JPH01501755A - 合成ｄｎａの構成および大ポリペプチドの合成におけるその使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 合成り　Ｎ　Ａの構成および大ポリペプチドの合成におけるその使用 合衆国政府は、本発明を導くに至った研究に海軍省が提供した援助の成果として 、本発明に関しである種の権利を有する。

関連出ｉ１のクロス・リファレンス 本願は、１９８６年１１月４日に出願された米国特許出願番号第９２７、２５８ 号の部分ａ！続出願である。

本発明は、高分子量重合体、核酸またはその核酸の発現生成物であるペプチドに 関し、特には、構造材料（ｓｔｒｕｃｔａｒｅｄｒａｔｅｒｉａｌ）として使用 される、反復配列を含む高分子量ツプチドの、生化学的方法による製造に関する 。

背景 粗換えＤＮＡ技術は、天然遺伝子の単離、および多様な宿主細胞中におけるこれ ら遺伝子の発現に用いられてきた。通常この技術は、その他の手段では有用な量 を製造できない、インターフェロンまたはペプチドホルモン等の生物学的に活性 なポリペプチドの製造に利用されてきた。また、天然遺伝子の単離、および部位 特異的なｉｎ　ｖｉｔｒｏ突然変異によって、修飾タンパク質を製造することも 可能であり、これらの遺伝子を改変し、ひいては産生ポリペプチドを変化させる ことができる。様々な天然遺伝子の断片を組み合わせることによって創製された ポリペプチドもあり、天然に存在する数種の分子のキメラ分子となる新たなポリ ペプチドが生み出されてきた。

ＤＮＡ化学合成のための、有効かつ自動的な方法の出現によって、全遺伝子を合 成し、そういった合成遺伝子の合成過程で任意に修飾することが可能になった。

これら様々な技術は、天然ポリペプチドの天然型または修飾型の製造に応用され てきたが、実質的に新しいポリペプチドを創製するために、これらの技術を使用 する試みはほとんど行われていなかった。

性質上、ポリペプチドは、広範囲な化学的、物理的、および生理学的特徴を有す る。しかし、天然の既知ポリペプチドでは適当でない商業的用途が存在する。

バイオテクノロジーが利用できるようになったとはいえ、一般にこれは、天然生 成物への適用、および天然分子の修飾に限られてきた。それと対照的に、有機化 学的合成の強みは、安価な炭素物質を、天然分子を包含し、しかし最も重要なこ とには、天然分子とは関係ない定義され且つ予期された化学的特性を有するポリ プロピレンおよびポリアクリレート等の全く新しい構造体を包含する広範囲の種 類のポリマー分子へ変換することができる点である。

そのような物質、特に、アミノ酸の反復配列を含む高分子量重合体は、生化学的 手段による製造が困難であることが証明されている。アミノ酸の繰り返し単位を 含む大ペプチドの産生に必要な遺伝子は、不安定であり、しばしば遺伝子中で反 復単位の欠失の原因となる分子間組換えが生じる。有機合成によって入手できる 重合分子を生物学的方法によって作り出すようなバイオテクノロジーの開発は、 バイオテクノロジーの適用範囲を著しく拡張するであろう。

関連文献の簡単な説明 同方向に４つまで重複したラクトースオペレーターのクローニングが５ａｄｌｅ ｒら、　Ｇｅｎｅ、（１９８０）　８　：　２７９−３００に記載されている。

高度に反復したサテライトＤＮＡを含むハイブリッド紹菌プラスミドがＢｒｕｔ ｌａｇ　ら、Ｃｅ１１．　（１９７７＞１０：５０９−５１９に記載されている 。細菌中でのポリ　（アスパルチル−フェニルアラニン）の合成がＤｏｅｌら、 　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ。

（１９８０）　８　：　４５７５−４５９２に記載されている。プロリン重合体 産生ヲコードするプラスミドのクローニングによってプロリン含有量を増やす方 法がＫａｒ＋ｇａｓら、　Ａｐｐｌｉｅｄ　ａｎｄ　Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａ ｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　（１９８２）　４３　：　６２９−６３５に記載 された。プラスミドのレプリコン内で安定に維持することができる、高度に反復 したＤ　Ｎ　Ａ配列の長さに関する生物学的限界が、ＧｕｐｔａらによってＢｉ ｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　（６０２−６０９ページ、１９８３年９月）に記載 されているー 発明の要約 合成された構造遺伝子の発現による、反復オリゴマー単位を有するポリペプチド の製造のための方法および組成物が提供される。オリゴマーペプチド配列をコー ドする個々の単位は、アミノ酸コドンの冗長性を利用するヌクレオチド配列に関 して多様である。長鎖核酸の配列は、個々の反復単位の多数を発現する核酸オリ ゴマーの合成によって組み立てられ、そしてそれらのオリゴマーは、結合されて 所望の長さのポリヌクレオチドが提供される。ポリペプチド生成物の有意な発現 に先立って対象宿主を高濃度に増殖せしめる発現系が使用され、その後発現系が 誘導され、ポリペプチド生成物が高収量で得られ、それは宿主細胞から単離され 得る。ある態様では、合成遺伝子の転写開始系が宿主のＲＮＡポリメラーゼによ って認識されず、そして誘導性の制御下で機能的ＲＮＡポリメラーゼを発現する 遺伝子が宿主中に含まれるような系が用いられる。

図面の簡単な説明 第１図ニブラスミドｐｓＹ７０１の構造。

第２図＝　（Ａ）β−ラクタマーゼまたは（Ｂ）　ｇｌｙ−ａｌａペプチドに対 する抗体を用いてのポリペプチドのイムノプロット。

第３図ニブラスミドルＧ１０／Ｓｌｐ　Ｉの作成流れ図。

第４図：ポリペプチド生成物のイムノプロット。　（Ａ）抗Ｓｌｐ抗体によるＴ ７ｇｐｌＯ／Ｓｌｐ、（Ｂ）抗Ｓｌｐ抗体によるＴ７ｇｐ９／Ｓｉｐ　、（Ｃ） クマシブルーによる染色。

第５図ニブラスミドＰＳＹ８５６の作成を示す流れ図。

第６図：Ｔ７系によるカナマイシン耐性の遺伝子生成物の蓄積を示すタイムコー ス。

第７図ニブラスミドｐＳＹ８５７の作成を示す流れ図。

第８図ニブラスミドｐｓＹ９８０の作成を示す流れ図。

第９図：　（Ａ）β−ガラクトシダーゼ／Ｓ１ｐｍの遺伝子融合体の生成物を含 むゲルのアミドブラック染色、（Ｂ）抗Ｓｌｐ抗体による同一生成物のイムノプ ロット。

第１０図ニブラスミドｐＳＹ　１２８５の作成を示す流れ図。

好ましい態様の説明 反復する比較的短いアミノ酸単位のポリオリゴマーである新規なポリペプチドが 提供される。これらオリゴマーは、異なったアミノ酸配列のスペーサーによって 連結されることもある。したがって、この新規なポリペプチドは、反復アミノ酸 を含み、エラストマータンパク質を含む磁維タンパク質として特に有用である。

反復単位含有ペプチドをコードする遺伝子は、特に、重複反復単位を含む遺伝子 と以前関連していた間ｊを避けるために構成される。

本発明の遺伝子は、同一のアミノ酸配列単位をコードする複数のＤＮＡ配列の多 量体から成る。ここでは、様々なアミノ酸単位をコードする２つ以上の異なる多 量体が互いに結合してブロック共重合体を形成しする場合がある。個々の単位は 、４ないし３０個のアミノ酸（１２ないし１２０個のヌクレオチド）、より一般 には４ないし２５個のアミノ酸（１２ないし７５個のヌクレオチド）、特には４ ないし８個のアミノ酸を有する。そして、たいてい同一アミノ酸が同一単位内で 少なくとも２回現れ、通常１個以上のアミノ酸によって分離される。同一アミノ 酸配列をコードする多量体の単位は、同一のアミノ酸配列を達成するコドンの冗 長性に基いて、２種類以上のヌクレオチド配列を含むことができる。

はとんどの場合、本発明のＤＮＡ組成物は以下の一般式で表すことができる。

Ｋｋ　（Ｗ）ＪＸｘＮＹｙ）　ｉ　Ｌ　１２式中、 Ｋは、任意の配列でよい約１ないし１００アミノ酸の、一般には１ないし６０ア ミノ酸のアミノ酸配列をコードする各ＤＮＡ配列であって、アミノ酸総数の約２ ０％未満より一般にはアミノ酸総数の１０％未満であって任意の配列であること ができ特に、天然配列であり、ここで多量体の構造遺伝子は読み枠内で他のＤＮ Ａに融合している。Ｋは転写開始メチオニンコドンを有するであろう。

ｋは０または１を示し、 Ｗは、以下の一般式を有する。

［（Ａ）ｎ　（Ｂ）ｐコ　ｑ 式中、 Ａは、配列内に少なくとも２回現われる少なくとも１つのアミノ酸を通常有する 同一のアミノ酸駿列を、それが現われるごとにコードするＤＮＡ配列であって、 前記反復単位中で、一般に約１２ないし９０個のヌクレオチド（ｎｔ）　、より 一般には約１５ないし７５個のヌクレオチドを含む。

通常は少なくとも２つの異なったＡ１一般に１０以下のＡ１より一般に６つ以下 の異なったＡが存在し、これらは前記同一アミノ酸配列をコードするが、少なく とも１残基のヌクレオチドが互いに異なっており、１０個という多くのヌクレオ チドが異なっていてもよいが、一般には他のＡ配列と６残基以上異なることはな い。同一のアミノ酸のために少なくとも２つの異るコドンが、例えばグリシンの ためにＧＧＣ及びＧＧＡが使用され、異るＡが同一のアミノ酸配列をコードする 。

ｎは、少なくとも２、一般に少なくとも約８の整数であって、約２５０以下、一 般に約２００以下、頻繁に約１２５以下の整数でもあり、約５０以下の場合もあ る。

Ｂは、Ａ単位によってコードさ九たアミノ酸配列単位以外のアミノ酸配列をコー ドする、Ａとは相違したＩ）ＮＡ配列であり、Ａ単位のオリゴマー間の連結単位 として機能する。Ｂは、一般に約３ないし４５個のヌクレオチド（１ないし１５ 個のアミノ酸）、より一般には約３ないし３０個のヌクレオチド（工ないし１０ 個のアミノ酸）を有する。

前記遺伝子に現れるＢ単位が同一または異なり、一般に１０を越えるＢ単位は存 在せず、より一般には５以下であり、Ｂ単位は１ないし４５個、より一般には約 １ないし１５個のヌクレオチドにおいて異なり、異なったＢは、同一のまたは異 なったアミノ酸配列をコードすることができる。

ｐは、０または１であって、連続的にＡ単位が存在するごとに異なることができ る。

ｑは、少なくとも１の整数であって、ＡおよびＢのヌクレオチド数、ならびにｎ およびｐの値とともに変わる。変更可能なｑは、構造遺伝子の多量体部分のヌク レオチドの少なくとも９０個、好ましくは少なくとも約１５０個、より好ましく は少なくとも４５０個、そして最も好ましくは少なくとも９００個となるように 選択されよう。そして、ヌクレオチド数は、一般に約１００００を超えず、より 一般には約８０００を超えず、通常は約９００ないし６０００の範囲、なお一般 に約９００ないし５０００の範囲に入ろう。そして、 Ｍは、０ないし１８個のヌクレオチドのＩ）ＮＡヌクレオチド配列であって、一 般にはＡおよび／ま左はＢのアミノ酸に限定されるが、通常はＡおよび／または Ｂのアミノ酸を包含する任意のアミノ酸配列をコードすることができる。

Ｘは、Ｗと同°−の場合も異なる場合もあるが、一般には異なっており、以下の 一般式を有する。

［（Ａ’）ｎ’　（Ｂ’）ｐ’］　ｑ’、式中、 Ａｔ、ｎ’、Ｂ’、ｐ’およびｑｊは、それぞれＡＳｎ。

Ｂ、　ｐおよびｑと同一である場合も異なる場合もあるが、少なくとも１つは異 なり、ここで類似の記号は、それらに対応する記号と同一の定義に入る。

Ｘは、０または１を示す。

Ｎは、Ｍと同一の場合も異なる場合もあるが、Ｍと同じに定義される。

Ｙは、Ｗと同一の場合も異なる塩１合もあるが、一般には異なり、以下の一般式 で表される。

［（Ａ”）ｎ”（Ｂ”）ｐ’］　ｑ２ 式中、 Ａ”、Ｂ２、Ｂ２、ｐおよびｑ２は、それぞれＡｓ　ｎｓ　Ｂｓｐおよびｑと同 一である場合も異なる場合もあるが、少なくとも１つは異なり、そこでの類似の 記号は、それらに対応する記号と同一の定義内に入る。

ｙは、０または１を示す。

ｉは、Ｘおよびｙが０のとき、１ないし１００、一般に１ないし５０、より一般 には１ないし３０、特には１を示す。

Ｘまたはｙが１のとき、ｑ、ｑ’ならびにｑ２の合計は、少なくとも２、一般に 少なくとも５、そして約５０以下、通常は約３０以下となろう。

ヌクレオチドの合計は、少なくとも９０個、一般に少なくとも約１５０個、好ま しくは少なくとも約９００個であろう。また、２０キロ個となることもあるが、 一般に約１２個、より一般には約１０個以下も可能である。

上記ＤＮＡ配列によってコードされるポリペプチドは、以下の一般式を有するで あろう。

Ｋ’　ｋ’　（Ｗ’　Ｍ’　Ｘｘ’　Ｎ″Ｙｙ’＞ｉｌＪ”式中、 Ｗｏは、以下の一般式を有する。

［ＣＤ）ｎ（Ｅ）ｐｌ　ｑ 式中、 Ｄは、Ａによってコードされるアミノ酸配列り、そしてそれ故に１個のアミノ酸 をコードするコドンを定義する３個のヌクレオチドに基づいて数上の制限を有す る。

Ｅは、Ｂによってコードされるアミノ酸配列であり、そしてそれ故にコドンを定 義する３個のヌクレオチドに基づいて数上の制限を有し、各Ｅは、Ｂのコードに 応じて同一のことも異なることもある。そして、Ｋ”　、Ｗ’　、Ｍ’　、Ｘ’ 、Ｎ”　、Ｙ”、およびＬｏは、それぞれに、ＷＳＭ、Ｘ、Ｎ。

およびＹでコードされるアミノ酸配列と同じである。しかし、ＫおよびＬにおい ては、プロテアーゼ処理、臭化シアン処理等のその後のプロセシングによって、 Ｎ末端またはＣ末端の非多量体鎖の部分的なまたは完全な除去が起こる場合があ る。

ｎ％ｐｓ　ｑｓ　ｋｓ　ｉｓおよびｌは、前述と同様に定義される。

同一組成（ア）を持った多量体の反復単位を有する特定の重合体組成は、以下の 一般式（Ｘおよびｙは０）で示される。

Ｋｋ’　［（Ｄ）ｎ　（Ｅ）ｐコ　ｑＬｌ”式中、 記号の定義は、すべて前述の通りであり、そしてこのＤＮＡ配列は、以下の一般 式を有する。

Ｋｋ　［（Ａ）ｎ（Ｂ）ｐｌ　ｑＬ１ 式中、 記号の定義はすべて前述の通り。

２ないし３の多量体ブロックの反復単位を有する共重合体組成物をコードする特 定のＤＮＡ配列は、以下の一般式で示される。

Ｋｋ　（Ｗ”Ｍ”Ｘ″Ｎ’Ｙｙ’）ｉ’Ｌｆ　一式中、 Ｗｏは、以下の一般式を有する多量体である。

［（Ａ’）ｎ’（Ｂ’）ｐ’］　ｑ’ 式中、 Ａ３は、４ないし８、一般に４ないし６個のコドンであり、その他の点ではＡの 定義に従う。

Ｂ３は、約２ないし１２、一般に２ないし１０である。

Ｂ３は、２ないし８、一般に４ないし６個のコドンを示す。

ｐ３は、０または１である。

ｑ３は、約２ないし２５、一般に２ないし２０である。

ＸｏおよびＹｌは、Ｗ”と同じ場合も異なる場合もあり、Ｗ”と同一の定義に従 う。

ＭｏおよびＮｏは、Ｎ”およびＭｏの定義に従う。

ｉ”は、少なくとも２、一般に少なくとも５、そして約７５以下、より一般には 約５０以下、通常は３０以下である。

他の記号に関しては、前述の通りである。

一般に、本発明の組成物は、少なくとも約５　ｋＤａｌ、通常は１０ｋＤａｌ、 好ましくは１５ｋＤａｌの分子量を有し、そして４００ｋＤａｌ又はそれ以上の 分子量を有することができ、通常は３００ｋＤａ１以下、より一般には約２５０ ｋＤａ１以下の分子量を有することが可能である。一般に、その高い方の範囲は 、多量体の組み合わせであって、通常、各多量体の分子量は約１５０ｋＤａｌ未 滴、通常約１００ｋＤａ１未満である。

使用されるヌクレオチド配列は、前記のごとく、反復単位が同一アミノ酸のため に異るコドンを有するように合成されるであろう。通常、反復単位をコードする ヌクレオチド配列の少なくとも約２５％、より普通には少なくとも約４０％、一 般には少なくとも約６０％が同じになるであろうが、しかし約９５％以下、好ま しくは約９０％以下が同じであることが望ましい。初めの構成物が自然な組換え 現象を起こすことが実験的に示される場合、これらの範囲内での大きな多様性が 利用されよう。

特に興味深いのは、反復単位として５ＧＡＧＡＧ　（Ｇ＝ニブリシンＡ＝アラニ ン、Ｓ＝セリン）を有するポリペプチドである。

この反復単位は、天然に存在する絹の繊維タンパク質に見い出され、これは、Ｇ ＡＧＡＧ　（ＳＧＡＧＡＧ）　−５ＧＡＡＧＹ　（Ｙ　＝チロシン）で表される 。本発明においては、反復単位は、そのＮ末端が、反復単位とは異なることのあ るλ４ＧＡＧＡＧ、または一般に少なくとも約３個のアミノ酸、通常少なくとも 約５個のアミノ酸、より通常には１２個のアミノ酸比を有するがしかし２００個 以下、通常は１００個以下のアミノ酸を有する他の配列であるように設計される 。通常、Ｎ末端が異なっているのは、融合タンパク質の発現をもたらすような方 法により、ベクター中へ遺伝子を挿入した結果であろう。産物の望ましい特性を 打ち消さないタンパク質は、いずれも上記のＮ末端を提供することができる。特 に、内因性宿主タンパク質、例えば細菌タンパク質を用いることもできる。タン パク質の選択は、転写開始領域の性質に依存することがある。同様に、Ｃ末端は 、反復配列と異なるアミノ酸配列を有することがある。便利には、１ないし１０ ０個、通常は１ないし２５個のアミノ酸が存在することができ、これは天然に存 在する構造遺伝子によるＣ末端であることもでき、典型的にはやはり融合生成物 の形成から生じる。

絹様タンパク質（Ｓｌｐ）の遺伝子は、上記のように約５ないし２５反復単位、 より通常は約１０〜２０反復単位のオリゴマーの提供によって製造することがで きる。異なる粘着末端を有することによってオリゴマーが連結され、２つ以上の オリゴマー単位、一般に約５０以下のオリゴマー単位、より一般には約３０以下 のオリゴマー単位、なお頻繁に約２５以下のオリゴマー単位を有する重合体を得 ることができる。

絹様タンパク質は、同一または異なった傾向（ｈａｎｄｅ＋ｊｎｅｓｓ）を持つ 交互の多量体を有することにより変化させることができる。例えば、前記に式中 で（Ｂ）ｐは偶数または奇数のアミノ酸となり得る。絹において、グリシンの水 素の配向と、アラニンおよびセリンのメチル基および水酸基の配向が逆になるこ とがある。　（Ｂ）ｐが偶数であれば連続配列を、奇数であれば（Ａ）ｎの交互 の配列を取るであろう。したがって、（Ｂｉｎをコードするアミノ酸の数を変更 することによって異なる特性が得られる。

特に興味深いのは、コイガイ　（Ｂｏ＋ｒｌｂｙｘ　ｍｏｒｉ）の絹の物理特性 および組成を模倣したポリペプチドである。

天然に存在するエラスチンに見い出されることがある、基本反復単位としてのＧ ＶＧＶＰ　（Ｇ＝ニブリシン■＝バリン、Ｐ＝ニブロリンを有するポリペプチド も興味深い。本発明において、Ｎ末端は任意の便利な配列であることができ、そ して所望によりプロテアーゼで全体または部分的に除去することができる。一般 に、対象の主題を有しないＮ末端配列は、約１００分子未満のアミノ酸、より一 般には約６０分子未満のアミノ酸といえよう。

特に興味深いのは、４ないし８分子のアミノ酸の基本反復単位と異なる内部反復 を含むことがある約６ないし２０個のアミノ酸の一般には８ないし１６個のアミ ノ酸の配列によって分離された約６ないし１０単位、好ましくは８革位の基本配 列である。例えば、第二の反復配列は、２回緩り返しのＧＡＧＡＧＳとなり得よ う。基本反復単位の総数は、一般に約１５０ないし３００　、通常１７５ないし ２５０の範囲に入るであろう。Ｃ末端は、ある反復単位もしくはその一部、また は１ないし１００個のアミノ酸、一般には１ないし３０個のアミノ酸の他の配列 で終わることができる。Ｃ末端は、本発明にとって臨界的ではなく、主として便 宜上の選択がなされるであろう。Ｎ末端に関しては、タンパク質分解のために設 計が行われることがある。絹タンパク質の場合のように、本発明のエラスチン様 タンパク質も同様の操作が行われることがある。

特に興味深いのは、エラスチンの特性を模倣しそしてエラストマー特性を与える タンパク質である。

反復単位を含む共重合体は、異なる単位、各多量体中の単位数、それらの間隔、 および多量体の組み合わせ集合体の繰り返し数の適当な選択によって、特性を変 化させるための強力な手段である。このように、−吹型量体の数および配列を変 更することにより、様々な異なった物理的および化学的特性が得られる。

ブロック共重合体の使用例は、組単位とエラスチン単位の組み合わせであり、こ れによって同一の単量体単位を有するだけの重合体と異なる特性を有する生成物 が得られる。

構造遺伝子を調製するには、様々な方法を使用することができる。オリゴマーの 調製のためには、ハイブリダイゼーションの後に適当な末端を有する２重鎮ＤＮ Ａが得られように相補的Ｄ　Ｎ　Ａａが合成される。所望により、単一工程でハ イブリダイゼーション条件に依存してコンカテマ−（ｃｏｎｃａｔｅａ＋ｅｒ） が得られるように、それぞれのオリゴマー単位を同一にすることができる。通常 、以下の実施例で記載されるような、従来のアニーリングおよび連結反応の条件 が用いられる。

所望により、２つの単位の末端がその他の単位と相補的であるが、同一単位の末 端は互いに結合し得ないように２つの異なったオリゴマー単位を調製することも ある。こうして、個々のオリゴマー単位を調製することができ、それらを互いに つないでコンカテマーを作ることができる。この場合、介在する連結配列は、少 なくとも一部は末端によって定義される。構成に依存して、５”末端は転写開始 メチオニンコドンを備えることができ、あるいは、構造遺伝子は、５°末端にユ ニーク配列（場合によっては特異的酵素により開裂され得る）を有するアダプタ ーに連結されることができ、又は、融合生成物を提供するように適切な読みわく 内で通常宿主にとって内因性である遺伝子の部分に挿入されることができる。

アダプター又は切断された遺伝子と構造遺伝子の５°末端との間に適切な相補的 末端をもうけることにより、これらの配列を適切な読みわく内に連結して所望の タンパク質を得るようにすることができる。アダプターまたは融合タンパク質を 用いることで得られる利点は、結合、分泌、他のタンパク質との複合体形成、ア フィニティー精製などの、特定の目的のためのＱＢ的配列を有する二２が挙げら れる。

いったん構造遺伝子を集成した後、クローニングが可能となり、特に配列の長さ に関して望みの遺伝子を有するクローンを単離でき、そして、その遺伝子を取り 出し、そして発現のための配列に連結することが可能となる。

発現構成体には、それぞれ構造遺伝子の５゛末端及び３゜末端に、転写および翻 訳の開始および終止制御領域が含まれるであろう。既述のごとく、これらの領域 は、融合タンパク質を用いることによって創製ことかでき、そこでは、本発明の 構造遺伝子が他の構造遺伝子に、その開始コドンより下流であって且つ開始コド ンと読み枠を合わせて挿入される。あるいは、様々な転写ならびに翻訳開始領域 が発現宿主中で使用する多様な遺伝子から得られ、この結果、本発明の構造遺伝 子の転写ならびに翻訳を得るために、これらの転写および翻訳開始領域を本発明 の構造遺伝子に結合させることができる。多様な終止領域が利用でき、これらは 転写開始領域と同一遺伝子からまたは異なる遺伝子からのものである。多数の構 成体が文献に記載されており、その他の構造遺伝子のために使用されるのと同様 の方法を、本発明の遺伝子に適用することができる。

特に興味深いのは、誘導可能な転写開始領域の使用である。

この方法では、望みの生成物の有意な発現に先立って、宿主株が高濃度で増殖し 得る。誘導可能な転写を起こさせることは、特に、ペプチドが宿主によって分泌 される場合よりも宿主中に保持される場合に有用である。

多数の誘導可能な転写開始領域が存在し、特定の状況下で使用することができる 。その誘導性領域は、β−ガラクトシダーゼ遺伝子を誘導するためのイソプロピ ルチオガラクトシド（ＩＰＴＧ）等ごとき特定の化学物質によって制御すること ができる。その他の誘導性領域には、λ左プロモーター及び若ブ・、ロモーター 、様々なアミノ酸（例えば、ヒスチジンおよびトリプトファン）のポリシストロ ン、温度感受性プロモーター、および制御遺伝子（例えば、ｃｌ　”８５７）が 挙げられる。

有利に利用できる別の系には、転写開始領域の組み合わせ使用がある。望みの遺 伝子の発現を制御するが、しかし内因性ＲＮＡポリメラーゼについて機能性を欠 くため発現宿主中では機能しない、第一の転写開始領域が使用される。続いて、 第一の転写開始領域がそれに対して機能するＲＮＡポリメラーゼの発現を制御す るために誘導性領域のごとき第二の転写開始領域が用いられる。この方法におけ る発現は、外外性ＲＮＡポリメラーゼの発現を調節する制御領域の活性化後にの み起こる。本明細書では、Ｔ７フアージの転写開始領域、特にＴ７フアージの遺 伝子９および１０の転写開始領域を用いてこの系を説明する。

他の系は、栄養の欠如、温度、浸透圧、塩濃度といった環境の変化に基づいて生 育的変化を受ける突然変異体の使用法に依存する。この系の例として、胞子形成 能はないが、胞子形成に関与する生成物の発現を開始させる成分を産生じ得る枯 草菌株が挙げられる。したがって、培地条件を変化させることによって、胞子形 成に関連した転写開始領域が活性化されよう。この状況下で、宿主は、発現を開 始させるに必要な誘導剤、すなわち活性化剤を提供する。

特定の宿主中での遺伝子の転写および翻訳の誘導的制御をもたらすその他の様々 な手法がある。

はとんどの場合、宿主は原核性または真核性の単細胞生物、例えば、細菌、藻類 、真菌、糸状真菌等であろう。宿主の例として、大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）　、枯 草菌（Ｂ、５ｕｂｔｉｌｉｓ）　、Ｂ−ステアロサーモフィルス（Ｂ、　５ｔｅ ａｒｏｔｈｅｒａ＋ｏｐｈｉｉｕｓ）　、Ｓ−セレビシｘ　−（Ｓ、ｃｅｒｅｖ ｉｓｉａｅ）が挙げられる。

・目的遺伝子の発現のための発現８！成体は、単独で又は転写に関与する補助的 遺伝子との組み合として、発現宿主中へ導入させるために適切なベクターに連結 させるのが一般であろう。文献に記載されている他のベクターとともに、多数の ベクターが市販品として入手できる。通常、ベクターは、１つ　“以上のユニー ク制限酵素切断部位、宿主中での染色体外に保持されるための複製糸、および宿 主に対する選択圧を可能にする１つ以上のマーカーを有することを特徴とする。

それらのマーカーは、補完、栄養要求株への原栄養性、殺菌剤、例えばペニシリ ンまたはカナマイシン等の抗生物質に対する耐性を付与し得る。選択圧よりも、 対象の遺伝子を含む特定のコロニーの検出を可能にするマーカー遺伝子が用いら れる場合もある。この状況は、β−ガラクトシダーゼ遺伝子によって例示される 。この場合、着色生成物をもたらす基質が用いられる。

任意の補助的遺伝子を包含する発現構成体は、特に、制限酵素的切断、挿入、お よび連結を用いた既知の手法に従って、発現ベクター内に導入される。

次に、発現構成体は適当な宿主の形質転換に°使用される。

形質転換または接合が用いられる場合、宿主に応じて、全細胞ま、たはプロトプ ラストを使用することができる。リン酸カルシウムで沈嶽させたＤ　Ｎ　Ａまた は非イオン性界面活性剤が、宿主中にプラスミドを導入するために利用できる。

ゲノムへの組込みのために裸のＤＮＡが導入できるので、宿主の形質転換にベク ターを使用する必要のないこきが期待される。しかし、組込みが望ましい場合で も、ベクターを利点するとより多くの利点が得られるので、ベクターの使用が好 まれている。

ベクターの性質に応じて、発現４ａ！＆体は、染色体外因子上に維持されるか、 または宿主中に組込みまれる。組込みが望ましい場合、原核生物及び幾つかの真 核細胞について、宿主の染色体中の配列と相同性のある配列を有することが好ま しい。一般に、この配列は、少なくとも約２００ｂｐ、そして約５０００ｂｐ以 下、通常は約２０００ｂｐ以下である。相同配列の選択は幾分気まぐれであるが 、宿主が栄養要求性突然変異体であって相同性が原栄養性を与えるような補完の ため使用できる。

形質転換体または組換体（ｉｎｔｅｇｒａｎｔ）は、適切な栄養培地中で高濃度 に増殖してから、発現構成体の転写系の性質に従って転写が誘導される。目的の タンパク質が細胞質中に保持される場合、これらの細胞を収穫して溶解し、その タンパク質は、その用途に応じて、クロマトグラフィー、溶媒／溶媒抽出、アフ ィニティークロマトグラフィー等の従来法に従って更に精製することができる。

反復性タンパク質には、様々な使用法が見い出される。

Ｓｌｐタンパク質は、絹の代用品などのように特異なａＸを有する繊維の製造に 使用することができる。コラーゲンタンパク質を製造することができ、このコラ ーゲンはその機能に応じてテロペプチドを含んだり含まなかったりする。アテロ ペプチド゛コラーゲンは、様々な補綴物のためまたは他の用途におけるコラーゲ ン代用品として使用するための有用な構造要素となるように、免疫原性・ン有す るとしてもそれは極めて低くあるべきである。同様に、反復配列を有するケラチ ン等の他のタンパク質も、本発明に従って調製することができる。

その他の有用な反復性タンパク質を、クモの糸および他の反復性結物繊維の配列 に基づいて調製することができる。免疫感作に有用な人工ペプチドも、寄生虫、 細菌、およびウィルス等の病原菌の様々な表面抗原に存在する反復配列に基づい て調製されよう。

実施例Ｉ Ａ、小規模ニブラスミドＤＮＡは、煮沸法またはアルカリ溶解法［Ｍａｎｉａｔ ｉｓら、　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ ｙ、　Ｃｏ１ｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ　（１９ｇ２＞　）によって、１． ５−の培養物から調製された。

Ｂ、大規模ニブラスミド担持株を、適当な抗生物質を添加したＩＩ２のＬｕｒｉ ａ肉汁中で一晩増殖させた。細胞を、５分間１０、０００　Ｘ　Ｇの遠心により 集め、１０−ｆの氷冷ＴＥ（１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＩ　ｐＨ８、ｉ　ｃｎＭ　 ＥＤＴＡ）中に再懸濁した。再び細胞を遠心し、４＠１のＴＥＳ　（ＴＥおよび ２５％ｗ／ｖショａ：）中に再＠濁してから渦動攪拌によりホモジナイズした。

試料を次の段階まで氷上に保存した。リゾチーム（１０■／−の１−）を細胞懸 濁液に添加し、２−の０．５　Ｍ　ＥＤＴＡ　（ｐＨ８）を加える前に５分間イ ンキュベーションした。１０分間のインキュベーションの後、５０−ｆのプロテ イナーゼＫ（４０■／−）を添加した。続いて、１０分間後に１５−’の溶解緩 衝液（０，１％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００，１ｍＭ　ＥＤＴＡ、　５０ｍＭ　Ｔ ｒｉｓ−ＨＣＩ　ｐ）１８）を添加した。１５〜２０分後、細胞溶解液を３５． ０ＯＯＸ　Ｇで９０〜１２０分間遠心した。上清（１９，８−ｆ　）を２０ｇの ＣｓＣ１および臭化エチジウム（１０■／’）　、４００ｐ１の入ったプラスチ ック試験管に移した。溶解後、混合物を２本のポリアロマ−超遠心管に分け、熱 で密封してからベックマンＴｉ６５モーター中で６０．００Ｏｒｐｍにて２４時 間還６した。下方のプラスミドＤＮＡバンドを注射針で管から取り出した。臭化 エチジウムを等量のＮａＣ１飽和イソプロパツールで３回抽出した。２容の８． ０をＤＮＡ溶液に添加し、続いて、ＤＮＡをエタノールで沈澱させた。

２．２本領ＤＮＡの調製 ＪＭ　１０３の培養物を、ＯＤ、。。が約０．２になるまで増殖させ、２−のア リコートに分けた。各アリコートを、Ｍ１３の新しいプラークで感染させ、約６ 時間３７℃で激しく攪拌しながらインキュベーションした。続いて、細胞をペレ ット化して、上滑をその後の感染のために保存した。２本領ファージＤＮＡを、 煮沸法（３Ｊａｎｉａｔｉｓら）によって抽出した。

３、除タンパク処理 ＤＮＡ試料の便利な量（通常、１００ｅＺ〜１０ｄ）に対してフェノール抽出を 行った。Ｄ　Ｎ　Ａ試料を、Ｏ，ＯＩＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　（ｐＨ７、５）　 、ＥＤＴＡで希釈し、Ｈ２Ｏで飽和したフェノールを等量添加した。この試料を 短時間渦動攪拌し、３分間氷上に置いた。小型遠心器で３分間遠心した後、水層 を新しい試験管に取り、再ヒ等量のクロロホルム：イソアミルアルコール（２４ ：１）で抽出した。

４、　エタノール沈澱 希薄暖衝液中のＤＮＡをエタノール沈澱によって濃縮した。

ＤＮＡ試料に１７１０容の３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ７，５）および２〜３容の 冷エタノールを添加した。このＤＮＡを一７０℃で３０分間または一２０℃で一 晩沈澱させ、小型遠心器中で４℃にて１５分間遠心することによってペレット化 した。ペレットを２００ｍの８０％冷エタノールで１回洗い、再び４℃で１０分 間ペレット化した。風乾または凍結乾燥後、ベレットを適当な緩衝液で再懸濁し た。

５、ＤＮＡのフォスファターゼ処理 ＤＮＡのフォスファターゼ処理は、制限酵素消化反応物に１４　（２５Ｕ）のウ シ腸フォスファターゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　！ａｎｎｈｅｉｍ）を直接添加 して３７℃で３０分間インキュベーションを継続することによって実施した。こ のフォスファターゼは、フェノール抽出による除タンパク処理に先立って、６５ ℃にて６０分間不活化した。

６、ＤＮＡポリメラーゼＩによるフィル−イン反応ＤＮＡを、５０ｍ！Ｊ　Ｔｒ ｉｓ−ＨＣＩ（ｐ）１７　、４）　、５０ｄ　ＫＣＩ、５（Ｃ！Ｊ　ＭｇＣｈ、 および４種嫌のデオキシヌクレオチド三すン酸各４００声を含む緩衝液中に再懸 濁した。１０単位のクレノーＤＮＡポリメラーゼ（ＢＲＬ）を添加し、１５分間 室温で反応を進行させた。続いて、このＤＮＡをフェノール抽出し、エタノール 沈澱させた。

７、Ｔ４４ポリヌクレオチドキナーゼ応この反応には以下のものが含まれている 。Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ＢＲＬ）、１５０ｎＨのＤＮＡ、１ｐ！の１ ０×キナーゼ暖衝液［０，７！　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　（ｐＨ７，６）　、０．１ 　ＭｇＣ１，，５０ｍｌＪ　ＤＴＴＩ　、および［コ’Ｐ］　ＡＴＰ　（２００ 〜３００ｎＣｉ）　。これを３７℃で３０分間インキュベーションして、ＤＮＡ をＮＡＣＳカラム＜Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｃｈ　Ｌａｂｓ）を用いて精 製した。

８、制限酵素エンドヌクレアーゼによる消化ＤＮＡは、ｌｘ’ＡＡ″援衝液［１ ０ＸＡＡ緩衝液＝３３０ＣＩＭ　Ｔｒｉｓ−酢酸（ｐ）１７．９）、６６０ｄ酢 酸カリウム、　１０ｈＭ酢酸マグネシウム、５０ｍＭジチオスレイトール（ＤＴ Ｔ）および１■／ｄウシ血清アルブミン（ヌクレアーゼなし）コに溶かした制限 酵素エンドヌクレアーゼ（ＢＲＬ）で消化した。可能なかぎり、ＤＮＡの濃度を ＩＲ／２５ｄ未満に保った。インキュベーションは、Ｂａｌ　Ｉ　、Ｂａｎ　Ｉ 、およびＮａｅＩ　（これらの消化は一晩）を除く制限酵素エンドヌクレアーゼ のほとんどについて３７℃で１〜４時間行った。

９、ＤＮＡの分析用アガロースゲル電気泳動ゲル分析用のＤＮＡ試料に、０．２ 容の負荷暖衝液（５ｘ電気泳動暖衝液、０．０１％ブロモフェノールブルー色素 、５０℃ＭＥＤＴＡ、および５０％プリセロール）を添加した。続いて、１．０ ％（Ｗ／Ｖ）アガロースゲルの入った水平液中電気泳動装置のレーンに負荷した 。電気泳動緩衝液は、ＩＸＴＡＣまたは１／２ＸＴＢＥのどちらかであった。Ｉ ＸＴＡＣは、４０ｎ％ＭＴｒｉｓ−塩基、１０ｍＭ　ＥＤＴＡから成り、酢酸で ｐｉ（’？、　８１：：調節した。１／２ＸＴＢＥは０．０４５Ｍ　Ｔｒｉｓ− 塩基、０．０４５Ｍ硼酸、１　ｔｒ、Ｍ　ＥＰＥＴ　（ｐＨ８＞）である。ゲル は、４０〜５０Ｖで１８時間通電した後、装置から外し、０．５ｄｌ−の臭化エ チジウムで３０分間染色した。ＤＮＡバンドは、長波長のＵＶ照射によって視覚 化した。

１０、分取用アガロースゲル電気泳動 方法と材料は、分析用アガロースゲル電気泳動の場合と同様である。唯一の違い は、低融点のアガロースゲルを用い、精製対象のＤＮＡのサイズに応じて濃度を ０．５〜２．５％の範囲で使用する点であった。ＤＮＡ制限酵素断片は、臭化エ チジウムで視覚化した後、ＬＭＰアガロースゲルから切り出した。

１１、　ＮＡＣ３精製 ＤＮＡを含むゲル断片は、７０℃で５分間融解し、置（１０ｍ１Ｊ　Ｔｒｉｓ− ＨＣＩ（ｐＨ７，５）　、０．２Ｍ　ＮａＣ］）で約５倍に希釈した。このゲル 溶液をＮＡＣＳカラム　（ＢＲＬ）にかけた。カラムを５−の同緩衝液で洗浄し た。結合したＤＮＡは、１０００ｂｐ未滴のＤＮＡ断片についてはＴ　Ｅ　２　 Ｃ１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　（ｐＨ７，５）　、１．０ＮａＣ１）　３００ ｄで、より大きい断片についてはＴＥ　３　［１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−）ＩＣＩ（ ｐＨ７，５）　、２Ｍ　ＮａＣ１］　３００ｍで溶出した。溶出したＤＮＡは、 エタノール沈澱によって濃縮した。

１２−　ＤＮＡ連結反応 ＤＮＡ粘着末端の連結反応は以下のものを使用した。１尾ＤＮＡ、１ｘＡＡ緩衝 液（前記８．参照）　、１　ｍＭ　ＡＴＰ、および２０単位のＴ４０ＮＡリガー ゼ（ＢＲＬ）を最終容量で２０Ｉに調製。ＤＮＡ連結反応は１５℃にて１６〜１ ８時間または室温にて１〜２時間のどちらかで進行させた。平滑末端でのＤＮＡ 連結反応には、ｌａｒ　ＤＮＡ、　２５＋＋＋Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ７， ５）　、５ｍＭ　ＭｇＣ１ｚ、５　ｍＭ　ＤＴＴ、　０．２５ｍＭスペルミジン 、２００　ｍｇ　ＢＳＡ、１１１１Ｍ塩化コバルトへキサミン（ＨＣＣ）　、０ ．５ｍＭ　ＡＴＰ、および４００単位の７４ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ）を含む２ ０１１１の反応溶液を使用した。ＤＮＡ連結反応は、室温で３０分間ないし１時 間進行させた。

細菌の形質転換法 腸菌を接種した。これを、ＯＤ、。。が約０．５になるまで３７℃で振盪培養し た。この培養物を、１０分間氷上に置き、６、０００ｘ　Ｇで１０分間遠心した 。細胞ペレットは、氷冷の０、　Ｉ　Ｍ　ＭｇＣｂ　１００献中に再懸濁し、氷 上に３０〜４０分間静置し、再び遠心した。ペレットを２−の１００ｍＭ　Ｃａ Ｃ１，に再懸濁し、滅菌済試験管に取り、２４時間氷上でインキュベーションし た。その後、コンピテント細胞を小分けし、−７０℃で貯蔵凍結したコンピテン トのアリコートを、氷上で解凍した。

５０１！１の細胞に、０．１ないしＩＫのＤＮＡを加え、混合物を氷上で３０分 間インキュベーションした。この試験管を水槽から取り出して、４２℃の湯槽中 で２分間静置した。Ｌ液体培地（１ｄ）を添加し、形質転換混合物を適温（通常 、３０℃または３７℃）で２時間震盪した。この形質転換混合物の１７１０を、 適当な抗生物質を含むし培地プレートに入れ、必要に応じてＸＧＡＬおよびＩＰ ＴＧを添加した。

３、枯草菌のＤＮＡ形質転換 枯草菌細胞を初期定常状Ｂ（１５分間にｋｌｅｔｔ単位で５％以下の変化）に増 殖せしめた。形質転換は既決（Ａｎａｇｎｏｓｔｏｐｏｕ　１ｏｕｓら、１９８ １）　（参考文献８）に従った。細胞（０，４５−ｆ　）を、１〜１０ｇのＤＮ Ａとともに３７℃で８０分間振盪培養した。その後、適当な抗生物質の入ったＴ ＢＡＢアガープレート上にプレートした。

４、枯草菌からプラスミドＤＮＡ０単離枯草菌からのプラスミドＤＮＡの単離は 、ペレット化した細胞を８−の溶液１［：５０ｄブドウ糖、１０ｍＭ　ＥＤＴＡ 　、　２５ｆｆＩＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ８）　、１０ｍｇ／ａｆリゾチー ム］に再懸濁し、室温で３０分間インキュベーションする点以外、アルカリ溶解 法に類似の方法によって得た。続いて、１６−の溶液２（０，２Ｎ　ＮａＯＨ， １％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ）を添加し、１０分間氷上でインキュベーションした。最 後に、１２−の３Ｍ酢酸カリウム（ｐＨ４，８）を添加し、さらに２０分間氷上 でインキュベーションした。溶解した細胞は、１５分間５ｏｒｖａｌ　ＳＳロー ターにて１５．００Ｏｒｐｍで遠心した。ＤＮＡは、等量のイソプロパツールの 添加により沈澱せしめ、さらに、７．００Ｏｒｐｍで遠心した。ペレットを、５ ｄの１０ｄ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ７，５＞　、１ｍＭ　ＥＤＴＡ　（Ｔ　Ｅ 　）中に再懸濁した。この溶液に、１回のフェノール抽出およびクロロホルム抽 出を実施した。ＤＮＡをエタノールで沈澱させ、３ｄｌのＴＥに再懸濁した。４ ．２ｇのＣｓＣ１゜１０■／−の臭化エチジウム４００ｄ　、およびＴＥの添加 によって容量を５，２ｄに調整した。この溶液を、Ｂｅｃｋｍａｎｑｕｉｃｋｓ ｅａｌ　ｐｏｌｙａｌｌｏｍｅｒ遠心管に移し、Ｂｅｃｋｍａｎ　ｖｔｉ６５０ −ター中において１８時間４５．００Ｏｒｐｍで遠心した。

配列（ＧＡＧＡＧＳ）　、ＧＡＡＧＹの合成ペプチドを、ＫａｇｅｎおよびＧ５ １ｃｋ　（１９７９）のグルタルアルデヒド法を用いてＢＳＡにカップリングし た。カップリングの程度は、痕跡量の放射性ヨウド化合成ペプチドによって追跡 した。完全フロインドアジュバント中濃度１■／ｄのペプチド接合体を用いてＯ Ｂｋにウサギを免疫した。ウサギには、３０日日目フロイントの不完全アジュバ ントに溶かした抗原を再注射し、６０日日目力価を測定した。抗原として合成ペ プチドを用いたマイクロタイターＲＩＡにより陽性の血清を検出した。ｒｌＡｅ ｔｈｏｄｓ　ｏｆＲａｄｉｏｉｃｉｕｎｏａｓｓｙ　Ｊ　、　Ｋａｇｅｎおよび Ｇ１１ｃｋ　（１９７９）、　ＪａｆｆｅおよびＢｅｒｍａｎ　（ｉ４者）、　 Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　ｐ３２８　。

５１ｐＩ！Ｉ配列に相当する５３分子のアミノ酸から成るペプチドを、Ａｐｐｌ ｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓペプチド合成装置テ調製した。分子ｆｆ１３６４ ０を有するこの物質の収量は、約０．５　ｇであった。このペプチドを、血清ア ルブミンにカップリングさせた。この物質は、ウサギでの抗体調製に用いるため 、Ａｎｔｉｔ＋＋ｄｉｅｓ、　Ｉｎｃ。

に送られた。抗血清が得られ１．これは、５１ｐＩおよびＳｌｐｍ配列の合成ペ プチドと反応した。これらの抗血清は、ｇｌｙ　ａｌａ配列を含む融合ペプチド の検出に有用である。

上記の方法に従って、一般式（Ｖ−Ｐ−Ｇ−Ｖ−Ｇ）。を有する抗原が合成され た。これを、キーホールリンベットのヘモシアニンにカップリングさせた。続い て、ＥＬＦペプチドに結合したポリクロナール抗体を上記の通りに調製した。

２、　タンパク質のポリアクリルアミド電気泳動増殖する培養物から得た約１０ ’の大腸菌を１０．０ＯＯｘ　Ｇで５分間遠心してペレット化した。細胞ペレッ トを、１００ないし５００Ｊ＝ｆの２×試料緩衝液［１００ｄ　Ｔｒｉｓ−）Ｉ Ｃ１（ｐ）１６．８）　、４％ＳＤＳ　、１０％β−メルカプトエタノール、６ ０％グリセロールまたはショ糖〕に再懸濁し、Ｔｅｋｒ＋ｅｒ音波破砕装置を用 いて３０分間超音波処理した。試料を約５分間煮沸し、２０ないし１００Ｉの細 胞溶解物をＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動（７，５ないし１６％ｗ／ｖ）に かけた。このゲルは、Ｌａｅｍｍｌｉ　（Ｎａｔｕｒｅ、　２２７：６８０−６ ８５　（１９７０））に従って調製した。

ゲル中のタンパク質を１０％メタノール、７，５％酢酸中の２％クマシブルーで １時間染色し、そして１０％メタノール、７．５％酢酸中で一晩脱色した。

３、ゲル中でのタンパク質のイムノプロットタンパク質の電気泳動の後、ゲルを 挟んでいるガラス板の１枚をポリアクリルアミドゲルからはずした。ゲル表面を トランスファー緩衝液（２５ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、　１９２．＋Ｍグリシン 、２０％メタノール）で湿らせた。ニトロセルロース紙片（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ 、　Ｓ！１１３０７）をトランスファー緩衝液で飽和させ、ゲル上に置いた。フ ィルターとゲルの間の気泡を除いた。ゲルとニトロセルロースフィルターヲ’Ｊ Ｊ　造元特Ｂｈ　（Ｄ　）　ランス７アーユニツト　（Ｂｉｏ　Ｒａｄ）にのせ た。移行は２００ｍＡで３〜４時間行った。続いて、ニトロセルロースフィルタ ーを取り出し、Ａｍｉｄｏ−Ｓｃｈｗａｒｔｚ　（０，０５％アミドブラック、 ４５％脱イオン水、４５％メタノール、１０％！￥酸）で３分間染色した。フィ ルターを室温で少なくとも１０分間“ＢＬＯＴＴＯ”（５％ｗ／ｖ脱脂乾燥乳、 ５０　ｍｌＪ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　ｐＨ７，４，０，９％ｗ／ｖＮａｃ１．０． ２％アジ化ナトリウム）中でインキュベーションした。このフィルターを、０． ５　ｘ　ＢＬＯＴＴＯ（２，５％ｗ　／　ｖ脱脂乾燥乳、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ− ＨＣＩ　ｐＨ７，４，０，９％ｗ　／　ｖ　ＮａＣ１，０，２％アジ化ナトリウ ム）で適当に希釈（１：５０ないし１：５００）した血清中に入れ、室温で約１ ６時間ゆっくりと攪拌した。フィルターをＴＳＡ　（５０ｒ＋；Ｍ　Ｔｒｉｓ− ＨＣｉ　ｐＨ７，４，０，９％ｗ／ｖＮａｃ１．０．２％アジ化ナトリウム）を ５回交換しながら１時間洗浄した。このブ０−）トを、Ｉ　Ｘ　１０　’ｃｐｍ の＋２ｓニープロテインＡを含む０．５　ｘ　ＢＬＯＴＴＯ液１５−中液入５、 室温で２時間ゆっくり攪拌した。フィルターは、ＴＳＡを最低７回交換しながら ２時間洗い、脱イオン水で１回すすぎ、空気乾燥した。このプロットは、サラン ラップで覆って、オートラジオグラフィアミ／Ｕ組成は、Ｈｅｎｒｉｃｋｓｏｎ 　Ｍｅｒｅｄｉｔｈ　（１９８４）のＰＴＣ誘導体Ｌｊｌ”Ａ法によって決定し た。タンパク質試料を、５．７Ｎ定常沸騰ＨＣ，ｆを用い、真空中にて２４時間 １０８℃で加水分解した。ＰＩＴＣによる反応後、アミノ酸誘導体を、）Ｉｅｗ ｌｅｔｔ　Ｐａｃｋａｒｄ１０９０システムおよび５ｕｐｅｌｃ＋　Ｃ１８カラ ム（４，６ｍ；＋＋Ｘ　２５　ｃｚ）が付いた逆相高速液体クロマトグラフィー によって２５４ｎｚで検出した。このとき、移動相として０．１　！　ＮＨ，Ｏ Ａｃ＋ト５０％のアセトニトリルの直線勾配を用いて溶出した。Ｈｅｎｒｉｃｋ ｓｏｎ。

ＲｏＬ、およびＭｅｒｅｄｉｔｈ、　Ｓ、Ｃ，（１９８４）　ｒ逆相高速液体ク ロマトグラフィーによるアミノ酸分析Ｊ　Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１３７ ：６５−７４゜５、アミノ酸配列解析 Ｎ末端のアミノ酸配列は、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ　Ｍｏｄｅｌ　 ４７０Ａ気相タンパク質シークエンサーを使用して、自動化エドマン分解によっ て決定した。ＰＴＨアミノ酸誘導体は、Ｈｅｗ　１ｅｔｔｐａｃｋａｒｄ　１０ ９０システムおよびＡｌｔｅｘ　Ｃ１８カラム　（２１ＪＸ２５に）を用いた逆 相高速液体クロマトグラフィーによって解析した。このときの溶出には、複合勾 配緩衝液系を使用した。

６、ペプチド合成 合成ペプチドは、製造元の提供する標準対称無水化合物を用い、Ａｐｐｌｉｅｄ 　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ　１Ｊｏｄｅｌ　４３０Ａペプチドシンセサイザーの固相 合成によって調製した。各段階のカップリング収率は、５ａｒｉｎら（１９８１ ）のニンヒドリン定量法によって測定した。無水ＨＦを用いて、合成ペプチドを 固相支持体から離脱させ、アミノ酸保護基を除去した（ＳｔｅｗａｒｔおよびＹ ｃＵｎｇ。

１９８４）。粗製ペプチドは、セファデックスＧ５０上でのクロマトグラフィー によって脱塩した。５ａｒｉｎ、　Ｖ、に、、　Ｋｅｎｔ、　Ｓ、Ｂ、）１．。

Ｔａｎ、　Ｊ、Ｐ、　２よび’Ｍａｒｒｉｆｉｅｌｄ、　ＲｏＢ、（１９８ｉ＞ 、　Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ。

２３７：９２７９３６　ｏ　Ｓｔｅｗａｒｔ、　Ｊ］、およびＹｏｕｒ＋ｇ、　 Ｊ、Ｄ、　（ｉ９８４）　。

「固相ペプチド合成法Ｊ　、　Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎ ｙ。

Ｒｃｃｋｆｏｒｄ、　ＩＬ、　ｐｐ　８５−９８゜Ｎ、Ｎ−ジイソブロビフオス フオアミヂド、調節孔ガラス力５１．、およびすべての合成試薬は、Ａｐｐｌｉ ｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ。

Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃ１ｔｙ、　Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａから入手した。

合成オリゴヌクレオチドは、１０倍過剰量の保護フォスフアミシトおよび合成支 持体カラムに結合した１ｕｏｌのヌクレオチドを用い、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏ ｓｙｓｔｅｃ＋ｓ　Ｍｏｄｅ）　３８０Ａ　ＤＮＡシンセサイザーによるトリエ ステル亜リン酸法で調製した。合成に用いられる方法は、シンセサイザーと共に 使用するのが好ましい標準法であって、既知の方法である（Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ ら。

Ｊｏｕｒｎａｌ　Ａｍｅｒ、Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、、　１０３：３１８５−２２１ ９　（１９８１））　ｏ脱保護および支持体からのオリゴマーの離脱は、ＭｃＢ ｒ　ｉｄｏら。

Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔｅｒｓ、　２４：２４５−２４８　（１９８ ３）に記載の標準法に従って実施した。合成の反復収率は、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂ ｉｏｓｙｓｔｅａ；ｓ（１９ｇ４）が推薦する、脱離保護基の光学的濃度測定に よれば、９７．５％を上回っていた。

粗製オリゴヌクレオチド混合物は、１９８４年９月９日のＡｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉ ｏｓｙｓｔｅ：ｓプロトコル（Ｕ、ｓｅｒ　Ｂｕｌｌｅｔｉｎ　Ｎｃ１３）に記 載されたような、調製用ゲル電気泳動によって精製した。アクリルアミドゲルの 濃度は、オリゴマーの長さに応じて１０ないし２０％に変化させた。ｔｆｉｔ製 オリゴマーは、ＵＶ照射によって同定し、ゲルから切り出して、砕浸法（Ｓｍｉ ｔｈ−！ｅｔｉ＋ｏｃｆｓｉｒ＋　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、　６５：３７１−３ ７９　（１９８０））によって抽出した。

２、ＤＮＡの配列決定法 ＤＮＡ配列は、以下の方法によって決定した。目的の領域を含む断片を、Ｍ１３ ｍｐ１８またはＭ１３ｍｐ１９ＯＪａｎｉａｔｉｓら、　１９８２．およびＮｏ ｒｒａｎｄｅｒら、１９８３）の重複クローニング部位にクローン化した。１本 ｆｆ１Ｊ　Ｄ　Ｎ　Ａを調製し、ラベルとして３５Ｓ−デオキシアデノシン−５ ′　（α−チオ）−トリフォスフェート　（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｏｃｌ ｅａｒ）を用いて、プライマー伸長法（Ｓａｎｇｅｒら、　１９７７およびＢｉ ｇｇｉｎら、　１９８３）によって配列決定した。逆転写酵素（ｉｏｉｅｃＬ＋ ｌａｒ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）をプライマーの伸長に用いる場合もあった。この＃ 　Ｚａ：Ｂ；ｕｒｓｋｙら（Ｇｅｎｅ　Ａｎａｌ、Ｔｅｃｈｎ、（１９８５）　 ２：８９−９４）が利用したダイデオキシ：デオキシヌクレオシドトリフオスフ ェート比を採用した。３２ｐまたはｓｓ３でラベルしたデオキシアデノシントリ フオスフェートをこれらの反応に使用した。いくらかＧＣ量の多い配列に見られ る、圧縮アーチファクトは、Ｇ反応からデオキシグアノシントリフオスフェート を除去し、代わりにデオキシイノシントリフオスフェート（Ｐ−Ｌ　Ｂｉｏｃｂ ｅ口ｉｃａ　Ｉｓ）を終濃度３７．５Ｉ！Ｍで使用することによって解決した。

その他の処方では、Ｇ反応におけるグイデオキシＧＴＰ濃度を０．５１とした。

すべての配列は、８Ｍ尿素を含む、６または８％ポリアクリルアミドゲル上で展 開した（Ｓａｒ＋ｇｅｒら、　１９７ｇ）。配列決定に用いられたプライマーは 、Ｐ　Ｌ’　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓより購入シタ。テータノ保存と解析には 、ＤＮＡ５ｔａｒとＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａＩＢｉｃｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ ｓ、　Ｉｎｃ、の両社からのソフトを利用した。

３、　クローン化ＤＮＡのインビトロ変異誘発変異の対象となる配列を含むプラ スミドＤＮＡ　（Ｉｇ）を２つの別個の反応によって消化した。第一の反応では 、目的の領域に隣接する部位で切断する、１つか２つの制限エンドヌクレアーゼ が使用された。第二の反応では、変異の対象となる配列から離れた部位で１カ所 のみを切断する制限エンドヌクレアーゼによって消化した。第一の反応で生じる ＤＮＡ断片を、アガロースゲル電気泳動で分離し、変異対象の配列を欠く大きな 断片を切り出して精製した。第二の反応から得られるＤＮＡ、　第一の反応から 得られる大きなりＮＡ断片、および変異体の配列に含まれる長さ２０〜３０塩基 の合成オリゴデオキシヌクレオチドを、１：１：２５０のモル比で混合した。

混合物は、２５ないし１００ｉ１１の１００ｍＭ　ＮａＣ！、　６．５　ｍＭ　 Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ７，５）中で３分間１００℃にて加熱することによって 変性させた。変性した混合物は、以下のように徐々に温度を下げて再アニーリン グさせた。３７℃３０分間、４℃３０分間、および０℃ｌＯ分間。反応には、０ ．５　ｄデオキシリボヌクレオチドトリフオスフェート、１１１１？Ｊ　ＡＴＰ 、４００単位の７４ＤＮＡリガーゼ、および５単位の大腸Ｗ　Ｄ　Ｎ　Ａポリメ ラーゼ大断片を添加し、１５℃にて１２〜１６時間シンキニベーションした。続 いて、反応混合物を大腸菌中に形質転換し、抗生物質討性コロニーを選択した。

発酵条件 発酵容器は、１５１のＣｈｅｍａｐ　（実働容ｉｌｌ　Ｏｔ２）　テ；ｊｏッｆ 、：、。

培養条件は、温度＝３０℃、ｐ）！＝６．８、ＮａＯＨ２，５Ｍを用いてｐＨ調 節　を行った。上部の圧は０．１　ｂａｒ未満とした。溶存８素は、５０％に調 節した。空気流は、０．５１／ｉ＋ｉｎから２０１ｔ　／ｓｉｎまで変えた。攪 拌速度は、２００ないし１５００ｒｐｍで変化させた。

発酵容−器には、攪拌しながら３０℃で１５時間培地Ａ中で増殖した１０％（Ｖ ／Ｖ）の接種物を接種した。

培地Ｂは発酵培地であった。出発容量は５Ｉ！であった。

ブドウ糖濃度が１％に達した時、ブドウ糖濃度を約１％に保つために発酵容器に 培地Ｂの濃厚液（５Ｘ）を添加した。

培養物がＯＤ、。。＝６０．０に達した時、温度を１０分間で４２℃まで上昇さ せ、続いて、２．５時間で３９℃まで低下させた。

このときの細胞を、遠心して収穫し、処理を行うまで一７０℃で凍結させた。

ＮａＣ１１０ トリプトフアン　１０ 酵母抽出物　５ カナマイシン　５Ｘ１０−” ＮＨ４Ｃｌ　４．５ ＫＨ２ＰＯ，０，７６ Ｍｇ５Ｏａ　・７Ｈｔ０　０．　ｉ８ に、Ｓｏ、　０．０９ ＣａＣ１ｚ　２４Ｘ　１Ｏ−３ ＦｅＳＯ，・７Ｈ，０７，６Ｘ　１０−’Ｔ　Ｅ　Ｏ，５９２ カゼインアミノ酸　２５ 酵母抽出物　５ ブドウ糖　２０ カナマイシン　５Ｘ１０−” 実施例２ ンタンパク質中で最も高頻度に反復するオリゴペプチドをコードする１８ｂｐの ＤＮＡが１ｎｖｉｔｒｏで合成された［１ｕｃａｓ、Ｆ−およびに、Ｍ、　Ｒｕ ｄａｌｌ　（１９８６）　「細胞外繊維タンパク質」：「絹」。

４７５−５５８頁、　Ｃｏｚｐｒｅｈｅｒ＋５ｉｖｅ　８ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ ｙ、　２６巻、３８９Ｍ。

ＦｌｏｒｋｉｎおよびＦ、）Ｉ、５ｔｏｔｚ（編）　Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、　Ａｍ ５ｔｅｒｄａｉ＋　］　、　２本の１本ｆｌ　Ｄ　Ｎ　Ａを合成し次に、生じた 二本鎖セグメントを萌対尾で多量化し、１３までの反復および１３を越える反復 のフンカテマーを生じさせた。我々が研究を行っている５ｉｌｋｌの構造遺伝子 は、オリゴペプチドｇａｇ、ｇｓ　（ｇ＝ニブリシンａ＝アラニン、Ｓ＝セリン ）をコードする１３反復を有しており、この構造遺伝子を「単量体」と呼ぶ。そ して、２゛６反復（Ｓｉｐに２）、３９反復（Ｓ１ｐＩ　−３）　、５２反復（ ＳｉｐＩ　４）　、６５反復（Ｓ１ｐＩ−５）、および７８反復（ＳｌｐＩ−６ ）を含む「２量体、３量体、４量体、５量体、および６量体」の３１ｐ　Ｉを作 製した。各単量体単位の間には、短い介在配列が存在している。集成は、以下の ように描くことができる。

反復Ｄ　Ｎ　Ａ三列　５’−ＧＧＴＧＣＧＧＧＣＧＣＡＧＧＡＡＧＴＣＧＣＣＣ ＧＣＧＴＣＣＴＴＣＡＣＣＡ−５’上記に示した２本の１本２３　Ｄ　Ｎ　Ａ前 記のようにして合成した。これらの鎖は、ゲル電気泳動によって’ｆｌｌ’Ａ分 離し、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いてリン酸化し、−緒に混合してアニ ーリングさせた。その結果、長いコンカラマー中で自然に頭対尾に配向する２本 鎖セグメントが生じた。セグメント間のフォスフオシエステル結合は、Ｔ４ＤＮ Ａリガーゼ；こよって形成した。この反応を、ＤＮＡポリメラーゼエのクレノー 断片を用いて粘着末端をフィルインすることよって終了させた。平滑末端になっ た反復ＤＮＡを、プラスミドベクターｐＵＣ１２［Ｖｅｉｅｒａら、　Ｇｅｒ＋ ｅ　１９：２５９−２６８　（１９８２））の旧ｎｃｎＲＥＮＢ位に連結した。

連結したＤＮＡを、大腸菌ＨＢ　ｉ０１中１こ形質転換し、この形質転換体をア ンピシリンの存在下で増殖する能力によって選択した。見込みがあるクローンの ＤＮＡについて、ＲＥＮ消化およびゲル電気泳動によって大きさおよび配向を解 析した。正しい向きの大きな挿入片を有する分離物のＤＮＡ配列が決定された。

それに続く多量体のために選択された「単量体」クローンは、オリゴペプチド′ ａｇａｇｓｇをコードする１３反復を有し、ｐｓＹ７０８と命名された。

Ｓ］ｐＩ挿入部のＤＮＡ配列、推定されるＳｉｐ　Ｉのアミノ酸配列およびＲＥ Ｎ部位、並びにｐｓＹ７０８のフランキング領域を第２表に示す。

３、発現ベクターｐｓＹ７０１の構成 プラスミドｐＳＰ　６５　（１０ｘ、　Ｂｏｅｈｒｔｎｇｅｒ　）Ｊａｎｎｈｅ ｉａ）を、Ａａｔｍで消化し、エノールで抽出してエタノールで沈澱させた。Ｄ ＮＡを１０１のＨ２Ｏに再懸濁した。このＤ　Ｎ　Ａの１７２を以下の混合物中 でエキソヌクレーゼ■によって消化した。

総容量を２００４とする、ＤＮＡ５■、ＩＯＸエキソヌクレーゼ■緩衝液（６０ ０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＩＣＩ　ｐＨ８，６−６ｍＭ　ＭｇＣｌ２．１０ｍＭβ−メ ルカプトエタノール）、および９単位のエキソヌクレーゼ■。２０ｉＩｌの試料 を、０１．１．２．５．５、および７．５分後に取り、直ちにｔＲＮＡ５ｇおよ びＳ１ヌクレア一ゼ３６単位を含む程衝液（３０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ４，５ ，０，２５Ｍにａｃｌ、ｌ　ｍＭｚｎＳ０４）１００〆で希釈した。インキ二ベ ーションを、３０℃で４５分間行い、１５ｊｄの停止緩衝液［０，５Ｍ　Ｔｒｉ ｓ（ｐＨ９，０）　、１２５ｍＭ　ＥＤＴＡ、　１％ｗ／　ｖ　ＳＤＳ、２００ ｇ　／　ｔｊ　ｔＲＮＡ）で反応を停止させた。この試料を、フェノール抽出し 、エタノールで沈澱させた。再懸濁したＤＮＡを、ＳａＩ！ｌＩ　ＲＥＮで消化 し、１％の低融点アガロースゲル中で電気泳動させた。β−ラクタマーゼ遺伝子 、プラスミド起点、およびβ−ガラクトシダーゼプロモーターを担持するＤＮＡ 断片をゲルから切り出し、６５℃で溶解した。１容のＨ２Ｏを加えた。各試料の ＤＮＡを、アガロースの存在下でＤＮＡ連結反応によって再環化した。この反応 には、融解ゲル８ｉＬ１、Ｄ　Ｎ　Ａ連結反応用緩衝液［１００ａ＋Ｍ　Ｔｒｉ ｓ−ＨＣＩ　（ｐＨ７，５）　、５０ｄ　ＭｇＣ１ｚ、５０ｍＭＤＴＴ　］　２ ｍ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ１０単位が含まれ、１５℃で３時間のインキユベーショ ンを行った。ＪＭ　１０１のコンピテント細胞を連結ＤＮＡで形質転換し、形質 転換体を、アンピシリン（４０χ／−Ｚ）含有のし培地プレート上での増殖によ って選択した。プラスミドＤＮＡは、４つの形質転換体から調製した。このＤＮ ＡをＢａａｉＨＩで消化し、ＤＮＡポリメ°ラーゼ１のクレノー断片を用いて” Ｐ−ｄＧＴＰでラベルし、ＰｖｕＩで消化してから、最小の断片をゲルで精製し た。１つの形質転換体からの断片を、Ｍａｘｉｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔ法によって配 列決定した。

他の３つのプラスミドの断片は、さらにＴａｑ　Ｉで消化し、同一のゲル上で電 気泳動した。配列決定されたプラスミドでは、重複クローニング部位とβ−ラク タマーゼのＮ末ｆｌＡＴＧから上流の位置との間の融合を有していた。その他の ２つのプラスミドのＢａｍＨＩ　−Ｔａｑ　Ｉ断片のサイズは、融合が、β−ラ クタマーゼ遺伝子の重複クローニング部位とβ−ラクタマーゼ遺伝子の４＃ｒ目 のアミノ酸との間で生じていることが示された。変化したβ−ラクタマーゼのＮ 末端領域のＤＮＡおよび対応するアミノ酸配列を、ｐｓＹ７０ｉのＲＥＮ部位の 環状地図と共に以下に示す（第１図参照）。第１図のアミノ酸配列は次のとおり 。

ｍｅｔ−ｔ　ｈ　ｒ−ｍｅ　ｔ　−ｉ　１ｅ−ｔ　ｈ　ｒ−ｐｒ　ｏ−５ｅｒ− １ｅｕ−ｇ　１ｙ−ｃｙｓ−ａ　ｒ　ｇ−ｓｅｒ−ｔ　ｈ　秩@− １ｅｕ−ｇ　１　ｕ−ａｓｐ−ｐｒｏ−ｈ　ｉｓ−ｐｈｅ−ａｒｇ−ｖａ　１− ａ　１　ａ−１ｅｕ−ｉ　１ｅ−ｐｒｏ−ｐｈｅ−ｐｈｅ−ａｌａ−ａ）ａ−ｐ ｈｅ−ｃｙｓ−１ｅｕ−ｐｒｏ−ｖａｌ−ｐｈｅ−ａｌａ−ｈｉｓ　。

４、ｐｓＹ７０８からの「単量体Ｊ　５１ｐＩのｐｓＹ７０１への挿入プラスミ ドｐｓＹ７０ｇを旧ｎｄＩ［Ｉで消化し、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノー断片 を用いて粘着末端をフィルインし、そしてＢａｆｆＩＩ　Ｉで消化した。プラス ミドｐｓＹ７０１は、Ｘｂａ　Ｉを用いて消化し、上記のようにフィルインし、 そしてＢａｆｆ１ＨＩで消化した。

次に、ｐｓＹ７０ｇからのＤＮＡ断片およびｐｓＹ７０１の主配列を低融点アガ ロースゲルによる電気泳動で精製してから、ＮＡＣ３（ＢＲＬ）カラムで精製し た。適切な断片を混合し、連結し、そして大腸菌ＪＭ　１０９中に形質転換した 。形質転換した細胞を、アンピシリン（４０ｍｇ／ｍ）　、ＩＰＴＧ　（５ｘ　 １０−’Ｍ）　ｂよびＸＧＡＬ（２０■／−）を含むしプレート上での増殖によ って選択した。　゛形質転換体のプラスミド含有量を分析し、さらに検討するた めに１つ（ｐＳＹ７５６）を選択した。これは、ＲＥＮ部位のマツピングによっ て決定した場合、単量体Ｓｌｐ　Ｉ　−１配列の挿入部を適切な方向に有してい たからである。ｐＳＹ７５６の全Ｄ　Ｎ　Ａ配列は決定されていないが、挿入部 とベクター間での連結部位は、上流のＸｂａ　Ｉ　、下流のＢａｍ）Ｉ　Ｉにつ いて正確な制限酵素切断配列であることが証明された。

５、ｐＳＹ７５６の５１ｐＩ遺伝子の多量体化プラスミドｐｓＹ７０８をＲＥＮ 　Ｓｃ＋ａ　Ｉで消化し、ポリペプチドａｒｚ　（ａ　ｌａ−ｇ　１ｙ−ａ　１ 　ａ−ｇ　ｌｙ−ｓｅｔ−ｇ　ｌｙ）　＋　ａｔｈｒ−１ｅｕ−ｇ　］　］ｕ− ａｓｐ−ｐｒ（Ｒ＜ＡＧＡＧＳＧ）　、　、ＴＬＥＤＰ）のためのコード配列を 担持するＤＮＡ断片を上記の４に従って精製した。プラスミドｐＳＹ７５６を５ １１ａ工で消化し、除タンパク処理し、そし次にｐｓＹ７０８からの精製された ＤＮＡ断片と連結した。大腸菌Ｊ！Ｊ　１０９の形質転換体を、アンピシリンを 含む培地上で選択した。種々のクローンが、ｐｓＹ７０８クローンのもとの単量 体配列の２単位（２量体ｐＳＹ８８２）、３単位（３量体ｐＳＹ８８３）　、及 び４単位（４量体ｐＳＹ８８４）を含むことが分かった。同様に、５量体および ６量体も構成された。これらペプチドのすべては、遺伝的に安定であって、β− ラクタマーゼとの融合体としてペプチドｇ１ｙ−ａｌａを産生β−ラクタマーゼ との融合タンパク質としてのＳ］ｐＩペプチドの大腸菌細胞中での発現は、イム ノプロット　（ウェスタン）解析によって検出した。抗−ｒＳ　１　ｐＪ抗体は 、合成箱タンパク質に対して産生されたものである。第２図に示すように、この 抗体は、大腸菌のβ−ラクタマーゼに融合した５ｌｐｌの２量体および３Ｍ体と 反応した。５ｌｐｌの挿入８は、この酵素のシグナル配列の第５アミノ酸に続く 。β−ラクタ　゛マーゼ抗体（第２図Ａ）は、プロセシングされていない融合タ ンパク質と同様、この図で主要抗原バンドとして約２８ｋＤの位置に現れるプロ セシングされた成熟酵素をも検出された。

ポリペプチドを含むあらゆるＳｉｐ　Ｉの移動度は極めて小さく、そしてこのタ ンパク質はゲル上に認めるほど大きくない。

抗Ｓａｐ抗体も、これらの融合産物の検出に有効である。

第２図Ｂのレーン２〜５は、β−ラクタマーゼと５１ｐＩの２量体融合を含む異 なるクローン４つを示している。一方、レーン６および７は、３量体融合を含む ２つのクローンのものである。明らかに、３量体の抗原性は、２量体のそれより 著しく強い。以前の実験から、５１ｐＩの単量体だけを含む融合タンパク質は、 抗Ｓｉｐ抗体により全く検出されないことが分かる。３量体ペプチドの抗原性の 増強によって、β−ラクタマーゼシグナルベブチドと融合したことが検出される 。プロセスされた型は、第２図Ｂのレーン６および７において、約３３ｋＤの位 置に見られる。正常にプロセスされたβ−ラクタマーゼ成熟酵素（β−ラクタマ ーゼ抗体と反応）、および３量体Ｓｌｐ　Ｉ　−３とβ−ラクタマーゼのシグナ ルペプチド間の融合に相当するペプチド様子は、シグナル配列内への５ｌｐｌ配 列の挿入にもかかわらずこの酵素の正常なタンパク質分解的プロセシングが大腸 菌で起きることを示唆している。

７、ａ、Ｔ７遺伝子への融合による５ｌｐｌ遺伝子の発現５１ｐＩ配列は、大腸 菌中で、バタテリオファージＴ７の遺伝子９および遺伝子１０との融合タンパク 質としても発現した。この構成を、第３図に模式的に示る。プラスミドｐｓＹ９ １５（４量体５１ｐＩ−４を含む）をＲＥＮ　Ｓａｌ　Ｉによって完全消化しモ してＢａ＋ｎ）ｌ　Ｉによって部分消化した。４量体Ｓｉｐ　Ｉ　−４を含むＤ ＮＡ断片を精製し、そしてＲＥＮＳａｌ　ＩおよびＢａｍ）ｌ　１によって消化 されたプラスミドｐｓＹ１１４　（Ｐｒｏｍｅｇａ　ＢｉｏｔｅｃｈのｐＧ２） 中にクローン化しる。この中間体プラスミドから、５１ｐＩの４量体挿入片をＲ ＥＮＡｃｃ　ＩおよびＥｃｏＲＩによって切り出した。さらに、この断片を、Ｅ ｃｏＲＩおよびＡｓｕ　ＩＩで消化されたｐＳＹ６３３　［：完全なＴ７遺伝子 配列を含有するｐＢＲ３２２：５ｔｕｄｉｅｒらのｐＡＲ４４１，（１９８６） ）中にクローン化した。得られたプラスミド中では、４量体５ｌｐｌが、遺伝子 ９０Ｃ末端近傍において遺伝子９の翻訳読み枠に融合している。ＩＰＴＧ誘導性 β−ガラクトシダーゼプロモーターの転写制御下で染色体に挿入されたＴ７ＲＮ Ａポリメラーゼ遺伝子を含有する大腸菌株０−４８Ｃ５ｔａｄｉｅｒら、　１９ ８６の株ＨＭＳ１７４　（λＤＥ３）］を形質転換するために、このプラスミド が用いられた。この遺伝子の配置では、Ｓｌｐ　Ｉ　−４配列の発現は、ＩＰＴ Ｇ誘導性β−ガラクトシダーゼプロモーターによってそれ自体調節されるＴ７Ｒ ＮＡポリメラーゼの産生に依存している。第４図ＡおよびＢに示されるように、 これらの細胞がＩＰＴＧで誘導されると、遺伝子９／Ｓｉｐ　Ｉ　−４の融合遺 伝子のタンパク質生成物が合成され、合成Ｓｉｐミルペプチドする抗体によって 検出される。融合生成物は、８２ｋＤのサイズを有するかのごとく、ゲル中を移 動する。予期されていたサイズは６５ｋＤであった。この特異な移ｍＦ２は、例 外的なアミノ酸組成（グリシンおよびアラニンに富む）の特徴であって、あらゆ るＳｌｐ含有生成物に見られる。

同様にして、Ｔ７遺伝子１０のタンパク質のプロモーター領域およびＴ７遺伝子 １ｏタンパク質の最初の１３アミノ酸を含むプラスミドｐＳＹ６３ｇ　（Ｓｔａ ｄ　ｉｅｒのｐＡＲ２１１３）を、ＲＥＮＢａｍ）Ｉ　Ｉで消化し、Ｄ　Ｎ　Ａ ポリメラーゼのクレノー断片でフィルインし、そしてＲＥＮ　ＥｃｏＲＩで消化 した。この線状化したプラスミド中に、ｐＳＹ６３３の４量体５１ｐＩ−４を含 有するＡｓｕ　ＩＩ　−ＥｃｏＲＩ断片をクローン化した。この連結反応によっ て、Ｔ７遺伝子１０の１３番目のアミノ酸に続く絹４量体の枠内融合が生じる。

後者の融合生成物は、プロセシングを施さずに紡錘に用いられる。それらは、Ｎ 末端の１３個のアミノ酸が大きなＳｉｐ　Ｉタンパク質のほんの一部にすぎない からである。融合生成物は、大きさが約３０ｋＤであるが、例外的な移動度を有 し、そして５０ｋＤと大いかのごとく移動する。これを第４図Ａに示す。プラス ミドｐＧ９／Ｓｉｐ　Ｉ　−４およびｐＧ１０／Ｓｌｐ　Ｉ　−４は、Ｔ７発現 系とは逆向きにβ−ラクタマーゼ遺伝子中にカナマイシン謝性遺伝子を挿入する ことによって、さらに改良された。したがって、Ｔ７系からいかなる低レベルの 発現も、β−ラクタマーゼ活性の上昇を導かない。そのような活性によって、プ ラスミドの保持を選別するために添加された培地中のアンピシリンが除去された 。アンピシリンが欠乏した場合、プラスミドは培養物中から消失した。カナマイ シン耐性遺伝子はこの問題を回避し、Ｔ７発現系において、特に大規模の培養の ために有意な改良となる。カナマイシン耐性遺伝子（Ｔｎ　９０３起源）は、Ｈ ｉｒ＋ｃＩＩ断片としてプラスミドｐＵｃ４Ｋ（Ｖｅｉｒａ、　Ｊ、＆、ＬＭｅ ｓｓｉｒ＋ｇ、　１９ｇ２．　Ｇｅｎｅ、　１９：ｇ５９−２６８）から分離ｐ ｓＹ９９７を有する大腸菌株０−４８を、ＣｈｅｚａｐまたはＢｒａｕｎの発酵 容器を使用して１０ｆのＬＢ中でＯＤ　（Ｋｌｅｔｔ単位）が３００（３Ｘ１０ ”細胞／−ｆ）となるまで３７℃にて増殖させた。さらに、３．５　ｄのＩＰＴ Ｇを添加して、Ｔ７系を誘導した。

１５０分後、細胞をミリポアフィルタ−ユニット　（Ｐｅｌｌｉｃｏｎカセット システム、フィルターの排除限界分子量１００．０００）を用いて１０倍に濃縮 した。続いて、細胞懸濁液を処理まで一７０℃にて凍結した。

細胞懸濁物を４２℃の水槽中で溶かしてフレンチプレス中で細胞溶解、させた。

溶解物を２５℃で１時間、１２５．０００ｘ　Ｇにて遠心した。透明な上溝をＤ ＮＡアーゼ（２５０−ｗ　／　ｔｄ　）で室温にて１５分間処理した。続いて、 ０．４５７−の滅菌フィルターで濾過した。濾液の容積を測定し、暖やか攪拌し ながら、氷中でインキユベーションした。さらに、２３１■の硫酸アンモニウム を、４５分間で濾液の各１ｔ７に添加した。硫酸アンモニウムの各１０ｇに対し てｌａｆのＮａ０ｉ１を添加し、ｐｏを中和した。連続攪拌して２時間後、混合 物を９．０００Ｘｇで１０分間回転させた。蒸留水を用いて、ペレットを元の濾 液の１／１０に再懸濁した。遠心および再懸濁を３回繰り返した。ペレットを、 蒸留水中に原濾液の１７１０に再＠濁した。各試料について、タンパク質濃度、 アミノ酸組成、およびアミノ酸配列を標準法で測定した。これは、生成物を得る ための幾つかの方法の１つである。この方法によると、純度９０％を上回る５１ ｐＩ−４が得られた。アミノ酸組成では、予想通りほぼ全体的に、ｇｌｙ、　ａ ｌａ、およびＳｅｒが占め、アミノ酸配列のＮ末端は、遺伝子１０リーダーのそ れであった。

プラスミドｐＳＹ５５Ｂ　（Ｓｔｖｄｉｅｒ　らのｐＡＲ１１５１，１９８６） からのＴ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子のコード配列（７７遺伝子１、Ｔ７ヌクレ オチド３１２８〜５８４５）を、クローン化ＤＮＡのインビトロ突然変異によっ て修飾した。我々は、制限酵素エンドヌクレアーゼＮｄｅ　Ｉの認識配列を３１ ７１の位置に挿入した。従来法によって合成されたオリゴデオキシヌクレオチド を用いて、Ｔ７遺伝子１配列を、その天然配列ＴＡＡＡＴＧから修飾配列ＣＡＴ ＡＴＧへと変化させた。

同様に、枯草菌遺伝子ｓｐｏ　ＶＧの上流の調節領域を、プラスミドｐＣＢ　１ ２９１　［Ｒｏｓｅｎｂｌｕｍら、Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、１４８：３ ４１−３４５（１９８１＞　）から得、８５位におけるｉｎ　ｖｉｔｒｏ突然変 異によって修飾しく　Ｊｏｈｎｓｏｎら、　Ｎａｔｕｒｅ、　３０２＝８００− ８０４（１９８３））、それがＮｄｅ　Ｉ切断部位をも含むようにした。次に、 ｓｐａ　ＶＧ遺伝子の上流制御配列を、これらの新たなＮｄｅ　Ｉ切断部位を介 してＴ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子のコード配列で連結した。大腸菌Ｈａ　１０ １の形質転換の後、各アンピシリン耐性単離体のプラスミド含有を制限酵素地図 によって調べた。正しい構成物をｐＳＹ６４９と命名した。

ｓｐｏ　ＶＧ　：　Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ融合遺伝子を含有するプラスミドＤ ＮＡ　（ｐＳＹ６４９）を、枯草菌中で機能するクロラムフェニコール耐性遺伝 子を含むように更に修飾した。初めに、プラスミドｐＧＲ７１−ｐ　４３　［Ｇ ｏｌｄｆａｒｂら、　Ｎａｔｕｒｅ、　２９３：３０９−３１１（１９８１）］ から約１２００塩基対のＮｄｅ　ｌ−５ａｌ　！断片を分離した。

この断片は、枯草菌のｐ４３プロモーター、およびＴｍ９からの隣接スるクロラ ムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子を担持する。クレノーＤＮＡ ポリメラーゼ反応を用いてすべての粘着末端をフィルインした後、この断片を、 ｐＵｃ　１３　［Ｖｅｉｅｒａら、　Ｇｅｎｅ、　１９：２５９−２６８　（１ ９８２）　）の重複クローニング部位中のＸｂａ　Ｉ部位に挿入した。アンピシ リンおよびクロラムフェニコール耐性の形質転体をその後の利用に備えて選択し た。正しいプラスミド構成をｐｓＹ６３０と命名された。

ｐ　４３フロモー　ター配列に融合したクロラムフェニコールアセチルトランス フェラーゼ遺伝子を含むプラスミドｐｓＹ６３０からのＳｍａ　Ｉ　＝Ｈｉｎｃ ＩＩエンドヌクレアーゼ切断断片をゲルで精製し、最初に７４ＤＮＡポリメラー ゼで処理したプラスミドｐＳＹ６４９のＰｖｕ　１部位に平滑末端連結した。生 じたプラスミドｐＳＹ８５６を枯草菌１１６８中に形質転換した。プラスミドｐ ＳＹ８５６は枯草菌中で自律的に複製し得ないので、クロラムフェニコール耐性 の安定な形質転体は、大腸菌染色体へのプラスミドの組込みから生じるにちがい ない［Ｆｅｒｒａｒｉら、　Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ。

１５４：１５１３−１５１５（１９８３）　］。組込み現象は、相同的組換えに よって４延進され、細菌染色体のｓｐａ　ＶＧまたはｐ４３部位で生じる可能性 が最も高い［ｐＳＹ８５６は、これら２つの部位においてのみ枯草菌染色体に相 同なりＮＡ配列を含む）。選択マーカーの安定性を決定するため、生じたｒＢＩ ＰＤＬ　Ｊ株をクロラムフェニコールの存在下及び非存在下の両方で増殖させた 。Ｔ４ポリメラーゼの発現が得られ、これはこの株の増殖及び生存に影響を与え ないようであった。

抗生物質カナマイシンに対する耐性をコードする遺伝子を含むスタフィロコッカ ス−アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ）のプラスミドｐ Ｕ８１１０　（Ｌａｎｃｅｙら、　ＪｏＭｅｄ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ。

７：２８５−２９７．１９７４）を、ＢＩＰｏＬ株の増殖制御されル５ｐｏＶＧ ：Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子の発現を調べるために用いた。ファージＴ７Ｄ ＮＡのＥｃｏＲＩ　−ＢａｍＨＩ断片（Ｔ７遺伝子のプロモーター配列を含む２ １．４０２〜２２．８５８位）を、プラスミドｐＡＲ４４１から精製した（Ｓｔ ｕｄｉｅｒら、　１９８６）　。このＤＮＡ断片を、ＥｃｏＲ工及びＢａｍＨＩ の側限酵素エンドヌクレアーゼ部位間でｐＵＢｌｌｏに連結した。生じたプラス ミドｐＳＹ９５２は、カナマイシン耐性遺伝子と同じ方向にＴ７特異的プロモー ターを含んでいる。

プラスミドｐＳＹ９５２を、枯草画工１６８およびＢＩＰＯＬ中に形質転換した 。そして、これらの株を、プラスミド由来のカナマイシン甜性遺伝子によりコー ドされたポリペプチドの発現レベルについて解析した。１１６８、ｐＵＢｌｌｏ を含むＩ　１６８　、ｐＳＹ９５２を含む１１６８、ＢＩＰｏＬ、ｐｉ！Ｂ１ｌ ０を含むＢＩＰＯＬ、およびｐＳＹ９５２を含む旧ＰｏＬの増殖培養物からの約 １０３の細胞を、増殖および胞子形成サイクルの間で複数の時点で得た。これら の紐胞試料中のタンパク質を処理し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって 解析した。

ｓｐｏ　ＶＧプロモーターからの転写速度が細胞密度の関数として増加し、そし て初期の胞子形成期間中で最大に達するので、標的タンパク質の加速的蓄積が、 ＰＳＹ９５２を含むＢＩＰｏｉ、、株で培養物が胞子形成を起こす時期において 期待される。その結果によれば、培養物が定常状態に接近してそれに入ると、分 子ｆｔ３４ｋＤのタンパク質が大いに増加することが示される。このタンパク質 のサイズは、ｐＳＹ９５２でコードされるカナマイシン耐性遺伝子生成物Ｃ３ａ ｄａｉｅら、　Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｏｇｙ、　１４１：１１７ｇ１１ｇ２ 　（１９８０）　）の予想サイズと一致する。このタンパク質は、ｓｐｏ　ＶＧ により制御されるＴ　７　ＲＮ　Ａポリメラーゼ遺伝子を欠＜　ｐＳＹ９５２を 含む１１６８もしくはＢＩＰＯＬ中、またはＴ７プロモーター配列を欠＜　ｐ［ ｌＢ１１０を含むＢＩＰＯＬ中には見い出されない。ｐＳＹ９５２を含むＢＩＰ ＱＬにおける増殖の２４時間後での標的タンパク質の最大蓄積レベルは、デンシ トメトリーでの測定によると、細胞タンパク質の２０％であった。

９、ｂ、枯草菌中でのＳｌｐ　Ｉ　−４の発現プラスミドｐＧＬＯ３１ｐ　Ｉを 、ＥｃｏＲＩ　ＲＥ　Ｎで消化した。クレノーＤＮＡポリメラーゼ反応を用いて 粘着末端をフィルインした後、このＤＮＡをＢｇＩＩ［によって消化した。プラ スミドｐＳＹ６６２を、Ｓｏａ　ＩおよびＢａｎ＋ＨＩ　ＲＥＮで消化した。続 いて、２つのブスラミドを、低融点温度のアガロースゲルを通す電気泳動によっ てｆｉ製し、そしてＮＡＣ３（Ｂｉ’ｉＬ）カラムで精製した。

ｐＧｌｏｓｌｐ　ＩのＤＮＡ断片をｐＳＹ６６２の分子鎖に連結し、アンピシリ ン（４０ｚｒ／−Ｚ）中で大腸菌に形質転換した。形質転換体を、プラスミド含 有について解析し、１つ（ｐＳＹ６６２／　Ｇ　１０／５１ｐＩ−４）を、なお の試験のために選択した。

枯草菌ＢｒＰｏＬのコンピテント細胞を、ｐＳＹ６６２／　Ｇ　１０／　Ｓｉｐ 　Ｉ。

−４を用いて形質転換し、９０分間振盪しながら３７℃でインキュベーションし た。続いて、この形質転換混合物を、１０ｎ／−のテトラサイクリンを含む新鮮 なＬＢで１：１００に希釈し、振盪しながら３７℃でインキュベーションした。

試料をとり、同数の細胞を溶解し、５ＤＳ−ＰＡＧＥの分離用ゲルにかけた。遺 伝子１０／Ｓｌｐ　Ｉ　−４融合タンパク質の合成を検出するために、抗Ｓｌｐ 抗体を用いてイノプロット分析を実施した。枯草菌中での５１ｐＩ−４ポリペプ チドの発現は、細胞タンパク質をポリアクリルアミドゲルからニトロセルロース フィルターへのトランスファー後、抗Ｓｌｐ抗体との血清反応性（ｓｅｒｏｒｅ ａｃｔ　ｉｖ　１ｔｙ）によって検出した。ＣＮＢｒでの細胞の徹底釣処理によ り、血清反応性タンパク質が５１ｐＩ−４遺伝子の生成物であることを、我々は 証明した。これはメチオニン残基の後を切断するが、５１ｐＩ−４はメチオニン を欠いているので、それは完全な状態のままである。ＣＮＢｒ処理によって、ク マシブルー色素で染色可能なタンパク質の９８％以上が除去さた。メチオニンを 欠くタンパク質で予期されるように、５１ｐＩ−４は完全な状態であって、なお 抗−３ｉｐ血清と反応する。

実施例３ Ｓ１ｐＩＩＴ遺伝子の集成および発現 １、　５１ｐＩＩＩ遺伝子の集成スキームの概要合成５１ｐＩｉｌ？造伝子は、 Ｓｉｐ　Ｉ遺伝子のクンバク質に、およびカイコガ（Ｂｏｍｕｙｘ　ｒｂＯｒｉ ）がつくる絹のフィブロインタンパク質の結晶領域に類似するタンパク質をコー ドする。Ｓｌｐ■は、規則的な間隔（約５０残基）を置いてアミノ酸のチロシン を含むため、絹フイブロインタンパク質と一層類似している。これは、５１ｐＩ の多量体には見られない。Ｓｉｐｍｍ伝６０ｂｐのＤＮＡの３つの２本領セクシ ョンが化学合成された。

各セクションは、バクテリオファージＭ１３への挿入によってクローニングされ 、そしてＤＮＡ配列が確認された。続いて、これらのセクションはベクターから 取り出され、特定の順番で互いに連結された。この約１８０　ｂ、ｐの連結物は 、Ｓｌｐｍ　ｒ単量体」と呼ばれる。次に、「単量体」は特定の順番で連結され 、Ｓ］ｐＩＩＩの２量体、３量体、４量体等が生得られた。次に、多量体は、５ １ｐＩＩＩタンパク賃を検出するために直接プラスミド発現ベクターにクローニ ングされ、又はまずアダプタープラスミドにクローニングされた。５ＩＰＩＩＩ 　ＤＮＡのアダプターへの挿入は、一層の遺伝子操作を可能にするが、これにつ いては後に記述する。集成のスキームは、以下のように描かれる。

２末鎖Ｄ　Ｎ　Ａセクションの合成。

セクション２　５・・山・・・曲・・・５１１．１，１２１．１１１１．。

セクション３□５ 「単量体」の粂ｆ２　叩　１　２　３＝３ＤＮＡおよび、Ｓ　１　ｐ　＊　＆壬 子の３つのセクションの対Ｓするアミノ酸配列を第３表に示す。

２重鎮ＤＮＡ配列が５°から３”方向で示される。この配列によりコードされる アミノ酸（ｇ＝ニブリシンａ＝アラニン、ｓ＝セリン、ｙ＝チロシン）は、各セ クションのすぐ下に示す。制限エンドヌクレアーゼによる切断のための認識配列 は、各セクションの上に示す。

上記６本の１本ｍＤＮＡを合成した。合成の後、ＤＮＡ鎮を精製し、相同性のあ る鎖をアニーリングした。各釦の約１ｄ　Ｃ０，５ｔａｒ）を、２Ｉの１０ｘＡ Ａ（記載）緩衝液および１６ｄの滅菌脱イオン水と、１．５−のポリプロピレン 製Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ管中で混合した。この管を沸騰水槽（ＩＩ！のビーカーに ５００−の水）に１０分間入れ、その後、このビーカーをホットプレートから外 し、実験台で室温まで冷却した。これには約１〜２時間を要した。

３本の２本領セクションを別々にＭ１３ｍｐ１８中にクローニングした。セクシ ョン１を、多重クローニング部位のうちＳｍａｌおよびＢａｍ）ｌ　Ｉの制限酵 素切断部位間で連結した。セクション２は、ＢａｍＨＩとＰｓｔ　Ｉ制限酵素切 断部位間で連結した。そして、セクション３は、Ｐｓｔ　ＩとＨｉｎｄｍ制限酵 素制限酵素切断部語間た。各クローンは、Ｍ１３ｍｐ１８．１、Ｍ１３ｍｐ１８ ．２、Ｍ１３ＩＩｌｐ１８．３である。各クローン化セクションのＤＮＡ配列を 決定した。正しいＤＮＡ配列を有する各セクションの代表１つを回収し、次の段 階、すなわち「単量体」の集成における材料とした。

３、　３１ｐＩＩ［の「単量体」の集成りＮＡセクション２および３を、制限酵 素を用いたＭ１３クローンの消化によって分離した。すなわち、セクション２で は、Ｍ１３０１９１８．２をＢａｍＨＩとＰｓｔ　Ｉとで消化した。セクション ３では、Ｍ１３ｍｐ１８．３をＰｓｔ　ＩとＨｉｎｄＩ［Ｉとで消化した。２つ のセクションを精製し、これらと最初にＢａｍＨＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化した Ｍ１３ｍｐ１８．１を等モル量混合した。Ｔ、　ＤＮＡリガーゼを添加して、相 同性のあるオーバーラツプする末端を１−２−３の順で連結した。粘着末端のハ イブリダイゼーション特異性のため、３つのセクションはこの順でのみ効果的に 連結する。

Ｍ１３ｍｐ１８．１．２．３と命名される集成体中のクローン化「単量体」のＤ ＮＡ配列は正しいと判明し、上記２で示された。

４、　５１ｐｎＩの「単量体」の多量体化大量の「単量体」構造遺伝子を調製す るため、最初にこの「単量体」をプラスミドベクターｐｕｃ　１２中にサブクロ ーニングした。Ｍ１３０１Ｐ１８．１．２．３をＥｃｏＲＩおよび旧ｎｄＩｎ制 限酵素で消化した。５１ｐＩＩ［ｒ単量体」をゲルで精製し、そしてＥＣＯＲＩ 及ｕＨｉｎｄＩＩＩで消化されたｐｕｃ　１２に連結した。生ずるプラスミドＤ ＮＡが調製され、「単量体」がＢａｎ　Ｉ　ＲＥＮでの消化によってベクターか ら遊離し、断片をゲル精製した。

多量体を創製するために、Ｂａｎ　Ｉ末端を有する「単量体」ＤＮＡをリガーゼ 反応により連結した。非パリンドローム末端のＢａｎ　Ｉ認識配列は、頭対尾連 結のみを可能にする。多量体化の程度は、ゲル電気泳動および臭化エチジウムを 用いたＤＮＡの染色によってモニターした。

５、Ｓｌｐｍの多量体のクローニング プラスミドｐＣＱＶ２　（Ｑｕｅｅｎら、　Ｊ、ＡｐｐｌｌＭｏｌ、Ｇｅｎ、、 　２：１−１０（１９８３））をＥｃｏＰ、ＩおよびＢａｍＨＩ制限酵素で消化 し、約９００ｂｐの断片を精製した。このＤＮＡ断片は、バタテリオファージλ ｃ　ｌ−８５７レプレツサー遺伝子、右方向のプロモーターＰ８、およびｃｒｏ 遺伝子を含んでいる。プラスミドｐＳＹ３３５（Ｆｅｒｒａｒｉら、　Ｊ、Ｂａ ｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、　１６１：５５６−５６２（１９８５）中ではｐＪＦ７ ５１と記載〕を制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＢａａ）Ｉ　Ｉで消化しミ続いて、ｐ ＣＱＶ２の約９００ｂｐのＤＮＡ断片に連結した。この構成によって得られたプ ラスミドＰＳＹ７５１は、３７℃および４２℃でβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を 発現するが、３０℃では発現しない（第８図）。

この方法では、最初に５１ｐＩ［ｆ遺伝子を、中間体プラスミド中の「アダプタ ー」配列にクローン化し、続いて発現系にサブクローン化する。このアダプター 配列は、以下の有用な特徴を有している。すなわち、中心部の１つのユニークＢ ａｎ　Ｉ制限酵素部位、Ｂａｎ　Ｉのいずれかの側にある３つのユニーク制限酵 素部位、アミノ酸メチオニン、アスパラギン酸−プロリンまたはアルギニンにお いてタンパク質分解をコードする情報および小サイズ。Ｂａｎ　Ｉ部位は、Ｂａ ｎ　Ｉ末端を有するＳｌｐｍ多量体のための挿入点である。

アダプターは、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　３８０Ａ　５ｙｎｔｈ ｅｓｉｚｅｒで合成され、Ｍ１３ｍｐ１ｇにクローン化され、そしてＤＮＡ配列 がＲ認された。続いて、アダプターは、Ｂａｎ　Ｉ　ＲＥＮ部位を欠く特に構成 されたプラスミドベクターにサブクローン化された。

この受容体プラスミドを以下のように調製した。プラスミドｐＪＨ１０１（Ｆｅ ｒｒａｒ　ｉら、　１９８３）を、制限酵素ＡｈａＩＩ［で部分消化し、そして 再連結した。大腸菌ＨＢ　１０１の形質転換体を、クロラムフェニコール（１１ ５■／−）を含む培地中で選択した。幾つの単離体の制限酵素切断解析をした後 ：、１つのプラスミドｐＳＹ３２５を選択した（第７図）。このプラスミドには 、クロラムフェニコール耐性遺伝子およびｐＪＨｌｏｌの複製起点（ｐ　Ｂ　Ｒ ３２２から）のみが含まれた。Ｘｈｏ　ＩＩによる完全消化の後、ｐＳＹ３２５ をゲルで精製したアダプターと連結した。結果として、アダプター−プラスミド ｐＳＹ９３７が得られ、この新しい制限酵素部位が実証された。

５１ｐＩＩＩ多量体をｐＳＹ９３７のＢａｎ　１部位にクローン化した（第７図 ）。陽性クローンをコロニーハイブリダイゼーションによって同定し、ハイブリ ダイゼーション用ＤＮＡプローブとして５１ｐＩＩＩのセクション１の短鎖を用 いた（第２表に示したプローブの配列）。陽性クローンをゲル電気泳動による挿 入多量体のサイズで特徴付けた。最後に、５１ｐＩ配列を、フランキングアダプ ター領域中の制限酵素部位を用いて、発現プラスミドの特異的位置にサブクロー ニングした。

５１ｐＩＩＩタンパク質は、以下のアミノ酸組成を有する。

ｓｌｐｍ　１１７８　ＡＡ　Ｍｉｌｌ　８３．０００（ｆｍ）　ＤＰＶＶＬＱＲ ＲＤＷＥＮＰＧＶＴＱＬＮＲＬＡＡＨＰＰＦＡＳＤｌ”！ＧＡＧＳ　（ＧＡＧＡ ＧＳ）　、ＧＡＡＧＹ［（ＧＡＧＡＧＳ）、ＧＡＡＧＹコ　、。

ＧＡＧＡＧＳＧＡＧＡＧＳＧＡＧＡＭ叶ＧＲＹＱＬＳＡＧＲＹＨＹＯＬＶＷＣＱ Ｋ（ｆｍ）は、転写開始コドン。

５ｌｐ１発現ベクター プラスミドＤＮＡのｐｓＹ１０８６は、５１ｐＩＩＩの１９反復配列＜３．５　 ｋｂ）を含むＪ）ＳＹ９３７の誘導体である。このプラスミドＤＮＡを、Ｎｒｕ 　ＩおよびＰｖｕ　ＩＩで消化し、断片をアガロースゲル電気泳動で分離した。

続いて、この精製５１ｐＩ［Ｉ多量体を、ＰｖｕＩ［Ｉ制限酵素で消化したプラ スミドｐｓＹ７５１にクローン化した。いくつかのクローンを解析したところ、 発現実験用および５１ｐＩＩＩ精製用として１つのクローン（ｐｓＹ１００８） を選択した。

ｐｓＹ１００８のアンピシリン薬剤耐性遺伝子を、ｐｓＹｌｏｌｏからのカナマ イシンマーカー（ＤｒａｌおよびＳｓｐ　ＩによるｐＳＹ６３３の消化、および ｐＵｃ４にの旧ｎｄＩｉＩ消化で得られたＫａｎ”の挿入にれた。プラスミドｐ ｓＹ１１８６の５ｌｐＩＩＩｅ分をＲａｎ　Ｉで除去することによって、新しい プラスミドｐｓＹ１２６２が生成した。このプラスミドには、単量体の重合によ り得られるＢａｎ　Ｉ末端を含む断片の直接連結を可能にするユニークＢａｎ　 Ｉ部位が含まれる。このプラスミドは、以下のタンパク質のための挿入部を含む プラスミドの生成に用いられてきた。５ＥＬＰ　１．２．３、および５１ｐ４゜ ５１ｐＩ［Ｉの産生および精製 細胞培養 大腸菌を以下の培地で培養する。

ｇ／Ｉｔ 酵母抽出物　２０ カサミノ酸　２０ ペプトン　２０ ゼラチンペプトン　２０ ＫＨ，Ｐり４２ に、１ＩＰ０４２ ＮａＪＰ０４＋　７Ｈ２０２ ３０℃で一晩増殖させた培養物（５００ａＺ〜１ｊ２／）を、５００１の発酵容 器に含まれる３７５！の培地へ接種するために用いた。

発酵容器の条件は、タコメーターの読みが１１００ｒｐ、容器の背圧が５ｐｓｉ 、＄よび５０％を越える溶解０□を維持するため通気速度が１７０！２／ｍｉｎ である。

培養物のＯＤ、、。が２．０に達した時、発酵容器にブドウ糖（Ｉｇ／Ａ）およ びアンピシリン（０，０５ｇ／ｆ）を添加し、ＯＤ値が再び２．０に達した。０ Ｄ６５゜が２．０に達した時、温度を１０分間４２℃に上昇させた後、２時間３ ８℃に低下させた。続いて、この培養物を１０℃に冷却し、細胞を連続遠心機に よる遠心で収穫して、処理まで一７０℃で凍結した。

２つの別々の発酵による回収量は、細胞の湿重量で７−３　ｋｇおよび５．２　 ′Ｋｇであった。

その他の培地も利用でき、異なったプラスミドに対して様々な選択条件が科せら れる　（すなわち、アンピシリンの代用にカナマイシン）。こういった条件は、 実験室規模の発酵で（用量１０・１）で使用された。

ＥＤＴＡ中に濃度が１ｋｇ湿重量／６ｆとなるように懸濁した。そして、８００ ０ｐｓ　ｉでＡＰＲ細胞破砕装置を２回通して細胞を破砕した。細胞溶解処理中 、細胞を氷槽で冷却し続けた。続いて、細胞溶解物を連続遠心機（４℃で操作す る５ｏｒｖａｌｌ　ＲＣ＝Ｂ冷却遠心機、Ｔ２−２８０−ター付き）を用いて２ ６．０００　Ｘ　Ｇで遠心した。こういった条件下で、生成量に対して９０％を 越える５ｌｆ）Ｉ［Ｉが、ベレット中に見い出された。その上清には、下８己の ようなＮＨ４ＳＯ４沈澱で回収できる産物は含まれていない。

ベレットは下記のようにしてＬｉＢｒで抽出した。

方法２、凍結細胞を解凍し、５０　ｍ！Ｊ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　（ｐ）！７．０ 　）、１０　ｉ：！ｆ　ＥＤＴＡおよびプロテアーゼ活性を阻害する５　ｍＭ　 ？ＭＳＦ中に濃度が１　ｋｇ湿重量／６１２となるように懸濁した。細胞を、こ の緩衝液中で室温にて０．５〜２時間攪拌し、次にリゾチームを濃度１ｇ／ｌま で添加し、２０分間インキュベーションした。さらに、細胞懸濁液を攪拌しなが ら、β−メルカプトエタノールを７０ｍＭまで添加し、界面活性剤ＮＰ４０を終 濃度１％に添加した。続いて、ＭｇＣｂを５００１Ｍまで添加して、ＤＮＡアー ゼを濃度１■／１で添加し、室温で２０分間インキュベーションした。さらに、 細胞溶解物を連続遠心機を用いて２６、０ＯＯＸ　Ｇで方法１に従って遠心し、 上溝を回収して、もう１度２６．０００　Ｘ　Ｇで連続遠心機を通過させた。２ 度目の遠心から得られる上清には、全量の５％末端の５１ｐＩＩＩが含まれてい たが、これは下記のようにＮＨ，ＳＯ，で回収される。１回目および２回目の２ ６．０ＯＯＸ　Ｇによる遠心操作から得られるペレットを合わせて、以下に記載 するようにＬｉＢｒで抽出した。

方法３．　この方法では、Ｔ７フアージのリゾチームをコードする第二のプラス ミドを含む大腸菌株を使用する。このプラスミドは、５ｉｐｎＩｉＬ伝子および 薬剤耐性決定因子をコードするプラスミドと両立できる。この株は、上記の２つ の方法と同じ培地および同一条件下で増殖する。しかし、細胞六でのＴ７リゾチ ームの産生によって、その細胞壁は弱められ、１００ｍＭを越えるＥＤＴＡおよ び濃度０．５ないし１．０％ｖ　／　ｖのＮＰ４０の添加によって、発酵の完了 時には細胞は容易に溶解し得る。ＮＰ４０の代わりに発酵培地中へのクロラムフ ェニコール（２０ｍｌ＃）の添加によっても溶解が容易に起きることもある。あ るいは、溶解に先立って細胞を遠心により集め、上記２つの方法と同様にＴｒｉ ｓ−ＥＤＴＡ中に１　ｋｇ湿重量／６ｆとして再懸濁してから、ＮＰ４０または クロラムフェニコールの添加によって溶解することができる。そのどちらかの方 法で細胞を溶解したのち、最初の２つの方法において記載したように連続ロータ ーによって２６．０ＯＯＸ　Ｇで細胞溶解物を遠心する。

これらの方法では、ペレットのＬｉＢｒ拍出、および上清のＮＨ，ＳＯ４沈澱が 、生成物の回収のために用いられる。

５ｌｐＨｌの精製 上記のごとく、細胞溶解物の２６．０００　Ｘ　Ｇでの遠心によって得られたペ レットを、等用量の９ＭＬｉＢｒで抽出する。塩溶液を添加し、そして室温での 攪拌によってペレットを均一に懸濁する。均一懸濁液が得られた後、この混合物 を１時間室温で攪拌する。続いて、混合物を、４℃または室温にて連続ローター による２６．０００　Ｘ　Ｇで遠心し、ペレットおよび上清分画を得る。上滑を 取り、ペレットを上記の９ＭＬｉＢｒ等用量に再懸濁する。１時間混合した後、 混合物を２６．０ＯＯＸ　Ｇで遠心し、得られた上清を最初のＬｉＢｒ抽出から の上清と混合して、４℃で一晩放置した。細胞中に含まれる約９０％の５１ｐＩ ｆｒが、この方法によるＬｉＢｒで抽出される。

ＬｉＢｒ抽出物を４℃で一晩放置すると、沈澱が生じ、これを２６、０ＯＯＸ　 Ｇでの遠心により除去して捨てる。上滑は透析バッグに入れ、２日間蒸留水を何 回か交接しながら透析する。

ＬｉＢｒを透析によって除去すると、５１ｐＩＩＩ産物が透析バッグに沈澱する 。沈澱物を遠心で集め、蒸留水で２〜３回洗う。最後に洗った生成物を遠心して 凍結乾燥する。

Ｓｌｐｍを２６．０００　ｘ　Ｇの上清分画から回収するには、ＮＨ，Ｓ０４沈 澱が用いられる。個体のＮＨ，ＳＯ，を、これが３８％飽和に達する＜２３１　 ｇ　／　Ｉｌ　）まで４℃に保った試料に徐々に加える。続いて、混合物を４℃ にて２〜３時間攪拌する。沈澱物を連続遠心機による遠心で回収し、等量の蒸留 水または０．５％ＳＯＳ水溶液で洗浄する。このペレットは、継続的洗浄によっ て白さを増し、夾雑タンパク質として除かれる。Ｓ］ｐＩＩＩが洗浄ペレットと して回収され、凍結乾燥によって乾燥できる。

Ｓｌｐｍのトリプシン処理工程 ５１ｐＩＩＩを、５０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　（ｐＨ８，０）　、ＩＭ　Ｎ ａＣ］緩衡液に懸濁し、３７℃の水槽に入れ、ＴＰＣＫ）！Ｊプシン処理溶液を 懸濁液中に混合した。最終トリプシン濃度は０．１％であった。

３時間後、溶液を１６．０ＯＯＸ　Ｇで１５分間遠心し、ペレットを初め０．５ ％ＳＤＳ溶液の１／２等量で洗い、続いて蒸留水で洗った。各洗浄の後、ペレッ トを遠心にて回収した。最終産物を水に懸濁し、４℃でさらに透析を続けた。

トリプシン処理によって、５１ｐＩＩｒは９９．４％の純度まで精製精製絹様タ ンパク質の物理的測定値は、微生物的に産生じた反復アミノ酸重合体が天然に存 在する重合体の特性を正確の絹フィブロインの結晶領域の逆平行鎮ベータシート 構造の実験モデル［Ｍａｒｓｈ、　Ｃｏｒｅｙ、およびＰａｕｌｉｎｇ、　Ｂｉ ｏｃｈｅｍ。

Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ａｃｔａ、　（１９５５）　１６　；　Ｐａｕｌｉｎｇ、およ びＣｏｒｅｙ、　Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ（１９５３）　３９：２４７　）を確 認するためになされた。Ｓｉｐミルフィルム得られたＸ線解析像の予備解析は、 Ｆｒａｓｅｒ、　ＭａｃＲａｉ、およびＳｔｅｗａｒｄ（１９６６）によって記 載されたものと一致する（第４表）。Ｓｌｐｍの円偏向二色性（ＣＤ）およびフ ーリエ変換赤外（ＦＴＩＲ）スペクトル解析結果は、ベータおよび逆ベータ構造 の高度の拡がりと一致する。

様々な溶媒中において、５１ｐｌＩＩから得られたスペクトルと天然に存在する 絹フィブロインのそれとを比較（ＩｓｕｋａおよびＹｏｕｎｇ、Ｐｒｏｃ、　Ｎ ａｔｌ、’Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　（１９６６）　５５：１１７５）すると 、溶液中の５１ｐＩ［［は、絹フィブロインに見られる、ランダム構および規則 性の高い構造の混合物からなるあることが示（ＡＧ）ゎ　９．４２　６．９５　 ８．８７（ＡＧＡＧＳＧ）ゎ　９．３９　６．８５　９．０５ＣＴＰ画分　９． ３８　６．８７　９．１３天然フイブロイン　９．４０　６．９７　９．２０９ 、４４　６．９５　９．３０ ３１ｐＩ［Ｉ　９，３８　６．９４　８．９７前記の様にして６種類のオリゴヌ クレオクド鎮を合成し、そして精製した。

オリゴヌクレオチドａ（ｉｉｉ）、　（ｉｖ）、　（Ｖ）および（ｖｉ　）をア ニーリングし、旧ｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩで消化したプラスミドｐＢｓｍ１ ３　（＋）のＤ　Ｎ　、Ａ　（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に連結した。連結反応の 生成物を、大腸菌ＪＭ　１０９株に形質転換した。形質転換体のコロニーを、ア ンピシリン耐性によって選択した。３２Ｐラベルのオリゴヌクレオチド（ｉｉ） 　、（ｉｖ）とのハイブリダイゼーションによって、コロニーをスクリーニング した。いくつかのハイブリダイゼーション陽性クローンからのプラスミドＤＮＡ を精製し、その塩基配列を決定した。それらプラスミドのうち２つ、ｐＳＹ　１ ２９２およびｐＳＹ　１２９３に、オリゴヌクレオチド（ｉｎ）、　（ｉｖ）、 （Ｖ）および（ｖｉ）で示される配列が含まれていた。これらの配列には、１つ を除いて合成オリゴヌクレオチドに存在するすべてのヌクレオチドが含まれてい た。７番目のＧ二〇塩基対が欠損しているものがあった（ｉｉｉ）。

この塩基対の欠損によって、１カ所のＢａｎ　Ｔ部位が機能しな（なっていた。

遺伝子断片の５゛末端に２番目のＢａｎＵを導入するために、オリゴヌクレオチ ド（ｉ）および（ｉｉ）をアニーリングし、旧ｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩで消 化したプラスミドｐＢｓｍ１３（＋）に連結した。アンピシリン耐性の形質転換 体からのプラスミドＤＮＡを精製した。２つのプラスミド、ｐＳＹ１２９５ｊ、 −よびｐＳＹ　１２９６　Ｃ５ｔｕｌ　（オリゴヌクレオチド配列に含まれるユ ニーク部位）で消化され得る〕の配列を決定した。

両プラスミドは、オリゴヌクレオチド（ｉ）ｇよび（ｉｉ）で表される配列を含 むことが示された。ｐＳＹ　１２９２からのプラスミドＤＮＡを、旧ｎｄＩＩＩ 、ＳＩヌクレアーゼ、およびＥＣＯＲＩで順次消化した。消化生成物をアガロー スゲル電気泳動によって分離し、約１５０塩基対のＤＮＡ断片をゲルから切り出 した。

このＤＮＡ断片を、Ｓｔｕ　ＩおよびＥｃｏＲＩで消化したプラスミドＤＮＡ　 ｐＳＹ　１２９６と連結した。この連結反応生成物を、大腸菌ＪＭ　１０９株に 形質転換し、アンピシリン耐性について選択した。

３２ｐラベルのオリゴヌクレオチド　（Ｖ）とハイブリダイゼーションするコロ ニーを選択した。２つのハイブリダイゼーション陽性クローンからのプラスミド ＤＮＡを精製して、その配列を決定した。これらのプラスミドを、ｐＳＹ　１２ ９７およびｐＳＹ　１２９ｇと命名した。これらは、以下の配列を含有していた 。

コ Ａ断片を受容するために修飾した。２つのオリゴヌクレオテそしてＢａｍ１　Ｉ で消化したプラスミドＤＮＡ　ｐｓＹ９３７に連結した。

連結反応の生成物を、大腸菌ＪＭ　１０９株に形成転換した。アンピシリン耐性 を示す形質転換体のコロニーを選択した。３２ｐラベルのオリゴヌクレオチド（ ｖｉｉ）とのハイブリダイゼーションによって、コロニーをスクリーニングした 。決定したＤＮＡの塩基配列によれば、２つのハイブリダイゼーション陽性クロ ーン、ｐＳＹ　１２９９およびｐＳＹ　１３００には、オリゴヌクレオチド（ｖ ｉｉ）および（ｖｎＩ）で示される配列が含まれていた。

プラスミドＤＮＡ、　ｐＳＹ　１２９８をＢａｎ　ＩＩで消化し、消化断片をア ガロースゲル電気泳動で分離した。約１５０ｂｐのＥＢＳＩ遺伝子断片を切り出 し、そして電気泳動およびエタノール沈澱で精製した。サイズ４５０ｂｐないし ６．０ＯＯｂｐの範囲の多量体を誘導するために、約ＩＫの精製断片を自己連結 した。続いて、自己連結した生成物を、Ｂａｎ　ＩＩで消化したプラスミド［１ ＮＡｐＳＹ　１２９９に連結した。この連結反応生成物を、大腸菌ＨＢ　１０１ 株に形質転換した。クロラムフェニコール耐性の形質転換体を選択した。各形質 転換体からのプラスミドＤＮＡを精製し、εＢＳＩ多量体ＤＮＡ挿入によるサイ ズの増大について解析を行った。サイズ範囲が１．５　ｋｂｐから４．４　ｋｂ ｐにわたる挿入部を有する１０個のクローン（ｐｓＹ１２４０−　ｐｓＹ１２４ ９）が得られた。

ＥＢＳＩ多量体遺伝子の発現 これらクローンのうちの１つ、ｐＳＹ　１２４８は、４ｋｂのＥＢＳＩ多量体遺 伝子を含むが、これをλＰＲ発現ベクターであるｐｓＹ７５１に再クローン化し た。ｐＳＹ　１２４８からのプラスミドＤＮＡを、Ｎｒｕ　Ｉおよびｐｖｕ　Ｉ ｆで消化し、アガロースゲル電気泳動で分離し、ＥＢＳＩ多量体遺伝子に相当す るＤＮＡバンドを切り出し、モしてＮＡＣＳ精製によって精製した。プラスミド ｐｓＹ？５１からのＤ　Ｎ　Ａを、Ｐｖｕ　ＩＩで消化し、そして前記Ｎｕｖ　 Ｉ−Ｐｖｕ［断片と連結した。連結反応生成物を大腸菌ＨＢ１０１に形質転換し 、そしてアンピシリン耐性の形質転換体を選択した。新しいプラスミドｐＳＹ　 １２８０を含む２つのクローンを選択した。ｐＳＹ　１２８０を含む大腸菌細胞 を３０℃でＯＤ６゜。値０．７まで増殖させ、そして次に１．５時間で４２℃ま で温度を上昇させた。細胞の産生ずるタンパク質を、５ＯＳ−ＰＡＧＥによって 分析した。分離したタンパク質をニトロセルロースペイパーに移行せしめ、抗Ｅ ＬＰウサギ血清を用いた免疫反応性によって検出した。見かけの分子量１２０ｋ Ｄを有する、強い反応を示すタンパク質バンドが認められた。

ｐｓｙ　１２８０のアンピシリン薬剤耐性遺伝子をカナマイシンマカーで置換し 、生じたプラスミドをｐＳＹ　１３２２と呼んだ。このプラスミドは、ＥＢＳＩ 精製のための発酵に用いられた（「方法」参照）。

ｐｓＹ１３３２／ｐｓＹ１２８０　ＥＢＳＩタンパク質　１４１３　ＡＡ　Ｍｌ ｌｉ　１１３．１５９ＭＤＰＶＶＬＯＲＲＤＷＢＮＰＧＶＴＱＬＮＲＬＡＡＨＰ ＰＦＡＳＥＲＦＣＭＧＳ［（ＧＶＧＶＰ）、（ＧＡＧＡＧＳＧＡＧＡＧＳ）、　 ］　２！ＭＣＹＲＡ）ＩＧＹＱＬＳＡＧＲＹＨＹＱＬＶＷＣＱＫＥＢＳＩタンパ ク質の精製 プラスミドＰｓｙ　１２８０を含む大腸菌ＨＢ　１０１株を１０１の容量で発酵 させた。この細胞を濾過により濃縮し、さらに遠心分離により収穫した。ペレッ ト化した細胞を、処理まで一７０℃で凍結保存した。凍結した細胞を氷上で解凍 し、細胞のｇ湿重量当たり４−の５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ７，０）　 、１０ｍＭ　ＥＤＴＡ。

５（ＩＩＭＰＭＳＦを含む溶液に懸濁した。その細胞を、フレンチプレスによっ て２回１５．０ＯＯｐｓｉで破砕し、そして０℃で冷却した。粗製溶解生成物を ２０分間２６に’Ｘ　Ｇでの遠心によって清澄化した。この上清タンパク質は、 固体の硫酸アンモニアを２０％飽和まで添加する（１１４ｇ／ｆ）ことによって 沈澱した。

沈澱物を、１０分間ＩＱＫ　Ｘ　Ｇでの遠心によって回収した。ベレットを１０ −の水に再懸濁し、４℃で１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ（ｐＨ８，０）　、１５Ｍ　Ｎａ Ｃ１に対して透析した。透析溶液を、室温で１．５時間０．１％トリプシン（Ｓ ｉｇｍａ）を用いて消化し、２０％硫酸アンモニウムを用いて再沈澱させた。沈 澱したタンパク質を、水に再懸濁し、４℃で１０ｄ　Ｔｒｉｓ（ｐ）１７．０） 　、１ｍＭＥＤＴＡ溶液に対して透析した。この試料のタンパク質純度は、アミ ノ酸、ｉｉｆｆｌの分析によって、８３％と決定した。

ＥＢＳＩタンパク質の弾性特性 上記の半精製ＥＢＳＩタンパク質の可溶性調製物を、３０分間３７℃でインキュ ベーションし、室温で１０分間１０Ｋ　Ｘ　Ｇでの遠心分離にかけた。この処理 によって、ＥＢＳＩタンパク質が凝集して不溶化し、ペレットは半透明の固体に なる。この固体は、ガラス棒での渦流または軟漫による機械的破砕に耐えた。こ の固体は、剃刀により、高い弾性を示すストリップに切断することができた。こ れらは、繰り返しの伸長と弛緩の後、それらの型を完全に保った。そして、圧縮 にも耐え、構造の不可逆的変形を全く起こさなかった。

ＥＢＳＩの精製 ＥＢＳＩ試料（純度−７０％）を、４℃で１５分間、５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＩ 、　５０ｍＭ　Ｎａｃｌ、　（ｐＨ８，０）の緩衝液に透析し、−晩でこの緩衝 液を１回交換した。沈澱物が認められた場合には、試料を、４℃で１５分間２７ ．０ＯＯＸ　Ｇでの遠心分離にかけた。その上清を、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣ Ｉ　、　５０ｍＭ　ＮａＣ１、（ｐＨ８，０）緩衝液で平衡科しておいたＤＥＡ Ｒ−５ｅｐｈａｃｅ　１カラムにかけた。ＥＢＳＩを含む分画からの流出物を集 めてプールした。

ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｃｅｌカラムからのプール分画に、試料中の最終濃度が２ ＭとなるようにＮａＣ１を加えた。不溶性物質を、２０分間２７．０００　ｘ　 Ｇでの遠心分離によって除去した。続いて、この上清を、２ＭＮａＣ１添加の５ ０ｍＭリン酸す）ＩＪウムｐＨ７緩衝液で平衡化したＰｈｅｎｙｌ−Ｓｅｐｈａ ｒｏｓｅカラムに適用した。溶出タンパク質がＡ２１ｏで全く検出されなくなる まで、このカラムを緩衝液で徹底的に洗った。続いて、５０ｏ＋Ｍ！Ｊン酸ナト リウム（ｐＨ７，０）緩衝液で段階的濃度勾配をかけて、カラムからの溶出を行 った。Ｅａｓｔ活性分画をプールし、その後の分析に備えて４℃で保存した。

前記の手法にこれらの工程を加えることによって、１００％純粋なＥＢＳＩが認 められた。

２本のオリゴヌクレオチド鎮を、「方法」のところで記載したようにして合成し 、そして精製した。

２本のオリゴヌクレオチド釦を、アニーリングして、ＲＥＮのＨｉｎｄｍおよび ＥｃｏＲＩで消化したプラスミドｐＢｓｍ１３　（＋）のＤＮＡを用いて連結さ せた。

この連結反応生成物を大腸菌ＪＭ　１０９株に形質転換した。形質転換体のコロ ニーを、３２ｐ−ラベルオリゴヌクレオチド（ｉ）とのハイブリダイゼーション によりスクリーニングした。ハイブリダイゼーション陽性コロニーからのプラス ミドＤＮＡを精製し、配列を決定した。１つのプラスミド、ｐＳＹ　１２８７に は、オリゴヌクレオチド（ｉ）および（ｉｉ）について示された配列が含まれて いた。

ｐＳＹ　１２８７からのプラスミドＤＮＡをＢａｎ　Ｉ制限酵素で消化し、消化 断片をアガロースゲル電気泳動によって分離した。

約６０ｂｐのＥＬＰＩ遺伝子断片を切り出して、ＮＡＣＳカラムによって精製し た。約ＩＫの精製断片を、サイズ３００ｂｐないし５０００ｂｐの範囲の多量体 を産生ずるために自己連結した。

続いて、自己連結生成物を、Ｂａｎ　Ｉ制限酵素で消化したプラスミドＤＮＡ　 ｐｓＹ９３７を用いて連結した。この連結反応の生成物を大腸菌ＨＢ　１０１株 に形質転換した。クロラムフェニコール耐性の形質転換体を選択した。個々の形 質転換体のプラスミドＤＮＡを精製し、ＥＬＰＩ重複ＤＮＡ挿入片によるサイズ の増大について解析を行った。サイズが１．　Ｏｋｂｐないし２．５　ｋｂｐの 範囲にある４つのクローン（ｐＳＹ　１３８ｇ−１３９１）が得られた。

これらのクローンは、λＰＲ発現ベクターＰＳＹ７５１へ再クローン化した。こ うして得られたクローン（ｐＳＹ　１３９２−１３９５）を、ＥＬＰＩの発現に 使用した。

ＥＬＰＩタンパク質のアミノ酸組成は、以下の通りであった。

ｐｓＹ１３９５　ＥＬＰＩタンパク質　８５９　ＡＡ　ＭＷ７２，５５５ＭＤＰ ＶＶＬＱＲＲＤＩＩｉＥＮＰＧＶＴＯＬＮＲＬＡＡＨＰＰＦＡＲＮ　Ｉ　ＬＡ　 ＩＲＷ［（ＶＰＧＶＧ）　４　コ　、、ＶＰＷＴＲＶＤＬＳＡＧＲＹ）！ＹＱＬ ＶＩＩＣＯＫＳＥＬＰ　１遺伝子の構成および発現 「方法」のところで記載したように、２種類のオリゴヌクこれらのオリゴヌクレ オチド領をアニーリングし、Ｐｓｔ　Ｉ制限酵素で消化したプラスミドｐＳＹ　 １３０４と連結した（ｐＳＹ　１３０４は、ｐＳＹ８５７の３量体担体の代わり に単量体単位を有する点で、ｐＳＹ８５７と異なっている）。クロラムフェニコ ール耐性の形質転換体コロニーからプラスミドＤＮＡを精製した。制限酵素５ｎ ａＢ　Ｉで消化可能なプラスミド、ｐｓｙ　１３６５を配列決定したところ、正 しいことが証明された。

上記のように（ｔ、ＬＰＩの構成および発現）精製したＥＬＰＩ遺伝子を、製造 元（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）が記載する通りにマングビーン（Ｍｕｎｇ　Ｂｅａ ｎ）　のヌクレアーゼで処理した。続いて、ＤＮＡ断片の混合物を、ＦｓｐＩ　 、　５ｎａＢＩ　、　＃よびウシの腸フォスファターゼで順次消化した。この連 結反応の生成物を、大腸菌ＨＢ　１０１株に形質転換し、クロラムフェニコール 耐性の株を選択した。個々の形質転換体からのプラスミドＤＮＡを精製し、ＥＬ Ｐ’ｌ単量体のＤＮＡ挿入部に関する解析を行った。２つのプラスミド、ｐｓＹ １３６６ＡおよびｐｓＹ１３６６Ｂの配列を決定した。両者とも、ＥＬＰＩのＤ ＮＡ配列を正しい方向で含有していることが示された。

プラスミドＤＮＡ５ｐＳＹ　１３６６を、Ｂａｎ　Ｉ制限酵素で消化し、５ＥＬ Ｆ　１を含むＤＮＡ断片をゲル精製した。多量体を創製するために、１；の５Ｅ ＬＰ　１のＤＮＡ断片を自己連結させた。サイズが５００ｂｐないし１０ｋｂｐ の範囲にある多量体が得られた。

５ＥＬＰ　１多量体を、ｐＳＹ　１２６２のＢａｎ　Ｉ　Ｒ位へクローン化シタ 。

陽性クローンを挿入された多量体について電気泳動により特徴すけ、そして発現 およびタンパク質解析のために使用した。

ＰＳＹ１３９６　５ＥＬＰＩタンパク質　２０２５　ＡＡ　ＭＩＩ１１４８，２ １２ＭＤＰＶＶＬＯＲＲＤＷＥＮＰＧＶＴＱＬＮＲＬＡＡＨＰＰＦＡＳＤＰＭＧ ＡＧＳ　（ＧＡＧＡＧＳ）ｇ［ＧＡ’Ａ（ＶＰＧＶＧ）４ＶＡＡＧＹ（ＧＡＧＡ ＧＳ）ｓ］　２４ＧＡＡ　（ＶＰＧＶＧ）　、　ＶＡＡＧＹ　（ＧＡＧＡＧＳ） 　２ＧＡＧＡＭ［１ＰＧＲＹＱＬＳＡＧＲＹＨＹＱＬＶｌＩＣ（ＩＫＳＥＬＰ　 ２−単量体の構成 プラスミドＤＮＡ５ｐＳＹ　１２９ｇを、Ｂａｎ　ｎ制限酵素で消化し、ＥＢＳ Ｉ遺伝子断片を前記のようにして精製した。ＥＢＳＩ単量体断片を、ＢａｍＩＩ 制限酵素で消化されそしてウシの腸フォスファターゼで処理されたｐＳＹ　１３ ０４　（ｐＳＹ８５７として構成された、５１ｐＩＩＩの単量体を含むｐＳＹ９ ３？）に連結した。

連結反応生成物の混合物を、大腸菌ＨＢ　１０１株に形質転換した。クロラムフ ェニコール耐性の形質転換体を選択した。いくつかの分離物の制限酵素解析の後 、ＥＢＳＩ単量体遺伝子に対応するＤＮＡ断片を含む１個のプラスミドｐＳＹ　 １３０１を選択した。

５ＥＬＰ　２−重複遺伝子集成および発現プラスミドＤＮＡ、　ｐＳＹ　１３０ １をＢａｎ　Ｉ制限酵素で消化し、５ＥＬＰ２　ｒ単量体」を含むＤＮＡ断片を ゲル精製した。多量体を創製するために、１ｇの５ＥＬＰ２　ＤＮＡ断片を自己 連結させた。

サイズが１２ｋｂｐを越える多量体が得られた。

５ＥＬＦ　２多量体を、ｐＳＹ　１２６２のＢａｎ　Ｉ部位へクローン化した。

陽性クローンを、挿入された多量体のサイズについてゲル電気泳動により特徴付 けた。サイズが１．５　ｋｂないし１ｌｋｂの範囲にある挿入部を有するクロー ンを選択した。６ｋｂ（１８反復）の挿入部を含むプラスミドＤＮＡ５ｐＳＹ　 １３７２を使用してさらに解析しそしてタンパク質の精製を行った。

５ＥＬＰ　２タンパク質の精製 プラスミドｐｓｙ　１３７２を含む大腸菌ＨＢ　１０１株を、「発酵法」で記し た方法に従って発酵させた。この細胞を遠心によって集めた。ペレット化した細 胞を、加工まで一７０℃で冷凍保存した。凍結した細胞を氷上で解凍し、細胞の ｇ湿重量当たり４−の５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ７，０）　、１０ｍＭ 　ＥＤＴＡ　、　５ｄＰＭＳＰを含む溶液に懸濁した。その細胞を、（、ａｕｌ ｉｎ細胞破砕装置に８．０００ｐｓｉで通過させて破砕した。粗製細胞溶解生成 物を２０分間、２６．０００ｘ　Ｇでの遠心によって清澄化した。この上清は、 ５ＥＬＰ　２の７５％以上を含んでおり、２０％の硫酸アンモニア（１１４ｇ　 ／　ｆ　’）の添加よって沈澱した。沈澱物を、１０分間１０．０ＯＯＸ　Ｇで の遠心によって回収した。ペレットを１０−の水に再懸濁し、４℃で１０　ｍＭ 　Ｔｒｉｓ（ｐＨ８，０）　、０．１５ＭＮａＣ１に対して透析した。約１０％ のＳＥＩ、Ｐ　２タンパク質を含む不溶性タンパク質分画を回収するために、透 析物質を１５分間２６．０ＯＯｘ　Ｇでの遠心にかけた。この不溶性タンパク質 ベレットを、３０分間５０℃にて時々攪拌しながら、０．２％ＳＤＳ中で２回洗 浄した。この不溶性タンパク質を、１５分間２６、０ＯＯＸ　Ｇでの遠心にかけ る度に回収し、５０％エタノールで洗浄した。最終タンパク質ペレットを水に再 懸濁し、ウェスタンプロット解析及び、アミノ酸組成により分析した。ウェスタ ンプロットによれば、５ＥＬＰ　２タンパク質は、大きな分子量（＞　１５０ｋ Ｄ）に一致する均一なサイズをを有しているように見える。アミノ酸組成では、 ５ＥＬＦ　２　調製物がほぼ８０％純の度を有し、観察されたアミノ酸のモル比 （Ｓｅｒ：Ｇｌｙ：Ａｌａ：Ｐｒｏ：Ｖａｌ：Ｔｙｒ）は、ｐＳＹ　１３７２に 存在するＳεＬＰ２の配列から予期された、予想組成値と極めて近接している。

ｐｓＹ１３７２　５ＥＬＰ２タンパク質　２０５５　ＡＡ　罪１５２．３５４Ｍ ＤＰＶＶＬＯＲＲＤＷＥ）ＩＰＧＶ丁ＯＬＮＲＬＡＡ）ＩＰＰＦＡＳＤＰＭＧＡ ＧＳ（ＧＡＧＡＧＳ）２　（ＧＶＧＶＰ）。

［（ＧＡＧＡＧＳ）　−ＧＡＡＧＹ　（ＧＡＧＡＧＳ）　ｓ　（ＧＶＧＶＰ）　 −］　１ｔ（ＧＡＧＡＧＳ）、ＧＡＡＧＹ　（ＧＡＧＡＧＳ）　２ＧＡＧＡＭＤ ＰＧＲＹＯＬＳＡＧＲＹＨＹＱＬＶＷＣＱＫＳＥＬＰ　３−構成および発現 プラスミドＤＮＡ　ｐＳＹ　１３０１を、Ｈａｅ　ＩＩ制限酵素で部分消化し、 消化断片をアガロースゲル電気泳動によって分離した。大きい方のＤＮＡ断片を 切り出し、ＮＡＣＳカラムで精製した。精製断片を自己連結させ、連結反応物を Ｔ４ＤＮＡ　ＩＪガーゼを不活化するため１５秒間７０℃で加熱し、最終的にＰ ｓｔ　Ｉ制限酵素で消化した。続いて、消化混合物を、大腸菌ｉ　１０９株に形 質転換した。クロラムフェニコール耐性の形質転換体を選択した。個々の形質転 換体からのプラスミドＤＮＡを精製し、以下の解析を行った（１　）　Ｐｓｔ　 Ｉ制限酵素に対する耐性、および（２）　５ＥＬＰ２遺伝子断遺伝子座れる６０ ｂｐのＨａｅ　ＩＩ断片の欠失。１つのクローン（ｐＳＹ　１３７？）が、両方 の要件を満たしていた。プラスミドＤＮＡ　ｐｓｙ　１３７７を、Ｂａｎ　Ｉ制 限酵素で消化し、５ＥＬＰ　３単量体を含むＤＮＡ断片をゲル精製した。多量体 を創製するために、１ｚの５ＥＬＰ３　ＤＮＡ断片を自己連結させた。

サイズが５００ｂ１１ないし１０ｋｂｐの範囲にある多量体が得られた。５ＥＬ Ｐ　３多量体を、ｐＳＹ　１２６２のＢａｎ　Ｉ部位へクローン化した。陽性ク ローンを、挿入された多量体のサイズについて電気泳動により特徴付け、そして 発現及びタンパク質解析に用いた。

ｐｓＹ１３９７　５ＥＬＰ３　Ｐｒｏｔｅｉｎ　２２５７　ＡＡ　ＭＷ　１６８ ．５３５ＭＤＰＶＶＬＱＲＲＤＷＥＮＰＧＶＴＱＬＮＲＬＡＡＨＰＰＦＡＳＤＰ ＭＧＡＧＳ　（ＧＡＧＡＧＳ）。

［（ＧＶＧＶＰ）−（ＧＡＧＡＧＳ）−］　２４（ＧＶＧＶＰ）、（ＧＡＧＡＧ Ｓ）、ＧＡＧＡＭＤＰＧＲＹＱＬＳＡＧＲＹＨＹＱＬＶＷＣＱＫＳＬＰ４−構成 および発現 プラスミドＤＮＡ　ｐＳＹ　１３０４　（ｐＳＹ８５７の３量体単位とは区別さ れるような、１つの単量体単位を有するｐｓＹ８５７）をＨａｅ　ＩＩで部分消 化し、そして消化断片をアガロースゲル電気泳動によって分離した。大きい方の ＤＮＡ断片を切り出し、ＮＡＣＳカラムで精製した。精製断片を自己連結させ、 そして連結反応物を７４ＤＮＡ　リガーゼを不活化するため１５秒間７０℃で加 熱し、最終的にＰｓｔ　Ｉ制限酵素で消化した。続いて、消化混合物を、大腸菌 ＪＭ　１０９株形質転換した。クロラムフェニコール耐性の形質転換体を選択し た。個々の形質転換体からのプラスミドＤＮＡを精製し、以下の解析を行った。

　（１）　Ｐｓｔ　Ｉ制限酵素に対する耐性、および（２）　５ＥＬＰ２遺伝子 断遺伝子座れる６　０　ｂｐ　ＨａｅｌＩ断片の欠失。１つのクローン（ｐＳＹ 　１３７ｇ）が、両方の要件を満たしていた。プラスミドＤＮＡ　ｐＳＹ　１３ ７８を、Ｂａｎ　Ｉ制限酵素で消化し、モして５ＬＰ４単量体を含むＤＮＡ断片 をゲル精製した。多量体を創製するために、１ｚの５ＬＰ４ＤＮＡ断片を自己連 結させた。サイズが３００ｂｐないし６　ｋｂｐの範囲にある多量体が得られた 。５ＬＰ４多量体を、ＰＳＹ　１２６２のＢａｎ　１部位へクローン化した。陽 性クローンを、挿入された多量体のサイズについての電気泳動により特徴付け、 そして発現およびタンパク質解析に用だ。

ｐｓＹ１３９８　５ＬＰ４タンパク質　１１０１　ＡＡ　Ｍｉｌｌ　７６．２３ １ＭＤＰＶＶＬＯＲＲＤＷＥＮＰＧＶＴＱＬＮＲＬＡＡＨＰＰＦＡＳＤＰＭＧＡ ＧＳ　［（ＧＡＧＡＧＳ）Ｇコ　、７（ＧＡＧＡＧＳ）　４ＧＡＧＡＭＤＰＧＲ ＹＱＬＳＡＧＲＹＨＹＱＬＶＷＣＱＫ上記の結果が示すように、高度の反復配列 を調製およびクローン化でき、絹ならびに他のタンパク質、および抗原といった 天然タンパク質を模倣し得る多様な生成物を製造するために、発現用にこの反復 配列が使用される。さらに、様々な宿主における誘導可能な条件下でペプチドの 発現を制御する新規な系が提供される。こうして、新規なタンパク質様産物を提 供でき、これによって、新しい特性が示され、または天然に存在する生成物の特 性に近接する可能性が生じる。

文　献 １、Ｍａｎｉａｔｉｓ、↑＋Ｉ　Ｆｒ１ｔｓｃｈ、　Ｅ、Ｆ、及びＳａｍｂｒｏ ｏｋ、　Ｊ、　１９８２゜Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂ ｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇｌ（ａｒｂｏｒ　Ｌａ ｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ　。

２、Ｌａｅｍｍｌｉ、　Ｕ、に、　１９７０．Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）、 　２２７：６８０−６８５゜３、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　Ｌｌ ｓｅｒ　Ｂｕｌｌｅｔｉｎ、１９８４．　Ｎｏ、１３゜４、Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ 、　Ｍ、Ｄ、及びＧａｒｕｔｈｅｒｓ、　Ｍ、Ｈ，１９８１゜Ｊｏｕｒｎａｌ　 Ａｍｅｒ、Ｃｈｅ＋ｎ、５ｏｃ０．　１０３：３１８５−３３１９゜５、ＭｃＢ ｒｉｄｅ、　Ｌ、Ｊ、及びＣａｒｕｔｈｅｒｓ、　Ｍ、ｌ（、１９３３゜Ｔｅｔ ｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔｅｒｓ、２４：２４５−２４８゜６、Ｓｍ１ｔｈ、 １９８００Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、６５：３７１−３７ ９゜Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、　８１７４１−７４６゜９、Ｄａｖａｎｌｏｏ、　 Ｐ、、　Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ、　Ａ、ＨｏＤｕｎｎ、　Ｊ、Ｊ、及び５ｔｕｄ　 ｉｅｒ。

Ｆ、Ｗ、　１９８４．　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、 　８１：２０３５−２０３９゜１０、Ｒｏｓｅｎｂｌｕｈ、　Ａ、、　Ｂａｎｎ ｅｒ、　Ｃ，Ｄ、Ｂ、、　Ｌｏｓｉｃｋ、　Ｒ，及びＦｉｔｚ−Ｊａｍｅｓ、Ｐ 、Ｃ，１９８１，Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、１４８：３４１−３５１゜１２、 Ｑｕｅｅｎ、Ｃ０１９８３，Ｊ、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｇｅｎ ｅｔｉｃｓ、２：１４、　Ｊｏｈｎｓｏｎ、％ＩＩ、Ｃ０，Ｍｏｒａｎ、　Ｃ， Ｐ、及びＬｏｓｉｃｋ、　Ｔ、Ｒ０１９８３゜Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）、 ３０２：８００−８０４゜１５、５ｔｕｄｉｅｒ、　Ｗ、Ｆ、及びＭｏｆｆａｔ 、　Ｂ、Ａ、　１９８６．　Ｊ、　Ｍｏｌ、　Ｂｉｏｌ、。

１８９：１１３−１３０゜ １６、Ｇｏｌｄｆａｒｂ、　Ｄ、　Ｓ、　、　Ｄｏｉ、　Ｒ，Ｈ，及びＲｏｄｒ ｉｇｕｅｚ、　Ｒ，Ｌ、１９８１゜Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）、　２９３： ３０９−３１１゜１７、　Ｆｅｒｒａｒｉ、　Ｆ、Ａ、、　Ｎｇｕｙｅｎ、　Ａ 、、　Ｌａｎｇ、　Ｄ、及びＨｏｃｈ、　Ｊ、Ａ。

１９８３、Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、１５４：１５１３−１５１５゜１８、　 Ｌａｃｅｙ、　Ｒ，Ｗ、及びＣｈｏｐｒａ、　１．１９７４．　Ｊ、　Ｍｅｄｏ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ。

？：２８５−２９７゜ １９、　Ｎｏｒｒａｎｄｅｒ、　Ｊ、、　Ｋｅｍｐｅ、　Ｔ、及びＭｅｓｓｉｎ ｇ、　Ｊ、　１９８３゜Ｇｅｎｅ、２６：１０１−１０６゜ ２０、　Ｓａｎｇｅｒ、　Ｆ、、　Ｎ１ｃｋｌｅｎ、　Ｓ、及びＣｏｕｌｓｏｎ 、　Ａ、Ｒ，１９７７゜Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、７４ ：５４６３−５４６７゜２１、８１ｇｇ１ｎ、　Ｍ、Ｄ、、　Ｇｉｂｓｏｎ、　 Ｔ、Ｊ、及びＨｏｎｇ、　Ｇ、Ｐ、　１９８３−Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｃ ！、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、８０：３９６３−３９６５゜２２、　Ｚａｇｕｒｓｋｙ、 　Ｒ，Ｊ、、　Ｂａｕｍｅｉｓｔｅｒ、　Ｋ、、　Ｌｏｍａｘ、　Ｎ、及びＢｅ ｒｍａｎ、Ｍ、Ｌ、１９８５．　Ｇｅｎｅ　Ａｎａｌ、Ｔｅｃｔ＋ｒ＋、、２： ８９−９４゜２３、　Ｓａｎｇｅｒ、　Ｆ、及びＣｏｕｌｓｏｎ、　Ａ、Ｒ，１ ９７８，ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔｅｒｓ。

８７：１０７−１１０゜ ２４．５ａｄｌｅｒ、　Ｊ、Ｒｏ、　Ｔｅｃｈｌｅｎｂｕｒｇ、　Ｍ、及びＪ、 　Ｌ、　Ｂｅｔｚ、　１９８０゜Ｐｌａｓｍｉｄｓ　ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ　ｍ ａｎｙ　ｔａｎｄｅｍ　ｃｏｐｉｅｓ　ｏｆ　ａ　５ｙｎｔｈｅｔｉｃｌａｃｔ ｏｓｅ　ｏｐｅｒａｔｏｒ、Ｇｅｎｅ　８：２７９−３００＝本明細書で記載さ れた出版物および特許出願のすべては、本発明の関連する技術を持った者の技術 水準を示唆するものである。あらゆる出版物および特許出願は、各出版物または 特許出願が特殊および別個に文献的組み入れを指摘されるような程度まで、ここ に文献として組み入れられている。

本発明が、完全に記述されていれば、当該分野における技術者にとって、添付の 請求項の精神および範囲を逸脱せずに、それに対する多（の変更および修飾をな し得ることは明らかであろう。

浄書（内容（こ変更なし） ＦＩＧ、１ ＦＩＧ、　２ Ａ　β−ラクタマーゼ１こ対する抗体を用いるイムツブ０フ８ｋＤ　１　２　３ 　４　５　６　７ ＦＩＧ、　３ ＦＩＧ、４ Ａ　Ｔ７ｇｐ　１０／５ｌＬｋ　１融合：抗−絹Ａｂを用いるイムツブ０ツトー ー――−・１＃ｌｌ１１−ｍ−−１８ｋＤ導　導　導 カ ｌ八 ＦＩＧ、６ Ｂｌｐｏｌ　Ｂｌｐｏｌ／ρＧ９ｃ３ ＭＷ　１　２　３　４　５　６ＭＷ１　２　３　４　５　６ＦＩＧ、　８ ＦＩＧ、９ Ａβ−ガラクトシダーゼ／Ｓｔｐ　ＩＩＩ融合体：アミドプラ・ツク染色手続補 正書（方式） 平成１年４月４日 特許庁長官　吉　１）文　毅　殿 １、事件の表示 ＰＣＴ／ＵＳ８７１０２８２２ ２、発明の名称 合成りＮＡの構成および大ポリペプチドの合成におけるその使用 ３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 名称　ジントロ　コーポレイション ４、代理人 住所　〒１０５東京都港区虎ノ門−丁目８番１０号５、補正命令の日付 平成１年３月７日（発送日） ６、補正の対象 （１）特許法第１８４条の５第１項の規定による書面の「特許出願人の代表者」 の欄 （２）委任状 （３）明細書の翻訳文 （４）請求の範囲の翻訳文 （５）図面の翻訳文 ７、補正の内容 （１）（２）　別紙の通り （３）明細書の翻訳文の浄書（内容に変更なし）（４）請求の範囲の翻訳文の浄 書（内容に変更なし）（５）図面の翻訳文の浄書（内容に変更なし）８、添付書 類の目録 （１）訂正した特許法第１８４条の５ 第１項の規定による書面　１通 （２）委任状及びその翻訳文　各１通 （３）明細書の翻訳文　１通 （４）請求の範囲の翻訳文　１通 （５）図面の翻訳文の浄書　１通 蘭恣錫審韻告 Ｉ吻情烏１４１１・−＾１１警吻鵞−ＩＩＩＩ１１・ＰＣτ／Ｕｓｅフ１０２８ ２２

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）オリゴペプチドの反復単位を含みペプチドをコードするＤＮＡ配列であっ て、前記反復単位が少なくとも３個の異なったアミノ酸を含みそして全体で４な いし３０個のアミノ酸を含むことを特徴とし、前記ベフチド中に少なくとも２つ の反復単位が存在しそして各反復単位中に少なくとも２つの同一アミノ酸が存在 し、前記単位が約１ないし１５個のアミノ酸で出来たアミノ酸架橋によって連結 されている場合があり、前記ＤＮＡ配列が、次の式： Ｋｋ（ＷＭＸｘＮＹｙ）ｉＬｌ ｛式中、 ＫおよびＬは、それぞれ約１ないし１００個のアミノ酸から成るアミノ酸配列を コードするＤＮＡ配列であって、ＫおよびＬが全アミノ酸の約２０％未満であり 、ｋおよび４は０または１を示し、 Ｗは、次の式： ［（Ａ）ｎ（Ｂ）Ｐ］ｑ （式中、Ａは、前記オリゴペプチド反復単位をコードするＤＮＡ配列であって、 前記反復単位中で約１２ないし９０個のヌクレオチドを含み、前記反復単位中に 存在する前記同一アミノ酸をコードする少なくとも２つのコドンが異なっており 、そこでは少なくとも１個のヌクレオチドに相違のある少なくとも２つの異なっ たＡが存在し、 Ｂは、同一または異なる単位であって、約３ないし４５個のヌクレオチドを有し 、Ａ単位によってコードされるオリゴペプチド単位以外をコードする、Ａとは相 違したＤＮＡ配列であり、 ｎは、１から１００の範囲にある整数であり、各ｐは、それぞれ０または１であ り、そしてｑは、少なくとも１であって、少なくとも９０個のヌクレオチドのＤ ＮＡ配列を形成するように選択される）を有し、ＭおよびＮは、同一の場合も異 なる場合もあり、コドンのＤＮＡ配列であって、それぞれＷおよびＸと読み枠が 合っている０ないし１８個のヌクレオチドから成るＤＮＡ配列であり、 Ｘは、Ｗと同一の場合も異なる場合もあり、次の式：［（Ａｌ）ｎ１（Ｂ１）ｐ ｌ］ｑ１を有し、Ｙは、Ｗと同一の場合も異なる場合もあり、次の式：［（Ａ２ ）ｎ２（Ｂ２）Ｐ２］ｑ２ （式中、すべての記号は、それらに対応する文字の定義に従う）を有し、 ｘおよびｙは０または１、 ｉは１ないし１００を示し、そして ｑ・ｑ１ならびにｑ２の合計は少なくとも１であり且つ約５０以下である｝を有 することとを特徴とするＤＮＡを列。 （２）前記ＤＮＡ配列のヌクレオチドが約１０キロ個以下である、請求項１記載 のＤＮＡ配列。 （３）ＭおよびＮのヌクレオチドが０個であり、そしてｘおよびｙの少なくとも １つが０である、請求項２記載のＤＮＡ配列。 （４）オリゴペプチドの反復単位を含むペプチドをコードするＤＮＡ配列であっ て、前記反復単位が少なくとも３個の異なったアミノ酸を含みそして全体で４な いし３０個のアミノ酸を含むことを特徴とし、前記ペプチド中に少なくとも２つ の反復単位が存在しそして各反復単位中に少なくとも２つの同一アミノ酸が存在 し、前記単位が約１ないし１５個のアミノ酸で出来たアミノ酸架橋によって連結 されている場合があり、前記ＤＮＡ配列が、次の式： Ｋｋ［（Ａ）ｎ（Ｂ）Ｐ］ｑＬｌ ｛式中、 ＫおよびＬは、それぞれ約１ないし１００個のアミノ酸から成るアミノ酸配列を コードするＤＮＡ配列であって、ＫおよびＬが全アミノ酸の約２０％未満であり 、ｋおよびｌは０または１を示し、 Ａは、前記オリゴペプチド反復単位をコードするＤＮＡ配列であって、前記反復 単位中で約１２ないし９０個のヌクレオチドを含み、前記反復中に存在する前記 同一アミノ酸をコードする少なくとも２つのコドンが異なっており、そこでは少 なくとも１個のヌクレオチドに相違のある少なくとも２つの異なったＡが存在し 、 Ｂは、同一または異なる単位であって、約３ないし４５個のヌクレオチドを有し 、Ａ単位によってコードされるオリゴペプチド単位以外をコードする、Ａとは相 違したＤＮＡ配列であり、 ｎは、１から１００の範囲にある整数であり、名ｐは、それぞれ０または１であ り、そしてｑは、少なくとも１であって、少なくとも９０個のヌクレオチドのＤ ＮＡ配列を形成するように選択される｝を有することとを特徴とするＤＮＡ配列 。 （５）前記Ａが、少なくとも２つの異なったコドンで、少なくとも３回同一アミ ノ酸をコードする、請求項４記載のＤＮＡ配列。 （６）前記同一アミノ酸がグリシンである、請求項４記載のＤＮＡ配列。 （７）オリゴペプチドの反復単位を含むペプチドをコードするＤＮＡ配列であっ て、前記反復単位がアミノ酸配列ＧＡＧＡＧＳまたはＧＶＧＶＰを含むことを特 徴とし、前記ＤＮＡ配列が、次の式： ［（Ａ）ｎ（Ｂ）Ｐ］ｑ ｛式中、 Ａは、前記オリゴペプチド反復単位をコードするＤＮＡ配列であって、同一また は異なるＡの中で少なくとも２つのＧのコドンが異なっており、そこでは少なく とも１個のヌクレオチドに相違のある少なくとも２つの異なったＡが存在し、Ｂ は同一または異なる単位であって、約３ないし４５個のヌクレオチドを有し、Ａ 単位によってコードされるオリゴペプチド単位以外をコードする、Ａとは相違し たＤＮＡ配列であり、 ｎは、５から２５の範囲にある整数であり、各ｐは、それぞれ０または１であり 、そしてｑは、少なくとも１であって、少なくとも９０個のヌクレオチドのＤＮ Ａ配列を形成するように選択される｝を有することを特徴とするＤＮＡ配列。 ｛８）前記オリゴペプチドがＧＡＧＡＧＳであり、そしてＢがチロシンのコドン を含んで成る、請求項７記載のＤＮＡ配列。 （９）Ａが次の式： ＧＧＧＣＧＧＧＣＧＣＡＧＧＡＡＧＴを有する、請求項７記載のＤＮＡ配列。 （１０）Ａが配列： 【配列があります】 を含んで成る、請求項８記載のＤＮＡ配列。 （１１）前記オリゴペプチドがＧＶＧＶＰである、請求項７記載のＤＮＡ配列。 （１２）Ａが次の式： ＧＧＴＧＴＡＧＧＣＧＴＴＣＣＧを有する、請求項１１記載のＤＮＡ配列。 （１３）ＷＭＸが配列： 【配列があります】 を含んで成る、請求項１記載のＤＮＡ配列。 （１４）オリゴペプチドの反復単位を有するペプチドをコードするＤＮＡ配列の 組換え体発現生成物を含んで成るポリペプチドであって、前記オリゴペプチドが 少なくとも３分子の異なったアミノ酸を含みそして全体で４ないし３０分子のア ミノ酸を含むことを特徴とし、前記ペプチド中に少なくとも２つの反復単位が存 在しそして各反復単位中に少なくとも２つの同一アミノ酸が存在し、前記単位が 約１ないし１５個のアミノ酸で出来たアミノ酸架橋によって連結されている場合 があり、前記ＤＮＡ配列が次の式： Ｋｋ（ＷＭＸｘＮＹｙ）ｉＬｌ ｛式中、 ＫおよびＬは、それぞれ約１ないし１００個のアミノ酸から成るアミノ酸配列を コードするＤＮＡ配列であって、ＫおよびＬが全アミノ酸の約２０％未満であり 、ｋおよびｌはＯまたは１を示し、 Ｗは、次の式： ［（Ａ）ｎ（Ｂ）Ｐ］ｑ （式中、Ａは、前記オリゴペプチド反復単位をコードするＤＮＡ配列であって、 前記反復単位中で約１２ないし９０個のヌクレオチドを含み、前記反復単位中に 存在する前記同一アミノ酸をコードする少なくとも２つのコドンが異なっており 、そこでは少なくとも１個のヌクレオチドに相違のある少なくとも２つの異なっ たＡが存在し、 Ｂは、同一または異なる単位であって、約３ないし４５個のヌクレオチドを有し 、Ａ単位によってコードされるオリゴペプチド単位以外をコードする、Ａとは相 違したＤＮＡ配列であり、 ｎは、１から１００の範囲にある整数であり、各ｐは、それぞれ０または１であ り、そしてｑは、少なくとも１であって、少なくとも９０個のヌクレオチドのＤ ＮＡ配列を形成するように選択される）｝を有することとを特徴とするポリペプ チド。 （１５）前記ポリペプチドが、反復単位としてＧＡＧＡＧＳおよびＧＶＧＶＰの 少なくとも１つを含む、請求項１４記載のポリペプチド。 （１６）オリゴペプチドの反復単位を有するペプチドをコードするＤＮＡ配列の 組換え体発現生成物を含んで成るペプチドであって、前記オリゴペプチドが少な くとも３個の異なったアミノ酸を含みそして全体で４ないし３０個のアミノ酸を 含むことを特徴とし、前記ペプチド中に少なくとも２つの反復単位が存在しそし て各反復単位中に少なくとも２つの同一アミノ酸が存在し、前記単位が約１ない し１５個のアミノ酸で出来たアミノ酸架橋によって連結されている場合があり、 前記ＤＮＡ配列が、次の式： Ｋｋ（てＭＸｘＮＹｙ）ｉＬｌ ｛式中、 ＫおよびＬは、それぞれ約１ないし１００個のアミノ酸から成るアミノ酸配列を コードするＤＮＡ配列であって、ＫおよびＬが全アミノ酸の約２０％未満であり 、ｋおよびｌは０または１を示し、 Ｗは、次の式： ［（Ａ）ｎ（Ｂ）Ｐ］ｑ （式中、Ａは、前記オリゴペプチド反復単位をコードするＤＮＡ配列であって、 前記反復単位中で約１２ないし９０個のヌクレオチドを含み、前記反復単位中に 存在する前記同一アミノ酸をコードする少なくとも２つのコドンが異なっており 、そこでは少なくとも１個のヌクレオチドに相違のある少なくとも２つの異なっ たＡが存在し、 Ｂは、同一または異なる単位であって、約３ないし４５個のヌクレオチドを有し 、Ａ単位によってコードされるオリゴペプチド単位以外をコードする、Ａとは相 違したＤＮＡ配列であり、 ｎは、１から１００の範囲にある整数であり、各ｐは、それぞれ０または１であ り、そしてｑは、少なくとも１であって、少なくとも９０個のヌクレオチドのＤ ＮＡ配列を形成するように選択される）｝を有することとを特徴とするペプチド 。 （１７）ＡがＧＡＧＡＧＳまたはＧＶＧＶＰをコードする、請求項１６記載のポ リペプチド。 （１８）原核生物の宿主中における制御された転写のための制御系であって、 ［１］ＤＮＡをメッセンジャーＲＮＡに転写し得る前記宿主にとって外来性のＲ ＮＡポリメラーゼをコードする構造遺伝子を含んで成り、誘導可能なプロモータ ーの転写制御下にあるＤＮＡ配列、および ［２］前記宿主の内因性ＲＮＡポリメラーゼでは機能しないが前記外来性ＲＮＡ ポリメラーゼでは機能するプロモーターの転写制御下において目的のポリペプチ ドをコードする構造遺伝子、 を含んで成る制御系。 （１９）前記誘導可能なプロモーターが、β−ガラクトシダーゼプロモーターま たはｓｐｏＶＧプロモーターである、請求項１８記載の制御系。 （２０）請求項１記載のＤＮＡ配列を含んで成る原核生物宿主。 （２１）オリゴペプチドの反復単位を含むペプチドをコードするＤＮＡ配列の組 換え体ＤＮＡ発現生成物を含んで成るペプチドの製造方法であって、前記反復単 位が少なくとも３個の異なったアミノ酸を含みそして全体で４ないし３０分子の アミノ酸を含むことを特徴とし、前記ペプチド中に少なくとも２つの反復単位が 存在しそして各反復単位中に少なくとも２つの同一アミノ酸が存在し、前記単位 が約１ないし１５個のアミノ酸で出来たアミノ酸架橋によって連結されている場 合があり、前記ＤＮＡ配列が、次の式：Ｋｋ（ＷＭＸｘＮＹｙ）ｉＬｌ ｛式中、 ＫおよびＬは、それぞれ約１ないし１００個のアミノ酸から成るアミノ醸配列を コードするＤＮＡ配列であって、ＫおよびＬが全アミノ酸の約２０％未満であり 、ｋおよびｌは０または１を示し、 Ｗは、次の式： ［（Ａ）ｎ（Ｂ）Ｐ］ｑ （式中、Ａは、前記オリゴペプチド反復単位をコードするＤＮＡ配列であって、 前記反復単位中で約１２ないし９０個のヌクレオチドを含み、前記反復単位中に 存在する前記同一アミノ酸をコードする少なくとも２つのコドンが異なっており 、そこでは少なくとも１個のヌクレオチドに相違のある少なくとも２つの異なっ たＡが存在し、 Ｂは、同一または異なる単位であって、約３ないし４５個のヌクレオチドを有し 、Ａ単位によってコードされるオリゴペプチド単位以外をコードする、Ａとは相 違したＤＮＡ配列であり、 ｎは、１から１００の範囲にある整数であり、各ｐは、それぞれ０または１であ り、そしてｑは、少なくとも１であって、少なくとも９０残基のヌクレオチドの ＤＮＡ配列を形成するように選択される）を有し、ＭおよびＮは、同一の場合も 異なる場合もあり、コドンのＤＮＡ配列であって、それぞれＷおよびＸと読み枠 が合っている０ないし１８残基のヌクレオチドから成るＤＮＡ配列であり、 Ｘは、Ｗと同一の場合も異なる場合もあり、次の式：［（Ａ１）ｎ１（Ｂ１）ｐ １］ｑ１を有し、Ｙは、Ｗと同一の場合も異なる場合もあり、次の式：［（Ａ２ ）ｎ２（Ｂ２）Ｐ２］ｑ２ （式中、すべての記号は、それらに対応する文字の定義に従う）を有し、 ｘおよびｙは０または１、 ｉは１ないし１００を示し、そして ｑ・ｑ１ならびにｑ２の合計は少なくとも１であり且つ約５０以下である｝を有 し、 前記方法が、請求項２０に記載した原核生物宿主を増殖させ、ここで前記ＤＮＡ 配列が前記宿主中で機能する転写開始および終止調制御域の転写および翻訳制御 の下にあり、これにより前記ペプチドが発現され、そして発現産物を単離するこ ととを含んで成る方法。 （２２）前記ペプチドが、反復単位ＧＡＧＡＧＳおよびＧＶＧＶＰの少なくとも １つを含んで成る、請求項２１記載の方法。