SE455704B - Bakteriecell innehallande plasmid med stabiliserad nedervning, plasmid samt forfarande for framstellning av bakteriecellen - Google Patents

Description

15 20 25 30 35 455 704 Z som åstadkommer resistens mot ett visst antibiotikum. På detta sätt är endast celler, vilka innehåller plasmiden, resistenta mot antibiotikumet. Genom att bringa cellerna att tillväxa i ett medium innehållande antibiotikumet erhålles selektion för celler innehållande plasmid i det att celler som förlorat plas- miden kommer att dö ut.

Användningen av antibiotikum vid selektionen har emeller- tid ett flertal nackdelar, bland vilka följande kan nämnas: a) Införande av ett antibiotikum förhöjer produktions- kostnaderna; b) det finns risk för förorening av antibiotikum i den slutliga produkten och svårigheter uppstår vid rening av pro- dukten; c) antibiotikumet måste förstöras före utsläpp av spill- vatten från fermentationen; d) det föreligger risk för spridning av antibiotikumre- sistenta gener till omgivningen.

Uppfinningen har till ändamål att åstadkomma en plasmid med stabiliserad nedärvning, varvid plasmiden innehåller minst en produktionsgen som är kolinjärt introducerad i plasmiden.

Ett annat ändamål med uppfinningen är åstadkommande av celler innehållande sådan plasmid.

Ytterligare ett ändamål med uppfinningen är åstadkommande av ett förfarande för framställningen av en autonomt repli- kerande plasmid innehållande en önskad produktionsgen.

Föreliggande uppfinning har gjort det möjligt att und- vika de nackdelar som är förknippade med tekniken med använd- ning av antibiotika såsom angivits ovan, och i enlighet med upp- finningen uppbär plasmiden förutom den önskade produktionsgenen eller generna genen för enzymet valyl-tRNA-syntetas. Det har befunníts, att kolinjär introduktion i plasmiden av denna gen åstadkommer stabiliserad nedärvning, vilket kommer att visas vidare nedan.

För att åstadkomma produktion av önskad substans introdu- ceras plasmiden bärande valyl-tRNA-syntetasgenen, även kallad valS-genen, i en bakteriell cell, som saknar valy1-tRNA-synteei- tasaktivitet. Detta kan åstadkommas exempelvis genom mutering av värdcellen i kromosomala valyl-tRNA-syntetáset. Denna kromo- || 10 15 20 25 30 35 455 704 3 somala mutation kan ha ändrat enzymet på ett sådant sätt, att det icke visar aktivitet vid förhöjd temperatur, såsom vid 37° eller högre. Detta har till följd, att om celler innehållande plasmiden odlas vid sådan förhöjd temperatur plasmidfria segre- ganter icke kan tillväxa och plasmiden innehållande produktions- genen sålunda stabilt nedärves.

Temperaturkänsliga mutanter i valyl-tRNA-syntetas kan isoleras genom nutageniseriiíg med vilket som helst mutagenise- rande ämne, Celler vilka ej har förmåga att tillväxa vid förhöjd temperatur screenas och valyl-tRNA-syntetasaktiviteten bestämmes.

Celler som saknar aktivitet in vítro i valyl-tRNA-syntetaset väljes för genetisk analys av mutationen, och mutanter uppvisan- de hög kotransduktion med pyrB utväljes. Från sådana mutanter introduceras den temperaturkänsliga va1S-genen i den stam som skall användas.

Den plasmid som användes i enlighet med uppfinningen är lämpligen härledd från naturligt uppträdande autogenerande genomer i prokaroyta organismer. Produktionsgenen i plasmiden riktas företrädesvis mot produktion av en primär metabolit.

Produktionsgenen kan vara riktad mot produktion av en aminosyra, exempelvis tryptofan.

Värdcellen innehållande plasmiden enligt uppfinningen kan lämpligen tillhöra arten E.co1i, såsom stammen GRB 238.

Uppfinningen innefattar även ett förfarande för framställ- innehâllande önskad produktionsgen kolinjärt arrangerad däri. I detta förfarande ning av en autonomt replikerande Dlasmid ínföres i nukleinsyrakedjan på i och för sig känt sätt ett första nukleinsyrafragment innehållande produktionsgenen och ett andra nukleinsyrafragment innehållande genen för valyl-tRNA~ syntetas. Vid förfarandet öppnas lämpligen nukleinsyrakedjan medelst restriktionsenzymer, varvid den efterföljande plasmid- syntesen utföres enzymatiskt. Det är föredraget att först in- troducera ett nukleínsyrafragment och sedan det andra.

Uppfinningen kommer nu att beskrivas genom konkreta exempel, vilka emellertid ej får uppfattas såsom inskränkande på uppfinningens omfång. Beträffande detaljer avseende den sta- biliserande genen, valyl-tRNA-syntetas, hänvisas till Eidlic och Meidhardt (Ref. 8). 10 iš 20 ZS 30 35 455; 704 4 l. Isolering av en Co1El-hybrid uppbärandg_genen för valyl-tRNA-syntetas (valS-genen). I W Temperaturresistenta konjuganterlisolerades på LA-plattor från Clarke and Carbon collection (tabell 1) med stammen GRB238 (tabell 1) som recípient. Ett flertal av de erhållna klonerna analyserades med avseende på plasmidinnehall genom agaros-gel- elektrofores av miniklara lysat. En av klonerna befanns innehål- la en plasmid, som efter isolering överförde temperaturresistent valS-aktivitet och uppvisade en trefaldíg förhöjning i den spe- cifika valS-aktiviteten jämfört med en stam av vild typ (tabell 2).

II. Subkloning av valS-genen.

Ett gram av plasmid-DNÅ från den klon som beskrivits un- der avsnitt I spjälkades partiellt med restriktionsendonukleas §ag3A. Denna DNA blandades med lug pBR322 DNA, lineariserad med restriktíonsendonukleas BamH1. _ DNA-blandningen lígerades sedan och överfördes till kompe- tenta celler av stam GRB238. Temperaturresistenta transforman- ter utvaldes vid 40°C på LA-plattor. En av transformanterna upp- bar en 9400 bp insert i BamH1-siten i pBR322 (se fíg. 1) kodande för valS-genen. Denna plasmid, pHOV 1, gav en 8-faldig förhöj- ning av den specifika valS-aktiviteten (se tabell Z).

Konstruktion av en valS-trp+-plasmid. 1 pg av pHOV1 och pHP39 DNA uppslöts med restriktions- enzymet EcoR1 till bildning av tre fragment, ett 13,8 kb som är den lineariserade pHOV1-plasmiden, ett 8,7 kb uppbärande trp-operonet från pHP39 och ett 1,1 kb-fragment. DNA-blandningen ligerades och kompetent GRB238-celler transformerades med den ligerade DNA-blandningen och temperaturresistenta transforman- ter utvaldes vid 40°C. De senare screenades med avseende på 10 av de erhållna klonerna analyserades genom III.

EEBI-fenotyp. agaros-gel-elektrofores av miníklara lysat och visade sig upp- bära lika stora plasmider, cirka 22,5 kb i storlek. En av dessa plasmider pSGS21 (fig. 1) analyserades restriktionsendonukleaser. Uppslutning med EcoR1 ger två frag- ment, ett 13,8 kb lika med linearíserad pHOV1 och ett 8,7 kb genom spjälkning med 10 15 20 25 30 35 455 704 S lika med det trp-uppbärande fragmentet från pHP39. Den relati- va specifika aktiviteten för valyl-tRNA-syntetaset i stam GRB238 innehållande plasmid pSGS21 var 6 gånger den för kon- trollen. Det något lägre värdet jämfört med GRB238 innehållan- de pHOV1 beror förmodligen på ett lägre kopietal för pSGS21 till följd av förhöjningen i mängd DNA i plasmíden.

IV. Stabilitet av valS-trp-plasmiden.

Stabiliteten av plasmíd pSGS21 vid 37°C bestämdes och jämfördes med stabiliteten för plasmid pSGS4 (tabell 1) vid 30°C (fig. 2). Plasmid pSGS21 är perfekt stabil efter 200 ge- nerationers tillväxt vid 37°C. cellkolonier efter 200 generationer av tillväxt uppvisade identisk plasmidstorlek jämfört med pSGS21. De specifika akti- viteterna för antranilat-syntetas och valyl-tRNA-syntetas bestämdes efter 160 och 200 generationer av tillväxt. Inga Agaros-gel-analys av 10 single- tecken på nedgång i de specifika aktiviteterna kunde observe- ras jämfört med kontrollen (GRB238 uppbärande pSGS21 odlad i 10 generationer) vilket indikerar plasmidens integritet (tabell 2).

MATERIAL OCH METODER Parningsprocedur.

Overföring av ColEl'hybridplasmid från stam JA200 utför- des geom F'-medierad överföring. Donorstammen JAZOO (valS+] och recipientstammen GRBZ38 (valSts) odlades i LB-medium till 2x108 celler/ml, blandades i förhållandet 1:2 och parades i 5 timmar.

Isolering av plasmid-DNA.

Plasmid-DNA ísolerades från 250 ml över natten-kulturer odlade i medium LB (Ref. 1) kompletterat med medium E (Ref. 10) och 0,2 % glykos vid 37°C. Cellerna skördades och tvättades en gång i iskyld 0,9 % vattenlösning av NaCl genom centrifugering.

De tvättade cellerna suspenderades ånyo f 8 ml 10mM EDTA, 2 mg/ml lysozym, 50mM glykos, Z5mM Tris-Hcl pH 8,0 och inkube- 16 ml 0,2M Na0H 1 % SDS tillsattes och ínkubationen fortsattes i 5 minuter. 12 ml 3M Na-acetat pH 4,8 tillsattes och inkubationen fortsattes i 60 minuter.

Blandningen centrifugerades i 20 min. och 35 000 g vid 4°C. rades pà is i 30 minuter. 10 15 20 25 30 35 455 704 Supernatanten avlägsnades försiktigt och blandades med 0,6 vol fryskall isopropanol och inkuberades vid -20°C i 20 min.

Blandningen centrifugerades vid 27000 g vid 4°C i S minuter.

Blandningen hälldes av och rörväggarna torkades torra. Pelleten suspenderades ånyo i 4,0 ml dest. H20. 4,25 CsCl och 250 pl EtBr (Smg/ml) tillsattes och centrifugerades i en Beckman Vti 65 rotor vid 52000 varv per minut, 10 timmar. Plasmidbandet avlägsnades, BtBr extraherades 5 gånger med 3 volymer CsCl- mättad isopropanol. DNA dialyserades i 10mM Tris HCl pH8,0, 1 mM EDTA och utfälldes med Et0H.

DNA-manipulationer.

Betingelser för användning av restriktionsendonukleaser och T4 DNA-ligas var de som föreslagits av tillverkaren (New England Biolabs, Inc, USA; Boehringer Mannheim, Germany). Efter uppslutning med restriktionsendonukleas inaktiverades enzymerna genom inkubering i 10 min. vid 6S°C. Analys av plasmíder och DNA-fragment utfördes genom elektrofores i horisontella agaros- plattgeler med Na-acetat (20mM-EDTA), Tris-HCl (33mM) pH 7,8- buffert.

Transformation.

Transformation av cellerna skedde i enlighet med procedu- ren enligt Cohen et al (Ref. 3).

Plasmidstabilitetstest.

Bakteriestammar innehållande plasmíder för test med avseen- de på upprätthållande stabilitet inokulerades på dubbelt selek- tivt minimalt agarplattmedium kompletterat med medium E, 0,2 % glykos ZS pg/ml tryptofan 10 pg/ml uracil och 30 pg/ml ampi- cíllin. Celler från de selektiva plattorna omsuspenderades i färskt Minimal medium E kompletterat med 25 pg/ml tryptofan och 10 pg/ml uracil till en celldensitet av cirka 109 per ml. Kultu- rerna späddes 106 gånger och ínkuberades i en rotationsskakanord- ning vid 37°C eller 30°C. Efter 20 generationers tillväxt ut- späddes kulturerna och proceduren fortsattes under minst 100 generationers tillväxt i det non-selektiva mediet. Vid lämpliga tidpunkter utspäddes alikvota delar av kulturerna och utspreds på LA-plattor. Efter inkubatíon över natten vid 30°C testades 100 kolonier från varje tidpunkt med avseende på närvaro av plasmidmarker genom överföring till Casa- respektive LA + ampi- cillin-plattor under användning av tandpetare. ' 10 15 20 25 30 455 704. 7 Valyl-tRNA-syntetasaktivitet.

Denna aktivitet uppmättes enligt Marchin et al (Ref. 7).

Antranilat-syntetasaktivitet.

För undersökning av antranilatsyntetas Skördades 1,5 x 109-celler och tvättades en gång med kall 0,9 % NaCl. Celler- na omsuspenderades i 0,2 ml 0,1M Tris - 0,1 % Triton X-100 pH 7,8, frystes under 15 min. vid -20°C och upptöades vid 20°C - 37°C. "Lysaten" lagrades på is och antranilatsyntetasaktivi- teten uppmättes inom 2 timmar. En lämplig mängd extrakt i en totalvolym av 50 P1 sattes till 0,5 ml reaktionsmix (0,0S M Tris- pH 7,8, 2 mM Mg acetat, 5 mM L-glutamin, 0,001M DTT och Reaktionsblandningen inkuberades under skakning i 20 min. vid 37°C. Reaktionen avbröts genom kylning och tillsats av 0,1 ml IM ammoniumacetat, pH 4,5. 1,5 ml etylacetat tillsattes och rören roterades lätt för nog- grann blandning. Faserna separerades genom centrifugering vid låg hastighet i 2 min. 0,5 till 1 ml av etylacetatskíktet av- lägsnades för antranilatbestämning i en Aminco-Bowman spektrofo- 0,15 mg/ml bariumchoiismat). tofluorimeter (excitation 310 nm, emission 400 nm). Okända prover är relaterade till standard.

Standard: 1 mM antranilsyra utspäddes 1 till 20 gånger. S0 pl av utspädningen sattes till 0,5 ml reaktionsmíxet och behandlades enligt ovan.

En enhet antranilatsyntetas definieras som mängden enzym som omvandlar 0,1 mikromol chorismat till antranilat under 20 minuter vid s7°c.

Plasmíden enligt uppfinningen, betecknad pSGS21, har depo- nerats under användning av E.Coli, stam GRB238 som värdorganism, hos Deutsche Sammlung für Mikroorganismen, Göttingen, Västtysk- land under depositionsnummer DSM2765. 455 704 8 1. 2. 10.

REFERENSER Bertani, G.: Studies on lycogenesis. I. the mode of phage liberation by lysogenic in Escherichia coli.

J. Bacteriol. 62, (1951) 295-500.

Bolivar, F., Rodriguez, R.L., Greene, P.J., Betlach, M.C., Heyneker, H.L., Boyer, H.W., Crosa, J.H., and Falkow, S.: Construction and characterization of new cloning vehicles. II. A multipurpose cloning system. Gene 2, (1977) 95-115.

Cohen, S.N., Chang, A.C.Y., and Hsu, L.: Nonchromo- somal antibiotic resistance in bacteria: Genetic transformation of Escherichia coli by R-factor DNA.

Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69. (1972) 2110-2114.

Clarke, L., and Carbon, J.A.: A colony bank containing synthetic ColE1 hybrid plasmids representativa of the entire Escherichia coli genome. Cell 9, (1976) 91-99.

Enger-Valk, B.E., Heyneker, H.L., Oosterbaan, R.A., and Pouwels, P.H.: Construction of new cloning vehicles with genes of the tryptophan operon of Escherichia coli as genetic markers. Gene 9, (1980) 9- 5.

Low, B.: Formation of merediploíds in mating with a class of Rec' recipient strains of Escherichia coli K-12. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 60, 19 160-167.

Marchin, G.L., Comer, M.M., and Neidhardt, F.C.: Viral modification of the valyl transfer ribo- nucleic acid synthetase of Escherichia coli J.Bact.chem. 247, (1972) 5152-51E5.

Eid1ic,L., and Neidhardt,F.C.: Protein and nucleic acid synthesis in two mutants of Escherichia coli with temperature-sensitive aminoacyl ribonucleic acid synthetases. J.Bacterio1.89, (1965) 706-711.

Tingle, M.A., and Neidhardt, F.C.: Mapping of a Structural Gene for Valyl-Transfer Ribonucleic Acid Synthetase in Escherichia coli by Transduction.

J- Bact- 98, (1969) 337-339- Vcgel, H.J., and Bonner, D.M.: Acetylornithinase of Escherichia coli: Partial purification and some properties. J. Biol. Chem. 218, (1956) 97-106. 455 704 amvmww d >= mnmä nmuoflww mwwow mmøoaww WwHww\%o§ämdnwHwH u>~oo mMbmM..MHb. WWF. Pwhw. nnhb. nwwflwm »ba nwwvo: iwflm fiwmm. ßv 33% E. cfi? šäïx än? NEW zwfio~šmfiïacdm=fl .Såå ...å wr.a|@w flwww vwwmøwdw w< Hon> zwwzzxw WE.. å? år". Éäï .aa zfiæzâd šë 9.9? 3 mr_o|ww Hwn> w. ro: _w@m ñwmm. av 2 u__o o.m.w.n. ñw. wmnwäwdsv mwwmšwm mmdonww WwHHw\fio5ämdnwwoH uEGB 2.2. äw 9555. 3 3 G3 Cam. 3 nozfiåßm <fiw+ mi. ëwïsøwsmw: E65 <åm+ 2% . - ._ - wmnmfi šäf 38+. 2% - _. - umwmw flHu+ mflwowuimww me mp. _wwo fiwøm. mv umom> nHu+. >üH. ena mnowwzmwmwäwdfl Cflñvwwmdwø flfiwnovøwodmfl mfiwd vmwww wbwmfin w mnoww|mwflofl w uwwwww. 455 704 * odlad över natten 10 Tabell 2.

Rel. va1y1-tRNA- Rel. antranílat- Stam Plasmid syntetasaktívítet syntetasaktivítet W3110 - 1 1 GRB238 - 0 - 61112238 cola-vals* z ,6 - GRB238 pHOV1 8,3 - GRB238 pSGS21 6,2 - 'k GRB238 pSGS21 o/n (10 g) 7,8 5,1 GRB238 pSGS21 180g 7,3 7,6

Claims (10)

11 455 704 PATENTKRAV

1. Bakteriecell innehållande en plaimid med etabilieerad nedärvning innefattande minst en produktionsgen kolinjärt produ- cerad genom genteknologi och ett nukleineyrafragment likaeà kolin- järt introducerat i plaemiden och utgörande genen för valy1-tRNA- -eyntetas, kännetecknad därav att den vid viss förhöjd temperatur saknar valyl-tRNA-syntetaeaktivitet, och att den utgöres av en värdstam uppbärande en mutation som gör det kromoeomalt medierade valyl-tRNA-ayntetasenzymet temperaturkänsligt.

2. Bakteriecell enligt krav 1 tillhörande arten E.coli.

3. Bakteriecell enligt krav 2 vilken utgöres av DSM 2765.

4. Plasmid för framställning av bakteriecellen enligt något av kraven 1 till 3 vilken plaemid har stabiliserad nedärvning och innehåller minst en produktionegen kolinjärt introducerad genom genteknologi, kännetacknad av ett nukleinsyrafragment, vilket är kolinjärt introducerat i plaemiden och utgöres av genen för valyl- -tRNA-eyntetas.

5. Plaemid enligt krav 1, vilken bortsett från produktions- genen och genen för valyl-tRNA-syntetas är härledd från naturligt uppträdande autogenererande genomer i prokaryota organismer.

6. Plasmid enligt krav 1 eller 2, vari produktionsgenen är inriktad pá produktion av en primär metabolit.

7. Flaemid enligt krav 3, vari produktionsgenen är inriktad pa produktion av en aminoeyra, exempelvis tryptofan.

8. Förfarande för framställning av en bakteriecell inrymman- de en autonomt replikerande plaemid innehållande en produktionsgen kolinjärt arrangerad däri, kännetecknat därav, att man i plas~ midens nukleinsyrakedja på i och för sig känt sätt introducerar ett företa nukleinayrafragment innehållande produktionegenen och ett andra nukleinsyrafragment innehållande genen för valyl-tRNA- -ayntetae, varefter plasmiden pa i och för sig känt sätt inför- livas i en bakteriecell.

9. Förfarande enligt krav 8, vari nukleineyrakedjan öppnas medelst restriktioneenzymer, varvid den efterföljande plasmideyn~ tetasen utföres enzymatiekt.

10. Förfarande enligt krav B eller 9, vari ett nukleinsyra- fragment introduceras först och sedan det andra.