DE69937272T2 - Verfahren zur herstellung eines peptids mittels eines hilfspeptids - Google Patents

Verfahren zur herstellung eines peptids mittels eines hilfspeptids Download PDF

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Description

  • Technisches Gebiet
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Peptiden unter Verwendung der genetischen Rekombinationstechnologie.
  • Technischer Hintergrund
  • Viele biologisch aktive Peptide sind durch genetische Rekombinationstechnologie unter Verwendung von Mikroorganismen, tierischen Zellen und ähnlicher als Wirte hergestellt worden. Als Verfahren zum Herstellen eines Peptids von Interesse sind das so genannte direkte Expressionsverfahren, wie beispielsweise ein Verfahren zur extrazellulären Sekretion eines Peptids, oder ein Verfahren zum Exprimieren eines Peptids vom N-Terminus in der Zelle bekannt; oder ein Verfahren zum Exprimieren eines Fusionsproteins, bei dem ein Schutzpeptid an den N-Terminus oder den C-Terminus eines Peptids angefügt worden ist, oder ähnliche. Verfahren sind verwendet worden, in denen ein Peptid von Interesse entweder innerhalb oder außerhalb der Zelle exprimiert wird, wobei das Expressionsprodukt dann einer chemischen oder enzymatischen Spaltung oder Modifikation unterworfen wird, um das Peptid von Interesse herzustellen, welches dann in einem Reinigungsprozess gereinigt wird, um das Peptid hervorzubringen.
  • Für die Produktion von Peptiden mit niedrigem Molekulargewicht wird im Allgemeinen das Fusionsprotein-Expressionsverfahren, das oben erwähnt wurde, verwendet, um die Degradierung des Proteins durch intrazelluläre proteolytische Enzyme zu verhindern. In diesem Fall sind Verfahren verwendet worden, in denen nach der intrazellulären Expression eines Fusionsproteins mit einer Spaltstellenregion, die daran zwischen dem Peptid von Interesse und dem Schutzpeptid angefügt worden ist, wobei diese Spaltstellenregion so entworfen wurde, dass die Spaltung durch eine chemische oder enzymatische Reaktion ermöglicht wird, wobei das Peptid von Interesse vom Fusionsprotein durch chemische oder enzymatische Mittel abgespalten wird und das Peptid durch eine Präzipitierung oder ein chromatographisches Verfahren isoliert und gereinigt wird.
  • Des Weiteren wird, wenn das Protein von Interesse ein Protein ist, dessen C-Terminus amidiert worden ist, wie beispielsweise Calcitonin, ein Peptid mit einem Glycinrest, der an das C-terminale Ende dieses Peptids angefügt worden ist als Teil eines Fusionsproteins exprimiert, wobei das Gly cin-verlängerte Peptid von Interesse vom Fusionsprotein durch proteolytisches Enzym abgespalten wird, und einem amidierenden Enzym, welches ein modifizierendes Enzym ist, wird ermöglicht, auf das Peptid einzuwirken, um ein amidiertes Peptid zu gewinnen, und das amidierte Peptid von Interesse wird durch Reinigungsverfahren erhalten.
  • Wenn jedoch die Produktion von Peptiden in industriellem Maßstab gewünscht wird, können zahlreiche Probleme bezüglich der Löslichkeit und der Gelierung des Peptids von Interesse unter zahlreichen Bedingungen zur Abspaltung und bei Modifikationsreaktionen, der Konzentration einer Probe, die auf die Säule in einem Chromatographieverfahren geladen wird, den Elutionsbedingungen von der Säule, der Stabilität nach der Elution und ähnlichen entstehen. Die meisten der Probleme werden durch verschiedene physikochemische Eigenschaften des Peptids von Interesse verursacht.
  • Hinsichtlich des Peptids von Interesse kann beispielsweise menschliches Glucagon-ähnliches Peptid-1 (nachfolgend bezeichnet als GLP-1; Bell GI et al., Nature, Vol. 304, S. 368–371, 1983) und Derivate von GLP-1 (nachfolgend bezeichnet als GLP-1-Derivate) mit einer insulinotropen Aktivität erwähnt werden. GLP-1 ist ein Peptid, das aus 37 Aminosäureresten besteht, welche vom Präproglucagon abstammen. Durch die Prozessierung von Präproglucagon ist GLP-1(7-37), bei dem 6 Aminosäuren am N-Terminus von GLP-1 deletiert sind und GLP-1(7-36)NH2, bei dem der C-Terminus von GLP-1(7-36) in einer Amidform modifiziert worden ist, biosynthetisch hergestellt worden (Mojsow, S. et al., J. Clin. Invest. Vol. 79, S. 616–619, 1987). Da diese Peptidhormone die Aktivität besitzen, die Sekretion von Insulin durch Einwirkung auf die Beta-Zellen in der Bauchspeicheldrüse zu fördern, ist die Möglichkeit, dass sie aufgrund ihrer pharmakologischen Wirkung als Kandidaten therapeutischer Mittel für Diabetiker wirken, in den vergangenen Jahren vorgeschlagen worden (Gutniak M. K. et al., New England Medicine, Vol. 326, S. 1316–1322, 1992; Nathan D. M. et al., Diabetes Care, Vol. 15, S. 270–275, 1992).
  • Als Verfahren zur Herstellung des oben genannten Peptids kann ein Fall in Erwägung gezogen werden, bei dem das Peptid durch ein Fusionsprotein-Expressionsverfahren unter Verwendung von E. coli etc. als Wirt in dem konventionellen Verfahren hergestellt wird, das oben erwähnt wurde. Im Fall von GLP-1(7-37), wird es beispielsweise als ein Fusionsprotein exprimiert, bei dem ein Schutzpeptid an das N-terminale oder C-terminale Ende des GLP-1(7-37) durch eine Spaltstellenregion zum Ausschneiden von GLP-1(7-37) angefügt worden ist entweder auf chemischem oder enzymatischem Weg vom Fu sionsprotein, und dann kann GLP-1(7-37) von dem Fusionsprotein entweder chemisch oder enzymatisch abgespalten werden, um GLP-1(7-37) herzustellen. Und GLP-1(7-36)NH2 kann durch Hinzufügen einer Modifikationsschritt-Reaktion zu dem oben erwähnten Verfahren hergestellt werden. So wird GLP-1(7-37), wie oben erwähnt, als ein Fusionsprotein als Substrat für ein Amidierungsenzym zur Amidierungs-Modifikationsreaktion exprimiert, wobei GLP-1(7-37) als ein Zwischenprodukt-Peptid für die Herstellung von GLP-1(7-36)NH2 angesehen werden kann. GLP-1(7-37) wird vom Fusionsprotein entweder chemisch oder enzymatisch abgespalten, und dann wird das so erhaltene GLP-1(7-37) einer Amidierungs-Modifikationsreaktion unter Verwendung eines Amidierungsenzyms unterworfen, um das gewünschte GLP-1(7-36)NH2 herzustellen.
  • Selbst jedoch, wenn die oben erwähnten Verfahren verwendet werden, um ein Peptid von Interesse, ein GLP-1-Derivat mit insulinotroper Aktivität herzustellen, können unerwünschte Probleme in den Produktionsverfahren entstehen. So sind Produktionsverfahren, die das günstige Zur-Verfügung-Stellen in industriellem Maßstab erlauben, noch nicht etabliert worden, und dadurch gibt es einen großen Bedarf für die Etablierung solcher Verfahren.
  • Beispielsweise wird als Verfahren zum Herstellen von GLP-1(7-37) als Peptid von Interesse ein Fusionsprotein, das ein Schutzpeptid und GLP-1(7-37) in einem konventionellen Verfahren exprimiert, wie oben erwähnt wurde, und GLP-1(7-37) kann durch direktes Abspalten von diesem Protein hergestellt werden. So können die Reinigungsschritte des Produktionsverfahrens (1) den enzymatischen Spaltschritt von GLP-1(7-37) vom Fusionsprotein verwenden und (2) einen Chromatographieschritt. Da jedoch GLP-1(7-37) leicht geliert oder während der Reinigung aggregiert, können manchmal Probleme bei den Produktionsverfahren entstehen, die von den physikochemischen Eigenschaften abhängen, beispielsweise die auffällig reduzierte Ausbeute und die Unfähigkeit der Harz-Regenerierung. Sobald es geliert ist, können, obwohl es bei pH 10 oder darüber gelöst wird und gereinigt werden kann, Probleme, wie unerwünschte Modifikation und Konformationsänderungen auftreten (Senderoff RI et al., J. Pharm. Sci., Vol. 87, S. 183–189, 1998).
  • Des Weiteren, wenn das Peptid von Interesse ein amidiertes Peptid GLP-1(7-36)NH2 ist, können Probleme bezüglich der Amidierungsreaktion auftreten. So reicht der optimale pH von enzymatischen Amidierungsreaktionen ungefähr von leicht sauer bis neutral, wohingegen die theoretischen isoelektrischen Punkte von GLP-1(7-37) und GLP-1(7-36)NH2 pI = 5,5 beziehungsweise pI = 7,5 sind. Wenn daher eine enzymatische Umwandlung von GLP-1(7-37) beim optimalen pH eines Amidierungsenzyms durchgeführt wird, welcher nahe dem isoelektrischen Punkt des Substrats GLP-1(7-37) liegt, wird vermutet, dass GLP-1(7-37) dazu neigt, ein isoelektrisches Präzipitat zu bilden.
  • Da ferner GLP-1(7-36)NH2, welches sich durch das präzipitierte GLP-1(7-37) bildete, ebenfalls copräzipitiert, könnten die Enzymreaktionen nicht vollständig ablaufen, was Probleme bei den Produktionsverfahren verursacht. Des Weiteren können ebenfalls Probleme bezüglich der Reinigung entstehen, da GLP-1(7-36) ebenfalls ein Peptid ist, das dazu neigt, bei der Bearbeitung während des Säulenschrittes zu aggregieren und in der Säule zu gelieren. So ist es erwartet worden, dass GLP-1-Derivate ebenfalls die oben erwähnten Probleme in den Produktionsverfahren haben, die von den physikochemischen Eigenschaften stammen.
  • Bei der Herstellung von GLP-1(7-37), GLP-1(7-36)NH2 und GLP-1-Derivaten in industriellem Maßstab können die oben erwähnten Probleme Probleme bei der industriellen Produktion verursachen, die aus den physikochemischen Eigenschaften des Peptids von Interesse selbst stammen, was ernstzunehmende Probleme bezüglich der Ausbeute, der Verfahrenskontrolle und sogar der Produktionskosten verursacht.
  • Offenbarung der Erfindung
  • Es ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zum Herstellen eines Peptids von Interesse in einer wirksamen Weise durch Minderung der Probleme herzustellen, welche aus den physikochemischen Eigenschaften des Peptids von Interesse selbst hervorgehen (z. B. dem Problem der niedrigen Löslichkeit und der Gelierung in der chemischen und enzymatischen Reaktion und dem Reinigungsschritt in den Produktionsverfahren des Peptids von Interesse), wenn eine effiziente Produktion dieses Peptids von Interesse in industriellem Maßstab unter Verwendung der genetischen Rekombinationstechnik in Erwägung gezogen wird.
  • Der Begriff „das Peptid von Interesse der vorliegenden Erfindung" bedeutet, so wie es hier verwendet wird, nicht nur das endgültig erhaltene Peptid, sondern auch die Peptid-Zwischenprodukte, welche in dem Produktionsverfahren hierfür benötigt werden.
  • Um die oben erwähnten Probleme zu vermeiden, haben die vorstelligen Erfinder ein effizientes Verfahren zum Herstellen eines Peptids von Interesse durch Behebung der Probleme des Peptids von Interesse durch Anfügen eines Hilfspeptids an das Peptid von Interesse gefunden. So stellt die vor liegende Erfindung ein Verfahren, das in den Ansprüchen definiert ist, bereit.
  • Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • 1 stellt das Verfahren zum Herstellen des Peptids von Interesse unter Verwendung eines Hilfspeptids dar.
  • 2 ist eine Zeichnung, die ein Verfahren zum Herstellen von pG117S4HR6GLP-1 zeigt.
  • 3 ist eine Zeichnung, die ein Verfahren zum Herstellen von pGP117S4HompRHKR zeigt.
  • 4 ist eine Zeichnung, die ein Verfahren zum Herstellen von pGP117S4HompRHPR zeigt.
  • 5 ist eine Zeichnung, die ein Verfahren zum Herstellen von pGP97ompPR zeigt.
  • 6 ist eine Zeichnung, die die Oligonucleotide und die Primer zeigt, die für die Herstellung von pGP97ompPR verwendet wurden.
  • 7 ist eine Zeichnung, die eine Aminosäuresequenz eines Fusionsproteins (GP97ompPR) zeigt, welche durch pGP97ompPR kodiert werden. Der unterstrichene Teil zeigt die Aminosäuresequenz an, die von GLP-1(7-37) stammt, und der doppelt unterstrichene Teil zeigt die Sequenz des Hilfspeptids an. 4, zeigt die Spaltstelle durch die E. coli OmpT-Protease an, und der Pfeil nach der doppelten Unterstreichung zeigt die Spaltstelle durch die Kex2-Protease an.
  • 8 ist eine Zeichnung, welche die Nucleotidsequenz der DNA des Fusionsproteins (GP97ompPR) zeigt, welche durch pG97ompPR kodiert wird, wobei die Region von A des Nucleotids Nr. 1 bis T des Nucleotids Nr. 462 das Fusionsprotein von GLP-1(7-37) kodiert. lac PO stellt die Promotor/Operator-Region des E. coli Lactose-Operons dar.
  • 9 ist eine Fotografie einer Electrophorese, welche die Kultivierung rekombinanter E. coli-Zellen und die Expression eines Fusionsproteins (GP97ompPR) zeigt. In der Figur sind die Ergebnisse der SDS-Polyacrylamidgel-Electrophorese der Proben zu den Probezeitpunkten a bis e gezeigt. Der Pfeil in der Figur zeigt die Bande des Fusionsproteins an.
  • 10 ist eine Zeichnung, die die Analyse der Spaltung eines Fusionsproteins (GP97ompPR) mit der E. coli OmpT-Protease anzeigt, welche in den Einschlusskörperchen vorhanden ist.
  • 11 ist eine Zeichnung, die die Aminosäuresequenz eines Fusionsproteins zeigt, welches durch pG117S4HR6GLP-1 kodiert wird. In der Figur zeigt der unterstrichene Teil eine Aminosäuresequenz an, die von GLP-1(7-37) stammt, und der doppelt unterstrichene Teil zeigt eine Aminosäuresequenz an, welche vom Hilfspeptid stammt.
  • 12 ist eine Zeichnung, die eine Aminosäuresequenz eines Fusionsproteins anzeigt, welche durch pGP117S4HompRHKR kodiert wird. In der Figur zeigt der unterstrichene Teil eine Aminosäuresequenz an, die von GLP-1(7-37) stammt, und der doppelt unterstrichene Teil zeigt eine Aminosäuresequenz an, welche vom Hilfspeptid stammt.
  • 13 ist eine Zeichnung, die eine Aminosäuresequenz des Fusionsproteins zeigt, welches von pGP117S4HompRHPR kodiert wird. In der Figur zeigt der unterstrichene Teil die Aminosäuresequenz an, die von GLP-1(7-37) stammt, und der doppelt unterstrichene Teil zeigt die Aminosäuresequenz an, welche von dem Hilfspeptid stammt.
  • 14 ist eine Zeichnung, die das Elutionsmuster von RHHGP[G] von dem SP-Spharose-Big-Beads zeigt, worin die Ausgangsposition der Eluierung durch den 4, gezeigt wird, und die zusammengefügten Fraktionen in der Figur gezeigt sind. Die Absorption wurde bei 280 nm gemessen.
  • 15 ist eine Zeichnung, die das Analysemuster in jedem Reinigungsschritt des Spaltverfahrens von GLP-1(7-37) von RHHGP[G] durch die Kex2-Protease zeigt. In der Figur zeigt A den Umkehrphasenpool vor der Spaltung durch die Kex2-Protease an, B nach der Spaltung mit der Kex2-Protease und C nach PorosR2. und 1 zeigt RHHGP[G] und 2 zeigt GLP-1(7-37) an.
  • 16 ist eine Zeichnung, welche die pH-Abhängigkeit der Amidierungsreaktion von RHHGP[G] zeigt.
  • 17 ist eine Zeichnung, die den zeitlichen Verlauf der Umwandlung von RHHGP[G] in RHHGP-1 in einer Amidierungsreaktion zeigt, wie durch Ionenaustausch-HPLC gemessen wurde, wobei 1 RHHGP[G] anzeigt und 2 RHHGP-1 anzeigt. Die Absorption wurde bei 280 nm gemessen.
  • Die Analysebedingung war wie folgt:
    Säule: Poros S/H, 4,6 mm I. D. × 50 mm
    Fließrate: 1,6 ml/min.
    Lösung A: 30 mM BR-Puffer, pH 6,0
    Lösung B: 30 mM BR-Puffer, pH 9,0
    Äquilibrierung: Lösung A
    Eluierung: Lösung B 0% → 100%, linearer pH-Gradient.
  • 18 ist eine Zeichnung, die die pH-Abhängigkeit der Kex2-Protease-Prozessierungsreaktion mit RHHGP-1 als Substrat zeigt.
  • 19 ist eine Zeichnung, die ein Eluierungsmuster und einen pH-Gradienten anzeigt, welcher bei der Reinigung von GLP-1(7-36)NH2 durch Macroprep High-S erzeugt wurde. Die Absorption wurde bei 280 nm gemessen.
  • 20 ist eine Zeichnung, die die Entfernung von Unreinheiten durch Macroprep High-S zeigt, wobei A die Probe zeigt, welche auf die Säule geladen wurde, B das analytische HPLC-Muster anzeigt. 1 zeigt GLP-1(7-37) an und 2 zeigt GLP-1(7-36)NH2 an. Die Absorption wurde bei 280 nm gemessen.
  • 21 ist eine Zeichnung, die zusammengefasst die analytischen HPLC-Muster der Proben in jedem Reinigungsverfahren in der Herstellung von GLP-1(7-36)NH2 bis zur ersten Spaltung mit OmpT zeigt, und die zweite Spaltung mit der Kex2-Protease. A zeigt das Umkehrphasen-HPLC-Muster nach OmpT an, B nach SP-Sepharose, C nach der Kex2-Reaktion, D nach Macroprep High-S und E nach Poros R2. 1 zeigt GP97ompPR an, 2 zeigt das Schutzpeptid an, 3 zeigt RHHGP[G] an, 4 zeigt RHHGP-1 und 5 GLP-1(7-36)NH2 an. Die Absorption wurde bei 280 nm gemessen.
  • Die Analysebedingung war wie folgt:
    Säule: YMC Protein RP, 4,6 mm i. D. × 50 mm
    Fließrate: 1,0 ml/min.
    Lösung A: 0,1% TFA/10% Acetonitril
    Lösung B: 0,1% TFA/60% Acetonitril
    Äquilibrierung: Lösung A
    Eluierung: Lösung B 44% → 74%/12 min.
  • 22 ist eine Zeichnung, die die pH-Abhängigkeit der Löslichkeit von RHHGP[G], RHHGP-1, GLP-1(7-37) und GLP-1(7-36)NH2 zeigt.
  • 23 ist eine Zeichnung, die die unterdrückende Wirkung auf die Aggregierung von RHHGP[G], RHHGP-1 und GLP-1(7-36)NH2 durch Tween 80 zeigt, wobei A die Unterdrückung der Aggregierung von RHHGP[G] und RHHGP-1 durch Tween 80 zeigt und B die Unterdrückung der Aggregierung von GLP-1(7-36)NH2 durch Tween 80 zeigt.
  • 24 ist eine Zeichnung, die die unterdrückende Wirkung auf die Aggregierung von GLP-1(7-36)NH2 durch NaCl und der Temperatur zeigt, wobei C die Unterdrückung der Aggregierung von GLP-1[G] durch NacT und D die Unterdrückung der Aggregierung von GLP-1(7-36)NH2 durch die Temperatur zeigt.
  • Ausführungsformen zur Durchführung der Erfindung
  • Das Hilfspeptid gemäß der vorliegenden Erfindung ist ein Peptid, das verwendet wird, um die Probleme der industriellen Produktion zu vermeiden, welche von den physikochemischen Eigenschaften des Peptids von Interesse selbst stammen. Unter den Problemen der industriellen Herstellung, welche von den physikochemischen Eigenschaften des Peptids von Interesse selbst stammen, wird besondere Aufmerksamkeit dem Problem den chemischen oder enzymatischen Reaktionen und der Reinigung während des Produktionsverfahrens dieses Peptids gezollt, wie beispielsweise den Problemen der Löslichkeit und der Gelierung des Peptids von Interesse unter verschiedenen Bedingungen zur Spaltung und in der Modifikationsreaktion, den Problemen der Probenkonzentrierung, die während der Säulenchromatographie-Verfahren auf die Säule geladen wird, das Problem der Elutionsbedingungen von der Säule und die Stabilität nach der Eluierung und ähnliches.
  • Das Hilfspeptid der vorliegenden Erfindung kann als passend in Abhängigkeit von den physikochemischen Eigenschaften des Peptids von Interesse hergestellt werden. Wenn beispielsweise der isoelektrische Punkt des Peptids entsprechend in Abhängigkeit von den physikochemischen Eigenschaften des Peptids von Interesse hergestellt wird. Beispielsweise, wenn der isoelektrische Punkt des Peptids von Interesse neutral bis schwach sauer ist, und der optimale pH-Wert während des Produktionsverfahrens ebenfalls neutral bis schwach sauer ist und dadurch die Löslichkeit des Peptids von Interesse bei einem solchen pH zu niedrig ist, dann wird das Hilfspeptid vorzugsweise so entworfen, dass der isoelektrische Punkt (pI) des Peptids von Interesse, an das ein Hilfspeptid angehängt worden ist, 8 bis 12 beträgt, und mehr bevorzugt 9 bis 11. Das Hilfspeptid der vorliegenden Erfindung kann entweder an den N-Terminus oder an den C-Terminus des Peptids von Interesse angehängt werden. Das Ausmaß (die Länge) eines Hilfspeptids ist bevorzugt 5 bis 50 Aminosäurereste, und mehr bevorzugt von 5 bis nicht mehr als 30 Aminosäureresten, aber es enthält mindestens eine basische Aminosäure oder saure Aminosäure.
  • Zusätzlich zu den oben erwähnten GLP-1-Derivaten schließen die Peptide von Interesse, die gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellt werden können, Peptide ein, die nicht mehr als 200 Aminosäurereste umfassen. Beispiele solcher Peptide schließen adrenocorticotropes Hormon, Adrenomedullin, Amylin, Angiotensin I, Angiotensin II, Angiotensin III, natriuturetisches Peptid vom A-Typ, natriuturetisches Peptid vom B-Typ, Bradykinin, großes Gastrin, Calcitonin, Calcitoningen-verwandtes Peptid, Cholecystokinin, Corticotropin-Freisetzungsfaktor, Cortistatin, natriuretisches Peptid vom C-Typ, Defensin 1, Delta-Schlaf-induzierendes Peptid, Dynorphin, Elafin, α-Endorphin, β-Endorphin, γ-Eridorphin, Endothelin-1, Endothelin-2, Endothelin-3, großes Endothelin-1, großes Endothelin-2, großes Endothelin-3, Enkephalin, Galanin, großes Gastrin, Gastrin, Magen-inhibitorisches Poly- Peptid (GIP), Gastrin-Freisetzungspeptid, Glucagon, Glucagon-ähnliches Peptid-2, Wachstumshormon-Freisetzungsfaktor, Wachstumshormon, Guanylin, Uroguanylin, Histatin 5, Insulin, Joining Peptide, luteinisierendes Hormon freisetzendes Hormon, Melanocyten stimulierendes Hormon, Midkin, Motilin, Neurokinin A, Neurokinin B, Neuromedin B, Neuromedin C, Neuropeptid Y, Neurotensin, Oxytocin, Proadrenomedullin N-terminales 20 Peptid, Cromogranin A, Paraschildrüsenhormon, PTH-verwandtes Peptid, Peptid Histidin-methionin-27, Schilddrüsenadenylatcyclase-aktivierendes Polypeptid 38, Plättchenfaktor 4, Peptid T, Secretin, Serumthymusfaktor, Somatostatin, Substanz P, Thyrotropin-freisetzendes Hormon, Urocortin, vasoaktives intestinales Peptid, Vasopressin und die Derivate davon etc. ein.
  • Als GLP-1-Derivate können zusätzlich zu den oben erwähnten GLP-1(7-37) und GLP-1(7-36)NH2 Peptide mit einer insulinotropen Wirkung erwähnt werden, bei denen Aminosäurereste ersetzt worden, hinzugefügt worden sind und/oder vom GLP-1-Peptid, umfassend 37 Aminosäurereste, deletiert worden sind, Peptide mit einer insulinotropen Aktivität, bei denen die Aminosäuren dieses Peptids weiter modifiziert worden sind (beispielsweise in eine amidierte Form) und Peptide mit einer insulinotropen Aktivität, welche aus Kombinationen daraus gewonnen werden.
  • Weiter sind als GLP-1-Derivate, die entsprechend gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt worden sind, solche GLP-1-Derivate, die isoelektrische Punkte von 4,5 bis 9,0 haben, bevorzugt. Mehr bevorzugt sind es GLP-1-Derivate mit isoelektrischen Punkten von 5,5 bis 7,5.
  • Als GLP-1-Derivate können zusätzlich zu den oben erwähnten die folgenden erwähnt werden:
    GLP-1(7-34), GLP-1(7-35), GLP-1(7-36), GLP-1(7-34)NH2, GLP-1(7-35)NH2 und GLP-1(7-37)NH2;
    GLP-1(7-37)-Arg, GLP-1(7-37)-Arg-Arg, GLP-1(7-37)-Lys, GLP-1(7-37)-Lys-Lys, GLP-1(7-37)-Lys-Arg, und GLP-1(7-37)-Arg-Lys, und die C-terminalamidierten Formen davon;
    GLP-1(7-37) und GLP-1(7-36)NH2, in dem die Aminosäureposition 8, Ala, von GLP-1 substituiert worden ist mit Thr, Gly oder Ser;
    GLP-1(7-37) und GLP-1(7-36)NH2, in dem die Aminosäureposition 26, Lys, von GLP-1 substituiert worden ist mit Arg;
    GLP-1(7-37) und GLP-1(7-36)NH2, in dem die Aminosäureposition 34, Lys, von GLP-1 substituiert worden ist mit Arg;
    GLP-1(7-37) und GLP-1(7-36)NH2, in dem die Aminosäureposition 36, Arg, von GLP-1 substituiert worden ist mit Lys;
    GLP-1(7-37) und GLP-1(7-36)NH2, in dem die Aminosäureposition 8, Ala, von GLP-1 substituiert worden ist mit Thr, Gly oder Ser, und die Aminosäureposition 26, Lys, substituiert worden ist mit Arg;
    GLP-1(7-37) und GLP-1(7-36)NH2, in dem die Aminosäureposition 8, Ala, von GLP-1 substituiert worden ist mit Thr, Gly oder Ser, und die Aminosäureposition 34, Lys, substituiert worden ist mit Arg;
    GLP-1(7-37) und GLP-1(7-36)NH2, in dem die Aminosäureposition 8, Ala, von GLP-1 substituiert worden ist mit Thr, Gly oder Ser, und die Aminosäureposition 36, Arg, substituiert worden ist mit Lys;
    GLP-1(7-37) und GLP-1(7-36)NH2, in dem die Aminosäureposition 26, Lys, von GLP-1 substituiert worden ist mit Arg, und die Aminosäureposition 34, Lys, substituiert worden ist mit Arg;
    GLP-1(7-37) und GLP-1(7-36)NH2, in dem die Aminosäureposition 26, Lys, von GLP-1 substituiert worden ist mit Arg, und die Aminosäureposition 36, Arg, substituiert worden ist mit Lys;
    GLP-1(7-37) und GLP-1(7-36)NH2, in dem die Aminosäureposition 34, Lys, von GLP-1 substituiert worden ist mit Arg, und die Aminosäureposition 36, Arg, substituiert worden ist mit Lys;
    GLP-1(7-37) und GLP-1(7-36)NH2, in dem die Aminosäureposition 8, Ala, von GLP-1 substituiert worden ist mit Thr, Gly oder Ser, die Aminosäureposition 26, Lys, von GLP-1 substituiert worden ist mit Arg, und die Aminosäureposition 34, Lys, substituiert worden ist mit Arg;
    GLP-1(7-37) und GLP-1(7-36)NH2, in dem die Aminosäureposition 8, Ala, von GLP-1 substituiert worden ist mit Thr, Gly oder Ser, die Aminosäureposition 26, Lys, von GLP-1 substituiert worden ist mit Arg, und die Aminosäureposition 36, Arg, substituiert worden ist mit Lys;
    GLP-1(7-37) und GLP-1(7-36)NH2, in denen die Aminosäureposition 8, Ala, von GLP-1 substituiert worden ist mit Thr, Gly oder Ser, die Aminosäureposition 34, Lys, von GLP-1 substituiert worden ist mit Arg, und die Aminosäureposition 36, Arg, substituiert worden ist mit Lys;
    GLP-1(7-37) und GLP-1(7-36)NH2, in dem die Aminosäureposition 26, Lys, von GLP-1 substituiert worden ist mit Arg, die Aminosäureposition 34, Lys, von GLP-1 substituiert worden ist mit Arg, und die Aminosäureposition 36, Arg, substituiert worden ist mit Lys; und
    GLP-1(7-37) und GLP-1(7-36)NH2, in dem die Aminosäureposition 8, Ala, von GLP-1 substituiert worden ist mit Thr, Gly oder Ser, die Aminosäureposition 26, Lys von GLP-1 substituiert worden ist mit Arg, und die Aminosäureposition 36, Arg, substituiert worden ist mit Lys;
  • Im Fall von GLP-1(7-37) als Beispiel des Peptids von Interesse kann ein Hilfspeptid mit basischen Aminosäuren an GLP-1(7-37) angefügt werden und kann dann für die Herstellung von GLP-1(7-37) verwendet werden, um die Probleme der Reinigungsverfahren, wie beispielsweise die Gelierung und die Löslichkeit von GLP-1(7-37) zu erleichtern. Das bedeutet, dass durch die Anfügung des Hilfspeptids an GLP-1(7-37) der isoelektrische Punkt von GLP-1(7-37) auf die alkalische Seite verschoben werden kann, und dadurch kann die Hydrophilität erhöht werden, um die Probleme der Reinigungsverfahren, wie beispielsweise die Aggregierung (Gelierung) in der Säule zu verhindern. Des Weiteren ist es durch die Anfügung dieses Hilfspeptids an GLP-1(7-37) möglich geworden, ein Peptid, das das Hilfspeptid und GLP-1(7-37) umfasst, in hoher Reinheit und in hoher Ausbeute in dem ersten chromatographischen Verfahren zu isolieren, was zu einer erhöhten Ausbeute an GLP-1(7-37) führt, was darauf hindeutet, dass die Verwendung eines Hilfspeptids in diesen Verfahren sehr nützlich ist.
  • Im Fall von GLP-1(7-36)NH2 als Beispiel des Peptids von Interesse ist es notwendig, zu erst ein Zwischenprodukt (dieses Peptid ist genauer gesagt GLP-1(7-37)) als Peptid von Interesse zu gewinnen, da GLP-1(7-36)NH2 ein amidiertes Peptid ist. So kann ein Hilfspeptid mit einer basischen Aminosäure an GLP-1(7-37) angefügt werden, welches für die Produktion von GLP-1(7-36)NH2 verwendet wird. Durch Anfügen eines Hilfspeptids mit einer basischen Aminosäure kann der isoelektrische Punkt von GLP-1(7-37) auf die alkalische Seite verschoben werden und dadurch kann die Präzipitatbildung aufgrund der erhöhten Löslichkeit des Peptids mit einem Hilfspeptid, das an GLP-1(7-37) angefügt worden ist, bei dem pH der enzymatischen Amidierungsreaktionsflüssigkeit in der folgenden Amidierungsmodifikationsreaktion unterdrückt werden und dadurch können die Gewinnung und die Ausbeute erhöht werden. Durch Anfügen eines hydrophilen Hilfspeptids, das eine basische Aminosäure enthält, kann die Löslichkeit des Peptids von Interesse ebenfalls erhöht werden, und ferner kann die Aggregierung von GLP-1(7-37) als Substrat in der Amidierungsmodifikationsreaktion und GLP-1(7-36)NH2 als Produkt vermieden werden, wodurch angezeigt wird, dass die Anfügung in dem Reinigungsverfahren nach der enzymatischen Amidierungsreaktion sehr nützlich ist.
  • In jedem der oben erwähnten Fälle hat das Peptid mit dem an GLP-1(7-37) angefügten Hilfspeptid vorzugsweise einen isoelektrischen Punkt von 8 bis 12. Indem dieses Peptid gegenüber einer Einwirkung eines Katio nen-Austauschharzes unterworfen wird, kann das Peptid in hohen Mengen (98% oder darüber) gewonnen werden.
  • Um das Peptid von Interesse aus dem Peptid zu gewinnen, das ein Hilfspeptid daran angefügt hat, wird eine Spaltstellenregion eingeschleust, die die chemische oder enzymatische Spaltung zwischen dem Hilfspeptid und dem Peptid von Interesse ermöglicht. Für die Spaltstellenregion wird ebenfalls eine Spaltstellenregion mit einer großen Spalteffizienz, abhängig von den physikochemischen Eigenschaften, entworfen, die das Peptid von Interesse besitzt. Als enzymatische und chemische Spaltverfahren sind solche, die in Methods in Enzymology, Vol. 185, Gene Expression Technology (David V. Goeddel ed., veröffentlicht von Academic Press, Inc.) beschrieben worden sind, ebenfalls verwendbar.
  • Als chemisches Spaltverfahren können ein Verfahren werden, bei dem das C-terminale Ende des Methionins durch Cyanogenbromid (D. V. Goeddel et al., Proc. Natr. Acad. Sci. U.S.A., Vol. 76, S. 106–110, 1979) abgespalten wird, ein Verfahren, bei dem die -Asp-Pro-Sequenz durch Ameisensäure abgespalten wird (Biochem. Biophys. Res. Commun. Vol. 40, S. 1173, 1970), ein Verfahren, bei dem die -Asn-Gly-Sequenz durch Hydroxylamin abgespalten wird, ein Verfahren, bei dem das C-terminale Ende des Trypsins durch BNPS-Skatol oder N-Chlorsuccinimid abgespalten wird und ähnliche. Wenn Methionin nicht in einer solchen Aminosäuresequenz des Peptids von Interesse enthalten ist, wird Methionin am Ende der Spaltstellenregion neben dem Peptid von Interesse eingeschleust, und eine chemische Spaltung durch Cyanogenbromid an der Spaltstellenregion kann durchgeführt werden.
  • Als enzymatische Spaltmethode ist es notwendig, eine Spaltstellenregion zu entwerfen, die spezifisch als Substrat für ein Enzym erkannt werden kann, welches für die Spaltungsbehandlung verwendet wird. Beispiele für solche Verfahren schließen die Spaltung von: der -X-Gly-Sequenz der X-Gly oder der Pro-X-Gly-Pro-Sequenz mit Collagenase ein (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., Vol. 81, S. 4692–4696, 1984); das C-terminale Ende von Lys der -Asp-Asp-Asp-Lys-Sequenz (SEQ ID Nr. 1) mit Enterokinase; das C-terminale Ende von Arg der -Ile-Glu-Gly-Arg-Sequenz (SEQ ID Nr. 2) durch Blutgerinnungsfaktor Xa ( japanische nicht geprüfte Patentveröffentlichung (Kokai) Nr. 61(1986)-135591 ); das C-terminale Ende von Arg der -Gly-Pro-Arg-Sequenz durch Thrombin ( japanische nicht geprüfte Patentveröffentlichung (Kokai) Nr. 62(1987)-135500 ); das C-terminale Ende von -Arg- durch Trypsin oder Clostripain; das C-terminale Ende von Arg oder Lys durch Endoprotease Arg-C (Nature, Vol. 285, S. 456–461, 1980); das C-terminale der Lys-Arg-, Arg-Arg- oder Pro-Arg-Sequenz durch Saccharomyces cerevisiae Kex2-Protease und Derivate davon (Biochem. Biophys. Res. Commun. Vol. 144, S. 807–814, 1987, japanische nicht geprüfte Patentveröffentlichung (Kokai) Nr. 1(1989)-199578 ); das C-terminale Ende von Lys durch Lysilendopeptidase oder Endopeptidase Lys-C ( japanische nicht geprüfte Patentveröffentlichung (Kokai) Nr. 61(1986)-275222 ); das C-terminale Ende von Asp oder Glu durch Staphylococcus aureus (S. aureus) V8-Protease (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., Vol. 69, S. 3506–3509, 1972); das C-terminale Ende der -Phe-Arg-Sequenz mit Kallikrein ( japanische nicht geprüfte Patentveröffentlichung (Kokai) Nr. 62(1987)-248489 ); Leu-Leu der -Pro-Phe-His-Leu-Leu-Val-Tyr-Sequenz (SEQ ID Nr. 3) mit Renin ( japanische nicht geprüfte Patentveröffentlichung (Kokai) Nr. 60(1985)-262595 ); das C-terminale Ende der -Glu-Gly-Arg-Sequenz mit Urokinase ( japanische nicht geprüfte Patentveröffentlichung (Kokai) Nr. 2(1990)-100685 ); das C-terminale Ende der Val-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-Sequenz (SEQ ID Nr. 4) mit Entern-peptidase (Biotechnology, Vol. 6, S. 1204–1210, 1988); das C-terminale Ende von poly-Gly mit Lysostaphin (japanische nicht geprüfte Patentveröffentlichung (Kokai) Nr. 1(1989)-160496 ); das C-terminale Ende von Lys-Arg, Arg-Arg oder Pro-Arg etc. mit Kluverromyces lactis ( japanische nicht geprüfte Patentveröffentlichung (Kokai) Nr. 1(1989)-124390 ) und ähnliche.
  • In den Beispielen der vorliegenden Erfindung wird beispielsweise eine Aminosäuresequenz (die Lys-Arg-, Arg-Arg- oder Pro-Arg-Sequenz), die durch die Kex2-Protease erkannt wird, in den Spaltstellenbereich eingeschleust und dann wird das Peptid von Interesse durch das Enzym abgespalten.
  • Abhängig von der Substratspezifität eines Enzyms, das in der Spaltungsbehandlung verwendet wird, und der Aminosäuresequenz des Peptids von Interesse, ist daher bevorzugt, dass ein oder mehrere aus Methionin, Tryptophan, Prolin, Glycin, Cystein, Arginin, Lysin, Asparaginsäure und Glutaminsäure in der Aminosäuresequenz der Spaltstellenregion vorhanden sind.
  • Wenn eine Modifizierung benötigt wird, um ein endgültiges Peptid von Interesse zu gewinnen (z. B. ein amidiertes Peptid), wird eine Modifikationsreaktion (z. B. eine Amidierungsmodifikationsreaktion mit einem Amidierungsenzym) durchgeführt, vor oder nachdem das Peptid von Interesse von dem Peptid von Interesse mit einem daran angefügten Hilfspeptid ausgeschnitten wird (in diesem Fall ist das endgültige Peptid von Interesse das Produktionszwischenproduktpeptid). Des Weiteren ist eine effiziente Modifikationsreaktion gewünscht, und dann wird eine Modifikationsreaktion (z. B. eine Amidierungs-Modifikationsreaktion) an dem Peptid von Interesse mit einem daran angehängten Hilfspeptid vor dem Ausschneiden des Peptids von Interesse durchgeführt, um das endgültige Peptid zu erhalten, an das ein Hilfspeptid angefügt worden ist, und dann wird die Spaltstellenregion zwischen dem Hilfspeptid und dem endgültigen Peptid von Interesse gespalten, um das endgültige Peptid von Interesse zu gewinnen.
  • Das Peptid von Interesse wird durch weiteres Anfügen eines Schutzpeptids und Exprimieren davon hergestellt, wie in dem konventionellen Fusionsproteinverfahren durchgeführt worden ist. So ist es möglich, das Peptid von Interesse in einer hohen Expressionsmenge innerhalb der Wirtszelle als Fusionsprotein zu produzieren, welches ein Schutzpeptid an das Peptid von Interesse mit einem daran angefügten Hilfspeptid angefügt hat (das Schutzpeptid kann entweder an den N-Terminus oder den C-Terminus des Peptids von Interesse mit einem daran angefügten Hilfspepid angehängt sein).
  • Das Schutzpeptid zur Verwendung in dem Herstellungsverfahren der vorliegenden Erfindung ist nicht besonders begrenzt und die konventionell verwendeten Peptide können mit entsprechenden Modifikationen verwendet werden. Beispielsweise können in der japanischen nicht geprüften Patentveröffentlichung (Kokai) Nr. 54(1979)-145289 Fragmente der Aminosäuresequenzen von β-Galactosidase, welche aus E. coli stammt, als Schutzpeptide verwendet werden. Die Aminosäuresequenz dieses Enzyms ist einem Fachmann auf dem Gebiet bekannt, und die Peptidfragmente, die von β-Galactosidase stammen, sind als Schutzpeptid in dem Fusionsproteinverfahren von Fachleuten auf dem Gebiet umfassend verwendet worden. In den erfindungsgemäßen Herstellungsverfahren können Peptidfragmente, die durch entsprechende Modifikationen der Aminosäuresequenzen von β-Galactosidase, die als Schutzpeptid verwendet werden, durch Berücksichtigung der Eigenschaften des Peptids von Interesse mit einem daran angehängten Hilfspeptid gewonnen werden. Es ist ebenfalls möglich, eine DNA-Hasensequenz chemisch zu synthetisieren, die die Aminosäuresequenz des Schutzpeptids kodiert.
  • Es ist bevorzugt, verschiedene isoelektrische Punkte für jedes der Schutzpeptide, des Peptids von Interesse mit einem daran angehängten Hilfspeptid, welche das Fusionsprotein bilden, und das Fusionsprotein zu entwickeln und zu erhalten, um die Lösungsfähigkeit des Fragments während der chromatographischen Verfahren nach der Spaltungsbehandlungsreaktion zu verstärken. Das Gleiche gilt ebenfalls für das Hilfspeptid und das Peptid von Interesse.
  • Es ist ebenfalls notwendig, eine Spaltstellen-Region zwischen dem Peptid von Interesse mit einem daran angehängten Hilfspeptid und dem Schutz peptid bereitzustellen, aber es ist möglich, eine Spaltstellenregion mit einer vorzugsweise hohen Spaltungseffizienz, falls notwendig, gemäß der oben erwähnten Strategie bereitzustellen. Jedoch ist ein Mehrschrittverfahren zur Abspaltung des Fusionsproteins an jeder Seite notwendig, da eine Vielzahl an Spaltstellenregionen bereitgestellt worden sind. Die erste Spaltungsbehandlung wird in dem Spaltungsbehandlungbereich zwischen dem Peptid von Interesse mit einem daran angehängten Hilfspeptid und dem Schutzpeptid durchgeführt, und dann wird eine Spaltungsbehandlung in der Spaltungsstellen-Region zwischen dem Hilfspeptid und dem Peptid von Interesse durchgeführt, wodurch das Peptid von Interesse gewonnen wird.
  • Um die umfassende Anwendbarkeit des oben erwähnten Produktionsverfahren zu bestätigen, wurden Verfahren untersucht, bei denen die chemische oder enzymatische Spaltung jeder Spaltungsstellen-Region untersucht wurden, und es wurde bestätigt, dass jedes Verfahren zur Spaltungsbehandlung durchgeführt werden kann. Repräsentative Beispiele der ortsspezifischen Spaltverfahren des Peptids in solchen Spaltungsstellen-Regionen schließen ein:
    • (1) ein Verfahren, bei dem die Abwesenheit von Cysteinresten in der Aminosäuresequenz des Schutzpeptids und des Peptids von Interesse verwendet wird, und Cystein zwischen das Peptid von Interesse mit einem daran angehängten Hilfspeptid und dem Schutzpeptid eingeschleust wird, welches dann cyanisiert wird, einer Alkali-Behandlung unterworfen wird und dann wird das Fusionsprotein spezifisch an dieser Stelle gespalten;
    • (2) ein Verahren, bei dem eine Spaltung an jeder Spaltstellen-Region mit dem gleichen Enzym durchgeführt wird, aber in dem verschiedene Aminosäuresequenzen an den Enzym-Erkennungsstellen verwendet werden, wobei die Reaktionsbedingung für eine Spaltungsstelle so entworfen wird, dass sie die Spaltung an der anderen Spaltstellenregion nicht erlaubt; und
    • (3) ein Verfahren, bei dem die Spaltung in jeder Spaltungsstellen-Region mit dem gleichen Enzym durchgeführt wird, aber indem die Aminosäurereste in der Spaltungsstellen-Region modifiziert sind (Spaltungsstellen-Region 2), welche zwischen dem Hilfspeptid und dem Peptid von Interesse vorhanden sind, die Reaktionsbedingungen für die Spaltung der anderen Spaltungsstellen-Region (Spaltungsstellen-Region 1), welche zwischen dem Peptid von Interesse mit einem daran angehängten Hilfspeptid und dem Schutzpeptid so entworfen ist, dass nicht die Spaltung an der Spaltungsstellen-Region 2 verursacht wird, und nach der Spaltung an der Spaltungsstellen-Region 1 das Peptid von Interesse mit einem daran angehängten Hilfspeptid gereinigt wird, und dann wird die modifizierte Aminosäure wieder modifiziert, so dass die Spaltungsstellen-Region 2 es möglich macht, durch das oben erwähnte Enzym gespalten zu werden.
  • Wirtszellen, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, sind nicht besonders limitiert, und die konventionell verwendeten prokaryontischen Zellen oder eukaryontischen Zellen, z. B. Mikroorganismenzellen, wie beispielsweise E. coli, Hefen oder Tierzellen, die geeignet exprimieren, können verwendet werden, indem ein Expressionsvektor mit einer Nucleotidsequenz verwendet wird, die ein Peptid von Interesse mit einem daran angehängten Hilfspeptid kodiert, entsprechend ausgewählt und verwendet wird. Des Weiteren werden andere Elemente, die für die starke Expression benötigt werden, wie beispielsweise ein Promotor, ein Terminator, und Splicestellen ebenfalls aus konventionell verwendeten ausgewählt und wie gewünscht verwendet.
  • In dem Produktionsverfahren des Peptids von Interesse der vorliegenden Erfindung beschreibt Folgendes einen Fall, bei dem das Peptid von Interesse GLP-1(7-37) und GLP-1(7-36)NH2 sind.
  • Das Fusionsprotein (nachfolgend als GP97ompPR bezeichnet), welches durch den GLP-1(7-37)-Expressionsvektor kodiert wird (nachfolgend bezeichnet als pGP97ompPR), ist ein Fusionsprotein, das ein Peptid (nachfolgend bezeichnet als RHHGP[G]) mit einem daran angehängten Hilfspeptid, wobei das Hilfspeptid eine basische Peptidregion am N-terminalen Ende vom GLP-1(7-37) enthält, und das eine E. coli β-Galactosidase-Derivat (β-gal97S) an das N-terminale Ende von RHHGP[G] als Schutzpeptid angehängt hat. Eine Spaltstellen-Region ist zwischen dem Schutzpeptid und RHHGP[G] und zwischen das Hilfspeptid von RHHGP[G] und GLP-1(7-37) eingeschleust worden. Jede der Regionen hat Aminosäuresequenzen, die für eine Substratspezifität verantwortlich sind, so dass eine Spaltstellenregion mit der endogenen OmpT-Protease gespalten werden kann, welche aus E. coli stammt, und die andere Spaltstellen-Region kann mit Kex2-Protease gespalten werden ( Japanisches Patent Nr. 2643968 , und japanische ungeprüfte Patentveröffentlichung (Kokai) 10(1998)-229884 und ähnliche).
  • Bezüglich GP97ompPR ist der isoelektrische Punkt von β-gal97S oder RHHGP[G] und GP97ompPR so entworfen worden, dass sie voneinander verschieden sind, um die Fragment-Lösungs-Fähigkeit in dem Chromatographieprozesse nach der Spaltbehandlungsreaktion zu verstärken. Beispielsweise ist in den unten beschriebenen Beispielen der isoelektrische Punkt von GP97ompPR so entworfen worden, dass er 5,95 beträgt, der von β-gal97S 4,60 beträgt und der von RHHGP[G] 10,09 ist.
  • Dann wurden E. coli (W3110/pG97ompPR), die mit dem pGP97ompPR transformiert sind, kultiviert, um GP97ompPR zu exprimieren. GP97ompPR wurde als unlösliches Protein in den Zellen stark exprimiert und wurde in den Einschlusskörperchen angehäuft. Die endgültige Zelldichte erreichte 180 bei OD660 nm.
  • Nach dem Zerstören der Zellen wurde GP97ompPR mit Harnstoff gelöst, und die Spaltstellen-Region zwischen dem Schutzpeptid β-gal97S und dem Peptid von Interesse RHHGP[G] mit einem daran angehängten Hilfspeptid in GP97ompPR mit der endogenen OmpT-Protease gespalten, welche in dem Einschlusskörperchen vorhanden ist. OmpT-Protease hat die Spaltstellen-Region mit einer Spalteffizienz von 85% spezifisch gespalten.
  • Als nächstes wurde zur Abtrennung von β-gal97S und RHHGP[G] und zur Entfernung von Harnstoff eine Kationen-Austausch-Chromatographie durchgeführt. Da die isoelektrischen Punkte des nicht gespaltenen GP97ompPR (pI = 5,95) und das von β-gal97S (pI = 4,60) beide im sauren Bereich waren, adsorbierten sie nicht an die Säule und RHHGP[G] wurde adsorbiert und eluiert. Durch diesen einen Schritt der Säulenbehandlung allein wurde RHHGP[G] in einer Reinheit von 99% erhalten. Die Tatsache, dass der erste Schritt der Säulenverfahren während des Produktionsverfahren RHHGP[G] in solch hoher Reinheit und hoher Ausbeute bereitstellt, ist, vom Standpunkt der Produktion von industriellem Maßstab, sehr nützlich.
  • Die Spaltstellen-Region zwischen dem Hilfspeptid und dem Peptid von Interesse, welche in RHHGP[G] (1,0 g) vorhanden ist, wurde unter Verwendung von Rex2-Protease gespalten. Unter den Reaktionsbedingungen, die in den Beispielen unten beschrieben sind, schritt die Reaktion bei einer Spaltungseffizienz von 95% voran. Die Ausbeute betrug 90%.
  • Anschließend wurde eine Umkehr-Phasen-Chromatographie durchgeführt, um GLP-1(7-37) weiter zu reinigen. Die Ausbeute dieses Prozesses betrug 80%, die endgültige Ausbeute der gesamten Verfahren betrug ungefähr 64% und 0,72 g an GLP-1(7-37) mit einer Reinheit von 98% wurden erhalten. Da die Menge der Kulturflüssigkeit, die für die Reinigung verwendet wurde, ungefähr 0,36 l betrug, bedeutet dies, dass ungefähr 2,0 g pro Liter der Kulturflüssigkeit erhalten wurden. Die Ausbeute und der Erhalt sind beide sehr hoch und dadurch haben sie die Nützlichkeit des erfindungsgemäßen Produktionsverfahrens bewiesen, welches ein Hilfspeptid verwendet. So ermöglicht das Produktionsverfahren der vorliegenden Erfindung die vollständige Umsetzung der Herstellung des Peptids von Interesse in industriellem Maßstab.
  • In Anbetracht der Produktion von GLP-1(7-37) unter Verwendung des Produktionsverfahrens der vorliegenden Erfindung ist die Ausbeute in jedem Schritt in Tabelle 2-B unten gezeigt.
  • Wie aus der Tabelle 2-B erkannt werden kann, wurde gezeigt, dass der Erhalt in jedem Schritt sehr hoch ist und dass die endgültige Ausbeute von 64% sehr hoch ist.
  • Des Weiteren wird eine Amidierungs-Modifikationsreaktion benötigt, wenn das Peptid von Interesse GLP-1(7-36)NH2 ist, da das Peptid ein amidiertes Peptid ist. Das Peptid kann wie folgt gewonnen werden:
    RHHGP[G], welches wie oben erwähnt gewonnen wurde, wurde einer Amidierungs-Modifikationsreaktion unter Verwendung eines Amidierungsenzyms (B. B. R. C., Vol. 150, S. 1275–1281, 1988, EP299790A , und ähnliche) unterworfen. Unter den Reaktionsbedingungen, die in den Beispielen, die unten stehen, beschrieben sind, trat keine Aggregierung oder Gelierung von RHHGP[G] als Enzymsubstrat und in dem Reaktionsprodukt, dem amidierten GLP-1(7-36)NH2 (nachfolgend bezeichnet als RHHGP-1) mit einem daran angehängten Hilfspeptid auf, und RHHGP-1 konnte in einer hohen Reaktionsrate von 98% (eine Ausbeute von 95%) hergestellt werden. Diese Ergebnisse zeigten die Nützlichkeit des Hilfspeptids in der Amidierungs-Enzymreaktion, welche mit einem Substrat aus RHHGP[G] durchgeführt wurde.
  • Nach der Amidierungs-Modifikationsreaktion wurde die Spaltstellen-Region zwischen dem Hilfspeptid und dem Peptid von Interesse, welches in RHHPG-1 vorhanden ist, unter Verwendung von Kex2-Protease gespalten. Unter den Reaktionsbedingungen in den Beispielen, die unten beschrieben werden, schritt die Reaktion mit einer Spaltungseffizienz von 95% (einer Ausbeute von 90%) oder darüber voran.
  • Um GLP-1(7-36)NH2 weiter zu reinigen, wurde eine Kationen-Austausch-Chromatographie und dann eine hydrophobe Chromatographie durchgeführt. Die endgültige Ausbeute des Gesamtverfahrens betrug ungefähr 50% und 13,5 g an GLP-1(7-36)NH2 mit einer Reinheit von 98% wurden erhalten. Da die Menge der Kulturflüssigkeit, welche für die Reinigung verwendet wurde, ungefähr 8 l betrug, bedeutete dies, dass ungefähr 1,68 g pro Liter Kulturflüssigkeit gewonnen wurden. Die Ausbeute und die Menge sind beide sehr hoch, und dadurch wurde gezeigt, dass das Produktionsverfahren in der vorliegenden Erfindung, welches ein Hilfspeptid verwendet, sehr nützlich ist. Auf diese Weise ermöglicht das Produktionsverfahren der vorliegenden Erfindung die vollständige Umsetzung der Produktion des Peptids von Interesse in industriellem Maßstab.
  • Ein Ziel der vorliegenden Erfindung zur Herstellung von GLP-1(7-36)NH2 ist es, die Aggregierung zu beseitigen und die Löslichkeit zum Zeitpunkt der Reaktion der Modifikationsenzyme, wie beispielsweise eines Amidierungsenzyms, das oben beschrieben worden ist, zu verstärken, indem ein Peptid umfassend GLP-1(7-37) mit einem daran angehängten Hilfspeptid verwendet wird. Um die Nützlichkeit der vorliegenden Erfindung weiter zu untersuchen, wurden RHHGP[G], RHHGP-1, GLP-1(7-37) und GLP-1(7-36)NH2 gereinigt und die pH-Abhängigkeit der Löslichkeit jedes Peptids wurde untersucht. Als Ergebnis zeigte sich, dass GLP-1(7-37) eine niedrige Löslichkeit im Bereich von pH 5,0 bis pH 7,0 hat, wie erwartet wurde. Andererseits hatte RHHGP[G] eine starke Löslichkeit im Bereich von pH 4,0 bis ungefähr pH 6,0. Das Ergebnis bestätigte, dass das Austauschen von RHHGP[G] mit einem Hilfspeptid bei GLP-1(7-37) als Enzymsubstrat nützlich ist, da die Amidierungs-Enzymreaktion in einer schwach sauren Region durchgeführt wird.
  • In dem Experiment, das die pH-Abhängigkeit der Löslichkeit jedes Peptids untersuchte, haben RHHGP[G] und RHHGP-1 eine plötzliche Reduzierung der Löslichkeit bei ungefähr pH 6,0 bzw. ungefähr pH 6,4 gezeigt. GLP-1(7-36)NH2 bildete mit der Zeit Präzipitate aus Mikrokristallen. So wird abgeschätzt, dass Substanzen, die in der Lage sind, die Löslichkeit von RHHGP 8G 9 und RHHGP-1 in einer neutralen bis schwach alkalischen Region und Substanzen, die in der Lage sind, die Löslichkeit des Peptids von Interesse in der schwachen Säure bis schwach alkalischen Region zu erhöhen, sehr nützlich in dem Produktionsverfahren sein können.
  • So haben die vorstelligen Erfinder nach den intensiven Untersuchungen, nach solchen Substanzen zu suchen, gefunden, dass die Aggregation wirksam durch die Zugabe eines Tensids (z. B. durch die Hinzufügung von 0,1% Tween 80) im Fall von RHHGP[G] und RHHGP-1 verhindert werden kann (z. B. durch die Zugabe von 0,3% oder mehr Tween 80) und/oder eines Salzes (z. B. 100 mM oder mehr NaCl) im Fall von GLP-1(7-36)NH2, und konnten die Nützlichkeit davon durch Einschleusen im Produktionsverfahren der vorliegenden Erfindung beweisen.
  • Hinsichtlich des Produktionsverfahrens von GLP-1(7-36)NH2 unter Verwendung des erfindungsgemäßen Produktionsverfahrens werden die Ausbeuten jedes Schritts, welche bei der Reinigung von GLP-1(7-36)NH2 durchgeführt werden, auf einer 10 g Skala gemeinsam in Tabelle 1 gezeigt (20 Liter des Produktionsorganismus W3110/pGP97ompPR wurde kultiviert und ein 8 Liter Teil der Kulturflüssigkeit wurde für die Reinigung verwendet). Tabelle 1 Zusammenfassung der Produktionsschritte von GLP-1(7-36)NH2
    Schritte Menge an GLP-1(7-37)/GLP-1(7-36)NH2 (g) Ausbeute der einzelnen Verfahren (%) Gesamtausbeute (%)
    Kultur (entsprechend 8 l Kulturlösung) 26,87 100 100
    OmpT-Reaktion 22,95 85,4 85,4
    SP Sepharose-Chromatographie 20,22 98,8 76,2
    Amidierungs-Enzymreaktion 20,70 100 77,0
    Kex2 Enzymreaktion 18,70 90,4 69,6
    MacroPrep HS Chromato. 16,78 93,7 62,4
    Poros R2 Chromato 13,48 80,4 50,2
  • Die Menge an GLP-1(7-37) ist für das Verfahren von der Kultivierung bis zur Amidierungs-Enzymreaktion gezeigt, und die Menge an GLP-1(7-36)NH2 ist für das Verfahren von dem Kex2-Schritt bis zum Poros-R2-Chromatographie-Schritt gezeigt. Die Menge an GLP-1(7-37)/GLP-1(7-36)NH2 wurde aus dem Verhältnis des Peakbereichs der HPLC zur Anzahl an Aminosäuren berechnet.
  • Wie aus Tabelle 1 klar wird, ist die Ausbeute eines Einheitsprozesses in jedem Schritt sehr hoch, und es wurde gezeigt, dass die Gesamtausbeute mit ungefähr 50% ebenfalls sehr hoch ist. So ist klar, dass das Verfahren zum Herstellen von Peptiden der vorliegenden Erfindung auf die Produktion von GLP-1(7-36)NH2 angewendet werden kann, und dass es heraufskaliert werden kann bis zum industriellen Produktionsniveau. Des Weiteren wurde bestätigt, da die Ausbeute des einzelnen Verfahrens in dem Prozess zur Spaltungsbehandlungsreaktion mit OmpT-Protease und Kex2-Protease 85% bzw.
  • 90,4% ist, dass jede Spaltungsstellen-Region, die so entworfen wurde, dass sie Aminosäuresequenz hat, die für die Spaltungsbehandlungsreaktion mit den Enzymen sehr geeignet sind.
  • Wie oben beschrieben, wurde gezeigt, dass als Beispiel des Verfahrens zum Herstellen eines GLP-1-Derivats mit insulinotroper Aktivität, die vorliegende Erfindung die Probleme der Herstellungsverfahren aufgrund der intrinsischen physikochemischen Eigenschaften des Peptids von Interesse erleichtern kann. Die Probleme bei der Herstellung aufgrund der physikochemischen Eigenschaften bei den GLP-1-Derivaten, welche durch GLP-1(7-37) und GLP-1(7-36)NH2 repräsentiert werden, die spezifisch beschrieben sind, können unter Verwendung des Produktionsverfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung überwunden werden, und, überflüssig, das zu erwähnen, ist die vor liegende Erfindung ebenfalls nützlich für die Produktion von GLP-1-Derivaten.
  • Die oben erwähnte Produktion von GLP-1-Derivaten kann durch ein Verfahren unter Verwendung eines Fusionsproteins mit einem Schutzpeptid, das daran angefügt ist, bewirkt werden. Wenn jedoch das Peptid von Interesse erfindungsgemäß aus dem Fusionsprotein durch das Peptid von Interesse mit einem daran angehängten Hilfspeptid gewonnen wird, werden mehrere Spaltstellen-Regionen bereitgestellt, und dadurch wird ein Mehrschrittverfahren zur Abspaltung des Fusionsproteins notwendig.
  • So haben die Erfinder Verfahren zum chemischen und enzymatischen Spalten jeder Spaltungsstellen-Region untersucht und haben bestätigt, dass es durch ein anderes Verfahren als das, das die Spaltung mit E. coli OmpT-Protease benutzt, möglich ist, wie insbesondere in einem unten beschriebenen Beispiel bestätigt wird. Repräsentative Beispiele des ortsspezifischen Spaltungsverfahrens des Peptids an solchen Spaltungsstellen-Regionen schließen ein:
    • (1) ein Verfahren, bei dem die Abwesenheit von Cysteinresten in der Aminosäuresequenz des Schutzpeptides und des Peptids von Interesse benutzt wird, und Cystein an dem C-Terminus des Schutzpeptids eingeschleust wird, welches dann cyanisiert wird, und einer Alkalibehandlung unterworfen wird, um das Fusionsprotein an dem N-Terminus des Cysteins spezifisch zu spalten;
    • (2) ein Verfahren, bei dem die Spaltung an jeder Spaltungsstellen-Region durch die Kex2-Protease durchgeführt wird, aber unter Verwendung verschiedener Aminosäuresequenzen an den Enzymerkennungsstellen, wobei die Reaktionsbedingungen für eine Spaltungsstellen-Region so entworfen ist, dass die Spaltung an einer anderen Spaltungsstellen-Region nicht ermöglicht wird; und
    • (3) ein Verfahren, bei dem die Spaltung an jeder Spaltungsstellen-Region mit Kex2-Protease durchgeführt wird, aber durch die Modifizierung von Aminosäuren in einer Spaltungsstellen-Region (Spaltungsstellen-Region 2), die Reaktionsbedingung für die Spaltung der anderen Spaltungsstellen-Region (Spaltungsstellen-Region 1) so entworfen ist, dass nicht die Spaltung an der ersten Spaltungsstelle (Spaltungsstellen-Region 2) verursacht wird, und nach der Spaltung an der letztgenannten Spaltungsstellen-Region (Spaltungsstellen-Region 1) das Peptid, das ein Hilfspeptid umfasst und ein Peptid von Interesse gereinigt werden, und dann wird die modifizierte Aminosäure wieder modifiziert, so dass die zuerst genannte Spaltungsstellen-Region (Spaltungsstellen-Region 2) dazu gebracht werden kann, dass sie mit der Kex2-Protease gespalten wird.
  • Beispiele
  • Anhand von GLP-1-Derivat als Peptid von Interesse wird die vorliegende Erfindung jetzt in weiterem Detail unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele beschrieben.
  • Als Produktionsverfahren, bei dem das Peptid von Interesse GLP-1(7-37) ist, welches oben beschrieben wurde, kann das Peptid, das durch das Exprimieren eines Fusionsproteins, welches das Schutzpeptid und GLP-1(7-37) umfasst, in einem konventionellen Verfahren hergestellt wird und dann durch das Abschneiden von GLP-1(7-37) direkt vom Protein. Jedoch hat dieses Verfahren Probleme beim Reinigungsverfahren, wobei die Gelierung oder Aggregierung von GLP-1(7-37) während der Reinigung aufgrund seiner physikochemischen Eigenschaften auftritt, welche in Problemen wie der extremen Reduzierung der Ausbeute und der Unfähigkeit der Regenerierung des Harzes resultierten. Dieser Nachteil könnte durch Änderung der physikochemischen Eigenschaften von GLP-1(7-37) durch Anhängen eines Hilfspeptids umgangen werden. Das Verfahren zum Herstellen dieses Peptids wird nun genauer unten beschrieben.
  • Beispiel 1. Konstruktion eines Plasmids
  • Das Expresssionsplasmid pGP97ompPR, welches ein Fusionsprotein (GP97ompPR) kodiert, welches für die Produktion von GLP-1(7-37) entworfen worden ist, wurde durch die 4 Schritte hergestellt, die unten gezeigt sind. Die Restriktionsenzym-Behandlung, die Ligierungsreaktion, die Phosphorylierung am 5'-Ende und die PCR-Bedingungen wurden gemäß konventionellen Verfahren durchgeführt.
  • (1) Schritt 1. Kontruktion von pG117S4HR6GLP-1
  • Um GP97ompPR, welches mit E. coli OmpT-Protease gespalten werden kann, zu entwerfen, wurde synthetische R6-DNA (siehe 6), welche die Aminosäuresequenz R6 (siehe 2) mit der Arg-Arg-Sequenz ist, einer Erkennungssequenz für die OmpT-Protease, in die StuI-Schnittstelle in pG117S4HGP inseriert (siehe japanische nicht geprüfte Patentveröffentlichung (Kokai) Nr. 9(1997)-296000 ), um pG117S4HR6GLP-1 (2) herzustellen.
  • (2) Schritt 2. Konstruktion von pGP117S4HompRHKR
  • Um weiter die Effizienz der Spaltung durch E. coli OmpT-Protease zu verstärken, wurde die Sequenz des R6-Teils geändert. Ein 3,2 kb Fragment (Fragment A), welches durch Spalten von pG117S4HR6GLP-1 mit NsiI und HindIII gewonnen wurde, wurde an ein 0,2 kb Fragment (Fragment B), welches durch das Spalten von PG117S4HR6GLP-1 mit BamHI und HindIII gewonnen wurde und synthetischer L1-DNA (siehe 6), welche einen Teil der Aminosäuresequenz L1 (siehe 3) mit der Arg-Arg-Sequenz kodiert, einer Erkennungssequenz für OmpT-Protease ligiert, um das pGP117S4HompRHKR (3) herzustellen.
  • (3) Schritt 3. Konstruktion von pGP117S4HompRHPR
  • Um die E. coli OmpT-Protease-Erkennungssequenz und die Kex2-Protease-Erkennungssequenz voneinander in der Spaltstellen-Region verschieden zu machen, wurde Lys-Arg in der Kex2-Protease-Erkennungssequenz durch Pro-Arg ersetzt. P1-Primer und P2-Primer (siehe 6) wurden synthetisiert, welche einer PCR unter Verwendung von pGP117S4HompRHKR als Matrize unterworfen wurden, um ein 0,1 kb DNA-Fragment zu konstruieren. Nach der Behandlung des so erhaltenen DNA-Fragments mit BglII und SphI wurde dies an einen 3,2 kb Fragment (Fragment C) ligiert, welches durch Spalten von pGP117S4HOMPRHKR mit BglII und HindIII gewonnen wurde, und einem 0,2 kb Fragment (Fragment D), welches durch Spalten von pGP117S4HompRHKR mit SphI und HindIII gewonnen wurde, um pGP117S4HompRHPR zu konstruieren (4).
  • (4) Schritt 4. Konstruktion von pGP97ompPR (5)
  • Um die Größe des Schutzpeptidanteils weiter zu reduzieren, wurde pGP97ompPR konstruiert. Die P3- und P4-Primer (siehe 6) wurden synthetisiert, welche einer PCR unter Verwendung von pGP117S4HompRHPR als Matrize unterworfen wurden, um ein DNA-Fragment zu konstruieren. Nach der Behandlung des so erhaltenen DNA-Fragments PvuII und NsiI wurde dies an ein 3,2 kb Fragment ligiert, welches durch die Abspaltung von pGP117S4HompRHPR mit PvuII und NsiI gewonnen wurde, um pGP97ompPR zu konstruieren.
  • Die Aminosäuresequenz des Fusionsproteins (GP97ompPR), welches durch das so konstruierte Plasmid pGP97ompPR kodiert wird, ist in 7 gezeigt, und die DNA-Nucleotidsequenz, die diese Aminosäuresequenz kodiert, ist in 8 gezeigt.
  • Beispiel 2. Expression eines Fusionsproteins (GP97ompPR)
  • E. coli-Stamm W3110 mit pGP97ompPR wurde in einem Kulturmedium (20 l, pH 7,0), das 4 g/l K2HPO4, 4 g/l KH2PO4, 2,7 g/l Na2HPO4, 0,2 g/l NH4Cl, 1,2 g/l (NH4)2SO4, 4 g/l Hefeextrakt, 2 g/l MgSO4·7H2O, 40 mg/l CaCl2·2H2O, 40 mg/l FeSO4·7H2O, 10 mg/l MnSO4·nH2O, 10 mg/l AlCl3·6H2O, 4 mg/l CoCl2·6H2O, 2 mg/l ZnSO4·7H2O, 2 mg/l NaMoO4·2H2O, 1 mg/l CuCl2·2H2O, 0,5 mg/l H3BO4 und 10 mg/l Tetracyclin enthält, in einem 30 l Fassfermenter bei einer Temperatur von 32°C bei 12 Stunden kultiviert und danach für 24 Stunden bei 37°C, während Glucose hinzugefügt wurde. Der pH-Wert des Me diums wurde durch Zufügen von 28% Ammoniumlösung auf pH 7,0 kontrolliert. 9 ist das Ergebnis von Änderungen der Zelldichte (OD660), und der Expression des Fusionsproteins (GP97ompPR) zum Zeitpunkt des Probenziehens, die mit einem 16% SDS-PAGE analysiert wurden. GP97ompPR wurde als Einschlusskörperchen exprimiert und machte 30% oder mehr des gesamten zellulären Proteins am Ende der Kultivierung aus.
  • Nach der Kultivierung wurde die Kulturflüssigkeit mit 500 kg/cm2 unter Verwendung eines Manton-Gaulin-Homogenisators (15M-8TA) homogenisiert, und wurde dann zentrifugiert, um die Präzipitatfraktion (Einschlusskörperchen) einzusammeln. Dann wurde eine gleiche Menge deionisierten Wassers zu der Kulturflüssigkeit gegeben, um das erhaltene Präzipitat zu waschen. Nach der Suspension wurde die Zentrifugation wiederholt, um das Präzipitat einzusammeln. Das Waschverfahren wurde wiederholt und schließlich wurde das gewonnene Präzipitat in einer geeigneten Menge deionisierten Wassers suspendiert.
  • Beispiel 3. Prozessierung von GP97ompPR mit E. coli OmpT-Protease
  • Die erhaltene Suspension der Einschlusskörper wurde verdünnt, um einen OD660-Wert von 1.000 zu ergeben. Aus der Flüssigkeit wurde ein 1.000 ml Anteil abgenommen, zu dem 250 ml 1 M Tris-HCl gegeben wurde, bei dem der pH-Wert noch nicht eingestellt worden war, 10 ml 0,5 M EDTA (pH 8,0) und 1.200 g gepulverten Harnstoffs wurden hinzugefügt, und dann wurde deionisiertes Wasser dazugegeben, um ein Endvolumen von 5.000 ml zu ergeben. Dann wurde HCl verwendet, um den pH-Wert auf 7,5 einzustellen, und die Flüssigkeit wurde für 2 Stunden auf 37°C erwärmt. Dieses Verfahren löste die Funktion der E. coli OmpT-Protease, welche in den Einschlusskörperchen vorhanden ist, aus, und GP97ompPR wurde gespalten und RHHGP[G] wurde freigesetzt. 10 ist das Ergebnis von RHHGP[G], welches von GP97ompPR ausgeschnitten wurde, und dann mit Umkehrphasen-HPLC analysiert wurde. Die Analyse verwendete eine YMC-Protein-PR-Säule, eine 10% Acetonitril-Lösung, die 0,1% Trifluoressigsäure als Lösung A enthielt, und 70% Acetonitril-Lösung, die 0,095% Trifluoressigsäure als Lösung B enthielt, mit einer Fließrate von 1 ml/min. und einem linearen Gradienten der Lösung B von 44% bis 70% in 13 min. Diese Prozedur spaltete 85% des GP97ompPR und am Ende der Reaktion wurde ein Peak, der RHHGP[G] entspricht, gewonnen (21A).
  • Das Ausschneiden des GLP-1(7-37) mit einem daran angehängten Hilfspeptid aus dem Fusionsprotein durch Spaltungsbehandlung mit E. coli OmpT-Protease wurde nicht auf das Fusionsprotein, das von GP97ompPR stammt, be schränkt, und war ebenfalls für die Fusionsproteine, die aus pG117S4HR6GLP-1, pGP117S4HompRHKR und pGP117S4HompRHPR stammen, welche in Beispiel 1 hergestellt worden waren, möglich. Die Aminosäuresequenzen dieser Fusionsproteine, die aus den Plasmiden stammen, sind in den 11, 12 und 13 gezeigt.
  • Beispiel 4. Reinigung von RHHGP[G]
  • Nach der E. coli OmpT-Protease-Reaktion wurden Harnstoff und Tween 80 bis zu einer Konzentration von 7 M bzw. 0,1% hinzugegeben, und der pH-Wert wurde auf 8,0 mit Hilfe von NaOH eingestellt. Das Gemisch wurde dann zentrifugiert, um einen Überstand zu gewinnen. Eine Säule, die mit SP-Sepharose BigBeads (Amersham Pharmacia Biotechnology) geladen war, wurde mit 100 mM Tris HCl, pH 8,0 und dann 20 mM Tris HCl, pH 8,0/5 M Harnstoff/0,1% Tween 80 äquilibriert. Nachdem der oben erwähnte Überstand zu der äquilibrierten Säule gegeben worden war, wurde die Säule mit der gleichen Äquilibrierungslösung gewaschen, und dann wurde sie mit 0,2 M NaCl/20 mM Tris HCl, pH 8,0/0,1% Tween 80 gewaschen und mit 0,5 M NaCl/20 mM Tris HCl, pH 8,0/0,1% Tween 80 (14) eluiert.
  • Die Reinheit von RHHGP[G] in dem Eluat betrug bis zu 98%. Der Grund, warum ein Peptid mit derartig hoher Reinheit durch ein einfaches Verfahren der Zugabe eines Hilfspeptids gewonnen werden konnte, dem die schrittweise Eluierung von einer Niederdruck-Chromatographiesäule folgte, ist der, dass zum Zeitpunkt des Entwerfens eines Hilfspeptids die Einschleusung hydrophiler Aminosäuren und der isoelektrischen Punkte für die Reinigung mittels Ionenaustausch-Säule in Betracht gezogen wurden.
  • Beispiel 5 zeigt, dass das obige Ergebnis stark dazu beigetragen hat, den Arbeitsaufwand während des Reinigungsverfahrens nach dem vorliegenden Schritt zu sparen.
  • Beispiel 5. Ausschneiden und Reinigung von GLP-1(7-37) mit RHHGP[G]
  • Die Prozessierung mit Kex2-Protease wurde unter Verwendung von RHHGP[G], welches in Beispiel 4 aufgereinigt wurde, in der folgenden Reaktionsmischung durchgeführt: 5,0 mg/ml RHHGP[G], 20 mM Tris HCl, 0,1% Tween 80, 0,3 M NaCl, pH 8,0, 2,0 mM CaCl2 und 8.000 Einheiten/ml Kex2-Protease (ungefähr 0,1 mg/l). Innerhalb einer Stunde wurde eine Reaktionsrate von 95% erreicht (15-B). Während der Reaktion wurde keine Präzipitatbildung des GLP-1(7-37) beobachtet.
  • Direkt nach der Enzymreaktion wurde Ammoniumacetat bis zu einer finalen Konzentration von 10 mM hinzugegeben und wurde mit HCl auf pH 4,5 eingestellt. Auf eine Poros-R2-Säule, die mit 10 mM Ammoniumacetat, pH 4,5, äquilibriert war, wurde die obige Lösung in einer Konzentration von 10 mg GLP-1(7-37) Äquivalente/ml Harz geladen. Danach wurde die Säule mit der gleichen Äquilibrierungsflüssigkeit gewaschen und dann mit 0,2% Essigsäure/10% Acetonitril, und wurde dann mit 0,2% Essigsäure/40% Acetonitril eluiert. Nach der Entferung von Acetonitril wurde ein lyophilisiertes Produkt erhalten. Die Ausbeute an GLP-1(7-37) betrug 80% mit einer Reinheit von 99% (15-C).
  • Der Vergleich des Verfahrens (siehe z. B. japanische nicht geprüfte Patenveröffentlichung (Kokai) Nr. 9(1997)-296000 ) zum Ausschneiden von GLP-1(7-37) direkt aus einem Fusionsprotein umfassend das Schutzpeptid und das Peptid von Interesse mit dem Verfahren der vorliegenden Erfindung ist in Tabelle 2 gezeigt. Tabelle 2 Vergleich von GLP-1(7-37)-Produktionsverfahren
    A
    Verfahren Reinheit (%) Ausbeute pro Prozesseinheit (%) Gesamtausbeute (%)
    Kex2-Enzymreaktion 15 - 100
    Säure-Präzipitationsbehandlung - 68 68
    Filtration 75 88 60
    Cationen-Austausch-Chromatographie 95 95 57
    Umkehrphasen-Chromatographie 99 72 41
    B
    Verfahren Reinheit (%) Ausbeute pro Prozesseinheit (%) Gesamtausbeute (%)
    Ompt-Reaktion 24 - 100
    Filtration 24 90 90
    Cationen-Austausch-Chromatographie 99 99 89
    Kex2-Enzymreaktion 96 90 80
    Umkehrphasen-Chromatographie 98 80 64
  • A beruht auf einem Verfahren zum Ausschneiden von GLP-1(7-37) direkt aus einem Fusionsprotein umfassend ein Schutzpeptid und das Peptid von Interesse. B beruht auf einem Verfahren zum Ausschneiden von GLP-1(7-37) von einem Fusionsprotein mit einem Schutzpeptid, das weiter an ein Peptid von Interesse mit einem daran angehängten Hilfspeptid angefügt wurde.
  • Durch die Verwendung von RHHGP[G] als Zwischenprodukt wurde GLP-1(7-37) mit einer Reinheit von 99% mit Leichtigkeit und in einer hohen Ausbeute gewonnen. Da die HPLC nicht in der Reinigung der vorliegenden Erfindung verwendet wird, ist es überflüssig zu sagen, dass es leicht ist, eine Aufstockung auf industriellen Maßstab zu machen.
  • Das Folgende ist ein Beispiel, in dem ein Peptid von Interesse eine Modifikation benötigt. Da GLP-1(7-36)NH2 ein amidiertes Peptid ist, wird eine Amidierungsmodifikationsreaktion benötigt.
  • Beispiel 6. Amidierungs-Modifikationsreaktion von GLP-1(7-37) mit einem daran angehängten Hilfspeptid
  • RHHGP[G], welches in Beispiel 4 gewonnen wurde, wurde in RHHGP-1 unter Verwendung eines Amidierungsenzyms umgewandelt. Um die Reaktionsbedingungen für den Fall zu bestimmen, wo RHHGP[G] als Substrat verwendet wird, wurde eine Optimierung bezüglich des pH-Werts der Temperatur, der Konzentration des Kupfersulfats, der Catalasekonzentration, der Substratkonzentration, der L-Ascorbinsäure-Konzentration und der Konzentration des Amidierungsenzyms in einem Reaktionsvolumen von 0,5 ml durchgeführt. Die Abtrennung von RHHGP[G] und RHHGP-1 und die Analyse davon wurden unter Verwendung einer Ionenaustausch-HPLC-Säule (Poros S/H, Perceptive Biosystems) in Gegenwart von 30 mM Britton-Robinson-Puffer durchgeführt (nachfolgend bezeichnet als BR-Puffer), welcher kein Barbital enthält, und bei einer pH-Gradientenelution (6,0 bis 9,0).
  • Der optimale pH-Wert der Reaktionsbedingungen betrug 5,0 bsi 5,5 (16). Die optimale Reaktionsbedingung war 10 mM Natriumacetat, pH 5,0, 5,0 μM Kupfersulfat, 0,5 g/l L-Ascorbinsäure, 1 μM/ml Catalase, 5,0 mg/ml RHHGP[G], eine Temperatur von 32°C und 1.500 Einheiten/ml Amidierungsenzym. Unter diesen Bedingungen wurde Tween 80 (0,1%), von dem festgestellt wurde, dass es einen Aggregierungs-unterdrückenden Effekt in dem Beispiel 11 unten hat, hinzugefügt, und 5 l der RHHGP[G]-Lösung wurden unter den oben erwähnten Bedingungen umgesetzt, und die Reaktion wurde durch Zugabe von EDTA gestoppt. Im Ergebnis wurde in der Reaktion unter den vorliegenden Bedingungen RHHGP[G] mit RHHGP-1 mit einer Reaktionsrate von 98% oder mehr in einer Stunde (17) umgesetzt.
  • Beispiel 7. Abspaltung von GLP-1(7-36)NH2 von RHHGP-1 durch Kex2-Protease
  • Die Prozessierungsreaktion mit Kex2-Protease zeigt eine pH-Abhängigkeit und eine Aktivitätsänderung in Abhängigkeit von der Sequenz des Anteils, welcher als Substrat dient ( EP794255A ). Demgemäß wurde die Optimierung des pH-Werts, die Calciumchlorid-Konzentration und die Menge des hinzugefügten Enzyms in einem Reaktionsvolumen von 0,5 ml durchgeführt. Im Fall von RHHGP-1 wurde gezeigt, dass die Reaktion das Maximum bei pH 8,0 erreicht (18). Die optimalen Reaktionsbedingungen, wenn RHHGP-1 als Substrat verwendet wurde, wurde auf 10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM Calciumchlorid, 8.000 Einheiten/ml Kex2-Protease und eine Reaktionstemperatur von 30°C bis 32°C festgelegt. Aus den Ergebnissen des Beispiels 11 unten konnte eine Aggregierung durch Einstellung der NaCl-Konzentration im Reaktionsgemisch auf 0,1 M oder darüber und durch weitere Zugabe von Tween 80 in einer Konzentration von 0,1% vermieden werden.
  • Durch Umsetzen der Probenlösung nach der Amidierungsreaktion in Beispiel 6 bei 30°C unter den vorliegenden Bedingungen für 2 Stunden wurde eine Reaktionsrate von 95% oder darüber erzielt (21-C). Während der Reaktion wurde keine Bildung von Präzipitat aus GLP-1(7-36)NH2 beobachtet.
  • Beispiel 8. Reinigung von GLP-1(7-36)NH2
  • Um die Unreinheiten in geringfügigen Mengen zu entfernen, wurde eine pH-Gradientenelution unter Verwendung eines Cationenaustauschharzes (MacroPrep High-S, BioRad) verwendet, um GLP-1(7-36)NH2 davon abzuspalten. Die Säule wurde mit 20 mM BR-Puffer, pH 4,5/20 mM NaCl/0,3% Tween 80 äquilibriert. Die Zusammensetzung der Probenlösung wurde auf 0,3 M NaCl/0,3% Tween 80, pH 4,5, eingestellt. Die Probenlösung wurde auf die Säule gegeben, welche mit der Äquilibrierungslösung gewaschen wurde. Unter Verwendung der Äquilibrierungslösung (Lösung A) und der Elutionslösung (Lösung B, pH 7,0 mit der gleichen Zusammensetzung wie die Äquilibrierungslösung) wurde GLP-1(7-36)NH2 in einem linearen Gradienten aus einer 50% Lösung B bis 100% Lösung B (19) eluiert, um den Anteil der Unreinheiten weniger als 0,5% werden zu lassen (20). In diesem Verfahren wurden die meisten Reaktionsteilnehmer, die im Beispiel 7 hinzugefügt worden sind, die nicht umgesetzten Produkte, und geringe Mengen an Unreinheiten entfernt, und GLP-1(7-36)NH2 mit einer Reinheit von 98% oder darüber wurde erhalten (21-D). Die gepoolte Lösung hatte einen pH von 4,5 und wurde bei 4°C gelagert.
  • Beispiel 9. Endgültige Reinigung von GLP-1(7-36)NH2
  • In dem obigen Beispiel 8 wurde GLP-1(7-36)NH2 mit einer Reinheit von 98% oder darüber erhalten. Wenn es als pharmazeutisches Medikament verwendet wurde, ist jedoch nicht nur die Reinheit des Peptids von Interesse wichtig, sondern auch die Kontaminierung mit nicht-peptidischem Endotoxin muss vermieden werden. Demgemäß wurde beim Versuch, Endotoxin etc. zu entfernen, eine präparative Umkehrphasen-HPLC-Säule, welche häufig für die endgültige Reinigung von Peptidmedikamenten verwendet wird, verwendet. Es gab jedoch Momente, in denen eine die Aggregierung und/oder Gelierung von GLP-1(7-36)NH2 in der Säule auftrat. Es wurde erwartet, dass die Neigung von GLP-1(7-36)NH2 zu aggregieren, leicht einen Haupt-Risikofaktor bei der Aufskalierung darstellt.
  • Andererseits, obwohl das hydrophobe Chromatographieharz Substanzen unter Verwendung deren Hydrophobizität adsorbiert, wie das Umkehrphasen-Chromatographieharz, hat es im Allgemeinen eine geringe Dichte funktionaler Gruppen und hat ein Adsorptionsvolumen von 5 bis 15 mg/ml Harz. Es gibt jedoch viele Arten an Trägern und viele Arten funktionaler Gruppen, und daher ist es möglich, Peptide zu wählen, die eine hohe Ausbeuterate ergeben, selbst wenn sie eine Neigung dazu haben, leicht zu aggregieren, wie GLP-1(7-36)NH2. Nach der Untersuchung zahlreicher funktionaler hydrophober Chromatographieharze haben wir gefunden, dass Harze, die hydrophile Träger mit Butylgruppen, Isobutylgruppen, Hexylgruppen oder Phenylgruppenharze oder Polystyrolharze umfassen, welche durch Poros-R2 repräsentativ dargestellt sind, geeignet sind. Ein Beispiel eines solchen Harzes, Poros R2 (Perceptive Systems), ist unten gezeigt.
  • Das maximale Adsorptionsvolumen für das Harz für GLP-1(7-36)NH2 ist ungefähr 12 mg/ml Harz, was höher ist als die anderen hydrophoben chromatographischen Harze, und was zu einer höheren Konzentration an GLP-1(7-36)NH2 während der Eluierung führt, was vermuten lässt, dass das Harz für die Lyophilisierung geeignet ist.
  • Eine 800 ml Säule wurde mit 10 mM Ammoniumacetat, pH 4,5, äquilibriert, zu der die Probenlösung des Beispiels 8 gegeben wurde. Nach dem Waschen mit der Äquilibrierungslösung wurde die Säule ferner mit 0,2% Essigsäure gewaschen und wurde mit 0,2% Essigsäure/40% Acetonitril eluiert. Die Ausbeute an GLP-1(7-36)NH2 betrug 80% und die Reinheit war 98% (21-E). Das Produkt enthält flüchtige Säure nur in geringer Konzentration und daher sollte es leicht nach der Entfernung von Acetonitril lyophilisiert werden können. Nach der Rekonstituierung des lyophilisierten Produkts kann Endotoxin durch das Gelierverfahren (Limulus ES-II-Test, Wako Pure Chemicals Co., Ltd.) gemessen werden und es wurde gefunden, dass es unterhalb der Nachweisgrenze liegt (0,03 μ/mg oder niedriger). Die Tatsache, dass das Säulenverfahren in der oben beschriebenen Methode die Reinigung in hoher Ausbeute und hoher Reinheit an GLP-1(7-36)NH2 erlaubt und die Eluierung durch ein Lösungsmittel ermöglicht, das lyophilisiert werden kann, ist, überflüssig zu sagen, industriell sehr nützlich.
  • Beispiel 10. Verringerung der Aggregierung unter Verwendung eines Hilfspeptids
  • Ein Ziel des Produktionsverfahrens der vorliegenden Erfindung, welches ein Hilfspeptid benutzt, ist es, die Aggregierungseigenschaften zu verringern, d. h. die Eigenschaften, die aus den physikochemischen Eigenschaften des Peptids von Interesse hervorgehen, was ein Problem in dem konventionellen Produktionsverfahren darstellt, und daher ist es notwendig, das Vorhandensein der Verminderung festzustellen. Im vorliegenden Beispiel wurde daher untersucht, ob die Aggregierungseigenschaft eines Peptids, das ein Hilfspeptid und GLP-1(7-37) und ein Peptid, das ein Hilfspeptid und GLP-1(7-36)NH2 umfasst, im Vergleich zu dem von GLP-1(7-37) und GLP-1(7-36)NH2 verbessert worden ist.
  • Zunächst wurde RHHGP[G] gereinigt und die Verbesserung der Aggregierungseigenschaften verglichen mit der von GLP-1(7-37) wurde untersucht und zum gleichen Zeitpunkt wurden Substanzen, die die Aggregierung unterdrücken, erforscht. Jede der Peptidproben, d. h. eine Probe, die durch Reinigen mit SP-Sepharose BigBeads-Chromatographie für RHHGP[G] hergestellt wurde, eine Probe, die durch Amidieren mit gereinigtem RHHGP[G] für RHHGP-1 hergestellt wurde, eine Probe, die durch Spalten von RHHGP[G] mit Kex2-Protease für GLP-1(7-37) hergestellt wurde, und eine Probe, die durch Spalten von RHHGP-1 mit Kex2-Protease für GLP-1(7-36)NH2 hergestellt wurde, wurde bis zu einer Reinheit von 98% durch Eluieren mit Acetonitril mit einem Acetonitril-Konzentrationsgradienten unter Verwendung der Poros-R2-Säule gereinigt und dann lyophilisiert, um jede Probe herzustellen.
  • Da die Aggregierungseigenschaft als mit der Löslichkeit jedes Peptids verbunden angesehen wird, wurde die pH-Abhängigkeit der Löslichkeit jedes Peptids untersucht. Die Ergebnisse sind in 22 und 23 gezeigt. Es kann gesehen werden, dass GLP-1(7-37) geringe Löslichkeit im Bereich von pH 5,5 bis pH 6,5 hat, d. h. von einer schwach sauren bis zu neutralen Bedingungen, welche der optimale pH-Wert für die Bedingungen der Amidierungs-Enzymreaktion sind, was darauf hinweist, dass es als Produktions-Zwischenprodukt nicht geeignet ist.
  • Andererseits bewahren RHHGP[G] und RHHGP-1, obwohl sie beginnen, eine absinkende Löslichkeit bei ungefähr pH 6,2 zu zeigen, eine angemessene Löslichkeit mindestens bis zu einem pH von 5 oder pH 6, und es wurde bestätigt, dass sie entsprechend effizient selbst unter Bedingungen für die Amidierungsenzym-Reaktion umgesetzt werden können.
  • Beispiel 11. Durchmusterung nach Substanzen mit Aggregierungs-Unterdrückung
  • Bei der Etablierung des Produktionsverfahrens von GLP-1(7-36)NH2 auf industriellem Niveau unter Verwendung des Produktionsverfahrens der vorliegenden Erfindung, welches ein Hilfspeptid verwendet, wäre eine Substanz, die die Löslichkeit von RHHGP[G] und RHHGP-1 in dem neutralen bis zu schwach alkalischen Bereich erhöht, und die Löslichkeit von GLP-1(7-36)NH2 in dem schwach sauren bis schwach alkalischen Bereich bewahrt, falls vorhanden, mehr bevorzugt (GLP-1(7-36)NH2 liegt hinter GLP-1(7-37) in der in 22 gezeigten Studie, aber es wurde gefunden, dass es mit der Zeit Präzipitate oder Mikrokristalle in einem Bereich des pH-Werts von 5,3 bis pH 8,0 bildet).
  • Als Substanzen, die zu der Lösung hinzugegeben werden, damit sie die Löslichkeit jedes Peptids bewahren, schließen mögliche Kandidaten Tenside, Zucker, Salze, organische Lösungsmittel und ähnliche ein. Daher wurden Tween 80 und Triton X100 als Tenside, Glucose, Mannitol und Sucrose als Zucker, NaCl als Salz und Ethanol, Glycerol und DMSO als organische Lösungsmittel auf ihre Fähigkeit zur Unterdrückung der Aggregierung getestet.
  • Zehn mg/ml wässrige Lösungen aus RHHGP[G], RHHGP-1 und GLP-1(7-36)NH2 wurden hergestellt. In Plastikröhrchen, die 0,1 ml 300 mM BR-Puffer, pH 7,9 und 0,1 ml von 10-fach konzentrierten Testprobenlösungen enthalten, wurden 0,8 ml jeder Peptidlösung gegeben, und der pH-Wert wurde auf Niveaus eingestellt, die leicht eine Aggregierung verursachen können, wie beispielsweise pH 7,5 bis pH 8,5 für RHHGP[G], pH 8,0 für RHHGP-1 und pH 6,5 für GLP-1(7-36)NH2, und dann wurde die Trübung (Absorption bei 660 nm) über die Zeit beobachtet. Unter den Ergebnissen, die erhalten wurden, sind die unterdrückenden Wirkungen auf die Aggregierung durch Tween 80, NaCl und die Temperatur in 23 und 24 gezeigt.
  • Es wurde gefunden, dass die Präziptitatbildung durch 0,1% Tween 80 in RHHGP[G] und RHHGP-1 stark unterdrückt wurde (23A), aber in GLP-1(7-36)NH2 war die Aggregierung durch Tween 80 bei 0,3% oder darüber (23B), bei NaCl bei 100 mM oder darüber (24C), und/oder bei niedriger Temperatur (24D) unterdrückt.
  • Anhand der obigen Ergebnisse wurde bewiesen, dass bezüglich des pH-Werts in dem tatsächlichen Produktionssystem die Zugabe eines Salzes und eines Tensids zur Unterdrückung der Aggregierung des Peptids von Interesse, wenn das Verfahren zur Herstellung von Peptiden der vorliegenden Erfindung verwendet wird, nützlich sind und es wurde angezeigt, dass das Peptid von Interesse in hoher Reinheit und hohen Ausbeuten hergestellt werden kann.
  • Beispiel 12. Verfahren zur Abspaltung in der Spaltstellen-Region
  • Verfahren zur Abspaltung, die verwendet werden, wenn eine Spaltung in den Spaltstellen-Regionen durchgeführt wird, wurden untersucht. Das bedeutet, wenn das Spaltverfahren für jeden der Fälle (1) Spaltstellen-Region 1: Cyanisierung/Alkanisierung, Spaltstellen-Region 2: Kex2-Protease; (2) Spaltstellen-Region 1: Kex2-Protease, Spaltstellen-Region 2: Kex2-Protease; und (3) Spaltestellen-Region 1: DTNB (5,5'-Dithiobis-(2-nitrobenzoesäure)) Zugabe/Kex2-Protease, Spaltstellen-Region 2: Reduzierung/Kex2-Protease unter Verwendung des Peptids von Interesse als GLP-1(7-37) und GLP-1(7-36)NH2 verwendet wurde, gefunden, dass die Spaltung durch ein Mehrschritt-Spaltungsverfahren durch chemische oder enzymatische Behandlung durchgeführt werden kann, wenn ein Fusionsprotein, das ein Schutzpeptid umfasst, in dem Produktionsverfahren der vorliegenden Erfindung verwendet wird.
  • Ergebnisse jedes Verfahrens sind unten gezeigt. Um die Hydrophilizität des Polypeptids zu verstärken, welches ein Hilfspeptid umfasst und GLP-1(7-37), das sich nach der Spaltung bildete, und dadurch die Löslichkeit bei neutralem pH-Wert zu verbessern, wurden 4 aufeinander folgende Histidinsequenzen in alle Hilfspeptide eingeschleust.
  • A. Verfahren zur Herstellung von GLP-1(7-37) durch spezifische Spaltung an den Cysteinresten unter Verwendung des Verfahrens (1)
  • Dieses Verfahren spaltet chemisch einen Cysteinrest in einer Spaltstellen-Region (Spaltstellen-Region 1), wenn das Peptid von Interesse kein Cystein enthält. Beispielsweise wurde bestätigt, dass nachdem das Fusionsprotein exprimiert wurde und erhalten wurde, ein Cysteinrest mit CADP (1-Cyano-4-dimethylamino-pyridiniumtetrafluoroborat) cyanisiert wurde, und spezifisch am N-terminalen Ende des Cysteins der Spaltstellenregion durch eine Alkali (NaOH)-Behandlung gespalten werden kann.
  • So wurde PGGRPSRHKR (SEQ ID Nr. 6) als eine Aminosäuresequenz ausgewählt, die in der Spaltstellen-Region 1 nahe der Aminosäuresequenz von GCHHHH (SEQ ID Nr. 5) als Hilfspeptid liegt, und wurde in eine Fusionsprotein eingeschleust. Dieses Fusionsprotein wurde zu 30 mg/ml in 50 mM Tris-HCl, pH 8,2, 5 M Harnstoff und 10 mM DTT (Dithiothreitol) gelöst, und in einem 30°C Inkubator für 30 min. inkubiert, um das Cystein vollständig zu reduzieren. Dieses wurde einer Gelfiltrations-Säule (hergestellt von Pharmacia, PD10-Säule) unterworfen, die mit 10 mM Tris-HCl, pH 8,2 und 5 M Harnstoff äquilibriert worden war, um DTT zu entfernen.
  • Um Cystein zu cyanisieren, wurde Essigsäure in einer finalen Konzentration von 0,1 M zugegeben, und CADP in einem 4-fach molaren Überschuss an Cystein wurde hinzugegeben und wurde bei 30°C für 1 Stunde umgesetzt. Die Cyanisierungsreaktion wurde durch Bestimmung der restlichen SH-Gruppen mit DTNB festgestellt.
  • Das oben erwähnte Fusionsprotein wurde spezifisch an der cyanisierten Cysteinstelle durch Entfernen eines Überschusses an Reaktionsmitteln durch eine PD10-Säule entfernt, die mit 10 mM Essigsäure und 5 M Harnstoff äquilibriert war, durch Zugeben von NaOH bis zu einer finalen Konzentration von 50 mM und dann das Stehenlassen bei Raumtemperatur für 30 Minuten. Die Spaltungsrate betrug ungefähr 50 bis 70%.
  • Die andere Spaltstellenregion (Spaltstellen-Region 2) wurde einer Spaltungsbehandlung in gleicher Weise wie Beispiel 7 unterworfen.
  • B. Spaltung einer Spaltstellenregion mit Kex2-Protease unter Verwendung des Verfahrens (2)
  • Ein Entwurf wurde gemacht, dass wenn jede Spaltstellen-Region eine Kex2-Protease-Spaltenstellen-Region besitzt, die Aminosäuresequenz einer Spaltstellen-Region (Spaltstellen-Region 2) unter den Reaktionsbedingungen für die Spaltung der anderen Spaltstellen-Region (Spaltstellen-Region 1) schwer zu spalten ist.
  • Es ist bekannt, dass bei der Optimierung einer Spaltstellen-Erkennungs-Sequenz in der Spaltstellen-Region der Kex2-Protease die Ladung des Aminosäurerestes an der P4-Substelle, zusätzlich zu den P1- und P2-Substellen die Aktivität des Enzyms starkt beeinflusst, und dass das Fusionsprotein unter einer bestimmten Bedingung überhaupt nicht gespalten wird, insbesondere, wenn eine saure Aminosäure in der P4-Substelle vorhanden ist ( japanische nicht geprüfte Patentveröffentlichung (Kokai) Nr. 9(1997)-296000 ). Indem dies benutzt wurde, beispielsweise indem eine Asparaginsäure (D) in die P4-Substelle in Form der Aminosäuresequenz SDHKR (SEQ ID Nr. 8) der Spaltstellen-Region 2 neben einer Aminosäuresequenz umfassend HRHKRSHHHH (SEQ ID Nr. 7) als Hilfspeptid, wurde 90% oder mehr mit der Kex2-Protease bei der Spaltung der Spaltstellenregion 1 im Fusionsprotein gespalten, aber die Spaltstellen-Region 2 war vor der Spaltung geschützt. Das Ergebnis zeigte, dass der Spaltstellenbereich 1 spezifisch durch Einschleusen von Asparaginsäure in die P4-Substelle gespalten werden kann.
  • In einer Ionenaustauschchromatographie und einer Säulenchromatographie (z. B. Cellufin C-200 Säulenchromatographie) mit Gelfiltrationsfähigkeit, die durchgeführt wurden, um das erhaltene GLP-1(7-37) mit daran angehängtem Hilfspeptid zu isolieren, wurde das gewünschte GLP-1(7-37) mit einem daran angehängten Hilfspeptid spezifisch adsorbiert. Einiges des nicht umgesetzten Fusionsproteins adsorbierte ebenfalls, aber das wurde leicht durch einen Salzkonentrationsgradienten abgetrennt. Die Ausbeute betrug 94%. Die Chromatographie kann ebenfalls auf GLP-1(7-36)NH2 mit einem daran angehängten anderen Hilfspeptid angewanddt werden.
  • Anschließend wurde nach der Amidierungs-Modifikationsreaktino die Kex2-Protease-Spaltungsbehandlung in dem Spaltstellenbereich 2 durchgeführt, um GLP-1(7-36)NH2 von GLP-1(7-36)NH2 auszuschneiden, das ein daran angehängtes Hilfspeptid trägt. Es wurde gefunden, dass unter den ersten Spaltbedingungen, welche Harnstoff (Denaturierungsmittel) enthielt, und alkalisch war, die Kex2-Protease den Spaltstellenbereich 2 nicht spaltete, aber dass in Abwesenheit von Harnstoff der Spaltstellenbereich 2 erkannt werden konnte, indem ein geeigneter pH-Wert gewählt wurde. Es wurde gezeigt, dass der optimale pH-Wert 6,5 bis 7,3 beträgt, und dass eine Spaltung bei einem pH-Wert von 8,2 daher nicht leicht war, welcher der Spaltreaktions-Bedingung des Spaltstellenbereichs 1 entspricht.
  • Dies liegt daran, dass das oben erwähnte GLP-1(7-36)NH2 mit einem daran angehängten Hilfspeptid von dem Fusionsprotein mit einem Schutzpeptid verschieden ist, das zusätzlich daran angehängt worden ist, und in einem breiten pH-Bereich, sogar in Abwesenheit von Harnstoff, löslich ist. So wurde der Kex2-Protease ermöglicht, einzuwirken, und das Peptid wurde abgetrennt und mittels Umkehrphasen-HPLC bestimmt, wobei die Spaltung von 98% oder mehr als vollständig definiert wurde. Da dieses System keinen Harnstoff enthält, tritt kaum ein Aktivitätsverlust der Kex2-Protease auf. Daher hat es den Vorteil, dass die Menge an Kex2-Protease, die benötigt wird, extrem gering ist, mit einem molaren Verhältnis zum Substrat, das 1:20.000 bis 1:40.000 entspricht.
  • Wie oben erwähnt wurde, wurde gezeigt, dass GLP-1(7-37) und GLP-1(7-36)NH2 durch die Verwendung des gleichen Enzyms in einer Spaltungsbehandlung von jedem Spaltstellenbereich hergestellt werden kann.
  • C. Spaltmethode unter Benutzung einer spezifischen Modifizierung von Cystein unter Verwendung von Verfahren (3)
  • Dieses Verfahren ist fast ähnlich wie das Verfahren (2) und wenn das Peptid von Interesse keine Cysteinreste enthält, modifiziert es den Cysteinrest, der in die P4-Substelle eines Spaltstellenbereichs eingeschleust worden ist (Spaltstellenbereich 2), d. h. er schützt den Spaltstellenbereich 2 vor der Spaltung zum Zeitpunkt der Kex2-Protease-Spaltungsreaktion in dem anderen Spaltstellenbereich (Spaltstellenbereich 1), indem die Seitenkette von Cystein mit DTNB (Dithionitriobenzoesäure) behandelt wird, führt die Reduktion durch, nachdem ein Peptid, das GLP-1(7-37) mit einem daran angehängten Hilfspeptid gewonnen wurde, um dadurch den Spaltstellenbereich 2 mit Kex2-Protease zu spalten. Repräsentative Beispiele solcher Modifikationsreaktionen schließen die Sulfonierung und die asymmetrische Disulfidisierung mit DTNB ein, sie sind aber nicht auf diese Reaktionen begrenzt, sofern das Verfahren eine negative Ladung an einen Cysteinrest verleiht. Beispielsweise wird die Aminosäuresequenz des Spaltstellenbereichs 2 neben der Aminosäuresequenz, umfassend HRHKRSHHHH (SEQ ID Nr. 7) als Hilfspeptid, in ein Fusionsprotein eingeschleust als SCHKR (SEQ ID Nr. 24).
  • Das wie oben beschrieben entworfene Fusionsprotein wurde exprimiert, das Fusionsprotein, das gewonnen wurde, wurde einer DTNB-Behandlung unterworfen, und Cystein wurde in ein asymmetrisches Disulfid verändert. Nach der Bestätigung der vollständigen Veränderung von Cystein wurde die Spaltungsbehandlungs-Reaktions mit Kex2-Protease durchgeführt und dann wurde bestätigt, dass ein Peptid, das GLP-1(7-37) mit einem daran angehängten Hilfspeptid umfasst, in einer quantitativen Menge erhalten werden kann. So wurde durch Änderung der P4-Substelle der Aminosäureseugenz-Erkennungsstelle der Kex2-Protease in dem Spaltstellenbereich 2 in Cystein und durch Einschleusen einer negativen Ladung in einer Seitenketten-spezifischen Weise der Spaltstellenbereich 2 vor der Spaltung zum Zeitpunkt der Spaltung mit Kex2-Protease an dem Spaltstellenbereich 1 geschützt.
  • Dann wurde eine Reinigung und eine Amidierungsreaktion wie in dem obigen B durchgeführt, DTT wurde hinzugegeben, um GLP-1(7-36)NH2 mit einem daran angehängten Hilfspeptid zu reduzieren, eine hydrophobe Säulenchromatographie wurde durchgeführt, um es zu einer Reinheit von 98% zu reinigen, und dann wurde das Produkt lyophilisiert. Sobald das Produkt zu 5 mg/ml in 20 mM BisTris, pH 7,0 und 2 mM Calciumchlorid gelöst war, wurden 1.000 Einheiten/ml Kex2-Protease hinzugefügt, und das Gemisch wurde bei 30°C umgesetzt, und GLP-1(7-36)NH2 mit einem Hilfspeptid, das daran angehängt war, wurde spezifisch gespalten, um GLP-1(7-36)NH2 zu ergeben.
  • Obwohl der Spaltstellenbereich 2 in diesem Beispiel in reduziertem Zustand vorlag, ist es möglich, und nicht notwendig zu erläutern, diesen so zu ändern, dass er eine positive Ladung hat, und dadurch die Reaktivität der Kex2-Protease zu ändern.
  • Industrielle Anwendbarkeit
  • Erfindungsgemäß wird ein Verfahren zum Herstellen biologisch aktiver Peptide in effizienter Weise und zu geringen Kosten in industriellem Maßstab bereitgestellt. Spezifisch wurde gezeigt, wie in den Beispielen der vorliegenden Erfindung beschrieben ist, dass GLP-1-Derivate, für die die industrielle Herstellung schwierig gewesen ist, in hoher Reinheit und mit hohen Ausbeuten hergestellt werden können. Das Herstellungsverfahren der vorliegenden Erfindung kann auf die Produktion biologisch aktiver Peptide, die nicht GLP-1-Derivate sind, angewandt werden und ist daher industriell extrem nützlich.
  • SEQUENZLISTE
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Claims (25)

  1. Verfahren zur Herstellung eines Peptids mit einer gewünschten biologischen Aktivität, umfassend die Schritte: (1) Kultivieren von Zellen, die mit einem Expressionsvektor mit einer Nukleotidsequenz, die ein Fusionsprotein codiert, transformiert worden sind, wobei das Fusionsprotein ein Peptid von Interesse umfasst, das nicht größer ist als 200 Aminosäuren, ein Schutzpeptid, das heterolog zum Peptid von Interesse ist und das Peptid von Interesse vor Abbau durch intrazellulare Proteasen schützt, und ein Hilfspeptid, wobei das Fusionsprotein Schnittstellen zwischen dem Schutzpeptid, dem Hilfspeptid und dem Peptid von Interesse aufweist, so dass das Fusionsprotein zwei Schnittstellen umfasst; (2) Ernten des Verschmelzungsproteins aus der Kultur; (3) Abspalten des Verschmelzungsprotein, so dass das Schutzpeptid freigesetzt wird und dadurch das Peptid von Interesse mit dem daran gebundenen Hilfspeptid erhalten wird; (4) Reinigen des Peptids von Interesse mit dem daran gebundenen Hilfspeptid; (5) gegebenenfalls Unterziehen des Peptids von Interesse mit dem daran gebundenen Hilfspeptid einer Modi fizierungsreaktion; (6) Abspalten des Peptids von Interesse mit dem daran gebundenen Hilfspeptid, so dass das Hilfspeptid freigesetzt wird und dadurch das Peptid von Interesse erhalten wird; und (7) Reinigen des Peptids von Interesse; wobei das Hilfspeptid die physikochemischen Eigenschaften des Peptids von Interesse verändert, um Probleme bei der Reinigung und/oder Modifizierung des Peptids von Interesse zu umgehen, die sich aus den physikochemischen Eigenschaften des Peptids von Interesse ergeben.
  2. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das Hilfspeptid den isoelektrischen Punkt des Peptids von Interesse verändert und/oder die Löslichkeit des Peptids von Interesse im Reinigungs- und/oder Spaltungs- und/oder Modifizierungsschritt erhöht.
  3. Verfahren gemäß Anspruch 2, wobei das Fusionsprotein, das Peptid von Interesse mit dem daran gebundenen Hilfspeptid und das Schutzpeptid unterschiedliche isoelektrische Punkte aufweisen.
  4. Verfahren gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, wobei das Hilfspeptid 5 bis 50 Aminosäurereste aufweist.
  5. Verfahren gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, wobei das Peptid von Interesse mit einem daran angefügten Hilfspeptid einen isoelektrischen Punkt von 8 bis 12 aufweist.
  6. Verfahren gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, wobei das Schutzpeptid 30 bis 200 Aminosäurereste aufweist.
  7. Verfahren gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, wobei im Reinigungsverfahren ein Ionenaustauscherharz verwendet wird.
  8. Verfahren gemäß Anspruch 7, wobei das Ionenaustauscherharz ein Kationenaustauscherharz ist.
  9. Verfahren gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, wobei in dem Reinigungsverfahren eine Umkehrphasenchromatographie oder eine hydrophobe Chromatographie verwendet wird.
  10. Verfahren gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, wobei ein Tensid und/oder ein Salz in mindestens einem der Schritte (1) bis (5) zugesetzt wird, um die Löslichkeit des Peptids von Interesse aufrechtzuerhalten.
  11. Verfahren gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die Wirtszelle eine prokaryontische Zelle oder eine eukaryontische Zelle ist.
  12. Verfahren gemäß Anspruch 11, wobei die Wirtszelle Escherichia coli ist.
  13. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei der isoelektrische Punkt des Peptids von Interesse mit einem daran angefügten Hilfspeptid 8 bis 12 ist.
  14. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei das Peptid von Interesse ein amidiertes Peptid ist.
  15. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei das Peptid von Interesse ein GLP-1-Derivat mit insulinotroper Aktivität ist.
  16. Verfahren gemäß Anspruch 15, wobei das GLP-1-Derivat mit insulinotroper Aktivität, das ein daran angefügtes Hilfspeptid aufweist, einen isoelektrischen Punkt von 8 bis 12 aufweist.
  17. Verfahren gemäß Anspruch 15 oder 16, wobei das GLP-1-Deriat mit insulinotroper Aktivität einen isoelektrischen Punkt von 4,5 bis 9,0 aufweist.
  18. Verfahren gemäß Anspruch 15 oder 16, wobei das GLP-1-Derivat mit insulinotroper Aktivität einen isoelektrischen Punkt von 5,5 bis 7,5 aufweist.
  19. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 13 bis 18, wobei ein Ionenaustauscherharz in dem Reinigungsverfahren verwendet wird.
  20. Verfahren gemäß Anspruch 19, wobei das Ionenaustauscherharz ein Kationenaustauscherharz ist.
  21. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 13 bis 18, wobei in dem Reinigungsverfahren eine Umkehrphasenchromatographie oder eine hydrophobe Chromatographie verwendet wird.
  22. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 13 bis 18, wobei ein Tensid und/oder ein Salz zugesetzt wird, um die Löslichkeit des Peptids von Interesse aufrechtzuerhalten.
  23. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 15 bis 22, wobei die Reinheit des erhaltenen GLP-1-Derivats mit insulinotroper Aktivität 98% oder größer ist.
  24. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 23, wobei der Gehalt an Endotoxin im gereinigten Endprodukt nicht größer als 0,03 Einheiten/mg ist.
  25. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 15 bis 24, das ferner den Schritt des Formulierens des GLP-1-Derivats mit insulinotroper Aktivität als Arzneimittel umfasst.
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