JPH07509604A - 植物の過敏反応の誘導因子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 植物の過敏反応の誘導因子 本発明をなすに至った研究についての部分的支持は、合衆国農務省からの基金に より与えられた。従って合衆国政府は、３５ＵＳＣ２００以下参照の下、本発明 に対し、ある不動の権利を有する。

ヒト及び動物と同様に植物も細菌による傷害及び破壊を受ける。世界的基準で、 エルウィニア、シュードモナス及びキサントモナス属に分類される細菌は、細菌 性植物病原体によるほとんどの破壊に関与する。植物の多（の細菌性病気は、農 民に散発的基準で大きな破壊をもたらす。破壊は、冒された植物の死滅、外観破 損又は生産力減少に起因する。

植物の多くの細菌病原体は、それらが感染する植物への顕著な程度の特異性を示 す。例えばエルウィニア・アミロボラは、リンゴ、ナシ及びロサヶアエ族の関連 植物に感染する。他の植物は、Ｅ、アミロボラにさらされても病気にならない。

しかしながら、十分な細胞のＥアミロボラが他の植物の葉組織に導入されると、 葉肉組織は数時間内に崩壊する。この崩壊は過敏反応（ＨＲ）と呼ばれており、 ＨＲの間、細菌は崩壊組織内に範囲を定められ、結局死滅し、従って全体として 植物に大きな損害を与えないので、それは植物の防御反応と考えられる。

細胞性植物病原体がＨＲ誘導能力を必要とする遺伝子は、過敏反応及び病原性に 対するｈｒｐ遺伝子と呼ばれ、又、病気を起こすために必要とされる。しかしな がら、ｈｒｐ遺伝子の生成物並びにどのようにそれらがＨＲの誘導中、及び病気 の発展中に作用するかは、本発明前、未知の状態にあった。本発明はＨＲに見ら れる崩壊の原因であり、病気の発展に必要であるｈｒｐ遺伝子（誘導因子）の生 成物に関する。

細菌病原体とそれらの植物宿主との間の相互作用は、一般に二つのカテゴリー（ １）宿主植物での細胞内細菌生育、症状発展及び病気発展に導く適合性（病原体 宿主）並びに（２）進行性病気症状ではな（、起きる特別な型の不適合性相互作 用、過敏反応となる不適合（病原体非宿主）に分けられる。宿主植物での適合性 相互作用の間、細菌集団は劇的に増加し、進行性症状が起きる：不適合性相互作 用の間、細菌集団は増加せず、進行性症状は起きない。

高い植物の過敏反応は、不適合性病原体（他の植物でのみ病原性である微生物） を含む組織の急速な局部崩壊及び死滅により特徴付けられ、そして多くの細菌、 かび、線虫及びウィルスに対する植物の防御と関連する〔フィトパソゲニック・ プロカリオテ入　（Ｍ、Ｓ、マウント及びＧ、　Ｈ，ラシイ編集）アカデミツク ・プレス、ニューヨーク、ｐｐ１４９−１７７　（１９８２）参照〕。細菌によ る過敏反応の惹起は、タバコ葉の細胞内空間を１０７細胞／ｍｌの不適合性病原 体で浸透したとき、１９６３年に初めて証明された。浸透領域は２４−４８時間 内に崩壊し、細菌増殖を支持するのをやめる〔ネイチャー１９９　：　２９９（ １９６３）参照〕。従って、ＨＲでは病原体は局在し、さらなる生長を制限する 。

実験室でＨＲを証明するのに用いられる技術は、容易である。タバコ葉の細胞内 空間は、慣用のまっすぐな解剖針で葉に扇形集落をまず穿刺することにより浸透 する。次いで、細菌の０．１−０．５ｍｌの細菌細胞懸濁液（通常１０’−１０ ”生存細胞／ｍ１）を含むｌ＋１容量シリンジ（針を有しない）を葉の一方の側 に対して穿刺で直接押しつける。葉の反対側に指を押しつけて葉を安定にし、穿 刺領域から液がもれるのを防ぐ一方、シリンジプランジャーをゆるやかに押しつ けて細菌呼局液を葉に導入する。浸透は、水浸漬領域が約１−４ｃｍ２葉に現れ ると成功したと考えられる。

過敏反応誘発の機構を説明するのに提案された普通の仮説は、植物細胞で特異レ セプターと反応する特異誘導因子の細菌による生成を含む。しかしながら、潜在 性病原体に対する本反応についての分子基底（遺伝子及び遺伝子生成物）は、Ｈ Ｒが１９６３年に初めて記載されて以来、植物病原体による研究が続けられてい るにもかかわらず、本発明前未知であった。

生理的及び遺伝的観察は、非宿主で過敏反応を誘導する同じ細菌因子が宿主での 病原性にも必要であることを示唆する。

過敏反応の誘導因子の生成は、幾つかのｈｒｐ遺伝子のクラスターにより調節さ れ、そしてそれは高度に保存され、又、多くの種の植物病原性細菌間でしばしば 相互交換可能である。個々の及び幾つかのｈｒｐ遺伝子は他のものによりクロー ンされて来たが、ｈｒｐ遺伝子の機能的クラスターは、エルウィナ・アミロボラ 及びツユ−トモナス・ノリンが工からのみクローンされた。これらのクラスター は、非病原性細菌にタバコ及び他の葉での過敏反応を誘導する能力を与えること を示して来た〔モレキュラー・プラント−マイクローブ・インターラクションズ ４：１３２（１９９１）、ツヤ−ナル・オブ・バクテリオロジイ１７０．４７４ ８（１９８８）及びビアー等、アトパンスズ・イン・モレキュラー・ジエネテイ クス・オブ・プラント−マイクローブ・インターラクンヨンズ（Ｈ，ヘネソク及 びり、　Ｐ、　Ｓ、パーマ編集）クルワー・アカデミツク・バブリソノヤーズ、 ボストン、ｐｐ５３−６０（１９９１）参照〕。

本発明によれば、誘導因子は、Ｅ　コリＤＨ５α（ｐＣＰＰ４３）から初めて、 次いで、リンゴやナシのようなバラ科植物の腐ラン病として知られる病気を生ず る細菌、野生型法のＥ、アミロボラから分離、精製された。本発明によれば、名 称「バービン」はＥ、アミロボラ由来の過敏反応誘導因子に提案される。本誘導 因子は、多くの異なる植物病原性細菌により生成されるプロテナーゼ性（ｐｒｏ ｔｅｉｎａｃｃｏｕｓ）　）（Ｒ誘導因子の族についての原型であると考えられ る。

従って、本発明の一局面は、細菌から分離された特異誘導因子蛋白が、非宿主植 物に適用したとき、蛋白を生成した細菌の生存細胞により惹起される反応と類似 の毒性反応を生ずることを記載することである。本発明の別の局面は、誘導因子 をコード化している遺伝子を分離し、記載することであり、それは正確に調節さ れた方法でその毒性効果を発揮する誘導因子蛋白を植物又は他の生物に生じさせ るのに用い得よう。

本発明の別の局面は、これらの蛋白を不活性化し、死滅し又はこれらと結合する 技術の計画及び開発を可能にするこれらの蛋白の特徴付は及び同定を提供するこ とである。本局面は、細菌の宿主植物に病気を生ずるためにそれらを生成する細 菌により同一蛋白が必要とされることが知られているので、必要とされる。蛋白 の毒性効果を中和することは、病気でのそれらの役割を中和し、植物の病気を減 少させる。

本発明のさらに別の局面は、これらの蛋白に対する抗体を発達させ、生成された 抗体を配列決定し、植物のゲノムに正しく挿入された場合に、植物に抗体を発現 させるであろう核酸配列を構築し、かくして細菌が植物に病気を生じさせるのを 防止することである。

本発明の一部分は、エルウィニア・アミロボラのｈｒｐ遺伝子クラスターの特異 ｈｒｐ遺伝子の同定に基づく。その特異遺伝子は転写され、翻訳されて過敏反応 のそのプロテナーゼ性誘導因子を生じる。本発明の他蛋白は、エルウィニア、キ サントモナス及びＥアミロボラ由来のＨＲ誘導因子と類似の蛋白をコード化して いる／ニードモナス種からの同種遺伝子の同定を処理する。本発明の完成前、過 敏反応のプロテナーゼ性誘導因子の分離は報告されていない。従って、本発明の 他の部分は、過敏反応のプロテナーゼ性誘導因子の分離及び精製の技術の記載で ある。本発明の付加的部分は、バーピンの生成を増強するＨＲ誘導因子蛋白をコ ード化している遺伝子の遺伝操作に関する。

従って、本発明の種々の部分及び局面は、リンゴ、ナシ及び他のバラ科植物の腐 ラン病の病原体、エルウィニア・アミロボラに対する予防を提供することに係る と要約しつる。加えて、本発明は広く、種々の植物の他の病気を起こすエルウィ ニア、シュードモナス及びキサントモナス属の細菌に対する予防を提供すること に係る。

本発明のよき理解を与えるために、本発明の記載に引用される細菌種、コスミド 及びプラスミドに関連する以下の用語を示す。

ＤＨ５α　クローニングに通常通りに用いられるエセリシア・コリの実験棟、 Ｅａ３２１　全てのミュータント及びクローンが誘導されたエルウィニア・アミ ロボラの野生型法、 Ｂａ３２１Ｔ１４３　Ｈｒｐ機能の回復のためのニスミドライブラリイ（ｐＣＰ Ｐ９ベクター中）をスクリーンするのに用いたトランスポゾンＴｎ５を含むミュ ータント。本スクリーニングの結果、ニスミドｐｃＰＰ４３０の同定となった。

（本ミュータントはｈｒｐ遺伝子の一つに挿入を有し、ｈｒｐＮはな（、挿入の 影響は、オペロンの変異誘発によりバーピンの発現を防止することである。） Ｂａ３２１に４９　バーピン生成の調節に含まれるｈｒｐ遺伝子に挿入されるＴ ｎｌＯミニｋａｎ　）ランスポゾンを含むｈｒｐミュータント。

Ｂａ３２１Ｔ５　Ｔｎ５ｔａｃｌ無極トランスポゾンにより変異誘発されたｈｒ ｐＮ遺伝子を含むｈｒｐミュータント。（本Ｅａ３２１のミュータントはバーピ ンをコード化している遺伝子に挿入を有する）。

ｐＣＰ　Ｐ　９　Ｅ、アミロボラのＤＮＡのクローニングのために構築したコス ミドベクター。ｐｃＰＰ４３０のベクタ一部分。

ｐｃ　Ｐ　Ｐ　４３０　Ｂａ３２１全ｈｒｐ遺伝子クラスターを含む４６．５ｋ ｂのＢａ３２１ＤＮＡを含んでいるニスミド。本コスミドは、Ｅ。

コリにＨＲを惹起する能力を与え、Ｈｒｐ表現型をＥ、アミロボラの全Ｈｒｐミ ュータントに回復する。ｈｒｐＮが誘導されたクローン。

ｐｃＰＰ１０８４　ｐｃＰＰ４３０由来の１．３ｋｂＨｉｎｄｌ［Ｉ断片を含ん でいるプラスミドで、それは全ｈｒｐＮ　（１１５５塩基対）を含む。ベクター はｐ　Ｂ　１ｕｅｓｃｒｉｐｔ　Ｍ　１３．である。

ｐｃＰＰ５０　マスイ等（バイオ／チクノロシイ、１９８４年１月ｐｐ８１−８ ５）のｐｌＮＩＩＩ■３−Ａ２を修飾することにより発達させたプラスミド。元 の断片は削除し、ｐ　Ｂ　１ｕｅｓｃｒｉｐｔ由来の断片を挿入した。修飾を行 いバービン生成により適したベクターを産生させるようにした。

ｐｃＰＰ２１３９　Ｅ、：Ｉりで、バーピンの過生成（ｓｕｐｅｒｐｒｏｄｕｃ ｔｉｏｎ）となるプラスミド。ｐｃＰＰ４３０からｐｃＰＰ５０ｉ：ｈｒｐＮ遺 伝子をクローニングすることにより構築される。

ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　Ｍ１３４　ＤＮＡのサブクローニング及び配列決定に 通常通りに用いられるプラスミド。クローン化ＤＮＡから蛋白のインビトロ発現 にも用いられる。

さらに、本明細書全般で用いられるこれらの及び他の用語は、モレキュラー・プ ラント−マイクローブ・インターラクンヨンズ４　（り）　：　４９３（１９９ １）及びアトパンスズ・イン・モレキュラー・ジエネティクス・オブ・プラント ーマイクローブス・インターラクション１　：　５３（１９９１）に見出しうる 。

Ｅ、コリＤＨ５α（ｐｃＰＰ１０８４）及びＥ、アミロボラＥａ３２１はいずれ もメリーランド、ロックビルのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション に寄託されている。これらの寄託番号は、それぞれＡＴＣＣ６９０２１及びＡＴ ＣＣ４９９４７である。ＡＴＣＣ６９０２１の寄託は、ブダペスト条約の下にな され、培養株は本条約の規定に従って入手することができるであろう。

本発明によるＨＲ誘導因子及び遺伝子の同定、分離、精製及び特徴付けに関する 種々の局面は、以下の図面及び実施例からより明らかに理解でき、それらの全て は本発明を明瞭にする目的のために提供されるのであって、その範囲を限定する ためのものではない。

図１は、エルウィニア・アミロボラのｈｒｐクラスターの制限エンドヌクレアー ゼマツプであり、そして 図２は、タバコ細胞浮遊培養の水浴溶液（ｂａｔｈｉｎｇ　５ｏｌｕｔｉｏｎ） のｐＨの変化を描く。

より詳しくは、図１はエルウィニア・アミロボラのｈｒｐクラスターの制限エン ドヌクレアーゼマツプを示し、ｒＥＪはＥｃｏＲＩを示し、ｒＨＪはＨｉｎｄＩ ＩＩを示し、そしてｒＢＪはＥ３ａｍＨ１３日部位を示す。斜線はＨＲを惹起し 、ナシに病原性である能力に対するそれらの効果を試験したトランスポゾン挿入 の位置を示す。

全ての示された挿入を伴うエルウィニア・アミロボラＥａ３２１（モレキュラー ・プラント−マイクローブ・インターラクションズ１　（３）　：１３５（１９ ８８）参照〕及びＥ、コリＤＨ５α（ｐｃＰＰ４３０）の代謝活性細胞は、タバ コでの過敏反応を起こすことができない。全ての示された挿入により囲まれた部 分は、タバコ細胞浮遊培養のＫ”／Ｈ”交換反応の惹起にとっても必須である。

全ての示された挿入を含んでいるＢａ３２１の誘導体はナシに対し病原性でない 。

図２についてより詳しくは、コントロール値（付加なし）はグラフ作成前に引い た。白画角はバーピン（６０ｎＭ）を示し、白丸はＥ、コリＤＨ５α（ｐＣＰ　 Ｐ２Ｓ５）の細胞（５Ｘ　１０’細細胞用１）を示し、黒画角はＥ、アミロボラ Ｅａ３２１の細胞（５ｘｌＯ’細胞／ｍ１）を示し、三角はＥ、コリＤＨ５（Ｉ Ｅ　（ｐＣＰＰ４３０に４９）の細胞（５Ｘ　１０’細胞／ｍｌ）を示し、菱形 はＥ、アミロボラＥａ３２１に４９の細胞（５Ｘ　１０’細！／１１１１）を示 し、そして黒丸はＥ、コリＤＨ５α（ｐＣＰＰ９）の細胞（５Ｘ１０’細胞／ｍ ｌ）を示す。タバコ細胞浮遊培養は示された調製物と共に室温で振盪した。ｐＨ を示された間隔で測定した。タバコ葉でＨＲを惹起した全ての調製物もタバコ細 胞浮遊培養媒体中ｐＨ上昇を生じた。

実施例１ プラスミドｐｃＰＰ４３０は、Ｂａ３２１として我々の実験室で知られるＥ、ア ミロホラの野生型株のゲノムＤＮＡのライブラリィから確認し、そしてアメリカ ン・タイプ・カルチャー・コレクションに４９９４７として寄託されている。株 は、１９７８年１ニフレンチ・ナショナル・コレクション・オブ・フイトパソゲ ニツク・バクテリアから受理し、そこではそれは、ＣＮＦＢ１３６７として知ら れている。

ゲノムＤ　Ｎ　Ａを既に記載された方法〔モレキュラー・プラント−マイクロー ブ・インターラクンヨンズ１　：　１３５　（１９８８）参照〕に従って分離し 、５ａｕ３Ａで切断し、あらかじめＢａｍＨｌで切断したｐｃＰＰ９のコスミド ベクターに連結し、パッケージし、そしてＥコリ株ＥＤ８７６７に移入した。得 られるニスミドは、ヘルパープラスミドｐＲＫ２０１３［バウアー、Ｄ、Ｗ、、 モレキュラー・ジエネテイクス・オブ・パソゲニシティ・オブ・エルウィニア・ アミ口ボラ：テクニクス、ツールズ・アンド・ゼア・アプリケーション、博士論 文、コーネル・ユニバーシティ、イサ力、ＮＹ（１９８８））の助けをかりて接 合により株に移動させた。

得られるライブラリィを希釈し、スペクチノマイシン及びカナマイシンを共に最 終濃度５０μｇｍ／ｍｌを含む普通寒天のプレート上に塗布した。３７℃で２４ 時間インキュベーション後、約５００コロニーを含むプレートを、各コロニーの 直径が０．５−１．０ｍｍであるときに選択した。これらのプレートからコロニ ーを、その上に領１ｍｌの株Ｅａ３２１Ｔ１４３のＷＰ！濁液をあらかじめ塗布 した、ルリアーバータニ寒天（ＬＡ）を含むプレート上にレプリカスタンプした 。Ｂａ３２１Ｔ１４３はＢａ３２１のＴｎｌＯ誘発Ｈｒｐ−ミュータント株であ る。それはナシ果実に病原性でなく、タバコ及び他の植物でＨＲを惹起しない。

それはテトラマイ７ン（１０ｕｇｍ／ｍｌ）をプラスしたルリアブロス中、Ｏ− Ｄ、　ｇｚｏ＝　１．３まで生育した。

ＬＡプレートを５時間２８℃でインキュベートし、これらのプレート上の増殖を 、グルコース２ｇ／ｌ、アスパラギン１．５　ｇ／Ｌクエン酸ナトナトリウム０ ５ｇ／Ｌ　Ｍｇ５０４５ｍｇ／ｌ、ニコチン酸１２５ｇ／ｌ、（ＮＨ４）ｔｓＯ ４１ｇ／ｌ、Ｋ２ＨＰＯ４３，５１ｇ／ｌ、ＫＨ２ＰＯ４１，５１ｇ／ｌ及び５ ０ｍｇ／ｌスペクチノマイシン及び１０ｍｇ／ｌテトラサイクリンを含む、エル ウィニア・アミロボラの生育用の最小培地にレプリカプレートした。本操作は、 Ｂａ３２１のライブラリィの種々のニスミドを含んだＢａ３２１Ｔ１４３のトラ ンスコンシュガントを選択した。２８℃で４８時間のインキュベーション後、未 成熟なナシ果実の新しくカットした薄片をトランスコンシュガントの各薄片の表 面に押しつけてナシ薄片下方の全コロニーをナシ組織と接触させた。ナシ薄片を 上下逆にし、よく湿らせた紙タオルを並べたプラスチック箱中でインキュベート し、５日まで毎日、小滴の浸出液の存在を観察した。未熟ナシ果実は開花後約６ 週間に、ピルス・コムニスｃｖ。

バルトレトの木から採集した。果実は直径２〜４ｃｍで、それらは使用するまで ０〜２℃で貯蔵した。本発明の本記載で用いた浸出液は、大部分が生存細菌細胞 からなる植物と細菌生成物の混合物である。

浸出液は５０μｇ／＋＋１スペクチノマイノン及び１０　ＩＩｇｍ／ｍｌテトラ サイクリンを含むＥ、アミロボラ最小培地のプレート上に希釈画線し、２８℃で ２日間インキュベートし、そして個々のコロニーを無菌のようじでほぐし、Ｅａ 最小寒天＋５０μｇ／ｍｌスペクチノマイシン及び１０μｇｍ／テトラサイクリ ンの新しいプレート上で繁殖させて病原性を再び試験した。新たにカットしたナ シ果実組織をようじで突き刺し、試験すべき株で汚染した。ナシ果実に病気を生 じたこれらのコロニー由来のニスミドは、０．５アリコートのＬＢ＋ＤＨ５α、 Ｅａ３２１　Ｔ　１４３ｐａｔｈ”トランスコンシュガント（病気を起こす能力 をＥａ３２１Ｔ１４３に与えたニスミドを含んているＥａ３２１Ｔ１４３の株） 及びｐＲＫ２０１３、ヘルパープラスミドの抗菌物質培養物を一液混合すること により、Ｅａ３２１Ｔ１４３がらＤＨ５αに移した。結合物を完全に混合し、遠 心し、そしてベレットを抗生物質を存在させることなく、１５０μｍのＬブロス に懸濁した。ペレットを完全に再び懸濁し、０．１ｍ１滴をＬＡプレート上に置 き、塗布することなく寒天中にしみこま也次いでプレートを２８℃で５時間イン キュベートした。インキュベーション後、斑点のある生育物を１ｍｌの５ｍＭリ ン酸カリウム緩衝液、ｐＨ６，５に再び懸濁し、０．１アリコートをＬ　Ａ　＋ ５０　ｕｇ／ｍｌスベクチノマインン及び２０℃１ｇ／ｍｌナリジクス酸のプレ ートに塗布し、次いでこれを３７°Ｃで４８時間インキュベートした。

同時にコロニーをＬＡ＋５Ｑμｇ／ｍｌスペクチノマインン及びＬＡ＋Ｋｍのプ レートにようじで移した。５０μｇ／ｍｌスペクチノマイノンプレート上でのみ 生育し、ヘルパープラスミドｐＲＫ２０１３（Ｋｍ’）の損失を示すこれらのコ ロニーは、凍結により保存用に、そして、さらに研究するために選択した。

ナ／に病原性を回復させた同じニスミド、本明細書では以下のｐｃＰＰ４３０と いう、もタバコでＥａ３２１Ｔ１４３の反応に影響を及ぼすがどうかを測定する ため、浮ｉ液をタバコ葉扇形集落に浸透させた。ＥコリＤＨ５αに維持されるｐ ｃＰＰ４３０の効果を、タバコで試験した。株をルリアブロス＋５０μｇ／ｍｌ スペクチノマイシン中０Ｄａｚｏ　０．４　０．６　（約１０８ｃｆｕ／　ｍｌ ）に生育させた。

培養物を遠心しく１２．ＯＯＯＸｇ、１分間）　、５ｍＭＩＪン酸緩ＩＩ液ｐＨ ６，５元（７）容量中に再び懸濁し、タバコ葉に浸透させた。組織の崩壊が８時 間以内に起きた。

ＤＨ５α（単独）又はＤＨ５α（ｐＣＰＰ９）の細胞をタバコ葉に浸透させた場 合、崩壊は観察されなかった。従って、我々は、Ｅａ３２１の特異ＤＮＡを含ん でいるｐｃＰＰ４３０がＥ、コリＤＨ５αにＨＲ反応を起こす能力を与え、そし てｐｃＰＰ４３０は本反応に必要な全遺伝子を含んでいると結論付けた。

ニスミドｐｃＰＰ４３０に含まれるＥ、アミロボラ由来のｈｒｐ遺伝子はエセリ シア・コリで特によ（発現する〔アドバンシズ・イン・モレキュラー・ジェネテ ィクス・オブ・プラント−マイクローブ・インターラクションズ、上掲；フィト バソロジイ７９．１１６６（１９８９）及びモレキュラー・プラント−マイクロ ーブ・インターラクンヨンズ４　（５）　：　４９３（１９９１）参照〕。通常 、Ｅａ３２１にとってＨＲを惹起するのにｄｅｎｏｖａ　ＲＮＡ及び蛋白合成が 必要である。しかしながら、Ｅ。

：ｌｌＪ　（ｐｃＰＰ４３０）　及びＥａ３２１　（ｐｃＰＰ４３０）は細菌性 転写又は翻訳インヒビター、例えばリファンピシン及びテトラサイクリンの存在 でＨＲを惹起する。これは、ＨＲ誘導因子が、タバコ葉が細菌で浸透される前に Ｅ、コリＤＨ５α（ｐｃＰＰ４３０）の細胞中／上に存在したことを示す。

ＨＲ誘導因子の調査は、Ｅ、アミロボラＥａ３２１、Ｅａ３２１　（ｐｃＰＰ４ ３０）又はＥ、コリＤＨ５α（ｐｃＰＰ４３０）の細胞フリー培養上清でタバコ 葉を浸透させることにより始めた。上清は、対数期を送られ適当な抗生物質を含 むＬＢブロスに６株を生育させることにより生成させた（０．　Ｄ、　ｓ２ｏ： 約１．０）。他の研究者等の経験〔フィトバソロジイ５７　：　３２２（１９６ ７）参照〕に基づいて、我々が期待したように過敏反応は起きなかった。

株Ｅａ３２１　（ｐｃＰＰ４３０）は以下の方法により創生した。

実施例２ 株Ｅａ３２１、Ｅ、コリＤＨ５α（ｐｃＰＰ４３０）及びＥ、）すＤＨ５α（ｐ ＲＫ２０１３）は、抗生物質はなく、それぞれ５０μｇ／ｍｌスペクチノマイシ ン又はＫｍ５°を含有するＬＢブロスに一晩生育した。翌朝、Ｑ、５ｍｌアリコ ートの６株をミクロ遠心管中で混合し、２分間遠心し、０．１５山１のルリアブ ロス（抗生物質なし）に再び懸濁した。０．１ｍｌアリコートの本￥濁液をルリ ア寒天（抗生物質なし）上にスポットし、５時間２８℃でインキュベートした。

本スポットからの生育物を１ｍｌの５ｍＭリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ６，５に 再び懸濁し、０．１アリコートを５０μｇ／ｍｌスペクチノマイシンを含むＥ、 アミロボラ最小培地のプレート上に塗布し、ｐｃＰＰ４３０を含むＥａ３２１の 株を選択した。プレートを２８℃で２〜３日インキュベートし、個々のコロニー を５０℃１ｇ／ｍｌスペクチノマイシンを含む最小培地及びＫｍ５０を含む最小 培地に同時にようじで移した。５０ｇｇ／ｍｌスペクチノマイシンを含む培地に 生育した（ｐｃＰＰ４３０の選択を示す）がＫｍｓｏを含む培地に生育しなかっ た（ヘルパープラスミドｐＲＫ２０１３の欠損を示す）コロニーのみが、次の研 究用に選択された。

用いた全細菌の細胞フリー培養上清は過敏反応を惹起しなかったが、幾っがの細 胞の調製物は、新しい方法で１２時間以内に強力な過敏反応を惹起した細胞フリ ーの調製物となり、それは調製物が作られた細菌細胞を全て代謝することにより 惹起したものと区別できなかった。過敏反応の誘導因子を実施例３に従って本細 胞フリー誘導因子（ｅｌｉｃｉｔｏｒ）調製物（ＣＦ　Ｅ　Ｐ）から分離し、精 製し、特徴付けた。

本発明によるＥ、コリ　ＤＨ５α（ｐｃＰＰ４３０）由来のバービンを含有する ＣＦＥＰの分離を以下の実施例に記載する。

実施例３ Ｅコリ　ＤＨ５α（ｐｃＰＰ４３０）の細胞をルリアーベルタニ（ＬＢ）培地に ０Ｄ６２０＝０．８まで生育させ、遠心により収集し、０．１ｍＭフェニルメチ ルスルホニルフリオリド（ＰＭＳＦ）、セリンプロテアーゼインヒビターを含む 元の容量の１／１０の５ｍＭ１ル・酸カリウム緩衝液、ｐＨ６，５再督濁した。

次いでソニケーター・ウルトラソニック・セル・ディスラブター（商標）（ハー ト・システムーウルトラソニクス）を用い、４の電気出力、４０％の衝撃係数に セットしたパルサーサイクル時間で音波処理により細胞を崩壊した（これらの条 件下、１゜ｍｌの細菌上清を氷上で１０分間、音波処理した）。１２，０００ｘ ｇで１時間遠心することにより残骸を音波処理物から除去したのち、上清液は０ ．２ｕ＋孔径のメンブランフィルタ−を濾過して全ての残留する無傷の細胞を除 去した。得られる調製物は、約１；１０の希釈でタバコ葉に過敏反応を惹起する ことができた。

ＣＦＥＰはＯＤ、□。＝０．４の培養物由来の細胞内材料を含み、同一密度のＥ 、コリの生細胞が過敏反応の惹起に要した。

本発明によるバーピンの精製を以下の実施例に記載する。

実施例４ 実施例３から得た調製物を用いる最初の試験は、ＨＲ惹起活性が熱安定性で性質 が蛋白様であることを示した。調製物は、既に記載された続く６５℃−晩のイン キュベーションとしてタバコ葉の浸透により測定されたように、ＨＲ惹起活性を 維持した。しかしながら、ＰＭＳＦ以外は、セリンプロテアーゼインヒビターを 調製の間に加えると、全てのＨＲ惹起活性は３７℃３時間、又は４℃６〜８時間 に無くなり、プロナーゼＥ（シグマ）１００μｇ／ｍｌとの調製物のインキュベ ーションは、３７６０１時間で、全ての惹起活性を失わせた。

誘導因子調製物の熱安定性の利点は、誘導因子をさらに精製する目的に用いられ た。実施例３の誘導因子調製物の沸騰水浴中１０分間の保持、続（遠心による不 溶物質の除去ののち、ごく限られた数の蛋白だけが残った。４４ｋＤに対応する 一つのバンドが、加熱した実施例３調製物の５ＤＳ−ポリアクリルアミド（１０ ％５ＤＳ−ＰＡＧＥゲルは提供者、ヘファー・サイエンティフィック・インスツ ルーメンツの指示に従って調製して用いた。ゲル中の蛋白を０．０２５％クーマ シープルーＲ−２５０で３０分間染色し、５０％メタノールと１０％酢酸溶液で 脱色した）ゲル上の電気泳動後、顕著であった。この泳動性のバンドは、ＨＲ惹 起活性を有する全ての調製物に特異的に存在した。等電点電気泳動造粒ゲル床上 の、又はイオン交換クロマトグラフィによる、実施例３調製物の分割の結果、Ｈ Ｒて惹起活性を有するフラク／ヨンは、常に４．０ないし４．５ｐｌの分子の大 きさで４４ｋＤに相当する蛋白を含有した。

バーピンの続（精製を完了するため、幾つかの分離技術を実施例３に記載したよ うに調製したＣＦＥＰに適用した。各段階前に、ＣＦＥＰは沸騰水浴中１０分間 加熱し、２５−３０℃に冷却し、１２．ＯＯＯＸｇで１０分間遠心した。上清液 は維持し、０．２μｍ孔径の濾過膜（ミリボア、ＭＦ）を濾過した。

熱処理ＣＦＥＰはアニオン交換樹脂（ワットマンＤＥ−５２）に乗せ、５＋ａＭ リン酸カリウム緩衝液、ｐＨ６，５中ＫＣＩの量を徐々に増加させながら溶出し た。

バーピンは９０ｍＭ　ＫＣＩを含有する緩衝液によりカラムから溶出した。バー ピンの存在は、最初の容量の５０％まで濃縮したカラムから要素を有するタバコ 葉領域の浸透により測定した。さらにフラクションは標準的手順に従って５ＤＳ −ＰＡＣ；Ｅゲルで電気泳動した。最終精製は高圧液体クロマトグラフィ（ＨＰ ＬＣ）により完了した。イオン交換クロマトグラフィにより精製した調製物は、 酢酸の添加によりｐＨ２に調整し、次いで遠心により全ての沈澱を除き、逆相Ｈ ＰＬＣブレバックカラム（ＹＭＣＡＱ−３０３）に適用した。カラムは０．２５ ％ｖ／ｖトリフルオロ酢酸にｐＨ２で１０−７０％アセトリドニルの勾配によっ て溶出した。

蛋白の検出は、１９０ｎｍないし３００止の光の吸収によった。各１２５ｍ１フ ラク／ヨンをタバコ葉領域の浸透によりＨＲを惹起する能力について試験した。

実施例３調製物の分割に用いた造粒ゲル床は、製造業者によって勧められた通り 、パイオーライト（商標）（バイオ−ラド・ラボラトリーズ）で調製した。ｐＨ ３−１０の広範囲両性電解質（シグマ）を２％のスラリーの最終濃度で用いた。

電極溶液は、ＩＭ　Ｈ３ＰＯ４（陰極）とＩＭＮａＯＨ（陽極）であった。

全てのＨＲ惹起試料に存在する顕著な４４ｋＤ蛋白（「バーピン」）バンドが惹 起活性を有するかどうかを測定するため、準備したＳＤＳゲルの適切な未染色部 分をカットし、ＳＤＳを欠いた緩衝液で電解した。溶出蛋白（２００＃ｇ／ｌｌ １ｌ）は、０．１ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオリドを含有する２１の５ ｍＭリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ６，５に対し一晩透析した。濃度＞５００ｎＭ （主２５μ植物の葉において、バーピンが過敏反応を惹起した。

続く実験は、バーピンがプロテアーゼ感受性、熱安定性で酸性であることを明ら かにした。プロテアーゼによるバーピンの処理は、ＨＲ惹起能力を失わせ、ＳＤ Ｓポリアクリルアミドゲルから４４ｋＤ蛋白バンドを排除した。しかしながら、 バーピンは、１００℃に１０分間保持して酵素を不活性化したプロテアーゼとイ ンキュベートしても、調製物は惹起活性を維持した。活性プロテアーゼが浸透混 合物に存在すると、過敏反応は発達しなかった。しかしながら、活性又は熱不活 性化プロテアーゼによるタバコ葉の浸透は肉眼的症状とはならなかった。バーピ ンは、沸騰水浴中１０分間加熱後、ＨＲ惹起活性を維持した。ＳＤＳゲルからの 精製バーピンは、慣用技術を用いる薄層等電点電気泳動ゲル上の分割によって測 定されるように４．３のｐｉを有した。

本発明によるバーピンの亜細胞位置は以下の実施例に記載される。

実施例５ 微生物の細胞表面のバーピンの位置は、以下の観察により示唆された。（ｉ）Ｅ 。

アミロボラＥａ３２１　（ｐｃＰＰ４３０）又はＥ，）すＤＨ５α（ｐｃＰＰ４ ３０）の上清は、過敏反応を惹起せず、バーピンは媒体に分泌されないが細菌中 又は上に存在することを示した：（ｉｔ）Ｅａ３２１　（ｐｃＰＰ４３０）及び ＥｊすＤＨ５α（ｐｃＰＰ４３０）の全細胞を４０及び８０μｇ／ｍｌのプロテ アーゼと、そして４０μｇ／ｍｌテトラサイクリンとそれぞれ３７℃で５分間イ ンキュベートヨンし、バーピンの連続生成を停止後、細菌は過敏反応を惹起しな かった。プロテアーゼインヒビター、ＰＭＳＦｏ．５ｍＭを上記インキュベーシ ョン混合物中でインキュベートすると、細菌は過敏反応を惹起した．ＰＭＳＦは 明らかにプロテアーゼによる不活性化からバーピンを保護した。（ＰＭＳＦ又は テトラサイクリンのみによるタバコ葉の浸透は、効果がなく、どの化合物もＨＲ を生ずることに独立して機能しないことを示す）；（ｉｆｉ）プロテアーゼの量 を増加しながら細菌を処理すると、プロテアーゼ処理細胞由来の調製物が電気泳 動されたＳＤＳゲルからバーピンの消失とよく相関する過敏反応を惹起する能力 を減じた〔表１１　：Ｃｂ／＞実施例３調製物の１０５．　０ＯＯｘ　ｇ，　１ 時間の遠心後、はとんどのＨＲ惹起活性が上清液に見出されるが、膜安定剤、Ｍ ｇＣｈ　３０ｍＭを音波処理前に加えると、はとんどの活性はペレットと関連し 、それは膜を含有する遠心した蛋白と関連する；そして（Ｖ）末者沸実施例３調 製物のゲルー浸透クロマトグラフィは、多分膿胞である非常な高分子ｆｆｉ　（ ＞　１　０’Ｄ）のフラクションと誘導因子との関連を示した；さらに（ｖｉ） 超遠心でのＥａ３２１　（ｐｃＰＰ４３０）の溶解細胞の分画（サイエンス２　 ３　３　：　１４０３（１９８５）参照）及びバーピン特異抗体との反応の結果 、細胞膜フラクションとの反応及び全細胞コントロールのみとなる。

前述の結果は、バーピンが細菌細胞表面又はその近くに位置すること及びそれは 不安定であることを示す。Ｅａ３２１　（ｐｃＰＰ４３０）又はＥ，コリＤＨ５ （Ｚ（ｐｃＰＰ４３０）の細胞墾濁液は、転移インヒビターテトラサイクリン（ ４　０ｕｇ／ｍｌ）の存在で、それぞれ０．５時間又は１時間よりも少しの間そ れらのＨＲ惹起活性を維持する。さらに、一度細胞がＨＲ惹起活性を失うと、バ ーピンは検出されなかった。しかしながら、プロテアーゼインヒビターＰＭＳ　 Ｆ　（０．　５＋ｍＭ）が懸濁液に含有されると、細菌は２時間以上ＨＲ惹起活 性を維持し、同時にＳＤＳゲルでその間ずっと少量のバーピンが検出された。等 しい細胞数を基にすると、バーピンを破壊し、過敏反応を防止するには、Ｅａ３ ２１　（ｐｃＰＰ４３０）よりもＥ．コリＤＨ５α（ｐｃＰＰ４３０）の方がよ り多くのプロテアーゼを必要とした。従って、蛋白分解に対するバーピンの感受 性は植物病原性細菌のＨＲ惹起活性の短期生存性質のこれまでの観察〔サイエン ス２　４　５　：　１３７４（１９８９）参照〕を説明しうる。

以下の方法及び表１は、ｈｒｐ遺伝子クラスターを含有するＥ．アミロボラＥａ ３２１由来のＨＲ惹起活性のプロテアーゼ感受性についてのプロトコール及びそ の結果を描（。

Ｅ，アミロボラＥａ３２１　（ｐｃＰＰ４３０）（７）細胞をＬＢ培地テ生育シ 、遠心により○．　Ｄ．　６２０＝　０．　６で収集した。次いで細胞を４０μ ｇ／ｍｌテトラサイクリン含有５ｍＭリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ６．５の０． １容量に再懸濁した。（表１に示すように）プロテアーゼを２００１１１細胞懸 濁液に加え、３７℃で５分間インキュベートし、続いて各混合物の１００μｍを タバコ葉に浸透させた。浸透後２４時間に崩壊に気付いた。２０μｍの５×分留 緩衝液を８０μｍ残留混残留色混合し、５分間沸騰し、次いでミクロ遠心で１０ 分間遠心し、１０％５ＤＳ−ＰＡＧＥゲルの各レーンに１５μｍ負荷した。電気 泳動を２０ｍＡで２時間実施し、次いで０．０２５％クーマン−ブルーＲ−２５ ０で３０分間染色し、そして５０％メタノールと１０％酢酸溶液で脱色した。Ｌ Ｂ培養物から生成した細胞フリーの上清を濾過滅菌し、次いでセントリブレブー １０（アミコン）により元の容量の１／１０まで遠心した。高濃度のプロテアー ゼによる処理によりＨＲ惹起活性が消失し、ＳＤＳゲルからバーピンバンド（４ ４ｋＤ）が消えた。本プロトコールから得られたデータを以下の表に記録する。

表１ ２０ｇｇ　弱い　＋ ８０ｇｇ＋０．５ｍＭ　ＰＭＳＦ　＋　−１−細胞フリーの上清　− 十二陽性反応 一二陰性反応 無傷のタバコ葉で過敏反応を惹起する細菌株の能力は、それらのタバコ細胞浮遊 培養でに’／Ｈ”交換反応を惹起する能力と強（関連する。Ｅ、アミロボラのｈ ｒｐ遺伝子クラスターの大部分かに’／Ｈ”交換反応の惹起に必要とされるので 、二つの反応は遺伝子に関連する。従って、タバコ細胞浮遊培養へのバーピンの 影響を、以下の実施例に従って試験した。

本発明によるバーピンの植物、植物細胞及び組織への影響を以下の実施例に記載 する。

実施例６ 特別の調製品がＨＲ惹起活性を有するかどうかを測定するため、我々は全細菌細 胞に用いたものと同様の技術を用いた〔モレキュラー・プラント−マイクローブ ・インターラクンヨンズ４　：　４９４　（１９９１）参照〕。タバコ植物にコ チアナ・タバクムし、“キサンチ”）を人工土壌ミックス中、９０　１００ｃｍ の高さに生育した。植物は浸透前く２４時間に温室から研究室に移した。葉身の 浸透は解剖針で作った小孔を通る無針シリンジで行った。ＨＲを示す、浸透領域 のコラスプは浸透２４時間後に記録した。

５ＤＳ−ＰＡＧＥにより検出されるように、４４ｋＤ蛋白を含む全てのＣＦＥＰ は、タバコ葉の浸透領域のコラスブを生じた。ＨＰＬＣにより精製したバーピン （実施例４）は、≧５００ｎＭ濃度でＨＲを惹起した。

タバコ細胞浮遊培養へのバーピンの影響を試験するため、４日経過のタバコ細胞 浮遊培養（＝ニコチアナ・タバクムｖａｒ、サムスン）をコーネル大学のバイオ チクノロシイ・プログラムから得た。細胞懸濁液を単層の目のあらい編み方のチ ーズクロスで濾過して、１１のビーカーに入れ、大きな凝集塊を除去した。タバ コ・アッセー・メディウム（ＭＥ　８０．５ｍＭ、　マニｈ　ｔし０．１７Ｍ、 　ＫｚＳ　０４　（２＋１１の０．２５Ｍ保存溶液）　、ＣａＣｌ２　（２ｍｌ の０．２５Ｍ保存溶液）、高純度水９９６ｍ１、ｌＮＮａＯＨによりｐＨ６，０ に調整し、ｏ、２ｇｍ孔径メンブランフィルタ−濾過〕を用い、単層のチーズク ロスを通して出来るだけ多くの細胞を洗浄した。

次いでこの洗浄、濾過懸濁液を１層のミラクロス（商標）（不織布）で内側を覆 った大きなロートにあけ、ミラクロス（商標）を満たした細胞をさらに２００− ４００ｍｌのタバコ・アッセー・メディウムで静かに洗浄した。１５ｇの湿潤細 胞を計量し、４１５ｍ１のタバコ・アッセー・メディウムに静かに再懸濁した。

本懸濁液の２０ｗ１のアリコートをプラスチックのコニカルカップ（４ｃｍ最上 部直径、２゜５ｃｍ底直径、高さ４ｃｍ）に計量し、直ちに１５０ｒｐｍ、　２ ａ１１１ストロークの回転振盪機に入れ、２５±３℃に維持した。

細胞は、それらが約５．８のｐＨに達するまで平衡化した（通常２０−３０分） 。

この時点で、ｌ＋１の細菌懸濁液又は音波処理抽出物或はＰＭＳＦの２０ｇｇ／ ｍｌ濃縮物、２０μｍを含有する０、５ｍｌの精製蛋白を各タバコ細胞試料に加 えた。試料のｐＨをコーニングｐＨメーターで読み取り、Ｏ，ＩＮ　ＮａＯＨ（ 又は必要ならば０．１Ｎ　ＭＣＩ）で、ｐＨ６に調整した。最初の読み取り後３ ０分で二次読み取りを行った。続く全ての読み取りは、０時での読み取り後、６ 時間まで１時間間隔で行った。全ての処理は、二回試験した。

細菌細胞懸濁液は、適切な抗菌剤を含むＬＢで一晩培養を行うことにより調製し 、次いで翌朝、株を０．２０の○Ｉ）ｓｚ。に希釈した。培養物をＯＤｏ、４ま で再濃度を有すると見積まれる。細胞を５０００ｘｇで遠心し、再懸濁して１ｍ １ＭＥＳ緩衝液ｐＨ６中、５倍濃度（Ｅａ３２１及び誘導体について）及び１０ ０倍濃（Ｅ、コリ及び誘導体について）とした。この方法で約Ｉ　Ｘ　１０　’ ｃｆｕ／ｍｌの細胞濃度に達した。１ｍｌの細胞懸濁液を２０国１タバコ細胞懸 濁液に添加したとき、アッセー用のｃｆｕ／ｍｌの最終濃度はｍ１当り５Ｘ１０ ’と見積まれた。

Ｅ、アミロボラの細胞は、タバコ細胞浮遊培養への細菌の添加後２−３時間遅れ て水浴溶液（ｂａｔｈｉｎｇ　５ｏｌｕｔｉｏｎ）のｐＨ（Ｋ”／Ｈ”交換反応 の測定）を増した（図２参照）。逆に、ゼロ時間でバーピンの一回の添加は最初 の時間に水浴溶液のｐＨを速やかに増加させた。ｐＨは続くインキュベーション の間、少し減少した。

インビトロでバーピンを生成しないＥ、アミロボラのミュータントは、Ｋ”／Ｈ “交換反応を惹起しなかった。Ｅ、アミロボラのクローンｈｒｐ遺伝子クラスタ ーに変異を含んでいるＥ、コリの株も交換反応を惹起しなかった。バーピンによ る交換反応及び過敏反応の惹起は、バーピンが細菌−植物相互作用に活性である という付加的証拠を与える。タバコ細胞培養へのバーピンの影響に関することれ らの研究からのデータは、図２に示す。

以下の実施例はＥ、コリＤＨ５７２（＋）ＣＰＰ４３０）及びＥａ３２１から得 られるバーピンの比較を与える。

実施例７ バーピンがＥ、アミロボラにより生成されるがｐｃＰＰ４３０の存在により刺激 されるＥコリにより生成されないことを証明するため、細胞を音波処理前５時間 、ｌ（Ｒ誘発培地でブレインキュベートした以外、Ｅ、コリＤＨ５α（ｐＣＰ　 Ｐ　４３０）からその分離に用いたものと同じ技術を、Ｅ、アミロボラＥａ３２ １に用いた。さらに、ｐｃＰＰ４３０のベクターを含むＥ、コリＤＨ５α（ｐＣ ＰＰ９）をＥコリＤＨ５α（ｐｃＰＰ４３０）と同じ操作に付した。Ｅａ３２１ から分離されたものと同じ分子量の分離された蛋白は、ＨＲ惹起能力を有した。

ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上の４４ｋＤバンドの相対強度に基づき、Ｅ、ア ミロボラＥａ３２１は、細胞基準当り、ＥコリＤＨ５α（ｐｃＰＰ４３０）の生 成するバーピンの量の約１／１０を生成することが見積まれた。Ｅ、アミロボラ Ｅａ３２１及びＥ、コリＤＨ５α（ｐｃＰＰ４３０）からの誘導因子蛋白の性質 は同一であった。

４４ｋＤ蛋白と関連した非プロテアーゼ感受性熱安定ＨＲ惹起活性がＥ、コＩＪ ＤＨ５α（ｐＣＰＰ９）から取った細胞フリー抽出物に見られた。

Ｅ、コリアミロボラバーピンの性質は、細菌が過敏反応を惹起できるという発見 の結果なされた幾つかの重要な生理的観察と一致する。細菌蛋白又はＲＮＡの合 成の不適合病原体及びインヒビターを伴う植物組織の浸透は、ｄｅ　ｎｏｖｏ　 ＲＮＡ及び蛋白合成が必要であることを示す過敏反応を防止する〔フィトパソロ ジイ７２　：　１５１３（１９８３）参照〕。細菌が希釈水寒天に浸透すると、 過敏反応は惹起せず、細菌と植物細胞との密接な接触が必要であることを示唆す る。前誘発細菌は、転移又は転写インヒビターが浸透すると、急速にＨＲ惹起能 力を失う〔サイエンス２４５　：　１３７４（１９８９）参照〕。誘導因子が細 菌細胞表面の成分であるという続く証拠が、誘導因子は浸透植物組織に拡散性で ないこと、そして各誘発細胞は一つの植物細胞のみを死滅することの観察で見出 された。これらの観察により予言されるように、バーピンは細菌細胞表面と関連 し、その蛋白分解に対する極端な感受性のために、天然で不安定のように見える 。従って、バービン崩壊は、植物−細菌相互作用の発展を調節するのに重要であ ろう。

非病原表現型のｈｒｐミュータントは、バーピンがＥ、アミロボラでの病原性の 一次決定子であることを示唆する。適合（宿主；疾病）及び非適合（非宿主：過 敏反応）相互作用でのバーピンの実質的役割についての基準は明らかでない。幾 つかの植物病原細菌の宿主範囲は、ｈｒｐ”病原体に栽培品種特異不適合性を与 えることができるａＷ遺伝子により調節されることが認められた。ａｖｒ遺伝子 生成物の生化学活性及び表現型発現に関するｈｒｐ遺伝子へのそれらの依存の基 準は、ａｖｒＢがｈｒｐ遺伝子により調節されるけれども、未知である。バーピ ンの生成又は蓄積の調節は、同定可能な因子でもありうる。Ｅ、アミラボラのｈ ｒｐ遺伝子クラスターは、非宿主組織（タバコ）よりも、宿主組織（ナシ）で約 １０倍低く発現する。

主要疾病決定因子は、腫瘍又は広範組織解離（それぞれ植物ホルモン及びペクチ ン酵素）を起こす植物病原細菌で確認されたが、宿主の限られた範囲での遅延壊 死を起こす細菌間の病原性に対する分子基準は未知である。これらの細菌の中に 、経済的に重要なシュードモナス・シリンガニ及びキサントモナス・カンペスト リス病原型がある。酵素を崩墳させる毒素及び植物細胞壁はこれらの病原因子の ビルレンスを増加しつるが、ｈｒｐ遺伝子は宿主組織での細菌増殖及び疾病症状 の生成に絶対に必要である。

ｈｒｐ遺伝子の保存〔レイビイ、Ｒ，Ｊ、、モレキュラー・スタブイス・オン・ バソゲニノティ・アンド＾ビルレンス・ファクターズ・オン・エルウィニア・ア ミロボラ、Ｍ、Ｓ、テシス、コーネル・ユニバージティー（１９９１）参照〕は 、Ｅ、アミロボラバービンが広範な重要クラスの植物細菌疾病決定因子の原型で あることを示唆する。従って、バーピンの、又はその生成の妥当なバランスの分 裂は、穀物植物の広く行き渡った細菌疾病を調節する新たな試みであろう。バー ピンの作用のモードは、又、過敏反応の及び広い系列の微生物病原体に対する植 物の耐性の分子基準を明らかにする。

以下の実施例は、バーピンをコード化している遺伝子が位置したＮ末端アミノ酸 配列の決定についての記載を与える。

実施例８ ｈｒｐＮと呼ばれる、バーピンをコード化している遺伝子を位置決定するため、 バーピン蛋白の部分のアミノ酸配列を決定した。実施例４のようにＨＰＬＣによ り精製したバーピンの試料（２５ａｇ）を用いた。４２．５分で溶出するピーク に相当する逆相クロマトグラフィカラムからの溶出液の部分を、真空で乾燥近く まで蒸発させて、アセトニトリル溶媒を除去した。次いでフラクションをＴＥ緩 衝液に溶解し、蛋白に存在する種々のアミノ酸の割合及びＮ末端から始まるアミ ノ酸の配列を決定する要望により、コーネル・ユニバージティー・バイオチクノ ロシイ・プログラムのプロティン・アナリシス・ラボラトリイに提出した。

これらの分析結果は、以下の表に示され、そこでは、バーピンの分析によるアミ ノ酸組成はＤＮＡ配列から提案されるアミノ酸組成とほとんど変わらない。

アルギニン　１．８　１．３ アスパラギン　７．０ アスパラギン酸　５．７　１４．２ グルタミン酸　２．１　９．３ グリシン　２２．０　２２．０ ヒスチジン　０．８　＜　１．０ イソロイシン　２．３　２．３ ０イシン　１０．６　１０．９ リジン　４．７　５．２ メチオニン　６．　Ｏ５，７ フエニルアラニン　１．６　２．０ プロリン　３．１　２．３ セリン　９．６　８．９ スレオニン　６．２　５．２ トリプトフアン　０．５　−−− チロシン　１．０　＜　１．０ バリン　２．８　２．２ アミノ酸組成の決定に用いた方法は、Ｓ、　Ａ、コーエン等、１９８４、アメリ カン・ラボシト９４４８頁による６Ｎ　ＨＣＩによる蛋白の加水分解、続くアミ ノ酸残基の保護及び分解を含んだ。

本発明によるバーピンのＮ末端アミノ酸配列は、バンカピラーの方法〔メリーズ ・オン・プロティン・マイクロキャラクタライゼーション；ア・プラクティカル ・ハンドブック、ｐｐｇ２２３−２４７、フマナ・プレス、クリフトン、ニュー シャーシー（１９８６）参照〕によって決定され、以下の通りである。

本発明による（上述のＮ末端アミノ酸配列を含む）バーピンの提案アミノ酸配列 は、 バーピンの部分アミノ酸配列は、バーピンのＮ末端の９ないし１５アミノ酸をコ ード化しているものに対応する塩基でオリゴヌクレオチドプローブを構築するの に有用であった。幾つかのこれらのアミノ酸は幾っがの核酸コドンを有しうるの て、４８倍変性オリゴヌクレオチドが標準的方法によって構築された。

バーピンのオリゴヌクレオチドプローブとのハイブリダイゼーションにょるバー ピンをコード化しているクローンの同定を以下の実施例に記載する。

実施例９ バーピンをコード化している構造遺伝子は、エルウィニア・アミロボラのＤＮＡ と、実施例８で構築したオリゴヌクレオチドプローブのハイブリダイゼーション により確認した。ニュミドｐｃＰＰ４３０のＥアミロボラのｈｒｐクラスクーで クローンした特異的ＤＮＡを制限酵素ＢａｍＨ１により消化し、分離部分を制限 酵素ＨｉｎｄＩ［［で消化した。Ｄ　Ｎ　Ａ消化物は、標準的方法に従って、０ ．７％アガロースで電気泳動し、エチジウムブロミドで染色し、ナイロン膜（イ モピロン）に移し、既に記載したオリゴヌクレオチドプローブとハイブリッド形 成した。プローブは、３２ｐ標識ＧＴＰを用いる放射活性リンで標識化した。

ハイブリダイゼーション及び膜のＸ　ＯＭａｔＸ線フィルム（コダック）への１ 露並びにフィルムの現像に続き、１．３ｋｂ　ＨｉｎｃｌＩ［［断片は、プロー ブに対する反応で最も強いハイブリダイゼー７ヨン／グナルを与えた。断片をｐ ブルースクリプトＮ１１３＋ベクター（ストラタジーン）にサブクローンし、ｐ ｃＰＰ１０８４と名付けた。

本発明による抗バーピン抗体の生成を以下の実施例に記載する。

実施例１Ｏ 抗体を、バーピンの注射に反応してウサギに作らせた。高精製バービンの３つの 注射（それぞれ１００．１５０及び５０ｕｇ）を２−３適間隔で行った。８週間 後、抗血清を集め、ＩｇＧを硫酸アンモニウムで沈澱させ、音波処理Ｅ、コリＤ Ｈ５σ（ｐｃＰＰ９）溶解質で前吸収した。抗血清の特異性は、実施例７に記載 したようにＨＰＬＣにより精製したバーピンのウェスタンプロットの反応によっ て確認した。ＤＨ５α（ｐｃｐｐ４３０）由来の分解ＣＦＥＰを含有するウェス タンプロットをハイプリント形成した場合、前免疫血清との反応は見られなかつ Ｉ；。

Ｔ７　ＲＮＡポリメラーゼ／プロモーター発現系でのｈｒｐＮの記述は、以下の 実施例に記載する 実施例１１ １　、３　ｋｂＨ１ｎｄＩＩ＋断片が完全ｈｒｐ　Ｎ遺伝子を含むことを確認す るＩ；め、Ｔ７ＳｌＯプロモーターの調節の下、１　、３　ｋｂＨ１ｎｄｎｌ断 片を含む、プラスミドｐＧｐｌ−２（プロ７−ゾイングス・ナシヨナル・アカデ ミイ・オン・サイエンシズＵ、Ｓ、Ａ。

８２　：　１０７４（１９８５）及びｐｃＰＰ１０８４をＥ、コリＤＨ５ａ又は Ｅａ３２１に形質転換した。これら２つの適合プラスミドはＴ７発現系を構成す る。ｐＧｐｌ、−１及びｐｃＰＰ１０８４を含有する細胞を、１００ｕｇ／ｍｌ のアンビリンと５０ｕｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢに３０°Ｃで生育した 。ＯＤ、、。−０，５で２００μｌの細胞を収集し、５ｍｌのＭ９媒体〔サンプ ルツク、Ｊ、、Ｅ、Ｆ、フリッチ、Ｔ、マニアティス、モレキュラー・クローニ ング、ア・ラポラトリイ・マニュアル、第２版、コールド・スプリング・ハーバ −（１９８９））で洗浄した。最後に細胞を０６０１％の１８アミノ酸（ンスチ ジン又はメチオニンなし）を補足した１、ｏｍｌのＭ９媒体に再懸濁した。細胞 を３０°Ｃで１時間、次いで４２℃に変えて１０分間振盪しながら（２００ｒｐ ｍ）生育した。リファンピシン（シグマＲ３５０１メタノール中２０ｍｇ／ｍｌ 保存溶液）を２００ｕｇ／ｍｌ最終濃度まで添加した。細胞を４２°Ｃでさらに インキュベートし、次いで３０℃に変えてさらに１時間インキュベートした。

細胞を１０μＣｉの３５３メチオニンにより３０℃で５分間、短時間標識した。

細胞を遠心し、５０μｍの「分解緩衝液」（６０ＩＩＩＭトリスーＨＣｌ、ｐＨ ６，８，１％ＳＤＳ、１％２−メルカプトエタノール、１０％グリセロール及び ０．０１％ブロモフェノールブルー）に再懸濁した。試料を１００℃で３分間加 熱し、２０μｌを１０％ＳＤＳ　ＰＡＧＥゲル上に置いた。（ホーファー・サイ エンティフィック・インスツルーメンツの指示に従い）マイティ・スモール（商 標）装置で１５■Ａ、２時間電気泳動後、ゲルを乾燥し、室温で２時間Ｘ線フィ ルムに爆露した。分子の大きさでバービンに相当する単一４４ｋＤバンドを、Ｅ 、コリＤＨ５α及びＥａ３２１構造物から観察した。この系から発現した４４ｋ Ｄバンドは、ウサギに作られた抗バーピン抗体と反応した（実施例１０）。本実 験は、１．３　ｋｂＨｉｎｄｍ断片が４４ｋＤバーピン蛋白と暗号化する完全な 開いた読み枠を含むことを示す。

本発明によるｈｒｐＮ遺伝子の核酸配列は、以下の実施例によって決定した。

実施例１２ ＤＮＡ配列決定分析はジデオキシ鎖終結法（サンガー１９７７、ＰＮＡＳ７４： ５６４３−５６６７）により実施した。配列は万能プライマー又はＴ３プライマ ーのいずれかを用いることにより両ストランドから証明した。Ｋｐｎｌ及びｐｔ ＋ｉにより１゜３ｋｂＨｉｎｄＩ［Ｉ断片から産生されたサブクローンを配列決 定の鋳型として直接使用した。ｈｒｐＮのヌクレオチド配列は遺伝子銀行に提出 され、受理番号Ｍ９２９９４と付された。ヌクレオチド配列は以下に示す。

ＡＡＧＣＴｘｕ℃ＡＴＧＧＣＡαＴｙｌ’　ＴＧＡｆ工ＧＴ［ＧＧａ℃χ口■α νひＯＲ７５騎　５０’ｒＩＡＴＩ’ｃＡＩＪｔＡ　ＧＡＧＧＡＡＴＡＣＧ　Ｔ ＬｏＡｌＧ　ＡＧＴ　ＣＩ’Ｇ　ＡＡＴ　ＡＣＡ　ＡＧｒα刀９３０℃αス讃゛ 仄λＮ刀紙鑞ＭτππＡＴＣα℃α−゛α刀α℃１３５αＥＡ　ＡＡＴ　ＡＡＣ ＧＧＧ　ＴｒＧ　Ｃ１℃ＧＧｒ　ＡＣＣＡＧｒ　ＱＩＩ：　ＣＡＧ　ＡＡＴ　Ｃ Ｃｒ　ＧＧＧ　１７’／′Ｉ″１′Ｃ；σｉＴ　ＧＧＣＭｒ　Ｔ（ユ°ＣＣＡ　 Ｃ１”Ｇα石０追α℃α℃α−”　ＭＴＣＡＡ　２１９〜ｙＴ　ＧＡＴ　ＡＯ： （Ｊ：　ＡＡＴ　ＣＡＧ　ＣＩＧＧＣｒ　ＧＧＣ’ＥＭｙ　Ｃ１℃ＡＣＣαＣＡ ＴＧ２６１Ａπ；　ｋＫ；　ＡＴＧ　Ｗ＆　ＡＧＣＡＩ’Ｇ　Ａ’ｌ”ＧαＣＧ Ｇｒαπα追ＣＴＧ　ＡＴＧα℃３０３Ｑ？ｒＧ；Ｃ’ＩＴＡ　（Ａ−Ｅ　ＧＧ Ｉ’　＋ｊ−ｉ、”ｌ’ｌ’Ａ　ＧＧｒ　ＡＩＶｒ　Ｇ℃’１”ＬＹＥ　ＧＧＩ ’　ＧＧＣ代Ａ３５Ｑ？Ｌ’　ＧＫ　ＯＧ　（ｊｊＬ：　ＧＡＡ　ＧｊＡ　ＵＩ Ｇ　’１亡ＧＡＡＣαＵ　ＣＩＧ　ＡＡＣら＾゛ｒｐ：ｔｃ　３Ｂノ’ｌ’Ｉ： Ａ（ＵＫ　ＧＧｒ　’ｌｔｌ；　Ｃ１ｕ　ＡＡＬ：　Ａ１．：Ｇ　にＩＧ　ＧＧ ＣＴＣＧ　ＡＡＡ　ＧＧＬ：　ＧらＣＡＡＬ：４Qす ＡＡ；ｌ’　ＮＸ　ＡＣＴ　’ＩＸ−Ａ　ＡＣＡ　ＡＬＡ　ＡＡＴ　ＴＯ：α： Ｇ　ＣＩＧ　Ｑ’ｉＣＣＡＧ　ＧＣＧ　（１；ＩＧ　４’／h ＧＧ［’　ＡＩ’ｒＡＡＣ’ＩｃＡ　ＡＬＧ　’ＩＣＵ　（’Ａｋ　ＡＡＣＧＡ ＣＧＡＩ”ＩＣＣＡＣＬ：　’ｔｅａ　ＧＩＬ　５１　ＪＮ：Ａ　ＧＡＴ　ＴＣ ＣＮ：Ｃ′ＩＣＡ　ＩＪ’ｌ’：　’ｌシＮＸ：　ＧＡＣα：Ｇ　紙ＣＭ；　Ｃ Ｍ５　ＧＩＧ　ｂ５コＣＩ’Ｇ　ＡＡＧ　ＡＴＧ　’１°１ｕ　ＡＧ：　ＧＡｊ ｊ　ＮＩＡ　Ａ１１３　ＣＡＡ　ＡＧＬ：　ＣｒＧ　Ｔｌ’ｒαｎＧＡｌ’　５ ９汲■ ＧＱ；ＣＡＡＣＡＬ’ＧＧＣＮＩ：（ＡＬ；ＧＧ、、ＡＧＩ”１（ズ：’１’Ｃ ｒＧＧＧＧＧＣＡＡＧＣＪ’ｔ；６３９讃Ｘ：ＣＧＡＡαＫ　ＧＡＧ　ＣＡＧ　 ／Ｖに肛銹ＴＡ／六Ｎ仏α譜ω℃ｉＣｒ　６８１（込ｊＧＣＧ　（ＪＧ　ＴＣＧ 　ＣＣＳ　Ｃ１ｕ　Ａｌｕ　ＧＧＩ’　ＡＩＶＩ’　ＧＧＬ”　ＣＩ’Ｇ　ＡＧ ：　ＧＡＧ　ＣＩＣ７２３ＣＩＴαＣＡＡＣＧＧＧ　ＧＧＡ　ＣＬ’Ｇ　ＧＧＡ 　Ｃ＆”ＬｏＧＧｒ　ＣＡＧ　ＧＳＣＧＧＩ’　ＡＡ’ｌ’　ＧＣＩ’　７６５ ＧＧＣＡＣＧ　ＧＧＴＣＩＴ　Ｇｉｎ　ＧＬ７１”　“１１：Ｇ１’Ｑ；　ＣＩ Ｇ　ＧｊＣＧＧＣ八Ｍ　ＧＧＧＣ１覧ｉ　８（１’／α応α；ＣＣｒＧＡＧＣＧ ＧＧ　Ｑ：Ｇ　ＧＩＧ　ＧＡＣＴＡＣＣＡＧ　ＣＡＧ　’１°ＩＡ　（ｆｌ’　 ＡＡＣ１１４９αＩ：　Ｇｌ’Ｇ　ＧＧｒ　ＡＣＣＧＧ１’　ＡＴＣＧＧｒ　ｋ ＩＧ　ＡＡＡ　ＧＣＧ　ＧＧＣＡＴＬ’　ＣＡＧ　ＧＣＧ　８９１ＣｒＧ　ＡＡ Ｔ　Ｇｋｒ　ＮＩＣ（Ｅｒ　ＡｆＸ；　（Ｘ：　Ｎ追ＣＡＣＡＧｒ　ＴＣＡ　Ａ ＣＣＣＧｒ　’ＩＱ’　９３３ＴｒＣＧＩ’ＣＡＭ　ＡＡＡ　ＧＧ：　Ｇｅｌ’ 　ＣＧＧα’Ｓ　Ａ、’１’Ｇ　０００　ＡＡＧ　ＧＡＡ　紙ＧＧＩ’　９−／ ｂＣＡＧ　Ｔｉｃ　ＡｆｆＧ　ＧＡＣＣＡＧ　Ｉ／Ｖｌ’　ＣＸ：ｒ　ＧＡＧ　 ＧｒＧ　ＩＴｒ　ＧＧ：　ＡＡＧ　ＣＣＧ　ＣＡＧ　ｌ０Ｆ７ＴＡＣＣＡＧ　Ａ ＡＡ　Ｑｆα刀ＧＧＩ’　ＣＡＧ　ＧＡＧ　ＧＩＧ　ＰｆＡ　ＡＣＣ（ｊＧ　Ｇ ＡＣＡＡＡ　１０５９’ＩＣＡ高αスＮ端αスー入にＡＡＧαスｍ′Ｇにχα込 Ａ゛亀１１０１ＡＣＡαスα：ｃ　ＡＧｒ　ｍｒｘ；ＣＭ；　ＴＩＣＮＣＡＭ　 ｍ　ＡＡＧ　ＧＧＣ＆良１１４３八’Ｉ’ＣＡＡＡ　ＡＧＧＱ：ＣＡＴＧ　ＧＣ Ｇ　ＧＧｒ　ＧｋＬ’　ＡＣＣＣ７−（：　ＭＣＧＧＣＡＡＣＣＪＧ　１１８５ ＣＡＧＣＡＣαＤ　ＧＴＧ　ＣＣＧ　ＧＩＧ　ＧＩＴＣｒｒ　ＣＧＣ’１ｍ　Ｇ ｒＡ　１７０　Ａ’１℃ｃｃｘ　１２２−／１′ＧＡ　Ｔ［おα工（ｉ込１α工 Ａ１゛貨端Ｃ，Ａｌｕに仄；ＧＣＡＣ’１’罠０〕＾ｌゴ１２７０α莢ΩχＤズ コＴＭＧＣｒ１′１２８７本配列で、バーピンにアミノ酸配列を供給するよう発 現される（停止コドンＴＡＧを含む）開いた読み枠は以下の通りである。

ＡＴＧ　ＡＧＴロ６ＮぼＮス＜ｒαＤＣＴＧα詰α方πλに追にあ鑞４２ｆｆｒ 　’ＩＣＴ　ＡＴＣＧＧＣＧＧｒα刀αＫ　ＧＧＡ　Ｎｄ゛ＡＡＣαＤ　ＴＩＧ 　Ｃ１℃ＧＧＩ”　８４ＡＯ：ＡＧＴ′ＣＧ：　ＣＡＧ　ＡＡＴαテα追７石α παＥ　ＡＡＴ　ＴＣＴα”ｋｃｎ；　１２６α石ＣｒＧ　ＧＧ：ＧＧＣＧＧＩ ’　ＡＡＴ　ＣＡＡ　ＡＡＴ　ＧＡＴ　ＡＣＣＧｒＣＡＡＴ　ＣＡＧ　Ｇｌｕ　 １６８ＧＣＴ　ＧＧＣＴｒＡ　ＣｒＣＡＯ：　ＧＧＣＡＴ’Ｇ　ＡＴＧ　１”ｌ Ｇ　Ａ’ｌＧ　ｅピＩエコＡＧＣＮＩＧ　Ｋｒｌ；　２１０α℃αｉｒ　ＧＧｒ 　ＧＧＧ　ＣｒＧ　ｋ１’Ｇ　ＧＧＣＧＧＴ’αＣＴＣＡαＣＧＧｒ　ＧＧＣ１ ’ＬＡ　２５２ＧＧＩ’ＭｒＧＯ：ＴＩＧＧＧＩ’Ｑ”Ｃ’ＩＣＡＧＧｒＧＧＣ ＣＩＧＧコＣＧＡ／−αａｃＬＧ２９４°ＬＯ，ｌ／１ＩＡＣα刀ｃｔｖ　ＡＡ ＣｃｚｉＡｔｖ　’ｘ’ｕαＥ　％Ｌ′’Ｌ’ＣＧ　にＩＧ　ＡＡＣＡＯＧ　３ ３６ＣｔＧαＮ　’１α；　ＡＡＡ　ＧＧ：αんＡＡＬ坑゛に：ｃ　＜ｒコＡＣ Ａ心Ｍζｌ’　３’／ｌｌ′ｒα二α刀ＣＩＧ　ＧＡＣＣＡＧαＵ　（、−Ｌｕ 　ＧＧ（’　ＡＴｒＭｅ　ＴＣＡ　ＡＣＩＥ　’１（ＥＣＣＡＡ　４２０ＭＣＧ ＡＣＧＡＴ　ＴＣＣＡＣＣ’ＫＬ　ＧＱ：　ＡＣＡ　ＧＡＴ　”ＩＣＣＡＣＣ’ ＩｃＡ　ＧＡＣ１圧４６２ＡＧＣＧＡＣＣＣＧ　ｊａ；　ＣＡＧ　Ｃｆ１ｆ’、 　ＣＩＧ　ＣＩＯＡＡＧ　Ａ１℃１１℃ＡＧＣＧＡＧ　ＡＩＸ　５０４Ａ″ｒＧ 　ＣＡＡ　ＡＧＣＣＩＸ；　ＴＴＴ　ＧＧＩ’　ＧＡＴα刀ＣＡＡ　ＧＡＴ　Ｇ ＧＣＡＣＸＩ：　ＣＡＧ　ＧＧＣ５４６ＡＧｒ　’Ｉｅ　ｕ　ＧＧＧ　ＧＧ：　 ＡＡＧ　ＧＡＧ　ＣＱＥ　ＡＣＣＧＭ　ＧＧＣＧＡＧ　ＣＡＧ　ＡＡＣ５８Ｂα ）：　ＩＡＴ　ＡＡＡ　ＡＡＡ　ＧＧＡ　ＧＩＣＡＣＩ’　ＣＡＴ　■ＣｒＧ　 ＴＣＧ　ＣＤ：　Ｃ［ＯＡ’ｒＧ　６３０ＧＧｒ　ＡＡＴＧＧＴＣ１℃ＡＧＣ％ 　Ｃ１ＣＣＩＴ　ＧＧＣＡＡＣＧＧＧ　ＧＧＡ　（、ＴＧ　ＱＥＡ　６１２ＧＧ Ｌ′α’Ｔ　ＣＡＧ　ＧＧＣＧＧｒ　ＭＴＧＣｒＧＧＣＡＣＧ　田Ｌ’　ＣＴｒ 　ＧＡＣＧＧｒ　’ＩｃＤ　１１４″ｒＣＧＣ１’Ｇ　ＧＧＣＧＧＣＡＡＡ　Ｇ ＧＧ　ＣＩＧ　ＣＧＧ　ＧＧＣＣ罠ＡＧ：α追α：ＧＧＩＧ７５６ＧＡＣｉＸ： 　（％　％　”１’ｌＡ　（ＬＴ　ＡＡＣＧＣＣＧｒＧ　ＧＧＩ”　ＡＣＣＧＧ ｒ　ＡｒＣαπ７９８Ａ１Ｇ　ＡＡＡ　ＧＣｆＳ　ＧＧＣＡＴＴ　ＣＭ；　ωＪ Ｃ（Ｇ　ＡＡＴ　ＧＫｒ　ＡｆｆＣＧＧｒ　ＡＣＧ　ＣＡＣ８４ＯＮ−ｕε埴１ °ＴＣＡＡＣＣα；ｌ”ＩＣｒＴｉｃ；　Ｇ１℃ＡＡＴ　ＡＡＡ　ＧＧＣＧＡＴ 　ＣＧＧ　８８２α）Ｓ　Ａ１’Ｇ　ＱＴＧ　ＡＡＧ　ＧＡＡ　凪ＧＧＩ’　Ｃ ＡＧ　７７０　ＡＴＧ　ＧＡＣＣＡＧ　ＩＸＴ　ＣＣＩ’　９２４ＧＡＧ　ＧＩ ′Ｇ　Ｌ″ｆＴ　ＧＧＣＡＡＧ　ＣＣＧ　ＣＡＧ　ＴＡＣＣＡＧ　ＡＡＡ　ＣＣ ＣＣＯＧ　ＧＧｒ　ＣＡＧ　９６６ＧＡＧ　Ｇｌ’Ｇ　ＭＡ　ＡＣＣＧＡＴ　Ｇ ＡＣＡＡＡ　’ＩｃＡ　’ＩＧＧ　ＧＣＡ　ＡＡＡ　ＧＣＡ　Ｃ１’Ｇ　ＡＧＣ １００１ｊＡＡＧσ：Ａ　ＧＡＴ　ＧＡＣＧＡＣαａ　ＡｆＧ　ＡＣＡ　ＧＣＡ Ｃｌ：　ＡＧＩ’　ＡＴＧ　ＧＡＧ　ＣＡＧ　１０５０’１’ｒＣＡＡＣＡＡＣ ：ＣＡＡＧ　Ｇ［ＣＡ１℃ｋｉｃ　ＡＡＡ　ＡＧＧ　ＣＣＣＡＴＧ　ＧＣＧ　Ｇ Ｇｒ　１０９２ＧＡＴ　ＡＣＣＧＧＣＡＡｃＧＧＣＭＣＣＩＧ　％　ＣＡＣＧＱ Ｅ　ＧＩＧ　ＣＣＧ　Ｇ’ｌ”Ｇ　ＧＩＴ　１１３４Ｃｒｒ　ＣＧＣ’ＩＧＧ　 ＧｒＡ　ｉ’良ＡＴＧ　（ＸＡ　’ＩＧＡ　１１５８大量のバーピンを生成する ｈｒｐＮ遺伝子の過剰発現を以下の実施例で示す。

実施例１３ ｐｃＰＰ５０と名付けられる新規プラスミドを、以下のようにバーピンの高発現 用に特に構築した。

発現ベクターｐｌＮｍｌ”−Ａ２　（バイオ／チクノロシイ、８１−８５頁（１ ９８４，１月）参照〕を修飾した。それを制限エンドヌクレアーゼＸｂａｌ及び Ｈｉｎｄｎ［で消化し、二つの断片とした。小さい方のＤＮＡ断片を排棄し、ｐ 　Ｂ　１ｕｅｓｃｒｉｐｔ　Ｓ　Ｋ　−ポリリンカーの部分（ＸｂａｌないしＨ ｉｎｄｎ［）を置換した。これらの操作は、ｐ■Ｎｍ目３−Ａ２からリポソーム 結合部位と開始コドン（ＡＴＧ）を除去し、それらを幾つかの有用なりローニン グ部位（Ｘｂａｌ、ＳｐｅｌＳＢａｍＨｌ、Ｓｍａｌ、Ｐｓｔｌ、ＥｃｏＲＶ、 Ｈｉｎｄｌ［（、ＢａｍＨｌ）で置換した。得られるベクター（ｐＣＰ　Ｐ　５ ０）はｈｒｐＮ遺伝子と共に用い、Ｅ、コリによるバーピンの超生成を促進した 。

ｈｒｐＮ　（実施例７）を含有するプラスミド１０８４を制限エンドヌクレアー ゼＨｉｎｄｌｌ＋で消化した。１．３ｋｂＨｉｎｄｌＩ［ＤＮＡ断片をアガロー スから精製し、これもＨｉｎｄＩ［Ｉで消化し、アルカリホスホラターゼで処理 したｐｃＰＰ５０に連結した。

ＤＮＡをＥ、コリＤＨ５αに形質転換した。幾つかの被転換体は、バービンの既 知可動性に一致する蛋白の生成用に５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上でスクリ ーンした。ｐｃＰＰ２１３９と名付けられる一つのクローンは大量のバーピンを 生成した。

以下の操作に従って、大量のバーピンがＥ、コリＤＨ５α（ｐｃＰＰ２１３９） に生成した。Ｅ、コリＤＨ５α（ｐｃＰＰ２１３９）を、５ｇ／ｌカザミノ酸と ４０ｍｇ／ｌチアミンを補足したＭ９最小培地に生育させた。細菌は３７°Ｃで さらに２０時間生育した。バーピンは実施例３に従って細菌から分離した。

Ｅコ１ＪＤＨ５α（ｐｃＰＰ２１３９）により生成されたバーピンは、タバコ葉 アッセーで活性であり、それは５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で同一分子量 を有し、ＥコリＤＨ５α（ｐｃＰＰ４３０）により生成されたバーピンのように 抗バーピン抗血清（実施例１０）と反応した。

希釈点タバコ葉アッセーで、Ｅ、コリＤＨ５α（ｐｃＰＰ２１３９）から生成し たＣＦＥＰは１．：１５０希釈で検出可能な活性を有した。Ｅ、コリＤＨ５α（ ｐＣｐｐ２１３９）は１：２０希釈までしか検出可能な活性を有しない。従って Ｅ。

：＋すＤＨ５ｅ　（ｐｃＰＰ２１３９）はＥ、Ｄ’ＪＤＨ５σ（ｐｃＰＰ４３０ ）　よ’）も少なくとも１５＠多くバーピンを生成した。調べた結果は以下の表 に表示する。

表２ Ｅ、コリ株由来　希釈 ＤＨ５α（ｐｃＰＰ４３０）　＋　−−ｍ−同様の結論が、二つの構成からのバ ービン調製物を含有する５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲルの試験により導かれた 。

Ｅ、アミロボラでのｈｒｐＮの測定に加えて、そしてバーピンが多くの異なる植 物病原細菌により生成される一族の蛋白様ＨＲ誘導因子にとっての原型であると 信じられるので、ｈｒｐＮ同族体の同定をも以下のプロトコールに従って、エル ウィニア・クリサンテミ及びエルウィニア・ステワルティで行った。

実施例１４ ｈｒｐＮを含有する、ｐＣＰＰ１０８４由来の１．３ｋｂＨｉｎｄｌ［ｌＤＮＡ 断片を、Ｅ。

クリサンテミ株由来のｈｒｐ遺伝子を含むことが既に示されている１８コスミド に対する放射活性プローブとして用いた。一つのニスミド、ｐＣＰＰ２１５７は 、高厳格条件下（０，４ｘＳＳＣ，０，２％ＳＤＳ、６５℃で洗浄実施）　、ｈ ｒｐＮクローンと強くハイブリッド形成した。ニスミドは次の分析に用いた。ｈ ｒｐＮプローブとハイブリッド形成した、ｐｃＰＰ２１５７由来の８００ｂｐＣ １ａｌ断片をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　Ｓ　Ｋ−にクローンし、ｐｃＰＰ２１４ ０を得た。８００ｂｐＣ１ａｌ断片の一端の（ンーケナーゼバージョン２．０キ ット、Ｕ、Ｓ、バイオケミカルズを使用する）最初のＤＮＡ配列決定は、７２％ ヌクレオチド同一性で２２４ヌクレオチドの部分を示した。配列比較はＦＡＳＴ Ａで行い、Ｅ、アミロボラｈｒｐＮ　（最高適合）ヌクレオチド１００５ないし １２２３に相当する。Ｅ、クリサンサミに関するヌクレオチド配列は、７２％同 一性を示す。Ｅ、クリサンサミ配列は以下を有する。

同様のプロトコールを用い、ｐｃＰＰ１０８４由来の１．３ｋｂＨｉｎｄｌＩ［ ＤＮａ断片をＥ、ステワルティのＤＮＡをプローブするのに用いた。ＤＣ２８３ 株のゲノムＤＮＡ及びニスミドクローンｐＥｓ４１１のＤＮＡ　Ｃコブリン等、 モル・プラント−マイクローブ・インターラクションズ５二２６６−２６８（１ ９９２）参照〕をＨｉｎｄｍで加水分解し、電気泳動し、そしてハイブリッド形 成した。両ＤＮＡＦＩ製物由来の１　、８　ｋｂＨ１ｎｄｌ［［断片をプローブ とハイブリッド形成した。これらの結果は、ＥアミロボラのｈｒｐＮは、Ｅステ ワルティのｈｒｐＮ様遺伝子と類似性を共通することを示す。

未発明による、植物の疾病の苛酷さの不活性化の二つの方法の効果は以下に記載 する。

実施例１５ Ｅアミロホラ細ηととバーピンに特異的な抗血／ｌＩ（実施例１０）又はノ１− ピンを崩壊させるプロテアーゼ（実施例７）との反応によるバーピンの不活性に よって、Ｅアミロホラにより起きるナシの病気が減少した。果実が直径３−４ｃ ｏのときに集めた未成軌ナノ果実を表面消毒し、縦に半分に切り、湿らせた紙タ オルの上に置いた。果実の側面にナシノー−１コルク穴あけ具でウェルをがノド した（ビアＳ〜゛　メリーズ・イノ・フィトバクテリオロンイ、３７２”−３７ ５頁（１９９０）、クレメ〉トＺ、ルドルフｌく及びサンズ、Ｄ編集参照）。１ ｍｌのＥａ３２１の培養液（２Ｘ　１０　’ｃｆｕ／ｍｌ）を５０１１１及び１ ００ｕｌの１：２５希釈の抗バービン抗血清（実施例１０）と混合し、５分後、 ５０１１１の混合液を各ナシ果実のウェルに入れた。同様に、Ｅａ３２１の懸濁 液をプロテアーゼと混合し、ナシ果実のウェルに入れた。ナシを２７℃でインキ ュベートし、３日間毎日観察した。コントロールは処理しない細胞と同じウサギ から取った免疫前血清と混合した細胞がらなった。結果を以下に表示する。

Ｅａ３２１＋プロテアーゼ（１００ｕｇ／ｍｌ）　６／８Ｅａ３２１＋プロテア ーゼ（２０Ｃ１＋ｇ／ｎｌ）　５／８Ｅａ３２１＋抗血清（５０ＩＩｇ／ｍｌ） 　５／８Ｅａ３２１＋抗血ｍ　（１００μｇ／ｍｌ）　５／８Ｅａ３２１＋免疫 前血清（１００ｆｆｇ／ｍｌ）　、　８／　８＊　ホされたように処理したＩ　 Ｘ　１０”ｃｆｕのＥａ３２１を含有する５０１１１を接種後６４時間カット末 端で滲出を示している処理ナシ半分（８つから）の数。

プロテアーゼ又はバービン特異抗血清によるＥ、アミロボラの処理により感染し たナシ果実の数が減じた。Ｅ、アミロボラの生活力又は生育に影響することなく バーピンに影響を及ぼす二つの処理の上記した試験の効果は特にきびしかった。

抗血清又は酵素は処理細胞由来の子孫のバーピンと反応することが明らかでなか ったので、処理細胞に存在するバーピンのみが影響を及ぼし得た。本発明による 実際的な使用を想像する条件下で、抗バービン抗体は、抗バービン抗体又はプロ テアーゼをコード化している遺伝子と形質転換した植物により生成され、順番に これらは誘導因子にさらされた植物の疾病の苛酷さを防止又は減少する。又、感 染は上記実施例で用いたような約１０８とは反対に一般に少数の細胞により開始 するので、プロテアーゼ又は抗バーピン抗体によるリンゴ又はナシ樹木の開化処 理は、腐ラン病を大きく減少するようである。

従って、本発明を要約すると、バーピンは植物病原細菌（及び多分性の病原性微 生物）が、非宿主に過敏反応を惹起するが又は宿主に疾病を促進することを可能 にする蛋白因子の原型であるという強力な証拠がある。まず第一に、三つの属、 エルウィニア、シュードモナスおよびキサントモナスの株は、それらの各非宿主 植物の葉に接種すると、非常に類似の（視覚的に及び生理的に）過敏反応を惹起 する。この関連性は１９６３年に細菌により惹起した過敏反応の発見以来、報告 されて来た。さらに、全ての三つ属の細菌の株によるＨＲの惹起に必要な遺伝子 （同様にｈｒｐ遺伝子として引用される）も、宿主植物に対する病原性及び非宿 生植物での過敏反応の惹起に必要なものである。

植物病原細菌でのｈｒｐ遺伝子間の関連性は、ラビイ及びビアによる研究で示さ れた〔モレキュラー・プラント・マイクローブ・インターラクションズ５　：　 （１９９２）　ｌ　Ｒ，Ｊ　ラビイ、モレキュラー・スタディズ・オン・バソゲ ニシティ・アンド・ビルレンス・ファクターズ・オン・エルウィニア・アミロボ ラ、Ｍ、Ｓ、テシス、コーネル・ユニバージティー、イサ力、ＮＹ１９９１）。

彼らは、ＤＮＡレベルで、Ｅアミロボラのｈｒｐ遺伝子クラスターとシュードモ ナス・シリンガニのｈｒｐクラスターとの間の関連性並びにＥ、アミロボラのｈ ｒｐ遺伝子クラスターとＥ、ステワルティのｉｔｓ　（水浸ａ）遺伝子クラスタ ーとの関連性を決定的に示した。他の研究者は種々のＰノリンガエ病原型（特異 的且つ異なる植物に病原性のＰ、シリンガニの株）のｈｒｐ遺伝子間の著しい関 連性を証明した。さらに他の調査員は、キサントモナス・カンペストリスとＰ、 ソラナケアルムの株の遺伝子間の密接な関連性を証明した。従って、多数の植物 の病気を生ずる幾つかの属の植物病原細菌間の保存ＤＮＡにとって圧倒的証拠が ある。

本発明により、Ｅアミロボラのｈｒｐ遺伝子とＥ、クリサンテミの類似遺伝子の 間のＤＮＡ配列に有意な類似性も見られた。さらに、我々は、トウモロコシの厳 しい病原体、ＥステワルティのｈｒｐＮとゲノムＤＮＡの間に強いハイブリダイ ゼーションを観察した。より詳しくは、ｈｒｐＮとｗｔｓ遺伝子クラスターの特 異的１゜８ｋｂＨｉｎｄｌＩ［断片の間のハイブリダイゼーションが観察された 。これは、ナツメヤ／について試練したエルウィニアの他の二つの種がｈｒｐＮ １７１似体を有することを示す。従って、本発明によるｈｒｐ様遺伝子生成物（ 蛋白）に有意な類似性が期待できる。

さらに、Ｅ、アミロボラの多くのｈｒｐ遺伝子は、これらの遺伝子の変異の表現 型に基づき、バーピンのｈｒｐ遺伝子クラスターの部分とハイブリッド形成する 、シュードモナス・シリンガニのｈｒｐ遺伝子クラスターの一遺伝子は、種々の グラム陰性細菌の分泌物に含まれる蛋白と高アミノ酸類似性を有する蛋白を暗号 化する。

従って、シュードモナス、キサントモナス及びエルウィニアのｈｒｐ遺伝子の既 知の類似性は、三つの属の株により生成されるＨＲ誘発因子がアミノ酸配列で、 又は少なくとも一般特性（蛋白）及び機能で類似するようであることを期待させ る強固な基準を与える。例えばｈｒｐＮ　ミュータントは、バーピンと類似に機 能する蛋白を暗号化する他の植物病原生物（例えば細菌、かび、線虫）由来の遺 伝子を、相補により確認するのに用いつる。そのような蛋白は、実質的に異なる 一次構造を有しつる（従って、ＤＮＡハイブリダイゼーション技術により検出す るのは困難であろう）けれども、これらの蛋白は、ｈｒｐＮ遺伝子を除き、機能 的であうたｈｒｐクラスターを保有するＥ、アミロボラ又はＥ、コリにＨＲを惹 起する能力を回復するであろう。

本発明の範囲内の他の用途は、バーピン及び／又はパーピン生成株を植物バーピ ンレセプター及び／又はそれらの相互作用物質でシグナル形質導入通路に確認し 、そしてそれらのコード化遺伝子をクローンするのに用いることである。従って 、これは、植物病原体に対し改良耐性を有する遺伝子に設計された植物を生成す る目的で、バーピンレセプター（複数もあり）をコード化している植物遺伝子（ 複数もあり）の構造又は発現を使用するために、病原性因子として、又は防御反 応の誘導因子として作用する（植物に依存して）バーピンの可能性を利用させる であろう。

本発明の範囲内のバーピンのさらに他の用途は、天然で又は組織培養で生育した 植物での二次代謝物生成の促進因子としてであろう。

さらに他の用途は、特異的トランスジェニック植物を開発するため植物遺伝子の プロモーターに特異的なバーピンをコード化している遺伝子の融合であろう。

植物遺伝子が「付けられる」と、バーピンは発現し、植物細胞は死滅する。幾つ かの適切な植物遺伝子プロモーター及びそれらの計画された用途は、（雄性不稔 植物の開発となる）花粉開発に含まれる遺伝子、かびによる感染に対する反応に 発現される遺伝子、例えばフェニルアラニンアンモニアリアーゼ及びカルコン合 成（植物細胞は死滅し、それによりかびの進行を制限し、植物をかび疾病に対し 耐性にする）；及び（収穫を促進するため、ｈｒｐ遺伝子の発現は落葉となる） 老化の発現に含まれる遺伝子を含む。

本発明の範囲内のバーピンのさらに他の用途は、化学化合物が反応するよう設計 され、それにより細菌バーピンが、それが疾病に必要であるから、特異的殺菌剤 標的を提供するのを不活性化する「標的分子」としてのバーピンの使用であろう 。

本発明に記載されるヌクレオチド及びアミノ酸の表示は以下の通りである。

配列表示 （１）一般情報 （ｉ）出願人・ゾンーミン・ウェイ、ディピッド・Ｗ・バウアー、ステイーブン ・Ｖ°ビア、アラン・コルマー、シエンーヤン・へ及びロン・Ｊ・ラビイ （ロ）発明の名称　植物の過敏反応の誘導因子（ｉ）配列の数：５ （２）配列ＩＤＮ０＋１についての情報：（１）配列特性 （Ａ）長さ：１５アミノ酸 （Ｂ）型、アミノ酸 （Ｃ）鎖の数・−末鎖 （Ｄ）トポロン−・直鎖状 （ｊ）配列の種類：ペプチド （ｘｉ）配列記載配列Ｅ　Ｄ　Ｎ　Ｏ：　１　：（２）配列ＩＤＮ０：２につい ての情報・（１）配列特性 （Ａ）長さ・３８５アミノ酸 （Ｂ）型二アミノ酸 （Ｃ）鎖の数ニー末鎖 （Ｄ）トポロノー：直鎖状 （ロ）配列の種類、ペプチド （＼Ｉ）配列記載　配列ＩＤＮ０：３・Ａｒｇ　Ｇｌｎ　Ａ５ｎ　Ａｌａ　Ｇｌ ｙ　Ｌａｕ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　ＳＩ！ｒ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｉ ｇｕ　Ｇｌｙ（２）配列ＩＤＮ０：３についての情報：（１）配列特性 （＾）長さ＋１２８７塩基対 （Ｂ）型　核酸 （Ｃ）鎖の数・−末鎖 （Ｄ）トポロン−０直鎖状 （ム）配列の種類・ＤＮＡ （ｘｉ）配列記載：配列ＩＤＮ○　３゜ＡＭ；ＣＬＴＣＩ■ＡＩＧＧＣＡＣＬ１ ’ｆ”ｒＧＡＱＥ１’ｌ鎚Ｇ１ｆｆμｘ■ν１万ｌ’Ｅ’ｌ’ＧＡＡ　ｂＯ丁’ ＢＴＩＣＡＴＡＡ　ＧＡＧＧＩＩＡ’１ＡＣＧ　１’ｌ’　ＡＩＧ　ＡＧｒ　Ｃ ｒＧ　ＡＡＴ　ＡＣＡ　ＡＧＩ’　ｔＸ；ｌ　’ｉ’３Ｃ１ｕＬχ二ζ讃゛１′ ＣＡハ１ＡＩＧＣンＬ八八丁１゛１ＸンｒＡＩＣ肛Ｇ（ン１°（ｇコ（メメヒ： １」５Ｇｌ”込ＡＡＴ　ＪＶＣＧ幻’１°％　Ｌ：ｌＧ　Ｕ；ｌ’　肛ＡＧＥ’ 　０３：　ＣＡＧ　ＡＡＴ（Ａ、−１°Ｌｉｄｓ　ｌ　’／’／ＴＡＧ　ＧＩＥ Ｔ　ＧＧＣＡＡＴ　ＴＣＰ　（Ｍ：Ａ　ＣＩ’Ｇ　ＧＧＧ　（？１’Ｇ　ＧＱ； α℃αＴｒ　ＡＡＴ　ＣＡＡ　２１９ＡＡＴ　ＧＡＴ　ＡＣＣＧ［ＣＡＡＴ　Ｃ ＡＧ　（？ｌＧ　Ｇｅｌ’　ＧＧＣ’１°ｉＡ　Ｃ１℃ＡＱ：　ＧＧＣＡ’ｆ’ Ｇ　２６１ＡＴＧ　ＡＴＧ　ＡＴＧ　ＡＴＧ　ＡＧ：　Ａｌｕ　Ａ１℃ＧＧ：　 ＧＧｒ　ＧＧＩ’αＣＣ１１１３ＡｆｆＧαε３０３απα℃りαＣＧＧｒαＣ Ｔハαπ頽α℃１απα℃πス　３４５ＧＧｒ　ＧＧＣＣＩ’Ｇ　ＧＧＣＧＭ　 ＧＧＡ　Ｃ１ｕ　’圓ＡＡＣ回ＣＩＧ　ＡＡＣＧＡＴ　ＡＩＧ　３Ｂ１’ｌ’ｌ Ｑ　Ｃ４ＧＧＴ　ＴＣＧ　ＣＩ’Ｇ　ＡＡＣＡＣＧ　ＣＩＧα１ｊｌｌｌ：　’ ＩＣＩ；　ＡＡＡα℃αＣＡＡＣ４２９ＭＴ　ＡＣＣＡＣＴ　ＴＣＡ　ＡＣＡ　 ＡＣＡ　ＡＡ’ｌ”ｌ江ＣＣＧ　ＣｒＧ　ＧＡＣＣＡＧ　Ｇ＄　ＣＩＴＥ　４７ １ＧＧｒ　ＡＣＴ　ＡＡＣＴＣＡ　ＡＣＧ　ＴＱ：　ＣＭ　ＡＡＣＧＡＣＧＡＴ 　ＴＣＣＮＩ：π：ｆｆＧＧＣ５１３ＡＣＡ　ＧＡＴ　ＴＣＣＡＣＣＴＣＡ　Ｇ ＡＣＴＣＣＡＧ：　ＧＡＣＣＣＧ　Ａｌ’Ｇ　ＣＡＧ　ＣＡＧ　ＣＩＧ　５５５ ＣｒＧ　ＡＡＧ　ＡＴＧ　ＴＩＸ：　ＡＧＣＧＡＧ　Ａ’ｌＡ　ＡＴＧ　ＣＡＡ 　ＡＧＣＣ１℃慢Ｔα’；’ｒ　ＧＡＴ　５９’／ＧＧＧ　ＣＡＡ　ＧＡＴＧＧ ＣＡＯ：　ＣＡＧ　ＧＧＣＡＧｒ　ＴＣＣ１Ｃｒα℃α：ＣＡＡＧ　ＣＡＧ　６ ３９α）、；　ＡＣＣＧＩＶｌｔ　ＧＧＣＧＡＧ　ＣＡＧ　ＡＡＣωン圓」蔀■ 購αスＧにＡＣｒ　６８１ＧＡＴ　ＧＣＧ　ＣＩ’Ｇ　ＴＣＧ　αＥＣ（、ＴＧ 　Ａ゛ｍ　ＧＧＩ’　ＡＡＴ　ＧＧｒ　ＣＤＧ　ＡＧＣＣＡＧ　Ｃ１℃　７２３ ＣｒｒαにＡＡＣＧＧＧ　ＧＧＡ　ＣｒＧ　ＧＧＡ　ｉｌｌ；ｆ、Ｔ　ＧＧｒ　 ＧＡＧ　ＧＧＣＧＧｒ　Ｍｒ　ＧＣｒ７６５αＣＡＣＧ　ＧＧｒ　Ｃｒｌ’　Ｇ ＡＣＧＧｒＴｍ　ＴＣＧ　Ｃ１ｕα℃αＣＡＡＡ　ＧＧＧ　ＣＩＧ　８０７α刀 ＧＧＣＣＴＧ　ＡＧＣＧＧＧα刀ＧＩ”Ｇ　ＧＡＣＴＸ：　ＣＡＧ　ＣＡＧ　Ｔ ＴＡ　ＧＧｒ　ＡＡＣ８４９αＩ：　Ｇｒ’Ｇ　ＧＧｒ　ＡＣＣＧＧｒ　ＡＴＣ ＧＧｒ　ＡＴＧ　ＡＡＡ　ＧＱＩ；　ＧＧＣＡＴＩ’　ＣＡＧ　１ｌｆｆ　８９ １σＩ　ＡｋＴ　ＣＡＴ　に℃ＧＧｒ　ＡＣＧ　ＣＡＣＮオＣＡＣＡＧＥ’　Ｔ ＣＡ　ＫＣＯＧｒ　’に：ｒ　９３３Ｔｉｃ　ＧｒＣＡＡＴ　ＭＡ　ＧＧ：　Ｇ ＡＴ　ＣＧＧ　αΣＡＩＣ；　ＧＣＧ　ＡＡＧ　ＧＡＡ　ＡＴＣα社９７５Ｏｉ Ｇ　ＴＴＣＡ’ＩＧ　ＧＡＣＣＡＧ　Ｗ　ＣＣ１’　ＧＡＧ　ＧｒＧ　ＴＴｒ　 ＧＧＣＡＡＧ　ＣＣＧ　ＣＡＧ　１０１７ＴＡＣＣＡＧ　ＡＡＡ　ＧＧＣＣＱＩ ；　ＧＧｒ　ＣＡＧ　ＧＡＧ　ＧＴＧ　ＡＡＡ　ＡＣＣＧＡＩＩ’　ＧＡＣＡＡ Ａ　１０５９に：ＣＡＡＡ　Ｘ追α℃に毛αＬαπ０σＡＣＣαＣＭＣαＥＮに Ｃ罠１１８５ＣＡＧ　ＣＡＣＧＣＧ　ＧｒＧ　ＣＯＩ：；　ＧＩＧ　ＧＩＴ　Ｃ Ｔｒ　ＣＧＣＴＧＧ　ｍ　ＴＴＧ　Ａｎｕ　ＣＣＡ　１２２’７（２）配列ＩＤ Ｎ０・４についての情報（１）配列特性 （＾）長さ　１１５８塩基対 （Ｂ）型　核酸 （Ｃ）鎖の数　−末鎖 （Ｄ）トポロン−直鎖状 （ｊ）配列の種類：　Ｄ　Ｎ　、Ａ （＼ｌ）配列記載　配列ＩＤＮ０．４ Ａ’１らハｆｌ’　Ｃ１′Ｇ　Ａｌｌ’　ＡＣＡ岨１’Ｑ妬Ｃ１らα込ω；もＮ Ｉ；Ａｌｕ（〃４２Ａ’ｌ’ｌ”ＬＬ？ｒ　Ａ’ＩＣω−ＧＵＩ’　Ｃｉに　Ｌ 圧■ＡＡＩ’　ＡＡＣＧＧＧ　ＴＩＧ　ＣＩＸ；　（Ｕｌ’　８４ｋ）、−ＡＧ ｒ（ＪＭ　Ｃｊ−ｆ　Ｍｌ’　ｄ、’ｌ°Ｌｉｉ；　〕’ｌｌｊ　ＧＧＴＧらＣ ＡＡ’ｌ”１０１’　ＧＣＡ（！ｌｌ；　１２■ Ｃｓｎ　ＧＩＧ　ＧＱ：　豊ｆｆｌ’　ＡＡｉ’　ＬＡＡ　ＡＡＩ”　ＣＡＬ’ 　ＡＣＣＧｒＣｋＦｃ　（ＡＧ　（、’ｉｕ　１６ｅ＋（’ｓ：＋’　ＣＧンｍ ｒＡ　Ｃ１ｋ；鳩−ＣＣｉ　Ａ’ｌＬａ　ＫＩＧ　ＡＩＧ　Ｊ’ＮＩＧ　ＡＩＩ ’Ｇ　ＡＧ、：　ＡＩＧ　Ａ゛ｌｕ@２ＨＩ （−λＸ艷田「島ＣＩＩｊＡＩＩ込藏圓ｌ°αＣ’Ｌ’ｌ’Ａ■ン刀ｌ°αん１ °ＬＩＡ　２５２Ｇｊｌ’　ＡＡＴ　ＧＧ：ＴＡＧ印ｌ′ｃｉん１υバ刀ｌ肛Ｃ １Ｖα℃崗μ込Ｃ１ｔｊ　２９４’ＷコＧ　ＡＡＣＧＣＧ　Ｃ１ｔコ　ＪＶ’ｉ Ｕ　ＧＡＩ’　Ａ’ｌｔ；　’Ｌ’ＬＡ　ＧＳＣＧＧＬ’　ＴＣＧ　ＣＩＴこｉ 　ＡＡＣ／’iこＱ　：１３゜ Ｃ１らＧらこ１℃Ｇ　ＡＡＡ　（ＸＩこ０人：　Ｎ’ｉ　ＡＡＴＡＣＣＡｌｌ； ｌ”ｆ’ｃＡ　ＡＣＡ　ＡＣＡ　ＡＡＴ　」’／ｋｌ’［’ＣＣＣｆ：：Ｇ　Ｃ ｒＧ　ＣＡ：　Ｃ１−Ｊ：ｓ　ＧＬ：Ｇ　ＣＩＧ　Ｇｊｒ　ＡＴｒ　ＡＡＣＴＣ Ａ　紡ｒＩＣＣＣＡＡ　４２θＡＡＣＧ’ｊ：　ＧＡユ°　ＴＣＣＡＱＱ　’１ ℃こ　Ｕスｌ　ＡＣＡ　ＣＡＴ　ＴＣＣＡＣＣＴＣＡ　ＧＡＣ’ｌｕ：　４６２ ＡｌγＧＡＩ−ＣＣＧ　Ａｌｕ　ＣＡＧ　ＣＡＧ　Ｃ１ｔｘ　ＣＬｕ　ＡＡＧ　 Ｅｌ　’１’■ＡＧＣＧＡｎ　ＡＩＡ　ｂ０４Ａ、ｉＧ□□□Ｕ仄ＣＩＧ　ｒｒ ｒ田」゛弘Ｉ゛哩ＸＭ榔゛ｌ゛σ℃傾：（λｊ匹　５４６ＡＬ”’ｉ’　ＴＣＣ ”Ｋ：ｒ　ＧＧＧ　ＧＧＣＡＡＧ　ＣＡＧ　ｃｃｂ　ＡＣＣＧＡＡαＣＧＡＧ　 （ｍ　ＡＡＣ５８８αｌ：　’ＬＡＴ　ＡＭ　ＡＡＡαａ　母ｃ　＜ｒ　ｃｘ’ 　ａｃｅ　ＣＩＧ　ＴＣＧαｒ　ＣＩＧ　ＡＩＧ　６３ｎα：ｉｒ　ＡＡＴ　Ｇ Ｇｒ　Ｃ１ｕ　ＡＧＣＣＡＧ　Ｃ１’ＣＣ１’ｒ　Ｇｌｊ：　ＡＡＣ（Ｘ；Ｇ　 ＧＧＡ　ＣｒＧ　ＧＧＡ　６’７２ＧＡＣＴＡＣＣＡＧ　ＣＡＧ　ＴＥＡ　ＧＧ Ｉ’　ＮＣαＩ：　Ｃ１’ＣＧＧｒ　ＡＣＣαｎ’　ＩＣＧＧｒ　７９８ＡＩＧ 　ＭＡ　ＧＣＧ　ＧＧＣＡＴＬｏＣＡＧ　ＧＣＧ　ＣｒＧ　ＡＡＴ　（ＡＬ’　 ＡＴＣα７　ＡＣＧ　ＣＡＣ８４（ＩＡＧＧ　ＣＡＣＡＩＪＴＩＣＡ　肛ＣＧＬ ”ｌｃｒ　ＴＴＣＧＩＣＡＡＩ’　ＡＡＡαＥ　Ｇｋ１’　（工６８８２（ｓＪ ｓ　ｋＬＧ　Ｇａｓ　ＡＡＧ　ＧＡＡ　Ａｎ℃ＧＧｒ　ＣＡＧ　ＴＴＣＡ１’Ｇ 　ＧＡＣＣＡＧ　ＴＪＮｒ　ＣＣＩ’　９２４ＧＡＧ　Ｇｌ’Ｇ　ＴＩＴαｚｍ α１．Ｇ　ＧＡＧＴＫ：　ＣＡＧ　ＡＡＡ　ＧＧＣαｎ　ＧＧｒ　（％　９６６ ＧＡＧ　Ｇｌ’Ｇ　ＡＡＡ　ＡＣＣＧＡＴ　ＧＡＣＡＡＡ　’１℃Ａ　ＴＧＧ　 ＧＣＡ　ＭＡ　ＧＣＡ　Ｃ１’Ｇ　ＡＧＣ１００８ＡＡＧ　ＣＡ　ＧＡＴ　ＧＡ ＣＧＡＣＧＧＡ　ＡＴＧ　ＡＣＡ　ＣＣＡ　ＧＣＣＡＧＴ　ＡＴＧ　ＣＡＧ　Ｃ Ｊ’ｎ　１０５０１”ｌｃ；　ＡＡＣＡＡＡ　ＧＣＣＡＡＧαんＡＴＧＡｌ’良 思ＡＧＧα：ＣＡ’ｌＧα刀ＧＧＩ’　１０９２ａｐ：ｒｏＡＣＣＧＧＣＡＡＣ ｃｚ　ＡＡＣｃｒａ　ｃｐｒｓ　ｒｘ　ｃｃｒ；　ａ罠ＣＣＧ　ＧＩＧ　ａｒｃ 　１１３４σｎ′αＣＴＧＳ　Ｇ１：Ａ　’Ｉ″ｒＧＡＴｕαスπｈ　ｕｓＢ（ ２）配列ＩＤＮ０・５についての情報・（１）配列特性 （＾）長さ・２２２塩基対 （Ｂ）型　核酸 （Ｃ）鎖の数ニー末鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉ）配列の種類：　ＤＮＡ （ｘｉ）配列記載・配列ＩＤＮ０：５：従って、我々は我々の発明の好ましい実 施態様を示し記載したが、本発明は変更及び修飾が可能であることが理解される べきであり、そりゆえ我々は、記載された正確な用語に限定されることを望まず 、本発明を種々の用法及び条件に適用するためになされつるような変化と変更を 利用することを要望する。そのような変更及び修飾は、例えば（天然起源から誘 導された又は、合成的に製造された）本明細書に記載された誘導因子及びｈｒｐ Ｎ遺伝子に両方に、特に上記したものと実質的に類似な活性を生ずるよう機能す る構造的に類似の配列の置換を含む。従って、特に上記したこれらの配列の機能 を実質的に変更しない（ＤＮＡ配列での）核酸の、又は（ペプチド配列での）ア ミノ酸の置換、削除、挿入又は付加による配列の変化は、本発明の範囲内にある と考えられる。それゆえ、そのような変化及び変更は、同等物の完全な範囲内に 、それゆえ、以下の請求の範囲の範囲内にあることを正当に意図する。

このように我々の発明、並びにそれをなし、そして用いる手段及び方法を、それ が関係し、又はそれが最も密接に関連する全ての当業者がそれをなし使用するよ うな完全、明確、簡潔且つ正確な用語で記載した。

ＦＩＧ　２ 時間（時） ■ フロントページの続き （５Ｌ）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，６識別記号　庁内整理番号Ｃ０７Ｈ２１１０４Ｂ　 ８６１５−４ＣＣＯ７Ｋ　１４／２１　８３１８−４Ｈ１４／２７　８３１８− ４Ｈ Ｃ１２Ｎ　１５１０９　ＺＮＡ Ｃ１２Ｐ　２１１０２　Ｃ９２８２−４Ｂ／／ＣＣ１２Ｎ　１／２１ Ｃ１２Ｒ１：１９） （７２）発明者　バウアー、ディピッド・ダブリュアメリカ合衆国１４８５０　 ニューヨーク、イサカ、ウェストビュー・レーン　１３７番（７２）発明者　コ ールマー、アラン アメリカ合衆国１４８５０　ニューヨーク、イサカ、レキシントン・ドライブ　 １３９番Ｉ （７２）発明者　へ、シェンーヤン アメリカ合衆国１４８５０　ニューヨーク、イサカ、バッファロー・ストリート ６１２・イ一番 （７２）発明者　ラビイ、ロン アメリカ合衆国１４８５０　ニューヨーク、イサ力、エリショロー・ロード　１ １２２番

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ＡＴＣＣ６９０２１であるエセリシア・コリＤＨ５α（ｐＣＰＰ１０８４） 。 ２．植物の表面又は内部組織に適用すると、植物の過敏反応を誘導することがで きる分離ペプチド。 ３．プロテアーゼ感受性、酸性で約４４ｋＤの分子の大きさ、約４．３のｐｌを 有し、少なくとも１分間１００℃で熱安定である、請求項２のペプチド。 ４．エルウィニア、シュードモナス又はキサントモナスのｈｒｐＮ遺伝子により 発現される誘導因子と機能的に類似である、請求項２のペプチド。 ５．ペプチドがエルウィニア、シュードモナス又はキサントモナスの細胞表面と 関連している、請求項４のペプチド。 ６． 【配列があります】付加、削除、置換及び挿入が３８５アミノ酸配列の生物活性 を阻害しないという規定をそなえた、少なくとも一つのアミノ酸付加を有する類 似配列、少なくとも一つのアミノ酸削除を有する類似配列、少なくとも一つのア ミノ酸置換を有する類似配列及び少なくとも一つのアミノ酸挿入を有する類似配 列、からなる群からの生物学的に活性なペプチド。 ７．植物にハーピン誘導因子のインヒビターを与えること及び該インヒビターを ハーピン誘導因子と反応させることを含む、植物の病気又は過敏反応を改良する 方法。 ８．インヒビターがプロテアーゼである、請求項７の方法。 ９、インヒビターがハーピンに対する抗体である、請求項７の方法。 １０．インヒビターが刺激に反応して遺伝的に発現する、請求項７の方法。 １１．群 【配列があります】． 適当な宿主への配列の挿入用のベクターとの組合せで、付加、削除、置換及び挿 入がハーピンの生物学的発現を阻害しない規定をそなえた、少なくとも一つの核 酸付加を有する類似配列、少なくとも一つの核酸削除を有する類似配列、及び少 なくとも一つの核酸置換を有する類似配列、から選択された核酸配列からなるハ ーピンの発現を考慮する適当な宿主への挿入用の遺伝子。