DE69333980T2

DE69333980T2 - Auslöser von überempfindlichkeitsreaktionen in pflanzen

Info

Publication number: DE69333980T2
Application number: DE69333980T
Authority: DE
Inventors: V. Steven Ithaca BEER; Zhong-Min Ithaca WEI; W. David Ithaca BAUER; Alan Ithaca COLLMER; Sheng-Yang Ithaca HE; Ron Ithaca LABY
Original assignee: Cornell Research Foundation Inc
Current assignee: Cornell Research Foundation Inc
Priority date: 1992-07-01
Filing date: 1993-06-30
Publication date: 2006-10-05
Anticipated expiration: 2013-07-01
Also published as: EP1357189A3; ATE317438T1; JPH07509604A; EP0648266A1; EP1357189B1; DE69333980D1; DE69334354D1; US6174717B1; ES2256836T3; US5849868A; EP0648266A4; EP0648266B1; PT1357189E; WO1994001546A1; ATE505546T1; EP1357189A2; ES2362721T3

Description

Pflanzen, sowie Menschen und Tiere, erleiden auf Grund von Infektion durch Bakterien Verletzung und Verluste. Auf einer weltweiten Grundlage sind Bakterien, die in die Klassen Erwinia, Pseudomonas und Xanthomonas eingestuft werden, für die meisten Verluste verantwortlich, die auf bakterielle Pflanzenpathogene zurückzuführen sind. Viele der bakteriellen Krankheiten von Pflanzen verursachen Landwirten auf einer sporadischen Basis große Verluste. Die Verluste ergeben sich aus dem Absterben, Verunstaltung oder verringerter Produktivität der betroffenen Pflanzen.
Viele bakterielle Pathogene der Pflanzen zeigen einen merklichen Grad der Spezifität in Richtung der Pflanzen, die sie infizieren. Zum Beispiel infiziert Erwinia amylovora Äpfel, Birnen und verwandte Pflanzen der Familie Rosaceae. Andere Pflanzen werden nicht krank, wenn sie E. amylovora ausgesetzt sind. Jedoch kollabiert, wenn ausreichende Zellen von E. amylovora in das Blattgewebe der anderen Pflanzen eingebracht werden, das Mesophyllgewebe innerhalb von Stunden. Dieser Kollaps ist Überempfindlichkeitsreaktion (HR) genannt worden, und sie gilt als eine Verteidigungsreaktion der Pflanzen, weil während der HR die Bakterien innerhalb des kollabierten Gewebes abgegrenzt sind, schließlich sterben und folglich nicht viel Schaden an der Pflanze als Ganzes verursachen.
Die Gene, die bakterielle Pflanzenpathogene für die HR-auslösende Fähigkeit benötigen, werden hrp-Gene genannt, für die Überempfindlichkeitsreaktion und Pathogenität werden auch für das Verursachen von Krankheit benötigt. Jedoch blieben die Produkte der hrp-Gene und wie sie funktionieren bei der Auslösung der HR und bei der Krankheitsentwicklung vor der vorliegenden Erfindung unbekannt. Die vorliegende Erfindung betrifft Produkte von hrp-Genen (Auslöser), die für den Kollaps verantwortlich sind, der in der HR gesehen wird, und die für die Krankheitsentwicklung benötigt werden.
Wechselwirkungen zwischen bakteriellen Pathogenen und ihren Pflanzenwirten fallen allgemein in zwei Kategorien: (1) kompatibel (Pathogen-Wirt), führt zu interzellulärem Bakterienwachstum, Symptomentwicklung und Krankheitsentwicklung in der Wirtspflanze; und (2) inkompatibel (Pathogen-Nichtwirt), was Überempfindlichkeitsreaktion zur Folge hat, wobei eine bestimmte Art von inkompatibler Wechselwirkung auftritt, ohne progressive Krankheitssymptome. Während der kompatiblen Wechselwirkungen an Wirtspflanzen nehmen Bakterienpopulationen drastisch zu und treten progressive Symptome auf; während der inkompatiblen Wechselwirkungen nehmen Bakterienpopulationen nicht zu, und treten progressive Symptome nicht auf.
Die Überempfindlichkeitsreaktion höherer Pflanzen ist durch den schnellen, lokalisierten Kollaps und Absterben der Gewebe gekennzeichnet, die ein inkompatibles Pathogen enthalten (einen Mikroorganismus, der nur zu anderen Pflanzen pathogen ist), und ist mit der Verteidigung der Pflanzen gegen viele Bakterien, Pilze, Nematoden und Viren verbunden [siehe Phytopathogene Prokaryotes, (M.S. Mount und G.H. Lacy Hrsg.) Academic Press, New York. S. 149–177 (1982)]. Hervorrufen der Überempfindlichkeitsreaktion durch Bakterien wurde zuerst 1963 dargelegt, als die interzellulären Räume von Tabakblättern mit 10⁷ Zellen/ml eines inkompatiblen Pathogenes infiltriert wurden. Die infiltrierten Bereiche kollabierten innerhalb von 24–48 Stunden und hörten auf, die Bakterienvermehrung zu unterstützen [siehe Nature 199:299 (1963)]. Folglich wird bei der HR das Pathogen lokalisiert, und weiteres Wachstum wird eingeschränkt.
Die Technik, die im Labor verwendet wird, um die HR darzulegen, ist einfach. Die interzellulären Räume von Tabakblättern werden durch Durchbohren eines Sektors an einem Blatt mit einer gewöhnlichen geraden Dissektionsnadel infiltriert. Dann wird eine Spritze mit einer Kapazität von 1 ml (ohne eine Nadel), die 0,1–0,5 ml einer Bakterienzellsuspension (normalerweise 10⁷–10⁸ lebensfähige Zellen/ml) von Bakterien enthält, gegen eine Seite des Blattes direkt über dem Durchstoß gedrückt. Während des Pressens eines Fingers auf die gegenüberliegende Seite des Blattes, um es zu stabilisieren und zu verhindern, dass Flüssigkeit aus dem durchbohrten Bereich herausläuft, wird der Spritzenkolben leicht gedrückt, um die Bakteriensuspension in das Blatt einzubringen. Die Infiltration gilt als erfolgreich, wenn ein Wasser-getränkter, ungefähr 1–4 cm² großer Bereich im Blatt erscheint.
Eine häufige Hypothese, die vorgeschlagen wird, um den Mechanismus der Überempfindlichkeitsreaktionsinduktion zu erklären, schließt die Produktion eines spezifischen Auslösers durch Bakterien ein, der mit einem spezifischen Rezeptor auf der Pflanzenzelle reagiert. Jedoch war die molekulare Grundlage (Gen und Genprodukt) für diese Antwort auf mögliche Pathogene vor der vorliegenden Erfindung trotz anhaltender Forschung durch Pflanzenpathologen unbekannt gewesen, weil die HR zuerst 1963 beschrieben wurde.
Physiologische und genetische Beobachtungen legen nahe, dass derselbe Bakterienfaktor, der die Überempfindlichkeitsreaktion in Nichtwirten auslöst, auch für die Pathogenität in Wirten benötigt wird.
Die Produktion des Auslösers der Überempfindlichkeitsreaktion wird durch einen Cluster von mehreren hrp-Genen reguliert, welche unter vielen Spezies von pflanzenpathogenen Bakterien hochkonserviert und häufig austauschbar sind. Obwohl einzelne und mehrere hrp-Gene durch andere kloniert worden sind, sind funktionelle Cluster von hrp-Genen nur aus Erwina amylovora und Pseudomonas syringae kloniert worden. Es ist gezeigt worden, dass diese Cluster nichtpathogenen Bakterien die Fähigkeit verleihen, die Überempfindlichkeitsreaktion in Tabak- und anderen Blättern auszulösen [siehe Mol. Plant-Microbe Interact. 4:132 (1991); J. Bacteriol 170:4748 (1988); und Beer et al., Advances in Molecular Genetics of Plant-Microbe Interactions (H. Hennecke und D.P.S. Verma Hrsg.) Kluwer Academic Publishers, Boston, S. 53–60 (1991)].
Gemäß eines ersten Gesichtspunkts der Erfindung stellen wir ein isoliertes Protein bereit, welches in der Lage ist, eine Überempfindlichkeitsreaktion in verschiedenen Pflanzenarten auszulösen, wenn das Protein unter normalen Pflanzenwachstumsbedingungen in Blattgewebe einer Pflanze eingebracht wird, wobei das Protein durch eine Nukleinsäuresequenz kodiert wird, die in der Lage ist, an eine Nukleinsäure mit der SEQ ID NR. 4 unter stringenten Bedingungen von 0,4 × SSC, 0,2% SDS Waschen bei 65°C zu hybridisieren.
Gemäß eines zweiten, alternativen Gesichtspunkts der Erfindung wird ein isoliertes biologisch aktives Peptid aus der Gruppe, bestehend aus

einer ähnlichen Sequenz mit mindestens einer Aminosäureaddition daran, einer ähnlichen Sequenz mit mindestens einer Aminosäuredeletion daran, einer ähnlichen Sequenz mit mindestens einer Aminosäuresubstitution daran und einer ähnlichen Sequenz mit mindestens einer Aminosäureinsertion daran, mit der Maßgabe, dass eine derartige Addition, Deletion, Substitution und Insertion die biologische Aktivität der 385 Aminosäuren Sequenz nicht hemmt, bereitgestellt.
Es wird hier ein Verfahren zum Verändern der Krankheit oder der Überempfindlichkeitsreaktion in einer Pflanze beschrieben, welches das Bereitstellen der Pflanze mit einem Inhibitor des Harpin-Auslösers und das Umsetzenlassen des Inhibitors mit dem Harpin-Auslöser umfasst.
Wir stellen gemäß eines dritten und alternativen Gesichtspunkts der Erfindung ein Gen zur Insertion in einen geeigneten Wirt bereit, um die Expression von Harpin zu ermöglichen, welches aus einer Nukleinsäuresequenz besteht, ausgewählt aus der folgenden Gruppe:
einer ähnlichen Sequenz mit mindestens einer Nukleinsäureaddition daran, einer ähnlichen Sequenz mit mindestens einer Nukleinsäuredeletion daran, einer ähnlichen Sequenz mit mindestens einer Nukleinsäuresubstitution daran und einer ähnlichen Sequenz mit mindestens einer Nukleinsäureinsertion daran, in Kombination mit einem Vektor zur Insertion der Sequenz in den geeigneten Wirt und mit der Maßgabe, dass eine derartige Addition, Deletion, Substitution und Insertion die biologische Expression von Harpin hemmt.
Gemäß eines vierten (und alternativen) Gesichtspunkts der vorliegenden Erfindung wird ein isoliertes DNA-Molekül bereitgestellt, das ein Peptid gemäß des ersten Gesichtspunkts der Erfindung kodiert.
Gemäß fünfter und sechster Gesichtspunkte der vorliegenden Erfindung stellen wir ein Expressionssystem und eine Wirtszelle bereit, die ein DNA-Molekül gemäß des fünften Gesichtspunkts der Erfindung enthält.
Der Auslöser der Überempfindlichkeitsreaktion wurde zuerst aus E. coli DH5ɑ(pCPP430) und später aus einem Wildtypstamm von E. amylovora, dem Bakterium, das eine Krankheit von Rosengewächsen, wie Apfel und Birne, verursacht, bekannt als Feuerbrand, isoliert und gereinigt. Der Name „Harpin" ist für den Auslöser der Überempfindlichkeitsreaktion aus E. amylovora vorgeschlagen; dieses Auslöser wird als der Archetypus für eine Familie von proteinartigen HR-Auslösern betrachtet, die durch viele verschiedene phytopathogene Bakterien produziert werden.
Wir beschreiben hier spezifische Auslöserproteine, die aus Bakterien isoliert werden, welche, wenn sie auf Nichtwirtspflanzen aufgebracht werden, eine toxische Reaktion verursachen, die ähnlich der Reaktion ist, die durch lebende Zellen der Bakterien ausgelöst wird, die die Proteine produzierten. Wir beschreiben auch die Isolierung und Charakterisierung der Gene, die die Auslöserproteine kodieren, welche verwendet werden könnten, um zu bewirken, dass Pflanzen oder andere Organismen das Auslöserprotein produzieren, welches seine toxischen Wirkungen in einer exakten regulierten Art und Weise ausüben würde.
Unsere Arbeit berücksichtigt eine ausreichende Charakterisierung und Identifizierung dieser Proteine, um Entwurf und Entwicklung von Techniken zu ermöglichen, die diese Proteine inaktivieren, zerstören oder binden. Dies ist wünschenswert, weil es bekannt ist, dass dieselben Proteine von den Bakterien benötigt werden, die sie produzieren, um eine Krankheit in Wirtspflanzen der Bakterien zu verursachen. Das Neutralisieren der toxischen Wirkungen der Proteine neutralisiert ihre Rollen bei der Krankheit und verringert die Krankheit in Pflanzen.
Wir fassen ins Auge, dass es möglich ist, Antikörper gegen diese Proteine zu entwickeln, die produzierten Antikörper zu sequenzieren, Nukleinsäuresequenzen zu konstruieren, welche, wenn sie richtig in das Genom einer Pflanze insertiert werden, bewirken würden, dass die Pflanze den Antikörper exprimiert und folglich die Bakterien daran hindert, eine Krankheit in den Pflanzen zu verursachen.
Wir beschreiben die Identifizierung eines bestimmten hrp-Gens des hrp-Genclusters von Erwinia amylovora. Jenes bestimmte Gen wird transkribiert und translatiert, um den proteinartigen Auslöser der Überempfindlichkeitsreaktion zu liefern. Ein anderer Teil der vorliegenden Beschreibung beschäftigt sich mit der Identifizierung von homologen Genen aus Erwinia-, Xanthomonas- und Pseudomonas-Spezies, die dem HR-Auslöser aus E. amylovora ähnliche Proteine kodieren. Vor unserer Arbeit ist von der Isolierung eines proteinartigen Auslösers der Überempfindlichkeitsreaktion nicht berichtet worden. Wir stellen deshalb eine Beschreibung von Techniken zur Isolierung und Reinigung eines proteinartigen Auslösers der Überempfindlichkeitsreaktion bereit. Wir beschreiben auch die genetischen Manipulation der Gene bereit, welche die HR-auslösenden Proteine kodieren, um die Produktion von Harpin zu erhöhen.
Deshalb kann zusammengefasst werden, dass die Erfindung in ihren verschiedenen Gesichtspunkten das Bereitstellen einer Prophylaxe gegen Erwinia amylovora, dem verursachenden Mittel von Feuerbrand von Apfel, Birne und anderen Rosengewächsen, betrifft. Außerdem betrifft die vorliegende Erfindung in ihren verschiedenen Gesichtspunkten weitgehend das Bereitstellen einer Prophylaxe vor Bakterien der Gattungen Erwinia, Pseudomonas und Xanthomonas, welche andere Krankheiten einer Vielzahl von Pflanzen verursachen.

Die folgenden Begriffe, die die Bakterienstämme, Cosmide und Plasmide betreffen, die sich auf die Beschreibung der vorliegenden Erfindung beziehen, werden bereitgestellt.

DH5a	ein Laborstamm von Escherichia coli, der routinemäßig zum Klonieren verwendet wird;
Ea321	Wildtypstamm von Erwinia amylovora, von welchem alle Mutanten und Klone abgeleitet sind;
Ea321T143	Hrp-Mutante, die das Transposon Tn5 enthält, das verwendet wurde, um eine Cosmid-Genbank (im pCPP9-Vektor) zur Wiederherstellung der Hrp-Funktion abzusuchen. Dieses Absuchen hatte die Identifizierung von Cosmid pCPP430 zur Folge. (diese Mutante weist eine Insertion in einem der hrp-Gene, nicht hrpN, auf; die Wirkung der Insertion ist es, die Expression von Harpin durch Mutagenese des Operons zu verhindern).

Ea321K49	Hrp-Mutante, die das Transposon Tn10mini-kan enthält, welches in einem hrp-Gen insertiert ist, das bei der Regulation der Harpinproduktion beteiligt ist.
Ea321T5	Hrp-Mutante, die das hrpN-Gen enthält, das mit dem nichtpolaren Transposon Tn5tac1 mutagenisiert wurde. (diese Mutante von Ea321 weist eine Insertion in dem Gen auf, das Harpin kodiert).
pCPP9	Cosmidvektor, der für das Klonieren von DNA von E. amylovora konstruiert wurde. Der Vektorteil von pCPP430.
pCPP430	Cosmid, das 46,5 kB von Ea321-DNA enthält, die den gesamten hrp-Gencluster von Ea321 einschließt. Dieses Cosmid verleiht E. coli die Fähigkeit, die HR auszulösen, und stellt allen Hrp-Mutanten von E. amylovora den Hrp-Phänotyp wieder her. Klon, von welchem sich hrpN ableitete.
pCPP1084	Plasmid, das ein 1,3 kB HindIII-Fragment von pCPP430 enthält, welches das gesamte hrpN (1155 Basenpaare) einschließt. Der Vektor ist pBluescript M13+.
pCPP50	Plasmid, das durch Modifizieren von pINIII¹¹³-A2 nach Masui et al. (Bio/Technology, Januar 1984 S. 81–85) entwickelt wurde. Ein Fragment des Originals wurde deletiert, und ein Fragment von pBluescript wurde insertiert. Die Modifikationen wurden durchgeführt, um einen Vektor zu erzeugen, der für die Harpinproduktion geeigneter ist.
pCPP2139	Plasmid, das, wenn es sich in E. coli befindet, Superproduktion von Harpin zur Folge hat. Konstruiert durch Klonieren des hrpN-Gens von pCPP430 in pCPP50.
pBluescript M13+	Plasmid, das routinemäßig für das Subklonieren und Sequenzieren von DNA verwendet wird. Wird auch zur in vitro-Expression von Protein von klonierter DNA verwendet.

Außerdem können diese und andere Begriffe, die überall in dieser Beschreibung verwendet werden, in Molecular Plant-Microbe Interactions 4(5):493 (1991) und Advances in Molecular Genetics of Plant-Microbes Interaction 1:53 (1991) gefunden werden.
Sowohl E. coli DH5ɑ(pCPP1084) und E. amylovora Ea321 sind bei der American Type Culture Collection in Rockville, Maryland hinterlegt worden. Ihre Hinterlegungsnummern sind ATCC 69021 beziehungsweise ATCC 49947. Die Hinterlegung von ATCC 69021 ist unter dem Budapester Vertrag erfolgt, und Kulturen werden gemäß der Bestimmungen dieses Vertrags zur Verfügung gestellt.
Die verschiedenen Gesichtspunkte bezüglich der Identifizierung, Isolierung, Reinigung und Charakterisierung des HR-Auslösers und -gens können klarer verständlich sein aus den folgenden Figuren und Beispielen, welche alle zwecks des Erklärens der vorliegenden Erfindung und nicht zum Beschränken des Schutzbereichs davon bereitgestellt werden.
1 ist eine Restriktionsendonukleasekarte des hrp-Clusters von Erwinia amylovora; und
2 stellt die Änderungen des pH-Werts einer Badelösung von Tabakzellsuspensionskulturen dar.
Genauer stellt 1 die Restriktionsendonukleasekarte des hrp-Clusters von Erwinia amylovora dar, in welcher „E" EcoRI-Restriktionsstellen bezeichnet, „H" HindIII-Restriktionsstellen bezeichnet und „B" BamHI-Restriktionsstellen bezeichnet. Die vertikalen Linien zeigen den Ort von Transposoninsertionen an, die auf ihre Wirkungen auf die Fähigkeit, die HR auszulösen und auf Birne pathogen zu sein, geprüft worden sind. Metabolisch aktive Zellen von Erwinia amylovora Ea321 [siehe Molecular Plant-Microbe Interactions 1(3):135 (1988.)] und E. coli DH5ɑ(pCPP430) mit allen angezeigten Insertionen können die Überempfindlichkeitsreaktion in Tabak nicht auslösen. Die Region, die durch alle angezeigten Insertionen umfasst ist, ist auch für das Auslösen einer K⁺/H⁺-Austauschreaktion der Tabakzellsuspensionskulturen wesentlich. Derivative von Ea321, die alle angezeigten Insertionen enthalten, sind für die Birne nicht pathogen.
Genauer im Hinblick auf 2 wurden die Kontrollwerte (kein Zusatzstoff) vor der graphischen Darstellung subtrahiert. Offene Quadrate stellen Harpin dar (60 nM); offene Kreise stellen Zellen von E. coli DH5ɑ(pCPP430) dar (5 × 10⁷ Zellen/ml); ausgefüllte Quadrate stellen Zellen von E. amylovora Ea321 dar (5 × 10⁷ Zellen/ml); Dreiecke stellen Zellen von E. coli DH5ɑ(pCPP430K49) dar (5 × 10⁷ Zellen/ml); Rauten stellen Zellen von E. amylovora Ea321K49 dar (5 × 10⁷ Zellen/ml); und ausgefüllte Kreise stellen Zellen von E. coli DH5ɑ(pCPP9) dar (5 × 10⁷ Zellen/ml). Tabakzellsuspensionskulturen wurden bei Raumtemperatur mit den angezeigten Herstellungen geschüttelt. Der pH-Wert wurde bei den angezeigten Abständen gemessen. Alle Herstellungen, die HR in Tabakblättern auslösten, verursachten auch eine pH-Zunahme des Tabakzellsuspensionskulturmediums.
BEISPIEL I
Das Plasmid pCPP430 wurde aus einer Bibliothek von genomischer DNA des Wildtypstamms von E. amylovora identifiziert, das in unserem Labor als Ea321 bekannt ist, und ist in der American Type Culture Collection als 49947 hinterlegt worden. Der Stamm wurde 1978 von der Französischen Nationalen Sammlung von phytopathogenen Bakterien (French National Collection of Phytopathogenic bacteria) erhalten, in weicher er als CNFB 1367 bekannt ist. Genomische DNA wurde isoliert und mit Sau3A gespalten, in den Cosmidvektor von pCPP9 ligiert, der vorher mit BamHI gespalten wurde, verpackt und in den E. coli-Stamm ED8767 gemäß vorher beschriebenen Verfahren [siehe Mol. Plant-Microbe Int. 1:135 (1988)] transfiziert. Die so erhaltenen Cosmide wurden durch Konjugation mit Hilfe des Helferplasmids pRK2013 in Stämme mobilisiert [Bauer, D.W., Molecular genetics of pathogenicity of Erwinia amylovora: techniques, tools and their application. Ph.D. thesis (Doktorarbeit). Cornell University, Ithaca, NY (1989)].
Die so erhaltene Bibliothek wurde verdünnt und auf Platten von Nähragar ausgestrichen, der sowohl Spectinomycin als auch Kanamycin mit einer Endkonzentration von 50 μg/ml enthält. Platten, die nach 24 Stunden langer Inkubation bei 37°C etwa 500 Kolonien enthalten, wurden ausgewählt, wenn der Durchmesser jeder Kolonie 0,5–1,0 mm betrug. Dia Kolonien von diesen Platten wurden auf Platten replica-gestempelt, die Luria-Bertani-Agar (LA) enthalten, auf welchen vorher 0,1 ml einer Suspension des Stamms Ea321T143 ausgestrichen worden waren. Ea321T143 ist ein Tn10-induzierter Hrp-Mutantenstamm von Ea321; er ist für die Birnenfrucht nicht pathogen und löst die HR in Tabak und anderen Pflanzen nicht aus. Er wurde zu OD₆₂₀ = 1,3 in Luriabrühe plus Tetracyclin (10 μg/ml) wachsen gelassen. Die LA-Platten wurden 5 Stunden lang bei 28°C inkubiert, und das Wachstum auf diesen Platten wurde auf ein Minimalmedium für das Wachstum von Erwinia amylovora replica-plattiert, welches Glukose 2g/l, Asparagin 1,5 g/l. Natriumzitrat 0,25 g/l, MgSO₄ 5mg/l, Nikotinsäure 0,25 g/l, (NH₄)₂SO₄ 1 g/l, K₂HPO₄ 3,51 g/l, KH₂PO₄ 1,51 g/l und 50 mg/l Spectinomycin und 10 mg/l Tetracyclin enthält. Dieses Verfahren wählte Transkonjuganten von Ea321T143 aus, welche verschiedene Cosmide der Ea321-Bibliothek enthielten. Nach 48 Stunden Inkubation bei 28°C, wurden frisch geschnittene Scheiben von unreifer Birnenfrucht auf die Oberfläche jeder Platte von Transkonjuganten gepresst, so dass alle Kolonien unter der Birnenscheibe mit Birnengewebe in Berührung kamen. Die Birnenscheiben wurden umgedreht, in Kunststoffkästen inkubiert, die mit gut angefeuchteten Papiertüchern ausgekleidet waren, und bis zu 5 Tage lang täglich auf die Gegenwart von Tröpfchen von Flüssigkeit beobachtet. Die unreife Birnenfrucht war ungefähr 6 Wochen nach der Blüte von Bäumen von Pyrus communis cv. Bartlettbirne geerntet worden. Die Früchte wiesen einen Durchmesser von 2–4 cm auf, und sie wurden bei 0–2°C bis zur Verwendung gelagert. Flüssigkeit, wie in dieser Beschreibung der vorliegenden Erfindung verwendet, ist ein Gemisch von Pflanzen- und Bakterienprodukten, das im Wesentlichen aus lebenden Bakterienzellen besteht.
Die Flüssigkeit wurde auf Platten von E. amylovora-Minimalmedium mit 50 μg/ml Spectinomycin und 10 μg/ml Tetracyclin verdünnungsausgestrichen, 2 Tage lang bei 28°C inkubiert, und einzelne Kolonien wurden mit sterilen Zahnstochern aufgelesen, auf eine frische Platte von Ea-Minimalagar + 50 μg/ml Spectinomycin und 10 μg/ml Tetracyclin übertragen und erneut auf Pathogenität getestet. Frisch geschnittenes Birnenfruchtgewebe wurde mit Zahnstochern durchbohrt, die mit den zu prüfenden Stämmen kontaminiert waren. Cosmide von solchen Kolonien, welche Krankheit auf Birnenfrucht verursachten, wurden in DH5ɑ aus Ea321T143 durch Kombinieren von 0,5 Aliquots von über Nacht-LB + antibiotische Kulturen von DH5ɑ, des Ea321T143-Weg⁺-Transkonjuganten (der Stamm von Ea321T143, der das Cosmid enthält, welches Ea321T143 die Fähigkeit verleiht, eine Krankheit zu verursachen), und pRK2013, dem Helferplasmid, remobilisiert. Die Kombination wurde innig gemischt, zentrifugiert, und das Pellet wurde in 150 μl L-Brühe ohne Antibiotika suspendiert. Das Pellet wurde innig resuspendiert, und 0,1 ml-Tropfen wurden auf LA-Platten gesetzt, in den Agar einsickern gelassen, ohne sich auszubreiten, und dann wurden die Platten bei 28°C 5 Stunden lang inkubiert. Nach der Inkubation wurde der Punktwuchs in 1 ml 5 mM Kaliumphosphatpuffer, pH 6,5, resuspendiert, und 0,1 Aliquots wurden auf Platten von LA + 50 μg/ml Spectinomycin und 20 μg/ml Naladixinsäure ausgestrichen, welche dann 48 Stunden lang bei 37°C inkubiert wurden. Kolonien wurden gleichzeitig mit Zahnstochern auf Platten von LA + 50 μg/ml Spectinomycin und LA + Km übertragen. Solche Kolonien, die nur auf den 50 μg/ml Spectinomycin-Platten wuchsen, was den Verlust des Helferplasmids pRK2013 (Km^r) anzeigt, wurden zur Konservierung durch Einfrieren und für eine weitere Untersuchung ausgewählt.
Um zu bestimmen, ob dasselbe Cosmid, das der Birne die Pathogenität wiederherstellt, nachstehend bezeichnet als pCPP430, auch die Reaktion von Ea321T143 auf Tabak beeinflusst, wurden Suspensionen in die Tabakblattsektoren infiltriert. Die Wirkung von pCPP430, das in E. coli DH5ɑ gehalten wurde, wurde in Tabak geprüft. Der Stamm wurde zu OD₆₂₀ von 0,4–0,6 (ungefähr 10⁸ cfu/ml) in Luria-Brühe + 50 μg/ml Spectinomycin wachsen gelassen. Die Kultur wurde zentrifugiert (1 Minute lang bei 12.000 × g), in 5 mM Phosphatpuffer, pH 6,5, zum ursprünglichen Volumen resuspendiert und in Tabakblätter infiltriert. Kollaps des Gewebes trat innerhalb von 8 Stunden auf. Kein Kollaps wurde beobachtet, wenn Zellen von DH5ɑ(alleine) oder DH5ɑ(pCPP9) in Tabakblätter infiltriert wurden. Folglich schlussfolgerten wir, dass pCPP430, das bestimmte DNA von Ea321 enthielt, E. coli DH5ɑ ermöglichte, die HR-Reaktion zu bewirken, und dass pCPP430 alle Gene enthielt, die für diese Reaktion erforderlich sind.
Das hrp-Gen aus E. amylovora, das im Cosmid pCPP430 enthalten ist, wird besonders gut in Escherichia coli exprimiert [siehe Advances in Molecular Genetics of Plant-Microbe Interactions, vorstehend; Phytopathology 79:1166 (1989); und Mol. Plant-Microbe Interactions 4(5):493 (1991)]. Gewöhnlich war de novo-RNA und Proteinsynthese für Ea321 erforderlich, um die HR auszulösen. Jedoch sind E. coli(pCPP430) und Ea321(pCPP430) in der Lage, die HR in Gegenwart von bakteriellen Transkriptions- oder Translationsinhibitoren, wie Rifampicin und Tetracyclin, auszulösen. Dies zeigte an, dass der HR-Auslöser in/an Zellen von E. coli DH5ɑ(pCPP430) vorlag, bevor die Tabakblätter mit den Bakterien infiltriert waren.
Die Suche nach dem HR-Auslöser begann durch Infiltrieren von Tabakblättern mit den zellfreien Kulturüberständen von E. amylovora Ea321, Ea321(pCPP430) oder E. coli DHɑ(pCPP430). Die Überstände wurden durch Wachsenlassen jedes Stamms in LB-Brühe mit dem geeigneten Antibiotikum zur späten log-Phase (OD₆₂₀ = ca. 1,0) produziert. Wie wir erwarteten, beruhend auf der Erfahrung anderer Arbeiter [siehe Phytopathology 57:322 (1967)], trat keine Überempfindlichkeitsreaktion auf.
Der Stamm Ea321(pCPP430) wurde durch das folgende Verfahren erzeugt:
BEISPIEL II
Die Stämme Ea321, E. coli DH5ɑ(pCPP430) und E. coli DH5ɑ(pRK2013) wurden über Nacht in LB-Brühe wachsen gelassen, die jeweils kein Antibiotikum, 50 μg/ml Spectinomycin oder Km⁵⁰ enthält. Am nächsten Morgen wurden 0,5 ml-Aliquots jedes Stamms in einem Mikrozentrifugenröhrchen kombiniert, 2 min lang zentrifugiert und in 0,15 ml Luria-Brühe (keine Antibiotika) resuspendiert. Ein 0,1 ml-Aliquot dieser Suspension wurde auf Luria-Agar (keine Antibiotika) getüpfelt und 5 Stunde lang bei 28°C inkubiert. Das Wachstum von diesem Tupfen wurde in 1 ml 5 mM Kaliumphosphatpuffer, pH 6,5 resuspendiert, und die 0,1 ml-Aliquots wurden auf Platten von E. amylovora-Minimalmedium ausgestrichen, das 50 μg/ml Spectinomycin enthält, um Stämme von Ea321 auszuwählen, die pCPP430 beherbergen. Die Platten wurden 2–3 Tage lang bei 28°C inkubiert. Einzelne Kolonien wurden gleichzeitig mit Zahnstochern auf Minimalmedium, das 50 μg/ml Spectinomycin enthält, und auf Minimalmedium, das Km⁵⁰ enthält, übertragen. Nur jene Kolonien, die auf dem Medium mit 50 μg/ml Spectinomycin (zeigt Selektion von pCPP430 an), aber nicht auf dem Medium mit Km⁵⁰ (zeigt Verlust des Helferplasmids pRK2013 an) wuchsen, wurden für eine weitere Untersuchung ausgewählt.
Obwohl zellfreie Kulturüberstände von allen verwendeten Bakterien die Überempfindlichkeitsreaktion nicht auslösen konnten, hatten Herstellungen bestimmter Zellen auf eine neue Art und Weise zellfreie Herstellungen zur Folge, die eine starke Überempfindlichkeitsreaktion innerhalb von 12 Stunden auslösten, die nicht von der zu unterscheiden war, die durch vollständige metabolisierende Bakterienzellen ausgelöst wurde, aus welchen die Herstellungen hergestellt wurden. Der Auslöser der Überempfindlichkeitsreaktion wurde isoliert, gereinigt und aus dieser zellfreien Auslöserherstellung (CFEP) gemäß Beispiel III charakterisiert.
Die Isolierung von CFEP, das Harpin aus E. coli DH5ɑ(pcPP430) gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung enthält, wird im folgenden Beispiel beschrieben:
BEISPIEL III
Zellen von E. coli DH5ɑ(pCPP430) wurden in Luria-Bertani-(LB-) Medium zu OD₆₂₀ = 0,8 wachsen gelassen, durch Zentrifugation gesammelt und in einem Zehntel des ursprünglichen Volumens von 5 mM Kaliumphosphatpuffer, pH 6,5, mit 0,1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF), einem Serinproteaseinhibitor, resuspendiert. Die Zellen wurden dann unter Verwendung eines Sonicator Ultrasonic Cell Disruptor^TM (Heat System-Ultrasonics) bei einer Leistungsabgabe von 4, und wobei der Pulsarzyklustimer auf 40% Auslastungsgrad gestellt wurde (unter diesen Bedingungen wurden 10 ml Bakteriensuspension 10 Minuten lang auf Eis mit Ultraschall bearbeitet), durch Ultraschall aufgebrochen. Nachdem die Trümmer aus dem Ultraschallgefäß durch 1 Stunde langes Zentrifugieren bei 12.000 × g entfernt worden waren, wurde die Überstandsflüssigkeit durch ein Membranfilter mit einer Porengröße von 0,2 μm filtriert, um alle restlichen intakten Zellen zu entfernen. Die so erhaltene Herstellung war bei Verdünnungen bis zu etwa 1:10 in der Lage, die Überempfindlichkeitsreaktion in Tabakblättern auszulösen. Die CFEP enthielt das intrazelluläre Material aus einer Kultur von OD₆₂₀ = 0,4, dieselbe Dichte von lebenden Zellen von E. coli, die zum Auslösen der Überempfindlichkeitsreaktion erforderlich ist.
Die Reinigung von Harpin gemäß dem vorliegenden Beispiel wird im folgenden Beispiel beschrieben:
BEISPIEL IV
Anfängliche Experimente unter Verwendung der aus Beispiel III erhaltenen Herstellung zeigten an, dass die HR-auslösende Aktivität von Natur aus wärmestabil und proteinartig war. Die Herstellung behielt HR-auslösende Aktivität, wie durch Infiltration von Tabakblättern bestimmt, wie vorher beschrieben, im Anschluss an Inkubation über Nacht bei 65°C. Jedoch ging, wenn PMSF, der Serinproteaseinhibitor, nicht während der Herstellung zugefügt worden war, alle HR-auslösende Aktivität nach 3 Stunden bei 37°C oder 6–8 Stunden bei 4°C verloren. Inkubation der Herstellung mit Pronase E (Sigma) mit 100 μg/ml 1 Stunde lang bei 37°C zerstörte jede Auslöseraktivität.
Der Vorteil der Wärmestabilität der Auslöserherstellung wurde verwendet, um in der weiteren Reinigung des Auslösers zu helfen. Nur eine beschränkte Anzahl von Proteinen blieb nach dem 10 Minuten langen Halten der Auslöserherstellung von Beispiel III in einem siedenden Wasserbad und dem nachfolgenden Entfernen des unlöslichen Materials durch Zentrifugation erhalten. Eine Bande, die 44 kDa entspricht, war hervorspringend im Anschluss an die Elektrophorese der erwärmten Herstellung von Beispiel III auf SDS-Polyacrylamidgel(10% SDS-PAGE-Gele wurden hergestellt und gemäß der Anleitungen des Lieferanten, Hoeffer Scientific Instruments, verwendet; Protein in den Gelen wurde mit 0,025% Coomassie Blau R-250 30 Minuten lang angefärbt und mit 50% Methanol und 10% Essigsäurelösung entfärbt). Eine Bande dieser Mobilität lag ausschließlich in allen Herstellungen mit HR-auslösender Aktivität vor.
Im Anschluss an die Auflösung der Herstellung von Beispiel III auf einem granulierten Gelbett einer isoelektrischen Fokussierung oder durch Ionenaustauschchromatographie enthielten die Fraktionen mit HR-auslösender Aktivität immer ein Protein, das einer molekularen Größe von 44 kDa entsprach, mit einem pI von 4,0 bis 4,5.
Um die weitere Reinigung von Harpin zu erreichen, wurden mehrere Trennungstechniken auf die CFEPs angewendet, die hergestellt wurden, wie in Beispiel III diskutiert. Vor jedem Schritt wurde die CFEP in einem siedenden Wasserbad 10 Minuten lang erwärmt, auf 25–30°C abgekühlt und 10 Minuten lang bei 12.000 × g zentrifugiert. Die Überstandsflüssigkeit wurde behalten und durch eine Filtrationsmembran mit einer Porengröße von 0,2 μm (Millipore, MF) filtriert.
Die wärmebehandelte CFEP wurde an ein Anionenaustauschharz (Whatman DE-52) gebunden und stufenweise mit zunehmenden Mengen KCl in 5 mM Kaliumphosphatpuffer, pH 6,5, eluiert. Harpin wurde durch einen Puffer, der 90 mM KCl enthält, von der Säule eluiert. Die Gegenwart von Harpin wurde durch Infiltration von Tabakblattsektoren mit Elementen von der Säule, die zu 50% des Ausgangsvolumens konzentriert worden waren, bestimmt. Außerdem wurden Fraktionen in SDS-PAGE-Gelen gemäß Standardverfahren elektrophoretisch getrennt. Abschließende Reinigung wurde durch Hochdruckflüssigkeitschromatographie (HPLC) erreicht. Die Herstellungen, die durch Ionenaustauschchromatographie gereinigt wurden, wurden durch die Zugabe von Essigsäure auf pH 2 eingestellt und wurden im Anschluss an die Zentrifugation, um alle Niederschläge zu entfernen, auf eine vorgepackte Reversephase-HPLC-Säule (YMC AQ-303) aufgebracht. Die Säule wurde mit einem Gradienten von 10–70% Acetonitril bei pH 2 in 0,25% w/v Trifluoressigsäure eluiert. Die Detektion des Proteins erfolgte durch Absorption von Licht von 190 nm bis 300 nm. Jede 0,25 ml-Fraktion wurde auf die Fähigkeit, die HR durch Infiltration der Tabakblattsektoren auszulösen, geprüft.
Das granulierte Gelbett, das zur Auflösung der Herstellung von Beispiel III verwendet wurde, wurde mit Bio-lyte^TM (Bio-Rad Laboratories) hergestellt, wie durch den Hersteller empfohlen wurde. Breitbandampholyte, pH 3–10 (Sigma), wurden bei einer Endkonzentration in der Aufschlämmung von 2% verwendet. Die Elektrodenlösungen waren 1M H₃PO₄ (Anode) und 1M NaOH (Kathode).
Um zu bestimmen, ob die Bande des vorspringenden 44 kDa-Proteins („Harpin"), das in allen HR-auslösenden Proben vorliegt, Auslöseraktivität aufwies, wurde die geeignete ungefärbte Region eines präparativen SDS-Gels ausgeschnitten und mit Puffer ohne SDS elektroeluiert. Das eluierte Protein (200 μg/ml) wurde über Nacht gegen 2 Liter 5 mM Kaliumphosphatpuffer, pH 6,5, der 0,1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid enthielt, dialysiert. Bei Konzentrationen von = 500 nM (= 25 μg/ml) löste Harpin die Überempfindlichkeitsreaktion in Blättern von allen geprüften Pflanzen aus, einschließlich Tabak, Tomate und Arabidopsis thaliana.
Nachfolgendes Experimentieren bestätigte, dass Harpin Protease-sensitiv, wärmestabil und sauer war. Die Behandlung von Harpin mit Protease hob die HR-auslösende Fähigkeit auf und beseitigte die 44 kDa-Proteinbande aus den SDS-Polyacrylamidgelen. Jedoch behielt die Herstellung, wenn Harpin mit Protease inkubiert wurde, die 10 Minuten lang bei 100°C gehalten worden war, um das Enzym zu inaktivieren, die HR-auslösende Aktivität. Wenn aktive Protease im Infiltrationsgemisch vorlag, entwickelte sich keine Überempfindlichkeitsreaktion. Jedoch hatte Infiltration von Tabakblättern mit aktiver, oder Wärme-inaktivierter Protease alleine keine makroskopischen Symptome zur Folge. Harpin behielt seine HR-auslösende Aktivität im Anschluss an 10 Minuten langes Erwärmen in einem siedenden Wasserbad. Gereinigtes Harpin von einem SDS-Gel wies einen pI von 4,3 auf, wie durch Auflösung auf Dünnschichtgelen der isoelektrischen Fokussierung unter Verwendung herkömmlicher Techniken bestimmt.
Der subzelluläre Ort von Harpin gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird im folgenden Beispiel beschrieben:
BEISPIEL V
Der Ort von Harpin auf der Zelloberfläche des Organismus wurde durch die folgenden Beobachtungen nahegelegt: (i) der Überstand von E. amylovora Ea321(pCPP430) oder E. coli DH5ɑ(pCPP430) löste nicht die Überempfindlichkeitsreaktion aus, was anzeigt, dass Harpin nicht in das Medium abgesondert wird, sondern sich eher in oder an den Bakterien befindet; (ii) im Anschluss an eine 5 Minuten lange Inkubation bei 37°C von ganzen Zeilen von Ea321(pCPP430) und E. coli DH5ɑ(pCPP430) mit 40 beziehungsweise 80 μg/ml Protease und mit 40 μg/ml Tetracyclin, um die fortdauernde Herstellung von Harpin anzuhalten, konnten die Bakterien eine Überempfindlichkeitsreaktion nicht auslösen. Als 0,5 mM PMSF, der Proteaseinhibitor, in das vorstehende Inkubationsgemisch eingeschlossen wurde, lösten die Bakterien die Überempfindlichkeitsreaktion aus; PMSF schützte Harpin anscheinend vor der Inaktivierung durch Protease. (Infiltration von Tabakblättern mit PMSF oder Tetracyclin alleine hatte keine Wirkung, was anzeigte, dass keine Verbindung beim Bewirken der HR unabhängig funktioniert); (iii) Behandlung von Bakterien mit zunehmenden Mengen Protease hatte verringerte Fähigkeit, die Überempfindlichkeitsreaktion auszulösen, zur Folge, welches gut mit dem Verschwinden von Harpin aus den SDS-Gelen korreliert, in welchen die Herstellungen der Protease-behandelten Bakterien elektrophoretisch getrennt worden waren [Tabelle 1]: (iv) im Anschluss an die 1 Stunde fange Zentrifugation der Herstellung von Beispiel III bei 105.000 × g wurde die meiste HR-auslösende Aktivität in der Überstandsflüssigkeit gefunden, jedoch war, wenn 30 mM MgCl₂, ein Membranstabilisator, vor der Ultraschallbehandlung zugefügt wurde, die meiste Aktivität mit dem Pellet verbunden, das mit dem zentrifugierten Teil die Membranen enthält; und (v) Gel-Permeationschromatographie der ungekochten Herstellung von Beispiel III zeigte eine Verbindung des Auslösers mit einer Fraktion sehr hohen Molekulargewichts (> 10⁶ Da) an, welches vermutlich Membranvesikel sind; und (vi) Fraktionierung von lysierten Zellen von Ea321(pCPP430) [siehe Science 233:1403 (1985)] in der Ultrazentrifuge und Reaktion mit einem harpinspezifischen Antikörper hatte Reaktion mit der Zellmembranfraktion und der Kontrolle ganzer Zellen zur Folge.
Die vorhergehenden Ergebnisse zeigen an, dass sich Harpin an oder nahe der Bakterienzelloberfläche befindet und dass es instabil ist. Zellsuspensionen von Ea321(pCPP430) oder E. coli DH5ɑ(pCPP430) behalten ihre HR-auslösende Aktivität in Gegenwart von Tetracyclin (40 μg/ml), einem Translationsinhibitor, nicht mehr als 0,5 Stunden beziehungsweise 1 Stunde lang bei. Außerdem wurde kein Harpin detektiert, sobald die Zellen die HR-auslösende Aktivität verloren. Jedoch behielten die Bakterien, als der Proteaseinhibitor PMSF (0,5 mM) in der Suspension eingeschlossen war, die HR-auslösende Aktivität mehr als zwei Stunden lang, und abnehmende Mengen Harpin wurden gleichzeitig in den SDS-Gelen über den Zeitraum detektiert. Auf einer Grundlage von gleicher Zellanzahl, war für E. coli DH5ɑ(pCPP430) mehr Protease erforderlich, um Harpin zu zerstören und die Überempfindlichkeitsreaktion zu verhindern, als für Ea321(pCPP430). Folglich kann die Sensitivität von Harpin gegenüber Proteolyse die vorhergehenden Beobachtungen der kurzlebigen Natur der HR-auslösenden Fähigkeit von phytopathogenen Bakterien erklären [siehe Science 245:1374 (1989)].
Das folgende Verfahren und die Tabelle 1 stellen das Protokoll für die und die Ergebnisse der Proteasesensitivität der HR-auslösenden Aktivität von E. amylovora Ea321, das seinen hrp-Gencluster enthält, dar.
Zellen von E. amylovora Ea321(pCPP430) wurden in LB-Medium wachsen gelassen und bei OD₆₂₀ = 0,6 durch Zentrifugation geerntet. Die Zellen wurden dann in 0,1 Volumen 5 mM Kaliumphosphatpuffer, pH 6,5, der 40 μg/ml Tetracyclin enthielt, resuspendiert. Protease (wie in Tabelle 1 angezeigt) wurde zu 200 μl Zellsuspension zugefügt und bei 37°C 5 Minuten lang inkubiert und 100 μl jedes Gemisches wurden anschließend in Tabakblätter infiltriert. Kollaps wurde 24 Stunden nach der Infiltration festgestellt. 20 μl 5× Crackingpuffer wurden mit 80 μl der restlichen Gemische gemischt, 5 Minuten lang gekocht und dann 10 Minuten lang in einer Mikrozentrifuge zentrifugiert, bevor 15 μl in jede Bahn eines 10% SDS-PAGE-gels geladen wurden. Die Electrophorese wurde 2 Stunden lang bei 20 mA durchgeführt, gefolgt von 30 Minuten langem Anfärben mit 0,025% Coomassie Blau R-250 und Entfärben mit einer Lösung aus 50% Methanol und 10% Essigsäure. Der zellfreie Überstand, der aus der LB-Kultur hergestellt wurde, wurde steril filtriert und dann zu einem Zehntel des ursprünglichen Volumens mit der Centriprep-10 (Amicon) konzentriert. Behandlung mit größeren Mengen Protease hatte Verlust der HR-auslösenden Fähigkeit und Verschwinden der Harpinbande (44 kDa) aus den SDS-Gelen zur Folge. Von den so erhaltenen Daten aus diesem Protokoll wird in der folgende Tabelle berichtet: TABELLE 1

+ = positive Reaktion
– = negative Reaktion

Die Fähigkeit von Bakterienstämmen, die Überempfindlichkeitsreaktion in intakten Tabakblättern auszulösen, korreliert stark mit ihrer Fähigkeit, eine K⁺//N⁺-Austauschreaktion in den Tabakzellsuspensionskulturen auszulösen. Die beiden Reaktionen sind genetisch verwandt, weil ein Hauptteil des hrp-Genclusters von E. amylovora zum Auslösen der K⁺/H⁺-Austauschreaktion erforderlich ist. Folglich wurde die Wirkung von Harpin auf Tabakzellsuspensionskulturen gemäß dem folgenden Beispiel geprüft.
Die Wirkung von Harpin auf Pflanzen, Pflanzenzellen und Geweben gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird im folgenden Beispiel beschrieben:
BEISPIEL VI
Um festzustellen, ob eine bestimmte Herstellung HR-auslösende Aktivität aufwies, verwendeten wir eine Technik, die der ähnlich ist, die mit ganzen Bakterienzellen verwendet wurde [siehe Mol. Plant-Microbe Interact. 4:494 (1991]. Tabakpflanzen (Nicotiana tabacum L., Xanthi') wurden in einer künstlichen Bodenmischung zu einer Höhe von 90–100 cm wachsen gelassen. Pflanzen wurden aus dem Gewächshaus zum Labor < 24 Stunden vor der Infiltration transportiert. Die Infiltration der Blattlamina wurde mit einer nadellosen Spritze durch ein kleines Loch durchgeführt, das mit einer Dissektionsnadel gebildet wurde. Der Kollaps des infiltrierten Bereichs, was auf die HR hinwies, wurde 24 Stunden nach der Infiltration notiert.
Alle CFEPs, die das 44 kDa-Protein enthielten, wie durch SDS-PAGE detektiert, bewirkten Kollapse der infiltrierten Bereiche der Tabakblätter. Harpin, das durch HPLC gereinigt wurde (Beispiel IV), löste die NR bei Konzentrationen von = 500 nM aus.
Um die Wirkung von Harpin auf Tabakzellsuspensionskulturen zu prüfen, wurden vier Tage alte Tabakzellsuspensionskulturen (Nicotiana tabaccum Var. Samsun) vom Biotechnologieprogramm der Cornelluniversität (Biotechnology Program at Cornell University) erhalten. Die Zellsuspension wurde durch eine Einzelschicht von lose gewebtem Mull in einen 1 Liter-Becher filtriert, um alle großen zusammengeballten Massen zu beseitigen. Tabakanalysemedium [MES 0,5 mM, Mannit 0,175 M, K₂SO₄ (2 ml einer 0,25 M Stammlösung), CaCl₂ (2 ml einer 0,25 M Stammlösung), hochreines Wasser 996 ml; eingestellt auf pH 6,0 mit 1N NaOH und filtriert durch einen Membranfilter mit einer Porengröße von 0,2 μm] wurde verwendet, um so viele Zellen wie möglich durch eine Mulleinzelschicht zu waschen. Diese gewaschene und filtrierte Suspension wurde als nächstes in einen großen Trichter gegossen, der mit einer Schicht von Miracloth^TM (Vliestuch) ausgekleidet war, und die Zellen, die das Miracloth^TM auskleideten, wurden mit weiteren 200–400 ml Tabakanalysemedium vorsichtig gewaschen. 15 g nasse Zellen wurden gewogen und vorsichtig in 415 ml Tabakanalysemedium resuspendiert. 20 ml-Aliquots dieser Suspension wurden in konische Plastikkelche eingemessen (oberer Durchmesser 4 cm; unterer Durchmesser 2,5 cm; 4 cm hoch) und sofort auf einen Rotationschüttelapparat gesetzt, der auf 150 U/min mit einem Takt von 2 cm gesetzt und bei 25 ± 3°C gehalten wurde.
Zellen wurden equilibrieren lassen, bis sie einen pH-Wert von ungefähr 5,8 erreichten (gewöhnlich 20–30 min). An diesem Punkt wurden 1 ml Bakteriensuspension oder mit Ultraschall behandelter Extrakt oder 0,5 ml gereinigtes Protein, das 20 μl eines 20 μg/ml-Konzentrates von PMSF enthält, zu jeder Tabakzellprobe zugefügt. Der pH-Wert der Probe wurde mit einem Corning-pH-Meter gelesen und wurde mit 0,1 N NaOH (oder 0,1 N HCl, wie benötigt) zurück auf pH 6 eingestellt. Der zweite Messwert wurde 30 Minuten nach dem ersten Messwert genommen. Alle nachfolgenden Messwerte wurden in stündlichen Abständen bis zu 6 Stunden lang nach dem Messwert zum Zeitpunkt 0 genommen. Alle Behandlungen wurden in doppelter Ausführung geprüft.
Bakterienzellsuspensionen wurden durch wachsende Übernachtkulturen in LB mit dem geeigneten Antibiotikum und dann Verdünnen der Stämme am nächsten Morgen zurück zu einer OD₆₂₀ von 0,20 hergestellt. Die Kulturen wurden erneut zu OD 0,4 wachsen gelassen. Bei dieser OD wurde geschätzt, dass die Stämme von Ea321 und ihre Abkömmlinge eine Konzentration von ungefähr 2 × 10⁸ cfu/ml aufweisen. Es wurde geschätzt, dass die Stämme von E. coli DH5ɑ und ihre Abkömmlinge eine Konzentration von ungefähr 1 × 10⁸ cfu/ml aufweisen. Die Zellen wurden bei 5000 × g zentrifugiert und resuspendiert, um 5-fache Konzentrationen (für Ea321 und Abkömmlinge) und 10-fache Konzentrationen (für E. coli und Abkömmlinge) in 1 mM MES-Puffer, pH 6, zu ergeben. Auf diese Art und Weise wurden Zellkonzentrationen von ungefähr 1 × 10⁹ cfu/ml erreicht. Als 1 ml Zellsuspension zu 20 ml Tabakzellsuspension zugefügt wurde, wurde die Endkonzentration von cfu/ml für die Analyse auf 5 × 10⁷ pro ml geschätzt.
Zellen von E. amylovora bewirkten eine Zunahme des pH-Werts der Badlösung (ein Maß der K⁺/H⁺-Austauschreaktion) mit einer Verzögerung von 2–3 Stunden, im Anschluss an die Zugabe von Bakterien zur Tabakzellsuspensionkultur (siehe 2). Im Gegensatz dazu bewirkte eine einmalige Zugabe von Harpin zum Zeitpunkt null eine schnelle Zunahme des pH-Werts der Badlösung während der ersten Stunde. Der pH-Wert verringerte sich etwas während der nachfolgenden Inkubation. Mutanten von E. amylovora, die kein Harpin in vitro produzieren, konnten die K⁺/H⁺-Austauschreaktion nicht auslösen. Stämme von E. coli, die Mutationen im klonierten hrp-Gencluster von E. amylovora enthalten, konnten die Austauschreaktion auch nicht auslösen. Das Auslösen der Austauschreaktion sowie der Überempfindlichkeitsreaktion durch Harpin stellt einen zusätzlichen Beweis bereit, dass Harpin bei den Bakterien-Pflanze-Wechselwirkungen aktiv ist. Die Daten von diesen Untersuchungen über die Wirkung von Harpin auf Tabakzellkulturen ist in 2 dargestellt.
Das folgende Beispiel stellt einen Vergleich von Harpin, das aus E. coli DH5ɑ(pCPP430) und Ea321 erhalten wurde, bereit.
BEISPIEL VII
Um darzulegen, dass Harpin durch E. amylovora und nicht E. coli produziert wird, angeregt durch die Gegenwart von pCPP430, wurden dieselben Techniken, die für seine Isolierung aus E. coli DH5ɑ(pCPP430) verwendet wurden, mit E. amylovora Ea321 verwendet, außer dass die Zellen 5 Stunden lang vor der Behandlung mit Ultraschall in einem HR-induzierenden Medium vorinkubiert wurden. Außerdem wurde E. coli DH5ɑ(pCPP9), welches den Vektor von pCPP430 beherbergt, denselben Verfahren wie E. coli DH5ɑ(pCPP430) unterzogen. Ein Protein, das mit demselben Molekulargewicht isoliert wurde, wie das, das aus Ea321 isoliert wurde, wies HR-auslösende Fähigkeit auf. Bezogen auf die relative Intensität der 44 kDa-Bande auf den SDS-Polyacrylamidgelen, wurde geschätzt, dass E. amylovora Ea321, etwa ein Zehntel der Menge von Harpin wie E. coli DH5ɑ(pCPP430) produziert, auf einer Grundlage pro Zelle. Die Eigenschaften des Auslöserproteins aus E. amylovora Ea321 und E. coli DH5ɑ(pCPP430) wären identisch. Keine Protease-sensitive wärmestabile HR-auslösende Aktivität, verbunden mit einem 44 kDa-Protein, wurde bei zellfreien Extrakten, die aus E. coli DH5ɑ(pCPP9) genommen wurden, erkannt.
Die Eigenschaften des E. amylovora-Harpin stimmen mit mehreren wichtigen physiologischen Beobachtungen überein, die im Anschluss an die Entdeckung gemacht wurden, dass Bakterien die Überempfindlichkeitsreaktion auslösen können. Die Infiltration von Pflanzengewebe mit inkompatiblen Pathogenen und Inhibitoren eines Bakterienproteins oder der RNA-Synthese verhindern die Überempfindlichkeitsreaktion [siehe Phytopathology 72:1513 (1982)], was anzeigt, dass eine de novo RNA- und Proteinsynthese erforderlich sind. Wenn Bakterien in verdünntem Wasseragar infiltriert werden, wird keine Überempfindlichkeitsreaktion ausgelöst, was nahelegt, dass inniger Kontakt zwischen Bakterien und Pflanzenzellen erforderlich ist. Vorinduzierte Bakterien verlieren schnell die HR-auslösende Fähigkeit, wenn sie mit Translations- oder Transkriptions-inhibitoren infiltriert sind [siehe Science 245:1374 (1989)]. Ein weiterer Beweis, dass der Auslöser eine Komponente der Bakterienzelloberfläche ist, wird bei Beobachtungen festgestellt, dass der Auslöser nicht im infiltrierten Pflanzengewebe diffusionsfähig ist und dass jedes eingeführte Bakterium nur eine Pflanzenzelle tötet. Wie durch diese Beobachtungen vorausgesagt, ist Harpin mit der Bakterienzelloberfläche verbunden und scheint wegen seiner äußersten Sensitivität gegenüber Proteolyse von Natur aus instabil, Folglich kann Harpinabbau beim Regulieren der Entwicklung der Pflanze-Bakterium-Wechselwirkung wichtig sein.
Der nichtpathogene Phänotyp von hrp-Mutanten legt nahe, dass Harpin auch eine primäre Determinante von Pathogenität in E. amylovora ist. Die Grundlage für die essentielle Rolle für Harpin sowohl bei kompatiblen (Wirt:Krankheit) als auch inkompatiblen (Nichtwirt:Überempfindlichkeitsreaktion) Wechselwirkungen ist nicht klar. Es wurde gezeigt, dass der Wirtsbereich in einigen pathogenen Bakterien durch avr-Gene reguliert wird, die kulturvarietätsspezifische Inkompatibilität zu hrp⁺-Pathogenen verleihen können. Die biochemische Aktivität der avr-Genprodukte und die Grundlage für ihre Abhängigkeit von hrp-Genen für phänotypische Expression ist unbekannt, obwohl avrB durch hrp-Gene reguliert wird. Die Regulierung der Produktion oder Ansammlung von Harpin kann auch ein determinierender Faktor sein; der hrp-Gencluster in E. amylovora ist im Wirtsgewebe (Birne) etwa 10fach niedriger als im Nichtwirtsgewebe (Tabak) exprimiert.
Obwohl Hauptkrankheitsdeterminanten in pflanzenpathogenen Bakterien identifiziert worden sind, die entweder Tumoren oder umfangreiche Gewebemazeration (Phytohormone beziehungsweise Pektinenzyme) verursachen, ist die molekulare Grundlage für die Pathogenität unter Bakterien, die verzögerte Nekrose in einem beschränkten Bereich der Wirte verursachen, unbekannt. Unter diesen Bakterien sind die wirtschaftlich wichtigen Pseudomonas syringae und Xanthomonas campestris Pathovaren. Toxine und Pflanzenzellwand-abbauende Enzyme können die Virulenz dieser Pathogene erhöhen, aber die hrp-Gene sind absolut zur Bakterienvermehrung in den Wirtsgeweben und zur Erzeugung der Krankheitssymptome erforderlich.
Die Konservierung der hrp-Gene [siehe Laby, R.J., Molecular studies on pathogenicity and virulence factors of Erwinia amylovora, M.S. Thesis, Cornell University (1991)] legt nahe, dass das E. amylovora-Harpin der Archetyp einer überaus wichtigen Klasse von Determinanten von bakteriellen Pflanzenkrankheiten ist. Folglich würde Unterbrechung von Harpin oder des richtigen Gleichgewichts seiner Produktion eine neue Annäherungsweise an das Regulieren der vorherrschenden bakteriellen Krankheiten von Getreidepflanzen sein.
Der Modus der Aktivität von Harpin würde auch die molekularen Grundlagen für die Überempfindlichkeitsreaktion und für den Widerstand von Pflanzen gegen ein breites Feld von mikrobiellen Pathogenen erkennen lassen.
Das folgende Beispiel stellt eine Beschreibung zur Bestimmung der N-terminalen Aminosäuresequenz bereit, durch welche das Gen, das Harpin kodiert, lokalisiert wird.
BEISPIEL VIII
Um das Gen, das Harpin kodiert, genannt hrpN, zu lokalisieren, wird die teilweise Aminosäuresequenz des Harpinproteins bestimmt. Eine Probe von Harpin (25 μg), gereinigt durch HPLC wie in Beispiel IV, wurde verwendet. Ein Teil des Eluents aus der Reversephase-Chromatographiesäule, der dem Peak entspricht, der bei 42,5 min eluiert, wurde im Vakuum zu nahezu Trockenheit verdampft, um das Acetonitrillösungsmittel zu beseitigen. Die Fraktion wurde dann in TE-Puffer gelöst und beim Proteinanalyselabor des Biotechnologieprogramms der Cornell-Universität (Protein Analysis Laboraton of the Cornell University Biotechnology Program) mit der Anfrage eingereicht, dass der Anteil der verschiedenen Aminosäuren, die im Protein vorliegen, und die Sequenz der Aminosäuren, die vom N-Terminus beginnen, bestimmt wird.
Die Ergebnisse dieser Analysen sind in der folgenden Tabelle gezeigt, in welcher sich die Aminosäurezusammensetzung von der Analyse des Harpins nur etwas von der Aminosäurezusammensetzung unterscheidet, die sich von der DNA-Sequenz ableitet:
Die Verfahren, die zur Bestimmung der Aminosäurezusammensetzung verwendet wurden, schließen Hydrolyse des Proteins mit 6N HCl ein, gefolgt von der Derivatisierung der Aminosäurereste und Auflösung gemäß S.A. Cohen et al., 1984, American Laboratory S. 48.
Die N-terminale Aminosäuresequenz von Harpin gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wurde gemäß den Verfahren von Hunkapiller bestimmt [siehe Methods Of Protein Microcharacterization; A Practical Handbook, S. 223–247, Humana Press, Clifton, New Jersey (1986)] ist, wie folgt:
Die abgeleitete Aminosäuresequenz von Harpin (einschließlich der vorstehend angegebenen N-terminalen Aminosäuresequenz) gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist:
Die teilweise Aminosäuresequenz von Harpin wurde verwendet, um eine Oligonukleotidsonds mit Basen zu konstruieren, die denen entsprechen, die die 9. bis 15. Aminosäure des N-Terminus von Harpin kodieren. Weil mehrere von diesen Aminosäuren mehrere Nukleinsäurecodons haben können, wurde ein 48-fach degeneriertes Oligonukleotid gemäß Standardverfahren konstruiert.
Die Identifizierung der Klone, die Harpin kodieren, durch Hybridisierung mit einer Oligonukleotidsonde für Harpin, ist im folgenden Beispiel beschrieben:
BEISPIEL IX
Das Strukturgen, das Harpin kodiert, wurde durch Hybridisierung der Oligonukleotidsonde, die in Beispiel VIII mit DNA von Erwinia amylovora konstruiert wurde, identifiziert. Die spezifische DNA, die in den hrp-Cluster von E. amylovora im Cosmid pCPP430 kloniert wurde, wurde mit dem Restriktionsenzym BamHI gespalten, und ein getrennter Teil wurde mit dem Restriktionsenzym HindIII gespalten. Die DNA-Spaltungen wurden in 0,7% Agarose elektrophonetisch getrennt, mit Ethidiumbromid angefärbt, auf eine Nylonmembran (Immobilon) überführt und gemäß Standardverfahren mit der vorher beschriebenen Oligonukleotidsonde hybridisiert. Die Sonde wurde mit radioaktivem Phosphor(III) unter Verwendung von ³²P-markiertem GTP markiert.
Im Anschluss an die Hybridisierung und Aussetzen der Membranen einem X-O-Mat-Röntgenfilm (Kodak) und Entwicklung des Films, ergab ein 1,3 kb-HindIII-Fragment das stärkste Hybridisierungsignal als Reaktion auf die Sonde. Das Fragment wurde in den pBluescript M13+-Vektor (Stratagene) subkloniert und als pCPP1084 bezeichnet.
Die Herstellung von anti-Harpinantikörpern ist im folgenden Beispiel beschrieben:
BEISPIEL X
Antikörper wurden in Kaninchen als Reaktion auf die Injektion von Harpin gezüchtet. Drei Injektionen von hochgereinigtem Harpin (100, 150 beziehungsweise 50 μg) wurden in Abständen von 2–3 Wochen durchgeführt. Das Antiserum wurde nach 8 Wochen geerntet, IgG wurde mit Ammoniumsulfat ausgefällt und mit Ultraschall behandeltem E. coliDH5ɑ(pCPP9)-Lysat präabsorbiert. Die Spezifität des Antiserums wurde durch Reaktion in Westernblots von Harpin bestätigt, das durch HPLC gereinigt wurde, wie in Beispiel VII beschrieben. Keine Reaktion wurde mit präimmunem Serum erkannt, wenn Westernblots hybridisiert wurden, die erneut gelöste CFEP von DH5ɑ(pCPP430) enthalten.
Die Beschreibung von hrpN im T7 RNA-Polymerase/Promoter-Expressionssystem ist im folgenden Beispiel beschrieben;
BEISPIEL XI
Um zu bestätigen, dass das 1,3 kb-HindIII-Fragment das gesamte hrpN-Gen enthält, wurden das Plasmid pGpI-2 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82:1074 (1985)] und pCPP1084, welches das 1,3 kb-HindIII-Fragment unter der Kontrolle des T7Φ10-Promotors enthält, in E. coli DH5ɑ oder Ea321 transformiert. Diese beiden kompatiblen Plasmide bilden das T7-Expressionssystem. Die Zellen, die sowohl pGpI-1 als auch pCPP1084 enthalten, wurden in LB mit 100 μg/ml Ampicillin und 50 μg/ml Kanamycin bei 30°C wachsen gelassen. 200 μl Zellen bei OD₆₂₀= 0,5 wurden geerntet und mit 5 ml M9-Medium gewaschen [Sambrook, J., E.F. Fritsch, T. Maniatis, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor, (1989)]. Schließlich wurden die Zellen in 1,0 ml M9-Medium, das mit 0,01% von 18 Aminosäuren ergänzt war (kein Cystidin oder Methionin), resuspendiert. Zellen wurden unter Schütteln (200 U/min) bei 30°C 1 Stunde lang, dann wurde auf 42°C 10 Minuten lang umgestellt, wachsen gelassen. Rifampicin (Sigma R35Ol 20 mg/ml Stammlösung in Methanol) wurde zu einer Endkonzentration von 200 μg/ml zugefügt. Zellen wurden bei 42°C weitere 10 Minuten lang inkubiert und dann auf 30°C umgestellt und eine weitere Stunde lang inkubiert. Zellen wurden mit 10 μCl ³⁵S-Methionin 5 min lang bei 30°C gepulst. Die Zellen wurden zentrifugiert und in 50 μl „Crackingpuffer" (60 mM Tris-HCl, pH 6,8, 1% SDS, 1% 2-Mercaptoethanol, 10% Glycerin und 0,01% Bromphenolblau) resuspendiert. Die Proben wurden 3 min lang auf 100°C erwärmt, und 20 μl wurden auf ein 10% SDS-PAGE-Gel aufgebracht. Nach der 2,0 Stunden langen Elektrophoress bei 15 mA in einem Mighty Small^TM-Gerät (gemäß Anleitung von Hoefer Scientific Instruments) wurde das Gel getrocknet und 2 Stunden lang bei Raumtemperatur einem Röntgenfilm ausgesetzt. Eine einzelne 44 kDa-Bande, welche der molekularen Größe von Harpin entsprach, wurde sowohl bei E. coli DH5ɑ- als auch Ea321-Konstrukten beobachtet. Die 44 kDa-Bande, die von diesem System exprimiert wurde, wurde auch mit dem anti-Harpinantikörper reagieren gelassen, der in Kaninchen gezüchtet wurde (Beispiel X). Dieses Experiment legte dar, dass das 1,3 kb-HindIII-Fragment das gesamte offene Leseraster (open reading frame) enthält, der das 44 kDa-Harpinprotein kodiert.
Die Nukleinsäuresequenz des hrpN-Gens gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wurde gemäß dem folgenden Beispiel bestimmt.
BEISPIEL XII
Die DNA-Sequenzieranalyse wurde mit dem Didesoxy-Kettenabbruchverfahren durchgeführt (Sangen 1977, PNAS 74:5643–5667). Die Sequenzen wurden von beiden Strängen unter Verwendung entweder des Universalprimers oder des T3-Primers überprüft. Die Subklone, die durch KpnI und Pt+l von dem 1,3 kb-HindIII-Fragment erzeugt wurden, wurden direkt als Matrizen zum Sequenzieren verwendet. Die Nukleotidsequenz von hrpN wurde bei der Genbank eingereicht und ihr wurde die Zugangsnummer M92994 zugewiesen. Die Nukleotidsequenz ist nachstehend gezeigt.
In dieser Sequenz ist das offene Leseraster (einschließlich des Stoppcodons TGA), welches exprimiert wird, um die Aminosäuresequenz für Harpin bereitzustellen, wie folgt:
Die Überexpression des hrpN-Gens zum Produzieren großer Mengen Harpin ist im folgenden Beispiel dargestellt:
BEISPIEL XIII
Ein neues Plasmid, das mit pCPP50 bezeichnet ist, wurde besonders für hohe Expression von Harpin wie folgt konstruiert:
Der Expressionsvektor pINIII¹¹³-A2 [siehe Bio/Technology, S. 81–85 (Jan. 1984)] wurde modifiziert. Er wurde mit der Restriktionsendonuklease XbaI und HindIII gespalten, welches zwei Fragmente ergab. Das kleinere DNA-Fragment wurde verworfen und durch einen Teil des pBluescript SK-Polylinkers ersetzt (XbaI zu HindIII). Diese Manipulationen entfernten die Ribosomenbindungsstelle und das Startcodon (ATG) von pINIII¹¹³-A2 und ersetzten sie durch mehrere nützliche Klonierungsstellen (XbaI, SpeI, BamHI, SmaI, PstI, EcoRV, HindIII, BamHI). Der so erhaltene Vektor (pCPP50) wurde in Verbindung mit dem hrpN-Gen verwendet, um die Superproduktion von Harpin durch E. coli zu erleichtern.
Das Plasmid pCPP1084, das hrpN (Beispiel VII) enthält, wurde mit der Restriktionsendonuklease HindIII gespalten. Das 1,3 kB-HindIII-DNA-Fragment wurde von einem Agarosegel gereinigt, und in pCPP50 ligiert, welches auch mit HindIII gespalten und mit Alkalischer Phosphatase behandelt worden war. Die DNA wurde in E. coli DH5ɑ transformiert. Mehrere Transformanten wurden auf einem SDS-Polyacrylamid-Gel auf Produktion eines Proteins, das der bekannten Mobilität von Harpin entspricht, abgesucht. Ein Klon, bezeichnet als pCPP2139, produzierte große Mengen Harpin.
Große Mengen Harpin wurden in E. coli DH5ɑ(pCPP2139) gemäß dem folgenden Verfahren produziert: E. coli DH5ɑ(pCPP2139) wurde in M9-Minimalmedium, das mit 5 g/l Casaminosäuren und 40 mg/l Thiamin ergänzt war, wachsen gelassen. Die Bakterien wurden weitere 20 Stunden lang bei 37°C wachsen gelassen. Das Harpin wurde aus den Bakterien gemäß Beispiel III isoliert.
Harpin, das durch E. coli DH5ɑ(pCPP2139) produziert wurde, war in Tabakblattanalysen aktiv und es wies dasselbe Molekulargewicht auf SDS-Polyacrylamid-Gelen auf und reagierte mit anti-Harpinantiserum (Beispiel X) wie Harpin, das durch E. coli DH5ɑ(pCPP430) produziert wurde.
In Verdünnungspunkt-Tabakblattanalysen wies CFEP, das von E. coli DH5ɑ(pCPP2139) produziert wurde, eine detektierbare Aktivität bei einer 1:150-Verdünnung auf. E. coli DH5ɑ(pCPP430) wies eine detektierbare Aktivität nur bei einer 1:10-Verdünnung auf. Folglich produzierte E. coli DH5ɑ(pCPP2139) mindestens 15mal so viel Harpin wie E. coli DH5ɑ(pCPP430). Die Ergebnisse, auf die Bezug genommen wird, sind in der folgenden Tabelle tabelliert. TABELLE 2

+ = positive Reaktion, Kollaps von Tabakgewebe wie in der Überempfindlichkeitsreaktion;
– = negative Reaktion, kein Kollaps von Tabakblattgewebe

Ähnliche Schlussfolgerungen wurden durch Untersuchungen von SDS-Polyacrylamid-Gelen gezogen, die Harpinproduktionen von den beiden Konstrukten enthalten.
Zusätzlich zur Bestimmung von hrpN in E. amylovora und weil angenommen wird, dass Harpin der Archetyp für eine Familie von proteinartigen HR-Auslösern ist, die durch viele verschiedene phytopathogene Bakterien produziert werden, wurde die Identifizierung von hrpN-Homologen auch in Erwinia chrysanthemi und Erwinia stewartii gemäß dem folgenden Protokoll aufgespürt.
BEISPIEL XIV
Das 1,3 kB-HindIII-DNA-Fragment von pCPP1084, das hrpN enthält, wurde als eine radioaktive Sonde gegen 18 vorher gezeigte Cosmide verwendet, um hrp-Gene vom E. chrysanthemi-Stamm AC4150 zu enthaften. Ein Cosmid, pCPP2157, hybridisierte stark mit dem HrpN-Klon unter hochstringenten Bedingungen (Waschungen erfolgten in 0,4 × SSC, 0,2% SDS, 65°C). Das Cosmid wurde in weiteren Analysen verwendet. Ein 800 bp-C/a1-Fragment von pCPP2157, welches mit der HrpN-Sonde hybridisiert, wurde in pBluescript SK kloniert, wobei pCPP2140 erhalten wurde. Das anfängliche DNA-Sequenzieren (unter Verwendung von Sequenase-Kit Version 2.0 U.S. Biochemicals) von einem Ende des 800 bp-C/a1-Fragments zeigte eine Region von 224 Nukleotiden mit 72%-Nukleotid-Identität. Sequenzvergleich wurde mit FASTA durchgeführt, und die Nukleotidsequenz für E. chrysanthemi, die dem E. amylovora-hrpN entspricht (beste Übereinstimmung), von Nukleotid 1005 bis 1223 zeigt eine Identität von 72% an.
Die E. chrysanthemi-Sequenz ist nachstehend angegeben:
Unter Verwendung eines ähnlichen Protokolls wurde das 1,3 kB-HindIII-DNA-Fragment von pCPP1084 verwendet, um eine DNA von E. stewartii zu untersuchen. Genomische DNA von Stamm DC283 und DNA des Cosmidklons pES411 [siehe Coplin et al., Mol. Plant-Microbe Interactions. 5:266–268 (1992)] wurden mit HindIII hydrolysiert, elektrophoretisch getrennt und hybridisiert. Ein 1,8 kB-HindIII-DNA-Fragment aus beiden DNA-Herstellungen hybridisierte mit der Sonde. Diese Ergebnisse zeigen an, dass hrpN von E. amylovora Homologie mit einem hrpN-ähnlichen Gen von E. stewartii teilt.
Die Wirkung der beiden Wege der Inaktivierung von Harpin auf die Krankheitsschwere in Pflanzen ist nachstehend beschrieben.
BEISPIEL XV

Inaktivierung von Harpin durch Umsetzung von E. amylovora-Zellen mit einem Antiserum, spezifisch für Harpin (Beispiel X), oder einer Protease, die Harpin abbaut (Beispiel VII), haben eine Verringerung der Krankheit der Birne, die durch E. amylovora verursacht wird, zur Folge. Unreife Birnenfrucht, die geerntet wurde, als die Frucht einen Durchmesser von 3–4 cm aufwies, wurde oberflächendesinfiziert, der Länge nach in Hälften geschnitten und auf angefeuchtete Papiertücher gelegt. Vertiefungen wurden mit einem Nummer 1-Korkbohrer in die Wangen der Frucht geschnitten (siehe Beer, S.V. Methods in Phytobacteriology, S. 372–375 (1990) Klement, Z., Rudolf, K. und Sands, D. Hrsg). Ein ml einer Kultur von Ea321 (2 × 10⁸ cfu/ml) wurde mit 50 μl und 100 μl einer 1:25-Verdünnung der anti-Harpinantiseren gemischt (Beispiel X) und nach 5 Minuten wurden 50 μl des Gemisches in der Vertiefung jeder Birnenfrucht abgelegt. In ähnlicher Weise wurden vor dem Ablegen in den Vertiefungen in der Birnenfrucht Suspensionen von Ea321 mit Protease gemischt. Die Birnen wurden bei 27°C inkubiert und 3 Tage lang täglich beobachtet. Kontrollen bestanden aus Zellen, die nicht behandelt wurden, und Zellen, die mit dem Präimmunserum gemischt wurden, das von demselben Kaninchen genommen wurde. Die Ergebnisse sind nachstehend tabelliert:

Behandlung	Infektion
Ea321	8/8
Ea321 + Protease (100μg/ml)	6/8
Ea321 + Protease (200 μg/ml)	5/8
Ea321 + Antiserum(50 μl/ml)	5/8
Ea321 + Antiserum (100 μl/ml)	5/8
Ea321 + Präimmunserum (100 μl/ml)	8/8

Behandlung von E. amylovora entweder mit Protease oder Harpin-spezifischem Antiserum verringerte die Anzahl der Birnenfrüchte, die infiziert wurden. Behandlung mit Präimmun- (normalem) Serum hatte keine Wirkung auf die Entwicklung der Krankheit. Der vorstehend beschriebene Test der Wirkung von zwei Behandlungen, die Harpin beeinflussen, ohne die Vitalität oder das Wachstum von E. amylovora zu beeinflussen, war besonders hart. Nur das Harpin, das auf den behandelten Zellen vorliegt, könnte beeinflusst werden, weil das Antiserum oder das Enzym nicht vorliegen könnten, um sich mit Harpin auf den Nachkommen von den behandelten Zellen umzusetzen. Unter Bedingungen, die für die praktische Verwendung ins Auge gefasst wurden, würden anti-Harpinantikörper durch Pflanzen produziert werden, die mit den Genen transformiert wurden, die anti-Harpinantikörper oder Protease kodieren, und diese wiederum würden die Krankheitsschwere der Pflanze, die dem Auslöser ausgesetzt wurden, hemmen oder vermindern. Auch von Natur aus ist es wahrscheinlich, dass die Behandlung von blühenden Apfel- oder Birnenbäumen mit Protease oder anti-Harpinantikörpern größere Verringerungen des Feuerbrands zur Folge hat, weil Infektionen allgemein durch eine kleine Anzahl von Zellen initiiert werden, im Gegensatz zu etwa 10⁸, wie sie im vorstehenden Beispiel verwendet wurden.
Folglich gibt es, um die vorliegende Offenbarung zusammenzufassen, einen starken Beweis, dass Harpin der Archetyp für proteinartige Faktoren ist, die pflanzenpathogenen Bakterien (und möglicherweise anderen pathogenen Mikroorganismen) ermöglichen, entweder die Überempfindlichkeitsreaktion in Nichtwirten auszulösen oder die Krankheit in Wirten zu fördern. Zunächst lösen die Stämme der drei Gattungen Erwinia, Pseudomonas und Xanthomonas eine sehr ähnliche (visuell und physiologisch) Überempfindlichkeitsreaktion aus, wenn sie in Blätter von ihren jeweiligen Nichtwirtspflanzen infiltriert wurden. Diese Beziehung ist fast seit der Entdeckung der Überempfindlichkeitsreaktion 1963, die durch Bakterien ausgelöst wird, dokumentiert worden. Außerdem sind die Gene, die zum Auslösen der HR durch Stämme aller drei Gattungen von Bakterien erforderlich sind (entsprechend bezeichnet als hrp-Gene), auch jene, die sowohl für die Pathogenität gegenüber Wirtspflanzen als auch für das Auslösen der Überempfindlichkeitsreaktion in Nichtwirtspflanzen erforderlich sind.
Die Beziehung zwischen hrp-Genen unter phytopathogenen Bakterien ist in Studien von Laby und Beer dokumentiert worden [Molecular Plant Microbe Interactions 5:(1992); R.J. Laby, Molecular studies on pathogenicity and virulence factors of Erwinia amylovora, M.S. Thesis, Cornell University, Ithaca, NY 1991]. Sie zeigten abschließend Verhältnisse auf der DNA-Ebene zwischen dem hrp-Gencluster von E. amylovora und dem hrp-Gencluster von Pseudomonas syringae, sowie das Verhältnis zwischen dem hrp-Gencluster von E. amylovora und dem wts- (wasseraufsaugenden) Gencluster von E. stewartii. Andere Arbeiter haben eine auffallende Beziehung unter den hrp-Genen von verschiedenen P. syringae-Pathovaren (Stämmen von P. syringae, die pathogen gegenüber spezifischen und verschiedenen Pflanzen sind) dargelegt. Noch andere Forscher haben eine enge Beziehung zwischen hrp-Genen von Stämmen von Xanthomonas campestris und P. solanacearum dargelegt. Folglich gibt es einen überwältigenden Beweis für konservierte DNA unter pflanzenpathogenen Bakterien von mehreren Gattungen, die eine Krankheit bei einer Vielzahl von Pflanzen verursachen.
Die wesentliche Ähnlichkeit in der DNA-Sequenz zwischen dem hrpN-Gen von E. amylovora und einem homologen Gen von E. chrysanthemi gemäß der vorliegenden Erfindung ist auch gezeigt worden. Außerdem haben wir starke Hybridisierung zwischen hrpN und genomischer DNA von E. stewartii, einem scherwiegenden Pathogen von Mais, beobachtet. Genauer wurde Hybridisierung zwischen hrpN und einem spezifischen 1,8 kB-HindIII-Fragment des wts-Genclusters beobachtet. Dieses zeigt an, dass die anderen beiden Spezies von Erwinia, die bis jetzt untersucht wurden, hrpN-Homologe aufweisen. Folglich kann wesentliche Ähnlichkeit in den hrpN-ähnlichen Genprodukten (Protein) gemäß der Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung erwartet werden.
Außerdem scheinen viele der hrp-Gene von E. amylovora an der Sekretion der Zelloberflächenexposition von Harpin, beruhend auf dem Phänotyp von Mutationen in jenen Genen, beteiligt zu sein. Ein Gen des hrp-Genclusters von Pseudomonas syringae, welches mit einem Teil des hrp-Genclusters von E. amylovora hybridisiert, kodiert ein Protein mit einer hohen Aminosäureähnlichkeit mit Proteinen, die an der Sekretion in verschiedenen gramnegativen Bakterien beteiligt sind.
Folglich stellen die bekannten Ähnlichkeiten der hrp-Gene von Pseudomonas, Xanthomonas und Erwinia eine feste Grundlage bereit, um zu vermuten, dass es wahrscheinlich ist, dass die HR-Auslöser, die von Stämmen der drei Gattungen produziert werden, in der Aminosäuresequenz oder mindestens in allgemeinen Eigenschaften (Protein) und in der Funktion ähnlich sind.
Die Verwendungen, in welche die verschiedenen Ausführungsformen und Teile der vorliegenden Erfindung gebracht werden können, sind viele und verschiedenartig. Zum Beispiel können hrpN-Mutanten verwendet werden, um durch Komplementierung Gene von anderen pflanzenpathogenen Organismen (z.B. Bakterien, Pilzen, Nematoden) zu identifizieren, die Proteine kodieren, die ähnlich wie Harpin arbeiten. Obwohl derartige Proteine im Wesentlichen verschiedene Primärstrukturen haben können (und deshalb schwer durch DNA-Hybridisierungstechniken zu detektieren sind), sollten diese Proteine die Fähigkeit wiederherstellen, die HR entweder gegenüber E. amylovora- oder E. coli-Zellen auszulösen, die ein hrp-Cluster tragen, das funktionell war, außer dem hrpN-Gen.
Eine andere Verwendung innerhalb des Schutzbereichs der vorliegenden Offenbarung ist, Harpin und/oder Harpin-produzierende Stämme zu verwenden, um in den Pflanzen Harpinrezeptoren und/oder ihre Interaktanten in Signalübertragungswegen zu identifizieren und ihre kodierenden Gene zu klonieren. Folglich würde dieses erlauben, das Potential von Harpin zu nutzen, (in Abhängigkeit von der Pflanze) als Pathogenitätsfaktor oder als Auslöser von Verteidigungsreaktionen zu arbeiten, um die Struktur oder Expression vom/n Pflanzengene(n) zu manipulieren, das/die (einen) Harpinrezeptor(en) kodiert/en, um gentechnologisch veränderte Pflanzen mit verbessertem Widerstand gegenüber Pflanzenpathogenen herzustellen.
Noch eine andere Verwendung von Harpin innerhalb des Schutzbereichs der vorliegenden Offenbarung würde als ein Potentiator von Sekundärmetabolitproduktion in Pflanzen sein, die entweder natürlich oder in der Gewebekultur gewachsen sind.
Noch eine andere Verwendung würde die Fusion des Gens, das Harpin kodiert, mit bestimmten Promotoren von Pflanzengenen sein, um bestimmte transgene Pflanzen zu entwickeln. Wenn das Pflanzengen „eingeschaltet" ist, würde Harpin exprimiert und die Pflanzenzelle abgetötet werden. Einige geeignete Pflanzengenpromotoren und ihre geplanten Verwendungen schließen Gene, die an der Pollenentwicklung beteiligt sind (was Entwicklung von männlichen sterilen Pflanzen zur Folge hat); Gene, die als Reaktion auf die Infektion durch Pilze exprimiert werden, z.B. Gene, die die Phenylalanin-Ammonium-Lyase und die Chalcon-Synthase kodieren (die Pflanzenzelle würde abgetötet werden, wodurch das Fortschreiten des Pilzes beschränkt und die Pflanze resistent gegen Pilzerkrankungen gemacht wird); und Gene ein, die an der Entwicklung des Alterns beteiligt sind (um die Ernte zu erleichtern, würde die Expression von hrp-Genen Entlaubung zur Folge haben).
Noch eine andere Verwendung von Harpin innerhalb des Schutzbereichs der vorliegenden Offenbarung würde die Verwendung von Harpin als ein „Zielmolekül" sein, mit welchem chemische Verbindungen konstruiert werden würden, um mit dem Bakterienharpin zu reagieren und dadurch zu inaktivieren, welches, weil es für die Krankheit essentiell ist, ein spezifisches Bakterizidziel bereitstellen würde.
Ein Verzeichnis des Nukleotids und der Aminosäuren, die im vorliegenden Patent beschrieben wurden, sind wie folgt:
Sequenzverzeichnis
Folglich sollte es, während wir die bevorzugte Ausführungsform unserer Erfindung veranschaulicht und beschrieben haben, selbstverständlich sein, dass diese Erfindung zur Veränderung und Abwandlung in der Lage ist, und wir deshalb nicht wünschen, auf die exakten aufgezeigten Begriffe beschränkt zu werden, sondern uns selbst wünschen, von derartigen Änderungen und Abänderungen Gebrauch zu machen, welche zum Anpassen der Erfindung an verschiedene Verwendungen und Bedingungen gemacht werden können. Derartige Veränderungen und Abwandlungen würden zum Beispiel die Substitution von strukturell ähnlichen Sequenzen sowohl für den Auslöser als auch die hrpN-Gene einschließen, die hier bereitgestellt werden (ob sie von natürlichen Quellen abgeleitet oder synthetisch hergestellt sind), welche arbeiten, um im Wesentlichen ähnliche Aktivitäten zu jenen, die vorstehend spezifisch beschrieben sind, zu ergeben. Folglich werden Änderungen in der Sequenz durch Substitution, Deletion, Insertion oder Addition von Nukleinsäuren (in den DNA-Sequenzen) oder Aminosäuren (in den Peptidsequenzen), welche die Funktion jener Sequenzen, die vorstehend spezifisch beschrieben sind, im Wesentlichen nicht ändern, als innerhalb des Schutzbereichs der vorliegenden Erfindung liegend betrachtet. Dementsprechend sollen derartige Änderungen und Abänderungen richtigerweise innerhalb des vollen Bereichs von Äquivalenten und deshalb innerhalb des Geltungsbereichs der folgenden Patentansprüche liegen.
Wir haben folglich unsere Erfindung und die Art und Weise und ein Verfahren zur Herstellung und Verwendung von dieser in derartig vollständigen, klaren, knappen und genauen Begriffen beschrieben, so dass jedem Fachmann, dessen Fachgebiet er angehört oder mit welchem Fachgebiet er am engsten verbunden ist, ermöglicht wird, dasselbe durchzuführen und zu verwenden.

Claims

Protein, das eine hypersensitive Reaktion in verschiedenen Pflanzenarten hervorrufen kann, wenn es unter normalen Pflanzenwachstumsbedingungen in Blattgewebe einer Pflanze eingebracht wird, wobei das genannte Protein durch eine Nucleinsäuresequenz kodiert ist, die mit einer zu einer Nucleinsäure mit SEQ ID Nr. 4 komplementären Sequenz unter stringenten Bedingungen von 0,4 × SSC, 0,2% SDS, Wäsche bei 65°C, hybridisieren kann.
Peptid nach Anspruch 1, das einem Hypersensitivitätsreaktions-Elicitorpeptid von einem Erwinia-, Pseudomonas- oder Xanthomonas-Pathogen entspricht.
Peptid nach Anspruch 1 oder 2, das proteasesensitiv und sauer ist, eine Molekülgröße von etwa 44 kD und einen pI von etwa 4,3 hat und bei 100°C wenigstens eine Minute lang wärmebeständig ist.
Peptid der Gruppe bestehend aus

ein ähnliches Peptid mit wenigstens einer Aminosäureaddition, ein ähnliches Peptid mit wenigstens einer Aminosäuredeletion, ein ähnliches Peptid mit, wenigstens einer Aminosäuresubstitution und ein ähnliches Peptid mit wenigstens einer Aminosäureinsertion, unter der Voraussetzung, dass eine solche Addition, Deletion, Substitution und Insertion nicht die Hypersensitivitätsreaktion auslösende Aktivität des Peptids hemmt.
Gen zum Einsetzen in einen geeigneten Wirt, um die Expression von Harpin zu ermöglichen, das aus einer Nucleinsäuresequenz besteht, ausgewählt aus der folgenden Gruppe:
einer ähnlichen Sequenz mit wenigstens einer Nucleinsäureaddition, einer ähnlichen Sequenz mit wenigstens einer Nucleinsäuredeletion, einer ähnlichen Sequenz mit wenigstens einer Nucleinsäuresubstitution und einer ähnlichen Sequenz mit wenigstens einer Nucleinsäureinsertion, in Kombination mit einem Vektor zum Einsetzen der Sequenz in den geeigneten Wirt, und unter der Voraussetzung, dass eine solche Addition, Deletion, Substitution und Insertion nicht die Expression von Harpin mit Hypersensitivitätsreaktion auslösender Aktivität hemmt.
Peptid nach einem der Ansprüche 1, 2 oder 3, wobei das genannte Peptid gereinigt, rekombinant ist oder kein Cystein hat.
DNA-Molekül, das ein Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 3 und 6 kodiert.
DNA-Molekül nach Anspruch 7, wobei das DNA-Molekül eine Nucleotidsequenz entsprechend SEQ ID Nr. 4 hat.
DNA-Molekül nach Anspruch 7 oder 8, wobei das genannte Peptid eine relative Molekülmasse von 94 kDa auf einem SDS-Polyacrylamidgel hat.
Expressionssystem, das ein DNA-Molekül nach einem der Ansprüche 7, 8 oder 9 enthält.
Wirtszelle, die ein DNA-Molekül nach einem der Ansprüche 7, 8 oder 9 enthält.
Wirtszelle nach Anspruch 11, wobei die genannte Wirtszelle Escherichia coli DH5 (pCPP430) ist.
Wirtszelle nach Anspruch 11, wobei die genannte Wirtszelle die ATCC-Beitrittsnummer 69021 hat.
Wirtszelle nach einem der Ansprüche 11 bis 13, wobei das DNA-Molekül in einem Expressionssystem ist.