JPS58107184A - 組換えｄｎａ含有宿主細胞の安定化法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、組換えＤＮＡクローニングベクターに乗って
いる遺伝子によって抑制される致死染色体マーカにより
、組換えＤ　Ｎ　Ａ宿主細胞を安定化し、かつ選択する
手段を提供する選択系に関する。

プラスミドの様な組換えＩ）　Ｎ　Ａクローニングベク
ターは細菌集団から急速に失なわれることが多く、工業
的規模の発酵では１．　ｏ　１６＃ＩＩｌ旭阻代以上の
ものが必要となるので、上記手段は非常（こ重要な意義
を有する。従って、所望の生成物を暗号化している組換
えＤＮＡをプラスミドに挿入したら、このプラスミドを
含有している微生物培養を安定化させ、この培養を含む
全細胞が所望のプラスミドを含有するようにすることが
、必須ではないにしても、望ましい。外来性ＤＮＡを持
った組換えＤＮＡは全て不安定であり、−夜培養した後
では、細胞群の９０％以上が組換えプラスミドを含んで
いなかったということが多いので、このことは極めて重
要である。この様な場合、所望の遺伝子の発現は、プラ
スミドを保持しているＫｆｉ胞１こおいてのみ可能であ
るので、生産能力は著しく減少する。

本発明は、機能的ポリペプチドを発現する組換えＤＮＡ
を含有している宿主細胞を安定化させ、かつ選択するた
めの方法であって、該方法は、ａ）バクテリオファージ
λのＰ　ｓ　ｔ　■−Ｈ１ｎｃ　ＩｃＩリプレッサー含
有制限フラグメントおよび機能的ポリペプチドを発現す
る；貴伝子を含んでいる組換えＤＮＡクローニングベク
タを宿主細胞に導入して形質転換し、 ｂ）宿主細胞に於いては致死的であるかまたは条件的に
致死的であるマーカであるが、該形質転換宿主＃Ｂ胞に
於いては核組換えＤＮＡクローニングベクターに含１れ
ている該リプレッサー遺伝子（抑制遺伝子）により抑制
されるマーカを含有している病原性生物によって、該形
質転換宿主細胞を溶原化するものであって、 該組換えＤＮＡクローニングベクターは該リプｖ　ツサ
−ｉこ感受性を持たないプロモーターとレプリコンを有
し、そして条件的に致死的である遺伝子を含有している
病原性生物で形質転換宿主細胞を溶原化した場合は、得
られた宿主細胞を制限的条件下で培養することからなる
方法を提供するものである。

本発明はまた、宿主細胞を安定化し、かつ選択する上記
方法番こ使用される組換えＤ　Ｎ’　Ａクローニングベ
クターおよび該ベクターによって形質転換した宿主細胞
を提供するものである。

組換えプラスミドを安定化させる有効な方法（こついて
はほとんど記載がなく、また有効と称する方法も全て著
しい欠点を有する。１つの方法は、組換えプラスミドに
抗生物質耐性遺伝子を挿入し、培養培地に適当な抗生物
質を添加する方法である。

抗生物質耐性遺伝子ををするプラスミドを含んでいる細
胞は選択され、プラスミドを失なったものは選択されず
（こ除去される。この方法の主な欠点は、抗生物ｗ耐性
菌を大規模に増殖しなければならず、培養培地に高価な
抗生物質を使用しなければならず、そしてまた所望の生
産物から抗生物質を除去するために精製しなければなら
ないことである。

組換えプラスミドを安定化する為のもう１つの既知の方
法は、染色体上に栄養素要求突然変異を補充することで
ある。この方法では、発酵培地の組成が厳しく制限され
、宿主細菌を要求栄養素を含んでいない培地で発酵させ
る必要がある。更に、細胞はプラスミドを失なった稜゛
も、栄養共生により生育し続けることもある。従って、
両タイプの選択法とも、培地の特異な操作薯こ依存して
いる。

この様な束縛によって発酵コストが増大し、生産性を改
善するための選択の余地が制限される。

培地組成に依存しない、あらゆる発酵条件下に於いて組
換ＤＮＡクローニングベクターを維持し得る、そしてポ
リペプチド生産物の生合成を増強し得る選択法の開発が
待ち望まれている。細胞の自滅はこの要求を満たすの（
こ適したものである。

というのは、染色体上に致死マーカーを含み、組換より
　Ｎ　Ａクローニングベクター上番こりプレッサーまた
は相補遺伝子を含んでいる自滅細胞を組み立てることが
できるからである。これらの仕様通り組み立てられた細
胞は、このベクターを失うと死滅する。本発明はこの原
理を改良し、培地中の実質的に全ての生存細胞が所望の
組換クローニングベクターを含んでいる様（こすると共
に、クローニングベクターに含まれている遺伝子の発現
を強化するものである。

生産物遺伝子の、＆力な発現、並方こプラスミドの分離
（ｓｅｇｒｅｇａｔｉｏｎ　）がないことは特に有利で
あり、かつ、これらはバクテリオファージλＣ■リプレ
ッサーが関与する他の選択系と本発明を区別制限フラグ
メントと機能的ポリペプチドを発現する遺伝子を含んで
いるクローニングベクターからなるこの様な選択系が開
示されている。機能的ポリペプチドを暗号化している遺
伝子は発現されるけれども、そこに開示された特定のプ
ラスミドの構造は、多少の分離を示しており、また強力
な、そして最良の生産物生産を行ないつるものではない
。本発明の改良法は、組換えＤＮＡを含有している宿主
細胞を安定化し、かつ選択し、同時に機能的ポリペプチ
ドの遺伝子発現および生合成を最大にする優れた方法で
あり、上記問題点を解決するものである。

本発明において、組換えＤＮＡクローニングベクターは
、プラスミド、バクテリオファージ、およびウィルスな
ど、１種若しくはそれ以上のＤＮＡ断片を付加すること
のできる０、あるいは付加されたＤＮＡ分子で構成され
ているあらゆるものを包含するものである。

不明ｉ剖書に於いて、形質転換（導入）とは、受容宿主
細胞にＤ　Ｎ’　Ａを導入し、その遺伝子型を変化させ
、従って受容細胞（こ遺伝性の変化をもたらすことであ
る。

形質転換体とは、形質転換した受容細胞のことをいう。

リプレッサーは、組ｉ　Ｄ　Ｎ　Ａクローニングベクタ
ー上（こ位置し、宿主細胞の染色体中の致死遺伝子また
は条件的致死遺伝子の発現を抑制、阻１トする遺伝子で
ある。

機能的ポリペプチドとは、回収可能な生物活性を有する
全部外来性（ヘテロローガス）のポリペプチドまたは前
駆体、外来性ポリペプチドおよび同質（ホモローガス）
のポリペプチドの一部または全部からなる回収可能な生
物活性を有するポリペプチド、外来性ポリペプチドおよ
び特異的に切断し得る生物活性のない同種ポリペプチド
からなる回収可能な生物活性のない融合ポリペプチド、
またはその存在を検出し得る生物活性ポリベプチドをい
う。

融合遺伝子生産物とは、同種（ホモローガス）ポリペプ
チドの一部または全部と融合した回収可能な外来性ポリ
ペプチドをいう。

マーカーとは、染色体、組換ＤＮＡクローニングベクタ
ーまたはウィルス中の位置および機能が既に知られてい
る遺伝子または遺伝子の組み合せをいう。

Ａｐ　はアンピシリン耐性表現型を、Ａｐ　　はアンピ
シリン感受性表現型を、ＴＣｒはテトラサイクリン耐性
表現型を、そしてＴｃ　はテトラサイクリン感受性表現
型をそれぞれ意味する。

既述した様に１本発明は組換ＤＮＡで暗号化されている
生産物を生産する培養を増殖するのに使用することがで
きる。有効な選択系がないと、この様な培養中の細胞の
多くは所望のプラスミドを失ない、従って所望の生成物
の生産が著しく減少する。本発明は、培養内の実質約０
こ全ての生存細胞が組換えＤＮＡクローニングベクター
を含有することおよび、より多量の機能的ポリペプチド
が（１１） 証するものである。従って本発明は、プラスミドの分離
かないこと、遺伝子発現のレベルが強化されていること
、およびこの方法を実施した場合、非改良方法と比較し
て、有意に多量の機能的ポリペプチドが生産されること
などの点で特に有利であり、優れたものである。

本発明は、合成が組換えＤＮＡクローニングベクターに
よって決定されるあらゆる物質の生産番こ使用し得る点
で特（こ万能のものである。好ましい組換えＤＮＡクロ
ーニングベクターはプラスミドであるが、バクテリオフ
ァージや、本発明を例示するのに有用なその他のベクタ
ーも、本発明で使用し得ることは当業者には明らかであ
ろう。本発明の有用性は機能的ポリペプチドを発現する
償伝子に依存するものではないので、１種若しくはそれ
以上の商業的価値のある遺伝子を持った組換え株を使っ
ても本発明を実施することができる。さら番こ、既述し
た遺伝子発現の増強は、特定の生産物遺伝子に限られる
ものではない。この様に、本（１２） 発明の改良法は、組換えＤＮＡ技術を使ってあらゆる機
能的ポリペプチドまたはその他の遺伝子生成物を生産す
るの（こ有用である。

組換えＤＮＡ宿主細胞を安定化させ、かつ保持するため
に、細胞の自滅を応用することを例示するために、バク
テリオファージλとＥ、Ｃｏ、ｇｉ（大腸菌）Ｋ１２の
相互作用を利用することにする。

バクテリオファージλは　Ｅ、Ｃｏ１１　Ｋ１２に感染
する際、２つの互い（こ排他的なサイクルのいづれかに
従う穏和バクテリオファージである。溶菌相に於いて、
バクテリオファージＤＮＡは自発的番こ複製し、バクテ
リオファージ成分の合成及び組み立てを指揮し、成熟バ
クテリオファージの放出と共に細胞を死滅させる。溶原
Ｆ目に於いては、バクテリオファージはプロファージと
して宿主の染色体内に統合され、染色体上のマーカーと
して復製し、バクテリオファージ成分の＆、６をブロッ
クする。バクテリオファージ遺伝子、λＣ■　は、溶原
状態を維持し、バクテリオファージ成分およヒ成熟の遺
伝子の発現をブロックするリプレッサーを暗号化してい
る。もしリプレッサーが不活性化されたり細胞から除去
されると、このプロファージは染色体から分離し、溶菌
サイクルに入り、細胞を死滅させる。欠損λｃ■遺伝子
を持ったバクテリオファージは、機能的リプレッサーを
別のソースから学えないと溶原状態を維持することがで
きず、細胞を死に至らしめる。本発明に例示する態様で
は、λＣｌ９０がリプレッサー依存性プロファージとし
て使用され、制限フラグメントに含まれ、組換えＤＮＡ
クローニングベクターにクローンされるｃＩ遺伝子が機
能的リプレッサーとして働いている。

更に詳しくは、本発明の有用性および改良された選択系
は、ｔｒｐＥ−インシュリンＡ鎖遺伝子を含んでいるプ
ラスミドＰ　ＩＡ７Δ４Δ１〜１．３　ｋ　ｂ　Ｅｃ。

ＲＩ−ＢａｍＨ■制限フラグメントを、新規なプラスミ
ドＰＰＲ１２にクローンすることによって示すことがで
きる。これは、プラスミドＰＰＲ１２〜、４ｋｂＥｃｏ
Ｒｉ−Ｂａｍｌ’−ＩＩ　セグメント（断片）を削除ス
ル様に行なう。プラスミドｐＩＡ７２４２１〜１．３ｘ
ｂ制限フラグメントの代りに、あらゆる所望のＤＮＡフ
ラグメントを使用することができるので、プラスミドｐ
ＰＲ１２は一般にベクターとして有用である。プラスミ
ドｐＰＲ１２は、バクテリオファージλＣｌ８５７１）
プレッサーを含んでいるプラスミドｐＰＲ３−，９ｋ　
ｂ　Ｐｓ　ｔ　ｌ−Ｈｌｎｃ［制限フラグメントをプラ
スミドｐ１３Ｒ３２２ｉこ挿入することにより、１１み
立てられる。プラスミドｐＰＲ３は、バクテリオファー
ジλＣｌ８５７の２．５ｋｂＢｇｌＵ　　フラグメント
をプラスミドｐ　ＩＢ７Δ＼４Ｚ、１の唯一の１３ａｍ
ＨＩ制限サイトイこ挿入することζこより組み立てられ
る。このバクテリオファージλｃ■８５７　の２．５ｋ
ｂＢｇ、ｇ■制限フラグメントは、ＣＩＩＪプレッサー
遺伝子を含むほか、ｒｅｘ遺伝子およびｃｒｏ遺伝子の
一部をも含んでいる。驚くべきことに、このＣＩＩ）プ
レッサー遺伝子含有制限フラグメントから、ｃｒ。

遺伝子およびｒｅｘ遺伝子の大部分を除去すると、遺伝
子発現が強化、増大し、機能的ポリペプチドの生産が著
しく増大する。本発明を例示するの番こ使用される特に
好適な、ｃｒｏおよびｒｅｘを除去しく１５） 、９　ｋ　ｂＰ　ｓ　Ｌ　■−１−１１ｎｃｌ制限フラ
グメントである。プラスミドＰＩＡ７Δ４Δ１、ｐＩＪ
３７Δ４Δ１．ｐＰＲ３およびＰＰＲ１２の制限サイト
および機能地図を添付の第１図〜第４図に示した（図中
、矢印は転写の方向を示している）。

プラスミドＰＩＡ７Δ４Δｌは、Ｅ、ｃｏｌｉトリプト
フアンプロモーヌー、抗生物質耐性マーカー、およびヒ
トインシュリンのＡポリペプチド鎖と融合したＥ、　ｃ
ｏｌｉＬｒｐ　Ｅ蛋白質の一部からなる継合遺伝子生産
物を発現する遺伝子を含んでいる。プラスミドＰＩＪ３
７Δ４Δ１は、ヒトインシュリンのＡポリペプチド鎖の
代りにＢポリペプチド鎖と融合したＬｒｐＥ蛋白質の一
部からなる融合ａ嵌子生産物を発現する遺伝子を含んで
いることを除けは上記のものと類似している。

プラスミドｐＩＬ７Δ４Δ１は、プラスミドｐＢＲ３２
２から導かれ、実施例ＩＡ−１に開示した方法で組み立
てられる。慣習により、記号「Δ」は削除を意味する。

従って、例えばプラスミドの機番こ（１６） 「ΔＥ　ｃ　ｏＲ■−Ｘ　ｂ　ａ　エゴ　と書かれたも
のは、ＥｃｏＲ４およびＸ　ｂ　ａ　Ｉ制限酵素サイト
間のヌクレオチド配列が、これらの酵素によって消化さ
れて除去されたプラスミドを意味する。簡略化のため、
削除を数字で表わすこともある。例えば親プラスミドｐ
ＢＲ３２２のテトラサイクリン耐性遺伝子の前のＥｃ。

ＲＩ認識サイトの最初の塩基対（ｂＰ）から開始して、
「Δ１」はｂｐｌ−３０（即ちΔＥｃｏＲ■−Ｈ１ｎｄ
■）を削除したことを意味し、従って、テトラサイクリ
ンプロモーター／オペレーター系を不能番こしたことを
意味する。「Δ２」は、ｂｐＪ−３７５（即ちΔＥｃｏ
ＲＩ−ＢａｍＨ■）の削除を意味し、従って、テトラサ
イクリンブロモ−ター／オペレーターとテトラサイクリ
ン耐性を暗号化している構造遺伝子の一部を除去したこ
とを意味する。「Δ４」は、ｔｒｐオペロンフラグメン
トかｂｂｐ　　９００−　１５００の削除、ｔｒｐＤポ
リペプチドの構造遺伝子の除去を意味する。

この〜１．３　ｋｂ　ＥｃｏＲ■−ＢａｍＨＩｔ　ｒｐ
　Ｅ−イア　シュリンＡ鎖遺伝子を含んでいるプラスミ
ドｐＩＡ７Δ４Δ工の制限フラグメントを、プラスミド
ｐＰｉ１１２の〜４、７　ｋｂＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨ：
［制限フラグメント（以下、ＰＰＲ１２Δ２という）に
クローニングすると、新規プラスミドＰＰＲ１７が得ら
れる。このプラスミドｐＩＡ７Δ４Δｌ〜１．３　ｋ　
ｈ　Ｅ　ｃ　ｏＲニーＢ　ａｍｌｌ　Ｉ制限フラグメン
トはΔ２の部分を含んでおり、従ってその構造はΔ２か
らΔ１に復活している。プラスミドＰＰＲ１７は、バク
テリオファージλＣｌ８５７の〜、９　ｋｂ　Ｐｓ　ｔ
　ｌ−ｌ−１ｉｎｃ　［［制限フラグメントを含んでお
り、従って溶原化された宿主細胞中でのバクテリオファ
ージ・ラムダの溶菌活性を阻止する。さらに、プラスミ
ドｐＰＲ１７は、既知の他のλ（■遺伝子含有プラスミ
ドより有意に高いレベルで、前記ｔｒｐＦ、〜インシュ
リンＡ鎖融合遺伝子生産物を暗号化し、発現する。プラ
スミドｐＰＲ１７の制限サイトおよび機能地図は第５図
に示した（図中、矢印°゛は転写の方向を示している）
。

新規ｐＰＩＲ１７組換えプラスミドは、大腸菌、例えば
Ｅ、　ｃｏ、５ｉＫ１２２９４（Ｇｏｅｄｄｅ、５ら、
１９７９、Ｐｒｏｃ、Ｎａｐ、　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ
、Ｓ　、Ａ、　　７６　：　］　０６）、Ｅ、ｃｏｌｉ
　　Ｋ１２　　ＲＶ３Ｑ８（Ｍａｕｅｒら、１９８０、
Ｊ、Ｍｏ１．Ｊ３ｉｏ１．１３９：１４７〜］６１）、
Ｅ。

ｃｏｌｉ　　Ｋ１２　Ｃ６ＱＱ　　（Ｂａｃｈｍａｎ、
１９７２、Ｅａ（：ｔｅ−ｒｉｏｌ、　Ｒｅｖ、　　３
６　：　５２６〜５５７　）、Ｅ、ｃｏｌｉＫｌ、２　
　Ｃ６Ｃ６０ＱＲＫ−＝（ＣｈａｎｇおよびＣｏｈｅｎ
。

１９７４、Ｐｒｏｃ、Ｎａ５Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、７１　
：１Ｑ３Ｑ−１，０３４）などの形質転換に使用するこ
とができる。こうして得られた株は、機能的ＣＩＩＪプ
レツサーを産生じないバクテリオファージλ、例えばバ
クテリオファージλＣｌ９０で溶原化することができる
。組み立てられた株Ｅ、　ｃｏｌｉ　Ｋ１２２ｇ４λＣ
ｌ９０／ｐＰＲ１７、Ｅ、　ｃｏｌｉ　Ｋ１２ＲＶ３０
ＢλＣＩ　９０／ＰＰＲＩ　７、Ｅ、　ｃｏｌｉ　Ｋｌ
　２ｃ５ＱＱλｃ■９０／ｐＰＲ１７およびＥ、　Ｃｏ
　Ｉ　＋　Ｋ　ｌ　２ｃ６００ＲＫ−Ｍｋ−λＣＩ　９
Ｃ／Ｐ　ＰＲ１７はｐＰ’Ｒ１７プラスミドの保持が必
要であるが、組み立てられた株Ｅ、ｃｏｌ　ｉＫ　１．
２２９４／ｐＰ’Ｒ１７、Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｋ１２　ＲＶ
３Ｑ３／ｐＰＲ１７、Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｋｌ　２・Ｃ６Ｑ
Ｑ／ｐＰＲ１７、およびＥ　、　ＣＯＩ　＋　　Ｋ　ｌ
　２　Ｃ６００Ｒｘ　ＭＫ　／ｐＰＲ１７は、このプラ
スミドがなくても同様に生きのびる（１９） ことができる。株中のプラスミド保持を比較すると、本
発明の株の実質的に全ての生存細胞が所望のプラスミド
を含んでいることがはっきりとわかる。さらに、このＥ
、ｃｏｌｉ　Ｋ１２２９４λＣｌ９０／ｐＰ’Ｒ］７、
　Ｆ、、ｃｏｌｉ　Ｋ１２　　ＲＶ３０８λＣｌ９０／
ｐＰＲ］７、　Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｋｌ　２　０６００λＣ
ｌ９０／ｐＰＲ］７、およびＥ、ｃｏｌｉ　Ｋｌ　２Ｃ
６ＱＱＩζに−ＭＫ−λＣｌ９０／ｐＰ］（１７株は、
ｐＰＲ１７プラスミドを保持しているばかりではなく、
所望の融合遺伝子生産物を産生ずる。

本発明の改良選択系および有用性は捷だ、ｔｒｐＥ−イ
ンシュリン１３鎖遺伝子を含むプラスミドｐＩＢ７Δ４
Δｌ　〜１，３ｋｂ　　ＥｃｏｌＲｉ−Ｂａｍｉ（■制
限フラグメントを、プラスミドＰＰＲ］７＋こついて記
載したものと同じ方法で、プラスミドｐＰＲ１２）こク
ローニングすることによっても例示することができる。

プラスミドｐＩＢ７Δ４Δ１は、ｐＩＡ７Δ４Δ１番こ
ついての記載と類似の方法で、プラスミドｐ　Ｂ　Ｒ３
２２から誘導される。プラスミドＰＩＢ７Δ４Δ１の構
造に一ついては実施例２て述べる。

（２０） 前記〜］−，３ｋｈＥｃｏＲ■−Ｂａｍ　ＨＩ　ｔｒｐ
　Ｅ　−インシュリンＢ鎖遺伝子を含有している、プラ
スミ１’　ｐ　Ｔ　Ｊ３７Δ４Δ１　の制限フラグメン
トを、プラスミドｐＰＲ］２の〜４．７　ｋｂ　Ｅｃｏ
ＲＩ−Ｂ　ａｍ　Ｈ４制限フラグメントにクローンする
と、新規プラスミドｐＰＲ１８が得られる。プラスミド
ｐＰＲ１８はバクテリオファージλＣＩ　８５７の〜、
９　ｋ　ｂ　ｐ　ｓ　ｔ　ｌ−Ｈ１ｎｃ■制限フラグメ
ントを含んでおり、溶原化された宿主細胞中でのバクテ
リオファージ・ラムダの溶菌活性を阻害する。更に、プ
ラスミドｐＰＲ１８は、既知の他のλｃＩ　　遺伝子含
有プラスミドより有意ニ高いレヘルで、前記ｔｒｐＥ−
インシュリンＢ鎖融合遺伝子生産物を暗号化し、発現す
る。プラスミドｐＰＲ１８の制限サイトおよび機能地図
は第６図に示した（図中、矢印は転写の方向を示してい
る。）。

新規Ｐ　Ｐ　１’！−１８Ｍｌ換えプラスミドを大腸菌
、例えハＥ、　ｃｏｌｉ　Ｋｌ　２２９４、Ｅ、　ｃｏ
ｔ　ｉ　Ｋ　１２　ＲＶ３０８、Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｋｌ　
２Ｃ５ＱＱ、Ｅ、　ｃｏｌ　ｉ　Ｋ　ｌ　２Ｃ５ＱＱＲ
Ｋ−Ｍｌ（−などに入れて形質転換することができ、得
られた株を機能的ＣＩＩＪプレツサーを産生じないバク
テリオファージλ、例えばバクテリオファージλＣｌ９
０で溶原化することができる。溶原化したｐＰＲ］　７
含有株について既述した様番こ、組み立てられたＥ、ｃ
ｏｌｉ　Ｋ１２　２９４λＣｌ９０／ｐＰＲ１８、Ｅ、
ｃｏｌｉ　Ｋ１２　ＲＶ３Ｑ８λｃＩ９Ｑ／ｐＰＲ１８
、Ｅ、　ｃｏｌｉ　Ｋｌ　２　Ｃ６００λＣｌ９０／ｐ
ＰＲＩＢおよびＥ、ｃｏｌ＋　Ｋｌ　２　Ｃ６００ＲＫ
　ＭＫ−λＣ■９０／Ｐ　Ｐ、ＲＩ　８株は、ｐＰＲ１
８プラスミドの保持を必要とするが、−万、組み立てら
れた株Ｅ、ｃｏｌ　１Ｋ１２　２９４／ｐＰＲ１８、Ｅ
、ｃｏｌｉ　Ｋ１２　　ＲＶ３０Ｂ／ｐＰＲ１８、Ｅ、
ｃｏｌｉ　Ｋ１２　　Ｃ６ＱＱ／ｐＰＲ１８およびＥ、
　ｃｏｌ　ｉＫ　ｌ　２Ｇ（３Ｑ　Ｑｌ（ｘ−Ｍｙ、　
／　ｐ　Ｐ　Ｒ１８はこのプラスミドを必要とせず、こ
のプラスミドなしで同様に生存し続けることができる。

株中のプラスミド保持を比較すると、本発明の株の実質
的に全ての生存細胞が所望のプラスミドを含んでいるこ
とがはっきりとわかる。更に、このＥ、　ｃｏＪ　１Ｋ
１２　２９４λｃＩ９０／ｐＰＲ１３、Ｅ、ｃｏｌｉ　
Ｋｌ　２ｋｖ３０８λＣ■９０／ＰＰＲ１８、Ｅ、　ｃ
ｏｌｉ　Ｋ１２　　Ｃ６００λｃＩ９０／ｐＰＲコ８お
よびＥ、　ｃｏｌｉ　Ｋ１２（’＋５ＱＱＲＫ−ＭＩ（
−λＣｌ９０／ｐＰＲＩＢ株は、それらのプラスミドを
保持しているばかりでなく、所望の融合遺伝子生産物を
産生ずる。

新規プラスミドｐＰＲ１２は、種々の宿主細胞、例えば
Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｋ１２　　Ｃ６ＱＱＲＫ−ＭＫ−に入れ
ることができる。得られた株を、プラスミドｐ　Ｐ　Ｒ
１７およびｐＰ］え１８形質転換体の場合と同様にして
、溶原化し、このプラスミドなしには生存できない株を
つくることができる。即ち、組み立てられた株、Ｅ、ｃ
ｏｌ　ｈ　Ｋ　１２　　Ｃ［３ＱＱＲＫＭｘ−λＣＩ　
９０／ｐＰＩＲ］　２は、ｐＰＲ１２プラスミドの保持
が必要であるが、−万、組み立てられた株Ｅ、ｃｏｌｉ
Ｋ１２Ｃ６００ＲＫ−ＭＫ−／Ｐ　Ｐ　Ｒ１２はこのプ
ラスミドがなくても同様（こ生存し続けることができる
。株中のプラスミド保持を比較すれば、本発明に係る株
の実質的に全ての生存細胞が所望のプラスミドを持って
いることがはっきりとわかる。

本発明を例示するために使用したλＣｌ８５７１Ｊプレ
ツサー遺伝子は温度に敏感であり、３８〜４４°Ｃ（２
３） 捷たはそれ以上で不活性化される。従って温度が３８〜
４４°Ｃになると、本発明によって宿主細胞株に導入さ
れたラムダ−プロファージの溶菌サイクルが誘発されて
細胞が溶解する。容易ζこ理解されるであろうが、宿主
細胞の溶菌を引き起こす致死マーカー捷たは条件的致死
マーカーを抑制する温度感受性リプレッサーを使用し、
欠いでその宿主細胞を、リプレッサーを不活性化する温
度で培養すると、そして条件的致死マーカーの場合は宿
主細胞を培養し得る温度範囲外の温度で培養すると、本
発明に係る改良選択法は、細胞内生産物を精製するため
の、簡単かつ容易な、そして経済的な溶菌法となる。

例示した様に、本発明では致死染色体マーカーを抑制す
るのに、プラスミド担持遺伝子を使用する。＃！胞の選
択は、プラスミド上のレプリコンおよび他の遺伝子には
依存せす、本発明の好ましい実施態様ではバクテリオフ
ァージλＣＩ　８５７の〜、９　ｋｂ　ＰｓｔＩ−Ｈｉ
ｎｃｌｌ　＋４　含有制限フラグメントを使用している
が、機能的リプレッサーを産生ず（２４） るその他のあらゆるバクテリオファー９２株の〜、９　
ｋｌ〕ＰｓｔＪ−Ｈｉｎｃｌｌ　ｃ■含有制限７９グメ
ントも使用することができる。更に、本発明を例示する
ために使用されたプロファージはλＣｌ９０ミューチー
ジョンをもっており、機能的λＣエリフレッサーを産生
じないが、その他のバタテリオファージλミュータント
（突然変異体）も、機能的ＣＩＩＪプレツサー遺伝子を
持っていなければ、使用することができる。容易に理解
されようが、この様なミュータントは、病原状態を保持
するために、他のリプレッサーソースを必要とする。

本発明の選択法により機能的ポリペプチドの発現を増強
させることができ、有用な種々の生産物を発現するプラ
スミド担持遺伝子を持った宿主細胞に適用することがで
きる。例えば、プラスミドの担なっている遺伝子は、天
然の遺伝子、天然にない遺伝子、または一部が天然の遺
伝子であり一部が合成のあるいは非天然の遺伝子からな
るものであってもよい。具体的には、本発明はヒトプレ
プロインシュリン、ヒトプロインシュリン、ヒトインシ
ュリンＡ鎖、ヒトインシュリンＢ鎖、ヒト成長ホルモン
、非ヒト成長ホルモン、非ヒトインシュリン、ヒトイン
ターフェロン、非ヒトインターフェロン、ウィルス抗原
、ウロキナーゼ、アラゆるペプチドホルモン、あるゆる
酵素、あらゆるポリペプチド、および実質的に全ての、
研究的または商業的価値を有するものを暗号化している
遺伝子を担なっているプラスミドを含有する細胞を選択
し、そして維持するのに使用することができる。

本明細書に記載した本発明の具体的な実施態様では、プ
ラスミドの複製および遺伝子生産物の発現は、それぞれ
ｐＭＢｌからのレプリコン（ＢｏｌｉｖａｒＬｉｆｅ　
Ｓｃｉ、　２５：８０７　９１８．１９７９参照）およ
びｔｒｐプロモーターによって決定される。その他のレ
プリコンおよびプロモーターも、それらがＥ、ｃｏｌｉ
　Ｋ１２　内で機能し、そして使用している特定のリプ
レッサーに感受性を有しない限り、使用することができ
る。どの様なレプリコンおよびプロモーターがＥ、ｃＯ
ＩｉＫ１２内で機能するか、そして特定のリプレッサー
に感受性を持たないかは、当業者の知るところであり、
あるいは容易に決定され得るものである。その他のレプ
リコンの例としては、Ｃｏ１Ｅｌ、ＮＲＩ、　ｉｉ２、
　ＲＫ６、ｐｓｃｌ　０１、　ＲＰｌ、ＲＰ４、　Ｆな
どからのレプリコン、Ｆ、、　ｃｏｌｉ　Ｋ１２内で複
製するバクテリオファージのものなどを挙げることがで
きるが、これらに限定されるものではない。−万、その
他のプロモーターの例としては、Ｉａｃプロモーター、
リポプＯティンプロモーター、リボゾーム蛋白質またハ
ＲＮ　Ａプロモーター、およびその他のあらゆるプロモ
ーターが含まれる。その他のレプリコンおよびプロモー
ターを組み立て得ることは、当業者の知るところである
。

Ｅ、　ｃｏｌｉ　Ｋｌ２は、バクテリオファージλにと
って好適な宿主であるという事実のほか、この株につい
ての遺伝学的および生化学的情報が豊富であるので、こ
の株は本発明の目的に好適である。

Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｋｌ２ＲＶ３Ｑ８株は最も好ましいもの
であるが、本発明は１つの属、種、あるいは株に限定さ
れるものではなく、あらゆるＥ、ｃｏｌｉ（大腸菌）あ
るいは、バクテリオファージλが溶原化を起こし、機能
的リプレッサーをクローンし得るその他の細胞も使用す
ることができる。

本発明の全ての実施態様の共通した特徴は、それらが培
地組成の影響を受けないということである。従って、本
発明においては、生産性を改良するために広範囲に発酵
操作を変えることができる。

以下の実施例は本発明を例示し、その好ましい実施態様
を示すものである。必要に応じて本発明を実施するため
の実際の手法および説明をつけた。

実施例１　プラスミドｐＩＡ７Δ４Δ１の組み立てＡ、
７でノミドｐＢＲＨｔｒｐの組み立てプラスミドｐＧＭ
ｌは、欠失部ΔＬＥ１４１４（Ｍｉｏ−２ｚａｒｉら、
１９７８、Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、１４５７−
１４−６６）を有するＥ、　ｃｏｌｉ　　）リプトファ
ンオペｏンを持っており、従って、”Ｐｌ＋ｌモロター
ーオペレーター系の支配下に、【ｒＰＤポリペプチド全
体、と、ｔｒｐｌＪ−ター配列の最初の６個のアミノ酸
とｔｒｐＥポリペプチドの最後のはＸｌ／３（以降（２
７） 合わせてＬＥという）からなる融合蛋白質を発現する。

Ｅ、　ｃｏｌｉ　Ｋｌ　２　　Ｗ３　ｌ　ｌ　Ｑ　　ｔ
ｎａ　２ｔｒｐ　−Δ１０２／ｐＧＭ１はアメリカン・
タイプ・カルチュア・コレクションに寄託されており（
ＡＴＣＣＮ。

３１６２２）、この株から、以下に述べる方法でｐＧＭ
ｌを簡単に収り出すことができる。

このプラスミド約２０μｇを、このプラスミド＊ を５ケ所（サイト）で切断する制限酵素　Ｐｖｕ■ｌ：
ると、後に、Ｅｃｏ’ＲＩサイトを持ったプラスミドに
クローンするためのＥｃｏＲ■開裂サイトができる。

ｐＧＭｌから得たＤＮＡフラク′メント２０１１ｇ　を
Ｔ４ＤＮＡリガーゼ緩衝液（２０ｍＭ　＋−リス、ｐＨ
７，６，０゜５ｍＭＡ、ＴＰ、ｌ　ＱｍＭ　ＭｇＣｌ２
．５ｍＭジチオトレイット）２０μβ中、５−燐酸化含
酸オリゴヌクレオチドＰＣＡＴＧＡＡＴＴＣＡＴＧ　　
２　Ｑ　Ｑピコモルの存在下、４°Ｃで一夜、１０単位
のＴ　４　ｏ　Ｎ　Ａリガーゼて処卯した。次いでこの
溶液を７０゛Ｃて（２８） １０分間加熱してリゲーション（結紮）を停止させた。

このリンカ−をＥｃｏＲＩ　消化（こよって開裂させ、
ＥｃｏＲＩ　　末端を持ったフラグメントを５％ポリア
クリルアミドゲル電気泳動法（以降、ＰＡＧＥという）
によって分離した。先づエチジウムプロミドで着色し、
次いで紫外線でフラグメントの位置を確かめ、該当箇所
のゲル部分を切断することにより、３．１個の最も大き
なフラグメントをゲルから分離した。各ゲルフラグメン
トを、０．１ｘＴＢＥ３００μｅで、透析袋＋ｃ入ｉ、
０．１　ｘｒＥＥＩｌｉ液（ＴＢＥ緩衝液は水１１中、
トリス塩基１０．８ｇｍ、ホウ酸５．５　ｇｍ、　Ｎａ
２ＥＯＴＡ　Ｏ，０９ｇｍを含む）中、１００ｖで１時
間電気泳動にかけた。水溶液を透析袋から集め、フェノ
ール抽出、クロロホルム抽出し、塩化ナトリウムについ
て帆２Ｍとした。次いでエタノール沈澱の後、ＤＮＡを
水番ことった。

ＥｃｏＲＩ粘着性末端を持ったこのｔｒｐプロモーター
／オペレーター含有遺伝子を、後記の方法で同定シた（
これは、プロモーター／オベレーグーの挿入により、テ
トラサイタリン耐性になるテトラサイクリン惑受性プラ
スミドへの７ラグメントの挿入についての説明も含むも
のである）。以降、全てのＤＮＡフラグメントの分離は
ＰＡＣ，Ｅを用い、次いで上記の電気溶出法によって行
なった。

８前記の制限酵素およびその他の酵素は、Ｂｅｔｈｅｓ
ｄａ　　Ｒｅ５ｅｒｃｈ　　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ
　　Ｉｎｃ、（Ｂｏｘ（３Ｑｌ（）　　Ｒｏｃｋｕｉｌ
ｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ　　２０８５０）；１３ｏｅｈ
ｒｉｎｇｅｒ　　Ｍａｎｎｈｅｉｍ　　Ｂｉｏｃｈｅｍ
ｉｃａｌｓ（７９４］　　Ｃａｓｔｌｅｗａｙ　　Ｄｒ
ｉｖｅ　　Ｐ、Ｏ，Ｂｏｘ５Ｑ８１（３１ｎｄｉａｎａ
ｐｏｌｉｓ　　、Ｉｎｄｉａｎａ　４６２５０）；およ
びＲｅ５ｅａｃｈ　　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ　　Ｍｉｌｅｓ
　Ｌａｂｏｒａｔｏ−ｒｉｅｓ　　Ｉｎｃ、（ＥＬＫｈ
ａｒｔ、Ｉｎｄｉａｎａ　　４５５１５　）から容易火
入子することができる。

および増幅 プラスミドｐＢＲＨ１（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚら、１９７
９、Ｎｕｃｌｅｉｃ　　Ａｃ１ｄｓ　　Ｒｅ５ｅｒｃｈ
　６．３２６７〜３２８７）（３１） はアンピシリン耐性を発現する。そしてテトラサイクリ
ン耐性遺伝子も持っているが、それに関連するプロモー
ターが存在しないのでその耐性を発現しない。従って、
このプラスミドはテトラサイクリン感受性である。この
ＥｃｏｉｌＪサイトにプロモーター／オペレーター系を
導入することにより、このプラスミドをテトラサイクリ
ン耐性にすることができる。

プラスミドｐＥＲ）月をＥｃｏＲＩで消化した。この酵
素をフェノール抽出、次いでクロロホルム抽出により除
去し、次いでこのＤＮＡを水中、エタノール沈澱させて
回収した。得られたＤＮＡ分子を、別々の反応混合物中
、実施例ＩＡで得た３種の□ＮＡフラグメントのそれぞ
れと混合し、既述した様にＴ　、４　Ｄ　Ｎ　Ａ、’ｌ
Ｊガーゼで結合させた。この反応混合物中に存在するＤ
ＮＡを使って、受容能力のあろＦ、、　ｒｎｌｉ　＋＜
　１２１ｆＫ　２　ｎ　４　（ｌ（ａｒｋｍａｎら、１
９７６、Ｐｒｏｃ、　ＮａＬ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、
ＵＳＡ　　７３：４１７４−４１９８、ＡＴＣＣＮｏ、
３１４４６）を、標準的な方法（Ｉ−１ｅｒｓｈｆｉｅ
ｌｄら、１９７４、Ｒｒｏｃ。

（３２） Ｎａｔ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　　７１　：　３４
５５−３４５９）番こよって形質転換し、この細菌をア
ンピシリン２０μｇ　／ｍｌおよびテトラサイクリン５
μｇ／ｍｌを含有スルＬＢ７”レ−）　＜　Ｍｉｌｌｅ
ｒ、１９７２　）上に置いた。

いくつかのテトラサイクリン耐性コロニーを選択し、そ
のプラスミドを分離し、これをｐＢＲＨｔ　ｒ　ｐと命
名した。所望のフラグメントの存在は、制限酵素分析に
より確認した。プラスミドｐＥＲＨｔｒ　ｐはβ−ラク
タマーゼを発現し、アンピシリン耐性ヲ示シ、【ｒＰプ
ロモーター／オペレーターヲ含ムＤＮＡフラグメントを
含有している。このＤＮ’Ａフラグメントは、ｔｒｐリ
ーダーの最初の６個のアミノ酸とｔｒｐＥポリペプチド
のはソ最後の１７３の融合からなる第１蛋白質（ＬＥと
いう）、ｔｒｐＤポリペプチドの最初のはソ半分に相当
する第２蛋白質（Ｄという）、およびテトラサイクリン
耐性遺伝子によって暗号化されている第３蛋白質、をも
暗号化している。

Ｃ，プラスミドｐ　Ｓ　０Ｍ７Δ２の組み立てプラスミ
ドｐ１３ＲＨｔｒｐをＥｃｏＲ■制限酵素で消化し、得
られたフラグメントをＰＡＧＥおよび電気溶出で分離し
、ＥｃｏｌｊＩで消化したプラスミドｐｓＯＭｌ　ｌ　
（Ｉｔａｋｕｒａら、１９７７、Ｓｃｉ、　ｌ　９３　
：１０５６、イギリス国特許出願公告第２．００７．６
７６　Ａ号）と混合した。この混合物をＴ４ＤＮＡリガ
ーゼで結合させ、得られたＤＮＡを、既述した方法でＥ
、　ｃｏｌｉ　Ｋ１２株２９４に導入（形質転換）した
。

形質転換菌をアンピシリン含有プレート上で選択し、得
られたアンピシリン耐性コロニーをコロニー雑種形成法
（Ｇｒｕｅｎｓｔｅｉｎら、１９７５、Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　　７２　’
　３９５１−３９６５）によってスクリーニングした。

上記操作において、ｐＢＲＨｔｒｐから分離しｐ３２を
用いて放射活性標識を施したＬｒｐプロモーター／オペ
レーター含有フラグメントをプローブとして用いた。

いくつかのコロニーがコロニー雑種形成によって陽性で
あることがわかり、従って選択された。プラスミドＩ）
ＮＡを分離し、挿入フラグメントの位置を酵素Ｂｇｌ　
ｌ］および、ｔ３ａｍｌ−ＩＪを用いた二重消化で、制
限分析によって決定した。適切な位置番こｔｒｐプロモ
ーター／オペレーターフラグメントを持った所望のプラ
スミドを含有しているコロニーを、アンピシリン１０μ
ｇ／ｍｌを含有しているＬＤ培地（Ｍｉｌｌｅｒ、　１
９７２　）　　で培養した。この所望のプラスミドをｐ
ｓＯＭ７Δ２と命名し、次の工程（こ使用した。

Ｄ、プラスミドｐＴｒｐ２４の組み立て１、その暗号鎖
の５および３末端にそれぞれＥｇｌ■およびＥｃｏＲＩ
制限サイトを持ったＬＥポリペプチドの遠位領域のコド
ンを含有する遺伝子フラグメントの組み立て プラスミドｐ　Ｓ　ＯＭ　７Δ２をＨｉｎｄ■消化し、
次いでラムダエキソヌクレアーゼ（５→３エキソヌクレ
アーゼ）で、ＬＥ暗号領域内のＢｇｌ■制限サイトを越
えて消化する採番こ選んだ条件下で消化した０Ｈｉｎｄ
ｌｌｌ−消化ｐｓＯＭ７Δ２　（７）約２０８ｇ　ヲＨ
衝Ｋｆ−（２０ｍＭグリシン緩衝液１．”Ｈ９，６，１
ｍＭＭｇ”２１ｍＭβ−メルカプトエタノール）に溶解
した。得られた混合物をラムダエキソヌクレアーゼ５単
位で、（３５） ６０分間室温で処即した。得られた反応混合物をフェノ
ール抽出、次いでクロロホルム抽出した後エタノール沈
澱させた。

ＬＥ遺伝子フラグメントの遠位末端にｌ１ｃｏＲＩ残部
をつくるために、改良ホスホトリエステル法（Ｃｒｅａ
ら、１９７８、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ。Ａｃａｄ、Ｓｃｉ。

ＵＳＡ７５：　５７６５）　　によってプライマー３２
　ｐ　ＣＣＴ　Ｇ　Ｔ　Ｇ　ＣＡ　Ｔ　Ｇ　Ａ　Ｔを合
成し、ラムダエキソヌクレアーゼ消化により得たＬＥ遺
伝子フラグメントの１本鎖末端と雑種形成させた。この
雑種形成は、プラスミドｐｓＯＭ７Δ２のラムダエキソ
ヌクレアーゼ−処＠Ｈｉｎｄｌｌｌ　消化生成物２０μ
ｇを水２０μβに溶解し、これを上記の５−燐酸化オリ
ゴヌクレオチド約８０ピコモルを含有する溶液６μ看□
　と混合すること番こより行なった。この合成フラグメ
ントをＬＥ暗号配列の３末端に交配（雑種形成）シ、Ｌ
Ｅフラクメントの残りの１本鎖部分を、ｄＡＴＰｌｄＴ
ＴＰｌｄＧＴＰおよびｄ　ＣＴＰを使ってＫｌｅｎｏｗ
ポリメラーゼ■によって埋めた。

Ｋｌｅｎｏｗポリメラーゼ■は、Ｄ’ＮＡポリメラーゼ
（３６） ■の蛋白質分解開裂によって得たフラグメントでソヌク
レアーゼ活性（ｅｘｏｎｕｃｌｅｏｌｙｔｉｃ　ａｃｔ
ｉｖｉｔｙ）を持っているが、親酵素の持つ５→３エキ
ソヌクｖ７−ゼ活性は持っていなイ（Ｋｏｒｎｂｅｒｇ
　、　１９７４、Ｗ。Ｈ，ＦｒｅｅｍａｎおよびＣｏ、
、ＳＦｏ、９３）。

反応混合物を５０°Ｃに加熱し、徐々番こ１０°Ｃに冷
却した後、Ｋｌ　ｅｎｏｗ酵累４μβを添加した。案温
で１５分間、次いで３７°Ｃで３０分間インキュベート
した後、０．２５モルのＥＤＴＡ　５μβを加えて反応
を停止させた。反応混合物をフェノール、次いでクロロ
ホルム抽出し、エタノールで沈澱させた。次いてＤＮＡ
を制限酵素ＢｇｌＵで開裂し、そのフラグメントをＰＡ
ＧＥで分離した。ゲルから得られた放射能写真から、約
４７０　ｂｐの期待した長さの３２ｐ標識フラグメント
を検出し、これを電気溶出により回収した。概説した様
に、このフラグメントＬＥ　（ｄ）は、プライマーのは
じまりと一致する鈍感末端（プラントエンド）とＢｇｌ
ｌ■末端を持っている。

２、プラスミドｐＴｈα１の組み立て チモｌ：／　７　ｙ　／１／７７　（ｔｈｙｍｏｓｉｎ
　ａｌｐｈａ　）　ｌの合成遺伝子をプラスミドｐＢＲ
３２２ｉこ挿入することによりプラスミドｐＴｈα１を
組み立てた。このチモシンアルファ１暗号ＤＮＡの合成
は、チモシンアルファ１遺伝子を示した第７図において
双頭矢印で示しである１６個のオリゴヌクレオチド（Ｔ
１からＴ１６）の合成およびそれらの結合からなる。

Ｎ末端にＭｅＥ　コドンＡＴＧを挿入し、５末端を、Ｅ
ｃｏＲ■　　とＥａｍＨｌで開裂されたプラスミド番こ
結合しやすい様に、１本鎖粘着末端でデザインした。

容易番こ理解される採番こ、この遺伝子の中央のＥｇβ
■サイトは、組換プラスミドの分析に役立つ。

オリゴデオキシリボヌクレオチドＴ１〜Ｔ１６は、完全
に保護されたトリデオキシリボヌクレオチド組み立てブ
ロックを使って、改良ホスホトリエステル法で合成した
。（ＩＬａｋｕｒａら、１９７７．５ｃｉｅｎｃｅ１９
８：１０５６およびＣｒｅａら、１９７８）。種々のオ
リゴデオキシリボヌクレオチドを以下の表１に示す。

（３９） 上記の合成は、第８図番こ示したフラグメントＴ１５の
合成法によって代表させることができる。この図には、
Ｔ１５の合成に使用される各種のヌクレオチドフラグメ
ントが数字で示しである。略号は以下の意味を持つ：　
ＴＰＳＴｅ＝２゜４．６−１リイソプ０ピルベンゼンス
ルホニルテトラゾール；Ｊ３ＳＡ＝ベンゼンスルホン酸
；ＴＬＣ−薄層クロマトグラフィー１ＨＰＬｃ−高速液
体クロマトクラフイー；ｏＭｒ＝４．４−ジメトキシト
リチル１ｃＥ＝２−シフ／エチル；Ｒ＝ｐ−／ｙロロフ
ェニル；Ｂｚ＝ベンゾイル；Ａｎ−アニソイル；１Ｂｕ
＝イソブチル；Ｐｙ−ピリジン１ＡｃＯＨ：酢酸；Ｅｔ
３Ｎ＝トリエチルアミン。

完全に保護されたトリデオキシリボヌクレオチド４（８
５■、０．０５ｍＭ）および２（１８０Ｆ’ｌ＆。

Ｑ、　ｌ　ｍＭ　）の５水酸基の位置を、それぞれ１０
および２０　ｙｔｔｌのクロロホルム／メタノール（７
／３（Ｖ／Ｖ））混液中、２％ＢＳＡで処理することに
より脱保護した。飽和重伏酸アンモニウム水溶液（２ｍ
ｌ）を加えて反応を停止させ、クロロホルム（４０） （２５πｌ）で抽出し、水（２ｘｌＯπｌ）で洗浄した
。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥し、少量（約５ゴ）
になるまで濃縮し、石油エーテル（３５〜６０°Ｃのフ
ラクション）を加えて沈澱させた。

無色の沈澱を遠心分離で集め、デシケーグーに入れて減
圧下で乾燥すると、それぞれ化合物６および８がそれぞ
れ得られた。いづれもシリカゲルＴＬＣで均一でアラた
（　ＭｅｒＫ５　Ｑ　Ｆ２５４、クロロホルム／メタノ
ール（９／１））。

トリマー１および３（それぞれ２７０ｑ、０６１５ｍＭ
；１４．５Ｗ、０．０７５ｍＭ）　を、ｌ−ＩＪ　工ｆ
　）ｙ−７ミン／ピリジン／水（１：３：１、Ｖ／ｖ、
１０＊Ｊ）で、２５分間室温で処理することにより、ホ
スホジエステル体５および７に変換した。試薬をロータ
リーエバポレータで除去し、残渣を無水ピリジン（３ｘ
ｌＯ＋／りを加えて繰り返し蒸発させることにより乾燥
した。トリマー８　（０，０５ｍＭ）とトＩＪマー７を
無水ピリジン（３ｍｌ）中、Ｔ’Ｐ　Ｓ　Ｔ　ｅ　（５
０■、０．１５ｍＭ）と混合し、この反応混合物を減圧
下、室温で２時間放置した。ＴＬＣ分析により、トリマ
ー８の９５％がヘキサマーに変換したことがわかった（
１０％水性硫酸を噴霧し、６０°Ｃで加熱することによ
りＤＭＴ基を検出して確認される）。水（１゜Ｏｍｌ　
）を加えて反応を停止し、減圧下で溶媒を留去した。ト
ルエンとの共沸によってピリジンを除去した後、トリマ
ー４および２について既述した様に、２％Ｂ　Ｓ　Ａ　
Ｃ８ｍｌ　）を用いてヘキサマーの５位を脱保護した。

生成物１０を、クロロホルム／メタノール（９８：２か
ら９５＝５（Ｖ／Ｖ）　　の段階的グラジェント溶出）
を用い、シリｊｙケｔＶカラム（Ｍｅｒｃｋ（３ＱＨ，
３，５Ｘ５（１７１１）で精製した。生成物１０を含む
フラクションを蒸発乾固した。

同様にして、トリマー５を６と結合し、この完全に保護
した生成物をシリカゲルで直接精製した。

後者の化合物を既述した様にトリエチルアミン／ピリジ
ン／水で処理して３末端を脱保護するとフラグメント９
が得られた。

最後に無水ピリジン（２ｍｌ）中、縮合剤としてＴＰＳ
”ｌ’ｅ（７５ｍ９、ｏ、２２ｓｍＭ）を用いてヘキサ
マー９と１０をカップリングさせた。反応終了後（室温
で４時間）、反応混合物をロータリーエバポレータにか
け、残渣をシリカゲルカラムにかけた。石油エーテルで
沈澱させると、生成物１１が得られた。これはＴＬＣに
おいて均質であった。化合物１１の１部（２Ｏｆｆ、＆
）をピリジン（０，５ｍｌ）に入れ、濃水酸化アンモニ
ウム処理（７ｍｌ、８時間、６０°Ｃ）、次いで８０％
酢酸中での処理（１５分、室温）により、完全に脱保護
した。酢酸を蒸発させた後、固状残留物を４％水酸化ア
ンモニウム水（Ｖ／Ｖ、　４ｍ１）　　＋？：、溶解し
、ｘ−ｙ−ルｘ−テｗ（３ｘ２　ｍｌ　）で抽出した。

水相を１〜２πを筺で濃縮し、１部をＩ−］　Ｐ　Ｌ　
Ｃにかけて化合物１２を精製した。主ピークに本目当す
るフラクション（影コ２゜００．Ｄ。２５４単位減プー
ルし、約５ｍｌに濃縮した。最終生成物１２ヲＢｉｏ　
−ｇｅｌ　ｐ−２により、２０％水性エタノールで溶出
することにより脱塩し、乾燥させ、水（２００μβ）に
再懸濁するとＡ２５４−１０の溶液が得られた。１２の
配列は２次元配列分析によって確認した。

（４３） ソマトスタチン（１ＴａＫｕｒａら、１９７７）、イン
ニリン（Ｇｏｅｄｄｅｌら、１９７９　）　ｂ　ヨＵ生
長ホ／ｌ／モン（Ｇｏｅｄｄｅｌ、Ｈｅｙｎｅｋｅｒ　
、ら、１９７９、Ｎａｔｕｒｅ２８１　：　５４４）に
ついて詳細番こ報告されている方法に従って、１６個の
合成オリゴヌクレオチドから、完全なデモシンアルファ
１遺伝子を組み立てた。Ｔ２からＴ１５　　’でのオリ
ゴヌクレオチド１０、ＩＩＺｇを、−１７、ｉ　　ポリ
ヌクレオチドキナーゼ（Ｇｏｅｄｄｅｌら、１９７９）
　　の存在下１，３２ｐ）−ＡＴＰ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌ
ａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ　）　　で定量的に燐酸化する
と約Ｉ　Ｃｉ　７ｍＭの比活性が得られた。放射能標識
フラグメントを２０％ポリアクリルアミド／７Ｍ尿素ゲ
ル電気泳動で精製し、溶出したフラグメン　　　トの配
列を、部分的蛇毒消化液の２次元電気泳動／ホモクロマ
トグラフィー（Ｊａｙら、１９７４、Ｎｕｃｌｅｉｃ　
　Ａｃ１ｄｓ　　Ｒｅｓ　、　１　：　３３１　）ｉこ
よって確認した。次の結合反応において、重重しくない
重合を最小限ζこするため薔こ、フラグメントＴ１とＴ
１６は脱燐酸化しなかった。発表されている方法（Ｇｏ
ｅｄｄｅｌら、１９７９）　　を使って、Ｔ４ＤＮＡリ
ガ（４４） −ゼにより、これらのオリゴヌクレオチド（各２μｇ）
を、４つのフラグメントの４つのグループに組み合わせ
た（第９図参照）。この反応生成物を、７Ｍの尿素を含
む１５％ポリアクリルアミドゲル上、ゲル電気泳動によ
って精製した（　Ｍａｘ　ａｍおよびＧ１１ｂｅｒｔ　
、　ｌ　９７７　、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ、　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、ＵＳＡ７１　：３４５５）。４つの単離した生
成物を結合させ、この反応混合物を１０％ポリアクリル
アミドゲル電気泳動によって分析した。デモシンアルフ
ァ１遺伝子のサイズ範囲のＤＮＡ（９３〜１０５ｂＰ）
を電気溶出した。

プラスミドｐＢＲ３−２２（０，５ｕ　ｇ　）をＢａｍ
ＨＩオヨヒＥｃｏＲＩ制限エンドヌクレアーゼで処理し
、フラグメントをポリアクリルアミドゲル電気泳動て分
離した。このゲルから電気溶出によって大きいフラグメ
ントを回収し、次いで結合させて合成りＮＡを組み立テ
タ（Ｇｏｅｄｄｅｌ　、　Ｈｅｙｎｅｋｅｒら、１９７
９）。

この混合物を使ってＥ、ｃｏｌｉＫ１２株２９４、ＡＴ
ＣＣ１ｋ３１４４６を形質転換した。形質転換混合物の
５％を２０μｇ／ｙｎｌのアンピシリンを含有するＬＥ
プレート上Ｏこ置いた。得られた４個のアンピシリン耐
性コロニーはテトラサイクリンに感受性を持っていた。

このことはテトラサイクリン耐性遺伝子内への挿入を暗
示している。これら４つのコロニーからのプラスミドを
分析した結果、いづれの場合もｐＴｈα１と命名された
プラスミドは（ａ）ｐ１３Ｒ３２２自身番こはなかった
８ｇｌｌｌサイト（第７図に示したチモシンα１の存在
を示す）および（ｂ）　Ｂ　ａｍＨ■／　Ｅ　ｃｏＲ■
開裂によって生成した約１０５塩基対のフラグメント、
を含んでいることがわかった。

プラスミドｐＴｈα１の組み立てルートを第９図に示し
た（同じ比率で描かれていない）。ここで、太い点は５
−燐酸エステル基を表わしている。

３、処理ｐＴｈσ１とＬＥ　（ｄ）フラグメントの反応
、　プラスミドｐＴｈα１　は、アンピシリン耐性を指
定している遺伝子、および、５暗号鎖末端においてＥｃ
ｏＲＩサイト内に、そして３末端においてＢａｍＨＩサ
イト内にクローンされたチモシンアルファ−１を指定し
ている構造遺伝子を含有している。このチモシン遺伝子
は１３ｇ１ｌｌ　　サイトをも含有している。前記の如
く調製したＬＥ’（ｄ）フラグメントを受は入れること
のできるプラスミドを調製するために、ｐＴＨα１をＥ
ｃｏｌＲＩ消化し、ｄＴＴＰおよびｄＡＴＰを用いてＫ
ｌｅｎｏｗポリメラーゼエ反応を行ないＥｃｏＲＩ残渣
を鈍感化（ｂｌｕｎｔ　）　Ｉ、た。

得られた生成物のＢｇｌｌ消化により、アンピシリン耐
性遺伝子および、相対する末端に、粘着Ｊ３ｇｌｌＪ残
渣と鈍感末端を有する直鎖状ＤＮＡフラグメントを作成
した。得られた生成物は、Ｂｇｌｌｌ粘着末端と鈍感末
端を含有する１、、Ｅ（ｄ）フラグメントと、Ｔ４リガ
ーゼの存在下で反応させることにより再環化し、かくし
てプラスミドｐＴｒｐ２４を得ることができる。こうす
ること番こより、鈍感末端結合が起る位置で、ＥｃｏＲ
Ｉサイトが再生される。

ＰＴｒＰ２４をＥｇｌｌｌ、次いでＥｃｏＲＩで消化し
、ＰＡＧＥおよび電気溶出を行なうと、３暗号末端に隣
接したＥｃｏＲＩ粘着末端およびＢｇｌｌｌ粘着末端を
持ったＬＥ　（ｄ）ポリペプチドを暗号化しているフラ
グメントが得られる。このＬＥ　（ｄ）　フラグメント
をプラスミドｐＳｏｍ７Δ２の１１ｇｌｌｌサイトにク
ローンすることができ、トリプトファンプロモーター／
オペレーターのコントロール下で発現されるＬＥポリペ
プチド／ソマトスクチン融合蛋白質を形成させることが
できる。そうするために、（１）トリプトファンプロモ
ーター／オペレーターカラ遠位のＥｃｏＲＪサイトを開
裂するためにｐＳｏｍ７Δ２を部分的にＥｃｏＲＪ　消
ｆじし、（２）適切にコドン読み取り枠（フレーム）を
維持し、Ｅ　ｃ　ｏ　ＲＩ開裂サイトを復活させるため
にプライマー配列を適切に選択することが必要である。

即ち、プラスミドｐｓｏｍ７Δ２（１６μｇ）を、２０
ｍＭ　）リス１．Ｔ−１７，５、５ｒｎＭＭｇ　Ｃ（！
　２．０．０２ＮＰ４０洗浄剤およびｌＱＱｍＭＮａＣ
，ｇを含有している・緩衝液２００μβに入れて希釈し
、ＥｃｏＲ（Ｑ。５単位で処理した。３７°Ｃで１５分
間処理した後、この反応混合物をフェノール抽出し、ク
ロロホルム抽出し、エタノール沈澱させ、次いでＢｇｌ
ｌｌで消化した。得られた比較的大きいフラグメントを
ＰＡＧｆ、次いで電気溶出により分離した。この〕（４
７） ラグメントは、ＬＥポリペプチドの近位末端のためのコ
ドンｒ　ＬＥ　（Ｐ）　Ｊ、即ちＢｇｌ■サイトから上
流のコドンを含んでいる。次いでこのフラグメントを、
Ｔ４ＤＮＡＩＪガーゼの存在下で上記ＬＥ（ｄ）フラグ
メントと結合させてプラスミドｐＳｏｍ７Δ２Δ４を調
製し、これをＥ、ｃｏｌｉ株２９４に形質転換導入する
ことにより、トリプトファンプロモーター／オペレータ
ーのコントロール下で、完全に復元されたＬＥポリペプ
チドとソマトスタチンからなる融合蛋白質が効率よく生
産される。

ブー３７．ミドｐＢＲ３２２をＨｉｎｄｌｌｌ消化し、
突出したＨｉｎｄｌｌ　末端を５１ヌクレアーゼで消化
した。

このＳ１ヌクレアーゼ消イしは、Ｈｉｎｄｌ’［開裂ｐ
ＢＲ３２２（１０μｇ）を、Ｓ　１　緩１ｉ１ｆ［（０
，３Ｍ　Ｎａ（４゜ｌ　ｒｎ　Ｍ　Ｚ　ｎ　Ｃ（２２，
２５ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４，５）３０μβ中、Ｓ
１ヌクレア一ゼ３００単位を用いて１５°Ｃで３０分間
処理することにより行（４８） なった。３０ＸＳ１ヌクレアーゼ停止／３液（０，８Ｍ
トリス塩基、５　Ｑ　ｍＭ　ＥＤＴＡ）　１　ｔｔｌ　
を加えることにより反応を停止させた。この混合物をフ
ェノール抽出、クロロホルム抽出し、エタノール沈澱を
行ない、次いで既述した採番こしてＥｃｏＲＪ消化した
。ＰＡＧＥ処理、次いで電気溶出することにより得たフ
ラグメントは、その暗号類がヌクレオチドチミジンで始
まる鈍感末端およびＥｃｏＲＩ粘着末端を含んでいる。

チミジンで始捷る５ｌ−１１４（ｅＨｉｎｄｌｌ残渣を
Ｋｌｅｎｏｗポリメラーゼ■処理した一’Ｂｇｌｌ残渣
と結合させ、結紮によりＢｇｎｌＩ　制限サイトを復活
させることができる。

従って、実施例ＩＣで調製したプラスミドｐＳｏＭ７Δ
２をＢｇＡ　ｎ消化し、得られたＢｇｎ　ＩＩ粘着末端
を、全ての４種のデオキシヌクレオチドトリホスフェー
トを使ってＫｌｅｎｏＷポリメラーゼ■で処理すること
により、２本鎖（こした。得られた生成物ヲＥｃｏＲ■
Ｈｇし、ＰＡＧＥ次いで小さいフラグメントを電気溶出
すると、ＢｇｌＵサイトより上流のＬＥ近位配列のコド
ンｌ’−ＬＥ（Ｐ）Ｊ、およびトリブトファンプロモー
ター／オペレーターヲ含有している線状ＤＮＡが得られ
た。この生成物は、ＢｇｌＵサイトを埋めることによっ
て生成した鈍感末端と合すること（こより１３ｇ１Ｈｌ
サイトを復活させる。即ち、この２つのフラグメントを
Ｔ４ＤＮＡリガーゼの存在下で結紮して再環化したプラ
スミドｐＨＫＹＩＱを得、これをコンピテントＥ、　ｃ
ｏｌｉ株２９４ｉ胞番こ形質転換導入すること（こよっ
て増殖させた。このを 組換えプラスミドｐＴ−１１（Ｙｌｏ持ったテトラサイ
ク△ リン耐性細胞を選択し、そのプラスミドＤＮＡを抽出し
た。Ｂｇｌ　ＨおよびＰｓＬＩで消化し、ＰＡＧＥ法で
分離し、大きいフラグメントを電気溶出することによっ
て、ＰｓＬＩおよびＢｇｌ　ＩＩＩ粘着末端を持った所
望の線状ＤＮＡを得た。この様にしてｐＩ川（Ｙｌｏか
ら調製したこのＤＮＡフラグメントは、複製の起源を含
んでおり、従って、ｔｒｐＬＥポリペプチド融合蛋白質
およびテトラサイクリン耐性を暗号化している両方の遺
伝子がｔ４ｐプロモータ（５１） 一／オペレーターのコントロール下にあるプラスミドｐ
ＩＡ−７Δ４Δ１を組み立てるための成分として有用で
ある。

実施例ＩＥで調製したプラスミドｐＳｏＭ７Δ２Δ４を
、部分的ＥｃｏＲＩ消化次いでＰｓｔｉ消化にかけた。

得られたフラグメントはプロモーター／オペレーターを
含んでおり、ＰＡＧＥ操作次いで電気溶出（こより分離
した。部分的ＥｃｏＲＩ　　消化は、ソマトスタチン遺
伝子の５末端隣接部が開裂され、アンピシリンＮｔ性遺
伝子とｔｒｐプロモーター／オペレーターの間に存在す
るＥｃｏＲＩサイトでは開裂していないフラグメントを
得るため；こ必要であった。

アンピシリン耐性遺伝子内でのＰｓｃｌ：切断によって
失われたアンピシリン耐性は、実施例ＩＦで調製された
最終的なｐｌ（ＫＹＩＱ線状ＤＮＡ誘導体との結合によ
って復活させることができる。

■、インシュリンＡ鎖構造遺伝子の分離インシュリンＡ
鎖構造遺伝子は、プラスミド（５２） ｐＩＡｌ　　（その組み立てはＧｏｅｄｄｅ／らＯこよ
り、ｐｒｏｃ、Ｎａｔ、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、ＵＳＡ７
６　：　１０６に記載されている）のＥｃｏＲ■および
ＢａｍＨ■消化によって得た。所望のフラグメントをＰ
ＡＧＥおよび電気溶出により精製した。これはＥｃｏＲ
４およびＢａｍＨＪ末端を持っていた。

皇 インシュリンＡ鎖構造遺伝子、ｔｒｐプロモーター／オ
ペレーター含有（ｄｊ［ＤＮＡフラグメント（実施例Ｉ
Ｇで調製）およびｐＩ（ＫＹＩＯ線状　ＤＮＡフラグメ
ント（実施例ＩＦで調製）を、適切な方向で、第１図に
示した採番こ結合し、所望のプラスミドｐＩＡ７Δ４Δ
１を調製した。プラスミドｐＩＡ７Δ４Δ１にはアンピ
シリンおよびテトラサイクリン耐性カ復活しているので
、簡単に選択することができる。

実施例２　プラスミドｐＩＢ７Δ４Δ１の組み立て最後
の結合に於いて、インシュリンＡ鎖の代りにインシュリ
ンＢ鎖を指定している構造遺伝子を用いるほかは、実施
例ＩＡ−Ｉに従って所望のプラスミドを組み立てた。イ
ンシュリン１３鎖構造遺伝子は、プラスミドｐＩＥ１（
その組み立てはＧｏｅｄｄ、ｅｌら、１９７９に記載さ
れティる）（７）ＥｃｏＲ■およびＢａｍＨ■消化によ
って得られた。このインシュリンＢ鎖暗号化１）　Ｎ　
ＡフラグメントをＰＡＧＥおよび電気製出番こより精製
した。これはＥｃｏＲ■およびＢａｍＨ■末端を持って
いた。

プラスミドｐＩＥ７Δ４Δ１　を第２図に示す。これは
、アンピシリンおよびテトラサイクリン耐性が復活して
いるので簡単に選択することができる。

実施例３　プラスミドｐＰＲ３の、阻み立てバクテリオ
ファージλＣｌ８５７　のいくつかのＢｇｌ　■制限サ
イトおよびプラスミドＰＩＢ７Δ４Δ１の単一のＥａｍ
Ｈ■制限サイトによって、バクテリオファージフラグメ
ントヲＰＩＢ７Δ４Δ１　クローニングベクターにクロ
ーンすることができる。バクテリオファージλＣｌ８５
７は、Ｂｇｌｌｌｉこ感受性のある７個のサイトを含ん
でいる。Ｂｇｌ　］］フラグメントの１つは、λＣ１遺
伝子およびλｒｅｘ遺伝子を含む２．５　ｋｈを含んで
いる（　５ｚｙｂａｌｓｋｉおよび５ｚｙｂａｌｓｋｉ
１１９７９、Ｇｅｎｅ　７　　：　　２１７〜２８０　
；およびＣＥｒ１ｅｎ　＊　ｃｃＬｅ　Ｍａｒｃｈ　ｌ
　９８Ｑ　、ＧｅｎｅｔｉｃＭａｐｓ。第１巻、Ｎ　Ｔ
　Ｈ）。Ｂｇｌ　ＩＩ７ラグメントは、ＢａｍＨＩ　フ
ラグメントの５拡張部と相補的な配列Ｇ　Ａ、　Ｔ　Ｃ
を持った５拡張部（ｅｘＬｅｎｓｉｏｎｓ　）を含んで
いる。ヒトインシュリンプラスミドｐ■Ｂ７Δ４Δ１は
、ＢａｍＨＩによって開裂される唯一のサイトを持って
いる。このＢａｍ　Ｔ−Ｉ　Ｉサイト内（こクローニン
グするとｐＩＢ７Δ４Δ１上のＴｃ耐性遺伝子が不活性
化される。Ｂｇｌ　］］フラグメントとＢａｍＨＩフラ
グＧＡＴＣＴ たは。。ＴＡＧＡ　の配列を持った組換え体ができる。

これらの配列は、ＢｇｌｌｌまたはＢａｍＨＩによって
開裂されない。従って、両酵素による制限化（ｒｅｓｔ
−ｒｉｃｃｉｏｎ　）　　によって、ｐＩＢ７Δ４Δ１
　のＥａｍＨｉサイト内（こ結合したλＢｇｌ［フラグ
メントラ含有するもの以外の全ての結紮生成物が除去さ
れる。

制限酵素は、実施例ＩＡに記載した商業的ソースから入
手し、既知の方法に従って常法通りに使用した。さらに
、その製造業者からの指示を受けた。即ち、バクテリオ
ファージλｃ■３５７　５ｕｓＳ７　ＤＮＡ　を、］Ｏ
ＯμｇのＩ）　Ｎ　Ａ、１２ｍＭ　トリス、ＨＣ４、Ｐ
Ｔ−１７，５，１２ｍＭ　Ｍ　ｇ　Ｃｌ　２．１２ｍＭ
２−メルカプトエタノールおよび１００単位（容量１２
〃ｌ中）の３ｇｌｌｌ制限酵素を含む反応混合物中、３
７°Ｃで完全に制限化した。この制限フラグメントをア
ガロースゲル電気泳動（以降、ＡＧＥという）で分離し
た。分離したフラグメントを、エチジウムプロミドで発
色させ、紫外線によって螢光帯が見える様にすることに
よってゲル上の位置づけを行なった。目的とする〜２，
５ｋｌ）のフラグメントをゲルから切り取り、実施例Ｉ
Ａに示した様に、ＴＪ３Ｅ内に電気溶出した。透析袋か
らの水溶液を集め、平衡緩衝液（、ＩＭＫＣ，ｇ、１０
．０ｍＭトリス・ＨＣ，ｇ％ＰＨ７，３）で平衡化した
ｌ）　Ｅ　Ａ　Ｆ、セル（５５） ロース力ラムネ（，５ｍｌワットマンＤＥ５２　）に通
した。カラムを平衡緩衝液２．５ｍｌで洗浄し、ＤＮＡ
（約５　μｇ）を溶出緩衝液（ｌ　Ｍ　ＮａＣ１，１０
ｍＭトリス・Ｉ−Ｉ　ＣＩｌ、Ｈ７，８）　１．５肩ｊ
で溶出した。この溶出液のＮａ＋イオン濃度を約、３５
Ｍに調節し、１００％エタノール２倍量（約９　ｍｌ　
）を加え、−２０°Ｃで１６時間冷却することによりＤ
　Ｎ’　Ａを沈澱させた。このＤＮＡ沈澱物を還心分離
によってベレット化し、７５％エタノールで洗浄して乾
燥した。

このＤＮＡフラグメントの分離は、ＡＧＥ、電気溶出、
ＤＥＡＥ−セルロースクロマトグラフィー、およびここ
に記載したエタノール沈澱によって行なった。このＤＮ
Ａ　７￥ＴＥ緩衝液（ｌ　ｍＭ　Ｅ　ＤＴＡ。

１０ｍＭトリス、　Ｈｃ　ｇ、　ＰＨ７，８）　＋コ再
溶解した。

＊注）ｎ　ＤＥＡＥセルロースカラムおよびＤＥ５２は
Ｗｈａｔｍａｎ　Ｉｎｃ、＋　９　Ｅｒｉｄｅｗｅｌｌ
　　Ｐｌａｃｅ　、　Ｃｌ１ｆｔｏｎ。

Ｎｅｗ　Ｊｅｒｓｅｙ　Ｏ７０１４から入手できる。

Ｂ、　１３ａｍ　ＨＪ制限酵素によるプラスミドｐＩＢ
７Δ４Δ１の消化 プラスミドｐ　ＩＢ　７Δ４Δ１を、２０ｍＭ）リス・
（５６） ＨＣｌ　、　ＰＴ−１７、Ｑ、ＩＱＱｍＭＮａＣｌ、７
ｍＭＭｇＣβ２．２ｍＭ２−メルカプトエタノールおよ
び　１０単位のＥ　ａｍ　ＨＩ制ｉｌエンドヌクレアー
ゼを含有する５０μｅの反応混合物中、３７°Ｃで完全
に制限化した。

約１４μｇの２．５　ｋｂ　Ｂｇｆｆ　ＩＩフラグメン
ト（実施例３Ａで調製）、ｆｆ１１．５μｇのＢａｍＨ
Ｉ制限化ｐＩＥ７Δ４Δ１（実施例３］３で調製）、５
０ｍＭトリフ、　、　１（Ｃｐ、　ＰＨ’７゜８、　ｌ
ＱｍＭジチオトレイット、５％グリセロール、ｌ　Ｑ　
ｍＭ　Ｍ　ｇ　Ｃｌ　２１，１ｍＭＡＴＰおよび、１単
位のＴ４ＤＮＡリガーゼを含む反応混合物１００μｌを
用いて、Ｔ４ＤＮＡリガーゼによる結合反応を行なった
。反応混合物を４°Ｃで１８時間インキュベートし、６
５°Ｃて５分間加熱して反応を終了させた。この様にし
て調製したプラスミドｐ　Ｐ　Ｒ３は４°Ｃで貯蔵した
。

実施例４　プラスミドｐ　ＰＩＲ３のＥ、　ｃｏｔ　ｉ
Ｋｌ　２Ｃ６’Ｏ’ＯＲ，（ＭＫ−への形質転換導入Ｅ
、ｃｏｌｉＫ１２Ｃ５ＱＱｌ（Ｋ−ＭＫ−の新鮮なオ−
ハナイト培養（ＣｈａｎｇおよびＣｏｈｅｎ、　１９７
４　。

Ｐｒｏｃ、Ｎａｃ、Ａｃａｄ　、Ｓｃｉ、　　７　ｌ　
：　ｌ　Ｑ３Ｑ−Ｉ　Ｑ３４参照）を新鮮なＬブロス中
（Ｍｉｌｌｅｒ、　１９７２　。

Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　
Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、ＧｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　　Ｈａｒｂ
ｏｒ　　Ｌａｂｓ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒ
ｂｏｒ。

Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋｇ照）、　に１０継代培養し、３７°
Ｃで１時間増殖させた。６５ＱＫＩｅｔｃ単位の細胞を
全て収穫し、１００　ｍＭ　ＮａＣ１２，５ｍｌで洗浄
し、１０％ゲリセロールの１．５　ＱｍＭＣａＣ１２に
懸濁し、室温で２０分間インキュベートした。遠心分離
により細胞を集め、Ｃａ　Ｃｌ　２−グリセロール、　
５　ｎｔｌに再懸濁し、３〜５分間氷で冷やして凍結し
た。

この細胞懸濁液は、使用時まで液体窒素中に貯蔵した。

保存および貯蔵は、その生活力、または共有結合で閉鎖
している環状ＤＮＡによる形質転換の頻度に悪影響を与
えなかった。水浴中で細胞を融解し、細胞、１ｍ／ｉこ
苅してＤＮＡ。０５πｌ（実施例３Ｃに従って５μｌの
ｐＰＲ３を調製し１．１×ＳＳＣ（標準的クエン酸塩食
塩水）４５μｌで希釈した）の割合で混合した。この様
にして調製しく５９） 一トシヨックし、水でさらに１０分間冷却し、Ｌ−グロ
ス１．８５ｍ１で希釈し、３２°Ｃで２時間インキュベ
ートし、λＫＨ５４ｈλ　オヨびλＩＨ−ｓ　５４ｈｓ
　Ｏ（両者ともＢａｃｋｍａｎ　　ら、］９７７．５ｃ
ｉｅｎｃｅ１９６：１８２に記載されている）をそれぞ
れ約１×１０　含有しているＬ−ブＤ　ス（Ｍｉｌｌｅ
ｒ。

１９７２参照）上に広げ、３２°Ｃでインキュベートし
た。形質転換体を、３２°Ｃにおいてバクテリオファー
ジλＫＨ５４ｈλおよびλＫＨ５４ｈ８０　　＋コ対す
る免疫で選択した。組換体を、Ａｐ　ｒ、Ｔｃ５、λＫ
Ｉ−１，５４ｈλおよびλＫ１−１５４　ｈ　８Ｑ免疫
をＲ認するたメニ３２°Ｃで試験し、λＫＨ５４ｈλオ
ヨヒλＫＨ５４ｈ３Ｑ感受姓を確認するために４２°Ｃ
で試験した。１つの形質転換体を選択し、Ｅ、Ｃ０１ｉ
　Ｋ１２Ｃ６００Ｒ１（−Ｍ　１（−／　ｐ　１月（３
と命名した。この生存コロニーを、期待した表現型につ
いて試験し、組み立てられた組換えプヂスミドｐ　Ｐ　
Ｒ３の増幅および単離に使用した。プラスミドｐ　Ｐ　
Ｒ３の制限酵素分析により、λｒｅｘ遺伝子がλｃＩ遺
伝子より、ｔｒｐＥ（６０） 一インシュリンＢ鎖遺伝子番こすつと近いことがわかっ
た。

ミドＤＮＡをクロラムフェニコールと共に増幅させ、清
澄化溶解質法（ｃｌｅａｒｅｄ　Ｉｙｓａｉｅ　ｐｒｏ
ｃｅｄｕｒｅ）（ＢａｚａｒａｌおよびＨｅｌ　１ｎｓ
ｋｉ　、　ｌ　９　（３８，Ｊ　、Ｍｏｌ　。

Ｂｉｏｌ、３６：１８５　１９４）により分離した。共
有結合によって環化した環状ＤＮＡを、ＣｓＣβおよび
プロピジウム・ジ−ヨーシト中、平衡超遠心分離（こよ
って精製した。プロピジウム・ジ−ヨーシトを２−プロ
パツールで抽出し、ＤＮＡをＣｓＣ，ｇ中、−２０°Ｃ
で貯蔵した。ＤＮＡ　Ｉ：Ｄ処理液を、セファデックス
（ＰＤＩＯ＊）クロマトグラフィーカラムにより、ＳＳ
Ｃ／ＩＱ緩衝液（，０１５ＭＮａＣ１゜、００１５Ｍク
エン酸ナトリウム１．Ｈ７，０）に交換した。

＊ｐｏ１０はＰｂａｒｍａｃｉａ　＊　８Ｑ　Ｑ　Ｃｅ
ｎｔｅｎｎｉａｌＡｖｃ　、　Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ　
、　Ｎｅｗ　Ｊｅｒｓｅｙ　Ｑ　８８５１から入手可能
。

実施例６　プラスミドＰｐｌ（］−２の組み立てプラス
ミドｐＰＲ３（実施例５と実質的に同様（こして単離）
約７０　μｇを、７（Ｊｔｔｌの１０ｘＰｓｔ４緩衝液
（２００ｍＭトリス・ＨＣｌ１．Ｋ７．５．１００ｍＭ
　Ｍｇ　ＣＩ　２．５００ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４）、
５０ｔｔ（ｊ（１■／　ｍｌ　）のＢＳＡ　（牛血清ア
ルブミン）および５５５μｌの水に溶解し、６５°Ｃで
約１５分間インキュベートした。約２５μｌのＰｓｔＩ
（１単位／μｌ　）制限酵素を加えた後、混合物を３７
°Ｃで約４．５時間インキュベートした。次いで得られ
たＰｓｔ制限フラグメントを常法により、ＡＧＥで分離
した。プラスミドｐＰＲ３には２個のＰｓｔＩ制限サイ
トがあるので、完全にＰｓｔ■消化すると〜３．６ｋｂ
フラグメントと〜４，２ｋｂフラグメントが得られる。

後者のフラグメントがバタテリオファージλＣ■遺伝子
を含んでいる。従って、既述した様にして、〜４．２ｋ
ｂフラグメントを回収した。

得られた所望の〜４．２ｋｂ制限フラグメントを含んで
いるＤＮＡベレットをＴＥｉ衝液５０μβに懸濁した。

この０ＮＩＳ−懸濁液を６５°Ｃて１５分間インキュベ
ートし、使用するまで４°Ｃで貯蔵した。

上で調製した〜４．２ｋｂＰｓｔＩ制限フラグメント約
５０１１１．１０μｍｇの１０ｘＨｉｎｃＩＩ緩衝液（
１００ｍＭ）リス、ＨＣｌ、、Ｈ７，９，６００ｍＭＮ
ａＣ１，５５ｍＭＭｇＣ７２、ｌＱｍＭ　　ジチオトレ
イット）、３８μｅの水および２μ１（１０単位／μｌ
）のＨｉ　ｎ　ｃ　■制限酵素を３７°Ｃで約２０分間
、次いて６５°Ｃて約５分間インキュベートした。この
混合物を約２０°Ｃに冷却し、約２００μβのＴ　ＨＥ
を加えた後、制限フラグメントを常法（こ従い、ＡＧＥ
により分離した。バクテリオファージλＣＴ遺伝子を含
んでいる所望の〜。９ｋｂＰｓｔ■−Ｉ−Ｉｉｎｃ　ｌ
　制限フラグメントをＴＥ緩衝液１０μｌに溶解し、４
°Ｃて貯蔵した。

約１００　ｔｔｌ　（３，２μｇ）ノフ−＞スミトｐＥ
Ｒ３２２，１５１１１（Ｄ　Ｉ　Ｑ　ＸＨｉｎｃｌｌ緩
衝液、３４μｌの水お（６３） よび１μで　（１０単位／μβ）のＨｉ　ｎ　ｃ　■制
限酵素を３７°Ｃで約２０分間、次いで６５°Ｃで約５
分間インキュベートした。この反応混合物を４°Ｃに冷
却し、実施例３に記載した様に、エタノール沈澱にかけ
た。所望の部分的Ｈｉｎｃｌｌ消化ＰＢＲ３２２を１０
μβの１０×ＰＳ【■緩衝液および７９μｅの水からな
る溶液番こ懸濁し、得られた懸濁液を６５°Ｃで５分間
インキュベートした後４°Ｃに冷却した。

欠いでＢ５Ａｌ　Ｏ／Ｌｌ　（１ｍｐ／ｍｌ）およびＰ
　ｓ　Ｌ　■制限酵素２μ１（１０単位／　ｍｌ　）を
加えた。得られた反応混合物を３７°Ｃで１時間、次い
で６５°Ｃで５分間インキュベートし、４”Ｃに冷却し
た。この様にして調製したＴ（１ｎｃｌＪ　−Ｐｓ　ｔ
　Ｉ制限フラグメントを常法によりＡＧＥで分離した。

このＤＮＡをＴＥ緩衝液に溶解し、使用するまで４°Ｃ
で貯蔵した。

（６４） ６Ａで調製したもの）約１０μＲ（１，８μｇ）および
〜４　ｋｂ　ｐｓｔＩ−Ｈｉｎｃｌｌフラグメント（実
施例６Ｂで調製したもの）１０μｌ（，９μｇ）を混合
し、を２μｅの５×リゲーシヨン（結紮）緩衝液（２５
０ｍＭ　　ト　リ　ス　、　　ＨＣｆｉ　　、　Ｐ）１
７．８　、　５　Ｑ　ｒｎ　Ｍ　　Ｍ　ｇ　Ｃ（２２，
２５ｍＭジチオトレイットおよび２５％グリセロール）
および４．６７μｌのＨ２０に溶解した。この溶液を６
５°Ｃで１０分間インキュベートした後、約３　μｌ　
（７）　、　（３５ｍＭＡＴＰおよび、３３μβ（２単
位／μｌ）のＴ４ＤＮＡＩＪガーゼを加えた。得られた
結紮混合物を周囲温度で１．５時間反応させ、所望のプ
ラスミドｐＰＲ１２を調製した。この様（こして得たプ
ラスミドｐＰＲ１２ＤＮＡを、使用するまで４°Ｃて貯
蔵した。

実施例７　プラスミドＰＰ’ＦＬ１２のＥ　、　ｃｏｔ
　ｉＫｌ　２Ｃ６００１え、。−Ｍｘ−への形質転換導
入プラスミドｐＰＲ３の代りにプラスミドＰＰＲ１２を
使用するほかは実施例４と実質的に同じ方法で所望の形
質転換を行なった。形質転換体は、３２°Ｃ番こおいて
、バクテリオファージλＫＨ５４ｈλおよびλＫＨ５４
ｈ８０＋こ対する免疫性で選択した。組換体のＡＰ　、
　Ｔｃ　、λＫＨ５４ｈλおよびλＫＨ５４ｈ８Ｑ免疫
性を調べるためには３２°Ｃで、λＫＨ５４ｈλおよび
λＫＨ５４’ｈ　８０　［受性を調べるためには４２°
Ｃで試験を行なった。１個の組換体が選択され、Ｅ。

ｃｏｌ　ｉ　Ｋ　１２Ｃ６００ＲＫ−ＭＫ−／ｐＰＲ１
２と命名された。この生存コロニーを、予恕した表現型
について試験し、プラスミドｐＰＲ１２の増幅および単
離に使用した。

実施例８　プラスミドＰＰＲ１２の増幅および分離 実施例５と実質的に同じ方法でプラスミドｐＰＲ１２を
増、隔し、分離した。

実施例９　プラスミドｐＰＲ１７の組み立てプラスミド
ｐＰＲ１２ＯＮＡ（実施例８て調製）約１５０μ１（２
０μｇ）、２０ｐ（！のｌ　Ｑ　ｘ　Ｂ　ａｍＨＩ緩新
液（２００ｍＭトリス、　ＨＣｌ、　ＰＩ−１７，０、
ＩＭＮａＣ，ｇ、７　Ｑ　ｍＭ　Ｍ　ｇ　Ｃｌ　２、２
　ＱｍＭ　　２−　メ）’ｌ／カプトエタノール）、２
１１に４（２０単位／μβ）の１３ａｍＪ制限酵素およ
び２８μｅのＨ２０を３７°Ｃで３０分間、次いで周囲
温度で１．３時間、最後に６５°Ｃで５分間インキュベ
ートした。この反応混合物を４°Ｃに冷却した後、約４
μ１（１０単位／μｌ）のＥｃｏＲ■制限酵素を加えた
。次いてこの反応混合物を３７°Ｃで１時間インキュベ
ートし、所望の〜４．，７ｋｂ制限フラグメントを生成
せしめた。常法によりＡＧＥで分離した後、所望のＤＮ
ＡベレットをＴＥ緩衝液に懸濁し、使用するまで一４°
Ｃで貯蔵した。

プラスミドｐＰＲ１２の代りにプラスミドｐＩＡ７Δ４
Δ１を使用するほかは、実施例９Ａと実質的に同じ方法
で所望の分離を行なった。更に、ＥＣＯＲ■（６７） 制限酵素は、部分的ＥｃｏＲＩ消化が所望であるので、
僅かに約３０分間だけ反応させた。常法に従ってＡＧＦ
、で分離した後、所望の〜ｌ　、３　ｋｂＥｃｏＲＪ−
Ｂ　ａ　ｍ　ＨＩ制限フラグメントを以下に記載する結
合反応に直ちに使用した。

子の結合 実施例９Ａの〜４，７　ｋｂ　ＤＮ　Ａ含有溶液約１．
５μｇと実施例９Ｂの〜１，３　ｋｂ　ＤＮＡ含有混合
物１．５μｇを混合し、２回エタノール沈澱を行なった
。ベレットを、６μβの１１２０および２μｌの５×リ
ゲーシヨン緩衝液からなる溶液に溶解し、６５°Ｃで１
０分間インキユベートシた。インキュベーションした後
、この混合物を１５°Ｃ１こ冷却し、約２μｌの、　（
３５ｍＭＡＴ　］’および、１ｔｔｌｊ（１単位／１ｌ
ｌｊ　）ＣＤＴ４ＤＮＡリガーゼを加えた。１５°Ｃで
約１８時聞納合反応を行ない所望のプラスミドｐＰＲ１
７を調製した。

実施例１０　プラスミドｐＰＲ］７のＥ、ｃｏｌｉＫ（
６８） １２　Ｃ６００ＲＫ　　ＭＫ−への形質転換導入プラス
ミドｐＰＲ３の代り（こプラスミドｐＰＲ１７を使用す
るほかは実施例４と実質的に同じ方法で所望の形質転換
を行なった。バクテリオファージλＫＨ５４ｈλおよび
λＫＨ５４ｈ８０に対する免疫により、３２°Ｃで形質
転換体を選択した。組換体のＡＰ、Ｔｃ、λＫＨ５４ｈ
λオヨびλＫＨ５４ｈ８Ｑ免疫性については３２°Ｃで
、　　　　　　　　゛およびλＫＨ５４ｈ８０　ｇ受性
については４２°Ｃで試験して調べた。１個の形質転換
体を選択し、Ｅ、ｃｏｌｉＫ　１２　Ｃ６００ＲＫ−Ｍ
Ｋ−／ｐ　ＰＲ１７と命名した。

この生存コロニーの期待された表現型を試験し、プラス
ミドｐＰＲ１７の増幅および分離に使用した。

実施例１１　プラスミドｐＰＲ１７の増擢および分離 プラスミドｐＰＲ１７の増幅および分離は、実施例５と
実質的に同じ方法を使って行なった。

実施例１２　プラスミドｐＰＲ１８の組み立てプラスミ
ドｐＩＡ、７Δ４Δ１の代りにプラスミドＰＩＢ７Δ４
Δ１を使用するほかは実施例９Ａ、、Ｃと実質的に同じ
方法で所望の組み立てを行ない、〜ｌ、３　ｋｂ　Ｅｃ
ｏｋＩ−ＢａｍＨＩ制限フラグメントを生成させた。

実施例１３　プラスミドｐＰＲ１８のＥ、ｃｏｌｉＫ１
２Ｃ６００ＲＫ−ＭＫ−への形質転換導入プラスミドｐ
ＰＲ３の代りにプラスミドＰＰＲ１８を使用するほかは
実施例４と実質的に同じ方法で所望の形質転換を行なっ
た。形質転換体は、３２°Ｃで、バクテリオファージλ
ＫＨ５４ｈλおよびλＫＨ５４ｈ８０１こ対する免疫性
で選択した。この組換体のＡｐ、Ｔｃ’、λＫＨ５４ｈ
λオヨびλＫＨ５４ｈ８０免疫性については３２°Ｃで
、λＫＨ５４ｈλおよびλＫＨ５４ｈ８０　感受性につ
いては４２°Ｃで試験して調べた。１個の形質転換体を
選択し、Ｅ、ｃｏｌｉＫ１２Ｃ６０’ＯＲＫ−ＭＫ−／
ＰＰＲ１８と命名した。この生存コロニーの期待される
表現型を調べ、このプラスミドｐＰＲ１８の増幅および
分離に使用した。

実施例１４　プラスミドｐＰ：Ｒ１７のＥ、ｃｏｌｉＫ
１２２９４への形質転換導入 本発明に係るプラスミドを、Ｅ　、　ｃｏｌ　ｉ　Ｋ１
２２９４に形質転換導入することにより、Ｋ−制限系に
対＋ して改変する。Ｅ、ｃｏ目に１２２９４　は”Ｋ　　’
にであり、従って形質転換によって、改変前のプラ＋　
　　＋ スミドＤＮＡは改変され、Ｒｘ　Ｍｋ　特異性を持った
株による制限に対して抵抗する様（こなる。かくして、
本発明のプラスミドをＲＫ”　Ｍ’に十Ｅ　、　ｃｏ　
Ｉ　ｉ株に形質転換導入するための、このプラスミドを
増蛎および分離するために、Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｋ１２２９
４形質転換体を使用する。

所望の形質転換は、Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｋ１２Ｃ６００１支
に−Ｍｘ−の代りにＥ、ｃｏｌｉＫ１２２９４を、プラ
スミドｐ　Ｐ　Ｒ，３の代りにプラスミドｐＰＲ１７を
使用するほかは、実施例４と実質曲番こ同じ方法で行な
った。形質転換体はＴＣｒで選択した。この組換体）Ａ
ＰｓＳＴｃｒ１λＫＨ５４ｈλオヨヒλＫＨ５４ｈ８０
に対する免疫性については３２°Ｃて、λＫＨ５４ｈλ
およびλＫＩ（５４ｈ８Ｑ　　に対する感受性について
は（７１） ４２°Ｃで試験して調べた。この形質転換体は推定上の
プラスミド担持マーカーの遺伝子結合を１００％示した
。１個の形質転換体を選択し、Ｅ、ｃｏｌｉ＋＜１２２
９４／ＰｐＲ１７と命名した。このコロニーを試験して
期待される表現型を証明し、これを使ってプラスミドｐ
ＰＲ１７の増幅および単離を行なった。

実施例１５　プラスミドｐＰＲ１７の増幅と分離Ｅ、ｃ
ｏｌｉ　Ｋ１２　２９４／ｐＰＲ１７を使用するほかは
、実施例５と実質的（こ同じ方法でプラスミド１）　Ｐ
　Ｒｌ　７の増幅および分離を行なった。

実施例１６　プラスミドｌ）　Ｐ　Ｒｌ　３のＪら、ｃ
ｏｌ　１Ｋ１２２９４への形質転換導入 プラスミドｐＰＲ１７の代りにプラスミドｐＰＲ１８を
使用するほかは実施例１４と実質曲番こ同じ方法で形質
転換を行なった。

実施例１７　プラスミドｐＰＲ１３の増幅と分離Ｅ、ｃ
ｏ１ｉＫ１２ジ９４／ＰＰＩ’−１８を使用するほかは
実施例５と実質曲番こ同様にして、プラスミドｐＰＲ１
３の増幅および分離を行なった。

（７２） 実施例１８　プラスミドｐＰＲ１７のＥ、ｃｏｌｉＫ１
２ＲＶ３０８への形質転換導入 実施例１５のプラスミドｐＰＲ１７およびＥ。

Ｃ０１１Ｋ１２Ｒｖ３０８を使用するほかは、実施例１
４と実質的に同じ方法で形質転換を行なった。

実施例１９　プラスミドｐＰＲ１３のＥ　、　ｃｏｌ　
１Ｋ１２　ＲＶ３０８　への形質転換導入実施例１７の
プラスミドｐＰＲ１８およびＥ。

Ｃ０１１１（１２Ｒｖ３０８を使用するほかは、実施例
１４と実質的に同じ方法で所望の形質転換を行なった。

実施例２０　λＣｌ９０で溶原化すること番こよるＥ、
ｃｏｌｉ　Ｋ１２　　ＲＶ３０８λＣｌ９０／ＰＰＲ１
７の組み立て Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｋ１２　ＲＶ３０８／ＰＰＲ１７（実施
例１８で調製）を、３５ＫＩｅｔｔ単位まで３２°Ｃで
増殖し、次いで４５°Ｃで６０分間増殖させた。この細
胞にλＣｌ９０を感染多重度２０で感染させ、４５°Ｃ
で４０分間インキユベートシた。コロニーヲ、テトラサ
イクリン１０μｇ／ｍｌを含有するし一寒天上、３２°
Ｃで増殖させた。得うレタＥ、Ｃ０Ｉｉ　Ｋ１２　ＲＶ
３０８λＣｌ９０／ＰＰＲ１７コロニーを、増殖を確か
めるためには３２°Ｃで、感受性を確かめるためには４
２°Ｃで試験した。

実ｍ例２１　　Ｅ、ｃｏｌｉＫ１２ＲＶ３０８λＣｌ９
０／ｐＰＲ１８の組み立て Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｋ１２　　ＲＶ３０８／ｐＰＲ１７の代
ＦＨＣＥ。

ｃｏｌｉ　Ｋ１２　１ＵＶ３０８／ｐＰＲ１８（実施例
１９　でＷＡ製）を使用するほかは、実施例２０と実質
曲番こ同じ方法で所望の組み立てを行なった。

実施例２２　　Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｋ１２　　Ｃ５ＱＱＲＫ
−ＭＫ−λＣ■９０／ＰＰＲ１２の組み立て Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｋ１２　ＲＶ３Ｑ３／ｐＰＲ１７の代り
にｐ、、ｃｏｌｉ　　Ｋ１２　Ｃ６００Ｒ１（−Ｍｌ（
−／ｐＰＲ１２（実施例７で調製）を使用するほかは、
実施例２０と実質的に同様（こして所望の組み立てを行
なった。

上記の方法で組み立てられたその池の代表的な株を以下
に列挙する。

実施例番号　　　　　名　　　称 ２３　　Ｅ、五免見に１２　Ｃ６００／ＰＰＲ１７２４
Ｅ、　ｃｏｔ　ｉ　　Ｋ１２　Ｃ６００／ｐＰ］（１８
２５Ｅ、　ｃｏｌ　ｉ　　Ｋ１２　ＲＶ３０８／ＰＰＲ
１２２６Ｅ、ｃｏｌ　ｉ　Ｋ１２　ＲＶ３０８ＪＣＩ９
０／ＰＰＲ１２２７Ｅ、ｃｏ月−Ｋ１２　Ｃ６００１ｃ
Ｉ９０／ＰＰＲ１７２８Ｅ、ユ旦■Ｋ１２ｃｏｌ　ｉ　
Ｋ１２　Ｃ６四占■９ンＰＰｋ１８２９　　Ｅ、正可ユ
に１２２９４去Ｉ９０／ＰＰＲ１７３０Ｅ、正隻すに１
２２９４占■９ンＰｐ１ｔＩＢ３１　　Ｅ、正虹ｊ−Ｋ
１２　Ｃ６ＱＱ１ｔＫ−ＭＩ呂Ｉ９０／ＰＰＲ１７３２
Ｅ、−臼シ　Ｋ１２　Ｃ６００１＝’−ｉ轡（−ムＩ９
０／ｐＰ＋ｔ１８プラスミドを含有している細胞の頻度
を検定するために、組換えプラスミド上のＴ（ｒ遺伝子
を利用した。培養の連続的希釈液をＬ−寒天上に広げ、
１０μｇ／ｍｌのテトラサイクリンと共に、そしてテト
ラサイクリンなしで３２°Ｃで増殖させた。プラ＋ スミド　細胞の頻度を、テトラサイクリンなしでＬ−寒
天上で増殖したコロニーの全数番こ対するテ（７５） トラサイクリン耐性コロニーの比と見做した。あるいは
Ｌ−寒天上のコロニーを１０μｇＡｉのテトラサイクリ
ンを含むＬ−寒天にレプリカ法でプレートし、３２°Ｃ
で増殖させた。プラスミド＋細胞の頻度は、テトラサイ
クリンを含１ないＬ−寒天上番こ増殖した全コロニー数
に対するテトラサイクリン耐性コロニーの比であると見
做した。その結果ヲＥ、ｃｏｌ　ｉ　Ｋ１２　ＲＶ３０
８／ｐ　ＩＡ７Δ４Δ１株ｇヨＵＥ、ｃｏｌｉ　Ｋ１２
　ＲＶ３０８λＣｌ９０／Ｉ）ＰＲｌ　７株＋コツイテ
Ｌｔ表２　ｉｎ、Ｅ、ｃｏｌｉ　］（１２ＲＶ３Ｑ３／
ｐｉ１３７Δ４Δ１株ｇよびＥ、　ｃｏｌｉ　Ｋ１２１
ｔｖ３０ＢλＣＩ９０／ｐ　Ｐ　］（１８株については
表３に、Ｅ、　ｃｏｌｉ　Ｋ１２”６００”＋ｃ　−Ｍ
＋＜−、／ｐｌ”Ｒ１２株およびＩイ：、ｃｏｌｉＫ１
２　　　Ｃ６ｏｏ１乏１（−Ｍｌ（−λ’４９０／ｐｌ
’Ｒ］２１朱番こついては表４に、それぞれ％で示した
。

（７６） 表２〜表４に示した結果から、組換えプラスミドを細菌
群に保持させるのに、本発明の選択系が唖めて有効であ
ることがわがる。Ｅ、　ｃｏｌ　ｉ　Ｋｌ　２Ｒｖ３０
８　／　Ｐ　Ｉ　Ａ　７　Δ４１１　ｆ７）　培養テハ
約５９６　（７）　細胞が、Ｅ　、　ｃｏｌ　ｉ　Ｋ１
２　ＲＶ　３０８／ＰＩＢ７Δ４Δ１（７）培ｉでは約
２１％の細胞が、培養ダブリング３ｏの後にプラスミド
マイナスとなった。適所にこの選択系を持ッティるＥ、
ｃｏｌｉ　Ｋ１２　ＲＶ３０８λＣＩ　９０／ｐＰＲ１
７オヨヒＥ、ｃｏｌｉ　Ｋ１２　ＲＶ３０８λＣｌ９０
／ｐＰ］（１３の培養では、プラスミドマイナスの細胞
はなかった。さらに、Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｋ１２　　Ｃ３Ｑ
ＱＲＩ。

−ＭＫ−λｃＩ９０／ｐＰＲ１２の培養も優れたプラス
ミド安定性を示した。即ち、Ｅ、ｃｏｌ　ｉ　Ｋｌ　２
　Ｃ６００”Ｋ　’に一、／ｐＰＲ１２の培養では、培
養ダブリング３３の後では１３％の細胞がプラスミドマ
イナスであったが、適所にこの選択系を持ったＥ、ｃｏ
ｌｉＫ１２　Ｃ６０Ｃ６００ＲＫ−λＣｌ９０／ＰＰＲ
１２の培養では全ての細胞がプラスミドプラスであった
。

本発明（こ係るプラスミドは、いづれもプラスミド分離
（ｓｅｇｒｅｇａｔｉｏｎ　）を示さなかった。従って
、本発明、に係る改良プラスミドは、プロファージによ
るｉえかない点で、本発明の改善がなされていないプラ
スミドと異なるものである。事実、適切にこの改良選択
系を持って増殖させた場合、プラスミドマイナスのコロ
ニーは全く観察されなかった。

【図面の簡単な説明】

第１図〜第６図はそれぞれプラスミドｐＩＡ７Δ４Δ１
、ｐ　Ｉ　Ｂ　７Δ４Δ１、ｐＰＲ３、ｐＰＲ１２、ｐ
ＰＲ１７、およびｐＰＲ１８の制限サイトおよび機能地
図を示す模式図、第７図はチモシンアルファ１遺伝子を
示す模式図、第８図はフラグメントＴ１５の合成法を示
すフローシート、第９図はプラスミドｐ　Ｔ　ｈα１の
組み立てルートを示すフローシートである。 特許出願人　イーライ・リリー・アンド・カンパニー代
理人　　　弁理士　青　山　　葆　　　外１名ＦＩＧ、
　１ 圧 （７９） ＩＧ−３ ＦＩＧ、４ ｉ ＦＩＧ、５ ＦＩＧ、　６ 第１頁の続き ＠発　明　者　ポール・ロバート・ロスチック・ジュニ
ア アメリカ合衆国インディアナ４６ １０７ビーチ・グローブ・ヤズー ・ドライブ１５２６番

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １機能的ポリペプチドを発現する組換えＤＮＡを含有し
   ている宿主細胞を安定イシさせ、かつ選択するための方
   法であって、該方法は、 ａ）バクテリオファージλのＰｓｔ■−Ｔ−１ｉｎｃｌ
   ｌｃＩリプレツサー含有制限フラグメントおよび機能的
   ポリペプチドを発現する遺伝子を含んでいる組換えＤＮ
   Ａクローニングベクタを宿主細胞に導入して形質転換し
   、 ｂ）宿主細胞に於いては致死的であるかまたは条件的に
   致死的であるマーカであるが、該形質転換宿主細胞に於
   いては該組換えＤＮＡクローニングベクターに含まれて
   いる該リプレッサー遺伝子により抑制されるマーカを含
   有している溶加性生物によって、該形質転換宿主細胞を
   溶原化するものであって、 該組ｉ　より　Ｎ　Ａクローニングベクターは該リブｖ
   　ツｔ−１こ感受性ヲ持たないプロモーターとレプリコ
   ンを有し、そして条件的Ｉこ致死的である遺伝子を含有
   している溶加性生物で形質転換宿主細胞を溶原化した場
   合は、得られた宿主細胞を制限的条件下で培養すること
   からなる方法。 ２、機能的ポリペプチドを発現する遺伝子が天然の遺伝
   子、非天然の遺伝子、および一部が天然の遺伝子であり
   一部が合成のまたは非天然の遺伝子である遺伝子からな
   る群から選ばれる第１項に記載の方法。 ３、機能的ポリペプチドを発現する遺伝子がヒトインシ
   ュリン、ヒトプレプロインシュリン、ヒトプロインシュ
   リン、ヒトインシュリンＡ鎖、ヒトインシュリンＢ鎖、
   非ヒトインシュリン、ヒト成長ホルモン、非ヒト成長ホ
   ルモン、ヒトインターフェロン、非ヒトインターフェロ
   ン、ウィルス抗原、ウロキナーゼ、任意の５　＋）ペプ
   チド、任意のペプチドホルモン捷たは任意の酵素を暗号
   化している遺伝子である第１項または第２項のいづれか
   に記載の方法。 ４、　ｃ　■　　リプレッサーがＣｌ８５７である第１
   項〜第３項のいづれかに記載の方法。 ５、病原性生物が機能的ＣＩ’Ｊプレッサーを産生じな
   いバクテリオファージλｃＩ　遺伝子を含んでいる第１
   項〜第４項のいづれか（・こ記載の方法。 ６、病原性生物がバクテリオファージラムターＣ■９０
   である第５項（こ記載の方法。 ７、病原性生物がバクテリオファージλＣｌ８５７であ
   る第１項〜第４項のいづれかに記載の方法。 ８、病原性生物がＣＩ遺伝子を削除されている第１項〜
   第３項のいづれかに記載の方法。 ９、組換えクローニングベクターがプラスミドＰＰＲ１
   ２、プラスミドｐＰＩＲ１７またはプラスミドｐＰＲ１
   ８である第１項〜第８項のいづれかどこ記載の方法。 ＪｏＪＪＬ４Ｊエクローニングベクターがバクテリオフ
   ァージである第１項〜第８項のいづれかＯこ記載の方法
   。　　　　　　　　　　　　・ Ｊｌ、宿主細胞がＥ、ＣＯ，ｅｉである第１項〜第１０
   項のいづれかに記載の方、去。 １２、第１項番こ記載の姐換えＤＮＡクローニングベク
   ター。 １３、プラスミドＰＰｋＪ２、プラスミドｐ　Ｐ　Ｒ１
   ，７、丑たはプラスミドｐＰＩｊ１８である第１２項に
   記載のベクター。 １４、第１２項または第１３項のベクターで形質転換さ
   れる宿主細胞。 １５、　Ｅ　、Ｃ：Ｏｌ　ｉである第１４項に記載の宿
   主細胞。 Ｊ６．プラスミドｐＰＲ１７またはプラスミドＰＰＲ１
   ８で形質転換され、バクテリオファージλＣ９０で溶原
   化される第１５項記載の宿主細胞。 Ｊ７．ｐＰＲ１２△２の制限フラグメント。