JPH01501600A - 駆虫タンパク質用の遺伝暗号を含むｄｎａ断片を組み込んでいる雑種遺伝子、プラスミド、そのようなタンパク質を発現する形質転換した藍細菌及び生物抑制剤として用いる方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ４８、シネチョシスチス（Ｓ　ｎｅｃｈｏｃ　５ｔｉｓ）　６８０３である請求 項３３に記載の藍細菌。

４９、形質転換型細菌及びそれらの子孫の昆虫抑制値を、調節されるべき遺伝子 座に適用することからなる水中の蚊を抑制する方法。

５０、形質転換型細菌及びそれらの子孫の昆虫抑制値を活性成分として含有する 駆虫組成物。

５１、形質転換型細菌及びそれらの子孫を担体として含有する駆虫組成物。

５２、ドイツ微生物標本能（ＤＳＭ）に提出されたエシエリヒア・コリ（ｇ、刈 ■）　Ｋ　１２　・Ｈ１・ｔ　ｒ　ｐ中に保有されるプラスミドｐｌＢＮｌｏと 同じ形質を有するプラスミド。

明　細　書 駆虫タンパク質層の遺伝暗号を含むＤＮＡ断片を組み込んでいる雑種遺伝子、プ ラスミド、そのようなタンパク質を発現する形質転換した藍細菌及び生物抑制剤 として用いる方法 発明の背景 （１）要　約 駆虫タンパク質層の遺伝暗号、特に双翅目類に対して活性な内毒素用の遺伝暗号 を含むＤＮＡ断片を組み込んでいる雑種遺伝子を開示する。ま°た、そのような 遺伝子又はＤＮＡ断片を含む組換えベクター並びに該組換えベクターで修飾した 原核及び真核細胞を開示する。

（２）従来技術 本発明は、駆虫タンパク質用の遺伝暗号、特に双翅目特にこのような遺伝子又は ＤＮＡ断片を含む組換えベクターに関する。更に、本発明は、これらの組換えベ クターで修飾した原核及び真核細胞に関する。

害虫を抑制するバチルス・スリンジエンセス（！ＬＬｃｉｕＬｌ　ｔ　ｕ　ｎ　 ｉｓ　５ｅｓ）内毒素の用途は、広範囲の作物害虫及び環境害虫にわたって証明 されている。

バチルス・スリンジエンセス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｕｒｉｎ　１ｅｎｓｅｓ ）変異イスラエレンシス＜ｍ創１１０）は、湿地の蚊及びブユ（ｂｌａｃｋ　ｆ ｌＦ）幼虫を攻撃する生物学的駆虫剤として用いられている。これらの昆虫は、 特に熱帯地帯における人の健康について切実な問題である（マラリアなど）。

市販の処方剤は、胞子及び結晶からなる胞子形成段階のバチルス・スリンジエン セス（江ハ■■ｉ　ｅ　ｎ　ｓＵ）変異イスラエレンシス（ｉｓｒａｅ　ｅ　ｓ ｉｇ）菌の培養株からなる。これらの結晶は、昆虫毒性を有するタンパク質から なる。これらのタンパク質は、昆虫の幼虫に摂取されると中部消化管に作用する 。

この方策の主要な欠点は、バチルス・スリンジエンセス（肱吐ｕｕｔｈｕｒ　ｎ 　ｅｎｓｅｓ）菌が環境において不安定であるという事実である（ｇ外線の影響 、゛強い雨による洗い流しなど）、それ故に、薬剤を定期的に噴霧しなければな らず、この方法は非常に不経済である。

蚊の抑制をいっそう確実にするために本発明で達成した特定の事例では、形簀転 換した藍藻類の使用に関する。

藍藻類又は藍細菌（Ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）は光合成原核生物である。こ れらは、蚊幼虫について基礎となる重要な食物を構成する。蚊に対して活性であ ってこれらの微生物のゲノムに挿入される旦４．内毒素用の遺伝暗号は、蚊幼虫 を攻撃する有効な方法を意味する。幾らかの蚊種は、主要な人間及び動物疾患の 重大な媒介生物であり、且つ継続的に抑制するのが困難な地域で生息しているの で、二の害虫の長期間の駆除を確実する方法は魅力的である。

実艮　自然に発生する微生物中で産出される毒素を使用する利点は、他の処方形 態（例えば噴霧）における内毒素の使用に比べて多様である。目標昆虫の食物中 における毒素の存在は、該昆虫に直接吸収されることを保証する。

更に、それによって、付近において毒素をいっそう安定に利用できることを保証 する（自己再現、水面近くでの浮遊など）。

そこで本発明は、政綱菌細胞中で発現可能であるキメラ遺伝子を扱い、該キメラ 遺伝子は、 （＆）藍細菌中でＤＮＡ断片の発現に有効であるプロモーター領域からなるＤＮ Ａ断片と、 （ｂ）バチルス菌株で産出される駆虫活性タンパク質、該タンパク質の駆虫活性 の末端切断形態　又は実質的にこれらと配列相同性を有するタンパク質月の暗号 である少なくとも１個のＤＮＡ断片とからなる。

特に興味あるのはキメラ遺伝子であり、該キメラ遺伝子において、前記ＤＮＡ断 片（ｂ）はバチルス・スリンジエンセス（肱はＵ皿Ｕ皿上ｌＩ■旦）変異イスラ エレンシス（５ｒａｅｌｅｎｓ’ｓ）の菌株で産出されるタンパク質月の暗号で ある。ダラム陽性菌バチルス・スリンジエンセス（肱ハ■旦ｔｈｕｒｉｎ　ｔｅ ｎｓｅｓ）　（旦、１．）の菌株は、胞子形成の過程で細胞内タンパク質結晶を 産出する（Ｂｕｌｌａ　ｅｔａｌ、、　１９７７）。Ｓ−内毒素と呼ばれるこれ らの結晶タンパク質は、広い種類の鱗翅目昆虫（Ｄｕｌｍａｇｅ、　１９７９） 、幾らかの双翅目類及び鞘翅目類に対して毒性である。旦、１゜の異なる菌株で 産出される内毒素は、それらの分子構造及び昆虫群の範囲において異なるかもし れない。更に、ある旦、ｉ、の単離では、別個のタイプの結晶タンパク質を産出 するかもしれない。

バチルス・スリンジエンセス（江はＵ皿１五刀工匡旦＠ｓ）変異イスラエレンシ ス（ｉｓｒａｅｌｅｎｓｉｓ）　（Ｇｏｌｄｂｅｒｇ及びＨａｒｇａｌｉｔ、　 ’１９７？）は、蚊及びプユの幼虫に対して強い毒性である結晶を産出する。更 に、可溶化した結晶タンパク質は、哺乳動物細胞に対して溶血活性及び細胞毒性 を示す（丁ｈｏｓｍａｓ及びＥｌｌａｒ）。

旦、ｉ、イスラエレンシス（ｉｓｒａｅｌｅ　５ｉｓ）結晶は、異なった抗原性 を有する１３０．６５及び２８ｋＤａの３個の主要なポリペプチドを含む。未だ に、どの成分が旦、ｉ、イスラエレンシス（ｉｓ　ａｅｌｅｎｓｉｓ）結晶の強 い蚊駆虫活性に役だっているかについて論争がある。元来、昆虫毒性及び溶血活 性のいずれも、２８ｋＤａタンパク質に属していた（Ｙａｍａｍｏｔｏ、　１９ ８３；　Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ、　１９８４）。これは近年、２８　ｋＤａ結晶結 晶タンパ音質号化する旦、ｉ、イスラエレンシス（１ｓｒａｅｌｅｎｓ　ｓ）の 分子クーロン化及び形質によって確認された（Ｍａｒｄ　ａｔ　ａｌ、、　１９ ８４．１９８６）。ビッサーら（Ｖｉｓｓｅｒ　ａｔ　ａｌ、）は、２８ｋＤａ タンパク質が溶血性であり、一方、特異な蚊駆虫活性が１３０　ｋＤａのタンパ ク質にもっばら属することを明らかにした。

本発明は、好ましくはバチルス・スリンジエンセス（■口旦用ｔｂｕｒｉｎ　１ ｅｎｓｅｓ）変異イスラエレンシス（江Ω吐…且）からＢｔ８と命名する蚊駆虫 活性を有するタンパク質を暗号化する遺伝子であって、構造を第２図に示す１３ ０　ｋＤａ結晶結晶タンパ音質に該タンパク質の末端切断形態を暗号化する遺伝 子に関する。

マツフィントラシュら（ＭｃＩｎｔｏｓｈ　ａｔ　ａｌ、）は、政綱菌シネチョ シスチス（Ｓ　ｎｅ　ｈｏ　５ｔｉｓ）　６８０３の染色体の中へ異種遺伝子を 標的挿入する方法を開示している。この微生物は、外来性ＤＮＡを自然に取り込 むことができる形質転換系を有する。供与体ＤＮＡ分子は、藍細菌からの染色体 ＤＮＡの断片中ヘカナマイシン耐性の細菌遺伝子を挿入することによって構成さ れていた。受容細胞ｉＬ　細胞１０００個当り４個の形質転換体を得る頻度でカ ナマイシン耐性に形質転換されていた。転移ハイプリダゼーションによる形質転 換体からのＤＮＡの分析により、カナマイシン耐性遺伝子が藍細菌染色体に挿入 されることが明らかになった。組み込みは、異種挿入体を含む相同ＤＮＡと染色 体ＤＮＡを置換することによって発生した。

幾つかの藍細菌種が外来性ＤＮＡを取り込む能力が逍養基に加えたＤＮＡは、自 然的な抗生物質耐性の突然変異株から単離したＤＮＡを表現型耐性を感受性細胞 に転移するために用いることで示されるように、自然に発生する機構によって細 胞に入り込む（５ｈｅｓｔａｋｏｖ及びＫｈｙｅｎ、　１９７０：　＾５ｔｉｅ ｒ及びＥｓｐａｒｄｅｌｌｉｅｒ、　１９７６；　５ｔｅｖｅｎｓ及びＰｏｒｔ ｅｒ、　１９８０；　Ｇｒｉｇｏｒｅｉｖａ及び５ｈｅｓｔａｋｏｖ、　１９８ ２）。これは、自然型細菌遺伝子の突然変異株を野生型細胞中へ導入できること を示唆する。また、藍細菌は、自然藍細菌プラスミドに結合させた細菌抗生物質 耐性の遺伝子からなる組換えプラスミドによる形質転換で示されるように、異種 ＤＮＡを取り込むことができる（Ｂｕｚｂｙ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８３；　Ｖ ａｎ　ａｓ　Ｈｏｎ＋ｌ＠ｌ　ａｔ　ａｌ、、　１９８０）。この場合、形質転 換体は、適当な抗生物質を含む培養基で容易に回復し、且つ組換えプラスミドを 保有することが明らかになった。

エシエリヒア・コリ（１−、ｃｏｌｉ）細胞からの接合転移によるＤＮＡ取り込 みの他の機構が、最近、幾つかの藍細菌種における組換えプラスミドで説明され ている（νｏｌｋ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８４）、藍細菌プラスミドが相補性研 究に有用であるのに反し、これらは染色体に固有の遺伝子を修飾するのにあまり 役立たない。

細菌において、プラスミドは、染色体遺伝子において挿入変異を起こさせるのに 用いられている（　Ｒｕｖｋｕｎ及びＡｕ５ｕｂｅｌ、　１９８１）。これは、 プラスミド中でクーロン化した染色体遺伝子の中へ抗生物質耐性遺伝子を挿入す ることによって達成し、その際にプラスミドは、相同組換えによって抗生物質耐 性の遺伝子をプラスミドから染色体へ移動させるために舒生型細胞の中へ導入さ れ、最後に組換えは、抗生物質耐性についての選択を続けながらプラスミドの細 胞をキユアリングすることによって選択する。この処置は、一部では自己複製プ ラスミドの藍細菌をキユアリングするのに有効な方法がないた。め、藍細菌には 用いられていない（τａｎｄｅｎａｕ　ｄｅ　Ｍａｒｓａｃ　ｅｔ　ａｌ、、　 １９８２）。

藍細菌中の染色体遺伝子を改質する処置を開発するための努力において、ウィリ アムスとスザリー（Ｗｉｌｌｉａｍｓ及び５ｚａｌａｙ、　１９８３）は、シネ チョコッカス（江肚■ＱＣＯＣｃｕｓ）Ｒ２の染色体ＤＮＡの断片に結合させた 細菌抗生物質耐性の遺伝子を用いて、シネチョコッカス（江肚娃匹■工■）Ｒ２ の形質転換を研究した。異種ＤＮＡは、相同組換えによってシネチョコッカス（ Ｓ　ｎｅｃｈｏ　ｏ　ｕｓ）　Ｒ２染色体の中へ有効に組み込まれ、且つ藍細菌 ＤＮＡ内での耐性遺伝子の位置により、突然変異の形質転換が構築されうろこと が判明した（　Ｗｉｌｌｉａｍｓ及び５ｚａｌａｙ、　１９８３；並びに未発表 の成果、　ＪＧＫＷ）。シネチョコッカス（江旦吐Ｉ…」）Ｒ２の形質転換系の これらの形質では、修飾した遺伝子をこの微生物の染色体の中へ導入できること を示唆している。

ウィリアムスとマツフィントラシュ（Ｗｉｌｌｉａｍｓ及びＨｅＩｎｔｏｉｈ） が報告した実験により、シネチョシスチスＣ３ｔＵ蝕μ工旺口）６８０３は、シ ネチョコッカス（打ｎｅｃｈ。

ｑ）Ｒ２で開示したよりも多く、相同組換えによってその染色体の中へ異種遺伝 子を挿入してしまうことが可能であることが明らかになる。

これらの結果に基づいて、旦、ｉ、遺伝子のような異種遺伝子を藍細菌の中へ転 移させるためのベクター系を開発するものである。

本発明の目的は、蚊駆虫タンパク質好ましくはバチルス・スリンジエンセス（Ｂ ａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｕｒｉｎ　１ｅｎｓｅｓ）のタンパク質層の暗号である新 規なキメラ遺伝子を提供することである。

本発明の他の目的は、前記キメラ遺伝子を含む新規な雑種プラスミドベクターを 提供することであり、該ベクターは、前記キメラ遺伝子をゲノム又は残りの染色 体外細胞中へ組み込むことができる。

本発明の別の目的は、前記プラスミド又はキメラ遺伝子で形質転換させた藍細菌 と、並びに前記形質転換廷細菌の使用による蚊の抑制方法を提供することである 。

本発明の他の目的、特徴及び利点は、添付図面に関連させて述べた下記の説明か ら当業者において明らかになるであろう。

側見旦豊里１ 本発明にしたがって、 （ａ）藍細菌中でＤＮＡ断片の発現に有効であるプロモーター領域からなるＤＮ Ａ断片と、 （ｂ）バチルス菌株で産出される駆虫活性タンパク質、該タンパク質の駆虫活性 の末端切断形態、又は実質的にこれらと配列相同性を有するタンパク質層の暗号 である少なくとも１個のＤＮＡ断片と、 からなる藍細菌細胞中で発現可能であるキメラ遺伝子を提供するものである。

前記キメラ遺伝子では、ＤＮＡ断片（ｂ）が好ましくは抗双翅目類活性を有する バチルス菌特にバチルス・スリンジエンセス（肱は■旦ｔｈｕｒｉｎ　ｔｅｎｓ ｅｓ）又はバチルス・スハエリクス（肱ハｕ胚５３５■■■皿）からのタンパク 質層の暗号であることを包含し、特にＤＮＡ断片（ｂ）が駆虫活性を有する第２ 図に示す構造に対応するＢｔ８と称するタンパク質並びにその末端切断形態用の 暗号であることを包含している。

また、前記キメラ遺伝子では、ＤＮＡ断片（ｂ）がＤＮＡ断片（Ｃ）に融合され ることを包含し、該ＤＮＡ断片（Ｃ）はタンパク質特に発現可能である酵素であ ってＤＮＡ断片（ｂ）を発現する藍細菌の同定又は選択を可能にする該酵素用の 暗号であり、特に選択可能又は採点可能なマーカーがネオ遺伝子である遺伝子を 包含している。

カナマイシン耐性の遺伝子（ネオ遺伝子）との７ミノ末端融合により、細菌中で なおりナマイシン耐性を付与する融合タンパク質を生成できることが知られてい る（Ｒｓｉｓｓ　ａｔ　ａｌ、、　ＥＭＢＯＪ、　３．３３１７頁、　１９８４ ）。

カナマイシン耐性は、細菌中及び藍細菌中のいずれでも最も適切な選択マーカー であるので、このような遺伝子融合は有望な応用である。実際、藍細菌を形質転 換するためにこのような°ＮＰＴＨ融合タンパク質を使用すると、カナマイシン 耐性についての選択により、融合産生体の発現についての直接選択が可能となる 。従って、ネオ遺伝子との毒素遺伝子融合は、カナマイシン耐性（二ついての選 択によって、藍細菌を形質転換するために用ｂ）、且つ高レベルの毒素を発現さ せる形質転換体について選択するために用いることができる。この選択処置は、 特に「ショットガン」方法において有用であり、それによって融合遺伝子を形質 転換の前に藍細菌ＤＮＡ配列の後ろにランダムに挿入している。これにより、藍 細菌中で高レベルの融合タンパク質を誘導する強いプロモーターの後ろに、融合 遺伝子からなる構築体につｉて直接選択することが可能となる。

前記ＤＮＡ断片（ｂ）は、藍細菌中で作用するプロモーターのｖＡ節下にある。

これは、ルピスコ（ｒｕｂｉｓｃｏ）オペロンの発現に向くプロモーター配列の ように、藍細菌中で自然に発現される遺伝子から誘導するプロモーター領域であ るか、或いは他の藍細菌のプロモーター領域、又乞よ細菌やファージのような異 なる微生物からのプロモーター領域であればよく、例えばλＰＬプロモーターは シネチョシスチス（Ｓ　ｎｅ　ｈｏ　ｓｔｉ　）中で作用する。

前記キメラ遺伝子は、前述した方法とは異なる方法、特に該キメラ遺伝子を保有 する９ａ種プラスミドを用（Ｘる形質転換によって藍細菌中に導入してもよＶｌ 。

二のようなプラスミドは、特に相同組換えによって型組菌のゲノム内ヘキメラ遺 伝子を組み込むために用いてもよい、このような組換えのために、雑種プラスミ ドは、型組菌のＤＮＡの内の少なくとも１個の染色体断片からなり・　特にキメ ラ遺伝子をＤＮＡの染色体断片の中に位置させる。

前記プラスミドはまた、型組菌ＤＮＡの染色体断片なしに、例えば型組菌中で複 製機能の開始点を有する染色体外プラスミドとして用いてもよい。

更に、本発明にしたがって、細胞ゲノム中に含みかつ前述したように染色体を発 現するプラスミドを保有する型組菌を提供している。

型組菌の中で、シネチョシスチス（Ｓ　ｎｅ　ｈｏｅ　５ｔｉｓ）やアナシスチ ス＜　匝■凪且）もいっそう好適に使用することができる。

しかし、他の種を使用してもよく、例えばバイオタイプ：　シネチョコッカス（ Ｓ　ｎｅ　ｈａ　ｏｃ　ｕｓ）、アガメネルム（組■■旦」）、アプハノカブサ （組励μｍ吐銭）、グロエカブサ（旺■ｎ旦）、ノストック（Ｈｏ５ｔｏｃ）、 アナバエナ（＾ｎａｂａｅｎａ）、フレミリア（■匡■且口）について使用でき る。

しかもまた、本発明にしたがって、形質転換した型組菌及びそれらの子孫を用い て、駆虫組成物及び駆虫方法を提供している。

前記形質転換藍細菌は、ある地域特に蚊幼虫の生育を促進する湿地及び全ての淀 んだ水に沈ませるための生存植菌物として用いてもよい。

しかし、前記型組菌は、駆虫処方剤をあらゆるタイプの組成物にして調製するた めに直接に用いてもよい。

・　； 第１図は、クローンｐＭＵ３８８におけるＸ′ｂａ工挿入体の制限酵素地図であ る。２個の欠損クローン（Ｂｔ８・ＡｃｃＩ及びＢｔ８・ＮｄｅＩ）も表示して いる。蚊幼虫に対する毒性であって、異なる挿入体を有するｐＵＣ１２を含むエ シエリヒア・コリ（旦、　江■）細胞の該毒性もまた示唆している。

第２ａ図は、１３０　ｋＤａの旦−１＋イスラエレンシス（ｉｓｒａｅｌｓｎｓ ｉｓ　）毒素遺伝子（Ｂｔ８）のＤＮＡ配列及び推論アミノ酸配列である。推定 のリポソーム結合部位は、アンダーラインしている（位置１４５〜１４９）。

第２ｂ図は、Ｂｔ８のアミノ酸配列を示す。

第３図は、ｐＬＫｍ９１においてλＰＬの後ろに毒素遺伝子を位置させるために 用いた方策を示す。

第４図は、９ＭＵ３８８及びｐＬＫｍ９１からのＢｔ８：　ネオの構築を示す。

第５図は、９ＭＵ３８８及びｐＫＷ１１８８シネチョシスチス（Ｓ　ｅ　ｈｏ　 ｓｔ’ｓ）発現ベクターの構築を示す。

第６図は、ｐＨＴ１１８８の構築を示す。

第７図は、ｐＨＴ１１８８の構築を示す。

第８図は、ルビスコオベロンの発現に向くプロモーター配列からなるシネチョシ スチス（Ｓｎｅｈｏ　５ｔｓ）６８０３からのＤＮＡ断片の単離を示す。

第９図は、プラスミドｐＲＢＣ４の構築を示す。

実施例１ バ　、　璽　’　”　′　Ｂａ　ｉｌ　ｕｓ　ｔｈｕｒｉｎ　ｔｅｎｓｅｓ−ニ レ′２　１ｓｒａｅｌｅｎｓｉｓ　（Ｂ　、　ｔ　。

１　＋　− クローン化操作の要約は下記の通りである。

バチルス・ジェネティック・ストック・センター（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　Ｇｅｎｅ ｔｉｃ　５ｔｏｃｋ　Ｃｅｎｔｅｒ）　（Ｃｏｌｕｍｂｉａ、　０ｈｉｏ）から 得た旦、ｉ、イスラエレンシス（５ｒａｅｌｅｎｓｉｓ）　４　Ｑ　２７２から 、±１１０ｋｂ（±７５）ＩＤａ）プラスミドを単離する。このＤＮＡを適当な 制限酵素で消化させ、そして直線状のｐＵｃ１２に連結する。受容細胞エシエリ ヒア・コリ（Ｌｌ）　Ｊ　Ｍ　１０７は、連結混合物によって形質転換させる。

この組換え体は、ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーションで毒素遺伝子の存在に ついてスクリーニングし、統いて蚊幼虫による昆虫検定法を用いて毒素産生物に ついてスクリーニングする。ハイブリダイゼーション検定において陽性反応し且 つ蚊幼虫に対して高い毒素活性を示すクローンを次の研究で選び出し、９ＭＵ３ ８８として表示する。

実施例２ ゝ　゛　二　ゝユｉ　・コｌ（Ｅ、Ｃ０１１１：”　Ｂ、ｔ、１１３０ｋＤａ　 ”　ンバ　のエシエリヒア・コリ（ｇ　、ｇ、５２ＪＪ　）クローンに５１４（ ９ＭＵ３８　ｇ　）は、アエデス・アエグプチ（Ａｅｄｅｓ■■且１）の幼虫に 対して高い毒性であり（第１表）、それ故に多分旦、ｔ、ｉの蚊駆虫結晶タンパ ク質用の遺伝子を保有する。９ＭＵ３８８プラスミドは、±３．６ｋｂのＸｂａ 挿人体を有するｐＵｃ１２を含む。このＸｂａ断片の制限酵素地図は第１図に示 している。

５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル（ＰＡＧＥ）におけるエシエリヒア・コリ（旦 、吐）　Ｋ５１４　（９ＭＵ３８８）の総細胞抽出物の分析は、旦、１．１の主 要な結晶タンパク質の一つと同じ見かけ分子量である±１３０　ｋＤａの弦いタ ンパク質帯を表わす。このタンパク質は、挿入体のないｐＵＣ１２ベクターを含 む調節エシエリヒア・コリ（旦、μ１ｉ）Ｋ５１４中には存在しない。

Ｂｔ８と称する±１３０　ｋＤａタンパク質は、エシエリヒア・コリ（Ｅ、　収 ■）細胞の総タンパク質量の５〜１０％になる。これは、細菌細胞中で沈降物と して存在し、該細胞の溶解後に、還元試薬（Ｄ　Ｔ　Ｔ、Ｍ　Ｅ　）を含有する アルカリ性ｐＨ（９〜１０）の緩衝液を用いて選択的に可溶化することができる 。

また、同じ条件で、元の旦、ｔ、ｉ結晶を効果的に可溶化することができる。可 溶化した半ｔ１０のＢｔ８タンパク質は、アエデス・アエグブチ（Ａｅｄｅｓ　 ｍ　）の幼虫の毒性検定に用いている。

可溶化したＢｔ８タンパク質についてのＬＣ５０値は、自然の旦、ｔ　、ｉ結晶 より顕著に高い１００　ｎｇ／ｍｌである。

しかしながら、可溶化した旦、ｔ　、ｉ結晶について、もつと高いＬＣ５０値も 記録している（　５０　ｎｇ／ｍｌ、第２表参照）。蚊幼虫は濾過摂取体である ので、これが粒子に比べて可溶性タンパク質の有効吸収が低いことの説明になる 。実際、Ｂｔ８タンパク質の毒性は、クエン酸による沈降で高めることができ（ ５ｎｇ／ｍｌ）、且つエシエリヒア・コリ（旦、μ■）中に存在する不溶化Ｂｔ ８は、自然の旦、１．１結晶に匹敵する５　ｎｇ／功１のＬＣ５０値である（第 ２表）。

アルカリ性ｔｉｓ液に可溶化した精製Ｂｔ８タンパク質は、試験管内で昆虫細胞 系における毒性について検定する。旦、１．ｉからの２７ｋＤａ毒素は、５０　 ｕｇ／ｍｌでアエデス・アルボビクツス（Ａｅｄｅｓ　ＬＬ■ム■且）細胞の完 全な溶解を起こすことが判るのに対し、Ｂｔ８は５０　ｕｇ／ｍｌでも可視の細 胞変性効果を持っていない。従って、Ｂｔ８タンパク質は、少なくともその機能 性状のいくつかにおいて２７ｋＤａ旦、ｔ　、ｉ結晶タンパク質と明らかに異な っている。

ｉｔ、ｉ結晶中に存在するクローン化Ｂｔ８ポリペプチドと１３０　ｋＤａタン パク質との構築的関係は、免疫学的データーによって確認する。ウェスタンブロ ッティング法において、Ｂｔ８タンパク質は、旦、１．１菌株４Ｑ２−７２の結 晶タンパク質で増したウサギ抗血清と激しく反応する。更に、￥ｒＩ製Ｂｔ８タ ンパク質で増したウサギ抗血清も、旦、ｔ、ｉ結晶の１３０　ｋＤａタンパク質 と激しく反応する。それ故に、エシュリヒ・ア・コリ（ｇ、ｃｏｌｉ）中におい て、主要な旦、ｔ、１結晶タンパク質と類似した機能的且つ構築的性状を有する タンパク質を暗号化する旦、１．ｉ遺伝子をクローン化し且つ発現させている。

実施例３ ”−’　１ クローンｐＭＵ３８８の全部の３．６ｋｂ挿人体が配列されている。配列（第２ 図）は、単一の大きい転写解読枠を示す。翻訳のための４群のポテンシャルＡＴ Ｇ出発点は、±１３０　ｋＤａポリペプチドのもとであって、塩基対位置１４２ ，１５７，１９９及び２３２で同定されている（第２図）。塩基対位置１５７の ＡＴＧコードンには、共通リポソーム結合部位ＧＧＡＧＧ　（塩基対１４５〜１ ４９）が前置している。塩基対位置１５７のＡＴＧから出発しかつ位置３５６５ のＴＧＡ停止コードンで絆了する解読枠は、１２７０００Ｄａの属性分子質量を 有する１１３６アミノ酸のタンパク質を暗号化し、５ＤＳ−ＰＡＧＥで測定した Ｂｔ８の推測質量とよく一致する。エシエリヒア・コリ（旦、−）Ｋ５１４　（ ２ＭＵ３８８）で産出したＢｔ８タンパク質を精製し、Ｎ末端アミノ酸配列をガ ス相配列決定法で測定する。得た配列Ｎｅｔ　−Ａｓｎ　−Ｘａａ−Ｇｌｙ−τ ｙｒ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ｌｅｕは、　ＡＴＧ位置１５ ７から出発するＤＮＡ配列から推論されるものと同一である（第１図）（Ｘａａ は明白に同定することができない残基を示す〉。

実施例４ −．ヅ １３０　Ｄａレボドプテラン（Ｌｅｐｏｄｏｐｔｅｒａｎ）特効の旦、ｉ、内毒 素はプロトキシン類であり、幼虫消化管プロテアーゼで分解後にいっそう小さい 毒性ポリペプチドを得る。

従って、１３０　ｋＤａ蚊特効のＢｔ８毒素が、プロテアーゼ処理後にいっそう 小さい毒素断片を生成するか否かを研究する。精１１Ｂｔ８タンパク質は、トリ プシン、キモトリプシン、又はアエデス・アエグプチ（Ａ　ｅ　ｄ　ｅ　ｓ　ｕ Ｌｌｕ）幼虫のタンパク質加水分解酵素を含有する抽出物のいずれかによって処 理する。３７°Ｃで１時間消化後に、１３０　ｋＤａタンパク質は、より小さい ポリペプチド断片に完全に分解する。５Ｉ）Ｓ−ＰＡＧＥ分析は、トリプシンに ついて４８．　７５．　７８ｋＤａ、キモトリプシンについて６５゜６８ｋＤａ 、及び蚊の消化管プロテアーゼについて４５，７２　ｋＤａの主要なタンパク質 量を示す。昆虫検定法で試験すると、これら全ての消化サンプルは、無傷の１３ ０　ｋＤａＢｔ８タンパク質に匹敵する蚊幼虫に対する毒性レベルを示す、また 、類似の毒性レベル（１ｕｇ／ｍｌのＬＣ５０値）は、８０　ｋＤａ断片即ちＢ ｔ８からの自然分解産出物によっても達成され、該自然分解産出物は４℃でこの タンパク質を延長保存した後に生じる（多分、Ｂｔ８サンプル中のエシエリヒア ・コリ（Ｌ刈■）プロテアーゼによる）。

蚊駆虫プロテアーゼによるＢｔ８タンパク質の１２〜１８時間にわたる延長処理 により、主要な４５ｋＤポリペプチドへのいっそうの分解を起こし、該ポリペプ チドは他のタンパク質加水分解に対して本質的に耐性である。

しかしながら、このポリペプチドのサンプルは蚊幼虫に対してそれほど毒性でな い、同様に、トリプシン及びキれぞれ得る。なお、検出される残りの毒性活性は 、多分、これらの生成物中にまだ存在する歿らかの不消化の７８及び６８ｋＤポ リペプチドによるものである（第３図）。

このデーターでは、Ｂｔ８毒素は、蚊の中部消化管プロテアーゼを含むタンパク 賃加水分解酵素によって、十分な蚊駆虫活性を保持している類似の６８〜８０ｋ Ｄａのポリペプチド断片へ分解されうろことを示唆している。

Ｂｔ８分子についての毒性に必須の領域を局在化させるために、Ｂｔ８遺伝子中 に存在する制限酵素部位を用いてクローンに５１４　（２ＭＵ１８８）の欠損変 異株を構築する。２個の３′末端欠失、即ち、塩基対位置２４７５のＡｃｃＩ部 位までのＢｔ８の５°断片を含むＢｔ８・ＡｃｃＩと、塩基対位置１８２０のＮ ｄｅ工部位で絆了するＢｔ８・ＮｄｅＩとを生じる。このクローンは、ウェスタ ンブロッティング法で測定したように（データーは示さない）、９０ｋＤａ及び ６７　ｋＤａの予想サイズのタンパク質を産出する。昆虫検定法で試験すると、 Ｂｔ８・ＡｃｃＩクローンは蚊駆虫活性を示し、一方、より短いＢｔ８・Ｎｄｅ Ｉは非毒性である。従って、活性の蚊駆虫ポリペプチドを暗号化する遺伝子断片 は、クローンＢｔ８・ＮｄｅＩで同定された断片に対してＢｔ８のＮ末端後半に 局在化されている。

〜４　こ　い　゛ ロー′　Ｂ、ｔ。

エシエリヒア・コリ（Ｅ、ｃｉｌｉ）の１゛ρ飽和培養からの細胞ベレット（ｐ ＭＵ３８８）を、１００ｍＩ２の５０ｍＨトリス塩酸（ｐＨ７，９）−５０ｍＭ ＥＤＴＡ−１５％スクロース中に懸濁する。細胞懸濁液をＯ″Ｃで３０分間リソ チーム（１００ｕｇ／ｍｌ）で処理し、吹に細胞が完全に溶解されるまで氷上で 超音波処理する。

除去する。このベレットを５０ｍｊ２のＩ　ＨＮ　ａ　Ｃｌ　−１％トリトン（ 丁ｒｉｔｏｎ）　Ｘ　１００−０　、１　＋＋）！フェニルペンチＪレスルホニ ルフロリド（ＰＭＳＦ）中に再懸濁して、０℃で３０分間インキュベートし、次 にｉ？！ＮａＣｌ２−１％トリトンＸ１００で２Ｉｉｉ］洗浄し更にリン酸緩衝 食塩水（ＰＢＳ）で洗浄する。この「終末ベレット」に存在するＢｔ８タンパク 質を、５ｍｊ２抽出緩衝液（０，ＩＭＮａｔＣＯり（ｐＨ９，５）−０，２Ｍチ オグリコール酸塩）中で３７°Ｃで２時間可溶化する。可溶化したタンパク質を ＰＢＳに対して透析する。タンパク質の精製を５ＤＳ−ＰＡＧＥで判定する。タ ンパク質の流度を供給会社の使用法に従ってタンパク質検定試薬（Ｂｉｏ　Ｒａ ｄ）を用いて測定する。

ｔ　８　゛　バ　＼　二　” 全ての実験を３７℃で行う。ＰＢＳ−０，５％ＮＨ，ＨＣｊ２　ｓ中で可溶化し た精製Ｂｔ８タンパクｌｉ　（Ｉ　Ｂ／ｍｌ）をトリプシン又はキモトリプシン （σ）　２０：　１　（Ｗ／Ｗ）で消化させる。蚊の消化管プロテアーゼの場合 、ＰＢＳ−１舊ＮａＣｌ中の精製Ｂｔ８タンパクＭ（功ｇ／加１）をアゼ１：１ ０（Ｗ／ν）で消化させる。

消化管プロテアーゼの調製：　５０匹の三令アエデス・アエグプチ（Ａ　ｅ　ｄ 　ｅ　ｓ　Ｍツ旦）幼虫消化管及び１匹の初会エム・セクスタ（ｉ、５ｅｘｔａ ）幼虫中部消化管を、超音波浴において１ｍ＆の５０ｍＭＮａ２ＸＬｉ　（１） Ｈ９’、５　）　−１０ｍＭＤ　Ｔ　Ｔ中で音波破壊する。残滓を１０分間１１ ００００ｒｐの遠心分離で除去する。上澄み液のタンパクｊｌ　＞１度を検定す る。この上澄み液は２０℃でアリクオツド（ａｌｉｑＨｔｓ）中に貯蔵する。

７′　・ 試験懸濁液１ｍｊ２の全量を１２ｍｍ直径のミクロ滴定プレートの両面に載置す る。１０匹の三令アエデス・アエグブチ（Ａｅｄｅｓ■Ｌ上ｕ）幼虫を加える。

死亡率を３０℃で２４時間記録する。酸沈降したサンプル用に、可溶化したタン パク質を１／１０容積の１２％クエン酸の添加によって沈降させる。沈降したタ ンパク質を遠心分離法によって小さく丸め、そして蒸留水中に再懸濁する。

た１１豊且淀 旦、ｉ、タンパク質に対する抗血清を、ニューシイランド白ウサギへの該タンパ ク質の皮下注射によって得る。

抗血清の特異性仲、供給会社の使用法に従って結合抗体を検出するために、°抗 つサ、ギ免疫グロブリン（σ）を接合したアルカリ性フォスファターゼを用いる ウェスタンブロッティング法によって確認する。

酵素結合の免疫吸着検定法（ＥＬ工ＳＡ）をエンガバル（Ｅｎｇｖｓｚｌ　）及 びベスセ（Ｐｅ５ｃ＠）の方式で行う。

；；ｉも− Ｂｔ８タンパク質のアミノ末端配列は、木賃的にヘイツクら（Ｈ＠ｗｉｃｋ　ｅ ｔ　ａｌ、）に従って操作される気相セキュ■ＳＡ）を用いて測定する・ ％　＋　１ 制限酵素エンドヌクレアーゼは、供給会社（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　！ｌｉｅ 　Ｌａｂｓ、　Ｉｎｃ、及びＢｅｔｂｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒ ａｔｏｒｉａｓ　Ｉｎｃ、）で述べられたように用いる。制限マツピング及び継 代クローン化をマニアチスら（Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ、）に従って行う ・　ＤＮＡ配列は、マクサム（Ｍａｒａｍ）及びギルバー）　（Ｇｉｒｂｅｒｔ ）方式で測定する。タンパク質バイトロバシーをカイト（Ｋｙｔｅ）及びドーリ ットル（Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ）法によって計算する。

第１表 アエデス・アエグプチ（Δ、■」上ｕ）の幼虫に対するプラスミド保有エシエリ ヒア・コリ（旦、−）　Ｋ　５１４の蚊駆虫活性 実施例５ ｔ８：　、　゛　一 実施例４において、遺伝子Ｂｔ８の暗号配列の断片（暗号配列の塩基対位置２３ ２２までの遺伝子の５′末端後半、ＡｃｃＩ部位で同定される）は、毒性ポリペ プチドを暗号化することを示唆している。

この断片をｐＢＲ３２２についてのＴｎ５の無傷の主（第４図） ｐＬＫｍ９１は既に開示されている（ヨーロッパ特許出願８５３００２９１．１ 号）。

９ＭＵ３８８はチャナム・アングスサナソンバット（Ｃｈａｎｕｎ　Ａｎｇｓｕ ｔｈａｎａｓｏｍｂｔ）の論文で開示されテイル。

Ｈｉｎｄｍ、ＤＮＡポリメラーゼのクレノー断片（Ｋｌｅｎｏｗ）、ＢａｍＨＩ 及びｃｉｐで処理したｐＭＫｍ９１のＤＮＡを、Ａｃｃ工、Ｋｌａｎｏｖ及びＢ ａｍＨＩによる９ＭＵ３８８の処理で得た２、４Ｋｂ断片に連結し、そして調整 用アガロースゲルから回収する。この組換えクローンは、アンピシリン（１００ ｕｇ／ｍｌ）についての選択及びカナマイシン（２０ｕｇ／ｍｌ）　耐性につい てのスクリーニングによって単離する。

ｂ、工ｓユｌ　、ｌ　Ｅ、ｏｌｉ　・’＝　”Ａｌ八へ１辺上１ プラスミド構築体ｐＢＩＮ１０中でＰＬプロモーター特表平１−５０１６００　 （９） の後ろの融合遺伝子１１１Ｌ圭ｊは、暗号化の融合タンパク質の性状を調べるた めに、エシエリヒア・コリ（旦。

μ■）中で発現させる。

ｐＢＩＮＩＯで形質転換されたエシエリヒア・コリ（Ｅ、ＣＪｌｉ）　Ｋ　１２ 　・Ｈ１・ｔ　ｒ　ｐは、５ＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロッティング法 で分析する。５ＤＳ−ＰＡＧＥ中の完全な細菌抽出物のコマッシイ（ｃｏｏｓｎ ａｓｓｉｅ）染色により、融合タンパク質の予想サイズ（約１００　Ｋｄ）に対 応する見かけ分子量を有する新タンパク質量の存在を明らかになる。また、この タンパク質は、抗旦、１．１結晶血清、抗Ｂｔ８又は抗Ｎ　Ｐ　Ｔ　ＩＩ血清の いずれかを用いるウェスタンブロッティング法で見ることができる。

再度、陽性反応帯によって融合タンパク質の予想サイズを明らかになる。このタ ンパク質は、殆ど分解産出物が検出されない（より低い分子量の帯）ので、エシ エリヒア・コリ（ｇ、ｃｏｌｉ）中で全く安定している。

ｐＢＩＮＩＯを含むエシエリヒア・コリ（ｇ　、　剣■）のクローンに１２・Ｈ ・ｔｒｐは、実際にカナマイシン耐性である。細菌は４００Ｕｇ／ｍｌＫｍ　（ ２８℃）で増殖することができる。融合タンパク質のＮ　Ｐ　Ｔ　ＩＩ活性は、 開示されたようにＮ　Ｐ　Ｔ　ＩＩ検定法を用いて評価する（Ｒｅｉｓｓ　ｅｔ ａｌ、、　Ｇｅｎｅ、　３０．２１７頁、　１９８４）。Ｂｔ８：ＮＰＴＩＩタ ンパク質を発現するエシエリヒア・コリ（ｇ、ｃｏｌｉ）クローンの細胞抽出物 は、野生型Ｎ　Ｐ　Ｔ　ＩＩを産出するエシエリヒア・コリ（互、並置）クロー ンからの抽出物と同時に、非変性状態のゲルに送り込む。細胞抽出物を次のよう にして調製する。エシエリヒア・コリ（ｇ　、ｃｉＸｉ）クローンを、２０ｍＩ ２培１！（ＬＢ培養基を含む）中で２８°Ｃで約４時間増殖させ、遠心分離しそ して１ｍＪ２ＴＥＳＩ！衝液中に再懸濁してから、ラボソニック（Ｌａｂｓｏｎ ｉｃ）　１５１０において５０Ｗで２回超音波処理しモして１５ｒｐｍで３０分 間遠心分離す゛る。上澄み液を実験に用いる。このタンパク質のＮ　Ｐ　Ｔ　Ｉ Ｉ特異活性は、３２ｐ−ＡＴＰを用いるカナマイシンの原位置のリン酸化によっ て測定する（　Ｒｅ１ｓｓ　ａｔ　ａｌ、、　Ｇｅｎｅ、　３０．２１７〜２２ ３頁、　１９８４）。この結果は、Ｂｔ８：ＮＰＴＩＩタンパク質が特異Ｎ　Ｐ 　Ｔ　ＩＩ活性を示すことが判明する。エシエリヒア・コリ（ｇ、ｃｏｌｉ）ク ローンに１２・Ｈ・ｔｒｐ　（ｐＢＩＮｌｏ）を、昆虫検定法において機能的毒 性の発現について分析する。エシエリヒア・コリ（Ｌ【１Ｕ、）に水を加えると 、４８時間以内にアエデス・アエグプチ（Ａｅｄｅｓ　７’）幼虫を殺す（第３ 表）ｅ　ｐＢＩＮｌｏを含有しない調節エシエリヒア・コリ（五、ｃｉｕ）　Ｋ 　１２・Ｈｌ・ｔｒｐは効果を有しない。それ故に、Ｂｔ８：ＮＰＴＩＩタンパ ク質は、蚊毒性及びＮＰ　Ｔ　ＩＩ　ｎ素活性のいずれも発現する。

これらの結果に基づいて、ベクター系は、Ｂｔ遺伝子のような異種遺伝子を型組 菌の中へ転移させるために開発されたものである。

実施例６ Ｕすｎ紅差 ａ、　−づ　ベ　− 藍細菌の形質転換用のベクターは、シネチョシスチス（Ｓ　ｎｅ　ｈｏ　５ｔｉ ｓ）　６８０３のＤＮＡ断片に結合した細菌抗生物質耐性遺伝子からなるプラス ミド又は直線状ＤＮＡである。これらのプラスミドは、　「供与体ＤＮＡ分子」 と称し、形質転換実験において供与体ＤＮＡと混合される型組菌は「受容細胞」 と呼んでいる。各供与体分子は、エシエリヒア・コリ（旦、　姐■）ベクターで クローン化したシネチョシスチス（Ｓ　ｎｅｃｈｏｃ　５ｔｉｓ）　６８０３の 断片からなる。このベクターはアンピシリン（Ａｐ）耐性遺伝子を含み（エシエ リヒア・コリ（Ｅ−【０」、）ベクター中における選択用）、これに対してカナ マイシン（Ｋｍ）１性遺伝子（形質転換した型組菌の選択用）は、型組菌ＤＮＡ の中へ挿入されている。

例として、供与体プラスミドｐ　ＫＷ　１１８８　（ＭｃＩｎｔ。

ｓｈ　ｅｔ　ａｌ、）に言及する。これは、エシエリヒア・コリ（Ｌｕ且）　ｐ 　Ｋ　Ｗ　１１５９中でクローン化され且つＴｎ９０３からの挿入Ｋｍ耐性遺伝 子を含むシネチョシスチス（Ｓ　ｎｅｃｈｏ　５ｔｉｓ）　６８０３の染色体Ｄ ＮＡ断片を含有する（第５図）。Ｋｍ耐性遺伝子をシネチョシスチス（社ｎｅｃ ｂｏ　ｓｔ’ｓ）に転移するためのベクターとしてこのｐＫＷ１１８８供与体プ ラスミドを用いると、Ｋ　ｍ　ｇ性藍細菌を１０００個の内で１個以下の頻度で 得ることができる。

シｂシス　ス　Ｓ　ｎｅｃｈｏｃ　ｓｔｌｇ）　タ　゛シネチョシスチス６８０ ３　（Ｒｉｐｐｋａ　ｅｔ　ａｌ、、　１９７９）をアメリカン・タイプ・カル チャー・コレクション（Ａｍｅｒｌ（ａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１ １ｅｃｔｉｏｎ）から得る。ペトロフ蓋ハウザー（Ｐｅｔｒｏｆｆ−Ｈａｕｓｅ ｒ）室中で細胞を計算することで測定すると、光学密度（Ａｙ３ｓ）　１．２は ｍρ当り約１０ｅ個の細胞に対応する。細胞は、加温白色蛍光管からの１５００ ルクスの光量で３４℃でＢＧ−１１培養基（Ｒｉｐｐｋａ　ｅｔ　ａｌ、、　１ ９７９）で増殖させる。液体培養には、５０〜１５０ｍｊ２／ｗｉｎ／１００ｍ Ｉ２培養容積で空気を潅流させる。この空気は、１％Ｃｕ　Ｓ　Ｏａ溶液を通し て泡立てることによって湿らせ、且つ２個のフィルター（ゲルマン（Ｇｅｌｍｉ ｎ）第１２１２３号及び第４２１０号）を１遇させることによって殺菌する。こ れらの条件下において、培養密度を２倍にするのに最低８時間が必要である。固 体培地は、３％デフコ・バクト・アガール（Ｄｉｆｃｏ　Ｂａｃｔｏ　Ａｇａｒ ）の高圧加熱滅菌溶液を等容積の２ＸＢＧ−１１塩と混合することによって調製 する（　Ａ１１ｅｎ、　１９６８）。エシエリヒア・コリ（Ｅ、劇■）　ＨＢ　 １０１　（Ｂｏｌｉｖａｒ及びＢａｃｋｍａｎ、　１９７９）を全てのＤＮＡ構 築に用いる。これはＬＢ培養基で培養され、細胞をＣａＣｌ２２で処理すること によって形質転換のためにｉ！Ｉｌ製する（　Ｍａｎｉａｔｉｓ及びＦｒ１ｔｓ ｃｈ、　１９８２）。形質転換体について選択するため、カナマイシンを２５　 ｕｇ／ｍ１用い、且つアンピシリンを５０　ｕｇ／ｍｌ用いる。

受容細胞を調製するために、シネチョシスチス（ｓｙ！ｊｌＬｉホｕ出且）　６ ８０３の活発な増殖培１（Ａｌ２Ｏ−０，３〜２．０）を新鮮なりＧ−１１培養 基中でＡ７３０＝０．５〜０．１０まで希釈し、Ａｌ２Ｏが０．２〜０．４にな るまで一夜増殖させる。この細胞を室温で遠心分離によって取り込み、Ａ７３０ ＝２．５　（ｍ１２当り２　Ｘ　１０ｓ細胞）でＢＧ−１１培養基に懸濁し、そ して直接形質転換に用いる。細胞を供与体ＤＮＡと混合し、細胞懸濁液を空気で 泡立てない点を除いて標準の増殖条件下にガラス管中でインキュベートする。細 胞とＤＮＡのこの混合物を「形質転換混合物」と称する。１０ｍＭ）−リス塩酸 （］）Ｈ７，５）−０，１００ＭＥＤＴＡ中のＤＮＡを、細胞懸濁液の容量の２ ％よりも少ない容量で加える。少なくとも２時間のインキュベーション後に、形 質転換混合物の０．１ｍＩ２サンプルを、ポリスチレンベトリブレート中の寒天 培養上に載っている膜フイルタ−（ＭＦ　Ｍｅｍｂｒａｎｅ、　０．４５ｕｍ、 　）Ｉｕｃｌｅｐｏｒｅ製、　Ｐｌｅａｓｓａｎｔｏｎ、　ｍＡ）上で広げる。

このプレートを１８〜２０時間インキュベートし、且つフィルターを適当な抗生 物質（ｍβ当りカナマイシン５ｕｇ；ｍρ当りアンピシリンｏ、３ｕｇ）を含む 寒天培養基に移す。

形質転換した細胞のコロニーを４日以内に見ることができる。

実施例７ １、　″　々？　ＢＩＫ１１８８　ノ°　（第６図）組換えプラスミドｐＢＩＫ １１８８を、プラスミドｐＫＷ　１１８８　（Ｍｃｌｎｔｏｓｈ　ｅｔ　ａｌ、 、　１９８５）及びｐＢＩＮｌｏ（実施例５参照）から出発して、次の実験案を 用いて生成する。

１、　ｐＫＷｌ　１８８は、Ｈｉ　ｎ　ｄ　ＩＩＩ及び処理Ｋｌｅｎｏｗで切断 され、そしてＳａｌ　Ｉで切断される二とにより、■遺伝子の一部が切り出され 、且つ±５．７Ｋｂの直線状断片を１個の平滑末端及び１個の付着末端とともに 得る（ＳａＩＩから）。

２、ｐＢＩＮｌｏは、５ＳｐＩ及び５ａｌＩで切断されることにより、λファー ジＰＬプロモーターの後ろに迂１影り主主遺伝子を含む±４．２Ｋｂの直線状断 片を得る。

３、　（１）及び（２）で得た両断片を連結した結果、組換えプラスミドｐＢＩ Ｋ１１８ｇを得る。

エシエリヒア・コリ（Ｅ、ｃｉｕ）　Ｋ　５１　：　連結混合物で形質転換され る細胞は、プラスミドＰ　Ｂ　Ｉ　Ｋ　１１８８を含むクローンについて選択す るために、Ａ　ｐ　１００　ｕｇ／ｍｌ及びＫ　ｍ　５０　Ｂ／ｍｌで選択され るものである。

プラスミドｐＢＩＫ１１８８は、ｐＫＷＩ　１８８　（Ｈｉｎｄｍ部位まで）に 本来存在するＴｎ９０３からの主主遺伝子の５°断片を含む、これはもはや機能 的Ｋｍ”遺伝子ではない、更に、プラスミドｐＢＩＫ１１８ｇは、ＰＬプロモー ターの後ろに１１旦二ム１融合遺伝子と、該融合遺伝子の側面に並ぶシネチョシ スチス（江肚■匹ｕ１江）ＤＮＡ断片と、Ａ　Ｐ　Ｒマーカー遺伝子とを含む。

従って、プラスミドｐＢＩＫ１１８８は、型組菌に作用するプロモーターの後ろ にＢｔ８二Ｕ融合遺伝子を含む（このＰＬプロモーターは藍細菌中で発現を誘導 する）　（Ｆｒｉｅｄｂｅｒｇ及びＳ＠１ｊｆｆｅｒｓ、　Ｍｏ１．　Ｇｅｎ、 　Ｇｅｎｅｔ、　２０３５０５〜５１０頁、　１９８６）、これは、藍細菌中で 遺伝子を転移させ且つ発現させるための供与体プラスミドとして用いることがで きる。

２、：、”　−存　ン　−−− ■ プラスミドｐＢＩＫ１１８８は、シネチョシスチス（Ｓ　ｎｅｃｈｏｃ　５ｔｉ ｓ）の染色体断片の中へＢｔ８：、差遺伝子を転移するための供与体プラスミド として機能することができる。Ｂｔｕ：ム差融合のＫｍｌｌは機能的Ｋｍ”耐性 遺伝子であるので、Ｋｍ”について選択することにより、１工Ｕ融合遺伝子を含 むシネチョシスチス（江■口邸り１江）の形質転換クローンについて選択するこ とになる。

シネチョシスチス（江■ユ刀工旺口）６８０３細胞は供与体プラスミドで形質転 換され、且つ形質転換クローンは５　ｕｇ／ｍｌＫ　ｍを含む培養基で選択され るべきである。数百側の形質転換クローンを１回の実験で得る。ランダムに選択 した２個のクローン、即ちクローン２０及びクローン４３を別個の性格づけのた めに用いる。

３、≦　−た−　２ １、サザーンブロッテイング法により、クローン２０及びクローン４３中の　ｔ ８：　、オ遺伝子の存在を確認する。

型組菌クローン２０及びクローン４３の染色体ＤＮＡを精製し、そしてＢａｍＨ Ｉ及びＥｃｏＲＩ制限酵素で消化させる。消化ＤＮＡのサザーンブロッティング 法により、プローブとして用いたＢｔ８毒素遺伝子の５°末端からの１．８Ｋｂ Ｘｂａｌ断片が、型組菌染色体ＤＮＡの３．４ＫｂＥ　ｃ　ｏ　ＲＩ及び３．６ ＫｂＢａｍＨＩ断片とハイブリットされることが明らかになる。この結果は、Ｂ 　ｔ　８：衣オ融合遺伝子が型組菌クローン２０及びクローン４３の染色体の中 へ組み込まれることを示唆している。

２、クローン２０及びクローン４３中の組換えタンパク質Ｂｔ８：ＮＰＴＩＩの 発現は免疫学的検定法を用いて分析する。ウェスタンブロッティング法により、 実際にこれらのクローンがＢｔ８：ＮＰＴＩＩ融合タンパク質を発現することが 明らかになる。

型組菌クローンの総細胞溶解液を５ＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、タンパク質をニト ロセルロース紙上に移し、そしてウサギ抗Ｂｔ８血清又はウサギ抗Ｎ　Ｐ　Ｔ　 ＩＩ血清のいずれかでプローブする。この結果は、抗Ｂｔ８及び抗ＮＰＴ抗体の どちらとも反応する１１００００Ｄａの見かけ分子量を有する新ポリペプチドの クローンＯ及び４３の存在を示している。このタンパク質は、形質転換していな いシネチョシスチス（Ｓ　ｎｅｃｈｏｃ　５ｔｉｓ）細胞中では検出されない。

従って、クローン２０及び４３はＢｔ８：ＮＰＴＩＩ融合タンパク質を発現する 。

実施例８ １、−　≧’ＢＴ　８８　Ｊ（第７図）ＰＢＴＩ　１１８８を得るために、プラ スミドｐＭＵ３８８からの完全なりｔ８毒素遺伝子を、λＰＬプロモーターの後 ろに配置し、モしてＫｍ？遺伝子（第５図）に次いでｐＫＷ１１８８中でクロー ン化させる。ｐＫＷ１１８８の無傷のＫｍ”遺伝子はなお存在し、且つ形質転換 体をスクリーニングするための選択マーカーとして用いることができる。

１．１　−　−　’　こ餠　ｔ８’−−；Ｌ３８３ １．９ＭＵ３８８は、Ｂ、ａｍＨＩ及び５ａｌＩで切断され、Ｂｔ８遺伝子を含 む２個の付着末端を有する上３゜６Ｋｂの直線状ＤＮＡ断片を得る。

２、ｐＬＫｍ９１は、ＢａｍＨＩ及びＳａｌ　Ｉで切断され、ＰＬプロモーター 及びＡｐ３遺伝子からなる上２゜９Ｋｂの直線状ＤＮＡ断片を得る。

３、　（１）及び（２）で得た断片の連結：速結混合物をエシエリヒア・コリ（ Ｌ　ｃｉｕ）　Ｋ　５１４中で形質転換させ、そして形質転換クローンをＡｐＨ （１００ｕｇ／ｍｌ）について選１、ｐＬ３８３は、Ｈａｅｌｌ（＋Ｓ１処理） 及び５ａｌＩで切断され、ＰＬの後ろにＢｔ８を含む±４Ｋｂの直線状ＤＮＡ断 片を得る。

２、ｐＫＷ１１８Ｂは、ＰｓｔＩ（＋３１処理）及び５ａＩＩで切断され、６． ６Ｋｂの直線状ベクター断片を得る。

３、　（１）及び（２）で得た断片を連結し、そして形質転換エシエリヒア・コ リ（互、　刈■）を１００　ｕｇ／ｍｌのＡｐで選択する。

プラスミドｐＢＴ１１１８８は、ＰＬプロモーターの後ろのＢｔ８遺伝子と、機 能的ネオ遺伝子と、側面に並ぶシネチョシスチス（ｎｅａｔ）の染色体ＤＮＡ配 列と、Ａｐ３マーカー遺伝子とを含む。

２　、　二　目υ　、　ン　−５− ローゝ プ・ラスミド゛ｐＢＴＩ１１８８は、Ｂｔ８をシネチョシスチス６８０３細胞の 中へ転移させるための供与体プラスミドちして使用されている。形質転換６８０ ３クローンは、５　ｕｇ／ｍｌのＫｍを含む培地上で選択する。ＤＮＡ１ｕｇ当 り数百側の形質転換コロニーを得る。

実施例９ 旦、ｉ、誘導の毒素遺伝子を、例えばルビスコオベロン用のシネチョシスチス（ Ｓ　ｎｅｃｈｏｃ　５ｔｉｓ）　６８０３プロモーターのように、政綱菌中で高 い発現を生じる強いプロモーターの後ろに配置する。

１・　し　ベロ゛　’　−ａ”　５ｎｅｈｏｃｓｔｉｓ　６８０３　ロ　−−′ 　二ｌ　−かベ　− アナバエナ（Ａｎａｂａｅｎａ）のルビスコオベロンをクローン化し且つ性格づ けする（　ＰＮＡＳ、牡、　１８３５〜１８３９．１９８３及びＰＮＡＳ、　８ １．５６６１〜５６６５．１９８４）。プローブとしてこの配列の一部を用い、 多分、プロモーター及びルビスコの大サブユニット（Ｌ、Ｓ、）の暗号配列の一 部とからなるＤＮＡ断片は、シネヨシスチス（江■劇ｌユ旺口）からエシエリヒ ア・コリ（Ｅ−、ｃｉｌｉ）中でクローン化させる（第５図）。この±７ＫｂＢ ａｍＨＩ断片から、±９００塩基対Ｈｉ　ｎ　ｃ　ＩＩ　−Ｘ　ｂ　ａ　Ｉ断片 をｐＵＣｌ　９中でサブクローン化し、プラスミドｐｓＦ５．１を発生する（第 ８図）、この断片は、±５５０塩基対の５９上流域配列及び±３５０塩基対のり 、Ｓ、暗号領域を含む。

この断片は、ｐＲＢＣ４と呼ばれる新プラスミド（第９図）を生成させるために 、発現ベクターｐＫＷ１１８８中で組換えする。Ｌ、Ｓ、の暗号配列のすぐ後ろ に、幾つかのクローン化部位を含むリンカ−断片を挿入する。

従って、ｐＲＢＣ４は、ｐＫＷ１１８８に存在する全ての元素と、多分ルビスコ オペロン用のプロモーター配列からなるシネヨシスチス（Ｓ　ｎｅｃｈｏｃ　５ ｔｉｓ）　Ｌ、Ｓ　、遺伝子の５゛上流域配列と、Ｌ、Ｓ、暗号領域の一部と、 クローン化用の適切な制限酵素部位（ＸｂａＩ、ＥｃｏＲＶ、。

５ａｌＩ、ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ）を含むリンカ−断片とを含有する。旦、１ ．遺伝子（Ｂｔ８及び１１１二ｊｆＬ）は、ｐＲＢＣ４のクローン化部位に挿入 されている。

得た組換えプラスミドは、シネチョシスチス（江肚０旦田］）　６８０３を形質 転換するため、及びプロモーター断片の後ろに挿入した旦、ｉ、遺伝子を転移さ せるために用い、該プロモーター断片はこれらの遺伝子の高レベルの発現を誘導 する。

次の菌株は、ドイツ微生物標本能（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ　Ｓａｍｍｌｕｎｇ　ｖａ ｎ　Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｒｖｅｎ）　（Ｄ　Ｓ　Ｍ　）に供託されているニ ブラスミドｐＭＵ３８８を保有するエシエリヒア・コリ（旦、□）Ｋ５１４ プラスミドｐＩＢＭ１０を保有するエシエリヒア・コリ（旦、ｃｉｕ）　Ｋ　１ ２−Ｈ１・ｔ　ｒ　ｐイン・ビトロ・インターナショナル社（Ｉｎ　Ｖｉｔｒｏ 　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、　Ｉｎｃ、、　６１１　Ｈａｍｍｏｎｄｓ　Ｆ ｅｒｒｙ　Ｒｏａｄ、　Ｌｉｎｔｈｉｃｕｍ＜　）Ｉａｒｙｌａｎｄ　２１０９ ０）によってブダペスト条約に基づいて、１９８７年３月４日、ｐＢＩＫ１１８ ８（第６図）ｔ；１ｌＶＩ　１０１２９とＬＴ及びｐＢＴ１１１８８　（第７図 ）はＩＶＩＩＯ１３０として供託されている。

１１文藍二Ｉ 次の文書が本明細書において引用されている。

リー・マツフィントラシュら（Ｌｅｅ　ＭｃＩｎｔｏｓｈ　ａｔ　ａｌ、）著、 植物ゲノムの分子態様及び機能（ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ＦｏｒＩＩ　ａｎ ｄ　Ｆｕｎｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｐｌａｎｔ　Ｇｅｎｏｍｅ）　（Ｐｌｅ ｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　１９８５．３３５〜３４６頁）チ ャナム・アングスサナソンバット（Ｃｈａｎｕｎ　Ａｎｇｓｕｔｈａｎａｓｏｍ ｂｔ）の論文、エシエリヒア・コリ（Ｌ■■）中のバチルス・スリンジエンセス （Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｕｒｉｎ　１ｅｎｓｅｓ変異イスラエレンシス（１ｓ ｒａｅｌｅｎｓｉｓ）の内毒素遺伝子の分子クローン化及び発現（Ｍａｈｉｄｏ ｌυｎ１ｖｅｒｓｉｔｙ、　１９８５゜Ｂａｎｇｋｏｋ、τｈａｉｌａｎｄ） 第４図 Ｈｉｎｄ　ｍ　ｂｔ８：　ネｔ ｐＭ口３８８　ｐＬＫｒｎ９１ 第８図 国際調査報告 ＰＣＴ／ｌＪｓ８８１００７３４ Ａｔｔａｃｎｍｅｎセセｏ　Ｆｏｒｍ　ＰＣＴ＃ＳＡ／２１０；　Ｐａｒｔ　Ｉ 　＆　Ｐａｒｔ　Ｘエエ。

ｐａｒｔ　工：　ＣＬＡＳＳｒＦ工ＣＡＴＩＯＮ　ＯＦ　５ＵＢＪＥＣＴ　ＭＡ ＴＴＥＲ＝ＵＳ　ＣＬ　：　４３５／２５３；　４３５／３２０．４２４／９３ Ｐａｒｔ　Ｉ工：　ＦＸＥＬＤＳ　５ＥＡＲＣＨＥＤ　（ＫＥＹＷＯＲＤＳ　Ｃ ０ＮＴＩＮＵＥＤ）：

Claims (52)

【特許請求の範囲】
1. １．（ａ）藍細菌中でＤＮＡ断片の発現に有効であるプロモーター領域からなる ＤＮＡ断片と、（ｂ）バチルス菌株で産出される駆虫活性タンパク質、該タンパ ク質の駆虫活性の末端切断形態、又は実質的にこれらと配列相同性を有するタン パク質用の暗号である少なくとも１個のＤＮＡ断片と、 からなる藍細菌細胞中で発現可能であるキメラ遺伝子。
2. ２．ＤＮＡ断片（ｂ）が、バチルス・スリンジエンセス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔ ｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｅｓ）又はバチルス・スハエリクス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　 Ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ）によって産出されるタンパク質用の暗号である請求項１ に記載のキメラ遺伝子。
3. ３．ＤＮＡ断片（ｂ）が、バチルス・スリンジエンセス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔ ｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｅｓ）変異イスラエレンシス（ｉｓｒａｅｌｅｎｓｉｓ） によって産出されるタンパク質用の暗号である請求項１に記載のキメラ遺伝子。
4. ４．ＤＮＡ断片（ｂ）が、Ｂｔ８であるタンパク質用の暗号である請求項１に記 載のキメラ遺伝子。
5. ５．ＤＮＡ断片（ｂ）が、第２ｂ図のタンパク質、又は実質的にこれらと配列相 同性を有するタンパク質用の暗号である請求項１に記載のキメラ遺伝子。
6. ６．ＤＮＡ断片（ｂ）が、少なくとも第２ｂ図のタンパク質のＮ末端の７７４ア ミノ酸に対応するタンパク質、又は実質的にこれらと配列相同性を有するタンパ ク質用の暗号である請求項１に記載のキメラ遺伝子。
7. ７．プロモーターがλＰしである請求項１に記載のキメラ遺伝子。
8. ８．プロモーターが藍細菌の染色体プロモーターである請求項１に記載のキメラ 遺伝子。
9. ９．プロモーターが、ルビスコ（ｒｕｂｉｓｃｏ）オペロンの発現に向く配列か らなるＤＮＡ断片である請求項８に記載のキメラ遺伝子。
10. １０．ＤＮＡ断片（ｂ）を、 （ｃ）藍細菌中で発現可能である酵素用の暗号であり且つＤＮＡ断片（ｂ）を発 現する藍細菌の同定を可能にするＤＮＡ断片と融合し、 前記ＤＮＡ断片（ｂ）及び（ｃ）が融合ポリペプチドを暗号化する請求項１に記 載のキメラ遺伝子。
11. １１．ＤＮＡ断片（ｃ）が選択可能なマーカー用の暗号である請求項１０に記載 のキメラ遺伝子。
12. １２．選択可能なマーカーがネオマイシン・ホスホトランスファラーゼ（ｎｅｏ ｍｙｃｉｎ　ｐｈｏｓｐｈｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）である請求項１１に記載 のキメラ遺伝子。
13. １３．ＤＮＡ断片（ｂ）がＢｔ８タンパク質用の暗号である請求項１０に記載の キメラ遺伝子。
14. １４．ＤＮＡ断片（ｂ）が駆虫活性の末端切断Ｂｔ８タンパク質用の暗号である 請求項１０に記載のキメラ遺伝子。
15. １５．請求項１から１４のいずれかに記載の少なくとも１個のキメラ遺伝子から なる雑種プラスミドベクター。
16. １６．（ｉ）藍細菌ゲノムのＤＮＡ断片と同一又は類似である少なくとも１個の ＤＮＡ断片と、（ｉｉ）藍細菌中で発現できる少なくとも１個のキメラ遺伝子で あって、 （ａ）藍細菌中でＤＮＡ断片の発現に有効であるプロモーター領域からなるＤＮ Ａ断片と、 （ｂ）バチルス菌株で産出される駆虫活性タンパク質、該タンパク質の駆虫活性 の未端切断形態、又は実質的にこれらと配列相同性を有するタンパク質用の暗号 である少なくとも１個のＤＮＡ断片とからなる該キメラ遺伝子とからなる雑種プ ラスミドベクター。
17. １７．ＤＮＡ断片（ｂ）が、バチルス・スリンジエンセス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　 ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｅｓ）又はバチルス・スハエリクス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ 　Ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ）によって産出されるタンパク質用の暗号である請求項 １６に記載の雑種プラスミドベクター。
18. １８．ＤＮＡ断片（ｂ）が、バチルス・スリンジエンセス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　 ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｅｓ）変異イスラエレンシス（ｉｓｒａｅｌｅｎｓｉｓ ）によって産出されるタンパク質用の暗号である請求項１６に記載の雑種プラス ミドベクター。
19. １９．ＤＮＡ断片（ｂ）が、Ｂｔ８であるタンパク質用の暗号である請求項１６ に記載の雑種プラスミドベクター。
20. ２０．ＤＮＡ断片（ｂ）が、第２ｂ図のタンパク質、又は実質的にこれらと配列 相同性を有するタンパク質用の暗号である請求項１６に記載の雑種プラスミドベ クター。
21. ２１．ＤＮＡ断片（ｂ）が、少なくとも第２ｂ図のタンパク質のＮ末端の７７４ アミノ酸に対応するタンパク質、又は実質的にこれらと配列相同性を有するタン パク質用の暗号である請求項１６に記載の雑種ブラスミドベクター。
22. ２２．プロモーターがλＰしである請求項１６に記載の雑種プラスミドベクター 。
23. ２３．プロモーターが藍細菌の染色体プロモーターである請求項１６に記載の雑 種プラスミドベクター。
24. ２４．プロモーターが、ルビスコ（ｒｕｂｉｓｃｏ）オベロンの発現に向く配列 からなるＤＮＡ断片である請求項１６に記載の雑種プラスミドベクター。
25. ２５．ＤＮＡ断片（ｂ）を、 （ｃ）藍細菌中で発現可能である酵素用の暗号であり且つＤＮＡ断片（ｂ）を発 現する藍細菌の同定を可能にするＤＮＡ断片と融合し、 前記ＤＮＡ断片（ｂ）及び（ｃ）が融合ポリペプチドを暗号化する請求項１６に 記載の雑種プラスミドベクター。
26. ２６．ＤＮＡ断片（ｃ）が選択可能なマーカーを暗号化する請求項２５に記載の 雑種プラスミドベクター。
27. ２７．選択可能なマーカーがネオマイシン・ホスホトランスファラーゼ（ｎｅｏ ｍｙｃｉｎ　ｐｈｏｓｐｈｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）である請求項２５に記載 の雑種プラスミドベクター。
28. ２８．ＤＮＡ断片（ｂ））がＢｔ８タンパク質用の暗号である請求項２５に記載 の雑種プラスミドベクター。
29. ２９．ＤＮＡ断片（ｂ）が、駆虫活性の末端切断Ｂｔ８タンパク質用の暗号であ る請求項２５に記載の雑種プラスミドベクター。
30. ３０．（ｉ）藍細菌のＤＮＡの染色体断片のうちの少なくとも１個の染色体断片 と、 （ｉｉ）藍細菌中で発現可能である少なくとも１個のキメラ遺伝子であって、 （ａ）藍細菌中でＤＮＡ断片の発現に有効であるプロモーター領域からなるＤＮ Ａ断片と、 （ｂ）バチルス菌株で産出される駆虫活性タンパク質、該タンパク質の駆虫活性 の末端切断形態、又は実質的にこれらと配列相同性を有するタンパク質用の暗号 である少なくとも１個のＤＮＡ断片とからなる該キメラ遺伝子とからなる請求項 １６に記載の雑種プラスミドベクター。
31. ３１．細菌プラスミドの複製間始点からなる請求項３０に記載の雑種プラスミド ベクター。
32. ３２．請求項３１に記載の雑種プラスミドを保有する菌株。
33. ３３．細胞ゲノムを含み、且つ （ａ）藍細菌中でＤＮＡ断片の発現に有効であるプロモーター領域からなるＤＮ Ａ断片と、 （ｂ）バチルス菌株で産出される駆虫活性タンパク質、該タンパク質の駆虫活性 の末端切断形態、又は実質的にこれらと配列相同性を有するタンパク質用の暗号 である少なくとも１個のＤＮＡ断片と、 からなるキメラ遺伝子を発現する藍細菌。
34. ３４．ＤＮＡ断片（ｂ）が、バチルス・スリンジエンセス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　 ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｅｓ）又はバチルス・スハエリクス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ 　Ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ）によって産出されるタンパク質用の暗号である請求項 ３３に記載の藍細菌。
35. ３５．ＤＮＡ断片（ｂ）が、バチルス・スリンジエンセス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　 ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｅｓ）変異イスラエレンシス（ｉｓｒａｅｌｅｎｓｉｓ ）によって産出されるタンパク質用の暗号である請求項３３に記載の藍細菌。
36. ３６．ＤＮＡ断片（ｂ）が、Ｂｔ８であるタンパク質用の暗号である請求項３３ に記載の藍細菌。
37. ３７．ＤＮＡ断片（ｂ）が、第２ｂ図のタンパク質、又は実質的にこれらと配列 相同性を有するタンパク質用の暗号である請求項３３に記載の藍細菌。
38. ３８．ＤＮＡ断片（ｂ）が、少なくとも第２ｂ図のタンパク質のＮ末端の７７４ アミノ酸に対応するタンパク質、又は実質的にこれらと配列相同性を有するタン パク質用の暗号である請求項３３に記載の藍細菌。
39. ３９．プロモーターがλＰＬである請求項３３に記載の藍細菌。
40. ４０．プロモーターが藍細菌の染色体プロモーターである請求項３３に記載の藍 細菌。
41. ４１．プロモーターが、ルビスコ（ｒｕｂｉｓｃｏ）オペロンの発現に向く配列 からなるＤＮＡ断片である請求項４０に記載の藍細菌。
42. ４２．ＤＮＡ断片（ｂ）を、 （ｃ）藍細菌中で発現可能である酵素用の暗号であり且つＤＮＡ断片（ｂ）を発 現する藍細菌の同定を可能にするＤＮＡ断片と融合し、 前記ＤＮＡ断片（ｂ）及び（ｃ）が融合ポリペプチドを暗号化する請求項３３に 記載の藍細菌。
43. ４３．ＤＮＡ断片（ｃ）が選択可能なマーカーを暗号化する請求項４２に記載の 藍細菌。
44. ４４．選択可能なマーカーがネオマイシン・ホスホトランスファラーゼ（ｎｅｏ ｍｙｃｉｎ　ｐｈｏｓｐｈｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）である請求項４２に記載 の藍細菌。
45. ４５．ＤＮＡ断片（ｂ）、Ｂｔ８タンパク質用の暗号である請求項４２に記載の 藍細菌。
46. ４６．ＤＮＡ断片（ｂ）が、駆虫活性の末端切断Ｂｔ８タンパク質用の暗号であ る請求項４２に記載の藍細菌。
47. ４７．アナシスチス（Ａｎａｃｙｓｔｉｓ）及びシネチョシスチス（Ｓｙｎｅｃ ｈｏｃｙｓｔｉｓ）の内から選択されている請求項３３に記載の藍細菌。
48. ４８．シネチョシスチス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）６８０３である請求項 ３３に記載の藍細菌。
49. ４９．形質転換藍細菌及びそれらの子孫の昆虫抑制値を、調節されるべき遺伝子 座に適用することからなる水中の蚊を抑制する方法。
50. ５０．形質転換藍細菌及びそれらの子孫の昆虫抑制値を活性成分として含有する 駆虫組成物。
51. ５１．形質転換藍細菌及びそれらの子孫を担体として含有する駆虫組成物。
52. ５２．ドィツ微生物標本館（ＤＳＭ）に提出されたエシュリヒア・コリ（Ｅ．ｃ ｏｌｉ）Ｋ１２・Ｈ１・ｔｒｐ中に保有されるプラスミドｐ１ＢＮ１０と同じ形 質を有するプラスミド。