JP4564754B2 - 遺伝的に改変された真核細胞又は生物の選択のための毒物／解毒剤遺伝子系 - Google Patents

Description

本発明は、遺伝的に改変された真核細胞（植物、酵母及び動物細胞、又は植物、酵母及び動物）の選択のための毒物／解毒剤遺伝子系に関する。

トランスジェニック生物（植物、動物又は酵母）を作成しようと試みる場合、前記生物又はその細胞のいくつか又は全てのゲノム中への外因性ＤＮＡ断片の実際の組込みを評価するという主要な問題に必然的に直面する。

例えばトランスジェニック植物では、アグロバクテリウム ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）はＤＮＡ断片を植物細胞ゲノム中に導入するための手段として一般的に用いられている（文献ＪＰ ２００１２９０９２及びＺａｍｂｒｙｓｋｉら、１９８８年の論文を参照）。

不運なことに、外因性ＤＮＡ断片又は遺伝子が発現される場合、植物細胞ゲノム中への前記ＤＮＡ断片の安定な挿入を評価することは実験者にとっていつも可能であるとは限らない。

実際、植物細胞の核へとアグロバクテリウムによって効果的にターゲッティングされるＤＮＡ断片のいくつかのコピーのうち、大部分は一過的に発現され、少量の断片（１／１０００〜１／１００００）だけがゲノム中に安定に組込まれる（Ｙ.Ｃｈｕｐｅａｕ，Ｍｅｄｅｃｉｎｅ／ｓｃｉｅｎｃｅ ２００１，ｖｏｌ．１７，ｐ．８５６〜８６６の論文）。

さらに、生物ゲノム中に組込まれる外因性ＤＮＡの正確な位置は基本的に予測不可能である（Ｔｉｎｌａｎｄ Ｂ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９６，ｖｏｌ．１，ｐ．１７８〜１８４，Ｂｅｃｈｔｏｌｄ ら．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２０００，ｖｏｌ．１５５，ｐ．１８７５〜１８８７）。

さらに、植物細胞中への相同組換えの率は「非正統的」組換えの率の約１００分の１であるようにみえる（Ｃｈｕｐｅａｕ，Ｍｅｄｅｃｉｎｅ／ｓｃｉｅｎｃｅ ２００１，ｖｏｌ．１７，ｐ．８５６〜８６６及びＫｅｍｐｉｎら、Ｎａｔｕｒｅ １９９７，ｖｏｌ．３８９．ｐ．８０２〜８０３）。

発明の目的
本発明は、外来外因性ＤＮＡ断片がゲノム中に正確に組込まれた遺伝的に改変された細胞及び多細胞生物の特性決定及び選択のための、好ましくは前記外来（外因性）ＤＮＡ断片が特定の位置に組込まれた細胞及び生物の特性決定及び選択のための方法及び手段を与えることを目的とする。

本発明のさらなる目的は、まれな相同組換え事象によって得られた前記細胞及び生物の選択を可能とすることである。

発明の概要
本発明は、真核細胞又は多細胞生物のゲノム中への外来（外因性）ＤＮＡ断片の安定な挿入の選択のために用いられる方法及び毒物／解毒剤遺伝子系に基づいており、前記ゲノム中の特定の（好ましくは予め決められた）位置への前記挿入の正確なターゲッティンングを可能とし、前記細胞又は生物のゲノム中への前記挿入された外来（外因性）ＤＮＡ断片の存在、完全さ及び正確な配向を容易に特性決定する可能性を与える。

本発明は、誘導性プロモーター／オペレーター遺伝子配列の制御下にある毒性遺伝子、好ましくは毒物、及び選択性マーカー（抗生物質耐性遺伝子の如き）を含む遺伝子構築物に基づいており、前記遺伝子構築物は真核細胞又は真核生物中に導入される。

本発明による系の遺伝子構築物は、誘導性プロモーター／オペレーター遺伝子配列の制御下にある毒性分子（ＴＯＸ）（好ましくは毒物タンパク質をコードするヌクレオチド配列）をコードする遺伝子配列及び所望により選択性マーカー（抗生物質耐性遺伝子Ａの如き）を含む。前記遺伝子構築物は、組換え細胞又は生物を作成するために真核細胞又は生物中に導入される。

前記導入は、公知のトランスフェクション又は前記遺伝子構築物の真核生物のゲノム中への導入及びその発現を可能にするウィルス感染の使用によって得られることが好ましい。

真核生物ゲノムは、真核細胞の核又は遺伝的材料も含む特定の細胞区画（葉緑体及びミトコンドリア）に存在するＤＮＡ配列を意味する。

植物細胞のゲノム中への前記遺伝子構築物の導入のための好適な好ましい手段は、例えばＬＢ及びＲＢ繰り返し遺伝子境界によって挟まれた前記遺伝子構築物を含むＴｉプラスミドに相当する改変されたＴｉプラスミドである（Ｈｅｌｌｅｎｓら、２０００，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ４２ ｖｏｌ．６，ｐ.８１９〜８３２；Ｄｅｎｎｉｓら、ＷＯ ００１８９３９）。

前記の改変されたプラスミドは以下のようなものであろう：
ＬＢ−ＴＯＸ−選択性マーカーＡ−ＲＢ

植物細胞のトランスフェクションは、この改変されたＴｉプラスミドを含むアグロバクテリウム ツメファシエンス株で植物細胞を感染させることによって得ることができる。ヌクレアーゼ（ＶｉｒＤ）がＬＢ−ＴＯＸ−Ａ−ＲＢ断片を切り出し、これは次に植物細胞の核に（ＶｉｒＤ２及びＶｉＥ２タンパク質の作用を介して）ターゲティングされる（Ｒｏｓｓｉら、１９９６，Ｐｒｏｃｅｄｅ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９３ ｖｏｌ．１，ｐ．１２６〜１３０）。前記構築物を組込まれた植物細胞、即ち組換え植物細胞はマーカーＡを用いて選択される。挿入のマーカーは配列決定又は毒性遺伝子（又はマーカーＡ）に対応するＤＮＡプローブを用いたゲノムライブラリーのスクリーニング又は当業者には周知のいかなる他の分子生物学的手法（ＰＣＲの如き遺伝子増幅、マッピング等）によって決定される。

このプロトコールを通して得られた各組換え細胞系はその後、前記遺伝子構築物又は系中への相同組換えによる細胞のゲノム中へのいかなる外来（外因性）ＤＮＡ断片の正確にターゲッティングされた組込みのために用いられることができる。

外因性ＤＮＡ断片は核酸構築物によって担持されることが好ましく、前記外因性ＤＮＡ断片が正確に組込まれた遺伝的に改変された細胞の選択は毒性遺伝子の発現を通して達成されるであろう。

実際、毒性遺伝子を担持しかつ組換え細胞のゲノム中に組込まれている本発明による遺伝子構築物並びに外因性ＤＮＡ断片を担持する核酸構築物は、前記構築物間の相同組換えが起こることができるように構築されている。これらの条件下では、相同組換えを通して外因性ＤＮＡ断片を組込まれた細胞のみが生き残るであろう。何故なら、それらは毒性遺伝子を含む本発明による構築物を外因性ＤＮＡ断片によって置換されているからである。

もし毒性遺伝子のみならずマーカーＡもが組換え事象中に除去されることをさらに確実にしたいのなら、マーカーＡは二つの毒性遺伝子（異なるか又は同一）によって挟まれることができ、構築物は以下のようになるであろう：
ＬＢ−ＴＯＸ−選択性マーカーＡ−ＴＯＸ−ＲＢ

従って、二つの毒性遺伝子を除去する組換え事象を有するいかなる細胞も選択性マーカーＡを必然的に欠くであろう。

本発明による遺伝子構築物中に存在する毒性遺伝子は、細菌の毒物／解毒剤ファミリーのメンバー又はそれらの誘導体（それらの毒物特性を改良するために当業者によって選択された前記毒物／解毒剤の遺伝的に改変された配列）であることができる。前記毒物分子は例えばＣｃｄＢ，ＰａｒＥ，ＲｅｌＥ，Ｋｉｄ，Ｄｏｃ，ＭａｚＥ，ＰｅｍＫ，Ｈｏｋタンパク質をコードする遺伝子である（Ｅｎｇｅｌｂｅｒｇ−ｋｕｌｋａ及びＧｌａｓｅｒ，１９９９ｎ Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５３，ｐ．４３〜７０；Ｇａｂａｎｔら、２００２，Ｉｎ Ｒｅｃｅｎｔ Ｒｅｓ Ｄｅｖｅｌ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｂｉｏｌ ｐ.１５〜２８）。これらのうちのいくつかは真核細胞で活性があることが以前に示されている（ｙｅａｓｔ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ａｎｄ ｈｕｍａｎ ｃｅｌｌｓ，Ｋｒｉｓｔｏｆｆｅｒｓｅｎら、２０００，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６６，ｐ．５５２４〜５５２６；Ｙａｍａｍｏｔｏら、２００２，ＦＥＢＳ ｌｅｔｔｅｒｓ ５１９，ｐ．１９１〜１９４）。この活性はこれらの細胞が環境中に放出された（「遺伝子汚染」）ときに細胞の生存力を制御するために用いられることが記載されている（ＷＯ ９９／５８６５２，Ｇｅｒｄｅｓら）。

解毒剤は例えばＣｃｄＡ，Ｋｉｓ，Ｐｈｄ，ＰｅｍＩ，Ｓｏｋタンパク質をコードする遺伝子である。

前記毒物遺伝子の発現の起こりうる「漏出」の危険（誘導性プロモーターの低いがゼロではない活性によるもの）は、誘導性プロモーター（この誘導性プロモーターは上述した毒物遺伝子の発現を制御する誘導性プロモーターと同一であるか又はそれとは異なる）の制御下にある解毒剤遺伝子の使用によって解決される。このスキーム下では、解毒剤遺伝子は毒物タンパク質の発現又は活性を制御するために本発明による構築物に加えられ、以下の配置を有するであろう：
ＬＢ−ＡＮＴＩＴＯＸ−ＴＯＸ−選択性マーカーＡ−ＲＢ

他の可能性は、真核細胞又は真核生物に導入されたエピソームＤＮＡ中に前記解毒剤遺伝子配列を導入することである。

それ故、毒物／解毒剤遺伝子系又は構築物は二つの要素、つまり安定な毒素と不安定な解毒剤（ＲＮＡ又はタンパク質配列）からなることができる。これらの解毒剤（ペプチド）は特定のＡＴＰ依存性プロテアーゼ（ｃｃｄ系のＣｃｄＡ解毒剤を分解するエシェリキア コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）のＬｏｎプロテアーゼの如き。Ｖａｎ Ｍｅｌｄｅｒｅｎら、１９９４，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ １１ ｖｏｌ．６，ｐ．１１５１〜１１５７）によって分解されることができる。

解毒剤分解に対して特異的なこのプロテアーゼをコードする遺伝子は、毒物のターゲット到達時のその迅速かつ効果的な活性を可能とするためにトランスジェニック真核細胞又は生物に導入されることが好ましい。

本発明は植物細胞中への外因性ＤＮＡ断片の組込みのために好適であるが、この系は、好ましくは細胞又は生物がヒトの胚細胞系、ヒトの接合子、ヒト胎児又はヒト個体でないという前提条件の下で、いかなる種類の真核細胞又は多細胞生物（酵母細胞、哺乳動物細胞又は昆虫細胞の如き動物細胞又は生物）への外来（外因性）ＤＮＡ構築物の挿入のために適用されることもできる。

さらに、植物細胞中での毒性遺伝子と誘導性プロモーターの組合せは、毒性遺伝子を効率的かつ完全にトランスジェニック系特異的除草剤として用いる可能性を開く。

本発明のこの応用は、特定の遺伝子構築物を用いた植物種又は品種のトランスジェニック系の作成を必要とする。

前記の改良された遺伝子構築物は、非毒性の天然又は人造化合物によって誘導可能なプロモーター／オペレーター遺伝子配列の制御下にある毒性分子をコードする遺伝子、好ましくは毒物／タンパク質をコードする遺伝子から作られる。

非毒性の天然又は人造化合物は、植物又は環境にとって毒性であるか又は毒性でない化合物を意味する。

この場合、得られたトランスジェニック植物は根絶される必要はないであろう。何故なら、プロモーター／オペレーター遺伝子配列は上述の化合物の添加によって毒性分子をコードする遺伝子の発現を可能にするために活性化されることができるからである。

例えば、特定のプロモーター／オペレーター遺伝子配列は化学化合物の添加によって制御されるものである（Ｚｕｏ及びＣｈｕａ，２０００ Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １１ ｖｏｌ．２，ｐ．１４６〜１５１；Ｚｕｏら、２０００，Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ ２４ ｖｏｌ．２，ｐ．２６５〜２７３）。

加えて、プロモーター／オペレーター遺伝子配列は、植物細胞又は組織のある特定の部分（葉、花など）が遺伝的に改変されることを可能にするために、組織特異的であることもできる。

さらに、プロモーター／オペレーター遺伝子配列は植物又は植物細胞自体によって好ましくはその発生の特定の段階で又は特定の組織で合成される化合物によって活性化又は抑制されることができる。

それ故、組織特異的又は発生段階特異的化合物は、植物ゲノム中に人工的に挿入される遺伝子によってコードされる化合物であることができる。

ある特定の場合では、融合タンパク質を毒物ターゲットへと案内する配列に融合された特定の毒性分子（毒物タンパク質）をコードする核酸配列を含む遺伝子構築物を得ることができる。

例えば、もし毒性分子がＣｃｄＢ毒物タンパク質であるなら、前記配列はＣｃｄＢのターゲット（ジャイレース）が位置しており活性である核へと構築物生成物をターゲッティングするシグナルタンパク質に融合されることができる。

さらに、ある特定の応用は、真核細胞に対する活性が最適状態に及ばない特定の毒物配列の使用を必要とするであろう。

それ故、本発明は毒物ターゲットをコードする配列の導入（上述の外因性遺伝子構築物内の又はこの構築物とは別の）によって改良されることができる。前記導入及び改変は、原核細胞、真核細胞又は真核生物の細胞ゲノムの改変であることができる。

例えば、組換え原核細胞又は生物を含む組換え細胞は、前記毒性分子のターゲット配列（もしＣｃｄＢ毒物が用いられるのなら（そしてもし前記ＣｃｄＢ毒物が対応する真核生物のジャイレースに対して十分効果的でないのなら）細菌のジャイレース遺伝子であることが好ましい）のそのゲノム中への導入によって改変されることができる。

細菌のジャイレースと真核生物のジャイレースの共出現は問題とはならないであろう。何故なら、ＣｃｄＢ＋原核生物のジャイレースの複合体は原核生物中でと同様に優勢な効果を奏するからである。

さらに、ターゲット毒物は、毒物が活性であることを意図される特定の細胞区画（葉緑体、ミトコンドリア）へと案内されることもできる。

それ故、本発明による遺伝子構築物は前記特定の細胞区画（葉緑体、ミトコンドリア）中へ直接組込まれることもできるか、又は細胞は一以上の特定の細胞区画（葉緑体、ミトコンドリア）を含むことができ、前記毒性分子に対する解毒剤遺伝子配列はエピソームＤＮＡ配列として組込まれることもできる。

Claims (15)

1. ヒトの胚細胞系、ヒトの接合子、ヒト胎児又はヒト個体を除く組換え真核細胞又は生物であって、ゲノム中に
   （ｉ）第１の誘導性プロモーター／オペレーター遺伝子配列の制御下にある毒性遺伝子（ＴＯＸ）をコードする少なくとも一つのヌクレオチド配列及び所望により選択性マーカーから作られている遺伝子構築物、及び
   （ｉｉ）前記毒性分子に対する解毒剤分子をコードする遺伝子配列（ＡＮＴＩＴＯＸ）であって、前記細胞又は生物中には本来存在せず、かつ第１の誘導性プロモーター／オペレーター遺伝子配列とは異なる第２の誘導性プロモーター／オペレーター遺伝子配列の制御下にある遺伝子配列
   が組込まれており、前記毒性分子に対する解毒剤分子をコードする遺伝子配列は構築物に追加されているか又は真核細胞又は生物に導入されたエピソームＤＮＡ中に存在する組換え真核細胞又は生物。
2. 毒性分子をコードする遺伝子配列が、毒物群から選択される毒物タンパク質をコードする遺伝子配列である請求項１記載の組換え真核細胞又は生物。
3. 毒性分子をコードする遺伝子配列が、ＣｃｄＢ，ＰａｒＥ，ＲｅｌＥ，Ｋｉｄ，Ｄｏｃ，ＭａｚＦ，及びＨｏｋタンパク質からなる群から選択される毒物タンパク質をコードする遺伝子配列である請求項２記載の組換え真核細胞又は生物。
4. 植物又は植物細胞である請求項１〜３のいずれか一項記載の組換え真核細胞又は生物。
5. 動物細胞又は動物である請求項１〜３のいずれか一項記載の組換え真核細胞又は生物。
6. 哺乳動物の細胞又は哺乳動物である請求項５記載の組換え真核細胞又は生物。
7. 酵母細胞である請求項１〜３のいずれか一項記載の組換え真核細胞又は生物。
8. 誘導性プロモーター／オペレーター遺伝子配列が非毒性化合物によって誘導される請求項１〜７のいずれか一項記載の組換え真核細胞又は生物。
9. 誘導性プロモーター／オペレーター遺伝子配列が外因性化合物又は真核細胞又は真核生物自体によってその発生の特定の段階で又は特定の組織で合成される化合物によって誘導される請求項８記載の組換え真核細胞又は生物。
10. 毒性分子のターゲットである遺伝子配列又は毒性分子のターゲットをコードする遺伝子配列をゲノム中に組込まれた形でさらに含む請求項１〜９のいずれか一項記載の組換え真核細胞又は生物。
11. 遺伝子構築物が葉緑体又はミトコンドリアの如き特定の細胞区画のゲノム中に組込まれている請求項１〜１０のいずれか一項記載の組換え真核細胞又は生物。
12. 選択性マーカーが二つの同一又は異なる毒性遺伝子によって挟まれている請求項１〜１１のいずれか一項記載の組換え真核細胞又は生物。
13. 下記工程を含む、ゲノム中に外来（外因性）ＤＮＡ断片が組込まれた遺伝的に改変された、ヒトの胚細胞系、ヒトの接合子、ヒト胎児又はヒト個体を除く真核細胞又は生物の作成及び選択方法：（ｉ）組込まれた毒性遺伝子を担持する遺伝子構築物を有する請求項１〜１２のいずれか一項の組換え真核細胞又は生物を準備し；（ｉｉ）前記外来ＤＮＡ断片を担持する構築物を準備し；（ｉｉｉ）組換え真核細胞のゲノム中に、遺伝子構築物が組込まれた挿入部位で前記外来（外因性）ＤＮＡ断片の配列と組換え真核細胞又は生物のゲノム中に組込まれた遺伝子構築物の配列との間の相同組換えによって前記外来（外因性）ＤＮＡ断片の組込みを得；（ｉｖ）前記外来（外因性）ＤＮＡ断片が組込まれた遺伝的に改変された真核細胞又は生物を前記細胞又は生物中での毒性分子の発現を可能にする条件下で選択し；そして（ｖ）外来（外因性）ＤＮＡ断片の組込み後、前記毒性分子を発現しない前記遺伝的に改変された真核細胞又は生物を回収する。
14. 前記真核細胞又は生物が、毒性遺伝子を組込むＴｉ−プラスミドによってトランスフェクトされた植物又は植物細胞であり、完全なトランスジェニック植物は回収された遺伝的に改変された植物細胞から所望により得られる請求項１３記載の方法。
15. Ｔｉ−プラスミドがアグロバクテリウム ツメファシエンス中に存在するＴｉ−プラスミドである請求項１４記載の方法。