DD285922A5 - Von bakterienzellbestandteilen praktisch freie zusammensetzung fuer den pflanzenschutz und verfahren zur gewinnung des wirkstoffes fuer diese - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft eine von Bakterienzellbestandteilen praktisch freie Zusammensetzung fuer den Pflanzenschutz. Erfindungsgemaesz enthaelt die Zusammensetzung eine Nitrilase aus Bakterien mit etwa 34 KDal, die im wesentlichen fuer 3,5-dihalogeniertes p-Hydroxybenzonitril spezifisch ist und eine spezifische Aktivitaet von mindestens etwa 0,1 mmol NH3/min/mg Protein mit Bromoxynitril als Substrat aufweist und zunaechst einen Traeger und/oder ein Verduennungsmittel. Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Gewinnung einer fuer 3,5-dihalogeniertes p-Hydroxybenzonitril spezifischen Nitrilase, bei dem K. ozaenae, das eine fuer 3,5-dihalogeniertes p-Hydroxybenzonitril spezifische Nitrilase produziert, isoliert, in einem entsprechenden Medium gezuechtet und lysiert wird, woraufhin man die Nitrilase isoliert.{Zusammensetzung; Pflanzenschutz; Nitrilase; Bakterien; 3,5-dihalogeniertes p-Hydroxybenzonitril; Traeger; Gewinnung; K. ozaenae; Medium, lysiert, isoliert}

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft eine von Bakterienzellbestandteilen praktisch freie Zusammensetzung für den Pflanzenschutz urd ein Verfahren zur Gewinnung des Wirkstoffes dieser Zusammensetzung.

Chorekterlstlk des bekannten Standes der Technik

Die Bromoxynil· und/oder-loxynil-spezifischen Nitrilase können zur Entgiftung von mit Bromoxynil und verwandten Herbiziden verunreinigten Stellen und zum Schutz von Wirtzellen vor der zytotoxischen Wirkung dieser Herbizide verwendet werden. Die Konstruktionen können zur Unterscheidung von diese Strukturen enthaltenden Wirtzellen und Wirtzellen, die diese Konstruktion nicht enthalten, verwendet werden.

Die Möglichkeit, Mikroorganismen und Zellen höherer Organismen neue genetische Fähigkeiten zu verleihen, hat eine Vielzahl von neuen Anwendungsgebieten eröffnet. Eines dieser Gebiete betrifft verschiedene Mittel, die wegen ihrer zytotoxischen Wirkung verwendet werden, wie beispielsweise viele Verbindungen, die in der Landwirtschaft zur Schädlingsbekämpfung und/oder Unkrautvernichtung eingesetzt werden. In vielen Fällen haben diese Verbindungen eine relativ lange Verweilzeit oder hinterlassen einen beträchtlichen Rückstand.

In vielen Fällen ist es erwünscht, zwischen zu erhaltenden Arten und solchen, die vertilgt werden müssen, zu unterscheiden. So ist es oft erwünscht. Unkreut selektiv zu vernichten, wobei die Ernte möglichst wenig beeinträchtigt werden sollte. In den meisten Fällen haben viele der Breitband-Herbizide einen sehr .iachteiligen Einfluß auf die Ernte, so daß ihre Verwendung auf ein»; Voremergenz- oder vorsichtige Postemergenz-Anwendung begrenzt ist.

Bs bestand daher gioßes Interesse, lebende Zellen so verändern zu können, daß sie gegenüber Beanspruchungen, wie durch zytotoxische Mittel, widerstandsfähig sind.

In der US-PS 4 535060 wird die Verwendung eines bakteriellen aroA-Gens beschrieben, das glyphosatempfindlichen Zellen Glyphosat-Resistenz verleiht. Hsu und Camper, »Can. J.Microbiol.", 22, S. 537-543 (1976) beschreiben die Isolierung von loxynil-,Abbauern" aus mit Erde angereicherten Kulturen. Hsu und Clemson, „Dissert. Abstr.lntrn.", B36, Nr. 8, S.3708 (1976) beschreiben den mikrowellen Abbau einer Familie von 3,5-Dihalogen-4-hydroxybenzoni'ril-Herbiziden. Ingram und Pullin, „Pestic. Sei.", 5, S. 287-291 (1974) beschreiben den längeren Verbleib von Bromoxynil in drei Bodenarten. Smith, „Abstr. Meeting Weed Soc. Am." (1971), S. 16-17 beschreibt den Abbau von Bromoxynil in schwerem Ton (Regina heavy clay). Smith und Flether, «Hort. Res.", 4, S.60-62 (1964) berichten von 3,5-Dihalogen-4-hydroxyben7onitrilen und Bodenorganismoi).

Ziel der Erfindung

Ziel de- Erfindung ist es, eine neue, von Bakterienzellbestandteilen praktisch freie Zusammensetzung, die Nitrilasen als Wirkstoff enthält, und ein Verfahren zur Herstellung des Wirkstoffes bereitzustellen.

-2- 285 922 Darlegung des Wesens der Erfindung

Erfindungsgemäß enthält die Zusanv nensetzung neben zunächst einem Träger oder einem Verdünnungsmittel eine Nitralase

aus Bakterien mit etwa 34 KDaI, die ί η wesentlichen für 3,5-dihalogeniertes p-Hydroxybenzonitril spezifisch ist und einespezifische Aktivität von mindeste.,« etwa 0,1 pmol NH₃/min/mg Protein mit Bromoxynil als Substrat aufweist.

Im Rahmen der E rf ir ing wurden neue DNA-Sequenzen, Konstruktionen, transformierte Zellen, Pflanzen und Peptide, die

halogeniert Hydrok_roenzonitrile und insbesondere 3,5-Dibrom- oder 3,5-Dijod-4-hydroxybenzonitril hydrolysierenbeschrieben. Beschrieben wird ferner ein Enzym, das das Nilril hydrolysieren kann, so daß die herbizide Wirkung dos Nitritsverhindert wird und eine Zelle oder ein Wirt, die gegenüber dem Herbizid empfindlich sind, geschützt werden oder e <ne mit dem

Herbizid verunreinigte Stelle entgiftet wird. Das SVrukturgen kann aus einem einzelligen Mikroorganismus gewonnen werden und insbesondere aus einem Bakterium, daß

das Benzonitril als Stickstoffquelle und im allgemeinen als ausschließliche Stickstoffquelle verwenden kann.

Im folgenden wird als „Benzonitril" ein halogeniertes p-Hydroxybenzonitril und insbesondere 3,5-Dijod- oder 3,5-Dibrom-4-

hydroxybenzonitril und als „Nitrilase" eine Nitrilase verstanden, die dieses halogenierte Benzonitrii als Stickstoffquelle undinsbesondere als ausschließliche Stickstoffquelle verwenden kann. Das Enzym kann auf verschiedene Weisen erhalten werden,zweckmäßigerweise aus Bakterien, die an einer Bromoxynil oder loxynil enthaltenden Stelle natürlich vorkommen. Von Interessesind Enterobakterien und insbesondere die Art Klebsieila. Klebsieila pneumoniae und insbesondere die Art ozaenae kanneingesetzt werden. Besser als sie aus dem Boden zu isolieren, werden die Organismen im Boden oder andere Medien mit höherwerdenden Konzentrationen an Benzonitril und verminderten Mengen an anderen Stickstoffquellen gezüchtet, bis überlebende

Organismen erhalten werden, die Benzonitril als einzige Stickstoffquelle verwenden. Unabhängig von den die Nitrilase enthaltenden Bakterien muß selektioniert werden, um zu gewährleisten, daß die Nitrilase bei

der Benzonitril-Entgiftung wirksam ist. Zusätzlich sollte die Nitrilase für dieses Benzonitril eher als für analoge Verbindungen,denen die Halogen- oder andere Substituenten fehlen, spezifisch sein. Die erfindungsgemäße Nitrilase ist daher für Bonzonitrile,wie angegeben, spezifisch und relativ inaktiv oder wesentlich weniger aktiv für analoge Verbindungen.

Zweckmäßigerweise sollte bei Kultivierung mit Benzonitril als Stick&toffquelle bei vergleichbaren Konzentrationen die Proliferationsgeschwindigkeit nicht deutlich niedriger sein, d.h. nicht mehr als 10% vermindert, als die Proliferationsgeschwindigkeit dec Bakteriums in Gegenwart einer normalen Stickstoffquelle, wie beispielsweise Ammoniak. Dieses Ergebnis wird mit nichtspezifischen Benzonitrilen nicht beobachtet. Sind der Wirtstamm oder die Wirtstämme einmal identifiziert, so können verschiedene Verfahren zur Identifizierung der Codiersequenz der Nitrilase eingesetzt werden. Das Gen kann auf einem Chromosom oder einem Planmid vorhanden sein. Das Genom wird fragmentiert, insbesondere mit einer Restriktionsendonuklerise, wobei eine oder mehrere Endonukleasen

eingesetzt werden können, um Fragmente von etwa 5 bis 50KB herzustellen. Diese Fragmente können auf entsprechenden

Vektoren in einem geeigneten Bakterium, wi j E. coli, Moniert werden, die entstandenen Transformanden werden auf Nitrilaseaktivität selektioniert, wobei der Wirtorganismus einen negativen Hintergrund abgibt. Steht fest, daß ein oder mehrere Klone Nitrilaseaktivität aufweisen, so können die das gewünschte DNA-Fragment enthaltende

extrachromosomalen Elemente, Plasmide oder Viren in herkömmlicher Weise isoliert werden, z. B. durch Lyse des Wirts,

Auvtällen der DNA und Abtrennen der Vektor-DNA, Plasmid- oder Virus-DNA von der chromosomalen DNA. Die

extrachromosomalen Elemente können durch Restriktionsendonukleasen gespalten werden, die gewünschten Fragmentekönnen durch verschiedene Verfahren zur Trennung und Identifizierung der Fragmente verschiedener Größe, wie

Elektrophorese oder Dichtegradienten-Zentrifugieren, isoliert werden. Das Fragment wird je nach Größe weiter manipuliert, um es an die Größe des Gens und seiner flankierenden Regulatorregionen

anzupassen. Es gibt verschiedene Verfahren zur Manipulation des Fragments, das die für das Enzym codierende Sequenz undihre flankierenden Regulatorsequenzen enthält, beispielswiese Teilspaltung mit verschiedenen Restriktionsenzymen inverschiedenen Reaktionsgemischen und anschließendes Klonen der Fragmente zur Bestimmung, in welchen Fragmenten die

Fähigkeit zur Expression der Nitrilase zurückbleibt. Das Enzym kann aber auch isoliert und teilsequenziert werden. Auf der Basis der Aminosäuresequenz können Sonden hergestellt

werden, die zur Identifizierung der das Gen enthaltenden Fragmente verwendet werden können. Durch Kombinieren dieser

Annährerung mit der Spaltung mit Restriktionsenzynen können Fragmente geklont und auf die Anwesenheit des gewünschten Gens selektioniert werden. Außerdem können Exonunleasen, wie Bal31, verwendet werden, um die Nukleotide an einem oder

beiden Enden des Fragments zu entfernen und die Anzahl der überflüssigen Nukleotide weiter zu verringern.

Alternativ kann das Gen in einem geeigneten Wirt geklont und die Boten-RNA (mRNA) durch Selektionieren mit einer Sonde, Identifizieren in einem entsprechenden In-vitro- oder In-vivo-Translationssystem, beispielsweise Xenopus oocytes oder Reticulolysat, isoliert werden. Die isolierte mRNA kann dann zur Herstellung von cDNA unter Einsatz herkömmlicher Verfahren,

wie reverse Transkriptase und Bildung der Komplementärkette mit DNA-Polymerase, verwendet werden. In diesen Fall fehlendem entstandenen Strukturgen die an die Transkription gebundenen Regulatorregionen.

Das Nitrilasegen kann auf verschiedene Weise modifiziert werden, entweder durch Verkürzen oder Verlängern eines oder beide

der 5'- und/oder 3'-Enden. Im allgemeinen sind nicht mehr als 25, insbesondere nicht über etwa 20 Codons an der natürlichvorkommenden Nitrilase beteiligt. Die Nitrilase kann um bis zu 50 Aminosäuren, im allgemeinen nicht über etwa30 Aminosäuren, verlängert werden. Kombinationen von Substitution, Abspaltung und Extension können eingesetzt werden.

Das heißt, das Gen kann auf verschiedene Weisen manipuliert werden, um beispielsweise die Eigenschaften des Enzyms zu

ändern oder es für Manipulationen der Plasmide geeigneter zu machen.

Die DNA-Sequenz, die das die Nitrilase exprimierende Strukturgen enthält, kann an viele andere DNA-Sequenzen zur Einführung

in eine entsprechende Wirtzelle gebunden werden. Die Begleitsequenz hängt von der Art des Wirts, der Einführungsweise der

DNA-Sequenz in den Wirt und davon ab, ob episomale Aufrechterhalten oder Integration erwünscht isv. Für prokaryoniische Wirte gibt es viele Vektoren, die zur Einführung durch Transformation, Konjugation, Iransduktion oder Transfektion der DNA-Seqienz in einen prokaryontischen Wirt verwendet werden können. DNA-Sequenzen umfassen eine Vielzahl von Plasmiden, wie pBR322, pACYC 184, pMB9 oder pRK290, Cosmide, wie pVK 100 oder Viren, wie P22.

-3- 285 S22

FQr eukaryontische Zellen können verschiedene Verfahren zur Einführung der DNA in den Wirt eingesetzt werden, wie Transformation mit Ca"-ausgefällter DNA, wobei eine nichtreplikative DNA-Sequenz, ein Plasmid oder ein Minichromosom beteiligt sind, Transformation mit einer T-DNA enthaltenden Sequenz in Agrobakterium, Mikroinjektion mit einer Mikropipette oder Elektroporation. Es hängt davon ab, ob ein kompetentes Replikationssystem in der DNA-Konstruktion vorhanden ist, ob die DNA als epiäomales Element repliziert oder in das Wirtgenom integriert und das Strukturgei im Wirt exprimiert wird. Es können episomale Elemente, wie tumorinduzierende Plasmide, beispielsweise Ti oder Ri, oder ihre Fragmente, oder Viren, wie CaMV oder TMV, oder ihre Fragmente verwendet werden, die für den Wirt nicht tödlich sind und in denen das Strukturgen in solchen episomalen Elementen vorhanden ist, daß os die Expression des Strukturgens ermöglicht. Von besonderem Interesse sind Fragmente mit Replikationsfunktion, denen andere Funktionen, wie Ontogenese oder Virulenz fehlen. Die aus der Nitrilase erhaltenen Fragmente können unter Verwendung eines geeigneten Klonicrungsvektors geklont werden. Das Klonen kann in einem geeigneten einzelligen Mikroorganismus, beispielsweise einem Bakterium, wie E.coli, durchgeführt werden. Zweckmäßigerweise wird ein Cosmid verwendet, wobei durch Teil- oder Vollspaltung Fragmente mit der gewünschten Größe entstehen. Beispielsweise kann das Cosmid pVKIOO mit einem geeigneten Restriktionsenzym teilgespalten und an Fragmente gebunden werden, die entweder durch Teil- oder Vollspaltung eines Plasmids, Chromosoms oder deren Fragment entstanden sind. Durch Verpackung wird gewährleistet, daß nur Fragmente der gewünschten Größe verpackt und in den Wirtorganismus transduziert werden.

Der Wirtorganismus wird anhand der Benzonitril-Resistenz ausgewählt. Die aufnehmenden Stämme können so verändert werden, daß sie geeignete genetische Merkmale aufweisen, die die Selektion von Transduktanten ermöglichen. Bei Mikroorganismen können die Transduktanten zur Konjugation mit anderen Mikroorganisnr in unter Verwendung, bei Bedarf, eine« mobilisierenden Plasmids eingesetzt werden. Zur weiteren Verminderung der Größe des das Strukturgen für die Nitrilase enthaltenden Frpgments können verschiedene Verfahren eingesetzt werden. So kann beispielsweise der Cosmidvektor isoliert, mit einer Vielzahl von Restriktionsendonukleaeen, wie EcoRI, BgI Il oder Sma I, gespalten werden und die entstandenen Fragmente in einen entsprechenden Vektor, zweckmäßigerweise in den vorher verwendeten Cosmidvektor, geklont werden. Anstelle eines Cosmidvektors stehen viele Klonierungsvektorr η geringer Größe, wie pACYC 177 und pACYC 184, zur Verfügung. Das heißt, Fragmente von vorzugsweise unter etwa 5 KB, im allgemeinen unter etwa 4 KB und insbesondere unter etwa 2 KB, können geklont werden und gewähren Benzonitrilresistenz.

Zweckmäßigerweise enthält das Fragment etwa 1KB ut.d unter etwa 5KB, vorzugsweise unter etwa 4KB, insbesondere mindestens etwa 1047 Basenpaare (BP), insbesondere einschließlich der flankierenden Regionen mindestens etwa 1100 BP, vorzugsweise unter etwa 1,5 KB. Von besonderem Interesse ist ein Bglll-Sma I-Fragment aus Klebsieila ozaenae und insbesondere ein Pstl-Hincll-Fragment mit etwa 1210BP.

Von besonderem Interesse ist eine Verkürzung des Nitrilasegens bis zu etwa 5 Codons am 5'-Ende und bis etwa 10 Codons am 3'-Ende oder das Zuführen bis zu etwa 50, im allgemeinen nicht über etwa 30 und vorzugsweise nicht über 20 Codons am 5'· und/oder 3'-Ende. Das heißt, das entstandene Enzym kann vom natürlich vorkommenden Enzym durch bis zu 50 Aminosäuren, Im allgemeinen nicht über etwa 30 Aminosäuren und vorzugsweise nicht über etwa 25 Aminosäuren verschieden sein, wobei eine Kombination von Substitution, Extension und Abspaltung durchgeführt wird. Die Nitrilase kann in jeder geeigneten Quelle, entweder in prokaryontischen oder eukaryontischen Zellen, wie Bakterien, Hefe, Schlauchpilzen oder Pflanzenzellen, exprimiert werden. Wo keine Sokretion erhalten wird, kann das Enzym durch Lyse der Zellen in bekannter Weise isoliert werden. Geeignet sind beispielsweise die Chromatographie, Elextrophorese oder Affinitätschromatographie. Zweckmäßigerweise wird Bromoxynil über eine entsprechende funktioneile Gruppe, wie die Carboxyl-Gruppe, an einen unlöslhhen Träger gebundon und als Verpackung für die Isolierung der Nitrilase verwendet. Die spezifische Nitrilaseaktivität beiträgt mindestens etwa 0,1 pmol Ammoniak/min/mg Protein, im allgemeinen mindestens etwa 0,5 oder mehr pmol Ammoniak/min/mg Protein unter Bedingungen, wie sie von Harper, „Biochem. J.", 167, S.685-692 (1977) beschrieben werden.

Das gereinigte Enzym kann in vielerlei Weisen veiwendet werden: es kann beispielsweise direkt in Untersuchungen auf Bromoxynil, loxynil oder andere verwandte Benzonitrile verwendet werden. Es kann abtr auch als Nachweis in diagnostischen Versuchen dienen, z. B. dadurch, daß es an eine zu untersuchende Substanz, wie ein Hapten oder Antigen, oder einen Antikörper, gebunden wird. Diese Versuche sind in den US-PS 3654090,3817837 und 3850752 beschrieben, in denen die Konjugation sowie die Bestimmung der Konzentration der zu untersuchenden Substanz eingehend erläutert sind (die entsprechenden Teile dieser Beschreibungen sind hier miteinbezogen).

Die die Nitrilase codierende DNA-Sequenz kann in verschiedenen Weisen verwendet werden, beispielsweise zur Isolierung des Wildtyps oder von Nitrilase-Mutanten.

Sie kann aber auch zur Integration durch Rekombination in einen Wirt eingesetzt werden, wobei dem Wirt Benzonitrilresistenz verliehen wird.

Die Pflanzenzellen kann das Strukturgen als Teil einer Konstruktion ii. einen Pflanzenzellkern durch Mikropipetteninjektion zur Integration durch Rekombination in das Wirtgenom eingeführt werden. Alternativ kann auch die Elektroporation zur Einführung des Strukturgens in eine Pflanzenwirtzelle verwendet werden. Wurde das Strukturgen aus einer Quelle mit Regulatorsignalen erhalten, die von dem Pflanzenwirt nicht erkannt werden, so müssen die entsprechenden Regulatorsignale für die Expression eingeführt werden. Wird ein Virus oder Plasmid, beispielsweise ein tumorinduzierendes Plasmid, verwendet, das kartiert worden ist, so kann eine Schnittstelle gewählt werden, die stromabwärts von einem Promotor liegt und in die das Strukturgan in - die das Strukturgen in einer entsprechenden Entfernung vom Promotor eingefügt werden kann. Weisen die DNA-Sequenzen keine geeignete Schnittstelle auf, so können sie mehrmals mit einer Exonuklease, wie Bal31, gespalten und eine synthetische Endonukleaseschnittstelle (Linker) eingeführt werden.

Von besonderem Interesse is' die Verwendung eines tumorinduzierenden Plasmids, z. B. Ti oder Ri, mit dem das Nitrilasegen in Pflanzenzellchromosomen eingeführt werden kann. Die Verwendung von Ti- und Ri-Plasmiden ist in PCT-A-WO 84/02913,02919 und 02920 sowie EP-A-0116718 sowie bei Matzke und Chilton .J. Mol. App. Gonetics", 1, S.39-49 (1981) beschrieben. Durch Verwendung des rechten Rands oder beider Ränder der T-DNA, d.h. der Ränder, die eine Expressionskassette flankieren, die das Nitrilaso-Strukturgen und die Transkriptions- und Translations-Regulatorsignale für den Start (Initiation) und das Ende (Teminalion) umfassen und die vom Pflanzenwirt erkannt werden, kann die Expressionskassette in das Pflanzengenom integriert werden und dio Expression der Nitrilase in der Pflanzenzelle bei verschiedenen Differenzierungsstufen ermöglicht werden.

Verschiedene Konstruktionen können für die Expression in Pflanzenzellen hergestellt werden. Dabei wird eine Expressionskassette zur Verfügung gestellt, die in Pflanzen zur Expression der Nitrilase im Pflanzenwirt funktionell ist. Für die Transkription können viele Transkriptionsstartregionen (Promotorregionen), entweder konstitutive oder induzierbare,

eingesetzt werden.

Die Transkriptionsstartregion ist an das die Nitrilase codierende Strukturgen gebunden und gewährleistet die Transkriptionsinitiation stromaufwärts vom Initiationscodon, normalerweise innerhalb etwa 200 Basen des Initiationscodons,

dort, wo der nicht übersetzten (nicht translatierttn) 5'-Region ein ATG fehlt.

Das 3'-Ende des Strukturgens hat ein oder mehrere Stopcodons, die an eine Transkriptionsendregion, die in einem Pflanzenwirt

funktionell ist, gebunden sind, wobei die Endregion mit dem gleichen oder verschiedenen Strukturgenen wie die Startregionverbunden ist.

Die Expressionskassette ist dadurch gekennzeichnet, daß sie in Richtung der Transkription der Startregion das Strukturgen unter

der Transkriptionskontrolle der Startregion und der Endregion für die Beendigung der Transkription und die Herstellung derm-RNA, wenn es angebracht ist, enthält.

Als Transkriptions- und Translations-Regulatorregionen können zweckmäßigerweise Opin-Promotor- und Terminator-Regionen

verwendet werden, die eine konstitutive Expression des Nitrilasegens gewährleisten. Es können aber auch andere Promotorenund/oder Terminatoren eingesetzt werden, insbesondere Promotoren, die eine induzierbare Expression oder regulierte

Expression in einem Pflanzenwirt ermöglichen. Geeignete Promotorregionen aus Ti-Plasmid sind Opinpromotoren, wie

beispielsweise der Octopin-Synthase-Promotor, Nopalin-Synthase-Promotor, Agropin-Synthase-Promotor oder Mannopin-

Synthase-Promotor. Andere Promotoren sind Virus-Promotoren, wie CaMV-Region Vl-Promotor oder der Promotor mit der Gesamtlänge (35S), Promotoren, die mit Ribulose-I.S-bisphosphat-carboxylat-Genen verbunden sind, beispielsweise die kleine Untereinheit, oder Gene, die mit Phaseolin, Proteinspeicherung, B-Conglycinin oder Zellulosebildung verbunden sind. Die verschiedenen Sequenzen können in herkömmlicher Weise aneinander gebunden werden. Die Promotorregion kann durch

die Region am 5'-Ende des Strukturgens, z. B. das Opingen, und durch Restriktionskartierung und Sequenzierung identifiziertwerden; sie kann selektioniert und isoliert werden. Entsprechend kann die Terminatorregion als 3'-Region aus dem Strukturgenisoliert werden. Die Sequenzen können geklont und in der richtigen Orientierung aneinandergebunden werden, sie ermöglichendie konstitutive Expression des Nitrilasegens in einem Pflanzenwirt.

Durch Einführen eines funktionellen, die Nitrilasb exprimierenden Gens in Kulturpflanzen können Bromoxynil, loxynil und

analoge Herbizide bei einer Vielzahl von Ertragspflanzen bei Konzentrationen verwendet werden, die die vollständige oderpraktisch vollständige Unkrautvernichtung gewährleisten, ohne die Ernte wesentlich zu beeinträchtigen. Auf diese Weisekönnen wirtschaftliche Vorteile erreicht werden, da Düngemittel und Wasser wirkungsvoller eingesetzt und die auf der

Anwesenheit von Unkraut beruhenden Nachteile vermieden werden. Die die Nitrilase exprimierende Expressionskassette kann in eine Vielzahl von Pflanzen eingeführt werden, sowohl

einkeimb'ättrige wie auch zweikeimblättrige, einschließlich Mais, Weizen, Sojabohnen, Tabak, Baumwolle, Tomaten, Kartoffeln,

Brassica-Arten, Reis, Erdnüsse, Petunien, Sonnenblumen, Zuckerrüben oder Rasen. Die Gene können in Zellen oder Pflanzenteilen vorhanden sein, wie Callus, Gewebe, Wurzeln, Knollen, Schößlinge, Stecklinge, Samen, Blätter, Keimlinge oder

Pollen.

Um den Pflanzen Benzonitrilresistenz zu verleihen, können verschiedene Formulierungen zum Schutz der Ertragspflan: en vor Unkraut und folglich zur Erhöhung der Ernte iind zur Verminderung des Wettbewerbs um Nährstoffe verwendet ward n. Beispielsweise kann Bromoxynil als solches für die Postemergenzkontrolle des Unkrauts bei ,sicheren" Kulturpflanzen, wie Sonnenblumen, Sojabohnen, Getreide oder baumwolle, oder alternativ in Kombination mit anderen Produkten eingesetzt

werden.

Es können übliche Mengen an Pestiziden auf Feldern verwendet werden in Formulierungen, die etwa 0,05 bis 1,98 kg/0,4 ha (0,1

bis 4 Pfund/a), vorzugsweise 0,09 bis 0,9 kg/0,4 ha (0,2 bis 2 Pfund/a) Bromoxynil abgeben, und das andere Herbizid in solchen

Mengen enthalten, daß sie etwa 0,05 bis 1,98 kg/0,4 ha (0,1 bis 4 Pfund/a) Wirkstoff abgeben. Die Formulierungen können andere Hilfsstoffe, wie Reinigungsmittel, Hilfsmittel, Sprühhilfsmittel, Haftmittel oder Stabilisierungsmittel enthalten. Die Formulierungen können entweder naß oder trocken angewendet werden, beispielsweise als fließfähige Pulver, emulgierbare

oder flüssige Konzentrate, wie sio an sich bekannt sind.

Herbizidlösungen können in herkömmlicher Weise angewendet werden, beispielsweise durch Besprühen, begießen oder Zerstäuben. Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert. Ausführungsbeispiele Experimentelles Material und Methoden Restriktionsenzyme und T4-Ligasen für Verknüpfungen wurden gemäß den Empfehlungen der Herstoller verwendet. Standardmethoden beim Klonen und der Molekularanalyse wurden gemäß Maniatis et al. .Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1982) durchgeführt. Die Klonanalyse wurde gemäß Ish-Horowltz et al.

„Nucl.Acids Res.", 9, S.2989 bis 2998 (1981) durchgeführt.

Für alle Klonierungsversuche wurde der Stamm E.coli MM 294 verwendet (Hanahan, „Mol.Biol.", 166, S.557 bis 580 [1983]). Folgendo Antibiotikamengen wurden eingesetzt: Chloramphenicol (Cm): 25μςΛηΙ; Tetracyclin (Tc): 10Mg/ml; Penicillin (Ap): Die Plasmid-DNA-Transformationen in E.coli wurden gemäß Mandel und Higa, .J.Mol.Biol.*, 53, S. 159 bis 162 (1970)

durchgeführt.

Bakterien aus einem mit Bromoxynil verseuchten Boden wurden isoliert und selektioniert. Einer dieser Organismen wurde als Klebsieila pneumoniao Unterart ozaenae identifiziert. Die Teilreinigung und Charakterisierung der bromoxynilspezifischen Nitrilase aus diesem Organismus ergab ein aktives Enzym

mit einer Scheinmolekularmasse von 34 kDal.

Nach wiederholter Kultivierung von K. ozaenae auf festem L-Agar wurde eine Variante isoliert, die nicht mehr fähig war, Bromoxynil als einzige Stickstoffquelle zu verwenden, wenn sie in einem definierten flüssigen Medium gezüchtet wurde, das je Liter 1,6g KH₂PO₄,3,6g X₂KPO₄,0,1 ρ MgSO₄ · 7H₂0,50mg Hefeextrakt, je 0,1 % Citrat, Glycerin und Succinat und Spurenelemente enthielt (vgl. Barnett und Ingraham,. J. Appl. Bacteriol.", 18, S. 131 bis 143 [1975]). Dieses Medium wird im folgenden als

YETE-Mehrfachkohlenstoffmedium bezeichnet. Dieses YETE-Mehrfachkohlenstoffmedium enthielt 0,05% Bromoxynil. Obwohl dieser Organismus Bromoxynil nicht als einzige Stickstoffquelle verwendet, wächst er in 0,05% Bromoxynil enthaltender L-Brühe zur vollen Dichte. Eine Kolonie der K.ozaenae-Variante wurde ausgewählt und in 10ml L-Brühe gezüchtet. Drei unabhängige K.ozaenae-Kolonien wurden von einer Bromoxynil enthaltenden LB-Platte ausgewählt und unter den gleichen Bedingungen gezüchtet. Diese vier gleichen K.ozaenae-Kolonien wurden gleichzeitig in 10ml 0,05% Bromoxynil enthaltender L-Brühe gezüchtet. Diese Kulturen wurden bei 30⁰C bis zur vollen Dichte gezüchtet, aus jeder Kultur wurde gemäß Ish-Horowitz et al. „Nucl.Acids Res.", 9, S.2989 (1981) Plasmid-DNA im Minimaßstab hergestellt. Nicht verdaute Plasmid-DNA wurde auf 0,5% Agarosegel der Elektrophorese unterworfen, die Plasmid-Slreifon wurden durch Färben mit Ethidiumbromid sichtbar gemacht. Die K.ozaenae-Variante zeigte eine einzige Plasmidart (mit einer Größe von 68KB), die entweder in Anwesenheit oder Abwesenheit von Bromoxynil entstand. Die drei K.ozaenae-Kolonien zeigten eine größere Plasmidart (90KB) wenn sie in Gegenwart von 0,05% Bromoxynil gezüchtet wurden. In Abwesenheit von Bromoxynil sind beide Piasmidformen in zwei der drei K.ozaenae-Kolonien vorhanden.

Diese Ergebnisse deuten auf die Umwandlung der größeren Plasmidart in eine kleinere Form, wobei gleichzeitig eine Plasmid-DNA mit etwa 22 KB verlorengeht, wenn die Bromoxynil-Selektion aufgehoben wird.

Alle vier Kolonien wurden in 200ml 0,05% Bromoxynil enthaltender L-Brühe gezüchtet. Die Zellen wurden mit einer französischen Presse aufgebrochen, die Hochgeschwindigkeits-Überstände wurden gegen einen Puffer, der 0,05mol/l K₂HPO₄, pH 7,5 und 2,5mmol/l Dithiothreit (DTT) enthielt, dialysiert. Die einzelnen Rohextrakte wurden auf Bromoxyil-spezifische Nitrilaseaktivität untersucht. Ein Rohextrakt aus der K.ozaenae-Variante enthielt keine nachweisbare Nitrilaseaktivität, während die anderen K.ozaenae-Rohextrakte spezifische Nitrilaseaktivitäten von 0,124,0,105 bzw. 0,143pmol NHj/min/mg Protein aufwiosen. 200ml Zellen wurden bei 30°C bis zur mittleren Log-Phase in M9-Medium, das 0,1 % Glucose und 0,04% Bromoxynil enthiolt, gezüchtet (Miller .Experiments in Molecular Genetics", Cold Spring Harbor Laboratory [1972]). Durch Aufbrechen der Zellen, Ultrazentrifugieren und Dialyse des Überstands im Puffer mit 0,05mol/l K₂HPO₄, pH 7,5 und 2,5mmol/l DTT wurden Rohextrakte hergestellt. Die Substratkonzentration betrug in allen Versuchen 3 mmol/l Bromoxynil. Die Freisetzung von NH₃ wurde gemäß Harper »Biochem. J.", 167, S.685-692 (1977) überwacht. Die Fähigkeit der K.ozaenae-Variante, in Bromoxynil enthaltender L-Brühe zu wachsen, kann auf einer erworbenen Undurchlässigkeit des Organismus für die Verbindung beruhen. Der Organismus kann jedoch in bestimmten Medien unter Verwendung von Bromoxynil als einzige Stickstoffquelle nicht wachsen.

Zusammenfassend scheint die K.ozaenae-Nitrilase im Plasmid codiert zu sein. Das (die) das Enzym codierende(n) Gen(e) scheint (scheinen) auf einem 22KB-Plasmid-DNA-Secment zu liegen, das spontan aus dem K.ozaenae-Plasmid in Abwesenheit der Bromoxynil-Selektion verlorengeht.

Die Bromoxynil-spezlfischo Nitrllase aus K. ozaenae wird in E.coll exprimlert.

Es wurde Plasmid-DNA aus K.ozaenae, die unter 0,5% Bromoxynil-Selektiongezüchtet wurden, hergestellt und in E.coliMM294 (thi, gyrA96, endl", hsdR 17) transformiert.

Die Transformanten wurden auf stickstofffreiem (N') festem Agarose-Minimalmedium, das je Liter 1,5g KH₂PO₄,3,5g K₂HPO₄, 0,1 g MgSO₄ 7 H₂O und 0,1 % Glucose sowie 0,05% Bromoxynil als einzige Stickstoffquelle enthielt, selektioniert. Nach 5tägiger Inkubation erschienen 10 Kolonien auf den Selektionsplatten. Diese Kolonien wurden auf 0,05% Bromoxynil enthaltenden L-Agarplatten ausgestrichen und auf die Anwesenheit des auxothrophen Thiamin-Markers in MM 294 untersucht. Keine der Kolonien wuchs in Minimalmedia in Abwesenheit von Thiamin, das angibt, daß der Stamm E.coli MM 294 ist. Alle Kolonien wuchsen im M9-Medium, das mit Thiamin und 0,05% Bromoxynil als einzige Stickstoffquelle versetzt wurde. Kein Wachstum wurde in diesem Medium in Abwesenheit von Bromoxynil beobachtet. Zwei der Kolonien wurden für weitere Analysen ausgewählt. Wurden Rohextrakte von E.coli MM 294, das das 90KB-Plasmid enthielt, auf Bromoxynil spezifische Nitrilaseaktivität untersucht, so wurde eine spezifische Aktivität von 0,216pmol freigesetztem NH,/min/mg festgestellt. In E.coli MM 294, das die kleiner Plasmidart enthielt, konnte keine Nitrilaseaktivität nachgewiesen werden. Das größere 90 KB Plasmid in E.coli wurde mit pBrxi, das kleinere Plasmid (68KB) mit pBrxi Δ bezeichnet.

Zur Bestätigung, daß der E.coli-Stamm MM 294, der das Plasmid pBrx 1 enthält, den richtigen Metaboliten als Ergebnis einer Bromoxynil spezifischen Nitrilasereaktion produziert, wurde eine 2 ml-MM 294-Kultur (pBrx 1) 24 h bei 30°C in 0,05% Bromoxynil enthaltendem M 9-Medium gezüchtet. Eine Probe des Kulturfiltrats wurde auf einer C, j-Hochdruck-Flüssigchromaiographiesäule Chromatographien. Die Gesamtmenge an im Kulturfiltrat vorhandenem Bromoxynil wurde zu einem neuen Metabolitgipfel umgewandelt. Der Metabolitgipfel wurde durch Spektralanalyse als 3',5'-Dibrom-4-hydroxybenzoesäure (DBHB) identifiziert. Das heißt, das Produkt der Bromoxynil spezifischen, plasmidcodierten Nitrilaseexpression in E.coli ist das gleiche wie das von K.ozaenae.

Das Bromoxynil spezifische Nltrllasegen wird In E.coil Moniert.

Um festzustellen, ob daß das Bromoxynil spezifische Enzym codierende DNA-Segment in E.coli klonierbar ist, wurde das Plasmid pBrx 1 mit BamHI gepalten, wobei zwei Streifen mit 53 KB bzw. 37 KB erhalten wurden. Die BamHI-Fragmente wurden in die BamHI-Stelle des E.coli-Plasmidvektors pACYC184 eingebunden (Chang und Cohen, .J.Bacteriol." 134, S. 1141 [1978]) und in E. coli MM 294 transformiert. Das Kloneli von pACYC 184 in der BamHI-Stelle führt zu einer Einschub-Inaktivierung des Tetracyclin-Resistenzgens. 10 chloramphenicolresisiente, tetracyclinempfindliche MM 294-Kolonlen wurden ausgewählt, im Minimaßstab eine Klonanalyse-DNA hergestellt und mit BamHI gespalten. Vier Klone enthielten das 37 KB-BamHI-Fragmente, während ein Klon das größere 53 KB-BamHI-DNA-Fragment von pBrx 1 aufwios. Fünf Klone enthielten ein geklöntes BamHI· Fragment, das auch im Plasmid pBrx 1Δ gefunden wurde und dem DNA-Segment entspricht, das nach der spontanen Detection des 22 KB-Segments der Plasmid-DNA aus pBrx 1 zurückbleibt. Alle 10 Klone wurden in 200ml L-Brühe in Anwesenheit von 20pg/ml Chloramphenicol (zur Selektion des Plasmids) gezüchtet, die erhaltenen Rohextrakte wurden auf Bromoxynil

spezifische Nitrilaseaklivität untersucht. Vier Klone, die das 37 KB-BamHI-Fragment enthielten, zeigten spezifische

Nitrilaseaktlvitäten im Bereich von 0,140pmol freigesetztem NHj/min/mg Protein, wogegen in den anderen sechs Klonen keine Nitrilaieaktivitftt nachweisbar war. Diese Ergebnisse zeigen, daß sich das eine Bromoxynil spezifische Nitrilaseaklivität

codierende Gen auf einem 37 KB-BamHI-Fragment befindet, das aus dem Plasmid pBrx 1 geklont wird, und daß das 22 KB-DNA-

Segment, das spontan In Abwesenheit der Bromoxynilselektion verlorengeht, zu dem 37 KB-BamHI-Fragment gehört. Um die Orientierung der BamHI-Fragmente in bezug auf den Vektor pACYC 184 zu bestätigen, wurde die DNA aus den oben

angegebenen vier Klonen mit EcoRI gespulten und der E'ektrophdresa auf einem 0,07%igen Agarosegel unterworfen. Ein

kombiniertes EcoRI-Abbauprodukt der Plasmide pBrx 1 und pBrxi Δ wurde ebenfalls untersucht.

Beide Orientierungen des 37 KB-BamHI-Fragments in bezug auf den Vektor pACYC 184 wurden bestimmt und als Plasmide pBrx 2

und pBrx3 bezeichnet. Es wurde auch festgestellt, daß die drei EcoRI-Fragmente zu dem 22 KB-DNA-Segment gehören, das

spontan aus den Plasmiden pBrx2 und pBrx3 abgespalten wird. Diese EcoRI-Fragmente haben eine Größe von 18KB, 3KB bzw.1,9KB. Das die Bromoxynil spezifische Nitrilase codierende Gen sollte sich innerhalb eines dieser drei EcoRI-Fragmente

befinden, wenn das Nitrilase-Strukturgen nicht durch eine EcoRI-Restriktionsstelle geteilt ist.

Die Lokalisierung der Bromoxynil spezifischen Nitrilase von E.coli (pBrx3) wurde untersucht, es wurden folgende Ergebnisse

erhalten:

Tabelle 1 Die Bromoxynil spezifische Nitrilase ist ein periplasmisches Enzym in E.coli

	Spezifische
Kulturbedingungen'	Nitrilaseaktivität"
mit Toluol behandelte Zellen (L-Brühe)	0,829
mit Lysozym behandelte Zellen (L-Brühe)	0,796
Gesamtzellen (L-Brühe)	0,770
Gesamtzellen (L-Brühe + Brx1)	1,25
Gesamtzellen iM9)	0,950
Gesamtzellen(M9 + Brx1)	1,45
Gesamtzellen/pACYC184(M9)	0

a E.coli |MM294)-Z?llen, die dai Plasmid p8rx3 enthielten, wurden in 5ml·

Kulturen bei 37'C In dem angegebenen Medium bit zur stationären Phase

gezüchtet. Die Kulturen enthielten, wo angegeben, 20pg/ml Chloramphenicol

und 0,04% Bromoxynil (Brx 1). 1 ml jeder Kultur wurde gesammelt, einmal mit

Nitrilasepuffer (0,1 mol/l K₁HPO₄, pH 7S) gewaschen. Die Zellen wurden in 0,1 ml

dieses Puffers wieder suspendiert. ΒΟμΙ-Proben wurden gemäß Harper

.Blechern. J.", 167, S.685 bis 692 (1977) mit und ohne 3mmol/l Bromoxynil als

Substrat auf Nitrilaseaktlvitlt untersucht, b pmol NHj/min/mg. Das Protein wurde als OD₁₀₀ = 1,4» 10' Zellen/ml = 150pg

bestimmt.

Diese Ergebnisse zeigen, daß sich die Nitrilase im periplasmatischen Raum der Zelle befindet. Eine zweite Beobachtung ist, daß das Enzym in Abwesenheit von Bromoxynil im Medium exprimiert wird, was darauf hindeutet, daß die Bromoxynil Induktion für die Enzymexpression nicht notwendig ist.

Weitere Reinigung der Bromoxynil spezifischen Nitrilase Die weitere Reinigung der K.ozeanae-Nitrilase wurde mit folgenden Ergabnissen durchgeführt: Tabelle 2 Reinigung der Bromoxynil spezifischen Nitrilase von E. coli

(Ausgangsmaterial: 6g Zellen)

Fraktion	Volumen	Protein	pmolNHj/min	S.A.*
Roh«	100ml	210ml	18,15	0,086
35-50%
NH4SO4	6ml	83 mg	26,77	0,250
DEAE-
Sephadex	56ml	19mg	15,52	0,820

a Die Zellen wurden bei 30'C bis zur mittleren Log-Phase in M 9-Madium, das 0,04%

Bromoxynil und Glucose enthielt, gezüchtet. Die Rohextrakte wurden durch Aufbrechen der Zellen, Ultrazentrifugieren und Dialyse in einem Puffer, der O.OSmol/l K₁HPO₄, pH 7,5, und

2,5mmol/l DTT enthielt, hergestellt. Die Subslralkonzentration betrug bji allen

Nitrilaseversuchen 3mmol/l

b μηιοΙ NHj/min/ng.

Eine 2,5cm² χ 10cm große Säule wurde mit Puffer, der 0,05% K₂HPO₄, pH 7,5,2,5mmol/l DTT und 1 mmol/l EDTA enthielt, equilibriert. Die Probe wurde aufgebracht, die Säule wurde 300 ml eines linearen Gradienten von 0,02 bis 0,40mol/l NaCI im oben angegebenen Säulenpuffer entwickelt. 1 mol/l NaCI enthaltender Puffer wurde am Ende des Gradienten aufgegeben. Es wurden Sml-Fraktionen gesammelt, 0,075Til-Proben verschiedener Fraktionen wurden auf Nitrilaseaktivität untersucht. Ein einziger Gipfel mit Enzymaktivität wurde bei 0,22mol/l Salz eluiert. Etwa 75% der aufgegebenen Nitrilaseaktivität wurden in den aktiven Fraktionen wiedergewonnen.

Die Fraktionen, die dem Nitrilasegipfel aus der DEAE-Säule entsprachen, wurden gegen 0,02 mol/l K₂HPO₄, pH 7,5 dialysiert; 50μΙ (8pg Protein) jeder Fraktion wurden auf 11,25%iges denaturiertes Laemmli-Gel aufgegeben. Die mit Protein angereicherte Bande, die dem AktivitStsgipfel aus der DEAE-Säule entspricht, ist ein Polypeptid mit einer Molekülmasse von 34000. Es wurden keine anderen Polypeptide in den aktiven Säulenfraktionen angereichert. Diese Ergebnisse bestätigen, daß die Bromoxynil spezifische Nitrilase ein Polypeptid mit einer Molekülmasse von etwa 34000 ist, das vermutlich das Produkt eines einzigen Gens ist.

Der pBrx2-Klon wurde vollständig mit EcoRI gespalten, dabei wur"de ein Fragment von etwa 19KB isoliert. Das Fragment wurde in den EcoRI-abgebauten pACYC 184-Vektor (3,9 KB) zu dem Plasmid pBrx 5 eingebaut, das wie oben beschrieben in E.coli transformiert v/urde. Das Plasmid wurde in herkömmlicher Weise isoliert und mit BgIII zu einem Fragment mit etwa 6,7 KB abgebaut, das in dem Vektor pACYC 184 bleibt.

Das isolierte Plasmid pBrx7 wurde mit Smal und BgIII zu einem Fragment mit etwa 3,9 KB verdaut, das in Smal-BamHI-abgebautes pACYC 177 (3,7 KB) eingebaut wurde (Chang und Cohen, .J. Bacteriol.", 134, S. 1141 bis 1156 [1978]). Das entstandene Plh-"nld, das Penicillinresistenz verleiht, wurde in E.coli wie oben beschrieben transformiert; die Transformanten wurden auf einem f enlcillinselektiven Medium zu einem Plasmid pBrx8 selektioniert, daß das Nitrilasegen auf einem 3,9 KB-Fragment trägt.

pBrx8 wurde mit Pstl teilabgebaut, die Fragmente wurden in Pstl-verdautem pUC 18 eingebaut (Yanisch-Perron et al., .Gene", 33, S. 103-119 [1985]). Die entstandenen Plasmide wurden in E.coli kloniert und auf Nitrilaseaktivität untersucht. Ein Klon wies ein 5,3 KB-Plasmid pBrx9 auf, das isoliert und mit Pstl und Hindi weitergespalton wurde, wobei ein Fragment mit 1210BP entstand, das in Richtung von Pst I zu Hindi, CIa I, Sal I, Sea I und Sph I-Restriktioi isstellen in relativ gleichmäßigen Abständen hat. Das Pstl-Hincll-Fragment wurde gemäß Sanger et al., „Proc. Natl. Acad.Sci. USA", 74, S.5463-5468 [1977]) sequenziert. Die Sequenz (mit den entsprechenden codierten Aminosäuren) ist im folgenden angegeben:

65 CTGCAGGATAGTAGGGGCTTGAAGAGGATACGCTGTTTGGCGAGCCATCAAAATAAGGGGATTTTC

95 125

ATG GAC ACC ACT TTC AAA GCA GCC GCT GTT CAG GCC GAA CCG GTA TGG ATG GAT GCC GCT Met Asp Thr Thr Phe Lys Ala Ala Ala VaI Gin Ala GIu Pro VaI Trp Met Asp Ala Ala

155 185

GCA ACA GCC GAT AAG ACC GTG ACG CTA GTA GCT AAA GCC GCA GCG GCT GGC GCG CAG CTC Ala Thr Ala Asp Lys Thr VaI Thr Leu VaI Ala Lys Ala Ala Ala Ala GIy Ala Gin Leu

215 245

GTC GCA TTT CCC GAA TTG TGG ATT CCG GGC TAC CCA GGA TTC ATG CTC ACG CAC AAC CAA VaI Ala Phe Pro GIu Leu Trp lie Pro GIy Try Pro GIy Phe Met Leu Thr His Asn Gin

275 305

ACC GAA ACC CTA CCA TTC ATC ATT AAA TAC CGC AAG CAG GCA ATC GCC GCC GAT GGA CCA T'lr GIu Thr Leu Pro Phe lie lie Lys Try Arg Lys Gin Ala lie Ala Ala Asp GIy Pro

335 365

GAA ATC GAA AAA ATT CGC TGC GCG GCT CAG GAG CAT AAC ATT GCG CTC TCC TTT GGG TAC GIu lie GIu Lys He Arg Cys Ala Ala Gin GIu His Asn lie Ala Leu Ser Phe GIy Tyr

395 425

AGC GAA CGG GCT GGC CGT ACT CTC TAC ATG TCA CAA ATG CTT ATC GAT GCC GAT GGC ATC Ser GIu Arg Ala GIy Arg Thr Leu Tyr Met Ser Gin Met Leu lie Asp Ala Asp GIy lie

455 485

ACC AAA ATT CGT CGT CGA AAG CTC AAA CCA ACC CGC TTT GAA CGA GAA CTC TTT GGC GAA Thr Lys lie Arg Arg Arg Lys Leu Lys Pro Thr Arg Phe GIu Arg GIu Leu Phe GIy GIu

515 545

GGT GAC GGA TCG GAC TTA CAG GTC GCC CAA ACT AGC GTT CGT CGG GTG GGT GCC CTC AAC GIy Asp GIy Ser Asp Leu Gin VaI Ala GIn Thr Ser VaI GIy .»rg VaI GIy AIa Leu Asn

575 605

TGC GCG GAG AAΓ TTG CAG TCG CTA AAC AAC TTT GCG CTT GCT GCC GAG GGT GAA CAG ATA Cys Ala GIu Asn Leu GIn Ser Leu Asn Lys Phe AIa Leu Ala Ala GIu GIy GIu Gin He

635 665

CAT ATC TCC GCC TGG CCA TTC ACG CTT GGA AGC CCT GTG CTC GTC GGA GAC TCC ATC GGC

His He Ser Ala Trp Pro Phe Thr Leu GIy Ser Pro VaI Leu VaI GIy Asp Ser lie GIy

695 725

GCC ATC AAC CAG GTC TAC GCG GCC GAG ACG GGG ACC TTC GTT CTC ATG TCG ACG CAG GTG

Ala He Asn Gin VaI Tyr Ala Ala GIu Thr GIy Thr Phe VaI Leu Met Ser Thr Gin VaI

755 785

GTT GGA CCG ACC GGC ATC GCC GCC TTC GAG ATC GAA GAC AGG TAC AAC CCG AAT CAG TAT

VaI GIy Pro Thr GIy lie Ala Ala Phe GIu He GIu Asp Arg Tyr Asn Pro Asn Gin Tyr

815 845

CTT GGT GGT GGG TAC GCG CGG ATC TAC GGG CCT GAC ATG CAG TTG AAG AGC AAG TCG TTG

Leu GIy GIy GIy Tyr Ala Arg He Tyr GIy Pro Asp Met Gin Leu Lys Ser Lys Ser Leu

875 905

TCA CCG ACC GAA GAG GGC ATC GTC TAC GCC GAG ATC GAC CTG TCG ATG CTT GAG GCA GCA

Ser Pro Thr GIu GIu GIy lie VaI Tyr Ala GIu lie Asp Leu Ser Met Leu GIu Ala Ala

935 965

AAG TAC TCG CTC GAT CCC ACG GGC CAC TAT TCG CGC CCT GAT GTG TTC AGC GTG TCG ATT

Lys Tyr Ser Leu Asp Pro Thr GIy His Tyr Ser Arg Pro Asp VaI Phe Ser VaI Ser He

995 1025

AAC CGG CAA CGG CAG CCT GCG GTG TCA GAA CTT ATC GAC TCA AAC GGT GAC GAG GAC CCG

Asn Arg Gin Arg Gin Pro Ala VaI Ser GIu VaI lie Asp Ser Asn GIy Asp GIu Asp Pro

1055 1085

AGA GCA GCA TGC GAG CCC GAC GAG GGG GAT CGT GAG GTC GTA ATC TCT ACG GCA ATA GGG

Arg Ala Ala Cys GIu Pro Asp GIu GIy Asp Arg GIu VaI VaI He Ser Thr Ala He GIy

1115 1155

GTT CTA CCC CGT TAT TGC GGA CAT TCC TAATAAAAAGAGACACGTGGTACCAAAGGGGTGTTCATGTCCA VaI Leu Pro Arg Tyr Cys GIy His Ser

1Γ.00 GACGCAGAAAATATAGCCCAGAGTTAAAACGCGAAGCCATCGCTTTAACCCGTCAAC

Das von den nicht codierenden flankierenden Regionen am 5'- und am 3'-Ende praktisch freie Pstl-Hincll-Fragment kann mit EcoRI-Linkern verknüpft und mit EcoRI gespalten werden und ist dann fertig, um in eine Pflanzenexpressionskassette durch Einschub in die EcoRI-Stolle von pCGN451 eingeführt zu werden.

pCGN451 umfaßt eine Octopin-Kassette, die etwa 1666BP der 5'-nichtcodierenden Region, die über oinen EcoRI-Linker an das 3'-Ende des Gens gebunden ist, und etwa 1349BP der 3'-nichtcodierenden DNA enthält. Die pTi-Koordinaton sind 11.207 bis 12.323 für die 3'-Region und 13.643 bis 15.208 für die 5'-Region (definiert gemäß Barker et al. .Plant Molecular Biology", 2, S. 11983]).

Dae 5'-Fragment wurde wie folgt erhalten: ein kleines unterkloniertes Fragment, daß das 5'-Ende der codierenden Region als BamH H-EcoRi-Fragment enthält, wurde in pBR322 als Plasmid pCGN407 geklont. Das BamH l-EcoR IFragmont hatte eine Xmnl-Stelle in der codierenden Region, während pBR322 zwei Xmnl-Stellen aufwies. pCGN407 wurde mit Xmn I abgebaut, mit Bal31Nuklease gespalten. Den Fragmenten wurden EcoRI-Linker zugegeben. Nach dem Abbau mit EcoRI und BamHJ wurden die Fragmente nach Größe fraktioniert, die Fraktionen geklont und sequenziert. In einem Fall wurde die ganze codierende Region und 10BP der 5'-nichtübersetzten Sequenzen entfernt, wobei die 5'-nichttranskribierte Region, die mRNA-Kappenstelle und 16BP der 5'-nichtüberseuten Region (zu einer BamHI-Stelle) intakt zurückblieben. Dieses kleine Fragment wurde durch Größenfraktionierung auf einem 7%igen Acrylamidgel erhalten, etwa 130BP lange Fragmonte wurden eluiert. Diese nach Größe fraktionierte DNA wurde in M13 mp 9 eingebunden; verschiedene Klone wurden sequenziert, die Sequenz wurde mit der bekannten Sequenz des Octopin-SynlhaseGens verglichen. Die M 13-Konstruktion wurde mit pl4 bezeichnet, dieses Plasmid wurde mit BamHI und EcoRI zu einem kleinen Fragment gespalten, das an ein Xhol-BamHI-Fragment, das stromaufwärts

5'-Sequenzen von pTiA6(Garfinkel und Nester, „J.Bacteriol.", 144, S.732 [198O)) enthielt, und an ein EcoRI-Xho I-Frspment, das 3'-Sequenzen enthielt, gebunden. Das entstandene Xho I-Fragment wurde in die Xho I-Stelle eines pUC8-Derivats mit der Bezeichnung pCGN426 geklont. Dieses Plasmid unterscheidet sich von pUC8 dadurch, daß die einzige EcoRI-Stelle mit DNA-Polymerase I gefüllt ist und dadurch, daß es die Pst I- und Hind Ill-Stelle durch Nukleaseverunreinigung der Hinc II-Restriktionsendonuklease verloren hat, wenn ein Xhol-Linker in die einzige Hinc Il-Stelle von pUC8 eingebaut wird. Das entstandene Plasmid pCGN451 hat eine einzige EcoRI-Stelle für den Einbau von Protein-codierenden Sequenzen zwischen der 5'-nichtcodierenden Region (die 1550BP der 5'-nichttranskribier(e'n Sequenz einschließlich des rechten Randes von T-DNA, die mRNA-Kappenstelle und 16BP der 5'-nichtübersetzten Sequenz enthält) und der 3'-Region (die 267BP der codierenden Region, das Stopoodon, 196BP der 3'-nichtübersetzten DNA, die Poly a-Stelle und 1153 BP der 3'-nichttranskribierten Sequenz enthält). Das Xhol-Fragment, das die Octopin-Synthase (ocs)-Kassette enthält, wurde in das Plasmid pCGN 517 eingebaut, das Tetracyclin- und Kanamycin-Resistenzgene aufweist.

pCGN517 wurde aus pHC73 (Hohn, .Gene", 11, S.291 (198Oj) durch Einführung in die einzige Pst I-Stelle des Kan'-Gens aus pUC4 K (Vieira, .Gene", 19, S. 259 [1982]) hergestellt. pCGN 517 wurde mit Sal I abgebaut, das Xho I-Fragment wurde in die einzige SaI I-Stelle eingebaut.

Das Xhol-Fragment wurde auch in ein zweites Plasmid pCGN529 eingebaut. pCGN529 wurde aus pACYC 184 durch Einbau des Ken'· Gens aus Tn 5 hergestellt (Rothstein et al., .Movable Genetic Elements", ε. 99, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, NY, 1981). Ein Bglll-Fragment mit einer Größe von 2,4 KB aus pRiA4-T_L-DNA (White und Nester, .J.Bacteriol", 144, S.710 (19801), das in die BamHI-Stelle eingeführt wurde, blieb nach der Substitution des Hindlll-BamHI-Fragmentc von pACYC 184 mit dem Kan'-Gen von Tn 5 zurück.

Das Xho-Fragment, das die ocs-Kassette enthielt, in die das Eco-Rl-Nitrilasegen an der einzigen EcoRI Stelle der ocs-Kassette eingebaut ist, wurde in pCGN 517 und pCGN 529 eingebaut. Dabei wurden zwei Plasmide pN 1 bzw. pN 2 erhalten, die für die Einführung in A.tumefaciens oder A. rhizogenes zur Integration der T-DAN der Ti- oder Ri-Pltsmide verwendet wurden. Die Integration in die entsprechenden Plasnvde kann in einem 3-Stufen-Verfahren gemäß Comai et al., .Plasmid", 10, S.21-50 (1983) durchgeführt werden. Übernacht-Kulturon eines E.coli-Wirts, der die Plasmide pRK2073, pN 1 oder pN2 und A.tumefea :iens A722 (Garfinkel, .J. Bakteriol",144, S. 732 [1980]) oder A. rhizogenes A4 T (White, ibid., 144.710 [1980]) enthielten, wurden über Nacht gezüchtet. Die Kulturen wurden vermischt und auf AB-Platten, die \ SOpg/ml Kanamycin enthielten, ausgestriche '. Einzelne Kolonien wurden zweimal ausgestrichen. Die richtige Integration wurde durch die Southern-Analyse der Gesamt-Agrobacterium-DNA nachgeprüft. Endonuklease-abgebaute DNA wurde mit kerben-übersetztem (nick-transladet) p8rx8 untersucht.

Da* Bromoxynll spezifische Nitrllategen wird In Gallengewebe exprimlert. Das Plasmid pBrx9, daß das Nitrilasegen auf einem 2,6KB-Fragment trägt, wurde mit BamHI abgebaut und mit Bal31 zur Entfernung eines Teils der 5'-flankierenden Region behandelt. Es wurden BamHI-Linker zugegeben und der Ring wieder

geschlossen. Die entstandenen Plasmide, die Ampicillinresistenz verleihen, wurden wie oben beschrieben in E.colitransformiert. Die Transformanten wurden auf einem Ampicillin-selektivan Medium zu den 5,2 KB-Plasmider. pBrx 16 bzw.pßrx 17 selektioniert, die das Nitrilasegen auf einem 2,6 KB-Fragment tragen. pßrx 16 wrude mit BamHI gespalten und mit Hinc Ilteilabgebaut, wobei ein 1,2 KB-Nitriiasegen-Fragment entstand.

Das BamHI-Hincll-Fragment wurde in mit BamH1-Smal abgebautem pCGN4G eingebaut, wobei das 6,6 KB-Plasmid pBrx22

entstand, daß das Nitrilasegen-Fragment enthält.

pCGN46 (Comai et a!., .Nature", 317, S.741-744 [1986]) ist eine Mannopin-Synthase (MAS)-Expressionskassette und enthälteinen MAS-Promotor und eineoct-3'-Region. pCGNM46 wurde wie folgt hergestellt: ein EcoRI-Fragrmnt (Eco 13 oder EcoC) mitetwa 5500 BP, das einen Teil der T_n-DNA(Barker et al., .Plant Mol.Biol.", 2, S. 325(1983]) einschließlich der Mannopin-Synthase·

Promotorregion (Pmas) trägt, wurde in einem mit pOVK232 gezeichneten Vektor geklont. Nach Abbau von ρVK232 mit EcoRI

wurde Eco 13 in die EcoRI-Stelle von pACYC 184 zu einem Plasmid pCGN 1 eingebaut. pCGN 14 wurde mit Sph I und CIa I (jeweilsan Pos.21562 und 20128 der Barker-Sequenz, w.o.) gespalten, um die P_MAs-Region zu entfernen, die in pUC 19 (Pharmacia Inc.),das mit SpM und Accl abgebaut wurde, eingebaut. Es entstand pCGN40. Die P^s-Region umfaßt eine Clal-Erkennuivjsstelle,die methyliert ist, um sie gegen den Abbau resistant zu machen.

pCGN40 wurde mit EcoRV und EcoRI gespalten, dort wo sich die EcoRV-Stelle in der T-DNA befindet, während die EcoRI-Stellein dem Polylinker von pUC 19 ist; dabei entsteht ein Fragment nit der P^us-Region. pCGN451, das die Octopin-Synthase-Kassetteenthält, wurde mit Smal und EcoRI abgebaut, das größere Frcgment, aus dem dieOctopin-Synthase-ö'-Region entfernt wordenist, wurde isoliert. Die EcoRV-EcoRI-PMAS-Region wurde in pCGN451 anstelle der Octopin-Synthase-5'-Region eingebaut, dortwo die Transkriptions-Startregion und die -Endregion durch einen Polylinker getrennt sind; es entsteht pCGN46.

Das Plasmid pBrx22, daß das 1,2KB-Nitrilasegen-Fragment enthielt, wurde, wie oben beschrieben, in E.coli transformiert. Das Plasmid wurde in herkömmlicher Weise isoliert und mit Xho I zu einem 4,1 KB-Fragment abgebaut, das den MAS-Promotor, das Bromoxynilgen mit 258P der bakteriellen 5'-nicht-übersetzten Sequenz und die ocs-3'-Region enthielt. Das 4,1 KB-Fragment

wurde in das mit Sail abgebaute Plasmid pCGN783 eingeführt, dabei entstand das Plasmid pBrx28 mit etwa 31 KB.

Herstellung von pCGN783 Herstellung von pCGN 167 Zur Herstellung von pCGN 167 wurde das AIu I-Fragment von CaMV (7144 bis 7735BP, Gardner et al. .Nucl. Acids Res.", 9, S. 2871-2888 (1981)) durch Abbau mit AIuI erhalten und in die Hincll-Stelle von M 13mp7 (Vieire, .Gene", 19, S.259 (1182)) zu C614 geklont. Durch EcoRI-Abbau von C614 wurde das EcoRI-Fragment von C614 erhalten, das das 35S-Promotor en.hielt, der

in die EcoRI-Fiolle von pUC8 (Vieira et al., .Gehe", 19, S. 259 p982|) zu pCGN 146 geklont wurde.

Um die Promotorregion zu trimmen, wurde die Bglll-Stelle (7670 BP) mit BgIII und Bal31 behandelt; dann wurde ein Bglll-Linker

an die mit Bal31 behandelte DNA zur Herstellung von pCGN 147 gebunden.

pCGN 148a, das eino Promotonegion, einen selektionierbaren Marker (KAN) mit 2ATG) und eine 3'-Region enthielt, wurde durch

Abbau von pCGN528 (s. u.) mit BgIII und Einführen des BamHI-Bglll-Promotor-Fragments aus pCGN 147 hergestellt. Dieses Fragment wurde in die BgI Il-Stelle von pCGN 528 geklont, so daß die BgI Il-Stelle in der Nähe des Kanamycingens von pCGN 528 Der für diese Konstruktion verwendete Pendelvektor (shuttle vector) pCGN 528, wurde wie folgt hergestellt. pCGN 525 wurde

durch Abbau eines Plasmids, das Tn5 mit einem Kanamycingen (Jorgenson et al., .Mol. Gen.", 177, S.65 [1979]) enthält, mit

Hindlll-ßamHI und Einführen des Hindlll-BamHI-Fragments, das das Kanamycingen enthält, in die Hindlll-BamHI-Stellen des Tetracyclingensvon pACYC184 (Chang und Cohen, .J. Bacteriol", 134, S. 1141-1156 [1978]) hergestellt.

pCGN526 wurde durch Einführen des BamHI-Fragments 19 von ρΤϊΑβ (Thomashowet al., »Cell", 19, S.729-739 [1980]) in die

BamHI-Stelle von pCGN525 hergestellt.

pCGN 528 wurde durch Entfernen des kleinen Xhol-Fragments aus pCGN 526 durch Abbau mit Xhol und Wiederverknüpfenerhalten.

pCGN 149a wurde durch Klonen des BamHI-Kanamycing η-Fragments aus pMB9KanXXI in die BamMI-Stelle von pCGN148ahergestellt.

pMB9kanXXI ist eine pUC4K-Variante (Vieira und Messing, .Gene", 19, S. 259-268 [1982]), der die Xhol-Stelle fehlt, die jedochein funktionelles Kanamycingen aus Tn903 enthält, das eine wirkungsvolle Selektion in Agrobakterium ermöglicht.

pCGN 149a wurde mit BgIII und Sphl abgebaut. Dieses kleine Bglll-Sphl-Fragment vo.i pCGN 149a wurde durch das BamHI-Sphl-

Fragment aus M1 (siehe unten) ersetzt, das durch Abbau mit BamHI und Sphl isoliert wurde. Dabei entsteht pCGN 167, eine Konstruktion, die einen CaMV-Promotor mit voller Länge, 1 -ATG-Kanamycingen, das 3'-Ende und das bakterielle Tn903-Kanamycingen enthält. M1 ist ein EcoRI-Fragment aus pCGN 550 (siehe Herstellung von pCGN 587), das in die EcoRI-Klonierstelle von M13mp 9 so

geklont wurde, daß die Pstl-Stelle In dem 1-ATG-Ksnamycingen in der Nähe der Polylinkerregion von M13mp9 ist.

Herstellung der 709 (1-ATG-Kanamycin-3'-Region)

pCGN 566 enthält den EcoRI-Hindlll-Linker von pUC 18 (Yanisch-Perron, ibid), der in die EcoRI-Hindlll-Stellen von pUC 13-cmeingeführt wurde (K. Buckley, Dissertation, UC-San Diego, 1985). Das Hindlll-Bg! Il-Fragment von pNW31c-8,29-1 (Thomashow etal., .Cell", 19, S.729 [198O)), das ORF 1 und 2 enthält (Barker et al., siehe oben [1983]), wurde in die Hindlll-BamHI-Stelle vonpCGN566 zu pCGN703 subkloniert.

Das Sau3AFragment von pCGN703, das die 3'-Region des Transkripts 7 von ρΤίΑβ enthält (entsprechend den Basen 239U-2920

von j T115955 (Barker et el., siehe oben [1983]), wurde in die BamHI-Stelle vor; pUC 18 (Yanisch-Perron et al., siehe oben [1985])zu pCGN709 subkloniert.

Herstellung von pCGN768c(35S-Promotor-3'-Region) Das Hindlll-BamHI-Fragrnent von pCGN 167 (Herstellung siehe unten), das den CaMV-SSS-Promotor, das 1-ATG-Kanamycingen

und das BamHI-Fragment 19 von pTiAÖ enthält, wurde in die BamHI-Hindlll-Stellen von pUC 19 geklont (Norrander et al., sieheoben [1983]; Yanisch-Perron et al., siehe oben [1985]); es entstand pCGN976.

Der 35S-Promotor und die 3'-Region aus dem Transkript 7 wurden durch Einführen eines 0,7 KB-Hindlll-EcoRI-Fragments von

pCGN976 (35S-Promotor) und des 0,5KB-EcoRI-Sall-Fragments von pCGN 709 (Transkript 7:3', Herstellung siehe oben) in die

Hindlll-Sall-Stellen von pCGN 566 hergestellt; es entstand pCGN 766c. Endaufbnu von pCGN783 Das OJKD-Hindlil-EcoRI-Fragment von pCGN766c (CaMV-SöS-Promotor) wurde an das 1,5KB-EcoRI-Sall-Fragment von

pCGN726c (1-ATG-KAN-3'-Region) in die Hindlll-Sall-S'.ellen von pUC 119 (J.Vieira, Rutgers University, N.J.) gebunden; esentstand pCGN 778.

Die 2,2KB-Region von pCGN778, das Hindlll-Sall-Fragment, das die CaMV-35S-Promotor (1-ATG-KAN-3'-Region) enthält,

ursetzte die Hindlll-Sall-Polylinkerregion von pCGN739; es entstand pCGN783.

pBrx 17 wurde mit BamHI abgebaut und mit Hincll teilabgebaut, wodurch das 1,2KB-Nitrilasegen-Fragment entstand. Das

BamHI-Hincll-Fragment wurde in mit BamHI-Smal abgebautes pCGN566 eingebaut, es entstand das 3,7 KB-PlasmidpBrx 25, das

das Nitrilasegen-Fragment enthielt.

pCGN566 wurde wie folgt hergestellt: pUC 13 (Cm^R) (Ken Buckley, Dissertation, U. C, San Diego) wurde mit EcoRI und Hindillabgebaut, Poly linker aus pUC 18 und pUC 19 wurden jeweils in das lineargemachte pUC 13 eingebaut, wobei pCGN 566 entstand,das einen Chloramphenicolresistenzmarker trägt.

Das Plasmid pBrx 25, das das 1,2 KB-Nitrilasegen-Fragment enthält, wurde wie oben beschrieben in E. coli transformiert. Das Plasmid wurde in herkömn licher Weise isoliert und mit BamHI und EcoRI wiederum zum 1,2 KB-Nitrilasegen-Fragment

abgebaut. Das BamH 1- und EcoRI-Fragment wurde in mit BamHI und EcoRI abgebautem pCGN46 eingebaut, es entstand das6,6KB- Plasmid pBrx27, das das Nitrilasegen-Fragmont enthält.

pBrx27 wurde wie oben beschrieben in E. coli transformiert. Das Plasmid wurde in herkömmlicher Weise isoliert und mit Xholabgebaut, es entstand ein 4,1 KB-Fragment, das den MAS-Promotor, das Bromoxynügen mit 11BP der bakteriellen 5'-Region inder übersetzten Sequenz und die ocs-3'-Region enthält. Das 4,1 KB-Fragment wurde in mit Sail abgebautes pCGN 783 eingebaut,es entstand das Plasmid pBrx29 mit etwa 31 KB.

Nachweis der Nitrilaseexpression

Die Plasmide pBrx28 und pBrx29 wurden in den Stamm Agrobacterium tumefacier.s K12 transformiert (Nester, .Ann. Rev. Micro.", 35, S.531 [1981]; Hoekema et al., .Nature", 303, S. 179 (1983]). KI" ;,8rx26] und K12 [pBrx29] wurden zur Bildung von Gallen auf Kalanchöe verwendet (Garfinkel, .J. Bacteriol.", 144, S. 732 [1980]).

Etwa 1 g (Frischgewicht) Gallengewebe wurden in flüssigem Stickstoff und e.'nem Puffer, der 0,1 mol/l Tris, pH 7,5,10 mmol/l EDTA, 0,15 mol/l NaCI, 0,05% NP-40 (Netzmittel), 25mg/ml BSA (RinderserumaiDumin), 1 mmol/l DTTund0,13Mg/mlLeupeptin enthält, gemahlen. Die Proben wurden nach der Zugabe von 0,05g Polyvinylpyrrolidon (Sigma) homogenisiert, dann bei 15000g 15min bei 4°C zentrifugiert. 25 μ! Antiserum, das durch Injektion van gereinigter Nitrilase in Kaninchen hergestellt wurde, und 250μΙ 10%ige (Masse/Volumen) Suspension von S. aureus (Calbiochem) wurden zu jedem Überstand zugegeben und 16h bei 4°C inkubiert. Die Proben wurden dann zentrifugiert, der Niederschlag wurde zweimal mit 20 mmol/l Tris, pH 7,5,1 mmol/l EDTA, 150 mmol/l NaCI und 0,05% NP-40 gewaschen. Die Niederschläge wurden in 100μΙ 0,125 mol/l Tris, pH 6,8,4% SDS (Natriumdodecylsulfat), 20% Glycerin und 10% BMe (ß-Mercaptoethanol) wieder suspendiert und 2min auf 90'C erhitzt. Alle Proben wurden auf i0%igem Acrylamidgel der Elektrophorese unterworfen (V.K.Laemmli „Nature", 227, S. 680-68511970]). Die

wiederaufgelSsten Polypeptide wurden auf Nitrozellulosefilter (Schleicher & Schuell) transferiert (vgl. Burnette, „Anal. Biochem.", 112, S. 195-203 [1981 ]). Die Nitrozellulosefilter (Schleicher & Schuell) wurden dann in BLOTTO (Johnson et al., .Gen. Anal. Technol.*, 1, S.38-42 [1983]) 1 bis 3h bei 42'C inkubiert, dann über Nacht bei Raumtemperatur in BLOTTO, das eine 1:5C-Lusung des Anti-Nitrilaseserums enthielt, inkubiert. Die Filter wurden 10min in 20 mmol/l Tris, pH 7,5 und 150 mmol/l NaCI, dann 20 min in dem gleichen Puffer, der jedoch 0,05% Twoen-20 enthielt und weitere 10min in dem Puffer ohne Tween-20 gewaschen. Es wurde dann BLOTTO, das 10'cpm/ml '"!-markiertes Protein A (9μ Ci/mg; NEN) enthielt, zu den Filtern zugegeben, die 2 h bei Raumtemperatur inkubiert wurden. Die Filter wurden über Nacht in 50 mmol/l Tris, pH 7,5,1 mol/l NaCI und 0,4% Sarkosyl gewaschen. Nach dem Spülen und dem Trocknen wurden die Filter einem Kodak AR-Röntgenfilm bei -7O⁰C unter Verwendung eines DuPont-Cronex-Intensivierungsserums ausgesetzt.

Transformation und Regenerierung von Tabakblätter-Scheiben, die mit A. tumefaclens cokuUlviert wurden Tabakpflanzen wurden unter sterilen Bedingungen (25 "C, 16h weißes Licht, MS-Mcdium C mg/1 IAA [Indolessigsäure], 0,15 mg/1 Kinotin) kultiviert. 3 Wochen alte Pflanzen, die durch Verpflanzungen des Haupttriebs erhalten wurden, werden als Gewebespender verwendet. Junge Blätter (bis zum vierten Blatt von oben) wurden ausgewählt, Blattscheiben mit einem Durchmesser von 2mm wurden ausgestanzt und in Petrischalen (3cm Durchmesser) in 1 ml MS-Msdium mit 1 mg/l IAA eingebracht. Nachdem die Scheiben über Nacht in völliger Dunkelheit gehalten wurden, wurde Agrobacterium (A772xpN 1 oder pN?)-Zellen (10'-10'/ml in Pflanzenkulturmedium) diesen Kulturen zugegeben. Die Cokultiviorung wurde 18 bJ3 24h in der Dunkelheit durchgeführt. Durch dreimaliges Waschen mit MS-Medium ohne Hormone, das jedoch 360 mg/l Cefotaxin (Boehringer, Mannheim) enthielt, wurden die Blattscheiben von Agrobacterium befreit. Die Blaitscheibon wurden in Petrischalen mit einem Durchmesser von 9cm in 10ml MS-Medium ohne Hormone eingebracht. Petrischalen mit Phytagar (0,6% Gibco, 350mg/l Cefotaxin) wurden mit Paraffin verschlossen und unter den gleichen Bedingungen als Gewebespenderpflanzen gehalten. Dh Regenerationskeime wurden in den folgenden 2 bis 5 Wochen sichtbar.

Die Pflanzen mit 6 Blättern wurden mit einem direkten Strahl einiir Bromoxynitlösung auf die eingotopfte Pflanze besprüht. Jeder 10-cm-Topf enthielt eine Pflanze und erhielt 2,5ml Spray. DiePfl.»nzen wurden in einem Gewächshaus bei 25°C, 70% relativer Feuchtigkeit und einer Lichtperiode von 60 h gezüchtet. Des Wachstum wurde 9 Tage nach dom Besprühen durch Zählen der neuen Blätter, die länger als 0,5cm waren, bestimmt.

Herstellung einer klelnan Untereinheit einer Promotor-Bromoxynllgen-Chlmäre von Tabak zur Expression der Broinoxynll· spezifischen Nitrilen In Tabak Herstellung einer Tabak-ssu-Promotorkassette

Genom-Klone, die die kleine Tabakgen-Untereinheit enthielten, wurden aus einer EcoRI-Teil^-iom'jibliothek, die aus Nicotiana tabacum (Samsum)-DNA hergestellt wurde, isoliert. Die Klone wurden unter Verwendung eines Pstl-DNA-Segments mit 740 BP eines Klons einer kleinen Erbsen-cDNA-Untereinheit ausgewählt (Brogtie et al., „Proa Natl. Acid. Sei. USA", 78, S. 7304-7308 [19811). Eid 3,4-KS-EcoRI-Fragment, das eine Tabak-codierende Region und eine 5'-flankierende Sequenz enthielt, wurde aus einem Charon-32-Lambda-Phasenklon (3-8) in M 13mp 18 geklont (Yanisch-Perron et al., .Gene", 33, S. 103-119 (1985)). Dieser Unterklon wurde mit NSUE 2018 bezeichnet. Die Lokalisierung der TATA-Box (Promotor) und des mußmaßlichen ATG-Startcodons für das Protein der kleinen Untereinheit wurde durch DNA-Sequenzierung bestimmt. Eine einstranglge DNA-Schablone wurde aus NSUE 2018 hergestellt und zu einem Ring eines 25basigen einstrangigen synthetischen Oligomers (5'TGTTAATTACACTTTAAGACAGAAAd') geschlossen. Diese Sequenz ist zu den 25 Basen unmittelbar am 5'-Endo des mußmaßi'chen ATG der kleinen Tabakgen-Untereinheit komplementär. Der Primer wurde zur Horstellun j von doppelstrangigor DNA unter Verwendung des Klenow-Fragments von DNA-Polymerase I erweitert, mit Hindill zu einem doppalstrangige.i DNA-Fragment mit einem stumpfen Ende an einem Ende des Primers und dem Hindlll-Überhang am anderen Ende abgebaut. pUC 13 wurde mit Smal und Hindlll abgebaut, das oben hergestellte doppelstrangige DNA-Fragment wurde in den Polylinker eingebaut, wobei ein 4,1 KB-Plasmid mit der Bezeichnung pCGN625 entstand. pCGN625 wurde mit Hindlll abgebaut, mit dem Klonow-Fragment am stumpfen Ende verbunden, mit EcoRI abgebaut und in mit EcoRI-Smal gespaltenes pUC 18 eingebaut; es entstand ein 4,1 KB-Plasmid pCGN627. Ein 6,3KB-DNA-Segment wurde erhalton, das ein BamHI-Pstl-Fragment aus pACYC 177 (Chang und Cohen, .J. Bacteriol", 134, S. 1141-1156(1978)) enthielt, das an der Pstl-Stelle an ein Pstl-EcoRI-Fragment gebunden ist. das die ocs-3'-Region, 12823 BP (EcoRI) bis 10069 BP (Pstl) umfaßt (Barker et al., .Plant Molec. Biol.", 2, S. 335-350 [1984)). Das 6,3KB-DNA-Segmerit wurde in mit BamHI und EcoRI abgebautes pCGN 627 eingeführt, so daß die ocs-3'-Rigion zu dem Tabakssu-Fragment benachbart ist; es entstand ein 7,7KB-Plasmid pCGN630.

Dos pCGN63G-Plasmid wurde durch Abbau mit BamHI, Verknüpfen am stumpfen Ende mit dem Klenow-Fragment, Ringschluß, Abbau mit Kpnl, Verbinden am stumpfen Ende mit T4-Polymerase und Einbau von BamHI-Linkern, um eine BamHI-Stelle zur Vorfügung zu stellen, manipuliert. Das entstandene Plcwid pCGN 1509 wurde mit BgIII gespalten, am stumpfen Ende mit Klenow-Polymerase vnrbunden und mit Hindlll-Linkern verknüpft. Das entstandene Plasmid pCGN 1510 hat eine Hindlll-Stelle in der ocs-3'-Region und eine Hindlll-Stelle, die benachbart und außerhalb der Tabak-i-j-Region ist. pCGN 1510 wurde dann mit BamHI und Sstl abgebaut, wobei die Region zwischen der ssu-Rsgion und der ocs-3'-Region zerschnitten wird, und ein BamHI-Ssil-Fragment aus pBrx 25 so eingebaut, so daß es zwischen und in der richtigen Orientierung der ssu-Promotorregion und der ocs-3'-fcndregion ist. Das entstandene 8,9KBPIasmid wurde mit pBrx36 bezeichnet.

pBrx36 wurde mit Hindlll abgebaut und in mit Hindlll gespaltenes pCGN 783 zu pBrx39 und pBrx40 eingebaut, wobei des Nitrilasegen in entgegengesetzter bzw. gleicher Transkriptionsrichtung wie das Kanamycingen ist. Die Plasmide wurden in A. tumefaciens LBA4404 transformiert und dann mit zweikeimblättrigen Tabakpflanzen (Nicotiana tabacum cv. „Xanthi") cokultiviert. Die kanamyeinresistenten Schößlinge wurden in herkömmlicher Weise in Tabakpflnnzen regeneriert.

Phenotyp von transgenen Tabakpfianzen, die das Bromoxynil spezifische Nitrilasegen exprimieren.

ßlattgewebe aus trai ^formierten Tabakpflanzen (5 bis 6 Blätter) exprimierten das Nitrilasegen (bestimmt nach herkömmlicher Western-Analyse). Ein 5mm großes Blattstück aus oberflichensterilisierten (10% Hypochlorit, mit Wasser gewaschen) Blättern wurden in oinem Bromoxynil enthaltenden Medium unter photoautotrophen Bedingungen suspendiert. Die verwendeten Medien waren MS-Salze, die 0,93mg/l Naphthylessigsäure und 0,11 mg/l Ber.zylaminopurin und unterschiedliche Mengen an

Bromoxynil enthielten. Die Bromoxynil-Konzentration schwankte von 10"³ bis 10~^β mol/l bei 0,1 Verdünnungen. Die photoautotrophen Bedingungen waren 5% CO₂,10% O₂ und 85% N₂. Kontroll-Tabakblattabschnitte, die nicht transformiert worden sind, wurden mit 10"⁶ rrol/l Bromoxynii gebleicht (gehemmt). Im Gegensau dazu waren transformierte Blattabschnitte, die die Bromoxynil spezifische Nitrilase aus den Plasmiden pBrx39 und pBrx40 exprimierten, gegenüber 10~⁶ bzw. 10 '⁴ mol/l Bromoxynil resistant.

Phenotyp von transgensn Tomatenpflanzen, die das Brorr.oxynil spezifische Nltrllasegen exprimleren. Die Cokultivierung von zweikeimblättrigen Tomatenpflänzchen (Lycopersiccn esculentum cv. UC828) wurde, wie für Tabak beschrieben, durchgeführt, Kanamycin-Schößlinge wurden regeneriert. Das Blattgewebe aus transformierten Tomatenpflanzen (7 bis 10 Blätter) exprimierten das Nitrilaseprotein (bestimmt durch Standard-Western-Analyse). Etwa 5mm große Blattabschnitte aus oberflächensterilisierten (10% Hypochlorit, mit Wasser gewaschen) Blättern wurden in einem Bromoxynil enthaltenden Medium bei verschiedenen Konzentrationen unter photoautotrophen Bedingungen suspendiert. Die Medien waren MS-Salze, die 2mg/l 2,4-Dichloressigsäure, 1 mg/l Isopentyladenin, 100mg/l Myoinosit und 10~⁶oder 10"' mol/l Bromoxynil enthielten. Es wurden die gleichen photoautotrophen Bedingungen, wie oben für Tabak beschrieben, verwendet. Kontrollblattabschnitte, die nicht transformiert worden sind, wurden mit 10"' mol/l Bromoxynil gebleicht, während transformierte Pflanzen, Hie das Bromoxynil spezifische Nitrilasegen aus pBrx29 exprimierten, gegenüber 10~⁶ mol/l Bromoxynil resistent waren. Transgene Tomatenpflanzen (10 bis 20 Blätter) wurden mit einem handelsüblichen Bromoxynilpräparat (BUCTRIL) besprüht und waren bei einer Konzentration von 0,22 kg/0,4 ha (0,5 Ib/acre) resistent.

Herstellung einer modifizierten Nitrilase mit einem substituierten C-Encle Das Plasmid pBrx9 wurde mit Sphl abgebaut und wieder zum Ring geschlossen, so daß eine Deletion in der Codierregion am C-Ende des Nitrila&egens entstand. Die DNA-Sequenz aus pUC 18 ist im Leseraster mit der 3'-Sphl-Stelle der Nitrilase- Codierregion, wobei etwa 10 Codons zu einem TGA-Codon aus pUC 18 zugefügt werden. Die Anwesenheit der zusätzlichen 10 Codons ist zufällig und bestätigt die Tatsache, daß diese Codons entfernt werden können,

ohne daß die Nitrilaseaktivität wesentlich beeinflußt wird, wobei eine verkürzte Nitrilase entsteht.

Im folgenden wird die Sequenz mit den vorausgesagton Aminosäuren der am C-Ende modifizierten Nitrilase (nu-11} angegeben:

92 119

ATG GAC ACC ACT TTC AAA GCA GCC GCT GTT CAG GCC GAA CCG GTA TGG ATG GAT MET Asp Thr Thr Phe Lys Ala Ala Ala VaI Gin Ala GIu Pro VaI Trp MET Asp

146 173

GCC GCT GCA ACA GCC GAT AAG ACC GTG ACG CTA GTA GCT AAA GCC GCA GCG GCT Ala Ala Ala Thr Ala Asp Lys Thr VaI Thr Leu VaI Ala Lys Ala Ala Ala Ala

200 227

GGC GCG CAG CTC GTC GCA TTT CCC GAA TTG TGG ATT CCG GGC TAC CCA GGA TCC GIyAIa Gin Leu VaI Ala Phe Pro GIu Leu Trp lie Pro GIy Tyr Pro GIy Phe

254 281

ATG CTC ACG CAC AAC CAA ACC GAA ACC CTA CCA TTC ATC ATT AAA TAC CGC AAG MET Leu Thr His Asn Gin Thr GIu Thr Leu Pro Phe lie lie Lys Tyr Arg Lys

308 335

CAG GCA ATC GCC GCC GAT GGA CCA GAA ATC GAA AAA ATT CGC TGC GCG GCT CAG Gin Ala He Ala Ala Asp GIy Pro GIu He GIu Lys lie Arg Cys Ala Ala Gin

362 389

GAG CAT AAC ATT GCG CTC TCC TTT GGG TAC AGC GAA CGG GCT GGC CGT ACG CTC GIu His Asn He Ala Leu Ser Phe GIy Tyr Ser GIu Arg Ala GIy Arg Thr Leu

416 443

TAC ATG TCA CAA ATG CTT ATC GAT GCC GAT GGC ATC ACC AAA ATT CGT CGT CGA Tyr MET Ser Gin MET Leu He Asp Ala Asp GIy He Thr Lys He Arg Arg Arg

470 497

AAG CTC AAA CCA ACC CGC TTT GAA CGA GAA CTC TTT GGC GAA GGT GAC GGA TCG Lys Leu Lys Pro Thr Arg Phe GIu Arg GIu Leu Phe GIy GIu GIy Asp GIy Ser

524 551

GAC TTA CAG GTC GCC CAA ACT AGC GTT GGT CGG GTG GGT GCC CTC AAC TGC GCG Asp Leu Gin VaI Ala GIn Thr Ser VaI GIy Arg VaI GIy AIa Leu Asn Cys AIa

578 605

GAG AAT TTG CAG TCG CTA AAC AAG TTT GCG CTT GCT GCC GAG GGT GAA CAG ATA GIu Asn Leu GIn Ser Leu Asn Lys Phe AIa Leu Ala Ala GIu GIy GIu Gin lie

632 659

CAT ATC TCC GCC TGG CCA TTC ACG CTT GGA AGC CCT GTG CTC GTC GGA GAC TCC His He Ser Al.a Trp Pro Phe Thr Leu GIy Ser Pro VaI Leu VaI GIy Asp Ser

686 /13

ATC GlC GCC ATC AAC CAG GTC TAC GCG GCC GAG ACG GGG ACC TTC GTT CTC ATG He GIy Ala lie Asn Gin VaI Try Ala Ala GIu Thr GIy Thr Phe VaI Leu MET

740 767

TCG ACG CAG GTG GTT GGA CCG ACC GGC ATC GCC GCC TTC GAG ATC GGA GAC AGG Ser Thr Gin VaI VaI GIy Pro Thr GIy He Ala Ala Phe GIu lie GIu Asp Arg

794 821

TCA AAC CCG MT CAG TAT CTT GGT GGT GGG TAC GCG CGG ATC TAC GGG CCT GAC Tyr Asn Pro Asn GJn Tyr Leu GIy GIy GIy Tyr AIa Arg He Tyc GIy Pro Asp

848 875

ATG CAG TTG AAG AGC AAG TCG TTG TCA CCG ACC GAA GAG GGC ATC GTC TAC GCC MET Gin Leu Lys Ser Lys Ser Leu Ser Pro Thr GIu GIu GIy He VaI Tyr Ala

902 929

GAG ATC GAC CTG TCG ATG CTT GAG GCA GCA AAG TAC TCG CTC GAT CCC ACG GGC GIu He Asp Leu i,er MET Leu GIu Ala AIa Lys" Tyr Ser Leu Asp Pro Thr GIy

956 983

CAC -TAT TCG CGC CCT GAT GTG TTC AGC GTG TCG ATT AAC CGG CAA CGG CAG CCT His Tyr Ser Arg Pro Asp VaI Phe Ser VaI Ser He Asn Arg GIn Arg GIn Pro

1010 1037

GCG GTG TCA GAA GTT ATC GAC TCA AAC GGT GAC GAG GAC CCG AGA GCA GCA TGC Ala VaI Ser GIu VaI lie Asp Ser Asn GIy Asp GIu Asp Pro Arg Ala AIa Gys

1064 1091

AAG CTT GGC ACT GGC CGT TTT ACA ACG TCG TGA CTG GGA AAA CCC TGG CGT TAC Lys Leu GIy Thr GIy Arg Phe Thr Thr Ser . Leu GIy Lys Pro Trp Arg Tyr

513 540

TTA CAG GTC GCC CAA ACT AGC GTT GGT CGG GTG GGT GCC CTC AAC TGC GCG GAG Leu Gin VaI Ala GIn Thr Ser VaI GIy Arg VaI GIy AIa Leu Asn Cys Ala GIu

567 594

AAT TTG CAG TCG CTA AAC AAG TTT GCG CTT GCT GCC GAG GGT GAA CAG ATA CAT Asn Leu GIn Ser Leu Asn Lys Phe AIa Leu Ala Ala GIu GIy GIu Gin lie His

621 648

ATC TCC GCC TGG CCA TTC ACG CTT GGA AGC CCT GTG CTC GTC GGA GAC TCC ATC He Ser AIa Trp Pro Phe Thr Leu GIy Ser Pro VaI Leu VaI GIy Asp Ser He

675 702

GGC GCC ATC AAC CAG GTC TAC GCG GCC GAG ACG GGG ACC TTC GTT CTC ATG TCG GIy Ala He Asn Gin VaI Tyr Ala Ala GIu Thr GIy Thr Phe VaI Leu MET Ser

729 756

ACG CAG GTG G^T GGA CCG ACC GGC ATC GCC GCC TTC GAG ATC GAA GAC AGG TAC Thr Gin VaI VaI GIy Pro Thr GIy He Ala AIa Phe GIu He GIu Asp Arg Tyr

783 810

AAC CCG AAT CAG TAT CTT GGT GGT GGG TAC GCG CGG ATC TAC GGG CCT GAC ATG Asn Pro Asn GIn Tyr Leu GIy GIy GIy Tyr AIa Arg He Tyr GIy Pro Asp MET

837 864

CAG TTG AAG AGC AAG TCG TTG TCA CCG ACC GAA GAG GGC ATC GTC TAC GCC GAG GIn Leu Lys Ser Lys Ser Leu Ser Pro Thy GIu GIu GIy lie VaI Tyr Ala GIu

891 918

ATC GAC CTG TCG ATG CTT GAG GCA GCA AAG TAC TCG CTC GAT CCC ACG GGC CAC lie Asp Leu Ser MET Leu GIu Ala AIa Lys Tyr Ser Leu Asp Pro Thr GIy His

945 972

TAT TCG CGC CCT GAT GTG TTC AGC GTG IlG ATT AAC CGG CAA CGG CAG CCT GCG Tyr Ser Arg Pro Asp VaI Phe Ser VaI Ser He Asn Arg GIn Arg Gin Pro AIa

999 1026

GTG TCA GAA GTT ATC GAC TCA AAC GGT CAC GAG GAC CCG AGA GCA GCA TGC GAG VaI Ser GIu VaI He Asp Ser Asn GIy Asp GIu Asp Pro Arg Ala Ala Cys GIu

1053 1080

CCC GAC GAG GGG GAT CGT GAG GTC GTA ATC TCT ACG GCA ATA GGG GTT CTA CCC Pro Asp GIu GIy Asp Arg GIu VaI VaI lie Ser Thr Ala He GIy VaI Leu Pro

1107 1134

CGT TAT TGC GGA CAT TCC TAA TAA AAA GAG ACA CGT TGT ACC AAA GGG GTG TTC Arg Tyr Cys GIy His Ser . . Lys GIu Thr Arg Cys Thr Lys GIy VaI Phe

1161 1188

ATI'· TCC AGA CGC AGA AAA TAT AGC CCA GAG TTA AAA CGC GAA GCC ATC GCT TTA MET Ser Arg Arg Arg Lys Try Ser Pro GIu Leu Lys Arg GIu Ala He AIa Leu

1215

ACC CGT C Thr Arg His

Herstellung einer modifizierten Nitrilate mit einem substituierten N-Ende

Das Plasmid pBrx9 wurde mit BamH 1 abgebaut und anschließend mit Bal31 etwa 5 min zur Entfernung von etwa 51 Nukleotiden zerschnitten. Das Enzym wurde Inaktiviert, die zerschnittene lineare DNA-Sequenz wurde mit BamH 1-Linkern verbunden, mit BamH 1 abgebaut und unter Verknüpfungsbedingungen zum Ring geschlossen. Das entstandene Plasmid pBrx 15 enthielt etwa 5,1 KB und eine geringere Anzahl an Codons am 5'-Ende. pBrx 15 wurde mit Hincl teilabgebaut, so daß es an der Hinc-Stelle stromabwärts von der Codierregion für die Nitrilase zerschnitten wurde, und mit BamH 1 vollständig abgebaut, wobei ein Fragment entstand, in dem die Codierregion für die Nitrilase am 5'-Ende verkürzt war. Dieses Fragment wurde in pCGN iingebaut, das vollständig mit BamH 1 und Smal abgebaut worden war; dabei entstand das Plasmid pBrx 23 mit 3,7 KB. Das Plasmid pCGN566 ist ein Derivat von pUC 13 mit Polylinkern aus pUC 18 und pUC 19 und einem Chloramphenicol-Resistenzgen.

Das Fragment aus pBrx 15 wird in das Leseraster mit einem stromaufwärts gerichteten Anfangscodon eingebaut, dabei ersetzen 17 von der pUC 19-Sequenz codierte Aminosäuren die Aminosäuren der natürlich vorkommenden Nitrilase.

Aufgrund dieser Sequenz behält die Nitrilase ihre Aktivität sowohl mit einer längeren Aminosäuresequenz am N-Ende als auch nach Verkürzung dieser N-terminalen Sequenz oder Substitution der natürlich vorkommenden Aminosäure der N-terminalen Sequenz mit anderen Aminosäuren.

Im folgenden wird die Sequenz der N-terminal-modifizierten Nitrilase (nit-23) angegeben:

27 54

ATG ACC ATG ATT ACG CCA AGC TTG CAT GCC TGC AGG TCG ACT CTA GAG GAT CCG MET Thr MET He Thr Pro Ser Leu His Ala Cys Arg Ser Thr Leu GIu Asp Pro

S-I 108

GAC ACC ACT TTC AAA GCA GCC GCT GT.T CAG GCC. GAA CCG GTA TGG ATG GAT GCC Asp Thr Thr Phs Lys Ala Ala Ala VaI Gin Ala GIu Pro VaI Trp MET Asp Ala

135 162

GCT "GCA ACA Gd' GAT AAG ACC GTG ACG CTA GTA GCT AAA GCC GCA GCG GCT GGC Ala Ala Thr Ala Asp Lys Thr VaI Thr Leu VaI Ala Lys Ala Ala Ala Ala GIy

189 216

GCG CAG CTC GTC GCA TTT CCC GAA TTG TGG ATT CCG GGC TAC CCA GGA TTC ATG Ala Gin Leu VaI Ala Phe Pro GIu Leu Trp lie Pro GIy Tyr Pro GIy Phe MET

243 270

CTC ACG CAC AAC CAA ACC GAA ACC CTA CCA TTC ATC ATT AAA TAC CGC AAG CAG Leu Thr His Asn Gin Thr GIu Thr Leu Pro Phe lie lie Lys Tyr Arg Lys GIn

297 324

GCA ATC GCC GCC GAT PGA CCA GAA ATC GAA AAA ATT CGC TGC GCG GCT CAG GAG Ala He Ala Ala Asp GIy Pro GIu lie GIu Lys lie Arg Cys Ala Ala Gin GIu

351 378

CAT AAC ATT GCG CTC TCC TTT GGG TAC AGC GAA CGG GCT GGC CGT ACG CTC TAC His Asn He AIa Leu Ser Phe GIy Tyr Ser GIu Arg Ala GIy Arg Thr Leu Tyr

405 432

ATG TCA CAA ATG CTT ATC GAT GCC GAT GGC ATC ACC AAA ATT CGT CGT CGA AAG MET Ser GIn MET Leu lie Asp Ala Asp GIy lie Thr Lys He Arg Arg Arg Lys

459 Λ86

CTC AAA CCA ACC CGC TTT GAA CGA GAA CTC TTT GGC GAA GGT GAC GGA TCG GAC Leu Lys Pro Thr Arg Phe GIu Arg GIu Leu Phe GIy GIu GIy Asp GIy Ser Asp

513 540

TTA CAG GTC GCC CAA ACT AGC GTT GGT CGG GTG GGT GCC CTC AAC TGG GCG GAG Leu Gin VaI AIa Gin Thr Ser VaI GIy Arg VaI GIy AIa Leu Asn Cys Ala GIu

567 594

AAT TTG CAG TCG CTA AAC AAG TTT GCG CTT GCT GCC GAG GGT GAA CAG ATA CAT Asn Leu GIn Ser Leu Asn Lys Phe AIa Leu Ala Ala GIu GIy GIu Gin lie His

621 648

ATC TCC GCC TGG CCA TTC ACG CTT GGA AGC CCT GTG CTC GTC GGA GAC TCC ATC He Ser AIa Trp Pro Phe Thr Leu GIy Ser Pro VaI Leu VaI GIy Asp Ser He

675 702

GGC GCC ATC MC CAG GTC TAC GCG GCC GAG ACG GGG ACC TTC GTT CTC ATG TCG GIy Ala lie Asn Gin VaI Tyr Ala Ala GIu Thr GIy Thr Phe VaI Leu MET Ber

729 756

ACG CAG GTG GTT GGA CCG ACC GGC ATC GCC GCC TTC GAG ATC GAA GAC AGG TAC Thr Gin VaI VaI GIy Pro Thr GLy lie Ala Ala Phe GIu He GIu Asp Arg Tyr

783 810

AAC CCG AAT CAG TAT CTT GGT GGT GGG TAC GCG CGG ATC TAC GGG CCT GAC ATG Asn Pro Asn GIn Tyr Leu GIy GIy GLy Tyr AIa Arg lie Tyr GIy Pro Asp MET

837 86/4

CAG TTG AAG AGC AAG TCG TTG TCA CCG ACC GAA GAG GGC ATC GTC TAC GCC GAG

Gin Leu Lys Ser Lys Ser Leu Ser Pro Thr GIu GIu GIy lie VaI Tyr Ala GIu

891 918

ATC GAC CTG TCG ATG CTT GAG GCA GCA AAG TAC TCG CTC GAT CCC ACG GGC CAC

lie Asp Leu Ser MET Leu GIu Ala Ala Lys Tyr -Ser Leu Asp Pro Thr GIy His

945 972

TAT TCG CGC CCT GAT GTG TTC AGC GTG TCG ATT AAC CGG CAA CGG CAG CCT GCG

Tyr Ser Arg Pro Asp VaI Phe Ser VaI Ser lie Asn Arg Gin Arg Gin Pro Ala

999 1026

GTG TCA GAA GTT ATC GAC TCA AAC GGT GAC GAG GAC CCG AGA GCA GCA TGC GAG

VaI Ser GIu VaI He Asp Ser Asn GIy Asp GIu Asp Pro Arg Ala Ala Cys GIu

1053 1080

CCC GAC GAG GGG GAT CGT GAG GTC GTA ATC TCT ACG GCA ATA GGG GTT GTA CCC

Pro Asp GIu GIy Asp Arg GIu VaI VaI He Ser Thr Ala He GIy VaI Leu Pro

1107 1134

CGT TAT TGC ',GA CAT TCC TAA TAA AAA GAG ACA CGT TGT ACC AAA GGG GTG TTC

Arg Tyr Cy; GIy His Ser Lys GIu Thr Arg Cys Thr Lys GIy VaI Phe

1161 1188

ATG TCC AGA CGC AGA ΛΑΑ TAT AGC CCA GAG TTA AAA CGC GAA GCC ATC GCT TTA

MET Ser Arg Arg Arg Lys Tyr Ser Pro GIu Seu Lys Arg GIu Ala He AIa Leu

1215

ACC CGT C Thr Arg His

Reinigung des Wildtyps und der modifizierten Nitrile»e

Nitrilase wurde aus E. coli MM 294-Zellen in der stationären Phase.- die pBrx 9, pBrx 11 oder pBrx 28-Plasmide enthielten, erhalten.

Die Kulturen wurden unter Amplcillin-Selektion gezüchtet, bis die Bestimmung auf Nitrilase in den Gesamtzellen einen OD_M0-Wert von etwa 2,0 zeigten. Die Kulturen wurden bei 8000g 15min bei 4⁰C zentrifugiert. Die Zellen wurden in 0,1 mol/l Kaliumphosphatpuffer, pH 7,4 gewaschen, zu Kügelchen geformt, getrocknet und bei -2O⁰C gefroren. Die Kügelchen wurden bei 4'C aufgetaut und in 40ml 50mol/l Kaliumphosphatpuffer, 1 mmol/l Dithiothreit und 0,1 mmol/l EDTA (KDE) wieder suspendiert. Dia Zellsuspension wurde durch eine französische Presse geleitet und bei 60000g 40min bei 4°C zentrifugiert. Der

ÜDeretand (Rohextrakt) wurde mit KDE-Puffer auf eine Proteinkonzentration von 12mg/ml (Fraktion I) verdünnt. Der Rohextrakt wurde mit Ammoniumsulfat fraktioniert, die 25- bis 35-%-Fraktion (Fraktion II) enthielt 85% der Nitrilaseaktivität. Diese Fraktion wurde in 10ml KDE-Puffer suspendiert und ausgiebig gegen diesen Puffer dialysiert.

Die Fraktion Il wurde weiter in einer DEAE-Sephadex A-50-Säule (4,9cm² χ 40cm), die in KDE-Puffer equilibriert worden ist, gereinigt. Der Nitrilasegipfel wurde mit einem NaCI-Gradienten von 0,1 bis 0,4 mol/l in KDE-Puffer eluiert. Die aktiven Fraktionen wurden gesammelt (Fraktion III), mit Ammoniumsulfat ausgefällt und in 25 mmol/l Histidin, pH 6,2, dialysiert. Eine Pharmacia-Chromatofokussier-Säule (1,75cm² x 20cm) wurde mit Polypuffer 94 Austauschharz (PBE 94), das mit 25 mmol/l Hisiidin, pH 6,2, equlibriert worden ist, hergestellt. Die Säule wurde zuerst mit Polypuffer 74, pH 4.0 zur Herstellung eines pH-Gradienten von 6 bis 4 gewaschen, dann wurde das Enzym mit 1 mmol/l NaCI eluiert. Dei die aktiven Enzymfraktionen enthaltende Gip fei wurde mit Ammoniumsulfat ausgefällt und in KDE (Fraktion IV) dialysiert. SDS-PAGE auf einem 11,25%igen Gel zeigte eine starke Bande bei einer Molekülmasse von etwa 37000 und eine schwache Verunreinigung bei einer .Molekülmasse von etwa

70000.

Die Überprüfung mit dem Densitometer zeigt, daß das Nitrilasepräparat uer Fraktion IV zu 99% homogen ist.

In der folgenden Tabe'le sind die Ergebnisse der Reinigung und die Eigenschaften der gereinigten Nitrilaseprodukte angegeben.

Vergleich der Reinigung und der Eigenschaften das Wildtyps und der modifizierten Bromoxynil spezifischen

Nitrilasen

nit-».vt nit-11 nit-23

Ammoniumsulfat-Fraktion 25-35%

DEAE-Sephadex-Elution 270 mmol/l ChromatofokussierendoElution,pH6-4-Gradient, 1 mol/l

mit 1 mol/l NaCI gewaschen NaCI

Spezifische Aktivität 25,7

Reinigung (x) 10,3

Km (mol/l) 0,31

Vmax(Mmol/min/mg) 15

Aktive Enzymform dimer

Nach den oben angegebenen Verfahren können Pflanzen erhalten werden, die Bromoxynil resistent sind und im Feld in Gegenwart von Bromoxynil verwendet werden können, ohne daß ihr Wachstum beeinträchtigt wird.

Erfindungsgemäß ist es nun möglich, die Pflanzen dadurch zu verbessern, daß sie gegenüber Herbiziden und insbesondere gegenüber spezifischen Benzonitril-Herbiziden resistent gemacht werden. Das heißt, das die Nitrilase codierende Gen kann in einen Pflanzenwirt eingeführt werden, wodurch das Gen exprimiert wird und der Pflanze Benzonitril-Resistenz verleiht.

Zusätzlich kann das Enzym durch Klonen des Gens in einem geeigneten bakteriellen Wirt, in dem das Enzym exprimiert wird, produziert werden. Enzyme mit einer zu überprüfenden Aktivität finden vitrlei Anwendungen, z. B. in Versuchen zum Nachweis bestimmter Substanzen oder des Benzonitrilsubstrats. Außerdem können die Enzyme und die die Enzyme exprimierendon Bakterien zur Entfernung der Benzonitril-Herbizide aus verunreinigten Böden eingesetzt werden.

Obwohl die Erfindung eingehend erläutert und die Beispiele zum Verständnis angegeben worden sind, können gewisse

Änderungen und Modifikationen innerhalb des Schutzumfangs der Ansprüche erfolgen.

E. coli MM 294 (pBrxS) wurde bei A.T.C.C. am 22. Januar 1986unter der Hinterlegungsnummer 53435 hinterlegt.

E. coli MM 294 (pBrx 11) wurde bei A.T.C.C. am 18. Juni 1087 unter der Hinterlegungsnummer 67441 hinterlegt.

E. coli MM 294 (pBrx23) wurde bei A.T.C.C. am 18. Juni' 987 unter der Hinterlegungsnummer 67442 hinterlegt.

10-25%	20-35%
150 mmol/l	290 mmol/l
	1 mol/l
pH 4,6	NaCI
55	19,7
16,4	35,8
0,05	0,11
36	9
multimer	dimer

Claims (6)

1. VQn Bakterienzellbestandteilen praktisch freie Zusammensetzung für den Pflanzenschutz, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine Nitrilmasse aus Bakterien mit etwa 34 KDaI, die im wesentlichen für 3,5-dihalogeniertes p-Hydroxybenzonitril spezifisch ist und eine spezifische Aktivität von mindestens etwa 0,1 μιηοΙ Nh^/min/mg Protein rnit Bromoxynil als Substrat aufweist und zumindest einen Träger und/oder ein Verdünnungsmittel enthält.

2. Zusammensetzung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Bakterien-Nitrilase eine spezifische Aktivität von mindestens 0,5 μιηοΙ NH₃/min/mg Protein aufweist.

3. Zusammensetzung nach Anspruch 1 mit einer spezifischen Aktivität von mindestens etwa 0,1 μητιοΙ NH₃/min/mg Protein mit Bromoxynil als Substrat.

4. Zuammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine praktisch reine, modifizierte Nitrilase aus Bakterien mit etwa 34 KDaI, die im wesentlichen für 3,5-clihalogeniertes p-Hydroxybenzonitril spezifisch ist, eine spezifische Aktivität von mindestens etwa 0,1 μηιοΙ NH₃/min/mg Protein mit Bromoxynil als Substrat aufweist und durch mindestens eine Substitution, Abspaltung oder Extension von insgesamt nicht mehr als etwa 50 Aminosäuren modifiziert worden ist, sowie zumindest einen Träger und/oder ein Verdünnungsmittel enthält.

5. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die praktisch reine Nitrilase aus Klebsieila stammt.

6. Verfahren zur Gewinnung einer für 3,5-dihalogeniertes p-Hydroxybenzonitril spezifischen Nitrilase für eine Zusammensetzung für den Pflanzenschutz, dadurch gekennzeichnet, daß K. ozaenae, daß eine für 3,5-dihalogeniertes p-Hydroxybenzonitril spezifische Nitrilase produziert, isoliert wird, K.ozaenae in einem entsprechenden Medium gezüchtet und K.ozaenae lysiert und die Nitrilase isoliert wird.