CN100419084C - 用于筛选遗传修饰的真核细胞或有机体的毒素/解毒剂遗传系统 - Google Patents

用于筛选遗传修饰的真核细胞或有机体的毒素/解毒剂遗传系统 Download PDF

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Abstract

本发明涉及在其基因组中合并遗传构建体的重组真核细胞或有机体，该遗传构建体由至少一种在可诱导的启动子/操纵子遗传序列控制下的编码毒基因(TOX)的核苷酸序列和可能的筛选标记组成。本发明也涉及通过使用所述重组真核细胞或有机体制备和筛选在它们的基因组中已经整合了异源(外源)DNA片段的遗传修饰的真核细胞或有机体的方法。

Description

用于筛选遗传修饰的真核细胞或有机体的毒素/解毒剂遗传系统
发明领域
[0001]本发明涉及用于筛选遗传修饰的真核细胞(植物、酵母和动物细胞或植物、酵母和动物有机体)的毒素/解毒剂系统。
发明背景
[0002]当打算产生转基因有机体(植物、动物或酵母)时，必然会面临评估将外源DNA片段实际整合入所述有机体或它的部分或全部的细胞的基因组中的主要问题。
[0003]例如在转基因植物中，根瘤农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)通常被用作可将DNA片段引入植物细胞基因组的手段(cf.JP2001029092文件和Zambryski等，1988的出版物)。
[0004]遗憾的是，当外源DNA片段或基因表达时，实验者并不总是能够评估所述DNA片段在植物细胞基因组中的稳定插入。
[0005]确实，在被农杆菌有效定位到植物细胞的细胞核的DNA片段的若干拷贝中，大多数是瞬时表达，只有极小部分(在1/1000-1/10000之间)稳定整合入基因组中(Y.Chupeau，Medicine/science 2001，vol.17，p.856-866的出版物)。
[0006]而且，外源DNA整合入有机体的基因组中的确切位置基本上是不可预知的(Tinland B，Trends Plant Science 1996，vol.1，p.178-184，Bechtold等，Genetics 2000，vol.155，p.1875-1887)。
[0007]而且，同源重组入植物细胞中的频率看来要比“非法”重组的频率约低100倍(Chupeau，Medecine/science 2001，vol.17，p.856-866和Kempin等，Nature 1997，vol.389，p.802-803)。
本发明的目的
[0008]本发明目的是提供鉴定和筛选遗传修饰的细胞和多细胞有机体的方法和手段，该细胞或多细胞有机体已经将外源的DNA片段正确地整合入它们的基因组中，优选地是在特异位点整合所述异源(外源)DNA片段的细胞和有机体。
[0009]本发明的进一步目的是能够筛选通过罕见同源重组事件获得的所述细胞和有机体。
本发明概述
[0010]本发明涉及一种方法和一种毒素/解毒剂遗传系统，用于筛选异源(外源)DNA片段在真核细胞或多细胞有机体的基因组中的稳定插入，并且所述插入也能够准确定位在所述基因组中的特异位点(优选预先定义的)，以及使轻松鉴定插入到所述细胞或有机体的基因组中的所述异源(外源)DNA片段的存在、完整性和正确定向成为可能。
[0011]本发明涉及包含在可诱导启动子/操纵子遗传序列控制下的毒基因和选择标记(例如抗生素抗性基因)的遗传构建体，优选地是毒素，所述遗传构建体被导入真核细胞或真核有机体。
[0012]根据本发明的遗传构建体系统包含编码有毒分子(TOX)的遗传序列(优选地是编码毒素蛋白的核苷酸序列)和可能的选择标记(例如抗生素抗性基因A)，该遗传序列在可诱导的启动子/操纵子遗传序列的控制下。所述的遗传构建体被导入真核细胞或有机体以产生重组细胞或有机体。
[0013]所述的导入，优选地通过使用已知的转染或病毒感染方法完成，该方法使得所述的遗传构建体能够导入真核基因组并且表达。
[0014]真核基因组的意思是存在真核细胞细胞核或也包含遗传物质的特定的细胞区室(叶绿体和线粒体)中的DNA序列。
[0015]适于将所述的遗传构建体导入植物细胞基因组的优选的方法例如相应于Ti质粒的修饰的Ti质粒，该质粒包含所述的遗传构建体，该遗传构建体的两端是LB和RB重复序列的基因边界(Hellens等，2000，Plant Mol Biol 42 vol6，p.819-832；Dennis等，WO0018939)。
[0016]所述的修饰的质粒如下：
LB-TOX-选择标记A-RB
[0017]植物细胞的转染可以通过用包含该修饰的Ti质粒的根瘤农杆菌株感染植物细胞而获得。核酸酶(VirD)将切割下LB-TOX-A-RB片段，该片段然后被定位到植物细胞的细胞核中(通过VirD2和ViE2蛋白的作用)(Rossi等，1996，ProcédéNatl Acad Sci USA 93 vol 1，p.126-130)。通过使用标记A筛选已经整合了所述构建体的植物细胞，即，重组植物细胞。插入标记通过测序或使用相应于毒基因(或相应于标记A)的DNA探针筛选基因文库或使用任何本领域技术人员众所周知的其它的分子生物学技术(基因扩增，例如PCR、绘制图谱等)确定。
[0018]这个方案获得的每个重组细胞系其后可以用于使通过同源重组进入所述的遗传构建体或系统中的任何的异源(外源)DNA片段精确地定位整合入细胞的基因组中。
[0019]外源DNA片段优选地由核酸构建体携带，并且已经正确整合了所述外源DNA片段的遗传修饰细胞的筛选将通过毒基因的表达实现。
[0020]确实，根据本发明的带有毒基因并且整合入重组细胞的基因组中的遗传构建体，以及带有外源DNA片段的核酸构建体被构建使得在所述构建体间同源重组能够发生。在这些条件下，只有已经通过同源重组整合了外源DNA片段的细胞可以存活，因为他们已经用外源DNA片段取代了根据本发明的包含毒基因的构建体。
[0021]如果人们打算进一步保证在重组事件中不只毒基因而且标记A被除去，则标记A可以接界两个毒基因(不同的或相同的)，并且该构建体如下：
LB-TOX-选择标记A-TOX-RB
[0022]因此，任何具有去除两个毒基因的重组事件的细胞也将必然缺少选择标记A。
[0023]根据本发明的遗传构建体中存在的毒基因可以是细菌毒素/解毒剂家族或其衍生物的成员(由本领域技术人员所筛选的所述毒素/解毒剂的遗传修饰的序列，目的是提高它们的毒性)。所述的有毒的分子例如是编码CcdB，ParE，RelE，Kid，Doc，MazE，PemK，Hok蛋白的基因(Engelberg-kulka和Glaser，1999n Annu Rev Microbiol.53，p.43-70；Gabant等，2002，In Recent Res Devel Plasmid Biolp.15-28)。以前表明它们中的一部分在真核细胞中有活性(酿酒酵母和人类细胞，Kristoffersen等，2000，Appl.Environ.Microbiol.66，p5524-5526；Yamamoto等，2002，FEBS letters 519，p191-194.)。描述这个活性用于控制当这些细胞释放到环境中时细胞的存活力，(“基因防护”)(WO99/58652，Gerdes等)。
[0024]解毒剂是例如编码CcdA，Kis，Phd，PemI，SoK蛋白的基因。
[0025]所述毒基因的表达的可能的“泄漏”风险(低，但是可诱导的启动子的活力不是全无)通过使用解毒剂基因解决，该解毒剂基因在可诱导启动子控制下(所述的可诱导启动子和此处上面提及的控制毒基因表达的可诱导启动子相同或不同)。在这种设计下，将解毒剂基因添加在根据本发明的构建体中来控制毒蛋白的表达或活性，并且具有下面的结构：
LB-ANTITOX-TOX-选择标记A-RB.
[0026]另外的可能性是所述的解毒剂遗传序列在也导入真核细胞或真核组织中的游离的DNA中导入。
[0027]因此，毒素/解毒剂遗传系统或构建体可由两个元件组成，一个稳定的毒素和一个不稳定的解毒剂(RNA或蛋白质序列)。这些解毒剂(肽)可以被特异的ATP依赖蛋白酶降解(例如降解ccd系统的CcdA解毒剂的大肠杆菌(Escherichia coli)的Lon蛋白质酶，VanMelderen等，1994，Mol Microbiol 11 vol 6，p.1151-1157)。
[0028]优选地，编码对解毒剂降解特异的蛋白酶的基因导入转基因真核细胞或有机体以使得毒素对它的靶标发挥快速有效的活性。
[0029]尽管本发明适于将外源DNA片段整合入植物细胞，这个系统也可以应用到异源(外源)DNA构建体插入到任何类型的真核细胞中或多细胞有机体(酵母细胞、动物细胞或有机体、例如哺乳动物细胞或昆虫细胞)，优选的前提是所述细胞或有机体必须不是人生殖细胞系、人受精卵、人胚胎或人个体。
[0030]而且，在植物细胞中毒基因和可诱导启动子的结合使使用毒基因作为有效的和完全的转基因系特异的除草剂成为可能。
[0031]本发明的申请要求产生具有特异遗传构建体的植物物种或品种的转基因系。
[0032]所述的改良的遗传构建体由编码有毒分子的基因构成，优选地是在启动子/操纵子遗传序列控制下的编码毒素/蛋白的基因，该启动子/操纵子基因序列由无毒的天然的或人工的化合物诱导。
[0033]无毒的天然或人工的化合物的意思是对植物或环境有毒的或无毒的化合物。
[0034]在当前情况下，获得的转基因植物不需要根除(eradicated)，因为启动子/操纵子遗传序列可以被激活以使得编码有毒分子的基因通过添加上述的化合物能够表达。
[0035]例如，特异的启动子/操纵子遗传序列是通过添加化学化合物控制的那些遗传序列(Zuo和Chua，2000，Curr Opin Biotechnol 11vol 2，p.146-151；Zuo等，Plant Journal 24 vol 2，p.265-273)。
[0036]另外，启动子/操纵子遗传序列也可以是组织特异的以使得植物细胞或组织的一些特异的部分(叶、花等)能够被遗传修饰。
[0037]而且，启动子/操纵子基因序列可以被化合物激活或抑制，该化合物由植物或植物细胞本身合成，优选地在它的发育的特定阶段或在特异组织中。
[0038]因而，组织特异或发育阶段特异的化合物可以是由人工插入到植物基因组中的基因编码的化合物。
[0039]在一些特定的情况下，可以获得包含编码特异的有毒分子(毒蛋白)的核酸序列的遗传构建体，该核酸序列融合于将融合蛋白引导向毒素靶标的序列。
[0040]例如，如果有毒分子是CcdB毒蛋白，所述序列可以融合于可以使构建体产物定位到细胞核的信号蛋白，CcdB的靶标(促旋酶)位于细胞核并且在细胞核里有活性。
[0041]另外，某些特定应用将需要使用特异的毒素序列，其抗真核细胞的活性是最适度以下的。
[0042]因而本发明可以通过导入编码毒素靶标序列(单独地或在外源的上述遗传构建体内)而改良。所述导入和改良可以是对原核细胞、真核细胞或真核有机体细胞基因组的修饰。
[0043]例如，如果CcdB毒素被使用(并且如果所述的CcdB毒素不是对相应的真核促旋酶足够有效)，包括重组原核细胞或有机体的重组细胞可以通过将所述有毒分子的靶标序列导入到它的基因组中而被修饰，优选地是细菌促旋酶基因。
[0044]细菌和真核促旋酶同时存在将不是问题，因为原核促旋酶复合物在原核细胞中表现显性效应。
[0045]而且，靶标毒素也可以被引导到特异细胞区室(叶绿体、线粒体)，在那里毒素也发挥活性。
[0046]因而，根据本发明的遗传构建体也可以直接整合入所述的特异的细胞区室(叶绿体、线粒体)或细胞也可以包含一个或多个特异细胞区室(叶绿体、线粒体)，其中针对所述的有毒分子的解毒剂遗传序列也作为游离的DNA序列而被整合。

Claims (21)

1. 一种重组真核细胞，该真核细胞不是人生殖细胞系、人受精卵，所述细胞包含：
(i)掺入细胞基因组的由至少一个毒基因核苷酸序列组成的遗传构建体，所述毒基因核苷酸序列在第一种可诱导的启动子或操纵子遗传序列控制下编码有毒分子，以及
(ii)编码针对所述有毒分子的解毒剂分子的遗传序列，条件是编码解毒剂分子的遗传序列在所述细胞中不天然存在；而其中所述的编码解毒剂分子的遗传序列被添加到所述构建体或以附加型DNA被引入到所述真核细胞中；
其中，当毒基因存在且表达到重组真核细胞中时，该真核细胞不能存活。
2. 根据权利要求1的重组真核细胞，其中掺入细胞基因组的遗传构建体由至少一个毒基因核苷酸序列和选择标记组成。
3. 根据权利要求1的重组真核细胞，其中编码解毒剂分子的遗传序列在不同于第一种可诱导启动子的第二种可诱导的启动子或操纵子遗传序列控制下。
4. 根据权利要求1的重组真核细胞，其中编码有毒分子的毒基因核苷酸遗传序列是编码选自毒素和解毒剂的毒蛋白的核苷酸序列。
5. 根据权利要求1的重组真核细胞，其中编码有毒分子的毒基因核苷酸遗传序列是编码选自CcdB、ParE、RelE、Kid、Doc、MazF、Hok蛋白的毒蛋白的遗传序列。
6. 根据权利要求1的重组真核细胞，其是植物细胞。
7. 根据权利要求1的重组真核细胞，其是动物细胞。
8. 根据权利要求1的重组真核细胞，其是酵母细胞。
9. 根据权利要求1的重组真核细胞，其中第一种可诱导启动子或操纵子遗传序列由无毒化合物诱导。
10. 根据前述权利要求的任何一项的重组真核细胞，其进一步包含整合入基因组的遗传序列，该遗传序列是有毒分子的靶标或编码有毒分子的靶标。
11. 根据权利要求1的重组真核细胞，其中遗传构建体被整合入特定细胞区室的基因组中。
12. 根据权利要求2的重组真核细胞，其中选择标记接界两个不同或相同的毒基因。
13. 根据权利要求6的重组真核细胞，其中所述植物细胞为遗传修饰的植物细胞。
14. 根据权利要求7的重组真核细胞，其中所述动物细胞为哺乳动物细胞。
15. 根据权利要求9的重组真核细胞，其中无毒化合物是外源化合物。
16. 根据权利要求11的重组真核细胞，其中特定细胞区室是叶绿体或线粒体。
17. 带有异源(外源)DNA片段整合入真核细胞基因组的遗传修饰的真核细胞的制备方法，包括下面的步骤：
(i)提供根据前述的权利要求1-16的任何一项的具有遗传构建体的重组真核细胞，该遗传构建体带有整合在其中的毒基因核苷酸序列，
(ii)提供带有所述异源DNA片段的构建体；
(iii)在步骤(i)所述的遗传构建体被整合的插入位点处，获得步骤(ii)所述的异源(外源)DNA片段在重组真核细胞的基因组内的整合；
(iv)在有毒分子能够在所述细胞中表达的条件下，筛选已经整合了所述异源(外源)DNA片段的遗传修饰的重组真核细胞；并且
(v)回收在整合了异源(外源)DNA片段后不表达所述有毒分子的所述的遗传修饰的重组真核细胞。
18. 根据权利要求17的制备方法，其中所述的异源(外源)DNA片段整合入重组真核细胞的基因组中。
19. 根据权利要求17或18的方法，其中所述的真核细胞是转染了整合的毒基因的Ti质粒的植物细胞。
20. 根据权利要求19的重组的方法，其中整合的毒基因的Ti质粒存在于根瘤农杆菌中。
21. 根据权利要求19的方法，其中完整的转基因植物获自回收的遗传修饰的植物细胞。
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