JPH06315381A - 植物細胞内で発現するキメラ遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 本発明は植物細胞内でポリぺプチドを発現す
ることができるキメラ遺伝子を提供する。 【構成】 本発明は、 （ａ）植物ウイルス由来のプロモーター領域； （ｂ）５′非翻訳領域； （ｃ）構造コード配列； （ｄ）ｍＲＮＡのポリアデニル化シグナル配列をコード
し、植物内で天然に発現される遺伝子の３′非翻訳領
域；を順番に含み、前記構造コード配列が前記プロモー
ター領域に対して異種である、植物細胞内でポリぺプチ
ドを発現することができるキメラ遺伝子に関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】この研究は遺伝子工学、植物生物
学、微生物学の分野に関するものである。

【０００２】

【従来技術】過去１０年間の間に、遺伝子工学は急速に
発展した。異種生物の遺伝子をバクテリアの細胞内に入
れ、そのバクテリアに組み込まれた遺伝子の形質を発現
させるという手法が数多く知られている。この場合、通
常プラスミドを使用する、そのプラスミドは、以下述べ
るようにレストリクション・エンドヌクレアーゼによっ
て、一つまたはいくつかの部分に分割できる。典型的な
方法は、一つのＤＮＡ鎖を分割して得た遺伝子を、プラ
スミドのようなベクターを分割して得たものと混ぜ合わ
せる、というものである。種々のＤＮＡはつなぎ合わさ
れて、新しくプラスミドを再構成する。Ｕ．Ｓ．パテン
ト４，２３７，２２４（コーエン・ボイヤー、１９８
０）；４，２６４，７３１（シャイン、１９８１）；
４，２７３，８７５（マニス、１９８１）；４，３２
２，４９９（バクスター等、１９８２）；４，３３６，
３３６（シルヘイビー等、１９８２）を参照。この他に
も参考になるような例は数多くある。ある論文には、Ｄ
ＮＡの情報がメッセンジャーＲＮＡに転写され、メッセ
ンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の情報がタンパク質へうつ
し取られていく過程が説明されている。例えば、ストラ
イヤー、１９８１（註：パテント以外のここに記載され
ている参考は、すべて例の後に引用されている）、レー
ニンジャー、１９７５。その他の論文は、遺伝子操作の
方法、生産物について述べている。マニアティス等、１
９８２；セットロー・ホレンダー、１９７９を参照。

【０００３】今までに行われてきた遺伝子工学の研究で
は、遺伝子は種々の細胞、主に大腸菌のようなバクテリ
テア、イーストなどの微生物、あるいは哺乳動物の細胞
へ組こまれてきた。動物の細胞や微生物の細胞に用いら
れた技術や物質は、植物を用いる遺伝子工学にそのまま
利用することはできない。

【０００４】ここで用いられている通り "植物" という
言葉は、多細胞の分化の進んだ個体、被子植物や多細胞
の藻類のように光合成を行うものを表している。バクテ
リテアやイーストなどの微生物、菌類はこの仲間に入ら
ない。しかし "植物細胞" という場合には植物から得ら
れる細胞ならなんでも、例えばカルス、樹冠の虫こぶ
（腫腸）のように未分化の組織、植物の種子、珠芽、花
粉、植物の胚などにも適用されている。

【０００５】数多くの植物遺伝子が単離されており、販
売されているものもあり、又、そうでなくても公に手に
入れることのできるものもある。そのような遺伝子に
は、大豆のアクションジーン（シャー等、１９８２）、
コーゼイン（ペダーソン等、１９８２）、大豆レジモグ
ロビン（ハイルデイッヒ・ニールセン等、１９８２）、
大豆貯蔵たんぱく（フイッシャー、ゴールドバーグ、１
９８２）がある。

【０００６】遺伝子の様々の領域 遺伝子が形質を発現する場合には、遺伝子から遺伝情報
を受け取ったポリペプチドが形成される。この過程は、
少なくとも二つの段階でできている。まず遺伝子の一部
を転写したメッセンジャーＲＮＡができ、そのメッセン
ジャーＲＮＡの一部分がポリペプチドに翻訳される。転
写、翻訳の過程は完全には解明されていないが、ＤＮＡ
配列がメッセンジャーＲＮＡに転写される場合、ＤＮＡ
の何個所かの領域でコントロールされている、と考えら
れている。ＤＮＡのそれぞれの部位とは、一連の塩基の
配列のことである。（つまり、アデノシン（Ａ）、チミ
ジン（Ｔ）、シテイジン（Ｃ）、グアニジン（Ｇ）でで
きているヌクレオチド残基がある順序に配列したもので
ある。）真核生物の遺伝子に、一般的に存在している領
域を図１に示す。これらの領域については、それぞれ名
前がつけられて簡単に説明されている。さらに、これら
の領域についてもう少しくわしく説明を加えるため様々
な用語が使われていることに注意が必要である。

【０００７】アソシエーションレイジョン２は、ＲＮＡ
ポリメラーゼをＤＮＡの断片に会合させる。アソシエー
ションレイジョン２は転写されないが、この遺伝子領域
の働きで、活性化された後、ＲＮＡポリメラーゼは、イ
ンタービーニングレイジョン４にそってある距離（例え
ば塩基１００〜３００個位）移動する。

【０００８】転写開始シークエンス６は、ＲＮＡポリメ
ラーゼに命令を下し、ｍＲＮＡの合成を開始する。適当
な信号を受け取るとＲＮＡポリメラーゼは、転写開始シ
ークエンス６をある距離だけ（例えば塩基２０〜３０個
分）越えてｍＲＮＡの合成を始める、と考えられてい
る。これは図１にインタービーニングレイジョン８とし
て表されている。

【０００９】それ以前の配列は、遺伝子プロモーター領
域と、集合的に呼ばれている。ＤＮＡの次の塩基配列は
ＲＮＡポリメラーゼの作用でメッセンジャーＲＮＡに転
写される。しかしこれが翻訳されてタンパク質が生産さ
れるということはない。一般に、ｍＲＮＡの５′末端は
リボソームに付着している。バクテリアの細胞では、
"リボソーム結合部位" （ＲＢＳ）と呼ばれる塩基の配
列で、接着が容易になっている。しかしながら、真核生
物の細胞では、ＲＢＳの存在は確かめられていない。ｍ
−ＲＮＡ鎖にＲＢＳが存在するかしないかに拘わらず、
ｍＲＮＡはリボソームにそって開始コドンに到達するま
で移動する。開始コドンは通常ＡＵＧという三個の塩基
配列でできている。まれに、ＧＵＧというコドンから翻
訳が開始されることもある。ｍＲＮＡの５′末端と開始
コドンの間にある、翻訳されない部分は、ｍＲＮＡの
５′非翻訳領域１０と呼ばれている。ＤＮＡのこれに相
当する部分はここでは、５′非翻訳領域１２と呼ばれて
いる。ＤＮＡのこの部分の塩基の特殊な配列は、遺伝子
の形質発現に重要であるとは考えられていない。しか
し、完成していない開始コドンが存在することで、ｍＲ
ＮＡの翻訳に影響がでることもあると言われている。コ
ザック１９７８参照。

【００１０】プロモーターシークエンスは、上述した以
上に複雑であろう。例えば、バクテリアに存在するある
種のプロモーターには "オペレーター" と呼ばれる制御
シークエンスがある。その様な複雑なプロモーターに
は、遺伝子の誘導あるいは抑制に関係している一つまた
はそれ以上のシークエンスが存在することが多い。一つ
の例はラックオペロンと言われるものでこれは、細胞中
に乳糖が存在しなければ、乳糖利用酵素の転写を促進す
ることはない。もう一つの例はｔｒｐオペレーターと呼
ばれるもので、細胞中にトリプトファンが過剰に存在す
ると、トリプトファン生成酵素の転写、翻訳を促すとい
うことはない。ミラー・レニコフ、１９８２参照。

【００１１】次の塩基配列は、コーディングシークエン
スまたは構造シークエンス１４（ＤＮＡ分子におい
て）、あるいは１６（ｍＲＮＡ分子内で）と呼ばれてい
る。上述したようにポリペプチドの翻訳は、ｍＲＮＡの
開始コドン（普通はＡＵＧである）が、リボソームの翻
訳メカニズムに到達した時に始まる。開始コドンの命令
で、リボソームは、メチオニンを出発点として各種アミ
ノ酸をペプチド結合で結合させ、ポリペプチドを形成す
る、メチオニンは、常にポリペプチドのアミノ基末端と
なる。（このメチオニン残基はその後、ほかの酵素の作
用でポリペプチドから切り離される）ＡＵＧ、開始コド
ンに続く塩基は、３個ずつ１組となりそれぞれコドンと
なる。塩基がどのように３つ組にグループ分けされてい
くかを規定する "リーディング・フレイム" は、開始コ
ドンにより決まる。それぞれのコドンは、形成されつつ
あるポリペプチドへの特別のアミノ酸を加えていく遺伝
情報である。遺伝暗号（６４個の異なったコドンがある
が）はすべて解読されている。レーニンジャーの序文９
６２頁参照、例えばＣＵＡは、ロイシンというアミノ酸
に対応する暗号であり、ＧＧＵはグリシン、ＵＧＵはシ
ステインの暗号である。

【００１２】三つのコドン（ＵＡＡ、ＵＡＧ、ＵＧＡ）
は停止コドンである。停止コドンがリボソームの翻訳メ
カニズムに到達すると、形成されていたポリペプチドは
リボソームから離れ、最後のアミノ酸残基がポリペプチ
ドのカルボキシル末端となる。

【００１３】モノシストロニック遺伝子中の３′側の停
止コドンにあるｍＲＮＡの部分は、ここでは、３′−非
翻訳領域１８と呼ばれている。この領域１８は、ｍＲＮ
Ａが転写された後、そのｍＲＮＡの処置、安定化あるい
は輸送に関係していると考えられている。またこのレイ
ジョン１８には、細胞内に存在するある種の酵素により
認識されるポリアデニレイションシグナル２０という塩
基配列があると考えられている。この酵素は、相当量の
アデノシン残基をｍＲＮＡに加え、ポリ−Ａテイル２２
を形成する。

【００１４】ＤＮＡ分子には３′非翻訳領域２４とポリ
アデニレーションシグナル２６があり、それぞれｍＲＮ
Ａの領域１８、シグナル２０の遺伝情報を指定してい
る。しかし、ＤＮＡ分子には、ポリ−Ａテイルはない。
ｍＲＮＡのポリアデニレーションシグナル２０、ＤＮＡ
のポリアデニレーションシグナル２６は図中、大きな点
で示されている。

【００１５】遺伝子−宿主不適合性 地球上のすべての生物体に、同じ遺伝暗号が適用され
る。コドンに対応するアミノ酸は、植物、動物、微生物
等あらゆる生物に共通である。しかし、遺伝暗号となる
のは遺伝子の構造シークエンスだけである。これは、あ
る開始コドンから停止コドンまでのｍＲＮＡで、ｍＲＮ
Ａを翻訳してポリペプチドが形成される場合の遺伝情報
を持っている。

【００１６】しかし、ある種の細胞の中で効率よく働く
遺伝子が別の種類の異なった細胞では全然働かないとい
うこともありうる。例えば、Ｅ．Ｃｏｌｉで形質を発現
する遺伝子が、異なったタイプのバクテリアの細胞、菌
類、イーストに運ばれていき、その新しい宿主のもとで
は、形質を発現しないこともある。ある完全な遺伝子
か、ある細胞内では形質を発現するが別の細胞では発現
しないということに関しては様々な理由が考えられる。
坂口：岡西、１９８１参照。このような理由として次の
事柄が挙げられる。

【００１７】１．遺伝子が複製されない、又は新しい宿
主細胞の子孫に安定して受け継がれていかない。

【００１８】２．遺伝子が新しい宿主細胞のレストリク
ションエンドヌクレアーゼあるいはその他の酵素で分解
されてしまう。

【００１９】３．新しい宿主細胞のＲＮＡポリメラーゼ
が、遺伝子のプロモーターレイジョンを認識しない。

【００２０】４．ＤＮＡのある領域が、宿主ＤＮＡのオ
ペレーターあるいはその他の制御シークエンスと似てい
るため、遺伝子の一部が宿主細胞のリプレッサーたんぱ
く質、あるいは他の分子と結合する。例えば、ラックオ
ペロンにはあるポリペプチドがあり、このペプチドは、
ポリペプチド自身がラクトースで不活性化されないと、
ラックプロモーターと隣り合ったある配列の塩基と結合
する。ミラー・レッニコフ、１９８２参照。

【００２１】５．遺伝子の一部分が削り取られてしまっ
たり、再構成されたり、移動して、宿主ゲノムの他の場
所に付着する例えば、数多くの原核生物の細胞中に遺伝
子組み換えを促進する酵素があるということが知られて
いる。（例えば大腸菌のレックプロテイン、Ｓｈｉｂａ
ｔａ等、１９７９参照）また、転座を促す酵素もある。
（第４５回、計量生物学コールドスプリングハーバーシ
ンポジウム、１９８１参照）。更に、異なったＤＮＡ鎖
の類似部分で自然遺伝子修飾が多く現れる。ラディン
グ、１９７８参照。

【００２２】６．遺伝情報を転写したｍＲＮＡに種々の
問題が生じる。例えば、リボソームに達する前に品質が
低下することがあり、ポリアデニン化されなかったり、
リボソームに運搬されていかないこともあり、リボソー
ムとうまく適合しないこともあり、大切な部分が、ＲＮ
Ａプロセシング酵素で削り取られてしまうこともある。

【００２３】７．遺伝子の遺伝情報を受け取ったｍＲＮ
Ａを翻訳して形成されたポリペプチドに問題が起こるこ
ともある。例えばポリペプチドが細胞に毒性を現す、グ
リコシル化され、あるいは変換されて変性ポリペプチド
に変わってしまう、分割されて小さなポリペプチドある
いはアミノ酸になる、細胞内の小さな部分に閉じ込めら
れてしまい、そこでは作働できないというようなことが
起こる可能性もある。

【００２４】一般に、新しい宿主細胞がもとの宿主細胞
とかなり異なっている場合、外から入ってきた遺伝子が
新しい細胞の中で形質を発現する可能性は小さくなる。
例えば、同じ「属」に属していれば、ある「種」のバク
テリアの遺伝子は別の「種」のバクテリアに移されても
発現する可能性が大きい。異なった「属」のバクテリア
内での発現の可能性は小さくなり、バクテリア以外の微
生物イースト、菌類、藻類の細胞内での発現の可能性は
更に小さくなる。ある１つの「界」に属する生物（植物
界、動物界、微生物界のうちの一つ）の細胞から取り出
した遺伝子が別の「界」の生物の細胞で発現するという
ことはほとんど考えられない。

【００２５】これらの問題があるために、これまで植物
細胞で外来遺伝子の形質を発現させることはできなかっ
た。ある植物細胞に、他の生物のＤＮＡを組み込む研究
を報告したグループもある。ラルギン、１９７９、クレ
ンス等、１９８２；デイベイ等、１９８０を参照。少な
くとも三グループが植物細胞に完全な遺伝子を組み込む
方法について報告している。放射性ＤＮＡを用いて、外
来遺伝子又はその一部が、植物細胞の子孫に安定して受
け継がれていることが証明された。ヘルナルステーン
等、１９８０；ガルフィンケル等、１９８１；マック・
チルトン、１９８１を参照。しかし外来遺伝子が、植物
細胞で発現したという報告はない。遺伝子−宿主不適合
性に、いくつかの例外があることが発見された。例え
ば、大腸菌遺伝子のいくつかは、ある種のイースト細胞
で発現する、又その反対にイーストの遺伝子が大腸菌で
発現することもある。ベッグス、１９７８；ストルール
等、１９７９参照。

【００２６】さらに、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔ
ｕｍｅｆａｃｉｅｎｓやＡ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓな
ど、ある種のバクテリア細胞は、種々の植物細胞に感染
し、根頭癌腫病やｈａｉｒｙｒｏｏｔ ｄｉｓｅａｓｅ
をひき起こす。これらのＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ
は、Ｔｉプラスミド、Ｒｉプラスミドと呼ばれるプラス
ミドを持ち、この中に植物細胞で発現する遺伝子があ
る。この遺伝子の暗号は "ｏｐｉｎｅｓ（オパイン）"
と呼ばれる物質をつくり出す酵素に関するものである。
ｏｐｉｎｅｓ（オパイン）に属する物質はｏｃｔｏｐｉ
ｎｅ（オクトピン）、ｎｏｐａｌｉｎｅ（ノパリン）、
ａｇｒｏｐｉｎｅ（アグロピン）である。ｏｐｉｎｅｓ
はバクテリア細胞の炭素源、窒素源エネルギー源として
使われる。ペティット・テンプ、１９７８を参照。ｏｐ
ｉｎｅ遺伝子は、バクテリア細胞内では不活性であると
考えられている。これらの遺伝子は植物細胞に入って初
めて発現する。

【００２７】遺伝子−宿主不適合性という障壁をとり除
くために、様々な人為的工夫もなされてきた。例えば、
宿主バクテリアの細胞に入ると質が低下する哺乳類のポ
リペプチドを、正常な宿主細胞に存在するバクテリアの
ポリペプチドとカプリングさせると質が低下しなくな
る。融合たんぱくが生成されたことになる。板倉等、１
９７７を参照。また別の例としては、宿主細胞内のエン
ドヌクレアーゼで組こまれた遺伝子が切断されるのを防
ぐため、（１）数種のエンドヌクレアーゼを欠く宿主細
胞に遺伝子を入れるか、（２）細胞内で遺伝子を複製
し、メチル化しやすくする、という方法も報告されてい
る。マニアティス等、１９８１を参照。

【００２８】さらに、遺伝子−宿主不適合性をとり除く
方法として、キメラ遺伝子に関するものがある。例え
ば、哺乳類のポリペプチド、インシュリン、成長ホルモ
ン、インターフェロン等の遺伝情報を指定する構造シー
クエンスを、バクテリアの制御シークエンスと結合させ
る。その結果つくられたキメラ遺伝子をバクテリア細胞
に入れる。するとその遺伝子は哺乳類のポリペプチドを
生成する。グアレンテ等、１９８０を参照。また、バク
テリアの構造シークエンスとヴイルスの制御シークエン
スとを結合させてできたものは、哺乳動物の細胞に感染
することができる。このキメラ遺伝子を哺乳動物の細胞
に入れると、バクテリアのポリペプチドを生成したとい
う報告がある。サウザン・バーグ、１９８２；コルベル
・カラピン等、１９８２を参照。

【００２９】レストリクションエンドヌクレアーゼ群 一般的に、エンドヌクレアーゼというのは、ＤＮＡをい
くつかのＤＮＡの断片に切断していく酵素である。エン
ドヌクレアーゼは、一本のＤＮＡ鎖の中の何処へでもは
たらきかけ、それを切断することができる。これに較べ
て、エクソヌクレアーゼは、ＤＮＡ鎖の末端からヌクレ
オチドをとり除いていく。ここで述べられているエンド
ヌクレアーゼ群はすべて二本鎖のＤＮＡとをＤＮＡの断
片に切断していくことができる。このためには、二種の
結合鎖を破す必要がある。（１）燐酸基とデオキシリボ
ース残基の間の共有結合と、（２）ＤＮＡの二本鎖を結
びつけている、水素結合（Ａ−ＴとＣ−Ｇ）である。

【００３０】レストリクションエンドヌクレアーゼ（こ
れ以後、エンドヌクレアーゼと呼ぶ）は、ＤＮＡをある
決まった塩基配列のところで切っていく。例えば、Ｅｃ
ｏＲＩ、ＨａｅＩＩＩは次の配列を認識し、切断してい
く。

【化１】

【００３１】上の例において、ＥｃｏＲＩによる切断
は、５′突出（すなわち、単鎖のテイルが３′末端では
なく５′末端を有する）を伴った粘着末端を創出した。
粘着末端は望ましい基を結合させることができる。例え
ば、ＥｃｏＲＩの末端は、ＨａｅＩＩＩ末端と結合する
ことはほとんどないが、別のＥｃｏＲＩ末端と結合する
ことはある。

【００３２】百種以上のエンドヌクレアーゼが知られて
おりそれぞれが、ＤＮＡをある決まった塩基配列のとこ
ろで切断することができる。ロバーツ、１９８２を参
照。レストリクションエンドヌクレアーゼはすべて、塩
基の配列のちがいを読み取ることができる。その上、あ
る種のものは、塩基がメチル化されているかどうかを判
断することもできる。例えばＭｂｏＩ、Ｓａｕ３ａとい
う二つのエンドヌクレアーゼは、下に示されている様な
塩基配列を切断する。

【化２】

【００３３】もしアデニン残基がメチル化されていれば
（ｍｅ−Ａ）、ＭｂｏＩはこの配列を切断できない。Ｓ
ａｕ３ａは、アデニンがメチル化されていても、メチル
化されていなくても、この塩基配列を切断する。プラス
ミドのメチレイション（従って切断）は、メチル化能力
のある細胞でプラスミドを複製することで、ある程度コ
ントロールすることができる。大腸菌のある酵素、ＤＮ
Ａアデニンメチラーゼ（ｄａｍ）は、ＧＡＴＣという塩
基配列のアデニン残基をメチル化する。ｄａｍ酵素を持
たない大腸菌の菌株はｄａｍ^- 細胞と呼ばれる。それに
対してｄａｍを持っているものはｄａｍ⁺ 又はｄａｍ細
胞といわれている。

【００３４】いくつかのエンドヌクレアーゼは、それぞ
れ異なった塩基配列を切断し、他のエンドヌクレアーゼ
の作用でできた粘着末端と完全に適合するような結合性
末端をつくり出す。例えば、少なくても５種の異なった
エンドヌクレアーゼが５′ＧＡＴＣ突出部をつくり出
す。これは表Ｉに示されている。

【００３５】

【表１】

【００３６】表Ｉに挙げたエンドヌクレアーゼの作用で
生じた結合力のある末端は、どれか別のエンドヌクレア
ーゼの作用で生じた結合性末端と結合することもあろ
う。例えばＢｇｌ ＩＩの作用で生じた末端とＢａｍＨ
Ｉの作用で生じた末端が結合すると、次のような塩基配
列になる。 ＡＧＡＴＣＣ ＴＣＴＡＧＧ この配列はＢｇｌ ＩＩ、ＢａｍＨＩでは切断できない
が、ＭＢＯＩ（メチル化されていない場合）又はＳａＵ
３ａでは切断できる。

【００３７】ＧＡＴＣを切断するエンドヌクレアーゼは
ＰｖｕＩと言われ次のように、３′突出部をつくりだ
す。

【化３】 また、エンドヌクレアーゼＣｌａＩは次の配列を切断す
る。

【化４】

【００３８】もしＸ₁ がＧ、あるいはＸ₂ がＣであれ
ば、この配列はＭｂｏＩで切断できる。（メチル化され
ていない場合、メチル化されていればＣｌａＩも阻害さ
れる。）あるいはＳａｕ３ａでも切断できる。

【００３９】ウイルス性のプロモーター ウイルスとは、一本鎖又は二本鎖の核酸（ＤＮＡ又はＲ
ＮＡ）が "カプシド"又は "コート" と呼ばれるたんぱ
く質性のおおい（脂質が含まれることもある）に包まれ
てできている微生物である。ウイルスは細胞より小さ
く、ほとんどすべての生化学的反応を行うために必要な
物質をもっていない。その代わり、細胞に感染し、細胞
の代謝系を借りてウイルス自身を増殖させる。

【００４０】次に簡単に、どのようにしてＤＮＡウイル
スが細胞に感染するかを説明する。話をわかりやすくす
るためＲＮＡウイルスについてはふれない。まず最初
に、普通宿主と呼ばれている細胞にウイルスは付着する
か、又は侵入する。ウイルスのＤＮＡ（ウイルス粒子全
体のこともある）は、細胞のプラスミド（染色体の外の
ＤＮＡループ）に入る。ウイルスＤＮＡの情報は、メッ
センジャーＲＮＡに転写され、翻訳されてポリペプチド
がいくつか生成される。このポリペプチドの一部が集ま
って、新しい "カプシド" をつくり、残りのポリペプチ
ドは酵素として作用し、種々の生化学的反応を触媒す
る。ウイルスＤＮＡも複製され、カプシドポリペプチド
と共に新しいウイルス粒子を形成する。これらウイルス
粒子は徐々に放出されるか、あるいは溶菌現象が起き、
細胞は破壊し、ウイルスは放出される。放出されたウイ
ルス粒子は、その後、新しい宿主細胞に感染する。ウイ
ルスに関するくわしい情報が必要であれば、ストライヤ
ー、１９８１；マシュー、１９７０を参照。

【００４１】ここで使用されている通り、 "ウイルス"
という言葉は、ファージヴァイロイド、複製中間体にも
適用される。また "ウイルス核酸" 、 "ウイルス由来の
ＤＮＡ又はＲＮＡ" という表現は、広くウイルスの核酸
から取り出されたＤＮＡ、ＲＮＡのすべてに適用されて
いる。例えば、ウイルスＲＮＡを鋳型として生成したＤ
ＮＡ又は、ウイルスＤＮＡを分析し塩基配列を決定し、
それと同じ配列のものを化学的に合成したＤＮＡも、ウ
イルス核酸とみなされるであろう。

【００４２】ウイルスの宿主域（つまり一つのウイルス
が感染できる細胞の種類）は限られている。あるウイル
スはある種のバクテリアにしか感染できない。またある
ウイルスは限られた属の植物にだけ感染する。哺乳動物
にだけ感染するウイルスもある。ウイルスが細胞に感染
するという場合、ＤＮＡ又はＲＮＡが宿主細胞に侵入す
るというだけでなく、細胞内でウイルス粒子の増殖がお
こるということである。種々様々な分析を通して優れた
技術を持った者は、ある特定のウイルスが、ある特定の
属、種、菌株に感染できるかどうかをすぐに判定するこ
とができる。ここで用いられている様に、 "植物ウイル
ス" という言葉は、植物細胞に感染できるウイルスを指
しており、他の細胞に感染するかしないかは問題ではな
い。

【００４３】ヴァイロイド（現在、これについてくわし
いことは分かっていない）は例外かもしれないが、ウイ
ルス粒子は、感染した宿主細胞において発現する遺伝子
を少なくとも１個は持っている。遺伝子が発現するに
は、ＤＮＡあるいはＲＮＡの一部がｍＲＮＡに転写され
るか、ｍＲＮＡ鎖として働き、ｍＲＮＡが翻訳されてポ
リペプチド形成されなければならない。ほとんどのウイ
ルスが５〜１０個の異なった遺伝子を持っており、適当
な宿主細胞中で発現する。

【００４４】ウイルス遺伝子に由来するプロモーター
は、遺伝子工学の様々な分野に利用されている。例え
ば、バクテリアの遺伝子からとり出した構成シークエン
ス（コーディング・シークエンスとも呼ばれている）
を、哺乳動物の細胞に感染するウイルスからとり出した
プロモーターと結合させて、キメラ遺伝子が作られた。
（最も一般的に用いられている哺乳動物のウイルスは、
Ｓｉｍｉａｎ Ｖｉｒｕｓ４０，Ｈｅｒｐｅｓ Ｓｉｍ
ｐｌｅｘ Ｖｉｒｕｓ（ＨＳＶ）と呼ばれている。）こ
れらのキメラ遺伝子は、哺乳動物の細胞に形質転換を起
こさせるために利用されている。ムリガン等、１９７
９；サウザン・バーグ、１９８２を参照。更に、バクテ
リアに感染するウイルスから取り出したプロモーターを
用いたキメラ遺伝子は、バクテリア細胞の形質転換に用
いられている。マニアテス等の報告した"ファージラム
ダＰＬプロモーター" を参照。

【００４５】数人の研究者は、植物細胞の形質転換のベ
クターとして植物ウイルスを利用することが可能であろ
うという説を発表した。ホーン等、１９８２を参照。一
般的に、 "ベクター" とはある細胞に遺伝子を移入させ
る時に利用されるＤＮＡ分子である。普通、望みの遺伝
子をベクターにそう入し、そのベクターを宿主細胞に感
染させる。数人の研究者は、植物ウイルス遺伝子に由来
するプロモーターを用いて、植物細胞内で形質を発現す
るキメラ遺伝子をつくり出すこともできるであろうとい
う説をだした。ホーン等、１９８２、２１６頁参照。

【００４６】しかしながら、多くの研究者達の努力にも
拘わらず、この発明に先立って、誰も（１）植物ウイル
ス性のプロモーターを異種生物の構造シークエンスと結
合させたキメラ遺伝子を製造することに成功しなかっ
た。また、（２）植物細胞内でこのような遺伝子が発現
したということも明らかにされていない。

【００４７】カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭ
Ｖ） ＣａＭＶのＤＮＡの塩基配列はすべて明らかにされてい
る。ガードナー等、１９８１；ホーン等、１９８２参
照。最も一般的な型では、ＣａＭＶゲノムの長さはおよ
そ８０００ｂｐである。しかし、自然に生じた感染性の
ある突然変異体では、５００ｂｐ短くなっているものも
発見されている。ハウアース等、１９８１参照。ＣａＭ
Ｖゲノム全体が、１本のｍＲＮＡに転写される。このｍ
ＲＮＡの沈降係数は３５Ｓである。３２ＳｍＲＮＡのプ
ロモーターは、Ｇａｐ １から左周りに１ｋｂ離れた大
きなインタージェニックレイジョンにある（ギレイ等、
１９８２参照）

【００４８】ＣａＭＶは、少なくとも８個のたんぱく質
を生産すると考えられている。これらのたんぱく質をつ
くり出す遺伝子は、遺伝子Ｉ〜ＶＩＩＩと名付けられて
いる。遺伝子ＶＩは、沈降係数１９ＳのｍＲＮＡに転写
される。１９Ｓ ｍＲＮＡは、Ｐ６６というたんぱく質
に翻訳される。これは、ウイルス粒子内にふくまれてい
るたんぱく質である。１９Ｓ′ｍＲＮＡは１９Ｓプロモ
ーターにより促進される。このプロモーターはＧａｐ
１から左周りに２．５ｋｂ離れたところに存在する。

【００４９】発明の要約 この発明は植物細胞内で発現するキメラ遺伝子、それら
の遺伝子を作り出す方法に関するものである。

【００５０】キメラ遺伝子にはプロモーター領域があ
り、このプロモーターの作用で植物細胞のＲＮＡポリメ
ラーゼは、ＤＮＡに対応するｍＲＮＡをつくり出す。こ
のようなプロモーター領域の１つに、ノパリンシンサー
ゼ（ＮＯＳ）プロモーター領域というものがあり、これ
は普通Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓというバクテリアの
Ｔｉプラスミド内にある。ＮＯＳは、Ａ．ｔｕｍｅｆａ
ｃｉｅｎｓの細胞内にある時は一般に不活性であり、Ｔ
ｉプラスミドが植物細胞内に入ると活性をもつようにな
る。これ以外に二個のプロモーターがカリフラワーモザ
イクウイルス（ＣａＭＶ）からとり出された。その他の
プロモーターは、植物細胞内に存在する遺伝子から、あ
るいは、植物細胞に感染するウイルスからとり出され
る。

【００５１】キメラ遺伝子にはｍＲＮＡの５′非翻訳領
域の暗号となる塩基の配列も存在する。この領域は、植
物細胞内でｍＲＮＡの構造シークエンスの発現を可能に
したり増加させたりすることができる。必要とされる
５′非翻訳領域は、ＮＯＳ遺伝子、植物ウイルス遺伝
子、あるいは植物細胞中に存在する遺伝子からとり出さ
れる。

【００５２】キメラ遺伝子には、望ましい構造シークエ
ンスも含まれている。つまり、構造シークエンスとは、
ｍＲＮＡに転写されて、そのｍＲＮＡが翻訳され、望み
のポリペプチドを生成する、そういう塩基配列を指して
いる。構造シークエンスは、プロモーター領域に対して
異種的であり、細菌性または哺乳動物たんぱく質等の所
望のたんぱく質をコードしてもよい。構造遺伝子には、
開始コドンと停止コドンがある。また構造遺伝子には、
翻訳に先立ってｍＲＮＡからとり除かれたイントロンが
存在することもある。

【００５３】キメラ遺伝子は、ｍＲＮＡの３′非翻訳領
域（ポリ−アデニレイションシグナルを含む）をコード
するＤＮＡ配列を含むこともできる。この領域は、構造
遺伝子を適切に発現させるため、普通植物細胞内で発現
する遺伝子からとり出される。このような遺伝子にはＮ
ＯＳ遺伝子、植物ウイルス遺伝子、植物細胞内の遺伝子
がある。

【００５４】この発明に用いられた方法については以下
に述べられている、また図２のフローチャートに要約さ
れている。適切に集められ、そして植物のゲノムにそう
入されれば、ここで発明されたキメラ遺伝子は植物細胞
内で発現し、のぞみのポリペプチド、例えば哺乳類のホ
ルモン、植物に抗生物質や除草剤に対する抵抗性を与え
るバクテリアの酵素などを生成するであろう。

【００５５】図の簡単な説明 図は模式的なものであり、正確な寸法にもとづいて描い
たものではない。

【００５６】図１ 典型的な真核細胞の遺伝子を表す。

【００５７】図２ この発明のステップをフローチャー
トで表したもので、キメラＮＯＳ−ＮＰＴ ＩＩ−ＮＯ
Ｓ遺伝子を例にして描かれている。

【００５８】図３ ＴｉプラスミドをＨｉｎｄ ＩＩＩ
により消化して得られたＨｉｎｄＩＩＩ−２３の断片で
ある。

【００５９】図４ ＮＯＳプロモーター領域、ＮＯＳ
５′非翻訳領域、ＮＯＳ構造シークエンスの最初の数個
のコドンを持つＤＮＡの一部を表したものである。

【００６０】図５ ＮＯＳプロモーター領域、および完
全な５′非翻訳領域を含むＤＮＡ断片を得るための、Ｄ
ＮＡ配列の正確な位置での切断を表す。

【００６１】図６ ＮＰＴ ＩＩ構造遺伝子部位を保持
しているプラスミド、ｐＭＯＮ １００１とｐＭＯＮ４
０との生成を表す。

【００６２】図７ ｐＭＯＮ５８を得るためＮＯＳプロ
モーター領域をプラスミドｐＭＯＮ４０に組み入れる。

【００６３】図８ Ｍ−２と命名されているＭ１３誘導
体の生成、このＭ−２は、ＮＯＳ３′非翻訳領域とポリ
−Ａシグナルを保持している。

【００６４】図９ ＮＯＳ−ＮＰＴ ＩＩ−ＮＯＳキメ
ラ遺伝子を組み立て、プラスミドｐＭＯＮ３８に組み入
れ、プラスミドｐＭＯＮ７５とｐＭＯＮ７６を生成す
る。

【００６５】図１０ ＮＯＳ−ＮＰＴ ＩＩ−ＮＯＳキ
メラ遺伝子をプラスミドｐＭＯＮ１２０に組み入れ、プ
ラスミドｐＭＯＮ １２８とｐＭＯＮ １２９を生成す
る。

【００６６】図１１ ＮＰＴＩ遺伝子を保持しているプ
ラスミドｐＭＯＮ６６の生成。

【００６７】図１２ キメラＮＯＳ−ＮＰＴ ＩＩシー
クエンスを保持しているプラスミドｐＭＯＮ７３の生
成。

【００６８】図１３ キメラＮＯＳ−ＮＰＴＩシークエ
ンスを保持しているプラスミドｐＭＯＮ７８の生成。

【００６９】図１４ キメラＮＯＳ−ＮＰＴＩ−ＮＯＳ
遺伝子を保持するプラスミドｐＭＯＮ １０６とｐＭＯ
Ｎ １０７の生成。

【００７０】図１５ キメラＮＯＳ−ＮＰＴＩ−ＮＯＳ
遺伝子をｐＭＯＮ １２０に組み入れ、プラスミドｐＭ
ＯＮ １３０とｐＭＯＮ １３１を生成する。

【００７１】図１６ 大豆たんぱく（ｓｂｓｓ）プロモ
ーターを保持しているＤＮＡ断片の構造。

【００７２】図１７ ｓｂｓｓプロモーターを保持して
いるプラスミドｐＭＯＮ １２１の生成。

【００７３】図１８ キメラｓｂｓｓ−ＮＰＴ ＩＩ−
ＮＯＳ遺伝子をｐＭＯＮ １２０に組み入れ、プラスミ
ドｐＭＯＮ １４１とｐＭＯＮ １４２を生成する。

【００７４】図１９ ウシ成長ホルモンの構造遺伝子領
域と、ＮＯＳ３′領域を保持している、プラスミドｐＭ
ＯＮ １０８の生成。

【００７５】図２０ 選択的に切断面にかこまれている
ＢＧＨ−ＮＯＳを保持しているプラスミドＮ−２５−Ｂ
ＧＨの生成。

【００７６】図２１ キメラｓｂｓｓ−ＢＧＨ−ＮＯＳ
遺伝子をｐＭＯＮ １２０に組み入れ、プラスミドｐＭ
ＯＮ １４７とｐＭＯＮ １４８を生成する。

【００７７】図２２ キメラＮＯＳ−ＢＧＨ−ＮＯＳ遺
伝子を保持するプラスミドｐＭＯＮ１４９の生成。

【００７８】図２３ ＥＰＳＰシンサーゼを生産する構
造遺伝子領域を保持しているプラスミドｐＭＯＮ８の生
成。

【００７９】図２４ 開始コドンの近くに切断面のある
ＥＰＳＰシンサーゼ構造遺伝子領域を保持するプラスミ
ドｐＭＯＮ２５の生成。

【００８０】図２５ ＥＰＳＰシンサーゼとＮＯＳ３′
領域を持ったキメラシークエンスを保持するプラスミド
ｐＭＯＮ １４６の生成。

【００８１】図２６ キメラＮＰＳ−ＥＰＳＰ−ＮＯＳ
遺伝子をｐＭＯＮ １２０に組み入れｐＭＯＮ １５３
を得る。

【００８２】図２７ キメラｓｂｓｓ−ＥＰＳＰ−ＮＯ
Ｓ遺伝子を保持するプラスミドｐＭＯＮ １５４の生
成。

【００８３】図２８ ＣａＭＶ１９Ｓプロモーターを保
持するプラスミドｐＭＯＮ９３の構造とその生成。

【００８４】図２９ キメラＣａＭＶ（１９Ｓ）−ＮＰ
Ｔ−ＮＯＳ遺伝子を保持するプラスミドｐＭＯＮ １５
６の構造とその生成。

【００８５】図３０ ＮＰＴ遺伝子を部分的に保持する
プラスミドｐＭＯＮ１１０の構造とその生成。

【００８６】図３１ ＮＰＴ−ＮＯＳ遺伝子を部分的に
保持するプラスミドｐＭＯＮ １３２の構造とその生
成。

【００８７】図３２ キメラＣａＭＶ（１９Ｓ）−ＮＰ
Ｔ−ＮＯＳ遺伝子を保持するプラスミドｐＭＯＮ １５
５の構造とその生成。

【００８８】図３３ ＣａＭＶ３２Ｓプロモーターを保
持するプラスミドｐＭＯＮ８１の構造とその生成。

【００８９】図３４ ＣａＭＶ３２Ｓプロモーターを保
持するプラスミドｐＭＯＮ １２５の構造と生成。

【００９０】図３５ ＣａＭＶ３２Ｓプロモーターを保
持するプラスミドｐＭＯＮ １７２の構造と生成。

【００９１】図３６ ＣａＭＶ３２Ｓプロモーターを保
持するファージＭ１２の構造と生成。

【００９２】図３７ キメラＣａＭＶ（３２Ｓ）−ＮＰ
Ｔ−ＮＯＳ遺伝子を保持するプラスミドｐＭＯＮ １８
３とｐＭＯＮ １８４の構造と生成。

【００９３】

【発明の詳細な解説】この発明の１つの好ましい実施態
様において、キメラ遺伝子は、次の要素を含み、生起さ
れる。 １．ノパリンシンサーゼ（ＮＯＳ）遺伝子から誘導され
るプロモーター領域および５′−非翻訳領域； ２．ネオマイシンフォスフォトランスフェラーゼＩＩ
（ＮＰＴ ＩＩあるいはＮＰＴ ＩＩ）遺伝子から誘導
された構造シークエンス； ３．ポリアデニル信号を含み、ＮＯＳ遺伝子から誘導さ
れる３′−非翻訳領域。

【００９４】このキメラ遺伝子は、この中でＮＯＳ−Ｎ
ＰＴ ＩＩ−ＮＯＳ遺伝子とみなされるが、集められて
いろいろな植物細胞に挿入され、カナマイシンなどのア
ミノグリコシド抗生物質に対する抵抗性をひきおこす。
このキメラ遺伝子を集合させる方法は図２のフローチャ
ートに要約されているが、詳細は以下および例に記述さ
れている。この方法のステップを理解することにおいて
読み手を助けるために、ＮＯＳ−ＮＰＴ ＩＩ−ＮＯＳ
キメラ遺伝子内に含まれた多くのプラスミドおよび断片
は、図２のカッコ内に引用される。しかしながら、図２
の方法は広く多様な他のプラスミドおよび断片に適切で
ある。読み手のさらなる助けとして図２に示されたステ
ップは呼び出し番号４２以下を付されている。この呼び
出し番号は次の解説に引用される。この発明の技術およ
びＤＮＡシークエンスは広く多様な植物の変換に有益で
あり、かつ適当であり、Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓあ
るいはＡ．ｒｈｉｚｏｇｌｎｅｓの１ないしそれ以上の
菌株により感染される植物のどれでもを含む。

【００９５】ＮＯＳプロモーター領域および５′−非翻
訳領域 出願者は、異種遺伝子の発現を支配するためにノパリン
シンサーゼ（ＮＯＳ）プロモーター領域を得、利用する
ことを決めた。ＮＯＳはｐＴｉＴ３７のような、ある型
のプラスミドに通常、保有されている。Ｓｃｉａｋｙ
他、１９７８。ＮＯＳプロモーターはＡ．ｔｕｍｅｆａ
ｃｉｅｎｓ細胞の中にある間は、通常は不活性である。
プロモーターおよび蛋白暗号シークエンスを含む全ＮＯ
Ｓ遺伝子は、ＴｉプラスミドのＴ−ＤＮＡ部にあり、そ
れは植物が感染して根こぶ腫瘍を形成するとき、植物の
染色体に挿入される。１度植物細胞の内側に入ると、Ｎ
ＯＳプロモーター領域が植物細胞の中のＲＮＡポリメラ
ーゼを支配し、ＮＯＳ蛋白暗号化シークエンスをｍＲＮ
Ａに転写する。そのｍＲＮＡは続いてＮＯＳ酵素に翻訳
される。

【００９６】プロモーター領域（結合領域２、中間領域
４、転写開始シークエンス６、中間領域８として図１に
示す）の異なる部分間の境界およびプロモーター領域と
５′−非翻訳領域間の境界は十分にはわかっていない。
出願者は完全なプロモーター領域および５′−非翻訳領
域をＮＯＳ遺伝子から利用することを決定する。そのＮ
ＯＳ遺伝子は植物細胞内で発現されることが知られてい
る。しかしながら１ないしそれ以上のこのシークエンス
が長さにおいての修正、あるいは他のシークエンスによ
る置換などの多くの方法において修飾されることは、全
く可能である。プロモーター領域および５′−非翻訳領
域内の、そのような修飾は、バクテリア細胞（参照例、
Ｒｏｂｅｒｔｓ他、１９７９）および哺乳類細胞（参照
例、Ｍｃｋｎｉｇｈｔ、１９８２）において研究されて
いる。この発明により教えられた利用方法論で、植物細
胞内遺伝子の発現に対するプロモーター領域及び５′−
非翻訳領域の修飾の効果を研究することは現在可能であ
る。そのような修飾を用いて、植物細胞内遺伝子の発現
の増加を可能にする。そのような修飾は、この発明のキ
メラ遺伝子に行われるとき、この発明の範囲の中にあ
る。

【００９７】ノパリン型腫瘍誘発プラスミドは、ｐＴｉ
Ｔ３７と命名されるが、それは基本的手順でＡ．ｔｕｍ
ｅｆａｃｉｅｎｓの菌株から分離される（Ｃｕｒｒｉｅ
ｒとＮｅｓｔｅｒ、１９７６）。それは多数の断片を作
るエンドヌクレアーゼＨｉｎｄ ＩＩＩによって分解さ
れる。これらの断片はゲル上で大きさによって分離さ
れ、断片の１つは単離されてゲルから取出される。この
断片はＴｉプラスミド由来の２３番目の最大断片である
ため、Ｈｉｎｄ ＩＩＩ−２３と命名される；それはお
よそ、大きさで３４００ベースペア（ｂｐ）であり、あ
るいは３．４キロベース（ｋｂ）としてみなされる。他
者の仕事（参照例、Ｈｅｒｎａｌｓｔｅｅｎｓ他、１９
８０）からＨｉｎｄ ＩＩＩ−２３断片は完全なｎｏｓ
遺伝子を含み、それがプロモーター領域、５′−非翻訳
領域、開始コドン・終了コドンを有する構造シークエン
ス、３′−非翻訳領域を含むことが知られている。Ｈｉ
ｂｄ ＩＩＩ−２３断片は図３で示される。

【００９８】多くの切断および配列決定の実験とから、
Ｈｉｎｄ ＩＩＩ−２３断片が他のエンドヌクレアー
ゼ、Ｓａｕ３ａにより分解可能であること、断片の大き
さを約３５０ｂｐにすることが決定される。そしてそれ
は完全なＮＯＳプロモーター領域、５′−非翻訳領域、
ＮＯＳ構造シークエンスのはじめの数コドンを含む。こ
の断片の配列が決定され、塩基シークエンスは、図４に
表される。ＮＯＳ構造シークエンスの開始コドン（ＡＴ
Ｇ）は、３５０ｂｐ断片内のベースペア３０１で始め
る。出願者はベースペア３００および３０１の間の断片
の分割を決定する；これはＮＯＳプロモーター領域およ
び完全５′−非翻訳領域を含む、長さ約３００ベースペ
アの断片をもって、しかし翻訳塩基をもってではなく、
それらを用意する。３５０ｂｐ断片を、精密に正しい位
置で分割するため、出願者はＳＩＡと命名されたＭ１３
クローンを得、以下に記される手順を利用する。

【００９９】ＳＩＡクローンを生起するためにＷａｓｈ
ｉｎｇｔｏｎ ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙのＭｉｃｈａｅｌ
Ｂｅｖａｎ博士は、３５０ｂｐ Ｓａｕ３ａ断片をＤ
ＮＡ単鎖に転換する。これはＭ１３ｍｐ２ファージと命
名されたウイルスのベクターを利用し、そのファージは
生活環における二重鎖（ｄｓ）および単鎖（ｓｓ）両段
階を経る（Ｍｅｓｓｉｎｇ他、１９８１）。ｄｓ３５０
ｄｐ断片はＭ１３ｍｐ２の二重鎖複製形成ＤＮＡに挿入
され、それはＢａｍＨＩによって切断される。２つの断
片は結紮され、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞を感染させる。３５０
ｄｐを含むｄｓＤＮＡは続いて複製された断片を挿入
し、Ｉ鎖（ウイルス性鎖）はＭ１３ウイルス性蛋白殻蛋
白によりまわりを包まれる。ＳＩＡと命名された１クロ
ーンにおいて３５０ｄｐ断片の配向はＮＯＳ遺伝子のア
ンチセンス鎖（ｍＲＮＡと同じシークエンスを含む）が
ウイルス性鎖で運搬されるということである。感染され
た細胞から開放されたウイルス性粒子は分離され、出願
者に提供される。

【０１００】単鎖ＳＩＡ ＤＮＡはアンチセンス３５０
ｂｐ断片をＮＯＳプロモーター領域と共に含み、ウイル
ス性粒子から分離され反復される。１４−ｍｅｒオリゴ
ヌクレオチドプライマーは出版された手順（Ｂｅａｕｃ
ａｇｅとＣａｒｒｕｔｈｅｒｓ、１９８１、Ａｄａｍｓ
他による修正、１９８２）を用いて合成される。この１
４−ｍｅｒは図４に示されるように３５０ｂｐ断片の塩
基２８７から３００に相補的となるように設計される。

【０１０１】合成プライマー５′末端は³²Ｐで放射能性
標識される；これは星印で図中に表す。プライマーのコ
ピーは３５０ｂｐ断片アンチセンス鎖を含む単鎖ＳＩＡ
ＤＮＡのコピーと共に混合される。プライマーは図５
の１番上に示されるようにＳＩＡ ＤＮＡの求められる
領域にアニーリングされる。この出現後、Ｋｌｅｎｏｗ
ＤＮＡポリメラーゼおよび調節された量の非標識デオキ
シヌクレオシドシリン酸塩（ｄＮＴＰ′ｓ）、Ａ、Ｔ、
Ｃ、Ｇが加えられる。Ｋｌｅｎｏｗポリメラーゼはヌク
レオチドをプライマーの３′（非標識）末端（５′（標
識）末端にでなく、）に加える。結果は、図５に示され
るように、単鎖ＤＮＡの円形ループであり、その一部は
ＤＮＡの第２鎖により合わせられる。第２鎖の５′終了
はＳａｕ３ａ挿入のＮＯ３００対塩基に位置する。

【０１０２】部分的二重鎖ＤＮＡはその後第３エンドヌ
クレアーゼＨａｅ ＩＩＩにより分解される。Ｈａｅ
ＩＩＩはＤＮＡ単鎖と二重鎖の両方を分割し得る。Ｈａ
ｅＩＩＩ分割部位は３５０ｂｐ挿入の外側の数カ所に存
在することが知られている。しかし３５０ｂｐ挿入の内
側には何も在しない。これは１平滑末端および、Ｓａｕ
３ａ挿入物の＃３０１塩基で開始する１つの３′突出を
有する断片を生起する。Ｈａｅ ＩＩＩ断片混合物は、
Ｔ₄ ＤＮＡポリメラーゼおよび非標識ｄＮＴＰ′Ｓで処
理された。これはＤＮＡの単鎖部分の原因となり、これ
は断片から除去されるべきであるＳａｕ３ａ挿入の＃３
０１塩基から最も近いＨａｅ ＩＩＩ分割部位までにわ
たる。この方法でＡＴＧ開始コドンは＃３００ベースペ
アから除去され、およそ長さ５５０ｂｐの平滑末端二重
鎖断片を生じる。

【０１０３】混合物はそれから第４エンドヌクレアーゼ
ＥｃｏＲＩにより分解され、それは５５０ｂｐ断片をＮ
ＯＳプロモーター領域の外側の単部位で分割する。それ
から、断片はゲルの大きさにより分離され、放射能性標
識断片は分離される。この断片は完全なＮＯＳプロモー
ター領域および５′−非翻訳領域を含む。 ５′−…ＣＴＧＣＡ …ＧＡＣＧＴのシークエンスをもつ１平滑（ブラント）
末端を有し、 ５′ＡＡＴＴＣ− Ｇ−のシークエンスをもつ１粘着（コーヘーシブ）末端
を（ＥｃｏＲＩ部位に）有する。 短鎖の長さは約３０８ｂｐである。前述のステップはス
テップ４２、４４、４６として図２にあらわされてい
る。この断片は図７に示されるようにｐＭＯＮ４０（以
下に記述）に挿入されｐＭＯＮ５８を得る。

【０１０４】ＮＰＴ ＩＩ遺伝子（ｐＭＯＮ４０）をも
ったプラスミドの生起 バクテリアｔｒａｎｓｐｏｓｏｎはＴｎ５と命名されて
いるが、それは完全なＮＰＴ ＩＩ遺伝子を含むことが
知られ、プロモーター領域および構造シークエンス、
３′−非翻訳領域を含む。ＮＰＴ ＩＩ酵素は、カナマ
イシン、ネオマイシン、Ｇ４１８などの、あるアミノグ
リコシド抗生物質を不活性化する；参照Ｊｉｍｅｎｅｚ
とＤａｖｉｓ、１９８０。この遺伝子は１．８ｋｂ断片
の中に含まれ、ファージラムダｂｂｋａｎ−Ｉ ＤＮＡ
（Ｄ．Ｂｅｒｇ他、１９７５）を２エンドヌクレアー
ゼ、Ｈｉｎｄ ＩＩＩ、ＢａｍＨＩを用いて切断するこ
とによって得る。この断片はＨｉｎｄ ＩＩＩおよびＢ
ａｍＨＩにより切断された公共研究所プラスミド、ｐＢ
Ｒ３２７に挿入された。図６に示されるように起因プラ
スミドはｐＭＯＮ １００１と命名され、約４．７ｋｂ
である。

【０１０５】ＮＰＴ ＩＩ構造シークエンスを運ぶＤＮ
Ａ断片の大きさを縮小するため、出願者は、次の方法で
ｐＭＯＮ１００１プラスミドから約５００ｂｐほど削除
する。第１にｐＭＯＮ １００１をＮＰＴ ＩＩ遺伝子
の外側にある独自のＳｍａ１限定部位で分解する。次
に、１０−ｍｅｒ合成ヌクレオチド連鎖（リンカー） ５′ＣＣＧＧＡＴＣＣＧＧ ＧＧＣＣＴＡＧＧＣＣを Ｓｍａ１分割部位に挿入する。これはＳｍａ１分割部位
を除去し、それをＢａｍＨＩ分割部位で置換する。第２
のＢａｍＨＩ分割部位はすでにあり、新しい分割部位か
ら約５００ｂｐである。出願者はＢａｍＨＩからプラス
ミドを分解し、４．２ｋｂ断片から５００ｂｐ断片を分
離し、４．２ｋｂ断片を円形化する。起因プラスミド
は、Ｅ．ｃｏｌｉに挿入され、これはそれからアムピシ
リン、カナマイシンに抵抗性があるとして選択される。
Ｅ．ｃｏｌｉのクローンコロニーは選択され、図６に示
されるように、これらの細胞はｐＭＯＮ４０と命名され
るプラスミドを含んでいる。前述したステップは図２に
ステップ４８、５０としてあらわされている。

【０１０６】プラスミドｐＭＯＮ４０へのＮＯＳプロモ
ーターの挿入 出願人はｐＭＯＮ４０からＮＰＴ ＩＩプロモーターを
削除し、それを図７に示すごとく次の方法で前記のごと
きＮＯＳプロモーター断片と置き換えた。あらかじめの
開裂と配列決定実験は（Ｒａｏ及びＲｏｇｅｒｓ１９７
９、Ａｕｅｒｓｗａｌｄ他、１９８０）Ｂｇｌ ＩＩ開
裂部位がプロモーター領域と構造配列との間のＮＰＴ
ＩＩ遺伝子に存在することを示した。プラスミドｐＭＯ
Ｎ４０はＢｇｌ ＩＩで消化した。粘着末端を次に開裂
プラスミドをクレノウポリメラーゼおよび４つのｄＮＴ
Ｐ′ｓと混合することにより満たし、次の平滑末端を得
た。

【０１０７】

【化５】５′−ＡＧＡＴＣ ＧＡＴＣＴ− −ＴＣＴＡＧ ＣＴＡＧＡ−５′

【０１０８】ポリメラーゼおよびｄＮＴＰ′ｓを除き、
次いで開裂プラスミドをＥｃｏＲＩで消化した。ＮＰＴ
ＩＩプロモーター領域を含むより小さい断片を除き、
１個のＥｃｏＲＩ末端と１個の平滑末端を有する大きな
断片をのこす。この大きな断片を前記の、図５に示した
ＮＯＳプロモーターを含む３０８ｂｐ断片と混合した。
この断片をリゲートし、Ｅ．ｃｏｌｉに挿入した。Ｅ．
ｃｏｌｉクローンをアンピシリン耐性に対して選択し
た。ＮＰＴ ＩＩプロモーター領域（細菌プロモータ
ー）のＮＯＳプロモーター領域（これは植物細胞におい
てのみ活性であると信じられる）での置換えはＮＰＴ
ＩＩ構造配列をＥ．ｃｏｌｉ中で不活性ならしめた。３
６個のカナマイシン感受性クローンからプラスミドを得
た。１個のクローンからのプラスミドをｐＭＯＮ５８と
命名し、以下の工程に用いた。

【０１０９】次の工程を図２に工程５２および５４とし
て表す。プラスミドｐＭＯＮ５８を消化してＮＯＳプロ
モーター領域、ＮＯＳ５′−非翻訳領域およびＮＰＴ
ＩＩ構造配列を含む１．３ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨ
Ｉ断片を得る。この工程は工程５６として図２に示す。

【０１１０】ＮＯＳ３′配列をＮＰＴ ＩＩ遺伝子に挿
入 「背景技術」で既述したように、真核遺伝子における
３′非翻訳領域の機能は十分理解されていない。しか
し、少なくとも１つの重要な配列、ポリ−アデニールシ
グナルを含むと考えられている。本発明者の推測によれ
ば、細菌性３′非翻訳領域を有する遺伝子は、植物に発
現されることが知られている、ＮＯＳの如き遺伝子由来
の３′非翻訳領域を有する同一遺伝子ほどには植物細胞
にて有効に発現されなかったのであろう。したがって、
本発明者は既に存在するＮＰＴ ＩＩ３′非翻訳領域以
外に、キメラ遺伝子にＮＯＳ３′非翻訳領域を加えるこ
とを決定した。別法として、本明細書で記述する方法を
使って、ＮＰＴ ＩＩ又はその他の存在する３′非翻訳
領域を除きかつ植物細胞にて発現されることが知られて
いる、目的の３′非翻訳領域でそれを置換することが可
能である。各種型の３′非翻訳領域（例えばオクトピン
型又はアグロピン型Ｔｉプラスミドからの３′領域、又
は植物細胞中に通常存在する遺伝子からの３′領域）
が、任意のキメラ遺伝子、任意の特定の植物細胞に使用
するのに適しているか、あるいは望ましいかは本発明方
法を使って通常の実験により、当業者により測定するこ
とができる。

【０１１１】植物細胞に挿入されるべき構造配列に当然
に続く３′非翻訳領域はその型の植物細胞にてその構造
配列の有効な発現を促進するかどうかは、当業者は常法
の実験で測定することができる。もしそうなら、異なる
３′非翻訳領域をキメラ遺伝子に挿入するのに要する数
工程は、本発明方法を行うために必要としないであろ
う。

【０１１２】前述した如く、ｐＭＯＮ５８から、ＮＰＴ
ＩＩの構造的シークエンスに結合するために適当なＮ
ＯＳ３′の翻訳されていない領域を含むＤＮＡフラグメ
ントを得るために、本発明者は、図３に示されたＴｉプ
ラスミドからの３．４ｋｂＨｉｎｄ ＩＩＩ−２３フラ
グメントを利用した。この３．４ｋｂフラグメントを分
離し、ＢａｍＨＩを用いてダイジェストして、ＮＯＳの
構造的シークエンス〔停止コドン（ｓｔｏｐ ｃｏｄｏ
ｎ）を含んでいる〕の３′部分およびＮＯＳ遺伝子の翻
訳されない３′部分（ポリ−アデニレーションシグナル
を含んでいる）を得た。この１．１ｋｂフラグメント
を、Ｈｉｎｄ ＩＩＩおよびＢａｍＨＩでダイジェスト
されたｐＢＲ３２７中に入れた。この結果得られたプラ
スミドを、図８に示した如くｐＭＯＮ４２として示し
た。

【０１１３】プラスミドｐＭＯＮ４２をＢａｍＨＩおよ
びＲｓａＩでダイジェストし、所望の翻訳されないＮＯ
Ｓ３′領域を含む７２０ｂｐフラグメントをゲル中で精
製した。この７２０ｂｐフラグメントを、他のエンドヌ
クレアーゼ、ＭｂｏＩでダイジェストし、次いでＥ．ｃ
ｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼＩの大きなフラグメントで
処理した。これにより、ポリ−Ａシグナルを含有する翻
訳されないＮＯＳ３′領域の大きな部分を含む、Ｍｂｏ
Ｉ平滑末端（ｂｌｕｎｔ ｅｎｄｓ）を有する２６０ｂ
ｐフラグメントを得た。

【０１１４】前記操作を図２中に工程５８によって示し
た。しかし、種々な変法を用いることができることは容
易に理解されるであろう。例えば、Ｈｉｎｄ ＩＩＩ−
２３フラグメントを、ＭｂｏＩで直接ダイジェストし、
翻訳されないＮＯＳ３′領域を有する所望の２６０ｂｐ
フラグメントを得ることが可能である。

【０１１５】キメラ遺伝子のアセンブリー キメラ遺伝子のアセンブリーを完成させるために、（翻
訳されないＮＯＳ３′領域を含んでいた）２６０ｂｐＭ
ｂｏＩフラグメントを、ｐＭＯＮ５８由来の〔ＮＯＳプ
ロモーター（ｐｒｏｍｏｔｅｒ）領域および翻訳されな
い５′領域およびＮＰＴ ＩＩ構造的シークエンスを含
んでいた〕１．３ｋｂ ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩフラグ
メントに、連結することが必要であった。この連結を容
易にし、かつフラグメントの配向を調節するために、本
発明者は、２６０ｂｐフラグメントのＭｂｏＩ末端をＢ
ａｍＨＩ末端（フラグメントの５′末端）およびＥｃｏ
ＲＩ末端（フラグメントの３′末端）に変換することに
決定した。この工程を実施するために、本発明者は次の
方法を使用した。

【０１１６】前記２６０ｂｐＭｂｏＩフラグメントは、
その末端がクレノウ・ポリメラーゼ（Ｋｌｅｎｏｗ ｐ
ｏｌｙｍｅｒａｓｅ）によって平滑末端に変更されてお
り、Ｍ１３ｍｐ８ＤＮＡのＳｍａＩ切断部位に挿入され
ている。前記ＳｍａＩ切断部位は図８に示されているよ
うに、Ｍ１３ｍｐ８ＤＮＡの中に存在する他の色々な切
断部位に囲まれている。ＭｂｏＩフラグメントは、平滑
ＳｍａＩ末端に、どちらの方向からでも挿入することが
可能である。各種の異なるクローンにおけるＭｂｏＩフ
ラグメントのオリエンテーション（ｏｒｉｅｎｔａｔｉ
ｏｎ）はＭｂｏＩフラグメントの中に不整的（ａｓｓｙ
ｍｅｔｒｉｃａｌｌｙ）に存在するＨｉｎｆＩ切断部位
を用いて検出された。前記Ｍ１３ｍｐ８ＤＮＡの中でＥ
ｃｏＲＩ切断部位近くに存在するＮＯＳ３′−非翻訳領
域の３′末端を有するクローンが選ばれた。このクロー
ンは図８に示されたように、Ｍ−２クローンと命名され
た。

【０１１７】前記Ｍ−２クローンから得られる複製型の
（二重らせん）ＤＮＡはＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩに
よって分解され、２８０ｂｐフラグメント（断片）が分
離された。いっぽう、ｐＭＯＮ５８プラスミドがＥｃｏ
ＲＩおよびＢａｍＨＩによって分解され、１３００ｂｐ
フラグメントが分離された。前記２個のフラグメントを
結合して、図９に示されるように、ＥｃｏＲＩ末端を有
するＮＯＳ−ＮＰＴＩＩ−ＮＯＳキメラ遺伝子の組立を
完了した。

【０１１８】前記２個のフラグメントの結合をコントロ
ールする種々の方法がある。例えば、２個のＥｃｏＲＩ
−ＢａｍＨＩフラグメントは相互にＤＮＡリガーゼを用
いて結合させ、ＥｃｏＲＩを切断することが可能であ
る。ＥｃｏＲＩを不活性化させた後、子牛アルカリ・ホ
スファターゼ〔ｃａｌｆ ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓ
ｐｈａｔａｓｅ（ＣＡＰ）〕で処理されたＥｃｏＲＩ末
端を有するベクター分子を前述の混合物中に添加しても
よい。前記混合物中のフラグメントは、種々のオリエン
テーションに結合させることができる。前述のプラスミ
ド混合物は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を形質変換させるた
めに用いられ、所望のオリエンテーションを有するプラ
スミドを含む細胞は、下記に説明されるように選択さ
れ、分別された。

【０１１９】ｐＭＯＮ３８と命名されたプラスミドは、
前記のＨｉｎｄ ＩＩＩ−２３フラグメント（Ｔｉプラ
スミドｐＴｉＴ３７から得られたもの）を、前記プラス
ミドｐＢＲ３２７のＨｉｎｄ ＩＩＩ切断部位に挿入す
ることにより創製した。プラスミドｐＭＯＮ３８は、固
有のＥｃｏＲＩ部位および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で発
現するアムピシリン耐性遺伝子を含んでいる。プラスミ
ドｐＭＯＮ３８はＥｃｏＲＩで切断され、それ自身が再
結合することを防止するためにアルカリ・ホスファター
ゼで処理される。〔米国特許第４，２６４，７３１（Ｓ
ｈｉｎｅ、１９８１）参照〕。得られたフラグメントは
ｐＭＯＮ５８から得られた１３００ｂｐＮＯＳ−ＮＰＴ
ＩＩならびに、前述のパラグラフにて説明されたよう
に結合され、ＥｃｏＲＩ−切断して得られたＭ−２から
製造された２８０ｂｐＮＯＳフラグメントと混合され
た。前記のフラグメントは結合され、大腸菌（Ｅ．ｃｏ
ｌｉ）の中に挿入された。完全なプラスミドとアムピシ
リン−耐性遺伝子を獲得した前記の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌ
ｉ）細胞はアムピシリンを含む板上で選別された。数個
のクローンが選別され、挿入されたキメラ遺伝子のオリ
エンテーションは、切断実験により評価した。相反する
オリエンテーションを有するＮＯＳ−ＮＰＴＩＩ−ＮＯ
Ｓ挿入物を保有するプラスミドを有する２個のクローン
が選別され、それぞれｐＭＯＮ７５およびｐＭＯＮ７６
と命名された。キメラ遺伝子はｐＭＯＮ７５またはｐＭ
ＯＮ７６のいずれか一方をＥｃｏＲＩで分解し、１５８
０ｂｐフラグメントを精製することによって分離するこ
とが可能である。

【０１２０】上記方法はステップ６０により図２上に表
される。これはＮＯＳ−ＮＰＴ ＩＩ−ＮＯＳキメラ遺
伝子の議論を完成する。この遺伝子の創製についての追
加の情報は実施例において提供される。このキメラ遺伝
子のコピーはプラスミドｐＭＯＮ １２８に含有され
る；それはＥｃｏＲＩを用いてのダイジェスションによ
りｐＭＯＮ １２８から取出すことができる。ｐＭＯＮ
１２８を含有するＥ．ｃｏｌｉのカルチャーはアメリ
カンタイプコレクションで寄託された；このカルチャー
はアクセッション番号３９２６４がわりあてられた。

【０１２１】このキメラ遺伝子の利用性を証明するため
に、出願人はそれを植物細胞に挿入した。ＮＰＴ ＩＩ
構造的配列は、植物細胞において発現され、そしてそれ
らおよびそれらの子孫に、植物細胞に対して通常毒であ
るカナマイシンの濃度に対する抵抗性を獲得せしめた。

【０１２２】ＮＰＴＩキメラ遺伝子の創造 本発明の別の好ましい態様において（１）ＮＯＳプロモ
ーター領域及び５′非翻訳領域、（２）ＮＰＴ Ｉのコ
ードである構造的配列、及び（３）ＮＯＳ３′非翻訳領
域を含むキメラ遺伝子を創造した。

【０１２３】ＮＰＴ Ｉ及びＮＰＴ ＩＩはそれらのア
ミノ酸配列及び基質特異性において主要な差異を有する
異なった且つ区別される酵素である。例えば、イー・ベ
ック等、１９８２を参照せよ。種々のタイプの植物細胞
におけるこれらの２種の酵素の相対的安定性及び活性は
また十分に理解されていないそしてＮＰＴ Ｉは或るタ
イプの実験及び植物の形質転換において使用するために
ＮＰＴ ＩＩより好ましいかもしれない。

【０１２４】完全ＮＰＴ Ｉ遺伝子を含む１２００ｂｐ
フラグメントはｐＡＣＹＣ１７７（チャン及びコーエン
（Ｃｈａｎｇ ａｎｄ Ｃｏｈｅｎ）１９７８）をエン
ドヌクレアーゼＡｖａ ＩＩで分解することによって得
られた。Ａｖａ ＩＩの末端をクレノウ（Ｋｌｅｎｏ
ｗ）ポリメラーゼで平滑末端に変換しそして合成リンカ
ー（Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｌｉｎｋｅｒ）を用いてＢａ
ｍＨＩ末端に変換した。このフラグメントを図１１に示
したように、ｐＢＲ３２７から得られたプラスミド中の
唯一のＢａｍＨＩサイト（ｓｉｔｅ）中に挿入した。得
られたプラスミドをｐＭＯＮ６６と命名した。

【０１２５】プラスミドｐＭＯＮ５７（図１１で示した
ｐＢＲ３２７のデリーション（ｄｅｌｅｔｉｏｎ）誘導
体）をＡｖａ ＩＩで分解した。ｐＭＯＮ５７の２２５
ｂｐフラグメントをプラスミドｐＵＣ８（フィエイラお
よびメシング（Ｖｉｅｉｒａａｎｄ Ｍｅｓｓｉｎｇ）
１９８２）から得た２２５ｂｐ Ａｖａ ＩＩフラグメ
ント同族体で置き換え、Ｐｓｔ Ｉ開裂部位をもたない
ｐＭＯＮ５７の誘導体を得た。このプラスミドをｐＭＯ
Ｎ６７と命名した。

【０１２６】プラスミドｐＭＯＮ５８（前述及び図７に
示した）をＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩで分解し、ＮＯＳ
プロモーターとＮＰ ＩＩＩ構造配列を有する１３００
ｂｐフラグメントを得た。このフラグメントをＥｃｏＲ
Ｉ及びＢａｍＨＩで分解されたｐＭＯＮ６７中に挿入し
た。得られたプラスミドをｐＭＯＮ７３と命名し図１２
に示した。

【０１２７】ｐＭＯＮ７３をＰｓｔＩとＢａｍＨＩで分
解し、ＮＯＳプロモーター領域と５′非翻訳領域を含む
２．４ｋｂフラグメントを分解した。プラスミドをｐＭ
ＯＮ６６（図１１に示した）Ｘｈｏ Ｉ及びＢａｍＨＩ
で分解し、ＮＰＴ Ｉの構造配列を含む９５０ｂｐフラ
グメントを得た。このフラグメントは構造配列の５′末
端で約３０のヌクレオチドを欠落していた。欠落塩基を
含有し、適切なＰｓｔＩ及びＸｈｏ Ｉ末端を有する合
成リンカーを作成した。ｐＭＯＮ７７フラグメント、ｐ
ＭＯＮ６６フラグメント及び合成リンカーを一緒に結合
せしめて図１３に示すプラスミドをｐＭＯＮ７８を得
た。このプラスミドはＮＯＳプロモーター領域と、ＮＰ
Ｔ Ｉ構造配列と結合している５′非翻訳領域を含有す
る。ＡＴＧ開始コドンはＮＯＳ構造配列のＡＴＧ開始コ
ドンが占める位置と同一位置であった。

【０１２８】プラスミドｐＭＯＮ７８をＥｃｏＲＩ及び
ＢａｍＨＩでダイジェストし、キメラＮＯＳ−ＮＰＴ
Ｉ領域を有する１３００ｂｐフラグメントを製出した。
Ｍ−２クローン（前述しかつ図９に示した）からの二重
鎖ＤＮＡをＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩでダイジェスト
し、ポリ−アデニレーションシグナルを有しかつＮＯＳ
３′非翻訳領域を有する２８０ｂｐフラグメントを製出
した。上部の二種のフラグメントを共にリゲイトし、Ｒ
ｃｏＲＩでダイジェストされた（前述の）プラスミドｐ
ＭＯＮ３８中に入れられたＮＯＳ−ＮＰＴ Ｉ−ＮＯＳ
キメラ遺伝子を造った。この結果得られた、反対の配向
を有するキメラ遺伝子のインサートを有する二種のプラ
スミドを図１４中にｐＭＯＮ１０６およびｐＭＯＮ１０
７として示した。

【０１２９】プラスミドｐＭＯＮ １０６またはｐＭＯ
Ｎ １０７のいずれかをＥｃｏＲＩで消化し、キメラＮ
ＯＳ−ＮＰＴ Ｉ−ＮＯＳ遺伝子を含む１．６ｋｂ断片
をつくる。この断片を、ＥｃｏＲＩで消化しそしてアル
カリホスファターゼで処理したプラスミドｐＭＯＮ １
２０に挿入する。得られたプラスミドは反対方向をもつ
挿入物を有し、図１５に示すごとくｐＭＯＮ１３０及び
ｐＭＯＮ１３１と命名した。

【０１３０】ＮＯＳ−ＮＰＴ Ｉ−ＮＯＳキメラ遺伝子
を植物細胞に挿入した。これはカナマイシンに対する耐
性を獲得した。これは植物細胞におけるキメラ遺伝子の
発現を示す。

【０１３１】大豆プロモーターによるキメラ遺伝子の製
造 本発明の別の望ましい具体例として、（１）大豆中に天
然に存在する遺伝子から得られるプロモーター領域及び
５′非翻訳領域〔この遺伝子はリブロース−１，５−ビ
ス−ホスフェートカルボキシラーゼの小さなサブユニッ
ト（ｓｂｓｓ、大豆の小さなサブユニットとして）をコ
ードする〕、（２）ＮＰＴ ＩＩをコードする構造配列
及び（３）ＮＯＳ３′非翻訳領域からなるキメラ遺伝子
をつくった。

【０１３２】ｓｂｓｓ遺伝子は光合成炭素固定に包含さ
れる大豆の葉における蛋白質についてコードする。この
ｓｂｓｓ蛋白は大豆の葉において、最も豊富な蛋白質で
ある（全体の葉蛋白質の約１０％にのぼる）ので、ｓｂ
ｓｓプロモーター領域は多産の転写を惹起する。

【０１３３】大豆のゲノム中のｓｂｓｓ蛋白質をコード
するほぼ六つの遺伝子があると信じられている。ｓｂｓ
ｓ遺伝子ファミリーのメンバーの一つ、ＳＲＳ１（高度
に大豆の葉中に転写されている）はクローンされかつ特
徴づけられた。プロモーター領域５′非翻訳領域および
構造的配列の部分はプラスミドｐＢＲ３２５（Ｂｏｌｉ
ｖｅｒ、１９７８）のＥｃｏＲＩサイト中にサブクロー
ンされた２．１ｋｂＥｃｏＲＩフラグメント上に含有さ
れる。得られたプラスミドｐＳＲＳ２．１は米国ジョー
ジア州アゼンス所在ジョージア大学のＲ．Ｂ．Ｍｅａｇ
ｈｅｒ博士からモンサント社に贈呈された。ｐＳＲＳ
２．１からの２．１ｋｂ ＥｃｏＲＩフラグメントは図
１６に示されている。

【０１３４】プラスミドｐＳＲＳ２．１はダムＥ．ｃｏ
ｌｉ細胞から造られ、８００ｂｐフラグメントを得るた
めにＭｂｏ Ｉを以てクリーブ（切断）された。このフ
ラグメントはＢｇｌ ＩＩを以てクリーブされたプラス
ミドｐＫＣ７（ＲａｏおよびＲｏｇｅｒｓ、１９７９）
中にインサートされた。得られたプラスミドは図１７に
示されるようにｐＭＯＮ １２１と命名された。

【０１３５】プラスミドｐＭＯＮ １２１はＥｃｏＲＩ
でダイジェストされ、そしてｓｂｓｓプロモーター領域
を含有する１２００ｂｐフラグメントは単離された。別
にプラスミドｐＭＯＮ７５（前述され図９に示された）
はＥｃｏＲＩでおよびＢｇｌＩＩを以てダイジェストさ
れ、そして１２５０ｂｐフラグメントはＮＰＴ ＩＩ構
造配列およびＮＯＳ３′非翻訳領域を含有して単離され
た。この二つのフラグメントは相容性のＢｃｌＩ／Ｂｇ
ｌＩＩオーバーハングスで結紮されてｓｂｓｓ−ＮＰＴ
ＩＩ−ＮＯＳキメラ遺伝子を含有する２４５０ｂｐフ
ラグメントを創出した。このフラグメントはＥｃｏＲＩ
でクリーブされたｐＭＯＮ １２０中にインサートされ
て、図１８に示されるように、反対のオリエンテーショ
ンを有するキメラ遺伝子を有する二つのプラスミドを創
出した。プラスミドはｐＭＯＮ１４１およびｐＭＯＮ
１４２と命名された。

【０１３６】ｓｂｓｓ−ＮＰＴ ＩＩ−ＮＯＳキメラ遺
伝子が、二・三のタイプの植物細胞に挿入され、該植物
細胞がカナノイシン耐性を持つようにする。この成功裡
の転換は、一つのタイプの植物からのプロモーター領域
が、完全に異なる属、科及び目の植物からの植物細胞内
の遺伝子を発現させることができることを証明した。

【０１３７】キメラｓｂｓｓ−ＮＰＴ ＩＩ−ＮＯＳ遺
伝子はまた、もう一つの有意な特徴を有していた。シー
クエンシング実験は、８００ｂｐ Ｍｂｏ Ｉ断片がｓ
ｂｓｓ構造配列のＡＴＧ開始コドンを含有していたこと
を示した。この開始コドンを除くよりもむしろ、出願人
は読み取り枠内の開始コドンの後に停止コドンを挿入す
ることに決定した。これはジシストロニックｍＲＮＡ配
列を創り出した。該配列はｓｂｓｓポリペプタイドのト
ランケーテッドアミノ部分と完全ＮＰＴ ＩＩポリペプ
タイドとをコードした。ＮＰＴ ＩＩポリペプタイドの
発現は、ジシストロニックｍＲＮＡが植物細胞内で翻訳
されうることを最初に立証した。

【０１３８】ｓｂｓｓプロモーターは以下に述べられる
プラスミドｐＭＯＮ１５４に含有される。このプラスミ
ドを含有するＥ．ｃｏｌｉの培養物はアメリカンタイプ
カルチャーコレクションに寄託されている。この培養物
は受付番号３９２６５となった。

【０１３９】ＢＧＨキメラ遺伝子の製造 本発明の代わりの好ましい具体例において、（１）ｓｂ
ｓｓプロモーター領域及び５′非翻訳領域、（２）ボビ
ン（ウシ）成長ホルモン（ＢＧＨ）をコードする構造配
列、及び（３）ＮＯＳ３′非翻訳領域、を含むキメラ遺
伝子が製造された。このキメラ遺伝子は次の如く製造さ
れた。

【０１４０】このポリぺプチドである牛成長ホルモン
（例えば１９８２年Ｏ Ｗｏｙｃｈｉｋらの著書参照）
をコードする構造配列がｐＢＲ３２２−誘導プラスミド
に挿入された。得られたプラスミドをプラスミドＣＰ−
１と命名した。このプラスミドをＥｃｏＲＩとＨｉｎｄ
ＩＩＩで消化し、上記構造配列を含有する５７０ｂｐ
のフラグメントを得た。二重ストランドになっているＭ
−２ＲＦ ＤＮＡ（既に記載し図８に示したもの）をＥ
ｃｏＲＩとＨｉｎｄ ＩＩＩで開裂し、ポリ−アデニル
化シグナルを有するＮＯＳ３′の翻訳されていない領域
を含む２９０ｂｐのフラグメントを得た。２つのフラグ
メントをリガーゼで結合しＥｃｏＲＩで消化してＥｃｏ
ＲＩ端部を有する８６０ｂｐのフラグメントを生成させ
た。これはＮＯＳ３′の翻訳されない領域に結合された
ＢＧＨ−コーディング構造配列を含んでいた。このフラ
グメントをＥｃｏＲＩで消化され、アルカリ性ホスファ
ターゼで処理されているプラスミドｐＭＯＮ３８中に挿
入し、図１９に示され、ｐＭＯＮ１０８と命名される新
規プラスミドを生成させた。

【０１４１】ｐＭＯＮ１０８をＥｃｏＲＩで消化し８６
０ｂｐのフラグメントを得ることにより、そして生成す
るＥｃｏＲＩフラグメント上に平滑末端（ｂｌｕｎｔ
ｅｎｄｓ）を生じさせるためにＫｌｅｎｏｗポリメラー
ゼを用いて、特異なＢｇ ＩＩＩレストラクションサイ
トをＢＧＨ構造配列の５′端部に導入した。このフラグ
メントをリガーゼでプラスミドＮ２５（ＢａｍＨＩサイ
トに挿入それたＢｇＩＩＩ及びＸｂａ Ｉを運搬する合
成リンカーを含有するｐＢＲ３２７誘導体）に結合させ
た。なおこのプラスミドはＸｂａ Ｉであらかじめ開裂
され、Ｋｌｅｎｏｗポリメラーゼで処理されて平滑末端
を得たものである（Ｎ２５はＸｂａＩサイトから１２塩
基だけはなれた特異なＢｇ ＩＩＩサイトを含有す
る）。図２０に示されたオリエンテーションにおいて８
６０ｂｐのＢＧＨ−ＮＯＳフラグメントを含有する、生
成プラスミドをプラスミドＮ２５−ＢＧＨと命名した。
このプラスミドはＢＧＨ構造配列の５′端部から約２５
塩基はなれた特異なＢｇｌＩＩ開裂サイトを含有する。

【０１４２】ｄａｍ−Ｅ．ｃｏｌｉ細胞より調製された
プラスミドＮ２５−ＢＧＨはＢｇＩＩＩ及びＣｌａ Ｉ
により消化され８６０ｂｐ断片を生成し、この断片はＮ
ＯＳ３′の翻訳されない領域についているＢＧＨ構造配
列を含んでいた。一方、別にｄａｍ−Ｅ．ｃｏｌｉ細胞
よりプラスミドｐＭＯＮ１２１（既述及び図１７を参
照）を調製しＣｌａ Ｉ及びＢｃｌ Ｉで消化されｓｂ
ｓｓプロモーター領域を含む１１００ｂｐ断片を生成し
た。この断片は相応するＢｃｌ Ｉ／ＢｅｌＩＩオーバ
ーハング（ｏｖｅｒｈａｎｇ）に於てリガーゼで結合さ
れ、ＣｌａＩで消化されてキメラ的ｓｂｓｓ−ＢＧＨ−
ＮＯＳ遺伝子を含む約２ｋｂのＣｌａ Ｉ断片を生成し
た。この断片は予めＣｌａ Ｉにより消化されたｐＭＯ
Ｎ１２０（既述、図１０参照）にインサートされた。図
２１に示される如く生成されたプラスミド、逆方向に
（ｉｎｏｐｐｏｓｉｔｅｄｉｒｅｃｔｉｏｎｓ）キメラ
的遺伝子をインサートされたものはｐＭＯＮ１４７及び
ｐＭＯＮ１４８と命名された。

【０１４３】図２２に示す方法で別のキメラ的ＢＧＨ遺
伝子、即ち （１）ＮＯＳプロモーター領域及び５′非翻訳領域 （２）ＢＧＨの為のコードである構造配列、及び （３）ＮＯＳ３′非翻訳領域 を創製した。

【０１４４】プラスミドｐＭＯＮ７６（上述及び図９参
照）はＥｃｏＲＩ及びＢｇｌ ＩＩで消化されＮＯＳプ
ロモーター領域及び５′非翻訳領域を含む３０８ｂｐ断
片を生成した。ｄａｍ−Ｅ．ｃｏｌｉ細胞より調製され
たプラスミドＮ２５−ＢＧＨ（上述及び図２０参照）は
Ｂｇｌ ＩＩ及びＣｌａ Ｉにより消化されＢＧＨ構造
配列及びＮＯＳ非翻訳領域を含む９００ｂｐ断片が生成
された。この２断片はリガーゼで結合されＥｃｏＲＩ及
びＣｌａ Ｉ端をもつ断片の中にキメラ的ＮＯＳ−ＢＧ
Ｈ−ＮＯＳ遺伝子が得られた。この断片はｐＭＯＮ１２
０をＥｃｏＲＩ及びＣｌａ Ｉで消化して得られた８ｋ
ｂ断片と結合された。結果として生成したプラスミドは
ｐＭＯＮ１４９と命名され図２２に示されている。

【０１４５】キメラＮＯＳ−ＥＰＳＰ−ＮＯＳ遺伝子の
創製 他の、好ましい具体例として、（１）ＮＯＳプロモータ
ー領域と５′非翻訳領域、（２）大腸菌酵素、５−エノ
ールピルビルシキメート−３−リン酸シンテーゼ（ＥＰ
ＳＰ酵素）の暗号となる構造配列、（３）ＮＯＳ３′非
翻訳領域とから成るキメラ遺伝子を創製した。

【０１４６】ＥＰＳＰシンテーゼは、モンサント社から
「ラウンドアップ」の登録商標で市販されている除草
剤、ｇｌｙｐｈｏｓａｔｅの標的酵素と考えられてい
る。ｇｌｙｐｈｏｓａｔｅはＥＰＳＰシンテーゼ活性を
抑制することが知られており（Ａｍｒｈｅｉｎ他、１９
８０）、細菌中のＥＰＳＰシンテーゼ遺伝子の増殖が、
そのｇｌｙｐｈｏｓａｔｅに対する耐性を増大すること
も知られている。それ故、植物中のＥＰＳＰシンテーゼ
活性の水準を増加することが、形質転換された植物に、
ｇｌｙｐｈｏｓａｔｅ耐性を付与するのであろう。ｇｌ
ｙｐｈｏｓａｔｅは大抵の植物に有毒であるから、これ
は雑草の防除に有益な手段を与える。ＥＰＳＰシンテー
ゼ活性を増大する様に形質転換された、目的の作物の種
子を、畠に播く。ｇｌｙｐｈｏｓａｔｅを、形質転換さ
れない植物を全部、絶滅する濃度で畠に施し、形質転換
された植物を、被害を受けずに残すことが出来よう。

【０１４７】ＥＰＳＰシンテーゼ遺伝子は、次の方法を
含む各種の方法で単離することが出来る。大腸菌ＤＮＡ
のＨｉｎｄ ＩＩＩ切断により作られた各種のＤＮＡ断
片を有するλファージライブラリを創製することが出来
る。例えばＭａｎｉａｔｉｓ他、１９８２を参照。

【０１４８】ＥＰＳＰシンテーゼ遺伝子は、芳香族アミ
ノ酸の生成に関与する遺伝子の一種である。これらの遺
伝子は「アロ」遺伝子と呼ばれ、ＥＰＳＰシンテーゼは
ａｒｏ Ａと呼ばれる。機能的アロ遺伝子を含まない細
胞はアロー細胞と呼ばれる。アロー細胞は通常、芳香族
アミノ酸を補給した培地で生育されなければならない。
Ｐｉｔｔａｒｄ及びＷａｌｌｉｓ、１９６６を参照。

【０１４９】ＥＰＳＰシンテーゼ遺伝子を持たない変異
大腸菌細胞に感染させるのに、各種Ｈｉｎｄ ＩＩＩ断
片を持つ異なったλファージを用いることが出来よう。
感染したアロー細胞を芳香族アミノ酸を含まない培地で
培養し、この様な培地で生育し得る形質転換されたアロ
＋クローンを選択することが出来よう。この様なクロー
ンはＥＰＳＰシンテーゼ遺伝子を含む可能性が強い。こ
の様なクローンからファージ粒子を単離し、この様なフ
ァージからＤＮＡを単離することが出来よう。ファージ
ＤＮＡは１、またはそれ以上の制限エンドヌクレアーゼ
で切断され、何回かの分析過程により、ＥＰＳＰシンテ
ーゼ遺伝子を含む断片を単離することが出来よう。

【０１５０】上記に要約したのと同様の操作を用いて、
申請人は、全大腸菌ＥＰＳＰシンテーゼ遺伝子を含む１
１ｋｂのＨｉｎｄ ＩＩＩ断片を単離した。この断片を
ＢｇＩＩＩで消化して、全ＥＰＳＰシンテーゼ遺伝子を
含む、３．５ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ−Ｂｇ ＩＩＩ断片
を生成させた。この３．５ｋｂ断片をプラスミドｐＫＣ
７（Ｒａｏ及びＲｏｇｅｒｓ、１９７９）に挿入して、
図２３に示すプラスミドｐＭＯＮ４を生成させた。

【０１５１】プラスミドｐＭＯＮ４をＣｌａ Ｉで消化
して、ＥＰＳＰシンテーゼ構造配列を含む２．５ｋｂの
断片を得た。この断片をＣｌａ Ｉで消化したｐＢＲ３
２７に挿入し、図２３に示すｐＭＯＮ８を創製した。ｐ
ＭＯＮ８をＢａｍＨＩとＮｄｅ Ｉで消化して、４．９
ｋｂ断片を得た。この断片は、ＥＰＳＰシンテーゼ構造
順列のアミノ末端を記号化する約２００のヌクレオチド
を欠いていた。

【０１５２】不在のヌクレオチドは、図２４に示す様に
ｐＭＯＮ８から得られるＨｉｎｆＩ／Ｎｄｅ Ｉ断片
と、（１）ＥＰＳＰシンテーゼの出発コドンと最初の３
つのヌクレオチド、（２）特異Ｂｇ ＩＩＩサイト、
（３）適当なＢａｍＨＩとＨｉｎｆ Ｉ末端を含む合成
オリゴヌクレオチド順列を連結することによって置き換
えられた。その結果出来上がったプラスミド、ｐＭＯＮ
２５は、そのままのＥＰＳＰシンテーゼ構造順列と、出
発コドンの付近に位置する特異なＢａｍＨＩとＢｇ Ｉ
ＩＩとを含んでいる。二重鎖Ｍ−２ＤＮＡ（前述し、図
８に示した）をＨｉｎｄ ＩＩＩとＥｃｏＲＩで消化
し、ＮＯＳ３′非翻訳領域とポリアデニル化信号を含む
２９０ｂｐ断片を得た。この断片を、ＥｃｏＲＩとＨｉ
ｎｄ ＩＩＩで消化したｐＭＯＮ２５プラスミドに導入
し、ＮＯＳ３′非翻訳領域に接合したＥＰＳＰ構造順列
を含むｐＭＯＮ１４６（図２５に示す）と呼ばれるプラ
スミドを創製した。

【０１５３】ｐＭＯＮ１４６をＣｌａ ＩとＢｇ ＩＩ
Ｉで切断し、ＮＯＳ３′非翻訳領域に接合したＥＰＳＰ
構造配列を持つ２．３ｋｂ断片を得た。ｐＭＯＮ７６
（前述し、図９に示した）をＢｇ ＩＩＩとＥｃｏＲＩ
で消化し、ＮＯＳプロモーター領域と５′−非翻訳領域
を含む３１０ｂｐ断片を創製した。これらの断片をＣｌ
ａ ＩとＥｃｏＲＩで消化したｐＭＯＮ１２０（図１０
に前述し、示した）と混合し、混合物を連結した。その
結果、出来上がったプラスミドをｐＭＯＮ１５３と命名
し、図２６に示す。このプラスミドはキメラＮＯＳ−Ｅ
ＰＳＰ−ＮＯＳ遺伝子を含む。

【０１５４】キメラｓｂｓｓ−ＥＰＳＰ−ＮＯＳ遺伝子
を含むプラスミドは図２７に示す様に、次の方法で作ら
れた。プラスミドｐＭＯＮ１４６（前述し、図２５に示
した）をＣｌａ ＩとＢｇ ＩＩＩで消化し、２．３ｋ
ｂ断片を精製した。この断片は、ポリアデニル化信号を
持つＮＯＳ３′非翻訳領域に接合したＥＰＳＰシンテー
ゼ構造配列を含んでいた。プラスミドｐＭＯＮ１２１
（上記に前述し、図１７に示した）をＣｌａ ＩとＢｃ
ＩＩで消化、１．１ｋｂ断片を精製した。この断片は
ｓｂｓｓプロモーター領域と５′−非翻訳領域とを含ん
でいる。２種の断片を混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで連
結し、次いでＣｌａ Ｉで消化した。これによって共存
的Ｂｇｌ ＩＩおよびＢｃｌ Ｉ末端で結合したキメラ
ｓｂｓｓ−ＥＰＳＰ−ＮＯＳ遺伝子が創製された。この
Ｃｌａ Ｉ末端を持つキメラ遺伝子をＣｌａ Ｉで消化
され、仔牛アルカリ・フォスファターゼ（ＣＡＰ）で処
理されたプラスミドｐＭＯＮ１２０に挿入した。この混
合物をＴ４ＤＮＡリガーゼで連結した。その結果、出来
上がった断片とプラスミドの混合物をスペクチノマイシ
ン耐性のために選択された大腸菌細胞を形質転換するの
に使用した。耐性細胞の集落を単離し、この集落中のプ
ラスミドを、図２７に示す様に、ｐＭＯＮ１５４と呼ぶ
ことにした。

【０１５５】ｐＭＯＮ１５４を含む大腸菌の培養物を、
Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｅｎ
ｔｅｒに寄託した。この培養物は受入番号３９２６５を
与えられた。

【０１５６】ＣａＭＶ（１９Ｓ）−ＮＰＴ ＩＩ−ＮＯ
Ｓ遺伝子の創製 この発明の他の好ましい具体例として、次の要素を含む
キメラ遺伝子が創製された。 １．プロモーター領域と、ｐ６６蛋白質の暗号となるＣ
ａＭＶ（１９Ｓ）遺伝子由来の５′非翻訳領域 ２．ＮＰＴ ＩＩ遺伝子の所要のＡＴＧ出発コドンの直
ぐ内側のＴＧＡ停止配列と同じ枠の中のＡＴＧ出発コド
ンと、何個かの内部ＡＴＧ順列を含むＣａＭＶ（１９
Ｓ）遺伝子からの部分的暗号配列 ３．ネオマイシン・フォスフォトランスフェラーゼＩＩ
（ＮＰＴ ＩＩ）遺伝子由来の構造配列。この順列はＮ
ＰＴ ＩＩ構造順列内のＴＧＡ配列と同じ解読わく内の
疑似ＡＴＧ配列によって先行された。 ４．Ｎｏｐａｌｉｎｅシンテーゼ（ＮＯＳ）遺伝子由来
のポリアデニル化信号を含む３′非翻訳領域

【０１５７】ここでＣａＭＶ（１９Ｓ）−ＮＰＴ ＩＩ
−ＮＯＳ遺伝子と呼ぶキメラ遺伝子を、プラミドｐＭＯ
Ｎ１２０に挿入し、図２９に示し、９例に記述するｐＭ
ＯＮ１５６と呼ばれるプラスミドを創製した。プラスミ
ドｐＭＯＮ１５６を、Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ細胞
に挿入し、そこでＡ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ細胞内の
Ｔｉプラスミドとの単回交叉により、共同組込みＴｉプ
ラスミドが形成された。共同組込みプラスミド中のキメ
ラ遺伝子は、Ｔｉプラスミド中の修正Ｔ−ＤＮＡ領域内
にあり、左右のＴ−ＤＮＡ境界に囲まれていた。

【０１５８】同様のキメラ遺伝子が、図３２に示し、１
０例に記述するｐＭＯＮ１５５と呼ばれるプラスミド中
で創製され、組み合わされた。このキメラ遺伝子は２つ
の例外の点を除いてｐＭＯＮ１５６内の遺伝子に似てい
た。

【０１５９】１．３個の解読わくの全部に停止コドンを
有するオリゴヌクレオチドリンカーが、ＣａＭＶ（１９
Ｓ）部分的構造順列とＮＰＴ ＩＩ構造配列の間に挿入
されたこと。 ２．ＮＰＴ ＩＩ構造配列の５′側の疑似ＡＴＧ順列が
除かれたこと。 このキメラ遺伝子の構造を、１０例に記述した。この遺
伝子はＡ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ細胞に、次いで植物
細胞に挿入された。その発現水準は、より高濃度のカナ
マイシンでの生長で定量される様に、ｐＭＯＮ１５６内
の同様な遺伝子よりも、明らかに高かった。共同組込み
Ｔｉ：：ｐＭＯＮ１５５プラスミドを含むＡ．ｔｕｍｅ
ｆａｃｉｅｎｓ細胞は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ
Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｅｎｔｅｒに寄託され、受入番号３
９３３６が与えられた。

【０１６０】キメラＣａＭＶ（３２Ｓ）−ＮＰＴ ＩＩ
−ＮＯＳ遺伝子の創製 この発明の、他の好ましい具体例では、 （１）３２Ｓ ＣａＭＶ ｍＲＮＡの転写を起こすプロ
モーター領域 （２）ＮＰＴ ＩＩの暗号となる構造配列 （３）ＮＯＳ３′非翻訳領域 より成るキメラ遺伝子が創製された。このキメラ遺伝子
の組み合わせは、１１例と、図３３〜図３７に記述され
ている。この遺伝子は植物細胞に挿入され、その植物を
カナマイシン耐性にした。

【０１６１】ペチュニア植物は通常、ＣａＭＶに感染し
ない。この技術に卓越した人々は、一定の実験手段によ
って、何か特別の植物ビールス・プロモーター（ＣａＭ
Ｖプロモーターの様な）が、そのプロモーターが得られ
たビールスの通常の宿主範囲以外の植物細胞を含む、何
等かの型の植物細胞内で、満足すべき水準で機能するか
否かを決定することが出来よう。

【０１６２】キメラ遺伝子を植物細胞に挿入する方法 異種のＤＮＡを植物細胞中に挿入するいくつかの方法が
知られている。出願人によって用いられた一つの方法
は、キメラ遺伝子を、Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓを担
体としたＴｉプラスミドに挿入し、Ａ．ｔｕｍｅｆａｃ
ｉｅｎｓ細胞を植物と共存培養する方式を含んでいた。
キメラ遺伝子を持つＴ−ＤＮＡの一片を植物ゲノムに移
し、形質転換を起こさせた。この方法は「植物細胞の形
質転換のためのプラセミド」Ｓｅｒｉａｌ Ｎｏ．４５
８，４１１と「遺伝的に形質転換された植物」Ｓｅｒｉ
ａｌ Ｎｏ．４５８，４０２の１９８３年１月１７日付
出願の２つの米国特許出願に詳細に記述されている。以
下に各種の他の方法を記す。これらの方法は、今日迄に
達成された形質転換の効率は低いものの、理論的に、本
発明のキメラ遺伝子を植物細胞に挿入出来る方法であ
る。本発明のキメラ遺伝子（特に、選択標識として利用
されるＮＰＴＩ及びＮＰＴ ＩＩの様なキメラ遺伝子）
は、ＤＮＡを植物や植物細胞に挿入する方法の研究を便
ならしめると思われる。

【０１６３】１．ＤＮＡを植物細胞に挿入する他の一つ
の技術は、リポゾームとも呼ばれる脂質小胞の利用を含
む。リポゾームは１またはそれ以上のＤＮＡ分子をカプ
セル化するのに用いられる。リポゾームとそのＤＮＡ含
量は植物細胞に取り入れられる。例えばＬｕｒｑｕｉ
ｎ、１９８１を参照。若しも、挿入されたＤＮＡが植物
ゲノムに併合され、複製され、遺伝されれば、植物細胞
は形質転換される。今日までリポゾームを用いてＤＮＡ
を植物細胞に届けようという努力は大きな成果を挙げて
いない（Ｆｒａｌｅｙ及びＰａｐａｐｈａｄｊｏｐｏｕ
ｌｏｓ、１９８１）。比較的小さなＤＮＡ分子だけが、
リポゾームで植物細胞に移し換えられているが、発現さ
れているものはない。しかし、リポゾーム送達技術は、
活発に開発されつつあり、本発明のキメラ遺伝子を含む
プラスミドをリポゾームを含む手段で植物細胞に移し換
えるために、種々の方法が開発される可能性が強い。

【０１６４】２．他の別の技術は、植物細胞を、（ａ）
ｐｏｌｙ−Ｌ−ｏｒｖｉｔｈｎｅ（Ｄａｖｅｙ他、１９
８０）の様な多価カチオン物質か、（ｂ）燐酸カルシウ
ム（Ｋｒｅｎｓ他、１９８２）で錯体としたＤＮＡと接
触させることを含む。今日まで達成された形質転換の効
率は低いが、これらの方法はいまでも活発に研究されて
いる。

【０１６５】３．所要のプラスミドを含む細菌の植物細
胞との融合を含む方法が開発された。この様な方法は細
菌をスフェロプラスに、植物細胞を原形質体に転換する
ことを含む。これらの方法の両方とも、酵素消化を用い
て、細菌及び植物細胞から細胞壁バリヤーを除くのであ
る。２つの細胞型は、その後、ポリエチレングリコール
の様な化学薬品に暴露することによって融合される。Ｈ
ａｓｅｚａｗａ他、１９８１を参照。今日までこの方法
で、達成された形質転換効率は低いが細 菌及び動物細
胞の融合を用いる同様の実験は良い結果を生んでいる。
Ｒａｓｓ ｏｕｌｚａｄｅｇａｎ他、１９８２を参照。

【０１６６】４．遺伝的に動物細胞を形質転換するのに
用いられて、成功した他の２つの方法は（ａ）微小ガラ
ス針を用いるＤＮＡの動物細胞への直接微量注入（Ｃａ
ｐｅｃｃｈｉ、１９８０）と、（ｂ）動物細胞によるＤ
ＮＡの電流誘導取り込み（Ｗｏｒｇ及びＮｅｕｗａｎ
ｎ、１９８２）を含む。これらの技術の何れもが、今日
まで植物細胞の形質転換に用いられていないが、本発明
のキメラ遺伝子を植物細胞に挿入するのに有用であろ
う。

【０１６７】植物レギュレーターを同定するためのキメ
ラ遺伝子の利用 本発明のキメラ遺伝子をＤＮＡ配列の同定、単離、研究
に用いて、これらが植物細胞内で遺伝子の発現の促進や
他の調整が可能であるかどうかを決定することが出来
る。

【０１６８】例えば、どの様な細胞からのＤＮＡでも部
分ヌクレアーゼ消化や他の方法を用いて、断片にするこ
とが出来る。ＤＮＡ断片は、構造配列のＡＴＧ出発コド
ンから、５′の方向に位置する特異切断部位で切断した
キメラ遺伝子の複数のコピーと混合される。出来れば、
構造配列は若し適当に転写されれば、ある種の抗生物質
に対する耐性を宿主に与えるポリぺプチドの様な選択標
識に、翻訳されるとよい。ＤＮＡ混合物は連結されて、
プラスミドを形成し、そのプラスミドは、その抗生物質
に感受性のある植物細胞を形質転換するのに用いられ
る。この細胞は、その抗生物質の適当な濃度を含む培地
上で培養される。植物細胞は構造配列が転写され、抗生
物質に耐性を与えるポリぺプチドに翻訳される場合にの
み、生存し、再生する。これは挿入されたＤＮＡ断片が
遺伝子プロモーターの役割を果たす場合にのみ、起こる
と考えられる。耐性のある集落は更に、評価を受けて、
その通りであるか否かを決定するのに用いられる。

【０１６９】この技術を用いて、細菌、酵母、カビ、藻
やその他の微生物や動物細胞のプロモーター領域を評価
し、これらが又、植物細胞の各種の型で遺伝子プロモー
ターとして作用するか否かを決定することが出来る。
又、ある型の植物からのプロモーターを他の植物細胞の
型の中で評価することも出来る。同じ様な方法で、キメ
ラ遺伝子の切断サイトを変えることにより、どの様なＤ
ＮＡ配列でも、５′非翻訳領域、３′非翻訳領域、又は
他の調整配列の如何なる型でも、その挙動を評価するこ
とが出来る。

【０１７０】若し、望まれれば各種ＤＮＡ配列の調整効
果の評価方法に部分キメラ遺伝子を用いることが出来
る。例えば、ＮＯＳプロモーター領域とＮＯＳ５′非翻
訳領域の両方又は一方をＮＯＳ−ＮＰＴ ＩＩ−ＮＯＳ
キメラ遺伝子から除くことが出来る。これにより、ＮＰ
Ｔ ＩＩ構造配列の前に切断サイトを有するがプロモー
ター領域をもたないキメラ遺伝子を創製することが出来
る。

【０１７１】挿入されたＤＮＡ断片が、（１）構造配列
の解読わくを変えるか、（２）ポリぺプチドのアミノ端
末を変える出発コドンを含む場合は、オリゴヌクレオチ
ドを切断サイトと構造配列の出発コドンの間に置くこと
が出来る。オリゴヌクレオチドはすべての３種の解読わ
くに停止コドンを含むであろう。それ故、若しも、出発
コドンが挿入されたＤＮＡ断片に含まれていれば、遺伝
子は２シストロン遺伝子であろう。最初のポリぺプチド
の末端は挿入された出発コドンの解読わくの中にあるど
ちらかの停止コドンになるであろう。第２の出発コドン
は選択標識酵素である別のポリぺプチドの翻訳を始める
であろう。

【０１７２】種々の句の意味 請求の範囲に用いられるいろいろな句は、請求の範囲の
意味、および適用範囲を明らかにするために、定義され
記述されなければならない。

【０１７３】どの特殊用語でもその意味は、この出願の
本文及び図に関して説明されなければならない。特に、
文献において矛盾して用いられるいろいろな用語が展開
することが認められる。たとえば、いろいろな意味が
“プロモーター”という語を発展させ、その語のあるも
のは５′−非翻訳領域を含み、またあるものは含まない
ということになる。説明によっておこる問題を努力して
さけるために、出願者は種々の用語を定義するよう試み
た。しかしながら、そのような定義は仮定されることな
く、あるいは包括的であるようにも意図されることな
く、適切な文献に照らして説明されなければならない。

【０１７４】“キメラ遺伝子”の語は、異なる独特な遺
伝子から誘導された、最低２つの部分を含む遺伝子とみ
なす。この中に用いられているように、この語は集合、
合成、あるいはその逆に人工の努力として生み出された
遺伝子、あるいはそこから複製または誘導されるいずれ
かの遺伝子に限定される。“人工の努力”はもしもそれ
が人間的努力、あるいは介在により引き起こされ、高め
られ、支配された状態のもとで起こった過程ならば、酵
素の、細胞の、また他の生物学的過程を含む；すなわち
自然な過程で単に作られただけの遺伝子は除外する。

【０１７５】ここに用いられているように、“遺伝子”
は当業者により遺伝子として順当に認められているＤＮ
Ａの断片に限定される。たとえばプラスミドは植物誘導
プロモーター領域及び異種構造シークエンスを含むが、
もし、それら２つの断片がプロモーター領域が構造シー
クエンスの転写を起こすようなプラスミドの中で互いに
位置しないならば、その時、その２つの断片は同じ遺伝
子に含まれたものとしてみなされることはない。

【０１７６】この発明はキメラ遺伝子に関するものであ
り、そのキメラ遺伝子は、それらプロモーター領域に関
しては“異種”である構造シークエンスを有する。これ
は少なくとも２型のキメラ遺伝子を含む。

【０１７７】１．植物細胞とは異種の遺伝子のＤＮＡ、
たとえばもしも哺乳類蛋白またはバクテリア蛋白を暗号
化する構造シークエンスが植物プロモーター領域に連ら
ならせられるならば、そのような遺伝子は異種とみなさ
れる。

【０１７８】２．異なる植物プロモーター領域により自
然に助長される植物細胞遺伝子、たとえば、もしも植物
蛋白を暗号化する構造シークエンスが順当に少量のプロ
モーターによって支配されれば、構造シークエンスは多
産プロモーターと一緒にされる。これは、より多量の構
造シークエンス転写をひきおこし、それにより高い蛋白
をもった植物の誘導が十分になる。そのような構造シー
クエンスは多産プロモーターに関しては異種とみなされ
る。

【０１７９】しかしながら、この発明にとって完全な構
造シークエンスが完全なプロモーター領域に異種である
ことは重要ではない。たとえば、この発明のキメラ遺伝
子は、“融合蛋白”、すなわち２つの別個の構造シーク
エンスから誘導されたポリぺプチド部分を含む蛋白に翻
訳されるように創製されてもよい。これは全部あるいは
一部の異種構造シークエンスを、植物遺伝子の構造シー
クエンス中の、その構造シークエンスの開始コドン後方
のどこかに挿入することにより完成される。

【０１８０】この中に用いられるように、“特定の遺伝
子から誘導されたプロモーター領域”という句は、１な
いしそれ以上の部分のプロモーター領域が特定の遺伝子
から誘導されている場合のプロモーター領域をその意味
に含む。たとえば、１ないしそれ以上の特定の植物誘導
プロモーター領域の部分（図１に示される介在領域８の
ような）は、特定の型の宿主細胞内において、得られた
キメラ遺伝子の発現を低減することのない異種構造シー
クエンスを含む遺伝子のような、異なる遺伝子から誘導
された１ないしそれ以上のシークエンスで置換されるこ
とが見出されるであろう。そのようなキメラ遺伝子は植
物誘導結合領域２、介在領域４、ならびに異種介在領域
８、５′−非翻訳領域１０、および構造シークエンス１
４があとにつく転写開始シークエンス６を含む。そのよ
うなキメラ遺伝子はこの発明の範囲内である。

【０１８１】この中に用いられているように、“〜から
誘導された”という句は、広く解釈される。たとえば、
構造シークエンスは次のことを含むいろいろな過程によ
り特別な遺伝子“から誘導”される：

【０１８２】１．遺伝子は、プラスミド内挿入および細
胞培養によるプラスミド複製、試験管内複製、また他の
方法などのような種々の方法により再生産され、求めら
れるシークエンスはエンドヌクレアーゼ分解のような種
々の方法によりＤＮＡコピーから得られる；

【０１８３】２．遺伝子により暗号化されたｍＲＮＡを
得、ｍＲＮＡから相補的ＤＮＡを調製し、次いでｃＤＮ
Ａをエンドヌクレアーゼ消化するなどの種々な方法で処
理する；

【０１８４】３．構造シークエンスにおける塩基配列を
エンドヌクレアーゼマッピングあるいはＭａｘａｍ−Ｇ
ｉｌｂｅｒｔ法のような種々の方法で決定してもよい。
求められるシークエンスの複製または近似物であるＤＮ
Ａ鎖を化学合成、またオリゴヌクレオチド断片の結紮法
により創製してもよい。

【０１８５】４．塩基の構造シークエンスは、遺伝子コ
ードをポリぺプチド内のアミノ酸残基シークエンスに適
合することによりもとをたどれる。一般に、いろいろな
ＤＮＡ構造シークエンスが重複する遺伝子コードのため
にポリぺプチドに対して決定される。これらの種々のも
ののうちから、塩基の求められるシークエンスが選択さ
れ、その（選択された）シークエンスを持つＤＮＡ鎖が
作られる。

【０１８６】もし求められるなら、どのＤＮＡシークエ
ンスも存在塩基を、ある塩基と代えることにより修飾さ
れる。そのような修飾は多くの理由で行われる。たとえ
ば、シークエンス内の１またはそれ以上の塩基は特殊な
エンドヌクレアーゼの分割部位を作り、あるいは削除す
るために他の塩基と置換される。もう１つの例としてシ
ークエンス内の１ないしそれ以上の塩基がメッセンジャ
ーＲＮＡの“茎と輪（ステムとループ）”構成の発生を
低減するために置換される。そのような修飾シークエン
スは、この発明の範囲内にある。

【０１８７】構造シークエンスはイントロンとエクソン
を含む；そのような構造シークエンスはＤＮＡあるいは
第一転写ｍＲＮＡから誘導される。別法として、１個以
上のイントロンの除去処理を受けたｍＲＮＡから、構造
シークエンスを誘導することもできる。

【０１８８】出願人はプラスミドｐＭＯＮ１２８および
ｐＭＯＮ１５４を含むＥ．ｃｏｌｉ細胞の２つの培養物
をＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏ
ｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に預けている。これらの
細胞はＡＴＣＣ受託番号３９２６４及び３９２６５とし
て、それぞれ寄託されている。出願人はいずれの培養物
にも関連する特徴を持つ微生物培養物を請求した。この
中に用いられるように、細胞培養物の“関連する特質”
は、培養を、ここに含まれる情報により明らかにされ、
示唆され、あるいは可能にされる用法にかなったものと
するような特徴に限定される。培養物の多くの特質は当
業者に知られた技術により修飾される；たとえば、細胞
内への特定のプラスミドあるいは遺伝子の挿入により特
定の抗生物質に対して細胞が耐性を付与され、あるい
は、ｐＭＯＮ１２８またはｐＭＯＮ１５４プラスミドが
指示細胞から移動され、また細胞の異なる菌株内に挿入
される。そのような変化はこの発明の範囲内にある。し
かもそれは非常に改良され、その改良が、この細胞培養
に接する多くの研究を経て起こることは疑う余地がな
い。

【０１８９】当業者は、ここに記述される特定の実施態
様の多数の等価物を、通常程度を越えない実験を使用し
て認識し、または確認することができるであろう。その
ような等価物はこの発明の範囲内にある。

【０１９０】

【実施例】例 例１：ｐＭＯＮ１００１の創製 ５０マイクログラム（ｕｇ）のラムダフアージｂｂｋａ
ｎ−１ＤＮＡ（Ｂｅｒｇ他、１９７５）は、１００単位
のＨｉｎｄ ＩＩＩ（すべての制限的エンドヌクレアー
ゼはＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ．Ｂｅｖ
ｅｒｌｙ，ＭＡで得られ、別な方法で書かれていなけれ
ば、供給者の指示に従って緩衝剤と共に用いられる）を
用いて２時間、３７℃で分解される。加熱不活性化（７
０℃、１０分間）後、３．３ｋｂ Ｔｎ５Ｈｉｎｄ Ｉ
ＩＩ断片はスクロース勾配上で純化される。１ｕｇの純
化されたＨｉｎｄ ＩＩＩ断片はＢａｍＨＩ（２単位、
１時間、３７℃）を用いて分解され、１．８ｋｂ断片を
生起させる。エンドヌクレアーゼを加熱不活性化する。

【０１９１】プラスミドｐＢＲ３２７（Ｓｏｂｅｒｏｎ
他、１９８１）、１ｕｇは、Ｈｉｎｄ ＩＩＩおよびＢ
ａｍＨＩ（各２単位、２時間、３７℃）を用いて分解さ
れる。分解に続きエンドヌクレアーゼは加熱不活性化さ
れ、分割されたｐＢＲ３２７ＤＮＡはＢａｍＨＩ−Ｈｉ
ｎｄ ＩＩＩ Ｔｎ５断片に加えられる。０．７５ｍＭ
の濃度へのＡＴＰ添加後、１０単位のＴ₄ ＤＮＡリガー
ゼ（Ｍｕｒｒａｙ他、１９７９の方法により調製）が加
えられ、反応は１６時間、１２−１４℃で続けられる。
１単位のＴ₄ ＤＮＡリガーゼは５分間、２２℃で１ｕｇ
のＨｉｎｄ ＩＩＩ−分割ｐＢＲ３２７プラスミドの９
０％環化をなす。

【０１９２】結紮（連結）されたＤＮＡはＣａＣ₁₂−シ
ョックＥ．ｃｏｌｉＣ６００ｒｅｃＡ５６細胞（Ｍａｎ
ｉａｔｉｓ他、１９８２）を変換するのに用いられる。
ルリアブロス（ＬＢ）における１時間、３７℃の発現
後、細胞は２００ｕｇ／ｍｌアムピシリンおよび４０ｕ
ｇ／ｍｌカナマイシンを含む固体ＬＢ媒地板上に広げら
れる。３７℃、１６時間の培養保育に続き数百のコロニ
ーが出現する。プラスミドミニプレプＤＮＡはこれらの
うち６コロニーから準備された（Ｉｓｈ−Ｈｏｒｏｗｉ
ｃｚとＢｕｒｋｅ、１９８１）。エンドヌクレアーゼ分
解は全６プラスミドが１．８ｋｂ Ｈｉｎｄ ＩＩＩ−
ＢａｍＨＩ断片を保持することを示す。これらの単離物
の１つが図６に示されるようにｐＭＯＮ１００１と命名
される。

【０１９３】例２：ｐＭＯＮ４０の創製 ５ｕｇプラスミドｐＭＯＮ１００１（例１に記述）は、
Ｓｍａ Ｉを用いて分解される。反応はフェノール抽出
により終了、ＤＮＡはエタノールにより沈殿される。Ｂ
ａｍＨＩリンカーＣＣＧＧＡＴＣＣＧＧ（０．１ｕｇ）
はＡＴＰおよびＴ₄ ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｂｅｔ
ｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）を用いてリン酸化され
ているが、それは１ｕｇのｐＭＯＮ１００１断片に加え
られる。混合物はＴ₄ ＤＮＡリガーゼ（１００単位）を
用いて１８時間、１４℃で処理される。ＤＮＡリガーゼ
を不活性化するために、７０℃１０分間加熱後、ＤＮＡ
混合物はＢａｍＨＩエンドヌクレアーゼ（２０単位、３
時間、３７℃）を用いて分解され、電気泳動により０．
５％アガロースゲル上で分離される。４．２ｋｂ Ｓｍ
ａ Ｉ−ＢａｍＨＩベクター断片に対応するバンドをゲ
ルから切出した。４．２ｋｂ断片はガラスビーズ上で吸
着により純化され（ＶｏｇｅｌｓｔｅｉｎとＧｉｌｌｅ
ｓｐｉｅ、１９７９）、エタノール沈殿され、ＡＴＰを
含む２０ｕｌのＤＮＡリガーゼ緩衝剤中に再懸濁され
る。Ｔ₄ ＤＮＡリガーゼ（２０単位）が加えられ、混合
物は、１５時間、室温でインキュベートされる。ＤＮＡ
はルビジウム塩化物ショックＥ．ｃｏｌｉＣ６００細胞
と共にＤＮＡ形質転換のために混合される（Ｍａｎｉａ
ｔｉｓ他、１９８２）。１時間、３７℃ＬＢ中で発現
後、細胞は２００ｕｇ／ｍｌのアムピシリンおよび２０
ｕｇ／ｍｌカナマイシンを含むＬＢプレート上に広げら
れる。プレートは３７℃、１６時間、インキュベートさ
れる。１２のアムピシリン抵抗、カナマイシン抵抗コロ
ニーが選ばれ、２ｍｌ培養を育成し、ミニプラスミド調
製が行われる。プラスミドのエンドヌクレアーゼマッピ
ングは１２のうちの１０はＳｍａ Ｉ部位を有さず、単
一のＢａｍＨＩ部位を含むことを示し、かつ適切な大き
さ、４．２ｋｂを有していた。１０コロニーの１つから
のプラスミドは図６に示されるように、ｐＭＯＮ４０と
命名される。

【０１９４】例３：ＮＯＳプロモーター断片の創製 次のシークエンス５′−ＴＧＣＡＧＡＴＴＡＴＴＴＧＣ
−３′を有するオリゴヌクレオチドが合成される（Ｂｅ
ａｕｃａｇｅとＣａｒｒｕｔｈｅｒ、１９８１、Ａｄａ
ｍｓ他１９８２により変更を加えた）。このオリゴヌク
レオチドは³²ｐ放射能ラベルを含む。この放射能ラベル
は５′シミジン残基にポリヌクレオチドキナーゼにより
加えられる。

【０１９５】Ｓ１Ａと称されるＭ１３ｍｐ７誘導体はＷ
ａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｔ．Ｌ
ｏｕｉｓ，ＭＯのＭ．ＢｅｖａｎとＭ．−Ｄ．Ｃｈｉｌ
ｔｏｎとにより出願人に提供された。出願人の知識と信
念のうち最良のものはＳ１ＡＤＮＡが次の方法により得
られたことである。ｐＴｉＴ３７プラスミドはＨｉｎｄ
ＩＩＩを用いて分解され、３．４ｋｂ断片を単離して
Ｈｉｎｄ ＩＩＩ−２３断片と命名した。この断片はＳ
ａｕ３ａを用いて分解され、Ｓａｕ３ａ末端を有する３
４４ｂｐ断片を生起する。この断片は二重鎖の複製可能
な形態のＭ１３ｍｐ７ファージベクター由来のＤＮＡに
挿入され（Ｍｅｓｓｉｎｇ他、１９８１）、それはＢａ
ｍＨＩを用いて切断される。３４４ｂｐ挿入のある２つ
の組みかえファージはＮＯＳプロモーター断片のアンチ
センス鎖を含むものの１つを結果として生ずる。組みか
えファージはＳ１Ａと命名され、クローンコピーが出願
人に与えられる。

【０１９６】出願人はＳ１Ａ ＤＮＡ（１４．４ｕｇ；
６ｐｍｏｌ）の単鎖形態を調製し、上述の２０ｐｍｏｌ
の１４−ｍｅｒオリゴヌクレオチドと共にアニールする
（１０分間、７０℃、後室温にさます）。オリゴヌクレ
オチドは図４および図５で示されるように塩基２８６−
３００の、Ｓａｕ３ａ挿入物にアニールする。

【０１９７】２００ｕｌのＳ１Ａテンプレートおよびア
ニール化オリゴヌクレオチドは、４ｄＮＴＰ′ｓ（１ｍ
Ｍ、２．５ｕｌの最終濃度で出現）と５０ｕｌのＫｌｅ
ｎｏｗポリメラーゼと共に混合される。混合物は３０分
間、室温でインキュベートされる。この間ポリメラーゼ
はｄＮＴＰ′ｓをオリゴヌクレオチドの３′末端に加え
る。ポリメラーゼは加熱不活性化され（７０℃、３分
間）、Ｈａｅ ＩＩＩ（１６０単位）が加えられる。混
合物はインキュベートされ（１時間、５５℃）、Ｈａｅ
ＩＩＩは不活性化され（７０℃、３分間）、４ｄＮＴ
Ｐ′ｓ（１ｍＭ、１２ｕ）およびＴ₄ ＤＮＡポリメラー
ゼ（５０単位）が加えられる。混合物はインキュベート
され（１時間、３７℃）、ポリメラーゼは不活性化（７
０℃、３分間）される。これは約５７０ｄｐの断片を生
ずる。ＥｃｏＲＩ（１５０単位）が加えられ、混合物は
インキュベート（１時間、３７℃）され、ＥｃｏＲＩは
不活性化（７０℃、３分間）される。

【０１９８】分別された混合物は２５％グリセロールを
含む６％アクリラマイド上にて分けられる。オートラジ
オグラフィーは大きさ約３１０ｂｐの放射能標識帯を示
す。この帯が切出される。前述の手順は図５に示され
る。

【０１９９】例４：ｐＭＯＮ５８の創製 ５ｕｇプラスミドｐＭＯＮ４０（例２に記述）はＢｇｌ
ＩＩ（１０単位、１．５時間、３７℃）を用いて分解
され、Ｂｇｌ ＩＩは不活性化（７０℃、１０分間）さ
れる。４ｄＮＴＰ′ｓ（１ｍＭ、１２ｕｌ）およびＫｌ
ｅｎｏｗポリメラーゼ（８単位）は加えられ、混合物は
インキュベートされ（３７℃、４０分間）され、ポリメ
ラーゼは不活性化（７０℃、１０分間）される。Ｅｃｏ
ＲＩ（１０単位）が付加され、インキュベート（１時
間、３７℃）されて、ウシアルカリフォスファターゼ
（ＣＡＰ）が付加され、インキュベート（１時間、３７
℃）される。約３．９ｋｂの断片はＮＡ−４５膜を用い
てアガロースゲル上で純化される（Ｓｃｈｅｉｃｈｅｒ
とＳｃｈｅｕｌｌ，Ｋｅｅｎｅ ＮＨ）。断片（１．０
ｐＭ）は例３に記されたようにＮＯＳプロモーター断片
（０．１ｐＭ）、Ｔ₄ ＤＮＡリガーゼ（１００単位）と
共に混合される。混合物はインキュベート（４℃、１６
時間）される。得られたプラスミドはＥ．ｃｏｌｉ細胞
に挿入され、そのＥ．ｃｏｌｉ細胞は２００ｕｇ／ｍｌ
アムピシリンを含む媒質上で選ばれる。３６クローンＡ
ｍｐ^R コロニーは選択され、ミニプレプラスミドはこれ
らのコロニーから作られる。１コロニーからのプラスミ
ドは３０８ｂｐのＥｃｏＲＩ−Ｂｇｌ ＩＩ断片、３０
８ＮＯＳ断片に保持される新たなＳｓｔ ＩＩ切断部
位、および新たなＰｓｔ Ｉ部位を示した。このプラス
ミドはｐＭＯＮ５８と命名され、図７で示されるように
ｐＭＯＮ５８ＤＮＡが上述のように調製される。

【０２００】例５：ｐＭＯＮ４２の創製 プラスミドｐＢＲ３２５−Ｈｉｎｄ ＩＩＩ−２３はプ
ラスミドｐＢＲ３２５の誘導体であり、（Ｂｏｌｉｖａ
ｒ、１９７８）Ｈｉｎｄ ＩＩＩ部位にｐＴＩＴ３７の
Ｈｉｎｄ ＩＩＩ−２３断片を保持するのであるが（図
３参照）、それはＷａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｕｎｉｖｅｒ
ｓｉｔｙ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯのＭ．Ｂｅｖａｎと
Ｍ．−Ｄ．Ｃｈｉｌｔｏｎにより出願人に提供された。
このプラスミドのＤＮＡを調製し、３０ｕｇをＨｉｎｄ
ＩＩＩ（５０単位）とＢａｍＨＩ（５０単位）とを用
いて分解する。１．１ｋｂ Ｈｉｎｄ ＩＩＩ−Ｂａｍ
ＨＩ断片はアガロースゲル電気泳動後ガラスビーズ上の
吸着により純化される（ＶｏｇｅｌｓｔｅｉｎとＧｉｌ
ｌｅｓｐｉｅ、１９７９）。純化された断片（０．５ｕ
ｇ）はｐＢＲ３２７の２．９ｋｂ Ｈｉｎｄ ＩＩＩ−
ＢａｍＨＩ断片に加えられる。ＤＮＡリガーゼ（２０単
位、４時間、２２℃）で処理後、得られたプラスミドは
Ｅ．ｃｏｌｉ６００細胞に挿入される。２００ｕｇ／ｍ
ｌのアムピシリンに対して起こる耐性クローンは固体媒
質上で選択される：２２０クローンが得られる。ミニプ
レプラスミドＤＮＡはこれらのクローンのうちの６クロ
ーンから作られ、Ｈｉｎｄ ＩＩＩとＢａｍＨＩを用い
て分解後１．１ｋｂ断片の存在についてテストされる。
正しい挿入を証明する１プラスミドはｐＭＯＮ４２と命
名される。プラスミドｐＭＯＮ４２ＤＮＡは先の例で記
されたように準備される。

【０２０１】例６：Ｍ１３クローンＭ−２の創製 ｄａｍ−Ｅ．ｃｏｌｉ細胞から調製された７５ｕｇプラ
スミドｐＭＯＮ４２（例５に記述）は、Ｒｓａ Ｉおよ
びＢａｍＨＩ（各５０単位、３時間、３７℃）により分
解され、７２０ｂｐ Ｒｓａ Ｉ−ＢａｍＨＩ断片はＮ
Ａ４５膜を用いて純化される。純化７２０ｂｐ Ｂａｍ
ＨＩ−Ｒｓａ Ｉ断片のうち８ｕｇはＭｂｏ Ｉを用い
て分解（１０分間、７０℃）され、末端はＤＮＡポリメ
ラーゼ１の巨大Ｋｌｅｎｏｗ断片および４種のｄＮＴＰ
を用いて補填により平滑化される。次いで０．１ｕｇの
得られたＤＮＡ混合物は、あらかじめＳｍａ Ｉにより
分解された（１単位、１時間、３７℃）０．０５ｕｇ
Ｍ１３ｍｐ８およびウシアルカリホスファターゼ（０．
２単位）に加えられる。結紮（１０単位Ｔ₄ ＤＮＡリガ
ーゼ１６時間、１２℃）およびＥ．ｃｏｌｉＪＭ１０１
細胞の感化後、数百の組みかえファージが得られる。二
重のＲＦＤＮＡは１２の組みかえファージ保有クローン
から調製される。ＲＦＤＮＡ（０．１ｕｇ）はＥｃｏＲ
Ｉ（１単位、１時間、３７℃）を用いて分割され、³²ｐ
−ｄＡＴＰとＫｌｅｎｏｗポリメラーゼを用いて末端標
識化されＢａｍＨＩ（１単位、１時間、３７℃）を用い
て再分解される。ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩ部位はＳ
ｍａ Ｉ部位を補う。そのため２６０ｂｐ Ｍｂｏ Ｉ
断片を含むクローンは、６％ポリアクリラマイドゲル上
の電気泳動とオートラジオグラフィー後、標識２７０ｂ
ｐ断片を生ずるように同定される。１２クローンのうち
の４つはこの断片を保有していた。挿入物の方向は、Ｈ
ｉｎｆ Ｉ（１単位、１時間、３７℃）を用いたＥｃｏ
ＲＩ切断、末端標識ＲＦＤＮＡ（０．１ｕｇ）の分解に
より決定される。Ｈｉｎｆ Ｉは１度目は断片の３′末
端から９９ｂｐ、２度目はＮＯＳコドン領域に最も近い
末端から４２ｂｐで２６０ｂｐ Ｍｂｏ Ｉ断片を分割
する。各方向の２クローンが得られる。１クローンは図
８に示されるようにＭ−２として消化され、該断片の
３′末端にＥｃｏＲＩ部位を有する２６０ｂｐ断片を含
む。Ｍ−２ＲＦＤＮＡはＭｅｓｓｉｎｇ他１９８１の手
順で準備された。

【０２０２】例７：ｐＭＯＮ７５およびｐＭＯＮ７６の
創製 ５０ｕｇ Ｍ−２ＲＦＤＮＡ（例６に記述）は５０単位
のＥｃｏＲＩおよび５０単位ＢａｍＨＩと共に２時間、
３７℃で分解される。２７０ｂｐ断片（１ｕｇ）はアガ
ロースゲルおよびＮＡ−４５膜を用いて純化される。プ
ラスミドｐＭＯＮ５８（例４に記述）はＥｃｏＲＩおよ
びＢａｍＨＩ（各５０ｕｇ、５０単位、２時間、３７
℃）を用いて分解、１３００ｂｐ断片はＮＡ−４５膜を
用いて純化する。２７０ｂｐ ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ
（０．１ｕｇ）および１３００ｂｐＥｃｏＲＩ−Ｂａｍ
ＨＩ（０．５ｕｇ）断片は混合され、Ｔ₄ ＤＮＡリガー
ゼ（２単位）を用いて１２時間、１４℃で処理される。
７０℃で１０分間加熱し、リガーゼを不活性化したあ
と、混合物はＥｃｏＲＩ（１０単位）で１時間、３７℃
で処理、その後不活性化するために７０℃、１０分間Ｅ
ｃｏＲＩを加熱する。これは図９に示されるように、キ
メラＮＯＳ−ＮＰＴ ＩＩ−ＮＯＳ遺伝子集合を１．６
ｋｂ断片上に完成する。プラスミドｐＭＯＮ３８はｐＢ
Ｒ３２７のＨｉｎｄ ＩＩＩ部位内に挿入されたｐＴｉ
Ｔ３７Ｈｉｎｄ ＩＩＩ−２３断片のクローンである
（Ｓｏｂｅｒｏｎ他、１９８０）。ｐＭＯＮ３８ＤＮＡ
（２０ｕｇ）はＥｃｏＲＩ（２０単位、２時間、３７
℃）およびウシアルカリフォスファターゼ（０．２単
位、１時間、３７℃）と共に分解される。ｐＭＯＮ３８
ＤＮＡ反応はフェノールと共に抽出され、エタノールに
より沈殿され、乾燥され、２０ｕｌの１０ｍＭＴｒｉｓ
−Ｈｃｌ、１ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ８中に再懸濁される。

【０２０３】０．２ｕｇの分割ｐＭＯＮ３８ＤＮＡは上
述のキメラ遺伝子混合物に加えられる。混合物はＴ₄ Ｄ
ＮＡリガーゼ（４単位、１時間、２２℃）で処理され、
Ｒｂ塩化物処理Ｅ．ｃｏｌｉＣ６００ｒｅｃＡ５６細胞
と共に形質転換するために混合される。アムピシリン耐
性（２００ｕｇ／ｍｌ）コロニーの選択をする平面培養
後、６３の有力な候補が得られる。プラスミドＤＮＡの
アルカリミニプレプはこのうちの１２で作られ適正な構
成のための制限エンドヌクレアーゼ消化により選別され
る。１．５ｋｂ ＥｃｏＲＩ断片及び新Ｂｇｌ ＩＩ部
位を含むプラスミドＤＮＡはＢａｍＨＩを用いて分解さ
れ、１．５ｋｂ ＥｃｏＲＩ断片の配向を決める。それ
ぞれの挿入方向の１つが選ばれる。１プラスミドは図９
に示されるようにｐＭＯＮ７５および他方はｐＭＯＮ７
６と命名される。これらのプラスミドからＤＮＡは先の
例において記されたように調製される。

【０２０４】例８：プラスミドｐＭＯＮ１２８およびｐ
ＭＯＮ１２９の創製 １．５ｋｂ ＥｃｏＲＩ断片はＥｃｏＲＩ分解によりｐ
ＭＯＮ７５あるいはｐＭＯＮ７６から切出され、先の例
に記述したようにアガロースゲル電気泳動後純化され
る。プラスミドｐＭＯＮ１２０（先に引用した別出願
“植物細胞の形質転換用プラスミド”）からの５ｕｇＤ
ＮＡはＥｃｏＲＩと共に分解、カーファルカリフォスフ
ァターゼで処理する。フェノール蛋白分離およびエタノ
ール沈殿後、ＥｃｏＲＩ切断ｐＭＯＮ１２０の線形ＤＮ
Ａは０．５ｕｇ１．５ｋｂ ＥｃｏＲＩキメラ遺伝子断
片と共に混合される。混合物は、２単位のＴ₄ ＤＮＡリ
ガーゼにより１時間、２２℃で処理される。Ｅ．ｃｏｌ
ｉ細胞の形質転換（Ｍａｎｉａｔｉｓ他、１９８２）お
よびスペクチノマイシン（５０ｕｇ／ｍｌ）に耐性を示
すコロニーの選択後、数千のコロニーがあらわれる。そ
のうちの６コロニーが選ばれ、育てられプラスミドミニ
プレグが作られる。プラスミドＤＮＡはＥｃｏＲＩを用
いて分解され、１．５ｋｂキメラ遺伝子挿入がチェック
され、ＢａｍＨＩを用いて挿入配向を決定する。Ｂａｍ
ＨＩ分解は、ｐＭＯＮ１２８内のキメラ遺伝子がｐＭＯ
Ｎ１２０の完成ノパリン合成物遺伝子と同じ方向に転写
されることを示す。ｐＭＯＮ１２９内の挿入定位はｐＭ
ＯＮ１２８内のそれ（挿入定位）に対し、反対側にな
る：ｐＭＯＮ１２９の分解における付加１．５ｋｂ Ｂ
ａｍＨＩ断片の出現はプラスミドｐＭＯＮ１２９が図１
０で示されるように、キメラＮＯＳ−ＮＰＴ ＩＩ−Ｎ
ＯＳ遺伝子の直列の重複を保有することを示す。

【０２０５】例９：プラスミドｐＭＯＮ１５６の創製 ＣａＭＶ ＤＮＡを含むプラスミドは、Ｕｎｉｖｅｒｓ
ｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，Ｄａｖｉｓの
Ｒ．Ｊ．Ｓｈｅｐｈｅｒｄ博士からＭｏｎｓａｎｔｏ
Ｃｏｍｐａｎｙへ提供された。出願人の最良の知識と信
念にとってこれらのプラスミド（ｐＯＳＩと命名）はＣ
Ｍ４−１８４（Ｈｏｗａｒｔｈ他、１９８１）と命名さ
れるＣａＭＶ鎖の完全なゲノムのｐＢＲ３２２プラスミ
ドのＳａｌＩ制限部位への挿入により得られる。Ｅ．ｃ
ｏｌｉ細胞はｐＯＳＩを用いて変換され、アムピシリン
（Ａｍｐ^R ）に耐性を示し、テトラサイクリン（Ｔｅｔ
^S ）に感応性がある。

【０２０６】この発明に用いられ得るＣａＭＶ ＤＮＡ
の分離に敵したＣａＭＶの多くの菌株は公に入手可能で
ある；参照、例えば、ＡＴＣＣ Ｃａｔａｌｏｇｕｅ
ｏｆＳｔｒａｉｎｓ １１、Ｐ．３８７（３版、１９８
１）。ｐＯＳＩ ＤＮＡはＨｉｎｄ ＩＩＩと共に分割
される。３つの小断片はＮＡ−４５膜を用いて０．８％
アガロースゲル上の電気泳動後純化される（Ｓｃｈｌｅ
ｉｃｈｅｒとＳｃｈｕｅｌｌ，Ｋｅｅｎ ＮＨ）。最小
断片の大きさは約５００ｂｐで１９Ｓプロモーターを含
む。この断片は６％アクリルアミドゲル上でさらに純化
される。この断片のシークエンスを変えない、多くの処
置の後（図２８に示す）、それはＭｂｏＩを用いて分解
されて４５５Ｂｐ Ｈｉｎｄ ＩＩＩ−Ｍｂｏ Ｉ断片
を生じる。この断片はＢｇｌ ＩＩおよびＥｃｏＲＩを
用いてｐＭＯＮ７５（例７に記述、図９に示す）を分解
することにより得られた１２５０ｂｐ断片と混合され
る。この断片はＮＰＴ ＩＩ構造シークエンスおよびＮ
ＯＳ３′−非翻訳領域を含む。２つの断片は融和性のあ
るＭｂｏ ＩおよびＢｇｌ ＩＩ突出部により共に結紮
され、ＣａＭＶ（１９Ｓ）−ＮＰＴ ＩＩ−ＮＯＳキメ
ラ遺伝子を含む断片を創製する。この断片は、Ｈｉｎｄ
ＩＩＩおよびＥｃｏＲＩを用いて切断された、ｐＭＯ
Ｎ１２０内に挿入される。得られたプラスミドは図２９
に示されるようにｐＭＯＮ１５６と命名される。

【０２０７】プラスミドｐＭＯＮ１５６はＥ．ｃｏｌｉ
細胞内に、次いでＡ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ細胞内に
挿入され、ここでＴ−ＤＮＡ端により囲まれたＣａＭＶ
（１９Ｓ）−ＮＰＴ ＩＩ−ＮＯＳキメラ遺伝子をもつ
相互融和Ｔｉプラスミドを形成する。相互融和プラスミ
ドを含むＡ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ細胞は、ペチュニ
ア細胞と共に共培養される。共培養ペチュニア細胞はカ
ナマイシンを含む媒質上で培養される。共培養ペチュニ
ア細胞のあるものは、カナマイシンを５０ｕｇ／ｍｌま
で含む媒質上でコロニーを生じた。これはＣａＭＶ（１
９Ｓ）−ＮＰＴＩＩ−ＮＯＳ遺伝子がペチュニア細胞内
に発現されること示す。この結果は形質転換植物細胞Ｄ
ＮＡのＳｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ ａｎａｌｙｓｉｓ
により確認された。

【０２０８】例１０：ｐＭＯＮ１５５の創製 プラスミドｐＭＯＮ７２はバクテリアトランスポゾンＴ
ｎ５（ＮＰＴ ＩＩ構造シークエンスを含む）由来の
１．８ｋｂ Ｈｉｎｄ ＩＩＩ−ＢａｍＨＩ断片を、Ｈ
ｉｎｄ ＩＩＩおよびＢａｍＨＩを用いて切断されたＰ
ｓｔ Ｉ−ｐＢＲ３２７プラスミド内に挿入することに
より得られる。このプラスミドはＢｇｌＩＩおよびＰｓ
ｔ Ｉを用いて切断され、ＮＰＴ ＩＩ構造シークエン
スが除去される。

【０２０９】ｄａｍ−細胞からのプラスミドｐＭＯＮ１
００１（例１に記述、および図６に示す）はＢｇｌ Ｉ
ＩおよびＰｓｔ Ｉを用いて切断され、ＮＰＴ ＩＩ構
造シークエンスのＩ部を伴う２１８ｂｐ断片を得る。こ
の断片はＭｂｏ^I を用いて切断され、１９４ｂｐ断片を
得る。

【０２１０】三重結紮は（ａ）ｐＭＯＮ７２の巨大Ｐｓ
ｔ Ｉ−ＢＳ ＩＩＩ断片；（ｂ）ｐＭＯＮ１００１よ
りのＰｓｔ Ｉ−Ｍｂｏ^I 断片；（ｃ）すべての３読み
込みわく内の終了コドンをもちＢｇｌ ＩＩおよびＭｂ
ｏ Ｉ末端を有する合成リンカーを用いることにより行
われる。Ｅ．ｃｏｌｉ細胞の形質転換およびアムピシリ
ン耐性コロニーの選択後、Ａｍｐ^R コロニーからのプラ
スミドＤＮＡは分析される。プラスミドを求められる構
成と共に含むコロニーが確認される。このプラスミドは
図３０に示されるようにｐＭＯＮ１１０と命名される。

【０２１１】ＮＰＴ ＩＩ構造シークエンスの３′末端
をｐＭＯＮ１１０内の５′部に加えるためにｐＭＯＮ１
１０はＸｈｏ Ｉで処理される。得られた突出末端は補
填されてＫｌｅｎｏｗポリメラーゼおよび４デオキシヌ
クレオシド三リン酸塩（ｄＮＴＰ′ｓ）、Ａ、Ｔ、Ｃ、
Ｇでの処理により平滑末端をもたらす。Ｋｌｅｎｏｗポ
リメラーゼは加熱により不活性化され、断片はＰｓｔ
Ｉを用いて切断され、３．６ｋｂ断片は純化される。プ
ラスミドｐＭＯＮ７６（例７に記述、図９に示す）はＨ
ｉｎｄ ＩＩＩで切断され補填されて平滑末端をＫｌｅ
ｎｏｗポリメラーゼおよび４ｄＮＴＰ′ｓを用いてもた
らし、Ｐｓｔ Ｉを用いて分解される。１１００ｂｐ断
片は純化され、それはＮＰＴ ＩＩ構造シークエンスの
１部およびノパリンシンテース（ＮＯＳ）３′−非翻訳
領域を含む。この断片は、ｐＭＯＮ１１０由来の３．６
ｋｂ断片と共に結紮される。混合物はＥ．ｃｏｌｉ細胞
を形質転換するために使用され；Ａｍｐ^R 細胞は選択さ
れ、求められる構成をもつプラスミドのあるコロニーが
確認される。

【０２１２】このプラスミドは図３１に示されるように
ｐＭＯＮ１３２と命名される。プラスミドｐＭＯＮ９３
（図２８に示す）はＨｉｎｄ ＩＩＩとを用いて分解さ
れ、４７６ｂｐ断片が分離される。この断片はＭｂｏ
Ｉを用いて分解され、４５５ｂｐ断片が純化される。そ
してそれはＣａＭＶ（１９Ｓ）プロモーター領域および
５′−非翻訳領域を含む。プラスミドｐＭＯＮ１３２は
ＥｃｏＲＩおよびＢｇｌＩＩを用いて分解され、（１）
３つ全部の読み込みわくにおいて終了コドンを有する合
成リンカー；（２）ＮＰＴ ＩＩ構造シークエンス；お
よび（３）ＮＯＳ３′−非翻訳領域を有する１２５０ｂ
ｐ断片を得る。これら２断片は一致したＭｂｏ Ｉおよ
びＢｇｌ ＩＩ終了を通して共に結合され、ＣａＭＶ
（１９Ｓ）−ＮＰＴ ＩＩ−ＮＯＳキメラ遺伝子が創製
される。

【０２１３】この遺伝子はｐＭＯＮ１２０に挿入され
る。ｐＭＯＮ１２０はＨｉｎｄ ＩＩＩおよびＥｃｏＲ
Ｉを用いて分解され、プラスミドｐＭＯＮ１５５を図３
２に示すように生起する。

【０２１４】プラスミドｐＭＯＮ１５５はＴｉプラスミ
ド、ｐＴｉＢ６５３を含むＡ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ
ＧＶ３１１１細胞内に挿入される。ｐＭＯＮ１５５プラ
スミドは単一交差を用いてＴｉプラスミドと共に相互融
和プラスミドを形成する。この相互融和プラスミドを含
む細胞はＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ
Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに寄託され、ＡＴＣＣ受諾番号
３９３３６に指定されている。この発明のキメラ遺伝子
を含む断片は相互融和プラスミドをＨｉｎｄＩＩＩおよ
びＥｃｏＲＩにより分解し、また１．７ｋｂ断片を純化
することにより、得ることができる。これらの細胞はペ
チュニア細胞を変換するために用いられ、そのペチュニ
ア細胞は少なくとも１００ｕｇ／ｍｌカナマイシンを含
む媒質上で育つようにされている。

【０２１５】例１１：ｐＭＯＮ１８３・１８４の創製 プラスミドｐＯＳＩ（例９に記述）はＢｇｌ ＩＩを用
いて分解され、１２００ｂｐ断片が純化される。この断
片は３２Ｓプロモーター領域および５′−非翻訳領域の
１部を含む。それはＢａｍＨＩおよびＢｇｌ ＩＩを用
いて分解されたプラスミドｐＳＨＬ７２内に挿入される
（ｐＳＨＬ７２はＰＡＧＯ６０と機能上等しい。Ｃｏｌ
ｂｅｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎ他、１９８１に記述）。得ら
れたプラスミドは図３３に示されるようにｐＭＯＮ５０
と命名される。

【０２１６】クローンＢｇｌ ＩＩ断片はポリアデニル
化部位として３２Ｓ ＲＮＡ転写のために作用するＤＮ
Ａ領域を含む。このポリアデニル化領域は次のように除
去される：ｐＭＯＮ５０はＡＶＡ ＩＩを用いて分解さ
れ、１１００ｂｐ断片が純化される。この断片はＥｃｏ
ＲＩ^* およびＥｃｏＲＶを用いて分解される。得られた
１９０ｂｐ ＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＶ断片は純化され、
プラスミドＰＢＲ３２７に挿入され、それはＥｃｏＲＩ
およびＥｃｏＲＶを用いて分解される。得られたプラス
ミド、ｐＭＯＮ８１は１９０ｂｐ ＥｃｏＲＶ−Ｅｃｏ
ＲＩ断片上のＣａＭＶ３２Ｓプロモーターを含み、図３
３に示される通りである。

【０２１７】ＣａＭＶ（３２Ｓ）の全プロモーター領域
がｐＭＯＮ８１内に存在することを確認するために、断
片の５′（ＥｃｏＲＶ）末端に隣接する領域が次の方法
でｐＭＯＮ８１に挿入される。ｄａｍ−細胞により調製
されるプラスミドｐＭＯＮ５０はＥｃｏＲＩおよびＢｇ
ｌ ＩＩを用いて分解され、得られた１５５０ｂｐ断片
は純化され、Ｍｂｏ Ｉを用いて分解される。得られた
７２５ｂｐ ＭｂｏＩ断片は純化され、プラスミドｐＫ
Ｃ７（ＲａｏとＲｏｇｅｒｓ、１９７９）の個有のＢｇ
ｌ ＩＩ部位に挿入して、プラスミドｐＭＯＮ１２５を
得る。図３４に示される通りである。２つのＭｂｏ Ｉ
末端に隣接する塩基のシークエンスはＢｇｌ ＩＩ部位
を再生し、７２５ｂｐ断片がＢｇｌ ＩＩにより切断さ
れることを可能とする。

【０２１８】３２Ｓプロモーターを保有する断片を生成
させるために、７２５ｂｐ ＢｇｌＩＩ断片はｐＭＯＮ
１２５から純化され、続いてＥｃｏＲＶおよびＡｌｕ
Ｉを用いて分解され、１９０ｂｐ断片を生ずる。プラス
ミドｐＭＯＮ８１はＢａｍＨＩを用いて分解され、Ｋｌ
ｅｎｏｗポリメラーゼで処理し、ＥｃｏＲＶを用いて分
解される。３．１ｋｂ ＥｃｏＲＶ−ＢａｍＨＩ（ｂｌ
ｕｎｔ）断片は純化され、１９０ｂｐ ＥｃｏＲＶ−Ａ
ｌｕ Ｉ断片と共に混合、ＤＮＡリガーゼで処理する。
形質転換およびアムピシリン耐性細胞の選択に続いて、
ＣａＭＶ（３２Ｓ）プロモーターシークエンスを３８０
ｂｐ ＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ断片上に保有するプラス
ミドｐＭＯＮ１７２が得られる。図３５に示される通り
である。この断片は３２Ｓ ＲＮＡのためのポリアデニ
ル化領域を有していない。Ａｌｕ ^I 末端の補填ＢａｍＨ
Ｉ部位への結紮はＢａｍＨＩ部位を再生する。ＣａＭＶ
（３２Ｓ）プロモーターに隣接した制限エンドヌクレア
ーゼ部位を再配列するために３８０ｂｐ ＢａｍＨＩ−
ＥｃｏＲＩ断片をｐＭＯＮ１７２から純化、Ｋｌｅｎｏ
ｗポリメラーゼで処理し、ファージＭ１３ｍｐ８の独特
ＳｍａＩ部位に挿入される。１つの組みかえファージＭ
１２は３８０ｂｐ断片を図３６に示される配向をもつて
保有する。このファージからの複製形成ＤＮＡは３２Ｓ
プロモーター断片をＥｃｏＲＩ（５′）−ＢａｍＨＩ
（３′）断片上に保有する。

【０２１９】キメラ遺伝子（ＣａＭＶ（３２Ｓ）プロモ
ーター領域ＮＰＴ ＩＩ構造シークエンス−ＮＯＳ３′
−非翻訳領域）を保有するプラスミドは次のように組立
てられる。３８０ｂｐ ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ Ｃａ
ＭＶ（３２Ｓ）プロモーター断片はファージＭ１２ＲＦ
ＤＮＡから純化され、ｐＭＯＮ７５由来の１２５０ｂ
ｐ Ｂｇｌ ＩＩ−ＥｃｏＲＩ ＮＰＴ ＩＩ−ＮＯＳ
断片と共に混合される。これら２つの断片の一致したＢ
ａｍＨＩおよびＢｇｌ ＩＩ末端を介しての結合は１．
６ｋｂ ＣａＭＶ（３２Ｓ）−ＮＰＴ ＩＩ−ＮＯＳキ
メラ遺伝子を生じる。この遺伝子は両方向の配向をもっ
てＥｃｏＲＩ部位でｐＭＯＮ１２０に挿入される。得ら
れたプラスミド、ｐＭＯＮ１８３およびｐＭＯＮ１８４
に図３７にあらわされる。これらのプラスミドはペチュ
ニア細胞を形質転換するために用いられる。形質転換さ
れた細胞は１００ｕｇ／ｍｌカナマイシンを含む媒質上
での成長を可能にする。

【０２２０】参考文献 Ｓ．Ａｄａｍｓ他、Ａｂｓｔｒａｃｔ ＃１４９，１８
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【図面の簡単な説明】

【図１】図１は典型的な真核細胞の遺伝子の構造を表す
模式図である。

【図２】図２は本発明の工程を表すフローチャートであ
る。キメラＮＯＳ−ＮＰＴ ＩＩ−ＮＯＳ遺伝子を例に
して描かれている。

【図３】図３はＴｉプラスミドをＨｉｎｄ ＩＩＩによ
り消化して得られたＨｉｎｄＩＩＩ−２３の断片を表す
模式図である。

【図４】図４はＮＯＳプロモーター領域、ＮＯＳ５′−
非翻訳領域、ＮＯＳ構造シークエンスの最初の数個のコ
ドンを持つＤＮＡの一部を表した部分構造式である。

【図５】図５はＮＯＳプロモーター領域、および完全な
５′−非翻訳領域を含むＤＮＡ断片を得るための、ＤＮ
Ａ配列の正確な位置での切断を表す模式図である。

【図６】図６はＮＰＴ ＩＩ構造遺伝子部位を保持して
いるプラスミド、ｐＭＯＮ１００１とｐＭＯＮ４０との
生成を表す模式図である。

【図７】図７はｐＭＯＮ５８を得るためＮＯＳプロモー
ター領域をプラスミドｐＭＯＮ４０に組み入れる模式図
である。

【図８】図８はＭ−２と命名されているＭ１３誘導体の
構築を示す模式図である。このＭ−２は、ＮＯＳ３′−
非翻訳領域とポリ−Ａシグナルを保持している。

【図９】図９はＮＯＳ−ＮＰＴ ＩＩ−ＮＯＳキメラ遺
伝子を組み立て、プラスミドｐＭＯＮ３８に組み入れ、
プラスミドｐＭＯＮ７５とｐＭＯＮ７６を構築する模式
図である。

【図１０】図１０はＮＯＳ−ＮＰＴ ＩＩ−ＮＯＳキメ
ラ遺伝子をプラスミドｐＭＯＮ１２０に組み入れ、プラ
スミドｐＭＯＮ１２８とｐＭＯＮ１２９を構築する模式
図である。

【図１１】図１１はＮＰＴ Ｉ遺伝子を保持しているプ
ラスミドｐＭＯＮ６６を構築を示す模式図である。

【図１２】図１２はキメラＮＯＳ−ＮＰＴ ＩＩシーク
エンスを保持しているプラスミドｐＭＯＮ７３の構築を
示す模式図である。

【図１３】図１３はキメラＮＯＳ−ＮＰＴ Ｉシークエ
ンスを保持しているプラスミドｐＭＯＮ７８の構築を示
す模式図である。

【図１４】図１４はキメラＮＯＳ−ＮＰＴ Ｉ−ＮＯＳ
遺伝子を保持するプラスミドｐＭＯＮ１０６とｐＭＯＮ
１０７の構築を示す模式図である。

【図１５】図１５はキメラＮＯＳ−ＮＰＴ Ｉ−ＮＯＳ
遺伝子をｐＭＯＮ１２０に組み入れ、プラスミドｐＭＯ
Ｎ１３０とｐＭＯＮ１３１の構築を示す模式図である。

【図１６】図１６は大豆たんぱく（ｓｂｓｓ）プロモー
ターを保持しているＤＮＡ断片の構築を示す模式図であ
る。

【図１７】図１７はｓｂｓｓプロモーターを保持してい
るプラスミドｐＭＯＮ１２１の構築を示す模式図であ
る。

【図１８】図１８はキメラｓｂｓｓ−ＮＰＴ ＩＩ−Ｎ
ＯＳ遺伝子をｐＭＯＮ１２０に組み入れプラスミドｐＭ
ＯＮ１４１とｐＭＯＮ１４２の構築を示す模式図であ
る。

【図１９】図１９はウシ成長ホルモンの構造遺伝子領域
と、ＮＯＳ３′領域を保持している、プラスミドｐＭＯ
Ｎ１０８の構築を示す模式図である。

【図２０】図２０は選択的な切断面にかこまれているＢ
ＧＨ−ＮＯＳを保持しているプラスミドＮ２５−ＢＧＨ
の構築を示す模式図である。

【図２１】図２１はキメラｓｂｓｓ−ＢＧＨ−ＮＯＳ遺
伝子をｐＭＯＮ１２０に組み入れプラスミドｐＭＯＮ１
４７とｐＭＯＮ１４８の構築を示す模式図である。

【図２２】図２２はキメラＮＯＳ−ＢＧＨ−ＮＯＳ遺伝
子を保持するプラスミドｐＭＯＮ１４９の構築を示す模
式図である。

【図２３】図２３はＥＰＳＰシンサーゼを生産する構造
遺伝子領域を保持しているプラスミドｐＭＯＮ８の構築
を示す模式図である。

【図２４】図２４は開始コドンの近くに切断面のあるＥ
ＰＳＰシンサーゼ構造遺伝子領域を保持するプラスミド
ｐＭＯＮ２５の構築を示す模式図である。

【図２５】図２５はＥＰＳＰシンサーゼとＮＯＳ３′領
域を持ったキメラシークエンスを保持するプラスミドｐ
ＭＯＮ１４６の構築を示す模式図である。

【図２６】図２６はキメラＮＯＳ−ＥＰＳＰ−ＮＯＳ遺
伝子をｐＭＯＮ１２０に組み入れｐＭＯＮ１５３の構築
を示す模式図である。

【図２７】図２７はキメラｓｂｓｓ−ＥＰＳＰ−ＮＯＳ
遺伝子を保持するプラスミドｐＭＯＮ１５４の構築を示
す模式図である。

【図２８】図２８はＣａＭＶ１９Ｓプロモーターを保持
するプラスミドｐＭＯＮ９３の構造とその構築を示す模
式図である。

【図２９】図２９はキメラＣａＭＶ（１９Ｓ）−ＮＰＴ
−ＮＯＳ遺伝子を保持するプラスミドｐＭＯＮ１５６の
構造とその構築を示す模式図である。

【図３０】図３０はＮＰＴ遺伝子を部分的に保持するプ
ラスミドｐＭＯＮ１１０の構造とその構築を示す模式図
である。

【図３１】図３１はＮＰＴ−ＮＯＳ遺伝子を部分的に保
持するプラスミドｐＭＯＮ１３２の構造とその構築を示
す模式図である。

【図３２】図３２はキメラＣａＭＶ（１９Ｓ）−ＮＰＴ
−ＮＯＳ遺伝子を保持するプラスミドｐＭＯＮ１５５の
構造とその構築を示す模式図である。

【図３３】図３３はＣａＭＶ３２Ｓプロモーターを保持
するプラスミドｐＤＭＯＮ８１の構造とその構築を示す
模式図である。

【図３４】図３４はＣａＭＶ３２Ｓプロモーターを保持
するプラスミドｐＭＯＮ１２５の構造とその構築を示す
模式図である。

【図３５】図３５はＣａＭＶ３２Ｓプロモーターを保持
するプラスミドｐＭＯＮ１７２の構造とその構築を示す
模式図である。

【図３６】図３６はＣａＭＶ３２Ｓプロモーターを保持
するファージＭ１２の構造とその構築を示す模式図であ
る。

【図３７】図３７はキメラＣａＭＶ（３２Ｓ）−ＮＰＴ
−ＮＯＳ遺伝子を保持するプラスミドｐＭＯＮ１８３と
ｐＭＯＮ１８４の構造とその構築を示す模式図である。

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 （ａ）植物ウイルス由来のプロモーター
   領域； （ｂ）５′非翻訳領域； （ｃ）構造コード配列； （ｄ）ｍＲＮＡのポリアデニル化シグナル配列をコード
   し、植物内で天然に発現される遺伝子の３′非翻訳領
   域；を順番に含み、前記構造コード配列が前記プロモー
   ター領域に対して異種である、植物細胞内でポリペプチ
   ドを発現することができるキメラ遺伝子。
2. 【請求項２】 プロモーターが、カリフラワーモザイク
   ウイルス由来である請求項１に記載の遺伝子。
3. 【請求項３】 ３′非翻訳領域が、ノパリンシンサーゼ
   遺伝子由来である請求項２に記載の遺伝子。
4. 【請求項４】 プロモーターが、カリフラワーモザイク
   ウイルスの完全長転写プロモーターである請求項１に記
   載の遺伝子。
5. 【請求項５】 ３′非翻訳領域が、ノパリンシンサーゼ
   遺伝子由来である請求項４に記載の遺伝子。