DE3752363T2

DE3752363T2 - Herstellung synthetischer dns und deren verwendung bei der synthese grosser polypeptide

Info

Publication number: DE3752363T2
Application number: DE3752363T
Authority: DE
Inventors: A. Franco FERRARI; Charles Richardson; James Chambers; Stuart C Causey; J. Thomas POLLOCK
Original assignee: Protein Polymer Technologies Inc
Current assignee: Protein Polymer Technologies Inc
Priority date: 1986-11-04
Filing date: 1987-10-29
Publication date: 2004-02-19
Anticipated expiration: 2007-10-30
Also published as: ATE233273T1; FI883082A0; JP3250968B2; AU612340B2; FI101720B; NO882946L; JPH1014586A; JPH01501755A; WO1988003533A1; NZ222450A; EP0293443A1; NO311982B1; DK369788D0; NO882946D0; EP0293443A4; FI883082A; AU1052888A; FI101720B1; JP2000135092A; EP0293443B1

Description

Technisches Gebiet
Das Gebiet betrifft die Herstellung von hochmolekularen Polymeren, entweder Nucleinsäuren oder Peptide, die Expressionsprodukte der Nucleinsäuren sind, und betrifft insbesondere die Herstellung hochmolekularer Peptide, die Sequenzwiederholungen enthalten, durch biochemische Prozesse, wobei die Peptide Anwendung als strukturierte Materialien finden.
Hintergrund
Rekombinante DNA-Technologie wurde bei der Isolierung natürlicher Gene und der Expression dieser Gene in einer Vielzahl von Wirtszellen angewendet. Typischerweise hatte diese Technologie ihren Nutzen beim Herstellen biologisch aktiver Polypeptide, wie z. B. Interferon oder Peptidhormonen, deren Herstellung in brauchbaren Mengen durch andere Mittel unmöglich war. Die Herstellung modifizierter Proteine war auch möglich, indem natürliche Gene isoliert und Techniken ortsspezifischer In-vitro-Mutagenese angewendet wurden, um diese Gene abzuändern und dadurch das produzierte Polypeptid zu verändern. Andere Polypeptide sind durch Kombinieren von Abschnitten verschiedener nativer Gene erzeugt worden, um Polypeptide herzustellen, die chimäre Moleküle der einzelnen natürlich auftretenden Moleküle sind.
Mit dem Anbruch effizienter und automatisierter Verfahren für die chemische DNA-Synthese ist es möglich geworden, ganze Gene zu synthetisieren und solche synthetischen Gene im Verlauf der Synthese nach Belieben zu modifizieren. Jedoch sind diese zahlreichen Technologien auf die Produktion von natürlichen oder modifizierten Versionen natürlicher Polypeptide angewendet worden. Es sind sehr wenige Versuche unternommen worden, diese Technologien dazu zu verwenden, um im Wesentlichen neue Polypeptide zu erzeugen. In der Natur weisen Polypeptide ein breites Spektrum chemischer, phy sikalischer und physiologischer Eigenschaften auf. Dennoch gibt es kommerzielle Anwendungen, für die natürlich auftretende Polypeptide nicht geeignet sind.
Obwohl die Biotechnologie vielseitig ist, war deren Anwendung für gewöhnlich auf natürlich auftretende Produkte oder Modifizierungen natürlich auftretender Produkte beschränkt. Im Gegensatz dazu war eine der großen Stärken der organischen Synthese die Fähigkeit zur Transformation billiger Kohlenstoffmaterialien zu einer breiten Vielfalt von polymeren Molekülen, einschließlich natürlich auftretenden Molekülen, jedoch am bedeutsamsten völlig neuen Strukturen, wie z. B. Polypropylen und Polyacrylaten, die definierte und vorhergesagte chemische Eigenschaften aufweisen, die nicht mit natürlich auftretenden Molekülen in Verbindung stehen.
Von solchen Materialien, insbesondere hochmolekularen Polymere, die Sequenzwiederholungen von Aminosäuren enthalten, hat sich erwiesen, dass sie durch biochemische Mittel schwer herzustellen sind. Die für das Herstellen von großen Grundeinheiten von Aminosäuren enthaltenden Peptide notwendigen Gene waren instabil und unterzogen sich häufig einer intermolekularen Rekombination, was Deletionen der Grundeinheiten im Gen verursachte. Die Entwicklung einer Biotechnologie, die polymere Moleküle durch biologische Prozesse produzieren würde, die jenen der verfügbaren organischen Synthese ähnlich sind, würde den Umfang der Anwendungen der Biotechnologie signifikant erweitern.
Kurze Beschreibung der einschlägigen Literatur
Die Klonierung multipler Lactose-Operatoren, bis zu vier in Tandemanordnung wird von Sadler et al., Gene 8, 279-300 (1980) offenbart. Hybride Bakterien-Plasmide; die höchst wiederholte Satelliten-DNA enthalten, werden von Brutlag et al., Cell 10, 509-519 offenbart. Die Synthese eines Poly(aspartyl-phenylalanins) in Bakterien wird von Doel et al., Nucleic Acids Research 8, 4575–4592 (1980) offenbart. Ein Verfahren zur Anreicherung des Prolin-Gehalts durch Klonieren eines Plasmids, das für die Produktion eines Prolin-Polymers kodiert, wurde von Kangas et al., Applied and Environmental Microbiology 43, 629-635 (1982) offenbart. Die biologischen Beschränkungen der Länge von höchst repetitiven DNA-Sequenzen, die möglicherweise innerhalb von Plasmid-Replicons stabil gehalten werden, wird von Gupta et al. in Bio/Technology, S. 602-609, September 1983 diskutiert.
GB-A-2162190 schlägt die Möglichkeit der Herstellung von Seidenproteinen unter Anwendung rekombinanter Mikroorganismen oder in Gewebekultur vor., Die Möglichkeiten der Herstellung von Materialien, die mit Seidenproteinen identisch sind und von Materialien, die modifiziert sind, werden ebenfalls offenbart.
Zusammenfassung der Erfindung
Es werden Verfahren gemäß den angefügten Ansprüchen zur Herstellung von Polypeptiden mit oligomeren Grundeinheiten durch Expression eines synthetischen Strukturgens bereitgestellt. Die einzelnen für eine oligomere Peptidsequenz kodierenden Einheiten werden bezüglich der Nucleotide unter Nutzung von Aminosäurecodon-Redundanz variiert. Lange Nucleinsäuresequenzen werden durch Synthetisieren von Nucleinsäureoligomeren aufgebaut, die eine Vielzahl von einzelnen Peptid-Grundeinheiten exprimieren, und die Oligomere werden verbunden, um ein Polynucleotid der gewünschten Länge bereitzustellen. Es werden Expressionssysteme verwendet, die das Wachstum des gegenständlichen Wirts zu hoher Dichte vor signifikanter Expression des Polypeptidprodukts gefolgt von der Induktion der Expression vorsehen, um hohe Ausbeuten des Polypeptidprodukts zu liefern, das aus den Wirtszellen isoliert werden kann. In einer der Ausführungsformen wird ein System angewendet, worin das Transkriptionsinitiationssystem des synthetischen Gens von der Wirts-RNA-Polymerase nicht erkannt wird, und es wird ein Gen in den Wirt eingebaut, das eine funktionstüchtige RNA-Polymerase unter induzierbarer Regulation exprimiert.
Kurzbeschreibung der Figuren
1: Struktur des Plasmids pSY701.
2: Immunoblots der Polypeptidprodukte unter Verwendung eines Antikörpers gegen (A) Beta-Lactamase oder gegen (B) Gly-Ala-Peptid.
3: Konstruktions-Fließbild für Plasmid pG10/S1pl.
4: Immunoblots von Polypeptidprodukten (A) T7gp10/S1pl mit Anti-Slp-Ab, (B) T7gp9/S1pl mit Anti-Slp-Ab oder (C) Färbung mit Coomassie-Blau.
5: Konstruktions-Fließbild für Plasmid pSY856.
6: Zeitverlauf der Akkumulierung des Kanamycin-Resistenz-Genprodukts mit dem T7-System.
7: Konstruktions-Fließbild für Plasmid pSY857.
8: Konstruktions-Fließbild für Plasmid pSY980.
9: (A) Amidoschwarz-Färbung des Gels, welches das Produkt der Beta-Galactosidase/S1pII-Genfusion enthält; (B) Immunoblot desselben Produkts mit Anti-S1p-Antikörper.
10: Konstruktions-Fließbild für Plasmid pSY1280.
Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
DNA-Sequenzen, welche diese Erfindung betreffen, kodieren für Polypeptide, die Oligomere von relativ kurzen Aminosäuresequenz-Grundeinheiten sind. Die Oligomere können durch Spacer einer anderen Aminosäuresequenz verbunden sein. Die Polypeptide enthalten daher repetitive Aminosäuresequenzen und sind insbesondere als Faserproteine, einschließlich elastomere Faserproteine brauchbar. Das für die die Grundeinheit enthaltenden Peptide kodierende Gen wird hergestellt, um insbesondere diejenigen Probleme zu vermeiden, die früher mit Genen assoziiert waren, die mehrere Grundeinheiten enthalten.
Die gemäß der gegenständlichen Erfindung hergestellten Gene umfassen Multimere von DNA-Sequenzen, welche für dieselbe Aminosäuresequenzeinheit kodieren, wobei zwei oder mehrere verschiedene Multimere, die für verschiedene Aminosäureeinheiten kodieren, miteinander verbunden werden können, um ein Block-Copolymer zu bilden. Die einzelnen Einheiten weisen 4 bis 30 Aminosäuren (12 bis 120 nt), häufiger 4 bis 25 Aminosäuren (12 bis 75 nt), insbesondere 4 bis 8 Aminosäuren auf, wobei für gewöhnlich dieselbe Aminosäure zumindest zweimal in derselben Einheit auftritt und im Allgemeinen durch zumindest eine Aminosäure voneinander getrennt sind. Die Einheiten des Multimers, die für dieselbe Aminosäuresequenz kodieren, umfassen zwei oder mehrere Nucleotidsequenzen, die sich auf die Codon-Redundanz stützen, um dieselbe Aminosäuresequenz zu erzielen.
Gemäß den Einschränkungen der angefügten Ansprüche können die gemäß dieser Erfindung hergestellten DNA-Zusammensetzungen größtenteils durch die folgende Formel dargestellt werden:
K_k(WMX_xNY_y)_iLi
worin:
K eine für eine Aminosäuresequenz von ungefähr 1 bis 100 Aminosäuren, für gewöhnlich 1 bis 60 Aminosäuren kodierende DNA-Sequenz ist, die eine beliebige Sequenz sein kann und im Allgemeinen weniger als ungefähr 20% der Gesamtzahl von Aminosäuren, allgemeiner weniger als ungefähr 10% der Gesamtzahl von Aminosäuren ausmacht, die irgendeine Sequenz, insbesondere eine natürlich auftretende Sequenz sein kann, worin das Multimer-Strukturgen mit einer anderen DNA-Sequenz im Leseraster fusioniert worden ist; K weist normalerweise das Initiations-Methionin-Codon auf;
k = 0 oder 1 ist;
W die folgende Formel aufweist: [(A)_n(B)_p]_q worin:
A eine DNA-Sequenz ist, die bei jedem Auftreten für dieselbe Aminosäuresequenzeinheit kodiert, bei der normalerweise zumindest eine Aminosäure zumindest zweimal in der Sequenz auftritt, wo A im Allgemeinen ungefähr 12 bis 90 Nucleotide (nt), häufiger ungefähr 12 bis 75 Nucleotide aufweist; wobei für gewöhnlich zumindest zwei verschiedene A, für gewöhnlich nicht mehr als zehn verschiedene A, häufiger nicht mehr als sechs verschiedene A vorliegen, die für dieselbe Aminosäuresequenz kodieren, sich jedoch voneinander durch zumindest ein Nucleotid unterscheiden und sich um bis zu zehn Nucleotide unterscheiden können, sich für gewöhnlich um nicht mehr als ungefähr fünf Nucleotide von einer anderen A-Sequenz unterscheiden, wobei jede der verschiedenen A für gewöhnlich zumindest zweimal wiederholt wird; zumindest zwei verschiedene Codons werden für dieselbe Aminosäure eingesetzt, z. B. GGC und GGA für Glycin in verschiedenen, für dieselbe Aminosäuresequenzeinheit kodierenden A;
N eine ganze Zahl von zumindest 2, für gewöhnlich zumindest ungefähr 8 und nicht mehr als ungefähr 250, für gewöhnlich nicht mehr als ungefähr 200, häufig nicht mehr als ungefähr 125 ist und in einigen Fällen ungefähr 50 nicht überschreiten wird;
B eine von A verschiedene DNA-Sequenz ist, die für eine Aminosäuresequenz kodiert, die nicht die von der A-Einheit kodierte Aminosäuresequenz ist und als eine Verbindungseinheit zwischen Oligomeren von A-Einheiten dient; B weist im Allgemeinen ungefähr 3 bis 45 nt (1 bis 15 Aminosäuren), häufiger ungefähr 3 bis 30 nt (1 bis 10 Aminosäuren) auf;
wobei die im Gen auftretenden B-Einheiten dieselben oder verschieden sein können, wobei für gewöhnlich nicht mehr als ungefähr 10 verschiedene B-Einheiten, häufiger nicht mehr als ungefähr 5 verschieden B-Einheiten vorliegen, wo sich die B-Einheiten um 1 bis 45 nt, häufiger um ungefähr 1 bis 15 nt unterscheiden können, wo die verschiedenen B für dieselbe oder für verschiedene Aminosäuresequenzen kodieren können;
p = 0 oder 1 ist und jedes Mal verschieden sein kann, wenn eine sukzessive A-Einheit vorliegt;
q eine ganze Zahl von zumindest 1 ist und mit der Anzahl von Nucleotiden in A und B ebenso wie die Werte von n und p variiert; die Variable q wird so gewählt, dass sie zumindest 90 Nucleotide, vorzugsweise zumindest ungefähr 150 nt, bevorzugter zumindest 450 nt und insbesondere bevorzugt zumindest ungefähr 900 Nucleotide für den multimeren Teil des Strukturgens bereitstellt; für gewöhnlich wird die Anzahl von Nucleotiden ungefähr 10.000, häufiger ungefähr 8.000 nicht überschreiten und im Allgemeinen im Bereich von ungefähr 900 bis 6.000, häufiger ungefähr 5.000 liegen; und
M eine DNA-Nucleotidsequenz von 0 bis 18 nt ist, die für jegliche Aminosäuresequenz, für gewöhnlich die Aminosäuren von A und/oder B umfassend und im Allgemeinen eingeschränkt auf die Aminosäuren von A und/oder B kodieren kann;
X = W oder davon verschieden sein kann, für gewöhnlich davon verschieden ist und die folgende Formel aufweist:
worin:
A¹, B², N¹, p¹ und q¹ gleich oder verschieden von A, B, n, p bzw. q sind, wobei zumindest eines davon verschieden ist, worin die analogen Symbole unter dieselbe Definition wie ihre Gegenstücke fallen;
x = 0 oder 1 ist; N gleich oder verschieden von M ist und unter dieselbe Definition wie M fällt;
Y gleich oder verschieden von W sein kann, für gewöhnlich davon verschieden ist und die folgende Formel aufweist:
worin:
A², B², n², p² und q² gleich oder verschieden von A, B, n, p bzw. q sind, wobei zumindest eines davon verschieden ist, worin die analogen Symbole unter dieselbe Definition wie ihre Gegenstücke fallen;
y = 0 oder 1 ist;
i = 1 bis 100, für gewöhnlich 1 bis 50, häufiger 1 bis 30 ist, insbesondere 1, wenn x und y = 0 sind;
wenn x oder y = 1 ist, q, q¹ und q² insgesamt zumindest 2; für gewöhnlich zumindest 5 und nicht mehr als ungefähr 30 ausmachen.
Die Gesamtzahl von Nucleotiden ist vorzugsweise zumindest ungefähr 900 nt und kann 20 knt (Kilonucleotide), für gewöhnlich nicht mehr als ungefähr 15 knt, häufiger nicht mehr als ungefähr 10 knt betragen.
Das von der obigen DNA-Sequenz kodierte Polypeptid besitzt die folgende Formel: K'_k(W' M' X_X N' Y'_y)_iL'_i worin:
W' die folgende Formel aufweist: [(D)_n(E)_p]_q worin:
D die von A kodierte Aminosäuresequenz ist und daher die numerischen Einschränkungen aufweist, die auf den 3 Basen basieren, die ein Codon definieren, das für eine Aminosäure kodiert;
E die von B kodierte Aminosäuresequenz ist und daher die numerischen Einschränkungen aufweist, die auf den 3 Basen basieren, die ein Codon definieren, wo jedes E abhängig von der Kodierung von B identisch oder verschieden sein kann; und worin desgleichen K', W', M', X', N', Y' und L' die von K, W, M, X, N, Y bzw. L kodierte Aminosäuresequenz sind; jedoch kann im Fall von K und L die anschließende Prozessierung, wie z. B. Proteasebehandlung, Bromcyanbehandlung usw., eine teilweise oder vollständige Entfernung der N- oder C-terminalen, nicht-multimeren Ketten bewirken.
n, p, q, k, i und l dieselben Definitionen, wie sie vorher angegeben wurden, besitzen.
Bestimmte polymere Zusammensetzungen mit multimeren Grundeinheiten mit denselben Zusammensetzungen (A) weisen die folgenden Formeln auf, worin x und y = 0 sind: K'_k[(D)_n(E)_p]_qL'_i worin:
alle Symbole wie vorher definiert sind; und
die DNA-Sequenz die Formel K_k[(A)_n(B)_p]_qL_i aufweist, worin alle Symbole wie vorher definiert sind.
Bestimmte, für copolymere Zusammensetzungen kodierende DNA-Sequenzen mit einer Grundeinheit von zwei bis drei multimeren Blöcken weisen die folgende Formel auf: K_k(W''M''X''N''Y''_y)''L_i worin:
W'' ein Multimer der Formel
ist, wobei A³ 4 bis 8, für gewöhnlich 4 bis 6 Codons aufweist und ansonsten unter die Definition von A fällt;
n³ ungefähr 2 bis 12, für gewöhnlich 2 bis 10 ist;
B³ 2 bis 8, für gewöhnlich 4 bis 6 Codons aufweist;
p³ = 0 oder 1 ist;
q³ ungefähr 2 bis 25, für gewöhnlich 2 bis 20 ist;
X" und Y" gleich oder verschieden von W", für gewöhnlich verschieden sind und unter dieselbe Definition wie W'' fallen;
M" und N" unter dieselbe Definition wie M' und N' fallen;
i" zumindest 2, für gewöhnlich zumindest 5 und nicht mehr als ungefähr 75, für gewöhnlich nicht mehr als ungefähr 50, im Allgemeinen nicht größer als 30 ist;
wobei die anderen Symbole wie vorher definiert sind.
Die Polypeptidzusammensetzungen, die von gemäß der Erfindung hergestellter DNA kodiert werden, weisen ein Molekulargewicht von zumindest ungefähr 10 kDa, vorzugsweise 15 kDa auf und können Molekulargewichte bis zu oder von mehr als 400 kDa aufweisen, für gewöhnlich nicht mehr als 300 kDa, häufiger nicht mehr als ungefähr 250 kDa aufweisen, wobei die höheren Bereiche im Allgemeinen Multimer-Kombinationen sind, wobei das einzelne Multimer für gewöhnlich kleiner als ungefähr 150 kDa, für gewöhnlich kleiner als ungefähr 100 kDa ist.
Die angewendeten Nucleotidsequenzen werden synthetisiert, so dass die Grundeinheiten verschiedene Codons für dieselbe Aminosäure aufweisen, wie oben beschrieben wurde. Für gewöhnlich werden zumindest ungefähr 25%, häufiger zumindest ungefähr 40% und im Allgemeinen zumindest ungefähr 60%, jedoch nicht mehr als ungefähr 95%, vorzugsweise nicht mehr als ungefähr 90% der Nucleotidsequenzen, die für Grundeinheiten kodieren, dieselben sein. Eine größere Vielfalt innerhalb jener Grundeinheiten wird eingesetzt, wo von den anfänglichen Konstrukten experimentell nachgewiesen ist, dass sie spontan rekombinieren.
Von besonderem Interesse sind Polypeptide, die SGAGAG (G = Glycin; A = Alanin; S = Serin) als Grundeinheit aufweisen. Diese Grundeinheit findet sich im natürlich auftretenden Seidenfaserprotein, die als GAGAG(SGAGAG)₈SGAAGY (Y = Tyrosin) dargestellt werden kann. In der gegenständlichen Erfindung wird die Grundeinheit konstruiert, wobei der N-Terminus MGAGAG oder jede andere Sequenz von im Allgemeinen zumindest ungefähr 3 Aminosäuren, für gewöhnlich zumindest ungefähr 5 Aminosäuren, häufiger 12 Aminosäuren und nicht mehr als 200, für gewöhnlich nicht mehr als 100 Aminosäuren sein kann, die von der Grundeinheit verschieden sein kann. Im Allgemeinen ist einverschiedener N-Terminus das Ergebnis der Insertion des Gens in einen Vektor auf eine Weise, welche die Expression eines Fusionsproteins bewirkt. Jedes Protein, das die gewünschten Eigenschaften des Produkts nicht stört, kann den N-Terminus bereitstellen. Insbesondere können endogene Wirts-Proteine, z. B. bakterielle Protein eingesetzt werden. Die Wahl des Proteins kann von der Beschaffenheit der Transkriptionsinitiationsregion abhängig sein. In ähnlicher Weise kann der C-Terminus eine von der repetitiven Sequenz verschiedenen Aminosäuresequenz aufweisen. In geeigneter Weise können 1 bis 100, für gewöhnlich 1 bis 25 Aminosäurenvorliegen, die den C-Terminus eines natürlich auftretenden Strukturgens darstellen können, was sich wiederum typischerweise aus der Bildung eines Fusionsproteins ergibt.
Ein seidenartiges Protein- (SIp-) Gen kann wie oben beschrieben durch Bereitstellen von Oligomeren mit ungefähr 5 bis 25 Grundeinheiten, häufiger ungefähr 10 bis 20 Grund einheiten hergestellt werden. Durch Vorliegen verschiedener kohäsiver Enden können die Oligomere konkatermerisiert werden, um das Polymer mit 2 oder mehreren oligomeren Einheiten, für gewöhnlich nicht mehr als ungefähr 50 oligomeren Einheiten, häufiger nicht mehr als ungefähre 30 oligomeren Einheiten und häufig nicht mehr als ungefähr 25 oligomeren Einheiten bereitzustellen.
Die seidenähnlichen Proteine können durch Aufweisen abwechselnder Multimere mit derselben oder unterschiedlicher Händigkeit verschiedenartig sein. Beispielsweise kann (B)_p in der Formel eine gerad- oder ungeradzahlige Anzahl von Aminosäuren bereitstellen. In Seide können sich die Wasserstoffe des Glycins an einer Seite und die Methylund Hydroxylgruppen von Alanin und Serin an der anderen Seite angleichen. Wenn (B)_p geradzahlig ist, wird eine durchgehende Angleichung, wenn ungeradzahlig, eine abwechselnde Angleichung von (A)_n auftreten. Folglich können unterschiedliche Eigenschaften durch Änderung der Anzahl der von (B)_p kodierten Aminosäuren erzielt werden.
Von besonderem Interesse sind Polypeptide, welche die Zusammensetzung und physikalischen Eigenschaften der Seide von Bombyx mori nachahmen.
Ebenfalls von Interesse sind Polypeptide, welche die repetitive Grundeinheit GVGVP (G = Glycin, V = Valin, P = Prolin) aufweisen, die in natürlich auftretendem Elastin auftreten. In der gegenständlichen Erfindung kann der N-Terminus jede geeignete Sequenz sein und kann, wenn erwünscht, als Ganzes oder teilweise durch eine Protease entfernt werden. Für gewöhnlich wird die N-terminale Sequenz, die das gegenständliche Motiv nicht aufweist, weniger als ungefähr 100 Aminosäuren, häufiger weniger als ungefähr 60 Aminosäuren aufweisen.
Von besonderem Interesse ist eine Grundsequenz von ungefähr 6 bis 10, vorzugsweise 8 Einheiten, die durch eine Sequenz von ungefähr 6 bis 20 Aminosäuren, für gewöhnlich 8 bis 16 Aminosäuren getrennt ist, die eine interne Wiederholung von 4 bis 8 Ami nosäuren umfassen kann, die von der repetitiven Grundeinheit verschieden ist. Beispielsweise könnte die zweite repetitive Sequenz zweimal wiederholtes GAGAGS sein. Die Gesamtzahl von repetitiven Grundeinheiten wird im Allgemeinen im Bereich von ungefähr 150 bis 300, für gewöhnlich 175 bis 250 liegen. Der C-Terminus kann mit einer Grundeinheit oder einem Teil davon oder einer anderen Sequenz von 1 bis 100, für gewöhnlich 1 bis 30 Aminosäuren terminieren. Der T-Terminus ist für die Erfindung nicht entscheidend und wird in erster Linie aus Gründen der Zweckdienlichkeit gewählt. Wie beim N-Terminus kann er für proteolytische Spaltung konstruiert sein. Wie für den Fall des Seidenproteins kann das gegenständlichen Elastin -artige Protein auf ähnliche Weise konstruiert werden. Von besonderem Interesse sind Proteine, welche die Eigenschaften von Elastin nachahmen und elastomere Eigenschaften bereitstellen.
Das Grundeinheiten umfassende Copolymer ist ein leistungsfähiges Verfahren für das Variieren von Eigenschaften, und zwar durch geeignete Wahl der verschiedenen Einheiten, der Anzahl von Einheiten in jedem Multimer, des Abstand zwischen ihnen und der Anzahl von Wiederholungen des Multimer-Kombinationsaufbaus. Folglich können durch Variieren der Anzahl und Anordnung von primären Monomeren eine Vielzahl von verschiedenen physikalischen und chemischen Eigenschaften erzielt werden.
Beispielgebend für die Verwendung von Block-Copolymeren sind Kombinationen von Seideneinheiten und Elastineinheiten, um Produkte mit Eigenschaften bereitzustellen, die von Polymeren verschieden sind, die ausschließlich dieselbe monomere Einheit aufweisen.
Um die Strukturgene herzustellen, können verschiedenartige Ansätze angewendet werden. Um die Oligomere herzustellen, können komplementäre DNA-Stränge synthetisiert werden, so dass bei Hybridisierung doppelsträngige DNA mit den geeigneten Termini erhalten wird. Wenn erwünscht, kann jede dieser oligomeren Einheiten dieselbe sein, so dass in einem einzigen Schritt in Abhängigkeit von den Hybridisierungsbedingungen ein Konkatemer erhalten werden kann. Normalerweise werden herkömmliche Annelierungs- und Ligationsbedingungen angewendet, wie z. B. jene, die in den folgenden Beispielen beschrieben werden.
Wenn erwünscht, können zwei verschiedene oligomere Einheiten hergestellt werden, wo die Termini der beiden Einheiten zueinander komplementär sind, wobei jedoch die Termini derselben Einheit nicht miteinander binden können. Auf diese Weise kann man einzelne oligomere Einheiten bauen und diese dann miteinander verbinden, um ein Konkatemer zu bilden, wo die verbindenden Intervening-Sequenzen zumindest teilweise durch die Termini definiert sind. Abhängig vom Konstrukt kann der 5'-Terminus das Initiationscodon Methionin bereitstellen oder es kann das Strukturgen mit einem Adapter verbunden werden, was eine einzigartige Sequenz (optional durch ein spezifisches Enzym spaltbar) am 5'-Terminus bereitstellen kann, oder kann in einen für den Wirt für gewöhnlich endogenen Gen-Teil im richtigen Leseraster insertiert werden, so dass ein Fusionsprotein bereitgestellt wird. Durch Bereitstellen von geeigneten komplementären Termini zwischen Adapter oder trunkiertem Gen und dem 5'-Ende des gegenständlichen Strukturgens können die Sequenzen in richtigem Leseraster verbunden werden, um das gewünschte Protein zu liefern. Vorteile, die durch Anwendung von Adaptern oder Fusionsproteinen erzielt werden können, umfassen Die Erlangung spezifischer Sequenzen für spezielle Zwecke, wie z. B. Verbinden, Sekretion, Komplexbildung mit anderen Proteinen, Affinitätsreinigung oder dergleichen.
Sobald das Strukturgen assembliert worden ist, kann es kloniert werden; Klone, die das gewünschte Gen, insbesondere bezüglich der Sequenzlänge aufweisen, können isoliert werden; und das Gen kann entfernt und zur Verknüpfung mit einer Sequenz für die Expression verwendet werden.
Das Expressionskonstrukt umfasst Transkriptions- und Translationsinitiations- und Terminationsregulationsregionen 5' bzw. 3' des Strukturgens. Wie bereits angedeutet, können diese Regionen durch Einsatz eines Fusionsproteins erzeugt werden, wobei das gegenständliche Strukturgen in ein anderes Gen stromab seines Initiationscodons und im Leseraster mit dem Initiationscodon insertiert wird. Alternativ dazu sind verschiedene Transkriptions- und Translationsinitiationsregionen aus einer Vielzahl von Genen zur Verwendung in Expressionswirten erhältlich, so dass diese Transkriptions- und Translationsinitiationsregionen mit dem gegenständlichen Strukturgen verbunden werden können, um die Transkriptions- und Translationsregion der gegenständlichen Strukturgene bereitzustellen. Eine breite Vielfalt von Terminationsregionen sind verfügbar, die aus demselben Gen wie die Transkriptionsinitiationsregion oder aus einem anderen Gen stammen können. Zahlreiche Konstrukte sind in der Literatur offenbart worden es können beim gegenständlichen Gen dieselben Verfahren angewendet werden, die bei anderen Strukturgenen eingesetzt worden sind.
Von besonderem Interesse ist die Verwendung einer induzierbaren Transkriptionsinitiationsregion. Auf diese Weise kann der Wirtsstamm vor der signifikanten Produktion des gewünschten Produkts zu hoher Dichte gezüchtet werden. Das Bereitstellen induzierbarer Transkription ist besonders zweckdienlich, wo das Peptid im zellulären Wirt zurückbehalten und durch den Wirt nicht sekretiert wird.
Etliche induzierbare Transkriptionsinitiationsregionen sind vorhanden oder können in bestimmten Situationen eingesetzt werden. Die induzierbaren Regionen können durch eine spezielle Chemikalie, wie z. B. Isopropylthiogalactosid (IPTG) zum Induzieren des Beta-Galactosidase-Gens gesteuert werden. Andere induzierbare Regionen umfassen die linken und rechten Lamda-Promotoren; verschiedene Aminosäure-Polycistrons, z. B. Histidin und Tryptophan; temperatursensitive Promotoren; und regulatorische Gene, z. B. cl^ts 857.
Ein alternatives System, das vorteilhaft eingesetzt werden kann, ist die Verwendung einer Kombination von Transkriptionsinitiationsregionen. Es wird eine erste Transkriptionsinitiationsregion eingesetzt, die die Expression des gewünschten Gens reguliert, die jedoch im Expressionswirt nicht funktionell ist, da sie mit der endogenen RNA-Polymerase nicht funktionstüchtig ist. Eine zweite Transkriptionsinitiationsregion, wie z. B. eine induzierbare Region, kann dann eingesetzt werden, um die Expression einer RNA-Polymerase zu regulieren, mit der die erste Transkriptionsinitiationsregion funktionstüchtig ist. Auf diese Weise tritt die Expression nur bei Aktivierung derjenigen Regulationsregion auf, welche die Expression der exogenen RNA-Polymerase reguliert. In der gegenständlichen Anwendung wird dieses System anhand der T7-Phagen-Transkriptionsinitiationsregion, im Speziellen anhand den Initiationsregionen der Gene 9 und 10 des T7-Phagen erläutert.
Ein alternatives System stützt sich auf die Verwendung von Mutanten, die auf Basis einer Umgebungsveränderung, wie z. B. Fehlen von Nährstoff, osmotischer Druck, Salinität oder dergleichen eine entwicklungsbedingte Veränderung erfahren. Beispielhaft für dieses System können Stämme von B. subtilis erhalten werden, die der Sporulation unfähig sind, die jedoch jene Komponenten produzieren können, welche die Expression von Produkten injizieren, die an der Sporulation beteiligt sind. Daher wird durch eine Veränderung der Mediumsbedingung eine mit der Sporulation assoziierte Transkriptionsinitiationsregion aktiviert. Unter diesen Umständen liefert der Wirt den notwendigen induzierenden Wirkstoff oder Aktivator, um die Expression zu injizieren.
Es existieren verschiedene andere Techniken zur Bereitstellung der induzierbaren Regulation der Transkription und Translation eines Gens in einem bestimmten Wirt.
Meistens wird der Wirt ein einzelliger Organismus, entweder ein Prokaryot oder Eukaryot sein, der aus Bakterien; Algen, Pilzen, filamentösen Pilzen usw. gewählt ist. Beispielhafte Wirte umfassen E. coli, B. subtilis, B. stearothermophilus, S. cerevisiae und dergleichen.
Das Expressionskonstrukt zur Expression des gewünschten Gens an sich oder in Verbindung mit an der Transkription beteiligten Hilfsgenen wird normalerweise zur Einführung in einen Expressionswirt an einen geeigneten Vektor gebunden. Ein große Zahl von Vektoren sind im Handel erhältlich und andere sind in der Literatur beschrieben. Die Vektoren sind normalerweise dadurch gekennzeichnet, dass sie eine oder mehrere einzigartige Restriktionsstellen, ein Replikationssystem für die extrachromosomale Erhaltung im Wirt und einen oder mehrere Marken aufweisen, die einen Selektionsdruck auf den Wirten ermöglichen. Die Marken können Komplementation, einem auxotrophen Wirt Prototrophie, Resistenz gegen ein Biozid, z. B. ein Antibiotikum wie Penicillin oder Kanamycin oder dergleichen bereitstellen. In eineigen Fällen wird statt Selektionsdruck ein Makergen eingesetzt, das die Detektion von einzelnen Kolonien erlaubt, die das Gen enthalten. Diese Situation wird durch das Gen für Beta-Galactosidase veranschaulicht, wo ein Substrat eingesetzt wird, das ein gefärbtes Produkt liefert.
Das Expressionskonstrukt kann einschließlich aller Hilfsgene gemäß bekannter Techniken, insbesondere unter Anwendung von Restriktion, Insertion und Ligation in den Expressionsvektor eingeführt werden.
Das Expressionskonstrukt kann dann für die Transformation des geeigneten Wirten verwendet werden. Abhängig vom Wirt können entweder intakte Zellen oder Protoplasten verwendet werden, wo Transformation oder Konjugation eingesetzt wird. Zweckmäßigerweise können Calciumphosphat-präzipitierte DNA oder nichtionische Detergenzien eingesetzt werden, um das Plasmid in den Wirt einzuführen. Es sollte nahe gelegt werden, dass es nicht notwendig ist, Vektoren für die Wirtstransformation einzusetzen, das nackte DNA für die Integration in das Genom eingeführt werden kann. Jedoch wird, sogar wo Integration erwünscht ist, bei Anwendung der Vektoren eine viel höhere Effizienz erzielt, was folglich den Einsatz von Vektoren favorisiert.
In Abhängigkeit vom Charakter des Vektors kann das Expressionskonstrukt an einem extrachromosomalen Element erhalten oder in den Wirt integriert werden. Wo die Integration erwünscht ist, wird es für gewöhnlich mit Prokaryoten und einigen Eukaryoten wünschenswert sein, eine Sequenz zu besitzen, die zu einer Sequenz im Chromosom des Wirts homolog ist. Für gewöhnlich wird die Sequenz ungefähr 200 bp und nicht mehr als ungefähr 5.000 bp, für gewöhnlich nicht mehr als ungefähr 2000 bp aufweisen. Die Wahl der homologen Sequenz ist einigermaßen willkürlich, kann jedoch zur Komplementierung verwendet werden, wenn der Wirt eine auxotrophe Mutante ist und die Homologie Prototrophie verleiht.
Die Transformanten oder Integranten können dann in einem geeigneten Nährmedium auf hohe Dichte gezüchtet werden, gefolgt von Induktion und Transkription im Einklang mit der Natur des Transkriptionssystems des Expressionskonstrukts. Wo das gewünschte Protein im Zytoplasma zurückgehalten wird, werden diese Zellen geerntet und lysiert und in Abhängigkeit vom Verwendungszweck des Proteins kann das Protein gemäß herkömmlicher Techniken, wie z. B. Chromatographie, Lösungsmittel-Lösungsmittel-Extraktion, Affinitätschromatographie und dergleichen weiter gereinigt werden.
Die repetitiven Proteine können eine Vielzahl von Anwendungen finden. Die SIp-Proteine können in der Produktion von Fasern mit einzigartigen Eigenschaften, als Ersatz für Seide und dergleichen verwendet werden. Es können Collagenproteine hergestellt werden, wo das Collagen anhängig von seiner Funktion frei vom Telopeptid ist oder das Telopeptid enthält. Atelopeptidcollagen sollte, wenn überhaupt, wenig Immunogenität aufweisen, sodass es ein nützliches Strukturelement für eine Reihe von Prothesenvorrichtungen oder zur Verwendung als Collagenersatz in anderen Anwendungen ist. Auf ähnliche Weise können andere Proteine mit repetitiven Sequenzen, wie z. B. Keratin gemäß der gegenständlichen Erfindung hergestellt werden. Andere nützliche repetitive Proteine könne auf Basis von Sequenzen von Spinnenseiden oder anderer repetitiven Tierfasern hergestellt werden. Künstliche, für die Immunisierung nützliche Peptide könnten ebenfalls auf Basis repetitiver Sequenzen, die in verschiedenen Oberflächenantigenen von krankheitsverursachenden Mikroorganismen, wie z. B. Parasiten, Bakterien und Viren hergestellt werden.
Die folgenden Beispiele dienen der Veranschaulichung und Solen die Erfindung nicht einschränken.
Beispiel 1
DNA-Herstellungsverfahren
1. Herstellung von Plasmid-DNA aus E. coli:
A. kleiner Maßstab: Plasmid-DNA wurde aus 1,5 ml-Kulturen entweder durch das Aufkochverfahren oder das Verfahren der alkalischen Lyse hergestellt (Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor (1982)).
B. großer Maßstab: Ein Plasmid-tragender Stamm wurde über Nacht in 1 Liter Luria-Bouillon mit dem geeigneten Antibiotikum gezüchtet. Die Zellen wurden durch Zentrifugation für 5 Minuten bei 10.000 g gesammelt und in 10 ml eiskaltem TE (10 mM Tris-HCI, pH 8, 1 mM EDTA) resuspendiert. Die Zellen wurden wiederum zentrifugiert, in 4 ml TES (TE und 25% (w/v) Saccharose) resuspendiert und durch Vortexen homogenisiert. Die Proben wurden für die folgenden Schritte auf Eis gehalten. Lysozym (1 ml von 10 mg/ml) wurde der Zeltsuspension zugesetzt und vor der Zugabe von 2 ml 0,5 M EDTA, pH 8, für 5 Minuten inkubiert. Nach 10 Minuten Inkubation wurden 50 ml Proteinase K (40 mg/ml) und 10 Minuten später 15 ml Lysepuffer (0,1% Triton X-100, 1 mM EDTA, 50 mM Tris-HCI, pH 8) zugesetzt. Nach 15 bis 20 Minuten wurde das Zelllysat bei 35.000 × g für 90-120 Minuten zentrifugiert. Der Überstand (19,8 ml) wurde in ein Kunststoffröhrchen mit 20 g CsCI und 400 μl Ethidiumbromid (10 mg/ml) überführt. Nach dem Auflösen wurde das Gemisch in zwei Polyallomer-Ultrazentrifugenröhrchen aufgeteilt, die heißversiegelt und in einem Beckmann Ti 65-Rotor bei 60.000 U/min für 24 Stunden zentrifugiert wurden. Die untere Plasmid-DNA-Bande wurde mit einer Injektionsnadel aus dem Röhrchen entfernt. Das Ethidiumbromid wurde dreimal mit einem gleichen Volumen von NaCl-gesättigtem Isopropanol extrahiert. Zwei Volumina H₂O wurden der DNA-Lösung zugesetzt und die DNA dann mit Ethanol präzipitiert.
2. Herstellung doppelsträngiger DNA:
Eine Kultur von JM103 wurde zu einer OD₆₀₀ von ungefähr 0,2 gezüchtet und dann in Aliquote von 2 ml aufgeteilt. Jedes Aliquot wurde mit einem frischen Plaque M13 infiziert und bei 37°C für ungefähr 6 Stunden unter heftigem Schütteln inkubiert. Dann wurden die Zellen pelletiert und der Überstand für nachfolgende Infektionen aufgehoben. Die doppelsträngige Phagen-DNA wurde mit dem Aufkochverfahren (Maniatis et al.) extrahiert.
3. Deproteinierung:
Phenolextraktion wurde an einem zweckmäßigen Volumen, typischerweise zwischen 100 μl und 10 ml der DNA-Probe durchgeführt. Die DNA-Probe wurde in 0,01 M Tris-HCl, pH 7,5, 1 mM EDTA verdünnt und es wurde ein gleiches Volumen wassergesättigtes Phenol zugesetzt. Die Probe wurde mittels Vortex kurz gemischt und für 3 Minuten auf Eis gelegt. Nach Zentrifugation für 3 Minuten in einer Mikrozentrifuge wurde die wässrige Phase entfernt, in ein neues Röhrchen überführt und einmal mit einem gleichen Volumen Chloroform : lsoamylalkohol (24 : 1) extrahiert.
4. Ethanolpräzipitation:
Die DNA in einem wässrigen Puffer wurde durch Ethanolpräzipitation konzentriert. Zur DNA-Probe wurde 1/10 des Volumens 3 M Natriumacetat, pH 7,5, und 2-3 Volumina kaltes Ethanol zugesetzt. Die DNA wurde für 30 Minuten bei –70°C oder über Nacht bei –20°C präzipitiert und dann durch Zentrifugation in der Mikrozentrifuge für 15 Minuten bei 4°C pelletiert. Das Pellet wurde einmal mit 200 μl kaltem, 80%igen Ethanol gewa schen und nochmals für 10 Minuten bei 4°C pelletiert. Nach Lufttrocknung oder Lyophilisierung wurden die Pellets im geeigneten Puffer resuspendiert.
5. Phosphatase-Behandlung der DNA:
Phosphatase-Behandlung von DNA wurde durch Zugabe von 1 μl (25 Units) Kälber-Intestinal-Phosphatase (Böhringer Mannheim) direkt zur Restriktionsenzymverdau-Reaktion und Fortsetzung der Inkubation für 30 Minuten bei 37°C durchgeführt. Die Phosphatase wurde für 60 Minuten bei 65°C vor der Deproteinierung durch Phenolextraktion inaktiviert.
6. Füll-Reaktion mit DNA-Polymerase 1:
DNA wurde in 50 mM Tris-HCI, pH 7,4, 50 mM KCl, 5 mM MgCl₂ und 400 μM von jedem der vier Desoxynucleotidtriphosphate enthaltendem Puffer resuspendiert. Zehn Units Klenow-DNA-Polymerase (BRL) wurden zugesetzt und die Reaktion für 15 Minuten bei Raumtemperatur fortgesetzt. Die DNA wurde dann mit Phenol extrahiert und mit Ethanol präzipitiert.
7. T4-Polynucleotidkinase-Reaktion:
Die Reaktion (10 μl) enthielt: T4-Polynucleotidkinase (BRL), 150 ng DNA, 1 μl 10x Kinasepuffer (0,7 M Tris-HCl, pH 7,6, 0,1 M MgCl₂, 50 mM DTT) und [³²P]-ATP (200-300 nCi). Dieses wurde bei 37°C für 30 Minuten inkubiert und die DNA dann unter Verwendung einer NACS-Säule (Bethesda Research Labs) gereinigt.
8. Verdau mit Restriktionsendonucleasen:
DNA wurde mit Restriktionsendonuclease (REN) in 1 × „AA"-Puffer [10 × AA-Puffer ist 330 mM Tris-Acetat, pH 7,9, 660 mM Kaliumacetat, 100 mM Magnesiumacetat, 50 mM Dithiothreitol (DTT) und 1 mg/ml Rinderserumalbumin (frei von Nuclease)] verdaut. Wann immer möglich, wurde die Konzentration der DNA unter 1 μg/25 μl gehalten. Die Inkubation war bei 37°C für 1-4 Stunden für die meisten Restriktionsendonucleasen außer für BamII-, BanI- und Nael-Verdaue, die über Nacht inkubiert wurden.
9. Analytische Agarosegel-Elektrophorese von DNA:
DNA-Proben für die Gelanalyse wurden mit 0,2 Volumina Beladungspuffer (5 × Elektrophoresepuffer, 0,01% Bromphenolblau-Farbstoff, 50 mM EDTA und 50% Glycerin) versetzt. Dann wurden die Proben in Lanes einer horizontalen Submers-Elektrophoreseeinheit geladen, die ein 1 %iges (w/v) Agarosegel enthielt. Der Elektrophoresepuffer war entweder 1 × TAC oder ½ × TBE. 1 × TAC besteht aus 40 mM Tris-Base, 10 mM EDTA, eingestellt auf pH 7,8 mit Essigsäure. ½ × TBE besteht aus 0,045 Tris-Base, 0,045 Borsäure, 1 mM EDTA, pH B. Das Gel wurde bei 40-50 V für 18 Stunden betrieben und dann entfernt und mit 0,5 μg/ml Ethidiumbromid für 30 Minuten gefärbt. Die DNA-Banden wurden an einem Langwellen-UV-Transilluminator sichtbar bemacht.
10. Präparative Agarosegel-Elektrophorese:
Die Verfahren und Materialien sind dieselben wie für die analytische Agarosegel-Elektrophorese. Der einzige Unterschied ist die Verwendung von Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt (LMP) in einer Konzentration im Bereich von 0,5 bis 2,5% (w/v) in Abhängigkeit von der Größe des zu reinigenden DNA-Fragments. DNA-Restriktionsfragmente wurden aus den LMP-Agarosegelen nach Sichtbarmachung mit Ethidiumbromid herausgeschnitten.
11. NASC-Reinigung:
DNA enthaltende Gelfragmente wurden bei 70°C für 5 Minuten geschmolzen und ungefähr 5fach mit TE1 (10 mM Tris-HCI, pH 7,5, 0,2 M NaCI) verdünnt. Die Gel-Lösung wurde auf eine NASC-Säule (BRL) aufgegeben. Die Säule wurde mit 5 ml desselben Puffers gewaschen. Die gebundene DNA wurde mit 300 μl TE2 (10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1,0 M NaCl) für DNA-Fragmente kleiner als 1.000 bp oder TE3 (10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 2 M NaCl) für größere Fragmente eluiert. Die eluierte DNA wurde durch Ethanolpräzipitation konzentriert.
12. DNA-Ligation:
Reaktionen für das Ligieren kohäsiver Enden enthielten: 1 mg DNA, 1 × AA-Puffer (siehe Schritt 8 oben), 1 mM ATP und 20 Units T4-DNA-Ligase (BRL) in einem Reaktionsendvolumen von 20 μl. Die Ligation lief für 16-18 Stunden bei 15°C oder 1-2 Stunden bei Raumtemperatur ab. Für stumpfendige Ligationen enthielten die Reaktionen 1 μg DNA, 25 mM Tris-HCI, pH 7,5, 5 mM MgCl₂, 5 mM DTT, 0,25 mM Spermidin, 200 mg BSA, 1 mM Hexamincobaltchlorid (HCC), 0,5 mM ATP und 400 Units T4-DNA-Ligase (NEB) und einem Reaktionsvolumen von 20 μl. Die Ligation lief für 30 Minuten bis 1 Stunde bei Raumtemperatur ab.
Bakterielle Transformationsverfahren
1. Herstellung von transformationskompetenten E. coli-Zellen:
Eine Kultur von 200 ml steriler L-Bouillon wurde mit einer kleinen Impföse voll E. coli-Zellen inokuliert. Diese wurde unter Schütteln bei 37°C inkubiert, bis die OD₆₀₀ ungefähr 0,5 betrug. Die Kultur wurde für 10 Minuten auf Eis gelegt und bei 6.000 × g für 10 Minuten zentrifugiert. Das Zellpellet wurde in 100 ml eiskaltem MgCl₂ resuspendiert, für 30-40 Minuten auf Eis gehalten und nochmals zentrifugiert. Das Pellet wurde in 2 ml eiskaltem 100 mM CaCl₂ resuspendiert und in ein steriles Teströhrchen übertragen und auf Eis für 24 Stunden inkubiert. Die kompetenten Zellen wurden dann allquotiert und bei -70°C gelagert.
2. Transformation von E. coli
Ein Aliquot der gefrorenen kompetenten Zellen wurde auf Eis aufgetaut. Zu 50 μl Zellen wurden 0,1 bis 1 μg DNA zugegeben und das Gemisch auf Eis für 30 Minuten inkubiert. Das Röhrchen wurde vom Eis entfernt und für 2 Minuten in ein 42°C-Bad gegeben. L-Bouillon (1 ml) wurde zugesetzt und das Transformationsgemisch unter Schütteln bei der gewünschten Temperatur (für gewöhnlich 30°C oder 37°C) für 2 Stunden inkubiert. Dann wurde ein Zehntel der Transformation auf L-Bouillon-Platten ausplattiert, die das geeignete Antibiotikum und es wurde, falls erforderlich, XGAL und IPTG zugesetzt.
3. DNA-Transformation von B. subtilis:
B. subtilis-Zellen wurden bis zur frühen stationären Phase gezüchtet (Änderung der Klett-Units um ≤5% in 15 Minuten). Die Transformation folgte etablierten Verfahren (Anagnostopoulos et al. (1981)) (Literaturzitat 8). Die Zellen (0,45 ml) wurden mit 1-10 μg DNA bei 37°C für 80 Minuten unter Schütteln inkubiert und dann auf TBAB-Agarplatten mit einem geeigneten Antibiotikum ausplattiert.
4. Isolierung von Plasmid-DNA aus B. subtilis:
Plasmid-DNA aus B. subtilis wurde durch ein Verfahren erhalten, das dem Verfahren alkalischer Lyse ähnlich war mit der Ausnahme, dass die pelletierten Zellen in 8 ml der Lösung 1 (50 mM Glucose, 10 mM EDTA, 25 mM Tris-HCl (pH 8,0), 10 mg/ml Lysozym) resuspendiert und bei Raumtemperatur für 30 Minuten inkubiert wurden. Dann wurden 16 ml Lösung 2 (0,2 N NaOH, 1% (w/v) SDS) zugesetzt und auf Eis für 10 Minuten inkubiert. Schließlich wurden 12 ml 3 M Kaliumacetat (pH 4,8) zugesetzt und für zusätzliche 20 Minuten auf Eis inkubiert. Die lysierten Zellen wurden 15 Minuten bei 15.000 U/min in einem Sorval SS-34-Rotor zentrifugiert. Die DNA wurde durch Zugaben eines gleichen Volumens Isopropylalkohol präzipitiert und bei 7.000 U/min zentrifugiert: Das Pellet wurde in 5 ml 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 1 mM EDTA (TE) resuspen diert. Die Lösung wurde einmal mit Phenol und mit Chloroform extrahiert. Die DNA wurde mit Ethanol präzipitiert und in 3 ml TE resuspendiert. Das Volumen wurde durch Zugabe von 4,2 g CsCl, 400 μl Ethidiumbromid mit 10 mg/ml und TE auf 5,2 ml eingestellt. Die Lösung wurde in ein Quick-Seal-Polyallomer-Zentrifugenröhrchen von Beckman transferiert und bei 45.000 U/min in einem Beckman vti65-Rotor für 18 Stunden zentrifugiert.
Antikörperherstellung, Proteinchemie und Elektrophorese der Proteine 1. Herstellung von Antikörper gegen künstlich synthetisierte Peptide: Synthetisches Peptid der Sequenz (GAGAGS)₈GAAGY wurde unter Anwendung des Glutaraldehyd-Verfahrens von Kagen und Glick (1979) an BSA gekoppelt. Das Ausmaß der Kopplung wurde durch Verwendung einer Spurenmenge radioaktiv iodierten, synthetischen Peptids überwacht. Peptidkonjugate in einer Konzentration von 1 mg/ml in komplettem Freund'schem Adjuvans wurden verwendet, im Kaninchen am Tag 0 zu immunisieren. Den Tieren wurde am Tag 30 nochmals Antigen in inkomplettem Freund'schem Adjuvans injiziert und der Titer am Tag 60 bestimmt. Positive Seren wurden unter Anwendung von Mikrotiter-RIA unter Verwendung des synthetischen Peptids als Antigen detektiert. Kagen und Glick, in: Methods of Radioimmunoassay, Jaffe und Berman (Hrsg.), Academic Press, S. 328 (1979).
Ein Peptid von 53 Aminosäuren entsprechend der SIpII-Sequenz wurde an einem Applied Biosystems-Peptidsynthesizer hergestellt. Die Ausbeute dieses Materials, das ein Molekulargewicht von 3.640 aufweist, war ungefähr 0,5 g. Das Peptid wurde an Rinderserumalbumin gekoppelt. Das Material wurde zur Herstellung von Antikörpern in Kaninchen an Antibodies Inc. verschickt. Es wurden Antisera erhalten, die sowohl mit synthetischen Peptiden der SIpI-Sequenz, als auch der SIpII-Sequenz reagierten. Diese Antisera sind für die Detektion von Fusionspeptiden, die Gly-Ala-Sequenzen enthalten, zweckdienlich gewesen.
Nach der oben beschriebenen Prozedur wurde ein Antigen synthetisiert, das die Formel (V-P-G-V-G)₈ aufwies, das an Keyhole-Limpet-Hämocyanin gekoppelt wurde. Polyklonale Antisera wurden dann wie oben beschrieben hergestellt, die an das ELP-Peptid banden.
2. Polyacrylamidgel-Elektrophorese der Proteine:
Ungefähr 10⁹E. coli-Zellen aus wachsenden Kulturen wurden durch Zentrifugation bei 10.000 × g für 5 Minuten pelletiert. Die Zellpellets wurden in 100 bis 500 μl 2X Probenpuffer (100 mM Tris-HCl, pH 6,8, 4% SDS, 10% B-Mercaptoethanol, 60% Glycerin oder Saccharose) resuspendiert und für 30 Minuten mit einem Ultraschallzertrümmerer von Tekmar ultraschallbehandelt. Die Proben wurden für ungefähr 5 Minuten aufgekocht und 20 bis 100 μl der Zelllysate wurden auf ein SDS-Polyacrylamidgel (7,5 bis 16% w/v) geladen. Die Gele wurden nach dem Verfahren von Laemmli (Nature, 227, 680-685 (1970)) hergestellt. Die Proteine in den Gelen wurden mit 2% Coomassie-Brilliant-Blue in 10% Methanol, 7,5% Essigsäure für 1 Stunde gefärbt und in 10% Methanol, 7,5% Essigsäure über Nacht entfärbt.
3. Immunoblotting der Proteine in Gelen:
Nach der Protein-Elektrophorese wurde eine der flankierenden Glasplatten von Polyacrylamidgel entfernt. Die Geloberfläche wurde mit Transferpuffer (25 mM Tris-HCl, 192 mM Glycin, 20% Methanol) befeuchtet. Ein Stück Nitrozellulosepapier (Sartorius, SM11307) wurde mit Transferpuffer gesättigt und auf das Gel gelegt. Luftblasen zwischen dem Filter und dem Gel wurden entfernt. Gel und Nitrozellulosefilter wurden wie vom Hersteller (Bio-Rad) angegeben in die Transfereinheit gegeben. Der Transfer wurde bei 200 mA für 3-4 Stunden durchgeführt. Dann wurde das Nitrozellulosefilter entfernt und mit Amidoschwarz für 3 Minuten gefärbt (0,05% Amidoschwarz, 45% entionisiertes H₂O, 45% Methanol, 10% Essigsäure) und in H₂O entfärbt. Das Filter wurde für zumindest 10 Minuten bei Raumtemperatur in „BLOTTO" (5% w/v fettfreie Trockenmilch, 50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 0,9% w/v NaCl, 0,2% w/v Natriumazid). Das Filter wurde in geeignet verdünntes (1 : 50 bis 1 : 500) Serum in 0,5X BLOTTO (2,5% fettfreie Trockenmilch, 50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 0,9% NaCl, 0,2% Natriumazid) gegeben und für ungefähr 16 Stunden bei Raumtemperatur sanft geschüttelt. Das Filter wurde für 1 Stunde 5 Mal mit TSA (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 0,9% NaCl, 0,2% Natriumazid) gewaschen. Der Blot wurde in 15 ml 0,5X BLOTTO-Lösung gegeben, die 1 × 10⁷ dpm ¹²⁵I-Protein A enthielt und für 2 Stunden bei Raumtemperatur sanft geschüttelt. Das Filter wurde für 2 Stunden zumindest 7 Mal mit TSA gewaschen, einmal mit entionisiertem H₂O gespült und luftgetrocknet. Der Blot wurde mit Saran-Folie bedeckt und autoradiographiert.
4. Aminosäureanalyse:
Aminosäurezusammensetzungen werden durch das PTC-Derivatisierungsverfahren von Henrickson und Meredith (1984) ermittelt. Die Proteinproben wurden mit 5,7 N ständig kochender HCl bei 108°C für 24 Stunden im Vakuum hydrolysiert. Nach der Reaktion mit PITC wurden die Aminosäurederivate mittels HPLC-Umkehrphasenchromatographie unter Verwendung eines 1090-Systems von Hewlett-Packard und einer Supelco C18-Säule (4,6 mm × 25 cm) mit einem linearen Gradienten von 0-50% Acetonitril in 0,1 M NHOAc, pH 6,78, als. mobile Phase bei 254 nm detektiert. R. L. Henrickson und S. C. Meredith, Amino Analysis bp Reverse Phase High Performance Liquid Chromatography, Anal. Biochem. 137, 65-74.
5. Aminosäuresequenzanalyse:
Die N-terminale Aminosäuresequenz wurde durch automatisierten Edman-Abbau mit Gasphasen-Proteinsequenzierer von Applied Biosystems, Modell 470A bestimmt. Die PTH-Aminosäurederivate wurden durch Umkehrphasen-HPLC unter Verwendung eines 1090-Systems von Hewlett-Packard und einer Altex C18-Säule (2 mm × 25 cm) mit einem komplexen Gradientenpuffersystem analysiert.
6. Peptidsynthese:
Synthetische Peptide wurden durch Festphasensynthese an einem Peptidsynthesizer von Applied Biosystems, Modell 430A hergestellt, und zwar unter Anwendung standardmäßiger, durch den Hersteller bereitgestellter symmetrischer Anhydridchemie. Die Kopplungsausbeute in jedem Schritt wurde durch das quantitative Ninhydrin-Verfahren von Sarin et al. (1981) bestimmt. Das synthetische Peptid wurde von festen Träger abgespalten und die Aminosäure-Blockgruppen mit wasserfreier HF entfernt (Stewart und Young (1984)). Die rohen Peptide wurden durch Chromatographie über Sephadex G-50 entsalzt. V. K. Sarin, S. B. H. Kent, J. P. Tam und R. B. Merrifield, Anal. Biochem. 237, 927-936 (1981). J. M. Stewart und J. D. Young, Solid Phase Peptide Synthesis, Pierce Chemical Company, Rockford, IL, S. 85-89 (1984).
DNA-Syntheseverfahren
1. In-vitro-DNA-Synthese:
Das N,N-Diisopropylphosphoramidite, Controlled-Pore-Glas-Säulen und alle Synthesereagenzien wurden von Applied Biosystems, Foster City, California erhalten.
Synthetische Oligonucleotide wurden durch das Phosphit-Triester-Verfahren mit einem DNA-Synthesizer, Modell 380A von Applied Biosystems unter Verwendung eines 10fachen Überschusses geschützter Phosphoramidite und 1 μmol an die Syntheseträgersäule gebundenes Nucleotid hergestellt. Die für die Synthese verwendete Chemie sind die für die Anwendung mit dem Synthesizer standardmäßigen Arbeitsvorschriften und sind beschrieben worden (Matteucci et al., Journal Amer. Chem. Soc. 103, 3185-3319 (1981)). Entfernung der Schutzgruppen und Abspaltung der Oligomere vom festen Träger wurden gemäß Standardverfahren durchgeführt, wie sie von McBride et al., Tetrahedron Letters 24, 245-248 (1983) beschrieben wurden. Die wiederholte Ausbeute der Synthese, die wie von Applied Systems empfohlen (1984) durch die optische Dichte der entfernten Schutzgruppe gemessen wurde, betrug mehr als 97,5%.
Das Oligonucleotid-Rohgemisch wurde wie in den Arbeitsvorschriften von Applied Sys- tems vom 9. November 1984 beschrieben (User Bulletin Nr. 13) durch präparative Gelelektrophorese gereinigt. Die Acrylamidgelkonzentration variierte von 10 bis 20% in Abhängigkeit von der Länge des Oligomers. Das gereinigte Oligomer wurde durch UV-Schattierung identifiziert, aus dem Gel herausgeschnitten und durch das Crush-and-Soak-Verfahren (Smith, Methods in Enzymology 65, 371-379 (1980)) extrahiert.
2. Sequenzierung der DNA:
DNA-Sequenzen wurden durch die folgenden Verfahren ermittelt. Die Region von Interesse enthaltenden Fragmente wurden in die multiple Klonierungsstelle von M13mp18 oder M13mp19 kloniert (Maniatis et al. (1982) und Norrander et al. (1983). Einzelsträngige DNA wurde durch das Primerextensionsverfahren (Sangen et al. (1977) und Biggin et al. (1983)) unter Verwendung von 35S-Desoxyadenosin-5'-(Alpha-thio)-triphosphat (New England Nuclear) als Marken hergestellt und sequenziert. In einigen Fällen wurde reverse Transkriptase (Molecular Genetics) verwendet, um den Primen zu verlängern, und zwar unter Anwendung der von Zagursky et al. (Gene Anal. Techn. 2, 89-94 (1985)) verwendeten Didesoxy : Desoxynucleosidtriphosphat-Verhältnisse. In diesen Reaktionen entweder mit ³²P oder mit ³⁵S markiertes Desoxyadenosintriphosphat verwendet. Kompressionsartefakte, die in manchen G-C-reichen Sequenzen auftraten, wurden überwunden, indem Desoxyguanosintriphosphat aus der G-Reaktion eliminiert und stattdessen Desoxyinosintriphosphat (P-L Biochemicals) in einer Endkonzentration von 37,5 μM verwendet wurde. In anderen Gemischen betrug die Konzentration von DidesoxyGTP in der G-Reaktion 0,5 mM. Alle Sequenzen wurden an 6 oder 8%igen Polyacrylamidgelen analysiert, die 8 M Harnstoff enthielten (Sangen et al. (1978)). Die zur Sequenzierung verwendeten Primen wurden von P-L Biochemicals bezogen. Zur Speicherung und Ana lyse von Daten wurde Software von DNAstar und International Biotechnologies Inc. verwendet.
3. In-vitro-Mutagenese klonierten DNA:
Plasmid-DNA (1 μg), welche die zu mutierende Sequenz enthielt, wurde in zwei gesonderten Reaktionen verdaut. Die eine Reaktion enthielt entweder eine oder zwei Restriktionsendonucleasen, die an die Region von Interesse unmittelbar angrenzenden Stellen spalten. In der zweiten Reaktion wurde die DNA mit einer Restriktionsendonuclease verdaut, die nur ein Mal an einer Stelle spaltet, die von der zu mutierenden Stelle weit entfernt ist. Die in der ersten Reaktion erzeugten Fragmente wurden durch Agarosegel-Elektrophorese getrennt und das große Fragment, dem die zu mutierende Stelle fehlt, wurde herausgeschnitten und gereinigt. DNA aus der zweiten Reaktion, das große DNA-Fragment aus der ersten Reaktion und ein synthetisches Oligodesoxynucleotid von 20-30 Basen Länge, das die mutierte Sequenz enthält, wurden in einem Molverhältnis von 1 : 1 : 250 gemischt. Das Gemisch wurde durch Erhitzen auf 100°C für 3 Minuten in 25 bis 100 μl 100 mM NaCl, 6,5 mM Tris-HCl, pH 7,5, 8 mM MgCl₂ und 1 mM β-Mercaptoethanol denaturiert. Das denaturierte Gemisch wurde durch schrittweise Absenken der Temperatur wie folgt renaturiert: 37°C für 30 Minuten, 4°C für 30 Minuten und 0°C für 10 Minuten. Die Reaktion wurde mit 0,5 mM Desoxyribonucleotidtriphosphaten, 1 mM ATP, 400 Units T4-DNA-Ligase und 5 Units großes Fragment der DNA-Polymerase aus E. coli ergänzt bei 15°C für 12-16 Stunden inkubiert. Das Reaktionsgemisch wurde dann in E. coli transformiert und es wurden gegen Antibiotikum resistente Zellen selektiert.
Fermentationsbedingungen
Beim Fermenten handelt es sich um einen 15 I-Chemap mit 10 I Arbeitsvolumen. Die Kulturbedingungen sind die folgenden: Temperatur – 30°C, pH = 6,8; 2,5 M NaOH wird zur pH-Regulierung verwendet. Der Gasraumdruck liegt unter 0,1 bar. Der gelöste Sauerstoff wird auf 50% geregelt. Die Belüftungsrate variiert von 0,5 I/min bis 20 I/min.
Die Rührerdrehzahl variiert zwischen 200 und 1.500 U/min.
Der Fermenten wird mit einem 10%igen (v/v) Inokulum beimpft, das für 15 Stunden bei 30°C unter Schütteln gezüchtet wurde.
Das Fermentermedium war Medium B. Das Anfangsvolumen betrug 5 1.

Als die Glucosekonzentration 1% erreichte, wurde dem Fermenten eine konzentrierte Lösung (5X) von Medium B zugesetzt, um die Glucosekonzentration auf ungefähr 1 zu halten. Als die Kultur eine OF₆₀₀ von 60,0 erreichte, wurde die Temperatur für 10 Minuten auf 42°C erhöht und dann für 2,5 Stunden auf 39°C abgesenkt. Die Zellen wurden dann durch Zentrifugation geerntet und bis zur Verarbeitung bei -70°C gelagert. Tabelle 1 Medium A: LB-Medium

Bestandteil	g/l
NaCl	10
Trypton	10
Hefeextrakt	5
Kanamycin	5 × 10-³

Medium B

Bestandteil	g/l
NH₄Cl	4,5
KH₂PO₄	0,76
MgSO₄·7H₂O	0,18
K₂SO₄	0,09
CaCl₂	24 × 10^–3
FeSO₄·7H₂O	7,6 × 10^–3
TE	0,5 ml
Casaminosäuren	25
Hefeextrakt	5
Glucose	20
Kanamycin	5 × 10^–3

Beispiel 2
Assemblierung und Expression des SIpI-Gens
1. Zusammenfassung des Schemas zur Assemblierung des Slpl-Gens
Eine 18 bp-DNA-Sequenz, die für das häufigste repetitive Oligopeptid in dem von Bombpx mori produzierten Seidenfaserprotein (F. Lucas und K. M. RudaII, Extracellular Fibrous Proteins: The Silks, in: Comprehensive Biochemistry, Bd. 26, Abschnitt B, M. Florkin und F. H. Stotz (Hrsg.), Elsevier, Amsterdam, S. 475-558 (1986)) kodiert, wurde in vitro synthetisiert. Zwei Einzelstränge wurden synthetisiert, miteinander anneliert und dann wurden die gebildeten doppelsträngigen Segmente Kopf-zu-Ende multimerisiert, um Koncatemere bis zu und mehr als 13 Wiederholungen zu erzeugen. Das Strukturgen für Seide I, mit dem die Erfinder weiterarbeiteten, wies 13 für das Oligopeptid gagags kodierende Wiederholungen auf, wobei g = Glycin, a = Alanin und s = Serin. Die Erfinder bezeichnen dieses Strukturgen als das „Monomer". Die Erfinder konstruierten „dimere, trimere, tetramere, pentamere und hexamere" SIpI-Gene, die 26 (SIpI-2), 39 (SIpI-3), 52 (SIpI-4), 65 (SIpI-5) und 78 (SIpI-6) enthielten. Es liegt eine kurze Intervening-Sequenz zwischen jeder Monomer-Einheit vor. Der Aufbau wird wie folgt dargestellt:
2. Assemblierung des „monomeren" SIpI-Strukturgens:
Die beiden oben gezeigten Einzelstränge wurden wie vorher beschrieben synthetisiert. Die Stränge wurden durch Gelelektrophorese gesondert gereinigt, mittels T4-Polynucleotidkinase phosphoryliert und dann zur Annelierung zusammengemischt. Dies lieferte die doppelsträngigen Segmente, die sich spontan Kopf-zu-Ende zu langen Koncatemeren anordneten. Die Phosphodiesterbindungen zwischen den Segmenten wurden mit T4-DNA-Ligase gebildet. Die Reaktion wurde durch Auffüllen der terminalen, kohäsiven Enden unter Verwendung des Klenow-Fragments der DNA-Polymerase 1 gestoppt. Die stumpfendige, repetitive DNA wurde dann an die HincII-REN-Stelle im Plasmidvektor pUC12 (Veiera et al., Gene 19, 259-268 (1982)) ligiert. Die ligierte DNA wurde in E. coli HB101 transformiert und die Transformanten auf ihre Fähigkeit hin selektiert, in Gegenwart von Ampicillin zu wachsen. Die DNA der potentiellen Klone wurde hinsichtlich Größe und Orientierung durch REN-Verdau und Gelelektrophorese analysiert. Die DNA-Sequenzen wurden für Isolate mit großen, richtig orientierten Inserts bestimmt. Der für die anschließende Multimerisierung gewählte „Monomer"-Klon wies 13 Wiederholungen auf, die für das Oligopeptid agagsg kodierten und wurde pSY708 genannt. DNA-Sequenz, abgeleitete Aminosäuresequenz und REN-Stellen des SIpI-Inserts und die flankierenden Regionen von pSY708 sind in Tabelle 2 gezeigt.
Tabelle 2
3. Konstruktion des Expressionsvektors pSY701:
Das Plasmid pSP65 (10 μg, Boehringer Mannheim) wurde mit AatII-REN verdaut, mit Phenol extrahiert und mit Ethanol präzipitiert. Die DNA wurde in 10 μl H₂O resuspendiert. Eine Hälfte dieser DNA wurde mit Exonuclease II im folgenden Gemisch verdaut: 5 μg DNA, 10 μl 10X Exonuclease III-Puffer (600 mM Tris-HCl, pH 8,0, 6,6 mM MgCl₂, 10 mM β-Mercaptoethanol) und 9 Units Exonuclease III in einem Gesamtvolumen von 200 μl. Proben von 20 μl wurden bei 0, 1, 2,5, 5 und 7,5 Minuten gezogen und sofort in 100 μl des folgenden Puffers verdünnt (30 mM Natriumacetat, pH 4,5, 0,25 M NaCl, 1 mM ZnSO₄), der 5 μg tRNA und 36 Units S1-Nuclease enthielt. Die Inkubation erfolgte bei 30°C für 45 Minuten und dann wurde die Reaktion durch Zugabe von 15 μl Stop-Puffer (0,5 M Tris, pH 9,0, 125 mM EDTA, 1% (w/v) SDS, 200 μg/ml tRNA) beendet. Die Proben wurden mit Phenol extrahiert und in Ethanol präzipitiert. Die resuspendierte DNA wurde mit SmaI-REN verdaut und über ein 1 %iges Gel niedrigschmelzender Agarose der Elektrophorese unterworfen. Die Gelbande, die dem das β-Lactamase-Gen tragenden DNA-Fragment, Plasmid-Ausgangspunkt und β-Galactosidase-Promotor entspricht, wurde aus dem Gel herausgeschnitten und bei 65°C geschmolzen. Ein Volumenanteil H₂O wurde zugesetzt. Die DNA in jeder Probe (Zeitpunkt) wurde durch Ligation in Gegenwart von Agarose rezirkularisiert. Die Reaktion umfasste 8 μl geschmolzenes Gel, 2 μl Ligationspuffer (100 mM Tris-HCl, pH 7,5, 50 mM MgCl₂, 50 mM DTT, 1 mM ATP), 10 Units T4-DNA-Ligase und wurde bei 15°C für 3 Stunden inkubiert. Kompetente JM101-Zellen wurden mit der ligierten DNA transformiert und Transformanten durch Wachstum auf L-Bouillon-Platten selektiert, die Ampicillin (40 μg/ ml) enthielten. Plasmid-DNA wurde aus vier Transformanten hergestellt. Die DNA wurde mit BamHI-REN, markiert mit ³²P-dGTP unter Verwendung des Klenow-Fragments von DNA-Polymerase 1 verdaut, mit Pvu verdaut und dann das kleinste Fragment mittels Gel gereinigt. Das Fragment aus einem der Transformanten wurde unter Anwendung des Verfahrens von Maxam und Gilbert sequenziert. Die Fragmente der anderen drei Plasmide wurden mit TagI weiter verdaut und am selben Gel der Elektrophorese unterworfen. Das sequenzierte Plasmid wies eine Fusion zwischen der multiplen Klonie rungsstelle und einer Position stromauf des N-terminalen ATG von β-Lactamase auf. Die Größe des BamHI-TagI-Fragments von zwei der anderen Plasmide gab eine Fusion zwischen der multiplen Klonierungsstelle und der vierten Aminosäure des (3-Lactamase-Gens zu erkennen. Die DNA und die entsprechenden Aminosäuresequenzen der N-terminalen Region der veränderten (3-Lactamase sind unten dargestellt, und zwar gemeinsam mit einer ringförmigen Karte der REN-Stellen für pSY701 (siehe 1). Die Aminosäuresequenz von 1 ist Met-Thr-Met-Ile-Thr-Pro-Ser-Leu-Gly-Cys-Arg-Ser-Thr-Leu-Glu-Asp-Pro-His-Phe-Arg-Val-Ala-Leu-Ile-Pro-Phe-Phe-Ala-Ala-Phe-Cys-Leu-Pro-Val-Phe-Ala-His.
4. Insertion von „Monomer"-SIpI aus pSY708 in pSY701:
Das Plasmid pSY708 wurde mit HindIII verdaut, die kohäsiven Enden unter Verwendung des Klenow-Fragments von Polymerase I aufgefüllt und dann mit BamHI verdaut. Das Plasmid pSY701 wurde mit Xbal verdaut, wie oben aufgefüllt und dann mit BamHI verdaut. Das DNA-Fragment pSY708 und das Gerüst von pSY701 wurden dann durch Elektrophorese über ein niedrigschmelzendes Agarosegel gereinigt und mit NACS- (BRL) Säulen gereinigt. Die geeigneten Fragmente wurden gemischt, ligiert und dann in E. coli JM109 transformiert. Transformierte Zellen wurden durch Wachstum auf L-Platten selektiert, die Ampicillin (40 mg/ml), IPTG (5 × 10^–4 M) und XGAL (20 mg/ml) enthielten. Die Transformanten wurden auf Plasmidgehalte analysiert und einer davon (pSY756) wurde für weitere Untersuchungen ausgewählt, da er das Insert der Monomer-SIpI-1-Sequenzen in richtiger Orientierung trug, wie durch Kartierung von REN-Stellen ermittelt wurde. Obgleich nicht die gesamte DNA-Sequenz für pSY756 ermittelt wurde, wurden die Verknüpfungen zwischen Insert und Vektor als die richtigen Sequenzen für Xbal stromauf und BamHI stromab verifiziert.
5. Multimerisierung des SIpI-Gens von pSY756:
Plasmid pSY708 wurde mit dem REN Smal verdaut und das DNA-Fragment, das die kodierende Sequenz für das Polypeptid Arg(Ala-Gly-Ala-Gly-Ser-Gly)₁₃Thr-Leu-Glu-Asp-Pro (R(AGAGSG)₁₃TLEDP) trug, wie oben in 4 gereinigt. Plasmid pSY756 wurde mit Smal verdaut, deproteiniert und dann mit dem gereinigten DNA-Fragment aus pSY708 ligiert. Transformanten von E. coli JM109 wurden auf Ampicillin enthaltendem Medium selektiert. Es wurde gefunden, dass die Klone 2 Einheiten (Dimer pSY882), 3 Einheiten (Trimer pSY883) und 4 Einheiten (Tetramer pSY915) der ursprünglichen Monomersequenz des pSY708-Klons enthielten. Auf ähnliche Weise sind Pentamere und Hexamere konstruiert worden. Alle dieser Plasmide sind genetisch stabil und produzieren das Gly-Ala-Peptid als Fusion mit β-Lactamase.
6. Expression der SIpI-Genfusion an das β-Lactamase-Protein:
Die Synthese des SIpI-Peptids als Fusionsprotein mit β-Lactamase in E. coli-Zellen wurde durch Immunoblotting- (Western-) Analyse detektiert. Anti-„SIp"-Antikörper wurden gegen ein synthetisches Seidenprotein hergestellt. Fusionen zwischen (3-Lactamase und SIpI wurden auch mit Antikörpern detektiert, die gegen die β-Lactamase aus E. coli hergestellt waren. Wie in 2 gezeigt, reagiert dieser Antikörper mit Dimeren und Trimeren des an die E. coli-β-Lactamase fusionierten SIpI. Das SIpI-Insert setzt die fünfte Aminosäure der Signalsequenz für dieses Enzym fort. Der β-Lactamase-Antikörper (2A) detektiert sowohl die unprozessierten Fusionsproteine, als auch das prozessierte, reife Enzym, das in dieser Figur als antigene Hauptbande an der Position von ungefähr 28 kD auftritt. Die Mobilitäten aller SIp-enthaltenden Polypeptide sind ungewöhnlich niedrig und die Proteine sind nicht so groß, wie sie an den Gelen erscheinen.
Der Anti-SIp-Antikörper ist auch für die Detektion dieser Fusionsprodukte zweckdienlich. Lanes 2-5 von 2B stellen 4 gesonderte Klone dar, die Dimerfusionen von SIpI mit β-Lactamase enthalten, während Lanes 6 und 7 von zwei Klonen stammen, die Tri merfusionen enthalten. Es ist zu erkennen, dass die Antigenität des Trimers beträchtlich höher ist als die des Dimers. Es ist aus früheren Experimenten bekannt, dass Fusionsproteine, die nur ein Monomer von SIpI enthalten, mit diesem Anti-SIp-Antikörper überhaupt nicht detektiert werden. Die erhöhte Antigenität des Trimerpeptids erlaubt dessen Detektion als eine prozessierte Fusion mit dem β-Lactamase-Signalpeptid. Die prozessierte Form ist ungefähr an der 33 kD-Position in Lanes 6 und 7 der 2B zu sehen. Das Erscheinungsbild des normal prozessierten, reifen β-Lactamase-Enzyms (detektiert mit β-Lactamase-Antikörper), sowie eines Peptids, das der Fusion zwischen dem SIpI-3-Trimer und dem Signalpeptid von (3-Lactamase (detektiert mit Gly-Ala-Antikörper) entspricht, weist darauf hin, dass trotz der Insertion von SIpI-Sequenzen innerhalb der Signalsequenz eine normale proteolytische Prozessierung des Enzyms in E. coli auftritt.
7.a. Expression des Slpl-Gens durch Fusion an T7-Gene:
Die SIpI-Sequenz ist auch als ein Fusionsprotein sowohl mit Gen 9-, als auch Gen 10-Proteinen aus dem Bakteriophagen T7 in E. coli exprimiert worden. Die Konstruktion ist in 3 als Diagramm dargestellt. Plasmid pSY915 (das SIpI-4-Tetramer enthaltend) wurde mit REN SaII vollständig und mit BamHI teilweise verdaut. Das das SIpI-4-Tetramer enthaltende DNA-Fragment wurde gereinigt und dann in Plasmid pSY114 (pG2 von Promega Biotech) kloniert, das mit den RENs SaII und BamHI verdaut worden war. Aus diesem Intermediär-Plasmid wurde das Tetramer-Insert von SIpI mit den RENS AccI und EcoRI entfernt. Dieses Fragment wurde dann in pSY633 (pBR322, die vollständige T7-Gen-9-Sequenz enthaltend; pAR441 von Studier et al (1986)) kloniert, das mit EcoRI und AsuII verdaut wurde. In das gebildete Plasmid wird das SIpI-Tetramer an das Gen-9-Translationsleseraster nahe dem C-Terminus von Gen 9 fusioniert. Dieses Plasmid wird dann verwendet, um den E. coli-Stamm 0-48 (Stamm HMS174 (λDE3) von Studier et al. (1986)) zu transformieren, der das unter transkriptioneller Kontrolle des IPTG-induzierbaren (3-Galactosidase-Promotors in das Chromosom insertierte T7-RNA-Polymerase Gen enthält. In dieser Konfiguration hängt die Expression der SIpI-4-Sequenz von der Produktion der T7-RNA-Polymerase ab, die ihrerseits durch den IPTG-induzierbaren (3- Galactosidase-Promotor kontrolliert ist. Wie in 4B und 4C gezeigt ist, wird bei Induktion dieser Zellen mit IPTG ein Proteinprodukt des Gen-9/SIpI-4-Fusionsgens synthetisiert, das mit Antikörper gegen synthetisches SIp-Peptid detektiert wird. Das Fusionsprodukt wandert im Gel, als ob es eine Größe von 82 kD aufweisen würde. Die erwartete Größe beträgt nur 65 kD. Die abnormale Mobilität ist für die ungewöhnliche Aminosäurezusammensetzung (reich an Glycin und Alanin) charakteristisch und wird für alle SIp-enthaltenden Produkte beobachtet.
Auf ähnliche Weise wurde Plasmid pSY638 (pAR2113 von Studier), das die Promotorregion und die ersten 13 Aminosäuren des T7-Gen-10-Proteins enthält, mit REN BamHI verdaut, mit dem Klenow-Fragment von DNA-Polymerase aufgefüllt und dann mit REN EcoRI verdaut. In dieses linearisierte Plasmid wurde das AsuII-EcoRI-Fragment von pSY-633 kloniert, welches das SIpI-4-Tetramer enthält. Diese Ligation erzeugt eine In-Frame-Fusion des Seiden-Tetramers im Anschluss an die dreizehnte Aminosäure von T7-Gen-10. Das letztere Fusionsprodukt kann ohne weitere Prozessierung für das Spinnen verwendet werden, da die N-terminalen 13 Aminosäuren nur einen kleinen Teil des großen SIpI-Proteins ausmachen. Obgleich das Fusionsprodukt ungefähr 30 kD groß ist, weist es eine abnormale Mobilität auf und wandert, als ob es größer (50 kD) wäre. Dies ist in 4A gezeigt.
Die Plasmide pG9/SIpI-4 und pG10/SIpI-4 wurden durch Insertieren eines Kanamycin-Resistenzgens in das β-Lactamase-Gen in entgegengesetzter Orientierung zum T7-Expressionssystem weiter verbessert. Folglich führt jegliche Niedrigexpression aus dem T7-System nicht zu erhöhter β-Lactamase-Aktivität. Eine solche Aktivität eliminierte das Ampicillin im Medium, das zugesetzt wurde, um auf die Erhaltung des Plasmids zu selektieren. als das Ampicillin erschöpft war, gingen die Plasmide aus der Kultur verloren. Das Kanamycin-Resistenzgen umgeht dieses Problem und stellt eine signifikante Verbesserung des T7-Expressionssystems dar, insbesondere für Kulturen in großem Maßstab. Das Kanamycin-Resistenzgen (ursprünglich aus Tn903) wurde aus einem Plasmid pUC4K (J. Veira, ). Messing, Gene 19, 259-268 (1982)) isoliert und war ein HincII-Fragment.
7.b. Fermentation und Reinigung von SIpI-4:
Der pSY997 tragende E. coli-Stamm 0-48 wurde bei 37°C unter Verwendung eines Chemap- oder Braun-Fermenters in 10 l LB auf eine OD (Klett-Einheiten) von 300 (3 × 10⁹ Zellen/ml) gezüchtet. Das T7-System wurde dann durch Zugabe von 3,5 mM IPTG induziert. Nach 150 Minuten wurden die Zellen unter Verwendung einer Millipore-Filtrationseinheit (Pellicon-Kassettensystem, Filter mit Molekulargewichts-Cutoff 100.000) 10x konzentriert. Die Zeltsuspension wurde dann bis zur weiteren Verarbeitung bei –70°C eingefroren.
Die Zeltsuspension wurde in einem Wasserbad bei 42°C aufgeschmolzen und in einer French-Presse lysiert und das Lysat bei 125.00 × g für 1 Stunde bei 25°C zentrifugiert. Der geklärte Überstand wurde mit DNAase (250 μm/ml) für 15 Minuten bei Raumtemperatur behandelt und dann durch ein 0,45 μm-Sterilfilter filtriert. Das Filtratvolumen wurde gemessen und in Eis unter langsamem Rühren inkubiert. Dann wurden 231 mg Ammoniumsulfat für jeden ml Filtrat über einen Zeitraum von 45 Minuten zugesetzt. Ein ml NaOH für jede 10 g Ammoniumsulfat wurde zugesetzt, um den pH zu neutralisieren. Nach 2 Stunden ununterbrochenem Rühren wurde das Gemisch bei 9.000 × g für 10 Minuten zentrifugiert. Das Pellet wurde in 1/10 des ursprünglichen Filtratvolumens mit destilliertem Wasser resuspendiert. Die Zentrifugation und Resuspendierung wurde drei Mal wiederholt. Das Pellet wurde in 1/10 des ursprünglichen Filtratvolumens mit Wasser destilliertem resuspendiert. Proben wurden dann hinsichtlich Proteinkonzentration, Aminosäurezusammensetzung und Proteinsequenz durch Standardverfahren analysiert. Dies ist eines von mehreren Verfahren zum Erlangen des Produkts. Das Verfahren liefert ein SIpI-4-Produkt, das zu mehr als 90% rein ist. Die Aminosäurezusammensetzung ist wie erwartet fast gänzlich Gly, Ala und Ser, und die N-terminale Aminosäuresequenz ist jene des Gen-10-Leaders.
8. Kontrollierte Expression des T7-RNA-Polymerase-Gens in Bacillus subtilis:
Die kodierende Sequenz des T7-RNA-Polymerase-Gens (T7-Gen 1, T7-Nucleotide 3128 bis 5845) aus Plasmid pSY558 (pAR1151 von Studier et al. (1986)) wurde durch In-vitro-Mutagenese klonierten DNA modifiziert. Die Erfinder insertierten die Erkennungssequenz für die Restriktionsendonuclease Ndel an Position 3171. Unter Verwendung eines Oligonucleotids, das wir früher beschrieben synthetisiert wurde, wurde die T7-Gen-1-Sequenz von ihrer natürlichen Sequenz TAAATG zur modifizierten Sequenz CATATG abgeändert.
Auf ähnliche Weise wurde die Stromauf-Regulationssequenz des Bacillus subtilis-Gens spoVG, erhalten aus Plasmid pCB1281 (Rosenblum et al., J. Bacteriol. 148, 341-351 (1981)) durch In-vitro-Mutagenese an Position 85 (Johnson et al., Nature 302, 800-804 (1983)) modifiziert, so dass sie auch eine Ndel-Spaltstelle umfasste. Die Stromauf-Regulationssequenzen des spoVG-Gens wurden dann mit der kodierenden Sequenz des T7-RNA-Polymerase-Gens auf dem Wege über diese neuen NdeI-Spaltstellen ligiert. Nach Transformation von E. coli HB101 wurden die Plasmidgehalte der einzelnen Ampicillinresistenten Isolate durch Restriktionskartierung überprüft. Die korrekte Konstruktion wurde pSY649 genannt.
Plasmid-DNA, die das spoVG:T7-RNA-Polymerase-Fusionsgen (pSY649) enthielt, wurde in der Weise weiter modifiziert, dass es ein Chloramphenicol-Resistenzgen umfasste, das in B. subtilis funktionstüchtig ist. Zuerst wurde das NdeI-nach-SaII-Fragment von ungefähr 1.200 Basenpaaren aus Plasmid pGR71-P43 (Goldfarb et al., Nature 293, 309-311 (1981)) isoliert. Dieses Fragment trägt den P43-Promotor von B. subtilis und ein benachbartes Chloramphenicol-Acetyltransferase-Gen aus Tn9. Nach Auffüllen aller kohäsiven Enden unter Anwendung der Klenow-DNA-Polymerase-Reaktion wurde dieses Fragment in die Xbal-Stelle innerhalb der multiplen Klonierungsstelle von pUC13 insertiert (Veiera et al., Gene 19, 259-268 (1982)). Ampicillin- und Chloramphenicol-resistente Transformanten wurden für die weitere Verwendung selektiert. Die korrekte Plasmid konstruktion wurde pSY630 genannt. Das SmaI-nach-HincII-Endonuclease-Spaltfragment aus Plasmid pSY630, welches das an die P43-Promotorsequenz fusionierte Chloramphenicol-Acetyltransferase-Gen enthielt, wurde Gel-gereinigt und stumpf endend an die PvuI-Stelle von Plasmid pSY649 ligiert, das vorher mit T4-DNA-Polymerase behandelt worden war. Das gebildete Plasmid pSY856 wurde dann in B. subtilis I168 transformiert. Da Plasmid pSY856 nicht in der Lage ist, in B. subtilis autonom zu replizieren, müssen gegen Chloramphenicol resistente Transformanten aus der Integration des Plasmids in das B. subtilis-Genom resultieren (Ferrari et al., ). Bacteriology 154, 1513-1515 (1983)). Der durch homologe Rekombination erleichterte Integrationsvorgang trat höchstwahrscheinlich entweder an den spoVG-, oder an den P43-Loci des bakteriellen Chromosoms auf (pSY856 enthält DNA-Sequenzen, die nur an diesen beiden Stellen zum B. subtilis-Chromosom homolog sind). Der resultierende Stamm „BIPoL" wurde in Gegenwart sowie Abwesenheit von Chloramphenicol gezüchtet, um die Stabilität des selektierbaren Markers zu ermitteln. Die Expression der T7-Polymerase wurde erreicht und dies hatte keine ersichtliche Wirkung auf das Wachstum oder die Lebensfähigkeit dieses Stammes.
9.a. Expression eines Plasmid-übertragenen Target-Gens (Kanamycin-Resistenz) in B. subtilis-Stamm PIPoL:
Das Plasmid pUB110 aus Staphylococcus aureus (Lacey et al., J. Med. Microbiology 7, 285-297 (1974)), welches das für die Resistenz gegen das Antibiotikum Kanamycin kodierende Gen enthält, wurde verwendet, um die Expression des wachstumsregulierten spoVG:T7-RNA-Polymerase-Gens von Stamm B1PoL zu testen. Ein EcoRl-BamHI-Fragment der Phagen-T7-DNA (Positionen 21.402 bis 22.858), das die T7-Gen-9-Promotorsequenz enthält, wurde aus Plasmid pAR411 (Studier et al. (1986)) gereinigt. Das DNA-Fragment wurde zwischen die EcoRI- und BamHI-Restriktionsendonucleasestellen in pUB110 ligiert. Das resultierende Plasmid pSY952 enthält den T7-spezifischen Promotor in derselben Orientierung wie das Kanamycin-Resistenzgen. Plasmid pSY952 wurde in B. subtilis I168 und B1PoL transformiert und diese Stämme wurden hinsichtlich des Ex pressionslevels des durch das Kanamycin-Resistenzgen kodierten Polypeptids analysiert. Ungefähr 10⁹ Zellen aus wachsenden Kulturen von I168, pUB110 enthaltendem 1168, pSY952 enthaltendem I168, BIPoL, pUB110 enthaltendem BIPoL und pSY952 enthaltendem BIPoL wurden zu mehreren Zeitpunkten während des Wachstums- und Sporulationszyklus erhalten. Die Proteine in diesen Zellproben wurden verarbeitet und durch Polyacrylamidgel-Elektrophorese analysiert.
Da die Geschwindigkeit der Transkription aus dem spoVG-Promotor als Funktion der Zelldichte ansteigt und während der frühen Sporulation ein Maximum erreicht, wird im pSY952 enthaltendem BIPoL-Stamm eine beschleunigte Akkumulierung des Target-Proteins während des Wachstums erwartet, sowie die Kultur in die Sporulationsphase eintritt. Die Ergebnisse zeigen, dass ein Protein mit einem Molekulargewicht von 34 Kilodalton in großer Menge zunimmt, sowie sich die Kultur der stationären Phase annähert und in diese eintritt. Die Größe des Proteins steht im Einklang mit der vorhergesagten Größe des in pSY952 kodierten Kanamycin-Resistenzgen-Produkts (Sadaie et al., J. Bacteriology 141, 1178-1182 (1980)). Dieses Protein ist in B1PoL und 1168, die pSY952 enthalten, dem das spoVG-regulierte T7-RNA-Polymerase-Gen fehlt oder in B1PoL, der pUB110 enthält, dem die T7-Prmotorsequenz fehlt, nicht vorhanden. Der maximal akkumulierte Target-Protein-Level nach 24 Stunden Wachstum betrug in pSY952 enthaltendem B1 PoL 20% des gesamten Zellproteins, wie durch Densitometrie ermittelt wurde.
9.b Expression von SIpI-4 in B. subtilis:
Plasmid pG10S1p1 wurde mit REN EcoRI verdaut. Nach Auffüllen der kohäsiven Enden unter Anwendung der Klenow-DNA-Polymerase-Reaktion wurde die DNA mit REN BgIII verdaut. Plasmid pSY662 wurde mit den RENS Smal und BamHI verdaut. Die beiden Plasmide wurden dann durch Elektrophorese durch ein niedrigschmelzendes Agarosegel und mit NACS- (BRL) Säulen gereinigt. Das DNA-Fragment von pG10S1 pl wurde an das Gerüst von pSY662 ligiert und in Ampicillin (40 μg/ml) enthaltenden E. coli transfor miert. Die Transformanten wurden auf Plasmidgehalte hin analysiert und einer davon (pSY662/G10/SIpI-4) wurde für weitere Untersuchungen ausgewählt.
Kompetente Zellen von B. subtilis BIPo1 wurden mit pSY662/G10/SIpI-4 transformiert und bei 37°C unter Schütteln für 90 Minuten inkubiert: Das Transformationsgemisch wurde dann 1 : 100 in frischem, 10 μg/ml Tetracyclin enthaltendem LB verdünnt und unter Schütteln bei 37°C inkubiert. Es wurden Proben gezogen und eine gleiche Anzahl von Zellen lysiert und auf Gele zur Trennung durch SDS-PAGE geladen. Immunoblotting-Analyse wurde unter Verwendung von Anti-SIp-Antikörpern durchgeführt, um die Synthese des Gen-10/SIpI-4-Fusionsproteins zu detektieren.
Die Expression des SIpI-4-Polypetids in B. subtilis wurde durch dessen Seroreaktivität mit Anti-SIp-Antikörper nach Transfer der Zellproteine von Polyacrylamidgel auf ein Nitrocellulosefilter detektiert. Die Erfinder verifizierten, dass das seroreaktive Protein das Produkt des SIpI-4-Gens war, indem sie die Zellproteine erschöpfend mit CNBr behandelten. Dies sollte hinter den Methioninresten spalten, da jedoch dem SIpI-4 Methionin fehlt, bleibt es intakt. Die CNBr-Behandlung eliminierte mehr als 98% der mit Coomassie-Farbstoff färbbaren Proteine. Und wie für ein Protein, dem Methionin fehlt, zu erwarten ist, blieb SIpI-4 intakt und reagierte nach wie vor mit Anti-SIp-Serum.
Beispiel 3
Assemblierung und Expression des SIpIII-Gens
1. Zusammenfassung des Schemas zur Assemblierung des SIpIII-Gens:
Das synthetische SIpIII-Gen kodiert für ein Protein ähnlich dem SIpI-Gen und der kristallinen Region des von der Seidenraupe Bombpx mori produzierten Seidenfaserproteins. SIpIII ist dem Seidenfaserprotein ähnlicher, da es die Aminosäure Tyrosin in regelmäßigen Abständen (ungefähr 50 Reste) umfasst, was für Multimere von SIpI nicht der Fall ist. Das SIpIII-Gen wurde aus kleineren Teilen assembliert. Zuerst wurden drei doppelsträngige DNA-Abschnitte von ungefähr 60 bp Länge chemisch synthetisiert. Jeder Abschnitt wurde durch Insertion in den Bakteriophagen M13 kloniert und die DNA-Sequenz verifiziert. Diese Abschnitte wurden dann aus dem Vektor entfernt und in spezieller Reihenfolge miteinander ligiert. Diese Verknüpfung von ungefähr 180 bp wird SIpIII-„Monomer" genannt. „Monomere" wurden dann in spezieller Reihenfolge verbunden, um Dimere, Trimere, Tetramere usw. von SpIIII zu liefern. Die Multimere wurden dann entweder direkt in Plasmidexpressionsvektoren kloniert, um das SIpIII-Protein zu detektieren, oder sie wurden anfänglich in ein Adapter-Plasmid kloniert. Die Insertion der SIpIII-DNA in den Adapter erlaubt die weitere Genmanipulation und wird später ausführlicher beschrieben. Das Assemblierungsschema wird wie folgt dargestellt:
Die DNA und die entsprechenden Aminosäuresequenzen der drei Abschnitte des SIpIII-Gens sind in Tabelle 3 gezeigt.
Tabelle 3
Die doppelsträngige DNA-Sequenz ist in Richtung 5' nach 3' gezeigt. Die von der Sequenz kodierten Aminosäuren (g = Glycin, a = Alanin, s = Serin, y = Tyrosin) sind unmittelbar unter jedem Abschnitt gezeigt. Erkennungssequenzen für die Spaltung durch Restriktionsendonucleasen sind oberhalb jedes Abschnitts gezeigt.
Die obigen sechs Einzelstränge wurden synthetisiert. Nach der Synthese wurden die DNA-Stränge gereinigt und die homologen Stränge wurden anneliert. Ungefähr 1 μl (0,5 μg) jedes Stranges wurde mit 2 μl 10X AA- (Beschreibung) Puffer und 16 μl sterilisiertem, entionisiertem H₂O in einem 1,5 ml-Eppendorf-Röhrchen aus Polypropylen gemischt. Das Röhrchen wurde für 10 Minuten in ein siedendes Wasserbad (500 ml in einem 1 I-Becherglas) gegeben und dann wurde das Becherglas von der Heizplatte entlernt und auf dem Labortisch auf Raumtemperatur abkühlen gelassen. Dies erforderte ungefähr 1-2 Stunden.
Jeder dieser drei doppelsträngigen Abschnitte wurde getrennt in M13mp18 kloniert. Abschnitt 1 wurde zwischen die SmaI- und BamHI-Restriktionsstellen der multiplen Klonierungsstelle ligiert. Abschnitt 2 wurde zwischen die BamHI- und PstI-Stellen ligiert. Und Abschnitt 2 wurde zwischen die PstI- und HindIII-Stellen insertiert. Die entsprechenden Klone sind: M13mp18.1, M13mp18.2, M13mp18.3. Die DNA-Sequenz wurde für jeden klonierten Abschnitt ermittelt. Ein Repräsentant jedes Abschnitts, der die korrekte DNA-Sequenz aufwies, wurde gewonnen und wurde zum Material für den nächsten Schritt: Assemblierung des „Monomers".
3. Assemblierung des „Monomers" von SIpIII:
Die DNA-Abschnitte 2 und 3 wurden durch Verdau der M13-Klone mit Restriktionsenzymen isoliert: für Abschnitt 2 wurde M13mp18.2 mit BamHI und Pstl verdaut; für Abschnitt 3 wurde M13mp18.3 mit PstI und HindIII verdaut. Die beiden Abschnitte wurden gereinigt und in äquimolaren Mengen mit M13mp18.1 gemischt, das vorher mit BamHI und HindIII verdaut worden war. T4-DNA-Ligase wurde zugesetzt, um die ho mologen, überlappenden Enden in der Reihenfolge 1-2-3 zu verbinden. Wegen der Hybridisierungsspezifität der kohäsiven Enden werden die drei Abschnitte nur in dieser Reihenfolge effizient verbunden. Die DNA-Sequenz des klonierten „Monomers" im M13mp18.1.2.3 genannten Verband wurde als korrekt und wie oben in 2 gezeigt ermittelt.
4. Multimerisierung des „Monomers" von SIpIII:
Um große Mengen des „Monomer"-Strukturgens herzustellen, subklonierten die Erfinder zunächst das „Monomer" in den Plasmidvektor pUC12. M13mp18.1.2.3 wurde mit den Restriktionsenzymen EcoRI und HindIII verdaut. Die erhaltene Plasmid-DNA wurde aufbereitet, das „Monomer" vom Vektor durch Verdau mit BanI-REN freigesetzt und das Fragment Gel-gereinigt.
Um Multimere zu erzeugen, wurde „Monomer"-DNA mit BanI-Enden durch Ligation verbunden. Die nicht palindrome, terminale BanI-Restriktionssequenz erlaubt die Verknüpfung nur in der Reihenfolge Kopf-zu-Ende. Das Ausmaß der Multimerisierung wird durch Gelelektrophorese und Färbung der DNA mit Ethidiumbromid beobachtet. Multimere von mehr als 20 Einheiten sind durch dieses Verfahren erhalten worden.
5. Klonierung der Multimere von SIpIII:
Plasmid pCQV2 (Queen et al., J. Appl. Mol. Gen. 2, 1-10 (1983)) wurde mit den Restriktionsendonucleasen EcoRI und BamHI verdaut, und ein Fragment von ungefähr 900 kb wurde gereinigt. Dieses DNA-Fragment enthält das Repressor-Gen des Bakteriophagen Lambda cI-875, den nahe daran gebundenen rechten Promotor P_R, und den Anfang des cro-Gens. Plasmid pSY335 (beschrieben als pJF751 in Ferrari et al., J. Bacteriology 161, 556-562 (1985)) wurde mit den Restriktionsenzymen EcoRI und BamHI verdaut und anschließend an das DNA-Fragment von ungefähr 900 bp von pCQV2 ligiert. Das aus der Konstruktion erhaltene Plasmid pSY751 exprimiert das β-Galactosidase-Gen bei 37°C und 42°C, nicht jedoch bei 30°C (8).
Bei diesem Ansatz wird das SIpIII-Gen zuerst in eine „Adapter"-Sequenz in ein Intermediär-Plasmid kloniert und dann zu den Expressionssystemen subkloniert. Die Adaptersequenz weist die folgenden zweckdienlichen Eigenschaften auf: eine einzigartige zentrale BanI-REN-Stelle, drei einzigartige REN-Stellen an beiden Seiten von BanI, Informationskodierung zur Proteinspaltung an den Aminosäuren Methionin, Aspartat, Prolin oder Arginin und geringe Größe. Die BanI-Stelle ist die Stelle der Insertion für die SIpIII-Multimere mit BanI-Enden.
Der Adapter wurde mit dem Synthesizer 380A von Applied Biosystems synthetisiert, in M13mp18 kloniert und die DNA-Sequenz verifiziert. Der Adapter wurde dann in einen speziell konstruierten Plasmidvektor subkloniert, dem BanI-REN-Stellen fehlten. Das Empfängerplasmid wurde wie folgt hergestellt. Plasmid pJH101 (Ferrari et al. (1983)) wurde mit dem Restriktionsenzym AhaIII teilweise verdaut und religiert. Transformanten von E. coli HB101 wurden auf Chloramphenicol (12,5 mg/ml) enthaltendem Medium selektiert. Nach der Restriktionsanalyse mehrerer Isolate wurde ein Plasmid, pSY325 (7) ausgewählt. Dieses Plasmid enthält nur das Chloramphenicol-Resistenzgen und den Replikationsstartpunkt (aus pBR322) von pJH101. Nach vollständigem Verdau mit XhoII wurde pSY325 mit dem Gel-gereinigten Adapter ligiert. Das Ergebnis war das Adapter-Plasmid pSY937 und dessen neue REN-Stellen wurden verifiziert.
Die SIpIII-Multimere wurden in die BanI-Stelle von pSY937 kloniert (7). Positive Klone wurden durch Kolonie-Hybridisierung und mit dem unteren Strang des Abschnittes 1 von SIpIII als DNA-Sonde für die Hybridisierung identifiziert (Sonden-Sequenz in Tabelle 2 gezeigt). Positive Klone wurden durch Gelelektrophorese auf die Größe des insertierten Multimers hin charakterisiert. Schließlich wurden die SIpIII-Sequenzen unter Verwendung der REN-Stelle in den flankierenden Adapterregionen in die speziellen Orte der Expressionsplasmide subkloniert.
Das c-Protein wies die folgende Aminosäurezusammensetzung auf:
(fm) soll das Initiationscodon darstellen.
SIpIII-Expressionsvektor
Plasmid-DNA pSY1086 ist ein pSY937-Derivat, das 19 Wiederholungen des SIpIII (3,5 kb) enthält. Diese Plasmid-DNA wurde mit Nrul und PvuII verdaut und die Fragmente wurden mittels Agarosegel-Elektrophorese getrennt. Das gereinigte SIpIII-Multimer wurde dann in das mit PvuIII-REN verdaute Plasmid pSYY751 kloniert. Mehrere Klone wurden analysiert und einer davon (pSY1008) zur Verwendung in Expressionsexperimenten und für die SIpIII-Reinigung ausgewählt.
Das Ampicillin-Medikament-Resistenzgen von Plasmid pSY1008 wurde mit dem Kanamycin-Marken aus pSY1010 (hergestellt durch Verdau von pSY633 mit Dral und Sspl und Insertion von Kan^R, erhalten durch HincII-Verdau von pUC4K) substituiert und das folgende Plasmid pSY1186 genannt. Durch Entfernen des SIpIII-Teils von Plasmid pSY-1186 mit BanI wurde ein neues Plasmid, pSY1262 erzeugt. Dieses Plasmid enthält eine einzigartige BanI-Stelle, die eine direkte Ligation Fragmenten erlaubt, die BanI-Enden enthalten, die durch Polymerisation von Monomeren erhalten wurde. Dieses Plasmid ist verwendet worden, um Plasmide zu erzeugen, die Inserts für die folgenden Proteine enthalten: SELP1, 2, 3 und SIp4.
Produktion und Reinigung von SIpIII
Zellkultur
E. coli werden im folgenden Medium kultiviert:

g/l

Hefeextrakt 20

Casaminosäuren 20

Pepton 20

Gelatine-Pepton 20

KH₂PO₄ 2

K₂HPO₄ 2

Na₂HPO₄·7H₂O 2

Glucose 2

Ampicillin 0,1
Eine Kultur über Nacht (500 ml bis 1 l), die bei 30°C gezüchtet worden ist, wurde verwendet, um 375 l Medien zu inokulieren, die in einem 500 I-Fermenten enthalten waren. Die Fermenterbedingungen umfassten eine Drehzahlmesser-Anzeige von 100 U/min, Gefäß-Gegendruck von 5 psi und eine Belüftungsrate von 170 I/min, um den gelösten Sauerstoff auf über 50% zu halten.
Glucose (1 g/l) und Ampicillin (0,05 g/l) wurden der Fermentation zugegeben, als die Kultur eine OD₆₅₀ von 1,0 erreichte und nochmals bei 2,0. Als die Kultur eine OD₆₅₀ von 2,0 erreichte, wurde die Temperatur für 10 Minuten auf 42°C erhöht und dann für 2 Stunden auf 38°C abgesenkt. Die Kultur wurde dann auf 10°C gekühlt und die Zellen durch Zentrifugation in einer kontinuierlichen Zentrifuge geerntet und bis zur weiteren Verarbeitung bei -70°C eingefroren. Die Ausbeuten aus zwei gesonderten Fermentationen betrugen 7,3 kg und 5,2 kg Feuchtgewicht von Zellen.
Es sollte angemerkt werden, dass andere Medien verwendet werden und mit unterschiedlichen Plasmiden zahlreiche Selektionsbedingungen aufgezwungen werden können (z. B. Ersatz von Ampicillin- durch Kanamycin-Selektion). Diese Bedingungen sind bei Labormaßstab-Fermentationen (10 l Volumen) verwendet worden.
Zelllyse
Verfahren 1. Die Zellen wurden aufgetaut und auf eine Konzentration von 1 kg Feuchtgewicht/ 6 l in 50 mM Tris-HCl, pH 7,0, 1 mM EDTA suspendiert und mittels 2 Passagen durch ein APR-Gaulin-Zellaufschlussgerät bei 8.000 psi aufgebrochen. Während dieser Lyse-Prozedur werden die Zellen mit einem Eisbad kalt gehalten. Das Zelllysat wird dann bei 26.000 × g mit einer kontinuierlichen Zentrifuge, wie z. B. den T2-28-Rotor in einer bei 4°C betriebenen SorvalI RC5B Kühlzentrifuge zentrifugiert. Unter diesen Bedingungen finden sich mehr als 90% des produzierten SIpIII im Pellet. Der Überstand enthält geringe Mengen Produkt, das durch NH₄SO₄-Präzipitiation wie unten beschrieben rückgewonnen werden kann.
Verfahren 2. Gefrorene Zellen werden aufgetaut und auf eine Konzentration von 1 kg Feuchtgewicht/ 6 l in 50 mM Tris-HCl, pH 7,0, 10 mM EDTA und 5 mM PMSF (zur Inhibierung von Protease-Aktivität) suspendiert. Die Zellen werden in diesem Puffer bei Raumtemperatur für 0,5 bis 2 Stunden gerührt, dann mit Lysozym in einer Konzentration von 1 g/l versetzt und die Inkubation für 20 Minuten fortgesetzt. β-Mercaptoethanol wird dann auf 70 mM zugesetzt und dann wird das Tensid NP40 in einer Endkonzentration von 1% für 20 Minuten bei gleichzeitigem kontinuierlichem Rühren der Zellsuspension zugesetzt. Dann wird MgCl₂ auf 50 mM zugesetzt, gefolgt von DNAase in einer Konzentration von 1 mg/l und die Inkubation wird bei Raumtemperatur für 2 Minuten fortgesetzt. Das Zelllysat wird dann wie in Verfahren 1 bei 26.000 × g in einer kontinuierlichen Zentrifuge zentrifugiert und der Überstand gesammelt und ein zweites Mal durch die kontinuierliche Zentrifuge bei 26.000 × g passiert. Der aus dieser zweiten Zentrifugation erhaltene Überstand enthält < 5% des gesamten SIpIII, jedoch kann die ses mit NH₄SO₄ wie unten beschrieben rückgewonnen werden. Die aus der 1. und 2. Zentrifugation bei 26.000 × g erhaltenen Pellets werden vereinigt und mit LiBr wie unten beschrieben extrahiert.
Verfahren 3. Für dieses Verfahren wird ein Stamm von E. coli verwendet, der ein zweites Plasmid enthält, das für das T7-Phagen-Lysozym kodiert. Dieses Plasmid ist mit dem Plasmid kompatibel, das für das SIpIII-Gen und die Medikamentenresistenz-Determinante kodiert. Der Stamm wird im selben Medium und unter denselben Bedingungen wie in den ersten beiden Verfahren gezüchtet. Jedoch ist ihre Zellwand wegen der Produktion des T7-Lysozyms innerhalb der Zellen geschwächt und sie können bei Beendigung der Fermentation durch Zusatz von EDTA auf > 100 mM und NP40 auf eine Konzentration von 0,5 bis 1,0% (v/v) leicht lysiert werden. Die Lyse kann auch durch Zusatz von Chloroform (20 ml pro Liter) zur Fermentationsbrühe anstelle von NP40 erzielt werden. Alternativ dazu können die Zellen vor der Lyse durch Zentrifugation gesammelt, auf 1 kg Feuchtgewicht/ 6 l in Tris-HCl wie in den ersten beiden Verfahren beschrieben resuspendiert und dann durch Zugabe von NP40 oder Chloroform lysiert werden. Im Anschluss an die Lyse durch irgendeines der Verfahren wird das Lysat in einem kontinuierlichen Rotor bei 26.000 × g wie bei den ersten beiden Verfahren beschrieben zentrifugiert. Wie mit diesen Verfahren werden LiBr-Extraktion des Pellets und NH₄SO₄-Präzipitation angewendet, um das Produkt zu gewinnen.
Reinigung von SIpIII
Das durch Zentrifugation bei 26.000 × g wie oben beschrieben erhaltene Pellet wird mit einem gleichen Volumen 9 M LiBr extrahiert. Die Salzlösung wird zugesetzt und das Pellet durch Rühren bei Raumtemperatur (RT) gleichmäßig suspendiert. Das Gemisch wird nach Erhalten einer gleichmäßigen Suspension für 1 Stunde bei RT gerührt. Das Gemisch wird dann bei 26.000 × g in einer kontinuierlichen Zentrifuge bei 4°C oder RT zentrifugiert, um eine Pellet- und eine Überstand-Fraktion zu erhalten. Der Überstand wird aufbewahrt und das Pellet nochmals mit einem weiteren gleichen Volumen 9 M LiBr wie oben extrahiert. Nach dem Mischen für 1 Stunde wird das Gemisch bei 26.000 × g zentrifugiert und der Überstand aus dieser Zentrifugation mit dem Überstand aus der ersten LiBr-Extraktion vereinigt und über Nacht bei 4°C stehengelassen. Ungefähr 90% des im Zelllysat-Pellet bei 26.000 × g enthaltenen SIpIII wird bei Anwendung dieses Verfahrens durch LiBr extrahiert.
Nach dem Stehen lassen des LiBr-Extrakts über Nacht bei 4°C bildet sich ein Präzipitat, das durch Zentrifugation bei 26.000 x g entfernt und verworfen wird. Der Überstand wird dann in Dialysebeutel gegeben und gegen dH₂O für mehrere Tage dialysiert, wobei das dH₂O mehrmals ausgetauscht wird. Sowie das LiBr durch Dialyse entfernt wird, präzipitiert das SIpIII-Produkt in den Dialysebeuteln. Das Präzipitat wird durch Zentrifugation gesammelt und 2-3 Mal mit dH₂O gewaschen. Das endgültige, gewaschene Produkt wird zentrifugiert und durch Lyophilisierung getrocknet.
Zur Rückgewinnung von SIpIII aus den 26.000 g-Überstandfraktionen wird die NH₄SO-₄ Präzipitiation angewendet. Festes NH₄SO₄ wird langsam der Probe zugesetzt, die bei 4°C gehalten wird bis eine Sättigung von 38% (231 g/l) erreicht ist. Das Gemisch wird dann bei 4°C für 2-3 Stunden gerührt. Das Präzipitat wird durch Zentrifugation in einer kontinuierlichen Zentrifuge gewonnen und 4–5 Mal mit einem gleichen Volumen destillierten Wassers oder 0,5% SDS in H₂O gewaschen. Nach jedem Waschvorgang wird das Präzipitat durch kontinuierliche Zentrifugation rückgewonnen. Das Pellet wird mit aufeinander folgenden Waschvorgängen zunehmend weiß, sowie kontaminierendes Protein entfernt wird. SIpIII wird als ein gewaschenes Pellet gewonnen und kann durch Lyophilisierung getrocknet werden.
Trypsin-Behandlungsschritt von SIpIII
SIpIII wurde in 50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 0,1 M NaCl-Puffer suspendiert und in ein Wasserbad mit 37°C gegeben und TPCK-behandeltes Trypsin wurde in die Suspension eingemischt. Die Endkonzentration des Trypsins betrug 0,1%. Nach 3 Stunden wurde die Lösung für 15 Minuten bei 16.000 × g zentrifugiert, das Pellet zuerst mit der Hälfte des Volumens 0,5% SDS in H₂O, dann mit destilliertem Wasser gewaschen. Nach jedem Waschvorgang wurde das Pellet durch Zentrifugation rückgewonnen. Das Endprodukt wurde in Wasser resuspendiert und für die weitere Analyse bei 4°C gehalten.
Mit der Trypsin-Behandlung wurde SIpIII auf 99,4% Reinheit gereinigt.
Physikalische Messungen von SIpIII
Physikalische Messungen der gereinigten seidenähnlichen Proteine sind mit jenen von Bombpx mori-Seide verglichen worden, um festzustellen, dass die repetitiven, mikrobiologisch hergestellten Aminosäurepolymere die Eigenschaften natürlich auftretender Polymere exakt nachahmen. Physikalische Messungen wurden durchgeführt, um das Modell der Antiparallelketten-Faltblattstruktur für die kristallinen Regionen des Bombpx mori-Seidenfibroins (Marsh, Corey und Pauling, Biochem. Biophys. Acta 15 (1955); Pauling und Corey, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 39, 247 (1953)) zu bestätigen. Die vorläufige Analyse der Röntgenstrahlenbeugungsmuster, die von SIp-Filmen erhalten wurden, stimmen mit jenen überein, die von Fraser, MacRai und Steward (1966) beschrieben worden sind (Tabelle 4). Die spektroskopische Analyse von SIpIII mittels Zirkulardichroismus(CD-) und Fouriertransformations-Infrarot- (FTIR-) Spektroskopie ist mit einem hohen Anteil von gestreckten β- und β-Wendel-Konformationen konsistent. Vergleiche der von SIpIII erhaltenen Spektren mit jenen von natürlich auftretendem Seidenfibroin in verschiedenen Lösungsmitteln (Isuka und Young, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 55, 1175 (1966)) wiesen darauf hin, dass SIpIII in Lösung aus einem Gemisch der in Seidenfibroinen beobachteten, zufälligen und höchst geordneten Strukturen besteht.
Tabelle 4
Beschrieben von Fraser et al., J. Mol. Biol. 19, 580 (1966).
Beispiel 4
EBSI-Gen-Konstruktion:
Sechs Oligonucleotidstränge wurden wie früher beschrieben synthetisiert und gereinigt.
Die Oligonucleotidstränge (iii), (iv), (v) und (vi) wurden anneliert und mit der DNA von Plasmid pBSm1 3(+) (Stratagene) ligiert, das mit HindIII und EcoRI verdaut worden war. Die Produkte dieser Ligationsreaktion wurden in E. coli-Stamm JM109 transformiert. Die Transformantenkolonien wurden auf Resistenz gegen Ampicillin hin selektiert. Die Kolonien wurden auf ihre Fähigkeit hin gescreent, mit ³²P-markierten Oligonucleotiden (iii), (v) zu hybridisieren. Plasmid-DNA aus mehreren positiv hybridisierenden Klonen wurde gereinigt und sequenziert. Zwei der Plasmide, pSY1292 und pSY1293, enthielten die für die Oligonucleotide (iii), (v) und (iv), (vi) gezeigte Sequenz. Diese Sequenzen enthielten alle der in diesen synthetischen Oligonucleotiden vorhandenen Nucleotide bis auf eines. Ein G:C-Basenpaar fehlte an Position 7 (iii). Das Fehlen des Basenpaares 1 blockierte eine der BanI-Stellen. Um eine zweite BanI-Stelle am 5'-Ende des Gen-Fragments einzuführen, wurden die Oligonucleotide (i) und (ii) anneliert und mit Plasmid pBSm13(+) ligiert, das mit HindIII und EcoRI verdaut worden war. Plasmid-DNA aus den gegen Ampicillin resistenten Transformantenkolonien wurde gereinigt. Zwei Plasmide, pSY1295 und pSY1296, die mit Stul verdaubar waren, einer einzigartigen, in der Oligonucleotidsequenz vorhandenen Stelle, wurden sequenziert. Von beiden wurde gezeigt, dass sie die für die Oligonucleotide (i) und (ii) gezeigte Sequenz enthalten. Plasmid-DNA aus pSY1292 wurde hintereinander mit HindIII, SI-Nuclease und EcoRI verdaut. Die Verdauprodukte wurden durch Elektrophorese in einem Agarosegel getrennt und das DNA-Fragment von ungefähr 150 Basenpaaren aus dem Gel herausgeschnitten. Dieses DNA-Fragment wurde mit der Plasmid-DNA pSY1296 verdaut, die mit Stul und EcoRI verdaut worden war. Die Produkte dieser Ligationsreaktion wurden in E. coli-Stamm JM109 transformiert und auf Resistenz gegen Ampicillin selektiert. Kolonien wurden auf Hybridisierung an ³²P-markiertes Oligonucleotid (v) hin gescreent. Die Plasmid-DNA aus zwei positiv hybridisierenden Klonen wurde gereinigt und sequenziert. Diese Plasmide wurden pSY1297 und pSY1298 genannt. Sie enthielten die folgende Sequenz:
EBSI-Multimer-Gen-Assemblierung:
Das BanI-Akzeptor-Plasmid pSY937 wurde modifiziert, um terminate, kohäsive BanII-DNA-Fragmente zu akzeptieren. Zwei Oligonucleotide wurden zu diesem Zweck synthetisiert.
1
Die Oligonucleotide (vii) und (viii) wurden anneliert und mit Plasmid-DNA pSY937 ligiert, die mit BamHI verdaut worden war. Die Produkte dieser Ligation wurden in E. coli-Stamm JM109 transformiert und Kolonien auf Resistenz gegen Chloramphenicol selektiert. Transformantenkolonien wurden durch Hybridisierung an ³²P-markiertes Oligo nucleotid (vii) gescreent. Plasmid-DNA aus zwei positiv hybridisierenden Klonen, pSY-1299 und pSY1300 enthielt die für die Oligonucleotide (vii) und (viii) gezeigte Sequenz, wie durch DNA-Sequenzierung gezeigt wurde.
Plasmid-DNA pSY1298 wurde mit BanII verdaut und die Verdaufragmente durch Agaro-Segel-Elektrophorese getrennt. Das EBSI-Gen-Fragment von ungefähr 150 Basenpaaren wurde herausgeschnitten und durch Elektro-Eluierung und Ethanolpräzipitation gereinigt. Ungefähr 1 μg des gereinigten Fragments wurde mit sich selbst ligiert, um Multimere im Größenbereich von 450 bp bis 6.000 bp herzustellen. Die Produkte der Selbst-Ligation wurden dann mit Plasmid-DNA pSY1299 ligiert, die mit BanII verdaut worden I war. Die Produkte dieser Ligationsreaktion wurden in E. coli-Stamm HB101 transformiert. Transformanten wurden auf Resistenz gegen Chloramphenicol selektiert. Plasmid-DNA aus einzelnen Transformanten wurde gereinigt und auf Größenzunahme aufgrund von EBSI-Multimer-DNA-Insertionen hin analysiert. Zehn Klone (pSY1240-1249) mit Inserts im Größenbereich von 1,5 Kbp bis 4,4 Kbp wurden erhalten.
Expression des EBSI-Multimer-Gens:
Einer dieser Klone, pSY1248, der ein EBSI-Multimer-Gen von 4 Kb enthielt, wurde in den λP_R-Expressionsvektor pSY751 subkloniert. Plasmid-DNA aus pSY1248 wurde mit Nrul und PvuII verdaut, durch Agarosegel-Elektrophorese gereinigt und die dem EBSI-Multimer-Gen entsprechende DNA-Bande herausgeschnitten und durch NACS-Reinigung gereinigt. DNA aus dem Plasmid pSY751 wurde mit PvuII verdaut und mit dem NruI-PvuII-Fragment aus pSY1248 ligiert. Die Produkte dieser Ligation wurden in E. coli HB101 transformiert und die Transformanten auf Resistenz gegen Ampicillin gescreent. Zwei Klone wurden isoliert, die das neue Plasmid pSY1280 enthielten. pSY1280 enthaltende E. coli-Zellen wurden bei 30°C auf eine OD₆₀₀ von 0,7 gezüchtet und dann für 1,5 Stunden auf 42°C geshifted. Die von diesen Zellen produzierten Proteine wurden durch SDS-PAGE analysiert. Die getrennten Proteine wurden auf Nitrocellulosepapier transferiert und durch Immunreaktivität mit Anti-ELP-Kaninchenserum detektiert. Eine stark reaktive Bande mit einem scheinbaren Molekulargewicht von 120 kD wurde beobachtet.
Das Ampicillin-Medikament-Resistenzgen von pSY1280 wurde durch den Kanamycin-Marker ersetzt und das folgende Plasmid pSY1332 genannt. Diese Plasmid wurde in der Fermentation für die Reinigung von EBSI verwendet (siehe Verfahren).
Reinigung des EBSI-Proteins:
Der das Plasmid pSY1280 enthaltende E. coli-Stamm HB101 wurde in einem Volumen von 10 l fermentiert. Die Zellen wurden durch Filtration konzentriert und durch Zentrifugation weiter geerntet. Die pelletierten Zellen wurden eingefroren bei –70°C bis zur weiteren Verwendung gelagert. Eingefrorene Zellen wurden auf Eis aufgetaut und in 4 ml 50 mM Tris-HCl, pH 7,0, 10 mM EDTA, 5 mM PMSF pro Gramm Zellfeuchtgewicht r suspendiert. Die Zellen wurden in einer French-Presse zweimal bei 15.000 psi aufgebrochen und dann auf 0°C gekühlt. Das Roh-Lysat wurde durch Zentrifugation bei 26.000 × g für 20 Minuten geklärt. Die Proteine im Überstand wurden durch Zugabe von festem Ammoniumsulfat auf 20% Sättigung (114 g/l) präzipitiert. Das Präzipitat wurde durch Zentrifugation bei 10.000 x g für 10 Minuten gesammelt. Das Pellet wurde in 10 ml H₂O resuspendiert und gegen 10 mM Tris, pH 8,0, 0,15 M NaCl bei 4°C dialysiert. Die dialysierte Lösung wurde mit 0,1% Trypsin (Sigma) für 1,5 Stunden bei Raumtemperatur verdaut und wieder mit 20% Ammoniumsulfat präzipitiert. Das präzipitierte Protein wurde in H₂O resuspendiert und gegen 10 mM Tris, pH 7,0, 1 mM EDTA bei 4°C dialysiert. Die Protein-Reinheit dieser Probe aufgrund der Aminosäurezusammensetzung mit 83% ermittelt.
Elastische Eigenschaften des EBSI-Proteins:
Das lösliche Präparat des teilweise gereinigten, oben beschriebenen EBSI-Proteins wurde bei 37°C für 30 Minuten inkubiert und bei 10.000 x g für 10 Minuten bei Raumtemperatur zentrifugiert. Diese Behandlung bewirkte, dass das EBSI-Protein aggregierte, unlöslich wurde und sich als durchsichtiger Feststoff niederschlug. Der Feststoff war gegen mechanisches Zerreißen durch Vortexen oder Mazeration mit einem Glasstab beständig.
Der Feststoff konnte mit einer Rasierklinge in Streifen geschnitten werden und wies einen hohen Elastizitätsgrad auf. Sie behielten nach wiederholter Dehnung und Entspannung ihre Form vollauf bei. Sie widersetzten sich einem Stauchen ohne ersichtliche irreversible Deformation der Struktur.
EBSI-Reinigung
Eine EBSI-Probe (–70% Reinheit) wurde in 50 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, pH 8,0 bei 4°V über Nacht mit einem Pufferwechsel dialysiert. Im Falle einer beobachteten Präzipitation wurde die Probe bei 27.000 × g für 15 Minuten bei 4°C zentrifugiert. Alle übrigen Schritte wurden bei 4°C durchgeführt. Der Überstand wurde auf eine DEAE-Sephacel-Säule aufgegeben, die mit 50 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, pH 8,0 äquilibriert worden war. Die EBSI enthaltenden Fraktionen wurden gesammelt und gepoolt. Den gepoolten Fraktionen aus der DEAE-Sephacel-Säule wurde NaCl zugesetzt, um eine Endkonzentration von 2 M NaCl in der Probe zu erhalten. Unlösliches Material wurde durch Zentrifugation bei 27.000 × g für 20 Minuten entfernt. Der Überstand wurde dann auf eine Phenyl-Sepharose-Säule geladen, die mit 50 mM Natriumphosphatpuffer, pH 7,0, mit 2 M NaCl äquilibriert war. Die Säule wurde gründlich mit Puffer gewaschen, bis bei A₂₈₀ kein eluierendes Protein mehr detektiert wurde. Die Säule wurde dann schrittweise mit 50 mM Natriumphosphatpuffer, pH 7,0, und schließlich mit Wasser eluiert. Die aktiven EBSI-Fraktionen wurden gepoolt und für die weitere Analyse bei 4°C gelagert.
Mit der Aufnahme dieser Schritte in die vorhergehenden Verfahren wurde 100% reines EBSI erhalten.
Beispiel 5
ELPI-Konstruktion und Expression
Zwei Oligonucleotidstränge wurden synthetisiert und wie im Anschnitt über die Verfahren beschrieben gereinigt.
Die beiden Oligonucleotidstränge wurden anneliert und mit der DNA von Plasmid pBS 13(+) (Stratagene) ligiert, die mit den RENs HindIII und EcoRI verdaut worden war.
Die Produkte dieser Ligationsreaktion wurden in E. coli-Stamm JM109 transformiert. Transformantenkolonien wurden auf ihre Hybridisierung mit ³²P-markiertem Oligonucleotid (i) hin gescreent. Plasmid-DNA aus positiv hybridisierenden Klonen wurde gereinigt und sequenziert. Ein Plasmid, pSY1287, enthielt die für Oligonucleotid (i) und (ii) gezeigte Sequenz.
Plasmid-DNA aus pSY1287 wurde mit der REN BanI verdaut und die Verdaufragmente durch Agarosegel-Elektrophorese getrennt. Das ELPI-Gen-Fragment von ungefähr 60 kb wurde herausgeschnitten und mittels NACS-Säule gereinigt. Ungefähr 1 μg des gereinigten Fragments wurde mit sich selbst ligiert, um Multimere im Größenbereich von 300 bp bis 5.000 bp herzustellen.
Die Produkte der Selbst-Ligation wurden dann mit der Plasmid-DNA pSY937 ligiert, die mit der REN BanI verdaut worden war. Das Produkt dieser Ligationsreaktion wurde in E. coli-Stamm HB101 transformiert. Transformanten wurden auf Resistenz gegen Chloramphenicol selektiert. Plasmid-DNA aus einzelnen Transformanten wurde gereinigt und auf Größenzunahme aufgrund der multiplen ELPI-DNA-Insertionen hin analysiert. Vier Klone (pSY1388-1391) mit Inserts im Größenbereich von 1,0 kbp und 2,5 kbp wurden erhalten. Diese Klone wurden in den λP_R-Expressionsvektor pSY751 subkloniert. Die erhaltenen Klone (pSY1392-pSY1395) wurden zur Expression von ELPI verwendet.
Das ELPI-Protein wies die folgenden Aminosäurezusammensetzung auf:
SELP1-Gen-Konstruktion und Expression
Zwei Oligonucleotidstränge wurden synthetisiert und wie im Abschnitt über die Verfahren beschrieben gereinigt.
Diese Oligonucleotidstränge wurden anneliert und mit Plasmid pSY1304 (ligiert, das mit der REN Pstl verdaut worden war (pSY1304 unterscheidet sich von pSY857 durch das Aufweisen einer monomeren Einheit anstelle der trimeren Einheit von pSY857). Plasmid-DNA aus gegen Chloramphenicol resistenten Transformantenkolonien wurde gereinigt. Ein Plasmid, pSY1365, das mit der REN SnaBI verdaubar war, wurde sequenziert und erwies sich als korrekt.
Das wie beschrieben gereinigte ELPI-Gen-Fragment (ELPI-Konstruktion und Expression) wurde wie vom Lieferanten (Stratagene) beschrieben mit Mung-Bean-Nuclease behandelt. Das Gemisch der DNA-Fragmente wurde dann mit Plasmid-DNA pSY1365 ligiert, die hintereinander mit den RENs FspI, SnaBI und Kälberdarm-Phosphatase verdaut worden war. Die Produkte dieser Ligationsreaktion wurden in E. coli-Stamm HB101 transformiert und auf Resistenz gegen Chloramphenicol selektiert. Plasmid-DNA aus einzelnen Transformanten wurde gereinigt und auf die ELPI-Monomer-DNA-Insertion hin analysiert. Zwei Plasmide, pSY1366 A und B wurden sequenziert. Von beiden konnte gezeigt werden, dass sie die ELPI-DNA-Sequenz in korrekter Orientierung enthielten.
Die Plasmid-DNA pSY1366 wurde mit der REN BanI verdaut und das das SELP1-Monomer enthaltende DNA-Fragment Gel-gereinigt. Um Multimere zu erzeugen, wurde 1 μg des SELP1-DNA-Fragments mit sich selbst ligiert. Es wurden Multimere einer Größe im Bereich von 500 bp bis 10 kbp erhalten. Die SELP1-Multimere wurden in die BanI-Stelle von pSY1262 kloniert. Positive Klone wurden durch Gel-Elektrophorese auf die Größe des insertierten Multimers hin charakterisiert und für die Expression und Proteinanalyse verwendet.
SELP2-Monomerkonstruktion
Plasmid-DNA pSY1298 wurde mit der REN BanII verdaut und das EBSI-Genfragment wie früher beschrieben gereinigt. Das EBSI-Monomerfragment wurde in pSY1304 (pSY937, ein Monomer von SIpIII enthaltend, konstruiert als pSY857) ligiert, das mit der REN BanII verdaut und mit Kälberdarm-Phosphatase behandelt worden war.
Die Produkte des Ligationsgemisches wurden in E. coli-Stamm HB101 transformiert. Transformanten wurden auf Resistenz gegen Chloramphenicol selektiert. Nach der Restriktionsanalyse mehrerer Isolate wurde ein Plasmid, pSY1301 ausgewählt, das ein dem EBSI-Monomer-Gen entsprechendes DNA-Fragment enthielt.
SELP2-Multiple Gen-Assemblierung und Expression
Plasmid-DNA pSY1301 wurde mit der REN BanI verdaut und das das SELP-„Monomer" enthaltende DNA-Fragment Gel-gereinigt. Um Multimere zu erzeugen, wurde 1 μg des SELP2-DNA-Fragments mit sich selbst ligiert. Es wurden Multimere erhalten, die größer als 12 kb waren.
Die SELP2-Multimere wurden in die BanI-Stelle von pSY1262 kloniert. Positive Klone wurden durch Gelelektrophorese auf die Größe des insertierten Multimers hin charakterisiert. Die Klone mit Inserts einer Größe im Bereich von 1,5 kb bis 11 kb wurden ausgewählt. Plasmid-DNA pSY1372, die ein Insert von 6 kb (18 Wiederholungen) enthielt, wurde für die weitere Analyse und Proteinreinigung verwendet.
SELP2-Proteinreinigung
Der Plasmid pSY1372 enthaltende E. coli-Stamm HB101 wurde gemäß dem in den Fermentationsverfahren beschriebenen Verfahren fermentiert. Die Zellen wurden durch Zentrifugation geerntet. Die pelletierten Zellen wurden bis zur weiteren Verarbeitung bei –70°C gefroren gelagert, Gefrorene Zellen wurden auf Eis aufgetaut und in 4 ml 50 mM Tris-HCl, pH 7,0, 10 mM EDTA, 5 mM PMSF pro Gramm Zellfeuchtgewicht suspendiert. Die Zellen wurden ein Gaulin-Zellaufschlussgerät bei 8.000 psi durchlaufend aufgebrochen. Das Roh-Lysat wurde durch Zentrifugation bei 26.000 × g für 20 Minuten geklärt. Der Überstand, der > 75% des SELP2-Proteins enthielt, wurde durch Zugabe von 20% Ammoniumsulfat (114 g/l präzipitiert. Das Präzipitat wurde durch Zentrifugation bei 10.000 × g für 10 Minuten gesammelt. Das Pellet wurde in 10 ml H₂O resuspendiert und gegen 10 mM Tris, pH 8,0, 0,15 M NaCl bei 4°C dialysiert. Das dialysierte Material wurde bei 26.000 × g für 15 Minuten zentrifugiert, um die unlösliche Proteinfraktion zu sammeln, die ungefähr 10% des SELP2-Proteins enthielt. Dieses unlösliche Proteinpellet wurde zweimal in 0,2% SDS bei 50°C für 30 Minuten unter gelegentlichem Schütteln gewaschen. Das unlösliche Protein wurde jedes Mal durch Zentrifugation bei 26.000 × g für 15 Minuten gesammelt, gefolgt von einem Waschvorgang mit 50% Ethanol. Das endgültige Proteinpellet wurde in Wasser resuspendiert und durch Western-Blot-Analyse und hinsichtlich der Aminosäurezusammensetzung analysiert. Mittels Western-Blot scheint die Größe des SELP2-Proteins homogen und mit dessen hohem Molekulargewicht (> 150 kd) übereinstimmend zu sein. Aufgrund der Analyse der Aminosäurezusammensetzung ist das SELP2-Präparat zu 80% rein und das beobachtete Aminosäuren-Molverhältnis (Ser : Gly : Pro : Val : Tyr) stimmt mit derjenigen Zusammensetzung sehr genau überein, die aus der in pSY1373 vorhandenen SELP2-Sequenz vorhergesagt wurde.
SELP3-Konstruktion und Expression
Die Plasmid-DNA pSY1301 wurde minder REN Haell teilweise verdaut und die Verdaufragmente durch Agarosegel-Elektrophorese getrennt. Die größeren DNA-Fragmente wurden herausgeschnitten und mittels NACS-Säule gereinigt. Die gereinigten Fragmente wurden mit sich selbst ligiert, die Ligationsreaktion wurde bei 70°C für 15 Minuten erhitzt, um die T4-DNA-Ligase zu inaktivieren und letztendlich mit der REN PstI verdaut. Das Verdaugemisch wurde dann in E. coli-Stamm JM109 transformiert. Transformanten wurden auf Resistenz gegen Chloramphenicol selektiert. Plasmid-DNA aus einzelnen Transformanten wurde gereinigt und analysiert hinsichtlich: (1) Resistenz gegen REN Pstl; und (2) Deletion des 60 bp-HaeII-Fragments, das innerhalb des SELP2-Gen-Fragments enthalten ist. Ein Klon (pSY1377) erfüllte beide Anforderungen. Plasmid-DNA pSY1377 wurde mit REN BanI verdaut und das das SELP3-Monomer enthaltende DNA-Fragment Gel-gereinigt. Um Multimere zu erzeugen, wurde 1 μg des SELP3-DNA-Fragments mit sich selbst ligiert. Es wurden Multimere einer Größe im Bereich von 500 bp bis 10 kbp erhalten. Die SELP3-Multimere wurden in die BanI-Stelle von pSY1262 kloniert. Positive Klone wurden durch Gel-Elektrophorese hinsichtlich der Größe des insertierten Multimers charakterisiert und für die Expression und Proteinanalyse verwendet.
SLP4 – Konstruktion und Expression
Die Plasmid-DNA pSY1304 (pSY857 mit einer einzigen monomeren Einheit im Unterschied zur trimeren Einheit von pSY857) wurde mit der REN Haell teilweise verdaut und die Verdaufragmente durch Agarosegel-Elektrophorese getrennt. Die größeren DNA-Fragmente wurden herausgeschnitten und mittels NACS-Säule gereinigt. Die gereinigten Fragmente wurden mit sich selbst ligiert, die Ligationsreaktion wurde bei 70°C für 15 Minuten erhitzt; um die T4-DNA-Ligase zu inaktivieren und letztendlich mit REN Pstl verdaut. Das Verdaugemisch wurde dann in E. coli-Stamm JM109 transformiert. Transformanten wurden auf Resistenz gegen Chloramphenicol selektiert. Plasmid-DNA aus einzelnen Transformanten wurde gereinigt und analysiert hinsichtlich: (1) Resistenz gegen REN Pstl; und (2) Deletion des 60 bp-Haell-Fragments, das innerhalb des SELP2-Gen-Fragments enthalten ist. Ein Klon (pSY1378) erfüllte beide Anforderungen. Plasmid-DNA pSY1378 wurde mit REN BanI verdaut und das das SLP4-Monomer enthaltende DNA-Fragment Gel-gereinigt. Um Multimere zu erzeugen, wurde 1 μg des SLP4-DNA-Fragments mit sich selbst ligiert. Es wurden Multimere einer Größe im Bereich von 300 bp bis 6 kbp erhalten. Die SLP4-Multimere wurden in die BanI-Stelle von pSY1262 kloniert. Positive Klone wurden durch Gel-Elektrophorese hinsichtlich der Größe des insertierten Multimers charakterisiert und für die Expression und Proteinanalyse verwendet.
Wie aus den obigen Ergebnissen erwiesen ist, können höchst repetitive Sequenzen hergestellt und für die Expression verwendet werden, um eine breite Vielfalt von Produkten herzustellen, die natürliche Produkte, wie z. B. Seiden- und andere Proteine und Antigene nachahmen. Zusätzlich werden neue Systeme für die Kontrolle der Expression des Peptids unter induzierbaren Bedingungen in einer Vielzahl von Wirten bereitgestellt. Auf diese Wiese können neue proteinische Produkte bereitgestellt werden, die neue Eigenschaften liefern oder die Eigenschaften natürlich auftretender Produkte nachahmen.
Literaturliste

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Alle Publikationen und Patentanmeldungen, die in dieser Patentschrift erwähnt sind, sind Beispiele für das Qualifikationsniveau des Fachkundigen, den diese Erfindung betrifft.
Da nun die Erfindung vollständig beschrieben ist, wird dem Fachkundigen offensichtlich sein, dass daran im Rahmen des Schutzumfangs der angefügten Ansprüche viele Änderungen und Modifikationen vorgenommen werden können.

Claims

Verfahren zum Synthetisieren einer rekombinanten DNA-Sequenz, die für ein Protein mit zumindest etwa 10 kDal kodiert, wobei das Protein Grundeinheiten aus 4 bis 30 Aminosäuren umfasst, wobei jede Grundeinheit zumindest drei verschiedene Aminosäuren und zumindest zwei derselben Aminosäure aufweist, wobei das Verfahren folgende Schritte umfasst: (a) das Herstellen einer monomeren DNA-Sequenz, die unterschiedliche Nucleotidsequenzen umfasst, die, basierend auf Codon-Redundanz, jeweils für zwei oder mehr derselben Grundeinheiten eines Faserproteins kodieren; und (b) das Multimerisieren der monomeren DNA-Sequenz, um die rekombinante DNA-Sequenz bereitzustellen.
Verfahren nach Anspruch 1, worin der Schritt des Herstellens der monomeren DNA-Sequenz das Verbinden unterschiedlicher DNA-Sequenzen umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, worin die monomere DNA-Sequenz in einem Klonierungsvektor hergestellt wird und vor der Multimerisation durch Restriktionsenzym-Verdau aus dem Klonierungsvektor ausgeschnitten wird.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin der Schritt des Herstellens einer monomeren DNA-Sequenz die Schritte des Synthetisierens unterschiedlicher doppelstrangiger DNA-Sequenzen und deren Klonierung in jeweilige Klonierungsvektoren umfasst.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin der Schritt des Herstellens der monomeren DNA-Sequenz den Schritt des aufeinander folgenden Bindens weiterer dieser Nucleotidsequenzen an einen 5'- oder 3'-Terminus einer der vorherigen Nucleotidsequenzen umfasst.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, das den Schritt des Sequenzierens der monomeren DNA-Sequenz vor der Multimerisation umfasst.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, das den Schritt des Sequenzierens der unterschiedlichen Nucleotidsequenzen vor dem Schritt der Herstellung der monomeren DNA-Sequenz umfasst.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin das Monomer überstehende Termini aufweist, die zueinander komplementär sind.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin das kodierte Protein eine Grundeinheit aus GVGVP oder SGAGAG umfasst.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin das kodierte Protein etwa 15 kDal aufweist.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin die Grundeinheiten 4 bis 25 Aminosäuren lang sind.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin die Grundeinheiten 4 bis 8 Aminosäuren lang sind.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin zumindest 25 der Grundeinheiten dieselben sind.
Verfahren nach Anspruch 13, worin zumindest 40% der Grundeinheiten dieselben sind.
Verfahren nach Anspruch 14, worin zumindest 60% der Grundeinheiten dieselben sind.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin nicht mehr als 95 der Grundeinheiten dieselben sind.
Verfahren nach Anspruch 16, worin nicht mehr als 90% der Grundeinheiten dieselben sind.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin unterschiedliche Monomere, die jeweils für unterschiedliche Aminosäure-Grundeinheiten kodieren, multimerisiert werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 17, worin ein Monomer, das für unterschiedliche Aminosäure-Grundeinheiten kodiert, multimerisiert wird.
Verfahren zur Herstellung eines Proteins mit zumindest etwa 10 kDal, das eine Grundeinheit eines Faserproteins aus 4 bis 30 Aminosäuren umfasst, wobei das Verfahren die Schritte des Einführens einer rekombinanten DNA-Sequenz, die nach einem Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche hergestellt wurde, in eine Wirtszelle und des Züchters der Wirtszelle, um das Protein dadurch zu exprimieren, umfasst.
Verfahren zur Herstellung eines Expressionsvektors, der für ein Protein mit zumindest 10 kDal kodiert, das Grundeinheiten aus 4 bis 30 Aminosäuren umfasst, wobei das Verfahren folgenden Schritt umfasst: das Insertieren einer DNA-Sequenz, die nach einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 19 hergestellt wurde, in einen Expressionsvektor, der für die Expression in einem Expressionswirt funktionell ist.
Verfahren zur Herstellung eines Expressionswirts, der zur Produktion eines Proteins mit zumindest 10 kDal fähig ist, das Grundeinheiten aus 4 bis 30 Aminosäuren umfasst, wobei das Verfahren folgenden Schritt umfasst: das Einführen eines nach einem Verfahren nach Anspruch 21 hergestellten Expressionsvektors in den Expressionswirt.
Verfahren zum Produzieren eines Proteins mit zumindest 10 kDal, das Grundeinheiten aus 4 bis 30 Aminosäuren umfasst, wobei das Verfahren folgenden Schritt umfasst: das Züchten eines nach dem Verfahren nach Anspruch 22 hergestellten Expressionswirts, um dadurch das Protein zu exprimieren.
Verfahren nach Anspruch 20 oder 23, das den weiteren Schritt des Isolierens des so exprimierten Proteins umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 20 bis 24, worin die rekombinante DNA-Sequenz in ein Strukturgen der Wirtszelle oder einen Vektor eingeführt wird.