかによるＥ、コ’）　ＨＢＩＯＩ　（ｐＮＬ７　）の生存性を分析した。この消耗実験からの生存細胞を、第１４及び第１５図における０Ｄ６００曲線の偏向後、１時間でサンプリングした。

これらの３種の場合、試験されたすべての生存コロニーは、５０μｇＡ１１のアンピシリンに耐性であるが、しかしトリプトファンが添加されなかった（第１４図）消耗実験からの生存コロニーは、５００μＥｌ／ｋｌのアンピシリン耐性細胞の５０チ減少を示した。従って、ｈｏｋタンパク質の連続した低レベル発現は、低グラスミドコピー数の細胞の選択を導ひくことができる。これらの３種の誘発実験のそれぞれからの１２個の耐アンピシリンコロニーを、５０μＷのアンピシリンを含むＬＢ培地中で増殖し、この初期の指数増殖期で、ＩＡＡを添方口し、１００μＩＩＡＩＩにした。ｍｌｌクシ生存細胞の数を、ＩＡＡの添加後、９０分で測定した。すべての３６の実験において、予定された殺害が観察され、すなわちそれらの生存フラクションは１０４〜１０−４であった。従って、Ｆｈｏｋ系の誘発に基づ＜　）（ＢＩＯＩ　（ＰＮＬ７）の生き残りは、ｈｏｋり／ノやり質の発現のレベルが限界値を越えない細胞の選択、たとえは低いプラスミドコピー数の細胞の選択によることが決定される。従って、　ｈｏｋに基づく生物学的封じ込めシステムの効率は、よシ強いプロモーターを交換し及び／又はｈｏｋｍＲＮＡの翻訳効率を高めることによって、さらに改良され得る。

例１４ｈｏｋ遺伝子の発現に対するλＰＲプロモーターの効果エキソヌクレアーゼＢａｊ３１によるｐＰＲ６３３の処理は、ｐａｒＢ領域のコード鎖の５′末端における一連の欠失（これらの２つは第１６ａ図に示されている）をもたらした。グラスミドｐＰＲ３４１は例３に記載されている。プラスミドｐＰＲ３４５は、ｐａｒＢの＋３０３〜＋５８０領域を含み、そしてこれは、ｈｏｋ遺伝子の読み枠を含む（第３図を参照のこと）。欠失は、ｈＯｋ遺伝子を発現するためにプロモーターもＳｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎ。

配列も付与しない。Ｓａｌ　Ｉ及びＢａｍ　ＨＩによシ制限されたｐＰＲ３４５中へのλＰＲプロモーター及びλレプレッサー（ｃＩ８５７　）を含むＢａ１ｌ　〜５ａｌＩ　７ラグメントのクローニングは、プラスミドｐＫＧ３４５　（第１６ｂ図）をもたらした。λＰＲの誘発（４２℃乃は、急速な宿主の殺害をもたらし、そしてこれは、誘発される場合、ｐＫＧ３４５がｈｏｋ十表視表現型し、そしてその効果が、前の構造体に比べて増大せしめられたことを示した。

よシ精密な分析によれば、その構造体は、λフラグメントのｃｒｏ’遺伝子がｈｏｋ遺伝子に融合したことを示した。これは、　ｈｏｋ遺伝子がλＰＲプロモーター及びｃｒｏ’　Ｓｈｉｎｅ−Ｄａ１ｇａｒｎｏ配列から発現せしめられた融合体をもたらした。従って、高められた宿主殺害効果は、ｈｏｋの天然のＩＪ　、ｙシーム結合部位に比べて、ｃｒｏ’　Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏからのよシ効果的な翻訳による。

第１７図は、ｃｒｏ’−ｈｏｋ融合体によって発現された高められた殺害効果を示す。その殺害速度（生存細胞数測定）及び増殖（０Ｄ４ｓｏ　）は、ｐＫＧ３４１又はｐＫＧ３４５のいづれかを含むＥ、コリ株ＭＣ１００Ｏを４２℃に移した後、示された。０Ｄ４５０の上昇は停止し、そして生存細胞数測定は両培養において急速に低下するが、しかしｃｒｏ’、−ｈｏｋ融合体の宿主殺害効果は、ｈｏｋのみと比べてよシ明確である（　ｐＫＧ３４５のための半減期は１時間である）。

例１５ｔｒｐ−ｈｏｋ封じ込め系を担持するグラスミドの生物学的封じ込め自然環境におけるプラスミドのトランスファーは、組換えＤＮＡ用途に関連して、高く不確実な危険要因である。従って、グラスミドは、それらが、トランスファーの後、新しい宿主細胞の殺害を誘発するであろう機能を担持する場合、よシ安全に使用されるべきである。他の細菌種のための殺害因子として、ｈｏｋ遺伝子生成物の可能性を調べるための試みにおいて、　ｐ３４１−１及び広宿主範囲の可動性グラスミドＲ８ＦＩ　０１０の耐カナマシン誘導体、ｐＢＯＥ９３の融合プラスミドが構成された。このノ・イブリッド（ＥｃｏＲＩ　−ＥｃｏＲＩ誘合体）を、Ｅ、コリＳ１７．１（染色体中に挿入された接合プラスミドＲＰＩ誘導体を含む）に形質転換せしめた。一連の可動性実験において、　ｐ３４１−１ −Ｒ８ＦＩＯＩＯが、８１７．１からそれぞれＥ、コリ１００５、セラチアマルセスセンス（５ｅｒｒａｔｉａ　ｍａｒｃｅｓｃａｎａ）及びプスードモナス　プチダにトランスファーされた。ｐＢＯＥ９３及びｐＢＲ３２２と融合したｐＢＯＥ９３のトランスファーを対照として行なった。

第２表に示された結果は、すべてのプラスミドが８１７．１から１００５へ、等しい頻度でトランスファーされたことを示し〔それは、１００５　（ｐ３４１− １−Ｒ８ＦＩＯＩＯ）　）ランス接合体がトリプトファンの不在下で殺されたことを示す〕。

ベクタープラスミドは、ひじように高い頻度で、Ｓ、マルセスセンス及びＰ、プチダにトランスファーサれ、ところがＰ３４１−１−Ｒ３ＦＩＯＩＯは、たとえトリプトファンがその間ずつと存在したとしても、１０４倍以下の低い頻度でこれらの両細菌にトランスファーされた。従って、　ｈｏｋ遺伝子生成物は、ひじょうに遠い関係にあるＰ、プチダ種のためにさえ致死的であシ、そして両生物体において、ｔｒｐ７’ロモータ一のためのＥ、コリの調節システムは、Ｓ、フルセスセンスがＥ、コリに近い関係にあるけれども、不明である。これは、Ｅ、コリのプラスミドを受ける可能性を有する、自然環境中の大多数の細菌が、ｔｒｉ −ｈｏｋ融合体が存在する場合、トリプトファンの外部からの濃度に関係なく殺されるであろうことを示す。

第　２　表ｐ３４１−ｔｒｐ　ＲＳＦ　１０１０のトランスファーＳ１７．１（ｐＢＯＥ９３）　Ｅ、コリ１００５　Ｋｉｎ＋Ｎａｔ　）１０−’（対照）　Ｓ、マンソーｙｘ　Ｋａｎ＋Ｔｃ　）１０−’Ｐ、プチグ　Ｋａｎ十Ｒｉｆ　）１０　’Ｓ１７．Ｉ　Ｅ、コリ１００５　Ｋａｎ＋Ｎａｔ　）１０−’（ｐ３４１−ｔｒｐＲ８Ｆ１０１０）　Ｓ、フルセスセンス　Ｋａｎ＋Ｔｃ　（１０”Ｐ、カダ　Ｋａｎ＋Ｒｉｆ　（１０−５例１６グラム陽性細菌のための生物学的封じ込めシステムの構成：適切な殺害機能としてのｈｏｋの同定これまでの例において、封じ込めシステムの構成のためのＲ１ｈｏｋ及び相同遺伝子の使用は、広範囲のグラム陰性細菌についてこれまで記載されて来た。

しかしながら、発酵におけるグラム陽性細菌の広範囲にわたる使用及びグラム陽性細菌が計画的な放出に使用することができる表示は、グラム陽性細菌のための生物学的封じ込めシステムの開発を必要とする。グラム陰性細菌のために上記システムに類似する封じ込みシステムを構成するための必要条件は、グラム陽性細菌に影響を及ぼす細胞殺害機能が、同一のものとして認められ得ることである。

Ｒ１ｈｏｋタンパク質は、広範囲のグラム陰性細菌において毒性であるので、グラム陽性細菌におけるｈｏｋタンパク質の可能性ある毒性効果が調べられた。

予備実験は、　Ｒ１ｈａｋ遺伝子からの生来のプロモーター及びυ＆シーム結合部位がＢ、サブチリスにおいてｈｏｋの発現を促進しないことを示した。

Ｂ、サブチリスにおけるｈｏｋの発現を得るために、ｈｏｋのためのコード配列を、Ｂ、サブチリスにおいて機能的であることが知られているプロモーター及びすがシーム結合部位を含む発現ベクター中に挿入した。プラスミドｐｓｒ−１はｐＡＩＱ２５　（Ｙａｎｚｕｒａ及びＨｅｎｎｅｒ、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８　Ｉｓ　１９８４年１月、４３９〜４４３ページ）の変性体であシ、ここでＰ、。−１−プロモーター及びベニシリラーゼ遺伝子は、５ｐａｃ−１プロモーター、続いて合成リボゾーム結合部位（ＡＡＧＧＡＧＧＴＧＡＴＣ）及びポリリンカーによって置換されている。ｐＳＩ−１のポリリンカー中に挿入された遺伝子は、ＩＰＴＧが増殖培地に添加される場合、そのグラスミド上にｌａｃオペレーター及びｌａｃ　ｌ遺伝子の存在によシ発現されるであろう（Ｙａｎｚｕｒａ及びＨｅｎｎｅｒ＊　ｏｐ、　ｅｆｔ、）。ｐＳＩ−１ベクター中へのＲ１ｈｏｋのクローニングの前、　ｈｏｋ遺伝子を次のようにして変性した。Ｎ−末端ｈｏｋコード領域に対応し、そしてＸｂａＩ（５’）及び５ａｕｎｌＡ（３’　）切断に対応するオーバーハングを有する二重鎖オリゴヌクレオチドを、β−ＬＩＮＫシアノエチルフォスフォラミジテ合成方法を用いて、ＣｙｃｌｏｎｅＴＭＤＮＡシンセサイザー（ＢｉｏｓｅａｒｃｈＩｎｃ、、　Ｎｅｗ　Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ＋　ＵＳＡから入手できる）によって合成した。そのオリゴヌクレオチドは、３つの位置でＲ１ｈｏｋ配列と異なシ、１つの結果はＨｉ　ｎｄ■認識部位の形成である。

オリゴヌクレオチド、すなわちｈｏｋコード配列のＣ−末端部分に対応する２　５０　ｂｐのＳａｕ　ｎ１Ａ−Ｐｓｔ　Ｉ７ラグメント（ｐＵＣ９組換え体（これからｈｏｋ遺伝が種々の制限酵素によシ切断され得る）に由来された〕及びＸｂａＩ及びＰｓｔＩによシ制限されたｐＵｃ１８から成る連結反応を用いて、Ｅ、コリＤＨ５ａ　（ＢｅｔｈｅｓｄａＲｅｓｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　＊　ＵＳＡから入手できる）を形質転換し、５０μＷのアンピシリン、０．００４％Ｘ−Ｇａ１及び１ｍＭのＩＰＴＧを含むＬＢプレート上で選択した。

白色のコロニーの１つから、プラスミドｐＬＫ２４を単離した。このグラスミドは、制限酵素分析によって決定される場合、予定される物理的地図を有する。その合成オリゴヌクレオチドに由来するｐＬＫ２４の領域を、ｈｏｋ遺伝子のコード領域の再確立を確認するために配列決定した。

ｐｓ　Ｉ−１中に変性されたｈｏｋ遺伝子を挿入するために、ｐＬＫ２４からの３００　ｂｐのｈｏｋ担持のＸｂａｌ−ＰａｔＩフラグメ／トを単離し、そしてＸｂａｌ及びＰｓｔｌによシ制限されたｐＳＩ−１に連結し、そしてその連結反応を用いて、５ａｄａｉｅ及びＫａｄａ、　Ｊ、　Ｂａｃｔ、　１５３　＋１９８３年２月、８１３〜８２１ページに記載の方法に従って適切なり、サブチリスＢＤ１７０細胞を形質転換し、そして続いて、クロラムフェニコール（５μＩ／１１１１）を含むＬＢプレート上で選択した。この構成法は、ｐＳＩ−１の合成リボゾーム結合部位から１１　ｂｐの距離にＡＴＧ開始コドンの位置を定めるので、耐りロラムフェニコール性コロニーヲ、ｈｏｋ　７ｂ：　Ｂ、　＋　７’？　’）　ス中で活性である場合、ＩｍＭのＩＰＴＧを含むＬＢジグレート上その形質転換体をグレートすることによって、増殖の阻害、すなわち推定される表現型について分析した。増殖阻害は、試験された形質転換体の約半分で観察された。そのような形質転換体の１つ、すなわちＢＤ１７０　（ｐＬＫ２６　）を、さらに分析した。

ＢＤ１７０　（ｐＬＫ２６　）から単離されたグラスミドＤＮＡは、推定される物理的地図（第１８図）を示し、そして従って、それは構造的に安定しているように見えた。

Ｂ、サブチリス中におけるＲ　１　ｈａｋ遺伝子生成物の毒性を試験するために、ＢＤ１７０　（ｐＬＫ２６　）及びＢＤ１７０（ｐＳＩ−１）を、初期の指数増殖期（ｏＤ６００　）　（この時点でＩＰＴＧを添加し、２ｒｒＩＭにした）にＬＢ培地中で増殖せしめた。これは、ｐＳＩ−１の５ｐａｃ−１グロモーターを誘発せしめる。ｒｎｌ当シの０Ｄ６００及び生存細胞を、この実験の間、測定した。第１９図に見られるように、２種の培養物の増殖速度は、　ＩＰＴＧの添加の前は同一であシ、すなわちＢ、サブチリス内のｂｏｋ遺伝子の単なる存在は、細胞増殖に影響を及ぼさない。Ｉ　ＰＴＧの添加後、ＢＤ１７０　（ｐＬＫ２６）培養物の０Ｄ６００は、ＩＰＴＧ処理の初めの１時間の間２倍になシ、続いての期間、０Ｄ６００の上昇は存在しなかった：これはＥ、コリにおけるｈｏｌ（効果のために観察されるパターンに相当する。生存細胞数測定は、　ＢＤ１７０　（ｐＬＫ２６）培養物へのＩ　ＰＴＣの添加後、すぐに減少しく第２０図）、その生存フラクションは０．２５であった。ＩＰＴＧ添加の効果は対照に対しては見られなかった。ＩＰＴＧの添加の後、１時間でのＢＤ１７０　（ｐＬＫ２６）の位相差鏡検法は・約５チのゴースト細胞の出現を示した。ｈｏｋ発現の任冗誘発で１．５時間生存する細胞が、Ｉ　ＰＴＧによる再誘発に対するそれらの敏感性について試験された。生存細胞からのすべての２５個のコロニーは、１ｒｎＭのＩＰＴＧを含むＬＢプレート上で増殖阻害を示した。

ｈｏｋ遺伝子生成物がグラム陽性細菌に対して毒性であシ、そして従って、それは本発明に記載の方法に従って生物学的封じ込めシステムを構成するために使用され得ることがこれらの結果から明確になる。

生存フラクションが０．２５に相当する発見は、この報告を無価値にする。なぜならば、生存細胞は、主にｈｏｋ遺伝子の不十分な発現によるものであると思われるからであシ、この特徴は、たとえばよシ強いプロモーター又は他の標準方法を用いることによって改良され得る。

例１７ｆｉｍ及びｈｏｋシステムの組み合せによって得られた推計学的な殺害効果Ｅ、コリに−１２における推計学的殺害効果が、Ｅ。

コリにおけるタイプｌ繊毛の周期的発現を特定するｆｉｍ遺伝子クラスターの一部に関連するｈｏｋ遺伝子を担持する組換えプラスミドによって得られた。

プラスミドｐＰＫＬ８　（第２１図）は、ｆｉｍＡ遺伝子のためのプロモーターを含む、３ｏｏｂｐの逆位可能なりＮＡフラグメントを担持する。このプラスミドはさらに、２種の調節遺伝子ｆｉｍＢ及びｆｉｍＥ（それぞれ”オン゛及び” オフ″遺伝子、Ｋｌ　ｅｍｍなど、９Ｍｏｌ。

Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ、１９９．１９８３＊４１０〜４１４に一ジ；　Ｋ１ｅｍｍ＋　Ｅｍｂｏ　Ｊ、５＋　１９８６　＋　１３８９〜１３９３’−ジ）を含む。

プラスミドｐＰＲ３４１（第２２図）は、すでに前に説明された（　Ｇｅｒｄｅｓなど、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ　ＵＳＡ　８　３　．１９８６．３１１６〜３１２０ページ）。

ｐＰＫＬ８を、Ｂｇｌｌ［及びＢｃｌｌにょシ制限した。ｆｉｍＢ及びｆｉｍＥ遺伝子及び逆位可能なプロモーター領域を含む３．３ｋｂのＢｇｌ　ＩＩ　〜Ｂｃｌ　Ｉ　７ラグメントを、ｐＰＲ３４１のＢａｍＨ１部位中に挿入し、プラスミドｐＰＫＬ１００（第２３図）を得、これを用いてＥ、コリに一１２株ＭＣ１００Ｏに形質転換した。この構成体を含むＥ、コリに一１２細胞を、従来通シにＬＢ−培地中で増殖せしめた。しかし々から、このような細胞の培養物は、１〜２％のゴースト細胞の存在を示し、この多くは異常に長かった（第２４ｍ及びｂ）。これは、宿主の続く殺害によｌ）　ｈｏｋ遺伝子の周期的転写を表示する。

逆位可能なプロモーターセグメントの方向を決定するために、プラスミドｐＰＫＬ１０００を、制限酵素５ｎａＢＩ及びＳａｃ…によシ消化した。その逆位可能なプロモーターセグメントは、５ｎａＢ　ｌのためのユニーク部位を含み、そしてその得られたフラグメントのサイズを研究することによって、そのプロモーター含有セグメントの方向を推定した：　６５０　ｂｐのＳａｃ　ｌ［〜５ｎａＢ　ｌフラグメントが“オン”形状に起因し、そして３５０　ｂｐのフラグメントが１オフ”形状に起因する（第２３図）。選択力の不在下で、それぞれ“オン” 及び“オフ″形状でセグメントを含むグラスミドの５Ｖ５０分布が、ｐＰＫＬ８　（第２５図のレーンＢ）によって例示される場合、推定される。しかしながら、同じパターンは、プラスミドｐＰＫＬ１００の場合には見られなく、ここで“ オフ＃形状のみが明確であった（第２５図のレーンＡ）。これは、逆位性スイッチカ６オン”形状にある。グラスミドｐＰＫＬ１００　ヲ含む細胞が生存していないことを指摘する。

例１８ｆｉｍＡ−ｈｏＫ封じ込めシステムを含む及び含まない細胞間の競争に基づく生物学的封じ込めグラスミドＩ）ＰＫＬｌｏｏ　（例１７を参照のこと）中の逆位可能なりＮＡ　７ラグメントがｆｉｍＢ及びｆｉｍＥの遺伝子用量によってｔｒａｎｓに影響を及ぼすかどうかをさらに明確にするために、次の構造体が、トランスでのこのプラスミドを補うために製造された。すなわち、プラスミドｐＰＫＬ１００はｐＢＲ３２２のレプリコンに基づかれているので、この適合性ベクターｐＡＣＹＣ１８４に基づく３種のプラスミド、すなわちｆｉｍＢ及びｆｉｍＥ遺伝子を担持するｐＬＰ５、ｆｉｍＢ遺伝子のみを含むｐＬＰ４及びｆｉｍＥ遺伝子のみを含むｐＬＰ６が構成された。

プラスミドｐＬＰ４が、ｐＰＫＬｌｏ　（Ｋｌｅｍｍ、　１９８６　。

ｏｐ、　ｅｆｔ、）からの２３００ｂＰのＢｇｌ　ＩＩ　−８ｔｕ　Ｉフラグメントを、　Ｂａｒｎ）（ｌ及びＥｃｏＲＶによシ消化されたプラスミドｐＡＣＹＣ１８４（第２６図を参照のこと）中に挿入することによって構成された。プラスミドｐＬＰ５は、２６５０　ｔｉｐのＢｇｌｌｌ−８ｎａｂｌ　７ラグメントをＢ　ａｍＨＩ及びＥｃｏＲＶによシ消化された！ラスミドｐＡＣＹＣ１８４中に挿入することによって構成された。プラスミドｐＬＰ６は、ｐＬＰ５０Ｈｉｎｃ　ｌ［欠失誘導体であった（第２６図を参照のこと）。

グラスミドｐＬＰ４　、　ｐＬＰ５及びｐＬＰ６を用いて、ｐＰＫＬｌｏｏをすでに含むＥ、コリＭＣＩ　０００宿主細胞を形質転換し、そしてこれを、１０μ ｇＡｌｌのプロリン、トレオニン、イソロイシン及びロイシン、２０μＷのクロラムフェニコール及び１０μｇＡＬｌのアンピシリンによシ補充された０、２チグリセロールＡ＋Ｂ培ｉ上で増殖せしめた。これらの３種の組合せの光学濃度の上昇によって測定される場合の増殖速度が第３表に示されている。ｐＢＲ３２２：　ｐＡｃＹｃ１８４のコピー数の比は、大まかに４＝１であシ、そして従って、プラスミ）’ノ組合せｐＬＰ４＋ｐＰＫＬ１００を有する宿主は、ｐＰＫＬｌｏｏのみを有する細胞と比較して、ｆｉｍＢ（これは、ｐＰＫＬｌｏ０中にｆｉｍＡプロモーターを含む逆位可能なりＮＡフラグメントの“オフ”から６オン” への形状を仲介する）の遺伝子用量において対応する２５％の上昇を有する。他方、プラスミド組合せｐＬＰ６　＋ｐＰＫＬ１００を含む細胞は、ｆｉｍＥ遺伝子（これは逆位可能なりＮＡフラグメントの“オン”から”オフ１への形状を仲介する）の量において大まかに２５％の上昇を有する。

ｐＬＰ４　＋　ｐＰＫＬｌｏｏの組合せの場合、ｆｉｍＡプロモーターのよ多頻度の高い活性化及び続く宿主の殺害の明確な徴候は、ｐＬＰ６＋ｐＰＫＬ１００の組合せを含む宿主のだめの１１０分と比べて、その対応する宿主のためには１４０分の世代時間から明らかになった（第３表）。さらに、細胞が顕微鏡によシ調べられる場合、前者は、約１２チのゴースト細胞の存在を示し、そして後者は実質的に何のゴースト細胞の存在も示さなかった。

第　３　表ｐＰＫＬ１００＋ｐＬＰ４　１４０分ｐＰＫＬ１００＋ｐＬＰ５　１２０分ｐＰＫＬ１００＋ｐＬＰ６　１１０分微生物の寄託特許手続の目的のために微生物の国際認識に基づくブタペスト条約の規定に従って、次の微生物のサンプルを１９８７年３月２５日、Ｄｅｎｔｓｃｈｅ　Ｓａｍｍｌｕｎｇｖｏｎ　Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ　、　Ｇｒｉｓｅｂａｃｈｓｔｒａｓｓｅ　８ｔ３４００Ｇ’ｏｔｔｉｎｇｅｎ、　Ｆｅｄｅｒａｌ　Ｒｅｐｕｂｌｉｃ　ｏｆ　Ｇｅｒｍａｎｙに寄託した。

Ｂ、サブチリス　ＢＤ１７０　（ｐＬＫ２６）　ＤＳＭ　４０３７Ｅ、コリ　ＨＢＩＯＩ　（ｐＮＬ７）　ＤＳＭ　４０３４Ｅ、コリ　Ｋ−１２ＭＣ１００Ｏ（ｐＫＧ３４５）　ＤＳＭ　４０３６Ｅ、コリ　Ｋ−１２ＭＣ１００Ｏ（ｐＰＫＬｌｏｏ）　ＤＳＭ　４０３５Ｅ、コリ　Ｋ−１２ＭＣ１００Ｏ（ｐＰＫＬ１００＋ｐＬＰ４）　ＤＳＭ　４０３１Ｅ、コリ　Ｋ−１２ＭＣ１００Ｏ（ｐＰＫＬ１００＋ｐＬＰ５）　ＤＳＭ　４０３２Ｅ、コリ　Ｋ−１２ＭＣ１００Ｏ（ｐＰＫＬ１００＋ｐＬＰ６）　ＤＳＭ　４０３３以下余臼ＬｏｏＣ’ｕｃＸＪｃｏ　量 ω ２．０−− 榔国際調査報告一１陶−＾−”””’　ＰＣＴ／ＤＫ８７１０００３１

Claims

【特許請求の範囲】１．レプリコンであって、該レプリコンが宿主細胞の１つのタイプ（第一次宿主細胞）に含まれる場合、細胞殺害機能をコードするヌクレオ配列が規則的に発現され、その結果そのレプリコンを含む細胞は、前記細胞殺害機能が発現される条件下で殺害され、そして前記レプリコンが宿主細胞のもう１つのタイプ（第二次宿主細胞）に含まれる場合、細胞殺害機能をコードするヌクレオチド配列が規則的に又は構成的に発現され、その結果そのレプリコンを含む細胞は、一定不変に殺害され、又は前記細胞殺害機能が発現される条件下で殺害されることを特徴とするレプリコン。２．前記細胞殺害機能の発現が転写のレベルで調節される請求の範囲第１項記載のレプリコン。３．前記転写のレベルでの調節が、１又はそれよりも多くの因子によって調節されるプロモーターによって生じる請求の範囲第２項記載のレプリコン。４．前記細胞殺害機能をコードするヌクレオチド配列の発現が宿主細胞の環境条件、細胞の生理学的状態ヌは周期的又は推計学的出来事によって決定される請求の範囲第２又は３項記載のレプリコン。５．前記発現が、環境における物理的条件又は環境におけるある化学物質の存在又は不在によって決定される請求の範囲第４項記載のレプリコン。６．前記化学物質を、炭素又は窒素源，体謝物，アミノ酸，ヌクレオチド，プリン又はピリミジン塩基、又は金属イオンから選択する請求の範囲第５項記載のレプリコン。７．前記化学物質がトリプトファンである請求の範囲第６項記載のレプリコン。８．前記物理的条件が環境の中で支配的な温度を含んで成る請求の範囲第５項記載のレプリコン。９．前記推計学的出来事が周期的な逆位性スイッチのプロモーターによって引き起こされる請求の範囲第４項記載のレプリコン。１０．前記逆位性スイッチプロモーターがＥ。コリｆｉｍＡプロモーターである請求の範囲第９項記載のレプリコン。１１．前記細胞殺害機能をコードするヌクレオチド配列の発現が翻訳のレベルで調節される請求の範囲第１項記載のレプリコン。１２．前記細胞殺害機能を特定するｍＲＮＡの翻訳がアンチセンスＲＮＡによって阻害される請求の範囲第１１項記載のレプリコン。１３．前記細胞殺害機能をコードするヌクレオチド配列が細菌性プラスミド，細菌性染色体，原核性ウィルス，真核性プラスミド，真核性ウィルス、真核性染色体，真核性ミトコンドリア又は真核性クロロプラストに由来し、ヌは合成配列である前記請求の範囲のいずれか１項に記載のレプリコン。１４．前記ヌクレオチド配列がプラスミドＲ１のｐａｒＢ領域からのｈｏｋ遺伝子又は該ＲＩｈｏｋ遺伝子に相同であるＤＮＡ配列を含有する請求の範囲第１３項記載のレプリコン。１５．前記細胞殺害機能をコードするヌクレオチド配列の転写を調節するヌクレオチド配列が、細菌性プラスミド，細菌性染色体，原核性ウィルス，真核性プラスミド，真核性ウィルス，真核性染色体，真核性ミトコンドリア，又は真核性クロロプラストに由来し、又は合成配列である請求の範囲第１〜１２項のいづれか１項記載のレプリコン。１６．前記レプリコンに生来関係しないＤＮＡ配列をさらに含んで成る前記請求の範囲のいづれか１項に記載のレプリコン。１７．請求の範囲第１〜１０項のいづれか１項記載のレプリコンを含む細胞。１８．請求の範囲第１１又は１２項記載のレプリコンを含み、そして細胞中において、同じか又は他のレプリコン上に存在するアンチヒンスＲＮＡをコードするヌクレオチド配列をさらに含んで成る細胞。１９．前記アンチセンスＲＮＡをコードするヌクレオチド配列が構成的に発現される請求の範囲第１８項記載の細胞。２０．前記アンチセンスＲＮＡが１又はそれよりも多くの要因によって調節されるプロモーターから発現される請求の範囲第１８項記載の細胞。２１．前記アンチセンスＲＮＡをコードするヌクレオチド配列の発現が、宿主細胞の環境条件，細胞の生理学的状態又は推計学的出来事によって決定される請求の範囲第２０項記載の細胞。２２．前記推計学的出来事が、周期的な逆位性スイッチのプロモーターによって、又は前記アンチセンスＲＮＡの組換え切断によってもたらされる請求の範囲第２１項記載の細胞。２３．前記逆位性スイッチプロモーターがＥ。コリｆｉｍＡプロモーターである請求の範囲第２２項記載の細胞。２４．前記アンチセンスＲＮＡをコードするヌクレオチド配列の発現が、環境における物理的条件文は環境におけるある化学物質の不在又は存在によって決定される請求の範囲第２１項記載の細胞。２５．前記アンチセンスＲＮＡをコードするヌクレオチド配列の発現が、炭素又は窒素源、代謝物、アミノ酸、ヌクレオチド、プリン又はピリミジン塩基、又は金属イオンから選択された化学物質によって決定される請求の範囲第２４項記載の細胞。２６．前記アンチセンスＲＮＡをコードするヌクレオチド配列がｌａｃプロモーターから転写される請求の範囲第２４項記載の細胞。２７．前記物理的条件が環境中において支配する温度を含んで成る請求の範囲第２４項記載の細胞。２８．前記アンチセンスＲＮＡをコードするヌクレオチド配列が細菌性プラスミド，細菌性染色体，原核性ウィルス，真核性プラスミド，真核性ウィルス，真核性染色体，真核性ミトコンドリア又は真核性クロロプラストに由来し、又は合成配列である請求の範囲第１８〜２７項のいづれか１項記載の細胞。２９．前記アンチセンスＲＮＡの転写を調節するヌクレオチド配列が、細菌性プラスミド，細菌性染色体，原核性ウィルス，真核性プラスミド，真核性ウィルス，真核性染色体，真核性ミトコンドリア又は真核性クロロプラストに由来し、又は合成配列である請求の範囲第１８〜２８項のいづれか１項記載の細胞。３０．細菌又は真核生物から選択される請求の範囲第１７〜２９項のいづれか１項記載の細胞。３１．細胞殺害機能をコードする配列及び該コード配列の転写を調節する配列を含有するヌクレオチド配列。３２．前記転写を調節する配列が、１又はそれよりも多くの要因によって調節されるプロモーターである請求の範囲第３１項記載のヌクレオチド配列。３３．細胞殺害機能をコードする配列が、細菌性プラスミド，細菌性染色体，原核性ウィルス，真核性プラスミド，真核性ウィルス，真核性染色体、真核性ミトコンドリア又は真核性クロロプラストに由来し、又は合成配列である請求の範囲第３１又は３２項記載のヌクレオチド配列。３４．前記配列が、プラスミドＲ１のｐａｒＢ領域からのｈｏｋ遺伝子又は核ｈｏｋ遺伝子に相同であるＤＮＡ配列を含有する請求の範囲第３３項記載のヌクレオチド配列。３５．細胞殺害機能をコードするヌクレオチド配列。３６．細菌性プラスミド，細菌性染色体，原核性ウィルス、真核性プラスミド、真核性ウィルス，真核性染色体，真核性ミトコンドリア又は真核性クロロプラストに由来し、又は合成配列である請求の範囲第３５項記載のヌクレオチド配列。３７．プラスミドＲ１のｐａｒＢ領域からのｈｏｋ遺伝子又は該ｈｏｋ遺伝子に相同であるＤＮＡ配列を含有する請求の範囲第３６項記載のヌクレオチド配列。３８．細胞殺害機能を特定するｍＲＮＡの翻訳を阻害することができるアンチセンスＲＮＡをコードするヌクレオチド配列。。。３９．前記アンチセンスＲＮＡ配列の転写を調節する配列をさらに含んで成る請求の範囲第３８項記載のヌクレオチド配列。４０．前記転写を調節する配列が、１又はそれよりも多くの要因によって調節されたプロモーターである請求の範囲第３９項記載のヌクレオチド配列。４１．細菌性プラスミド，細菌性染色体，原核性ウィルス，真核性プラスミド，真核性ウィルス，真核性染色体，真核性ミトコンドリア又は真核性クロロプラストに由来し、又は合成配列である請求の範囲第３８〜４０項のいづれか１項記載のヌクレオチド配列。４２．生物学的システムを含む方法であって、ある条件下で規則的に発現し、そして異なつた条件下で規則的又は構成的に発現する、細胞殺害機能をコードするヌクレオチド配列を生物学的システム中に導入することを含んで成る方法。４３．前記生物学的システムが、請求の範囲第３１〜３４項のいづれか１項記載のヌクレオチド配列又は請求の範囲第３５〜３７及び３８〜４１項のいづれか１項記載のヌクレオチド配列を細胞中に導入することによって、定義された環境下に含まれる細胞を含んで成り、これから細胞殺害機能の発現が、該細胞のための環境条件文は該細胞の生理学的状態によって決定される請求の範囲第４２項記載の方法。４４．前記細胞を、細菌又は真核生物から選択する請求の範囲第４２又は４３項記載の方法。４５．レプリコンが、請求の範囲第３１〜３４項のいづれか１項記載のヌクレオ配列を該レプリコン中に挿入することによって、第一次宿主細胞に含まれ、これから細胞殺害機能が規則的に転写され、該転写が１又はそれよりも多くの要因によって調節され、この少なくとも１つが第一次宿主細胞のゲノム中に独占的に存在する遺伝子によってコードされている請求の範囲第４２項記載の方法。４６．レプリコンが、請求の範囲第３５〜３７項のいづれか１項記載のヌクレオ配列を該レプリコン中に挿入することによって第一次宿主細胞に含まれ、これから、細胞殺害機能をコードするｍＲＮＡが構成的に発現され、このｍＲＮＡの翻訳が、第一次宿主中に挿入されたヌクレオ配列から転写されたアンチセンスＲＮＡによって阻害され、該アンチセンスＲＮＡをコードするヌクレオチドが、構成的に発現され、又は１又はそれよりも多くの要因によって調節されるプロモーターから発現される請求の範囲第４２項記載の方法。４７．レプリコンが、請求の範囲第３１〜３４項のいづれか１項記載のヌクレオチド配列を該レプレッサー中に挿入することによって、第一次宿主細胞、同種の細胞及び定義できる範囲の第二次宿主細胞に含まれ、これから細胞殺害機能が規則的に転写され、該転写が１又はそれよりも多くの要因によって調節され、この少なくとも１つが、第一次宿主細胞，同種の細胞及び定義できる範囲の第二次宿主細胞のゲノム中に存在する遺伝子によってコードされている請求の範囲第４２項記載の方法。４８．レプリコンが、請求の範囲第３５〜３７項のいづれか１項記載のヌクレオチド配列を該レプリコン中に挿入することによって、第一次宿主細胞，同種の細胞及び定義できる範囲の第二次宿主細胞に含まれ、これから細胞殺害機能をコードするｍＲＮＡが構成的に発現され、前記ｍＲＮＡの翻訳が、レプリコン上にも存在するアンチセンスＲＮＡをコードするヌクレオチド配列から転写されたアンチセンスＲＮＡによって阻害され、前記アンチセンスＲＮＡをコードするヌクレオチド配列が第一次宿主細胞中において、構成的に発現され又は１又はそれよりも多くの要因によって調節されるプロモーターから発現され、この少なくとも１つが第一次宿主細胞、同種の細胞及び定義できる範囲の第二次宿主細胞のゲノム中に存在する遺伝子によってコードされている請求の範囲第４２項記載の方法。４９．レプリコンを含む細胞が、請求の範囲第３１〜３４項のいづれか１項記載のヌクレオチド配列を該レプリコン中に挿入することによって含まれ、これからの細胞殺害機能の発現は推計学的出来事である請求の範囲第４２項記載の方法。５０．前記推計学的出来事が逆位性スイッチのプロモーターによって仲介されている請求の範囲第４９項記載の方法。５１．前記逆位性スイッチのプロモーターがＥ。コリｆｉｍＡプロモーターである請求の範囲第５０項記載の方法。５２．レプリコンを含む細胞が、請求の範囲第３１〜３４項のいづれか１項記載のヌクレオチド配列を該レプリコン中に挿入することによって含まれ、これからの細胞殺害機能の発現は周期的な出来事である請求の範囲第４２項記載の方法。５３．細胞殺害機能をコードするヌクレオチド配列（この発現は推計学的出来事によって決定される）；病原物質からの、免疫化のための１又はそれよりも多くのエピトープをコードするヌクレオチド配列；及び発現される場合、宿主細胞の外表面に前記エピトープを輸送するための手段を担持する第一次宿主細胞を含有するワクチン。５４．前記宿主細胞が、アドヘシンの発現のための遺伝情報を付与されている請求の範囲第５３項記載のワクチン。５５．前記エピトープをコードするヌクレオチド配列が、天然に存在する細胞表面タンパク質をコードする遺伝子中に挿入され、該細胞表面に転位される融合タンパク質を発現する請求の範囲第５４項記載のワクチン。５６．前記天然に存在する細胞表面タンパク質をコードする遺伝子がフィンブリンをコードする遺伝子である請求の範囲第５５項記載のワクチン。５７．前記宿主細胞を、エンテロバクテリアセアエ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ），ラク酸細菌、ビブリオナセアエ（Ｖｉｂｒｉｏｎａｃｅａｅ）及びプスードモナデス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄｅｓ）から選択する請求の範囲第５３項記載のワクチン。５８．前記細胞殺害機能の発現を決定する推計学的出来事が、前記細胞殺害機能をコードするヌクレオチド配列中に転写する周期的な逆位性スイッチのプロモーターによってもたらされる請求の範囲第５３項記載のワクチン。５９．前記細胞殺害機能の発現を決定する推計学的出来事が、前記細胞殺害機能を特定するｍＲＮＡの翻訳を阻害するアンチセンスＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を転写する周期的な逆位性スイッチのプロモーターによって、又は前記アンチセンスＲＮＡの組換え切断によってもたらされる請求の範囲第５３項記載のワクチン。６０．前記逆位性スイッチのプロモーターがＥ。コリｆｉｍＡプロモーターである請求の範囲第５８又は５９項記載のワクチン。６１．前記逆位性スイッチの頻度が、ワクチンが投与される哺乳類の満足する免疫化を得るために必要とされる時間、エピトープの十分な投与レベルを維持するために、選択される請求の範囲第５８項記載のワクチン。６２．前記宿主細胞を、１５〜３０日間維持する請求の範囲第６１項記載のワクチン。６３．前記病原物質（これからエピトープが由来する）を、ウィルス，細菌又は真核生物、たとえば菌類又は原生動物から選択する請求の範囲第５３項記載のワクチン。６４．前記宿主細胞が、異なつた病原物質からのエピトープをコードする複数のヌクレオチド配列を担持し、そして前記エピトープのそれぞれが融合タンパク質として発現される請求の範囲第５６項記載のワクチン。６５．前記宿主細胞が、活性化される場合、細胞殺害機能をコードするヌクレオチド配列中に転写する追加のプロモーターを担持する請求の範囲第５３項記載のワクチン。６６．前記細胞殺害機能をコードするヌクレオチド配列が、推計学的出来事によって決定される発現の配列と同じである請求の範囲第６５項記載のワクチン。６７．前記細胞殺害機能をコードするヌクレオチド配列が、推計学的出来事によって決定される発現の配列から分離される請求の範囲第６５項記載のワクチン。６８．細胞殺害機能をコードする１又はそれよりも多くのヌクレオチド配列を担持する病原物質（該物質は、１又はそれよりも多くのヌクレオチド配列の発現によって殺されている）を含有するワクチン。