DE60023860T2

DE60023860T2 - Verfahren zur herstellung von rekombinanten peptiden

Info

Publication number: DE60023860T2
Application number: DE60023860T
Authority: DE
Inventors: D. Marc BETTER; D. Patrick GAVIT
Original assignee: Xoma Technology Ltd USA
Current assignee: Xoma Technology Ltd USA
Priority date: 1999-03-18
Filing date: 2000-03-17
Publication date: 2006-08-03
Anticipated expiration: 2020-03-18
Also published as: ES2253212T3; EP1165782B1; EP1165782A1; DE60023860D1; AU3758700A; WO2000055322A1; CA2365697A1; US20020009781A1; ATE309353T1; US7749731B2; NZ514230A; US6500648B1; US20090246831A1; JP2002538824A; AU782359B2; CA2365697C; US7247454B2; US6242219B1; US20030194782A1

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich allgemein auf verbesserte Verfahren zur Herstellung rekombinanter Peptide aus Bakterienzellen.
STAND DER TECHNIK
Obwohl sich bioaktive Peptide chemisch durch eine ganze Reihe verschiedener Synthesestrategien herstellen fassen, bietet die Herstellung rekombinanter Peptide, einschließlich der Peptide, die aus 5 bis 50 Aminosäuren bestehen, die Möglichkeit einer Produktion in großem Maßstab, und das zu vernünftigen Kosten. Allerdings ist die Expression sehr kurzer Polypeptidketten in mikrobiellen Systemen, wie z.B. in den Zellen des Bakteriums Escherichia coli, mitunter sehr problematisch. Dies gilt auch dann, wenn die Peptidsequenz als Teil eines Fusionsprotein exprimiert wird. Peptide, die Teil von Fusionsproteinen sind, können in spezifischen zellulären Bestandteilen exprimiert werden, wie z.B. in Zytoplasma, in Periplasma oder in Kulturmedium, um eine möglichst hohe Ausbeute zu erzielen und um zelluläre Abbauprozesse zu vermeiden.
Die Herstellung eines Peptids aus einem Fusionsprotein in reiner Form erfordert es, dass das Peptid über einen Mechanismus aus dem Fusionsprotein freigesetzt und rückgewonnen wurde, um es anschließend über eine Isolierung oder Aufreinigung zu erhalten. Verfahren zur Aufspaltung von Fusionsproteinen sind beschrieben worden. Jedes Verfahren erkennt dabei eine chemische oder enzymatische Spaltungsstelle, die das Trägerprotein mit dem gewünschten Protein oder Peptid verknüpft [Forsberg et al., I. J. Protein Chem. 11, 201–211, (1992)]. Chemische Spaltungsreagenzien erkennen im Allgemeinen einzelne oder paarige Aminosäurereste, die sich an mehreren Stellen auf der Primärsequenz befinden können; von daher sind sie für die Freisetzung großer Peptide oder Proteindomänen, die mehrere interne Erkennungsstellen aufweisen, nur von begrenztem Nutzen. Allerdings können die Erkennungsstellen für die chemische Aufspaltung an den Verbindungsstellen der kurzen Peptide und und den Trägerproteinen von Nutzen sein. Zu chemischen Spaltungsreagenzien zählen etwa Cyanogenbromid, das an den Methioninresten aufspaltet [Piers et al., Gene, 134, 7, (1993)], N-Chlorsuccinimid [Forsberg et al., Biofactors 2, 105–112, (1989)) oder BNPS-Skatol [Knott et al., Eur. J. Biochem. 174, 405–410, (1988); Dykes et al., Eur. J. Biochem. 174, 411–416, (1988)), das an den Tryptophanresten aufspaltet, Dünnsäure, die an den Aspartyl-Prolyl-Bindungen aufspaltet [Gram et al., Biol Technology 12, 1017–1023, (1994); Marcus, Int. J. Peptide Protein Res., 25, 542–546, (1985)), und Hydroxylamin, das bei einem pH von 9,0 an den Asparagin-Glycin-Bindungen aufspaltet [Moks et al., Biol Technology 5, 379–382, (1987)].
Von Interesse ist das US-Patent Nr. 5.851.802, in dem eine Reihe von Expressionsvektoren rekombinanter Peptide beschrieben werden, die für Peptidsequenzen codieren, die sich von dem Bakterizitäts-/Permeabilitätssteigerndes Protein (BPI) ableiten, das über Aminosäure-Spaltungsstellensequenzen als Fusionspartner mit Trägerproteinsequenzen verknüpft ist. In einigen konstruierten Fusionsproteinen wurde eine säurelabile Aspartyl-Prolyl-Bindung an der Verbindung zwischen der Peptidsequenz und der Proteinsequenz positioniert. BPI-abgeleitete Peptide wurden aus Fusionsproteinen freigesetzt, indem die isolierten Einschlusskörper ohne vorherige Solubilisierung mit Dünnsäure behandelt wurden. Die freigesetzten Peptide waren in einem wässrig-sauren Milieu löslich. Darüber hinaus wurden die BPI-abgeleiteten Peptide unter Bedingungen aus den Fusionsproteinen gewonnen, bei denen die Fusionsproteine in das Kulturmedium abgegeben wurden. Diese sekretierten Fusionsproteine wurden dann aufgereinigt und mit Dünnsäure behandelt, um die Peptide freizusetzen.
Von Interesse sind darüber hinaus die im Folgenden zitieren Veröffentlichungen, die sich auf rekombinante Fusionsproteine und Peptide beziehen.
Shen, Proc. Nat'l. Acad. Sci. (USA), 281, 4627 (1984) beschreiben unlösliche Einschlusskörper als bakterielle Expression eines für Proinsulin und β-Galaktosidase codierenden Fusionsproteins; die Einschlusskörper wurden zuerst isoliert und vor der Aufspaltung mit Cyanogenbromid mit Ameisensäure solubilisiert.
Kempe et al., Gene, 39, 239 (1985) beschreiben unlösliche Einschlusskörper als Expression in E. coli eines Fusionsproteins, das für mehrere Einheiten der Neuropetid-Substanz P und für β-Galaktosidase codieren; die Einschlusskörper wurden zuerst isoliert und vor der Aufspaltung mit Cyanogenbromid mit Ameisensäure solubilisiert.
Lennick et al., Gene, 61, 103 (1987) beschreiben unlösliche Einschlusskörper als Expression in E. coli eines Fusionsproteins, das für mehrere (8) Einheiten (8) des α-humanen atrialen natriuretischen Peptids codiert; die Einschlusskörper wurden zuerst isoliert und vor der Aufspaltung mit Endoproteinase mittels Harnsäure solubilisiert.
Dykes et al., Eur. J. Biochem., 174, 411 (1988) beschreiben die lösliche intrazelluläre Expression in E. coli eines Fusionsproteins, das für das α-humane atriale natriuretische Peptid und für Chloramphenicol-Acetyltransferase codiert; das Fusionsprotein wurde proteolytisch oder chemisch mit 2-(2-Nitrophenylsulphenyl)E-Methyl-3'-Bromindolenin aufgespalten, um das Peptid freizusetzen.
Ray et al., Biol Technology, 11, 64 (1993) beschreiben die lösliche intrazelluläre Expression in E. coli eines Fusionsproteins, das für Lachscalcitonin und Glutathion-S-Transferase codiert; das Fusionsprotein wurde mittels Cyanogenbromid aufgespalten.
Schellenbergeret al., Int. J. Peptide Protein Res., 41, 326 (1993) beschreiben unlösliche Einschlusskörper als Expression eines Fusionsproteins, das für ein Peptid der Substanz P (11a.a.) und für β-Galaktosidase codiert; die Einschlusskörper wurden zuerst isoliert und mit Chymotrypsin behandelt, um das Fusionsprotein aufzuspalten.
Hancock et al., WO94/04688 (PCT/CA93/00342) and Piers et al. (Hancock), Gene, 134, 7 (1993) beschreiben (a) unlösliche Einschlusskörper als Expression in E. coli eines Fusionsproteins, das für ein Defensin-Peptid, genannt humanes neutrophiles Peptid 1 (HNP-1) codiert, oder für ein hybrides Cecropin-/Mellitin-Peptid (CEME) und für Glutathion-5-Transferase (GST) codiert; die Einschlusskörper wurden zuerst isoliert und dann: (i) mit 3% Octylpolyoxyethylen vor der Harnsäure-Solubilisierung und vor der Faktor-X-Protease des HNP1-GST-Fusionsproteins extrahiert oder (ii) vor der Spaltung mit Cyanogenbromid des CEME-GST-Fusionsproteins mit Harnsäure solubilisiert; (b) im extrazellulären Überstand von S. aureus eines Fusionsproteins exprimiert, das für das CEME-Peptid und das Protein A codiert; (c) bestimmte Fusionsproteine mit einigen aufgereinigten Fusionsproteinen proteolytisch abgebaut; und (d) andere Fusionsproteine proteolytisch abgebaut, wobei es nicht gelang, die Fusionsproteine rückzugewinnen und aufzureinigen.
Lai et al., U.S. Patent Nr. 5.206.154 und Callaway, Lai et al. Antimicrob. Agents & Chemo., 37: 1614 (1993) beschreiben die Expression als unlösliche Einschlusskörper eines Fusionsproteins, das für ein Cecropinpeptid und für das Protein codiert, das vom 5'-Ende des L-Ribulokinasegens codiert wird; die Einschlusskörper wurden zuerst isoliert und vor der Aufspaltung mit Cyanogenbromid mittels Ameisensäure solubilisiert.
Gramm et al., Biol Technology, 12: 1017 (1994) beschreiben die Expression als unlösliche Einschlusskörper in E. coli eines Fusionsproteins, das für ein Peptid des humanen Parathormons und für ein Bakteriophagen-T4-codiertes gp55-Protein codiert; die Einschlusskörper wurden zuerst isoliert (6% wt/vol.) und dann mit Säure behandelt, um die Asp-Pro-Spaltungsstelle zu hydrolysieren.
Kuliopulos et al., J. Am. Chem. Soc., 116: 4599 (1994) beschreibt die Expression als unlösliche Einschlusskörper in E. coli eines Fusionsproteins, das für mehrere Einheiten eines Hefepeptids des α-Mating-Typs und für ein bakterielles Ketosteroid-Isomerase-Protein codiert; die Einschlusskörper wurden zuerst isoliert und vor der Aufspaltung mit Cyanogenbromid mit Guanidin solubilisiert.
Pilon et al., Biotechnol. Prog., 13, 374–379 (1997) beschreiben die lösliche intrazelluläre Expression in E. coli eines Fusionsproteins, das für ein Peptid und für Ubiquitin codiert; das Fusionsprotein wurde mit Ubiquitin-spezifischer Protease (UCH-L3) aufgespalten.
Haught et al., Biotechnol. Bioengineer., 57, 55–61 (1998) beschreiben die Expression als unlösliche Einschlusskörper in E. coli eines Fusionsproteins, das für ein P2 genanntes antimikrobielles Peptid und für bovines Prochymosin codiert; die Einschlusskörper wurden zuerst isoliert und vor der Aufspaltung mit Cyanogenbromid mit Ameisensäure solubilisiert.
Aus der oben genannten Literatur geht hervor, dass die Produktion von kleinen Peptiden aus Bakterien wegen einer Reihe von Gründen bisher problematisch war. Besonders problematisch ist dabei die Proteolyse gewisser Peptide, selbst dann, wenn die entsprechenden Peptide als Teil eines größeren Fusionsproteins hergestellt werden. Derartige Fusionsproteine, die ein Trägerprotein/Trägerpeptid umfassen, können entweder nicht von Bakterienwirtszellen exprimiert werden, oder sie können zwar exprimiert werden, werden aber von bakteriellen Proteasen gespalten. Insbesondere die Schwierigkeiten bei der Expression kationischer antimikrobieller Peptide in Bakterien ist von Hancock et al. WO94104688 (PCT/CA93/00342), weiter oben zitiert, beschrieben worden, die aus Sicht der Autoren auch die Anfälligkeit derartiger polykationischer Peptide auf den Abbau durch bakterielle Proteasen zurückzuführen ist.
Für die präklinische oder klinische Beurteilung müssen oft Peptidmengen hergestellt werden, die sich im Grammbereich bewegen [Kelley, Biol Technology 14, 28–31 (1996)]. Gelingt die Herstellung rekombinanter Peptide in diesem großen Maßstab, dann birgt eine derartige Produktion ein großes ökonomisches Potenzial. Allerdings entfällt bei der Herstellung von Peptiden und Proteinen aus Bakterien ein ganz erheblicher Anteil der Produktionskosten auf den Aufarbeitungsprozess. Die initiale Rückgewinnung der Peptide aus den bakteriellen Einschlusskörpern in den Fusionsproteinen erfordert beispielsweise im Allgemeinen mehrere verschiedene Verfahrensschritte, die die folgenden vier Schritte umfassen: (1) Aufbrechung/Lyse der Zelle, (2) Isolierung der Einschlusskörper aus der aufgebrochenen/lysierten Zelle, (3) Solubilisierung der isolierten Einschlusskörper in Denaturant oder Detergenz, um die solubilisierten Fusionsproteine zu erhalten, und (4) Aufspaltung der Fusionsproteine und Abtrennung der Peptide und Trägerproteine. Daher ist es wünschenswert, dass Aspekte des Verfahrens zur Herstellung rekombinanter Produkte verbessert und/oder optimiert werden, um die Herstellung von Peptiden durch rekombinante Verfahren in großem Maßstab unter ökonomischen Gesichtspunkten praktikabler machen.
Nach dem derzeitigen Stand der Technik besteht weiterhin ein Bedarf an verbesserten Verfahren zur Herstellung rekombinanter Peptide aus Bakterienzellen, vor allem an vereinfachten Verfahren, bei der nicht mehrere Schritte erforderlich sind, wie z.B. die Isolierung und Aufreinigung der Peptid-Fusionsproteine in einem ersten Schritt und die Isolierung und Aufreinigung der Einschlusskörper der Fusionsproteine in einem zweiten Schritt, um dann schließlich die rekombinanten Peptide zu erhalten.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung sieht verbesserte Verfahren zur Produktion rekombinanter Peptide aus Bakterienzellen vor. Die verbesserten Verfahren machen die Notwendigkeit einer Isolierung und Solubilisierung von Einschlusskörpern bzw. die Isolierung und Aufreinigung von Peptid-Fusionsproteinen überflüssig. Mit den vereinfachten Verfahren wird die Aufbrechung/Lyse der Zellen und die Freisetzung von Peptiden aus Bakterienzellen bzw. aus Bakterienzellkulturen in einem einzigen Schritt ermöglicht. Fusionsproteine, die sich für die Verfahren dieser Erfindung eignen, weisen wenigstens eine Peptidsequenz, eine Trägerproteinsequenz und eine säuresensitive Aminosäure-Spaltungsstellensequenz auf, die sich zwischen der Peptidsequenz und der Trägerproteinsequenz befindet. Die Erfindung sieht verbesserte Verfahren zur mikrobiellen Produktion von Peptiden aus Fusionsproteinen vor, die intrazellulär in Bakterienzellen exprimiert werden. Die rekombinanten Peptide, die sich mit dieser Erfindung erhalten lassen, werden auf dem Wege der Säurespaltung an der oder den säuresensitiven Spaltungsstellen im Fusionsprotein freigesetzt. Daher lassen sich rekombinante Peptide nach dieser Erfindung effizient und kostengünstig produzieren.
Die Erfindung sieht also ein verbessertes Verfahren zur Gewinnung von Peptiden aus Bakterienzellen nach Exprimierung eines Fusionsprotein in Inneren dieser Zellen vor, wobei das Fusionsprotein das Peptid, ein Trägerprotein und eine durch Säure spaltbare Stelle zwischen dem Peptid und dem Trägerprotein umfasst; die Verbesserung besteht dabei darin, dass die Bakterienzellen mit Säure behandelt werden können, und zwar unter Bedingungen, die eine Aufbrechung/Lyse der Zelle und die Freisetzung des Peptids aus dem Fusionsprotein in einem einzigen Schritt erlauben. Ein verbessertes Verfahren kann dabei zusätzlich den Schritt zum Erhalten der freigesetzten Peptide umfassen, die aus den aufgebrochenen oder lysierten Zellen abgetrennt wurden. Nach dieser Erfindung kann das freigesetzte Peptid von der aufgebrochenen oder lysierten Zelle mit Hilfe einer Abtrennungsvorrichtung wie z.B. einer Zentrifugationsvorrichtung oder einer Filtrationsvorrichtung von der aufgebrochenen oder lysierten Zelle abgetrennt werden. Die Erfindung sieht ebenfalls ein verbessertes Verfahren zur Gewinnung von Peptiden aus Bakterienzellen nach Exprimierung eines Fusionsproteins im Inneren dieser Zellen vor, wobei das Fusionsprotein das Peptid, ein Trägerprotein und eine durch Säure spaltbare Stelle zwischen dem Peptid und dem Trägerprotein umfasst; die Verbesserung erstreckt sich dabei auf die folgenden Schritte: (a) Behandlung der Bakterienzellen mit Säure unter Bedingungen, die die Aufbrechung oder Lyse der Zelle und die Freisetzung des Peptids aus dem Fusionsprotein erlauben; (b) die Abtrennung des löslichen Materials vom unlöslichen Material im Anschluss an Schritt (a); und (c) die Rückgewinnung des freigesetzten Peptids in dem löslichen Material in Anschluss an Schritt (b). Nach der Erfindung kann das lösliche Material von dem unlöslichen Material mit Hilfe einer Abtrennungsvorrichtung wie z.B. einer Zentrifugationsvorrichtung oder einer Filtrationsvorrichtung abgetrennt werden. Die verbesserten Verfahren dieser Erfindung können eingesetzt werden, wenn sich die Bakterienzellen zur Säurebehandlung in einem Zellkulturmedium befinden, oder wenn die Bakterienzellen zur Säurebehandlung von dem Zellkulturmedium getrennt wurden, oder wenn sich die Bakterienzellen zur Säurebehandlung in einem Zellkulturmedium in einem Fermentationskessel befinden. Nach den Verfahren dieser Erfindung ist eine bevorzugte durch Säure spaltbare Stelle in dem Fusionsprotein die Asp-Pro-Spaltungsstelle. Das Trägerprotein wird bevorzugt als unlösliches Protein im Inneren der Bakterienzellen exprimiert.
Die verbesserten Verfahren der Erfindung zur mikrobiellen Herstellung rekombinanter Peptide aus Fusionsproteinen gründen auf der überraschenden Entdeckung, dass die Aufbrechung/Lyse der Bakterienzellen und die Freisetzung der Peptide gleichzeitig in einem einzigen Schritt erfolgen kann. Nach dieser Erfindung ist vor der Freisetzung und Rückgewinnung der Peptide kein Verfahrensschritt für die Isolierung der Einschlusskörper aus den Zellen und die Solubilisierung dieser Einschlusskörper erforderlich. Desgleichen ist vor der Freisetzung und Rückgewinnung der Peptide kein Verfahrensschritt zur Aufreinigung der Fusionsproteine erforderlich, die in großen Mengen im Inneren von Bakterienwirtszellen als lösliche oder unlösliche Proteine exprimiert wurden. Bemerkenswerterweise können die Peptide, die als Komponenten von Fusionsproteinen effizient in Bakterienwirtszellen hergestellt wurden, in einem einzigen Schritt der Aufbrechung/Lyse der Zelle und der Freisetzung von Peptiden effizient aufgespalten und aus den Fusionsproteinen freigesetzt werden. Besonders erstaunlich ist, dass die Peptide, die sich nach den Verfahren dieser Erfindung effektiv in E. coli herstellen lassen, in einem einzigen Schritt der Zellaufbrechung/Lyse und der Peptidaufspaltung in löslicher Form freigesetzt werden können und sich leicht aus dem unlöslichen Zellmaterial rückgewinnen lassen. Beispielsweise wurden BPI-abgeleitete, rekombinante Peptide, die eine oder mehrere der biologischen Aktivitäten des BPI auf weisen (z.B. Bindung an LPS, Neutralisierung von LPS, Bindung an Heparin, Neutralisierung von Heparin, antimikrobielle Aktivität) nach den Verfahren dieser Erfindung hergestellt und rückgewonnen. Die Erfindung sieht also optimierte Verfahren zur Herstellung von Bakterienzellen aus funktionellen rekombinanten Peptiden vor.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG
Die vorliegende Erfindung sieht verbesserte Verfahren zur Herstellung rekombinanter Peptide vor. Nach diesen verbesserten Verfahren ist es möglich, rekombinante Peptide zu erhalten, die von Fusionsproteinen codiert und aus diesen freigesetzt werden. Die bei den Verfahren dieser Erfindung eingesetzten Fusionsproteine umfassen eine Peptidsequenz, eine Trägerproteinsequenz und eine säuresensitive Aminosäure-Spaltungsstellensequenz, die sich zwischen der Peptidsequenz und der Trägerproteinsequenz befindet. Die vereinfachten Verfahren ermöglichen die Aufbrechung/Lyse der Zellen und die Freisetzung der Peptide, wobei Bakterienzellen oder Bakterienzellkulturen (z.B. Fermentationskulturen) verwendet werden können. Die Verfahren machen die Aufbrechung/Lyse und anschließende Isolierung und Solubilisierung von Einschlusskörpern von Fusionsproteinen aus Bakterienkulturen vor der Peptidfreisetzung und -gewinnung überflüssig. Überraschenderweise erlaubt die Behandlung der Bakterienzellen bzw. der Bakterienzellkulturen unter ausreichend sauren Bedingungen und ausreichend hohen Temperaturen, um die Peptide in einem einzigen Schritt gleichzeitig mit der Aufbrechung/Lyse der Zellen zu spalten und freizusetzen, dass lösliche Peptide direkt aus unlöslichem lysiertem Zellmaterial rückgewonnen werden können.
Fusionsproteine, die BPI-abgeleitete Peptide mit antimikrobieller Aktivität enthielten, wurden bis zur Azidifizierung der Bakterienzellen ohne signifikante Proteolyse in großen Mengen intrazellulär exprimiert. Mit den rekombinanten Verfahren dieser Erfindung können eine Reihe verschiedener Peptide hergestellt werden, die sich von BPI ableiten, wie z.B. die Peptide, die die Sequenzen aufweisen, die in Tabelle 4 des hiermit vollständig zitierten US-Patent Nr. 5.851.802 aufgeführt sind.
Ein Vorteil der vorliegenden Erfindung besteht in der Möglichkeit, Peptide von Fusionsproteinen effizienter und kostengünstiger aus Bakterienwirtszellen herzustellen. Ein weiterer Vorteil besteht in der Möglichkeit, mit den optimierten Verfahren homogene Peptide in großen Mengen herzustellen, die sich besonders für eine Massenproduktion großen Fermentationskesseln eignen.
Mit „BPI-abgeleiteten Peptiden" oder "BPI-Peptiden" werden hier Peptide bezeichnet, die sich von dem "bakterizitäts-/permeabilitätssteigernden Protein (BPI)" ableiten oder auf diesem basieren, einschließlich der Peptide, die sich von Domäne I (Aminosäuren 17–45), Domäne II (Aminosäuren 65–99) oder Domäne III (Aminosäuren 142–169) des BPI (SEQ ID Nr. 15 und 16) ableiten, wobei jedes Peptid die Aminosäuresequenz einer funktionellen BPI-Domäne oder einer Untereinheit derselben aufweist, sowie Varianten dieser Sequenz bzw. Untersequenz, die wenigstens eine der biologischen Aktivitäten des BPI aufweist. Die Aminosäuresequenz des gesamten humanen BPI-Proteins und die Nukleinsäuresequenz der DNA, die für dieses Protein codiert, wurden in 1 bei Gray et al., J. Biol. Chem., 264, 9505 (1989) (hiermit zitiert) dargestellt. Die von Gray et al. beschriebene DNA und Aminosäuresequenzen sind hier in SEQ ID Nr. 15 und 16 abgebildet. Ein N-terminales BPI-Fragment von ca. 23 kD, als rBPI₂₃ bezeichnet [Gazzano-Santoro et al., Infect. Immun. 60, 4754–4761 (1992)], ein als rBPI₂₁ oder rBP1₂₁Δcys bezeichnetes Analogon (US-Patent Nr. 5.420.019, hiermit zitiert) sowie ein rekombinantes Holoprotein, ebenfalls als rBPI bezeichnet, wurden anhand der Sequenzen, wie sie in SEQ ID NOS: 15 and 16 dargelegt sind, hergestellt, mit Ausnahme der Tatsache, dass Valin bei Position 151 durch GTG angegeben wird statt mit GTC, und es sich bei Rest 185 um Glutaminsäure (durch GAG angegeben) handelt und nicht um Lysin (durch AAG angegeben). „Biologische Aktivität des BPI" bezieht sich hier auf die Bindung an LPS, die Neutralisierung von LPS, die Bindung an Heparin, die Neutralisierung von Heparin und die antimikrobielle Aktivität (einschließlich der bakteriziden und fungiziden Aktivität). Derartige BPI-abgeleitete Peptide, die wenigsten eine der Aktivitäten des BPI aufweisen, können als antimikrobielle Wirkstoffe (einschließlich bakterizider oder fungizider Wirkstoffe), als Endotoxin bindende oder Endotoxin neutralisierende Wirkstoffe, als Heparin bindende oder Heparin neutralisierende Wirkstoffe, einschließlich Wirkstoffe zur Neutralisierung der gerinnungshemmenden Effekte von verabreichtem Heparin, zur Behandlung chronisch-entzündlicher Zustände und zur Hemmung einer physiologischen oder pathologischen Angiogenese eingesetzt werden. "Kationisches BPI-Peptid" bezeichnet ein BPI-Peptid mit einem pI-Wert von > 7,0.
Mit "transformierter Bakterienwirtszellen" wird hier eine Bakterienzelle bezeichnet, die rekombinantes Genmaterial enthält, oder aber eine Bakterienzelle, die Genmaterial enthält, welches zur Expression eines rekombinanten Produkts benötigt wird. Das Genmaterial kann dabei über jedes bekannte einschlägige Verfahren wie z.B. der Transformation, der Transduktion, der Elektroporation oder der Infektion in die Zelle eingebracht werden.
Mit "Vektor" oder „Vektoriconstrukt" wird hier Plasmid-DNA bezeichnet, die rekombinantes Genmaterial enthält, welches für ein oder mehrere rekombinante Produkte codiert und welches zur autonomen Replikation in Bakterien fähig ist.
Mit "Trägerprotein" wird hier ein Protein bezeichnet, das in Bakterien exprimiert werden kann und als Fusionspartner für ein verknüpftes Peptid oder Protein eingesetzt werden kann. Bevorzugte Trägerproteine sind Proteine, mit denen eine sehr hohe Ausbeute exprimiert werden kann und die als Fusionspartner eine hochgradige Expression des verknüpften Peptids oder Proteins bewirken. Besonders bevorzugte Trägerproteine sind dabei Proteine, die intrazellulär als lösliche oder unlösliche Proteine exprimiert werden, wie z.B. die D-Untereinheit des humanen osteogenen Proteins ("Bone D"). Dabei kann jedes bekannte Trägerprotein als Proteinfusionspartner dienen, z.B. Ubiquitin [siehe z.B. Pilon et al., Biotechol. Prog. 13, 374–379 (1997)]; Staphylokokkenprotein A [siehe z.B. Uhlén et al., Gene 23, 369: 378 (1983) und Piers et al., Gene 134, 7–13 (1993)]; Thioredoxin [siehe z.B. LaVallie et al., Bio/Technology 11, 187–193 (1993)]; Maltose bindendes Protein [siehe z.B. Tsao et al., Gene 169, 59–64 (1996)); Glutathion-S-Transferase [siehe z.B. Ray et al., Biol Technology 11 64–70 (1993) und Piers et al., Gene 134, 7–13 (1993)]; Prochymosin [siehe z.B. Haught et al., Biotechnology and Bioengineering 57, 55–61 (1998)];β-Galaktosidase [siehe z.B. Kempe et al., Gene 39, 239–245 (1985)]; und gp 55 des T4 [siehe z.B. Gram et al., Biol Technology 12, 1017–1023 (1994)). Mit "kationisches Trägerprotein" wird hier ein Trägerprotein bezeichnet, das einen pI-Wert (errechnet anhand der Aminosäuresequenz oder gemessen anhand der Lösung) von mehr als 7,0 aufweist, noch besser allerdings einen pI-Wert von über 8,0. Zu derartigen Proteinen zählen (1) Bone D (pI-Wert 8,18) (SEQ ID Nr. 1 und 2) und (2) Gelonin (pI-Wert 9,58) (siehe z.B. US-Patent Nr. 5.416.202 und 5.851.802, hiermit vollständig zitiert).
Mit "Aminosäure-Spaltungsstelle" werden hier eine oder mehrere Aminosäuren bezeichnet, die als Erkennungsstellen für chemische oder enzymatische Reaktionen dienen, dergestalt, dass die die Peptidkette von dem chemischen Agens oder von dem Enzym an dieser Stelle aufgespalten wird. Aminosäure-Spaltungsstellen umfassen die Stellen für Aspartatsäure-Prolin (Asp-Pro), für Methionin (Met), für Tryptophan (Trp) und für Glutaminsäure (Glu). Mit „säuresensitiven Aminosäure-Spaltungsstellen" werden hier eine oder mehrere Aminosäuren bezeichnet, die als Erkennungsstellen dienen, insofern, als die Peptidkette an dieser Stelle durch Säure aufgespalten wird. Besonders bevorzugt ist die Asp-Pro-Spaltungsstelle, die durch Säurehydrolyse zwischen Asp und Pro aufgespalten werden kann.
Peptide, die sich von BPI ableiten oder auf diesem basieren (BPI-abgeleitete Peptide), sind in den anteilig gehaltenen US-Patenten Nr. 5.858.974 [WO 97/04008 (PCT/US96/03845)]; US-Patentanträgen der aufeinander folgenden Nr. 08/504,841 und 09/119,858 [WO 96/08509 (PCT/US95/09262)]; US-Patent Nr. 5.652.332 und 5.856.438 [WO 95/19372 (PCT/US94/10427)]; US-Patent Nr. 5.733.872 und 5.763.567 [WO 94/20532 (PCT/US94/02465)]; US-Patent Nr. 4.348.942; 5.639.727; 5.807.818; 5.837.678; und 5.854.214 [WO 94/20128 (PCT/US94/02401)) beschrieben (alle hiermit zitiert).
Andere Aspekte oder Vorteile der vorliegenden Erfindung werden durch die folgenden Anschauungsbespiele verdeutlicht. Beispiel 1 beschreibt dabei die Konstruktion eines Fusionsprotein-Expressionsvektorkonstrukts; Beispiel 2 beschreibt die Expression rekombinanter Fusionsproteine; Beispiel 3 beschreibt die Säurehydrolyse von Bakterienzellen bzw. Bakterienzellkulturen und die Freisetzung rekombinanter Peptide; Beispiel 4 beschreibt die Säurehydrolyse von Bakterienzellkulturen in Fermentationskesseln; Beispiel 5 beschreibt die Säurehydrolyse von Bakterienzellen nach Entfernung des Zellkulturmediums; Beispiel 6 beschreibt die Rückgewinnung und Aufreinigung rekombinanter Peptide aus säurehydrolysierten Bakterienzellen; Beispiel 7 schließlich beschreibt Testverfahren zur Untersuchung der biologischen Aktivität rekombinanter Peptide.
BEISPIEL 1
Konstruktion eines Fusionsprotein-Expressionsvektors
1. Konstruktion des bakteriellen Expressionsvektors pING4702
Es wurde ein bakterieller Expressionsvektor konstruiert, der für ein Fusionsproteins-Peptid codieren sollte. Dieser Vektor weist eine Sequenz für ein Gen auf, das für die D-Untereinheit des humanen osteogenen Proteins codiert ("Bone D") (siehe Aminosäuren 23 bis 161 von SEQ ID Nr. 1 und 2), die mit einer Sequenz verknüpft ist, die für eine Verknüpfungssequenz codiert, die Dipeptid Asp-Pro beinhaltet, sowie eine Sequenz, die für ein Peptid codiert, das sich von der Sequenz für BPI ableitet (SEQ ID NR. 3). Dieses Vektorkonstrukt pING4702 wurde in einem mehrstufigen Verfahren hergestellt, das im Folgenden beschrieben wird.
Zunächst wurden zwei synthetische Oligonukleotide synthetisiert, die für ein BPI-abgeleitetes Peptid, ein Asp-Pro-Dipeptid sowie eine entsprechende Restriktionsenzym-Erkennungsstelle zur Klonierung codieren. Bei den Oligonukleotiden, die für diese Sequenz codieren, handelte es sich um:
16 μg jedes Oligonukleotids wurden in 50 μl Reaktionslösung in 100 mM NaCl, 10 mM Tris, pH 7,8, 1 mM EDTA zunächst 10 Minuten lang bei 68°C und dann 30 Minuten lang bei 57°C linearisiert und anschließend langsam wieder auf Raumtemperatur abgekühlt. Das resultierende linearisierte Oligonukleotidfragment codiert für eine Asp-Pro-Vorläufersequenz, die von eine Sequenz gefolgt wird, die für ein Peptid mit der 12-Aminosäuresequenz von XMP 391 codiert (wie in US-Patent Nr. 5.851.802 beschrieben):
Das linearisierte Oligonukleotidfragment weist darüber hinaus Restriktionsenzymstellen zur Aufspaltung durch BamHI am 5'-Ende und durch XhoI am 3'-Ende der Sequenz. Das resultierende linearisierte Oligonukleotid wurde mittels Zentrifugation auf einer Chroma Spin 10-Säule (Clontech, Palo Alto, CA) aufgereinigt.
Anschließend wurden DNA-Fragmente aus zwei Plasmidvektoren hergestellt. Das Plasmid pIC100, ein Derivat des pBR322, das auch die Leader-Sequenz des E. carotovora pelB-Gens enthält (wie im hiermit zitierten US-Patent Nr. 5.416.202 beschrieben (siehe z.B. Beispiel 10)), wurde mit EcoRI und XhoI gespalten und das größere Vektorfragment mit einer Größe von ca. 2836 bp aufgereinigt. Das Plasmid pING3353 wurde (wie im hiermit zitierten US-Patent Nr. 5.851.802 beschrieben) mit EcoRI und BamHI aufgeschlossen und das ca. 550 bp große Fragment, das für das peIB:Bone D-Protein codiert, anschließend aufgereinigt.
In einem dritten Schritt wurden die linearisierten Oligonukleotide, das EcoR1/XhoI-Fragment des pING100 und das EcoRI/BamHI-Fragment des pING3353 in 20 μl 50 mM Tris, pH 7.6, 10 mM MgCl2, 1 mM ATP, 1 mM DTT, 5% PEG-8000 mit 3 Einheiten T4-DNA-Ligase 16 Stunden lang bei 4°C ligiert, um den Übergangsvektor pING4700 herzustellen. Das Plasmid pING4700 verleiht Resistenz gegen Ampicillin und codiert für das Bone D-Asp-Pro-Vorläuferpeptid des Fusionsproteins.
Das Plasmid pING4700 wurde mit EcoRI und XhoI aufgespalten, und das für das Fusionsprotein codierende 604-bp-Fragment (wie in US-Patent 5.851.802 beschrieben (siehe Beispiel 1)) zu dem ca. 5500 bp großen Vektorfragment aus pING3217 ligiert, das zuvor mit EcoRI und XhoI in μl 50 mM Tris, pH 7,6, 10 mM MgCl2, 1 mM ATP, 1 mM DTT, 5% PEG-8000 mit 3 Einheiten T4-DNA-Ligase 16 Stunden lang bei 4°C aufgespalten worden war. Das resultierende Plasmid pING4702 codiert unter Transkriptionskontrolle des araB-Promoters für das Fusionsprotein des Bone D-Asp-Pro-Vorläuferpeptids (SEQ ID Nr. 7 und 8). Das Plasmid pING4702 verleiht Resistenz gegen Antibiotika-Tetracycline.
2. Bakterielles Expressionsvektorkonstrukt pING4703
Ein zweiter bakterieller Expressionsvektor wurde konstruiert, der für ein Peptid-Fusionsprotein codiert, das Bone D (siehe Aminosäuren 23 bis 161 der SEQ ID Nr. 1 und 2), das Dipeptid Asp-Pro und ein Peptid aus 25 Aminosäuren enthält, das sich von der Sequenz für BPI ableitet (SEQ ID NR. 9). Dieses Vektorkonstrukt pING4703 wird wie im Folgenden beschrieben hergestellt.
Zunächst wurden zwei synthetische Oligonukleotide, die für ein BPI-abgeleitetes Peptid, eine Asp-Pro-Vorläufersequenz und für die entsprechenden Restriktionsenzym-Erkennungsstellen für die Klonierung codieren, synthetisiert. Bei den Oligonukleotiden, die für diese Sequenz codieren, handelte es sich um:
16 μg jedes einzelnen Oligonukleotids wurde in einer 50 μl Reaktionslösung in 100 mM NaCl, 10 mM Tris, pH 7,8, 1 mM EDTA 10 Minuten lang bei 68°C und 30 Minuten lang bei 57°C stabilisiert und anschließend langsam auf Raumtemperatur abgekühlt. Ein Aliquot des stabilisierten Oligonukleotids wurde mit 10 mM Tris, pH 8,3, 50 mM KCl (300 μl Gesamtvolumen) verdünnt und bei 72°C mit einer Reaktionslösung aufgefüllt, die AmpliTaq (Perkin Elmer, Norwalk, CT), dATP, dGTP, dCTP und dTTP enthielt. Das resultierende doppelsträngige Fragment codierte für die Restriktionsstellen BamHI bzw. XhoI am 5'-Ende bzw. am 3'-Ende, und codierte für eine Asp-Pro-Vorläufersequenz, gefolgt von einer Sequenz, die für ein Peptid mit einer Sequenz aus 24 Aminosäuren für XMP.102 codierte (wie in US-Patent Nr. 5.851.802 beschrieben):
Das doppelsträngige Fragment wurde mit BamHI und XhoI aufgespalten und, sowohl mit dem ca. 5500 bp großen EcoRI/XhoI-Vektorfragment des pING3217 als auch mit dem ca. 550 bp großen EcoRI/BamHI-Fragment des pING3353 in 20 μl 50 mM Tris, pH 7,6, 10 mM MgCl2, 1 mM ATP, 1 mM Dithiothreitol, 5% PEG-8000 mit 1 Unit T4 DNA Ligase 16 Stunden lang bei 4°C ligiert. Das resultierende Plasmid pING4703 codiert unter Transkriptionskontrolle des ara8-Promoters für das Fusionsprotein des Bone D-Asp-Pro-Vorläuferpeptids (SEQ ID Nr. 13 und 14). Das Plasmid pING4703 verleiht Resistenz gegen Antiobiotika-Tetracycline.
BEISPIEL 2
Expression eines rekombinanten Fusionsproteins
Die Expression eines rekombinanten Produkts unter Kontrolle des araB-Promoters wurde wie folgt untersucht: Die Expressionsvektorkonstrukte wurden in E. coli E104 transformiert (hinterlegt als ATCC 69009; ATCC 69008; ATCC 69101; ATCC 69102; ATCC 69103; ATCC 69104; ATCC 69331; ATCC 69332; ATCC 69333, wobei jedes Konstrukt ein Gelonin-codierendes Plasmid enthielt) und anschließend Tetracyclin-resistente Kolonien selektiert. Die Bakterienkulturen dieser Kolonien wurden bei 37°C in einem TYE-Medium (15 g Trypton, 10 g Hefeextrakt, 5 g NaCl pro Liter) angezüchtet und mit 15 μg/ml Tetracyclin aufgefüllt. Zur Aufbewahrung der Bakterienzellen vor der Anzüchtung in dem Fermentor wurden Bakterienkulturen (1–2 ml) in mit 15% Glyzerin aufgefülltem TYE-Medium tiefgefroren und bei –20°C aufgewahrt. Um die Herstellung des rekombinanten Produkts zu initiieren, wurde eine Ampulle mit Zellen, die den Expressionsvektor des Produkts enthielten, aufgetaut, wie weiter unten beschrieben in 100 ml GMM-Kulturmedium inokuliert und bis auf ca. 200-Kletteinheiten angezüchtet; anschließend wurden diese entweder in einen 14-l-Fermentor oder einen 35-l-Fermentor inokuliert. Jeder Fermentor enthielt dabei Salz-Minimalmedium mit Glycerin als Kohlenstoffquelle (Glycerin-Minimalmedium, GMM). Das 14-l bzw. 35-l-Fementorgefäß enthielt anfänglich ca. 7 l bzw. 20 l der GMM, das pro Liter die folgenden Inhaltsstoffe enthielt:

*Die Tracelösung-D setzte sich wie folgt zusammen:

Der Fermentor wurde anschließend mit der bakteriellen Saatkultur inokuliert und bei einem pH von 6,0 und einer Temperatur von 32°C mit 10 l Luft/Minute und bei 1000 rpm gerührt. Bei einer Verknappung der Nährstoffe (geschätzt anhand der Zunahme des gelösten Sauerstoffs (DO) auf ca. 100%) wurden der Kultur so lange zusätzliche Nährstoffe zugeführt, bis eine optische Dichte (OD₆₀₀) von ca. 100 erreicht wurde. Bei der Nährstoffzugabe wurde die Zufuhrrate kontrolliert, um den Anteil des DO bei einem definierten Wert von ca. 20% zu halten. Im Rahmen der ersten Nährstoffzugabe wurden der Kultur folgende Nährstoffe zugeführt:
Die Kultur wurde mittels Gradienteninduktion bei einer OD von ca. 100 mit einer zweiten Nährstofflösung induziert, die das induzierende Agens L-Arabinose enthielt. Die zweite Nährstoffzugabe setzte sich zusammen aus:
Die Kulturen wurden 23–26 Stunden nach der Induktion abgeerntet.
Die Zellen können, wie in den Beispielen 3 und 5 weiter unten beschrieben, mit Hilfe einer 0,2 μm Hohlfaserkartusche (10 ft.²) (Microgon, Laguna Hills, CA), von dem Kulturmedium abgetrennt werden. Alternativ dazu kann die Fermentationsbrühe (d.h. das Kulturmedium mit den Zellen) zur Azidifizierung und weiteren Aufbereitung direkt in den Fermentationskessel eingebracht oder aus dem Fermentor entfernt werden, wie in den Beispielen 4 und 5 weiter unten beschrieben. In Beispiel 6 weiter unten wird die Rückgewinnung und Aufreinigung rekombinanter Peptide beschrieben.
BEISPIEL 3
Säurehydrolyse von Bakterienzellen und Freisetzung rekombinanter Peptide
1. Freisetzung von Peptiden aus Bakterienzellen
Die Einschlusskörper wurden zuvor isoliert. Die Säurebehandlung der isolierten Einschlusskörper durch Inkubation in Dünnsäure bei hohen Temperaturen (siehe z.B. Beispiel 3 des US-Patents Nr. 5.851.802) bewirkte eine Hydrolyse der Aspartyl-Prolyl-Bindungen (Asp-Pro) zwischen dem Bone-D-Protein und dem rekombinanten Peptid. In diesen Experimenten wurden die Bakterienzellen bei dem Versuch, die Zellen direkt zu lysieren und die Einschlusskörper direkt zu hydrolysieren, um die Peptide freizusetzen, direkt azidifiziert. Dazu wurden die Zellen bei hohen Temperaturen in Dünnsäure verdünnt. E. coli E104, das Plasmid pING4702 enthielt, wurde in einem 10-l-Fermentor angezüchtet und mit Arabinose induziert. Nach Beendigung des Durchlaufs im Fermentor wurden die Bakterienzellen mittels einer 0,2 μm Hohlfaserkartusche (Microgon, 10 ft²) größtenteils vom Überstand abgetrennt und tiefgefroren. Die aus dem Fermentor gewonnenen Zellen wurden aufgetaut und in unter sauren Bedingungen 4 Stunden lang bei 85° Grad inkubiert (wie in Tabelle 1 angegeben).
Als Kontrolle wurde etwa 1 g Zellen mit Lysozym lysiert und die Einschlusskörper vor der Säurehydrolyse nach bereits an anderer Stelle beschriebenen Verfahren isoliert (siehe z.B. Beispiel 3 des US-Patents Nr. 5.851.802).
TABELLE 1
Diese Zellen wurden in 10 ml 100 mM Tris, 5 mM EDTA, pH 8,0 suspendiert. Die Masse wurde 15 Minuten lang auf Eis gestellt, dann wurde 1 ml Lysozym 10 mg/ml hinzugegeben und die Masse nochmals 20 Minuten lang auf Eis gestellt. Um die mit Lysozym behandelten Zellen aufzubrechen, wurde die Masse mit einem Sonic U Ultraschallgerät (B. Braun Biotech Inc., Allentown, PA) bei der höchsten Einstellung 4 Mal jeweils 10 Sekunden lysiert. Die lysierten Zellen wurden 25 Minuten lang in einem JA20-Rotor bei 13.000 rpm zentrifugiert. Das Pellet der Einschlusskörper wurde dann vier Stunden lang bei 85° C in 10 ml HCl inkubiert.
Vor der Inkubation bei 85°C wurde bei allen Proben der pH durch die Zugabe von HCl auf 2,5 eingestellt; mit Ausnahme der Probe, die Harnsäure enthielt, bei der der pH bei 3,0 eingestellt wurde. Nach der Inkubation wurden die Proben in einem JA20-Rotor 25 Minuten lang bei 13.000 rpm zentrifugiert, um das lösliche Material vom unlöslichen Material abzutrennen. Die Menge der freigesetzten Peptide im Überstand der einzelnen Proben wurde mittels HPLC bestimmt. Dazu wurde ein Beckman Coulter-Instrument (Fullerton, CA) mit einem Shimadzu Scientific Instruments-Autoinjektor (Columbia, MD) und eine Vydac (Hesperia, CA) C18 (Nr. 218TP54) Säule verwendet. Bei Lösungsmittel A handelte es sich dabei um 10% Acetonitril 10,1% TFA; bei Lösungsmittel B um 90% Acetonitril/0,1% TFA. Die Säule wurde mittels 20–40% B-Gradienten 20 Minuten lang bei einer Flussrate von 1 ml/Minute und einer Peptiddetekion bei 229 nm geladen.
Die Peptidkonzentration im Überstand ist in Tabelle 2 aufgeführt.
TABELLE 2
Diese Daten zeigen erstmals, dass Peptide durch die Inkubation der Bakterienzellen in Dünnsäure direkt aus Zellen freigesetzt werden können, während die anderen Proteine überwiegend unlöslich bleiben.
2. Zeitlicher Ablauf der Freisetzung der Peptide aus den Bakterienzellen.
Die oben beschriebenen Ergebnisse zeigen, dass Peptid durch die direkte Hydrolyse von Zellen in Dünnsäure aus einem Bone D-Peptid-Fusionsprotein, das einen säuresensitive Asp-Pro-Peptid-Linker aufwies, freigesetzt wurde. Es wurden weitere Versuche durchgeführt, um den zeitlichen Ablauf der Hydrolyse zu bestimmen. Für diese weiteren Versuche wurde eine Probe der gleichen, weiter oben beschriebenen konzentrierten, tiefgefrorenen Zellprobe verwendet. Dazu wurden ca. 2 g der Zellpaste mit 20 ml Wasser verdünnt und konzentrierte HCl hinzugegeben, um einen pH von 2,5 zu erreichen. Die Probe wurde bei 85°C inkubiert; in regelmäßigen Abständen wurden Proben zur quantitativen Bestimmung entnommen. Jede Probe wurde zentrifugiert, um unlösliches Material zu entfernen; der Überstand wurde mittels HPLC auf freigesetzte Peptide hin untersucht. Die Konzentration der Peptide in der löslichen Fraktion ist in Tabelle 3 aufgeführt.
TABELLE 3
Wie in Tabelle 3 dargestellt, nahm die Menge der Peptide in der löslichen Fraktion am Ende des 7-Stunden-Zeitraums noch weiter zu.
In weiteren Versuchen wurde eine Bakterienzellprobe in einem Zellkulturmedium bei einem pH von 2,15 inkubiert, um den zeitlichen Ablauf der Freisetzung der Peptide aus diesen Zellen zu bestimmen, die zuvor weder konzentriert noch tiefgefroren worden waren. Dazu wurden 40 ml in Fermentationsbrühe gelöste Bakterienzellen (Fermentationskultur von E. coli E104 mit pING4702) gegen Ende der Prozessierung im Fermentor, wie in Beispiel 2 beschreiben, direkt auf einen pH von 2,15 eingestellt, indem 500 μl konzentrierter HCl hinzugefügt wurden, um eine abschließende Konzentration von ca. 150 mM zu erreichen. Die Probe wurde bei 85°C inkubiert; stündlich wurde eine Probe entnommen, zentrifugiert und der Überstand mittels HPLC auf Peptide hin untersucht. Die Menge der Peptide, die mit der Zeit freigesetzt wurden, ist in Tabelle 4 aufgeführt.
TABELLE 4
Bei einem pH von 2,15, und wenn sich die Zellen direkt im Fermentationsmedium behandelt wurden, erfolgte die maximale Freisetzung von Peptiden nach sieben Stunden bei 85°C; dann nahm die Menge der freigesetzten Peptide wieder ab.
Weitere Versuchen zeigten, dass es mit verdünnter H₂SO₄ und mit verdünnter HNO₃ ebenfalls möglich ist, lösliche Peptide aus Bakterienzellen und Bakterienzellen in Zellkulturmedien (d.h. Fermentationskulturen) freizusetzen. In Studien mit H₂SO₄ wurden zwei Proben von Bakterienzellen in Fermentationsbrühen (Fermentationskultur von E. coli E104, die pING4702 enthielt) zu je 20 ml, wie in Beispiel 4 beschrieben, nach abgeschlossener bakterieller Fermentation entnommen und auf einen pH von 2,4 azidifiziert. Eine Probe wurde durch Zugabe von HCl auf einen pH von 2,4 eingestellt, die andere durch Zugabe von H₂SO₄ auf einen pH von 2,4. Jede Probe wurde bei 85°C inkubiert; über einen Zeitraum von sieben Stunden wurde stündlich eine Probe entnommen und die Menge löslicher Peptide in jeder Probe mittels HPLC bestimmt. Die Peptidkonzentration in den einzelnen Aliquoten ist in Tabelle 5 aufgeführt.
TABELLE 5
In Versuchen mit HNO₃ wurde, wie in Beispiel 4 beschrieben, eine Bakterienzellprobe in Fermentationsbrühe mit Salpetersäure inkubiert. Dazu wurden 20 ml Zellen durch Zugabe von Salpetersäure auf einen pH von 2,2 eingestellt und bei 85°C inkubiert. Regelmäßig wurden Proben entnommen und die Konzentration rekombinanter Peptide in der löslichen Fraktion mittels HPLC bestimmt. Die Peptidkonzentration in den einzelnen Aliquoten ist in Tabelle 6 aufgeführt.
TABELLE 6
Diese weiteren Versuchen zeigten, dass Säuren wie z.B. Salpetersäure, die sich Materialien aus rostfreiem Stahl, wie sie in Fermentationskesseln eingesetzt werden, gegenüber weniger korrosiv erweisen, sich für die verbesserten Verfahren dieser Erfindung eignen.
BEISPIEL 4
Säurehydrolyse der Bakterien direkt im Fermentationskessel
Da Peptide, wie in Beispiel 3 beschrieben, durch eine direkte Inkubation der Zellen mit Säure aus Bakterienzellen und Zellkulturen freigesetzt werden konnten, wurden Versuchen durchgeführt, um zu bestimmen, ob es möglich ist, die löslichen Peptide am Ende des Fermentationsverfahrens direkt aus einem Bioreaktor rückzugewinnen, wenn der Inhalt des Fermentors vor Ort azidifiziert und erhitzt wird. In ersten Versuchen wurde E. coli E104 mit pING4702 (wie in Beispiel 2 beschrieben) in einem 35-l-Fermentor kultiviert. Die erste Nährstofflösung wurde 20,5 Stunden nach der Inokulation in den Fermentor eingebracht; als eine OD₆₀₀ von 97,2 erreicht wurde, wurde die Kultur mit einer zweiten Nährstofflösung induziert. 62,5 Stunden nach der Induktion wurde 10% HCl in Aliquoten zu 50 ml in den Fermentor gegeben, bis ein pH von ca. 2,28 erreicht war. Insgesamt wurden den ca. 26 l des in dem Fermentor befindlichen Fermentationsproduktes 990 ml Säure beigegeben. Nach der Verringerung des pHs wurde die am Fermentor eingestellte Temperatur auf 85°C erhöht; über einen Zeitraum von sechs Stunden wurden regelmäßig Proben aus dem Fermentor entnommen. Der Kesselinhalt wurde während der Reaktion mit Hilfe des Rührwerks des Fermentors durchmischt. Die HPLC-Analyse des löslichen Materials in der Probe ergab, dass die Peptidkonzentration nach vier bis fünf Stunden nicht weiter anstieg. Die Peptidkonzentration ist in Tabelle 7 aufgeführt.
TABELLE 7
In weiteren Versuchen wurde E. coli E104 mit pING4702 in einem 35-l-Fermentor so lange kultiviert, bis eine OD₆₀₀ von 89 erreicht war, mit einer zweiten arabinosehaltigen Nährstofflösung induziert und 24 Stunden lang weiter kultiviert. Es wurde 10% HCl zugegeben, um die Kultur auf einen pH von ca. 2,3 einzustellen; die Temperatur wurde für 5,5 Stunden auf 85°C erhöht. Die Peptidkonzentration in der löslichen Fraktion betrug 0,332 mg/ml.
BEISPIEL 5
Säurehydrolyse der Bakterien nach Entfernung des Zellkulturmediums
Der Stamm E. coli E104, der pING4703 enthielt, wurde, wie in Beispiel 2 beschrieben, in einem 14-l-Fermentor kultiviert; 10 ml der Fermentationskultur wurden durch die Zugabe von konzentrierter HCl auf einen pH von 2,2 eingestellt. Die Probe wurde bei 85°C inkubiert; alle paar Stunden wurden Proben entnommen und der Überstand mittels HPLC auf Peptide hin analysiert. Dabei wurde zur quantitativen Bestimmung der Peptide aus dem Produkt, das durch pING4702 codiert wird, nach dem gleichen Verfahren vorgegangen wie in Beispiel 3 beschrieben. Die Ergebnisse dieser Versuche sind in Tabelle 8 aufgeführt.
TABELLE 8
Diese Peptidtiter waren viel niedriger als diejenigen Titer, die nach den in den Beispielen 3 und 4 beschrieben Verfahren aus Kulturen von E. coli E104 (pING4702) gewonnen wurden, und niedriger als die Titer, die gewonnen wurden, wenn E. coli E104 (pING4703) im Anschluss an eine Inkubation mit Lysozym nach dem in Beispiel 3 beschriebenen Verfahren mittels Ultraschall lysiert wurde. E. coli E104 (pING4703), die nach einer Behandlung mit Lysozymen mittels Ultraschall lysiert wurden, wiesen einen Titer von ca. 0,46 mg/ml in der löslichen Fraktion auf.
In weiteren Versuchen wurden Proben von Bakterienzellkulturen sowohl vor als auch nach einer Säurehydrolyse bei 85°C mittels SDS-PAGE analysiert. Die Ergebnisse zeigen, dass das Fusionsprotein aus Bone-D und Peptid durch Säure hydrolysiert wurde. Ein Experiment wurde durchgeführt, um zu bestimmen, ob das Zellkulturmedium in der Hydrolysereaktion einen Einfluss darauf hat, ob rekombinante Peptide in der löslichen Fraktion rückgewonnen werden können, da in der hydrolysierten Probe eine prominente Bande an der Position von Bone D erkennbar war, während auf der anderen Seite nur sehr geringe Mengen des intakten Fusionsproteins nachgewiesen werden konnten. Durch Zentrifugation wurde Zellpaste aus fermentierter E. coli E104 (pING4703) zubereitet; 1 g Zellpaste wurde in 7 ml H₂O; 7 ml 5 mM EDTA bzw. 7 ml zellfreier Fermentationsbrühe aus dem gleichen Bakterienfermentor suspendiert. Jede Probe wurde durch Zugabe von konzentrierter HCl auf einen pH von 2,2 eingestellt und bei 85°C inkubiert. Die Menge der rekombinanten Peptide, die mit der Zeit in der löslichen Fraktion abgegeben wurden, wurden mittels HPLC bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 9 aufgeführt.
TABELLE 9
Diese Daten zeigten, dass rekombinante Peptide löslich waren, wenn die Zellen in Wasser oder in 5 mM EDTA hydrolysiert wurden, nicht aber im Fermentationsmedium nach Säurehydrolyse.
Es wurden weitere Versuchen durchgeführt, um zu bestimmen, ob sich die rekombinanten Peptide nach Hydrolyse aus Bone-D in Säure als unlöslich erwiesen, und in Detergenzien oder in chaotropischen Salzen aus dem unlöslichen Material freigesetzt werden können.
Drei Proben zu je 1 g Zellpaste aus E. coli E104 (pING4703) wurden in 7 ml 100 mM Tris, 5 mM EDTA, pH 8,0 suspendiert; eine Probe zu 1 g Zellpaste wurde in 7 ml des zellfreien Kulturmediums aus fermentierter E. coli suspendiert. Eine der beiden Proben wurde in einem Tris-Puffer suspendiert; 1 ml Lysozym 10 mg/ml wurde hinzugefügt, die Probe wurde auf Eis inkubiert und wie in Beispiel 3 beschrieben mittels Ultraschall lysiert. Der pH-Wert aller vier Proben wurde durch die Zugabe von konzentrierter HCl auf ca. 2,0 eingestellt und die Proben anschließend vier Stunden lang bei 85°C inkubiert. Die mittels HPLC bestimmte Menge der Peptide, die in die lösliche Fraktion der vier Proben freigesetzt wurde, ist in Tabelle 10 aufgeführt.
TABELLE 10
Die Peptide waren nach der Säurehydrolyse also nicht in der löslichen Fraktion der Probe 3 erkennbar. Um zu bestimmen, ob die Peptide aus dem unlöslichen Material freigesetzt werden können, wurde das Pellet aus Probe 3 nacheinander mit 7 ml Puffern gewaschen, die jeweils Triton X-100, Harnsäure, Guanidinhydrochlorid oder SDS enthielten. Die Menge der vom Pellet freigesetzten Peptide ist in Tabelle 11 aufgeführt.
TABELLE 11
Diese Ergebnisse zeigten, dass Peptide durch Waschungen in harnsäure- oder guanidinhydrochloridhaltigen Puffern aus dem unlöslichen Material zurückgewonnen werden konnten. Daher wurden die Peptide unter den Bedingungen der Hydrolyse nicht abgebaut, sondern durch Komponenten der Medien unlöslich gemacht. Die Menge des Materials, das in allen Waschungen insgesamt zurückgewonnen werden konnte, betrug 2,67 mg pro Gramm Zellen, verglichen mit 4,16 mg/g bzw. 3,63 mg/g, die jeweils bei den Proben 1 und 4 direkt aus dem löslichen Material zurückgewonnen werden konnten. Daher empfiehlt es sich bei einigen Bakterienzellkulturen, die Bakterienzellen von dem Medium abzutrennen und nach dem in Beispiel 3 beschriebenen Verfahren zu azidifizieren. Bei anderen Bakterienzellkulturen kann die Fermentationsbrühe (Bakterienzellen in Zellkultur/Fermentationsmedien) nach den in Beispiel 3 und 4 beschriebenen Verfahren direkt azidifiziert werden.
BEISPIEL 6
Rückgewinnung und Aufreinigung rekombinanter Peptide aus säurehydrolysierten Zellen
1. Rückgewinnung
Die Erfindung sieht eine Verfahren zur Rückgewinnung von Peptiden aus der löslichen Fraktion säurehydrolysierter Zellen vor, während der überwiegende Teil der anderen bakteriellen Proteine, das Trägerprotein und andere Verunreinigungen in der unlöslichen Fraktion verbleiben. Das lösliche Material kann dabei durch Zentrifugation, durch Filtration oder durch ein beliebiges anderes geeignetes Trennverfahren vom unlöslichen Material separiert werden. Dabei können zur Abtrennung dieser Materialien verschiedene Zentrifugen sowie verschiedene Filtrationsvorrichtungen, Filtrationssysteme oder Filtrationsverfahren eingesetzt werden. Es wurden eine Reihe unterschiedlicher derartiger Filtrationsvorrichtungen, Filtrationssysteme und Filtrationsverfahren eingesetzt, um das lösliche Material von dem unlöslichen Material abzutrennen, wie z.B. die Dead-end-Filtration (Tiefenfiltration) oder die Tangentialfluss-Filtration. Eine zusammenfassende Darstellung der Ergebnisse der exemplarischen Filtrationsversuche zur Trennung des löslichen Materials vom unlöslichen Material ist in Tabelle 12 aufgeführt.
TABELLE 12
Diese Ergebnisse zeigen, dass eine Reihe unterschiedlicher Filtrationsvorrichtungen, Filtrationssysteme und Filtrationsverfahren erfolgreich eingesetzt werden können, um das lösliche Material vom unlöslichen Material zu trennen.
2. Aufreinigung
Nach der Fermentierung von E. coli E104 (pING4702), wie in Beispiel 2 beschrieben, wurden die Bakterienzellen in der nicht prozessierten Fermentationsbrühe in verdünnter HCl hydrolysiert. Dazu wurden 40 ml der Fermentationsbrühe durch die Zugabe von konzentrierter HCl auf einen pH von 2,15 eingestellt. Die Probe wurde bei 85°C 5,5 Stunden inkubiert. Die hydrolysierten Zellen wurden dann abzentrifugiert, um das unlösliche Material zu entfernen; der Überstand wurde durch die tropfenweise Zugabe von 500 mM Natriumcitrat auf einen pH von 3,0 eingestellt.
Eine 21,6 ml SP-Sepharose-Säule (Amersham-Pharmacia, Piscataway, NJ), 2,5 × 4,4 cm, wurde mit 10 mM Natriumcitrat, pH 3,0, equlibriert und die Probe aufgetragen. Die Säule wurde mit 10 mM Natriumcitrat, pH 3,0 Puffer gewaschen und dann mit 10 mM Natriumphosphat, pH 7,0, eluiert, bis der pH des Säulenablaufs bei 7 lag. Die Säule wurde dann mM 10 mM Natriumphosphat, 150 mM NaCl, pH 7,0 gewaschen. Die Säule wurde mit 10 mM Natriumphosphat, 800 mM NaCl pH 7,0, eluiert und anschießend mit 10 mM Natriumphosphat, 2 M NaCl resuspendiert. Das SP Sepharose-Eluat wurde mit einem Teil 10 mM Natriumphosphat, 3 M Ammoniumsulfat, pH 7,0, verdünnt.
Eine 3,1 ml Butyl-Sepharose-Säule (Amersham-Pharmacia), 1 × 4 cm, wurde mit 10 mM Natriumphosphat, 1,5 M Ammoniumsulfat, pH 7,0, equlibriert und die Probe aufgetragen. Die Butyl-Sepharose-Säule wurde mit 10 mM Natriumphosphat, 1,1 M Ammoniumsulfat, pH 7,0, gewaschen und anschließend mit 10 mM Natriumphosphat, 0,4 M Ammoniumsulfat, pH 7,0, eluiert. Die Säule wurde dann mit 10 mM Natriumphosphat, pH 7,0, resuspendiert.
Anschließend wurden die Peptidkonzentrationen in der Fraktion der SP-Sepharose-Säule und in der Fraktion der Butyl-Sepharose-Säule mittels HPLC analysiert. Die Probenvolumina, Peptidkonzentrationen und der Prozentsatz der rückgewonnenen Peptide ist in Tabelle 13 aufgeführt.
TABELLE 13
Eine 107 ml Superdex 30 Säule (Amersham-Pharmacia), 1,6 × 53 cm, wurde mit 5 mM Natriumacetat, 150 mM NaCl, pH 5,0, equilibriert. 8 ml des Butyl-Sepharose-Eluats wurden auf die Superdex 30 Gelfiltrationssäule aufgetragen und die Säule dann mit 5 mM Natriumacetat, 150 mM NaCl, pH 5,0 geladen. Nachdem 32 ml durch die Säule geflossen waren, wurden 3 ml der Fraktionen aufgefangen. Die Fraktionen 12–19 wurden gepoolt und wiesen ein Volumen von ca. 20 ml auf. Die Konzentration der rekombinanten Peptide in dem Superdex 30-Pool lag bei 0,107 mg/ml, bei einer Rückgewinnung von 102% aus dem vorangegangenen Schritt; die Rückgewinnung aus dem Säurehydrosylat der Zellen betrug 76,6%. Der endgültige Reinheitsgrad der Peptide betrug 97,4%.
BEISPIEL 7
Tests zur biologischen Aktivität rekombinanter Peptide
Eine Reihe unterschiedlicher rekombinanter Peptide, einschließlich der BPI-abgeleiteten Peptide, die die Sequenzen aufweisen, die im hiermit zitierten US-Patent Nr. 5.851.802 aufgelistet sind, können mit den rekombinanten Verfahren dieser Erfindung hergestellt und anhand der bekannten Aktivitätstests auf ihre biologische Aktivität hin getestet werden. So können Tests zur antimikrobiellen Aktivität (einschließlich der fungiziden und der bakteriziden Aktivität) durchgeführt werden, einschließlich Radialdiffusionstests. Mit rekombinanten Proteinen, die gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellt wurden, können eine Reihe von Tests mit unterschiedlichen Pilz- und Bakterienzellen durchgeführt werden, einschließlich der in US-Patent Nr. 5.851.802 beschriebenen Tests (siehe Beispiel 6).
So wurden beispielsweise Versuchen durchgeführt, um die fungizide Aktivität des rekombinanten Peptids von pING4702 zu untersuchen, das nach dem in Beispiel 6 beschriebenen Verfahren gereinigt wurde, und zwar mit Hilfe eines Mikrodilutionstests mit vier Stämmen von C. albicans, C. glabrata und S. cerevisiae. Ein ähnliches Peptid (XMP.391), das chemisch synthetisiert wurde, wurde als positive Kontrolle ebenfalls für den Test herangezogen. Zur Durchführung des Mikrodilutionstests wurden die Pilzkulturen über Nacht bei 30°C in einem YPD-Medium (1% Hefeextrakt, 2% Pepton und 2% Dextrose) angezüchtet. Dann wurden die einzelnen Kulturen in dem YPD-Medium 400-fach verdünnt und 8 Stunden lang bei 30°C angezüchtet Von jeder Kultur wurden 3 ml abzentrifugiert und in 0,9% NaCl suspendiert, bis eine A600 von etwa 0,3 erreicht war. Diese Kulturen wurden dann nochmals in einer Sabouraud-Dextrose-Bouillon (6 ml) bis auf 1 × 104 CFU/ml verdünnt. Die Konzentration des rekombinanten Peptids in 5 mM Acetat, 150 mM NaCl, pH 5,0 betrug etwa 2 mg/ml. Die Konzentration des synthetischen Peptids betrug etwa 1 mg/ml. Die Proben wurden serienmäßig verdünnt und in Mikrotiterplatten gegeben, die die Kulturen enthielten. Die Platten wurden 48 Stunden lang bei 30°C inkubiert, bevor die Wachstumshemmung bestimmt wurde. Die Testergebnisse sind in Tabelle 14 aufgeführt.
TABELLE 14
Daneben oder alternativ dazu können Tests durchgeführt werden, um die Aktivität der rekombinant hergestellten Peptide bezüglich ihrer Endotoxinbindung bzw. Endotoxinneutralisierung zu beurteilen. Dazu können eine Reihe unterschiedlicher Tests verwendet werden, einschließlich der Tests, die in den anteilig gehaltenen US-Patenten Nr. 5.733.872 und 5.763.567 [WO 94/20532 (PCT/US94/02465)]; 5.652.332 und 5.856.438 [WO 95/19372 (PCT/LTS94/10427)]; 5.858.974 [WO 96/08509 (PCT/US95/09262) und WO 97/04008 (PCT/US96/03845)] beschrieben sind und die hiermit vollständig zitiert werden.
Daneben oder alternativ dazu können Tests durchgeführt werden, um die Aktivität der rekombinant hergestellten Peptide bezüglich ihrer Heparinbindung bzw. Heparinneutralisierung zu beurteilen. Dazu können eine Reihe unterschiedlicher Tests verwendet werden, wie z.B. die Tests, die in den anteilig gehaltenen US-Patenten Nr. 5.348.942; 5.639.727; 5.807.818; 5.837.678; und 5.854.214 [WO 94/20128 (PCT/US94/02401)]; 5.733.872 und 5.763.567 [WO 94/20532 (PCT/US94/02465)]; 5.652.332 und 5.856.438 [WO 95/19372 (PCT/US94/10427)] (hiermit vollständig zitiert) beschrieben.
Es versteht sich, dass in dieser Veröffentlichung nur ganz bestimmte spezifische Umsetzungen der Erfindung genannt werden, und dass alle Veränderungen oder Alternativen, die in Sinn und Umfang mit diesem Verfahren gleichwertig sind, von den weiter unten aufgeführten Patentansprüchen abgedeckt sind. Insbesondere bei der praktischen Umsetzung dieser Erfindung sind seitens fachkundiger Personen nach Veröffentlichung dieser Erfindung zahlreiche Modifikationen und Variationen zu erwarten. Daher ist der Umfang dieser Erfindung allein durch die weiter unten aufgeführten Patentansprüche begrenzt.
SEQUENZENLISTEN

Claims

Verfahren zum Erhalten eines Peptids aus Bakterienzellen nach der Expression eines Fusionsproteins innerhalb der Zellen, wobei das Fusionsprotein das Peptid, ein Trägerprotein und eine durch Säure spaltbare Stelle zwischen dem Peptid und dem Trägerprotein umfaßt, dadurch gekennzeichnet, daß das Verfahren die Behandlung der Bakterienzellen mit Säure umfaßt, um in einem einzigen Schritt die Zellen aufzubrechen oder zu lysieren und das Peptid von dem Fusionsprotein freizusetzen.
Verfahren nach Anspruch 1 mit dem zusätzlichen Schritt, das freigesetzte Peptid abgetrennt von den aufgebrochenen oder lysierten Zellen zu erhalten.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei das freigesetzte Peptid von den aufgebrochenen oder lysierten Zellen durch eine Abtrennungs-Vorrichtung abgetrennt wird.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei die Abtrennungs-Vorrichtung eine Zentrifugations-Vorrichtung ist.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei die Abtrennungs-Vorrichtung eine Filtrations-Vorrichtung ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die durch Säure spaltbare Stelle in dem Fusionsprotein Asp-Pro ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das Trägerprotein innerhalb der Bakterienzellen als ein unlösliches Protein exprimiert wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei das Trägerprotein ein kationisches Trägerprotein ist.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei das Trägerprotein die D-Untereinheit des humanen osteogenen Proteins ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei die Bakterienzelle E. coli ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei das Peptid ein BPI-abgeleitetes Peptid ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei sich die Bakterienzellen für die Säurebehandlung in Zellkultur-Medium befinden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei die Bakterienzellen für die Säurebehandlung von dem Zellkultur-Medium abgetrennt werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei die Bakterienzellen für die Säurebehandlung in dem Zellkultur-Medium in einem Fermentationskessel vorliegen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, wobei die Säure HCl, H₂SO₄ oder HNO3 ist.
Verfahren zum Erhalten eines Peptids aus Bakterienzellen nach der Expression eines Fusionsproteins innerhalb der Zellen, wobei das Fusionsprotein das Peptid, ein Trägerprotein und eine durch Säure spaltbare Stelle zwischen dem Peptid und dem Trägerprotein umfaßt, dadurch gekennzeichnet, daß das Verfahren umfaßt: (a) Behandlung der Bakterienzellen mit Säure, um die Zellen aufzubrechen oder zu lysieren und das Peptid von dem Fusionsprotein in einem einzigen Schritt freizusetzen, (b) Abtrennung des löslichen Materials von dem unlöslichen Material nach Schritt (a), und (c) Rückgewinnung des freigesetzten Peptids in dem löslichen Material nach Schritt (b).
Verfahren nach Anspruch 16, wobei das lösliche Material von dem unlöslichen Material durch eine Abtrennungs-Vorrichtung getrennt wird.
Verfahren nach Anspruch 17, wobei die Abtrennungs-Vorrichtung eine Zentrifugations-Vorrichtung ist.
Verfahren nach Anspruch 17, wobei die Abtrennungs-Vorrichtung eine Filtrations-Vorrichtung ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 16 bis 19, wobei die durch Säure spaltbare Stelle in dem Fusionsprotein Asp-Pro ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 16 bis 20, wobei das Trägerprotein innerhalb der Bakterienzelle als ein unlösliches Protein exprimiert wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 16 bis 21, wobei das Trägerprotein ein kationisches Trägerprotein ist.
Verfahren nach Anspruch 22, wobei das Trägerprotein die D-Untereinheit des humanen osteogenen Proteins ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 16 bis 23, wobei die Bakterienzelle E. coli ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 16 bis 24, wobei das Peptid ein BPI-abgeleitetes Peptid ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 16 bis 25, wobei die Bakterienzellen für die Säurebehandlung in Zellkultur-Medium vorliegen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 16 bis 25, wobei die Bakterienzellen für die Säurebehandlung von dem Zellkultur-Medium abgetrennt werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 16 bis 26, wobei die Bakterienzellen für die Säurebehandlung in dem Zellkultur-Medium in einem Fermentationskessel vorliegen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 16 bis 28, wobei die Säure HCl, H2_SO₄ oder HNO₃ ist.